KR100822566B1 - 방사성 치료 리포좀 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이오노포어 (ionophores)를 갖고 리포좀의 내부에 위치하는 킬레이터 용액과 알파-입자 방출 방사성핵종(들)을 갖는 리포좀을 포함하는 컨쥬게이터 시스템 (conjugator system)에 관한 것이다. 또한 이러한 유형의 방사성 리포좀의 제조 방법 및 시스템의 용도와 시스템 제조용 키트를 설명한다.
컨쥬게이터 시스템, 리포좀, 이오노포어, 방사성핵종, 암치료

Description

방사성 치료 리포좀 {Radioactive Therapeutic Liposomes}
본 발명은 이오노포어 (ionophores)를 갖고 리포좀의 내부에 위치하는 킬레이터를 갖는 리포좀을 포함하는 컨쥬게이터 시스템 (conjugator system)에 관한 것으로, 여기서 리포좀은 α 입자를 방출하는 무거운 방사성핵종으로 안정적으로 표지된다. 본 발명은 또한 컨쥬게이터 시스템의 제조 방법 및 상기 시스템의 용도와 상기 컨쥬게이터 시스템 제조용 키트에 관한 것이다.
항암 치료에서 방사성핵종의 생의학적 용도는 지금까지는 양이온 또는 음이온종, 예를 들어 갑상선암에 대한 [131I]요오드화물과 골격암 전이로부터의 통증 완화를 위한 89Sr의 사용, 및 모노클로날 항체에 부착된 대부분 베타-방출성 방사성핵종의 사용에 초점을 맞춰왔다 (DeVita 등, 1996).
암에 대한 표적화된 방사성핵종 치료의 사용은 종양 특이적 담체 화합물에 방사성핵종을 부착시키는 방법을 발견하는 능력에 의존했다 (Gaze, 1996). 현재, 유용한 방사선 특징을 갖는 몇몇 방사성핵종은 방사성핵종과 담체 화합물 사이에 화학적으로 안정한 연결을 제공하는 문제 때문에 종양 표적화에 사용될 수 없다. 그러나, 신규한 담체 시스템은 치료에 유용한 것으로 생각되는 방사성핵종의 보고 일 뿐만 아니라 방사성 동위원소의 사용을 또한 확장시킬 수 있다 (Gaze, 1996).
표면에 부착된 수용체 친화성기를 갖거나 갖지 않는 리포좀이 약물 전달에 대해 평가되었고, 현재 몇몇 암 형태에서 화학치료제의 전달을 위해 임상적으로 사용되고 있다. 최근, 리포좀 연구의 발전을 통해 상기 화합물들을 암에 대한 내부 방사선요법을 위한 방사성핵종의 담체로서 유용하게 만들 수 있는 약물동력학을 보이는 신규한 리포좀이 개발되었다 (Gabizon, 1995). 이러한 최근의 리포좀 제제와 제조 방법의 발전을 통해 리포좀의 크기를 막을 통한 압출을 이용함으로써 작은 직경으로 보다 양호하게 한정시킬 수 있기 때문에, 순환 시간이 연장된 100 ㎚ 미만의 작은 소포 (vesicles)를 생성시켰다. 또한, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 그라프팅된 리포좀의 도입으로 혈장 단백질로부터의 방해가 감소되어 세망내피계의 대식세포에 의해 영향을 받는 인식과 클리어런스가 감소되었다 (Maruyama 등, 1997). 이에 의해, 지속적인 혈중 농도로 인한 종양 업테이크 수준의 증가가 달성되었다. 리포좀의 표면에 수용체 친화도를 갖는 분자, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 폴레이트를 컨쥬게이팅시킴으로써 보다 높은 수준의 종양 업테이크가 달성되었다. 또한, 몇몇 연구에서는 리포좀과 표적 리간드 사이에 연결기로서 PEG를 적용시키는 것이 수용체 접근성도 또한 개선시킬 수 있기 때문에 그 이점을 언급하였다 (예를 들어 Maruyama 등, 1997; Gabison 등, 1999; Lee 등, 1994).
리포좀은 이전에 방사성 동위원소에 대한 담체로서 연구되었다 (Goins 등, 1998; Turner 등, 1988). 문헌[Pikul 등 (1987)]에서는 수동적으로 포함된 212Pb-덱 스트란 (즉, 212Pb-덱스트란은 리포좀 생성 동안 첨가되고, 212Pb-덱스트란의 분획은 리포좀의 내부를 나타내는 수성상과 함께 도입된다)에 기초한 연구를 보고하였다. 저자는 상기 리포좀이 암 치료에 적합하다고 제시하지는 않았으나, 방사성 동위원소를 사용하여 시험관내에서 세포내 세포 사멸의 연구를 위해 1차적으로 사용하였다. 212Pb 붕괴로부터 생성된 212Bi의 운명에 대한 데이타는 제시되지 않았고, 리포좀의 크기는 현재 생체내 종양 치료를 위해 최적인 것으로 생각되는 크기 (약 100 ㎚) (Forssen, 1997)에 비해 매우 큰 350-500 ㎚ 정도였다. 또한, 리포좀은 막 내에 PEG를 포함하지 않았다.
문헌[Ogihar-Umeda 등 (1996)]에서는 리포좀을 감마 방출 방사성핵종인 67Ga, 111In 및 99mTc에 대한 담체로서 사용하였고, 영상화를 위한 방사성표지된 리포좀의 사용을 제시하였다.
이론적인 연구에서, 문헌[Kostarelos 등 (1999)]에서는 잠재적 치료성 방사성핵종 131I, 67Cu, 188Re 및 211At로 표지된 리포좀의 사용을 제시하였지만, 방사성표지된 리포좀의 제조를 위한 화학적 절차를 제시하지 않았다.
EP 386 146 B1에서는 중성자 포획 종양 치료를 위한 리포좀 봉입된 화합물의 사용 방법 및 조성물을 기재하고 있다. 그러나, 이들 리포좀은 활성화 후에만 방사성으로 되는 안정한 원소 (예를 들어 붕소)로 로딩되었고, 리포좀은 이오노포어나 킬레이터를 포함하지 않았다.
문헌[Utkhede 등 (1994)]에서는 본 발명에서 설명하는 킬레이터와 다른 킬레이터인 킬레이터 DTPA와 90Y가 로딩된 리포좀을 기재하고 있다. 또한, 모/딸 (mother/daughter) 핵종(들)의 보유는 설명되지 않았고, 또한 90Y는 본원에 설명된 원소와 같은 무거운 원소가 아니다.
무거운 알파 방출성 방사성핵종을 갖는 담체의 충분히 안정한 방사성표지를 달성하는데에는 일반적으로 각 원소의 화학에 적합한 특이적 화학적 절차를 필요로 하며, 그러한 방법은 알려져 있지 않다. 예를 들어 Ga, In, Tc, Cu 또는 Re의 방사성표지에 사용되는 절차는 예를 들어 212/213Bi, 212Pb, 223/224Ra, 227Th 또는 225Ac와 같이 무거운 방사성핵종 (원자량 150 초과) 양이온성 알파 방출물질 (emitter)에 적합한 것으로 예측될 수 없다.
따라서, 본 발명의 목적은 (1) 알파 입자 방사선을 방출하는 무거운 방사성핵종(들) 및 킬레이터를 봉입하고, (2) 모 핵종(들)이 리포좀에 포함될 때 딸 핵종(들)을 보유할 수 있으며, (3) 방사성핵종의 패널에 유용한 능동적인 도입 방법에 의해 제조될 수 있는, 수용체 친화성기를 갖거나 갖지 않는 방사성핵종-리포좀 컨쥬게이터 시스템, 및 상기 시스템의 용도와 상기 시스템 제조용 키트를 제공하는 것이다. 상기 목적은 첨부된 청구의 범위에 의해 특징지워지는 본 발명에 의해 달성되었다.
본 발명은 이오노포어, 즉 리포좀에 대한 금속 추출제를 갖고, 리포좀의 내부에 위치하는 킬레이터 및 무거운 방사성핵종(들) (원자량 150 초과)을 갖는 리포 좀을 포함하는 컨쥬게이터 시스템에 관한 것이다. 리포좀은 방사성핵종의 능동 도입을 사용하여, 즉 이오노포어를 통해 제조되고, 일반적으로 100 ㎚ 크기의 리포좀을 생성시키는 절차에 따라 제조된다. 생성물은 수일에 걸쳐 우수한 화학적 안정성을 보이고, 또한 예를 들어 212Pb에서 212Bi로의 변환을 통해 리포좀 내부에 딸 핵종(들)을 보유할 수 있다. 리포좀은 막에 부착된 폴리알킬렌옥사이드와 같은 변형기, 예를 들어 PEG을 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있다. 본 발명은 또한 상기 방사성표지된 리포좀을 종양 탐색 단백질, 예를 들어 폴레이트 컨쥬게이팅된 모노클로날 항체에 연결시키는 방법을 설명한다.
본 발명을 도면과 실시예를 참고하여 보다 상세하게 설명할 것이다.
도 1은 리포좀 막에 컨쥬게이팅된 Fab' 또는 폴레이트-표지된 Fab' 항체를 포함하는 PEG화 리포좀의 OVCAR 3 세포에 대한 결합을 보여주는 그래프이다.
도 2는 폴레이트화 PEG 대 비폴레이트화 PEG 리포좀의 OVCAR 3 세포에 대한 결합을 보여주는 그래프이다.
암 치료에 적합한 방사성표지된 리포좀을 개발하기 위해, 본 발명자들은 방사성핵종 212Bi, 213Bi, 223Ra, 224Ra, 225Ac, 212Pb 및 227Th에 기초하여 알파 입자를 방출하는 무거운 방사성핵종 (즉, 원자량 150 초과)이 로딩된 리포좀의 제조 방법과 용도를 연구하였다. 이오노포어를 갖는 리포좀 (소포)을 사용하여, 바람직하게는 킬레이터를 갖는 방사성표지된 리포좀 (즉, 리포좀이 방사성핵종과 킬레이터를 봉입함)을 방사성핵종의 능동 도입 방법에 의해 100 ㎚의 전형적인 입자 크기를 갖는 리포좀 생성 절차에 따라 제조하였다.
단층라멜라 소포는 다음과 같은 방식으로 지질 박막 수화와 압출에 의해 제조하였다 (Olson 등 1979, Mac Donald 등 1991). 몰비 2:1, 일반적으로 각각 10 및 5 μmol의 DSPC (디스테아로일 포스파티딜 콜린)와 콜레스테롤을 둥근 바닥 플라스크 내의 클로로포름에 용해시켰다. 용매를 감압 하에 회전 증발에 의해 제거하였다. 이어서 건조된 지질막을 0.5-1 ㎖의 150 mM 시트르산, 30 mM DOTA (1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸 1,4,7,10 N,N',N'',N''' 테트라아세트산) (pH 4)으로 수화시켰다. 생성된 현탁액을 5회의 동결 해동 사이클에 적용한 후, 수동 압출 장치 (Avestin, Ottawa, Canada)를 사용하여 공극 크기 100 ㎚의 폴리카르보네이트 필터를 통해 5회, 공극 크기 50 ㎚의 필터를 통해 5회 반복 압출시켰다. 생성물의 지질 농도는 ~30 mM이었다. 리포좀에 방사성핵종을 로딩하기 전에, 250 mM 수크로스, 20 mM HEPES (N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2 에탄술폰산) (pH 7.4)에 대해 PD-10 칼럼 상에서 용출시켜 외부 용액을 교환하였다.
리포좀 구성성분:
a) 내부 수성 매질: pH 1-14, 바람직하게는 2-9, 보다 바람직하게는 4-5. 구성성분: 물; 내부 수성 매질의 바람직한 pH를 바람직한 시간 간격 동안, 즉 방사성금속(들)의 이오노포어 매개된 도입이 개시될 때까지 유지시킬 수 있는 물질. 바람직하게는, 내부 수성 매질의 구성성분은 또한 방사성금속(들)의 착화 기능을 이끈다. 이것은 i) 예를 들어 pH 조절에 사용되는 물질, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 및 관련 화합물 내의 산소 원자(들)의 정전기 공여체 기능에 의해, ii) 또한, 내부 수성 매질에 착화제, 예를 들어 EDTA, DTPA, DOTA, DOTMP 및 관련 화합물을 가짐으로써 수행될 수 있다.
b) 이오노포어: 예를 들어 리포좀 외부상으로부터 리포좀 내부로 지질 2중층을 가로질러 방사성금속을 수송할 수 있는 (본질적으로 비가역적으로) 물질. 예: 바람직한 방식으로 기능하는 것으로 보이는 이오노포어: 칼슘 이오노포어 A 23187, 디시클로헥실 18-C6, 비벤조-18-C6, 2,3-디머캅토-1-프로판올, Pb-이오노포어.
c) 지질 2중층의 구성성분: 지질 2중층의 구성성분은 바람직하게는 소포를 형성할 수 있는 혼합물을 생성시키고, 이의 액체 대 고체 전이 온도는 생리학적 온도를 초과한다. 예를 들어 i) 인지질. 예; 장쇄 알킬-포스파티딜콜린, 예를 들어 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DLPC), 1,2-딘리리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (POPC); ii) 스테롤 또는 지질 2중층을 굳어지게 하는 (지질 2중층의 유동성을 저하시키는) 점에서 유사한 특성을 갖는 화합물. 예: 스테롤 종류의 화합물: 콜레스테롤 및 콜레스테롤 3-술페이트, 및 iii) 구조체의 종양 세포 표적화 특성을 증가시키고 혈중 보유 시간을 증가시키기 위한 (입체적) 생체내 안정화제(들), 예를 들어 폴리에테르, 폴 리에틸렌글리콜. 리포좀 제제에 PEG 및(또는) PEG 유도체의 도입은 주입된 리포좀의 세망내피계에 의한 순환계로부터의 클리어런스 감소의 측면에서 이점을 제공할 것이다. 일반적으로 인지질에 대해 3 내지 10 몰%로 제제에 포함된다. 그러나, 목적하는 안정화 효과를 얻기 위해 필수적인 안정화제의 양은 단량체 (정전 특성과 극성) 및 반복 단위의 수, 즉 사슬 길이에 의존적이다. 예 (PEG 및(또는) PEG 유도체): 1,2-딘리리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜) 2000] (PEG2000 DJ＼1PE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜)2000] (PEG2000 DPPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[폴리(에틸렌글리콜)2000] (PEG2000 DSPE).
d) 종양 세포 표적화 특성을 갖도록 구조체의 변형을 촉진시키는 구성성분: 적합한 활성화된 지질의 선택은 연구의 필요조건 뿐만 아니라 합텐의 특성에 의해 결정될 것이다. 반응의 효능은 이탈기, 친수성 스페이서, 리포좀의 물질적 특성 및 반응물의 농도에 의해 지배될 것이다. 합텐이 리포좀과 연합되어 유지되는 것이 요구되는 생체내 연구를 위해, 막들 사이에 보다 느리게 교환하는 보다 긴 아실 사슬 지질 앵커를 선택함으로써 명백한 이점이 얻어질 것이다. 또한, 합텐과 지질 앵커 사이의 공유 결합은 화학적 및 효소적 절단 모두에 대해 안정하여야 한다. 활성화된 지질은 지질과 변형제 사이에 예를 들어 아민, 아미드, 티오에테르 또는 디술피드 결합을 형성하는 기능을 할 수 있다. 구조적 안정화제, 예를 들어, PEG 및(또는) PEG 유도체가 제제 중에 포함되면, 커플링을 위한 기능을 하는 기는 바람직하게는 안정화제의 것과 동일하거나 또는 더 긴 유효 사슬 길이를 갖는 안정화제 와 동일하거나 유사한 화합물의 말단에 존재한다. 예: 구조체를 PEG 및(또는) PEG 유도체로부터 종양 세포 표적화 특성을 갖도록 변형시키는 것을 촉진하는 소포 구성성분: N-[w-(2-피리딜디티오프로피오닐아미노) 폴리(에틸렌글리콜) 2000] 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (PDP-PEG2000-DSPE), N-{w-[4-(p-말레이미도페닐)부타노일]아미노} 폴리(에틸렌글리콜) 2000] 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (MpB-PEG2000-DSPE).
비연합된 방사성핵종으로부터 리포좀 연합된 방사성핵종을 분리하는 것은 크기 배제 크로마토그래피의 사용에 의해 달성하였다 (Mauk and Gamble 1979, Tilcock 등, 1991). 리포좀 로딩 절차 이후 분리를 위해, PD-10 크기 배제 칼럼을 사용하였다. PD-10 칼럼 상에 1 ㎖ 또는 그 미만의 적용된 부피로부터, 리포좀은 처음 4.5 ㎖에 용출되었다. 리포좀과 연합되지 않은 방사성핵종은 저분자량 종에 대응하는 분획에 용출되었다. PBS 내에서 로딩된 리포좀의 안정성 (방사성핵종 보유에 관하여)의 연구에서 또한 PD-10 칼럼을 사용하였다.
혈청 내 유리 방사성핵종으로부터 리포좀 연합된 방사성핵종을 분리하는 것은 Sepharose CL-4B 칼럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 수행하였다 (Hwang and Mauk, 1977). 그에 의해 비결합된 방사성핵종이 실질적으로 없는 액체 담체 내에 분산된 방사성 리포좀을 함유하는 용액을 제조할 수 있다.
유리 방사성핵종을 리포좀 연합된 분획으로부터 용이하게 분리될 수 있는 상태로 안정화시키기 위해 크로마토그래피 절차에 앞서 EDTA (에틸렌 디아민 N,N' 테트라아세트산)을 첨가하였다.
리포좀 연합된 방사성핵종에 대한 방사성핵종 로딩 수율 및 그의 잠복성 (latency)을 228Ac, 223Ra, 212Pb, 212Bi, 205Bi 및 207Bi에 대해 감마-분광학에 의해 확립하였다. 228Ac 및 205/207Bi를 잠재적 치료 유용성 방사성핵종 225Ac, 212Bi 및 213Bi 각각에 대한 트레이서 (tracer)로서 사용하였다.
본 발명자들은 중요하고도 예기치않게 212Bi가 상기한 유형의 리포좀 내에 포함시킨 212Pb의 붕괴 후 유의하게 이동되지 않았음을 발견하였다. 212Bi에 대한 분자적으로 연결된 생성기 (generator)로서의 212Pb의 사용에 대한 현재의 상태는, 킬레이터로부터 유의한 방출 (≥30%)이 일반적으로 일어난다는 것을 가르킨다 (McClure and Feinendegen, 1998; Mirzadeh 등, 1993). 그러나, 212Pb를 예를 들어 리포좀의 내부와 같은 고농도의 킬레이터 내에 트랩핑시킴으로써, 핵 변환 이후 딸 핵종을 트래핑하기 위해 사용될 수 있는 컨쥬게이터 시스템을 제공하여 딸 생성물의 방출을 피할 수 있다. 212Bi 딸 핵종을 거의 정량적으로 보유할 수 있는 212Pb에 대한 컨쥬게이터 시스템이 보고된 것은 처음이다. 따라서, 본 발명은 리포좀 내부에 위치하는 방사성핵종과 킬레이터를 포함하는 이오노포어를 갖는 리포좀 (컨쥬게이터 시스템)에 관한 것이며, 여기서 상기 컨쥬게이터 시스템은 딸 핵종을 보유할 수 있거나 보유할 수 없다.
본 발명에 따른 킬레이터는
1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA),
1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TRITA),
1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TETA),
1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산 (DOTMP),
1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산,
1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산,
디에틸렌 트리아민 N,N',N'' 펜타아세트산 및 그의 이성질체 유도체,
크립테이트[2,2,2], 크립테이트[3,2,2], 크립테이트[2,2,1] 및 그의 모노- 및 디-벤조 유도체,
전자 풍부 (공여체) 기 (히드록실, 카르복실, 에스테르, 아미드, 아민)를 포함하는 가교된 칼릭스[4]아렌,
1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-아세트산, 및
1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-말로네이 트를 포함하는 군 중에서 선택될 수 있다.
다른 중요하고도 놀라운 발견은 본 발명에 따른 리포좀이 223Ra를 효율적으로 포함하고 보유할 수 있다는 것이다. 라듐-223으로 표적화된 종양에 대해 잠재적으로 유용한 컨쥬게이터 시스템이 설명된 것은 처음이다. 또한, 본 발명자들은 비스무쓰 및 악티늄이 또한 현재 설명된 유형의 리포좀 내에 포함되고 강하게 보유될 수 있다는 것을 보여주며, 이는 212Bi, 213Bi 및 225Ac에 기초한 컨쥬게이터 시스템이 또한 제조될 수 있음을 가르킨다.
본 발명에 따른 컨쥬게이터 시스템은 리포좀 막에서 표면기, 예를 들어 PEG를 개질시키거나 또는 개질시키지 않고 제조할 수 있다 (PEG 그라프팅된/PEG화 리포좀). 막 내에 PEG를 적용하는 이점은 단백질, 예를 들어 항체, 항체 단편 또는 구조체 또는 폴레이트, 또는 다른 수용체 친화성 (수용체 결합) 단백질/분자의 컨쥬게이션을 허용하는 몇몇 PEG-반응성 기를 제공한다는 점이다.
본 발명은 또한 리포좀 막에 부착된 수용체 결합 단백질을 갖는 신규한 유형의 리포좀에 관한 것이다. 본원에서 본 발명자들은 폴레이트 표지된 항체에 컨쥬게이팅된 방사성표지된 PEG 그라프팅된 리포좀을 설명한다. 엔도사이토시스 (endocytosis)를 통해 산화된 폴레이트의 세포성 업테이크에 관여하는 글리코실-포스파티딜-이노시톨-연결된 세포 막 단백질인 폴레이트 결합 단백질 (FBP)을 발현하는 종양을 표적하기 위한 폴레이트 및 폴레이트 유도체의 용도는 연구자들 사이에서 주목받고 있다 (Kranz 등, 1996; Reddy 등, 1998; Shinoda 등, 1998; Trippet 등, 1999). 몇가지 유형의 인간 암세포는 FBP를 과발현하는 것으로 나타나기 때문에, 상기 수용체는 폴레이트로 컨쥬게이팅된 치료 방사성동위원소의 전달을 위한 가능한 표적이 될 수 있다. 따라서, 폴레이트에 컨쥬게이팅된 항체를 사용함으로써, 암에 대하여 표적화 방사성핵종 치료를 달성할 수 있다. 또한, 폴레이트 표지된 항체의 항원 결합 부위가 FBP와 상이한 종양 연합된 항원에 대하여 지향되면, 이중 결합 능력이 달성된다 (즉, 항체-항원 및 FBP 수용체 모두에 대한 친화성이 달성된다). 본 발명자들이 알기로는 폴레이트-표지된 항체의 컨쥬게이션이 설명되는 것은 처음이다.
본 발명에 따른 리포좀에 컨쥬게이팅된 폴레이트 표지된 항체는 방사선치료를 증가시키기 위해 방사성핵종 또는 상이한 방사성핵종들의 혼합물로 더욱 표지할 수 있다.
본 발명에서는 리포좀에 컨쥬게이팅된 폴레이트 표지된 항체의 상기한 신규한 조합물이 방사성핵종(들)을 폴레이트 수용체를 발현하는 세포에 표적화하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 이는 포유동물 세포에 세포독성이 매우 큰 높은 선에너지 전달 (high-LET) 방사선 방출물질인 알파 입자 방출물질에서 특히 유용하다 (Hall, 1994; Larsen 등, 1998; Ritter 등, 1977). 그러나, 알파 방사성원은 다른 유형의 방사선에 비해 특히 좁은 영역에 방사선을 전달할 수 있다. 따라서, 알파 방사선원이 표적 조직에 지향될 수 있으면, 정상 조직에 대한 조직 노출을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 컨쥬게이터 시스템은 또한 항체를 에스트로겐 또는 테스토스 테론에 컨쥬게이팅시킴으로써 예를 들어 에스트로겐 수용체 또는 테스토스테론 수용체를 발현하는 세포를 표적화하기 위해 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 표지된 항체는 바람직하게는 IgG 또는 IgM 종류 및(또는) 그의 단편 및(또는) 구조체 (예를 들어 미니체 (minibody))이다. 또한, 이들 항체 및(또는) 단편 및(또는) 구조체는 쥐, 키메릭 또는 완전 인간화된 폴리클로날 또는 모노클로날의 것일 수 있다.
본 발명은 또한 정맥내 및(또는) 국소적 및(또는) 종양내 투여 경로에 의해 인간을 포함한 포유동물에게 주사 또는 주입하기에 적합한 제약학적 용액을 제조하기 위한 본 발명에 따른 컨쥬게이터 시스템의 용도에 관한 것이다. 제약학적 용액은 악성종양을 치료하기 위해 방사성면역컨쥬게이트 또는 몇몇 방사성면역컨쥬게이트들, 및(또는) 다른 형태의 방사성약물 요법, 화학요법, 외부 광선 요법 또는 수술과 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 악성종양, 예를 들어 뇌-, 폐-, 자궁경부-, 난소- 또는 유방암, 또는 백혈병, 림프종 또는 악성 흑색종을 치료하기 위해 본 발명에 따른 컨쥬게이터 시스템을 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 방사성표지를 용이하게 하기 위해 혼합될 수 있는, 리포좀 용액을 담고있는 바이알과 방사성핵종을 용액 내에 담고있는 제2 바이알을 포함하는, 본 발명에 따른 컨쥬게이터 시스템의 제조용 키트에 관한 것이다. 또한, 이는 수용체 친화성 컨쥬게이터 시스템을 얻기 위해 수용체 친화성을 갖는 단백질 및(또는) 분자를 담고있는 제3 바이알과 혼합될 수 있다.
시약 및 장치
감마-분광학은 멀티채널 분석기 (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, USA)에 연결된 게르마늄 검출기 (Canberra, Meriden, CT, USA)를 사용하여 수행하였다. Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, USA)를 액체 섬광 계수를 위해 사용하였다. DSPC와 콜레스테롤은 Northern Lipids (Vancouver, Canada)로부터 구입하였다. Sephadex G-25 PD-10 칼럼 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)을 방사성표지된 리포좀의 정제를 위해 사용하였다. 마크로시클릭 킬레이터 DOTA를 리포좀내 킬레이터로서 사용하였으며 Macrocyclics (Richardson, TX, USA)로부터 구입하였다. Ultrex 등급 HNO3 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, USA)과 6M HCl (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa., USA) 및 Fluka (Sigma-Aldrich AS, Norway를 통해)로부터의 비스(2-에틸 헥실)인산 (HDEHP)을 연구에서 사용하였다.
리포좀의 이오노포어 매개된 양이온 로딩을 위해 사용된 모든 완충액은 아르기닌 (유리 염기)를 사용하여 목적하는 pH로 조정하였다. 사용된 모든 물은 Milli-Q 정수 시스템 (Millipore, Bedford, MA., USA)으로부터 입수하였다. 이온 교환 수지는 Bio-Rad (Hercules, CA, USA)에서 공급받았다.
수지는 물, 이어서 6 M HCl, 이어서 아세톤 및 마지막으로 물로 세척함으로써 예비컨디셔닝시켰다. 수지는 칼럼 패킹에 앞서 물 중에 보관하였다.
사용된 DMSO는 4Å 체를 사용하여 보관하였다.
본 작업에 사용된 232Th(NO3)4는 20y 이상 보관한 것이다. 샘플을 Nuclear Chemistry Group, Department of Chemistry University of Oslo (Oslo, Norway)로부터 제공받았다.
3H-엽산은 Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK)으로부터 구입하였다.
다른 모든 화학물질은 Sigma-Aldrich (Norway)로부터 구입하였다.
표 1은 리포좀을 사용한 실험에서 사용된 방사성핵종의 몇가지 물성을 보여준다.
핵종 t1/2 감마선(s) 확률%*
228Ac 6.13h 911.2 (26.6) 26.6
223Ra 11.43d 269.4 (13.7) 271.2 (0.108) (219Rn)2 13.7 10.8
212Pb 10.6h 238.6 (43.6) 43.6
208Tl 3.05m 583.1 (32.5) 35.2
207Bi 31.55y 569.7 (97.7) 97.7
205Bi 15.31d 703.4 (31.1) 31.1
*각 방사성핵종에 대해 가장 풍부한 감마선만을 나열하였다. Nuclear Data Sheets, Academic Press INC로부터의 데이타.

최선의 양식
상기한 절차에 따라 제조한 리포좀을 라듐-223 또는 납-212로 로딩하였다. 그후, 항체를 리포좀과 반응시켜 리포좀의 표면 상에 항체 분자를 얻었다. 약 100 ㎛의 리포좀 크기가 전신 전달을 위해 적절할 것이지만, 예를 들어 두개내 뇌 종양의 치료를 위해 또는 복강내 난소암의 치료를 위해 강내 전달을 성취하고자 할 때 에는 200-1000 ㎛의 전형적인 크기를 사용할 수 있다. (보다 큰 리포좀 크기는 제제가 주사되는 강으로부터의 클리어런스 속도를 느리게할 수 있어서, 종양 부위에서 고농도를 유지시킬 수 있다.)
<실시예 1>
리포좀 내 212Pb/212Bi의 로딩
방법: Hassfjell 및 Hoff (1994)에 의해 기재된 바와 같이 228Th원으로부터 220Rn의 발산을 통해 212Pb/212Bi을 생산하였다. 담체가 첨가되지 않은 212Pb/212Bi를 수집 용기로부터 0.1 M HNO3를 사용하여 걸러내고 (leached), 용액을 AG 50W-X4 양이온 교환 수지의 2×20 mm 칼럼에 적용하였다. 이어서 212Pb/212Bi를 2 M HCl에 용출시키고 용액을 증발 건조시켰다. 이어서 212Pb/212Bi를 200 ㎕ 10 mM 아세테이트 용액 (pH 5)에 용해시켰다. 212Pb는 그의 238.6 keV 감마선의 측정에 의해 정량하였다 (표 1). 212Bi는 방사성 평형에서 그의 딸 208Tl의 583.1 keV 감마선을 측정함으로써 정량하였다.
결과: 첨가된 활성의 0.2% 미만이 3일 이내의 인큐베이션 시간 동안 리포좀과 연합된 것으로 밝혀졌다.
30-60 mM의 지질 농도에 대응하는 리포좀을 이오노포어 A23187 (10-13 nM)의 필름과 격렬하게 혼합하였다. 이어서 약 1 MBq의 212Pb/212Bi를 첨가하고, 혼합물을 75℃에서 30분 동안 인큐베이팅시킨 후, PD-10 칼럼 상에서 용출시켰다. 이어서 95% 이상의 로딩된 소포를 함유하는 분획을 제2 PD-10 칼럼 상에서 용출시켰다. 리포좀 연합된 212Pb/212Bi의 잠복성을 소포를 인간 혈청 또는 PBS 내에서 37℃에서 인큐베이팅시킴으로써 조사하였다. 활성 분포를 24시간의 기간에 걸쳐 추적조사하였다.
결과: 212Pb의 로딩 효능: 34.8% (n=3).
보유를 감마 분광학에 의해 측정하였고, 99% 이상의 212Pb가 24시간 이내의 인큐베이션 시간 동안 리포좀과 연합되었다.
<실시예 2>
리포좀 연합된 212Pb의 붕괴로부터 형성된 212Bi의 보유
방법: 리포좀을 상기한 바와 같이 212Pb로 로딩하였다. 리포좀 연합된 방사성을 반응 혼합물을 PBS 중 10 mM EDTA로 예비평형화시킨 PD-10 칼럼 상에서 PBS 중 10 mM EDTA로 용출시킴으로써 단리하였다.
3시간 후, 212Pb와 212Bi 사이의 일시적인 평형이 확립되는 것을 확실하게 하기 위해, 리포좀 연합된 방사성핵종으로부터 유리 방사성핵종의 분리를 위해 용액의 분취액을 PBS 중의 10 mM EDTA로 예비평형화시킨 PD-10 컬럼에 적용하였다. 활 성 분포를 24시간에 걸쳐 측정하였다.
분리 절차 (크로마토그래피 과정으로부터 얻은 것과 동일한 기하학의)를 거치지 않은 표지된 리포좀의 별개의 분취액을 표준물질로서 사용하기 위해 측정하였다. 이것은 방사성 평형에서 212Bi/212Pb의 활성비를 확립하기 위해 수행하였다.
결과: 크로마토그래피로 분리한 리포좀에 대해 얻은 212Bi/212Pb 비를 평형 혼합물의 비와 비교함으로써, 95% 이상의 212Bi가 리포좀 연합된 212Pb의 붕괴 후 리포좀에 보유되는 것으로 나타난 것으로 추정되었다.
추가로, 2개의 크로마토그래피로 얻은 분획에서 212Bi 활성의 측정치를 비교하였다. 총 212Bi 활성의 99% 이상이 리포좀에 대응하는 분획에서 용출되었다.
<실시예 3>
리포좀 내에 가능한 Pb 및 Bi 재로딩의 조사
방법: 150 mM 시트르산, 30 mM DOTA를 엔트랩핑하고 PBS 중 10 mM EDTA을 함유하는 외부 용액을 사용하는 30-60 mM 지질에 대응하는 리포좀을 이오노포어 A23187의 필름 (유리 바이알의 내면 상에 20-26 nmol)에 첨가하였다. 이어서 PBS 중 212Pb 및 212Bi를 첨가한 후 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 용액의 분취액을 PD-10 칼럼들을 통해 용출시키고, 리포좀-용출물에 대응하는 크로마토그래피로 얻은 분획을 고유의 (intrinsic) Ge-검출기로 분석하였다.
결과: 24시간의 기간에 걸쳐 212Pb 및 212Bi의 검출가능한 로딩이 관찰되지 않았다 (<1%).
<실시예 4>
리포좀 내 223Ra의 로딩
223Ra는 기술된 바와 같이 227Ac에 기준한 생성기로부터 생산하였다 (Larsen and Henriksen, 1999). 간단히 설명하면, 227Ac와 그의 딸 핵종 227Th를 광산을 사용하는 223Ra의 용출을 용이하게 하는 추출 크로마토그래피 수지의 칼럼에 보유시켰다. 라듐을 리포좀 내로 포함시키기 위해, 생성기로부터의 용출된 용액을 증발 건조시킨 다음, 223Ra를 5 mM 시트레이트 (pH 7.4)에 용해시켰다.
30-60 mM의 지질 농도에 대응하는 리포좀을 이오노포어 A23187의 필름 (유리 바이알의 내면 상에 10-13 nmol)과 격렬하게 혼합하였다. 이후, 약 50 kBq의 223Ra를 첨가하고, 혼합물을 75℃에서 20분 동안 인큐베이팅시켰다. 이어서 반응 혼합물을 100 ㎕의 10 mM EDTA에 첨가하고, PD-10 칼럼 상에서 용출시켜 지질 소포와 연합된 방사성을 단리시켰다.
리포좀 연합된 223Ra의 보유는 소포를 인간 혈청 (Sigma) 또는 인간 혈청 중 5 mM EDTA 내에서 0.3 ㎎ 총 지질/㎖ 혈청의 리포좀 농도에서 37℃에서 인큐베이팅 시킴으로써 조사하였다. 결과를 표 2에 나타냈고, 이는 223Ra가 리포좀 내에 매우 안정하게 보유됨을 증명한다.
인큐베이션 시간 (일) 리포좀 분획 내 총223Ra%
1 94.6±1
3 94±2.5
4 94.7±0.5
평균 s.d., n=4

<실시예 5>
재로딩이 223Ra 보유 실험에 기여하는지를 측정함
방법: 150 mM 시트르산, 30 mM DOTA, 외부 용액 PBS 또는 혈청을 사용한 지질 필름의 수화에 의해 형성된, 30-60 mM의 지질에 대응하는 리포좀을 이오노포어 A23187의 필름 (유리 바이알의 내면 상에 분포된 10-13 nmol)에 첨가하였다. 이어서 5 mM 시트레이트 (pH 7.4) 중 223Ra를 첨가한 후 37℃에서 인큐베이팅시켰다. 용액의 분취액을 PD-10 칼럼에 적용하고, 리포좀에 대응하는 크로마토그래피로 얻은 분획을 고유의 Ge-검출기에 의해 분석하였다.
<실시예 6>
리포좀 내 207Bi의 로딩
방법: 203-207Bi는 자연 납 표적물 상에서 (p, xn) 반응에 의해 생산하고 납 선택적 추출 크로마토그래피 수지를 사용하여 정제하였다 (Henriksen and Hoff, 1998).
본 연구에서 주로 205Bi 및 207Bi로 이루어진 동위원소 Bi-혼합물 (이하 207Bi로 나타냄)를 사용하였다. 10-4M HCl 중 207Bi의 용액 50 ㎕을 앞서 이오노포어 A23187의 필름 (유리 바이알의 내면 상에 10-13 nmol)과 혼합한 30-60 mM의 지질에 대응하는 리포좀에 첨가하고 75℃에서 30분 동안 인큐베이팅시켰다. 이어서 반응 혼합물을 100 ㎕의 10 mM EDTA에 첨가하고, PD-10 칼럼 상에서 용출시켜 지질 소포와 연합된 방사성을 단리시켰다.
결과: 총 207Bi의 32%가 리포좀과 연합된 것으로 밝혀졌다.
<실시예 7>
리포좀 내 228Ac의 로딩
방법: 228Ac는 용매 추출과 이온 교환을 조합하여 232Th(NO3)4 제제로부터 단리시켰다. 232Th(NO3)4 (원래 4H2O)를 20 ㎖의 0.1 M HNO3 에 용해시키고 500 ㎖ 분리 깔때기에 첨가하고 헵탄 중 HDEHP의 2 M 용액 5×100 ㎖과 접촉시켰다. 이어서 수성상을 헵탄으로 3회 세척한 후 기술된 바와 같은 228Ac의 단리를 위해 AG50W-X12 양이온 교환 수지의 3×40 mm 칼럼에 적용하였다 (Cabell, 1959). 칼럼으로부터, 212Pb, 212Bi, 224Ra 및 228Ra를 3 M HNO3 내에 용출시키고, 용액을 >20시간 동안 방치 시켰다. 이어서, 용액을 증발 건조시킨 후 1 ㎖의 1 M HNO3로 용기로부터 방사성핵종을 걸러냈다. 이 용액을 AG50W-X12의 3×40 mm 칼럼에 적용하였다. 다시 212Pb, 212Bi, 224Ra 및 228Ra를 3 M HNO3 내에 용출시켰다. 228 Ac를 6 M HNO3 내에 용출시키고 용출물을 증발 건조시켰다. 이어서 228Ac를 200 ㎕의 5 mM HNO3을 사용하여 용기로부터 걸러냈다. 약 6 kBq의 228Ac를 상기한 바와 같이 이오노포어 A23187를 함유하는 리포좀에 첨가하고, 75℃에서 60분 동안 인큐베이팅시켰다. 이어서, 반응 혼합물을 100 ㎕의 10 mM EDTA에 첨가하고, PD-10 칼럼 상에서 용출시켜 지질 소포와 연합된 방사성을 단리시켰다. 95% 이상의 로딩된 소포에 대응하는 분획을 모은 후 제2 PD-10 칼럼 상에서 용출시켰다. 228Ac의 리포좀내 보유는 방사성표지된 소포를 37℃에서 인간 혈청 또는 PBS 내에서 인큐베이팅시킴으로써 조사하였다. 활성 분포를 24시간 기간에 걸쳐 추적조사하였다.
결과: 로딩 실험에서, 90-95%의 첨가된 228Ac (표지 및 정제 동안의 붕괴에 대해 교정함)가 로딩 절차 이후 리포좀과 연합되었다. 보유 실험에서, 98% 이상의 228Ac가 24시간 이내의 인큐베이션 시간 동안 리포좀과 연합되는 것으로 밝혀졌다.
<실시예 8>
90Y의 로딩
방법: 방사성표지된 리포좀의 행동을 연구하기 위해 본 실시예에서 90Y를 트레이서로서 사용하였다. 90Y 및 90Sr은 본 연구에서 액체 섬광 계수에 의해 측정하였다.
90Y는 문헌[Dietz and Horwitz (1992)]에 기재된 바와 같이 스트론튬 선택적 추출 크로마토그래피 수지에 의해 90Sr로부터 단리시켰다. 여기서, 0.1 M HNO3 중 90Sr (Amersham, Buckinghamshire, England)을 증발 건조시키고, 잔류물을 3 M HNO3에 첨가하였다. 용액을 Sr-수지 (EiChroM, Darien, IL, USA)의 3×20 mm 칼럼 상에 로딩하고, 칼럼을 5 ㎖의 3 M HNO3로 세척하였다.
본 절차는 90Sr/90Y 혼합물의 90Sr 함량을 약 103의 계수로 저하시키기 위해 칼럼 상에 Sr을 충분히 보유시키면서 90Y를 선택적으로 용출시킨다 (Dietz and Horwitz, 1992), 이후, 0.05 M HNO3을 사용하여 칼럼으로부터 90Sr을 스트리핑시키고, 이 용액을 90Y가 성장하도록 하기 위해 1주 동안 방치시켰다. 이어서, 용액을 증발 건조시키고, 잔류물을 3 M HNO3에 첨가한 후 Sr-수지의 제2 칼럼 상에서 방사성핵종을 분리시켰다. 90Y를 함유하는 용출물을 증발 건조시키고, 200 ㎕의 5 mM HNO3를 사용하여 용기로부터 방사성핵종을 걸러냈다. 상기 용액을 이오노포어 A23187을 함유하는 리포좀 (앞서 설명한 바와 같이)에 첨가하고, 75℃에서 60분 동안 인큐베이팅시켰다. 이어서 반응 혼합물을 50 ㎕의 10 mM EDTA에 첨가하고, PD-10 칼럼 상에서 용출시켜 지질 소포와 연합된 방사성을 단리시켰다. 이어서 95% 이상의 소포에 대응하는 분획을 제2 PD-10 칼럼 상에서 용출시켰다. 리포좀 연합된 90Y의 리포좀 보유를 소포를 37℃에서 인간 혈청 또는 PBS 중에서 인큐베이팅시킴으로써 조사하였다. 활성 분포를 4일의 기간에 걸쳐 추적조사하였다.
결과:첨가된 90Y의 95% 이상이 1시간의 로딩 및 겔 배제 칼럼 상의 정제 후 리포좀과 연합되었다.
리포좀 보유 연구에서, 5시간 및 1일 후 99% 이상이 리포좀 연합되었다는 결과를 얻었다. 4일 후, 리포좀 연합된 분획은 98±1%인 것으로 측정되었다.
이들 실험에서 나타나는 바와 같이, 리포좀은 알파-입자 및(또는) 베타-입자 방출 방사성핵종으로 방사성표지될 수 있고 이들 핵종을 생리학적 온도에서 잘 보유할 수 있다.
<실시예 9>
이트륨-90/라듐-223 PEG화 리포좀-폴레이트-Fab'의 제조
F(ab')2 R
Figure 112002026770761-pct00001
골수종 (Subclass IgG1) (PBS 중 14 ㎎/㎖)를 본 실험에서 사용하였다 (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway).
엽산의 항체에의 컨쥬게이션
엽산·2H2O를 먼저 디메틸 술폭시드 (Fluka, H2O 함량 0.05% 미만)에 용해시켰다. 이어서 용액을 활성화된 4Å 체 (Fluka) 상에 캐눌레이팅시키고, 아르곤 분위기 하에 암소에서 6-10시간 동안 보관하였다. 트리튬 표지된 폴레이트 (3H-폴레이트)를 3H-폴레이트의 칼륨염의 수용액으로서 첨가하였다 (시트르산에 대해 1%). 단백질에의 컨쥬게이션을 위해 사용된 3H-폴레이트의 특이적 활성은 7-7.5 GBq/mol이었다.
3H-폴레이트를 10몰 당량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드를 폴레이트 용액에 첨가하고 주변 온도에서 30분 동안 인큐베이팅시킴으로써 F(ab')2 골수종 항체에 커플링시키기 위해 활성화시켰다. 그 후, 30-40배 몰 과량의 활성화된 폴레이트를 단백질 (PBS 중 14 ㎎/㎖)에 첨가하고 30-60분 동안 반응시켰다. 반응물을 PBS/보레이트 (pH 8.5) 중 0.3 M 글라이신 0.2 ㎖을 첨가함으로써 켄칭시켰다. 폴레이트 F(ab')2 컨쥬게이트 (폴레이트-P(ab')2)를 PBS 내에서 예비평형화시킨 PD-10 칼럼을 사용하여 미반응 물질로부터 분리시켰다. 폴레이트-Fab'를 형성하기 위해, 폴레이트-F(ab')2를 1 mM 디티오트레이톨 (DTT) 내에서 주변 온도에서 2시간 동안 인큐베이팅시킨 후, NAP-5 크기 배제 칼럼 상에서 용출시켰다. 폴레이트-Fab'를 함유하는 분획을 용액을 통해 아르곤을 버블링시킴으로써 탈 산소시킨 후, 용액을 리포좀 용액과 즉시 혼합하였다.
엽산 컨쥬게이션 정도를 280 ㎚에서 분광광도 판독과 결합된 액체 섬광 계수 (Beckmann LS6500)에 의해 측정되는 바와 같은 정제된 단백질의 3H-함량에 의해 측정하였다.
폴레이트-Fab'의 리포좀 결합 분획의 정량을 위해, 미량의 요오드화 F(ab')2를 DTT와의 반응에 앞서 첨가하였다 (단백질은 표준 절차에 따라 IodoGen을 통해 요오드화시켰다).
표지된 항체의 리포좀에의 컨쥬게이션
DSPE-PEG2000-MPB (Northern Lipids, VA, Canada), 나트륨염을 총 인지질의 5 몰%로 포함시켰다. 리포좀을 달리 구성시켰고 비-PEG화 리포좀에 대해 설명한 것과 동일한 방식으로 이오노포어 매개된 양이온 로딩 단계를 위해 또한 제조하였다.
로딩 단계 이후 반응 혼합물을 실온에 도달시킨 후, 리포좀 현탁액을 폴레이트-Fab'를 첨가하기 전에 탈산소시켜 0.3-0.5 ㎎/㎖의 단백질 농도를 얻었다. 지질 농도는 Bartlett 인 분석 (Bartlett, 1958)에 의해 측정시 1-3 mM이었다. 폴레이트-Fab'와 리포좀을 주변 온도에서 2시간 동안 반응시켰다. 이어서 반응 혼합물을 PBS 내에 평형화된 PD-10 칼럼을 사용하여 적용하였다. 폴레이트-Fab' 컨쥬게이팅된 PEG-리포좀을 폴레이트-수용체 결합 분석에 사용하기에 앞서 4℃에서 12-15시간 동안 보관하였다.
리포좀-결합된 방사성을 이중 표지된 샘플로부터 각 채널에서 스필오버 (spillover)에 대해 교정한 NaI 웰 (well) 형 검출기에 의해 측정하였다. 단일 핵종의 샘플 및 핵종들의 혼합물을 참조용으로 사용하였다.
방사성 측정으로부터, 단백질 농도를 100 ㎚의 리포좀 크기와 8·104 인지질/소포 (Kirpotin 등, 1997) 및 Fab' 골수종 항체의 분자량은 52,000인 것으로 가정하여 리포좀당 Fab'의 수로 전환시켰다.
세포 결합된 방사성을 Insta-Gel plus (Packard)를 첨가한 후 NaI-검출기 (Y-90에 대해 3 더 높은 농도) 및 액체 섬광 계수에 의해 측정하였다 (표 3).
폴레이트를 갖거나 갖지 않는 항체와 컨쥬게이팅된90Y-리포좀의 OVCAR 세포로의 결합
첨가된 리포좀/세포 세포 결합된 폴레이트-음성 리포좀% 세포 결합된 폴레이트-양성 리포좀%
1·105 <0.5 10±3
1·104 1±0.5 9±3
1·103 4±2 11±2
1·102 5±1 16±2
10 8±3 46±8

리포좀 상의 3H-폴레이트의 검출
20 mM HEPES/300 mM 수크로스 중 PEG 리포좀 (2.5 mM 지질 농도)을 3H-폴레이트 컨쥬게이팅된 Fab' (PBS 중 0.5 ㎎/㎖, 폴레이트/Fab' 비 2±0.2)와 반응시켰 다. 실온에서 2시간 후, 폴레이트-Fab' 연결된 리포좀을 Sepharose CL-4B의 칼럼 상에서 용출에 의해 단리하였다. 리포좀 상의 3H-폴레이트-Fab'의 양을 크로마토그래피로 얻은 분획의 액체 섬광 계수에 의해 정량하였고, 폴레이트-Fab'/리포좀 비는 약 110인 것으로 측정되었다.
약어:
DSPC: 디스테아로일 포스파티딜 콜린
DOTA: 1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸 1,4,7,10 N,N',N'',N''' 테트라아세트산
DSPE-PEG2000-MPB: N-(4-(p-말레이미도페닐)부티릴)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (Northern Lipids, VA, Canada).
HEPES: N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2 에탄술폰산
PBS: 포스페이트 완충 염수
EDTA: 에틸렌 디아민 N,N' 테트라아세트산
HDEHP: 비스(2-에틸 헥실) 인산
PEG: 폴리에틸렌글리콜
DTT: 디티오트레이톨
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Claims (34)

  1. 이오노포어(ionophores)를 갖고, 킬레이터가 내부에 위치되어 있으며, α 입자를 방출하는 무거운 방사성핵종을 봉입(encapsulation)하고, 여기서 상기 무거운 방사성핵종은 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 224Ra 및 227Th 중에서 선택되거나, 또는 붕괴되어 212Bi를 생성하는 212Pb이고, 상기 킬레이터는 7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TRITA), 1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산 (DOTMP), 1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산, 1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산, 디에틸렌 트리아민 N,N',N'' 펜타아세트산 및 이들의 이성체 유도체, 크립테이트[2,2,2], 크립테이트[3,2,2], 크립테이트[2,2,1] 및 이들의 모노- 및 디-벤조 유도체, 전자 풍부 (공여체) 기 (히드록실, 카르복실, 에스테르, 아미드, 아민)를 함유하는 가교된 칼릭스[4]아렌, 1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-아세트산 및 1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-말로네이트를 포함하는 군 중에서 선택되는 방사성 리포좀.
  2. 제1항에 있어서, 리포좀 내부의 킬레이터가, 제1항에 정의된 무거운 방사성핵종의 붕괴로부터 얻어진 딸 핵종을 보유하는 방사성 리포좀.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 막 내에 활성화된 기를 함유하여, 단백질, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 또는 구조체, 또는 폴레이트(folate)가 상기 활성화된 기에 컨쥬게이션되도록 하는 방사성 리포좀.
  5. 제4항에 있어서, 활성화된 기가 폴리에틸렌글리콜인 방사성 리포좀.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 또는 구조체, 또는 폴레이트에 컨쥬게이션되는 방사성 리포좀.
  7. 삭제
  8. 제6항에 있어서, IgM 또는 IgG 계열의 항체, 또는 이들 계열의 항체로부터의 단편 또는 구조체와 컨쥬게이션되는 방사성 리포좀.
  9. 삭제
  10. 제6항에 있어서, 리포좀에 컨쥬게이션된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 쥐의, 키메릭 또는 인간의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 방사성 리포좀.
  11. 제10항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 폴레이트로 표지되고, 이때 항원 결합 부위가 폴레이트 결합 단백질을 지향하는 방사성 리포좀.
  12. 제10항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 폴레이트로 표지되고, 이때 항원 결합 부위가 폴레이트 결합 단백질과 상이한 항원을 지향하는 방사성 리포좀.
  13. 삭제
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 무거운 방사성핵종이 212Pb이고, 이것이 붕괴되어 212Bi를 생성하는 방사성 리포좀.
  15. 무거운 방사성핵종들의 혼합물을 리포좀과 혼합하고 37℃보다 높은 온도에서 인큐베이션시켜 방사성핵종을 리포좀 내로 이동시킴으로써, 이오노포어 및 킬레이터를 갖는 리포좀을 무거운 방사성핵종으로 안정하게 방사성표지하는 것을 포함하고, 여기서 상기 무거운 방사성핵종은 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 224Ra 및 227Th 중에서 선택되거나, 또는 붕괴되어 212Bi를 생성하는 212Pb이고, 상기 킬레이터는 7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA), 1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TRITA), 1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (TETA), 1,4,7,10 테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산 (DOTMP), 1,4,7,10 테트라아자시클로트리데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산, 1,4,7,10 테트라아자시클로테트라데칸-1,4,7,10 N,N',N'',N'''-테트라(메틸렌) 포스폰산, 디에틸렌 트리아민 N,N',N'' 펜타아세트산 및 이들의 이성체 유도체, 크립테이트[2,2,2], 크립테이트[3,2,2], 크립테이트[2,2,1] 및 이들의 모노- 및 디-벤조 유도체, 전자 풍부 (공여체) 기 (히드록실, 카르복실, 에스테르, 아미드, 아민)를 함유하는 가교된 칼릭스[4]아렌, 1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-아세트산 및 1,10 디아자-4,7,13,16-테트라옥사시클로옥타데칸-1,10 N,N' 비스-말로네이트를 포함하는 군 중에서 선택되는, 방사성 리포좀의 제조 방법.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서, 리포좀이 막 내에 활성화된 기를 함유하여, 단백질, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 또는 구조체, 또는 폴레이트가 상기 활성화된 기에 컨쥬게이션되도록 하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 활성화된 기가 폴리에틸렌글리콜인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 리포좀이 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 항체 단편 또는 구조체, 또는 폴레이트에 컨쥬게이션되는 것인 방법.
  20. 삭제
  21. 제19항에 있어서, 리포좀이 IgM 또는 IgG 계열의 항체, 또는 이들 계열의 항체로부터의 단편 또는 구조체와 컨쥬게이션되는 것인 방법.
  22. 삭제
  23. 제19항에 있어서, 리포좀에 컨쥬게이션된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 쥐의, 키메릭 또는 인간의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 폴레이트로 표지되고, 이때 항원 결합 부위가 폴레이트 결합 단백질을 지향하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 항체 단편 또는 구조체가 폴레이트로 표지되고, 이때 항원 결합 부위가 폴레이트 결합 단백질과 상이한 항원을 지향하는 것인 방법.
  26. 삭제
  27. 제15항에 있어서, 무거운 방사성핵종이 212Pb이고, 이것이 붕괴되어 212Bi를 생성하는 것인 방법.
  28. 제1항 또는 제2항에 따른 방사성 리포좀을 포함하는, 악성종양을 치료하기 위해 인간을 포함한 포유동물에게 주사 또는 주입하기에 적합한 제약학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 정맥내, 국소 또는 종양내 투여 경로에 의해 인간을 포함한 포유동물에게 주사 또는 주입하기에 적합한 제약학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 악성종양을 치료하기 위해 공지의 방사성면역컨쥬게이트 또는 몇몇 공지의 방사성면역컨쥬게이트들, 또는 다른 형태의 방사성약물 요법, 화학요법, 외부 광선 요법 또는 수술과 조합하여 사용되는 제약학적 조성물.
  31. 폴레이트 결합 단백질, 에스트로겐 수용체, 테스토스테론 수용체, 또는 모노클로날 항체에 대한 각종 항원 중에서 선택된 수용체를 발현하는 악성종양 표적 세포에 치료 방사선을 전달하기 위한 목적으로, 인간을 제외한 환자에게 주사함으로써 제1항 또는 제2항에 따른 방사성 리포좀을 사용하는 방법.
  32. 악성종양 조직이 뇌암, 폐암, 자궁경부암, 난소암, 유방암, 백혈병, 림프종 또는 악성 흑색종인, 수용체를 발현하는 악성종양 세포에 치료 방사선을 전달하기 위한 목적으로, 인간을 제외한 환자에게 주사함으로써 제1항 또는 제2항에 따른 방사성 리포좀을 사용하는 방법.
  33. 방사성표지를 용이하게 하기 위해 혼합될 수 있는, 리포좀 용액을 담고있는 바이알 및 방사성핵종을 용액으로 담고있는 바이알을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방사성 리포좀 제조용 키트.
  34. 방사성표지 및 수용체 친화성 분자로의 표지를 용이하게 하기 위해 혼합될 수 있는, 리포좀 용액을 담고있는 제1 바이알, 방사성핵종 용액을 담고있는 제2 바이알 및 수용체 친화성을 갖는 분자를 담고있는 제3 바이알을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1항 또는 제2항에 따른 방사성 리포좀 제조용 키트.
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