JP3571335B2 - リポゾームマイクロレシーバー組成物および方法 - Google Patents

Description

1. 産業上の利用分野
本発明は、治療学的化合物を長期間に渡って血流に投与するためのリポゾームおよび方法に関する。
2. 参考文献

3.背景技術
バイオテクノロジーの最近の進歩に伴って、医薬用ペプチドまたはタンパク質の開発が薬理工業の必須部分となりつつある（Lee,1986,1988）。いくつかの治療用のタンパク質が組換DNA技術により上首尾に製造されており、例えばヒト成長ホルモン、ヒトインスリン、α−インターフェロン、インターロイキン−２、TPAおよび種々のタンパク質ワクチンであり、これらの全ては現在市販されている（Banga）。経口投与が一般に治療学的応答しないので、非経口経路が好ましい。しかしながら、非経口投与する際に、ほとんどのペプチドおよびタンパク質は、血流中で極めて短時間の寿命、代表的には２時間未満の寿命しか有していないので、多量の投与および多数の一日の接種または注入を必要とする。屡、利用する治療学的摂取は、医薬に近い管理を必要とし、そして適用するほとんどの患者について異なっている。
リポゾームが静脈内（IV）投与された化合物のキャリヤーとして提案されている。しかしながら、リポゾーム包含部の血流へのゆっくりとした放出のためにリポゾームを使用することは、細網内系（RES）の細胞により血流からのリポゾームの迅速なクリアランスにより過酷に制限れている。代表的にはRESは、１時間以内でIV接種リポゾームの80〜95％を除去し、そして４〜６時間以内で血流から循環するリポゾームを有効に除去する。
リポゾームのRES取込み速度を影響する手記の因子が報告されている（例えば、Gregoriadis,1974;Jonah;Gregoriadis,1972;Juliano;Allen,1983;Kimelberg,1976;Richardson;Lopez−Berestein;Allen,1981;Scherphof;Gregoriadis,1980;Hwang;Patel,1983;Senior,1985;Allen,1983;Ellens;Senior,1982;Hwang;Ashwell;Hakomori;Kaelsson;Schauer;Durocher;Greenberg;Woodruff;Czop;およびOkada）。要するに、リポゾームサイズ、チャージ、リポイド飽和の程度および表面部分が全てRESによってリポゾームクリアランスに関連している。しかしながら、今までに同定された単一因子が長い血液寿命を提供するのに有効でなく、そして特にIV投与の後一日以上の血流で比較的に高いパーセンテージのリポゾームを提供するのに有効でない。
血流中の好適な長いリポゾーム寿命とする１つの因子は、小さいリポゾームサイズ、代表的には小さい非ラメラー小嚢（SUV）の範囲、少なくとも0.03ないし0.07ミクロンである。しかしながら、SUVの静脈内容量は、治療有効投与範囲内でのペプチドまたはタンパク質での富化SUVが親投与に実際的でない範囲に制限されてしまう。
4. 発明の開示
従って、本発明の目的は、血流中で延長された期間の治療用化合物を投与するためのリポゾームおよび方法を提供することである。
本発明の一実施態様において、本発明は、治療学的有効量で静脈内投与できかつ約４時間未満の寿命で血流中に遊離形態でクリアし得る治療用化合物の有効活性の期間を少なくとも24時間に延長するリポゾーム組成物を包含する。かゝる組成物は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし20モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ii）約0.1ないし約0.4ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびかゝる治療学的に有効量の少なくとも３倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物からなる。かゝる組成物は、遊離形態での化合物の治療学的に有効投与量の少なくとも３倍のリポゾーム−包含化合物の量を含有する投与量で静脈内投与するのに意図される。
一つの好ましい実施態様において、親水性ポリマーは、約1000ないし5000ドルトンの分子量を有するポリエチレングリコールであり、そしてポリマーは、ホスホリポイド、例えばホスファチジルエタノールアミン（PE）の極性頭基で誘導される。変わりに、ポリマーは、その他の好適な生体適合性親水性ポリマー、例えばポリ乳酸およびポリグリコール酸であることができる。
別の好ましい実施態様において、組成物は、組成物は、治療学的有効量で静脈内投与することができる静脈内接種されたポリペプチドの治療活性を少なくとも48時間に延長するのに有効である。このポリペプチドは、ペプチドまたはタンパク質、例えばスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（TNF−アルファ、ベータ）、コロニー刺激因子（Ｍ−CSF（マクロファージ）、Ｇ−CSF（顆粒細胞）、GM−CST（顆粒細胞、マクロファージ）、TPAプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ、HIV−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン、エリスロポイエチン（EPO）、第VIII因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）、ソマトメジンＣ（IGF−１）およびリボソーム禁止タンパク質等であることができ、そしてこのものは静脈内投与した際に、治療学的に活性である。バスコプレシンがそうであるようにポリペプチドがピコグラム／ナノグラムで活性であるが、組成物は、ペプチドの治療学的に有効量を５ないし10日間の間血流中にデリバーリーするのに有効である。
さらに本発明の形成部分は、治療学的に活性量で静脈内投与し得、そして約４時間未満の半減期を有する治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも24時間まで延長する方法である。この方法において、上記の種類のリポゾーム組成物を治療学的に有効量の少なくとも３倍である化合物の量を含有する投与量で対象物に静脈内投与する。
更に、治療学的に有効量で静脈内投与できる治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間延長するのに有効なリポゾーム組成物を記載する。かゝる組成物は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし20モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ii）約0.07ないし約0.15ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾーム、およびかゝる治療学的に有効量の少なくとも10倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与で静脈内投与するためのリポゾーム包含形態の化合物からなる。かゝる組成物は、治療学的に有効量の少なくとも10倍であるリポゾーム包含化合物の量を含有する投与量で皮下投与することを意図している。
かゝるリポゾーム組成物は、治療学的に活性量で治療学的化合物、好ましくはポリペプチドの放出期間を少なくとも２週間の間延長する方法に使用される。
別の実施態様において、本発明は、ポリ乳酸またはポリグリコール酸で誘導された小嚢形成性リポイドおよび極性頭基を有する小嚢形成性リポイド並びにリポイドの頭基に誘導されるポリ乳酸またはポリグリコール酸部分からなるリポイド組成物からなる。
本発明のこのれのおよびその他の目的および特徴は、以下に詳述する本発明の明細書を添付図面を参照して読むと充分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、小嚢形成性リポイドアミンをポリアルキルエーテルで誘導する一般的反応機構を説明し；
図２は、ポリエチレングリコールで塩化シアヌル結合剤を介して誘導されたホスファチジルエタノールアミン（PE）を調製する反応機構を説明し；
図３は、ジイミダゾール活性化試薬によりポリエチレングリコールで誘導されたホスファチジルエタノールアミン（PE）を調製する反応機構を説明し；
図４は、トリフルオロメタンスルホネート試薬によりポリエチレングリコールで誘導されたホスファチジルエタノールアミン（PE）を調製する反応機構を説明し；
図５は、ペプチド（Ａ）、エステル（Ｂ）およびジサルファイド（Ｃ）結合によりポリエチレングリコールで誘導された小嚢形成性リポイドを説明し；
図６は、ポリ乳酸で誘導されたホスファチジルエタノールアミン（PE）を調製する反応機構を説明し；
図７は、異なる量のホスファチジルグリセロールを含有するPEG−PEリポゾームに関するIV接種後の時間の関数としてパーセント接種投与量に関して示される血液中のリポゾーム保持時間のプロットであり；
図８は、支配的な不飽和ホスホリポイド成分からなるリポゾームの血液における保持時間を示す図７と同様なプロットであり；
図９は、PEG−リポゾーム（黒三角）および従来のリポゾーム（黒丸）の血液における保持時間を示す図７と同様なプロットであり；
図10は、0.1ミクロン（黒四角）、0.2ミクロン（黒丸）および0.4ミクロン（黒三角）ポリカーボネート膜による排出によってサイジングされたPEG−リポゾームの血液寿命のプロットであり；
図11は、ポリ乳酸（黒四角）およびポリグリコール酸（白三角）で誘導された小嚢形成性リポイドを含有するリポゾームおける保持時間のプロットであり；
図12は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、0.2μｇ（黒四角）、0.8μｇ（黒三角）および２μｇ（黒丸）の全投与量でのバスコプレシンの水溶液の投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示し；
図13は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および24μｇ（黒丸）全投与量で包含されたバスコプレシンを含有するPEG−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示し；
図14は、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）、２μｇ（黒四角）、８μｇのバスコプレシンおよび33％（黒丸）、16％（黒三角）および０％（黒四角）のリポゾーム中のコレステロールのモルパーセントを含有するPEG−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示し；
図15は、遊離マクロファージ−コロニー刺激因子（Ｍ−CSF）（黒三角）、30モル％のコレステロールを含有するPEG−リポゾーム（黒三角）およびPEG−リポゾームに関連するＭ−CSFの血液クリアランス運動を示し；
図16は、遊離Ｍ−CSF（黒三角）、コレステロールのないPEG−リポゾーム（黒三角）およびPEG−リポゾームに関連するＭ−CSFの血液クリアランス運動を示し；
図17は、30（黒丸）および０（黒三角）モル％コレステロールを含有するPEG−リポゾームからの血中へのＭ−CSFの放出％のプロットであり；そして
図18Aは外科手術および生理食塩水（対照、白丸）および２μｇ（黒三角）、25μｇ（黒丸）および50μｇ（黒ダイアモンド）の量での遊離バスコプレシンの皮下投与後の予備投与量のパーセンテージとしてのラットにおける尿放出量を示し；
図18Bは、外科手術および生理食塩水（対照、白丸）および25μｇ（黒三角）、100μｇ（黒丸）および400μｇ（黒ダイアモンド）の量でのPEG−リポゾームに包含されたバスコプレシンの皮下投与後の予備投与量のパーセンテージとしてのラットにおける尿放出量を示す。
発明の詳細な説明
I. 誘導リポイドの調製
図１は、小嚢形成性リポイドアミンをポリアルキルエーテル（PEG）、ポリ乳酸およびポリグリコール酸（これらの全ては速やかに水に溶解し、小嚢形成性リポイドと結合でき、そして毒性効果なしで生体内耐性を有する）で例示される生体適合性親水性ポリマーで誘導する一般的反応機構を示す。利用する親水性ポリマー、例えばPEGはその末端でメトキシ、エトキシまたはその他の非反応性基でによりキャップされているのが好ましく、あるいは一端が他端より反応性であるもの、例えばポリ乳酸が好ましい。
このポリマーは、以下に記載するような好適な活性化剤、例えばシアヌル酸、ジイミダゾール、無水試薬等との反応により一端において活性化される。活性化された化合物をついで小嚢形成性リポイド、例えばホスファチジルエタノールアミン（PE）と反応させて誘導リポイドを製造する。
別法として、小嚢形成性リポイドにおける極性基をポリマーとの反応について活性化させてもよくあるいは２つの基を公知のカップリング方に従って一致したカップリング反応で結合してもよい。メトキシまたはエトキシ基で一端においてキャップされたPEGは、種々のポリマーサイズ、例えば500ないし20,000ドリトン分子量で工業的に得ることができる。
小嚢形成性リポイドは、２個の炭化水素鎖、代表的にはアシル鎖および極性頭基を有するものが好ましい。この種に属するものは、ホスホリポイド、例えばホスファチジルコリン（PC）、PE、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルイノシトール（PI）およびスフインゴミエリン（sphingomyelin）（SM）であり、但し、２つの炭化水素が炭化水素鎖において代表的に約14ないし22炭素原子を有するものであり、そして種々の置換度を有している。また、この種に属するものは、グリコリポイド、例えばセレブロサイドおよびガングリオサイドである。
利用できる別の小嚢形成性リポイドは、コレステロールおよび関連ステロール類である。一般に、コレステロールは、リポイドバイレイヤー膜に固くアンカーすることができず、代表的に高分子量ポリアルキルエーテルで誘導された際に固くアンカーすることができず、従って血流中でRESのリポゾームリポゾーム回避を促進するのに有効でない。
より一般にそして本明細書で定義されるように、「小嚢形成性リポイド」は、疎水性および極性頭基部分を有し、そして（ａ）ホスホリポイドに例示されるようにそれ自身水中でバイレイヤー膜中で自然に形成することができ、あるいは（ｂ）ホスホリポイドリポイドと組み合わせて、その親水性部分がバイレイヤーの内部の疎水性領域に接触しそしてその極性部分が膜の外部の極性表面に配向してリポイドバイレイヤーに安定に取り込まれる両性リポイドを包含するつもりである。後者の種類の小嚢形成性リポイドの例は、コレステロールおよびコレステロール誘導体、例えばコレステロールスルフェートおよびコレステロールヘミサクシネートである。
本発明の一つの重要な特徴によると、小嚢形成性リポイドは、比較的に流動性のあるリポイドであり、これはリポイド相が比較的低い液／液結晶相移動温度例えば室温または比較的剛性にリポイドを有していることを意味し、かゝるリポイドが比較的に高い融点、例えば50℃までを有していることを意味する。一般に、剛性であればあるほど、すなわち、飽和リポイドは、リポイドバイレイヤー構造における膜剛性により寄与し、そして血清におけるバイレイヤー安定性により寄与する。その他のリポイド、例えばコレステロールも、バイレイヤー構造における膜剛性および安定性に寄与することが知られている。アシル基が種々の程度の飽和度を有するホスフォリポイドが工業的に得ることができ、あるいは発行された方法に従って調製できる。
図２は、塩化シアヌル基によりPEGをPEに誘導するPE−PEG−リポイドを製造する反応機構を示している。反応の詳細は、例１に与えられている。要約すると、メトキシキャップされたPEGを、図に示された活性化PEG化合物IVを製造した条件下に炭酸ナトリウムの存在下に塩化シアヌルで活性化する。この物質は、精製されて未反応のシアヌル酸を除去する。活性化PEG化合物をトリエチルアミンの存在下にPEと反応させて図中VIIで示された所望のPE−PEGを製造する。収率は、PEGの最初の量に関して８〜10％である。
最前に記載された方法をPE、コレステリルアミンおよび蔗糖アミン基を有するグリコールリポイドを包含する種々のリポイドアミンに適用できる。
ポリアルキルエーテルをカップリングする第２の方法、例えばPEGをリポイドアミンでキャップする方法を図３に記載する。ここで、キャップされたPEGをジイミダゾールカップリング試薬で活性化して図３中Ｘで示される活性化されたイミダゾール化を形成する。リポイドアミン、例えばPEとの反応は図中XIで示されるようなアミド結合によるリポイドへカップリングするPEGを導く。この反応の詳細は、例２に記載している。
キャップされたポリアルキルエーテルをリポイドアミンへカップリングする方法を図４に示す。ここで、PEGをまずそのOH末端においてトリメチルシラン基で保護する。末端保護反応は、図中Ａで示され、そしてトリメチルシリル黒とPEGとのトリメチルアミンの存在下での反応を包含する。保護されたPEGを次いでトリフルオロメチルスルホネートの無水物（図４中XVI）を反応させてトリフルオロメチルスルホネートで活性化されたPEG化合物を形成する。この活性化した化合物とリポイドアミン、例えばPEとのトリメチルアミンの存在下での反応により、リポイドアミンがポリエーテルポリマー中の末端メチレン炭素によりポリエーテルにカップリングされた所望の誘導されたリポイド、例えばPEG−PE化合物が得られる。トリメチルシリル保護基は、図中Ｈ＋で示されるように酸処理によりあるいは第４アミンフロライド塩、例えばターシャリーブチルアミンとの反応により放出できる。
最前に記載したものに加えて種々の公知のカップリング反応がPEG等の親水性ポリマーで誘導された小嚢形成性リポイドを調製するのに好適であることが明らかであろう。例えば、図４に示したスルホネート無水物カップリング剤を使用して両性リポイドのヒドロキシル基、例えばコレステロールの5'−OHにポリアルキルエーテルを接合することができる。その他の反応性リポイド基、例えば酸またはエステルリポイド基を公知のカップリング法に従ってカップリングに使用することもできる。例えばホスファチジン酸の酸基を活性化して好適な酸無水物、例えば無水酢酸により活性リポイド酸無水物を形成でき、次いで反応性リポイドをイソチオシアネート試薬の存在下での反応により保護されたポリアルキルアミンに接合できる。
別の実施態様において、誘導されたリポイド成分を調製して不安定なリポイド−ポリマー結合、例えばペプチドエステルまたはジサルファイド結合を包含することができ、そしてこのものは選択的生理学的条件下に、例えば血流中に存在するペプチダーゼまたはエステラーゼ酵素の存在下に分裂することができる。図５は、結合を含有する（Ａ）ペプチド、（Ｂ）エステルおよび（Ｃ）ジサルファイドにより結合された例示的なリポイドを示す。ペプチド結合化合物を、例えばまずポリアルキルエーテルを図示したトリペプチドのＮ−末端アミンと、例えば図３に示した反応によりカップリングすることによって調製できる。次いで、ペプチドカルボキシル基を従来のとおりカルボジイミドカップリング試薬によりリポイドアミン基にカップリングすることができる。エステル結合化合物を、例えば無水カップリング剤を介してアルコールを使用してリポイド酸、例えばホスファチジン酸をポリアルキルエーテルにカップリングすることによって調製できる。別法として、内部エステル結合および好適な末端基、例えば第１アミン基をを含有する短結合フラグメントを使用してアミドまたはカルバメート結合を介してポリアルキルエーテルを両性リポイドにカップリングすることができる。同様にして、結合フラグメントは、図５中のＣで示される化合物を形成するのに使用される内部ジサルファイド結合を含有してもよい。
図６は、PEによるポリ乳酸の誘導方法を示す。例４に記載の如くポリ乳酸を、PEの存在下にジシクロヘキシルカルボイミド（DCCI）と反応させる。同様にして、ポリグリコール酸で誘導された小嚢形成性リポイドを、例４に詳述の通り好適なカップリング剤、例えばDCCIの存在下にポリグリコール酸またはグリコール酸とPEとの反応により形成することができる。ポリ乳酸またはポリグリコール酸のいずれかで誘導された小嚢形成性リポイド本発明の一部を形成する。本発明の形成部分はまた、１ないし20モル％で誘導されたリポイドを含有するリポゾームである。
II. リポゾーム組成物の調製
本発明のリポゾームを形成するのに衣装スルホン酸リポイド成分は種々の小嚢形成性リポイドから選択することができ、代表的にはホスホリポイドおよびステリールを包含する。明らかなとおり、本発明のリポゾームの一つの要件は、長い血液循環寿命である。従って、血液寿命に対するリポイド成分の効果を評価するのに使用できる標準化された尺度を確立することが有効である。
生体内リポゾーム循環時間を評価するのに使用される一つの方法は、血流中のIV接種されたリポゾームの分散および接種後の選択された時間でのRESの一次器官を測定する。本明細書において使用される標準化モデルにおいて、RES取込みが血流中の全リポゾームとRESの主要器官である肝臓および脾臓における中の全リポゾームととの比率によって測定される。実際には、年令を性が合ったマウスを放射線標識されたリポゾーム組成物で尾静脈により静脈内接種（IV）し、各時間点を、全ての血液および肝臓および脾臓を一緒にした放射線標識カウントを例６に詳述するように測定することによって測定される。
肝臓および脾臓がRESによるリポゾームの最初の取込みの略100％を示すので、最前に記載した血液/RES比は、生体内における血液からRESへの取込みの範囲の良好な近似値を提供する。例えば、約１またはそれ以上の比率は、血流中に存在する接種リポゾームの有為性を示し、そして約１未満の比率は、RES中のリポゾームの有為性を示す。興味あるリポイド組成物のほとんどに関して、血液/RES比は、１、２、３、４および24時間において測定された。
本発明のリポゾームは、１ないし20モル％の第Ｉ節に記載された親水性ポリマーで誘導された小嚢形成性リポイドを包含する。本発明の一実施態様によると、これらのリポゾームの血循環寿命は、ほとんどリポゾームを構成するホスホリポイドの飽和度に依存する。すなわち、ホスホリポイド成分は、主として流動性の比較的に不飽和アシル鎖またはより飽和された剛性化アシル鎖から構成することができる。本発明の特徴は、例７に記載されており、この例は種々の飽和度を有するPEG−PE、コレステロールおよびPC（表４）を用いて形成されたリポゾームにおける血液/RES比を検査している。表５のデータから分かるように、高い血液/RES比がバルクPC、PCホスホリポイドのリポイド不飽和の範囲に無関係に実質的に全てのリポゾーム処方で達成されそしてリポイド飽和度の関数としての合成トレンドは観察されなかった。
従って、小嚢形成性リポイドを選択して選択された流動度または剛性を達成し、血清中のリポゾームの安定性および血清および／または腫瘍におけるリポゾームからの包含された薬剤の放出の割合を調節することができる。また、小嚢形成性リポイドをリポイド飽和特性において選択して所望のリポゾーム調剤性質を達成することができる。例えばより流動性のリポイドがより剛性のリポイド成分よりも排出またはホモジネーションにより配合およびダウンサイズし易いということが一般の場合である。一般に、より流動性のリポイド（低い移動温度）が血流における高い化合物放出割合ゆえに好ましい。
同様にして、リポゾーム中のコレステロールのパーセンテージが観察された血液/RES比に対する著しい影響なしに広い範囲にわたって変化できるということも見出した。例8Aに提出した研究は、そこに記載の表６に関して、０ないし30モル％のコレステロールの範囲において実質的に血液/RES比の変化を示さない。
しかしながら、コレステロールおよび関連コレステロール誘導体は、リポゾーム包含治療学的化合物の血流への放出の制御に重要である。例えば例15および16に報告した研究は、包含したポリペプチド（ペプチドまたはタンパク質）の生体外におけるリポゾームからヒト血清または生体内での放出の割合がコレステロール濃度に著しく依存することを示している。高いコレステロール（例えば、30モル％またはそれ以上）を含有するPEG−リポゾームは生体外において血清中の非常に少量のペプチドまたはタンパク質を放出し、一方コレステロールの量が減少すると包含されたポリペプチドの損失の増加をもたらした。同様にして、そして以下に記載するように、静脈内投与されたPEG−リポゾームにおけるコレステロールの増加は、血流中けの包含された化合物の放出の減少をもたらし（例18）、そして生理学的効果の減少をもたらす（例16）。従って、本発明の特徴によると、長い循環リポゾームからの化合物の放出の割合は、リポゾーム中に包含されるコレステロールパーセントにより制御できる。
また、本発明を支持するのに行われた研究において、血液/RES比が帯電リポゾーム成分、例えばホスファチジルグリセロール（PG）の存在によって影響されないことを見出した。これは、4.7モル％PG（三角）または14モル％PG（四角）を含有するPEG−PEリポゾームに対する包含マーカーの損失％をプロットした図７から見出すことができる。24時間の期間にわたる血流中のリポゾーム保持の相違が実質的に観察されなかった。
親水性ポリマーにより誘導された小嚢形成性リポイドは、小嚢形成性リポイドの全モル数の％として誘導されたリポイドのモル数に基づいて約１ないし20モル％の量で存在するのが好ましい。より低いモル比、例えば0.1モル％が巨大分子量ポリマー、例えば100キロドルトンを越える分子量を有するもので誘導されたリポイドに好適であることが分かる。第Ｉ節に記載した通り、誘導されたリポイドにおける親水性ポリマーは、約200ないし20,000ドルトンの分子量を有することが好ましく、そしてより好ましくは約1,000ないし5,000ドルトンである。非常に短いエポキシエーテル部分の血液/RES比に対する効果を検査した例8Bは、約５以上の炭素原子のエーテルのポリエーテル部分が血液/RES比の著しい改良を達成するのに必要とされることを示している。
B. リポゾーム組成物の調製
リポゾームを、種々に技術、例えばSzoka等,1980年に記載の技術により調製することができる。薬剤−含有リポゾームを調製する一つの方法は、Szoka等によりまたは米国特許第4,235,871号明細書に記載された逆相蒸発法である。逆相蒸発小嚢（REV）は、約２ないし４の代表的粒子サイズを有しており、そして主としてオリゴラミラーであり、すなわち一つまたはいくつかのリポイドバイレイヤーシェルを含有する。この方法を例5Aに詳述する。この方法は、一般に包含タンパク質を有するリポゾームを製造するのに好ましく、高い包含効率（50％まで）が可能であり、従ってタンパク質損失または非包含タンパク質の回収および精製の問題が減少される。
マルチラメラー小嚢（MLV）は、単純なリポイド−フィルムヒドレーション技術により形成できる。この操作において、上記に詳述した好適な溶剤に溶解された種類のリポゾーム形成リポイドを容器内で蒸発して薄膜を形成し、次いでこの薄膜を例5Bに詳述するように水性媒体により被覆する。リポイドフィルム水和物は、水和してMLVを形成し、代表的には約0.1ないし10ミクロンである。
本発明の一つの重要な実施態様において、約0.1ないし0.4、好ましくは0.1ないし0.2ミクロンサイズ範囲で選択されたサイズ範囲で実質的に均一なサイズを有する静脈内接種用のリポゾームを調製する。このサイズ範囲のリポゾームは、投与すべき治療学的に活性量を運ぶのに充分高い包含容量を有している。より低いリポゾームサイズにおいて、リポゾーム包含化合物と遊離化合物との比率が低すぎて血流中の必須初期投与レベルを達成せず、あるいは溢出により循環を残すことができない。同時に、0.1ないし0.4ミクロンリポゾームは、以下に記載する通り長い血液循環を与えそして滅菌濾過による滅菌を認めるのに充分小さい。
REVおよびMLVのための一つの有効なサイジング法は、選択された均一な孔サイズ、代表的には0.4、0.2および／または0.1ミクロン孔サイズを有するポリカーボネート膜によるリポゾームの水性懸濁液を排出することを包含する。膜の孔サイズは、製造されるリポゾームの最大サイズに、特に製剤が同一サイズ膜により２倍またはそれ以上排出される場合比例する。このリポゾームサイジングの方法は、以下の例に記載する均一サイズREVおよびMLV組成物を調製すうるのに使用される。より最近の方法は、不斉セラミックフィルターによる排出を包含する。この方法は、1986年２月13日に出願されたリポゾーム排出法と称する米国特許出願番号829,710号明細書に詳述されている。均一化法もリポゾームのダウンサイジングに有効である。
C. 化合物負荷
一実施態様において、本発明の化合物は、血流または投与IVした際に血流において治療学的に活性であるが遊離形態では短い血液半減期、代表的には４時間未満の半減期を有するポリペプチド中への徐放デリバリーに使用される。かゝるペプチドの例として、例えばバスコプレシン、カルシトニン、オキシトシン、ソマトトロピン、ヒト成長因子ホルモン、心房性ナチュレシック因子（ANF）およびインスリン等のホルモン；およびスーパーオキサイドジスムターゼ、グルコセレブロシターゼ、アスパラギナーゼおよびアデノシンデアミナーゼ等の酵素；、インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１、２、３、４、５、６、７）、組織壊死因子（TNF−アルファ、ベータ）およびコロニー刺激因子（Ｍ−CSF（マクロファージ）、Ｇ−CSF（顆粒細胞）、GM−CST（顆粒細胞、マクロファージ）等の免疫調整剤;TPAプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ等の抗凝集剤;HIV−１ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、マラリアワクチンおよびミエローマワクチン等のワクチン；エリスロポイエチン（EPO）、第VIII因子、骨成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板−誘導成長因子、腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）等のその他のポリペプチド（ペプチドおよびタンパク質）、ソマトメジンＣ（IGF−１）およびポークウィードアンチビラルタンパク質およびゲロニン等のリボソーム禁止タンパク質が挙げられる。
本発明に有効なポリペプチドは代表的には約２ないし４時間またはそれ以下のオーダーで比較的に短い血液半減期を有しており、そして血中でピコグラム/mlないしナノグラム/ml濃度範囲で活性である。
上記の通り、別の方法、例えば溶剤注入またはリポイドヒドレーションも利用できるが、ポリペプチドは、リポゾームの逆相エマルジョン製法により受動的に負荷するのが好ましい。リポゾーム形成およびサイジングの後、遊離（未結合）薬剤を、種々の方法例えばゲル濾過またはイオン交換クロマトグラフィーまたはジアフィルタレーションにより除去することができる。代表的には、最終滅菌組成物中の遊離ペプチドの量は、約20％未満であり、好ましくは組成物中の全ポリペプチドの10％未満である。
同時に、包含された化合物は、選択されたリポゾーム投与においてIV投与による遊離形態での治療学的投与として与えられる化合物の量の３ないし20倍の量で存在するのが好ましい。従って、遊離形態でのペプチドの治療学的投与量がIV投与に関して１μｇである場合、選択されたリポゾーム投与量は、３ないし20μｇのペプチドを含有することが好ましい。10〜20％のこの化合物、例えば２〜４μｇを非包含形態で使用できるので、投与できるリポゾームの全量は、遊離化合物の最大許容投与量によって制限できることが明らかである。多量のリポゾームが包含化合物と非包含化合物との高い比率を達成することによって投与できることが明らかである。一般にはこの比率は、リポゾームが多くなり、リポゾーム組成物からの薬剤の遊離が完全になりそして保存の際のリポゾームの安定性が増すにつれて高くなる。
本発明による治療学的デリバリーに有効であるのは、抗バクテリア剤、例えばゲンタマイシン、アミカシン、チネルマイシン、カナマイシンおよびストレプトマイシン、セフォタキシム、セフチゾキシムおよびセフトリアキソンおよび抗微生物剤、例えばAZT（ジドビジン）、DDI（ジデオキシイノシン）、DDC（ジデオキシシチジン）、ガンシクロビア、D4T（ジデヒドロキシデオキシチミジン）、ホスフォノフォルメート、ルバビリンおよびアシクロビアーである。
かゝる化合物は、上記の通り逆蒸発相、リポイドヒロレーション、溶剤注入またはその他のリポゾーム形成法によるリポゾーム形成の際に受動負荷により包含され、そしてゲル濾過等によるサイジングの後に除去される。
別法として、生理学的pHにおいて弱塩基を形成する薬剤をリポゾーム中の高い薬剤濃度でリポゾーム中に活性負荷することができる。薬剤をリポゾーム中に活性負荷する一つの方法は、1988年９月28日に出願した我々の米国特許出願番号第413,037号明細書に記載されている。この方法において、リポゾームは、比較的に高いアンモニウムイオン、例えば0.125Mアンモニウムスルフェートの存在下に調製される。リポゾームを所望のサイズにサイジングした後、リポゾーム懸濁液を処理してリポゾーム膜を横切るインサイド−アウトサイドアンモニウムイオン傾斜を構成する。この傾斜は、媒体、例えば等張グルコース媒体を含有する非アンモニウムによる透析によりあるいはゲル濾過、例えば0.15M NaClまたはKClで平衡化したSephadex G−50カラムにより、外側相におけるアンモニウムイオンをナトリウムまたはカリウムに効率的に置換することによって構成できる。別法として、リポゾーム懸濁液を非アンモニウム溶液で希釈し、それによってアンモニウムイオンの外側相濃度を減じる。リポゾームの内側のアンモニウム濃度は、外側リポゾーム相のものの少なくとも10倍、好ましい少なくとも100ないし1000倍である。
リポゾームを横切るアンモニウムイオン傾斜は順にpH傾斜を構成する。何故なら、アンモニアがリポゾーム膜を横切って放出されそしてプロトンが内部リポゾーム相で補足されるからである。選択された薬剤でリポゾームを負荷するためには、リポゾームの比較的に薄い懸濁液、例えば約50mMリポイドを薬剤の水溶液に混合し、そしてこの混合物を長時間、例えば24時間にわたって室温で平衡化する。ある代表的な実施態様において、25mg/mlのリポイド濃度を有するリポゾームの懸濁液を等しい容量のアントラシクリン薬剤と約10mg/mlの濃度で混合する。インキュベーション期間の終了の際に、この懸濁液を処理して遊離（未結合）薬剤を除去する。
III. 静脈内投与
A. 血流中での延長された寿命
本発明による血流中への延長された化合物放出に対する一つの要件は、IVリポゾーム投与における血流中での延長されたリポゾーム寿命である。血液/RES比における血流中でのリポゾーム寿命の一つの尺度は、上記の通りリポゾーム投与の後に選択された時間で測定した。種々のリポゾーム組成物に関する血液/RES比を例６の表３に記載した。PEG−誘導リポイドの不存在下に、血液/RES比は、0.03またはそれ以下であった。PEG−誘導リポイドの存在下に、血液/RES比は、低分子量PEGについては0.2ないしいくつかの配合については1.7〜４の範囲であり、そのうちの１つはコレステロールを欠いておりそしてそのうちの３つはチャージしたホスホリポイドを欠いている（例えばPG）。
例７の表５に記載したデータは、表３に記載したデータと一致する約1.26ないし3.27の範囲の血液/RES比（２つの低い回収率％を除く）。第II節に記載した通り、血液寿命値は、リポゾームリポイドの飽和度、コレステロールの存在およびチャージしたリポイドの存在に実質的に無関係である。
上記に報告した血液/RES比を表３および５に記載したデータについて使用したものと等しい血液/RES比を使用した本発明者等の米国特許第4,920,016号明細書に報告された血液/RES比と比較できる。上記特許明細書に報告された最良の24時間血液/RES比は、GM₁、飽和PCおよびコレステロールからなる配合について0.9であった。次善の配合物は、約0.5の24時間血液/RES比であった。従って、代表的数多くの最近の処方で得られた代表的４時間血液/RES比は、現在のところ報告されている最良の処方の２倍以上であった。更にまた、GM₁またはHPIリポイドによる高い血液/RES比を達成する能力は、リポゾーム中の主として飽和されたリポイドの存在に依存していた。
血流中のリポゾームマーカーの血漿運動は、本発明のリポゾーム処方によって達成される高揚したリポゾーム寿命のその他の尺度を提供することができる。上記の図７および８は、代表的なPEG−リポゾーム処方における24時間にわたるリポゾームマーカーの損失を示しており、マーカーがリポイドか包含された水溶性化合物であるかには無関係である（図８）。両方のプロットにおいて、リポゾーム接種の後24時間に存在するリポゾームマーカーの量は、元々接種された材料の10％以上である。
図９は、代表的PEG−リポゾーム処方およびPEG−誘導リポイドの不存在下での同一のリポゾームに関する血流からのリポゾーム損失を示している。24時間後、PEG−リポゾームに残存するマーカー％は、約20％以上であり、一方従来のリポゾームは、３時間後に５％未満の保持率であり、そして24時間で実質的にマーカーが検出できなかった。
図７〜９から見出される結果は、種々のリポゾーム処方について測定された24時間血液リポゾーム値と一致し、そして例６〜９の表３および５〜７に記載した。例６の表３から見出されるように、24時間で残存する投与量％は、従来のリポゾームについては１％未満であり、これに対してPEG−リポゾームについては少なくとも５％であった。最良の処方において、約20〜40％の値が得られた。同様にして例７の表５において、24時間後の血中のリポゾームレベル（ここで再び、二つの低い回収値を無視する）は、与えられた全投与量の12ないし約25％であった。同様な結果は、例８の表６および７に報告されている。
血液寿命に対するリポゾームの効果は、0.1ないし0.25ミクロンの選択されたサイズを有する静脈内接種されたリポゾームにおけるリポゾームマーカーの損失を比較することによって研究されていた。実験明細を例10に示す。図10に示した結果は、約10％またはそれ以上のリポゾームマーカーが各リポゾーム処方について24時間後に血中に存在することを示している。従って、全てのリポゾーム製剤が高い血液寿命を示すが、リポゾームサイズを選択して全薬剤放出時間の増加または減少を提供できることも明らかである。
２種類のその他の生体適合性親水性ポリマー、すなわち、ポリ乳酸およびポリグリコール酸で達成されるリポゾーム血液循環の高揚を図11に示す。同図は、皮下リポゾーム接種後24時間の期間の相第のリポゾームマーカーの損失を示す。24時間で残存するマーカの％は、ポリ乳酸に関しては4.3％（黒四角）であり、そしてポリグリコール酸については約６％（白四角）である。これらの値は、24時間後の従来のリポゾームにおいて見出される0.1〜１％保持率（白三角）と比較する。
血液/RES比とモデルアニマル系から得られた血流中のリポゾーム保持時間の両方に関連するデータは、興味あるヒトおよび家畜に外挿入するのは道理にかなっている。何故なら、肝臓および脾臓によるリポゾームの取込みがマウス、ラット、モンキーおよびヒトを含むいくつかの哺乳動物種において同様な速度で生じることが見出されているからである（Gregoriadis,1974;Kimelberg,1976;Juliano,Richardoson;Lopez−Berestein）。この結果は、同様にしてRESによるリポゾーム取込みに最も重要であるらしい生物学的因子（血清リポタンパクによるオプシニゼーション、サイズ−依存取込み効果および表面部分による細胞シールドを包含する）が検査された全ての哺乳動物種の共通の特徴であるということを反映している。
B. 血流中の化合物放出
長時間の長い循環半減期に加えて、本発明のリポゾームのその他の重要な性質は、血流中における治療学的有効投与割合で包含された化合物。を放出する能力である。
上記の通り、0.1ないし0.4ミクロンのリポゾームサイズは、血流中の比較的に低いリポゾーム濃度でさえも血流中のリポゾームの％として有効化合物放出に関してリポゾームにおいて負荷する比較的に高い化合物を認める。投与できるリポゾームの全量が接種組成物中のいくつかの遊離化合物の不可避の存在により制限されるので、このことは重要な内容である。
その他の内容は、血液循環の際のリポゾームから放出されう包含された化合物の能力である。この特徴は、以下の例15に記載した研究に説明されている。ここで、包含されたバスロプレシン（１キロドルトンペプチド）を含有するPEG−リポゾームを、約０ないし約30モル％のコレステロールの濃度を増加して調製した。血清中のリポゾームからのペプチド放出に対する生体外尺度は、コレステロールの量が増加するに従って実質的に少ないペプチド放出を示した。生体内におけるペプチドホルモンの放出速度を、リポゾームの静脈内接種につづいて１〜８時間での減少した尿アウトプットにより測定されたジウレチック効果により測定した。研究の明細を例15に示す。図14に示されるように、尿放出に対する短時間効果は、コレステロール含有率、PEG−リポゾームに依存し、最高のコレステロールが最高のホルモン効果をもたらした。同様にして、リポゾームのIV投与に続いて２〜８時間の間において、最低のコレステロール濃度を有する２種類のPEG−リポゾーム処方は最大ホルモン効果を与え、リポゾームからのより高い放出割合を示す。
例16に報告された研究は、長い循環リポゾームからの巨大タンパク質の放出割合を制御する能力を示している。ここで、包含されたＭ−CSF（55キロドルトンペプチド）を含有するPEG−リポゾームをリポイドおよびタンパク質の両方の血流中の保持％について検査した。図15にプロットしたデータは、30モル％コレステロールを含有するPEG−リポゾーム処方に関するIV接種後24時間のリポゾームリポイド（黒三角）およびタンパク質（黒丸）運動を示す。このデータは、例16に記載の通り24時間にわたり約20％の包含材料の損失を示す。
図17は、コレステロールなしでのPEG−リポゾームに関する同様なプロットを示す。このデータはここで、24時間後Ｍ−CSFの40〜50％ロスを示す。通常化されたリポイドおよびタンパク質マーカーを24時間にわたり選択された時間で比較すると、コレステロールからのタンパク質の放出（黒三角）およびコレステロールのない（黒三角）PEG−リポゾームのプロットが得られる。このプロットは、リポゾームのコレステロール含有率を変化させることによって長い循環リポゾームで得られる著しく異なるタンパク質放出運動を示す。図17に示した別の特徴は、両処方における24時間での放出された最初に接種されたタンパク質の比較的に高い割合（少なくとも３％）である。
IV. 静脈内リポゾーム処理
本発明は、一実施態様において治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも24時間まで延長する方法を包含する。この化合物は、治療学的活性量で静脈内投与できそして遊離形態で約４時間の半減期を有するものである。
この方法の実施に当たって、リポゾーム包含形態で化合物を含有する上記の通りのリポゾーム組成物が提供される。
この組成物は、治療学的有効量の少なくとも３倍、代表的には５〜20倍の化合物の量を含有する有効投与量で対象物に静脈内投与される。従って、例えば化合物の治療学的有効量が10μg/kg体重である場合、リポゾーム組成物は、少なくとも30μｇ化合物/kg体重、代表的には50〜200μｇ化合物/kg体重のリポゾーム投与量で接種される。上記の通り、５〜20％またはそれ以上の化合物が組成物を投与する際に遊離形態であるので、接種できる化合物の量は一般に、遊離化合物の最大許容投与量により制限される。従って、例えば遊離形態での化合物の最大許容量が２μg/kg体重であり、そしてリポゾーム組成物が10％の非包含化合物を含有する場合、与えられるリポゾーム化合物の最大投与量は、20μg/kg体重である。
遊離形態およびPEG−リポゾームに包含された形態でのシトシナラビノサイド（araC）によるマウスにおけるL1210白血病の処理に関する研究は、リポゾーム組成物が、遊離形態での薬物に関して生存の約120％増加に比較してPEG−リポゾーム形態で投与した際に生存の250〜350％増加をもたらしたことを示している。
本発明の方法による数日のオーダーで長い薬物放出時間を達成する能力を例13〜15に報告したIVバスコプレシン投与に対する研究によい説明する。この研究は、バスコブレシン疾患による一般的糖尿病であるBrattleboroラットについて行った。図13は、遊離バスコブレシンの0.2μｇ（黒四角）、0.8μｇ（黒三角）および2.0μｇ（黒丸）の投与レベルでのIV接種の予備投与尿放出％で測定した効果を示す。尿の放出の減少は、最大１日後であるが２日までに対照レベル（黒四角）にまで戻る。
図14は、外科手術および２μｇ（黒四角）、８μｇのバスコプレシンおよび33％（黒丸）、16％（黒三角）および０％（黒四角）のリポゾーム中のコレステロールのモルパーセントを含有するPEG−リポゾームの投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。尿放出の際立った減少が１日以内に観察され、２日までに若干の対照値までのリバウンドがあり、同様にして一部のリポゾーム処方における遊離ペプチドによるものである。加えて、尿放出の際立った減少がIV投与後少なくとも７日の間観察された。長時間の治療学的効果が８μｇ投与で飽和し24μｇでさらなる効果が見出せなかったことを記載する。バスコプレシンの同一の長期間の治療学的効果が図14に示しそして上記の通りに種々の量のコレステロールを含有するPEG−リポゾームにおいて観察された。この図におけるデータは、最高ペプチド放出割合を有する低いコレステロールリポゾームで見出された増加短期間（１〜２日）および減少長期間（２〜８日）効果を説明している。
より一般的には、ピコグラム〜ナノグラム/ml範囲で活性な種々のポリペプチドを本発明の方法により数日の期間にわたって投与することができることが明らかである。図15〜17に示したデータは、例えば（ａ）巨大タンパク質を延長された期間に治療学的量での徐放に関して血流中で差し押さえることができ、そして（ｂ）タンパク質の血流への放出の割合をリポゾーム組成物により選択的に制御できることを示している。
V. 皮下リポゾーム処理
本発明の別の実施態様によると、本発明の長時間の生存するリポゾーム組成物がリポゾーム包含化の皮下（SubQ）部分から血流への徐放にも有効であることが見出されている。特に、３週間またはそれ以上までの治療効果が本発明のリポゾーム組成物の単一皮下接種により達成できることを見出している。
この方法を示すのに使用した実験モデルは、上記のそして例17に詳述したバスコプレシンモデルである。簡単に説明すると、遊離バスコプレシンの皮下接種を包含する処理法が、生理学的効果の期間に関してPEG−リポゾーム中で皮下投与されたバスコプレシンと比較する。図18Aは、２μｇ（黒四角）、25μｇ（黒丸）、50μｇ（黒四角）および100μｇ（黒ダイアモンド）の投与量での遊離バスコプレシンの皮下接種で観察された尿製造の抑制を示している。投与量が高くなると、一日での尿製造の著しい減少が観察され、四日で対照レベル（白丸）へのレバウンドが観察された。
図18Bは、PEGリポゾーム中のペプチドの皮下投与の効果を示す。最小投与量、すなわち25μｇ（黒三角）は約８日まで若干の活性の延長を与えた。100μｇ（黒四角）のバスコプレシン投与量は、約20日までの著しい尿アウトプットの減少を示す。少なくとも24日までのいくぶんか長い効果が400μｇ（黒四角）の投与量で観察された。
バスコプレシンを利用する処理法は、皮下部位からのバスコプレシンの長時間投与によるダイエット療法の処理に意図されている。より一般的には、この方法は、治療学的有効量で皮下投与できる治療学的化合物の有効活性の期間を少なくとも１週間のまで延長することを意図している。この方法は、（ｉ）小嚢形成リポイドおよび親水性ポリマーで誘導された１ないし20モル％の小嚢形成リポイドからなり、そして（ii）約0.07ないし約0.15ミクロンの寸法範囲の選択された平均粒子径を有するリポゾームを利用する。
リポゾーム組成物は、かゝる治療学的に有効量の少なくとも10倍である量のリポゾーム包含化合物を含有する組成物の投与量で皮下投与される。
例えば種々のペプチドおよびタンパク質等のピコグラムないしナノグラム/ml濃度で血流中で活性であるバスコプレシン等の化合物に関して、この方法を数週間にわたって化合物の治療学的デリバリーに使用できる。
本発明のリポゾーム組成物の皮下部位から長期間の治療学的効果を提供する能力は、リンパ球によりこの部位から取り込まれたリポゾームがクファー（Kupfer9細胞を包含する通常のリンパクリアランス機構を上首尾に避けることができることを提案している。この機構は、PEG−リポゾームによるインターパーリショナル（IP）経路によりaraC投与に対する研究により支持される。要約すると、包含されたaraCを含有しそしてIP経路により投与されたPEG−リポゾームがIP経路により与えられた遊離薬剤を用いて生存の約120％の増加と比較して250〜300％の生存の増加をもたらすことを見出した。この結果は、PEG−リポゾームがリンパ球により血流に腹膜から移動することができることを提案している。
以下の実施例は、説明する目的のためであるが、本発明の範囲を制限するためのものではない。
材料
コレステロール（CHOL）は、Sigma（St.Louis,MO）から得られた。シンゴマイシン（SM9、卵ホスファチジルコリン（レクチンまたはPC）、IV30、IV20、IV10およびIV1を有する部分的に水素化されたPC、ホスファチジルグリセロール（PG）、ホスファチジルエタノールアミン（PE）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（PE）、ジパルミトイルPC（DPPC）、ジオレイルPC（DOPC）およびジステアロイルPC（DSPC9は、Avanti polar Lipids（birmingham,AL）またはAustin Chemical Co（Chicago.I1）から得られた。
［¹²⁵I］−チラミニルイヌリンを出版法に従って作製した。⁶⁷ガリウムレートをNEM Neoscan（Boston,MA）より供給した。バスコプレシンおよびマクロファージ刺激因子は、各々Sigma（St.Louis,MO）およびCetus（Emeryville,Ca）から得られた。
例１
塩化シアヌルにより結合されたPEG−PEの調製
A. 活性化PEGの調製
先にPEGと称した２−０−メトキシプロピレングリコール1900−4,6−ジクロロ−1.3.5−トリアジンをJ.Biol.Chem.,252:3582（1977）に記載したとおりに以下の改良を用いて製造した。
塩化シアヌル（5.5g;0.03モル）を10gの無水炭酸ナトリウムを含有する無水ベンゼン200mlに溶解し、そしてPEG−1900（19g;0.01モル）を添加し、そしてこの混合物を室温で一晩攪拌した。この溶液を濾過し、そして600mlの石油エーテル（沸点範囲、35〜60℃）を攪拌しながらゆっくりと添加した。微粉砕された沈澱をフィルター上に回収しそして400mlのベンゼンに再溶解した。5m“LiChrosorb“（E.Merk）のカラム（250×3.2mm）上でヘキサンで展開しそして紫外線検出器で検出する高圧液体クロマトグラフィーにより測定して石油エーテルが残留塩化シアヌルがなくなるまで沈澱および濾過を繰り返した。室温でのpH10.0で緩衝液中の一晩の加水分解後の活性化PEG−1900の硝酸銀による滴定より1.7モルの遊離クロライド/PEGモルが得られた。
生成物のTLC分析をBakerから得られた逆相プレートを用いて、展開剤としてメタノール：水,4:1（v/v）を用いてそして可視化のために沃素蒸気に曝して行った。これらの条件下に、出発メトキシポリグリコール1900は、R_f＝0.54ないし0.60であった。活性化PEGはR_f＝0.41であった。未反応塩化シアヌルはR_f＝0.88であり、そしてこれを除去した。
活性化PEGを窒素について分析し、そして適当な補正を更に合成段階に使用する量の試薬を選定するのに適用した。従って、生成物が理論量のほんの20％の窒素しか含まなかった場合、次の合成段階に使用する材料の量は、100/20または５倍にまで増加した。生成物は理論量のほんの50％の窒素を含有した場合、ほんの100/50または２倍増加が必要とされた。
B. Ｎ−（４−クロロポリグリコール1900）−1,3,5−卵ホスファチジルエタノールアミンの調製
スクリューキャップ試験管中に、0.74mlのクロロホルム中100mg/ml（0.100mモル）卵ホスファチジルエタノールアミンストック溶液を、窒素気流中で蒸発乾固し、そして第Ａ節に記載した活性化PEGの残留物に205mg（0.100mモル）を提供する量で添加した。27ml（0.200mモル）トリエチルアミンをこの混合物に添加し、そして空気を窒素ガスで置換した。
次いでこの混合物を真空下に蒸発乾固し、そして結晶固形分のペースト状の塊が得られた。このこ４容量のアセトンと１容量の酢酸との混合物5mlに溶解した。得られた混合物をシルカゲル（Merk Kieselgel 60,70〜230メッシュ）を充填した21mm×240mmクロマトグラフィー吸収カラムの頂部に配置した。シリカゲルはまずアセトン酢酸80/20;v/vで湿らせておいた。
カラムクロマトグラフィーを同一溶剤混合物で添加し、そして別々の20〜50mlアリコートの溶出液を回収した。溶出液の各部分を展開剤として２−ブタノン／酢酸／水;40/25/5,v/v/vを用いてそして可視化のために沃素蒸気に曝してシリカゲル被覆プレート上でTLCにより分析した。R_f＝約0.79の材料だけを含有するフラクションを一緒にしそして真空下に蒸発乾固した。高真空下での一定重量までの乾燥により86mg（31.2mモル）のほぼ無色の含有−燐Ｎ−（４−クロロポリグリコール1900）−1,3,5−卵ホスファチジルエタノールアミンが得られた。
固形化を24mlエタノール／クロロホルム;50/50クロロホルムに採り、遠心分離して不溶性材料を除去した。透明溶液の真空下での蒸発乾固により21mg（7.62マイクロモル）の無色液体が得られた。
例２
カルバメート結合PEG−PEの調製
A. ポリエチレングリコールメチルエーテル1900のイミダゾールカルバメートの調製
Aldrich Chemical Co.から得られた9.5g（5mモル）のを分子篩上で乾燥した45mlのベンゼンに溶解した。0.89G（5.5mモル）の純粋なカルボニルジイミダゾールを添加した。純度を赤外線スペクトルによりチェックした。反応容器内の空気を窒素で置換した。容器を閉じ、そしてサンドバスで75℃にて16時間加熱した。
この反応混合物を冷却し、そして室温で透明な溶液を形成した。この溶液を50.0mlにドライベンゼンで希釈し、そしてPEGエーテル1900のイミダゾールカルバメートの100マイクロモル/mlストック溶液として冷蔵庫で保存した。
B. ポリエチレングリコールメチルエーテル1900のホスファチジルエタノールアミンカルバメートの調製
10.0ml（1mモル）の100mモル/ml PEGエーテル1900のイミダゾールカルバメートのストック溶液（化合物Ｘ）を10mlナス型フラスコにペペットで移した。溶剤を真空下に除去した。クロロホルム中で3.7mlの卵ホスファチジルエタノールアミン（Ｖ）100mg/ml溶液（0.5mモル）を添加した。溶剤を真空下に除去した。2mlの1,1,2,2−テトラクロロエチレンおよび139マイクロリットル（1.0mモル）のトリエチルアミンIVを添加した。溶液を閉鎖しそしてサンドバス中で95℃にで６時間加熱した。この際に、フラクションについて行ってブタン／酢酸／水;40・５・5;v/v/vを展開剤として使用してSiO₂被覆TLC上での範囲を測定する薄膜クロマトグラフィーを蒸気混合物を行った。I₂蒸気可視化によりほとんどのR_f＝0.68の遊離ホスファチジルエタノールアミンが反応し、そしてR_f＝0.78〜0.80の含燐リポイドに置換されていることを確認した。
残留反応混合物からの溶剤を真空下に除去した。残留物を10ml塩化メチレンに採り、そしてMerk Kieselgel 60,70〜230メッシュ）を充填した21mm×240mmクロマトグラフィー吸収カラムの頂部に配置した。この混合物を以下の溶剤を使用して順にカラムに通した。

溶出液の50ml部分を回収し、そして各部分をクロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム;130・70・８・0.5％;v/v/v/vでの展開の後に可視化用のI₂蒸気吸収を用いてSiO₂上のTLCXにより検定した。ほとんどのホスフェートは、フラクション11、12、13および14に見出された。
これらのフラクションを一緒にし、真空下に蒸発乾固し、そして高真空下に一定重量にまで乾燥した。これによりポリエチレングリコールメチルエーテル1900のホスファチジルエタノールアミンカルバメートの無色ワックス669mgが得られた。これは、263マイクロモルを表しそしてホスファチジルエタノールアミンに基づいて52.6％の収率である。デウテロクロロホルムに溶解した生成物のNMRスペクトルは、デルタ＝3.4ppmにおけるエチレンオキサイド鎖のメチレン基による強いシングレットと一緒に卵PEに関するスペクトルに対応するピークを表した。エチレンオキサイドからのメチレンプロトンとPEアシル基の末端メチルプロンとの比率は、所望の生成物であるポリエチレングリコール接合ホスファチジルエタノールアミンカルバメート,M.W.2,654の分子のポリエチレンオキサイド部分に関して約2000の分子量を確認するのに充分な大きさであった。
例３
エチレン−結合PEG−PEの調製
A. Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールの調製を反応機構3Aに示す。
15.0g（10mモル）のポリエチレングリコールM.Wt1500（Aldrich Chemicl）を80mlのベンゼンに溶解した。1.40ml（11mモル）のクロロトリメチルシラン（Aldrich Chemicl）および1.53ml（1mモル）のトリエチルアミンを添加した。この混合物を室温で不活性雰囲気下に５時間攪拌した。
この混合物を吸引濾過してトリエチルアンモニウムクロライドを分離し、そして結晶を5mlのベンゼンで洗浄した。この溶液を真空下に蒸発乾固して放置すると固化する無色のオイル15.83gを製造した。
展開剤として４容量のエタノールと１容量の水の混合物および沃素蒸気可視化を使用したSi−C₁₈逆そうプレート上での生成物のTLCは全てのポリグリコール（Rf＝0.93）が消費されそしてRf＝0.82の物質で置換されたことを表している。赤外線スペクトルは、ポリグリコールだけの吸収特性を表した。
Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールM.Wt1500の収率は略定量であった。
B. Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルの調製
上記の通りに得られた15.74g（10mモル）の結晶Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールを40mlの無水ベンゼンに溶解し、解砕氷のバス中で冷却した。1.53ml（11mモル）トリエチルアミンおよびAldrich Chemiclから得られた1.85ml（11mモル）のトリフルオロメタンスルホン酸無水物を添加し、そしてこの混合物を不活性雰囲気下に一晩反応混合物が褐色に変化するまで攪拌した。
次いで溶剤を減圧下に蒸発させそして残留シロップ状ペーストを100.0mlに塩化メチレンで希釈した。トリフルオロスルホン酸エステルの反応性が高いので、Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルを更に精製する必要がなかった。
C. Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール1500PEの調製
Ｉ−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルのストック溶液10mlを真空下に蒸発乾固して1.2gの残留物（約0.7モル）を得た。この残留物に372mg（0.5mモル）の卵PEを含有する3.72mlのクロロホルム溶液を添加した。得られた溶液に、139マイクロリットル（1.0mモル）のトリエチルアミンを添加し、そして溶剤を真空下に蒸発した。得られた在留物に、5mlのドライジメチルホルムアミドおよび70マイクロリットル（0.50mモル）トリエチルアミン（IV）を添加した。反応容器からの空気を窒素で置換した。容器を閉鎖しそしれサンドバス中で110℃にて22時間加熱した。溶剤を真空下に蒸発して1.58gの褐色オイルを得た。
Kiesegel 60シリカ70〜230メッシュを充填した21×260mmクロマトグラフィー吸収カラムを調製し、そして40容量のブタン、25容量の酢酸および５容量の水からなる溶剤で濯いだ。粗製生成物を3mlの同一溶剤に溶解し、そしてクロマトグラフィーカラムに移動した。クロマトグラムを同一溶剤で展開し、そして連続的30ml部分の溶出液を各々TLCにより分析した。
TLC検定系は、ブタン／酢酸／水;40/25/5;v/v/vの溶剤組み合わせを用いてシリカゲル被覆ガラスプレートを使用した。沃素蒸気は可視化の役割をした。この溶剤系において、Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール1500PEはRf＝0.78を示した。未変化PEはRf＝0.68であった。
所望のＮ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール1500PEは170〜300ml部分のカラム溶出液に主として一致した。真空下に蒸発乾固すると、これらの部分は、111mgの淡黄色の化合物を与えた。
D. Ｎ−プロピレングリコール1500:ホスファチジルエタノールアミン酢酸脱保護の調製
一度クロマトグラフしたPE化合物を2mlのテトラヒドロフランに溶解した。これに、6mlの酢酸および2mlの水を添加した。得られた溶液を３日間23℃で放置した。反応混合物からの溶剤を真空下に蒸発し、そして一定重量にまで乾燥して75mgの淡黄色のワックスを得た。Si−c18逆相プレート上での４容量のエタノール、１容量の水の混合物で展開するTLCは、いくつかの遊離PEおよびいくつかのポリグリコール状の物資が加水分解の際に形成したことを示した。
残留物を0.5mlのテトラヒドロフランに溶解し、そして3mlのエタノール溶液;80:20;v/vに溶解した。この混合物を、オクタデシル結合シリカゲルを充填した10mm×250mmクロマトグラフィーカラムに適用し、そしてカラムをエタノール水80:20容量％で展開し、連続的20ml部分の溶出液を補正した。この溶出液を逆そうTLCにより検定した。生成物Rf＝0.08ないし0.15の生成物だけを含有するフラクションを一緒にした。これは、代表的には20〜100ml部分のフラクションである。真空下に蒸発乾固すると、これらの部分は出発ホスファチジルエタノールアミンに基づいてほんの３％にしか相当しない33mgの無色ワックスPEG−PEを与える。
NMR分析は、生成物がPE残基およびポリエチレングリコール残基の両方を取込んだが、好適に出現する元素分析にもかかわらずポリグリコール鎖の鎖長が３ないし４エチレンオキサイド残基の還元されていたことを示した。調製された生成物をPEG−PEリポゾームの調製に使用した。
E. Ｎ−ポリエチレングリコール1500P.E.の弗素脱保護による調製
500mgの粗製Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールPEを5mlのテトラヒドロフランに溶解し、そして189mg（0.600ミリモル）のターシャリーブチルアンモニウムフルオライドを添加し、そして溶解するまで攪拌した。反応対を一晩20℃で放置した。
溶剤を減圧下に蒸発させそして残留物を10mlのクロロホルムに溶解し、２開連続して10ml部分の水で洗浄し、そして遠心分離してクロロホルムおよび水相を分離した。クロロホルム相を真空下に蒸発させて390mgの橙褐色のワックスを得、これおを不純Ｎ−ポリエチレングリコール1500P.E.化合物と測定した。
このワックスをmlのクロロホルムに再溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲルの21×270mmカラムの頂部に移した。カラムを100mlの溶剤をカラムに通過させることによって展開した。表２は溶剤使用順序を示す。

カラム溶出液の分離された50mlフラクションを用意した。カラムのフラクションをSi−C18逆相プレート上のTLCの分離した。TLCプレートを１容量の水と混合した４容量のエタノールで展開した。可視化を沃素蒸気への暴露により行った。
Rf＝約0.20の沃素吸収リポイドを含有するフラクションだけを一緒にし、そして真空下に蒸発乾固し、高真空下に一定重量のまで乾燥した。この方法で94mgのワックス状結晶固体がM.W.2226で得られた。デウテロクロロホルムに溶解したこの物質のプロトンNMRスペクトルは、いくつかのポリエチレングリコールに起因するメチレンプロトンと一緒にホスファチジルエタノールアミンによる期待されたピークを示した。（デルタ＝3.7）。
例４
PE−親水性ポリマーの調製
A. PEポリ乳酸の調製
200mg（0.1mモル）ポリ（乳酸）、m.wt.＝2000（ICN,Cleved,Ohio）を2.0mlのジメチルスルホキシドにこの物質を完全に溶解するように攪拌しながら加熱することによって溶解した。次いで、この溶液を直ちに65℃にまで冷却し、そして75mg（0.1mモル）のジステアリルホスファチジルエタノールアミン（Cal.Biochem,La Jolla）および41mg（0.2mモル）のジシクロヘキシルカルノジイミド（DCCI）の混合物に注いだ。次いで、28ml（0.2mモル）のトリエチルアミンを添加し、空気を窒素ガスにより管から除去し、この管をキャップし、そして65℃で48時間加熱した。
この時間の後、管を室温にまで冷却し、そして6mlのクロロホルムを添加した。クロロホルム溶液を三回連続して6ml容量の水で洗浄し、各洗浄の後に遠心分離し、そして相をパスツーリュピペットで分離した。残存するクロロホルム相を吸引下に濾過して懸濁したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを除去した。濾液を真空下に乾燥して212mgのセミ結晶固形分を得た。
この固形分を４様容量のエタノールと１容量の水との混合物15mlに溶解し、H⁺Dowex50カチオン交換樹脂の50mm深さおよび21mm直径ベットに通過させ、そして100mlの同一溶剤で洗浄した。
濾液を蒸発簡乾固して131mgの無色ワックスを得た。291mgのかゝるワックスを2.5mlのクロロホルムに溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲルの21mm×280mm×カラムの頂部に移した。クロマトグラムをカラムに連続して各々100mlの
100％ クロロホルム, 0％（メタノール中１％NH₄OH）
90％ クロロホルム 10％（メタノール中１％NH₄OH）
85％ クロロホルム 15％（メタノール中１％NH₄OH）
80％ クロロホルム 20％（メタノール中１％NH₄OH）
70％ クロロホルム 30％（メタノール中１％NH₄OH）
を通過させることによって展開した。
各25ml部分の溶出液を保存し、そしてSF₂−被覆プレート上でCHCl₃、CH₃OH、H₂O、濃NH₄OH:130:70:8:0.5を展開剤として使用し、そして可視化のためにI₂蒸気吸収を使用してTLCにより検定した。275〜325ml部分のカラム溶出液は、Rf＝0.89のPO₄＋単一物質を含有していた。一緒にしそして蒸発乾固すると、319mgの無色ワックスがえられた。
ホスフェート分析は、おそらく115000の分子量と一致した。明らかに、ポリ（乳酸）の重合がこれがホスファチジルエタノールアミンと反応した割合に匹敵する割合で生じた。
B. DSPEのポリ（グリコール酸）アミドの調製
266mg（3.50mモル９グリコール酸、745mg（3.60mモル）ジシクロヘキシルカルボジイミド、75mg（0.10mモル）ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、32マイクロリットル（0.23mモル）トリエチルアミンおよび5.0ml乾燥ジメチルスルホキシドの混合物を75℃で窒素雰囲気下に加熱し、室温に冷却し、次いで等量のクロロホルムで希釈し、次いで三回連続して等量の水で洗浄してジメチルスルホキシドを除去した。遠心分離およびパスツールピペットによる分離を各々行った。
クロロホルム相を吸引濾過して少量の懸濁物質を除去し、そして濾液を真空蒸発乾固して527mgの淡琥珀色ワックスを得た。
この物質を2.5mlのクロロホルムに再溶解し、そしてクロロホルムで湿らせたシリカゲル（Merck Hieselgel 60）の21mm×270mmカラムの頂部に移した。
クロロホルムをカラムに連続して各々100mlの
100％ クロロホルム, 0％（メタノール中１％NH₄OH）
90％ クロロホルム 10％（メタノール中１％NH₄OH）
85％ クロロホルム 15％（メタノール中１％NH₄OH）
80％ クロロホルム 20％（メタノール中１％NH₄OH）
70％ クロロホルム 30％（メタノール中１％NH₄OH）
を通過させることによって展開した。
各25ml部分の溶出液を回収し、そしてSF₂−被覆プレート上でCHCl₃、CH₃OH、H₂O、濃NH₄OH:130:70:8:0.5を展開剤として使用し、そして可視化のためにI₂蒸気吸収を使用してTLCにより検定した。
実質的に全てのPO₄＋物質が溶出液の275〜300ml部分であろう。これを減圧下に下に蒸発乾固し、次いで高真空乾燥することによって282mgの無色ワックスが得られる。
ホスフェート分析は、924000の分子量を提案している。
反応の際の溶剤容量のマニプレーションおよびグリコール酸とジシクロヘキシルカルボジイミドの比率は、おそらくその他のサイズの分子となったであろう。
例５
RECおよびMLVの調製
A. サイズされたREV
以下に記載する例に表示されたモル比での全量15μモルの選択されたリポイド成分をクロロホルムに溶解し、そしてロータリーエバポレーションによる薄膜として乾燥した。このリポイドフィルムを1mlのジエチルエーテルに溶解し、蒸留水で洗浄した。このリポイド溶液に0.34mlの5mMトリス、100mM NaCl、0.1mM EDTA、pH7.4を添加し、そしてこの混合物を溶液の温度を室温またはそれ以下に保持した１分間の音波処理により乳化した。リポゾームが包含［125I］トリアミニルイヌリンを含有するように調製されたが、これは約４μCi/ml緩衝液の濃度で燐酸緩衝液を包含していた。
エーテル溶液を減圧下に下に室温で除去し、そして得られたゲルを0.1mlの上記緩衝液中に採り、そして激しく震盪した。得られたREV懸濁液は、顕微鏡観察により測定すると約0.1ないす20ミクロンの粒子サイズを有しており、そして主として１またはほんの少しのバイレイヤーラメラーを有する比較的に巨大な（１ミクロン以上）小嚢から構成されていた。
リポゾームを二度0.4ミクロンまたは0.2ミクロンの選択された孔サイズを有するポリカーボネートフィルター（Szoka,1978）を通して排出した。0.4ミクロンフィルターを通して排出されたリポゾームは、平均して0.17±（0.05）ミクロン直径を有しており、そして0.2ミクロンフィルターを通して排出されたリポゾームは、0.16（0.05）ミクロン直径を有していた。非包含［125I］トリアミニルイヌリンを排出リポゾームをSephadex G−50（Pharmacia）に通過させることによって除去した。
B. サイズされたMLV
マルチラメラー小嚢（MLV）リポゾームを標準法に従って主としてCHCl₃を含有する有機溶剤中にリポイドの混合物を溶解し、減圧下にローテーションにより薄膜として乾燥することによって調製した。数例において、リポイド相について放射線標識を乾燥する前にリポイド溶液に添加した。リポイドフィルムを所望の水性相の添加およびホスホリポイド成分の相転移点以上の温度で少なくとも１時間攪拌するにより水和した。数例において水性相に関する放射線標識を緩衝液中に含めた。数例において水和リポイドを繰り返し三度凍結・乾燥して以下の包含段階を容易にした。
リポゾームサンプルのサイズを定義された孔ポリカーボネートフィルターを、圧縮窒素ガスを使用して通して排出することによって制御した。一つの方法において、リポゾームを一度0.4μｍの孔を有するフィルターに通過させ、次いで10度0.1μｍの孔を有するフィルターに通過させた。別の方法において、リポゾームを三度0.2μｍの孔を有するフィルターに通過させ、続いて粒子の平均直径がDLSで測定して100nm未満になるまで0.05μｍ孔による排出を繰り返した。非包含水性成分を、排出サンプルを包含された容量で小分子から空隙容量においてリポゾームを分離するゲル透過カラムに通過させることによって除去した。
C. ⁶⁷GaのDF−含有リポゾームへの負荷
公知の方法（Gabizon）に適用するような⁶⁷Ga−DF標識リポゾームの調製に関するプロトコール。要するに、リポゾームを内部水性相に包含されたキレーターデスフェラルメシレートを用いて調製してヒドロキシキノリン（オキシン）によるバイレイヤーにより移動された不可逆Gaを結合した。
D. ダイナミック光散乱
リポゾーム粒子サイズ分布尺度をBrookhaven Instruments BI−2030ATオートコレクターを付したNICOMP 200を用いてDLSにより得られた。この装置は、製造者指示に従って操作した。NICOMP結果は、平均直径および相対容量による小嚢のGaussian分布の標準偏差として表現された。
例６
リポゾーム血液寿命測定
A. 血液循環時間および血液/RES比の測定
リポゾームの生体内研究を２種類の異なる動物モデル、すなわち、各々25gでのSwiss−Websterマウスおよび各々200〜300gの実験室ラットに関して行った。マウスの研究は、１μＭホスホリポイドでのリポゾームサンプルの尾静脈接種並びに引き続いての規定時間後の動物殺傷並びにガンマカウントによる標識定量のための組織除去を包含した。体重および各即死における接種投与量の％を測定した。ラットにおける研究は、３〜４μＭホスホリポイド／ラットで別の大腿骨動脈中のカテーテル中のリポゾームサンプルの接種後の規定時間における血液サンプルの除去のための大腿骨静脈中の慢性カレーテルの構築を包含する。24時間までの数時間の点における血液に残存する接種投与量の％を測定した。
B. 血流中のリポゾーム保持の時間
メトキシPEG、分子量1900および１−パルミトイル−２−オレイル−PE（POPE）からなるPEG−PEを、約0.1:2のリポイド：リポイドモル比の部分的に加水分解された卵PC（PHEPC）と一緒にし、そしてリポイド混合物を水和し例４に記載したような0.1ミクロンポリカーボネート膜により排出して約0.1ミクロンの平均サイズを有するMLVを製造した。このMLVリポイドは、少量の放射線標識マーカー¹⁴C−コレステリルオレエートおよび包含されたマーァー³H−イヌリンを包含した。
リポゾーム組成物を接種し、そしてマウスへの初期投与％を接種ご１、２、３、４および24で例４に記載のとうりに測定した。放射線標識物質の損失時間を図７に示す。この図は、包含イヌリン（黒丸）、100％の初期接種点に補正されたイヌリンマーカー（白丸）およびリポイドマーカー（黒三角）についての接種％を接種後24時間にわったてプロットしたものである。同図からわかるように、リポイドおよび包含マーカーの両方が24時間後元の接種投与量の10％以上を示した。
C. 24時間血液リポゾームレベル
静脈内接種後24時間の血液中の接種投与量％および血液/RES比を測定する研究を上記の通りに行った。表３の左欄に示した組成を有するリポゾーム処方を上記の通りに調製した。他に断りのない限り、リポイド−誘導PEGはPEG 1900であり、そしてリポゾームサイズは、0.1ミクロンである。静脈接種後24時間の血液中に残存する投与量％および測定した血液/RES比を各々中央欄および右欄に示す。

上記の通り、接種後24時間の血中に残存する投与量％は、PEG−誘導リポイドについては５ないし40％の範囲内であった。これに対して、PEG−誘導リポイドを欠くリポゾーム処方においては、両方とも１％未満のリポゾームマーカーしか24時間後に残存しなかった。さらに表３に示すとおり、血液/RES比は対照リポゾームにおける0.01〜0.03からPEG−誘導リポイドを含有するリポゾームにおいて少なくとも0.2そして4.0までも増加した。
例７
PEG−PEリポゾームにおける血液/RES比に対すホスホリポイドアシル鎖の飽和の効果
メトキシPEG、分子量1900およびジステアリルPE（DSPE）からなるPEG−PEを、例２の通りに調製した。PEG−PEリポイドを、スピンゴミエリン（SM）、充分に水素化された大豆PC（PC）、コレステロール（Chol）、部分的に水素化された大豆PC（PHPC）および表４においてPCIV1、IV10、IV10、IV30およびIV40と同定された部分的に水素化されたPCリポイドから選択して配合した。リポイド成分を表５の左欄に示した比率で混合し、そして例４に記載した通り0.1ミクロンのサイズとなるよいうに形成した。

接種後24時間に、血液中におよび肝臓（Ｌ）および脾臓（Ｓ）中に残存する接種材料％（⁶⁷−Ga−デスフェラールの％により測定）を測定し、そしてこれらの値を表４の左欄に２つのデータで示した。血液およびＬ＋Ｓ（RES）値を使用して血液/RES値を各組成物について計算した。表４の右欄は、回収された放射線活性の全量を示す。同表における二つの低い回収値は、異常なクリアランス挙動を示した。
同表からの結果は、血液/RES比が流動度、リポゾームを形成するホスホリポイド成分の飽和度にほとんど無関係であることを示している。特に、高度に飽和されたPC成分（例えばIV1およびIV10PC）を、高度に不飽和のPC成分（例えばIV40）をおよび中間飽和成分（たとえばIV20）を含有するリポゾームから観察された血液/RES比の調和のある変化はなかった。
加えて、比較的に飽和されたPEG−DSPE化合物および比較的に不飽和のPEG−PODE化合物（例５）を使用して得られた血液/RES比の比較は、誘導されたリポイドの飽和度自身がRESによる取込みを避ける能力に臨界的でないことを示している。
例８
A. PEG−PEリポゾームにおける血液/RES比に対するコレステロールおよびエトキシ化コレステロールの効果
メトキシPEG、分子量1900およびDSPEからなるPEG−PE化合物を例６の通りに誘導した。PEG−PEリポイドを以下の表５の左欄に示したスピンゴミエリン（SM）、充分に水素化された大豆PC（PC）およびコレステロール（Chol）から選択して処方した。同表に示す３種類の処方は、約30、15および０モル％コレステロールを含有した。REV（0.3ミクロンサイズ）およびREV（0.1ミクロンサイズ）の両方を包含された三重水素標識されたイヌリンを用いて例４の実質的に同様にして調製した。
表６の右欄に示した投与後２および24時間後に血液に残存する包含イヌリン％は、０〜30モル％の範囲でコレステロールの測定可能な効果を示さなかった。

B. エトキシ化コレステロールの効果
メトキシ−エトキシコレステロールをメトキシエタノールをコレステロールに第Ｉ節に記載したトリフルオロスルホネートカップリング法を介してカップリングすることによって調製した。メトキシPEG、分子量1900および誘導DSPEからなるPEG−PEを例６に記載の通りに誘導した。PEG−PEリポイドを、表７の右欄に記載の通りジステアリルPC（DSPC）、部分的に水素化された大豆PC（PHSPC）、コレステロールエチルおよびエトキシ化コレステロールから選択して配合した。データは、（ａ）PEG−PEと組み合わせてエトキシ化コレステロールがPEG−PE単独とほぼ等しい血中におけるリポゾーム寿命の増加度を与えることを示している。それ自身、エトキシ化コレステロールは、リポゾーム寿命の穏やかな程度の高揚を提供するが、PEG−PEによて提供されたものより実質的に少ない。

例９
チャージされたリポイド化のPEG−PEリポゾームにおける血液/RES比に対する効果
メトキシPEG、分子量1900および誘導DSPEからなるPEG−PEを例６に記載の通りに誘導した。PEG−PEリポイドを、図６に記載された卵PG（PG）、部分的に水素化された卵PC（PHEPC）およびコレステロール（Chol）から選択されたリポイドを用いて配合した。リポイドを例４の通りの0.1ミクロンのサイズを有するMLVとして製造した。
例10
血液寿命に対するリポゾームサイズの効果
PEG−DSPEをPEG−1900、部分的に水素化された卵PC（PHEPC）およびコレステロール（Chol）を0.15:1.85:1のモル比で配合した。リポゾームを0.25、0.15または0.1ミクロンポリカーボネートフィルターを通して排出することによってサイジングして各々約0.4、0.2および0.1ミクロンのリポゾームサイズをもたらした。非−包含³H−イヌリンをゲル濾過により除去した。
各３種類のリポゾームを静脈内接種し、そして血中の接種されたリポゾームマーカーの存在を、１、２、３、４および24時間後に測定し、結果を図10に示す。全ての３種類のリポゾームは、24時間後に残存する少なくとも約10％リポゾームマーカーで証拠だてられるように長い血液半減期を示した。0.1ミクロン配合（黒四角）は、0.2ミクロン配合（黒丸）より長時間生存し、後者は順に0.4ミクロン配合物より長時間生存した。
例11
血液寿命に対するその他の親水性ポリマーの効果
上記の通りにして調製されたポリ乳酸−PSPEまたはポリグリコール酸−PSPEを、水素化大豆PC（HSPC）およびコレステロール（Chol）と2:3.5:1または1:3.5:1のいずれかの比率で配合した。リポゾームを0.1ミクロンポリカーボネートフィルターを通して排出することによってサイジングした。リポゾームを例５に記載の通りにGa−DFにより標識した。
これらのリポゾーム配合物を静脈内接種し、そして血中の接種されたリポゾームマーカーの存在を、１、２、３、４および24時間後に測定し、結果を図11に示す。15分間正常化すると、約3.9％のリポゾームマーカーがポリ乳酸−DSPE（黒四角）で24時間後に存在した。約６％のリポゾームマーカーの平均値がポリグリコール酸−PSPE（白三角）で24時間後に存在した。
例12
PEG−被覆または未被覆リポゾームの血漿運動
PEG分子量1900およびジステアリルPE（DSPE）からなるPEG−PEをを例２に記載の通りに調製した。PEG−PEリポイドを、PHRPCおよびコレステロールと0.15:1.85:1のモル比で配合した。第２のリポイド混合物はPEG−PEがない以外が同一のリポイドを含有した。リポゾームを、DEの存在下でのリポイド水和および引続いてのゲル濾過による非包含DFの除去並びに例５のとおりの標識化により例５に記載のとおりに２種類のリポイド混合物から調製した。両方の組成物は、0.15M NaCl,0.5mMデスフェラール中10μＭリポイド/mlを含有していた。
２種類のリポゾーム組成物（0.4ml）を例６に記載の通り動物にIV接種した。0.25、１、３または５および24時間接種後に、血液サンプルを除去し、そして接種の直後に測定した量の％として表して血中に残存するイヌリン量について検定した。結果を図９に示す。図示されるように、PEG−被覆リポゾームは、約11時間の血液半減期を有しており、そしてほぼ30％の接種材料が24時間後の血液に存在した。これに対して、未被覆リポゾームは、１時間未満の血中の半減期を示した。24時間において、接種材料の量は、測定不能であった。
例13
遊離バスコプレシンでの処理
VPについて先天的疾患のBrattleboro株の雄性成年ラット（ValtinおよびSchroeder,1964）を処理前に少なくとも３日間ケージを代謝するために順応させた。ほとんどの実験において、酸化窒素2100cc/分、酸素400cc/分、および５％イソフルエン（Aerrane）の混合物を用いて麻酔を行った。麻酔をイソフルエンの％を２％に減少する以外同一のガス混合物を用いて外科手術中保持した。別の実験において、インハールドエチルエーテルを麻酔に使用した。
A. 外科手術
首および両後肢の腹側を剃った。少しの切込みを耳と首との間の中間点で行い排管を取り外した。ラットを腹這いにし安定化した。鼠茎領域における腹側後肢において切込みを行いそして包帯を取り去り大腿部静脈コンプレックスを曝した。更に、鋭い切開部を大腿部静脈または動脈を切り離した。静脈に関して、血流を３〜０シルクタイ（Davis−Geck,Danbury,CT）を容器の抹消の上に通過させそしてボールドッグクランプで容器を好適にクランプしながら静脈に張力をかけることによって閉塞した。これは静脈を拡張しそして容易に切開することを認める。小さい鋏を使用して、静脈をニックし、そして通常の生理食塩水（９％）または５％デキストロースを満たしたポリエチレン製カテーテル管の傾斜６インチ部分を静脈に挿入した。正確な配置を、1cc注射を使用して静脈欠陥およびフラッシュにより確認した。カテーテルを容器の下にお小さなタイを通過させそしてこれを鼠茎のまらりにノッキングすることによってゆるく静脈に留めた。
B. 投与
一度動物を外科的に調製したら、150〜1000μｌの試験溶液を静脈内投与した。投与容量を調節してバスコプレシンの所望の容量、例えば0.2、0.8および３μｇの水性バスコプレシンを与えた。静脈カテーテルえお外し、そして腹側静脈を外し、そして両方の膝切開部を閉じた。動物の意識を回復させる。
C. 尿製造研究
ラットをダイエット養生を示しそして尿容量を充分に確立した対照期間の後、動物の体重を測定し、そしてインハルド麻酔で麻酔した。腹側静脈をキャヌレートし、そして上記の外科的方法で投薬単位を投与した。動物を代謝ケージで保持し、そして尿を投与後数日間にわたって回収した。尿容量を投与後直ちにそしてその後少なくとも一日２回測定した。
図12は、生理食塩水（白丸）、0.2μｇ（黒四角）、0.8μｇ（黒三角）および２μｇ（黒丸）の全投与量でのバスコプレシンの水溶液の投与後の予備投与量のパーセンテージとしてラットにおける尿流出量を示す。薬剤様よ後１日において、尿製造は、投与量依存降下を示した。第２日およびその後は尿製造は実質的に対照レベルに戻った。
例14
巨大ユニラメラーリポゾームを逆相蒸発法に従って製造した（SzokaおよびParahadjopoulos,1978）。リポゾームの製造に使用されたリポイド組成物は、0.2:1:1:1のモル比のPEG−DSPE、PC、シンゴマイレンおよびコレステロールであった。10μモル/mlのホスホルポを有する1ml最終容量のリポゾームのためのリポイド混合物をクロロホルムに溶解し、そして減圧下に蒸発乾固した。残留溶剤を１時間高真空下に除去した後、混合物をpH7における燐酸緩衝液で新しく洗浄したエチルエーテルに溶解した。次いで、著しいアルギニンバスコプレシンを含有する0.34mlの水性緩衝液（5mMトリス、100mM Nacl、0.1mM EDTA）をエーテル中のリポイドに添加した。痕跡量の³H−標識されたバスコプレシンをタンパク質濃度について測定するバスコプレシン溶液に添加した。次いで、エーテルを制御されたロート蒸発により除去し、そして付加的な薬剤のない緩衝液を添加してゲル抑制の直前に1ml溶液を得た。得られたリポゾームのバスコプレシン含有率をBio−Gel A15上のゲル濾過によりリポゾーム結合から分離することによって測定した。
リポゾームを、0.4ミクロンNucleporeフィルターにより排出し（Olsen等,1979年）、そして粒子サイズ分布をNicom model 200を用いてダイナミック光散乱により測定した。平均直径は、0.2μｍないし0.5μｍの範囲内にあり、そして低いポリ分散性を示した。未結合バスコプレシンを透析により除去し、そして上記の通りにゲルクロマトグラフィーにより監視した。
上記からのPEG−リポゾーム調剤を例13の通りにして調製されたラットにリポゾーム投与量２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および24μｇ（黒丸）バスコプレシン溶液で静脈内投与した。予備投与尿流出％を上記の通りにして測定し、図14に示した。このデータは、薬剤投与後第１日における尿製造における実質的に同一の依存抑制を示し、主としてリポゾーム配合物中の非包含バスコプレシンから得られるものであろう。遊離ペプチド投与と比較して全ての３つの製造は、対照（白丸）に関してリポゾーム投与後２〜８日の間にわたって尿製造の著しい抑制を示した。
例15
PEG−リポゾームバスコプレシンでの処理：
リポゾームコレステロール濃度の効果
33、16または０モル％コレステロールを含有するリポゾームを用いて例14の通りに巨大ユニラメラーリポゾームを製造した。バスコプレシン包含、リポゾームサイジングおよび遊離ペプチド除去を例14の通りに行った。
３種類のPEG−リポゾーム調剤を８μｇバスコプレシンを与えるリポゾーム投与量で例13の通りに製造されたラットに静脈内投与し、そして投与後９日間にわたって予備投与尿製造を測定した。生理食塩水（白丸）および０（黒四角）、16（黒三角）および33（黒丸）モル％コレステロールを有するPEG−リポゾームについての結果を図15に示す。
日１応答は、コレステロールの％に著しく依存し、尿に対する最大の効果がコレステロールの最低モル比を有するリポゾームにおいて製造された。この結果は、血清中へのPEG−リポゾームのバスコプレシン放出の生体外安定性研究と一致した。血液の存在下に、バスコプレシンの透く開法が30モル％以上のコレステロールを含有するリポゾームにおいて観察された。これに対して、減少量のコレステロールを含有するリポゾームは、包含ペプチドの著しく高い放出を示した。従って、低いコレステロールを有するかコレステロールを有していない一日後に見られる著しく高いジウレチィック効果が血清中にリポゾームから放出された遊離ペプチドによるものであることが明らかであろう。
興味深いことには、全ての３種類の配合が例14に記載の方法に見出されるように際立ってそして実質的に同様なジウレティック効果をリポゾーム薬剤投与後２〜８日にわたって製造した。
例16
PEG−リポゾームからのＭ−CSFの血液クリアランス運動
PEG−PE、PHEPC IV−40、コレステロールおよびα−トコフェロールを5:61:33:1のモル比で含有するリポイドフィルムを蒸留水で水和し、そして得られたMLVを30分間音波処理してSUVを形成した。Ｍ−CSFを濃縮し、そしてタンパク質の部分のU125I−沃素で標識した。
等量（2ml）のタンパク質溶液およびSUBを混合し、そしてこの混合物をアセトン／ドライバス中で凍結し、そして一晩親液化した。乾燥材料を0.8mlの蒸留水中で再水和し、そして得られたリポゾーム懸濁液を１度0.4μポリカーボネートフィルターにそして３度0.2μフィルターに通過させた。サイジングされたリポゾームを蒸留水中10mlに希釈し、二度高速遠心で洗浄し、そして洗浄ペレットを0.9μｌの滅菌緩衝液に40μモルリポイド/mlおよび0.5ないし1.25mgタンパク質/mlの最終濃度に再懸濁した。
上記からのPEG−リポゾーム調剤を例６のとおりに動物に静脈内投与し、そしてＭ−CSFの血液レベルをラットを例14の通りにして調製した後に２μｇ（黒四角）、８μｇ（黒三角）および24μｇ（白丸）のバスコプレシンのリポゾーム投与量で１、２、４および24日において測定した。同様な測定を溶液形態で投与された等量のＭ−CSFについて行った。30モル％コレステロールを含有するPEG−リポゾーム配合物に関する血漿運動を図15に示す。このデータは、リポゾーム関連タンパク質についての約８％（黒丸）と比較して24時間での血液中に残存する１％未満のタンパク質を有する遊離タンパク質（黒三角）の速やかなクリアランスを示している。リポイドマーカー％により判断された血流中に残存するリポゾーム％は、10％より若干大きかった。リポイドおよびタンパク質マーカーの速度のクリアランスの比較は、約20％のタンパク質マーカーが接種後24時間までにリポゾームから放出されたことを示している。
コレステロール遊離PEG−リポゾームを用いて得られた血漿運動を図16に示す。24時間後に残存するリポゾーム％をリポゾーム関連Ｍ−CSFについて約4.5％と比較して約8.5（黒三角）であった。この結果は、約40〜50％の元の包含タンパク質がリポゾームから接種後24時間に放出したことを示す。
包含されたタンパク質中のリポゾームリポイドマーカー中の放射線活性カウントを100％初期値に正常化し、そして時間にわたる血流中に放出された接種投薬％を、正常化されたタンパク質と正常化されたリポゾームマーカー放射線活性レベルとの相違から測定した。接種後１、２、４および24時間において放出されたタンパク質％のケイ酸値のプロットを図17に示す。
コレステロール遊離配合（黒三角）に関するプロットは、２時間においてタンパク質放出ピークを示し、非コレステロール配合物（黒三角）における２〜24時間の放出量においてゆるやかな傾斜であった。24時間におけるリポゾームから放出されたタンパク質の量は、全投与の約３〜４％であった。
30モル％コレステロールを含有する配合物（黒丸）に関するプロットは、24時間にわったて放出タンパク質放出割合が徐々に増加することを示した。24時間におけるリポゾームから放出されたタンパク質の量は、比較的に高いレベル（３％またはそれ以上）であった。
例17
皮下接種リポゾーム
MLVを例５に記載の通りに薄膜水和により調製した。薄膜のリポイド組成は、0.15:1.85:1のモル比でのPEG−DSPE、HEPCおよびコレステロールとした。この薄膜を7.5mg/mlでバスコプレシンを含有する水性緩衝液（5mMトリス、100mM NaCl、0.1mM EDTA）で水和した。MLVを0.1ミクロンポリカーボネート膜を、例15の通りに通して繰り返し排出することによってサイジングし、そして遊離（非包含）ペプチドをゲル濾過により除去した。PEG−リポゾームの懸濁液中の最終濃度は、100μM/mlとした。
遊離形態でのバスコプレシンをBrattlebroラットに例13の通りに皮下接種した。皮下接種部位は、頸動脈部分とした。投与量は、２μｇ（黒三角）、25μｇ（黒丸）、50μｇ（黒四角）および100μｇ（黒ダイアモンド）とした。
上記の通りに製造したPEG−リポゾームに包含されたバスコプレシン動物に皮下投与した（1ml）。観察された予備投与尿排出の％を図18Aにプロットする。投与量は、25μｇ（黒三角）、100μｇ（黒丸）および400μｇ（黒四角）とした。観察された予備投与尿放出の％を図18Bにプロットする。
本発明が特定のリポゾーム処方、リポゾーム包含化および処理方法に関して記載されてきたが、種々の関連組成物、化および処理方法が本発明の範囲を逸脱しないことは明らかである。

Claims (9)

1. 血流中への治療用化合物の持続的な放出において使用するためのリポゾーム組成物であって、該組成物は、
   （ｉ）小嚢形成性脂質と、ポリエチレングリコールで誘導体化された１ないし20モル％の小嚢形成性脂質とからなり、該ポリエチレングリコールは、該小嚢形成性脂質 の極性頭基に結合されており、そして該ポリエチレング リコールで誘導体化された小嚢形成性脂質は、該リポソ ームの脂質二重層に組み込まれており、該極性頭基およ び該結合されたポリエチレングリコールは、脂質二重層 各々の極性表面に配向しており、（ii）約0.1ないし0.4μｍ（ミクロン）の寸法範囲の選択された平均粒子径を有し、かつ（iii）包含された治療用化合物を有する、リポゾームを含み、
   該リポゾームは、該誘導体化された脂質が存在しないリポゾームの幾数倍の血液循環寿命を有し、少なくとも24時間の血流中への該治療用化合物の持続的な放出を達成する、
   組成物。
2. 前記ポリエチレングリコールが約1,000ないし5,000ドルトンの分子量を有する、請求の範囲第１項に記載の組成物。
3. 前記ポリエチレングリコールがリン脂質に誘導体化される、請求の範囲第２項に記載の組成物。
4. 前記治療用化合物がペプチドまたはタンパク質である、請求の範囲第１項ないし第３項のいずれか一項に記載のリポゾーム組成物。
5. 前記ペプチドがペプチドホルモンである、請求の範囲第４項に記載の組成物。
6. 前記ペプチドが、バソプレシン、カルシトニン、オキシトシン、インスリン、スーパーオキサイドジスムターゼ、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子（TNF）、マクロファージコロニー刺激因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター（TPA）、第VIII因子、およびエリスロポイエチンからなる群から選択される、請求の範囲第４項に記載の組成物。
7. 静脈内投与のための、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか一項に記載のリポゾーム組成物。
8. 皮下投与のための、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか一項に記載のリポゾーム組成物。
9. 静脈内または皮下投与のための医薬品の調製のための、請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか一項に記載のリポゾーム組成物。

Images