ES2247069T3 - Liposomas terapeuticos radioactivos. - Google Patents
Liposomas terapeuticos radioactivos.Info
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Abstract
Sistema de conjugación, caracterizado porque comprende liposomas con ionóforos y con quelante localizados en el interior de los liposomas, y los liposo mas encapsulan además radionucleido(s) pesado(s) que emite(n) partículas á o 212Pb como generador del emisor á 212Bi, en el que los radionucleidos pesados tienen un peso atómico mayor de 150.
Description
Liposomas terapéuticos radioactivos.
La presente invención se refiere a un sistema de
conjugación que comprende liposomas con ionóforos, y con un quelante
localizado dentro de los liposomas, en el que los liposomas están
marcados de forma estable con radionucleidos pesados que emiten
partículas \alpha. La presente invención se refiere además a un
método para preparar el sistema de conjugación, así como a un equipo
para preparar el sistema de conjugación.
Las aplicaciones biomédicas de los radionucleidos
en la terapia anticáncer se han centrado hasta ahora en el uso de
especies catiónicas o aniónicas, p.ej., [^{131}I]yoduro
contra el cáncer tiroideo y ^{89}Sr para paliar el dolor derivado
de las metástasis de cáncer óseo, y en el uso principalmente de
radionucleidos emisores beta unidos a anticuerpos monoclonales
(DeVita et al., 1996).
El uso de la terapia con radionucleidos dirigidos
contra el cáncer depende de la capacidad de encontrar formas de unir
radionucleidos a compuestos portadores específicos de tumor (Gaze,
1996). Actualmente, algunos de los radionucleidos con
características de radiación útiles no se pueden usar en el
reconocimiento de tumores debido al problema de proporcionar una
unión químicamente estable entre el radionucleido y el compuesto
portador. Los sistemas portadores nuevos pueden ampliar, sin
embargo, el uso de radioisótopos, así como el arsenal de
radionucleidos considerados útiles para la terapia (Gaze, 1996).
Los liposomas, con o sin grupos con afinidad por
receptor unidos a la superficie, se han evaluado para la
administración de fármacos, y en la actualidad se usan clínicamente
para la administración de productos quimioterapéuticos en algunas
formas de cáncer. Recientemente, el desarrollo en la investigación
de liposomas ha conducido a nuevas versiones, con una
farmacocinética que podría hacer útiles estos compuestos como
vehículos para radionucleidos para la radioterapia interna contra el
cáncer (Gabizon, 1995). Este desarrollo reciente en la formulación y
fabricación de liposomas ha dado como resultado pequeñas vesículas
de menos de 100 nm con un tiempo de circulación prolongado, al
poderse limitar mejor el tamaño de los liposomas a diámetros
pequeños usando extrusión a través de membranas. Además, la
introducción de liposomas modificados con polietilenglicol (PEG) ha
reducido la interferencia de las proteínas plasmáticas, y ha
reducido así el reconocimiento y la eliminación realizadas por los
macrófagos del sistema reticuloendotelial (Maruyama et al.,
1997). Por ello, se han conseguido niveles incrementados de
captación tumoral debidos a la concentración sanguínea sostenida. Se
ha conseguido aún más captación tumoral conjugando moléculas con
afinidad por receptor, p.ej., anticuerpos monoclonales o folato, a
la superficie de los liposomas. Además, varios estudios han indicado
la ventaja de aplicar PEG como ligador entre el liposoma y el
ligando de reconocimiento, ya que esto también puede mejorar la
accesibilidad al receptor (p.ej., Maruyama et al., 1997;
Gabison et al., 1999; Lee et al., 1994).
Los liposomas se han estudiado previamente como
vehículos para radioisótopos (Goins et al., 1998; Turner
et al., 1988). Pikul et al. (1987) informaron de un
estudio basado en ^{212}Pb-dextrano incorporado
pasivamente (es decir, el ^{212}Pb-dextrano se
añadió durante la generación del liposoma, y se incorporó una
fracción de ^{212}Pb-dextrano junto con la fase
acuosa que representaba el interior del liposoma). Los autores no
sugirieron que estos liposomas fueran adecuados para la terapia del
cáncer, sino que se usaron primariamente para estudiar la
destrucción celular intracelular in vitro con radioisótopos.
No se presentaron datos del destino del ^{212}Bi generado a partir
de la desintegración del ^{212}Pb, y el tamaño de los liposomas
fue del orden de 350-500 nm, que es muy grande
comparado con el tamaño considerado óptimo actualmente (aprox. 100
nm) para la terapia de tumores in vivo (Forssen, 1997).
Además, los liposomas no contenían PEG en la membrana.
Ogihar-Umeda et al. (1996)
usaron liposomas como vehículo para los radionucleidos emisores
gamma ^{67}Ga, ^{111}In y ^{99m}Tc, y sugirieron el uso de
liposomas radiomarcados para el diagnóstico por la imagen.
En un estudio teórico, Kostarelos et al.
(1999) sugirieron el uso de liposomas marcados con los
radionucleidos potencialmente terapéuticos ^{131}I, ^{67}Cu,
^{188}Re y ^{211}At, pero no se sugirieron los procedimientos
químicos para la preparación de los liposomas radiomarcados.
El documento EP386 146 B1 describe una
composición y un método de uso para compuestos encapsulados en
liposomas para la terapia de tumores mediante captura de neutrones.
Sin embargo, estos liposomas se cargaron con elementos estables
(p.ej. boro), que se hace radiactivo solamente después de activarlo,
y los liposomas no contenían ni ionóforos ni quelantes.
Utkhede et al., (1994) describen liposomas
cargados con ^{90}Y y el quelante DTPA, que es un quelante
distinto comparado con los quelantes descritos en la presente
invención. Además, no se describe la retención de el/los
nucleido(s) padre/hijo y, además, ^{90}Y no es un elemento
pesado como los elementos descritos en la presente solicitud.
El conseguir un radiomarcado suficientemente
estable de vehículos con radionucleidos pesados emisores alfa
requiere normalmente procedimientos químicos específicos adaptados
para adecuarse a la química de cada elemento, y no se conocen tales
métodos. No se puede esperar que los procedimientos utilizados para
radiomarcar, p.ej., Ga, In, Tc, Cu o Re sean compatibles con los
emisores alfa catiónicos de radionucleidos pesados (peso atómico
superior a 150) como, p.ej., ^{212/213}Bi, ^{212}Pb,
^{223/224}Ra, ^{227}Th o ^{225}Ac.
Por lo tanto, es un objetivo de la presente
invención proporcionar un sistema de conjugación
radionucleido-liposoma, con o sin grupos con
afinidad por receptor, que (1) encapsula el quelante y el/los
radionucleido(s) pesado(s) que emite(n)
radiación de partículas alfa, (2) puede retener el/los
nucleido(s) hijo cuando se incorpora(n) el/los
nucleido(s) padre en el liposoma, y (3) se puede preparar
mediante un procedimiento de incorporación activo útil para un panel
de radionucleidos, así como el uso del sistema y un equipo para
preparar el sistema. Estos objetivos se han obtenido mediante la
presente invención, caracterizada por las reivindicaciones
adjuntas.
La presente invención se refiere a un sistema de
conjugación que comprende liposomas con ionóforos, es decir, un
agente de extracción de metal para liposomas, y con quelante y
radionucleido(s) pesado(s) (peso atómico superior a
150) localizados dentro del liposoma. Los liposomas se preparan
usando la incorporación activa del radionucleido, es decir, por
medio de ionóforos, y se preparan según procedimientos que producen
liposomas de un tamaño típicamente de 100 nm. El producto resultante
muestra una buena estabilidad química durante varios días, y puede
retener también el/los nucleido(s) hijo dentro del liposoma,
p.ej. a partir de la transformación de ^{212}Pb en ^{212}Bi. Los
liposomas se pueden preparar con o sin grupos modificantes como
poli(óxidos de alquileno), p.ej. PEG, unidos a la membrana. También
se describe aquí un método para unir tales liposomas radiomarcados a
proteínas que reconocen tumores, tales como, p.ej., anticuerpos
monoclonales conjugados con folato.
La presente invención se describirá a
continuación con más detalle, con referencia a las figuras y los
ejemplos.
Figura 1. Unión de liposomas PEGilados, que
contienen anticuerpo Fab' o Fab' marcado con folato conjugado a la
membrana del liposoma, a células OVCAR 3.
Figura 2. Unión de liposomas con PEG modificados
con folato y sin modificar, a células OVCAR 3.
Para desarrollar liposomas radiomarcados que son
adecuados para la terapia del cáncer, los presentes inventores han
estudiado la preparación y el uso de liposomas cargados con
radionucleidos pesados (es decir, peso atómico superior a 150) que
emiten partículas alfa, basándose en los radionucleidos ^{212}Bi,
^{213}Bi, ^{223}Ra, ^{224}Ra, ^{225}Ac, ^{212}Pb y
^{227}Th. Usando liposomas (vesículas) con ionóforos, se
prepararon liposomas radiomarcados preferiblemente con un quelante
(es decir, los liposomas están encapsulado el radionucleido y el
quelante) mediante el uso de la incorporación activa del
radionucleido, y se prepararon según procedimientos que producen
liposomas de un tamaño típico de 100 nm.
Se prepararon vesículas unilamelares mediante
hidratación y extrusión de película lipídica fina (Olson et
al. 1979, Mac Donald et al. 1991) de la siguiente manera:
se disolvió DSPC (diestearoilfosfatidil colina) y colesterol en una
proporción molar 2:1, típicamente 10 y 5 \mumoles,
respectivamente, en cloroformo en un matraz de fondo redondo. Se
eliminó el disolvente mediante evaporación rotatoria usando presión
reducida. La película lipídica seca se hidrató después en
0,5-1 ml de ácido cítrico 150 mM, DOTA 30 mM (ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético),
pH 4. La suspensión resultante se sometió a cinco ciclos de
congelación y descongelación seguidos de extrusión repetida a través
de filtros de policarbonato con tamaño de poro de 100 nm 5 veces y
con tamaño de poro de 50 nm 5 veces usando un dispositivo de
extrusión manual (Avestin, Ottawa, Canadá). El producto tuvo una
concentración lipídica de \sim30 mM. Antes de la carga con
radionucleidos de los liposomas, la disolución externa se
intercambió mediante elución en una columna PD-10
con sacarosa 250 mM, HEPES 20 mM (ácido
N-2-hidroxietilpiperacin-N'-2-etanosulfónico),
pH 7,4.
Constituyentes de los liposomas: a) Medio acuoso
interno: pH 1-14, preferiblemente
2-9, más preferiblemente 4-5.
Constituyentes: Agua; agentes capaces de mantener el pH deseado en
el medio acuoso interno durante el intervalo de tiempo deseado, es
decir, hasta que se inicia la incorporación mediada por el ionóforo
de el/los radiometal(es). Preferiblemente, los constituyentes
del medio acuoso interno también inducen una función complejante de
el/los radiometal(es). Esto se puede efectuar mediante i)
p.ej., grupos funcionales donadores electrostáticos de los agentes
usados para ajustar el pH, p.ej. el/los átomo(s) de oxígeno
en acetato, citrato y compuestos relacionados; ii) además, teniendo
un agente complejante en el medio acuoso interno, p.ej. EDTA, DTPA,
DOTA, DOTMP y compuestos relacionados.
b) Ionóforo: p.ej., agente capaz de transportar,
de forma esencialmente irreversible, un radiometal a través de la
bicapa lipídica desde la fase extraliposomal hacia el interior del
liposoma. Ejemplos: Ionóforos que mostraron funcionar de la manera
deseada: Ionóforo de calcio A23187, Diciclohexil
18-C6,
Bibenzo-18-C6,
2,3-dimercapto-1-propanol,
ionóforo de Pb.
c) Constituyentes de la bicapa lipídica: Los
constituyentes de la bicapa lipídica preferiblemente dan como
resultado una mezcla capaz de formar vesículas, y para los cuales la
temperatura de transición de líquido a sólido está por encima de la
temperatura fisiológica; p.ej., i) fosfolípidos. Ejemplos:
alquilfosfatidil colinas de cadena larga, p.ej.
1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DLPC),
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DMPC),
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC),
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DSPC),
1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DOPC),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(POPC); ii) esteroles o compuestos que poseen propiedades similares,
ya que endurecen (disminuyen la fluidez de) la bicapa lipídica.
Ejemplos: Compuestos de clase esterol: Colesterol y sulfato de
3-colesterol, y iii) estabilizante(s) in
vivo (estéricamente) para incrementar las propiedades de
reconocimiento de células tumorales de la construcción y para
incrementar el tiempo de estancia en la sangre, p.ej. poliéteres,
polietilenglicoles. La inclusión de PEG y/o derivados de PEG en las
formulaciones de liposomas ofrecerá ventajas en cuanto a la
eliminación reducida de los liposomas inyectados en el sistema
circulatorio por parte del sistema reticuloendotelial. Se incluyen
normalmente en la preparación en un 3-10% molar
respecto del fosfolípido. La cantidad de estabilizante necesaria
para obtener el efecto estabilizante deseado es, sin embargo,
dependiente del monómero (propiedades electrostáticas y polares) y
del número de unidades repetidas, es decir, la longitud de la
cadena. Ejemplos: (PEG y/o derivados de PEG):
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)
2000] (PEG2000 DMPE),
1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)2000]
(PEG2000 DPPE),
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)2000]
(PEG2000 DSPE).
d) Constituyentes que facilitan la modificación
de las construcciones para que posean propiedades de reconocimiento
de células tumorales: La elección del lípido activado apropiado
estará determinada por la naturaleza del hapteno, así como por las
necesidades de la investigación. La eficacia de la reacción estará
controlada por el grupo saliente, el espaciador hidrofílico, las
propiedades materiales del liposoma y la concentración de los
reactivos. Para investigaciones in vivo, en las que se
necesita que el hapteno permanezca asociado con el liposoma, se
conseguirán distintas ventajas eligiendo anclajes lipídicos de
cadena acilo de longitud superior con un intercambio más lento entre
membranas. Además, el enlace covalente entre el hapteno y el anclaje
lipídico debería ser estable tanto para la escisión química como
enzimática. Los lípidos activados pueden funcionar para formar,
p.ej., enlaces amina, amida, tioéter o disulfuro entre el lípido y
el modificador. Si se incluyen estabilizantes estéricos en la
preparación, p.ej. PEG y/o derivados de PEG, el grupo que funciona
como acoplador está presente preferiblemente al final de un
compuesto igual o parecido al estabilizante, y con una longitud de
cadena efectiva igual o mayor que la del estabilizante. Ejemplos:
Constituyentes de vesículas que facilitan la modificación de las
construcciones para que posean propiedades de reconocimiento de
células tumorales a partir de PEG o derivados de PEG:
N-[w-(2-piridilditiopropionilamino)
poli(etilenglicol)2000]
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
(PDP-PEG2000-DSPE),
N-(w-[4-(p-maleimidofenil)butanoil]amino)
poli(etilenglicol)2000]
1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
(MpB-PEG2000-
DSPE).
DSPE).
La separación de radionucleidos asociados a
liposomas de radionucleidos sin asociar se consiguió mediante el uso
de cromatografía de exclusión por tamaño (Mauk y Gamble 1979,
Tilcock et al. 1991). Para las separaciones después de los
procedimientos de carga de liposomas se emplearon columnas de
exclusión por tamaño PD-10. De los volúmenes
aplicados de 1 ml o menos en las columnas PD-10, los
liposomas eluyeron en los primeros 4,5 ml. Los radionucleidos sin
asociar a los liposomas eluyeron en la fracción correspondiente a
las especies de peso molecular bajo. Las columnas
PD-10 también se usaron en el estudio de la
estabilidad (con respecto a la retención de radionucleidos) de los
liposomas cargados en PBS.
La separación de los radionucleidos asociados a
liposomas de los radionucleidos libres en el suero se realizó
mediante cromatografía de exclusión por tamaño en una columna de
Sepharose CL-4B (Hwang y Mauk, 1977). Por ello se
pudieron preparar disoluciones que contenían liposomas radiactivos
dispersos en un vehículo líquido sustancialmente carente de
radionucleidos sin unir.
Se añadió EDTA (ácido
etilendiamino-N,N'-tetraacético)
antes de los procedimientos cromatográficos para estabilizar el
radionucleido libre en un estado en el que se pudiera separar
fácilmente de la fracción asociada a liposomas.
El rendimiento de carga del radionucleido, y la
latencia para los radionucleidos asociados a liposomas se
establecieron mediante espectroscopia gamma para ^{228}Ac,
^{223}Ra, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{205}Bi y ^{207}Bi,
^{228}Ac y ^{205/207}Bi se usaron como trazadores para los
radionucleidos potencialmente útiles terapéuticamente ^{225}Ac,
^{212}Bi y ^{213}Bi, respectivamente.
Los presentes inventores hicieron el
descubrimiento significativo e inesperado de que ^{212}Bi no se
translocaba significativamente después de la desintegración del
^{212}Pb incorporado en este tipo de liposomas. El estado actual
del uso de ^{212}Pb como generador unido molecularmente de
^{212}Bi indica que normalmente ocurre una liberación
significativa (\geq 30%) desde un quelante (McClure y Feinendegen,
1998; Mirzadeh et al., 1993). Sin embargo, atrapando el
^{212}Pb en una concentración alta de quelante, tal como por
ejemplo dentro del liposoma, se podría evitar la liberación del
producto hijo proporcionando un sistema de conjugación que se podría
usar para atrapar el nucleido hijo después de la transformación
nuclear. Esta es la primera vez que se informa de un sistema de
conjugación para ^{212}Pb que podría retener el nucleido hijo
^{212}Bi de forma casi cuantitativa. Así, la presente invención se
refiere a liposomas con ionóforos que comprenden un radionucleido y
un quelante localizados dentro del liposoma (sistema de
conjugación), y en la que este sistema de conjugación puede o no
retener el nucleido hijo.
Se puede seleccionar un quelante según la
presente invención del grupo que comprende ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TRITA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TETA), ácido
1,4,7,
10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico (DOTMP), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico, ácido dietilen-triamino-N,N',N''-pentaacético y sus derivados isoméricos, criptato[2,2,2], criptato[3,2,2], criptato[2,2,1] y sus derivados mono- y dibenzoicos, calix[4]arenos que contienen grupos ricos en electrones (donadores) (hidroxilo, carboxilo, éster, amida, amina), ácido 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-acético, y 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-malonato.
10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico (DOTMP), ácido 1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico, ácido dietilen-triamino-N,N',N''-pentaacético y sus derivados isoméricos, criptato[2,2,2], criptato[3,2,2], criptato[2,2,1] y sus derivados mono- y dibenzoicos, calix[4]arenos que contienen grupos ricos en electrones (donadores) (hidroxilo, carboxilo, éster, amida, amina), ácido 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-acético, y 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-malonato.
Otro descubrimiento importante y sorprendente fue
que los liposomas según la presente invención podrían incorporar y
retener ^{223}Ra de forma eficaz. Esta es la primera vez que se
describe un sistema de conjugación potencialmente útil en el
reconocimiento de tumores con radio-223. Además, se
demuestra que también se pueden incorporar y retener fuertemente
bismuto y actinio en el tipo descrito de liposomas, lo que indica
que también se pueden preparar sistemas de conjugación basados en
^{212}Bi, ^{213}Bi y ^{225}Ac.
El sistema de conjugación según la presente
invención se puede hacer con o sin grupos modificadores de
superficie, p.ej. PEG, en la membrana de los liposomas (liposomas
modificados con PEG/PEGilados). La ventaja de aplicar PEG en la
membrana es que proporciona grupos reactivos de PEG que permiten la
conjugación de proteínas, tales como p.ej. anticuerpos, fragmentos o
construcciones de anticuerpos o folato, u otras proteínas/moléculas
con afinidad por receptor (que se unen a un receptor).
La presente solicitud se refiere además a un tipo
nuevo de liposomas con proteínas de unión a receptor unidas a la
membrana del liposoma. Se describen aquí liposomas modificados con
PEG radiomarcados conjugados a anticuerpos marcados con folato. El
uso de folato y de derivados de folato para reconocer tumores que
expresan proteínas de unión a folato (FBP), una proteína de membrana
celular unida a
glucosil-fosfatidil-inositol
implicada en la captación celular de folatos oxidados por medio de
endocitosis, ha atraído la atención de los investigadores (Kranz
et al., 1996; Reddy et al., 1998; Shinoda et
al., 1998; Trippet et al., 1999). Ya que varios tipos de
células cancerosas humanas han mostrado una sobreexpresión de FBP,
este receptor puede ser una posible diana para la administración de
radioisótopos terapéuticos conjugados con folato. Así, usando
anticuerpos conjugados con folato, se podría obtener una terapia con
radionucleidos dirigidos contra el cáncer. Además, si el lugar de
combinación con el antígeno del anticuerpo marcado con folato se
dirige contra un antígeno asociado a tumor diferente de FBP, se
consigue una capacidad de unión doble (es decir, se consigue
afinidad tanto por el anticuerpo-antígeno como por
el receptor de FBP). Por lo que se conoce, esta es la primera vez
que se describe la conjugación de anticuerpos marcados con
folato.
Los anticuerpos marcados con folato conjugados
con los liposomas según la presente invención se podrían marcar
adicionalmente con un radionucleido o una mezcla de diferentes
radionucleidos para incrementar la radioterapia.
La presente invención demuestra que esta nueva
combinación de anticuerpos marcados con folato conjugados con
liposomas se puede usar para dirigir radionucleido(s) hacia
células que expresan receptores de folato. Esto es especialmente
útil con los emisores de partículas alfa, que son emisores de
radiación de elevada transferencia lineal de energía (elevada TLE)
que son extremadamente citotóxicos para las células de mamíferos
(Hall, 1994; Larsen et al., 1998; Ritter et al.,
1977). Sin embargo, una fuente de radiación alfa puede administrar
radiación a un área particularmente pequeña comparado con otros
tipos de radiación. Así, si una fuente de radiación alfa se puede
dirigir a un tejido diana, se puede reducir la exposición del tejido
normal.
Un sistema de conjugación según la presente
invención se podría usar también para reconocer células que
expresan, p.ej., receptores de estrógeno o receptores de
testosterona, conjugando anticuerpos con estrógeno o
testosterona.
Los anticuerpos marcados usados según la presente
invención son preferiblemente de clase IgG o IgM, y/o sus fragmentos
y/o construcciones (p.ej. minianticuerpos). Además, estos
anticuerpos y/o fragmentos y/o construcciones podrían ser murinos,
quiméricos o completamente humanizados, policlonales o
monoclonales.
La presente invención también se refiere al uso
del sistema de conjugación según la presente invención para preparar
una disolución farmacéutica adecuada para inyección o infusión en
mamíferos, que incluyen humanos, mediante una vía de administración
intravenosa y/o regional, y/o intratumoral. La disolución
farmacéutica se puede usar en combinación con un
radioinmunoconjugado o varios radioinmunoconjugados, y/o otras
formas de terapia radiofarmacéutica, quimioterapia, radioterapia
externa o cirugía, para tratar tumores malignos.
La presente invención también se refiere a la
fabricación del sistema de conjugación según la presente invención,
para tratar tumores tales como, p.ej., cáncer de cerebro, pulmón,
cuello uterino, ovario o mama, o leucemia, linfoma o melanoma
maligno.
La presente invención también se refiere a un
equipo para la preparación del sistema de conjugación según la
presente invención, que comprende un vial que contiene una
disolución de liposomas y un segundo vial que contiene un
radionucleido en disolución, que se pueden mezclar para facilitar el
radiomarcado. Además, esto se podría mezclar con un tercer vial que
contiene proteínas y/o moléculas con afinidad por receptor para
obtener un sistema de conjugación con afinidad por receptor.
Se realizó espectroscopia gamma usando un
detector de germanio (Canberra, Meriden, CT, EE.UU.) acoplado a un
analizador multicanal (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, EE.UU.). Se
usó un Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, EE.UU.) para el
recuento de centelleo líquido. Se adquirió DSPC y colesterol de
Northern Lipids (Vancouver, Canadá). Se usaron columnas
PD-10 de Sephadex G-25 (Amersham
Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) para la purificación de los
liposomas radiomarcados. Se usó el quelante macrocíclico DOTA como
quelante intraliposómico y se adquirió de Macrocyclics (Richardson,
TX, EE.UU.). En el estudio se usó HNO_{3} de grado Ultrex (J.T.
Baker, Phillipsburg, NJ, EE.UU.) y HCl 6M (Fisher Scientific,
Pittsburgh, PA, EE.UU.) y ácido
bis(2-etil-hexil) fosfórico
(HDEHP) de Fluka (por medio de Sigma-Aldrich AS,
Noruega).
Todos los tampones usados para la carga de
liposomas con cationes mediada por ionóforo se ajustaron al pH
deseado usando arginina (base libre). Todo el agua utilizada se
obtuvo de un sistema de purificación de agua Milli-Q
(Millipore, Bedford, MA, EE.UU.).
Las resinas de intercambio iónico fueron
suministradas por Bio-Rad (Hercules, CA,
EE.UU.).
Las resinas se preacondicionaron lavando con
agua, y después con HCl 6 M, seguido de acetona y finalmente con
agua. Las resinas se almacenaron en agua antes de cargar las
columnas.
El DMSO usado se almacenó con tamices de 4
\ring{A}.
El ^{232}Th(NO_{3})_{4} usado
en este trabajo había sido almacenado durante más de 20 años. La
muestra fue proporcionada por el Grupo de Química Nuclear,
Departamento de la Universidad de Química de Oslo, Oslo,
Noruega.
El ácido ^{3}H-fólico se
adquirió de Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, R.U.).
Todos los demás productos químicos se adquirieron
de Sigma-Aldrich, Noruega.
La Tabla 1 muestra algunas propiedades físicas de
los radionucleidos usados en los experimentos con liposomas.
| Nucleido | t_{1/2} | rayo(s) gamma | % de probabilidad* |
| ^{228}Ac | 6,13 h | 911,2 (26,6) | 26,6 |
| ^{223}Ra | 11,43 d | 269,4 (13,7) | 13,7 |
| 271,2 (0,108) (^{219}Rn)^{2} | 10,8 | ||
| ^{212}Pb | 10,6 h | 238,6 (43,6) | 43,6 |
| ^{208}Tl | 3,05 m | 583,1 (32,5) | 35,2 |
| ^{207}Bi | 31,55 a | 569,7 (97,7) | 97,7 |
| ^{205}Bi | 15,31 d | 703,4 (31,1) | 31,1 |
| * \begin{minipage}[t]{150mm} Se enumera solamente el rayo gamma más abundante para cada radionucleido. Datos procedentes de Nuclear Data Sheets, Academic Press INC. \end{minipage} |
Se cargaron liposomas preparados según los
procedimientos descritos con radio-223 o
plomo-212. Después, se hicieron reaccionar
anticuerpos con los liposomas para conseguir moléculas de anticuerpo
sobre la superficie de los liposomas. Un tamaño de liposoma de
alrededor de 100 \mum será apropiado para la administración
sistémica, pero se pueden utilizar tamaños típicos de
200-1000 \mum cuando se debe conseguir una
administración intracavitaria, p.ej. para el tratamiento de tumor
cerebral intracraneal, o para el tratamiento de cáncer ovárico
intraperitoneal (el tamaño de liposoma mayor podría frenar la
velocidad de eliminación de la cavidad en la que se inyecta la
preparación, manteniendo por ello una concentración alta en la
región tumoral).
Método: Se produjo ^{212}Pb/^{212}Bi
por medio de emanación de ^{220}Rn desde una fuente de ^{228}Th
como describieron Hassfjell y Hoff (1994). Se lixivió
^{212}Pb/^{212}Bi del recipiente de recogida usando HNO_{3}
0,1 M, y se aplicó la disolución a una columna de 2x20 mm de resina
de intercambio catiónico AG 50W-X4. Después se eluyó
^{212}Pb/^{212}Bi en HCl 2 M y la disolución se evaporó a
sequedad. El ^{212}Pb/^{212}Bi se disolvió después en 200 \mul
de una disolución de acetato 10 mM, pH 5. ^{212}Pb se cuantificó
mediante medida de su rayo gamma de 238,6 keV (Tabla 1). ^{212}Bi
se cuantificó midiendo el rayo gamma de 583,1 keV de su ^{208}Ti
hijo en el equilibrio radiactivo.
Resultados: Se comprobó que menos del 0,2%
de la actividad añadida se asoció a los liposomas durante tiempos de
incubación de hasta 3 días.
Se mezclaron vigorosamente liposomas que se
correspondían con una concentración lipídica de
30-60 mM con una película del ionóforo A23187
(10-13 nM). Después se añadió aproximadamente 1 MBq
de ^{212}Pb/^{212}Bi, y la mezcla se incubó a 75ºC durante 30
min, seguido de elución en una columna PD-10. La
fracción que contenía más del 95% de las vesículas cargadas se eluyó
después en una segunda columna PD-10. Se investigó
la latencia de ^{212}Pb/^{212}Bi asociado a liposomas incubando
las vesículas a 37ºC en suero humano o PBS. Se siguió la
distribución de actividad durante un periodo de 24 h.
Resultados: Eficacia de carga de
^{212}Pb: 34,8% (n=3).
La retención se midió mediante espectroscopia
gamma, y más del 99% del ^{212}Pb estuvo asociado a los liposomas
durante tiempos de incubación de hasta 24 h.
Método: Se cargaron liposomas con
^{212}Pb como se describió anteriormente. La radiactividad
asociada a los liposomas se aisló eluyendo la mezcla de reacción con
EDTA 10 mM en PBS en una columna PD-10
preequilibrada con EDTA 10 mM en PBS.
Después de 3 horas, para asegurar que se
estableciese el equilibrio transitorio entre ^{212}Pb y
^{212}Bi, se aplicaron alícuotas de la disolución a columnas
PD-10 preequilibradas con EDTA 10 mM en PBS para
separar los radionucleidos libres de los radionucleidos asociados a
liposomas. La distribución de actividades se siguió a lo largo de un
periodo de 24 h.
Se midió una alícuota separada de los liposomas
marcados que no se sometieron al procedimiento de separación (de
geometría idéntica a la obtenida de los procedimientos
cromatográficos) para usarla como patrón. Esto se realizó para
establecer la proporción de actividad de ^{212}Bi/^{212}Pb en el
equilibrio radiactivo.
Resultados: Comparando la proporción de
^{212}Bi/^{212}Pb obtenida para los liposomas separados
cromatográficamente con la de la mezcla de equilibrio, se estimó que
más del 95% del ^{212}Bi mostró estar retenido en los liposomas
después de la desintegración del ^{212}Pb asociado a los
liposomas.
Además, se compararon las medidas de la actividad
de ^{212}Bi en las dos fracciones obtenidas cromatográficamente.
Más del 99% de la actividad total de ^{212}Bi eluido en las
fracciones correspondía a liposomas.
Método: Se añadieron liposomas que se
correspondían a 30-60 mM de lípido, que encerraban
ácido cítrico 150 mM, DOTA 30 mM, y con el uso de una disolución
externa que contenía EDTA 10 mM en PBS, a una película del ionóforo
A23187 (20-26 nmoles en la superficie interior de un
vial de vidrio). Después se añadieron ^{212}Pb y ^{212}Bi en
PBS, seguido de incubación a 37ºC. Se eluyeron alícuotas de la
disolución a través de columnas PD-10, y las
fracciones obtenidas cromatográficamente que correspondían al eluato
de liposomas se analizaron mediante el detector de Ge
intrínseco.
Resultados: No se observó carga detectable
(< 1%) de ^{212}Pb y ^{212}Bi a lo largo de un periodo de 24
h.
Se produjo ^{223}Ra a partir de un generador
basado en ^{227}Ac como se describe (Larsen y Henriksen, 1999).
Brevemente, ^{227}Ac y su nucleido hijo ^{227}Th se retienen en
una columna de una resina de extracción cromatográfica que facilita
la elución de ^{223}Ra usando un ácido mineral. Para incorporar
radio a los liposomas, la disolución eluida del generador se evaporó
a sequedad y después se disolvió ^{223}Ra en citrato 5 mM, pH
7,4.
Se mezclaron vigorosamente liposomas que se
correspondían con una concentración lipídica de
30-60 mM con una película del ionóforo A23187
(10-13 nmoles en la superficie interior de un vial
de vidrio). A continuación, se añadieron aproximadamente 50 kBq de
^{223}Ra, y la mezcla se incubó a 75ºC durante 20 min. La mezcla
de reacción se añadió después a 100 \mul de EDTA 10 mM, y se eluyó
en una columna PD-10 para aislar la radiactividad
asociada a las vesículas lipídicas.
La retención del ^{223}Ra asociado a liposomas
se investigó incubando las vesículas a 37ºC en suero humano (Sigma)
o EDTA 5 mM en suero humano a una concentración liposómica de 0,3 mg
de lípido total/ml de suero. Los resultados se exhiben en la Tabla
2, y demuestran que ^{223}Ra se retiene de forma muy estable en
los liposomas.
| Tiempo de incubación (días) | % de ^{223}Ra total en la fracción liposómica |
| 1 | 94,6 \pm 1 |
| 3 | 94 \pm 2,5 |
| 4 | 94,7 \pm 0,5 |
| D. E. media, n=4 |
Método: Se añadieron liposomas que se
correspondían a 30-60 mM de lípido, formados
mediante hidratación de películas lipídicas con ácido cítrico 150
mM, DOTA 30 mM, disolución externa de PBS o suero, a una película
del ionóforo A23187 (10-13 nmoles distribuidos en la
superficie interior de un vial de vidrio). Después se añadió
^{223}Ra en citrato 5 mM de pH 7,4, seguido de incubación a 37ºC.
Se aplicaron alícuotas de la disolución a columnas
PD-10, y la fracción obtenida cromatográficamente
que se correspondía con los liposomas se analizó mediante el
detector de Ge intrínseco.
Método: Se produjo
^{203-207}Bi mediante reacciones (p, xn) sobre
objetivos de plomo natural, y se purificó usando una resina
cromatográfica de extracción selectiva de plomo (Henriksen y Hoff,
1998).
En este estudio se usó una mezcla isotópica de Bi
que consistía principalmente en ^{205}Bi y ^{207}Bi, en lo
sucesivo denominada ^{207}Bi. Se añadieron 50 \mul de una
disolución de ^{207}Bi en HCl 10^{-4} M a los liposomas, que
correspondían a 30-60 mM de lípido, los cuales se
habían mezclado por adelantado con una película del ionóforo A23187
(10-13 nmoles en la superficie interior de un vial
de vidrio) e incubado durante 30 min a 75ºC. A la mezcla de reacción
se le añadieron después 100 \mul de EDTA 10 mM, y se eluyó en una
columna PD-10 para aislar la radiactividad asociada
a las vesículas lipídicas.
Resultados: Se comprobó que un 32% del
^{207}Bi total estaba asociado a los liposomas.
Método: Se aisló ^{228}Ac de una
preparación de ^{232}Th(NO_{3})_{4} mediante una
combinación de extracción de disolvente e intercambio de iones. Se
disolvió ^{232}Th(NO_{3})_{4} (4H_{2}O
originalmente) en 20 ml de HNO_{3} 0,1 M y se añadió a un embudo
de separación de 500 ml, y se puso en contacto con 5x100 ml de una
disolución 2 M de HDEHP en heptano. Después se lavó la fase acuosa
tres veces con heptano y a continuación se aplicó a una columna de
3x40 mm de resina de intercambio catiónico AG50W-X12
para el aislamiento de ^{228}Ac como se describe (Cabell, 1959).
Se eluyeron de la columna ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{224}Ra y
^{228}Ra en HNO_{3} 3 M, y la disolución se dejó durante >20
h. La disolución se evaporó después a sequedad, seguido de
lixiviación de los radionucleidos del recipiente con 1 ml de
HNO_{3} 1 M. Esta disolución se aplicó a una columna de 3x40 mm de
AG50W-X12. Una vez más, se eluyeron ^{212}Pb,
^{212}Bi, ^{224}Ra y ^{228}Ra en HNO_{3} 3 M. ^{228}Ac se
eluyó en HNO_{3} 6 M, y el eluato se evaporó a sequedad. Después
se lixivió ^{228}Ac del recipiente usando 200 \mul de HNO_{3}
5 mM. Se añadieron aproximadamente 6 kBq de ^{228}Ac a los
liposomas que contenían el ionóforo A23187 como se describió
anteriormente, y se incubó durante 60 min a 75ºC. La mezcla de
reacción se añadió después a 100 \mul de EDTA 10 mM, y se eluyó en
una columna PD-10 para aislar la radiactividad
asociada a las vesículas lipídicas. Las fracciones que correspondían
a más del 95% de las vesículas cargadas se mezclaron y después se
eluyeron en una segunda columna PD-10. La retención
liposómica de ^{228}Ac se investigó incubando las vesículas
radiomarcadas a 37ºC en suero humano o PBS. La distribución de
actividad se siguió a lo largo de un periodo de 24 h.
Resultados: En el experimento de carga, el
90-95% del ^{228}Ac añadido (corregida la
desintegración durante el marcado y la purificación) estaba asociado
a los liposomas después del procedimiento de carga. En el
experimento de retención, se comprobó que más del 98% del ^{228}Ac
estaba asociado a los liposomas durante tiempos de incubación de
hasta 24 h.
Método: Se usó ^{90}Y como trazador en
este ejemplo para estudiar el comportamiento de los liposomas
radiomarcados. En este estudiose midieron ^{90}Y y ^{90}Sr
mediante recuento de centelleo líquido.
^{90}Y se aisló a partir de ^{90}Sr por medio
de una resina cromatográfica de xtracción selectiva de estroncio
como describieron Dietz y Horwitz (1992). Aquí, se evaporó a
sequedad ^{90}Sr (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra) en
HNO_{3} 0,1 M y al residuo se le añadió HNO_{3} 3 M. La
disolución se cargó en una columna de 3x20 mm de resina de Sr
(EiChroM, Darien, IL, EE.UU.) y la columna se lavó con 5 ml de
HNO_{3} 3 M.
Este procedimiento eluye selectivamente ^{90}Y
mientras se retiene Sr suficientemente en la columna, para disminuir
el contenido de ^{90}Sr de una mezcla ^{90}Sr/^{90}Y por un
factor de aproximadamente 10^{3} (Dietz y Horwitz, 1992). Después
de esto, ^{90}Sr se extrajo de la columna usando HNO_{3} 0,05 M,
y esta disolución se dejó durante una semana para permitir que
^{90}Y aumentase. Después, la disolución se evaporó a sequedad y
al residuo se le añadió HNO_{3} 3 M antes de separar los
radionucleidos en una segunda columna de resina de Sr. El eluato que
contenía ^{90}Y se evaporó a sequedad y el radionucleido se
lixivió del recipiente usando 200 \mul de HNO_{3} 5 mM. Esta
disolución se añadió a los liposomas que contenían el ionóforo
A23187 (como se describió previamente) y se incubó durante 60 min a
75ºC. A la mezcla de reacción se le añadieron después 50 \mul de
EDTA 10 mM, y se eluyó en una columna PD-10 para
aislar la radiactividad asociada a las vesículas lipídicas. La
fracción que se correspondía con más del 95% de las vesículas se
eluyó después en una segunda columna PD-10. La
retención liposómica del ^{90}Y asociado a liposomas se investigó
incubando las vesículas a 37ºC en suero humano o PBS. La
distribución de actividad se siguió a lo largo de un periodo de 4
días.
Resultados: Más del 95% del ^{90}Y
añadido estaba asociado con los liposomas después de 1 hora de carga
y purificación en la columna de exclusión en gel.
En el estudio de la retención liposómica se
obtuvieron los siguientes resultados: después de 5 h y 1 día, más
del 99% estaba asociado a los liposomas. Después de 4 días se
determinó que la fracción asociada a los liposomas era de un
98\pm1 %.
Como se demuestra en estos experimentos, los
liposomas se pueden radiomarcar con radionucleidos que emiten
partículas alfa y/o partículas beta y retener bien estos nucleidos a
la temperatura fisiológica.
Se usó F(ab')_{2} R\diameter de
mieloma (subclase IgG_{1}) de 14 mg/ml en PBS para este
experimento (Michalsen, Instituto Noruego de Salud Pública, Oslo,
Noruega).
Primero se disolvió ácido fólico \cdot2H_{2}O
en sulfóxido de dimetilo (Fluka, contenido en H_{2}O menor de
0,05%). Después, la disolución se hizo fluir por una cánula a
tamices activados de 4 \ring{A} (Fluka) y se almacenó en atmósfera
de argón en la oscuridad durante 6-10 horas. Se
añadió folato marcado con tritio (^{3}H-folato) en
forma de disolución acuosa de la sal potásica de
^{3}H-folato (1% con respecto a ácido cítrico). La
actividad específica del ^{3}H-folato usado para
la conjugación con proteína fue 7-7,5 GBq/mol.
El ^{3}H-folato se activó para
unirlo a anticuerpo de mieloma F(ab')_{2} añadiendo 10
equivalentes molares de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida a la disolución de folato, e incubando durante 30 min a
temperatura ambiente. A continuación, se añadió un exceso molar de
30-40 veces de folato activado a la proteína, 14
mg/ml en PBS, y se dejó reaccionar durante 30-60
min. La reacción se detuvo añadiendo 0,2 ml de glicocola 0,3 M en
PBS/borato, pH 8,5. El conjugado de folato y F(ab')_{2}
(folato-F(ab')_{2}) se separó del material
sin reaccionar usando una columna PD-10
preequilibrada en PBS. Para formar folato-Fab', se
incubó folato-F(ab')_{2} en ditiotreitol
(DTT) 1 mM a temperatura ambiente durante 2 h, seguido de elución en
una columna de exclusión por tamaño NAP-5. La
fracción que contenía folato-Fab' se desoxigenó
burbujeando argón a través de la disolución, y después la disolución
se mezcló inmediatamente con la disolución de liposomas.
El grado de conjugación de ácido fólico se
determinó mediante el contenido de ^{3}H de la proteína
purificada, medido mediante recuento de centelleo líquido (Beckmann
LS6500) combinado con lecturas espectrofotométricas a 280 nm.
Para la cuantificación de la fracción de
folato-Fab' asociada a liposomas, se añadió una
cantidad traza de F(ab')_{2} yodado antes de la reacción
con DTT (la proteína se yodó por medio de IodoGen según
procedimientos normalizados).
DSPE-PEG2000-MPB
(Northern Lipids, VA, Canadá), sal sódica, se incluyó en un 5% molar
de fosfolípido total. Los liposomas se constituyeron por lo demás y
se prepararon también para la etapa de carga de cationes mediada por
ionóforo de forma idéntica a la descrita para los liposomas sin
PEGilar.
Después de dejar que la mezcla de reacción
después de la etapa de carga alcanzase la temperatura ambiente, la
suspensión de liposomas se desoxigenó antes de añadir
folato-Fab' para obtener una concentración de
proteína de 0,3-0,5 mg/ml. La concentración lipídica
fue 1-3 mM determinada mediante el análisis de
fósforo de Bartlett (Bartlett, 1958). El folato-Fab'
y los liposomas se dejaron reaccionar durante 2 h a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción se aplicó después usando una columna
PD-10 equilibrada con PBS. Los
liposomas-PEG conjugados con
folato-Fab' se almacenaron a 4ºC durante
12-15 h antes del uso en los ensayos de unión de
folato-receptor.
Se midió la radiactividad asociada a liposomas
mediante un detector de tipo Nal-well corrigiendo el
desbordamiento en los canales respectivos de las muestras marcadas
doblemente. Se usaron como referencia muestras de nucleido único y
mezclas de los nucleidos.
A partir de las medidas de radiactividad, la
concentración de proteína se convirtió en el número de Fab' por
liposoma, considerando un tamaño de liposoma de 100 nm y
8\cdot10^{4} fosfolípidos/vesícula (Kirpotin et al.,
1997) y un peso molecular del anticuerpo de mieloma Fab' igual a
52.000.
La radiactividad asociada a células se midió
mediante el detector Nal (3 concentraciones superiores de
Y-90) y recuento de centelleo líquido después de
añadir Insta-Gel plus (Packard) (Tabla 3).
| Unión de liposomas con ^{90}Y conjugados con anticuerpos con o sin folato, a células OVCAR. | ||
| Liposoma añadido/célula | % de liposomas folato-negativos | % de liposomas folato-positivos |
| unidos a células | unidos a células | |
| 1\cdot10^{5} | <0,5 | 10 \pm 3 |
| 1\cdot10^{4} | 1 \pm 0,5 | 9 \pm 3 |
| 1\cdot10^{3} | 4 \pm 2 | 11 \pm 2 |
| 1\cdot10^{2} | 5 \pm 1 | 16 \pm 2 |
| 10 | 8 \pm 3 | 46 \pm 8 |
Se hicieron reaccionar
liposomas-PEG (conc. lipídica 2,5 mM) en HEPES/300
20 mM/sacarosa 300 mM con Fab' conjugado con
^{3}H-folato (0,5 mg/ml en PBS, proporción
folato/Fab de 2 \pm 0,2). Después de 2 h a temperatura ambiente,
los liposomas unidos a folato-Fab' se aislaron
mediante elución en una columna de Sepharose CL-4B.
La cantidad de ^{3}H-folato-Fab'
en los liposomas se cuantificó mediante recuento de centelleo
líquido de las fracciones obtenidas cromatográficamente, y la
proporción folato-Fab'/liposomas se determinó para
ser aproximadamente 110.
- DSPC:
- diestearoilfosfatidil colina
- DOTA:
- ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N'',N'''-tetraacético
- DSPE-PEG2000-MPB:
- N-(4-(p-maleimidofenil)butiril)-1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (Northern Lipids, VA, Canadá).
- HEPES:
- ácido N-2-hidroxietilpiperacin-N'-2-etanosulfónico
- PBS:
- solución salina tamponada con fosfato
- EDTA:
- ácido etilendiamino-N,N'-tetraacético
- HDEHP:
- ácido bis(2-etil-hexil) fosfórico
- PEG:
- polietilenglicol
- DTT:
- ditiotreitol
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Claims (34)
1. Sistema de conjugación, caracterizado
porque comprende liposomas con ionóforos y con quelante localizados
en el interior de los liposomas, y los liposomas encapsulan además
radionucleido(s) pesado(s) que emite(n)
partículas \alpha o ^{212}Pb como generador del emisor \alpha
^{212}Bi, en el que los radionucleidos pesados tienen un peso
atómico mayor de 150.
2. Sistema de conjugación según la reivindicación
1, caracterizado porque la concentración de quelante dentro
de los liposomas es adecuada para retener nucleidos hijo.
3. Sistema de conjugación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el quelante se
selecciona del grupo que comprende ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TRITA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TETA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico
(DOTMP), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico,
ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico,
ácido
dietilentriamino-N,N',N''-pentaacético
y sus derivados isoméricos, criptato[2,2,2],
criptato[3,2,2], criptato[2,2,1] y sus derivados mono-
y dibenzoicos, calix[4]arenos que contienen grupos
ricos en electrones (donadores) (hidroxilo, carboxilo, éster, amida,
amina), ácido
1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-acético,
y
1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-malonato.
4. Sistema de conjugación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los liposomas
contienen grupos activados en la membrana que permiten la
conjugación de proteínas u otras moléculas con afinidad por receptor
a estos grupos activados.
5. Sistema de conjugación según la reivindicación
4, en el que dichos grupos activados son polietilenglicol.
6. Sistema de conjugación según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los liposomas
están conjugados con proteínas de unión a receptor.
7. Sistema de conjugación según la reivindicación
6, en el que dichas proteínas de unión a receptor son anticuerpos
monoclonales o policlonales, o fragmentos o construcciones de
anticuerpos, o folato.
8. Sistema de conjugación según la reivindicación
6, caracterizado porque los liposomas están conjugados con
anticuerpos de clase IgM o IgG, o fragmentos o construcciones de
estas clases de anticuerpos.
9. Sistema de conjugación según la reivindicación
6, caracterizado porque los liposomas están conjugados con
anticuerpos de clase IgM o IgG, o fragmentos o construcciones de
estas clases de anticuerpos, en el que los anticuerpos, fragmentos o
construcciones están marcadas con folato y un radionucleido o una
mezcla de diferentes radionu-
cleidos.
cleidos.
10. Sistema de conjugación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque los
anticuerpos o fragmentos o construcciones de anticuerpos conjugados
con los liposomas son murinos, quiméricos o humanos, monoclonales o
policlonales.
11. Sistema de conjugación según la
reivindicación 10, caracterizado porque los anticuerpos o
fragmentos o construcciones de anticuerpos están marcados con
folato, en el que el sitio de unión al antígeno está dirigido hacia
la proteína de unión a folato (FBP).
12. Sistema de conjugación según la
reivindicación 10, caracterizado porque los anticuerpos o
fragmentos o construcciones de anticuerpos están marcados con
folato, en el que el sitio de unión de antígeno está dirigido hacia
un antígeno diferente de FBP.
13. Sistema de conjugación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque el
radionucleido es un emisor alfa pesado, y/o ^{212}Pb como
generador del emisor \alpha ^{212}Bi, seleccionado de
^{211}At, ^{212}Bi, ^{213}Bi, ^{212}Pb, ^{225}Ac,
^{223}Ra, ^{224}Ra y ^{227}Th.
14. Sistema de conjugación según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el nucleido
hijo y el nucleido padre son ^{212}Bi y ^{212}Pb,
respectivamente.
15. Método para preparar un sistema de
conjugación radiomarcado, caracterizado porque los liposomas
con ionóforos y quelante de una concentración adecuada se
radiomarcan de forma estable con emisores de partículas \alpha
pesados, mezclando una disolución que contiene radionucleido o una
mezcla de radionucleidos que emiten radiación de partículas
\alpha, o ^{212}Pb como generador del emisor \alpha
^{212}Bi, en la que los emisores de partículas \alpha pesados
tienen un peso atómico mayor de 150, con una disolución que contiene
liposomas e incubando a temperatura elevada, comparada con la
temperatura fisiológica, para obtener el transporte de el/los
radionucleido(s) al interior de los liposomas.
16. Método según la reivindicación 15,
caracterizado porque el quelante se selecciona del grupo que
comprende ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(DOTA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TRITA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraacético
(TETA), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico
(DOTMP), ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico,
ácido
1,4,7,10-tetraazaciclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(metilen)fosfónico,
ácido
dietilentriamino-N,N',N''-pentaacético
y sus derivados isoméricos, criptato[2,2,2],
criptato[3,2,2], criptato[2,2,1] y sus derivados mono-
y dibenzoicos, calix[4]arenos que contienen grupos
ricos en electrones (donadores) (hidroxilo, carboxilo, éster, amida,
amina), ácido
1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10-N,N'-bis-acético,
y
1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoxaciclooctadecan-1,10
N,N'-bis-malonato.
17. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 16, caracterizado porque los liposomas
contienen grupos activados en la membrana que permiten la
conjugación de proteínas u otras moléculas con afinidad por
receptor.
18. Método según la reivindicación 17,
caracterizado porque los grupos activados son
polietilenglicol.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque los liposomas
se conjugan con proteínas de unión a receptor.
20. Método según la reivindicación 19, en el que
dichas proteínas de unión a receptor son anticuerpos monoclonales o
policlonales, o fragmentos o construcciones de anticuerpos, o
folato.
21. Método según la reivindicación 19,
caracterizado porque los liposomas se conjugan con
anticuerpos de clase IgM o IgG, o fragmentos o construcciones de
estas clases de anticuerpos.
22. Método según la reivindicación 19,
caracterizado porque los liposomas se conjugan con
anticuerpos de clase IgM o IgG, o fragmentos o construcciones de
estas clases de anticuerpos, en el que los anticuerpos se marcan con
folato y un radionucleido o una mezcla de diferentes radionucleidos,
usando procedimientos normalizados para marcar el anticuerpo con
folato y radionucleidos.
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 22, caracterizado porque los
anticuerpos o fragmentos o construcciones de anticuerpos conjugados
con los liposomas son murinos, quiméricos o humanos, monoclonales o
policlonales.
24. Método según la reivindicación 23,
caracterizado porque los anticuerpos o fragmentos o
construcciones de anticuerpos se marcan con folato, en el que el
sitio de unión al antígeno está dirigido hacia FBP.
25. Método según la reivindicación 23,
caracterizado porque los anticuerpos o fragmentos o
construcciones de anticuerpos se marcan con folato, en el que el
sitio de unión al antígeno está dirigido hacia un antígeno diferente
de FBP.
26. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 25, caracterizado porque el
radionucleido es un emisor \alpha pesado o ^{212}Pb como
generador del emisor \alpha ^{212}Bi, seleccionado de
^{211}At, ^{212}Bi, ^{213}Bi, ^{212}Pb, ^{225}Ac,
^{223}Ra, ^{224}Ra y ^{227}Th.
27. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 26, caracterizado porque el nucleido
hijo y el nucleido padre son ^{212}Bi y ^{212}Pb,
respectivamente.
28. Proceso para la fabricación del sistema de
conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,
adecuado para inyección o infusión en mamíferos, que incluyen
humanos.
29. Proceso según la reivindicación 28, para
preparar una disolución farmacéutica adecuada para inyección o
infusión en mamíferos, que incluyen humanos, mediante vía de
administración intravenosa, y/o regional, y/o
intratu-
moral.
moral.
30. Uso del sistema de conjugación según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para preparar una
disolución farmacéutica adecuada para inyección o infusión en
mamíferos, que incluyen humanos, en combinación con un
radioinmunoconjugado o varios radioinmunoconjugados y/o otras formas
de terapia radiofarmacéutica, quimioterapia, radioterapia externa o
cirugía para tratar tumores malignos.
31. Uso de un sistema de conjugación según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para la fabricación de un
medicamento para inyección en pacientes humanos con el propósito de
administrar radiación potencialmente terapéutica en células malignas
que expresan receptores seleccionados de la proteína de unión a
folato, receptor de estrógeno y receptor de testosterona.
32. El uso según la reivindicación 31, en el que
dichas células malignas se derivan de tejido maligno seleccionado de
cáncer de cerebro, cáncer de pulmón, cáncer de cuello uterino,
cáncer ovárico, cáncer de mama, leucemia, linfoma y melanoma
maligno.
33. Equipo para la preparación del sistema de
conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,
caracterizado porque comprende un vial que contiene una
disolución de liposomas y un vial que contiene un radionucleido en
una disolución, que se pueden mezclar para facilitar el
radiomarcado.
34. Equipo para la preparación del sistema de
conjugación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14,
caracterizado porque comprende un vial que contiene una
disolución de liposomas y un segundo vial que contiene un
radionucleido en una disolución y un tercer vial que contiene una
molécula con afinidad por receptor, que se pueden mezclar para
facilitar el radiomarcado y el marcado con una molécula con afinidad
por receptor.
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