PL201398B1

PL201398B1 - System koniugatora radionuklid-liposom, sposób jego wytwarzania, zastosowanie systemu koniugatora do wytwarzania roztworu farmaceutycznego, zastosowanie terapeutyczne systemu koniugatora oraz zestaw do wytwarzania systemu koniugatora

Info

Publication number: PL201398B1
Application number: PL358541A
Authority: PL
Inventors: Roy H. Larsen; Gjermund Henriksen
Original assignee: Anticancer Therapeutic Inv Sa
Priority date: 2000-02-21
Filing date: 2001-02-21
Publication date: 2009-04-30
Also published as: DK1257299T3; CZ299032B6; ZA200206500B; NZ520848A; NO20000855D0; US6592843B2; DE60112251D1; UA73160C2; AU2001237827B2; AU2001237827B8; JP4933712B2; CN100350981C; ATE300316T1; EP1257299B1; CZ20023164A3; CN1404402A; NO20000855L; BR0108572A; PL358541A1; JP2003522808A

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest system koniugatora radionuklid-liposom, który obejmuje liposomy z jonoforami, wewn atrz których to liposomów umiejscowione s a chelator i ci ezki radionu- klid/radionuklidy, emituj acy cz astki a i/lub 212 Pb jako generator dla a-emitera 212 Bi, przy czym ci ezki radionuklid ma ci ezar atomowy powy zej 150. Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania ra- dioaktywnych liposomów tego typu, zastosowanie systemu koniugatora do wytwarzania roztworu far- maceutycznego, oraz zastosowanie systemu do wytwarzania leku i zestaw do wytwarzania systemu. PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 201398 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 358541 ⁽¹³⁾ (22) Data zgłoszenia: 21.02.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

21.02.2001, PCT/NO01/00065 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

23.08.2001, WO01/60417 PCT Gazette nr 34/01 (51) Int.Cl.

A61K 51/12 (2006.01) A61K 9/127 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01)

Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy

System koniugatora radionuklid-liposom, sposób jego wytwarzania, zastosowanie (54) systemu koniugatora do wytwarzania roztworu farmaceutycznego, zastosowanie terapeutyczne systemu koniugatora oraz zestaw do wytwarzania systemu koniugatora

(30) Pierwszeństwo: 21.02.2000,NO,20000855	(73) Uprawniony z patentu: ANTICANCER THERAPEUTIC INVENTIONS AS,Oslo,NO
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 09.08.2004 BUP 16/04	(72) Twórca(y) wynalazku: Roy H. Larsen,Bekkestua,NO Gjermund Henriksen,Mj0ndalen,NO
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2009 WUP 04/09	(74) Pełnomocnik: Sitkowska Jadwiga, PATPOL Sp. z o.o.

⁽⁵⁷⁾ Przedmiotem wynalazku jest system koniugatora radionuklid-liposom, który obejmuje liposomy z jonoforami, wewną trz których to liposomów umiejscowione są chelator i ciężki radionu212 212 klid/radionuklidy, emitujący cząstki α i/lub Pb jako generator dla α-emitera Bi, przy czym ciężki radionuklid ma ciężar atomowy powyżej 150. Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania radioaktywnych liposomów tego typu, zastosowanie systemu koniugatora do wytwarzania roztworu farmaceutycznego, oraz zastosowanie systemu do wytwarzania leku i zestaw do wytwarzania systemu.

PL 201 398 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest system koniugatora, który obejmuje liposomy z jonoforami oraz z chelatorem umiejscowionymi wewnątrz liposomów, które to liposomy są znakowane ciężkimi radionuklidami emitującymi cząstki α. Wynalazek obejmuje ponadto sposób wytwarzania systemu koniugatora, oraz zastosowanie systemu i zestaw do wytwarzania systemu koniugatora.

Zastosowania biomedyczne radionuklidów w terapii nowotworów skupiały się dotychczas na zastosowaniu cząstek kationowych lub anionowych, np. jodku [¹³¹] przeciwko rakowi tarczycy i ⁸⁹Sr w paliatywnej terapii przeciwbólowej w przerzutach raka do szkieletu, oraz stosowania radionuklidów emitujących przeważnie promieniowanie beta, przyłączonych do przeciwciał monoklonalnych (DeVita i in., 1996).

Stosowanie celowanej terapii raka za pomocą radionuklidów opiera się na zdolności znalezienia sposobów przyłączenia radionuklidów do specyficznych w stosunku do guza związków nośnikowych (Gaze, 1996). Obecnie niektóre z radionuklidów o użytecznej charakterystyce promieniowania nie mogą być stosowane do celowanej terapii nowotworów z powodu problemów z uzyskaniem stabilnego chemicznie wiązania między radionuklidem a związkiem nośnikowym. Nowe systemy nośnikowe mogą jednakże rozszerzyć zastosowanie radioizotopów, jak również arsenał radionuklidów uważanych za użyteczne w terapii (Gaze, 1996).

Liposomy, z grupami mającymi powinowactwo do receptora przyłączonymi lub nie do ich powierzchni, badane były jako środki do dostarczania leków i są obecnie stosowane klinicznie do dostarczania środków chemioterapeutycznych w pewnych formach nowotworów. Ostatnio postęp w badaniach nad liposomami doprowadził do nowych wersji charakteryzujących się farmakokinetyką, którą może uczynić te związki użytecznymi jako nośniki dla radionuklidów do wewnętrznej radioterapii raka (Gabizon, 1995). W wyniku ostatnich postępów w formulacji i wytwarzaniu liposomów uzyskano małe pęcherzyki o wielkości poniżej 100 nm o przedłużonym czasie życia w krążeniu, dzięki ulepszeniu możliwości uzyskiwania liposomów o małych średnicach za pomocą techniki ekstruzji przez błony. Ponadto, wprowadzenie liposomów szczepionych glikolem polietylenowym (PEG) zmniejszyło oddziaływanie z białkami osocza, i w ten sposób zmniejszyło rozpoznawanie i klirens przez makrofagi z układu siateczkowo-śródbłonkowego (Maruyama i in., 1997). W ten sposób, dzięki utrzymaniu stę żenia we krwi, osiągnięto zwiększenie wychwytu do guza. Jeszcze większy wychwyt do guza uzyskano poprzez skoniugowanie do powierzchni liposomów cząsteczek mających powinowactwo do receptora, np. przeciwciał monoklonalnych lub folanu. Ponadto, szereg badań wykazało zaletę stosowania PEG jako linkera między liposomem a ligandem kierującym, ponieważ to również może polepszyć dostępność receptora (np. Maruyama i in., 1997, Gabison i in., 1999, Lee i in., 1994).

Liposomy badano poprzednio jako nośniki dla radioizotopów (Goins i in., 1998, Turner i in., 1998). Pikul i in. (1987) opisali badanie oparte na ²¹²Pb-dekstranie inkorporowanym pasywnie (to jest ²¹²Pb-dekstran dodano podczas generowania liposomów, i część ²¹²Pb-dekstranu inkorporowano razem z fazą wodną stanowiącą wnętrze liposomu). Autorzy nie sugerowali, aby liposomy te nadawały się do terapii raka, ale stosowali je przede wszystkim do badania wewnątrzkomórkowego zabijania komórek in vitro przez radioizotop. Nie przedstawiono żadnych danych odnośnie losu ²¹²Bi generowanego w wyniku rozpadu ²¹²Pb; a wielkość liposomów wynosiła 350-500 nm, co jest wielkością bardzo dużą w porównaniu do wielkości (około 100 nm) obecnie uznawanej za optymalną dla terapii raka in vivo (Forssen, 1997). Ponadto, liposomy nie zawierały w błonie PEG.

Ogihar-Umeda i in. (1996) stosowali liposomy jako nośnik dla emitujących promieniowanie gamma radionuklidów ⁶⁷Ga, ¹¹¹In i ^99mTc i sugerowali stosowanie radioznakowanych liposomów do obrazowania.

W badaniach teoretycznych Kostarelos i in. (1999) sugerowali stosowanie liposomów znakowa131 67 188 211 nych potencjalnie terapeutycznymi radionuklidami ¹³¹l, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁸Re i ²¹¹At ale nie sugerowano procedur chemicznych do wytwarzania radioznakowanych liposomów.

W EP386146B1 opisano kompozycję i sposób stosowania związków zamkniętych w liposomach do terapii raka z wychwytem neutronów. Jednakże liposomy te obciążano pierwiastkami stabilnymi (np. borem), które stają się radioaktywne jedynie po aktywacji, i liposomy te nie zawierały ani jonoforów ani chelatora.

Utkhede i in. (1994) opisują liposomy obciążone ⁹⁰Y i chelatorem DTPA, który jest innym chelatorem niż chelatory opisane w niniejszym wynalazku. Ponadto, nie jest opisana retencja nuklidu/nuklidów

PL 201 398 B1 macierzystych/pochodnych, i dodatkowo ⁹⁰Y nie jest pierwiastkiem ciężkim tak jak pierwiastki opisane w niniejszym zgł oszeniu.

Uzyskanie dostatecznie stabilnego radioznakowania nośników ciężkimi radionuklidami emitującymi promieniowanie α zwykle wymaga specyficznych procedur chemicznych dopasowanych do chemii każdego z pierwiastków i metody takie nie są znane. Nie można oczekiwać, aby procedury stosowane do radioznakowania np. Ga, In, Tc, Cu lub Re, były kompatybilne z ciężkimi radionuklidami (ciężar atomowy powyżej 150), będącymi kationowymi emiterami α, _{jak na przykład} ^212/213Bi, ²¹²Pb, ^223/224Ra, ²²⁷Th lub ²²⁵Ac.

Celem wynalazku jest zatem dostarczenie systemu koniugatora radionuklid-liposom, z grupami mającymi powinowactwo do receptora lub bez takich grup, który (1) zawiera zamknięty chelator i ciężki radionuklid/radionuklidy, emitujący promieniowanie cząsteczkowe α, (2) może utrzymywać nuklid/nuklidy pochodne kiedy nuklid/nuklidy macierzyste są inkorporowane w liposomie, i (3) może być wytworzony za pomocą jednej aktywnej procedury inkorporacji użytecznej dla grupy radionuklidów, jak również zastosowania systemu i zestawu do wytwarzania takiego systemu. Cele te osiągnięto za pomocą niniejszego wynalazku, scharakteryzowanego załączonymi zastrzeżeniami.

Przedmiotem wynalazku jest system koniugatora radionuklid-liposom, obejmujący liposomy z jonoforami, to jest ś rodkami ekstrahującymi metal do liposomów, oraz z chelatorem i ciężkim radio nuklidem/radionuklidami, o ciężarze atomowym powyżej 150, i/lub ²¹²Pb jako generatorem dla α-emitera ²¹²Bi, umiejscowionymi wewnątrz liposomu.

Liposomy wytwarza się stosując aktywne inkorporowanie radionuklidu, to jest poprzez jonofory, i wytwarza sieje stosując procedury dające liposomy o wielkości typowo 100 nm. Uzyskany produkt wykazuje dobrą stabilność chemiczną w ciągu kilku dni, i może również utrzymywać wewnątrz liposomu nuklid/nuklidy pochodne, np. z transformacji ²¹²Pb do ²¹²Bi. Liposomy można wytwarzać z grupami modyfikującymi, jak tlenki polialkilenu, np. PEG, przyłączonymi do błony, lub bez takich grup. W niniejszym zgłoszeniu opisujemy również sposób łączenia takich radioznakowanych liposomów do białek wyszukujących guza, takich jak na przykład przeciwciała monoklonalne skoniugowane z folanem.

Niniejszy wynalazek zostanie obecnie opisany bardziej szczegółowo z odniesieniem do figur i przykładów.

Figura 1. Wiązanie PEGylowanych liposomów, zawierających przeciwciało Fab' lub Fab' znakowane folanem skoniugowanym z błoną liposomu, do komórek OVCAR3.

Figura 2. Wiązanie folanowanych i niefolanowanych PEG-liposomów, do komórek OVCAR3.

W celu opracowania radioznakowanych liposomów odpowiednich do terapii raka, twórcy niniejszego wynalazku badali wytwarzanie i stosowanie liposomów obciążonych ciężkimi radionuklidami (to

212 213 jest o ciężarze atomowym powyżej 150) emitującymi cząstki α, na bazie radionuklidów ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁵Ac, ²¹²Pb i ²²⁷Th. Stosując liposomy (pęcherzyki) z jonoforami, wytworzono radioznakowane liposomy, korzystnie z chelatorem (to jest w liposomach zamknięty jest radionuklid i chelator), stosując aktywne inkorporowanie radionuklidu, i wytwarzano je stosując procedury dające liposomy o wielkości typowo 100 nm.

Pęcherzyki jednolaminarne wytworzono na drodze hydratacji i ekstruzji cienkiego filmu lipidowego (Olson i in., 1979, MacDonald i in., 1991) w następujący sposób. DSPC (distearoilofosfatydylocholinę) i cholesterol w stosunku molowym 2:1, typowo odpowiednio 10 i 5 μmoli, rozpuszczono w chloroformie w kolbie okrągłodennej. Usunięto rozpuszczalnik przez odparowanie na wyparce próżniowej pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie suchy film lipidowy uwodniono w 0,5-1 ml 150 mM roztworu kwasu cytrynowego, 30 mM DOTA (kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy), pH 4. Uzyskaną zawiesinę poddano pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania, po czym pięciokrotnej ekstruzji przez filtry poliwęglanowe o wielkości porów 100 nm, stosując ręczne urządzenie wytłaczające (Avestin, Ottawa, Kanada). Produkt miał stężenie lipidów ~30 mM. Przed obciążeniem liposomów radionuklidami roztwór zewnętrzny wymieniono przez elucję na kolumnie PD-10 na roztwór 250 mM sacharozy, 20 mM HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etano-sulfonowy), pH 4.

Składniki liposomów:

a) Wewnętrzne medium wodne: pH 1-14, korzystnie 2-9, bardziej korzystnie 4-5. Składniki: woda, środki zdolne do utrzymywania żądanego pH w wewnętrznym medium wodnym przez żądany okres czasu, to jest aż do rozpoczęcia inkorporowania radiometalu/radiometali za pośrednictwem jonoforów. Korzystnie, składniki wewnętrznego medium wodnego również prowadzą do funkcji kompleksowania radiometalu/radiometali. Można to uzyskać przez i) funkcje elektronodonorowe środków stosowanych do ustawienia pH, np. atom(y) tlenu w octanie, cytrynianie i podobnych środkach;

PL 201 398 B1 ii) ponadto przez obecność środka kompleksującego w wewnętrznym medium wodnym, np.

EDTA, DTPA, DOTA, DOTMP, i związków pokrewnych.

b) Jonofor, to jest środek zdolny do transportowania, z zasady nieodwracalnego, radiometalu przez podwójną warstwę lipidową z fazy pozaliposomowej do wnętrza liposomu. Przykłady: jonofor wapniowy A 23187, dicykloheksylo 18-C6, Dibenzo-18-C6,2,3-dimekapto-1-propanol, jonofor Pb.

c) Składniki podwójnej warstwy lipidowej. Składniki podwójnej warstwy lipidowej korzystnie tworzą mieszaninę zdolną do tworzenia pęcherzyków, i dla której temperatura przejścia ciecz-ciało stałe jest wyższa od temperatury fizjologicznej. Są to na przykład:

i) fosfolipidy, których przykładami są długołańcuchowe alkilofosfatydylocholiny, np. 1,2-dilauroilo-sn-glicero-3-fosfocholina(DLPC), 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC), 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC), 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC),

1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC), 1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC);

ii) sterole lub związki posiadające podobne właściwości usztywniania (zmniejszania płynności) podwójnej warstwy lipidowej, których przykładami są związki z klasy steroli cholesterol i 3-siarczan cholesterolu; oraz iii) stabilizator(y) in vivo (steryczne) do zwiększania właściwości kierowania konstruktu do komórki nowotworowej i zwiększania czasu przebywania we krwi, np. polietery, glikole polietylenowe.

Włączenie PEG i/lub pochodnych PEG do preparatów liposomowych jest korzystne ze pod względu na zmniejszony klirens wstrzykiwanych liposomów z krążenia poprzez układ siateczkowo-śródbłonkowy. Typowo są zawarte w preparacie w ilości 3-10% molowych względem fosfolipidu. Ilość stabilizatora niezbędna dla uzyskania pożądanego efektu stabilizacji jest jednakże zależna od monomeru (właściwości elektrostatycznych i polarności) i liczby jednostek powtarzalnych, to jest długości łańcucha. Przykłady PEG i pochodnych PEG: 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[poli(glikol etylenowy)2000] (PEG2000DPPE, 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[poli(glikol etylenowy)2000] PEG2000 DSPE).

d) Składniki ułatwiające modyfikację konstruktów dla nadania im właściwości kierowania do komórek nowotworowych.

Wybór odpowiedniego aktywowanego lipidu będzie zdeterminowany rodzajem haptenu, jak również wymaganiami prowadzonych badań. Efektywność reakcji będzie zależna od grupy opuszczającej, łącznika hydrofilowego, właściwości materialnych liposomu i stężenia reagentów. W przypadku badań in vivo, w których wymagane jest aby hapten pozostawał zasocjowany w liposomie, można uzyskać różne zalety przez dobranie kotwiczących lipidów o dłuższym łańcuchu acylowym, których wymiana między błonami jest wolniejsza. Ponadto, wiązanie kowalencyjne między haptenem a kotwicą lipidową powinno być stabilne zarówno chemicznie jak i odporne na rozszczepienie enzymatyczne. Aktywowane lipidy mogą funkcjonować z wytworzeniem wiązań np. aminowych, amidowych, tioeterowych lub disiarczkowych między lipidem a modyfikatorem. Jeśli do preparatu wprowadzone są stabilizatory steryczne, np. PEG lub pochodne PEG, grupa funkcyjna do sprzęgania jest korzystnie obecna na końcu związku takiego samego jak stabilizator lub podobnego i o efektywnej długości łańcucha takiej samej lub dłuższej jak w stabilizatorze. Przykładami składników pęcherzyków z PEG lub pochodnymi PEG ułatwiających modyfikację konstruktów w celu nadania im właściwości kierowania do komórek nowotworu są: N-[ff>-(2-pirydyloditiopropionyloamino)poH(gnkol etylenowy)2000]-1,2-di-stearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina(PDP-PEG2000-DSPE),N-{ff>-[4-(p-maleimidofenylo)butanoHoammo}-pon(gnkol etylenowy)2000]-1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (MpB-PEG2000-DSPE).

Separację radionuklidów związanych z liposomami od radionuklidów niezwiązanych z liposomami przeprowadzono stosując chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek (Mauk and Gamble, 1979, Tilcock i in., 1991). Do separacji po procedurach obciążania liposomów zastosowano kolumny PD-10 do chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząstek. Z objętości 1 ml lub mniejszy wprowadzanych na kolumny PD-10 liposomy eluowały w pierwszych 4,5 ml. Radionuklidy niezwiązane z liposomami eluowały we frakcji odpowiadającej cząstkom o niższym ciężarze cząsteczkowym. Kolumny PD-10 stosowano również do badania stabilności (pod względem retencji radionuklidu) obciążonych liposomów w PBS.

Separację radionuklidów związanych z liposomami od wolnych radionuklidów w osoczu przeprowadzono stosując chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek na kolumnie Sepharose CL-4B (Hwang and Mauk, 1977). W ten sposób można było otrzymać roztwory zawierające

PL 201 398 B1 radioaktywne liposomy zdyspergowane w nośniku ciekłym zasadniczo wolnym od niezwiązanych radionuklidów.

Przed procedurami chromatograficznymi dodawano EDTA (kwas etylenodiamino-N,N'-tetraoctowy) w celu stabilizacji wolnego radionuklidu w stanie, który może być łatwo oddzielony od frakcji związanej z liposomami.

Wydajność obciążenia radionuklidem dla radionuklidów związanych z liposomami oraz latencję radionuklidów związanych z liposomami określano za pomocą spektroskopii gamma dla ²²⁸Ac, ²²³Ra, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²⁰⁵Bi i ²⁰⁷Bi, ²²⁸Ac i ²⁰⁵Bi/²⁰⁷Bi stosowano jako wskaźnik izotopowy dla potencjalnie użytecznych terapeutycznie radionuklidów, odpowiednio ²²⁵Ac, ²¹⁵Bi i ²¹³Bi.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także sposób wytwarzania radioznakowanego systemu koniugatora, polegający na tym, że liposomy z jonoforami i chelatorem w odpowiednim stężeniu stabilnie radioznakuje się ciężkim emiterem cząstek α, przez zmieszanie roztworu zawierającego radionuklid lub mieszaninę radionuklidów emitujących promieniowanie cząstek alfa lub ²¹²Pb jako generator dla α-emitera ²¹²Bi, z roztworem zawierającym liposomy i inkubowanie w podwyższonej temperaturze w porównaniu z temperaturą fizjologiczną, uzyskując transport radionuklid(ów) do liposomów.

Twórcy niniejszego wynalazku dokonali istotnego i nieoczekiwanego odkrycia, że ²¹²Bi nie ulegał istotnym przemieszczeniom po rozpadzie ²¹²Pb inkorporowanego w tym typie liposomów. Obecny stan stosowania ²¹²Pb jako połączonego molekularnie generatora dla ²¹²Bi wskazuje, że zwykle z chelatora uwalnianie jest znaczące (>30%) (McClure and Feinendegen, 1998; Mirzadeh i In., 1993). Jednakże przez wychwycenie ²¹²Pb w wysokim stężeniu chelatora, tak jak na przykład wewnątrz liposomy, można uniknąć uwalniania produktu pochodnego poprzez użycie systemu koniugatora, który może być stosowany do wychwycenia nuklidu pochodnego po przekształceniu jądrowym. System koniugatora dla ²¹²Pb, który może prawie ilościowo zatrzymywać nuklid pochodny ²¹²Bi, opisano obecnie po raz pierwszy. Tak więc, wynalazek dotyczy liposomów z jonoforami, które zawierają radionuklid i chelator umiejscowione wewnątrz liposomy (system koniugatora), który to system koniugatora może zatrzymywać nuklid pochodny lub go nie zatrzymywać.

Chelator zgodnie z wynalazkiem może być wybrany z grupy obejmującej:

kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TRITA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TETA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)fosfonowy (DOTMP), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)fosfonowy, kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)fosfonowy, kwas dietylenotriamino-N,N',N-pentaoctowy i ich izomery, kryptat[2.2.2], kryptat [3.2.2], kryptat

[2.2.1] i ich mono- i di-benzo pochodne, mostkowane kaliks[4]areny, zawierające grupy bogate w elektrony (donorowe) (hydroksylowe, karboksylowe, estrowe, amidowe, aminowe), kwas 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoksacyklooktadekano-1,10-N,N'-bis-octowy, i 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoksacyclooktadekano-1,10-N,N'-bis-malonian.

Innym ważnym i niespodziewanym odkryciem było to, że liposomy według niniejszego wynalazku mogą skutecznie inkorporować i zatrzymywać ²²³Ra. Po raz pierwszy opisano system koniugatora, potencjalnie użyteczny do kierowania radu 223 do nowotworu. Ponadto wykazaliśmy, że możliwe jest inkorporowanie również bizmutu i aktynu i ich wysoka retencja w liposomach obecnie opisanego typu, co wskazuje, że można wytworzyć również system koniugatora oparty na ²¹²Bi, ²¹³Bi i ²²⁵Ac.

System koniugatora według niniejszego wynalazku można wytworzyć z modyfikującymi grupami powierzchniowymi, np. PEG, na powierzchni błony liposomy (liposomy szczepione PEG/PEGylowane) lub bez takich grup modyfikujących. Zaletą stosowania PEG w błonie jest to, że dostarcza się w ten sposób grup reaktywnych z PEG, co pozwala na koniugowanie białek, takich jak przeciwciała, fragmenty lub konstrukty przeciwciał lub folany, albo innych białe/cząsteczek mających powinowactwo do receptora (wiążących się z receptorem).

Niniejszy wynalazek dotyczy nowego typu liposomów, z przyłączonymi do błony liposomy białkami wiążącymi się z receptorem. Opisujemy tu radioznakowane liposomy szczepione PEG, skoniugowane z przeciwciałami znakowanymi folanem. Stosowanie folanu i pochodnych folanu do kierowania do nowotworów wyrażających białka wiążące folan (FBP), białka błony komórkowej połączone wiązaniem glikozylo-fosfarydylo-inozytolowym, zaangażowanym w wychwyt komórkowy utlenionego folanu na drodze endocytozy, przyciąga uwagę wielu naukowców (Kranz i in., 1996); Reddy i in., 1998; Shinoda i in., 1998; Trippet i in., 1999). Ponieważ wykazano, że wiele typów ludzkich komórek

PL 201 398 B1 rakowych jest zdolnych do nadekspresji FBP, receptor ten może być możliwym celem do dostarczania radioizotopów terapeutycznych skoniugowanych z folanem. Tak więc, stosując przeciwciała skoniugowane z folanem, można uzyskać selektywną (kierowaną) terapię raka radionuklidem. Ponadto, jeśli antygenowe miejsce łączące przeciwciała znakowanego folanem jest skierowane przeciwko związanemu z nowotworem antygenowi innemu niż FBP, uzyskuje się zdolność podwójnego wiązania (czyli powinowactwo zarówno do przeciwciała-antygenu jak i receptora FBP). Według naszej wiedzy, jest to pierwszy przypadek opisania koniugowania przeciwciał znakowanych folanem.

Znakowane folanem przeciwciała skoniugowane z liposomami według niniejszego wynalazku mogą być w celu intensyfikacji radioterapii dalej znakowane radionuklidem lub mieszaniną radionuklidów.

Niniejszy wynalazek wykazuje, że to nowe połączenie przeciwciał znakowanych folanem skoniugowanych z liposomami może być stosowane do kierowania radionuklidu(ów) do komórek wyrażających receptory folanu. Jest to szczególnie użyteczne w przypadku emiterów cząstek α, które są erniterami promieniowania o silnym liniowym przenoszeniu energii (high LET), ekstremalnie cytotoksycznymi dla komórek ssaków (Hall, 1994; Larsen i in., 1998; Ritter i in., 1977). Jednakże źródło promieniowania α może dostarczać promieniowanie do wyjątkowo małego obszaru w porównaniu z innymi typami promieniowania. Tak więc, jeśli źródło promieniowania α może być skierowane do tkanki docelowej, ekspozycja tkanki normalnej może być zmniejszona.

System koniugatora według wynalazku, przez koniugowanie przeciwciał dla estrogenu lub testosteronu, może być również stosowany do kierowania do komórek wyrażających np. receptor estrogenu lub receptor testosteronu.

Znakowanymi przeciwciałami zgodnie z niniejszym wynalazkiem są korzystnie przeciwciała klasy IgG lub IgM, i/lub ich fragmenty i/lub konstrukty (np. miniciała). Ponadto, przeciwciała te i/lub ich fragmenty i/lub konstrukty mogą być mysie/szczurze, chimeryczne, lub w pełni zhumanizowane, poliklonalne lub monoklonalne.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zastosowanie systemu koniugatora określonego powyżej do wytwarzania roztworu farmaceutycznego, odpowiedniego do iniekcji lub infuzji ssakom, w tym ludziom. Roztwór taki może być podawany przy wykorzystaniu dożylnej i/lub miejscowej i/lub doguzowej drogi podawania. Roztwór farmaceutyczny może być stosowany do leczenia nowotworów złośliwych w połączeniu z radioimmunokoniugatem lub kilkoma radioimmunokoniugatami i/lub innymi formami terapii radiofarmaceutycznej, chemioterapii, terapii zewnętrzną wiązką promieniowania lub chirurgii.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zastosowanie systemu koniugatora określonego powyżej, do wytwarzania leku do iniekcji do podmiotów ludzkich w celu dostarczania potencjalnie terapeutycznego promieniowania do złośliwych komórek w których zachodzi ekspresja receptora wybranego z białka wiążącego folan, receptora estrogenu i receptora testosteronu. Złośliwymi komórkami są szczególnie komórki pochodzące ze złośliwej tkanki wybranej z raka mózgu, raka płuc, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka sutka, białaczki, chłoniaka lub czerniaka złośliwego.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zestaw do wytwarzania systemu koniugatora określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje fiolkę zawierającą roztwór liposomu i fiolkę zawierającą radionuklid w roztworze, które mogą być zmieszane dla ułatwienia radioznakowania.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest także zestaw do wytwarzania systemu koniugatora określonego powyżej, charakteryzujący się tym, że obejmuje fiolkę zawierającą roztwór liposomu i drugą fiolkę zawierającą radionuklid w roztworze, oraz trzecią fiolkę zawierającą cząsteczkę, taką jak białko, o powinowactwie do receptora, które mogą być zmieszane dla ułatwienia radioznakowania i znakowania czą steczką mają c ą powinowactwo do receptora.

Reagenty i wyposażenie

Spektroskopię gamma przeprowadzano stosując detektor germanowy (Canberra, Meriden, CT, USA) sprzężony z analizatorem wielokanałowym (EG&G ORTEC, Oak Ridge, TN, USA). Do pomiarów metodą scyntygrafii cieczowej stosowano urządzenie Beckmann LS 6500 (Beckmann, Fullerton, CA, USA). DSPC i cholesterol nabyto w firmie Northern Lipids (Vancouver, Canada). Do oczyszczania radioznakowanych liposomów stosowano kolumny Sephadex G-25 PD-10 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Szwecja). Jako wewnątrzliposomowy chelator stosowano makrocykliczny chelator DOTA, zakupiony w firmie Macrocyclics (Richardson, TX, USA). W badaniach stosowano HNO3 gatunku Ultrex (J. T. Baker, Phillipsburg, USA), 6M HCl (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) i kwas bis(2-etyloheksylo)fosforowy (HDEHP) z firmy Fluka (poprzez Sigma-Aldrich AS, Norwegia).

pH wszystkich buforów stosowanych do obciążania liposomów kationami za pośrednictwem jonoforów ustawiano do żądanej wartości za pomocą argininy (wolna zasada). Cała stosowana woda

PL 201 398 B1 pochodziła z systemu oczyszczania wody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA). Żywice jonowymienne dostarczyła firma BioRad (Hercules, CA, USA).

Żywice prekondycjonowano przez przemywanie wodą, następnie 6 M HCl, po czym acetonem i na końcu wodą. Przed napełnieniem kolumn żywice przechowywano w wodzie.

Stosowany DMSO przechowywano z sitami 4A.

²³²Th (NO3)2 stosowany w tej pracy był przechowywany przez ponad 20 lat. Próbkę dostarczono z Nuclear Chemistry Group, Department of Chemistry University of Oslo, Oslo, Norwegia.

Kwas ³H-foliowy nabyto w firmie Amersham Pharmacia Biotech (Buckinghamshire, UK). Wszystkie pozostałe chemikalia nabyto w firmie Aldrich-Sigma, Norwegia.

W tabeli 1 przedstawiono właściwości fizyczne radionuklidów stosowanych w eksperymentach z liposomami.

T a b e l a 1

Nuklid	t%	promienie gamma	% prawdopodobieństwa*
²²⁸Ac	6,13 h	911,2 (26,6)	26,6
²²³Ra	11,43 d	269,4 (13,7) 271,2(0,108) (²¹⁹Rn)2	13.7 10.8
²¹²Pb	10,6 h	238,6 (43,6)	43,6
²⁰⁸Tl	3,05 m	583,1 (32,5)	35,2
²⁰⁷Bi	31,55 l	569,7 (97,7)	97,7
²⁰⁵Bi	15,31 d	703,4 (31,1)	31,1

* Dla każ dego z radionuklidów podano tylko dane dla najbardziej rozpowszechnionego promieniowania gamma.

Dane z Nuclear Data Sheets, Academic Press INC.

Najlepsze wykonanie wynalazku

Liposomy sporządzone według opisanych procedur obciążono radem-223 lub ołowiem-212. Następnie liposomy poddano reakcji z przeciwciałami w celu uzyskania liposomów z cząsteczkami przeciwciał na powierzchni. Do dostarczania układowego odpowiednie będą liposomy o wielkości około 100 μm, ale typowe wielkości 200-1000 μm mogą być stosowane do dostarczania do jam ciała, np. do wewnątrzczaszkowego leczenia guza mózgu lub do dootrzewnowego leczenia raka jajnika. (Większy wymiar liposomów może spowolnić klirens z jamy ciała, do której wstrzyknięto preparat, przez co utrzymywane jest wysokie stężenie w regionie guza).

PRZYKŁADY

212 212

P r z y k ł a d 1: Inkorporowanie ²¹²Pb/²¹²Bi o liposomów

Metody:

212 212 220 228 ²¹²Pb/²¹²Bi wytworzono przez emanację ²²⁰Rn ze źródła ²²⁸Th w sposób opisany przez Hassfjell

212 212 and Hoff (1994). ²¹²Pb/²¹²Bi bez dodanego nośnika wypłukiwano z pojemnika zbiorczego stosując 0,1 M

HNO3 i roztwór wprowadzano na kolumnę 2 x 20 mm z żywicą kationowymienną AG 50W-X4. Na212 212 212 212 stępnie eluowano ²¹²Pb/²¹²Bi w 2M HCl i roztwór odparowano do sucha. Następnie ²¹²Pb/²¹²Bi roz212 puszczono w 200 μl 10 mM roztworu octanu o pH 5. Pb oznaczono ilościowo mierząc jego promie212 niowanie gamma 238,6 keV (Tabela 1). ²¹²Bi oznaczono ilościowo mierząc promieniowanie gamma jego nuklidu pochodnego ²⁰⁸Tl przy 583,1 keV w równowadze radioaktywnej.

Wyniki: stwierdzono, że przy czasach inkubacji do 3 dni z liposomami związane było poniżej 0,2% dodanej aktywności.

Liposomy odpowiadające stężeniu lipidów 30-60 mM energicznie wymieszano z filmem jonoforu

212 212

A23187 (10-13 nM). Następnie dodano około 1 MBq ²¹²Pb/²¹²Bi i mieszaninę inkubowano w temperaturze 75°C przez 30 minut, po czym eluowano na kolumnie PD-10. Następnie na drugiej kolumnie PD-10

212 212 eluowano frakcję zawierającą ponad 95% obciążonych pęcherzyków. Okres utajenia ²¹²Pb/²¹²Bi związanego z liposomami badano przez inkubowanie pęcherzyków w temperaturze 37°C w ludzkim osoczu lub PBS. Dystrybucję aktywności śledzono przez 24 godziny.

212

Wyniki: skuteczność obciążenia ²¹²Pb: 34,8% (n=3)

Mierząc retencję za pomocą spektroskopii gamma stwierdzono, że dla czasów inkubacji do 24 h

212 z liposomami związane było ponad 99% ²¹²Pb.

PL 201 398 B1

212 212

P r z y k ł a d 2: Retencja ²¹²Bi wytworzonego w wyniku rozpadu ²¹²Pb związanego z liposomami

Metody: Liposomy obciążono ²¹²Pb w sposób opisany powyżej. Radioaktywność związaną z liposomami wyizolowano eluując mieszaninę reakcyjną 10 mM EDTA w PBS na kolumnie PD-10 równowagowanej 10 mM EDTA w PBS.

Po 3 godzinach w celu upewnienia się czy ustaliła się przejściowa równowaga między ²¹²Pb a ²¹²Bi próbki roztworu nanoszono na kolumny PD-10 równowagowane 10 mM EDTA w PBS w celu separacji wolnych radionuklidów od radionuklidów związanych z liposomami. Śledzono dystrybucję aktywności przez 24 godziny.

Odrębną próbkę znakowanych liposomów które nie przechodziły procedury separacji (o geometrii identycznej jak liposomy otrzymane z procedur chromatograficznych) poddano pomiarom jako wzo212 212 rzec. Przeprowadzono to w celu określenia stosunku aktywności ²¹²Pb/²¹²Bi w stanie równowagi radioaktywnej.

212 212

Wyniki: Porównując stosunek ²¹²Pb/²¹²Bi otrzymany dla liposomów rozdzielonych chromatograficznie ze stosunkiem dla mieszaniny równowagowej oszacowano, że po rozpadzie ²¹²Pb związanego z liposomami w liposomach zatrzymane jest ponad 95% ²¹²Bi.

Ponadto, porównano wyniki pomiarów aktywności ²¹²Bi w dwóch frakcjach otrzymanych chromatograficznie. Ponad 99% łącznej aktywności ²¹²Bi eluowało we frakcjach odpowiadających liposomom.

P r z y k ł a d 3: Badanie możliwości ponownej inkorporacji Pb i Bi do liposomów

Metody: Liposomy odpowiadające 30-60 mM lipidu, z zamkniętym 150 mM kwasem cytrynowym 30 mM DOTA, zewnętrzny roztwór zawierający 10 mM EDTA w PBS dodano do filmu jonoforu A23187 (20-26 nmoli na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki). Następnie dodano ²¹²Pb i ²¹²Bi w PBS i inkubowano w temperaturze 37°C. Próbki roztworu eluowano przez kolumny PD-10, a otrzymane chromatograficznie frakcje odpowiadające eluatowi liposomów analizowano za pomocą wewnętrznego detektora Ge.

212 212

Wyniki: Przez okres 24 h nie zaobserwowano wykrywalnego obciążenia (<1%) ²¹²Pb i ²¹²Bi

P r z y k ł a d 4: Obciążanie liposomów ²²³Ra.

²²³Ra wytworzono z generatora na bazie ²²⁷Ac w sposób opisany (Larsen and Henriksen, 1999). W skrócie procedura polegała na tym, że ²²⁷Ac i jego nuklid macierzysty utrzymywano na kolumnie z żywicą do ekstrakcji chromatograficznej ułatwiającą elucję ²²³Ra za pomocą kwasu mineralnego. W celu inkorporowania radu do liposomów roztwór eluowany z generatora odparowano do sucha i następnie ²²³Ra rozpuszczono w 5 mM cytrynianie, pH 7,4.

Liposomy odpowiadające stężeniu lipidów 30-60 mM energicznie mieszano z filmem jonoforu A23187 (10-13 nmoli na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki). Następnie dodano około 50 kBq ²²³Ra i mieszaninę inkubowano w temperaturze 75°C przez 20 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 100 μ10 mM EDTA i eluowano na kolumnie PD-10 w celu wyizolowania radioaktywności związanej z pęcherzykami lipidowymi.

Retencję ²²³Ra związanego z liposomami badano inkubując pęcherzyki w temperaturze 37°C w ludzkim osoczu (Sigma) lub 5 nM EDTA w ludzkim osoczu przy stężeniu liposomów 0,3 mg lipidów łącznie/ml osocza. Wyniki podano w tabeli 2. Pokazują one, że ²²³Ra jest bardzo stabilnie utrzymywany w liposomach.

T a b e l a 2

Czas inkubacji (dni)	% całkowitego ²²³Ra we frakcji liposomów
1	94,6±1
2	94±2,5
3	94,7±0,5
Średnia ± s .d., n=4

P r z y k ł a d 5: Określenie udziału ponownej inkorporacji w eksperymencie retencji ²²³Ra.

Metody: Liposomy odpowiadające 30-60 mM lipidu, utworzone przez uwodnienie filmów lipidowych za pomocą 150 mM kwasu cytrynowego, 30 mM DOTA oraz zewnętrzny roztwór PBS lub osocza dodano do filmu jonoforu A23187 (10-13 nmoli na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki). Następnie dodano ²²³Ra w 5 mM cytrynianie, pH 7,4, i inkubowano w temperaturze 37°C. Próbki roztworu

PL 201 398 B1 wprowadzano na kolumny PD-10 i otrzymane chromatograficznie frakcje odpowiadające liposomom analizowano za pomocą wewnętrznego detektora Ge.

P r z y k ł a d 6: Inkorporowanie ²⁰⁷Bi do liposomów

Metody: ^203-207Bi wytworzono przez reakcje (p.xn) na naturalnych tarczach ołowiowych i oczyszczono stosując ekstrakcyjne żywice chromatograficzne selektywne dla ołowiu (Henriksen and Hoff, 1998).

OOP 007

W badaniu tym stosowano mieszaninę izotopów Bi, składających się głównie z ²⁰⁵Bi i ²⁰⁷Bi, określaną dalej jako ²⁰⁷Bi. Do liposomów odpowiadających 30-60 mM lipidu, które wcześniej zmieszano z filmem jonoforu A23187 (10-13 nmoli na wewnętrznej powierzchni szklanej fiolki) dodano 50 μl roztworu ²⁰⁷Bi w 10^-4M HCl i inkubowano przez 30 minut w temperaturze 75°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 100 μl 10 mM EDTA i eluowano na kolumnie PD-10 w celu wyodrębnienia radioaktywności związanej z pęcherzykami lipidowymi.

Wyniki: Stwierdzono, że z liposomami związane jest 32% całkowitej ilości ²⁰⁷Bi.

P r z y k ł a d 7: Inkorporowanie ²²⁸Ac do liposomów

Metody: ²²⁸Ac wyizolowano w preparatu ²³²Th(NO3)2 za pomocą połączenia ekstrakcji rozpuszczalnikiem i wymiany jonowej. ²³²Th(NO3)2 (pierwotnie 4H2O) rozpuszczono w 20 ml 0,1M HNO3 i dodano do 500 ml rozdzielacza i kontaktowano z 5x100 ml 2M roztworu HDEHP w heptanie. Następnie fazę wodną przemyto trzy razy heptanem i wprowadzono na kolumnę 3x40 mm z żywicą kationowymienną AG50W-X12, gdzie przeprowadzono wyizolowanie ²²⁸Ac w sposób opisany (Cabell, 1959). ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra i ²²⁸Ra eluowano z kolumny w 3M HNO3 i pozostawiono roztwór na >20 h. Następnie roztwór odparowano do sucha, po czym wypłukano radionuklidy ze zbiornika za pomocą 1 ml 1M HNO3. Roztwór ten naniesiono na kolumnę 3x40 mm AG50W-X12. Ponownie, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²²⁴Ra i ²²⁸Ra eluowano z kolumny w 3M HNO3. ²²⁸Ac eluowano w 6M HNO3 i eluat odparowano do sucha. Następnie ²²⁸Ac wypłukano ze zbiornika za pomocą 200 μl 15 mM HNO3. Do opisanych powyżej liposomów zawierających jonofor A23187 dodano około 6 kBq ²²⁸Ac i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 75°C. Następnie mieszaninę reakcyjną dodano do 100 μl 10 mM EDTA i eluowano na kolumnie PD-10 w celu wyizolowania radioaktywności związanej z pęcherzykami liposomowymi. Frakcje odpowiadające ponad 95% obciążonych pęcherzyków zebrano i następnie eluowano na drugiej kolumnie PD-10. Retencję ²²⁸Ac w liposomach badano przez inkubowanie radioznakowanych pęcherzyków w temperaturze 37 °C w osoczu ludzkim lub PBS. Śledzono dystrybucję aktywności przez 24 godziny.

Wyniki: W eksperymencie inkorporowania po procedurze obciążania z liposomami związane było 90-95% dodanego ²²⁸Ac (skorygowane z uwzględnieniem rozpadu podczas znakowania i oczyszczania). W eksperymencie retencji stwierdzono, że dla czasów inkubacji do 24 h ponad 98% ²²⁸Ac jest związane z liposomami.

P r z y k ł a d 8: Inkorporowanie ⁹⁰Y

Metody: W przykładzie tym dla badania zachowania radioznakowanych liposomów jako znacznik stosowano ⁹⁰Y. Dla oznaczania ⁹⁰Y i ⁹⁰Sr stosowano metodę scyntylacji cieczowej.

⁹⁰Y oddzielono od ⁹⁰Sr za pomocą żywicy chromatograficznej do selektywnej ekstrakcji strontu w sposób opisany przez Dietz i Horwitz (1992). ⁹⁰Sr (Amersham, Buckinghamshire, Anglia) w 0,1 M HNO3 odparowano do sucha i do pozostałości dodano 3M HNO3. Roztwór wprowadzono na kolumnę 3x20 mm z żywicą Sr (EiChromM. darien, IL, USA) i kolumnę przemyto 5 ml 3M HNO3.

Za pomocą tej procedury selektywnie eluuje się ⁹⁰Y, natomiast Sr jest zatrzymywany na kolumnie w stopniu dostatecznym dla obniżenia zawartości ⁹⁰Sr w mieszaninie ⁹⁰Sr/⁹⁰Y o współczynnik około 10³ (Dietz and Horwitz, 1992). Po tym ⁹⁰Sr spędzono z kolumny stosując 0,05M HNO3 i roztwór ten pozostawiono na jeden tydzień w celu narastania ⁹⁰Y. Następnie roztwór odparowano do sucha i do pozostałości dodano 3M HNO3, po czym oddzielono radionuklidy na drugiej kolumnie Sr-żywica. Eluat zawierający ⁹⁰Y odparowano do sucha i wypłukano radionuklidy ze zbiornika, stosując 200 μl 5 mM HNO3. Roztwór ten dodano do liposomów zawierających jonofor A23187 (opisany poprzednio) i inkubowano przez 60 minut w temperaturze 75°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 50 μl 10 mM EDTA i eluowano na kolumnie PD-10 w celu wyizolowania radioaktywności związanej z pęcherzykami lipidowymi. Następnie na drugiej kolumnie PD-10 eluowano frakcję odpowiadającą ponad 95% pęcherzyków. Retencję w liposomach ⁹⁰Y związanego z liposomami badano inkubując pęcherzyki w temperaturze 37°C w osoczu ludzkim lub PBS. Śledzono dystrybucję aktywności przez 4 dni.

Wyniki: Po 1 godzinie obciążania i oczyszczania na żelowej kolumnie wykluczania ponad 95% dodanego ⁹⁰Y było związane z liposomami.

W badaniu retencji w liposomach otrzymano następujące wyniki: po 5 h i 1 dniu ponad 99% było związane z liposomami. Po 4 dniach frakcja związana z liposomami była równa 98±1%.

PL 201 398 B1

Jak pokazano w tych eksperymentach, liposomy mogą być radioznakowane radionuklidami emitującymi cząstki alfa i/lub cząstki beta i mogą dobrze utrzymywać te nuklidy w temperaturze fizjologicznej.

P r z y k ł a d 9: Wytwarzanie koniugatu PEGylowany liposom-folan-Fab' znakowanego

Itrem-90/Radem-223

W eksperymencie tym zastosowano F(ab')₂R0 szpiczaka (podklasa IgG₁) w stężeniu 14 mg/ml w PBS (Michalsen, Norwegian Institute of Public Health, Norwegia).

Koniugowanie kwasu foliowego do przeciwciał

Kwas foliowy2H₂O rozpuszczono najpierw w dimetylosulfotlenku (Fluka, zawartość H₂O poniżej 0,05%). Roztwór przeniesiono następnie za pomocą kaniuli na aktywowane sita molekularne 4A (Fluka) i przechowywano w atmosferze argonu w ciemności przez 6-10 godzin. Dodano folan znakowany trytem (³H-folan) jako wodny roztwór soli potasowej ³H-folanu (1% w stosunku do kwasu cytrynowego). Aktywność właściwa ³H-folanu stosowanego do koniugowania z białkiem wynosiła 7-7,5 GBq/mol.

³H-folan aktywowano do sprzęgania z przeciwciałem F(ab')2 szpiczaka przez dodanie do roztworu folanu 10 równoważników molowych 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu i inkubowanie przez 30 minut w temperaturze otoczenia. Następnie do białka dodano 30-40-krotny nadmiar molowy aktywowanego folanu, 14 mg/ml w PBS, i pozostawiono do przereagowania na 30-60 minut. Reakcję przerywano przez dodanie 0,2 ml 0,3M glicyny w PBS/boran, pH 8,5. Koniugat folanu z F(ab')2 (folanF(ab')2) oddzielono od materiału nieprzereagowanego stosując kolumnę PD-10 uprzednio równowagowaną w PBS. Dla otrzymania koniugatu folan-Fab', koniugat folan-F(ab')2 inkubowano w 1 mM ditiotreitolu (DTT) w temperaturze pokojowej przez 2 h, po czym eluowano na kolumnie wykluczania zależnego od wielkości cząstek NAP-5. Frakcję zawierającą koniugat folan-Fab' odtleniono przez przepuszczanie przez roztwór gazowego argonu, po czym roztwór natychmiast zmieszano z roztworem liposomów.

Stopień skoniugowania z kwasem foliowym oznaczono mierząc zawartość ³H w oczyszczonym białku metodą scyntylacji cieczowej (Beckmann LS6500) w połączeniu z odczytem spektrofotometrycznym przy 280 nm.

W celu ilościowego oznaczenia związanej z liposomami frakcji koniugatu folan-Fab' przed reakcją z DTT dodano śladową ilość jodowanego Fab' (białko jodowano poprzez lodoGen, stosując standardowe procedury).

Koniugowanie znakowanych przeciwciał z liposomami

DSPE-PEG2000-MPB (Northern Lipids, VA, Kanada), sól sodową, włączono w ilości 5% molowych całego fosfolipidu. Liposomy miały inny skład i wytworzono je również do etapu obciążania kationem za pośrednictwem jonoforu identycznie jak opisano dla liposomów niePEGylowanych.

Po dojściu mieszaniny reakcyjnej po etapie obciążania do temperatury pokojowej zawiesinę liposomów odtleniono przed dodaniem do niej koniugatu folan-Fab' do stężenia białka 0,3-0,5 mg/ml. Stężenie lipidów oznaczone za pomocą testu fosforowego Bartletta (Bartlett, 1958) wynosiło 1-3 mM. Reakcję folanu-Fab' i liposomów prowadzono przez 2 h w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną naniesiono na kolumnę PD-10 równowagowaną w PBS. PEG-liposomy skoniugowane z folanem-Fab' przed zastosowaniem w testach wiązania folan-receptor przechowywano w temperaturze 4°C przez 12-15 h.

Radioaktywność związaną z liposomami oznaczano detektorem typu jamy Nal korygując o spillover w odpowiednich kanałach od podwójnie znakowanych próbek. Jako odnośniki użyto próbki pojedynczego nuklidu i mieszanin nuklidów.

Na podstawie pomiarów radioaktywności stężenie białek przekształcono w liczbę Fab' na liposom, zakładając wielkość liposomu 100 nm i 8·10⁴ fosfolipidów/pęcherzyki (Kirpotin i in., 1997) oraz ciężar cząsteczkowy przeciwciała szpiczaka Fab' równy 52000.

Radioaktywność związaną z komórkami zmierzono za pomocą detektora Nal (3 wyższe stężenia dla Y-90) i metodą scyntylacji cieczowej po dodaniu Insta-Gel plus (Packard) (Tabela 3).

T a b e l a 3

Wiązanie ⁹⁰Y-liposomów skoniugowanych z przeciwciałami z folanem lub bez folanu, do komórek OVCAR.

Dodatek liposomu/komórkę	% komórek związanych z liposomami folano-negatywnymi	% komórek związanych z liposomami folano-pozytywnymi
1	2	3
1·10⁵	< 0,5	10±3
1·10⁴	1±0,5	9±3

PL 201 398 B1 cd. tabeli 3

1	2	3
1·10³	4±2	11±2
1·10²	5±1	16±2
10	8±3	46±8

₃

Detekcja ³H-folanu na liposomach

PEG-liposomy (stężenie lipidów 2,5 mM) w 20 mM HEPES/300 mM sacharozy przereagowano z Fab' skoniugowanym z ³H-folanem (0,5 mg/ml w PBS, stosunek folan/Fab' 2±0,2). Po 2 h w temperaturze pokojowej liposomy skoniugowane z folanem-Fab' wyizolowano przez elucję na sefarozie CL-4B. Ilość ³H-folanu-Fab' na liposomach oznaczono ilościowo metodą scyntylacji cieczowej frakcji otrzymanych chromatograficznie, a stosunek folan-Fab'/liposomy określono na około 110.

Skróty:

DOTA: distearolilofosfatydylocholina

DOTA: kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N' ,N,N'-tetraoctowy

DSPE-PEG2000-MPB: N-(4-p-maleimidofenylo)butyrylo)-1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina (Northern Lipids, VA, Kanada)

HEPES: kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy

PBS: solanka buforowana fosforanem

EDTA: kwas etylenodiamino-N,N'-tetraoctowy

HDEHP: kwas bis(2-etyloheksylo)fosforowy

PEG: glikol polietylenowy

DTT: ditiotreitol

Odnośniki literaturowe

Bartlett GR. Phosphorus assay in column Chromatography. J. Biol. Chem. 234 (3), 466-468(1958).

Cabell MJ. The purification, determination and neutron capture cross section of actinium-227. Can. J. Chem. 37. 1094-1 101, (1959).

DeVita Jr VT. Hellman S. Rosenberg SA. Cancer. Principles & practice of oncology. 5th edition Lippincot-Raven, Philadelphia. New York, USA (1997).

Dietz ML and Horwitz EP. Improved chemistry for the production of Y-90 for medical applications. Appl. Radiat. Isot. 43, 1093-1101 (1992).

Forssen EA. The design and development of DaunoXome® for solid tumor targeting in vivo. Adv. Drug Delivery Rev. 24. 133-150 (1997).

Gabizon R, Horowitz AT. Goren D. Tzemach D, Mandelbaum-Shavit F, Quasen MM, and Zalipsky S. Targeting Folate receptor with folate linked to extremities of poly(ethylene glycol)-grafted liposomes: In vitro studies. Bioconjugate Chem. 10, 289-298 (1999).

Gabison A. Liposome circulation time and tumor targeting: Implication for cancer chemotherapy. Adv. Drug Delivery Rev. 16, 285-294 (1995).

Gaze MN. The current status of targeted radiotherapy in clinical practice. Phys. Med. Bol. 41,

1895-1903 (1996).

Goins B. Phillips WT. and Klipper R. Repeat injection studies of technetium-99m labeled PEG-liposomes in the same animal. J. Liposome Res. 8(2), 265-281 (1998).

Hall E. Radiobiology for the radiologist. Fourth Edn. JB Lippincott Company, Philadelphia, USA (1994).

Hassfjell SP and Hoff P. A generator for production of Pb-212 and Bi-212. Appl. Radiat. Isot. 45, 1021-1025 (1994).

Henriksen G and Hoff P. Isolation of cyclotron produced Bi-205, Bi-206 and Pb-203 using a lead-selective extraction chromatographic resin. Appl. Radiat. Isot. 49, 357-359 (1998).

Hwang KJ and Mauk MR. Fate of lipid vesicles in vivo: A gamma-ray perturbed angular correlation study. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 74, 4991-4995 (1977).

Kirpotin D, Park JW. Hong K. Zalipsky S. Wen-Lu L, Carter P, Benz CC and Papahadjopoulos

D. Sterically stabilised Anti-HER2 Immunoliposomes: Design and targeting to human breast cancer cells in Vitro. Biochemistry 36, 66-75, (1997).

Kostarelos K. Emfietzoglou D and Stamatelou M. Liposome-mediated deliverv of radionuclides to tumor models for cancer radiotherapy: A quantitative analysis.J. Liposome Res. 9 (3). 407-424 (1999).

PL 201 398 B1

Kranz. DM. Roy, EJ and Patrick, TA. Conjugates of folate anti-effector celi antibodies. United

States Patent number: 5 547 668 (20. Aug. 1996).

Larsen RH; Akabani G. Welsh P and Zalutsky MR. The cytotoxicity and microdosimetry of astatine-211-labeled chimeric monoclonal antibodies in human glioma and melanoma cells in vitro. Radiat.

Res. 149, 155-162 (1998).

Larsen RH. Henriksen G. Norwegian Patent application No P990001 (1999).

Lee RJ and Low PS. Delivery of liposomes into cultured KB cells via folate receptor-mediated endocytosis. J. Biol. Chem. 269, 3198-3204 (1994).

MacDonald RC, MacDonald RI, Menco BPhM., Takeshita K. Subbarao NK and Hu Lan-rong. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Bioch. Biophys. Acta 1061, 297-303 (1991).

Maruyama K, Takizawa T, Takahashi N, Tagawa T. Nagaike K and Iwatsuru M.

Targeting efficiency of PEG-immunoliposome-conjugated antibodies at PEG terminals. Adv. Drug Delivery Rev. 24, 235-242 (1997).

Mauk MR and Gamble RC. Preparation of lipid vesicles containing high level of entrapped radioactive cations. Anal. Biochem. 94, 302-307 (1979).

McClure JJ and Feinendegen, LE. Alpha-emitters for medical therapy: Second Bi-annual Workshop, Toronto, Canada. June 4-5. (1998). Report from Department of Energy. Germantown, MD, USA

Mirzadeh S, Kumar K. Ganzow. OA. The chemical fate of 212Bi-DOTA formed by b-decay of 212Pb(DOTA)2-. Radiochimica Acta, 60, 1-10 (1993).

Ogihara-Umeda I, Sasaki T. Kojima S. Nishigori H. Optimal radiolabeled liposomes for tumor imaging. J. Nucl. Med. 37 (2), 326-332 (1996).

Olson F. Hunt CA, Szoka F, Vail WJ and Papahadjopoulos D. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through polycarbonate membranes. Bioch. Biophys. Acta 557. 9-23 (1979).

Pikul II SS. Parks NJ. Schneider PD. In vitro killing of melanoma by liposome delivered intracellular irradiation. Arch. Surg. 122, 1417-1420 (1987).

Reddy. JA and Low. PS. Folate-mediated targeting of therapeutic and imaging acents to cancers. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 15 (6): 587-627(1998).

Ritter MA, Cleaver JE. and Tobias CA. High-LET radiations induce a large proportion of non-rejoining DNA-breaks. Nature 266. 653-655 (1977).

Shinoda, T, Takagi. A, Maeda, A. Kagatani, S, Konno, Y and Hashida, M. In vivo fate of folateBSA in non-tumour- and tumour-bearing mice. J Pharm Sci 87 (12): 1521-1526, 1998.

Tilcock CP. Ahkong QF and Parr M. An improved method for the preparation of liposomal gadolinium-DTPA- lonophore-Mediated active entrapment of gadolinium. Inwest. Radiol. 26. 242-247 (1991).

Trippett, TM and Bertino. JR. Therapeutic strategies targeting proteins that regulate folate and reduced folate transport. J Chemotherapy 11: 3-10 (1999).

Turner AF, Presant CA, Proffitt RT, Wiliams LE, Winsor DW and Werner JL. In-111-labeled liposomes: Dosimetry and tumor depiction. Radiology 166 (3), 761-765(1988).

Utkhede D, Yeh V, Szucs M and Tilcock C. Uptake of Yttrium-90 into lipid vesicles. Jour. Lip. Res. 4(2), 1049-1061 (1994).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. System koniugatora radionuklid-liposom, znamienny tym, że obejmuje liposomy z jonoforami i z chelatorem umiejscowionymi wewnątrz liposomów, w których to liposomach zamknięty jest również ciężki radionuklid/radionuklidy, emitujący cząstki α i/lub ²¹²Pb jako generator dla α-emitera ²¹²Bi, przy czym ciężki radionuklid ma ciężar atomowy powyżej 150.
2. System koniugatora według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie chelatora wewnątrz liposomów jest odpowiednie do zatrzymania nuklidów pochodnych.
3. System koniugatora według zastrz. 1, znamienny tym, że chelator jest wybrany z grupy obejmującej:

kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TRITA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TETA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy (DOTMP),

PL 201 398 B1 kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy, kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy, kwas dietylenotriamino-N,N',N-pentaoctowy i ich izomery, kryptat[2.2.2], kryptat [3.2.2], kryptat [2.2.1] i ich mono- i di-benzo pochodne, mostkowane kaliks[4]areny, zawierające grupy bogate w elektrony (donorowe) (hydroksylowe, karboksylowe, estrowe, amidowe, aminowe), kwas 1,10-diaza-4,7,13,16tetraoksacyklooktadekano-1,10-N,N'-bis-octowy, i 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoksacyclooktadekano-1,10-N,N'-bis-malonian.
4. System koniugatora według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, ż e liposomy zawierają w błonie aktywowane grupy umożliwiające koniugowanie do tych aktywowanych grup białek lub innych cząsteczek mających powinowactwo do receptora.
5. System koniugatora według zastrz. 4, znamienny tym, że wzmiankowane grupy aktywowane stanowi glikol polietylenowy.
6. System koniugatora według zastrz. 4, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z biał kami wiążącymi się z receptorem.
7. System koniugatora według zastrz. 6, znamienny tym, że wzmiankowanymi białkami wiążącymi się z receptorem są przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, lub fragmenty lub konstrukty przeciwciał, lub folan.
8. System koniugatora według zastrz. 6, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z przeciwciałami klasy IgM lub IgG, lub fragmentami lub konstruktami przeciwciał z tych klas.
9. System koniugatora według zastrz. 6, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z przeciwciał ami klasy IgM lub IgG, lub fragmentami lub konstruktami przeciwciał z tych klas, przy czym przeciwciała, fragmenty lub konstrukty są znakowane folanem i radionuklidem lub mieszaniną różnych radionuklidów.
10. System koniugatora według zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty skoniugowane z liposomami są gryzoni, chimeryczne lub ludzkie, monoklonalne lub poliklonalne.
11. System koniugatora według zastrz. 10, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty są znakowane folanem, przy czym miejsce wiązania antygenu jest skierowane przeciwko białku wiążącemu folan (FBP).
12. System koniugatora według zastrz. 10, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty są znakowane folanem, przy czym miejsce wiązania antygenu jest skierowane przeciwko antygenowi innemu niż FBP.
13. System koniugatora według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że radionuklidem jest 212 212 211 212 213 212 ciężki emiter α i/lub ²¹²Pb jako generator dla α- emitera ²¹²Bi, wybrany spośród ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra, ²²⁴Ra i ²²⁷Th.
14. System koniugatora według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że nuklidem pochod212 212 nym i nuklidem macierzystym są odpowiednio ²¹²Bi i ²¹²Pb.
15. Sposób wytwarzania radioznakowanego systemu koniugatora, znamienny tym, że liposomy z jonoforami i chelatorem w odpowiednim stężeniu stabilnie radioznakuje się ciężkim emiterem cząstek α, przez zmieszanie roztworu zawierającego radionuklid lub mieszaninę radionuklidów emitu212 212 jących promieniowanie cząstek α i/lub Pb jako generator dla α-emitera Bi, z roztworem zawierającym liposomy i inkubację w temperaturze podwyższonej w porównaniu z temperaturą fizjologiczną, uzyskując transport radionuklidu(ów) do liposomów, przy czym radionuklid ma ciężar atomowy powyżej 150.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że chelator jest wybrany z grupy obejmującej:

kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TRITA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetraoctowy (TETA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy (DOTMP), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy, kwas 1,4,7,10-tetraazacyklotetradekano-1,4,7,10-N,N',N,N'-tetra(metyleno)-fosfonowy, kwas dietylenotriamino-N,N',N-pentaoctowy i ich izomery, kryptat[2.2.2], kryptat [3.2.2], kryptat [2.2.1] i ich mono- i di-benzo pochodne, mostkowane kaliks[4]areny, zawierające grupy bogate w elektrony (donorowe) (hydroksylowe, karboksylowe, estrowe, amidowe, aminowe), kwas 1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoksacyklooktadekano-1,10-N,N'-bis-octowy, i

1,10-diaza-4,7,13,16-tetraoksacyclooktadekano-1,10-N,N'-bis-malonian.

PL 201 398 B1
17. Sposób według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że liposomy zawierają w błonie aktywowane grupy umożliwiające koniugowanie białek lub innych cząsteczek wykazujących powinowactwo do receptora.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że wzmiankowane grupy aktywowane stanowi glikol polietylenowy.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z białkami wiążącymi się z receptorem.
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że wzmiankowanymi białkami wiążącymi się z receptorem są przeciwciała monoklonalne lub poliklonalne, lub fragmenty lub konstrukty przeciwciał, lub folan.
21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z przeciwciałami klasy IgM lub IgG, lub fragmentami lub konstruktami przeciwciał z tych klas.
22. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że liposomy są skoniugowane z przeciwciałami klasy IgM lub IgG, lub fragmentami lub konstruktami przeciwciał z tych klas, przy czym przeciwciała, fragmenty lub konstrukty są znakowane folanem i radionuklidem lub mieszaniną różnych radionuklidów przy użyciu standardowych technik znakowania przeciwciał folanem lub radionuklidem.
23. Sposób według zastrz. 20 albo 21, albo 22, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty skoniugowane z liposomami są mysie/szczurze, chimeryczne lub ludzkie, monoklonalne lub poliklonalne.
24. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty są znakowane folanem, przy czym miejsce wiązania antygenu jest skierowane przeciwko białku wiążącemu folan (FBP).
25. Sposób według zastrz. 23, znamienny tym, że przeciwciała lub fragmenty przeciwciał lub konstrukty są znakowane folanem, przy czym miejsce wiązania antygenu jest skierowane przeciwko antygenowi innemu niż FBP.
26. Sposób według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że radionuklidem jest ciężki emiter α wybrany spośród ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ²¹²Pb, ²²⁵Ac, ²²³Ra, ²²⁴Ra i ²²⁷Th lub ²¹²Pb jako generator dla α-emitera ²¹²Bi.
27. Sposób według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że nuklidem pochodnym i nuklidem macierzystym są odpowiednio ²¹²Bi i ²¹²PB.
28. Zastosowanie systemu koniugatora określonego jak w zastrz. 1 do 14, do wytwarzania roztworu farmaceutycznego, do iniekcji lub infuzji ssakom, w tym ludziom.
29. Zastosowanie według zastrz. 28, do wytwarzania roztworu farmaceutycznego odpowiedniego do iniekcji lub infuzji dożylną i/lub miejscową i/lub doguzową drogą podawania.
30. Zastosowanie według zastrz. 28, do wytwarzania roztworu do stosowania w połączeniu z radioimmunokoniugatem lub kilkoma radioimmunokoniugatami i/lub innymi formami terapii radiofarmaceutycznej, chemioterapii, zewnętrznej terapii wiązką promieniowania lub terapii chirurgicznej do leczenia nowotworów złośliwych.
31. Zastosowanie systemu koniugatora określonego jak w zastrz. 1 do 14, do wytwarzania leku do wstrzykiwania ludziom w celu dostarczania potencjalnego terapeutycznego promieniowania do złośliwych komórek.
32. Zastosowanie według zastrz. 31, w którym złośliwe komórki pochodzą z tkanki wybranej z tkanek raka mózgu, raka płuc, raka szyjki macicy, raka jajnika, raka sutka, białaczki, chłoniaka lub czerniaka złośliwego.
33. Zestaw do wytwarzania systemu koniugatora określonego jak w zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że obejmuje fiolkę zawierającą roztwór liposomu i fiolkę zawierającą radionuklid w roztworze, które mogą być zmieszane dla ułatwienia radioznakowania.
34. Zestaw do wytwarzania systemu koniugatora określonego jak w zastrz. 1 do 14, znamienny tym, że obejmuje fiolkę zawierającą roztwór liposomu i drugą fiolkę zawierającą radionuklid w roztworze, oraz trzecią fiolkę zawierającą cząsteczkę o powinowactwie do receptora, które mogą być zmieszane dla ułatwienia radioznakowania i znakowania cząsteczką mającą powinowactwo do receptora.