JPH11171772A - 抗腫瘍薬のリポソーム化製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明は、抗腫瘍薬である１−（２−Ｃ−シア
ノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシ
ル）シトシンを含有するリポソーム化製剤を提供する。 【解決手段】リポソームを構成する脂質として、コレス
テロールを必須の成分として含有し、他の成分としてジ
（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファ
チジルコリン、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケ
ノイル）ホスファチジルグリセロール及び／またはポリ
エチレングリコール部分の平均分子量が１０００乃至５
０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサク
シニル−ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイ
ル）ホスファチジルエタノールアミンを含有するリポソ
ーム化製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、１−（２−Ｃ−シ
アノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノ
シル）シトシンを効率的に腫瘍組織に蓄積させることを
可能とするリポソーム化製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−
β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン（1-(2
-C-cyano-2-deoxy-β-D-arabino-pentofuranosyl)cytos
ine。以下、ＣＮＤＡＣとする。）は、該水溶液の経口
投与により優れた抗腫瘍活性を有する（ Azumaら、J. M
ed. Chem. 36、4183-4189（1993）／特開平４−２３５
１８２参照。）ものの、抗腫瘍効果の増強および副作用
の低減のため，腫瘍組織への移行率（選択性）を高める
べく剤形の改善が望まれていた。

【０００３】一般的に、腫瘍組織近傍の血管は正常組織
より物質透過性が高く、通常では血管外に漏出しない高
分子量の化合物やリポソーム等の微粒子が漏出する（Y.
Matsumuraら、Cancer Res. 46, 6387-6392（1986）／
D. D. Lasic とF. Martin（編）、「Stealth Liposome
s」、CRC Press、pp119-126（1995）参照。）。また、
リンパ組織が未発達であるため、漏出した物質は再度循
環系に移行しにくい。特にサイズの大きな物質は漏出後
拡散しにくいので、この傾向が顕著である（Y. Matsumu
raら、Cancer Res. 46, 6387-6392（1986）参照。）。
従って、水溶性の高分子や微粒子をキャリヤーとして血
管内に投与することにより腫瘍組織への薬物のターゲテ
ィングが可能であると考えられる。

【０００４】リポソームは、生体適合性に優れ、表面物
性やサイズ等の制御が容易であり、物性の異なる種々の
化合物を包含しうる等の点から、薬物のターゲティング
に利用することができる（D.D.Lasic、「Liposomes: fr
om basic to applications」、Elsevier Science Publi
shers、pp.261-471（1993）参照。）。しかしながら、
実際上リポソームへの薬物の包含効率が低く実用的でな
いなどの問題点があり、これまで抗腫瘍剤としてはドキ
ソルビシンのリポソーム化製剤等のごく一部の成功例し
かない（D. D. Lasic、Nature 380、561-562（199
6））。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このように、ＣＮＤＡ
Ｃを効率的に腫瘍組織へ蓄積させることが可能な製剤が
求められていた。リポソーム化製剤とすることはこのた
めの有効な手段と考えられるが、ＣＮＤＡＣのリポソー
ム化製剤について報告例はなく、包含特性も未知であっ
た。

【０００６】発明者等は、リポソームへのＣＮＤＡＣの
包含にはコレステロールが決定的な役割を果たすことを
見出し、リポソームを構成する全脂質成分に対するコレ
ステロールの割合が１０乃至６０ｍｏｌ％とすることに
よりＣＮＤＡＣのリポソーム化製剤が製造できることを
示した。さらに、リポソーム化製剤の静脈内投与によ
り、通常の溶液製剤の静脈内投与を陵駕する腫瘍中薬物
濃度が得られることを見出し、本発明を完成した。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）ＣＮＤ
ＡＣまたはその薬理上許容される塩を含有することを特
徴とするリポソーム化製剤、（２）リポソーム構成成分
としてコレステロールを含有することを特徴とする
（１）に記載のリポソーム化製剤、（３）リポソームを
構成する全脂質成分に対するコレステロールの割合が１
０乃至６０モル％であることを特徴とする（１）または
（２）に記載のリポソーム化製剤、（４）リポソーム構
成成分として水溶性高分子鎖を有する脂質を含有するこ
とを特徴とする（２）に記載のリポソーム化製剤、
（５）水溶性高分子鎖を有する脂質がポリエチレングリ
コール部分の平均分子量が１０００乃至５０００のＮ−
モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジ
（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファ
チジルエタノールアミンである（４）に記載のリポソー
ム化製剤、（６）リポソームを構成する脂質が、ジ（Ｃ
_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファチジ
ルコリン、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイ
ル）ホスファチジルグリセロール、コレステロールから
なる（１）に記載のリポソーム化製剤、（７）リポソー
ムを構成する脂質が、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたは
アルケノイル）ホスファチジルコリン（総脂質に対して
２０乃至７０モル％）、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまた
はアルケノイル）ホスファチジルグリセロール（総脂質
に対して１０乃至４０モル％）、コレステロール（総脂
質に対して１０乃至６０モル％）からなる（１）に記載
のリポソーム化製剤、（８）リポソームを構成する脂質
が、ジラウロイルホスファチジルコリン（総脂質に対し
て３０モル％）、ジラウロイルホスファチジルグリセロ
ール（総脂質に対して３０モル％）、コレステロール
（総脂質に対して４０モル％）からなる（１）に記載の
リポソーム化製剤、（９）リポソームを構成する脂質
が、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホ
スファチジルコリン、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたは
アルケノイル）ホスファチジルグリセロール、ポリエチ
レングリコール部分の平均分子量が１０００乃至５００
０のＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニ
ル−ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホ
スファチジルエタノールアミン、コレステロールからな
る（１）に記載のリポソーム化製剤、（１０）リポソー
ムを構成する脂質が、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたは
アルケノイル）ホスファチジルコリン（総脂質に対して
２０乃至７０モル％）、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまた
はアルケノイル）ホスファチジルグリセロール（総脂質
に対して１０乃至４０モル％）、ポリエチレングリコー
ル部分の平均分子量が１０００乃至５０００のＮ−モノ
メトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジ（Ｃ
_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファチジ
ルエタノールアミン（総脂質に対して１乃至１０モル
％）、コレステロール（総脂質に対して１０乃至６０モ
ル％）からなる（１）に記載のリポソーム化製剤、（１
１）リポソームを構成する脂質が、ジパルミトイルホス
ファチジルコリン（総脂質に対して３０モル％）、ジパ
ルミトイルホスファチジルグリセロール（総脂質に対し
て２５モル％）、ポリエチレングリコール部分の平均分
子量が２０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリコ
ールサクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタノ
ールアミン（総脂質に対して５モル％）、コレステロー
ル（総脂質に対して４０モル％）からなる（１）に記載
のリポソーム化製剤、（１２）リポソームを構成する脂
質が、ジミリストイルホスファチジルコリン（総脂質に
対して３０モル％）、ジミリストイルホスファチジルグ
リセロール（総脂質に対して２５モル％）、ポリエチレ
ングリコール部分の平均分子量が２０００のＮ−モノメ
トキシポリエチレングリコールサクシニル−ジステアロ
イルホスファチジルエタノールアミン（総脂質に対して
５モル％）、コレステロール（総脂質に対して４０モル
％）からなる（１）に記載のリポソーム化製剤、（１
３）リポソームを構成する脂質が、ジラウロイルホスフ
ァチジルコリン（総脂質に対して３０モル％）、ジラウ
ロイルホスファチジルグリセロール（総脂質に対して２
５モル％）、ポリエチレングリコール部分の平均分子量
が２０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリコール
サクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタノール
アミン（総脂質に対して５モル％）、コレステロール
（総脂質に対して４０モル％）からなる（１）に記載の
リポソーム化製剤、（１４）リポソームの体積平均粒子
径が５０乃至４００ｎｍであることを特徴とする（１）
乃至（１３）に記載のリポソーム化製剤、（１５）
（１）ないし（１４）に記載のリポソーム化製剤を介し
てＣＮＤＡＣまたはその薬理上許容される塩を腫瘍組織
に送達する方法、からなる。

【０００８】上記の発明において、「リポソーム」と
は、当業者周知の通り（D.D.Lasic、「liposomes: from
basic to applications」、Elsevier Science Publish
ers、pp.1-171（1993）参照。）、膜状に集合した脂質
および内部の水相から構成される閉鎖小胞を意味する。

【０００９】「リポソーム化製剤」とは、内部に薬物を
包含させたリポソームの水中分散型製剤を意味し、該薬
物はリポソームを構成する膜状に集合した脂質相に包含
されていてもよくリポソーム内部の水相に包含されてい
てもよい。

【００１０】本発明において使用するリポソームの直径
（「体積平均粒子径」）としては、静脈内投与後の血中
滞留性および／または腫瘍組織への集積性が高い５０乃
至４００ｎｍが望ましく、より好適には５０乃至１００
ｎｍである（A.L.Klibanovら、Biochim. Biophys. Acta
1062, 142-148（1991）及びD.D.Lasic、「liposomes:
from basic to applications」、Elsevier Science Pub
lishers、pp.261-471（1993）参照）。リポソームの
「体積平均粒子径」は、動的光散乱法等の原理に基づき
求めることができる（D.D.Lasic、「liposomes: from b
asic to applications」、Elsevier Science Publisher
s、pp.1-171（1993）参照）。

【００１１】上記「リポソーム」及び「リポソーム化製
剤」の定義において、脂質とは、グリセロリン脂質、グ
リセロ糖脂質、スフィンゴリン脂質、スフィンゴ糖脂
質、ステロール類、炭素数１０乃至２０のアルキル、ア
ルケニル、アルカノイルまたはアルケノイル鎖を有する
合成有機化合物等の群から選ばれる化合物を意味する。
グリセロリン脂質とは、ホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、
ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、Ｎ−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニ
ルホスファチジルエタノールアミン等を意味し、グリセ
ロ糖脂質とは、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクト
シルジグリセリド等を意味し、スフィンゴリン脂質と
は、スフィンゴミエリン等を意味し、スフィンゴ糖脂質
とは、セレブロシド、ガングリオシド等を意味しステロ
ール類とは、コレステロール、コレステロールヘミサク
シネート、３β−［Ｎ−（Ｎ’、Ｎ’−ジメチルアミノ
エタン）−カルバモイル］−コレステロール、エルゴス
テロール、ラノステロール等を意味し、炭素数１０乃至
２０のアルキル、アルケニル、アルカノイルまたはアル
ケノイル鎖を有する合成有機化合物とは、ステアリン
酸、ステアリルアミン、ステアリン酸ヒドラジド、ステ
アリン酸エステル、Ｎ−［１−（２、３−ジオレイルオ
キシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウ
ムクロライド、Ｎ−α−トリメチルアンモニオアセチル
ドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド、Ｏ−パルミト
イルプルラン等を意味する。

【００１２】ここで、ホスファチジルコリン、ホスファ
チジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホ
スファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミ
ン、スルホキシリボシルジグリセリド、ジガラクトシル
ジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、スフィンゴ
ミエリン、セレブロシド、ガングリオシド、Ｎ−モノメ
トキシポリエチレングリコールサクシニルホスファチジ
ルエタノールアミン等は各々二本ずつ飽和または不飽和
の脂肪酸エステル鎖を有するが、その脂肪酸（アルカノ
イルまたはアルケノイル基）部分の炭素数が１０乃至１
８の脂質をリポソーム構成成分として使用することがで
きる。「Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル」基
としては、デシリル、ウンデシリル、ラウロイル、トリ
デシリル、ミリストイル、ペンタデシリル、パルミトイ
ル、ヘプタデシリル、ステアロイル、オレオイル基等を
挙げることができるが、これらのうち好適なものはラウ
ロイル、ミリストイル、パルミトイル及びステアロイル
基である。

【００１３】これらの試薬（脂質等）は、購入すること
ができる。また、卵黄レシチンおよび大豆レシチン等の
ように、通常種々の炭素数および／または不飽和度の脂
肪酸エステル鎖を有する脂質が混合した状態で入手でき
るものは、これらを単一成分に分離精製することなく使
用することができる。

【００１４】さらに、上記（３）に記載したように、
「水溶性高分子鎖を有する脂質」をリポソーム構成成分
として使用することにより、血中滞留性、腫瘍組織への
集積特性が特に優れた修飾リポソームを製造することが
できる（例えば、D.D.LasicとF.Martin（編）、「Steal
th liposomes」、CRC Press、pp.103-117（1995）参
照。）。「水溶性高分子鎖」としてはポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、プルランのよ
うな多糖類等をあげることができる。「水溶性高分子鎖
を有する脂質」としては、例えばＮ−モノメトキシポリ
エチレングリコールサクシニルホスファチジルエタノー
ルアミン、Ｏ−（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノ
イル）プルラン、Ｎ−（Ｃ_10-18アルカノイルまたはア
ルケノイル）ポリアクリルアミド等をあげることができ
るが、好適にはＰＥＧ部分の平均分子量が１０００乃至
５０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサ
クシニル−ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイ
ル）ホスファチジルエタノールアミンまたはＯ−パルミ
トイルプルランであり、最も好適にはＰＥＧ部分の平均
分子量が２０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリ
コールサクシニル−ジステアロイルホスファチジルエタ
ノールアミンである。

【００１５】また、必要に応じて抗酸化作用等を目的と
して、α−トコフェロール等の添加物を脂質構成成分と
して使用することができる。

【００１６】リポソーム内部を構成する水相には、通
常、塩化ナトリウム水溶液、緩衝液（リン酸緩衝液、酢
酸緩衝液等）、単糖類若しくは二糖類の水溶液（グルコ
ース水溶液、トレハロース水溶液等）を使用することが
でき、好適にはグルコース水溶液またはトレハロース水
溶液である（D.D.LasicとF.Martin（編）、「Stealth l
iposomes」、CRC Press、pp.103-117（1995）参
照。）。

【００１７】ところで、コレステロールはリポソームの
構造を強固にする役割を果たすため、従来では専らリポ
ソームの構造安定性および包含した薬物の漏出を抑制す
るために配合されるのみであり（D.D.Lasic、「Liposom
es: from basic to applications」、Elsevier Science
Publishers、pp.1-171およびpp.261-471（1993）参
照。）、薬物の包含効率そのものを高めるために配合さ
れることはなかった。

【００１８】ＣＮＤＡＣは分子内に塩基性のアミノ基を
有するので薬理上許容される酸成分と結合して「薬理上
許容される塩」を形成することができる。「薬理上許容
される塩」としては、例えば特開平４−２３５１８２号
に記載されたものを挙げることができるが、本発明にお
いて好適なものは塩酸塩である。

【００１９】また、ＣＮＤＡＣおよびその薬理上許容さ
れる塩は、その製造工程で溶媒和物または水和物を形成
したり、保存中に水和物を形成することがあるが、それ
らの溶媒和物及び水和物も本発明の製剤の有効成分であ
る「ＣＮＤＡＣまたはその薬理上許容される塩」に含ま
れる。

【００２０】上記に挙げた脂質の群の中で、保存時およ
び生体中でのリポソームの形態安定性、物質透過性、対
象とする薬物の包含特性、およびリポソームの体内動態
特性等を考慮し、種々の脂質の種類および混合比が選択
される。

【００２１】リポソームを構成する脂質の組成（脂質成
分および各脂質成分の総脂質に対するモル比）として
は、例えば、以下の（Ａ）または（Ｂ）の組成を挙げる
ことができる。

【００２２】 （Ａ） ＤＡＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＡＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には３０モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） （Ｂ） ＤＡＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＡＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には２５モル％） ＰＥＧ−ＤＡＰＥ （ １乃至１０モル％、好適には ５モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） 上記の組成において、ＤＡＰＣはジ（Ｃ_10-18アルカノ
イルまたはアルケノイル）ホスファチジルコリンを示
し、ＤＡＰＧはジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケ
ノイル）ホスファチジルグリセロールを示し、ＰＥＧ−
ＤＡＰＥはポリエチレングリコール部分の平均分子量が
１０００乃至５０００のＮ−モノメトキシポリエチレン
グリコールサクシニル−ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまた
はアルケノイル）ホスファチジルエタノールアミンを示
す。

【００２３】これらのうち好適な組成は（Ａ）または
（Ｂ）の組成であり、更に好適な組成は以下に示す
（ａ）乃至（ｄ）の組成である。

【００２４】 （ａ） ＤＬＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＬＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には３０モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） （ｂ） ＤＰＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＰＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には２５モル％） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ （ １乃至１０モル％、好適には ５モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） （ｃ） ＤＭＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＭＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には２５モル％） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ （ １乃至１０モル％、好適には ５モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） （ｄ） ＤＬＰＣ （２０乃至７０モル％、好適には３０モル％） ＤＬＰＧ （１０乃至４０モル％、好適には２５モル％） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ （ １乃至１０モル％、好適には ５モル％） コレステロール （１０乃至６０モル％、好適には４０モル％） なお、上記の組成においてＤＬＰＣはジラウロイルホス
ファチジルコリン（dilauroylphosphatidylcholine）を
示し、ＤＬＰＧはジラウロイルホスファチジルグリセロ
ール（dilauroylphsphatidylglycerol）を示し、ＤＰＰ
Ｃはジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoy
lphosphatidylcholine）を示し、ＤＰＰＧはジパルミト
イルホスファチジルグリセロール（dipalmitoylphospha
tidylglycerol）を示し、ＤＭＰＣはジミリストイルホ
スファチジルコリン（dimirystoylphosphatidylcholin
e）を示し、ＤＭＰＧはジミリストイルホスファチジル
グリセロール（dimirystoylphosphatidylglycerol）を
示し、ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥはポリエチレングリコ
ール部分の分子量が約２０００のＮ−モノメトキシポリ
エチレングリコールサクシニル−ジステアロイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（N-monomethoxypoly (ethy
leneglycol) succinyl-distearoylphosphatidyl ethan
olamine）を示す。

【００２５】化合物Ａを含有するリポソーム化製剤とし
て好適なものは、以下の処方例Ａ乃至Ｄを用いて［実施
例１］で述べる方法で製造されるものである。

【００２６】処方例Ａ ＤＬＰＣ ９０（μｍｏｌ） ＤＬＰＧ ９０（μｍｏｌ） コレステロール １２０（μｍｏｌ） ＣＮＤＡＣ塩酸塩 １乃至２０（ｍｇ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５重量％グルコース水溶液で２ｍＬとした。

【００２７】処方例Ｂ ＤＰＰＣ ９０（μｍｏｌ） ＤＰＰＧ ７５（μｍｏｌ） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ １５（μｍｏｌ） コレステロール １２０（μｍｏｌ） ＣＮＤＡＣ塩酸塩 １乃至２０（ｍｇ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５重量％グルコース水溶液で２ｍＬとした。

【００２８】処方例Ｃ ＤＭＰＣ ９０（μｍｏｌ） ＤＭＰＧ ７５（μｍｏｌ） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ １５（μｍｏｌ） コレステロール １２０（μｍｏｌ） ＣＮＤＡＣ塩酸塩 １乃至２０（ｍｇ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５重量％グルコース水溶液で２ｍＬとした。

【００２９】処方例Ｄ ＤＬＰＣ ９０（μｍｏｌ） ＤＬＰＧ ７５（μｍｏｌ） ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ １５（μｍｏｌ） コレステロール １２０（μｍｏｌ） ＣＮＤＡＣ塩酸塩 １乃至２０（ｍｇ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ５重量％グルコース水溶液で２ｍＬとした。

【００３０】

【発明の実施の形態】リポソームは、当業者周知の方法
に従い製造し、サイズを調節することができる。すなわ
ち、上記で選ばれた脂質および塩化ナトリウム水溶液、
緩衝液、グルコース水溶液等を水相として用い、薄膜
法、逆相蒸発法、エタノール注入法、エーテル注入法、
脱水−再水和法等により製造でき、超音波照射法、凍結
融解後の超音波照射法、エクストルージョン法、フレン
チプレス法、ホモジナイゼーション法等の方法によりサ
イズが調節できる（D.D.Lasic、「Liposomes: from bas
icto applications」、Elsevier Science Publishers、
pp.1-171（1993）参照。）。本発明においても、これら
の方法に従いリポソームを製造し、必要に応じてリポソ
ームのサイズを調節することができる。

【００３１】また、リポソーム化製剤中の薬物濃度は製
造時における薬物の配合量のほか、製造後に超遠心分離
等の濃縮工程または塩化ナトリウム水溶液等による希釈
工程を挿入することにより適宜調節することができる。
本発明のリポソーム化製剤の場合、塩酸塩として１乃至
１５ｍｇ／ｍＬのＣＮＤＡＣを包含するように薬物濃度
を調節することができる。

【００３２】ＣＮＤＡＣのように水溶性が高い（試験例
１参照。）化合物は、該化合物をあらかじめ溶解した水
相を用いてリポソームを製造することにより、リポソー
ムに包含させることができる（D.D.Lasic、「Liposome
s: from basic to applications」、Elsevier Science
Publishers、pp.261-471（1993）参照。）。

【００３３】本発明のリポソーム化製剤の投与量は、症
状、年齢、および、製剤中に含有される有効成分（ＣＮ
ＤＡＣ）の量によって異なるが、例えば、成人に対して
１日あたり、ＣＮＤＡＣとして０．１ｍｇ（好適には１
ｍｇ）乃至１０００ｍｇ（好適には５００ｍｇ）に相当
する製剤を１回または数回にわけて静脈内または直接腫
瘍組織に投与することができる。また、治療に最適なＣ
ＮＤＡＣの有効量を維持するために、連続的に投与する
こともできる。

【００３４】

【実施例】以下、実施例および試験例により本発明をさ
らに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を限定す
るものではない。なお、下記の例で使用した脂質は、コ
レステロールを除き全て川原油化（株）より購入した。
また、ＣＮＤＡＣ塩酸塩は、特開平４−２３５１８２号
に記載の方法により製造した。

【００３５】［実施例１］ ＣＮＤＡＣを包含したリポ
ソームの製造 ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalmitoylpho
sphatidylcholine、ＤＰＰＣ）、ジパルミトイルホスフ
ァチジルグリセロール（dipalmitoylphosphatidylglyce
rol、ＤＰＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルコリ
ン（dimyristoylphosphatidylcholine、ＤＭＰＣ）、ジ
ミリストイルホスファチジルグリセロール（dimiristoy
lphsphatidylglycerol、ＤＭＰＧ）、ジラウロイルホス
ファチジルコリン（dilauroylphosphatidylcholine、Ｄ
ＬＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール
（dilauroylphsphatidylglycerol、ＤＬＰＧ）、コレス
テロール、ポリエチレングリコール部分の分子量が約２
０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサク
シニル−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミ
ン（N-monomethoxypoly(ethylene glycol) succinyl-di
stearoylphosphatidylethanolamine、ＰＥＧ２０００−
ＤＳＰＥ）、ＣＮＤＡＣ塩酸塩、および５重量％グルコ
ース水溶液を使用し、Banghamら（J. Mol. Biol. 8、66
0-668（1964）参照。）の方法により多重層リポソーム
の粗分散液を得た。処方例を表１に示す。これらのリポ
ソームを以下、ＣＮＤＡＣリポソームとする。

【００３６】

【表１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 処方 脂質組成（数字は使用した脂質のμｍｏｌ数を表す。） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 処方１ ＤＬＰＣ／ＤＬＰＧ／コレステロール ＝９０／９０／１２０ 処方２ ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／コレステロール ＝９０／７５／１５／１２０ 処方３ ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／コレステロール ＝９０／７５／１５／１２０ 処方４ ＤＬＰＣ／ＤＬＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／コレステロール ＝９０／７５／１５／１２０ 処方５ ＤＬＰＣ／ＤＬＰＧ ＝１５０／１５０ 処方６ ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ ＝２１０／７５／１５ 処方７ ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ ＝２１０／７５／１５ 処方８ ＤＬＰＣ／ＤＬＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ ＝２１０／７５／１５ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 各処方において、脂質に２０ｍｇのＣＮＤＡＣ塩酸塩を
含む５重量％グルコース水溶液１．５ｍＬを加え、さら
に５重量％グルコースを加えて全体を２ｍＬとした。

【００３７】孔径５０乃至２００ｎｍのポリカーボネー
ト製メンブランフィルタ（野村マイクロサイエンス社）
を装着したエクストルーダ（Liposofast-Basic。AVESTI
N社製）を用い、ＣＮＤＡＣリポソームの粗分散液を通
過させる（以下、所定サイズの孔径のポリカーボネート
製メンブランフィルタを装着したエクストルーダを用い
たリポソームのメンブラン通過を、所定サイズのエクス
トルージョンという。）ことにより、リポソームのサイ
ズを調節した。

【００３８】ＣＮＤＡＣの包含率（試験例２参照。）が
高かったコレステロールを含有するＣＮＤＡＣリポソー
ムの分散液を１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で希釈す
ることによって脂質濃度を約０．１ｍＭとし、粒子径測
定機（Nicomp Particle Sizer Model 370、Nicomp Part
icle Sizing Systems社製）を使用して体積平均粒子径
（volume-weighted diameter。以下、Ｄ_vとする。）お
よび数平均粒子径を測定し、（１）式を用いて多分散指
数（polydispersity。以下、ＰＤとする。）を算出し
た。こうして求められたＤ_vおよびＰＤの値を表４に示
す。コレステロールを含有するいずれのリポソームも粒
子径分布が狭く平均粒子径が５０乃至４００ｎｍの範囲
にあり、血中滞留性および／または腫瘍組織への集積の
適したサイズに調節できたことを確認した。

【００３９】 多分散指数＝体積平均粒子径／数平均粒子径 （１）

【００４０】

【表２】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 処方番号 エクストルージョン 体積平均粒子径 多分散指数 サイズ 可否 Ｄ_v（ｎｍ） ＰＤ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ ５０ｎｍ 可 ８０．３ １．２８ ２ ５０ｎｍ 可 １０３．４ １．２０ １００ｎｍ 可 １４４．２ １．５０ ２００ｎｍ 可 １７８．４ １．２７ ３ ５０ｎｍ 可 ９５．４ １．３８ ４ ５０ｎｍ 可 ８８．６ １．２４ ２００ｎｍ 可 ２０７．６ １．５６ ５ ５０ｎｍ 可 （未測定） ６ ５０ｎｍ 可 （未測定） ７ ５０ｎｍ 可 （未測定） ８ ５０ｎｍ 可 （未測定） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ［試験例１］ ＣＮＤＡＣの親水性／親油性の評価 当業者周知の方法（A. Martinら、「Physical pharmacy
（3rd ed.）」、Lea &Febiger、pp.272-313（1983）参
照。）に従って求められたｎ−オクタノール／水溶液系
におけるＣＮＤＡＣの分配係数は、水溶液相のｐＨが３
乃至７である場合に０．０００３乃至０．０３と、ＣＮ
ＤＡＣはきわめて親水性が高いことがわかった。従っ
て、ＣＮＤＡＣは水相に溶解しリポソームに包含させる
ことが妥当であると判断された。

【００４１】［試験例２］ リポソームへのＣＮＤＡＣ
の包含率の決定 ＣＮＤＡＣリポソームの分散液を生理食塩水で希釈する
ことにより、製造時の処方から計算される分散液中の脂
質濃度を０．５ｍＭとした。この分散液１００μＬを、
分散液中に含まれる全ＣＮＤＡＣ濃度を測定するための
試料とした。また、この分散液１ｍＬを超遠心分離（１
４００００ｇ×２０ｍｉｎ．）によりリポソームを沈殿
させることによって得た上清１００μＬを、包含されな
かったＣＮＤＡＣ濃度を測定するための試料とした。

【００４２】これらのＣＮＤＡＣ濃度測定のための試料
１００μＬに、蒸留水１５０μＬ、メタノール２５０μ
Ｌ、およびクロロホルム２５０μＬを加え、ボルテック
スミキサーを使用して１０分間振とうし、遠心分離（１
０００ｇ×５ｍｉｎ．）することにより系を２層に分離
させた。この上層を、表３に示す条件にて逆相高速液体
クロマトグラフィーにより分析し、５ｍｉｎ．で溶出さ
れるＣＮＤＡＣの濃度を測定した。

【００４３】

【表３】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 測定機 ＬＣ−１０Ａ（島津製作所社製） カラム ５Ｃ１８−ＡＲ（Ｗａｔｅｒｓ社製） カラム温度 ４０℃ 検出波長 ２７１ｎｍ 移動相 アセトニトリル／蒸留水／イオンペア試薬^* ＝２１／９７９／１（体積比） 流速 １ｍＬ／ｍｉｎ インジェクション体積 １０μＬ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− イオンペア試薬^*は、Ｐｉｃ Ｂ７（Ｗａｔｅｒｓ社）を使用した。

【００４４】リポソームへのＣＮＤＡＣの包含率は、Ｃ
ＮＤＡＣの分散液中の全濃度Ｃ_tおよび上清中濃度Ｃ_sを
次式に代入することにより算出した。

【００４５】 包含率 ＝ （１−Ｃ_s／Ｃ_t）×１００（％） （２） こうして求められた、各種のリポソームへのＣＮＤＡＣ
の包含率を表４に示す。このように、リポソームにコレ
ステロールを配合した処方１乃至４においてはＣＮＤＡ
Ｃがリポソームに包含されたが、コレステロールを配合
しなかった処方５乃至８においてはＣＮＤＡＣがリポソ
ームに包含されなかった。

【００４６】

【表４】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− リポソーム処方 エクストルージョンのサイズ 包含率（％） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ ５０ｎｍ １５ ２ ５０ｎｍ １８ １００ｎｍ ３５ ２００ｎｍ ３５ ３ ５０ｎｍ ２３ ４ ５０ｎｍ ２５ ２００ｎｍ ３５ ５ ５０ｎｍ ０ ６ ５０ｎｍ ０ ７ ５０ｎｍ １ ８ ５０ｎｍ １ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ［試験例３］ 各種の製剤投与後の腫瘍中ＣＮＤＡＣ濃
度の測定 実施例１に記載の方法に従い、２００ｍＬナス型フラス
コを使用し、表５に示す処方にてＣＮＤＡＣリポソーム
を製造した。１００ｎｍのエクストルージョンの後、こ
のリポソーム分散液を超遠心分離（１４００００Ｇ×２
０ｍｉｎ．）し、上清を除去して未封入のＣＮＤＡＣを
除去した。分散液の総量が５０ｍＬとなるように１５０
ｍＭ塩化ナトリウム水溶液を加え分散液が均一になるま
で撹袢し、リポソーム化製剤を得た。体積平均粒子径、
多分散指数はそれぞれ１３３．６ｎｍおよび１．４１で
あった。また、分散液中のＣＮＤＡＣ濃度は４．８ｍｇ
／ｍＬ、製造時の処方から計算される脂質濃度は２０５
ｍＭであった。

【００４７】また、ＣＮＤＡＣの水溶液製剤は、ＣＮＤ
ＡＣ濃度が４．８ｍｇ／ｍＬとなるようにＣＮＤＡＣを
１５０ｍＭ塩化ナトリウム水溶液に溶解して製造した。

【００４８】

【表５】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 脂質組成（数字は使用した脂質のμｍｏｌ数を表す。） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 処方 ＤＰＰＣ／ＤＰＰＧ／ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ／コレステロール ＝３１５０／２６２５／５２５／４２００ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ７００ｍｇのＣＮＤＡＣ塩酸塩を含む５％グルコースを
加えて７０ｍＬとした。

【００４９】６週齢のＣＤＦ１マウスの皮下にマウス結
腸ガンｃｏｌｏｎ２６を移植し、１０乃至１４日後に上
で製造したＣＮＤＡＣ製剤をおのおの５０ｍｇ／ｋｇ静
脈投与した。投与して４時間後、採血の後マウスを脱血
死させ腫瘍組織および腎臓を摘出し、その重量を測定し
た。これらの生体試料に０．５乃至３ｍＬの１５０ｍＬ
塩化ナトリウム水溶液を加え、ホジナイゼーションし
た。試験例１と同様にして測定した各ホモジネート中の
ＣＮＤＡＣ濃度、および生体試料と添加した塩化ナトリ
ウム水溶液との重量比から算出した希釈度から各試料中
のＣＮＤＡＣ濃度を求めた。

【００５０】その結果、表６に示すように、リポソーム
化製剤を投与した場合、血液中および腫瘍組織中に高濃
度のＣＮＤＡＣが検出された。一方、水溶液製剤を投与
した場合には、ＣＮＤＡＣは血液中および腫瘍組織中の
いずれにも検出されず、腎臓中に検出された。これらの
結果より、ＣＮＤＡＣは水溶液として投与されたのち速
やかな排泄および／または分解のため、腫瘍組織への蓄
積効率が低いのに対し、リポソーム化されることにより
これらの欠点が改善され、腫瘍組織への蓄積効率が高ま
ることが示された。さらにこの結果は、上記の試験例２
で求められたＣＮＤＡＣの包含率が実用面での要求を満
たすレベルであることを示す。

【００５１】

【表６】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 投与４時間後のＣＮＤＡＣ濃度（μｇ／ｍＬ） 血液中 腫瘍組織中 腎臓中 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− リポソーム化製剤 １８９±９９ １２．２±４．４ ３２．０±２０．８ 水溶液製剤 ０ ０ ４．１± ３．１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００５２】

【発明の効果】本発明において、コレステロールを必須
のリポソーム構成脂質成分として選択することによりＣ
ＮＤＡＣを高濃度に包含するリポソーム化製剤が得られ
た。本発明におけるＣＮＤＡＣのリポソーム化製剤は、
静脈内に投与すると高い血中ＣＮＤＡＣ濃度を持続し、
かつ、ＣＮＤＡＣを効率的に腫瘍組織に送達し蓄積させ
ることを可能とする製剤として有用性が高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 蔵方 慎一 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共株 式会社内 (72)発明者 松田 彰 北海道札幌市北区北24条西12丁目１−７− 501 (72)発明者 佐々木 琢磨 石川県金沢市泉野町４丁目12−５−401

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β
   −Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシンまたはそ
   の薬理上許容される塩を含有することを特徴とするリポ
   ソーム化製剤。
2. 【請求項２】リポソーム構成成分としてコレステロール
   を含有することを特徴とする請求項１に記載のリポソー
   ム化製剤。
3. 【請求項３】リポソームを構成する全脂質成分に対する
   コレステロールの割合が１０乃至６０モル％であること
   を特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム化製
   剤。
4. 【請求項４】リポソーム構成成分として水溶性高分子鎖
   を有する脂質を含有することを特徴とする請求項２に記
   載のリポソーム化製剤。
5. 【請求項５】水溶性高分子鎖を有する脂質がポリエチレ
   ングリコール部分の平均分子量が１０００乃至５０００
   のＮ−モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル
   −ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホス
   ファチジルエタノールアミンである請求項４に記載のリ
   ポソーム化製剤。
6. 【請求項６】リポソームを構成する脂質が、ジ（Ｃ
   _10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファチジ
   ルコリン、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイ
   ル）ホスファチジルグリセロール、コレステロールから
   なる請求項１に記載のリポソーム化製剤。
7. 【請求項７】リポソームを構成する脂質が、ジ（Ｃ
   _10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファチジ
   ルコリン（総脂質に対して２０乃至７０モル％）、ジ
   （Ｃ_{１０−１８}アルカノイルまたはアルケノイル）ホス
   ファチジルグリセロール（総脂質に対して１０乃至４０
   モル％）、コレステロール（総脂質に対して１０乃至６
   ０モル％）からなる請求項１に記載のリポソーム化製
   剤。
8. 【請求項８】リポソームを構成する脂質が、ジラウロイ
   ルホスファチジルコリン（総脂質に対して３０モル
   ％）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（総脂
   質に対して３０モル％）、コレステロール（総脂質に対
   して４０モル％）からなる請求項１に記載のリポソーム
   化製剤。
9. 【請求項９】リポソームを構成する脂質が、ジ（Ｃ
   _{１０−１８}アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファ
   チジルコリン、ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケ
   ノイル）ホスファチジルグリセロール、ポリエチレング
   リコール部分の平均分子量が１０００乃至５０００のＮ
   −モノメトキシポリエチレングリコールサクシニル−ジ
   （Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファ
   チジルエタノールアミン、コレステロールからなる請求
   項１に記載のリポソーム化製剤。
10. 【請求項１０】リポソームを構成する脂質が、ジ（Ｃ
    _10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファチジ
    ルコリン（総脂質に対して２０乃至７０モル％）、ジ
    （Ｃ_10-18アルカノイルまたはアルケノイル）ホスファ
    チジルグリセロール（総脂質に対して１０乃至４０モル
    ％）、ポリエチレングリコール部分の平均分子量が１０
    ００乃至５０００のＮ−モノメトキシポリエチレングリ
    コールサクシニル−ジ（Ｃ_10-18アルカノイルまたはア
    ルケノイル）ホスファチジルエタノールアミン（総脂質
    に対して１乃至１０モル％）、コレステロール（総脂質
    に対して１０乃至６０モル％）からなる請求項１に記載
    のリポソーム化製剤。
11. 【請求項１１】リポソームを構成する脂質が、ジパルミ
    トイルホスファチジルコリン（総脂質に対して３０モル
    ％）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（総
    脂質に対して２５モル％）、ポリエチレングリコール部
    分の平均分子量が２０００のＮ−モノメトキシポリエチ
    レングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチ
    ジルエタノールアミン（総脂質に対して５モル％）、コ
    レステロール（総脂質に対して４０モル％）からなる請
    求項１に記載のリポソーム化製剤。
12. 【請求項１２】リポソームを構成する脂質が、ジミリス
    トイルホスファチジルコリン（総脂質に対して３０モル
    ％）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（総
    脂質に対して２５モル％）、ポリエチレングリコール部
    分の平均分子量が２０００のＮ−モノメトキシポリエチ
    レングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチ
    ジルエタノールアミン（総脂質に対して５モル％）、コ
    レステロール（総脂質に対して４０モル％）からなる請
    求項１に記載のリポソーム化製剤。
13. 【請求項１３】リポソームを構成する脂質が、ジラウロ
    イルホスファチジルコリン（総脂質に対して３０モル
    ％）、ジラウロイルホスファチジルグリセロール（総脂
    質に対して２５モル％）、ポリエチレングリコール部分
    の平均分子量が２０００のＮ−モノメトキシポリエチレ
    ングリコールサクシニル−ジステアロイルホスファチジ
    ルエタノールアミン（総脂質に対して５モル％）、コレ
    ステロール（総脂質に対して４０モル％）からなる請求
    項１に記載のリポソーム化製剤。
14. 【請求項１４】リポソームの体積平均粒子径が５０乃至
    ４００ｎｍであることを特徴とする請求項１乃至１３の
    いずれかに記載のリポソーム化製剤。
15. 【請求項１５】請求項１ないし１４に記載のリポソーム
    化製剤を介して１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−
    β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシンまたは
    その薬理上許容される塩を腫瘍組織に送達する方法。