JPS63221837A - 脂質膜構造体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は脂質膜構造体、更に詳しくはグリコホリン及び
ガングリオシドを含有する脂質膜構造体に関する。

〈産業上の利用分野〉 本発明の脂質膜構造体は肝、牌、肺などの細網内皮系組
織に捕捉されにくく、体内で微小循環性を有し、血中で
の薬物濃度を高く維持することのできる医療上有用なも
のである。

〈従来の技術〉 一般に静脈内投与されたリポソームは、肝臓、肝臓、肺
臓などの細網内皮系組織（以下、ＲＥＳ　）に分布しや
すいことが知られている。この性買はリポソームに限ら
ず脂肪乳剤、エマルシコン製剤、マイクロカプセルなど
に共通のものであり、これは木製剤が生体にとっては非
自己である異物であるための必然的な結果であるともい
える。またこのことが、上記の剤型を静脈内投与などの
全身投与において薬物の放出をコントロールできる徐放
性製剤として利用するのに、大きな障壁となっていると
言っても過言ではない。

従来から、上記製剤が全身投与においても体内で微小循
環性を有するようにする工夫はなされてとている０例え
ばリポソームの場合、他の製剤に比べてサイズのコント
ロールがしやすいことやサイズを小さくできることを利
用し、小さな一枚膜リポソームを用いて肝や牌などのＲ
ＥＳへの分布を抑制させ薬物の血中濃度を高く維持させ
る例［バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ。

７６１、１４２（１９８３）］が報告されている。また
リポソームの場合は、その膜組成を比較的自由に変えら
れることを利用して血中での安定性を向上させ、微小循
環性を有するようにする工夫もなされている。即ち相転
穆温度の高いレシチンを利用する例［バイオケミカルフ
ァーマコロジー、　３２．３３８１（１９８３）］　、
レシチンの代りにスフィンゴミエリンを用いる例［Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、　３
２，６０９（１９８３）］　、膜成分としてコレステロ
ールを添加する例［バイオキミカ・エト・バイオフィジ
カ・アクタ、土、　１４２　（１９８３）］などがある
。

更に近年は赤血球膜由来である糖蛋白質、グリコホリン
が注目され、これをリポソーム膜に再構成すると、リポ
ソームはＲＥＳに存在する貧食細胞に貧食されにくくな
り［砂本順三、第８回生体膜と薬物の相互作用シンポジ
ウム講演要旨系、Ｐ、１９（岡山、１９８５年）］、静
脈内投与すると比較的安定に血中を微小循環できるよう
になる［内海英雄、濱田昭ら、日本薬学会′ｆＳｔｏａ
年会講演要旨集、Ｐ。

３３６（千葉、１９８６年）］と報告されている。

しかしながら以上記した如く静脈内投与した場合でも、
ＲＥＳを回避して血中を微小循環できるリポソーム製剤
の研究は盛んに行われてきているが、その効率の面を考
えると、必ずしもその目的が充分に達成されたとは言い
難い現状にある。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明者等は、効率的にかつ再現性よく、肝、牌、腫な
どの細網内皮系組織に捕捉されずに体内を微小循環でき
る脂質膜構造体について鋭意検討した結果、本発明を完
成した。

〈発明の構成〉 本発明はグリコホリン及びガングリオシドを含有する脂
質膜構造体に関する。

本発明にかかわるグリコホリンとは、シアロ糖蛋白質で
あり一般には動物の赤血球膜から抽出して得られる。赤
血球としてはヒト、ブタ、ウマ、イヌ由来のものなどが
あげられるが、本脂質膜構造体を臨床の場でヒトに投与
する場合にはヒト赤血球由来のグリコホリンを、動物薬
として動物に投与する場合にはその動物由来のグリコホ
リンを用いることが望ましい。またヒト赤血球グリコホ
リンの場合には、現在その蛋白質部分のアミノ酸配列の
違いによりグリコホリンＡ１グリコホリンＢ１グリコホ
リンＣの３種が同定されているが、本発明においてはそ
れらを単独で用いても良く、又、それらの混合物を用い
ても良い。

ガングリオシドとは、シアロ糖脂質であり！！鎖端にシ
アル酸を有するガングリオシドＧＭ、。

０Ｍ２　　、　０Ｍ３　　、　　ＧＤｌａ　％　　ＧＤ
ｌｂ　　　、　　　ＧＤ３　　、ＧＱｌｂ、ＧＴｌｂな
どが例としてあげられるが、これらを単独でもしくは混
合物として用いればよい。

本発明にかかわる脂質膜構造体としては極性脂質の極性
基が界面の水相に向って配列した膜構造を有する粒子を
意味し、その例としてはリポソーム、マイクロエマルジ
ョン、脂肪乳剤等があげられる。

本発明のグリコホリン及びガングリオシドを含有する脂
質膜構造体の調製は公知の方法に従えばよい。即ちグリ
コホリン及びガングリオシドを、分子内に極性部及び非
極性部を有し水及び油のいずれにも親和性を有する両親
媒性物質である他のと 脂質膜成分をともに脂質膜構造体調製時にあらかしめ溶
媒に溶解または分散混合して用いればよい。

例えばリポソームの場合、ホスファチジルコリン、スフ
ィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン等の
リン脂質やジアルキル型合成界面活性剤等の膜形成主成
分物質とグリコホリン及びガングリオシドとをあらかじ
め混合し、これを公知の〔アニュアル・レビュー・才ブ
・バイオフィジックス・アンド・バイオエンジニアリン
グ９゜４ａ７（１９８０）　］　　リポソームの調製法
に従い処理することにより目的のリポソームを製造する
ことができる。かかるリポソームは他の膜成分物質に膜
安定化剤としてコレステロール、コレスタノール等のス
テロール類、ジアルキルホスフェート、ジアシルホスフ
ァチジン酸、ステアリルアミン等の荷電物質及びα−ト
コフェロール等の酸化防止剤等を含んでいても良い。

マイクロエマルジョンの場合、ポリオキシエチレンソル
ビタン脂肪酸エステル（Ｔｗｅｅｎ）　、脂肪酸ナトリ
ウム、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油等の界面活性
物質とグリコホリン及びガングリオシドとをあらかじめ
混合し、これに大豆油等の油脂を加えて公知のマイクロ
エマルジョンの調製法に従い処理することにより目的の
マイクロエマルジョンを製造することができる。

また、脂肪乳剤の場合、ホスファチジルコリンとグリコ
ホリン及びガングリオシドとをあらかじめ混合し、これ
に大豆油を加えて公知の脂肪乳剤の調製法に従い処理す
ることにより目的の脂肪乳剤を製造することができる。

このようにして調製される本発明の脂質膜構造体が、Ｒ
ＥＳを回避し、血中での微小循環性を有するようにする
には、通常その調製工程において、グリコホリンの全脂
質膜成分に対する割合を、重量分率で１／１００以上に
することが望ましく、またガングリオシドは、グリコホ
リンに対して、重量比で０．０２〜２倍量にすることが
望ましい。

本発明の脂質膜構造体が保持しうる薬物は脂質膜構造体
の種類によって異なる０例えばリポソームが保持しうる
ものとしては特に制限がなく、水溶性薬物及び脂溶性薬
物をあげることができる。

またマイクロエマルジョンの場合には脂溶性薬物を保持
可能なものとしてあげることができ、中で；己 も体内での代謝分解が速い薬物、尿中排巷が速い薬物な
ど体内で有効に薬効を発現しにくいものが本発明の脂質
膜構造体に保持させる薬物として適当と考えられる。具
体的にはインターフェロン、インターロイキン、ＭｆＩ
Ｉｉ壊死因子（ＴＮＦ）　、上皮成長因子（ＥＧＦ）　
、エリスロボエチンなどの生理活性物質、プロスタグラ
ンジン、ステロイドなどのホルモン類、シトシンアラビ
ノシドなどの制癌剤等が適当な薬物としてあげられる。

本発明の脂質膜構造体において、グリコホリン及びガン
グリオシドは脂質膜構造体に疎水性相互作用を介して強
固に結合して組込まれており、またモノマーとして遊離
するものはほとんどないことをゲル濾過法により確認し
た。

〈発明の効果〉 本発明の脂質膜構造体は、優れた体内での微小循環性を
有し、血中での薬物濃度を高く維持することができ、か
つ再現性よく調製することができる。また従来の技術に
おいて、全身投与後ＲＥＳを回避して体内を微小循環さ
せる新しい剤形の試みはリポソームにおいてのみ行われ
ていたが、本発明においては、リポソームのみならず脂
肪乳剤、マイクロエマルジョン等にも体内での微小循環
性を付与することができる。

更に本発明の脂質膜構造体は、静脈内投与などの全身投
与において微小循環性を宥することができるが、皮下注
射、筋肉内注射、関節腔内注射などにおいては本脂賀膜
構造体が体液中において安定であることを利用し局所投
与における徐放性製剤として使用することも期待できる
。

〈実施例〉 本発明を更に対照例、実施例及び試験例により説明する
が、本発明はこれらによって限定されるものではない。

対照例Ｉ し−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン６０μｍ
ａｔ　、コレステロール６０μｍｏｌ及びＬ−α−ジパ
ルミトイルホスファチジン酸６μｍｏｌをクロロホルム
及びメタノールの混液（容積比２：１）に溶かした０次
に窒素ガス気流中で有機溶媒を除去してナス型コルベン
のガラス壁に１ｉｐｉｄ　ｆｉｌｍ　　を生成させた。

ここに３トイヌリン３００μＣｉを含有するｌ　ｍＭイ
ヌリンのリン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７，４以下ＰＢ
Ｓと略す）溶液７．５　　ｍｆＬを加えてポルテックス
・ミキサーで攪拌振盪し、更に軽く超音波処理してリポ
ソームの懸濁液を調製した。これを４θ〜４５℃に加温
し、次いで０．４μｌの孔径を有するポリカーボネート
製メンブランフィルタ−に通過させ、粒径０．２μｍ以
下のリポソームの懸濁液を調製した０次にこれを超遠心
分離（１５万×ｇ、１時間、２回）し、上澄みを除去す
ることによりリポソームに保持されなかったイヌリンを
除去し、ＰＢＳを加えて最終的にイヌリンをその内水相
に保持するリポソーム懸濁液を得た。この時ＰＢＳは、
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリンのコリン
基を酵素法により定量することによりホスファチジルコ
リン濃度が６０μｍｏｌ　／７．５　ｍｊＥ−８ｕｍａ
ｔ／　ｍｕとなるように、量を加減して加えた。

対照例２ 対照例１の脂質に更にヒト赤血球由来グリコホリンＡを
６μｇ加えて、これをクロロホルム、メタノール及び水
の混液（容積比１５０ニア５：１）に分散溶解させる以
外は対照例１と同様に操作し、最終的にホスファチジル
コリン濃度が８μｍｏｌ／　ｍｊ２となるリポソーム懸
濁液を得た。

対照例３ ヒトグリコホリンＡ６μｇの代りにヒトグリコホリンＡ
１５μｇを用いる以外は対照例２と同様に操作し、リポ
ソーム懸濁液を得た。

対照例４ し−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン６０μｍ
０１、コレステロール６０μｍｏｌ及びヒトグリコホリ
ンＡ　３ｍｇをクロロホルム、メタノール及び水の混液
（容積比１５０ニア５：１）に分散溶解させる以外は対
照例１と同様に操作し、最終的にホスファチジルコリン
濃度が８μｍｏｌ／　ｍｆＬとなるリポソーム懸濁液を
得た。

対照例５ ヒトグリコホリンＡ３ｒｓｇの代りにヒトグリコホリン
Ａ９ｍｇを用いる以外は対照例４と同様に操作し、リポ
ソーム懸濁液を得た。

上記対照例１〜５の処方を以下の表１に示す。

参考例１ 前述の３Ｈ−イヌリン３００μＣｉを含有する１ｍＮ１
イヌリンのＰＢＳ溶液７．５ｍλの一部をとり、ＰＢＳ
にて２０倍に希釈して、１　　ｍｌＬあたり２μＣｉの
イヌリンを含有する溶液を調製した。

対照例６ スフィンゴミエリン８４μｍｏｌ　、コレステロール３
６μｍｏｌ　、　Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジ
ン酸１２μｍｏｌをクロロホルム及びメタノールの混液
（容積比２：１）に溶かすこと以外は対照例１と同様に
操作し、最終的にスフィンゴミエリン濃度が１１．２μ
ｍｏｌ／　ｍＩＬとなるリポソーム懸濁液を得た。

対照例７ Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジン酸１２μｍｏｌ
の変わりにヒトグリコホリンＡ３ｍｇを用いて、これを
クロロホルム、メタノール及び水の混液（容積比１５０
ニア５：１）　に分散溶解させる以外は対照例６と同様
に操作し、リポソーム懸濁液を得た。

対照例８ 対照例６の脂質に更にガングリオシドＧＭｊを０．５４
μｍｏｌ加える以外は対照例６と同様に操作し、リポソ
ーム懸濁液を得た。

実施例１ 対照例７の脂質に更にガングリオシドＧＭｓを０．５４
μｍｏｌ加える以外は対照例７と同様に操作し、リポソ
ーム懸濁液を得た。

上記対照例６〜実施例１の処方を以下の表乏に示す。

対照例９ Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン８４μｍ
０１、コレステロール３６μｍｏｌ　、Ｌ−α−ジパル
ミトイルホスファチジン酸１２μｍｏｌをクロロホルム
及びメタノールの混液（容積比２：１）に溶かすこと以
外は対照例１と同様に操作し、最終的にホスファチジル
コリン濃度が１１．２μｍａｔ／　ｍｆｌとなるリポソ
ーム懸濁液を得た。

対照例１Ｏ Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジン酸１２μｍｏｌ
の代わりにヒトグリコホリンＡ３ｆｆ１ｇを用いて、こ
れをクロロホルム、メタノール及び水の混液（容積比１
５０ニア５：１）に分散溶解させる以外は対照例９と同
様に操作し、リポソーム懸濁液を得た。

対照例１１ 対照例９の脂質に更にガングリオシドＧＭ３を０．５４
μｌｌ１ｏｌ加える以外は対照例９と同様に操作し、リ
ポソーム懸濁液を得た。

実施例２ 対照例１Ｏの脂質に更にガングリオシドＧＭ３を０．５
４μｍｏｌ加える以外は対照例１０と同様に操作し、リ
ポソーム懸濁液を得た。

上記対照例９〜実施例２の処方を以下の表３に示す。

試験例１ 対照例！、２，３，４．５　　で得られたリポソームの
懸濁液並びに参考例１で得られた３日−イヌリン溶液を
それぞれＳＤ系雌雄性ラット体重１８０〜２２ｏｇ）の
後肢静脈内に体重２００ｇあたり０．５　　ｒｎＪｌ（
Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリンとして４
μｍｏｌ、全脂質として約８μｍｏｌ）注入した。投与
後１５分、３０分、２時間、４時間、６時間口に頚静脈
より血液を約０．１２　ｒｎλ採血し、このうち５０μ
ｍ２　（ｎ−２）を濾紙に滴下、乾燥後燃焼装置にて燃
焼後液体シンチレーション法によりその放射活性を求め
た。投与量に対する血中からの回収率（豹はラットの全
血液量を体重の６．５％とみっもって計算した。結果を
表４に示した。

表４から明らかなようにグリホリン単独の添加量を増す
ほどイヌリンは血中濃度が高く維持されることが明らか
となり、その効果には飽和が認められ、脂質（ホスファ
チジルコリン＋コレステロール）２０μｍｏｌあたりグ
リコホリンを５００μｇ以上添加してもそれ以上の効果
は望めないことが確認された。

また同時に投与６時間後、ラットの頚動脈を切断放血さ
せ開腹後、肝臓、肺臓、腎臓及び肺臓を摘出した０次に
これら臓器の一部または全部をとり、ＰＢＳ中でホモジ
ェナイズしたのち液体シンチレーション法により放射活
性を測定、投与量に対する回収率（豹を求めた。結果を
表５に示した。

表５から明らかなようにグリコホリン添加量を増すほど
イヌリンの肝への分布は抑制されるが、その効果には飽
和が認められ、脂質（ホスファチジルコリン＋コレステ
ロール）２０μｍｏｌあたりグリコホリンを５００μｇ
以上添加してもそれ以上の効果は望めないことが確認さ
れた。

なお本発明において用いたイヌリンは、単独で静脈内投
与した場合には速やかに血中より消失し尿中へ排泄され
てしまうことが知られており、本試験（参考例１）にお
いてもそれが確認された。

以上から、リポソーム膜表面をグリコホリンで膜修飾す
ることにより、ある程度はリポソームに微小循環性を付
与し肝臓への分布を抑制させることができることが明ら
かとなり、グリコホリン単独ではその効果に限界のある
ことも明らかとなった。

試験例２ 対照例６，７．８並びに実施例１で得られたリポソーム
懸濁液をそれぞれＳＤ系雌雄性ラット体重１８０〜２２
０ｇ）　ノ後肢静脈内に体］１２００ｇあたり０．５ｍ
ｊ！（スフィンゴミエリンとして５．６　μｍｏｌ、全
脂質として約８μｍｏｌ）注入する以外は試験例１と同
様に操作した。

結果を表６（イヌリンの血中濃度推移）及び表７（イヌ
リンの組織分布）に示した。

表６から明らかなように血中（４度を高く維持する効果
はガングリオシド単独修飾リポソーム（対照例８）くグ
リコホリン車独修価リポソーム（対照例７）くグリコホ
リン及びガングリオシド修飾リポソーム（実施例１）で
あった。

また表７から明らかなようにＲＥＳへの分布抑制効果を
検討すると本発明のグリコホリン及びガングリオシド修
飾リポソームが有意差（１％危険率）をもって肝への分
布抑制効果を有することが認められた。

以上から、グリコホリンに加えて更に糖脂質であるガン
グリオシドをリポソーム膜に添加することによりリポソ
ームの肝への分布を抑制し、薬物の血中濃度を更に高く
維持することが可能であることが確認された。

試験例３ 対照例９．１０．１１並びに実施例２で得られたリポソ
ーム懸濁液をそれぞれＳＤ系雌雄性ラット体重１８０〜
２２ｏｇ）の後肢静脈内に体重２００ｇあたり０．５ｍ
Ａ　（Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリンと
して５．６μＩＩＩｏｌ、全脂質として約８μｍｏｌ）
注入する以外は試験例１と同様に操作した。

結果を表８（イヌリンの血中濃度推８）及び表９（イタ
リンの組織分布）に示した。

表８から明らかなように血中濃度を高く維持する効果は
、グリコホリン単独修飾リポソーム（対照例１０）＜グ
リコホリン及びガングリオシド修飾リポソーム（実施例
２）であり、更にこの両者間には有意差（１％危険率）
が認められた。ガングリオシド単独修飾リポソーム（対
照例１１）の場合には、むしろコントロールリポソーム
（対照例９）よりも薬物の血中消失が速くなる結果が得
られた。従フて試験例２の結果と併せて考えると、ガン
グリオシド単独修飾リポソームは微小循環性を有するも
のではない。

また表９から明らかなように肝への分布抑制効果を検討
すると、その効果はガングリオシド単独修飾リポソーム
（対照例１１）＜グリコホリン単独修飾リポソーム（対
照例１０）＜グリコホリン及びガングリオシド修飾リポ
ソーム（実施例２）であり、グリコホリン及びガングリ
オシドが共存することにより本効果が確実に得られるこ
とがわかった０本試験例では肝臓への分布がグリコホリ
ン単独修飾リポソーム（対照例１０）とグリコホリン及
びガングリオシド修飾リポソーム（実施例２）でコント
ロールリポソームの場合より若干増す（有意差もあり）
結果となったが、肝臓、肺臓、腎臓、肺臓を全て含めた
ＲＥＳ全体への分布としてみれば、グリコホリン単独修
飾リポソーム（対照例１０）やグリコホリン及びガング
リオシド修飾リポソーム（実施例２）は分布が抑制効果
を有することは明らかであり、その効果は後者が大であ
った。

以上から試験例２と同様、グリコホリンに加えてガング
リオシドをリポソーム膜に添加することにより、リポソ
ームのＲＥＳへの分布を抑制し薬物の血中濃度を高くす
ることが可能であることが確認された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. グリコホリン及びガングリオシドを含有する脂質膜構造
   体。