UA73160C2 - Кон'югаційна система, що являє собою радіоактивні терапевтичні ліпосоми, спосіб їх одержання та застосування - Google Patents

Abstract

Винахід відноситься до кон'югаційної системи, яка містить ліпосоми з іонофорами та з розчином хелатора та радіоізотопом(-ами), що випромінює альфа-частинки, розташованими усередині ліпосоми. Крім того, описано спосіб одержання цього типу радіоактивних ліпосом, а також застосування цієї системи та набір для одержання цієї системи.

Description

Опис винаходу

Цей винахід стосується кон'югаційної системи, яка містить ліпосоми з іонофорами та хелатором, розташованим усередині ліпосом, де ліпосоми надійно споряджені важкими радіоізотопами, які випромінюють о-частинки. Цей винахід далі стосується способу одержання кон'югаційної системи та застосування цієї системи, а також набору для одержання кон'югаційної системи.

Біологічні та медичні застосування радіоіїзотопів у протираковій терапії до цих пір зосереджувалися на 70 застосуванні катіонних або аніонних зразків, наприклад, | "Пйодиду проти раку щитовидної залози та З985г для тимчасового полегшення болю від метастазів раку кісток, та на застосуванні здебільшого бета-випромінювальних радіоізотопів, приєднаних до моноклональних антитіл (Ое Міда та інші, 1996).

Застосування цілеспрямованої радіоізотопної терапії проти раку спирається на можливість знайти способи прикріплення радіоізотопів сполук-носіїв специфічних до пухлин (СбСаге, 1996). Сьогодні деякі з радіоізотопів з /5 Корисними радіаційними характеристиками не можна застосовувати для спрямовування у пухлину, тому що існує проблема забезпечення хімічно стійким зв'язком між радіоїзотопом та сполукою-носієм. Нові системи носіїв можуть, однак, поширити як застосування радіоізотопів, так і арсенал радіоізотопів, які вважають корисними для терапії (Саге, 1996).

Ліпосоми з або без рецепторних афінних груп, прикріплених до поверхні, проаналізували на їхню спроможність доставляти ліки, і вони зараз застосовуються клінічно для доставки хіміотерапевтичних препаратів при деяких формах раку. Розробки у галузі ліпосомних досліджень нещодавно привели до нових версій стосовно фармакокінетики, які можуть зробити ці сполуки корисними в якості носіїв радіоіїзотопу для внутрішньої протиракової радіотерапії (Сабрігоп, 1995). Внаслідок цих нещодавніх розробок стосовно складів та виготовлення ліпосом отримали дрібні пухирці розміром менш ніж ТО00нНМ з подовженим часом циркуляції, тому що розмір сч ліпосом можна найкращім чином обмежити малими діаметрами шляхом застосування екструзії крізь мембрани.

Крім того, введення щеплених поліетиленгліколем (ПЕГ) ліпосом знизило втручання білків плазми та, таким (о) чином, знизило розпізнавання та кліренс, що спричиняється макрофагами ретикулоендотеліальної системи (Магоуата, та інші, 1997). Досягли підвищених рівнів поглинання пухлиною завдяки постійній концентрації у крові. Досягли навіть подальшого поглинання пухлиною шляхом спряження молекул з рецепторним афінітетом, о наприклад, моноклональних антитіл або фолату з поверхнею ліпосом. Крім того, декілька дослідів вказують на перевагу застосування ПЕГ як лінкера між ліпосомою та лігандом, на який вона спрямовується, тому що це |се) також може поліпшити досягання рецептора (наприклад, Магиоуата та інші, 1997, Сабрізоп та інші, 1999, І ее та «- інші, 1994).

Ліпосоми раніше вже досліджували в якості носіїв радіоіїзотопів. (Соіпз та інші, 1998, Тигпег та інші, (зе) 1988). РікШ! та інші (1987) повідомляли про дослідження на основі 2 "Рр-декстрану, що вводився пасивно ї- (тобто, 212рРр.-декстран додавали під час утворення ліпосоми, та фракція 2"2Рр-декстран входила до складу разом з водною фазою, утворюючи внутрішню частину ліпосоми). Автори не передбачали, що ці ліпосоми були придатними для лікування раку, та їх застосовували насамперед для дослідження внутрішньоклітинного лізису « клітин іп мійго радіоїзотопом. Не було представлено жодних даних про долю 22Ві, утворюваного при розпаді 22РЬ, а розмір ліпосом становив приблизно 350-500НМ, що є дуже великим порівняно з розміром З с (приблизно 100НМ), який зараз вважають оптимальним при пухлинній терапії іп мімо (РГогезеп, 1997). Також, "» ліпосоми не містили ПЕГ у мембрані. " Одіпаг-Отеда та інші (1996) застосовували ліпосоми в якості носіїв гама-випромінювальних радіонуклідів "за, 7 |п та 97Тс та запропонували застосовувати споряджені радіоізотопами ліпосоми для одержання зображень.

Ше У теоретичному дослідженні Козіагеоз та інші (1999) запропонували застосовувати ліпосоми, споряджені 2) потенційно терапевтичними радіонуклідами "ЗІ, б/у, 188Юе та 211Дї, проте вони не запропонували хімічних з способів одержання споряджених радіоізотопами ліпосом.

ЕРЗ86 146 В1 описує композицію та спосіб застосування інкапсульованих у ліпосоми сполук для терапії (Ге) 50 пухлин шляхом захоплення нейтронів. Проте, ці ліпосоми були навантажені стійкими елементами (наприклад, о бором), які робилися радіоактивними тільки після активації, та ліпосоми не містили ні іонофорів, ні хелатора.

ШКпеде та інші (1994) описують ліпосоми, що містять Оу та хелатор-діетилентриамінпентаоцтову кислоту (ОТРА), яка відрізняється від хелаторів, описаних у цьому винаході. Крім того, утримання материнського/дочірнього радіоізотопу(-ів) не описано, та, крім того, 90 не є важким елементом, на відміну від елементів, описаних у цьому винаході. (Ф; Для того, щоб досягти достатньо надійного спорядження носіїв важкими альфа-випромінювальними ко радіоізотопами, звичайно необхідно здійснити специфічні хімічні процедури, пристосовані так, щоб відповідати хімії кожного елемента, та такі способи невідомі. Не можна чекати, що процедури, які застосовуються для бо спорядження радіоізотопами, наприклад, са, Іп, Тс, Си або Ке будуть придатними для альфа-випромінювальних катіонів важких радіоізотопів (атомна вага перебільшує 150), таких як, наприклад, 2121/2213 Ві 212рр, 223/224р4, 227ТН або 225Ас,

Отже, предметами цього винаходу є кон'югаційна система радіоізотопів-ліпосом з або без споріднених до рецептора груп, яка (1) інкапсулює хелатор та важкий радіоізотоп(-и), який випромінює альфа-частинки, (2) 65 може утримувати дочірній ізотоп(-и), якщо материнський ізотоп(-и) вводиться у ліпосому, та (3) яку можна одержати із застосуванням способу активного введення, придатного для ряду радіоізотопів, а також застосування системи та набір для одержання цієї системи. Ці предмети винаходу забезпечуються цим винаходом та характеризуються формулою винаходу, що додається.

Цей винахід стосується кон'югаційної системи, яка містить ліпосоми з іонофорами, тобто агентами, що екстрагують метал для ліпосом, та з хелатором, та з важким радіоізотопом(-ами) (атомна вага перебільшує 150), розташованими усередині ліпосоми. Ліпосоми одержують, застосовуючи активне введення радіоізотопу, тобто через іонофори, та одержують згідно зі способами виробництва ліпосом з розміром звичайно 100НМ. Кінцевий продукт демонструє гарну хімічну стійкість протягом декількох днів та може також утримувати дочірній ізотоп(-и) усередині ліпосоми, наприклад, при трансформації 22РЬь у 212Ві, Ліпосоми можна виготовити з або без 70 модифікувальних груп, таких як поліалкіленоксиди, наприклад ПЕГ, приєднаних до мембрани. Тут ми також описуємо спосіб зв'язування таких споряджених радіоізотопами ліпосом з білками, що шукають пухлину, такими як, наприклад, кон'юговані з фолатом моноклональні антитіла.

Цей винахід далі буде описано докладніше, з посиланням на фігури та приклади.

Фігура 1. Зв'язування з клітинами ОМСАК З ПЕгГлікованих ліпосом, які містять Гар' або споряджене фолатом 75 антитіло з Рар", кон'юговане з мембраною ліпосоми.

Фігура 2. Зв'язування з клітинами ОМСАК З ліпосом з ПЕГ, спряжених з фолатом, порівняно з неспряженими з фолатом ліпосомами з ПЕГ.

Для одержання споряджених радіоізотопами ліпосом, придатних для лікування раку, автори цього винаходу досліджували виготовлення та застосування ліпосом, які містять важкі радіоізотопи (тобто, їхня атомна вага перебільшує 150), які випромінюють альфа-частинки, на основі радіонуклідів 212Ві, 213Ві, 223ра, 221Ва, 225дс, 212рЬ та 227ТН, Застосовуючи ліпосоми (пухирці) з іонофорами, споряджені радіоізотопами ліпосоми переважно з хелатором (тобто, ліпосоми, що інкапсулюють радіоізотоп та хелатор) одержали шляхом активного введення радіоізотопу та згідно зі способами, що дозволяють одержати ліпосоми звичайного розміру, який становить 100ОНМ. с

Одношарові пухирці одержали шляхом гідратації тонкої ліпідної плівки та екструзії (ОЇІвоп та інші, 1979, о

Мас Ропаїа та інші, 1991) наступним способом: дистеароїлфосфатидилхолін (ОРОС) та холестерин у молярному співвідношенні 2:11, звичайно 10 та бмкмоль, відповідно, розчинили у хлороформі у круглодонній колбі.

Розчинник видалили шляхом роторного випаровування із застосуванням зниженого тиску. Суху ліпідну плівку потім сгідратували у 0,5-їмл 150мМ лимонної кислоти, ЗОмл ООТА (1,4,7,10 тетраазациклододекан | «в) 1,47 1ОоМ,М'М",М'тетраоцтова кислота), рН 4. Одержана в наслідок цього суспензія зазнала п'ять циклів «со заморожування та розморожування з наступною повторюваною екструзією крізь полікарбонатні фільтри з розміром пор 100ОнНМ, яку здійснювали п'ять разів, та крізь фільтри з розміром пор 5ОНМ, яку також здійснювали «-- п'ять разів, при цьому застосовували ручний пристрій для екструзії (Амевіїп, Обама, Сапада). Продукт мав со ліпідну концентрацію приблизно ЗОММ. До початку введення радіоізотопу у ліпосоми зовнішній розчин зазнав обміну шляхом елюювання на колонці РхРО-10 250ММ цукрози, 20ММ НЕРЕ5 і - (М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2-етансульфонова кислота), рН7 4.

Компоненти ліпосом: а) внутрішнє водне середовище: рН 1-14, переважно 2-9, більш переважно 4-5.

Компоненти: вода, агенти, спроможні підтримувати бажаний рН у внутрішньому водному середовищі протягом « бажаного періоду часу, а саме, доки не почнеться опосередковане іонофорами введення радіоактивного металу(-ів). Переважно, компоненти внутрішнього водного середовища зумовлюють функцію т с комплексоутворення радіоактивного металу(-ів). Це може бути наслідком впливу Ї) наприклад, електростатичної ч донорської функцій агентів, які застосовуються для регулювання рН, наприклад, атома(-ів) кисню в ацетатних, » цитратних та споріднених сполуках, ії) та крім того, наслідком наявності комплексоутворюючого агента у внутрішньому водному середовищі, наприклад, ЕОТА (етилендіамінтетраоцтова кислота), ОТРА (діетилентриамінпентаоцтова кислота), ООТА (1,4,7,1О0тетраазациклододекан 1,4,7,10М,М,М",М'"тетраоцтова -і кислота), СОТМР (1,4,7,1Отетраазациклододекан-1,4,7,10 М,М',М",М"-тетра(метилен)фосфонова кислота) та с споріднених сполук. 5) Іонофори: наприклад, агенти, спроможні транспортувати, практично необоротно, радіоактивний метал крізь - ліпідний подвійний шар з позаліпосомної фази усередину ліпосоми. Приклади: іонофори, які продемонстрували, о 50 що функціонують бажаним чином: кальцій-іонофор А 23187, дициклогексил 18-С6, бібензо-18-С6, 2,3-димеркапто-1-пропанол, Рр-іонофори. (зе) с) Компоненти ліпідного подвійного шару: компоненти ліпідного подвійного шару переважно утворюються у суміші, яка є здатною утворювати пухирці та для якої температура переходу із рідини у тверду речовину перебільшує фізіологічну температуру, наприклад, ії) фосфоліпіди. Приклади: алкіл-фосфатидилхоліни з довгим 22 ланцюгом, наприклад, 1,2-дилауроїл-зп-гліцеро-3-фосфохолін (ОІГРС), 1,2-динліристоїл-зп-гліцеро-3-фосфохолін

Ге! (ОМРСО), 1,2-дипальмітоїл-зп-гліцеро-З3-фосфохолін (ОРРС), 1,2-дистеароїл-зп-гліцеро-З3-фосфохолін (О5РС), 1,2-діолєоїл-зп-гліцеро-З3-фосфохолін (СОРС), 1-пальмітоїл-2-олеоїл-зп-гліцеро-З-фосфохолін (РОРС,), (ії) де стероли або сполуки, що мають схожі властивості у тому, що вони загущують (знижують плинність) ліпідний подвійний шар. Приклади: сполуки стиролового класу: холестерин та холестерин З3-сульфат, та ії) (стерично) іп 60 мімо стабілізатор(-и) покращення властивостей конструктів стосовно цілеспрямованості доставки у пухлинну клітину та подовження часу знаходження у крові, наприклад, прості поліефіри, поліетиленгліколі. Введення ПЕГ та/або похідних ПЕГ у ліпосомні склади надасть переваг стосовно зниження ретикулоендотеліальною системою кліренсу ліпосом, що вводяться шляхом ін'єкції, з циркуляційної системи. Звичайно вводяться у препарат у 3-10 молярних 95 відносно фосфоліпіду. Кількість стабілізатора, яка необхідна для отримання бажаного 65 стабілізуючого ефекту, залежить, проте, від мономеру (електростатичних та полярних властивостей) та кількості повторних одиниць, тобто від довжини ланцюга. Приклади (ПЕГ та/або похідні ПЕГ):

1,2-динліристоїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламін-М-(полі(етиленгліколь)2000) (ПЕГ2О00 ОООРЕ), 1,2-дипальмітоїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламін-М-(полі(етиленгліколь)2000) (ПЕГ2О00 ОРРЕ), 1,2-дистеароїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламін-М-|полі(етиленгліколь)2000)| (ПЕГ2000О ОРЕ). а) Компоненти, що сприяють модифікації конструктів, щоб вони мали властивості для цілеспрямованого досягнення пухлинної клітини: вибір відповідного активованого ліпіду буде визначатися природою гаптену, а також вимогами дослідження. Ефективність реакції буде зумовлюватися відщеплюваною групою, гідрофільним спейсером, властивостями матеріалу ліпосоми та концентрацією реагентів. Для досліджень іп мімо, у яких необхідно, щоб гаптен залишався зв'язаним з ліпосомою, певні переваги досягаються завдяки вибору ліпідних 7/о якорів з більш довгим ацильним ланцюгом, які обмінюються повільніше між мембранами. Далі, ковалентний зв'язок між гаптеном та ліпідним якорем повинен бути стійким як до хімічного розщеплення, так і до ферментативного гідролізу. Активовані ліпіди можуть функціонувати так що вони утворюють, наприклад, амінний, амідний, тіоефірний або дисульфідний зв'язки між ліпідом та модифікатором. Якщо стеричні стабілізатори вводяться у препарат, наприклад ПЕГ та/або похідні ПЕГ, група, що функціонує для взаємодії, /5 переважно, знаходиться на кінці сполуки, що є ідентичною або подібною до стабілізатора, та має ефективну довжину ланцюга, що дорівнює або перебільшує довжину ланцюга стабілізатора. Приклади: компоненти пухирців, які сприяють модифікації конструктів так, щоб вони мали властивості цілеспрямовано досягати пухлинної клітини, з ПЕГ та/або похідних ПЕГ: М-Мм/-(2-піридилдитіопропіоніламіно)полі(етиленгліколь)2000) 1,2-дистеароїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламін (РОР-РЕС2000-О5РЕ),

М-бм-(4-(р-малеїмідофеніл)бутаноїл|іаміно)полі(етиленгліколь)200011,2-дистеароїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламі н(МрВ-РЕС2000-О5РЕ).

Відокремлення пов'язаного з ліпосомами радіоіїзотопу, від не пов'язаного з ліпосомами радіоізотопу, здійснили шляхом застосування гель-витіснювальної хроматографії (Майк апа Сатбріе 1979, ТіїсосК та інші 1991). Для такого відокремлення після процедур завантаження ліпосом застосовували колонки для сч об Гель-витіснювальної хроматографії РО-10. Завдяки застосуванню об'ємів їмл або менше на колонках РО-10 ліпосоми елюювалися у перші 4,5мл. Радіоіїзотопи, не пов'язані з ліпосомами, елюювалися у фракцію, що і) відповідає зразкам з низькою молекулярною вагою. Колонки РО-10 також застосовували у дослідженні надійності (щодо утримання радіоізотопу) навантажених ліпосом у соляному розчині з фосфатним буфером.

Відокремлення пов'язаних з ліпосомами радіоізотопів від вільних радіоізотопів у сироватці здійснювали о

Зр шляхом гель-витіснювальної хроматографії на колонці Зерпагове СІ-48 (Нуапу апа Мак, 1977). Таким чином можна приготувати розчини, які містять радіоактивні ліпосоми, дисперговані у рідкому носії, який практично не ісе) містить незв'язані радіоізотопи. «-

ЕОТА (етилендіамін М,М'тетраоцтову кислоту) додали до початку процедур хроматографії з метою стабілізації вільного радіоїзотопу у стані, при якому його можна легко відокремити від пов'язаної з ме) ліпосомами фракції. ї-

Кількість введених радіоізотопів та латентність пов'язаних з ліпосомами радіоіїзотопів визначили шляхом гама-резонанасної спектроскопії для 8Ас, 223Ва, ?12рРр, ?12Ві, 205Ві та ?07Ві, 228дс та 205207 Ві застосовували як ізотопний індикатор для потенційно терапевтично придатних радіонуклідів 225Ас, 212Ві та 21ЗВі, відповідно. «

Автори цього винаходу зробили значне та несподіване відкриття того, що 2Ві не зазнає суттєвого переміщення після розпаду 212Рр, введеного у цей тип ліпосом. Сучасний стан застосування 212Рр як З с молекулярнозв'язаного генератора 7"2Ві вказує на те, що звичайно трапляється суттєве виділення (більше або "з дорівнює 30905) з хелатора (МссСішге апа Реіпепдедеп, 1998, Міггадей та інші, 1993). Проте, завдяки уловлюванню 212рр при високій концентрації хелатора, такій, як наприклад, усередині ліпосоми, можна уникнути виділення дочірнього продукту, використовуючи кон'югаційну систему, яку можна застосовувати для - 15 уловлювання дочірнього ізотопу після ядерного перетворення. Це вперше, коли повідомляється про кон'югаційну систему для 712Рр, яка може утримувати дочірній ізотоп 22Ві майже у загальній кількості. Отже, цей винахід о стосується ліпосом з іонофорами, які містять радіоїзотоп та хелатор, розташовані усередині ліпосоми - (кон'югаційна система), та де ця кон'югаційна система може або не може утримувати дочірній ізотоп.

Хелатор згідно Кк! цим винаходом можна обрати Кк! групи, яка містить 1,4,7 10 (о) тетраазациклододекан-1,4,7,10М,М',М",М'"-тетраоцтову кислоту (ООТА), о 1,4,7, ЛОтетраазациклотридекан-1,4,7,10М,М',М",М'"-тетраоцтову кислоту (ТКІТА), 1,4,7, 1 Отетраазациклотетрадекан-1,4,7,10М,М',М",М'"-тетраоцтову кислоту (ТЕТА), 1,4,7,ЛОтетраазациклодо декан-1,4,7,10М,М',М",М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту (ПООТМР), 1,4,7, ЛОтетраазациклотридекан-1,4,7,10М, М, М",М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, 1,4,7,ЛОтетраазациклотетрадекан-1,4,7,10М,М',М",М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, (Ф; діетилентриамін М,М',М'"пентаоцтову кислоту та її ізомерні похідні,

ГІ криптат(І2,2,2), криптат(|3,2,2), криптат|2,2,1) та їхні моно- та ди-бензо-похідні, з'єднані місточковим зв'язком каліксІарени, що містять багаті електронами (донорські) групи (гідроксил, карбоксил, естер, амід, амін), во 1,1Одіаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10М,М'біс-оцтову кислоту та 1,1Одіаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10М,М'біс-малонат.

Інше важливе та несподіване відкриття полягало у тому, що ліпосоми згідно з цим винаходом могли містити та ефективно утримувати "Ка. Це вперше, коли описується кон'югаційна система, що є потенційно придатною для доставки у пухлину радію-223. Крім того, ми демонструємо, що вісмут та актиній також можна включати та 65 ефективно утримувати в описаному тут типі ліпосом, що вказує на те, що можна також одержати кон'югаційну систему на основі ?2Ві, ?1ЗВі та ??5дс,

Кон'югаційну систему згідно з цим винаходом можна також виготовити з або без груп, що модифікують поверхню, наприклад, ПЕГ, у мембрані ліпосоми (щеплені ПЕГ/ПЕГліковані ліпосоми). Перевага застосування

ПЕГ у мембрані полягає у тому, що їх застосування забезпечує декількома реакційноздатними ПЕГ-групами, що сприяє кон'югації з білками, такими як, наприклад, антитіла, фрагменти антитіл, або конструкта, або фолат, або інші споріднені до рецепторів (рецептор-зв'язувальні) білки/молекули.

Цей винахід далі стосується нового типу ліпосом з рецептор-зв'язувальними білками, приєднаними до мембрани ліпосоми. Тут ми описуємо споряджені радіоїзотопами щеплені ПЕГ ліпосоми, кон'юговані зі спорядженими фолатом антитілами. Застосування фолату та похідних фолату для націлювання на пухлину, що 7/0 експресують фолат-зв'язувальні білки (ЕВР), білок клітинної мембрани, з'єднаний з глікозил-фосфатидил-інозитолом, який включається у клітинне поглинання окиснених фолатів через ендоцитоз, привертає увагу дослідників (Кгап2 та інші, 1996, Кедау та інші, 1998, Зпіпода та інші, 1998, Тгірреї та інші, 1999). Оскільки було продемонстровано, що декілька типів ракових клітин людини надмірно експресують фолат-зв'язувальний білок, то цей рецептор може бути можливою мішенню для доставки терапевтичних 7/5 радіоізотопів, зв'язаних з фолатом. Отже, застосовуючи кон'юговані з фолатом антитіла, можна отримати спрямований радіоїзотопний терапевтичний засіб проти раку. Крім того, якщо споряджений фолатом антигензв'язувальний центр антитіла спрямовується проти пов'язаного з пухлиною антигену, відмінного від фолат-зв'язувального білка, досягається спроможність подвійного зв'язування (тобто, досягається спорідненість як до цього антигену, так і до фолат-зв'язувального білка-рецептора). До вашої уваги, це вперше, коли описується кон'югація споряджених фолатом антитіл.

Споряджені фолатом антитіла, кон'юговані з ліпосомами згідно з цим винаходом, можна далі мітити радіоізотопом або сумішшю різних радіоізотопів для підвищення ефективності радіотерапії.

Цей винахід демонструє, що цю нову комбінацію споряджених фолатом антитіл, кон'югованих з ліпосомами, можна застосовувати для доставки радіоізотопу(-ів) до клітин, що експресують рецептори фолату. Це є особливо сч об Корисним з випромінювачами альфа-частинок, що характеризуються великими втратами енергії на одиницю шляху пробігу (підн-Г ЕТ), які є особливо цитотоксичними для клітин ссавців (Наї|, 1994, І агзеп та інші, 1998, і)

КіКег та інші, 1977). Проте, джерело альфа-випромінювання може доставляти випромінювання до надзвичайно дрібної ділянки, порівняно з іншими типами випромінювання. Отже, якщо джерело альфа-випромінювання можна спрямувати до тканини-мішені, тоді можна знизити опромінення здорової тканини. о зо Кон'югаційну систему згідно з цим винаходом можна також застосовувати для спрямовування на клітини, що експресують, наприклад, естрогенний рецептор або тестостеронний рецептор, шляхом кон'югування антитіл з ікс, естрогеном або тестостероном. «-

Споряджені антитіла, що застосовуються згідно з цим винаходом, є переважно класу дос або ІМ, та/або їхніми фрагментами або конструктами (наприклад, мінітілом). Крім того, ці антитіла, та/або фрагменти, та/або ме) з5 Конструкти можуть бути мишачими, химерними або повністю людськими, поліклональними або М моноклональними.

Цей винахід також стосується застосування кон'югаційної системи згідно з цим винаходом для приготування фармацевтичного розчину, придатного для ін'єкцій або інфузій ссавцям, у тому числі людям, внутрішньовенно, та/або місцево, та/або шляхом введенням у пухлину. Фармацевтичний розчин можна застосовувати у комбінації «

З радіоактивним імунокон'югатом або декількома радіоактивними імунокон'югатами та/або у комбінації зіншими пт) с формами променевої та фармацевтичної терапії, хіміотерапії, дистанційної променевої терапії або хірургії для лікування злоякісних хвороб. ;» Цей винахід також стосується способу застосування кон'югаційної системи згідно з цим винаходом для лікування ракових хвороб, таких як, наприклад, рак головного мозку, рак легенів, рак шийки матки, рак яєчників, рак молочної залози, лейкозу, лімфоми або злоякісної меланоми. -І Цей винахід також стосується набору для одержання кон'югаційної системи згідно з цим винаходом, який містить пробірку, яка містить ліпосомний розчин, та другу пробірку, яка містить радіоїзотоп у розчині, які о можна змішати для полегшення спорядження радіоізотопами. Крім того, цю суміш можна змішати з вмістом - третьої пробірки, яка містить білки та/або молекули з рецепторним афінітетом, для одержання кон'югаційної 5ор бистеми з рецепторним афінітетом.

Ме. Реагенти та обладнання о Гама-резонансну спектроскопію виконували із застосуванням германієвого детектора (Сапбрегїта, Мегіаеп, СТ,

БА), зв'язаного з багатоканальним аналізатором (ЕбСЯО ОКТЕС, бак Кідде, ТМ, ОБА). Прилад Весктапп І 5 (Весктапп, Ешепоп, СА, ОА) застосовували для сцинтиляційного рахування. ОБРС та холестерин купували у дв Могйпет Гіріаз (Мапсошмег, Сапада). Колонки Зерпадех 5-25 РО-10 (Атегапат Рпагтасіа Віоїесп АВ, Оррзаїа,

Зуедеп) застосовували для очищення споряджених радіоіїзотопами ліпосом. Макроциклічний хелатор ООТА

Ф) застосовували як внутрішньоліпосомний хелатор та його купували у Масгосусіїсв (Кіспагазоп, ТХ, О5А). У цьому ка дослідженні застосовували НМО»з класу Огех (У. Т. ВакКег, Рийірзриго, МУ, ОБА), та 6М НеС1 (БРівпег

Зсіепійіс, Рійкериго, РА, ОА), та біс(2-етилгексил) фосфорну кислоту (НОЕНР) від Рішка (через Зідта-Аїагіснп 6о Аз, Могмау).

Усі буфери, які застосовувалися для опосередкованого іонофорами катіонного навантаження ліпосом, довели до бажаного рН шляхом застосування аргініну (вільна основа). Усю воду, що застосовувалася, отримали, застосовуючи систему очищення води Міїй-с (МіПіроге, Веатога, МА, ОА). Іонообмінні смоли постачалися

Віо-Кай (Негсшез, СА, ОА). 65 Смоли попередньо кондиціонували шляхом промивання водою, потім ЄМ НС, а потім ацетоном та, зрештою, водою. Смоли зберігали у воді до заповнення колонок.

Диметилсульфоксид (ДМСО), який застосовували, зберігався у 4А ситах. 232ТН(МО3)4, що застосовувався у цьому дослідженні, зберігався понад 20 років. Зразок отримали від

Мисіеаг Спетівігу Ссгоир, Оерагтепі ої Спетівігу Опімегейу ої Овіо, Овіо, Могмау.

ЗН-фолієву кислоту купували у Атегейат Рпагтасіа Віоїесп (Вискіпдапатзпіге, ОК).

Усі інші реагенти купували у Зідта-Аїагіси, Могмау.

Таблиця 1 демонструє деякі фізичні властивості радіоіїзотопів, що застосовувалися в експериментах з ліпосомами. о

М пня шт: нс й " гли нави птекснно ганевнеронноваьня пералннно для кет гадосенету. "Лише найбільш інтенсивне гама-випромінювання перелічено для кожного радіоізотопу.

Дані від Мисіеаг Оайа Зпееїів, Асадетіс Ргезз ІМС.

У ліпосоми, приготовані згідно з описаними процедурами, ввели радій-223 або свинець-212. Після цього с ов антитіла піддали реакції з ліпосомами з метою досягнення розташування молекул антитіла на поверхні ліпосом.

Розмір ліпосом приблизно 1700мкм буде відповідним для системної доставки, проте звичайні розміри і) 200-14000мкм можна застосовувати, коли треба здійснити внутрішньопорожнинну доставку, наприклад, для лікування внутрішньочерепної пухлини головного мозку або для лікування внутрішньочеревинного раку яєчників. (Більш великий розмір ліпосом може знизити швидкість кліренсу порожнини, в яку вводиться препарат шляхом о

Зо ін'єкції, тим самим зберігаючи високу концентрацію препарату у ділянці пухлини).

ПРИКЛАДИ ее,

Приклад 1. Введення 7РЬ/"2Ві у ліпосоми «-

Способи: 212РБрф/712Ві одержали шляхом утворення 220Бп з джерела 228Тн, як описано Наззйеї апа Ної с (1994). Жоден з доданих носієм 7 2РБ/"2Ві не вилуговувався зі збиральної судини при застосуванні 001М НМО»з 35 та розчин вилили у колонку розміром 2х20мМ з катіонообмінною смолою АС 50МУ-Х4.212РЬ/212Ві потімелюювали Ге 2М НС та розчин випаровували до сухого стану. "2РБ/212ВІі потім розчинили у 200мкл 10мМ розчину ацетату, рН 5.212рь кількісно проаналізували шляхом вимірювання його гама-випромінювання 238,бкеВ (Таблиця 1). ?2Ві кількісно оцінили шляхом вимірювання гама-випромінювання 583,1кеВ його дочірнього 2929Т1 при радіоактивній « рівновазі. з

Результати: Визначили, що менш ніж 0,290 від доданої радіоактивності пов'язувалося з ліпосомами протягом с часу витримування до З днів. :з» Ліпосоми, які відповідали ліпідній концентрації 30О-6ЄбМмМ, сильно перемішали з плівкою іонофора А23187 (10-13НМ). Потім додали приблизно 1МБк 7 РБ/""2Ві та суміш витримували при 752С протягом 30 хвилин, після

Цього елюювали на колонці РО-10. Фракцію, що містила більш ніж 9595 навантажених пухирців, потім елюювали -І на другій колонці РО-10. Латентність пов'язаних з ліпосомами 2РБр/22Ві визначали шляхом витримування о пухирців при 372С у сироватці людини або у фізіологічному розчині з фосфатним буфером (РВ5). Радіоактивне розповсюдження проходило після цього протягом 24 годин. - Результати: Ефективність введення РР: 34,895 (п--3).

Ге») 20 Утримання вимірювали шляхом гама-резонансної спектроскопії, та більш ніж 99956 212РЬ пов'язувалося з ліпосомами протягом часу витримування, який становив до 24 годин. с Приклад 2: Утримання 272Ві, утвореного внаслідок розпаду пов'язаного з ліпосомами 72РЬ

Способи: У ліпосоми ввели 212РБр, як описано вище. Пов'язану з ліпосомами радіоактивність виділили шляхом елюювання реакційної суміші ТММ ЕОТА у РВ5 на колонці РО-10, попередньо урівноваженій 10ММ ЕОТА у РВ5.

Через З години для того, щоб переконатися, що між 2і2рь та 212Ві встановилася перехідна рівновага, (Ф) аліквотні проби розчину помістили у колонки РО-10, попередньо урівноважені 10ММ ЕОТА у РВ5, для ко відокремлення вільних радіоізотопів від пов'язаних з ліпосомами радіоізотопів. Радіоактивне розповсюдження проходило після цього протягом 24 годин. во Окрему аліквоту споряджених ліпосом, які не зазнали процедури відокремлення (з геометрією, ідентичною до геометрії, отриманої з процедур хроматографії), вимірили та застосовували як стандартну. Це виконували для визначення коефіцієнта радіоактивності 22Рр/212Ві при радіоактивній рівновазі.

Результати: Шляхом порівняння коефіцієнта 212РБ/212Ві, отриманого для ліпосом, відокремлених шляхом хроматографії, з коефіцієнтом рівноважної суміші, визначили та продемонстрували, що більш ніж 9595 ?12Ві 65 утримується у ліпосомах після розпаду пов'язаного з ліпосомами 22РБ.

Крім того, порівнювали вимірювання радіоактивності 22Ві у двох фракціях, отриманих шляхом хроматографії. Більш ніж 9995 від загальної радіоактивності 22Ві елюювалися у фракції, що відповідають ліпосомам.

Приклад З: Досліджування можливого перенавантаження Р та Ві у ліпосомах

Способи: До плівки іонофора А23187 (20-26нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки), застосовуючи зовнішній розчин, що містить 1Л0ММ ЕОТА у РВ5, додали ліпосоми, що відповідають ліпідній концентрації 30-60мМ, 150мМ уловлювальної лимонної кислоти, ЗОММ ООТА. Потім додали 22РЬ та 272Ві у РВ5 з наступним витримуванням при 372. Аліквоти розчину пропускали крізь колонки РО-10 та фракції, отримані шляхом 70 хроматографії, які відповідали ліпосомному елюату, проаналізували із застосуванням вбудованого

Се-детектора.

Результати: Ніякого помітного навантаження (менше 195) 7РЬ та 712Ві не спостерігали протягом 24 годин.

Приклад 4: Введення 22ЗКа у ліпосоми 75 223Да одержали з генератора на основі "Ас, як описано у І агзеп апа Непгікзеп, 1999, Стисло, "Ас та його дочірній ізотоп 22/Тн утримувалися у колонці зі смолою для екстракційної хроматографії, яка сприяє елююванню Ра, із застосуванням мінеральної кислоти. Для введення радію у ліпосоми елюйований розчин з генератора випаровували до сухого стану та 223Ка потім розчинили у 5мМ цитраті, рН 74.

Ліпосоми, що відповідали ліпідній концентрації 30-6ЄбмММ сильно перемішували з плівкою іонофора А23187 (10-13нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки). Після цього додали приблизно 5ОкБк 223Ка та суміш витримували при 752С протягом 20 хвилин. Реакційну суміш потім додали до 100мкл ТММ ЕОТА та елюювали на колонці РО-10 для відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями.

Утримання пов'язаного з ліпосомами 223Ка досліджували шляхом витримування пухирців при 37 С у сироватці людини (Зідта) або 5мММ ЕОТА у сироватці людини при концентрації ліпосом 0,Змг загального с 29 ліпіду/мл сироватки. Результати наведено у Таблиці 2, і вони демонструють, що 223Ка дуже стабільно (3 утримується у ліпосомах. о з Ф - (Середнє стандартне відхилення. їЯ о і -

Приклад 5: Визначення, чи буде перенавантаження впливати на експеримент утримання Ка

Способи: До плівки іонофора А23187 (10-13нМоль розподілені на внутрішній поверхні скляної пробірки) додали ліпосоми, що відповідали ліпідній концентрації 30-6ОмММ, утворені шляхом гідратації ліпідних плівок 150мММ лимонної кислоти, ЗОММ ООТА, у якості зовнішнього розчину був РВЗ або сироватка. Потім додали Ка « 40. У 5ММ цитрату з рН 7,4 з наступним витримуванням при 372С. Аліквоти розчину пропускали крізь колонки РО-10 ще с та отриману шляхом хроматографії фракцію, яка відповідала ліпосомам, проаналізували із застосуванням ц вбудованого Се-детектора. "» Приклад 6: Введення 207Ві у ліпосоми

Способи: 293207Ві отримали шляхом реакцій (р. хп) на природних свинцевих мішенях та очистили із застосуванням смоли для селективної екстракційної хроматографії свинцю (Непгікзеп апа Ноїї, 1998). ш- Суміш ізотопів Ві, що складається здебільшого з 295Ві та 207Ві, яку далі позначатимемо як /2О7ВІі, о застосовували у цьому досліді. 5ХОмкл розчину 207В у 107 М НСЇ додали до ліпосом, що відповідають ліпідній з концентрації 30-60ОмММ, які заздалегідь змішали з плівкою іонофора А23187 (10-13нМоль на внутрішній поверхні скляної пробірки) та витримували протягом 30 хвилин при 7520. Потім реакційну суміш додали у 100мкл 10ММ (о) 50 ЕОТА та елюювали на колонці РО-10 з метою відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. о Результати: Визначили, що 3295 від усього 297Ві пов'язувалося з ліпосомами.

Приклад 7: Введення ?8Ас у ліпосоми

Способи: 278дс відокремили від препарату 22ТН(МОз)4 шляхом комбінації екстракції розчинником та іонного обміну. 222ТИ(МОз)4 (первинно 4Н2О) розчинили у 20мл 0,1М НМО», та додали у ділильну лійку об'ємом 50омл, о та примусили контактувати з 5хі0О0мл 2М розчину НОЕНР у гептані. Водну фазу потім тричі промили гептаном та потім пропустили крізь 3х40ММ колонку з катіонообмінною смолою АСБОМУ-Х12 для відокремлення "8Ас, як о описано у Сарбеї!, 1959, 22Рр, 212Ві, 221Ка та 228Ба елюювали з колонки ЗМ НМОЗз та розчин залишили на більш ніж 20 годин. Розчин потім випаровували до сухого стану з наступним вилуговуванням радіоізотопів з судини за 60 допомогою о їмл 0 1М о НМО5. Цей о розчин о пропустили крізь Зх40мММ колонку АСБОМУ-Х12.

Знов 212рр, 212Ві, 224ра та 228ра елюювали ЗМ НМОз. 228Ас елюювали ЄМ НМОз та елюат випаровували до сухого стану. ?78ДАс потім вилуговували з судини, застосовуючи 200мкл 5мМ НМО»з. Приблизно бкБк ?8Ас. додали у ліпосоми, що містили іонофор А23187, як описано вище, та витримували протягом бО хвилин при 75 20. 65 Реакційну суміш потім додали до 100мкл 10ММ ЕОТА та елюювали на колонці РО-10 з метою відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними пухирцями. Фракції, що відповідали більш ніж 9590 навантажених пухирців, зібрали та потім елюювали на другій колонці РО-10. Утримання ?8Ас ліпосомами досліджували шляхом витримування споряджених радіоїзотопами пухирців при 37 оС у сироватці людини або у РВ5.

Поширення радісактивності після цього тривало протягом 24 годин.

Результати: В експерименті введення 90-9595 від доданого ""8Ас (скоректовано з урахуванням розпаду під час навантаження та очищення) зв'язувалося з ліпосомами після процедури навантаження. Визначили, що в експерименті утримання більш ніж 9895 ?28Ддс пов'язувалося з ліпосомами протягом часу витримування, який становив до 24 годин.

Приклад 8: Введення У

Способи: у застосовували як ізотопний індикатор у цьому прикладі для дослідження поведінки споряджених радіоізотопами ліпосом. У та З98г у цьому досліді вимірювали шляхом рідинного сцинтиляційного рахування. зоу відокремили від б5г за допомогою смоли для селективної екстракційної хроматографії стронцію, як 7/5 описано у Оіеї? апа Нопмії: (1992). Тут, зо8г (Атегзпат, Вискіпдапатвепйіге, Епдіапа) у 0,1М НМО» випаровували до сухого стану та у залишок додали ЗМ НМОз. Розчин пропустили крізь ЗХ2ОмММ колонку зі смолою для стронцію (ЕіСпоМм, Вагіеп, І, О5А) та колонку промили 5мл ЗМ НМО».

Ця процедура селективно елюює СОУ, у той час як Зг практично утримується у колонці, зменшуючи вміст г у суміші 98г/20у з коефіцієнтом приблизно 103 (Оівї? апа Ногпміїг, 1992). Після цього 95г видалили з колонки із застосуванням 0,05М НМО» та цей розчин залишили на один тиждень для того, щоб дозволити зоу збільшитися.

Потім розчин випаровували до сухого стану та у залишок додали ЗМ НМО» перед відокремленням радіоізотопів на другій колонці зі смолою для стронцію. Елюат, що містив Оу, випаровували до сухого стану та радіоізотоп вилуговували з судини, застосовуючи 200мкл 5мМ НМО»з. Цей розчин додали до ліпосом, що містили іонофор

А23187 (як описано вище), та витримували протягом 60 хвилин при 752С. У реакційну суміш потім додали 5Омкл с 29 10мММ ЕОТА та елюювали на колонці РО-10 для відокремлення радіоактивності, пов'язаної з ліпідними Ге) пухирцями. Фракцію, яка відповідає більш ніж 9595 пухирців, потім елюювали на другій колонці РО-10. Утримання ліпосомами пов'язаного з ліпосомами 9 досліджували шляхом витримування пухирців при 372С у сироватці людини або у РВ5. Поширення радіоактивності тривало після цього протягом 4 днів. о зо Результати: Більш ніж 95905 від доданого у пов'язувалося з ліпосомами після 1 години введення та очищення на гель-витіснювальній колонці. со

У досліді з ліпосомним утриманням отримали наступні результати: після 5 годин та одного дня більш ніж 9990 «- були пов'язаними з ліпосомами. Через 4 дні визначили, що пов'язана з ліпосомами фракція становила 98--1965.

Як продемонстровано у цих експериментах, ліпосоми можна споряджати радіоізотопами, що випромінюють і. з5 альфа-частинки та/або бета-частинки, та що вони можуть добре утримувати ці ізотопи при фізіологічній р. температурі.

Приклад 9: Одержання ПЕГлікованих ліпосом, зв'язаних з фолатом-Раб', що містять ітрій-90/радій-223 14мг/мл Б(авр)» Ко; мієломи (Субклас дб) у РВ5 застосовували для цього експеримента (Місна!зеп,

Моглмедіап Іпзійше ої Рибіїс Неакй, Овіо, Могмау). «

Кон'югація фолієвої кислоти з антитілами - с Фолієву кислоту "2Н2О спочатку розчинили у диметилсульфоксиді (РішКка, вміст НО менш ніж 0,0595). Розчин ц потім перемістили за допомогою канюлі на активовані сита 4А (Бійка) та зберігали в атмосфері аргону у ,» темряві протягом 6-10 годин. Мічений тритієм фолат (ЗН-фолат) додали у виді розчину солі калію ЗН-фолату (196 відносно лимонної кислоти). Специфічна радіоактивність ЗН-фолату, який застосовували для кон'югації з білком, становила 7-7,5ГБк/моль. - ЗН-фолат активували для взаємодії з К(аб')» антитіла мієломи шляхом додавання 10 мольних еквівалентів 2) 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодіїміду у розчин фолату та витримування протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після цього активований фолат з молярним надлишком у 30-40 разів додали до білку, - 14мг/мл у РВ5, та дозволили здійснюватися реакції протягом 30-60 хвилин. Реакцію загасили шляхом додавання

Ге» 20 О2мл 0,3М гліцину у РВЗ/бораті, рН 8,5. Кон'югат фолату та К(аб)2 (фолат-Р(аб)») відокремили від матеріалу, який не реагував, застосовуючи колонку РО-10, попередньо урівноважену РВ5. Для того, щоб утворити ме, фолат-Раб', фолат-Р(ар)» витримували у 1мМ дитіотреїтолі (ОТТ) при кімнатній температурі протягом 2 годин з наступним елююванням на гель-витіснювальній колонці МАР-5. Фракцію, що містила фолат-Ра», дезоксигенували шляхом барботування аргону крізь розчин, після чого розчин одразу змішали з ліпосомним 29 розчином.

ГФ) Ступінь кон'югації фолієвої кислоти визначили вмістом ЗН в очищеному білку, що вимірили шляхом рідинного сцинтиляційного рахування (ВесКтапп І 56500) разом з даними спектрофотометрії при 280НМ. о Для кількісного оцінювання фракції фолату-Рар', зв'язаного з ліпосомами, слідові кількості йодованого Е(ар')» додали до початку реакції з ОТТ (білок йодували, застосовуючи Іодосеп згідно зі стандартними процедурами). 60 Кон'югація споряджених антитіл з ліпосомами

Натрієву сіль ОБРЕ-РЕС2000-МРВ (Могпнегп Ііріаг, МА, Сапада) включили до 595, молярних, від усього фосфоліпіду. Ліпосоми були інакше утвореними та їх також виготовили для етапу опосередкованого іонофорами катіонного введення таким саме способом, як описано для не-ПЕГлікованих ліпосом.

Після того, як температура реакційної суміші після етапу навантаження досягла кімнатної температури, бо ліпосомну суспензію дезоксигенували до додавання фолату-Рар' для одержання концентрації білка 0,3-0,5мг/мл.

Ліпідна концентрація становила 1-3ЗММ, що визначили шляхом фосфорного аналізу за Вагпек (Вагіей, 1958).

Фолат-Рар" та ліпосоми залишили реагувати протягом 2 годин при кімнатній температурі. Реакційну суміш потім нанесли, застосовуючи колонку РО-10, урівноважену РВ5. Кон'юговані з фолат-Рар' ПЕГ-ліпосоми зберігали при 42 протягом 12-15 годин до початку застосування в аналізах зв'язування фолату-рецептора.

Зв'язану з ліпосомами радіоактивність вимірювали детектором з лунками з Маї, що коректує перебільшення у відповідних каналах, з двічі споряджених зразків. Зразки з єдиним нуклідом та суміші нуклідів застосовували як контрольні.

Завдяки вимірюванням радіоактивності концентрацію білка перетворили у кількість Бар'на ліпосому, 70 припускаючи розмір ліпосом становив Т00нМ та 8-107 фосфоліпідів/пухирців (Кігройп та інші, 1997), та молекулярна вага Рар'-антитіла мієломи становила 52000.

Зв'язану з клітинами радіоактивність вимірювали із застосуванням Маї!-детектора (концентрації у три рази більші для У-90) та рідинного сцинтиляційного рахування після додавання Іпвіа-сеї ріоз (Таблиця 3). ів »

Виявлення ЗН-фолату на ліпосомах сч

Ліпосоми з ПЕГ (ліпідна концентрація 2,5мМ) у 20ММ НЕРЕЗ/З00ММ цукрозі піддали реакції з баб, зв'язаним.ї (У з ЗН-фолатом (0,5мг/мл у РВ5, відношення фолат/Рар' 2 0,2). Після знаходження при кімнатній температурі протягом 2 годин ліпосоми, зв'язані з фолатом-Рар', виділили шляхом елюювання на колонці Зерпагозе СІ -48.

Кількість ЗН-фолату-Бар' на ліпосомах кількісно визначили шляхом рідинного сцинтиляційного рахування Га») 3о отриманих шляхом хроматографії фракцій, та визначили, що коефіцієнт фолат-Рар'ліпосома становив приблизно 110. о

Скорочення: «--

ОРОС: дистеароїлфосфатидилхолін ротА: 1,4,7,10 тетраазациклододекан 1,4,7,10М,М',М",М'"тетраоцтова кислота і,

ОБРЕ-РЕС2000О-МРВ: М-(4-(р-малеімідофеніл)бутирил)-1,2-дистеароїл-зп-гліцеро-3-фосфоетаноламін ї- (Могпіпет І іріаз, МА,. Сапада).

НЕРЕЗ: М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2-етансульфонова кислота

РВ5: фізіологічний розчин з фосфатним буфером

ЕОТА: етилендіамін М,М'татраоцтова кислота «

НОЕНР: біс(2-етилгексил)/фосфорна кислота шщ с РЕС: поліетиленгліколь й ОТ: дитіотреїтол "» Посилання:

Вашек сок. Рпозрпогиз аззау іп соїштп Спготаїйодгарпу. 9. Віої. Спет. 234 (3), 466-468(1958).

Сареї! Му. Те ригійсайоп, де(егтіпайоп апа пецігоп сарійге сговзв зесіоп ої асііпішт-227. Сап. .. -І Спет. 37, 1094-1101, (1959).

Оемна г МТ, Нейтап 5, Козепрегд ЗА. Сапсег. Ртгіпсіріев й ргасісе ої опсоіоду. 5 еайоп о ПрріпсоЇ-Камеп, РПпйааеї!рніа, Мем/ Хогк, ОА (1997). - Обіеїш Мі апа Нопмий» ЕР. Ітргомей сПпетівігу ог (Ше ргодисіоп ої У-90 їтог теадіса! арріїсанопв. Аррі. 5р Кагіаї. Івої. 43, 1093-1101 (1992).

Фо Богевеп ЕА. Тпе дезідп апа демеюртепі ої ЮапоХотеФф ог зоїйй (тог іагдейпуд іп мімо. Адм. Огид о Оеїїмегу Кеу. 24, 133-150 (1997).

Сабігоп К, Ногом/ї2 АТ, богеп Ю. Тлетасі О, Мапаеірашт-Знамії Е, Оцазеп ММ, апа 7аїїрзКу 5. Тагдейіпа

ЕБоіаїе гесеріог м/йй їоіаїе ПпКей (о ехігетійез ої роїУ(е(уіїепе діусої)-дгайей ІПрозотев: по мйгОо ВіШаіев. Віосопіддаге Спет. 10, 289-298(1999).

Сабрізоп А. Гірозоте сігсцайоп (те апа (штог іагдейіпод: Ітріїсайоп бог сапсег спетоїПпегару. Адми. Огид іФ) Оеїїмегу Кеу. 16, 285-294 (1995). ко бае ММ. Те сигтепі віайз ої (агдеїгеа гадіо(Негару іп сіїіпіса! ргасіісе. Рпуз. Меа. Во). 41, 1895-1903 (1996).

Сбоїіпз В, РПййрз МУ/Т. апа Кіїррег К. Кереаї іпіесіоп віцаїевз ої (есппебйшт-99т Іабеіей РЕС-іІірозотезв іп бо Ше зате апітаї|. У. Прозоте Кез. 8(2), 265-281 (1998).

НаїЇ Е. Кадіобіоіоду гог (Пе гадіоіодіві. Гоигпій Едп. УВ Гірріпсоїї Сотрапу, Рпйадеїрнпіа, ОБА (1994).

Наззіеї! 5Р апа Ної Р. А депегайг їог ргодисіоп ої Рр-212 апа вВі-212. Аррі. Кадіаї. Ізої. 45, 1021-1025 (1994).

Непгіквеп С апа Ной Р. Івоїайоп ої сусіоїгоп ргодисей Ві-205, Ві--06 апа РБ-203 изіпд а Іеад-зеІесіїме ехігасіоп Спготаїйоадгарнпіе гезіп. Аррі. Кадіаї. Ізої. 49, 357-359 (1998). 65 Нжапуд КО апа Мак МК. Раїе ої Іірій мевісіев іп мімої А датта-гау репигрей апдшіаг соггеїайоп віцду.

Ргос. Маїї. Асай. Зеї. ОБА. 74, 4991-4995 (1977).

Кігроїйп О, Рак ОМУ, Нопд К. 7аїїреКу 5. ММеп-Г и Ї, Сапег Р, Веп2 СС апа Рарападіорошіовз О. е(егісаПу віабіївей Апі-НЕК2 Іттипоїїрозотев: Юевзідп ап (агдейпуд о о питап Ббгеазі сапсег сейв іп о Мімно.

Віоспетівігуг-36, 66-75. (1997).

Козіагеюз К. Ептіівеїгодіои О апа біатай(еюи М. Іірозоте-теадіайєй аеїїмегу ої гадіописіїдсв о Штог тодеї!в Тог сапсег гадіоіпегару: Л доапійайме апаїувів. 5 9. І ірозоте Кезв..9 (3), 407-424 (1999).

Ктгап2г. ОМ. Коу, ЕуУ апа Раїйіск, ТА. Сопішдаєев ої їоЇафїе апіі-ейесіог сеї! апііродіе5. Опіей б5іа(ез

Раїепі питрбег: 5 547 668 (20. Аца. 1996).

Іаггеп КН, АКкарапі 0. МуУеівй Р апа 7аішеку МЕ. Те суфоіїохісйу апа тісгодовітейу ої /о авіанпе-211-Іареіей спітегіс топосіопа! апіродіев іп питап 710 діота апа теїапота сеїї5 іп міго. Кааіаї.

Кезв. 149. 155-162 (1998).

Ї агвеп КН. Непгікзеп б. Могледіап Раїйепі арріїсайоп Мо РОЗО0О1 (1999).

Їее Ку) апа гом РБ5. Оеїїмегу ої ІПрозотев іпіо сиМигей КВ сеїЇв міа їоЇаіе гесеріог-тедіаїей епадосуфювів.

У. Віої. Спет. 269, 3198-3204 (1994).

Масропаїдй КС, Масоропаїд КІ, Мепсо ВРИМ., ТаКезпйа К, Зиррагао МК апа Ни 15 І ап-гопд. ЗтаїЇІ-моїите ехігивіоп аррагайиз ог ргерагайоп ої Іагде, ипіатег|Іаг мевісіеєв. Віосп. Віорпуз. Асіа 1061, 297-303 (1991).

Магоуата К, ТаКігажша Т, ТаКапйазпі М. Тадажша Т. Мадаїке К апа Імаївиги М. Тагдейпу ейісіепсу ої

РЕСб-іттипоїїрозоте-сопіцдаїса апііродіеєз а РЕС (егтіпаїів. Аду. Огид Оеїїмегу Кеу. 24, 235-242 (1997).

Мак МК апа Сатбіе КС. Ргерагайоп ої Іїрій мевісіев сопіаіїпіпуд Підн Іемеі ої епігаррей гадіоасіїме сацопв. Апа!. Віоспет. 94, 302-307 (1979).

МесСіцге 9) апа Реіпепдедеп, ГЕ. АІрпа-етіЧЦеге їог тедісаІ! (пегару: Зесопа Віаппца! УУогкепор, Тогопіо,

Сапада. дипе 4-5, (1998). Кероп їтот Оерагітепі ої Епегду. Сегтапіомп, МО, ОБА

Міггаден 5, Китаг К, Сапгом. ОА. Тпе спетісаї! Та(е ої 2128ВіІ-ЮОТА їогтей ру р-десау ої 212РБ(РОТА)2-.

Кадіоспітіса Асіа, 60, 1-10 (1993). сч

Одіпага-Отеда І, Завзакі Т. Ко|їта 5. Мівзпідогі Н. Оріїта! гадіоІареей ІПрозотевз їТог Шютог ітадіпд. 5.

Мисі. Меа. 37 (2), 326-332 (1996). і)

Оїівоп ЕР, Нипі СА, 5г2оКка Е, МаїїЇ МУ) апа Рарападіорошовз ЮО. Ргерагайоп ої ЗО ІПрозотевз ої аеїїпей віге дізігіршіоп Бу ехігивіоп (пгоцоп роїусагропаге тетрбгапез. Віосп. Віорпувз. Асіа 557. 9-23 (1979).

Рікш 1 55, Рагкв Му. Зсипеїдег РО. Іп мйго Кійпу ої теїапота Бу Іровзоте аеїїмегей іпігасейшаг су

Зо Ітадіайоп. Агсп. Зиго. 122, 1417-1420 (1987).

Кедау. ОА апа Гомж. РБ5. РоіІа(ге-тедіаєеа (агдейпуд ої (пегарешцііс апа ітадіпд адепів (о сапсегв. Стіісаї ісе)

Кеміемув іп Тпегареціїс Огид Сатіег Зувіетвз 15 (6): 5 587-627(1998); «-

Кійег МА, СіІеамег УЕ. апа Торіаз СА. Нідн-Ї ЕТ гадіайопе іпдисе а Іагде ргоропіоп ої поп-геіфоіпіпд

ОМА-вгсакв. Мафшге 266, 653-655 (1977). о

ЗПпіпода. Т, ТаКаді, А. Маеда, А. Кадаїапі, 5, Коппо, М апа Назпіда, М. Іп мімо Табе ої юіа(е-В5А іп ї- поп-(тоиг- апа (Шштоиг-реагіпд тісе. ) Рпагт зЗсі 87 (12): 10 1521-1526, 1998.,

Тісоск СР. АнКопуд ОБГ апа Раїт М. Ап ітргомей теййой ог (пе ргерагайоп ої Ірозотаї! дадоїїпінт-ОТРА-

Іопорпоге-Меадіайей асіїме епігартепі ої дадоїїпічт. Іпмеві. Кадіо!. 26. 242-247 (1991).

Тіррей ТМ апа Вегііпо. ОК. ТНегареціїс зігафедіез агдейпо ргоївїпе (Ша! 15 гедціайе їоіЇа(їе апа « Тедисей юїайе (гаперогі. / СпетоїПпегару 11:3-10(1999). з с Тигпег АР, Ргезапі СА. Ргойій КТ, ММйатве ІЕ, МУіпвог ОМУ апа МУегпег ОГ. Та-111-І(ареіед Ірозотезв: . Бовзітейгу апа Шштог дерісіоп. Кадіоіоду 166 (3), 761-765(1988). и?» ШКпеде О, Меп М, Злгисв М апа Тісоск С Оріаке ої УЦгішт-9О іпіо рій 20 мевзісіев. доцг. Гір. Кез. 4(2), 1049-1061 (1994). во - Е я 40 -- ліпосоми, кон'юговані з баб

ОО 5 -9- ліпосоми, кон'юговані з фолатом-каю - З зо

В

ФО в, в і Шк хо и 5 шин і я о Ши м х

ГФ! 1 то 1009 1000 10000 100000

Відношення кількості доданих ліпосом до кількості клітин іме)

Фіг. 1 60 б5 во во х

У з 9 Е 40 х -й- без фолату в --- з фолатом та з "У й -к- з фолатом та з 22ва

ЇХ зо й го

У . 10 ЄС тя о поно. терені о 1 10 100 1000 10000 100000

Відношення кількості доданих ліпосом до кількості клітин

Фіг.2

Claims (34)

Формула винаходу

1. Кон'югаційна система, яка відрізняється тим, що вона містить ліпосоми з іонофорами та хелатором, розташованими усередині ліпосом, при цьому ліпосоми далі інкапсулюють важкий(-ї) радіоізотоп(-и), який(-ї) випромінює(-ють) 5 -частинки, або 22Рь як генератор А-випромінювач 272Ві,

2. Кон'югаційна система за п. 1, яка відрізняється тим, що концентрація хелатора усередині ліпосом є придатною для утримання дочірніх ізотопів. сч

3. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1 або 2, яка відрізняється тим, що хелатор вибирається з групи, Го) яка містить 1,4,7,10 тетраазациклододекан-1,4,7,10 М, М, М", М'-тетраоцтову кислоту (ООТА), 1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 М, М, М", М'-тетраоцтову кислоту (ТКІТА), 1,4,7,10 тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10 М, М, М", М"-тетраоцтову кислоту (ТЕТА), о зо 1,4,7,10 тетраазациклододекан-1,4,7,10 М, М', М", М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту (ООТМР), 1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 М, М', М", М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, (се) 1,4,7,10 тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10 М, М', М", М"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, - діетилентриамін М, М', М" пентаоцтову кислоту та її ізомерні похідні, криптат (І2,2,21, криптат |З,2,21, криптат (2,211 та їхні моно- та ди-бензо-похідні, со з'єднані місточковим зв'язком калікс(Іарени, що містять багаті електронами (донорські) групи (гідроксил, м карбоксил, естер, амід, амін), 1,10 діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10 М, М' біс-оцтову кислоту та 1,10 діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10 М, М' біс-малонат.

4. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1 - 3, яка відрізняється тим, що ліпосоми містять активовані « дю групи у мембрані, які надають можливість кон'югації білків або інших споріднених до рецепторів молекул з цими - активованими групами.

с

5. Кон'югаційна система за п. 4, де згадані активовані групи - це поліетиленгліколь. :з»

6. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1 - 5, яка відрізняється тим, що ліпосоми є кон'югованими з білками, які зв'язуються з рецептором.

7. Кон'югаційна система за п. 6, де згадані білки, які зв'язуються з рецептором, є моноклональними або - 15 поліклональними антитілами, або фрагментами або конструктами антитіл, або фолатом.

8. Кон'югаційна система за п. 6, яка відрізняється тим, що ліпосоми є кон'югованими з антитілами класу (ЯМ (95) або Ід або фрагментами або конструктами з цих класів антитіл.

-

9. Кон'югаційна система за п. 6, яка відрізняється тим, що ліпосоми є кон'югованими з антитілами класу (ЯМ або дб або фрагментами або конструктами з цих класів антитіл, де антитіла, фрагменти або конструкти є (о) 20 міченими фолатом та радіоізотопом, або сумішшю різних радіоізотопів. о

10. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1 - 9, яка відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти антитіл, кон'юговані з ліпосомами, є мишачими, химерними або людськими, моноклональними або поліклональними.

11. Кон'югаційна система за п. 10, яка відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти антитіл 59 є міченими фолатом, при цьому антигензв'язувальний центр антитіла спрямований на білок, що зв'язує фолат. ГФ)

12. Кон'югаційна система за п. 10, яка відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти антитіл ГФ є міченими фолатом, при цьому антигензв'язувальний центр антитіла спрямований на антиген, відмінний від білка, що зв'язує фолат. во

13. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1 -12, яка відрізняється тим, що радіоїзотоп є важким альфа-випромінювачем та/або 272 Рр як генератор ж випромінювач 22Ві, який вибирається З 211д 2128Ві, 213Ві, г12рр, 225Дс, 223Ка, 224ра та 221 ТІ,

14. Кон'югаційна система за будь-яким з пп. 1-13, яка відрізняється тим, що дочірній ізотоп та материнський ізотоп є 212Ві та "2рРрбр, відповідно. 65

15. Спосіб одержання міченої радіоіїзотопами кон'югаційної системи, який відрізняється тим, що ліпосоми з іонофорами та хелатором придатної концентрації надійно мітять радіоізотопами, які є важкими випромінювачами альфа-частинок, шляхом змішування розчину, який містить радіоїзотоп або суміш радіоізотопів, які випромінюють альфа-частинки, або 212РЬ як генератор альфа-випромінювач 2"2Ві, з розчином, який містить ці ліпосоми, та інкубування при підвищеній порівняно з фізіологічною температурою з досягненням переміщення радіоізотопу(-ів) у ліпосоми.

16. Спосіб за п. 15, який відрізняється тим, що хелатор вибирається з групи, яка містить 1,4,7,10 тетраазациклододекан-1,4,7,10 М, М, М", М"-тетраоцтову кислоту (РОТА), 1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 М, М, М", М"-тетраоцтову кислоту 70 (ТАТА), 1,4,7,10 тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10 М, М, М", М'"-тетраоцтову кислоту (ТЕТА), 1,4,7,10 тетраазациклододекан-1,4,7,10 М, М', М", М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту (ООТМР), 1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 М, М', М", М'"-тетра(метилен)фосфонову кислоту, 1,4,7,10 тетраазациклотетрадекан-1,4,7,10 М, М, М", М"- тетра(метилен)фосфонову кислоту, діетилентриамін М, М, М" пентаоцтову кислоту та її ізомерні похідні, криптат (2,2,2), криптат ІЗ,2,21), криптат (2,2,1)|) та їхні моно- та ди-бензо-похідні, з'єднані місточковим зв'язком каліксІЧарени, що містять багаті електронами (донорські) групи (гідроксил, карбоксил, естер, амід, амін), 1710 діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10 М, М біс-оцтову кислоту та 1710 діаза-4,7,13,16-тетраоксациклооктадекан-1,10 М, М' біс-малонат.

17. Спосіб за будь-яким з пп. 15 або 16, який відрізняється тим, що ліпосоми містять активовані групи у мембрані, які надають можливість кон'югації з білками або іншими спорідненими до рецепторів молекулами.

18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що активовані групи - це поліетиленгліколь.

19. Спосіб за будь-яким з пп. 15 - 18, який відрізняється тим, що ліпосоми кон'югують з білками, які зв'язуються з рецептором. с

20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що згадані білки, які зв'язуються з рецептором, є моноклональними або поліклональними антитілами, або фрагментами або конструктами антитіл, або фолатом. і)

21. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що ліпосоми кон'югують з антитілами класу (ОМ або до або фрагментами або конструктами з цих класів антитіл.

22. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що ліпосоми кон'югують з антитілами класу (ЯМ або ДС або с фрагментами або конструктами з цих класів антитіл, де антитіла мітять фолатом та радіоізотопом або сумішшю різних радіоізотопів із застосуванням стандартних процедур для мічення антитіл фолатом та радіоізотопами. о

23. Спосіб за будь-яким з пп. 15-22, який відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти (че антитіл, кон'юговані з ліпосомами, є мишачими, химерними або людськими, моноклональними або поліклональними. о

24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти антитіл мітять - фолатом, при цьому антигензв'язувальний центр антитіла спрямований на білок, що зв'язує фолат.

25. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що антитіла або фрагменти або конструкти антитіл мітять фолатом, при цьому антигензв'язувальний центр антитіла спрямований на антиген, відмінний від білка, що « зв'язує фолат.

26. Спосіб за будь-яким з пп. 15-25, який відрізняється тим, що радіоїзотоп є важким альфа-випромінювачем ЩО с або "2рРь як генератор А-випромінювач 72ВІ, "з який вибирається з дк, 212Ві, 21ЗВі, 712рр, 225дАс, 223ра, 221ра та 221ТН, "

27. Спосіб за будь-яким з пп. 15-26, який відрізняється тим, що дочірній ізотоп та материнський ізотоп є 212Ві та 212рр, відповідно.

28. Застосування кон'югаційної системи за будь-яким з пп. 1 - 14 для одержання фармацевтичного розчину, і придатного для введення шляхом ін'єкції або інфузії ссавцям, у тому числі людям. оз

29. Застосування за п. 28 для одержання фармацевтичного розчину, придатного для введення шляхом з ін'єкції або інфузії ссавцям, у тому числі людям, шляхом внутрішньовенної ін'єкції, та/або місцево, та/або шляхом введення у пухлину. Ге») 20

30. Застосування за п. 28 у комбінації з радіоактивним імунокон'югатом або декількома радіоактивними імунокон'югатами, та/л"або іншими формами променевої та фармацевтичної терапії, хіміотерапії, дистанційної с променевої терапії або хірургії для лікування ракових хвороб.

31. Застосування кон'югаційної системи у відповідності з будь-яким з пп. 1 - 14 для влучання у клітини, що експресують рецептори, які вибирають з білка, що зв'язується з фолатом, естрогенного рецептора, тестостеронного рецептора та/або різних антигенів моноклональних антитіл, для ін'єкції людським суб'єктам для ГФ) доставки потенційно терапевтичної радіації у ракові клітини, що експресують цей(-ї) рецептор(-и).

32. Застосування кон'югаційної системи у відповідності з будь-яким з пп. 1 - 14 для ін'єкції людським о суб'єктам для доставки потенційно терапевтичної радіації у ракові клітини, що експресують рецептор(-и), де ракова тканина - це пухлина головного мозку, легенів, шийки матки, яєчників або молочної залози, або лейкоз, бо лімфома, або злоякісна меланома.

33. Набір для одержання кон'югаційної системи у відповідності з будь-яким з пп. 1 - 14, який відрізняється тим, що він містить пробірку, яка містить ліпосомний розчин, та пробірку, яка містить радіоіїзотоп у розчині, які можна змішати для здійснення мічення радіоізотопами.

34. Набір для одержання кон'югаційної системи у відповідності з будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється бо тим, що він містить пробірку, яка містить ліпосомний розчин, та другу пробірку, яка містить радіоіїзотоп у розчині, та третю пробірку, яка містить споріднену до рецептора молекулу, які можна змішати для здійснення мічення радіоізотопами та мічення молекулою, спорідненою до рецептора. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «в) (Се) «- (зе) і - -

с . и? -І (95) - ФО (42) іме) 60 б5