ES2323493T3 - Liposomas. - Google Patents
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Abstract
Un liposoma que comprende: i) un fosfolípido neutro, ii) un fosfolípido cargado negativamente, iii) un esterol, teniendo un compuesto modificador atrapado en la fase interna de dicho liposoma; en el que el compuesto modificador es un compuesto que puede modificar químicamente de forma irreversible un material interiorizable dentro de dicho liposoma tras la difusión de dicho material a través de la bicapa fosfolipídica de dicho liposoma, de forma que el material químicamente modificado de forma irreversible permanece interiorizado dentro de dicho liposoma, y; en el que el fosfolípido neutro está presente al 60-90 por ciento en moles del contenido de lípidos totales, el fosfolípido cargado negativamente está presente al 2-20 por ciento en moles del contenido de lípidos totales y el esterol está presente al 5-25 por ciento en moles del contenido de lípidos totales.
Description
Liposomas.
Esta invención se refiere a liposomas de una
composición bicapa específica que contiene un compuesto modificador
atrapado en su fase interna, pudiendo dicho compuesto modificador
modificar químicamente material posteriormente interiorizado, de
forma que dicho material permanece interiorizado dentro de los
liposomas. Para la interiorización son adecuados una variedad de
materiales; sin embargo, los liposomas de la invención son
particularmente adecuados para la interiorización de quelatos
metálicos. Los liposomas son útiles para obtener imágenes de
infección, inflamación o tumor en seres humanos y para la
administración eficaz de principios activos.
Los liposomas son vesículas que están
constituidas por una bicapa fosfolipídica que encierra un interior
acuoso. La encapsulación de material en el interior acuoso permite
la acumulación de ese material en tejidos diana y disminuye su
dispersión a tejidos no diana en los que puede ocasionar daños. Esto
es un mecanismo especialmente útil en el que el material es un
fármaco con efectos secundarios tóxicos. Los liposomas son un
sistema de administración común para tales fármacos; por ejemplo,
el fármaco terapéutico contra el cáncer epipodofilotoxina produce
leucopenia, trombocitopenia y anemia si se administra
sistémicamente. El documento WO 00/09071 1 desvela una preparación
liposómica de epipodofilotoxina como un medio para evitar estos
efectos secundarios sistémicos. Similarmente, el documento WO
96/17596 desvela una composición liposómica que comprende interferón
\alpha, y el documento WO 92/02208 desvela una composición
liposómica que comprende doxorubicina.
Los liposomas también son de interés
considerable debido a su valor como vehículos para agentes de
diagnóstico. Ejemplos son agentes de diagnóstico para la obtención
de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión
de fotón único (SPECT), ultrasonidos y rayos X. Los radiofármacos
para los estudios de obtención de imágenes por marcadores y SPECT
son de interés particular. Se han evaluado diversos medios y en la
bibliografía científica pueden encontrarse explicaciones detalladas
de liposomas de radiomarcado.
El radiomarcador más común usado hoy en día en
la medicina nuclear de diagnóstico es ^{99m}Tc. Este radiomarcador
se produce a partir de la descomposición beta del
molibdeno-99 (^{99}Mo) y tiene un periodo de
semidesintegración de 6 horas. Está ampliamente disponible a bajo
coste a partir de un sistema generador y su periodo de
semidesintegración relativamente corto proporciona una manipulación
más segura y más cómoda que otros radiomarcadores disponibles. Su
emisión gamma es 141 keV, que es ideal para producir imágenes de
alta resolución. El ^{99}TcO_{4}^{-} se produce a partir de
un generador y, debido a que es relativamente poco reactivo, debe
reducirse a un estado de oxidación más bajo antes de usarse como
radiofármaco. El cloruro estannoso es el agente reductor más
comúnmente usado. La incubación de liposomas con disolución de
^{99m}TcO_{4}^{-} y cloruro estannoso se ha evaluado como un
medio para liposomas radiomarcados. La eficiencia de radiomarcado de
ese procedimiento no fue reproducible, y la eliminación del agente
reductor en exceso, el pertecnetato libre y el coloide de
^{99m}Tc-SnCl_{2} fueron problemas (Barratt,
G.M. Tüzel, N.S. y Ryman, B.E. Liposome Technology Volumen II,
Gregoridas, G. Ed, CRC Press, Boca Raton, (1984)). En este
documento también se notificó que el ^{99m}Tc se liberaba de
liposomas tanto in vitro como in vivo. Estos asuntos
dieron como resultado liposomas de utilidad limitada para muchas
aplicaciones.
Se mostró que el
octadecilamina-DTPA incorporado en liposomas marca
rápida y eficazmente liposomas con ^{67}Ga o ^{99m}Tc mediante
quelación, pero más del 30% del marcador se perdió después de una
incubación de 2 horas en plasma.
Las vesículas lipídicas multilaminares marcadas
con ^{111}In usando 8-hidroxiquinolina mostraron
una eficiencia de marcado del 30% (Caride, V.J. y Sostman, H.D. en
Liposome Technology Volumen II, Gregoridas, G. Ed, CRC Press, Boca
Raton, (1984)). La acetilacetona, un agente quelante lipófilo
soluble en agua, puede complejarse con ^{111}In. Entonces, éste
se mezcla con ácido nitriloacético encapsulado en liposomas con la
posterior formación de ácido nitriloacético marcado. Los liposomas
marcados resultantes son inestables, a menos que la acetilacetona
en exceso se elimine mediante un procedimiento de intercambio iónico
(Beaumier, P.L. y Hwang, K.J. J. Nuc. Med. 23,
810-815 (1982)).
Otro procedimiento para preparar liposomas
marcados con ^{99m}Tc implica la incubación de liposomas con un
radiomarcador en forma de un complejo que actúa de vehículo para el
radiomarcador. Un procedimiento tal se desveló a principios de los
90 (Phillips, W.T. y col., Nuc. Med. Biol. 19,
539-547 (1992); documento US 5143713). El vehículo
preferido es
hexametilenpropilen-amina-oxima
(HMPAO), que está marcada con ^{99m}Tc y se incuba con liposomas
a temperatura ambiente con el fin de producir liposomas
radiomarcados. El complejo ^{99m}TcHMPAO es lipófilo y, por
tanto, se cree que entra en los liposomas mediante difusión pasiva a
través de la bicapa lipídica. Se cree que el
^{99m}Tc-HMPAO atraviesa fácilmente las membranas
de liposomas cargados negativamente. Los liposomas cargados
negativamente del documento US 5143713 tienen una composición
lipídica en una relación molar de fosfolípido
neutro:colesterol:fosfolípido cargado
negativamente:\alpha-tocoferol de 10:9:1 (Ejemplo
1, textual). Se cree que el antioxidante atrapado dentro de
los liposomas convierte el ^{99m}Tc-HMPAO
lipófilo en una forma hidrófila que permanece en la fase acuosa
interna del liposoma. Sin embargo, los liposomas sólo están
eficazmente radiomarcados si el antioxidante permanece químicamente
estable y atrapado dentro de los liposomas.
Los estudios han revelado una estabilidad en
almacén limitada de estas suspensiones de liposoma debido a la
labilidad química del reductor glutatión (Goins y col., J. Liposome
Res. 8, 265, 1998).
Los usos clínicos de liposomas radiomarcados son
muy conocidos en la técnica. Se han propuesto varias aplicaciones
en la medicina nuclear para liposomas, incluyendo la obtención de
imágenes de tumores, la obtención de imágenes de infecciones e
inflamaciones y la obtención de imágenes de conjuntos de sangre.
Estudios biológicos previos usaron liposomas
multilaminares mayores, que predominantemente se eliminaron del
conjunto de sangre en las células fagocíticas mononucleares del
hígado y el bazo (Morgan, J.R. y col., J. Med. Microbiol. 14,
213-217 (1981)). También se mostró que el
procedimiento de marcado era inestable, dando como resultado una
pérdida excesiva de marcador de los liposomas. Esta inestabilidad se
vio claramente en imágenes de ratas infectadas con una alta
excreción urinaria de ^{99m}Tc libre. Un trabajo más reciente ha
usado liposomas que se han procesado a un tamaño que minimiza la
captación en el sistema de fagocitos mononucleares, alargándose así
el tiempo de circulación en la sangre. Un estudio en ratas
infectadas por S. aureus demostró que los abscesos se
vieron fácilmente en el plazo de 2 horas desde la inyección de
liposomas con ^{99}Tc con una relación de diana respecto a fondo
de 2,9 \pm 0,3; aumentando a 6,9 \pm 1,1 en 24 horas (Goins, B.
y col. J. Nuc. Med. 34, 2160-2168 (1993)). Los
liposomas se marcaron usando el procedimiento del vehículo de
HMPAO, pareció que el procedimiento de marcado era estable in
vivo debido a la baja excreción urinaria de ^{99m}Tc durante
un periodo de 24 horas. Los liposomas usados comprendieron diversos
lípidos tales como diestearoilfosfatidilcolina (DSPC),
dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y colesterol. Se estudiaron
tanto liposomas de
DSPC:colesterol:DMPG:\alpha-tocoferol cargados
negativamente (relación molar 50:38:10:2) como de
DSPC:colesterol:\alpha-tocoferol neutros (relación
molar 66:32:2). Los liposomas fueron sumamente unilaminares y
tenían un diámetro medio de aproximadamente 155 nm. Los tumores
pudieron distinguirse de la actividad muscular de fondo 4 horas
post-inyección. El estudio también encontró que los
liposomas neutros tenía un aumento de la captación en el tumor y
una disminución de la captación no específica por el sistema de
fagocitos mononucleares en comparación con los liposomas cargados
negativamente.
Por las vesículas fosfolipídicas que están en
fase gel a temperatura fisiológica e inferior se sabe que la
inclusión de colesterol fluidiza las membranas. Por otra parte, tal
fluidización se desea para la difusión de material a través de la
bicapa lipídica. En cambio, no se desea en el contexto de retener
compuestos atrapados dentro de liposomas preformados. Una
consideración adicional en la determinación del contenido óptimo de
colesterol es el efecto en la biodistribución. Hace algunos años se
reconoció que el tiempo de circulación prolongado ampliaría las
aplicaciones clínicas de liposomas radiomarcados, por ejemplo la
obtención de imágenes de tumores e inflamaciones/infecciones. Se ha
mostrado que el contenido de colesterol es un factor que influye en
la biodistribución y la cinética de eliminación en la sangre; el
efecto fluidizante del colesterol hace que la superficie de la
membrana del liposoma sea menos susceptible a la adsorción de
proteínas (es decir, grado reducido de opsonización). Por ejemplo,
los liposomas unilaminares ricos en colesterol de aproximadamente
185 nm de diámetro se probaron en ratas con infección focal por
S. aureus (Goins, B. y col., J. Nuc. Med. 34,
2160-2168 (1993)). Los liposomas contenían lípidos
en la relación molar
DSPC:colesterol:DMPG:\alpha-tocoferol,
50:38:10:2. Estos liposomas mostraron una semivida circulatoria de
10 horas en ratas, que era considerablemente más larga que la
encontrada para formulaciones previas. Con esta formulación se
documentaron relaciones de abscesos respecto a músculo de hasta 35.
En otro estudio se encontró que los liposomas que contenían DSPC y
20 por ciento en moles de colesterol tenían una semivida
circulatoria de 30 minutos en ratones, a diferencia de las 5 horas
para liposomas con DSPC y 30 por ciento en moles de colesterol
(Semple, S.C. y col. Biochemistry, 35, 2521- (1996)). Basado en las
enseñanzas de la técnica anterior, la elección del contenido de
esteroles que asegura tanto la conservación de características
fisicoquímicas preferidas, además de la
biodistribución/farmacocinética in vivo, no está nada
clara.
Los liposomas preformados que se marcan por el
usuario final deben poder almacenarse a largo plazo de forma que se
conserven las propiedades fisicoquímicas de los liposomas requeridas
para el marcado y el posterior uso in vivo.
La liofilización en presencia de azúcares
sencillos es un medio posiblemente valioso para preparar liposomas
de una forma adecuada para el almacenamiento a largo plazo. Los
estudios han mostrado que los liposomas pueden liofilizarse en
presencia de sacarosa externa y posteriormente rehidratarse sin
cambio de su tamaño (Tilcock, C. y col., Biochim. Biophys. Acta,
1148, 77-84 (1993)). Otro estudio analizó la
concentración óptima de sacarosa para la liofilización (Szucs, M. y
Tilcock, C. Nucl. Med. Biol. 22, 263-268 (1995)). Se
encontró que con sacarosa 300 mM el diámetro promedio y la
distribución de tamaño no fueron significativamente diferentes antes
de la liofilización y después de la rehidratación. Los liposomas de
estos estudios se marcaron en la superficie con ^{99}Tc tras la
rehidratación, un procedimiento que se encontró que da como
resultado una fuga de ^{99m}Tc in vivo.
Por tanto, existe la necesidad de liposomas que
(1) retengan material interiorizado en su forma química original
durante el almacenamiento a largo plazo, (2) retengan su tamaño
inicial durante el almacenamiento a largo plazo, (3) puedan
cargarse con un material interiorizable, incluso tras el
almacenamiento a largo plazo, y (4) puedan usarse para la obtención
de imágenes de diagnóstico de infección, inflamación y tumores, o
para la administración eficaz de principios activos. Un objeto es
de esta invención es proporcionar tales liposomas. Las propiedades
fisicoquímicas más decisivas a considerar para el liposoma de la
invención son tamaño del liposoma, retención del material atrapado
y estabilidad del contenido del liposoma. Además, estos liposomas
también son adecuados para la interiorización de ciertos agentes de
contraste de MRI, además de profármacos que se convierten
químicamente en compuestos terapéuticos útiles una vez están dentro
de los liposomas.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona liposomas novedosos que pueden cargarse con un material
interiorizable para proporcionar liposomas adecuados para obtener
imágenes de infección, inflamación y tumor, además de para la
administración de fármacos. La composición da como resultado
liposomas que son fisicoquímicamente robustos y que retienen el
material atrapado en su forma química original tanto durante el
procesamiento, por ejemplo la deshidratación, como durante el
almacenamiento prolongado.
Los liposomas de la presente invención
comprenden:
- un fosfolípido neutro,
- un fosfolípido cargado negativamente,
- un esterol,
- teniendo un compuesto modificador atrapado en la fase interna de dicho liposoma;
en los que el compuesto modificador es un
compuesto que puede modificar químicamente de forma irreversible un
material interiorizable dentro de dicho liposoma tras la difusión de
dicho material a través de la bicapa fosfolipídica de dicho
liposoma, de forma que el material químicamente modificado de forma
irreversible permanece interiorizado dentro de dicho liposoma,
y;
en los que el fosfolípido neutro está presente
al 60-90 por ciento en moles del contenido de
lípidos totales, en los que el fosfolípido cargado negativamente
está presente al 2-20 por ciento en moles del
contenido de lípidos totales y el esterol está presente al
5-25 por ciento en moles del contenido de lípidos
totales.
Un "compuesto modificador" se define
en la presente invención como un compuesto que puede modificar
químicamente de forma irreversible material que se ha interiorizado
dentro de liposomas preformados de forma que dicho material
permanece interiorizado dentro del liposoma. El compuesto
modificador está entrapado dentro de los liposomas durante su
preparación e idealmente permanece sustancialmente atrapado, además
de químicamente invariable, durante la preparación para el
almacenamiento prolongado y durante periodos de almacenamiento
prolongados. Tras tal almacenamiento prolongado, los liposomas
puede usarse adecuadamente para interiorizar material mediante
difusión de dicho material a través de la bicapa fosfolipídica,
seguido de la modificación química del material dentro de los
liposomas. La modificación química inducida por el compuesto
modificador es adecuadamente una modificación que es irreversible y
que previene que el material interiorizado difunda fuera de los
liposomas. Las modificaciones fuera del alcance de la presente
invención son reacciones químicas reversibles, por ejemplo
reacciones de protonación, como se usan en la carga de fármacos a
distancia mediada por el pH en liposomas.
Los compuestos modificadores adecuados de la
presente invención incluyen reactivos químicos tales como oxidantes,
reductores o agentes transquelantes. Los reductores preferibles de
la invención son los antioxidantes ácido ascórbico, glutatión y
cisteína. Un compuesto modificador antioxidante más preferido es el
glutatión. El compuesto modificador permanece atrapado dentro de
los liposomas de la invención durante periodos de almacenamiento
prolongados en su forma química original. Así se permite el paso
transmembrana eficaz y la carga del material interiorizable en
dichos liposomas tras el almacenamiento prolongado de los liposomas.
Los requisitos contradictorios de retener el compuesto modificador
atrapado tanto durante la preparación para el almacenamiento a largo
plazo como durante el almacenamiento a largo plazo, a la vez que se
permite el paso transmembrana posterior y la interiorización de
material, se satisfacen usando las composiciones de bicapa lipídica
de la presente invención.
La estabilidad del compuesto modificador puede
ser dependiente del pH. Por tanto, una característica adicional de
la presente invención es un ajuste de la composición de las fases
acuosas intraliposómicas y extraliposómicas. Por ejemplo, si el
compuesto modificador es glutatión, el pH intraliposómico está
preferentemente entre 3 y 6 para minimizar la oxidación y la
hidrólisis del glutatión. El pH intraliposómico preferido puede
lograrse usando sistemas de tamponamiento. La fase interna
preferida son disoluciones de sacarosa tamponadas con fosfato o
citrato-fosfato. La fase externa preferida para la
conservación satisfactoria de las propiedades fisicoquímicas
durante la preparación para el almacenamiento a largo plazo es una
disolución de sacarosa sin tampón.
El material adecuado para la interiorización en
los liposomas de la invención puede ser un agente de obtención de
imágenes de SPECT radiactivo, un agente de contraste de MRI, un
agente de contraste de rayos X o un profármaco. Un profármaco
adecuado es uno que puede difundir pasivamente a través de la bicapa
lipídica del liposoma de la invención y se convierte adecuadamente
en el fármaco correspondiente con la interiorización. Dicho fármaco
no difunde adecuadamente a través de la membrana del liposoma. Los
materiales preferidos para la interiorización son compuestos
radiactivos, compuestos paramagnéticos y compuestos radiopacos. La
interiorización de tales materiales produce liposomas que son
adecuados para la obtención eficaz de imágenes de infección,
inflamación y tumor en seres humanos. Los materiales más preferidos
de la invención son quelatos metálicos, en los que el metal de
dichos quelatos metálicos se elige adecuadamente de un radiometal,
un metal paramagnético o un metal radiopaco. Los radiometales
preferidos son ^{99m}Tc y ^{111}In, los metales paramagnéticos
adecuados son gadolinio y manganeso y un metal radiopaco adecuado
es tungsteno. Un radiometal más preferido es ^{99m}Tc, siendo el
quelato metálico preferido ^{99m}Tc-HMPAO.
\global\parskip0.930000\baselineskip
El "contenido de lípidos totales" se
define en la presente invención como la suma en moles de todos los
componentes lipídicos presentes en la bicapa lipídica de los
liposomas. Estos componentes lipídicos son los diversos fosfolípidos
más el esterol. La cantidad de cada componente lipídico presente en
la bicapa lipídica de los liposomas se expresa en términos de
porcentaje en moles del contenido de lípidos totales, es decir, el
contenido de lípidos totales se corresponde por tanto con el 100%
en moles.
El fosfolípido neutro está preferentemente
presente entre el 70 y el 85 por ciento en moles del contenido de
lípidos totales. El fosfolípido cargado negativamente esté
preferentemente presente entre el 5 y el 10 por ciento en moles del
contenido de lípidos totales. Una realización preferida es liposomas
con una composición bicapa en la que el esterol está presente entre
el 10 y el 25 por ciento en moles del contenido de lípidos
totales.
El componente de esterol en los liposomas de la
presente invención es adecuadamente colesterol o sus derivados, por
ejemplo ergosterol o hemisuccinato de colesterol, pero es
preferentemente colesterol. El esterol está presente en una
cantidad que tanto (1) permite la máxima retención del compuesto
modificador atrapado como (2) minimiza las alteraciones en las
propiedades fisicoquímicas (por ejemplo, tamaño del liposoma y
distribución de tamaño) durante la preparación para el
almacenamiento a largo plazo, a la vez que (3) permite el paso de
material en la fase interna del liposoma, incluso después de
periodos de almacenamiento prolongados. El ejemplo 1 muestra que
los liposomas de DSPC:DMPG:colesterol (relación molar entre 49:5:7,5
y 49:5:15) demostraron generalmente un grado reducido de fuga de
glutatión (forma oxidada y reducida), un cambio menor en el tamaño
del liposoma y un cambio más pequeño en la pureza radioquímica (PRQ)
post-liofilización, en comparación con los
liposomas de DSPC:DMPG:colesterol (relación molar 49:5:44) (Tabla
I). Se sabe que la inclusión de un esterol tal como colesterol en
la bicapa fosfolipídica influye en la fluidez de la membrana. La
presente invención proporciona liposomas de un contenido de esterol
optimizado que son suficientemente estables in vitro durante
una estabilidad en almacén prolongada, mantienen totalmente sus
características fisicoquímicas deseables y, tras la interiorización
del material, tienen un perfil de biodistribución adecuado para uso
in vivo. También se demostró que el tamaño del liposoma
afectaba la farmacocinética y la biodistribución, como se muestra
en el ejemplo 6. Se encontraron una radiactividad en sangre en
porcentaje y captación en la lesión similares para liposomas de
DSPC:DSPG:colesterol y DSPC:DMPG:colesterol liofilizados de tamaño
similar (relación molar entre 49:5:7,5 y 49:5:20) y suspensiones de
liposomas con alto contenido de colesterol
(DSPC:DMPG:colesterol:\alpha-tocoferol; relación
molar 49:5:44:2).
La bicapa lipídica de los liposomas de la
presente invención contiene preferentemente componentes de
fosfolípido cargado negativamente y neutro que tienen porciones de
ácido graso con cadenas de acilo de entre 14 y 20 átomos de
carbono. El componente de fosfolípido neutro de la bicapa lipídica
es preferentemente una fosfatidilcolina, lo más preferentemente
elegida de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) y
dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). El componente de fosfolípido
cargado negativamente de la bicapa lipídica puede ser un compuesto
de fosfatidilglicerol, fosfatidilserina o fosfatidilinositol,
preferentemente elegido de diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y
dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG). Preferentemente, el
fosfolípido neutro es un compuesto de fosfatidilcolina y el
fosfolípido cargado negativamente es un compuesto de
fosfatidilglicerol. La porción de ácido graso de estos fosfolípidos
puede elegirse de ácido mirístico, ácido palmítico, ácido
esteárico, ácido oleico, ácido linoleico o ácido araquidónico. Las
porciones de ácido graso preferidas son ácido mirístico y ácido
esteárico, con porciones de ácido graso con longitudes de cadena de
acilo de 14 y 18 carbonos, respectivamente. Una realización más
preferida de esta invención es que las porciones de ácido graso de
los componentes de fosfolípido tanto cargado negativamente como
neutro sean de igual longitud de cadena de acilo.
Los liposomas de la presente invención no
requieren el uso de \alpha-tocoferol como
componente de sus membranas. El \alpha-tocoferol
se incluyó en algunos liposomas radiomarcados de la técnica anterior
como un antioxidante necesario para limitar la oxidación de los
fosfolípidos, además de cualquier componente atrapado, y así
garantizar PRQ aceptables. Se encontró que la inclusión de
\alpha-tocoferol no era un requisito esencial para
los liposomas de la presente invención y se lograron valores de PRQ
aceptables en ausencia de \alpha-tocoferol en la
composición lipídica.
El periodo de semidesintegración en sangre de
los liposomas in vivo debe ser suficientemente largo y, por
tanto, los liposomas de la invención deben ser de un tamaño
adecuado. Los liposomas de la presente invención son adecuadamente
de un diámetro entre 50 y 400 nm y preferentemente de un diámetro
entre 80 y 140 nm. El ejemplo 6 muestra que una disminución en el
tamaño del liposoma aumentó la radiactividad en porcentaje en la
sangre, una medición que es indicativa del tiempo de permanencia en
sangre. También se mostró que el uso de DSPG en vez de DMPG como
fosfolípido cargado negativamente aumentó ligeramente la
radiactividad en sangre en porcentaje para un tamaño de liposoma
dado. Para liposomas con el intervalo de diámetro
130-180 nm, en el que el tamaño y la captación en
la lesión se relacionan inversamente, el grado de captación en la
lesión fue similar para los liposomas basados tanto en DSPG como en
DMPG liofilizados. Estas conclusiones fueron apoyadas por una
evaluación multifactorial combinada de los datos de biodistribución
para las preparaciones de liposomas basados tanto en DSPG como en
DMPG. La figura 4 representa un modelo que predice la radiactividad
en sangre en porcentaje (4 horas post-inyección),
siendo el tamaño del liposoma el modulador primario. La figura 5
muestra la radiactividad en sangre en porcentaje predicha (4 horas
post-inyección) como una función del tamaño del
liposoma, DMPG y DSPG.
Los liposomas de la presente invención se
prepararon mediante procedimientos que son ampliamente conocidos en
la técnica (Lasic DD. Preparation of liposomes en: Lasic DD, ed.
Liposomes from physics to applications. Ámsterdam, Los Países
Bajos: Elsevier Science Publishers B.V. 1993;
63-107). El procedimiento de preparación se
describe brevemente en el ejemplo 1.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En un segundo aspecto de la presente invención
se proporciona un liposoma que tiene un material interiorizado que
comprende el liposoma del primer aspecto de la invención y en el que
el material interiorizado ha sido modificado químicamente de forma
irreversible por el compuesto modificador. La preparación de
liposomas que tienen material interiorizado normalmente tiene lugar
simultáneamente con la reconstitución de los liposomas tras el
almacenamiento prolongado. Preferentemente, el material
interiorizado es o un agente de obtención de imágenes de SPECT, un
agente de contraste de MRI, un agente de contraste de rayos X o un
fármaco. Lo más preferentemente, el material interiorizado es un
compuesto radiactivo, un compuesto paramagnético o un compuesto
radiopaco. El material interiorizado especialmente preferido es un
radiometal. Un radiometal se compleja preferentemente con un agente
quelante adecuado para el transporte de dicho radiometal en los
liposomas. Un agente quelante adecuado debe poder complejarse con
el radiometal deseado y difundir a través de la membrana liposómica.
Esto requerirá un vehículo que forme un complejo radiometálico que
sea lipófilo y suficientemente soluble en agua para permitir la
transferencia eficaz dentro del compartimento de agua de la vesícula
lipídica.
Si el material interiorizado es un agente de
obtención de imágenes de SPECT, es preferentemente un emisor gamma,
siendo ^{99m}Tc y ^{111}In particularmente útiles en la
obtención de imágenes de sujetos humanos. Un emisor gamma más
preferido de la invención es ^{99m}Tc. Un quelato adecuado para
^{99m}Tc sería una alquilenamina-oxima. Para
^{99m}Tc, el quelato preferido es HMPAO, ya que el
^{99m}Tc-HMPAO atraviesa fácilmente la membrana
de los liposomas cargados negativamente.
La interiorización eficaz de material en los
liposomas de la presente invención depende de la presencia del
compuesto modificador atrapado en la fase interna. En el caso de que
un complejo radiometálico sea el material interiorizado, la función
del compuesto modificador atrapado es convertir el complejo
radiometálico, que preferentemente comprende ^{111}In o
^{99m}Tc, en una forma más hidrófila que permanece interiorizada
dentro del liposoma, dando como resultado un procedimiento de
radiomarcado más eficaz. Por tanto, es decisivo que el compuesto
modificador se retenga dentro de los liposomas preformados de forma
que el paso transmembrana del complejo radiometálico en los
liposomas no sea inhibido y que el complejo radiometálico no se
convierta en una forma hidrófila fuera de los liposomas, afectando
adversamente la pureza radioquímica (PRQ).
En los ejemplos 1 y 3, las Tablas I y III
muestran PRQ aceptables del 70% para liposomas basados en DMPG y
DSPG liofilizados que contienen la relación molar
7,5-15 de colesterol. En el ejemplo 2 se demostró
que la eliminación del tampón de la fase externa dio un buen
mantenimiento de la PRQ y minimizó el grado de fuga de glutatión
con la liofilización. En el ejemplo 4, las Tablas IV y V muestran
que la cinética de degradación del glutatión y la fuga del
glutatión encapsulado son ambas lentas bajo condiciones extremas,
concomitante con valores de PRQ estables (dentro de los errores
experimentales). Las figuras 1 y 2 demuestran la mejora de la PRQ y
la estabilidad química de algunos liposomas basados en DMPG y DSPG
liofilizados seleccionados en comparación con suspensiones de
liposomas de la composición
DSPC:DMPG:colesterol:\alpha-tocoferol (relación
molar 49:5:44:2).
Un tercer aspecto de la presente invención
proporciona un kit para la preparación de liposomas que tienen
material interiorizado. El término "kit" significa una
realización comercialmente aceptable de la invención diseñada para
la preparación simplisa de liposomas que tienen material
interiorizado adecuado para la administración a seres humanos. El
kit de la invención comprende:
- (i)
- un primer compartimento que contiene liposomas según el primer aspecto de la invención, y
- (ii)
- un segundo compartimento que contiene el material según el primer aspecto de la invención o un precursor del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes del kit pueden estar presentes
en recipientes separados tales como viales o alternativamente como
compartimentos separados de un único recipiente tal como un vial o
una jeringa de dos compartimentos. La interiorización de material
en los liposomas se logra reconstituyendo primero el material, o un
precursor del mismo, con una disolución apropiada seguida de la
incubación de la disolución con los liposomas. Si el vial contiene
un precursor del material, la disolución contiene adecuadamente los
reactivos necesarios para producir el material, por ejemplo, en el
caso de un compuesto radiactivo, el radioisótopo apropiado. Un uso
preferido de los liposomas producidos en este documento es la
administración a seres humanos para los fines de obtención de
imágenes de infección, inflamación o tumores. En un modo de uso más
preferido, los liposomas liofilizados estériles se incuban con
^{99m}Tc-HMPAO estéril para dar liposomas marcados
con ^{99m}Tc adecuados para la administración a seres
humanos.
Los liposomas del primer compartimento se
preparan:
- (i)
- produciendo una población de liposomas de una primera forma en una distribución de tamaño adecuada,
- (ii)
- sustituyendo la fase externa de los liposomas por un medio diferente de la fase interna, y
- (iii)
- procesando los liposomas en una segunda forma adecuada para el almacenamiento prolongado.
\newpage
La creación de una población de liposomas con el
tamaño y distribución de tamaño apropiada para las realizaciones
biológicas óptimas pueden lograrse por varios procedimientos. Para
la preparación de cantidades comerciales, un procedimiento
preferido es la homogeneización a alta presión. Puede llevarse a
cabo una única pasada o varias pasadas hasta que se produce una
población de liposomas de tamaño adecuado.
Los componentes de la fase interna pueden
encapsularse con la hidratación de una mezcla homogénea de los
componentes lipídicos deseados o durante el procesamiento. En el
procesamiento se incluye una etapa para eliminar el compuesto
modificador externo. La eliminación del compuesto modificador
externo puede llevarse a cabo por centrifugación, diafiltración,
diálisis o cromatografía. La diafiltración es el procedimiento más
preferido para sustituir la fase externa.
En una realización preferida, los liposomas se
procesan en una forma adecuada para mantener sus propiedades
fisicoquímicas y biológicas durante periodos de almacenamiento
prolongados. La composición bicapa de los liposomas según la
invención hace que puedan procesarse a partir de una primera forma
de suspensión en una segunda forma adecuada para el almacenamiento
prolongado sin pérdida del compuesto modificador atrapado,
alteración en el tamaño del liposoma o alteración de la fluidez de
la membrana. Esta segunda forma puede ser una versión congelada o
deshidratada de la primera forma. Los procedimientos adecuados para
producir esta segunda forma son congelación, liofilización y
vitrificación. Un procedimiento preferido es la liofilización. En
esta segunda forma, los liposomas pueden conservar su tamaño
original, además del compuesto modificador atrapado en su forma
química original durante periodos de almacenamiento prolongados.
Como se demuestra en los ejemplos 1 y 3, la realización de los
liposomas basados en DSPG y basados en DMPG con la liofilización
sólo fue satisfactoria cuando el contenido de colesterol estuvo en
un intervalo bajo (Tablas I y III). La mínima fuga de glutatión, las
alteraciones menores en el tamaño del liposoma y la PRQ fueron
características comunes para ambos tipos de formulaciones de
liposomas con la
liofilización.
liofilización.
Los liposomas de la presente invención se
preparan preferentemente en una forma adecuada para la
administración a seres humanos para la obtención de imágenes de
infección, inflamación y tumores. Por tanto, es necesario
garantizar que los liposomas (1) tienen propiedades fisicoquímicas
apropiadas (por ejemplo, tamaño, distribución de tamaño y fluidez
de la bicapa lipídica), (2) tienen las fases acuosas interna y
externa deseadas y (3) son estériles. Un cuarto aspecto de la
presente invención es el uso de los liposomas para obtener imágenes
de infección, inflamación y tumores en seres humanos. Los liposomas
que tienen material interiorizado de la invención se usan
preferentemente para la obtención de imágenes de infección y/o
inflamación en un ser humano. Las afecciones infecciosas e
inflamatorias adecuadas incluyen osteomielitis, enfermedad
inflamatoria del intestino y apendicitis.
La realización biológica de liposomas que tienen
material interiorizado depende de la estabilidad de la preparación
tanto in vitro como in vivo en relación con
propiedades fisicoquímicas clave. Para una preparación liposómica es
decisivo que el material interiorizado permanezca asociado a los
liposomas.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 representa la estabilidad de la PRQ
de liposomas basados en DMPG y DSPG liofilizados (símbolos
cerrados) y suspensión de liposomas (símbolos abiertos) con el
almacenamiento a 25ºC (véase el ejemplo 4 para los detalles de
formulación).
La figura 2 muestra la estabilidad química de
glutatión encapsulado para liposomas basados en DMPG y DSPG
liofilizados (símbolos cerrados) y suspensión de liposomas (símbolos
abiertos) con el almacenamiento a 25ºC (véase el ejemplo 4 para los
detalles de formulación).
La figura 3 compara DSPG y DMPG con respecto a
la radiactividad en porcentaje en a) sangre y b) lesión para
liposomas de DSPC:DXPG:colesterol (relación molar: 49:5:X)
liofilizados marcados con ^{99m}Tc reconstituidos (4 h p.i.,
dosificación de lípidos - 2 mg/kg de peso corporal). Están incluidos
los resultados para la suspensión de liposomas. Los datos se dan
como media \pm DE (n=3) (véase el ejemplo 6 para los detalles de
formulación).
La figura 4 representa a) radiactividad en
sangre en porcentaje predicha frente a la medida para un modelo de
mínimos cuadrados parciales (PLS-1) usando el
contenido de colesterol, DMPG/DSPG y el tamaño del liposoma como
variables, b) coeficientes de regresión para el modelo.
La figura 5 muestra la superficie de respuesta
de la radiactividad en sangre en porcentaje como una función del
tamaño del liposoma y DMPG (0)/DSPG (1) para el modelo de PLS
mostrado en la figura 4.
La figura 6 compara las imágenes de la
gammacámara post-inyección de liposomas de
DSPC:DSPG:colesterol (relación molar: 49:5:12,5) liofilizados
marcados con ^{99m}Tc reconstituidos en rata infectada y no
infectada.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos no limitantes:
Se preparó una mezcla de lípidos que contenía
DSPC, DMPG (o DSPG) y colesterol en una relación molar de 49:5:X,
en la que X varió entre 0 y 44. Brevemente, los lípidos se
disolvieron en disolventes orgánicos y la mezcla de lípidos
resultante se secó a presión reducida y se tamizó para producir un
fino polvo de lípidos.
Una dispersión de lípidos en una disolución de
sacarosa 300 nM tamponada con citrato-fosfato 10 mM
que contenía glutatión (pH 5) se sometió a las etapas de
homogeneización a alta presión y/o extrusión. La eliminación del
glutatión extraliposómico se logró mediante diafiltración contra
disolución de sacarosa 300 mM. Entonces, los liposomas se
liofilizaron.
El radiomarcado de los liposomas anteriormente
preparados se logró mediante la difusión de HMPAO marcado con
^{99m}Tc a través de la bicapa lipídica. Brevemente, el ^{99m}Tc
se obtuvo en forma de disolución de pertecnetato de sodio mediante
elución de un generador de ^{99}Mo/^{99m}Tc comercial (Amertec
II) y se diluyó a una concentración de 200 MBq/ml. El eluato se usó
en el plazo de 2 horas después de la elución del generador. Un vial
de HMPAO (Ceretec^{TM}) se reconstituyó con 5 ml de pertecnetato
(200 MBq/ml) y se agitó durante 10 segundos. La actividad estuvo
entre 900 MBq y 1100 MBq (\pm 10%). Después de entre 1 y 5
minutos, 4 ml de la disolución radiactiva se transfirieron a los
liposomas liofilizados y la mezcla se agitó durante 10 segundos. La
actividad de la disolución resultante estuvo entre 810 MBq y 990 MBq
(\pm 10%).
Las propiedades fisicoquímicas de los liposomas
de DSPC:DMPG:colesterol (relación molar 49:5:X) que contienen
glutatión liofilizados se resumen en la Tabla I. Normalmente, el
tamaño del liposoma (promedio Z; diámetro medio ponderado por la
intensidad) se midió mediante espectroscopía de correlación de
fotones, la concentración en número de vesículas mayores
(1-30^{s}_{B}m) mediante la técnica del contador
de Coulter, la PRQ mediante cromatografía en capa fina instantánea,
el contenido extraliposómico y total de glutatión mediante HPLC.
Los liposomas que contienen glutatión de la
composición DSPC:DMPG:colesterol con una relación molar 49:5:10 se
prepararon como se describe en el ejemplo 1. La fase interna contuvo
una disolución de sacarosa 300 mM tamponada con fosfato (pH 6). La
fase externa contuvo o una disolución de sacarosa 300 mM o una
disolución de sacarosa 300 mM tamponada con fosfato (pH 6).
La Tabla II resume el efecto del tampón externo
en la realización de los liposomas de DSPC:DMPC:colesterol
(relación molar 49:5:10) que contienen glutatión durante la
liofilización.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los liposomas que contenían glutatión de la
composición DSPC:DSPG:colesterol con una relación molar 49:5:X se
prepararon como se explica resumidamente en el ejemplo 1, en la que
X varió de 10 a 15. La fase interna contuvo una disolución de
sacarosa 300 mM tamponada con citrato-fosfato (pH
5), mientras la fase externa fue una disolución de sacarosa 300
mM.
La Tabla III resume las propiedades
fisicoquímicas de liposomas de DSPC:DSPG:colesterol (relación
molar
49:5:X) que contienen glutatión liofilizados.
49:5:X) que contienen glutatión liofilizados.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de diversos lotes de liposomas
liofilizados de la composición DSPC:DMPG:colesterol y
DSPC:
DSPG:colesterol (relación molar 49:5:X), en la que X varió de 10 a 15 (véanse las Tablas I-III), se monitorizó guardando viales en salas de estabilidad con temperatura y humedad controladas y protegidos de la luz. Las diversas condiciones de almacenamiento usadas fueron 4ºC/humedad ambiente, 25ºC/60% de humedad, 30ºC/60% de humedad y 40ºC/75% de humedad. Los siguientes parámetros se midieron al sacarlos, hasta 5 meses de almacenamiento: contenido de glutatión extraliposómico y total, tamaño del liposoma y PRQ.
DSPG:colesterol (relación molar 49:5:X), en la que X varió de 10 a 15 (véanse las Tablas I-III), se monitorizó guardando viales en salas de estabilidad con temperatura y humedad controladas y protegidos de la luz. Las diversas condiciones de almacenamiento usadas fueron 4ºC/humedad ambiente, 25ºC/60% de humedad, 30ºC/60% de humedad y 40ºC/75% de humedad. Los siguientes parámetros se midieron al sacarlos, hasta 5 meses de almacenamiento: contenido de glutatión extraliposómico y total, tamaño del liposoma y PRQ.
\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se anestesiaron ratas macho Wistar de 200 g
(\pm 25 g) con halotano. Se creó un absceso focal en el muslo
derecho mediante inoculación de 0,1 ml de 7 x 10^{8} células/ml de
suspensión concentrada de S. Aureus en el músculo
gracilis. La aguja se sacó post-inyección y el área
se limpió ligeramente con una bola de algodón hidrófilo empapada en
disolución de etanol al 70%. Los animales se colocaron de nuevo en
sus jaulas y se monitorizaron cuidadosamente mientras se
recuperaban. Los animales se estudiaron en el plazo de 48 horas
desde la inoculación.
Se investigaron in vivo lotes de
liposomas de DSPC:DMPG:colesterol (relación molar 49:5:X) y
DSPC:DSPG:
colesterol (relación molar 49:S:X) liofilizados, en la que X varió de 7,5 a 20 (véanse las Tablas I-III). Los estudios de biodistribución se llevaron a cabo en el modelo de rata infectada por S. Aureus descrito en el ejemplo 5.
colesterol (relación molar 49:S:X) liofilizados, en la que X varió de 7,5 a 20 (véanse las Tablas I-III). Los estudios de biodistribución se llevaron a cabo en el modelo de rata infectada por S. Aureus descrito en el ejemplo 5.
La figura III compara la radiactividad en % en
(a) sangre y (b) lesión 4 horas después de la inyección intravenosa
de liposomas basados en DSPG y DMPG liofilizados marcados con
^{99}Tc reconstituidos (dosificación de lípidos, 2 mg/kg de peso
corporal).
Las imágenes de la gammacámara dinámica de ratas
se obtuvieron tras la inyección de los liposomas de la invención
(dosificación de lípidos 4 mg/kg de peso corporal).
La figura VI representa una imagen comparativa
de una rata infectada y una no infectada 30 minutos
post-inyección de liposomas de DSPC:DSPG:colesterol
(relación molar 49:5:12,5) liofilizados marcados con ^{99}Tc
reconstituidos.
Claims (30)
1. Un liposoma que comprende:
- i)
- un fosfolípido neutro,
- ii)
- un fosfolípido cargado negativamente,
- iii)
- un esterol,
teniendo un compuesto modificador atrapado en la
fase interna de dicho liposoma;
en el que el compuesto modificador es un
compuesto que puede modificar químicamente de forma irreversible un
material interiorizable dentro de dicho liposoma tras la difusión de
dicho material a través de la bicapa fosfolipídica de dicho
liposoma, de forma que el material químicamente modificado de forma
irreversible permanece interiorizado dentro de dicho liposoma,
y;
en el que el fosfolípido neutro está presente al
60-90 por ciento en moles del contenido de lípidos
totales, el fosfolípido cargado negativamente está presente al
2-20 por ciento en moles del contenido de lípidos
totales y el esterol está presente al 5-25 por
ciento en moles del contenido de lípidos totales.
2. El liposoma de la reivindicación 1 en el que
el compuesto modificador es un reductor.
3. El liposoma de las reivindicaciones 1 y 2 en
el que el compuesto modificador se elige de ácido ascórbico,
cisteína y glutatión.
4. El liposoma de la reivindicación 3 en el que
el compuesto modificador es glutatión.
5. El liposoma de las reivindicaciones
1-4 en el que la proporción del compuesto
modificador presente en la fase interna de dicho liposoma está en
el intervalo del 95-100% del compuesto modificador
presente en las fases interna y externa de dicho liposoma.
6. El liposoma de las reivindicaciones
1-5 en el que dicho material interiorizable se elige
de un agente radiactivo, un agente paramagnético o un agente
radiopaco.
7. El liposoma de las reivindicaciones
1-6 en el que dicho material interiorizable es un
quelato metálico.
8. El liposoma de la reivindicación 7 en el que
el metal de dicho quelato metálico se elige de un radiometal
adecuado para la obtención de imágenes de SPECT o PET, un metal
paramagnético adecuado para MRI o un metal radiopaco adecuado para
obtener imágenes de rayos X.
9. Los liposomas de las reivindicaciones 7 y 8
en los que el metal de dicho quelato metálico se selecciona de
^{99m}Tc, ^{111}In, gadolinio, manganeso o tungsteno.
10. El liposoma de las reivindicaciones
1-5 en el que dicho material interiorizable es un
profármaco.
11. El liposoma de las reivindicaciones
1-10 en el que dicho esterol está presente al
10-25 por ciento en moles del contenido de lípidos
totales.
12. El liposoma de las reivindicaciones
1-11 en el que la longitud de cadena de acilo graso
de dicho fosfolípido neutro y la de dicho fosfolípido cargado
negativamente está en el intervalo 14 a 20 átomos de carbono.
13. El liposoma de las reivindicaciones
1-12 en el que las cadenas de acilo graso de dicho
fosfolípido neutro y de dicho fosfolípido cargado negativamente son
de igual longitud.
14. El liposoma de las reivindicaciones
1-13 en el que las cadenas de acilo graso de dicho
fosfolípido neutro y dicho fosfolípido cargado negativamente se
eligen de ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido
oleico, ácido linoleico y ácido araquidónico.
15. El liposoma de las reivindicaciones
1-14 en el que dicho fosfolípido neutro es un
compuesto de fosfatidilcolina.
16. El liposoma de las reivindicaciones
1-15 en el que dicho fosfolípido neutro es
diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) o dimiristoilfosfatidilcolina
(DMPC).
17. El liposoma de las reivindicaciones
1-16 en el que dicho fosfolípido cargado
negativamente es un compuesto de fosfatidilglicerol, un compuesto
de fosfatidilserina o un compuesto de fosfatidilinositol.
18. El liposoma de las reivindicaciones
1-17 en el que dicho fosfolípido cargado
negativamente es diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) o
dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG).
19. El liposoma de las reivindicaciones
1-18 en el que el diámetro medio del liposoma está
en el intervalo 50 y 400 nm.
20. El liposoma de las reivindicaciones
1-19 en el que el diámetro medio del liposoma está
en el intervalo 80 y 140 nm.
21. Un liposoma que tiene un material
interiorizado que comprende:
- i)
- el liposoma de las reivindicaciones 1-20,
- ii)
- el material químicamente modificado de forma irreversible de las reivindicaciones 1 a 10.
22. El liposoma de la reivindicación 21 en el
que el material interiorizado es un agente de obtención de imágenes
de SPECT, un agente de contraste de MRI o un agente de contraste de
rayos X.
23. El liposoma de la reivindicación 21 en el
que el material interiorizado es un fármaco.
24. Un kit para la preparación del liposoma de
las reivindicaciones 21-22 que comprende:
- i)
- un primer compartimento que contiene el liposoma de las reivindicaciones 1-9 y las reivindicaciones 11-20, y
- ii)
- un segundo compartimento que contiene el material interiorizable de las reivindicaciones 6 a 9 o un precursor del mismo.
25. Un kit para la preparación del liposoma de
la reivindicación 23 que comprende:
- i)
- un primer compartimento que contiene el liposoma de las reivindicaciones 1-5 y las reivindicaciones 10-20, y
- ii)
- un segundo compartimento que contiene el material interiorizable de la reivindicación 10 o un precursor del mismo.
26. El kit de las reivindicaciones 24 ó 25 en el
que el liposoma de dicho primer compartimento y el material o
precursor del mismo de dicho segundo compartimento están
liofilizados.
27. El kit de las reivindicaciones 24 a 26 en el
que dicho primer compartimento comprende además un
crioprotector.
28. El kit de la reivindicación 27 en el que el
crioprotector es sacarosa.
29. El liposoma de la reivindicación 22 para uso
en la obtención de imágenes de infección, inflamación o tumor en un
ser humano.
30. El liposoma de la reivindicación 29 para uso
en la obtención de imágenes de osteomielitis, enfermedad
inflamatoria del intestino y apendicitis.
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