DE60112251T2

DE60112251T2 - Radioaktive therapeutische liposomen

Info

Publication number: DE60112251T2
Application number: DE60112251T
Authority: DE
Inventors: H. Roy LARSEN; Gjermund Henriksen
Original assignee: Algeta ASA
Current assignee: Bayer AS
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2021-02-22
Also published as: JP2003522808A; NO312708B1; CZ299032B6; BR0108572A; JP4933712B2; WO2001060417A2; EP1257299B1; ES2247069T3; US6592843B2; US20010048914A1; MXPA02008110A; AU2001237827B2; KR20020092963A; KR100822566B1; AU2001237827B8; WO2001060417A3; EP1257299B9; DK1257299T3; ATE300316T1; NZ520848A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugatorsystem, das Liposomen mit Ionophoren und mit im Inneren der Liposomen angeordnetem Chelator umfasst, wobei die Liposomen stabil mit α-Teilchen emittierenden schweren Radionukliden markiert sind. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des Konjugatorsystems sowie einen Kit zur Herstellung des Konjugatorsystems.
Biomedizinische Anwendungen von Radionukliden in der Therapie gegen Krebs konzentrierten sich bislang auf die Verwendung kationischer oder anionischer Spezies, z. B. [¹³¹I] Iodid gegen Schilddrüsenkrebs und ⁸⁹Sr zur Schmerzlinderung bei Knochenmetastasen und auf die Verwendung von hauptsächlich beta-emittierenden Radionukliden, die an monoklonale Antikörper gebunden sind (DeVita et al., 1996).
Die Anwendung der gezielten Radionuklidtherapie gegen Krebs beruht auf der Möglichkeit Methoden aufzufinden, um Radionuklide an tumorspezifische Trägerverbindungen zu binden (Gaze, 1996). Heutzutage können einige Radionuklide mit brauchbaren Strahlungscharakteristika nicht im Tumortargeting verwendet werden, da man vor dem Problem steht, eine chemisch stabile Verknüpfung zwischen dem Radionuklid und der Trägerverbindung bereitzustellen. Neue Trägersysteme können jedoch sowohl die Verwendung von Radioisotopen als auch das Arsenal der für die Therapie geeignet erachteten Radionuklide erweitern (Gaze, 1996).
Liposomen mit oder ohne an die Oberfläche gebundenen rezeptoraffinen Gruppen wurden hinsichtlich der Wirkstofffreisetzung untersucht und kürzlich klinisch bei einigen Krebsformen zur Freisetzung von Chemotherapeutika verwendet. Vor kurzem führten Entwicklungen in der Liposomenforschung zu neuen Varianten mit einer Pharmakokinetik, die diese Verbindungen als Träger für ein Radionuklid zur internen Radiotherapie gegen Krebs brauchbar machen könnten (Gabizon, 1995). Diese neuen Entwicklungen in der Formulierung und Herstellung von Liposomen führten zu kleinen Vesikeln von weniger als 100 nm mit längerer Zirkulationszeit, da die Größe der Liposomen durch Extrusion durch Membranen besser auf kleine Durchmesser begrenzt werden kann. Außerdem hat die Einführung von polyethylenglykolierten (PEG) Liposomen störende Einflüsse von Plasmaproteinen vermindert und dadurch das Erkennen und die Clearance, die durch Makrophagen des reticuloendothelialen Systems gesteuert werden, herabgesetzt (Maruyama et al., 1997). Aufgrund des anhaltenden Blutspiegels wird dadurch die Aufnahme in den Tumor erhöht. Es wurde sogar eine weitergehende Aufnahme in den Tumor erreicht, indem man Moleküle mit Rezeptoraffinität, z. B. monoklonale Antikörper oder Folat, an die Oberfläche von Liposomen konjugierte. Außerdem haben mehrere Studien gezeigt, dass die Verwendung von PEG als Linker zwischen dem Liposom und dem dirigierenden Liganden vorteilhaft ist, da hierdurch auch die Rezeptorzugänglichkeit verbessern werden kann (z. B. Maruyama et al., 1997; Gabison et al., 1999; Lee et al., 1994).
Kürzlich wurden Liposomen als Träger für Radioisotope untersucht (Goins et al., 1998; Turner et al., 1998). Pikul et al. (1987) berichteten über eine Studie auf der Grundlage von passiv aufgenommenem ²¹²Pb-Dextran (d. h. das ²¹²Pb-Dextran wurde während der Erzeugung des Liposoms zugegeben und ein Teil des ²¹²Pb-Dextrans wurde zusammen mit der wässrigen Phase, die das Innere des Liposoms darstellt, aufgenommen). Die Autoren geben keinen Hinweis darauf, dass sich diese Liposomen zur Krebstherapie eignen, sondern sie dienten primär dazu, die intrazelluläre Zelltötung in vitro mittels Radioisotop zu studieren. Es gibt keine Informationen über das Schicksal von ²¹²Bi, das aus dem Zerfall von ²¹²Pb hervorgeht, und die Liposomengröße lag im Bereich von 350–500 nm, was gegenüber der Größe (ungefähr 100 nm), die gegenwärtig als optimal zur Tumortherapie in vivo angesehen wird, sehr groß ist (Forssen, 1997). Außerdem enthielten die Liposomen kein PEG in der Membran.
Ogihar-Umeda et al. (1996) verwendeten Liposomen als Träger für die gamma-emittierenden Radionuklide ⁶⁷Ga, ¹¹¹In und ^99mTc, und schlugen die Verwendung von radiomarkierten Liposomen zur Bildgebung vor.
In einer theoretischen Studie schlugen Kostarelos et al. (1999) die Verwendung von Liposomen vor, die mit den potentiell therapeutischen Radionukliden ¹³¹I, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁸Re und ²¹¹At markiert sind, aber sie schlugen keine chemische Verfahren zur Herstellung der radiomarkierten Liposomen vor.
Die EP 386 146 B1 beschreibt eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Anwendung von in Liposomen eingeschlossenen Verbindungen in der Neuroneneinfangtherapie von Tumoren. Diese Liposomen waren jedoch mit stabilen Elementen (z. B. Bor) beladen, die erst nach Aktivierung radioaktiv werden, und die Liposomen enthalten weder Ionophore noch einen Chelator.
Utkhede et al. (1994) beschreiben Liposomen, die mit ⁹⁰Y und dem Chelator DTPA beladen sind, wobei dieser Chelator von den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Chelatoren verschieden ist. Außerdem wird die Retention eines Mutter-/Tochternuklids beziehungsweise von Mutter-/Tochternukliden nicht beschrieben und außerdem ist ⁹⁰Y kein schweres Element, wie die in dieser Anmeldung beschriebenen Elemente.
Für eine ausreichend stabile Radiomarkierung von Trägern mit alpha-emittierenden schweren Radionukliden sind üblicherweise spezielle chemische Verfahren erforderlich, die auf die Chemie des jeweiligen Elementes zugeschnitten sind, und solche Verfahren sind nicht bekannt. Man kann nicht davon ausgehen, dass Verfahren, die zum Radiomarkieren von z. B. Ga, In, Tc, Cu oder Re angewendet werden, auf kationische alpha-Teilchen emittierende schwere Radionuklide (Atomgewicht über 150) wie beispielsweise ^212/213Bi, ²¹²Pb, ^223/224Ra, ²²⁷Th oder ²²⁵Ac anwendbar sind.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Radionuklid-Liposom-Konjugatorsystem mit oder ohne rezeptoraffine Gruppen bereitzustellen, das (1) einen Chelator und (ein) alpha-Teilchenstrahlung emittierende(s) schwere(s) Radionuklid(e) umfasst, (2) (ein) Tochternuklid(e) binden kann, wenn das (die) Mutternuklid(e) in dem Liposom eingeschlossen ist und (3) sich durch ein aktives Aufnahmeverfahren, welches sich für eine Reihe von Radionukliden eignet, herstellen lässt; die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung des Systems und einen Kit zur Herstellung des Systems. Diese Aufgaben wurden durch die vorliegende Erfindung gelöst, die durch die beigefügten Ansprüche charakterisiert ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konjugatorsystem, das Liposomen mit Ionophoren, d. h. einem Metallextraktionsmittel für Liposomen, und mit Chelator und (einem) schweren Radionuklid(en) (Atomgewicht über 150), angeordnet im Inneren des Liposoms, umfasst. Die Liposomen werden durch aktives Inkorporieren des Radionuklids hergestellt, d. h. über Ionophore, und sie werden gemäß Verfahren hergestellt, die Liposomen mit einer Größe von typischerweise 100 nm ergeben. Das erhaltene Produkt zeigt eine gute chemische Stabilität über mehrere Tage und kann auch (ein) Tochternuklid(e) im Inneren des Liposoms binden, z. B. aus der Umwandlung von ²¹²Pb zu ²¹²Bi. Die Liposomen können mit oder ohne modifizierende Gruppen wie Polyalkylenoxide, z. B. PEG, die an die Membran gebunden sind, hergestellt werden. Im Folgenden wird auch ein Verfahren zur Verknüpfung solcher radiomarkierter Liposomen an tumorsuchende Proteine, wie beispielsweise monoklonale Antikörper, die mit Folat konjugiert sind, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher unter Bezug auf die Figuren und Beispiele beschrieben.
1: Bindung von PEGylierten Liposomen, enthaltend Fab'- oder Folat-markierte Fab'-Antikörper, die an die Liposomenmembran konjugiert sind, an OVCAR 3-Zellen
2: Bindung von PEG-Liposomen an OVCAR 3-Zellen, wobei die PEG-Liposomen mit Folat oder nicht mit Folat markiert sind.
Zur Entwicklung von zur Krebstherapie geeigneten radiomarkierten Liposomen haben die vorliegenden Erfinder die Herstellung und Verwendung von Liposomen, die mit alpha-Teilchen emittierenden schweren Radionukliden (d. h., Atomgewicht über 150) beladen sind, auf der Basis der Radionuklide ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁴Ra, ²²⁵Ac, ²¹²Pb und ²²⁷Th untersucht. Bei Verwendung von Liposomen (Vesikeln) mit Ionophoren wurden radiomarkierte Liposomen mit vorzugsweise einem Chelator (d. h. die Liposomen kapseln Radionuklid und Chelator ein) mittels des aktiven Inkorporiens des Radionuklids hergestellt und sie wurden gemäß Verfahren hergestellt, die Liposomen mit einer typischen Größe von 100 nm ergaben.
Man stellte unilamellare Vesikel durch Hydratation eines dünnen Lipidfilms und anschließende Extrusion folgendermaßen her (Olson et al. 1979, MacDonald et al. 1991): DSPC (Distearoylphosphatidylcholin) und Cholesterin in einem molaren Verhältnis von 2:1, typischerweise 10 und 5 μmol, wurden in Chloroform in einem Rundkolben gelöst. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck entfernt. Der trockene Lipidfilm wurde danach in 0,5–1 ml 150 mM Citronensäure, 30 mM DOTA (1,4,7,10-Tetraazacyclodedecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure), pH 4, hydratisiert. Die erhaltene Suspension wurde fünf Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen, danach wurde wiederholt durch Polycarbonatfilter, fünfmal bei einer Porengröße von 100 nm und fünfmal bei einer Porengröße von 50 nm, unter Verwendung einer manuelle Extrusionsvorrichtung extrudiert (Avestin, Ottawa, Kanada). Das Produkt wies eine Lipidkonzentration von ungefähr 30 mM auf. Die externe Lösung wurde durch Eluieren an einer PD-10-Säule gegen 250 mM Saccherose, 20 mM HEPES (N-2-Hydroxy ethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), pH 7,4, ausgetauscht und anschließend wurden die Liposomen mit Radionuklid beladen.

a) Liposombestandteile: Wässriges Medium im Inneren: pH 1–14, vorzugsweise 2–9, insbesondere 4–5. Bestandteile: Wasser; Mittel, die den gewünschten pH-Wert in dem wässrigen Medium im Inneren über den gewünschten Zeitraum aufrecht zu halten vermögen, d. h., bis das Ionophoren-vermittelte Inkorporieren des (der) Radiometalls(e) begonnen hat. Vorzugsweise führen die Bestandteile des wässrigen Mediums im Inneren ebenfalls zu einer Komplexierung des (der) Radiometalls(e). Dies lässt sich erreichen durch i) beispielsweise elektrostatische Donorfunktionen der zur Einstellung des pH-Werts verwendeten Mittel, beispielsweise das (die) Sauerstoffatom(e) in Acetat, Citrat und verwandten Verbindungen; ii) zusätzlich mit einem Komplexierungsmittel im wässrigen Medium im Inneren, z. B. EDTA, DTPA, DOTA, DOTMP und verwandte Verbindungen.
b) Ionophore: z. B. Mittel, das im Wesentlich irreversibel ein Radiometall durch die Lipid-Doppelschicht aus der extraliposomalen Phase in das Innere des Liposoms zu transportieren vermag. Beispiele: Ionophore, die bekanntlich in der gewünschten Weise wirken: Calciumionophor A 23187, Dicyclohexyl-18-C6, Bibenzo-18-C6, 2,3-Dimercapto-1-propanol, Pb-Ionophor.
c) Bestandteile der Lipid-Doppelschicht: Bestandteile der Lipid-Doppelschicht laufen vorzugsweise auf eine Mischung hinaus, die Vesikel zu bilden vermag und für die die Übergangstemperatur von flüssig zu fest oberhalb der physiologischen Temperatur liegt; z. B. i) Phospholipide. Beispiele: langkettige, Alkylphosphatidylcholine, z. B. 1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DLPC), 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPPC), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC), 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC); ii) Sterine oder Verbindungen, die ähnliche Eigenschaften dahingehend aufweisen, dass sie die Lipid-Doppelschicht (Abnahme der Fluidität der Lipid-Doppelschicht) verstärken. Beispiele: Verbindungen aus der Klasse der Sterine: Cholesterin und Cholesterin-3-sulfat und iii) (sterisch) in vivo Stabilisator(en) zur Erhöhung der gegen Tumorzellen gerichteten Eigenschaften des Konstrukts und zur Erhöhung der Verweilzeit im Blut, z. B. Polyether, Polyethylenglycole. Der Einbezug von PEG und/oder PEG-Derivaten in Liposomen-Formulierungen ist von Vorteil, da die Clearance der injizierten Liposomen aus dem Kreislaufsystem durch das reticuloendotheliale System vermindert wird; üblicherweise enthalten in der Zubereitung in einer Menge von 3–10 Mol-%, bezogen auf Phospholipid. Die Menge an Stabilisator, die zur Erzielung des gewünschten Stabilisierungseffekts notwendig ist, hängt jedoch von dem Monomer (elektrostatische und polare Eigenschaften) und der Anzahl der Wiederholungseinheiten ab, d. h. der Kettenlänge. Beispiele (PEG und/oder PEG-Derivate): 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly(ethylenglykol) 2000] (PEG2000 DJ\IPE), 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly(ethylenglykol)2000] (PEG2000 DPPE), 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[poly(ethylenglykol)2000] (PEG2000 DSPE).
d) Bestandteile, welche die Modifizierung des Konstruktes leichter machen, damit es über Tumorzellen-dirigierende Eigenschaften verfügt: Die Wahl des geeigneten aktivierten Lipids wird durch die Beschaffenheit des Haptens ebenso wie durch die Erfordernisse der Untersuchung bestimmt. Die Effizienz der Reaktion wird durch die Abgangsgruppe, den hydrophilen Spacer, die Stoffeigenschaften des Liposoms und die Konzentration der Reaktanten bestimmt. Bei in vivo-Untersuchungen, in denen das Hapten mit dem Liposom assoziiert bleiben muss, erzielt man deutliche Vorteile, wenn man längerkettige Acylketten als Lipidanker wählt, die langsamer zwischen Membranen austauschen. Außerdem sollte die kovalente Bindung zwischen Hapten und Lipidanker sowohl gegenüber einer chemischen als auch einer enzymatischen Spaltung stabil sein. Die aktivierten Lipide können die Aufgabe haben, beispielsweise Amin-, Amid-, Thioether- oder Disulfidbindungen zwischen dem Lipid und Modifikator zu bilden. Wenn sterische Stabilisatoren in der Zubereitung enthalten sind, z. B. PEG und/oder PEG-Derivate, so befindet sich die Gruppe für die Kupplung vorzugsweise am Ende einer Verbindung, die gleich oder ähnlich dem Stabilisator ist und eine effektive Kettenlänge aufweist, die gleich oder länger als die des Stabilisators ist. Beispiele: Vesikelbestandteile von PEG und/oder PEG-Derivaten, welche die Modifizierung von Konstrukten erleichtern, damit sie über Tumorzell-dirigierende Eigenschaften verfügen: N-[w-(2-Pyridyldithiopropionylamino)poly(ethylenglycol) 2000], 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (PDP-PEG2000-DSPE), N-{w-[4-(p-Maleimidophenyl)butanoyl]amino}poly(ethylenglycol) 2000], 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (MpB-PEG2000-DSPE).

Die Abtrennung eines mit einem Liposom assoziierten Radionuklids von einem nicht assoziierten Radionuklid gelang mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie (Mauk und Gamble 1979, Tilcock et al. 1991). Im Anschluss an die Liposomenbeladung verwendete man zur Abtrennung PD-10-Größenausschlusssäulen. Wenn Volumina von 1 ml oder weniger auf die PD-10-Säulen aufgetragen wurden, so eluierten die Liposomen in den ersten 4,5 ml. Nicht mit Liposomen assoziierte Radionuklide eluierten in der Fraktion, die den niedermolekularen Spezies entsprach. PD-10-Säulen wurden ebenfalls in der Untersuchung über die Stabilität (hinsichtlich der Retention von Radionuklid) der beladenen Liposomen in PBS verwendet.
Die Trennung von an Liposomen assoziierten Radionukliden von freien Radionukliden im Serum gelang durch Größenausschlusschromatographie an einer Sepharose-CL-4B-Säule (Hwang und Mauk, 1977). So konnte man Lösungen mit radioaktiven Liposomen, die in einem flüssigen Träger dispergiert waren, im Wesentlichen frei von ungebundenen Radionukliden herstellen.
Vor der Chromatographie gab man EDTA (Ethylendiamin-N,N'-tetraessigsäure) zu, um das freie Radionuklid in einem Status zu stabilisieren, der eine problemlose Abtrennung von der mit Liposomen assoziierten Fraktion gestattet.
Der Beladungsgrad von Radionuklid für und die Latenz von Liposomen, die mit Radionukliden assoziiert waren, wurde durch gamma-Spektroskopie für ²²⁸Ac, ²²³Ra, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²⁰⁵Bi und ²⁰⁷Bi nachgewiesen. ²²⁸Ac und ^205/207Bi wurden als Tracer für die potentiell therapeutisch brauchbaren Radionuklide ²²⁵Ac, ²¹²Bi und ²¹³Bi verwendet.
Die vorliegenden Erfinder machten die wichtige und unerwartete Entdeckung, dass nach dem Zerfall von ²¹²Pb, das in diesem Typ von Liposomen enthalten war, eine signifikante Translokation von ²¹²Bi nicht erfolgte. Bezüglich der Verwendung von ²¹²Pb als molekular verknüpfter Generator des ²¹²Bi wird momentan die Auffassung vertreten, dass üblicherweise aus einem Chelator eine signifikante Freisetzung (≥ 30%) erfolgt (McClure und Feinendegen, 1998; Mirzadeh et al., 1993). Wenn man jedoch das ²¹²Pb mit einem in hoher Konzentration vorhandenen Chelator abfängt, wie beispielsweise im Inneren des Liposoms, so könnte die Freisetzung des Tochterprodukts bei Bereitstellung eines Konjugatorsystems, das zum Abfangen des Tochternuklids nach der Kernumwandlung verwendet werden könnte, vermieden werden. Hierin wird zum ersten Mal über ein Konjugatorsystem für ²¹²Pb berichtet, das das Tochternuklid ²¹²Bi fast quantitativ binden kann. Daher betrifft die vorliegende Erfindung Liposomen mit Ionophoren, die ein im Inneren des Liposoms (Konjugatorsystem) angeordnetes Radionuklid und einen Chelator umfassen, und wobei dieses Konjugatorsystem das Tochternuklid binden kann oder nicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Chelator ausgewählt sein unter
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA),
1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TRITA),
1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA),
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure (DOTMP),
1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure,
1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure,
Diethylentriamin-N,N',N''-pentaessigsäure und isomeren Derivaten davon,
Kryptat[2.2.2], Kryptat[3.2.2], Kryptat[2.2.1] und Mono- und Dibenzoderivaten davon,
verbrückten Calix[4]arenen mit elektronenreichen (Donor-) Gruppen (Hydroxyl, Carboxyl, Ester, Amid, Amin),
1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bisessigsäure und
1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bismalonat.
Eine weitere wichtige und überraschende Entdeckung war, dass Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung wirksam ²²³Ra einschließen und binden können. Hiermit wird erstmalig ein Konjugatorsystem beschrieben, das sich potentiell für Tumortargeting mit Radium-223 eignet. Außerdem zeigen wir, dass ebenfalls Bismut und Actinium in dem vorliegend beschriebenen Typ von Liposomen eingeschlossen und fest gebunden werden kann und zeigen, dass Konjugatorsysteme auf der Basis von ²¹²Bi, ²¹³Bi und ²²⁵Ac ebenfalls hergestellt werden können.
Das erfindungsgemäße Konjugatorsystem kann mit oder ohne modifizierende Gruppen an der Oberfläche, z. B. PEG, in der Liposomenmembran (PEG-modifizierte/PEGylierte Liposomen) hergestellt werden. Der Vorteil der Verwendung von PEG in der Membran ist, dass einige PEG-reaktive Gruppen bereitgestellt werden, die eine Konjugation von Proteinen wie z. B. Antikörper, Antikörperfragmente oder -konstrukte oder Folat, oder anderen rezeptoraffinen (Rezeptorbindung) Proteinen/Molekülen gestatten.
Die vorliegende Anmeldung betrifft außerdem einen neuen Typ von Liposomen mit Rezeptorbindungsproteinen, die an die Liposomenmembran gebunden sind. Wir beschreiben im Folgenden radiomarkierte, PEGylierte Liposomen, die an Antikörper, die mit Folat markiert sind, konjugiert sind. Die Verwendung von Folat und Folatderivaten, um auf Tumore zu zielen, die Folatbindungsproteine (FBP), ein Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol-verknüpftes Zellmembranprotein, das in die zelluläre Aufnahme von oxidierten Folaten über Endocytose involviert ist, exprimieren, hat unter Forschern Aufmerksamkeit erregt (Kranz et al., 1996; Reddy et al., 1998; Shinoda et al., 1998; Trippet et al., 1999). Da bekanntlich mehrere Typen von menschlichen Krebszellen FBP überexprimieren, kann dieser Rezeptor ein mögliches Ziel für die Freisetzung von therapeutischen Radioisotopen sein, die mit Folat konjugiert sind. Daher könnte man durch Verwendung von Antikörpern, die an Folat konjugiert sind, eine zielgerichtete Radionuklidtherapie gegen Krebs erhalten. Wenn außerdem die folatmarkierte Antikörper-Antigen-Bindungsstelle gegen einen Tumor gerichtet ist, der mit einem von FBP verschiedenen Antigen assoziiert ist, so erreicht man eine duale Bindungsmöglichkeit (d. h. Affinität sowohl zum Antikörper-Antigen als auch zum FBP-Rezeptor wird erzielt). Unseres Wissens nach wird hiermit zum ersten Mal die Konjugation von Antikörpern, die mit Folat markiert sind, beschrieben.
Die mit Folat markierten Antikörper, die erfindungsgemäß an die Liposomen konjugiert sind, können außerdem mit einem Radionuklid oder einem Gemisch verschiedener Radionuklide markiert sein, um die Radiotherapie zu verbessern.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass diese neue Kombination von mit Folat markierten Antikörpern, die an Liposomen konjugiert sind, verwendet werden kann, um mit Radionuklid(en) auf Zellen zu zielen, die Folatrezeptoren exprimieren. Dies ist insbesondere brauchbar bei alpha-Teilchen Emittern, die Strahlungsemitter mit hochlinearem Energietransfer (high-LET) sind, die extrem cytotoxisch für Säugerzellen ist (Hall, 1994; Larsen et al., 1998; Ritter et al., 1977). Eine alpha-Strahlungsquelle kann jedoch Strahlung an eine besonders kleine Fläche, bezogen auf andere Strahlungsarten, abgeben. Wenn daher eine alpha-Strahlungsquelle gegen ein Zielgewebe gerichtet ist, so kann dies die Strahlungsexponierung für das gesunde Gewebe reduzieren.
Man könnte auch ein erfindungsgemäßes Konjugatorsystem verwenden, um auf Zellen zu zielen, die beispielsweise den Östrogenrezeptor oder Testosteronrezeptor exprimieren, indem man Antikörper an Östrogen oder Testosteron konjugiert.
Die erfindungsgemäß verwendeten markierten Antikörper sind vorzugsweise von der Klasse IgG oder IgM und/oder Fragmente und/oder Konstrukte (z. B. Minikörper) davon. Außerdem können diese Antikörper und/oder Fragmente und/oder Konstrukte von der Maus stammen, chimärer Natur sein oder völlig vom Menschen stammen, polyklonal oder monoklonal sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugatorsystems zur Herstellung einer pharmazeutischen Lösung, die zur Injektion oder Infusion in Säuger, einschließlich des Menschen, durch intravenöse und/oder regionale und/oder intratumorale Verabreichungsweise geeignet ist. Die pharmazeutische Lösung kann in Kombination mit einem Radioimmunkonjugat oder verschiedenen Radioimmunkonjugaten und/oder anderen Formen der radiopharmazeutischen Therapie, Chemotherapie, äußerliche Strahlungsbehandlung oder Chirurgie zur Behandlung bösartiger Tumore verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugatorsystems zur Behandlung bösartiger Tumore, wie z. B. Gehirnkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Eierstockkrebs oder Brustkrebs, oder Leukämie, Lymphomen und bösartigen Melanomen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Kit zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugatorsystems, das ein Behältnis mit einer Liposomlösung und ein zweites Behältnis mit einem Radionuklid in einer Lösung, die zu erleichterten Radiomarkierung vermischt werden kann, umfasst. Außerdem kann man mit einem dritten Behältnis mit einem Protein und/oder Molekül mit Rezeptoraffinität vermischen, um ein rezeptoraffines Konjugatorsystem zu erhalten.
Reagenzien und Geräte
Gamma-Spektroskopie wurde mittels eines Germaniumdetektors (Canberra, Meriden, CT, USA), der mit einem Multikanalanalysator (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, USA) gekoppelt war, durchgeführt. Als Flüssigkeitsszintillationszähler verwendete man ein Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, USA). DSPC und Cholesterin wurden von Northern Lipids (Vancouver, Canada) bezogen. Sephadex G-25 PD-10-Säulen (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) wurde zur Reinigung von radiomarkierten Liposomen verwendet. Der makrocyclische Chelator DOTA wurde als intraliposomaler Chelator verwendet und von Macrocyclics (Richardson, TX, USA) bezogen. Ultrareine HNO₃ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA) und 6 M HCl (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) und bis(2-Ethylhexyl)phoshorsäure (HDEHP) von Fluka (über Sigma-Aldrich AS, Norwegen) wurden in dieser Untersuchung verwendet.
Sämtliche Puffer, die für die Ionophoren-vermittelte, kationische Beladung von Liposomen verwendet wurden, wurden auf den gewünschten pH mittels Arginin (freie Base) eingestellt. Das gesamte verwendete Wasser wurde mit Hilfe eines Milli-Q-Wasserreinigungssystem erhalten (Millipore, Bedford, MA, USA). Ionenaustauscherharze wurden von Bio-Rad (Hercules, CA, USA) bezogen.
Die Harze wurden vorkonditioniert, indem mit Wasser, danach mit 6 M HCl und anschließend mit Aceton und schlussendlich mit Wasser gewaschen wurde. Die Harze wurden im Wasser aufbewahrt, bis man die Säulen bepackte.
Das verwendete DMSO wurde über Molekularsieb 4 Å aufbewahrt.
Das in dieser Arbeit verwendete ²³²Th(NO₃)₄ wurde mehr als 20 Jahre aufbewahrt. Die Probe wurde vom Nuclear Chemistry Group, Department of Chemistry University of Oslo, Oslo, Norwegen, bereitgestellt.
³H-Folsäure von Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK) bezogen.
Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich, Norwegen, bezogen.
Table 1 zeigt einige physikalische Eigenschaften von Radionukliden, die in Experimenten mit Liposomen eingesetzt wurden. Tabelle 1

* Aufgelistet ist nur der häufigste Gammastrahl für jedes Radionuklid. Daten von Nuclear Data Sheets, Academic Press INC.

Bestes Verfahren
Man belud die nach den beschriebenen Verfahren hergestellten Liposomen mit Radium-223 oder Blei-212. Danach wurden Antikörper mit Liposomen umgesetzt, um Antikörpermoleküle an der Oberfläche der Liposomen zu erzielen. Eine Liposomengröße von etwa 100 μm ist für eine systemische Freisetzung geeignet, typische Größen von 200–1000 μm können aber, wenn eine intrakavitäre Freisetzung, z. B für die Behandlung von intrakranialem Hirntumor oder zur Behandlung von intraperitonealem Eierstockkrebs erzielt werden soll, verwendet werden. (Bei Injektion der Zubereitung könnte die größere Liposomengröße die Clearancegeschwindigkeit aus der Kavität verlangsamen und dadurch könnte eine hohe Konzentration in dem Tumorbereich aufrecht erhalten werden).
BEISPIELE
Beispiel 1: Beladung von ²¹²Pb/²¹²Bi in Liposomen
Verfahren: ²¹²Pb/²¹²Bi wurde durch ²²⁰Rn-Emanation aus einer ²²⁸Th-Quelle hergestellt, wie von Hassfjell und Hoff (1994) beschrieben. Trägerfreies ²¹²Pb/²¹²Bi sickerte bei Verwendung von 0,1 M HNO₃ aus dem Sammelgefäß und die Lösung wurde auf eine 2 × 20 mm Säule mit AG 50W-4 Kationenaustauscherharz aufgetragen. ²¹²Pb/²¹²Bi wurde danach in 2 M HCl eluiert und die Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Das ²¹²Pb/²¹²Bi wurde danach in 200 μl einer 10 mM Acetatlösung, pH 5, gelöst. ²¹²Pb wurde durch Messung seines 238,6 keV Gammastrahls (Tabelle 1) quantifiziert. ²¹²Bi wurde durch Messung des 583,1 keV Gammastrahls seines Folgeproduktes ²⁰⁸Tl im radioaktiven Gleichgewicht gemessen.
Ergebnisse: Man fand, dass nach Inkubationszeiten von bis zu 3 Tagen weniger als 0,2% der zugesetzten Aktivität mit den Liposomen assoziiert war.
Man mischte Liposomen, die einer Lipidkonzentration von 30–60 mM entsprachen, kräftig mit dem Ionophoren A23187 (10–13 nM), das in Form eines Films vorlag. Danach gab man etwa 1 MBq ²¹²Pb/²¹²Bi zu und inkubierte das Gemisch 30 Minuten bei 75°C und eluierte anschließend an einer PD-10 Säule. Die Fraktion mit mehr als 95% an beladenen Vesikeln wurde danach auf einer zweiten PD-10-Säule eluiert. Die Latenz von ²¹²Pb/²¹²Bi, das mit Liposomen assoziiert war, wurde durch Inkubieren der Vesikel bei 37°C in menschlichem Serum oder PBS untersucht. Die Aktivitätsverteilung wurde über einen Zeitraum von 24 h verfolgt.
Ergebnisse: Beladungseffizienz von ²¹²Pb: 34,8% (n = 3)
Retention wurde durch Gammaspektroskopie bestimmt und mehr als 99% von ²¹²Pb war mit den Liposomen nach Inkubationszeiten von bis zu 24 h assoziiert.
Beispiel 2: Retention von ²¹²Bi, das sich beim Zerfall von ²¹²Pb, das mit Liposomen assoziiert war, bildete
Verfahren: Liposomen wurden mit ²¹²Pb beladen, wie zuvor beschrieben. Die mit dem Liposom assoziierte Radioaktivität wurde durch Eluieren des Reaktionsgemischs mit 10 mM EDTA in PBS an einer mit 10 mM EDTA in PBS voräquilibrierten PD-10-Säule isoliert.
Um sicherzustellen, dass sich das transiente Gleichgewicht zwischen ²¹²PB und ²¹²Bi ausgebildet hatte, wurden nach 3 Stunden Aliquote der Lösung auf mit 10 mM EDTA in PBS voräquilibrierte PD-10-Säulen aufgetragen, um freie Radionuklide von Radionukliden, die mit mit Liposomen assoziiert waren, zu trennen. Die Aktivitätsverteilung wurde über einen Zeitraum von 24 h verfolgt.
Ein gesonderter Aliquot der markierten Liposomen, den man nicht dem Trennverfahren unterworfen hatte (von identischer Geometrie zu dem, den man bei chromatographischen Verfahren erhalten hatte), wurde zur Verwendung als Standard gemessen. Dies diente dazu, das Aktivitätsverhältnis von ²¹²Bi/²¹²Pb im radioaktiven Gleichgewicht zu bestimmen.
Ergebnisse: Man verglich das Verhältnis von ²¹²Bi/²¹²Pb, das man für die durch Chromatographie getrennten Liposomen erhalten hatte, mit dem des Gemischs im Gleichgewicht, und berechnete, dass nach dem Zerfall von mit Liposom assoziiertem ²¹²Pb mehr als 95% des ²¹²Bi in den Liposomen gebunden war.
Außerdem wurden die zwei durch Chromatographie erhaltenen Fraktionen hinsichtlich der gemessenen ²¹²Bi-Aktivität verglichen. Mehr als 99% der gesamten ²¹²¹Bi-Aktivität eluierte in den Fraktionen, die den Liposomen entsprachen.
Beispiel 3: Untersuchungen über mögliches erneutes Beladung von Pb und Bi in Liposomen
Verfahren: Liposomen, entsprechend 30–60 mM Lipid, einschließend 150 mM Zitronensäure, 30 mM DOTA und unter Verwendung einer externen Lösung mit 10 mM EDTA in PBS wurden zu dem Ionophor A23187 (20–26 nmol an der inneren Oberfläche eines Glasbehältnisses), das in Form eines Films vorlag, gegeben. Danach gab man ²¹²Pb und ²¹²Bi in PBS zu und inkubierte anschließend bei 37°C. Aliquote der Lösung wurden durch PD-10-Säulen eluiert und die chromatographisch erhaltenen Fraktionen, die dem Liposomeneluat entsprachen, wurden mittels des intrinsischen Ge-Detektors untersucht.
Ergebnisse: Über einen Zeitraum von 24 h stellte man keine nachweisbare Beladung (< 1%) von ²¹²Pb und ²¹²Bi fest.
Beispiel 4: Beladung von ²²³Ra in Liposomen
²²³Ra wurde aus einem Generator auf Basis von ²²⁷Ac erzeugt, wie beschrieben (Larsen und Henriksen, 1999). Mit kurzen Worten, ²²⁷Ac und sein Tochternuklid ²²⁷Th werden in einer chromatographischen Extraktionssäule mit Harz zurückgehalten, was das Eluieren von ²²³Ra mit Mineralsäure erleichtert. Zur Aufnahme von Radium in Liposomen wurde die aus dem Generator eluierte Lösung zur Trockne eingedampft und ²²³Ra wurde in 5 mM Citrat, pH 7,4, gelöst.
Liposomen, die einer Lipidkonzentration von 30–60 mM entsprachen, wurden kräftig mit dem Ionophor A23187 (10–13 nmol an der inneren Oberfläche eines Glasbehältnisses), das in Form eines Films vorlag, vermischt. Danach wurde mit etwa 50 kBq ²²³Ra versetzt und das Gemisch 20 Minuten bei 75°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde danach zu 100 μl 10 mM EDTA gegeben und an einer PD-10 Säule zur Gewinnung der mit den Lipidvesikeln assoziierten Radioaktivität eluiert.
Die Retention von mit Liposomen assoziiertem ²²³Ra wurde durch Inkubieren der Vesikel in menschlichem Serum (Sigma) oder in 5 mM EDTA in menschlichem Serum bei einer Liposomenkonzentration von 0,3 mg Gesamtlipid/ml Serum bei 37°C untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt und zeigen, dass ²²³Ra sehr stabil in den Liposomen gebunden wird.
Tabelle 2
Beispiel 5: Bestimmung, falls Nachbeladung einen Beitrag in dem ²²³Ra-Retentionsversuch leisten würde.
Verfahren: Liposomen, entsprechend 30–60 nM Lipid, gebildet durch Hydratation von Lipidfilmen mit 150 mM Citronensäure, 30 mM DOTA, äußerliche Lösung PBS oder Serum, wurden zu dem Ionophor A23187 (10–13 nmol verteilt auf der inneren Oberfläche eines Glasbehältnisses), das in Form eines Films vorlag, gegeben. Danach gab man ²²³Ra in 5 mM Citrat, pH 7,4, zu und inkubierte anschließend bei 37°C. Aliquote der Lösung wurden auf PD-10-Säulen aufgetragen und die chromatographisch erhaltenen Fraktionen, die den Liposomen entsprachen, wurden mittels des intrinsischen Ge-Detektors untersucht.
Beispiel 6: Beladung von ²⁰⁷Bi in Liposomen
Verfahren: ^203–207Bi wurde durch (p. xn) Reaktionen an natürlichen Bleitargets erzeugt und chromatographisch unter Verwendung eines bleiselektiven Extraktionsharzes gereinigt (Henriksen und Hoff, 1998).
Ein Bi-Isotopengemisch, das hauptsächlich aus ²⁰⁵Bi und ²⁰⁷Bi bestand, im Folgenden als ²⁰⁷Bi bezeichnet, wurde in dieser Studie verwendet. 50 μl einer Lösung von ²⁰⁷Bi in 10^–4 M HCl wurde zu den Liposomen, die 30–60 mM Lipid entsprachen, gegeben, die zuvor mit dem Ionophor A23187 (10–13 nmol auf der inneren Oberfläche des Glasbehältnisses), das in Form eines Films vorlag, gemischt und bei 75°C 30 Minuten inkubiert worden waren. Das Reaktionsgemisch wurde danach zu 100 μl 10 mM EDTA gegeben und an einer PD-10-Säule zur Gewinnung der mit den Lipidvesikeln assoziierten Radioaktivität eluiert.
Ergebnisse: Man fand, dass 32% des gesamten ²⁰⁷Bi mit den Liposomen assoziiert war.
Beispiel 7. Beladung von ²²⁸Ac in Liposomen
Verfahren: ²²⁸Ac wurden aus einer ²³²Th(NO₃)₄-Zubereitung durch Kombination von Lösungsmittelextraktion und Ionenaustausch isoliert. ²³²Th(NO₃)₄ (4H₂O ursprünglich) wurden in 20 ml 0,1 M HNO₃ gelöst und in einen 500 ml Scheidetrichter gegeben und mit 5 × 100 ml einer 2 M Lösung von HDEHP in Heptan in Kontakt gebracht. Die wässrige Phase wurde danach dreimal mit Heptan gewaschen und danach auf einer 3 × 40 mm Säule mit AG50W-X12 Kationenaustauscherharz zur Gewinnung von ²²⁸Ac aufgetragen, wie beschrieben (Cabell, 1959). Von der Säule wurde ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra und ²²⁸Ra in 3 M HNO₃ eluiert und die Lösung wurde > 20 h stehen gelassen. Danach wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und anschließend wurden die Radionuklide mit 1 ml 1 M HNO₃ aus dem Behälter herausgelöst. Diese Lösung wurde auf eine 30 × 40 mm Säule mit AG50W-X12 aufgetragen. Erneut wurden ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra und ²²⁸Ra in 3 M HNO₃ eluiert. ²²⁸Ac wurde in 6 M HNO₃ eluiert und das Eluat wurde zur Trockne eingedampft. ²²⁸Ac wurde danach aus dem Behälter unter Verwendung von 200 μl 5 mM HNO₃ herausgelöst. Ungefähr 6 kBq von ²²⁸Ac wurde zu den Liposomen, die das Ionophor A23187 enthielten, gegeben, wie zuvor beschrieben, und bei 75°C 60 min inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde danach zu 100 μl 10 mM EDTA gegeben und an einer PD-10-Säule zur Gewin nung der mit den Lipidvesikeln assoziierten Radioaktivität eluiert. Fraktionen, die mehr als 95% der beladenen Vesikel enthielten, wurden gepoolt und danach an einer zweiten PD-10-Säule eluiert. Die Retention von ²²⁸Ac im Liposom wurde untersucht, indem die radiomarkierten Vesikel bei 37°C in menschlichem Serum oder PBS inkubiert wurden. Die Aktivitätsverteilung wurde über einen Zeitraum von 24 h verfolgt.
Ergebnisse: In dem Beladungsversuch war nach der Beladung 90–95% des zugefügten ²²⁸Ac (berichtigt bezüglich des Zerfalls während Markierung und Reinigung) mit den Liposomen assoziiert. Man fand, dass in dem Retentionsexperiment mehr als 98% des ²²⁸Ac mit den Liposomen nach Inkubationszeiten von bis zu 24 h assoziiert war.
Beispiel 8: Beladung von ⁹⁰Y
Verfahren: ⁹⁰Y wurde in diesem Beispiel als Tracer verwendet, um das Verhalten von radiomarkierten Liposomen zu untersuchen. In dieser Untersuchung wurden ⁹⁰Y und ⁹⁰Sr durch Flüssigszintiallationszählung gemessen.
⁹⁰Y wurde von ⁹⁰Sr mittels Chromatographie an einem strontiumselektiven Extraktionsharz abgetrennt, wie von Dietz und Horwitz (1992) beschrieben. Hierbei wurde ⁹⁰Sr (Amersham, Buckinghamshire, England) in 0,1 M HNO₃ zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 3 M HNO₃ versetzt. Die Lösung wurde auf einer 3 × 20 mm Säule mit Sr-Harz (EiChroM. Darien IL, USA) aufgetragen und die Säule wurde mit 5 ml 3 M HNO₃ gewaschen.
Bei diesem Verfahren wird selektiv ⁹⁰Y eluiert, während Sr ausreichend an der Säule gebunden wird, so dass der ⁹⁰Sr-Gehalt in einem ⁹⁰Sr/⁹⁰Y-Gemisch um einen Faktor von ungefähr 10³ (Dietz und Horwitz, 1992) verringert wird. Danach wurde ⁹⁰Sr von der Säule unter Verwendung von 0,05 M HNO₃ abgelöst und diese Lösung wurde eine Woche stehen gelassen, um es ⁹⁰Y zu ermöglichen, hineinzuwachsen. Nachdem man die Lösung zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit 3 M HNO₃ versetzt hatte, trennte man die Radionuklide an einer zweiten Säule an Sr-Harz ab. Das ⁹⁰Y enthaltende Eluat wurde zur Trockne eingedampft und das Radionuklid wurde aus dem Behältnis unter Verwendung von 200 μl 5 mM HNO₃ herausgelöst. Diese Lösung wurde zu Liposomen, die das Ionophor A23187 (wie zuvor beschrieben) enthielten, gegeben und bei 75°C 60 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde danach zu 50 μl 10 mM EDTA gegeben und an einer PD-10-Säule zur Isolierung der mit den Lipidvesikeln assoziierten Radioaktivität eluiert. Die Fraktion, die mehr als 95% der Vesikel entsprach, wurde danach an einer zweiten PD-10-Säule eluiert. Die Retention von mit Liposom assoziierten ⁹⁰Y in Liposomen wurde durch Inkubieren der Vesikel in menschlichem Serum oder PBS bei 37°C untersucht. Die Aktivitätsverteilung wurde über einen Zeitraum von 4 Tagen verfolgt.
Ergebnisse: Nach 1 Stunde Beladung und Reinigen mit Gelausschlusschromatographie an einer Säule waren mehr als 95% des zugesetzten ⁹⁰Y mit den Liposomen assoziiert.
In der Untersuchung über die Retention im Liposom erhielt man folgende Ergebnisse. Nach 5 h und 1 Tag war mehr als 99% mit Liposomen assoziiert. Nach 4 Tagen betrug der Anteil der Fraktion mit assoziiertem Liposom 98 ± 1%.
Wie in diesen Experimenten gezeigt, können Liposomen mit alpha-Teilchen und/oder beta-Teilchen emittierenden Radionukliden radiomarkiert werden und diese Nuklide gut bei physiologischer Temperatur binden.
Beispiel 9: Herstellung von Yttrium-90/Radium-223 PEGyliertem Liposom-Folat-Fab'
F(ab')₂ RØ Myelom (Unterklasse IgG₁), 14 mg/ml in PBS, wurde für diesen Versuch verwendet (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norwegen).
Konjugation von Folsäure an Antikörper
Folsäure·2H₂O wurde zunächst in Dimethylsulfoxid (Fluka, H₂O-Gehalt weniger als 0,05%) gelöst. Die Lösung wurde danach auf aktiviertes 4 Å Molekularsieb (Fluka) mit einer Kanüle aufgetragen und unter einer Argonatmosphäre im Dunkeln 6–10 Stunden aufbewahrt. Tritiummarkiertes Folat (³H-Folat) wurde als wässrige Lösung des Kaliumsalzes von ³H-Folat (1% in Bezug auf Zitronensäure) zugegeben. Die spezifische Aktivität des zur Konjugation an Protein verwendeten ³H-Folats betrug 7–7,5 GBq/mol.
Das ³H-Folat wurde für die Kupplung an Antikörper mit myelomischem F(ab')₂ durch Zugabe von 10 Moläquivalenten 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid zu der Folatlösung und 30minütige Inkubation bei Umgebungstemperatur aktiviert. Danach gab man einen 30- bis 40-fachen molaren Überschuss des aktivierten Folats zu dem Protein, 14 mg/ml in PBS, und ließ 30–60 Minuten aufeinander einwirken. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 0,2 ml 0,3 M Glycin in PBS/Borat, pH 8,5, gequencht. Das Folat-F(ab')₂-Konjugat (Folat-F(ab')₂) wurde vom nicht umgesetzten Material unter Verwendung einer in PBS voräquilibrierten PD-10-Säule abgetrennt. Zur Bildung von Folat-Fab' wurde Folat-F(ab')₂ in 1 mM Dithiotreitol (DTT) 2 Stunden bei Umgebungstemperatur inkubiert und danach erfolgte Eluieren an einer Größenausschlusssäule NAP-5. Man desoxidierte die Folat-Fab' enthaltende Fraktion, indem man Argon durch die Lösung perlen ließ und vermischt danach die Lösung sofort mit der Liposomlösung.
Das Ausmaß der Folsäure-Konjugation wurde anhand des ³H-Gehalts des gereinigten Proteins, wie gemessen durch Flüssigszintillationszählung (Beckmann LS 6500) zusammen mit den spektralphotometrischen Messdaten bei 280 nm, bestimmt.
Zur Quantifizierung der liposomgebundenen Fraktion von Folat-Fab' wurde eine Spurenmenge an iodiertem F(ab')₂ vor der Umsetzung mit DTT (das Protein wurde mittels IodoGen gemäß Standardverfahren iodiert) zugegeben.
Konjugation markierter Antikörper an Liposomen
DSPE-PEG2000-MPB (Northern Lipids. VA. Kanada), Natriumsalz, war in einer Menge von 5 mol-% des Gesamtphospolipidgehalts enthalten. Die Liposomen wurden anderweitig erzeugt und ebenfalls für den Ionophoren-vermittelten, kationischen Beladungsschritt in gleicher Weise, wie die die für die nicht-PEGylierten Liposomen beschrieben ist, zubereitet.
Man ließ das Reaktionsgemisch nach dem Beladungsschritt auf Raumtemperatur kommen und desoxidierte danach die Liposomensuspension und gab sie danach zu Folat-Fab', um eine Proteinkonzentration von 0,3–0,5 mg/ml zu erhalten. Die Lipidkonzentration betrug 1–3 mM, gemäß der Bestimmung des Phosphorgehalts anhand des Bartlett-Assays (Barlett, 1958). Das Folat-Fab' und die Liposomen ließ man 2 Stunden bei Umgebungstemperatur reagieren. Das Reaktionsgemisch wurde danach unter Verwendung einer in PBS äquilibrierten PD-10-Säule angewendet. Mit Folat-Fab' konjugierte PEG-Liposomen wurden vor der Verwendung in dem Folat-Rezeptor-Bindungsassays 12–15 Stunden bei 4°C aufbewahrt.
Liposomgebundene Radioaktivität wurde mit einem NaI-Detektor vom Welltyp, berichtigt um den Spillover in den entsprechenden Kanälen, von den doppelt markierten Proben gemessen. Als Referenz dienten Proben eines einzigen Nuklids und eines Nuklidgemisches.
Aus den Radioaktivitätsmessungen errechnete man die Proteinkonzentration in die Anzahl von Fab' pro Liposom, wobei man von einer Liposomengröße von 100 nm und 8·10⁴ Phospholipide/Vesikel (Kirpotin et al., 1977) und einem Molekulargewicht des Antikörpers mit myelomischem Fab' von 52000 ausging.
Die zellgebundene Radioaktivität wurde mit dem NaI-Detektor (3fach höhere Konzentration für Y-90) und Flüsssigszintiallationszählung nach Zugabe von Insta-Gel plus (Packard) (Tabelle 3) gemessen.
Tabelle 3. Bindung von ⁹⁰Y-Liposomen, die mit Antikörpern mit oder ohne Folat konjugiert sind, an OVCAR-Zellen
Nachweis von ³Folat an Liposomen
PEG-Liposomen (2,5 mM Lipidkonzentration) in 20 mM HEPES/300 mM Saccharose wurde mit ³Folat konjugiertem Fab' (0,5 mg/ml in PBS, Verhältnis Folat/Fab' 2 ± 0,2) umgesetzt. Nach zwei Stunden bei Raumtemperatur wurden die Folat-konjugierten Liposomen durch Eluieren an einer Sepharose CL-4B Säule isoliert. Die Menge an ³H-Folat-Fab' an den Liposomen wurde durch Flüssigszintiallationszählung der chromatographisch erhaltenen Fraktionen quantifiziert und das Folat-Fab'/Liposom-Verhältnis wurde auf ungefähr 110 bestimmt.
Abkürzungen:

DSPC:

Distearoylphosphatidylcholin

DOTA:

1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure

DSPE-PEG2000-MPB:

N-(4-(p-Maleimidophenyl)butyryl)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (Northern Lipids, VA, Canada).

HEPES:

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

PBS:

phosphatgepufferte Kochsalzlösung

EDTA:

Ethylendiamin-N,N'-tetraessigsäure

HDEHP:

Bis(2-ethylhexyl)phosphorsäure

PEG:

Polyethylenglycol

DTT:

Dithiotreitol

Literatur

Bartlett GR. Phosphorus assay in column Chromatography. J. Biol. Chem. 234 (3), 466–468 (1958).
Cabell MJ. The purification, determination and neutron capture cross section of actiniuim-227, Can. J. Chem. 37, 1094–1101, (1959).
DeVita Jr VT, Hellman S, Rosenberg S A. Cancer. Principles & practice of oncology. 5. Auflage Lippincot-Raven, Philadelphia, New York, USA (1997).
Dietz ML und Horwitz E P. Improved chemistry for the production of Y-90 for medical applications. Appl. Radiat. Isot. 43, 1093–1101 (1992).
Forssen E A. The design and development of DaunoXome^® for solid tumor targeting in vivo. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 133–150 (1997).
Gabizon R, Horowitz AT, Goren D, Tzemach D, Mandelbaum-Shavit F, Quasen MM, und Zalipsky S. Targeting Folate receptor with folate linked to extremities of poly(ethylene glycol)grafted liposomes: In vitro studies. Bioconjugate Chem. 10, 289–298 (1999).
Gabison A. Liposome circulation time and tumor targeting: Implication for cancer chemotherapy. Adv. Drug Delivery Rev. 16, 285–294 (1995).
Gaze MN. The current status of targeted radiotherapy in clinical practice. Phys. Med. Bol. 41, 1895–1903 (1996).
Goins B. Phillips WT, und Klipper R. Repeat injection studies of technetium-99m labeled PEG-liposomes in the same animal. J. Liposome Res. 8(2), 265–281 (1998).
Hall E. Radiobiology for the radiologist. 4. Auflage. JB Lippincott Company, Philadelphia, USA (1994).
Hassfjell SP und Hoff P. A generator for production of Pb-212 and Bi-212. Appl. Radiat. Isot. 45, 1021–1025 (1994).
Henriksen G und Hoff P. Isolation of cyclotron produced Bi-205, Bi-206 and Pb-203 using a lead-selective extraction chromatographic resin. Appl. Radiat. Isot. 49, 357–359 (1998).
Hwang KJ und Mauk M R. Fate of lipid vesicles in vivo: A gamma-ray perturbed angular correlation study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 4991–4995 (1977).
Kirpotin D, Park JW, Hong K. Zalipsky S, Wen-Lu L, Carter P, Benz CC and Papahadjopoulos D. Sterically stabilised Anti-HER2 Immunoliposomes: Design and targeting to human breast cancer cells in Vitro, Biochemistry, 36, 66–75, (1997).
Kostarelos K, Emfietzoglou D und Stamatelou M. Liposome-mediated delivery of radionuclides to tumor models for cancer radiotherapy: A quantitative analysis. J. Liposome Res. 9(3), 407–424 (1999).
Kranz, DM, Roy, EJ und Patrick, T A. Conjugates of folate anti-effector cell antibodies, U.S. Pat. No. 5,547,668 (Aug. 20, 1996).
Larsen RH, Akabani G, Welsh P und Zalutsky M R. The cytotoxicity and microdosimetry of astatine-211-labeled chimeric monoclonal antibodies in human glioma and melanoma cells in vitro. Radiat. Res. 149, 155–162 (1998).
Larsen RH, Henriksen G. Norwegian Patent application No P990001 (1999).
Lee R J und Low P S. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 269. 3198–3204 (1994).
MacDonald RC, MacDonald RI, Menco BPhM., Takeshita K, Subbarao NK und Hu Lanrong. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Bioch. Biophys. Acta 1061, 297–303 (1991).
Maruyama K, Takizawa T, Takahashi N, Tagawa T, Nagaike K und Iwatsuru M, Targeting efficiency of PEG-immunoliposome-conjugated antibodies at PEG terminals. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 235–242 (1997).
Mauk MR und Gamble R C. Preparation of lipid vesicles containing high level of entrapped radioactive cations. Anal. Biochem. 94, 302–307 (1979).
McClure JJ und Feinendegen, L E. Alpha-emitters for medical therapy: Second Biannual Workshop, Toronto, Canada, June 4–5, (1998). Report from Department of Energy, Germantown, Md., USA
Mirzadeh S, Kumar K, Ganzow, O A. The chemical fate of 212Bi-DOTA formed by b-decay of 212Pb(DOTA)2-. Radiochimica Acta, 60, 1–10 (1993).
Ogihara-Umeda I, Sasaki T, Kojima S, Nishigori H. Optimal radiolabeled liposomes for tumor imaging. J. Nucl. Med. 37 (2), 326–332 (1996).
Olson F, Hunt CA, Szoka F, Vail WJ und Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Bioch. Biophys. Acta 557, 9–23 (1979).
Pikul II SS, Parks N J, Schneider P D. In vitro killing of melanoma by liposome delivered intracellular irradiation. Arch. Surg. 122, 1417–1420 (1987).
Reddy, JA und Low, P S. Folate-mediated targeting of therapeutic and imaging agents to cancers. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 (6): 587–627 (1998)
Ritter MA, Cleaver JE, und Tobias CA. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA-breaks. Nature 266, 653–655 (1977).
Shinoda, T, Takagi, A, Maeda, A, Kagatani, S, Kono, Y und Hashida, M. In vivo fate of folate-BSA in non-tumour- and tumour-bearing mice. J Pharm Sci 87 (12): 1521–1526, 1998.
Tilcock CP, Ahkong QF und Parr M. An improved method for the preparation of liposomal gadolinium-DTPA-Ionophore-Mediated active entrapment of gadolinium. Invest. Radiol. 26, 242–247 (1991).
Trippett, TM und Bertino, J R. Therapeutic strategies targeting proteins that regulate folate and reduced folate transport. J Chemotherapy 11: 3–10 (1999).
Turner AF, Presant CA, Proffitt RT, Wiliams LE, Winsor DW und Werner J L. In-111-labeled liposomes: Dosimetry and tumor depiction. Radiology 166 (3), 761–765 (1988).
Utkhede D, Yeh V, Szucs M und Tilcock C. Uptake of Yttrium-90 into lipid vesicles. Jour. Lip. Res. 4(2). 1049–1061 (1994).

Claims

Konjugatorsystem, dadurch gekennzeichnet, dass es Liposomen mit Ionophoren und mit im Inneren der Liposomen angeordnetem Chelator umfasst und die Liposomen außerdem (ein) α-Teilchen emittierende(s) schwere(s) Radionuklid(e) oder ²¹²Pb als Generator des α-Emittors ²¹²Bi umschließen, wobei das (die) schwere(n) Radionuklid(e) ein Atomgewicht von mehr als 150 aufweist (aufweisen).
Konjugatorsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Chelators im Inneren der Liposomen geeignet ist, Tochternuklide zu binden.
Konjugatorsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Chelator ausgewählt ist unter 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TRITA), 1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N"'-tetra(methylen)-phosphonsäure (DOTMP) 1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure, Diethylentriamin-N,N',N''-pentaessigsäure und isomere Derivative davon, Kryptat[2,2,2], Kryptat[3,2,2], Kryptat[2,2,1] und Mono- und Dibenzoderivate davon, verbrückte Calix[4]arene mit elektronenreichen (Donor-) Gruppen (Hydroxyl, Carboxyl, Ester, Amid, Amin), 1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bis-essigsäure und 1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bis-malonat.
Konjugatorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen aktivierte Gruppen in der Membran enthalten, die eine Konjugation von Proteinen oder anderen rezeptoraffinen Molekülen an diese aktivierten Gruppen gestatten.
Konjugatorsystem nach Anspruch 4, wobei es sich bei den aktivierten Gruppen um Polyethylenglykol handelt.
Konjugatorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen an Rezeptorbindungsproteine konjugiert sind.
Konjugatorsystem nach Anspruch 6, wobei die Rezeptorbindungsproteine monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte oder Folat sind.
Konjungatorsystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen mit Antikörpern der Klasse IgM oder IgG oder Fragmenten oder Konstrukten dieser Antikörperklassen konjugiert sind.
Konjugatorsystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen mit Antikörpern der Klasse IgM oder IgG oder Fragmenten oder Konstrukten dieser Antikörperklassen konjugiert sind, wobei die Antikörper, Fragmente oder Konstrukte mit Folat und einem Radionuklid oder einem Gemisch verschiedener Radionuklide markiert sind.
Konjugatorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die an die Liposomen konjugierten Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte von der Maus stammend, chimärer Natur oder vom Menschen stammend, monoklonal oder polyklonal sind.
Konjugatorsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte mit Folat markiert sind, wobei die Antigenbindungsstelle gegen Folatbindungsprotein (FBP) gerichtet ist.
Konjugatorsystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte mit Folat markiert sind, wobei die Antigenbindungsstelle gegen ein von FBP verschiedenes Antigen gerichtet ist.
Konjugatorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Radionuklid um einen schweren alpha-Emitter und/oder ²¹²Pb als Generator des α-Emitters ²¹²Bi handelt, ausgewählt unter ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra, ²²⁴Ra und ²²⁷Th.
Konjugatorsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Tochternuklid und das Mutternuklid ²¹²Bi beziehungsweise ²¹²Pb sind.
Verfahren zur Herstellung eines radiomarkierten Konjugatorsystems, dadurch gekennzeichnet, dass man Liposomen mit Ionophoren und einem Chelator geeigneter Konzentration stabil mit schweren α-Teilchen-Emittern radiomarkiert, indem man eine Lösung, die ein α-Teilchenstrahlung emittierendes Radionuklid oder ein Gemisch von Radionukliden oder ²¹²Pb als Generator des α-Emitters ²¹²Bi enthält, wobei die schweren α-Teilchen-Emitter ein Atomgewicht von mehr als 150 aufweisen, mit einer Liposomen enthaltenden Lösung mischt und bei gegenüber physiologischer Temperatur erhöhter Temperatur inkubiert, wobei man eine Wanderung des (der) Radionuklids (der Radionuklide) in die Liposomen erhält.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Chelator ausgewählt ist unter 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (DOTA), 1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TRITA), 1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetraessigsäure (TETA), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure (DOTMP) 1,4,7,10-Tetraazacyclotridecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure, 1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecan-1,4,7,10-N,N',N'',N'''-tetra(methylen)-phosphonsäure, Diethylentriamin-N,N',N''-pentaessigsäure und isomere Derivative davon, Kryptat[2,2,2], Kryptat[3,2,2], Kryptat[2,2,1] und Mono- und Dibenzoderivate davon, verbrückte Calix[4]arene mit elektronenreichen (Donor-) Gruppen (Hydroxyl, Carboxyl, Ester, Amid, Amin), 1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bis-essigsäure und 1,10-Diaza-4,7,13,16-tetraoxacyclooctadecan-1,10-N,N'-bis-malonat.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen aktivierte Gruppen in der Membran enthalten, die eine Konjugation von Proteinen oder anderen rezeptoraffinen Molekülen gestatten.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den aktivierten Gruppen um Polyethylenglykol handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen an Rezeptorbindungsproteine konjugiert sind.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Rezeptorbindungsproteine monoklonale oder polyklonale Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte oder Folat sind.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen mit Antikörpern der Klasse IgM oder IgG oder Fragmenten oder Konstrukten dieser Antikörperklassen konjugiert sind.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen mit Antikörpern der Klasse IgM oder IgG oder Fragmenten oder Konstrukten dieser Antikörperklassen konjugiert sind, wobei die Antikörper mit Folat und einem Radionuklid oder einem Gemisch verschiedener Radionuklide mittels Standardverfahren zur Folat- und Radionuklidmarkierung des Antikörpers markiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die an die Liposomen konjugierten Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte von der Maus stammend, chimärer Natur oder vom Menschen stammend, monoklonal oder polyklonal sind.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte mit Folat markiert sind, wobei die Antigenbindungsstelle gegen FBP gerichtet ist.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper oder Antikörperfragmente oder -konstrukte mit Folat markiert sind, wobei die Antigenbindungsstelle gegen ein von FBP verschiedenes Antigen gerichtet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Radionuklid um einen schweren alpha-Emitter und/oder ²¹²Pb als Generator des α-Emitters ²¹²Bi handelt, ausgewählt unter ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra, ²²⁴Ra und ²²⁷Th.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Tochternuklid und das Mutternuklid ²¹²Bi beziehungsweise ²¹²Pb sind.
Verfahren zur Herstellung des Konjugatorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14, geeignet zur Injektion oder Infusion in Säuger, einschließlich des Menschen.
Verfahren nach Anspruch 28, zur Herstellung einer pharmazeutischen Lösung, die zur Injektion oder Infusion in Säuger, einschließlich des Menschen, durch intravenöse und/oder regionale und/oder intratumorale Verabreichungsweise geeignet ist.
Verwendung des Konjugatorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Lösung, die zur Injektion oder Infusion in Säuger, einschließlich des Menschen geeignet ist, in Kombination mit einem Radioimmunkonjugat oder verschiedenen Radioimmunkonjugaten und/oder anderen Formen der radiopharmazeutischen Therapie, Chemotherapie, äußerlichen Strahlungsbehandlung oder Chirurgie zur Behandlung bösartiger Tumoren.
Verwendung eines Konjugatorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Injektion in menschliche Patienten zu dem Zweck, potentiell therapeutische Strahlung an entartete Zellen abzugeben, die unter Folatbindungsprotein, Östrogenrezeptor und Testosteronrezeptor ausgewählte Rezeptoren exprimieren.
Verwendung nach Anspruch 31, wobei die entarteten Zellen abgeleitet sind von bösartigem Gewebe, das unter Gehirnkrebs, Lungenkrebs, Gebärmutterhalskrebs, Eierstockkrebs, Brustkrebs, Leukämie, Lymphomen und bösartigen Melanomen ausgewählt ist.
Kit zur Herstellung des Konjugatorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Behältnis mit einer Liposomenlösung und ein Behältnis mit einem Radionuklid in einer Lösung, die zur erleichterten Radiomarkierung vermischt werden kann, umfasst.
Kit zur Herstellung des Konjugatorsystems nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Behältnis mit einer Liposomenlösung und ein zweites Behältnis mit einem Radionuklid in einer Lösung und ein drittes Behältnis mit einem Molekül mit Rezeptoraffinität enthält, die zur erleichterten Radiomarkierung und Markierung mit einem rezeptoraffinen Molekül vermischt werden können.