ES2845644T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con sirtuina1 (SIRT1) mediante inhibición del transcrito del antisentido natural a sirtuina 1 - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido antisentido que se une a un transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 (SIRT1) humano para uso como compuesto terapéutico, en donde el transcrito antisentido natural de Sirtuina (SIRT1) es SEQ ID NO: 7, y en donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) humana correspondiente a SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de enfermedades relacionadas con sirtuinal (SIRT1) mediante inhibición del transcrito del antisentido natural a sirtuina 1

Los casos de la divulgación comprenden oligonucleótidos que modulan la expresión y/o la función de SIRT1 y moléculas asociadas.

ANTECEDENTES

La hibridación ADN-ARN y ARN-ARN es importante para muchos aspectos de la función del ácido nucleico, que incluyen la replicación, la transcripción y la traducción del ADN. La hibridación también es fundamental para una diversidad de tecnologías que detectan un ácido nucleico particular o alteran su expresión. Los nucleótidos antisentido, por ejemplo, interrumpen la expresión génica al hibridar con el ARN diana, interfiriendo de este modo con el empalme, la transcripción, la traducción y la replicación del ARN. El ADN antisentido tiene la característica adicional de que los híbridos ADN-ARN sirven como un sustrato para la digestión por la ribonucleasa H, una actividad que está presente en la mayoría de los tipos de células. Las moléculas antisentido pueden suministrarse a células, como es el caso de los oligodesoxinucleótidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endógenos como moléculas de ARN. La FDA aprobó recientemente un fármaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapéutica.

El documento WO 2010/065662 A2 se refiere al tratamiento de enfermedades relacionadas con la sirtuina 1 (SIRT1) mediante inhibición del transcrito del antisentido natural a sirtuina 1.

Bonauer et al. (Science, vol. 324, n° 5935, 26 de junio de 2009, páginas 1710-1713) se refiere al microARN-92a que controla la angiogénesis y la recuperación funcional de tejidos isquémicos en ratones.

BASE DE DATOS DE EMBL [en línea] 4 de marzo de 2000, "xj35b03.xl Soares_NFL_T_GBC_S1 Homo sapiens cDNA clon IMAGE: 2659181 3 ', mRNA sequence", recuperado del número de acceso de EBI. EM_EST:AW169958, número de acceso a la base de datos AW169958.

BASE DE DATOS DE EMBL [en línea] 23 de septiembre de 2008. "ADNc de retina de adulto de Mus musculus, biblioteca enriquecida de longitud completa de RIKEN, clon: A930026H04 producto: proteína hipotética, secuencia de inserción completa", recuperado del número de acceso de EBI. EM_EST: AK044604; número de acceso a la base de datos AK044604.

COMPENDIO

La invención se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgación que constituyen la invención se definen por las reivindicaciones.

Este compendio se proporciona para presentar un compendio de la divulgación para indicar brevemente la naturaleza y sustancia de la divulgación. Se presenta en el entendimiento de que no se utilizará para interpretar ni limitar el alcance o significado de las reivindicaciones.

En un caso la divulgación proporciona métodos para inhibir la acción de un transcrito antisentido natural usando oligonucleótido(s) antisentido dirigidos a cualquier región del transcrito antisentido natural que da como resultado una regulación positiva del gen sentido correspondiente. También se contempla en este documento que la inhibición del transcrito antisentido natural puede lograrse mediante ARNsi, ribozimas y moléculas pequeñas, que se consideran dentro del alcance de la presente divulgación.

Un caso proporciona un método de modulación de la función y/o la expresión de un polinucleótido SIRT1 en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud en donde dicho oligonucleótido tiene una identidad de secuencia de al menos el 50% con un complemento de un polinucleótido que comprende de 5 a 30 nucleótidos consecutivos dentro de los nucleótidos 1 a 1028 de SEQ ID NO: 3 o nucleótidos 1 a 429 de SEQ ID NO: 4, o nucleótidos 1 a 156 de SEQ ID NO: 5 o nucleótidos 1 a 593 de SEQ ID NO:6, 1 a 373 de SEQ ID NO: 7 y 1 a 1713 de SEQ ID NO: 8 (Figura 17) modulando de ese modo la función y/o expresión del polinucleótido SIRT1 en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro.

En otro caso preferido, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleótidos SIRT1, por ejemplo, nucleótidos establecidos en SEQ ID NO: 3 a 8, y cualquier variante, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 9 a 66 (Figuras 19 a 26).

Otro caso proporciona un método para modular la función y/o expresión de un polinucleótido SIRT1 en células o tejidos de paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud, en donde dicho oligonucleótido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleótido SIRT1; modulando de este modo la función y/o expresión del polinucleótido SIRT1 en células o tejidos de paciente in vivo o in vitro.

Otro caso proporciona un procedimiento de modulación de la función y/o expresión de un polinucleótido de SIRT1 en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud, donde dicho oligonucleótido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un oligonucleótido antisentido para un polinucleótido antisentido de SIRT1; modulando de este modo la función y/o expresión del polinucleótido de SIRT1 en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En un caso preferido, una composición comprende uno o más oligonucleótidos antisentido que se unen a polinucleótidos SIRT1 con sentido y/o antisentido.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleótidos modificados o sustituidos.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces modificados.

En otro caso más, los nucleótidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, ácidos nucleicos peptídicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moléculas de ácido nucleico (ANB). Preferiblemente, los nucleótidos modificados son moléculas de ácido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-ANB.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos se administran a un paciente por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía intraperitoneal.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos se administran en una composición farmacéutica. Un régimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para incluir múltiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o más tipos distintos de terapias.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos están encapsulados en un liposoma o unidos a una molécula portadora (p. ej., colesterol, péptido TAT).

Otros aspectos se describen a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las características nuevas de la invención se establecen particularmente en las reivindicaciones anejas. Una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente divulgación se obtendrán 20 por referencia a la siguiente descripción detallada que establece casos ilustrativos, en los que se utilizan los principios de la divulgación, y las figuras adjuntas en las que:

La Figura 1 muestra los resultados de la PCR en tiempo Real de oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los ARNsi diseñado para sirtas (sirtas_5, P=0,01). En las mismas muestras, los niveles de ARN de sirtas disminuyeron significativamente después del tratamiento con sirtas_5, pero no se modificaron después del tratamiento con sirtas_6 y sirtas_7, que tampoco tuvieron efecto sobre los niveles de ARNm de SIRT 1 (Fig. 1B). sirtas_5, sirtas_6 y sirtas_7 corresponden a las SEQ ID NO: 32, 33 y 34 respectivamente.

La Figura 2 muestra los resultados del recorrido de oligonucleótidos a través del CV396200.1 antisentido de SIRT. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos antisentido diseñados para sirtas. CUR-0292 a CUR-0309 corresponden a las SEQ ID NO: 9 a 26 respectivamente.

La Figura 3 muestra los resultados para los oligonucleótidos modificados con PS, ANB y 2'O Me en células HepG2 (Fig. 3A) y Vero76 (Fig. 3B). Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con mezcla de oligonucleótidos antisentido diseñados PS, ANB, 2'O Me y 2'O Me a antisentido SIRT1. Los niveles de ARNm de SIRT1 en células Vero también aumentaron 48 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido modificados con PS y ANB a antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0245, CUR-0736, CUR 0688, CUR-0740 y c Ur -0664 corresponden a las SEQ ID NO: 27 a 31 respectivamente.

La Figura 4 muestra los resultados de la PCR de las Biopsias de Grasa de Mono. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRt 1 en biopsias de grasa de monos a los que se les administró CUR-963, un oligonucleótido diseñado para CV396200.1 antisentido de SIRT1. CUR-963 corresponde a SEQ ID NO: La Figura 5 muestra los resultados de la PCR de hepatocitos primarios de hígado de mono. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 después del tratamiento con un oligonucleótido frente a antisentido de SIRT1. La barra indicada como CUR-0245 corresponde a SEQ ID NO: 27.

La Figura 6 muestra los resultados de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se incrementan significativamente en uno de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1230, CUR-1231, CUR-1232 y CUR-1233 corresponden a las SEQ ID NO: 35 a 38.

La Figura 7 muestra los resultados de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente en dos de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 y CUR-1305 corresponden a las SEQ ID NO: 39 a 42.

La Figura 8 muestra los resultados de la PCR en tiempo real. Los resultados muestran un aumento significativo en los niveles de ARNm de SIRT1 en las células HepG248 horas después del tratamiento con uno de los oligonucleótidos diseñados para BE717453 antisentido de s Ir T. Las barras indicadas como CUR-1264, CUR1265 y CUR-1266 corresponden a las SEQ ID NO: 43 a 45 respectivamente.

La Figura 9 muestra los resultados de la PCR en tiempo real. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AV718812 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 y CUR-1298 corresponden a las SEQ ID NO: 46 a 50 respectivamente.

La Figura 10 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en células HepG2 48 h después del tratamiento con dos de los oligos diseñados para AW169958 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1381, CUR-1382, CUR-1383 y CUR-1384 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 51, 52, 53 y 54 respectivamente.

La figura 11 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 están significativamente aumentados en células 3T3 después de 48 h del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT1 de ratón. Las barras indicadas como CUR-0949, CUR-0842, CUR-1098 y CUR-1099 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 61, 55, 65 y 66 respectivamente.

La figura 12 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 están significativamente aumentados en células 3T3 48 h después del tratamiento con cinco de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT1 de ratón. Las barras indicadas como CUR-0948, CUR-0949, CUR-0950, CUR-0951, CUR-0846 y CUR-0844 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 60, 61, 62, 63, 59 y 57 respectivamente.

La figura 13 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces la desviación estándar en ARNm de SIRT 1 después de tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 están significativamente aumentados en células HepG248 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT 1 de ratón. Las barras indicadas como CUR-0842, CUR-0844 y CUR-0845 se corresponden con muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 55, 57 y 58, respectivamente.

La figura 14 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra el cambio en veces la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 están significativamente aumentados en células HepG248 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT1 de ratón. Las barras representadas como CUR-0843, CUR-0846 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 56 y 59, respectivamente.

La Figura 15 muestra

SEQ ID NO: 1: Homo sapiens sirtuina (regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso, homólogo) 1 (S. cerevisiae) (SIRT1), ARNm (Número de acceso NCBI: NM_012238.3)

SEQ ID NO: 2: secuencia genómica de SIRT (se muestran exones en letras mayúsculas, intrones en minúsculas). La Figura 16 muestra

SEQ ID NO: 72: Mus musculus sirtuina 1 (regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso, homólogo) 1 (S. cerevisiae) (SIRT1) ARNm (Número de acceso NCBI: NM_001159589)

SEQ ID NO: 73: secuencia genómica de SIRT (se muestran exones en letras mayúsculas, intrones en minúsculas). La Figura 17 muestra

SEQ ID NO: 3: Secuencia antisentido natural expandida (CV396200 - expandida).

SEQ ID NO: 4 Secuencia antisentido natural (CV428275)

SEQ ID NO: 5: secuencia antisentido natural (BE717453)

SEQ ID NO: 6: secuencia antisentido natural (AV718812)

SEC ID NO: 7: Secuencia antisentido natural (AW169958)<

SEQ ID NO: 8: Secuencia antisentido natural de ratón (AK044604)

La Figura 18 muestra las SEQ ID NOS: 9 a 26, * indica enlace fosfotioato

La Figura 19 muestra las SEQ ID NOS: 27 a 31, * indica enlace fosfotioato, indica ANB y m indica 2'O Me La Figura 20 muestra las SEQ ID NOS: 32 a 34, los oligonucleótidos de ensayo de doble cadena diseñados para CV396200 antisentido de SIRT que corresponden a sirtas_5, sirtas_6 y sirtas_7 respectivamente

La Figura 21 muestra las SEQ ID NOS: 35 a 38 diseñadas para CV396200 antisentido de SIRT1.

La Figura 22 muestra las SEQ ID NOS: 39 a 42 diseñadas para CV428275 antisentido de SIRT1.

La Figura 23 muestra las SEQ ID NOS: 43 a 45 diseñadas para BE717453 antisentido de SIRT1.

La Figura 24 muestra las SEQ ID NOS: 46 a 50 diseñadas para AV718812 antisentido de SIRT1.

La Figura 25 muestra los oligonucleótidos antisentido, SEQ ID NOS: 51 a 54. * indica enlace fosfotioato.

La Figura 26 muestra los oligonucleótidos antisentido, SEQ ID NOS: 55 a 66. * indica enlace fosfotioato, indica ANB La Figura 27 muestra SEQ ID NO: 67 a 70. Las SEQ ID NO: 67 corresponden al exón 4 del CV396200 antisentido natural de SIRT1, las SEQ ID NO: 68, 69 y 70 corresponden a la secuencia del cebador directo, la secuencia del cebador inverso y la secuencia informadora respectivamente.

La Figura 28 muestra la SEQ ID NO: 71 que corresponde a CUR 962, * indica enlace fosfotioato y indica ANB. DESCRIPCIÓN DETALLADA

A continuación, se describen varios aspectos de la divulgación con referencia a aplicaciones de ejemplo para ilustración. Debe entenderse que se exponen numerosos detalles, relaciones y métodos específicos para proporcionar un entendimiento completo de la divulgación. Un experto en la materia relevante, sin embargo, reconocerá fácilmente que la divulgación puede ponerse en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros métodos. La presente divulgación no está limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o acontecimientos. Además, no se requieren todos los actos o acontecimientos ilustrados para implementar una metodología de acuerdo con la presente divulgación. Todos los genes, nombres de genes y productos de genes descritos en este documento pretenden corresponder a homólogos de cualquier especie para los que son aplicables las composiciones y métodos descritos en este documento. Así, los términos incluyen, pero no se limitan a, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se describe un gen o producto génico de una especie particular, esta divulgación pretende ser solo ilustrativa, y no debe interpretarse como una limitación a menos que el contexto donde aparece lo indique claramente. Así, por ejemplo, para los genes descritos en este documento, que en algunos casos se relacionan con el ácido nucleico de mamíferos y secuencias de aminoácidos se pretende que abarquen genes homólogos y/u ortólogos y productos génicos de otros animales que incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En casos preferidos, los genes o secuencias de ácidos nucleicos son humanos.

Definiciones

La terminología utilizada en este documento tiene el objetivo de describir solo aspectos particulares y no pretende limitar la descripción. Como se usa en este documento, las formas singulares «un», «una» y «el», «la» pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, en la medida en que las expresiones «que incluye», «incluye», «que tiene», «tiene», «con», o variantes de las mismas se usan en la descripción detallada y/o en las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresión «que comprende».

El término "alrededor de" o "aproximadamente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular de acuerdo con lo determinado por un experto en la materia, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, «alrededor de» puede significar dentro de 1 o más de 1 desviación estándar, de acuerdo con la práctica en la técnica. Como alternativa, "alrededor de" puede significar un intervalo de hasta el 20%, preferiblemente hasta el 10%, más preferiblemente hasta el 5%, y aún más preferiblemente hasta el 1% de un valor dado. Como alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procedimientos biológicos, el término puede significar dentro de un orden de magnitud de un valor, preferentemente dentro de 5 veces y más preferiblemente, dentro de 2 veces. Donde se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, el término "alrededor de" significa que debería asumirse dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular.

Como se usa en este documento, el término «ARNm» significa (el)los transcrito(s) de ARNm actualmente conocido(s) de un gen dirigido , y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.

Por "oligonucleótidos antisentido" o «compuesto antisentido» se entiende una molécula de ARN o de ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si es un oligonucleótido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ARN diana (Eguchi et al., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Un oligonucleótido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresión y/o función de un polinucleótido particular. La definición pretende incluir cualquier molécula de ARN o ADN extraña que es útil desde un punto de vista terapéutico, de diagnóstico u otro. Tales moléculas incluyen, por ejemplo, moléculas de ARN o ADN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), micro ARN, moléculas de ARN señuelo, sARNi, ARN enzimático, ARN de edición terapéutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), empalmadores alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que se hibridan a al menos una parte del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

En el contexto de esta divulgación, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. El término “oligonucleótido” también incluye oligómeros lineales o circulares de monómeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas sustituidas y alfa-anómeras de los mismos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleótidos son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana por medio de un patrón regular de interacciones monómero a monómero, tales como tipo de apareamiento de bases de Watson-Crick, tipos de apareamiento de bases de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.

El oligonucleótido puede ser "quimérico", es decir, estar compuesto por diferentes regiones. En el contexto de esta divulgación los compuestos "quiméricos" son oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicas, por ejemplo, una o más regiones de ADN, una o más regiones de a Rn , una o más regiones de ANP, etc. Cada región química está compuesta por al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos típicamente comprenden al menos una región en donde el oligonucleótido se modifica con el fin de mostrar una o más propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleótido incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, mayor resistencia a la degradación por nucleasas, mayor captación celular y/o mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleótido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleótidos quiméricos de la presente divulgación pueden formarse como estructuras mixtas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o análogos de oligonucleótidos, como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleótido puede estar compuesto por regiones que pueden enlazarse en "registro", es decir, cuando los monómeros se enlazan consecutivamente, como en el ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un "puente" covalente entre las regiones y tengan, en aspectos preferidos, una longitud que no supere aproximadamente los 100 átomos de carbono. Los espaciadores pueden portar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, portar propiedades de unión a ácido nucleico especiales (intercaladores, aglutinantes de surcos, toxinas, fluoróforos, etc.), ser lipófilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, péptidos que contienen alanina que inducen hélices alfa.

Tal como se usa en el presente documento, "SIRT1" y "Sirtuina 1" son incluyentes de todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleótido sentido y antisentido, etc.

Como se usa en este documento, "SIRT1" se referirá al homólogo del regulador 2 de información de tipo de apareamiento silenciado y es un miembro de la familia de proteínas SIRTuin desacetilasa. La secuencia de aminoácidos de SIRT1 se puede encontrar en el número de acceso de Genbank NP-08509. SIRT1 es el homólogo humano de la proteína Sir2 de levadura y exhibe actividad desacetilasa dependiente de NAD.

Tal como se utilizan en el presente documento, las palabras Sirtuina 1, SIRT1, sirtuina, homólogo 1 de regulación de información de tipo de apareamiento silencioso 2, hSIR2, hSIRT1, sirtuin-1 deacetilasa dependiente de NAD, SIR2L1, proteína similar a SIR2 1, se consideran iguales en la bibliografía y se usan indistintamente en la presente solicitud.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “oligonucleótido específico para” u “oligonucleótido que se dirige a” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen diana, o (ii) capaz de formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen diana. La estabilidad de los complejos y los dúplex puede determinarse mediante cálculos teóricos y/o ensayos in vitro. Los ensayos ilustrativos para determinar la estabilidad de los complejos y dúplex de hibridación se describen en los Ejemplos más adelante.

Como se usa en este documento, la expresión «ácido nucleico diana» abarca ADN, ARN (que comprende preARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de tal ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleótidos con sentido o antisentido. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos, que se hibridan específicamente con él, se denomina generalmente "antisentido". Las funciones del ADN que se va a interferir incluyen, por ejemplo, la replicación y la transcripción. Las funciones del ARN que se va a interferir incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la translocación del ARN al sitio de traducción de proteína, la traducción de proteína del ARN, el empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que pueda ser acoplada en o facilitada por el ARN. El efecto global de tal interferencia con la función del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de un producto codificado u oligonucleótidos.

La interferencia de ARN "ARNi" está mediada por moléculas de ARN bicatenario (ARNds) que tienen homología específica de secuencia con sus secuencias de ácido nucleico "diana" (Caplen, N. J., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:9742-9747). En determinados casos de la presente divulgación, los mediadores son dúplex de ARN «de interferencia pequeños» (ARNsi) de 5-25 nucleótidos. Los ARNsi se derivan del procesamiento de ARNds por una enzima RNasa conocida como Dicer (Bernstein, E., et al., (2001) Nature 409: 363-366). Los productos dúplex de sARNi se reclutan en un complejo de sARNi multiproteína denominado RISC (complejo silenciador inducido por ARN). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree entonces que un RISC es guiado a un ácido nucleico diana (adecuadamente ARNm), donde el dúplex de sARNi interactúa de una forma específica de secuencia para mediar en la escisión en un modo catalítico (Bernstein, E., et al., (2001) Nature 409:363-366; Boutla, A., et al., (2001) Curr. Biol.

11:1776-1780). Los ARN de interferencia pequeños que pueden usarse de acuerdo con la presente divulgación pueden sintetizarse y usarse de acuerdo con procedimientos que son bien conocidos en la técnica y que serán familiares para el experto en la materia. Los ARN de interferencia pequeños para su uso en los procedimientos de la presente divulgación comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos (nt). En los ejemplos de casos no limitantes, los ARNsi pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleótidos.

La selección de oligonucleótidos adecuados se facilita usando programas informáticos que alinean automáticamente secuencias de ácido nucleico e indican regiones de identidad u homología. Tales programas se usan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de un intervalo de especies permite la selección de secuencias de ácidos nucleicos que muestran un grado de identidad adecuado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan inmunotransferencias de Southern para permitir una determinación del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Al realizar inmunotransferencias de Southern a grados de rigurosidad variables, como es bien conocido en la técnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico diana en un sujeto que se va a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay una libertad considerable en la selección de regiones adecuadas de genes para su uso en la presente divulgación.

Por “ARN enzimático” se indica una molécula de ARN con actividad enzimática (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc.

260, 3030-3035). Los ácidos nucleicos enzimáticos (ribozimas) actúan uniéndose primero a un ARN diana. Tal unión se produce a través de la parte de unión diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. De este modo, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento de bases, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana.

Por "ARN señuelo" se entiende una molécula de ARN que imita el dominio de unión natural para un ligando. El ARN señuelo compite, por lo tanto, con la diana de unión natural para la unión de un ligando específico. Por ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresión de ARN de respuesta de transactivación (TAR) del VIH puede actuar como un "señuelo" y se une de forma eficiente a la proteína tat del VIH, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas en el ARN del VIH (Sullenger et al., (1990), Cell, 63, 601-608). Esto pretende ser un ejemplo específico. Los expertos en la materia reconocerán que esto es solo un ejemplo, y fácilmente pueden generarse otros casos usando técnicas generalmente conocidas en la técnica.

Como se usa en este documento, el término «monómeros» típicamente indica monómeros unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que varían en tamaño de entre unas pocas unidades monoméricas, p. ej., de entre aproximadamente 3-4, a aproximadamente varios cientos de unidades monoméricas. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, como se describe más completamente más adelante.

El término “nucleótido” cubre nucleótidos de origen natural, así como nucleótidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleótidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. De este modo, "nucleótidos" incluye no solamente las moléculas que contienen heterociclos de purina y pirimidina conocidas, sino también análogos heterocíclicos y tautómeros de las mismas. Los ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleótidos son moléculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deazaguanina, N4,N4-etanocitosina, N6,N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-(C3-C6)-alquinilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleótidos "que no son de origen natural" descritos en Benner et al., pat. de EE. UU. No. 5.432.272. El término "nucleótido" pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, además de análogos y tautómeros de los mismos. Nucleótidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleótidos de origen natural en relación con la aplicación terapéutica y diagnóstica en seres humanos. Los nucleótidos incluyen los azúcares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, p. ej., como se describe en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992) así como sus análogos.

"Análogos", en referencia a nucleótidos, incluye nucleótidos sintéticos que tienen restos de bases modificados y/o restos de azúcar modificados (véase, p. ej., descrito generalmente por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nueva York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25 (22), 4429-4443, Toulmé, JJ, (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); bicicloarabinonucleósidos [3.2.0] unidos a 2'-O, 3'-C (véase, p. ej., N. K. Christiensen., et al, (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash Tp , Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem.

7(7):641-9; Cho EJ et al., (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Dichos análogos incluyen nucleótidos sintéticos diseñados para potenciar propiedades de unión, por ejemplo, la estabilidad especificidad del dúplex o el tríplex, o similares.

Tal como se usa en el presente documento, "hibridación" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligoméricos. Un mecanismo de apareamiento implica la formación de puentes de hidrógeno, que pueden ser puentes de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o de nucleótidos (nucleótidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleótidos complementarios que se aparean mediante la formación de puentes de hidrógeno. La hibridación puede producirse en circunstancias variables.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones donde se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones donde se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro .

Como se usa en este documento, la frase «condiciones de hibridación rigurosas» o «condiciones rigurosas» se refiere a condiciones donde un compuesto de la divulgación se hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones rigurosas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgación, las «condiciones rigurosas» bajo las que los compuestos oligoméricos se hibridan con una secuencia diana se determinan por la naturaleza y la composición de los compuestos oligoméricos y los ensayos donde están siendo investigados. En general, las condiciones de hibridación rigurosas comprenden bajas concentraciones (<0,15 M) de sales con cationes inorgánicos tales como Na++ o K++ (es decir, baja fuerza iónica), temperatura superior a 20°C-25°C por debajo de la Tm del complejo de compuesto oligomérico: secuencia diana, y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridación disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condición de hibridación de alta rigurosidad es tampón cloruro de sodio-citrato de sodio O, 1X (SSC)/0,1% (p/v) de SDS a 60°C durante 30 minutos.

“Complementario”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleótidos en una o dos cadenas oligoméricas. Por ejemplo, si una nucleobase en una determinada posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una determinada posición de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana un ADN, ARN, o una molécula de oligonucleótido, entonces la posición del enlace de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera una posición complementaria. El compuesto oligomérico y el ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido, adicional son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula está ocupado por nucleótidos que pueden formar puentes de hidrógeno entre sí. De este modo, "específicamente hibridable" y "complementariedad" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un número suficiente de nucleótidos de modo que se produzca unión estable y específica entre el compuesto oligomérico y un ácido nucleico diana.

Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomérico sea un 100% complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos, de modo que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el acontecimiento de hibridación (p. ej., una estructura en bucle, un desapareamiento o una estructura de horquilla). Los compuestos oligoméricos de la presente divulgación comprenden al menos aproximadamente el 70%, o al menos aproximadamente el 75%, o al menos aproximadamente el 80%, o al menos aproximadamente el 85%, o al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 99% de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o a nucleótidos complementarios. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleótidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleótidos no complementarios que están flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría el 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico diana y así estaría dentro del alcance de la presente divulgación. Es posible determinar el porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana de forma habitual con programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410 ; Zhang y Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656). La homología, identidad de secuencias o complementariedad porcentual se pueden determinar mediante, por ejemplo, el programa Gap (Paquete de Análisis de Secuencia Wisconsin, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando parámetros por defecto, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489).

Como se usa en este documento, la expresión "Punto de Fusión Térmico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo una fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidos, a la que el 50% de los oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana se hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Típicamente, las condiciones rigurosas serán aquellas a las que la concentración de sales es la concentración de iones Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para oligonucleótidos cortos (p. ej., de 10 a 50 nucleótidos). También pueden lograrse condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida.

Como se usa en este documento, "modulación" significa un incremento (estimulación) o una disminución (inhibición) de la expresión de un gen.

El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede abarcar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen de tipo salvaje. Esta definición también puede incluir, por ejemplo, variantes "alélicas", " de empalme", "de especie" o "polimórficas". Una variante de empalme puede tener una identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un mayor o menor número de polinucleótidos debido al empalme alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgación son las variantes de productos génicos de tipo salvaje. Las variantes pueden ser el resultado de al menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos y pueden dar lugar a ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede o no estar alterada. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia dada.

Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán una identidad significativa de aminoácidos los unos en relación con los otros. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimórficas también pueden abarcar "polimorfismos de un solo nucleótido" (SNP), o mutaciones de una sola base donde la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una determinada población con una propensión por una patología, que es susceptibilidad frente a resistencia.

Los polinucleótidos derivados incluyen ácidos nucleicos sometidos a modificación química, por ejemplo, sustitución de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, p. ej., oligonucleótidos derivados, pueden comprender partes de origen no natural, tales como restos de azúcar alterados o enlaces entre azúcares. Ilustrativos entre estos son el fosforotioato y otras especies que contienen azufre que son conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos derivados también pueden contener marcadores, que incluyen radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Un polipéptido o péptido "derivado" es aquel que se modifica, por ejemplo, por glucosilación, pegilación, fosforilación, sulfatación, reducción/alquilación, acilación, acoplamiento químico o tratamiento suave con formalina. Un derivado también puede modificarse para contener un marcador detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, pero no se limita a, un radioisótopo, un marcador fluorescente y enzimático.

Como se usa en este documento, el término "animal" o "paciente" pretende incluir, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos, mulos, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y arácnidos.

"Mamífero" incluye mamíferos de sangre caliente que típicamente están bajo atención médica (p. ej., seres humanos y animales domesticados). Ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y seres humanos, además de solo seres humanos.

"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patología en un mamífero e incluye (a) evitar que se produzca la patología en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero tiene predisposición a la patología, pero todavía no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patología, p. ej., detener su desarrollo; y/o (c) aliviar la patología, p. ej., causar la regresión de la patología hasta que se alcance un criterio de valoración deseado. Tratar también incluye la mejora de un síntoma de una enfermedad (p. ej., reducir el dolor o molestia), en donde dicha mejora puede o no afectar directamente a la enfermedad (p. ej.,causa, transmisión, expresión, etc.).

"Enfermedad o trastorno neurodegenerativo" se refiere a una amplia gama de enfermedades y trastornos del sistema nervioso central y periférico que incluyen, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA) ), demencia, esclerosis múltiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte de células neuronales.

"Enfermedad metabólica" se refiere a una amplia gama de enfermedades y trastornos del sistema endocrino que incluyen, por ejemplo, resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, tolerancia a la glucosa , colesterol alto en sangre, hiperglucemia, dislipidemia e hiperlipidemia.

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a cualquier tumor maligno, particularmente en el pulmón, riñón o tiroides. El propio cáncer se manifiesta como un "tumor" o tejido que comprende células malignas del cáncer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas como tales, pero no limitados a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomisarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligondendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Como se ha indicado anteriormente, la divulgación permite específicamente el diagnóstico diferencial de tumores pulmonares, renales y tiroideos.

Composiciones y Moléculas de Polinucleótidos y Oligonucleótidos

"Proteína SIRT1" se refiere a un miembro de la familia sir2 de sirtuin desacetilasas. En un caso, una proteína SIRT1 incluye levadura Sir2 (número de acceso de GenBank P53685), C. elegans Sir-2.1 (número de acceso de GenBank NP.sub.--501912), SIRT1 humano (número de acceso de GenBank NM.sub.--012238 y NP.sub.--036370 (o AF083106))

"Sirtuinas" SIRT1 son proteínas que incluyen un dominio SIR2, un dominio definido como secuencias de aminoácidos que se puntúan como aciertos en la familia Pfam "SIR2" -PF02146 (adjunta al Apéndice). Esta familia se menciona en la base de datos de INTERPRO como descripción de INTERPRO (entrada IPR003000). Para identificar la presencia de un dominio "SIR2" en una secuencia de proteína y hacer la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína se puede buscar en la base de datos Pfam de HMM (p. ej., la base de datos de Pfam, versión 9) utilizando los parámetros predeterminados (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). El dominio SIR2 está indexado en Pfam como PF02146 y en INTERPRO como descripción de INTERPRO (entrada IPR003000). Se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam en "The Pfam Protein Families Database" Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(1):276-280 y Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 y se puede encontrar una descripción detallada de los HMM, por ejemplo, en Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; y Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314.

En un caso, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de Sirtuina 1 (SIRT1), que incluyen, sin limitación, secuencias codificantes y/o no codificantes, con sentido y/o antisentido asociadas con SIRT1.

En casos preferidos, se usan oligonucleótidos antisentido para evitar o tratar enfermedades o trastornos asociados con Sirtuina 1 (SIRT1). Las sirtuinas (SIRT) son enzimas modificadoras de proteínas que se distribuyen de forma ubicua en todos los organismos. SIRT1 es un mamífero homólogo del regulador de información silencioso 2 nicotinamida-adenina-dinucleótido de levadura dependiente de desacetilasa (conocido como Sir2), que es el miembro de la familia SIRT mejor caracterizado. SIRT1 regula la fisiología de las células del linaje de adipocitos. Los moduladores de la actividad de SIRT1 pueden usarse para mejorar, tratar o prevenir enfermedades y trastornos asociados con la fisiología adiposa, p. ej., obesidad, una enfermedad relacionada con la obesidad o un trastorno metabólico relacionado con la grasa.

SIRT1 regula la longevidad en varios organismos modelo y está involucrado en varios procesos en células de mamíferos que incluyen la supervivencia, diferenciación y metabolismo celular. La inducción de SIRT1, ya sea por compuestos activadores de SIRT como el resveratrol, o el acondicionamiento metabólico asociado con la restricción calórica, podría tener cualidades neuroprotectoras y así retrasar el proceso neurodegenerativo, promoviendo así la longevidad (Han SH, (2009) J Clin Neurol. Sep;5(3): 120-5.; Michan S, et al. (2007) Biochem J. 404(1): 1-13.).

Hay varios informes que apoyan un papel protector axonal para SIRT 1 en el sistema neuronal. La degeneración axonal es una característica morfológica importante observada tanto en neuropatías periféricas como en enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) y la esclerosis lateral amiotrófica (Fischer LR, et al. (2004) Exp Neurol 185:232-240; Stokin GB, et al. (2005) Science 307:1282-1288). La degeneración axonal generalmente ocurre en la etapa temprana de los procesos degenerativos y, a menudo precede o se correlaciona estrechamente con síntomas clínicos como el deterioro cognitivo (Yamamoto H, et al. (2007) Mol Endocrinol. 21 (8): 1745-1755) .

En un caso preferido, los oligonucleótidos son específicos para polinucleótidos de SIRT1, que incluye, sin limitación, regiones no codificantes. Las dianas de SIRT 1 comprenden variantes de SIRT1; mutantes de SIRT1, incluyendo SNP; secuencias no codificantes de SIRT1; alelos, fragmentos, y similares. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula de ARN antisentido.

De acuerdo con casos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no está limitada a polinucleótidos de SIRT1 solo, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homólogos, regiones no codificantes y similares de SIRT1.

En otro caso preferido, un oligonucleótido está dirigido a una secuencia antisentido natural (antisentido natural a las regiones codificantes y no codificantes) de dianas de SIRT1, incluyendo, sin limitación, variantes, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula de ARN o ADN antisentido.

En otro caso preferido, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes donde una base diferente está presente en una o más de las posiciones de nucleótido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleótidos naturales o no naturales en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido. Estos compuestos se ensayan entonces usando los métodos descritos en este documento para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.

En algunos casos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%. En algunos casos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos casos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos casos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos casos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100%.

Un compuesto antisentido se puede hibridar específicamente cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico diana para causar una pérdida de actividad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácidos nucleicos no diana en las condiciones en las que se desea la unión específica. Dichas condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimérico, sustituido etc., se puede hibridar específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para causar una pérdida de utilidad y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias no diana en condiciones donde se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de los ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de los ensayos in vitro , en las condiciones en las que se realizan los ensayos.

En otro aspecto preferido, el direccionamiento de SIRT1 incluyendo sin limitación secuencias antisentido que se identifican y se expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridación etc., una o más de las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 3 a 8, y similares, modulan la expresión o función de SIRT1. En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En otro aspecto preferido, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos comprenden secuencias de ácidos nucleicos establecidos en las SEQ ID NOS: 9 a 66 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo PCR, hibridación, etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotídicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto preferido, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente divulgación puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato anteriormente señalados y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidoss, per se, también se conoce y no necesita se descrito en este documento.

La especificidad y sensibilidad de antisentido también es empleada por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado de forma segura y eficaz a seres humanos y actualmente hay numerosos ensayos clínicos en marcha. Así, se establece que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

En casos de la presente divulgación, los compuestos antisentido oligoméricos, particularmente oligonucleótidos, se unen a moléculas de ácidos nucleicos diana y modulan la expresión y/o función de moléculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN a interferir comprenden, por ejemplo, la replicación y la transcripción. Las funciones de ARN que se va a interferir comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, la translocalización del ARN al sitio de traducción de proteína, la traducción de proteína desde ARN, el empalme del ARN para producir una 0 más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede estar acoplada o facilitada por el a Rn . Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.

Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligoméricos, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), empalmadores alternos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. Como tales, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico particular, en el contexto de esta divulgación, puede ser un procedimiento multietapa. El procedimiento generalmente empieza con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función va a modularse. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgación, el ácido nucleico diana codifica la Sirtuina 1 (SIRT1).

El procedimiento de direccionamiento generalmente también incluye la determinación de al menos una región diana, segmento, o sitio dentro del ácido nucleico diana para que la interacción antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, p. ej., la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente divulgación, el término "región" se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de los ácidos nucleicos diana hay segmentos. "Segmentos" se definen como partes más pequeñas o subpartes de regiones dentro de un ácido nucleico diana. "Sitios", como se usa en la presente divulgación, se define como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.

En un caso preferido, los oligonucleótidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales de la Sirtuina 1 (SIRT1) y modulan la expresión y/o la función de la Sirtuina 1 (SIRT1) (SEQ ID NO: 1). Ejemplos de secuencias antisentido incluyen las SEQ ID NO: 3 a 66.

En otro caso preferido, los oligonucleótidos antisentido se unen a uno o más segmentos de polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) y modulan la expresión y/o función de la Sirtuina 1 (SIRT1). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleótidos consecutivos de los polinucleótidos sentido o antisentido de Sirtuina 1 (SIRT1).

En otro caso preferido, los oligonucleótidos antisentido son específicos para secuencias antisentido naturales de Sirtuina 1 (SIRT1) en donde la unión de los oligonucleótidos a las secuencias antisentido naturales de Sirtuina 1 (SIRT1) modulan la expresión y/o función de la Sirtuina 1 (SIRT1).

En otro caso preferido, los compuestos oligonucleótidos comprenden secuencias antisentido establecidas como SEQ ID NOS: 9 a 66, secuencias antisentido que se identifican y expanden usando, por ejemplo, PCR, hibridación etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Ejemplos de enlaces modificados o uniones internucleotídicas comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro caso preferido, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente divulgación puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, per se, es también conocida y no es necesario describirla en este documento.

Ya que se conoce en la técnica, el codón de iniciación de la traducción es típicamente 5'-AUG (en moléculas ARNm transcritos; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de iniciación de la traducción también se refiere como el "codón AUG," el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Una minoría de genes tiene un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. Así, las expresiones «codón de iniciación de la traducción» y «codón de inicio» pueden abarcar muchas secuencias de codón, aun cuando el aminoácido iniciador en cada caso típicamente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de inicio alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferentemente para la iniciación de la traducción en un tipo particular de célula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgación, «codón de inicio» y «codón de iniciación de la traducción» se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica la Sirtuina 1 (SIRT1), independientemente de la(las) secuencia(s) de tales codones. Un codón de terminación de la traducción (o "codón de terminación") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).

Los términos "región de codón de inicio" y "región de codón de iniciación de traducción" se refiere a una parte de tal ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos bien en cualquier dirección (i.e., 5' o 3') desde un codón de iniciación de la traducción. De forma análoga, las expresiones «región de codón de parada» y «región de codón de terminación de la traducción» se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que abarca de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (i.e. 5' o 3') desde un codón de terminación de la traducción. En consecuencia, la "región de codón de inicio" (o "región de codón de iniciación de la traducción") y la "región de codón de parada" (o "región de codón de terminación de la traducción") son todas las regiones que pueden ser dirigidas de manera efectiva con los compuestos antisentido de la presente divulgación.

El marco de lectura abierto (ORF) o "región de codificación" que se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción es también una región que puede ser dirigida de manera efectiva. Dentro del contexto de la presente divulgación, una región dirigida es la región intragénica que abarca el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) de un gen.

Otra región diana incluye la región 5' sin traducir (5'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de iniciación de la traducción y por tanto que incluye nucleótidos entre el sitio 5' de terminación y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). Otra región diana más incluye la región no traducida 3' (3'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción, y que incluye, por lo tanto, nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un resto de guanosina N7 metilado unido al resto más 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La región caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', así como los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio caperuza. Otra región diana para esta descripción es la región caperuza 5'.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariótico están traducidos directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones," que se excinden de un transcrito antes de que sean traducidos. Las regiones restantes (y, por lo tanto, traducidas) se conocen como «exones» y se empalman juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, el direccionamiento de sitios de empalme, es decir, las uniones intrón-exón o uniones exón-intrón, es particularmente útil en situaciones donde el empalme aberrante está implicado en la enfermedad, o cuando una producción en exceso de un producto de empalme particular está implicada en la enfermedad. Una unión de fusión aberrante debido al reordenamiento o deleción es otro aspecto de un sitio diana. Los transcritos de ARNm producidos mediante el proceso de empalme de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como «transcritos de fusión». Los intrones pueden ser eficazmente dirigidos usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.

En otro ejemplo preferido, los oligonucleótidos antisentido se unen a regiones codificadoras y/o no codificadoras de un polinucleótido diana y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En otro ejemplo preferido, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos antisentido naturales y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En otro ejemplo preferido, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos sentido y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

Los transcritos de ARN alternativos se pueden producir a partir de la misma región genómica de ADN. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como «variantes». Más específicamente, las «variantes de pre-ARNm» son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que difieren de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico en su posición de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intrónica como exónica.

Después de la excisión de uno o más regiones de exones o de intrones, o porciones de las mismas durante el empalme, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm". En consecuencia, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm única siempre debe producir una variante de ARNm única como resultado del empalme. Estas variantes de ARNm también se conocen como «variantes de empalme alternativas». Si no se produce el empalme de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm.

Las variantes se pueden producir mediante el uso de señales alternativas para iniciar o terminar la transcripción. Los pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de iniciación o codón de terminación. Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de inicio alternativos se conocen como «variantes de inicio alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codón de terminación alternativo se conocen como «variantes de terminación alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de terminación alternativa es la «variante de poliA», donde los múltiples transcritos producidos resultan de la selección alternativa de una de las «señales de terminación de poliA» por la maquinaria de transcripción, produciendo de este modo transcritos que terminan en sitios de poliA únicos. Dentro del contexto de la divulgación, los tipos de variantes descritos en este documento también son aspectos de ácidos nucleicos diana.

Las localizaciones del ácido nucleico diana a las que se hibridan los compuestos antisentido se definen como al menos una porción de 5 nucleótidos de longitud de una región diana a la que se direcciona un compuesto antisentido.

Aunque las secuencias específicas de determinados segmentos diana se especifican en el presente documento, un experto en la materia reconocerá que estas sirven para ilustrar y describir casos particulares dentro del alcance de la presente divulgación. Los segmentos diana adicionales son fácilmente identificables por un experto en la materia en vista de esta divulgación.

Los segmentos diana de 5-100 nucleótidos de longitud que comprenden un alargamiento de al menos cinco (5) nucleótidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos se consideran que son adecuados también para el direccionamiento.

Los segmentos diana pueden incluir secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana ejemplares preferidos (siendo los nucleótidos restantes un alargamiento consecutivo del mismo ADN o ARN que comienza inmediatamente corriente arriba del extremo 5' del segmento diana y que continua hasta que el ADN o ARN contiene aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). De forma similar, los segmentos diana preferidos se representan mediante secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 3' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleótidos un alargamiento consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente corriente abajo del extremo 3' del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contiene de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). Un experto en la materia armado con los segmentos diana ilustrados en este documento será capaz, sin excesiva experimentación, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.

Una vez que una o más regiones, segmento o sitios diana se han identificado, los compuestos antisentido se eligen para que sean lo suficientemente complementarios a la diana, es decir, se hibriden lo suficientemente bien y con suficiente especificidad para proporcionar el efecto deseado.

En casos de la divulgación los oligonucleótidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleótidos tienen al menos 5 nucleótidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleótido se dirija a secuencias solapantes de manera que los oligonucleótidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleótido diana. Las dianas también incluyen regiones codificantes, además de no codificantes.

En un caso, se prefiere direccionar ácidos nucleicos específicos mediante oIigonucleótidos antisentido. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular es un procedimiento multietapa. El procedimiento generalmente empieza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o un polinucleótido no codificante tal como, por ejemplo, ARN no codificante (ARNnc).

Los ARN se pueden clasificar en (1) ARN mensajero (ARNm), que se traduce nen proteínas, y (2) ARN de proteínas no codificantes (ARNnc). El ARNnc comprende microARN, transcritos antisentido y otras Unidades Transcricionales (UT) que contienen una alta densidad de codones de terminación y que carece de cualquier "Marco de Lectura Abierto" extensivo. Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciación en regiones no traducidas 3' (3'UTR) de loci codificantes de proteínas. Los ARNnc son frecuentemente raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado mediante el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayoría de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se ha mostrado que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las llamadas regiones intergénicas (Cheng, J. et al. (2005) Science 308 (5725), 1149-1154; Kapranov, P. et al. (2005). Genome Res 15 (7), 987-997). El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresión génica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que están codificados en la misma ubicación genética, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actúan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que están codificados en una ubicación cromosómica distinta de los ARN en los que actúan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.

Sin pretender estar ligado por ninguna teoría la perturbación de un polinucleótido antisentido mediante los oligonucleótidos antisentido descritos en este documento pueden alterar la expresión de los ARN mensajeros con sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulación puede tanto ser discordante (la inactivación antisentido produce elevación de ARN mensajero) como concordante (la inactivación antisentido produce reducción concomitante de ARN mensajero). En estos aspectos, los oligonucleótidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivación o secuestro. El antisentido codificante, así como el no codificante, pueden ser dirigidos de una manera idéntica y esa categoría es capaz de regular los transcritos con sentido correspondientes, tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleótidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivación de transcritos de ARN antisentido por oligonucleótidos antisentido o cualquier otro medio de modulación de la diana deseada.

Estrategia 1: En el caso de una regulación discordante, la inactivación del transcrito antisentido eleva la expresión del gen convencional (con sentido). Si el último gen debe codificar un fármaco diana conocido o supuesto, entonces la inactivación de su homólogo antisentido podría imitar posiblemente la acción de un agonista receptor o una enzima estimulante.

Estrategia 2: En el caso de una regulación concordante, podrían inactivarse de forma conjunta tanto los transcritos antisentido como con sentido y lograr de esa manera una reducción sinérgica de la expresión génica (con sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido se usa para lograr la inactivación, entonces esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleótido antisentido dirigido al transcrito con sentido y otro oligonucleótido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un único oligonucleótido antisentido energéticamente simétrico que se dirige simultáneamente a transcritos con sentido y antisentido solapantes.

De acuerdo con la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), compuestos de ARNsi, compuestos de interferencia (ARNi) de ARN mono o bicatenario tales como compuestos de ARNsi, y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Como tales, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma habitual linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro manera para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir constructos tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una única cadena con autocomplementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden incluir nucleótidos protuberantes en los extremos. Las modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto de ácido no nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el ARNds puede adoptar la forma de una molécula tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. Así, el ARNds puede ser completa o parcialmente bicatenario. La modulación específica de la expresión génica puede lograse mediante la expresión estable de horquillas de ARNds en líneas celulares transgénicas, sin embargo, en algunos aspectos, la expresión o función génica está regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una sola cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden funcionar a través de mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos) pueden describirse como "similares a ^a Dⁿ " (es decir, que generalmente tienen uno o más 2 '-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilazúcares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos aspectos (quiméricos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.

En otro aspecto preferido, los oligonucleótidos deseados o compuestos antisentido comprenden al menos uno de: ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeño (ARNsi); un microARN interferente (ARNmi); un ARN temporal pequeño (ARNst); o un ARN de horquilla corto (ARNsh); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); ARN de activación pequeño (ARNsa), o combinaciones de los mismos.

El ARNds también puede activar la expresión génica, un mecanismo que se ha denominado «activación génica inducida por ARN pequeño» o ARNa. Los promotores génicos que se dirigen a ARNds inducen la potente activación transcripcional de los genes asociados. El ARNa se demostró en células humanas usando ARNds sintéticos, denominados «ARN de activación pequeño» (ARNsa). No se sabe actualmente si el ARNa se conserva en otros organismos.

Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeño (ARNdc), tal como ARN de interferencia pequeño (ARNsi) y el microARN (ARNmi), es el desencadenante de un mecanismo evolutivamente conservado conocido como interferencia por ARN (ARNi). La ARNi conduce invariablemente al silenciamiento génico mediante la remodelación de cromatina para suprimir de este modo la transcripción, la degradación de ARNm complementario, o el bloqueo de la traducción de proteínas. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la sección de ejemplos a continuación, se muestra que los oligonucleótidos aumentan la expresión y/o función de los polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) y los productos codificados de los mismos. Los ARNds también pueden actuar como ARN de activación pequeños (ARNsa). Sin desear quedar ligado a teoría alguna, al dirigir las secuencias en los promotores génicos, los ARNsa inducirían la expresión de genes diana en un fenómeno denominado activación transcripcional inducida por ARNds (ARNa).

En un aspecto adicional, los «segmentos diana preferidos» identificados en este documento pueden emplearse en un proceso de cribado de compuestos adicionales que modulan la expresión de polinucleótidos de sirtuina 1 (SIRT1). Los "moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica Sirtuina 1 (SIRT1) y que comprenden al menos una parte de 5 nucleótidos que es complementaria a un segmento diana preferido. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana preferido de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos sentido o antisentido naturales de Sirtuina 1 (SIRT1) con uno o más moduladores candidatos, y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1), por ejemplo, las SEQ ID NOS: 9 a 66. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (p. ej., tanto disminuir como aumentar) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1), el modulador puede entonces emplearse en estudios de investigación adicionales de la función de polinucleótidos de Sirtuina 1(SIRT1), o para uso como un agente de investigación, diagnóstico o terapéutico de acuerdo con la presente divulgación.

El direccionamiento de la secuencia antisentido natural modula preferentemente la función del gen diana. Por ejemplo, el gen SIRT1 (p. ej., número de acceso NM_012238.3, Fig. 15). En un aspecto preferido, la diana es un polinucleótido antisentido del gen de la Sirtuina 1. En un aspecto preferido, un oligonucleótido antisentido se dirige a secuencias con sentido y/o antisentido naturales de polinucleótidos de Sirtuina 1(SIRT1) (p. ej., número de acceso NM_012238.3, Fig. 15) variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a las mismas. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleótidos antisentido y/o con sentido de SIRT1.

Los segmentos diana preferidos de la presente divulgación también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgación para formar oligonucleótidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.

Se ha mostrado en la técnica que tales restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión de la diana y regulan la traducción, así como el procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden estar sujetos a modificaciones químicas (Fire et al., (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons y Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons et al., (2001) Gene, 263, 103-112; Tabara et al., (1998) Science, 282, 430-431; Montgomery et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507; Tuschl et al., (1999) Genes Dev., 13, 31913197; Elbashir et al., (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir et al., (2001) Genes Dev. 15, 188-200). Por ejemplo, tales restos bicatenarios han mostrado que inhiben la diana mediante la hibridación clásica de la cadena antisentido del dúplex a la diana, desencadenando de ese modo la degradación enzimática de la diana (Tijsterman et al., (2002) Science, 295, 694-697).

En un aspecto preferido, un oligonucleótido antisentido se dirige a polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) (p. ej., número de acceso NM_012238.3), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

De acuerdo con aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no se limita a Sirtuina 1 (SIRT1) sola, sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homólogos y similares de las moléculas de Sirtuina 1 (SIRT1).

En otro caso preferido, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de polinucleótidos SIRT1, por ejemplo, polinucleótidos establecidos como SEQ ID NO: 3 a 8, y cualquier variante, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 9 a 66.

En un aspecto, los oligonucleótidos son complementarios a, o se unen a, secuencias de ácido nucleico de Sirtuina 1 (SIRT1) antisentido, incluyendo sin limitación secuencias sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) y modulan la expresión y/o función de moléculas de Sirtuina 1 (SIRT 1).

En otro aspecto preferido, los oligonucleótidos son complementarios o se unen a secuencias de ácido nucleico de SIRT1 natural antisentido, expuestas como las SEQ ID NO: 3 a 8 y modulan la expresión y/o función de las moléculas SIRT1.

En un aspecto preferido, los oligonucleótidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleótidos consecutivos de las SEQ ID NOS: 9 a 66 y modulan la expresión y/o función de las moléculas de Sirtuina 1 (SIRT1).

Las dianas polinucleotídicas comprenden SIRT1, incluyendo miembros de la familia de las mismas, variantes de SIRT1; mutantes de SIRT1, incluyendo SNP; secuencias no codificantes de SIRT1; alelos de SIRT1; variantes de especies, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

En otro aspecto preferido, el oligonucleótido que se dirige a polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1), comprende: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeño (ARNsi); microARN interferente (ARNmi); un ARN temporal pequeño (ARNst); o un ARN de horquilla corto (ARNsh); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); o, ARN de activación pequeño (ARNsa).

En otro caso preferido, el direccionamiento de polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1), p. ej. SEQ ID NO: 3 a 8, modula la expresión o función de estas dianas. En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En otro aspecto preferido, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control.

En otro aspecto preferido, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NOS: 9 a 66. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares.

En otro caso preferido, las SEQ ID NOS: 9 a 66 comprenden uno o más nucleótidos de ANB.

La tabla 1 muestra oligonucleótidos antisentido ilustrativos útiles en los métodos de la divulgación.

La modulación de un ácido nucleico diana deseado puede llevarse a acabo de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ARNsi, etc. Las moléculas de ácido nucleico enzimático (por ejemplo, las ribozimas) son moléculas de ácido nucleico capaces de catalizar una o más de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moléculas de ácidos nucleicos separadas en un modo específico de secuencia de bases de nucleótidos. Tales moléculas de ácido nucleico enzimático se pueden usar, por ejemplo, para direccionar virtualmente cualquier transcrito de ARN (Zaug et al., 324, Nature 429 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; y Jefferies et al., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989).

Debido a su especificidad de secuencia, las moléculas de ácido nucleico enzimático que se escinden en trans muestran promesa como agentes terapéuticos para enfermedad humana (Usman & McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem.

30, 285-294; Christoffersen y Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Las moléculas de ácido nucleico enzimático pueden diseñarse para escindir dianas de ARN específicas dentro del fondo del ARN celular. Un acontecimiento de escisión de este tipo hace que el ARNm no sea funcional y anula la expresión de proteínas de ese ARN. De este modo, la síntesis de una proteína asociada a una patología puede inhibirse de forma selectiva.

En general, los ácidos nucleicos enzimáticos con actividad de escisión de ARN actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión se produce a través de la parte de unión de diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. Así, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y a continuación se une a un ARN diana mediante el apareamiento de bases complementarias, y una vez se une al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de unirse un ácido nucleico enzimático y escindir su ARN diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y poder unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

Se han usado diversos enfoques como las estrategias de selección in vitro (evolución) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435) para evolver nuevos catalizadores de ácidos nucleicos capaces de catalizar una variedad de reacciones, tales como la escisión y ligado de enlazadores de fosfodiéster y enlazadores de amida, (Joyce, (1989) Gene, 82, 83-87; Beaudry et al., (1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker et al., (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel et al., (1993) Science 261:1411-1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar et al., (1995) FASEB J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 7, 442).

El desarrollo de ribozimas que son óptimas para la actividad catalítica contribuiría significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresión génica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalítica (kcat ) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones de saturación (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de «ligasa de ARN» artificial cataliza la reacción de automodificación correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Además, se sabe que determinadas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen grupos de unión al sustrato hechos de ADN catalizan la escisión de ARN con múltiples velocidades de renovación que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitución de un resto específico dentro del núcleo catalítico de la cabeza de martillo con determinados análogos de nucleótido proporciona ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalítica. Estos hallazgos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones químicas con velocidades catalíticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayoría de las ribozimas naturales de autoescisión. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se autoescinden puedan optimizarse para dar la máxima actividad catalítica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente más rápidas para la escisión de fosfodiéster de ARN.

La escisión intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se demostró por primera vez en 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). El catalizador de ARN se recuperó y se hizo reaccionar con múltiples moléculas de ARN, lo que demuestra que era verdaderamente catalítico.

Los ARN catalíticos diseñados en base al motivo "cabeza de martillo" se han usado para escindir secuencias diana específicas al producir cambios de bases apropiados en el ARN catalítico para mantener el apareamiento necesario de bases con las secuencias diana (Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M., et al. (1988) FEBS Lett., 228: 228-230). Esto ha permitido el uso del ARN catalítico para escindir secuencias diana específicas e indica que los ARN catalíticos diseñados de acuerdo con el modelo de «cabeza de martillo» pueden escindir posiblemente ARN de sustrato específico in vivo. (véase Haseloff y Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Walbot y Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600).

El ARN de interferencia (ARNi) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresión génica en mamíferos y células de mamífero. Este enfoque requiere el suministro de ARN de interferencia pequeño (ARNsi) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plásmido de expresión o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla corto que se procesa a ARNsi. Este sistema permite el transporte eficaz de los pre-RNAsi al citoplasma donde son activos y permiten el uso de promotores regulados y específicos de tejido para la expresión génica.

En un aspecto preferido, un oligonucleótido o compuesto antisentido comprende un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN), o un mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleótidos de origen natural, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (estructura), así como oligonucleótidos que tienen partes de origen no natural que funcionan de forma similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, mayor captación celular, afinidad mejorada por un ácido nucleico diana y mayor estabilidad en presencia de nucleasas.

De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos o «compuestos antisentido» incluyen oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos), ribozimas, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), compuestos de ARNsi, compuestos de interferencia (ARNi) de ARN mono o bicatenario tales como compuestos de ARNsi, ARNsa, ARNa, y otros compuestos oligoméricos que se hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Como tales, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma habitual linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otra manera para que sean circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden incluir constructos tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una única cadena con autocomplementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden incluir nucleótidos protuberantes en los extremos. Las modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto de ácido no nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el ARNds puede adoptar la forma de una molécula tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. Así, el ARNds puede ser completa o parcialmente bicatenario. La modulación específica de la expresión génica se puede lograr por expresión estable de las horquillas de ARNds en líneas de células transgénicas (Hammond et al., (1991) Nat. Rev. Genet., 2, 110-119; Matzke et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) Genes Dev., 15, 485-490). Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una sola cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden funcionar a través de mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos) pueden describirse como "similares a ^a Dⁿ " (es decir, que generalmente tienen uno o más 2 '-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en vez de U) o "similares a ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilazúcares o azucares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos aspectos (quiméricos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones en forma A como B.

Los compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgación pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleótidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleósidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgación comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgación (tal como un ARNds, por ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que este comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En un aspecto, los compuestos antisentido de la descripción tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que estos incorporan oligonucleótidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias. En algunos aspectos, los oligonucleótidos tienen 15 nucleótidos de longitud.

En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleótido de la divulgación tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleótidos de longitud. Un experto en la materia apreciará que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo entremedias.

En un aspecto preferido, la administración de al menos un oligonucleótido dirigido a uno o más polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) evita o trata enfermedades asociadas con la expresión o función anormal de los polinucleótidos de Sirtuina 1(SIRT1) y productos codificados de los mismos, u otras enfermedades relacionadas. Ejemplos de enfermedades que se pueden tratar con los oligonucleótidos antisentido comprenden: cáncer (p. ej., cáncer de mama, cáncer colorrectal, CCL, CML, cáncer de próstata), una enfermedad o trastorno neurodegenerativa (p. ej., enfermedad de Alzheimer (AD), enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ALS), Esclerosis Múltiple y trastornos causados por agregación de poliglutamina); enfermedad del músculo esquelético (p. ej., distrofia muscular de Duchene, atrofia muscular esquelética, distrofia de Becker o distrofia miotónica); una enfermedad metabólica (p. ej., resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, intolerancia a la glucosa, colesterol en sangre elevado, hiperglucemia, dislipidemia e hiperlipidemia); diabetes de inicio en adulto, nefropatía diabética, neuropatía (p. ej., neuropatía sensorial, neuropatía autonómica, neuropatía motora, retinopatía); enfermedad ósea (p. ej., osteoporosis), una enfermedad sanguínea (p. ej., una leucemia); enfermedad hepática (p. ej., debida al abuso del alcohol o hepatitis); obesidad; resorción ósea, degeneración macular asociada a la edad, demencia asociada al SIDA, ALS, Palsy de Bell, aterosclerosis, una enfermedad cardiaca (p. ej., disrritmias cardiacas, fallo cardiaco congestivo crónicoinfarto isquémico, enfermedad de arteria coronaria y cardiomiopatía), enfermedad crónicamente degenerativa (p. ej., enfermedad del músculo cardiaco), fallo renal crónico, diabetes de tipo 2 , ulceración, catarata, presbiopia, glomerulonefritis, síndrome de Guillan-Barre, infarto hemorrágico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria de bowel, SLE, enfermedad de Crohn, osteoartritis, osteoporosis, Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica (COPD), neumonía, envejecimiento de la piel, incontinencia urinaria, una enfermedad o trastorno asociado con la disfunción mitocondrial (p. ej., miopatía mitocondrial, encefalopatía, enfermedad de Leber, cefalopatía de Leigh, enfermedad, enfermedad de Pearson, acidosis láctica, encefalopatía mitocondrial, acidosis láctica y síntomas como los síntomas de infarto (MELAS) etc.) y una enfermedad o trastorno asociado con muerte celular neuronal, envejecimiento u otra afección caracterizada por pérdida celular no deseada.

En aspectos de la presente divulgación, se proporcionan regímenes terapéuticos y/o cosméticos y tratamientos adaptados relacionados a sujetos que requieren tratamientos de la piel o en riesgo de desarrollar afecciones para las que requerirán tratamientos para la piel. El diagnóstico se puede hacer, p. ej., en función del estado del SIRT1 del sujeto. Los niveles de expresión de SIRT1 de un paciente en un tejido dado tal como la piel se pueden determinar por métodos conocidos por los expertos en la técnica y descritos en otra parte en el presente documento, p. ej., analizando tejido usando PCR o métodos de detección basados en anticuerpos.

Un aspecto preferido de la presente divulgación proporciona una composición para el tratamiento de la piel y/o una aplicación cosmética que comprende oligonucleótidos antisentido de SIRT 1, p. ej., para regular en sentido ascendente la expresión de SIRT1 en la piel. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NO: 3 a 66. La patente de EE.UU. No. 7,544,497, "Compositions for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms," describe el uso cosmético potencia para agentes que modulan la actividad de SIRT1 reduciendo la Km de la proteína SIRT1 para su sustrato. En algunos aspectos, las células se tratan in vivo con los oligonucleótidos de la presente divulgación, para aumentar la esperanza de vida celular o prevenir la apoptosis. Por ejemplo, la piel puede protegerse del envejecimiento, p. ej., el desarrollo de arrugas, tratando la piel, p. ej., células epiteliales, como se describe en el presente documento. En un aspecto ilustrativo, la piel se pone en contacto con una composición farmacéutica o cosmética que comprende un compuesto antisentido SIRT1 como se describe en el presente documento. Lesiones cutáneas ilustrativas o afecciones de la piel incluyen trastornos o enfermedades asociadas con o causadas por inflamación, daño solar o envejecimiento natural. Por ejemplo, las composiciones encuentran utilidad en la prevención o tratamiento de dermatitis de contacto (incluyendo dermatitis de contacto irritante y dermatitis de contacto alérgica), dermatitis atópica (también conocida como eccema alérgico), queratosis actínica, trastornos de queratinización (incluyendo eczema), enfermedades de epidermólisis bullosa (incluyendo pénfigo), dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritemas (incluyendo eritema multiforme y eritema nodoso), daño causado por el sol u otras fuentes de luz, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, cáncer de piel y efectos del envejecimiento natural.

Se ha informado que SIRT 1 interfiere con la señalización del receptor de andrógenos inducido por dihidrotestosterona. (Véase, p. ej., Fu, et al., 2006, "Hormonal Control of Androgen Receptor Function through SIRT1," Molecular and Cellular Biology 26(21): 8122-8135.)

En los aspectos de la presente divulgación, una composición que comprende oligonucleótidos antisentido SIRT1, p. ej., para regular al alza la expresión de SIRT1 en el cuero cabelludo e inhibir la señalización del receptor de andrógenos, previniendo así la alopecia androgenética (perdida de cabello). En aspectos, a un paciente que padece alopecia se le administra una formulación tópica o sistémica.

En un caso, un oligonucleótido antisentido descrito en este documento se incorpora a una formulación tópica que contiene un vehículo tópico que es generalmente adecuado para la administración tópica de fármacos y que comprende cualquier material conocido en la técnica. El vehículo tópico puede seleccionarse para proporcionar la composición en la forma deseada, por ejemplo, como ungüento, loción, crema, microemulsión, gel, aceite, solución o similar, y puede estar compuesto de un material de origen natural o de origen sintético. Es preferible que el vehículo seleccionado no afecte adversamente al agente activo u otros componentes de la formulación tópica. Los ejemplos de vehículos tópicos adecuados para su uso en el presente documento incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras y similares. Las formulaciones pueden ser ungüentos, lociones, cremas, microemulsiones y geles incoloros e inodoros.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en ungüentos, que generalmente son preparaciones semisólidas que se basan típicamente en vaselina u otros derivados del petróleo. La base de ungüento específica a usar, como apreciarán los expertos en la técnica, es aquella que proporcionará una administración óptima del fármaco y, preferiblemente, proporcionará otras características deseadas también, por ejemplo, emoliencia o similar. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y sin sensibilidad. Como se explica en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.), las bases de ungüentos se pueden agrupar en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsionables; bases de emulsión; y bases solubles en agua. Las bases oleaginosas para ungüentos incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de ungüentos emulsionables, también conocidas como bases de ungüentos absorbentes, contienen poca o nada de agua e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Las bases de ungüentos en emulsión son emulsiones de agua en aceite (W/O) o emulsiones de aceite en agua (O/W) e incluyen, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de pomada solubles en agua ilustrativas a partir de polietilenglicoles (PEG) de peso molecular variable (véase, p. ej., Remington's, más arriba).

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en lociones, que generalmente son preparaciones para aplicar a la superficie de la piel sin fricción, y son típicamente preparaciones líquidas o semilíquidas en las que partículas sólidas, incluido el agente activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Las lociones son usualmente suspensiones de sólidos, y pueden comprender una emulsión oleosa líquida del tipo de aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas para tratar grandes áreas corporales, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. Generalmente, es necesario que la materia insoluble sea una loción que esté finamente dividida. Las lociones típicamente contendrán agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, así como compuestos útiles para localizar y mantener el agente activo en contacto con la piel, p. ej., metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, o similares. Una formulación de loción ejemplar para usar junto con el presente método contiene propilenglicol mezclado con una vaselina hidrófila tal como la que puede obtenerse con la marca comercial Aquaphor.sup.RTM de Beiersdorf, Inc. (Norwalk, Conn.).

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en cremas, que generalmente son emulsiones viscosas líquidas o semisólidas, ya sea de aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua, y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa está generalmente compuesta por vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa usualmente, aunque no necesariamente, excede la fase oleosa en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación en crema, como se explica en Remington's, más arriba, es generalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en microemulsiones, que generalmente son estables termodinámicamente, dispersiones isotópicamente claras de dos líquidos inmiscibles, tales como aceite y agua, estabilizados por una película interfacial de moléculas tensioactivas (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (Nueva York: Marcel Dekker, 1992), volumen 9. Para la preparación de microemulsiones, se necesitan un tensioactivo (emulsionante), cotensioactivo (coemulsionante), una fase oleosa y una fase acuosa. Los tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo que sea útil en la preparación de emulsiones, por ejemplo, emulsionantes que se usan típicamente en la preparación de cremas. El cotensioactivo (o "coemulsionante") generalmente se selecciona del grupo de derivados de poliglicerol, derivados de glicerol y alcoholes grasos. Las combinaciones preferidas de emulsionante/coemulsionante se seleccionan generalmente, aunque no necesariamente, del grupo que consiste en monoestearato de glicerilo y estearato de polioxietileno, palmitoestearato de polietilenglicol y etilenglicol, así como triglicéricos caprílicos y cápricos y macrogolglicéridos oleosos. La fase acuosa no solo incluye agua sino también, típicamente, amortiguadores, glucosa, propilenglicol, polietilenglicoles, preferentemente polietilenglicoles de bajo peso molecular (p. ej., PEG 300 y PEG 400) y/o glicerol y similares, mientras que la fase oleosa generalmente comprende, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos, aceites vegetales modificados, aceites de silicona, mezclas de mono-, di- y triglicéridos, mono- y diésteres de PEG (p. ej., macrogol glicéridos oleosos), etc.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en formulaciones de gel, que generalmente son sistemas semisólidos que consisten en suspensiones formadas por partículas inorgánicas pequeñas (sistemas de dos fases) o moléculas orgánicas grandes distribuidas de forma sustancialmente uniforme por todo un líquido transportador (geles de fase única). Los geles monofásicos se pueden preparar, por ejemplo, combinando el agente activo, un líquido portador y un agente gelificante adecuado tal como tragacanto (del 2 al 5%), alginato sódico (al 2-10%), gelatina (al 2-15%), metilcelulosa (al 3-5%), carboximetilcelulosa sódica (al 2-5%), carbómero (al 0,3-5%) o alcohol polivinílico (al 10-20%) juntos y en mezcla hasta que se produce un producto semisólido característico. Otros agentes gelificantes adecuados incluyen metilhidroxicelulosa, polioxietileno-polioxipropileno, hidroxietilcelulosa y gelatina. Aunque los geles comúnmente emplean un líquido portador acuoso, también se pueden usar alcoholes y aceites como el líquido transportador.

Se pueden incluir diversos aditivos, conocidos por los expertos en la materia, en las formulaciones, p. ej., formulaciones tópicas. Los ejemplos de aditivos incluyen, pero no se limitan a, solubilizantes, potenciadores de la permeación de la piel, opacificantes, conservantes (p. ej., antioxidantes), agentes gelificantes, agentes tamponantes, tensioactivos (particularmente tensioactivos no iónicos y anfóteros), emulsionantes, emolientes, agentes espesantes, estabilizadores, humectantes, colorantes, fragancias, y similares. La inclusión de solubilizantes y/o potenciadores de la permeación de la piel es particularmente preferida, junto con emulsionantes, emolientes y conservantes. Una formulación tópica óptima comprende aproximadamente del 2% en peso al 60% en peso, preferiblemente del 2% en peso% al 50% en peso de solubilizador y/o potenciador de la permeación de la piel; del 2% en peso al 50% en peso, preferiblemente del 2% en peso% al 20% en peso de emulsionantes; del 2% en peso al 20% en peso de emoliente; y del 0,01 al 0,2% en peso de conservante, constituyendo el agente activo y el vehículo (p. ej., agua) el resto de la formulación.

Un potenciador de la permeación de la piel sirve para facilitar el paso de niveles terapéuticos de agente activo para pasar a través de un área de tamaño razonable de piel intacta. Los potenciadores adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo: alcanoles inferiores tales como metanol etanol y 2-propanol; alquil metil sulfóxidos tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO) decilmetilsulfóxido (MSO C10) y sulfóxido de tetradecilmetilo; pirrolidonas tales como 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona y N-(-hidroxietil)pirrolidona; urea; N,N-dietil-m-toluamida; alcanodioles C2-C6; diversos disolventes tales como dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA) y alcohol tetrahidrofurfurílico; y las azacicloheptan-2-onas sustituidas en 1, particularmente 1 -n-dodecilciclazacicloheptan-2-ona (laurocapram; disponible bajo la marca registrada Azone.sup.RTM de Whitby Research Incorporated, Richmond, Va.).

Los ejemplos de solubilizantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: éteres hidrófilos tales como dietilenglicol monoetil éter (etoxidiglicol, disponible comercialmente como Transcutol.sup.RTM) y oleato de dietilenglicol monoetil éter (disponible comercialmente como Soficutol.sup.RTM); derivados de aceite de ricino de polietileno tales como aceite de ricino polioxi 35, aceite de ricino hidrogenado polioxi 40, etc.; polietilenglicol, particularmente polietilenglicoles de menor peso molecular tales como PEG 300 y PEG 400, y derivados de polietilenglicol tales como glicéridos caprílicos/cápricos PEG-8 (disponibles comercialmente como Labrasol.sup.RTM); alquilmetilsulfóxidos tales como DMSO; pirrolidonas tales como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; y ADM. Muchos solubilizantes también pueden actuar como potenciadores de la absorción. Se puede incorporar un único solubilizante en la formulación, o se puede incorporar una mezcla de solubilizantes en la misma.

Los emulsionantes y coemulsionantes adecuados incluyen, sin limitación, los emulsionantes y coemulsionantes descritos con respecto a las formulaciones en microemulsión. Los emolientes incluyen, por ejemplo, propilenglicol, glicerol, miristato de isopropilo, propionato de polipropilenglicol-2 (PPG-2) éter miristílico y similares.

Otros agentes activos también se pueden incluir en formulaciones, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes y bloqueadores solares que se encuentran comúnmente en formulaciones de protección solar incluyendo, pero no se limitan a, antranilatos , benzofenonas (particularmente benzofenona-3), derivados de alcanfor, cinamatos (por ejemplo, metoxicinamato de octilo), metanos de dibenzoílo (por ejemplo, butil metoxidibenzoil metano ), ácido p-aminobenzoico (PABA) y derivados de los mismos, y salicilatos (p. ej., salicilato de octilo).

En otro aspecto preferido, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes donde una base diferente está presente en una o más de las posiciones de nucleótido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de ARNds. Estos compuestos se ensayan entonces usando los procedimientos descritos en este documento para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o aproximadamente el 100%.

En otro aspecto preferido, los oligonucleótidos antisentido, tales como, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico expuestas en la SEQ ID NOS: 9 a 66 comprenden una o más sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleótidos están sustituidos con ácidos nucleicos bloqueados (ANB).

En otro aspecto preferido, los oligonucleótidos se dirigen a una o más regiones de las moléculas de ácido nucleico que son sentido y/o antisentido de las secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas con SIRT1 y las secuencias expuestas como las SEQ ID NO: 1 a 8. Los oligonucleótidos también se direccionan a las regiones solapantes de las SEQ ID NOS: 1 a 8.

Determinados oligonucleótidos preferidos de esta divulgación son los oligonucleótidos quiméricos. «Oligonucleótidos quiméricos» o «quimeras», en el contexto de esta divulgación, son oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta por al menos un nucleótido. Estos oligonucleótidos típicamente contienen al menos una región de nucleótidos modificados que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, una mayor resistencia a nucleasas, una mayor captación en células, una mayor afinidad de unión por la diana) y una región que es un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de ARNasa H, por lo tanto, produce la escisión de la diana de ARN, mejorando de este modo en gran medida la eficiencia de la modulación antisentido de la expresión génica. En consecuencia, con frecuencia pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que se hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN se puede detectar de forma rutinaria mediante electroforesis con gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas conocidas en la técnica. En un aspecto preferido, un oligonucleótido quimérico comprende al menos una región modificada para aumentar la afinidad de unión de la diana, y, normalmente, una región que actúa de sustrato para ARNasa H. La afinidad de un oligonucleótido por su diana (en este caso, un ácido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleótido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleótido y la diana; la disociación se detecta espectrofotométricamente. Cuanto mayor sea la Tm, mayor será la afinidad del oligonucleótido por la diana.

Se pueden formar compuestos antisentido quiméricos de la divulgación como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos, tal como se ha descrito anteriormente. Dichos compuestos también se han denominado en la técnica híbridos o gapmeros. Las patentes representativas de EE.UU. que muestran la preparación de tales estructura híbridas comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nos. 5.013.830; 5.149.797; 5, 220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.

En otro aspecto preferido, la región del oligonucleótido que se modifica comprende al menos un nucleótido modificado en la posición 2' del azúcar, de la forma más preferente un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluoro. En otros aspectos preferidos, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'-flúor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, restos abásicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Tales modificaciones se incorporan habitualmente en los oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de unión a diana) que los 2'-desoxioligonucleótidos frente a una diana dada. El efecto de tal afinidad aumentada es mejorar en gran medida la inhibición por oligonucleótidos de ARNi de la expresión génica. La ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los dúplex de a RN:ADN; por lo tanto, la activación de esta enzima produce la escisión del ARN diana, y así puede mejorar en gran medida la eficiencia de inhibición de ARNi. La escisión del ARN diana puede demostrarse habitualmente por electroforesis en gel. En otro aspecto preferido, el oligonucleótido quimérico también se modifica para mejorar la resistencia a nucleasas. Las células contienen diversas exo y endonucleasas que pueden degradar ácidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido donde se incorporan sea más resistente a la digestión por nucleasa que el oligodesoxinucleótido nativo. La resistencia a nucleasas se mide habitualmente incubando oligonucleótidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleótido intacto que queda con el tiempo, generalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleótidos que se han modificado para mejorar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante más tiempo que los oligonucleótidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleótidos mejoran o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleótidos que contienen al menos una modificación de fosforotioato son actualmente más preferidos. En algunos aspectos, las modificaciones de oligonucleótidos que mejoran la afinidad de unión a diana son, también, independientemente, capaces de mejorar la resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker et al (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374.

Ejemplos específicos de algunos oligonucleótidos preferidos concebidos por esta divulgación incluyen aquellos que comprenden estructuras modificadas, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los más preferidos son oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroátomo, particularmente esqueletos de CH2 --NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [conocido como un esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2-N(CH3)--N (CH3)--CH2 y O--N(CH3)--CH2--CH2, donde el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como O--P--O--CH,). Las estructuras de amida descritas por De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 también se prefieren. También se prefieren oligonucleótidos que tienen esqueletos de morfolino (Summerton y Weller, Patente de EE.UU. No. 5,034,506). En otros aspectos preferidos, tal como la estructura de ácido nucleico peptídico (ANP), la estructura de fosfodiéster del oligonucleótido se sustituye por una estructura de poliamida, uniéndose los nucleótidos directa o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la estructura de poliamida (Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497). Los oligonucleótidos también pueden comprender uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 o O(CH2)n CH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior de C1 a C10 , alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3 ; OCF3; O--, S--, o N-alquilo; O--, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2 ; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, también conocida como 2'-O-(2-metoxietil)] (Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Otras modificaciones preferidas incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi (2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' y la posición 5' del nucleótido del terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los oligonucleótidos también pueden incluir, además o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente «base»). Tal como se usa en el presente documento, nucleótidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en ácidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (también denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la técnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, además de nucleótidos sintéticos, p. ej., 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., (1987) et al. Nucl. Acids Res. 15:4513). Se puede incluir una base "universal" conocida en la técnica, p. ej., inosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-Me-C incrementan la estabilidad dúplex del ácido nucleico alrededor de 0,6-1,2 °C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, págs. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran /la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichos restos incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol, un resto de colesterilo (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6553), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 306; Manoharan et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), un tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et al. (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk et al. (1993) Biochimie 75, 49), un fosfolípido, p, ej., di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicerol-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea et al. (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Manoharan et al. (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969), o ácido adamantano acético (Manoharan et al. (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651). Los oligonucleótidos que comprenden restos lipófilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleótidos, son conocidos en la técnica, por ejemplo, las pat. de Ee .UU. Nos. 5,138,045, 5,218,105 y 5,459,255.

No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido dado estén uniformemente modificadas, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un único oligonucleótido o incluso dentro de un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente divulgación también incluye oligonucleótidos que son oligonucleótidos quiméricos, como se ha definido anteriormente en este documento.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación está conjugada con otro resto que incluye, pero no se limita a, nucleótidos abásicos, poliéter, poliamina, poliamidas, péptidos, hidratos de carbono, lípido, o compuestos de polihidrocarburo. Los expertos en la materia reconocerán que estas moléculas pueden enlazarse a uno o más de cualquiera de los nucleótidos que comprenden la molécula de ácido nucleico en varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato.

Los oligonucleótidos usados de acuerdo con esta divulgación pueden prepararse de manera práctica y habitual mediante la técnica muy conocida de síntesis en fase sólida. El equipo para dichas síntesis es comercializado por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. También se puede emplear cualquier otro medio para dicha síntesis; la síntesis real de los oligonucleótidos está bien dentro de los talentos de un experto en la materia. También es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados. También es muy conocido usar técnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluoresceína, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible en Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleótidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleótidos modificados tales como oligonucleótidos modificados con colesterol.

De acuerdo con la divulgación, el uso de modificaciones tales como el uso de monómeros de ANB para potenciar la potencia, especificidad y duración de la acción y ampliar las vías de administración de oligonucleótidos comprende químicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, PS, etc. Uhlman, et al. (2000) Current Opinions in Drug Discovery & Development Vol. 3 No 2 ). Esto puede lograrse sustituyendo algunos de los monómeros en los presentes oligonucleótidos por monómeros de ANB. El oligonucleótido modificado con ANB puede tener un tamaño similar al compuesto parental o puede ser más grande o preferentemente más pequeño. Se prefiere que dichos oligonucleótidos modificados con ANB contengan menos de aproximadamente el 70%, más preferentemente menos de aproximadamente el 60%, lo más preferentemente menos de aproximadamente el 50% de monómeros de ANB y que sus tamaños estén entre aproximadamente 5 y 25 nucleótidos, más preferentemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleótidos.

Las estructuras de oligonucleótidos modificados preferidas comprenden, pero no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de las unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455, 233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563, 253; 5,571,799; 5,587,361; y 5,625,050.

Las estructuras de oligonucleótido modificados preferidas que no incluyen un átomo de fósforo en los mismos tienen estructuras que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otros que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264, 562; 5, 264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596, 086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623, 070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439 .

En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace internucleosídico, es decir, la estructura, de las unidades de nucleótido se sustituyen por grupos novedosos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto de ácido nucleico diana adecuado. Tal compuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene excelente propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En compuestos de ANP, la estructura de azúcar de un oligonucleótido se sustituye por una estructura que contiene amida, en particular una estructura de aminoetilglicina. Las nucleobases se conservan y se unen directa 0 indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la parte de amida de la estructura. Las patentes representativas de EE.UU. que muestran la preparación de compuestos de ANP comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE.UU. nos. 5,539,082; 5,714,331; y 5,719,262.

Se puede encontrar información adicional sobre los compuestos de ANP en Nielsen et al., Science, (1991), 254, 1497­ 1500.

En otro aspecto preferido de la descripción, los oligonucleótidos con estructuras de fosforotioato y oligonucleósidos con estructuras de heteroátomos, y en particular -CH2-NH-O-CH2 , -CH2 -N (CH3)-O-CH2, se conocen como metileno (metilimino) o estructura MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -O-N(CH3)-CH2-CH2- en donde la estructura nativa de fosfodiéster se representa como -O-P-O-CH2- de la patente de EE. UU. n.° 5,489,677 mencionada anteriormente, y la estructura de amida de la patente de EE. UU. n.° 5,602,240 mencionada anteriormente. También son preferidos los oligonucleótidos que tienen estructuras de morfolino de la patente de EE.UU. 5,034,506 anteriormente referenciada. .

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S-, o N-alquilo; O-, S-, o N-alquenilol O-, S-o N-alquinilo; o O alquilo-O-alquilo, en donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO o alquenilo y alquinilo C2 a CO sustituidos o sin sustituir. Se prefieren particularmente O(CH2 )n OmCH3, O(CH2)n,OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 donde n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo reportero, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido, o un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación preferida comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietil) o 2'-MOE) (Martin et al., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504) i.e., un grupo alcoxialcoxi. Otra modificación preferida comprende 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2'-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en el presente documento más adelante, y 2 '-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2'-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-O CH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro

(2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en oligonucleótidos enlazados en 2'-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas comprenden, pero sin limitación, las patentes de EE.UU. n.° 4,981,957; 5,118,800;

5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514, 785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722;

5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646, 265; 5,658,873; 5,670,633; y 5,700,920 .

Los oligonucleótidos también pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (con frecuencia denominadas en la técnica simplemente «base»). Tal como se usa en el presente documento, nucleótidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina

(T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados comprenden otros nucleótidos sintéticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y

3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Además, los nucleótidos comprenden los divulgados en la patente de Estados Unidos n° 3.687.808, aquellos divulgados en The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed.

John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados por Englisch et al., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991,

30, page 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Capítulo 15, 'Antisense Research and Applications', páginas

289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleótidos son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la divulgación. Estos comprenden pirimidinas sustituidas en 5, 6-azapirimidinas y N-2, N-6 y purinas sustituidas en 0-6 que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracil y 5-metilcistosina, las sustituciones 5-metilcitosinahan mostrado que aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-O-metoxietilo.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, comprenden, pero no se limitan a, las patentes de

EE. UU. n.° 3,687,808, así como 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175, 273; 5, 367,066; 5,432,272; 5,457,187;

5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,750,692, y 5,681,941.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular, o la captación celular del oligonucleótido.

Tales restos comprenden, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol (Letsinger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6553-6556), ácido cólico (Manoharan et al., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053-1060), un tioéter, p. ej., hexil-S-tritiltiol (Manoharan et al., (1992) Ann. NY Acad. Sci., 660, 306-309; Manoharan et al., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770), un tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992) Nucl. Acids Res., 20,

533-538), una cadena alifática, p. ej., residuos de dodecandiol o undecilo (Kabanov et al., (1990) FEBS Lett., 259, 327­ 330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie 75, 49-54), un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac-glicerol o trietilamonio 1 ,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), una poliamina o una cadena de polietilenglicol (Mancharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973), o ácido adamantano acético (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett.,

36, 3651-3654), un resto palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237), o un residuo octadecilamina o hexilamino-carbonil-t oxicolesterol (Crooke et al., (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).

Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. n.° 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105;

5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552, 538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802;

5,138,045; 5,414,077; 5,486, 603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762, 779;

4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082, 830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830;

5,112,963; 5,214,136; 5, 245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5, 565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 y 5,688,941.

Descubrimiento de fármacos: Los compuestos de la presente divulgación también pueden aplicarse en las áreas del descubrimiento de fármacos y validación de dianas. La presente divulgación comprende el uso de los compuestos y segmentos diana preferidos identificados en el presente documento en esfuerzos en descubrimiento de fármacos para elucidar las relaciones que existen entre polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) y una patología, fenotipo o afección. Estos métodos incluyen detectar o modular los polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) que comprenden poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos de la presente divulgación, medir el nivel de ácido nucleico o de proteína de los polinucleótidos de Sirtuina 1 (SIRT1) y/o un criterio de valoración fenotípico o químico relacionado en algún momento después del tratamiento, y opcionalmente comparar el valor medido con una muestra no tratada o muestra tratada con otro compuesto de la divulgación. Estos métodos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el procedimiento de validación de dianas o para determinar la validez de un producto génico particular como diana para el tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o fenotipo particular.

Evaluación de la regulación positiva o inhibición de la expresión génica:

La transferencia de un ácido nucleico exógeno a una célula u organismo huésped puede evaluarse detectando directamente la presencia del ácido nucleico en la célula u organismo. Tal detección puede lograse mediante varios métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la presencia del ácido nucleico exógeno puede detectarse por Southern blot o por una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican específicamente secuencias de nucleótidos asociadas al ácido nucleico. La expresión de los ácidos nucleicos exógenos también puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen el análisis de expresión génica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un ácido nucleico exógeno puede detectarse y cuantificarse usando una Northern blot y PCR con transcripción inversa (RT-PCR).

La expresión de ARN del ácido nucleico exógeno también puede detectarse midiendo una actividad enzimática o una actividad de proteína reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminución o aumento en la expresión de ácido nucleico diana como una indicación de que el ácido nucleico exógeno está produciendo el ARN efector. Basándose en la conservación de secuencias, pueden diseñarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la región codificante más altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier región codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada región de codificación entre una región de codificación informadora y su señal poli(A). Estos plásmidos producirían un ARNm con un gen reportero en la parte aguas arriba del gen y una potencial diana de ARNi en la región no codificante 3'. La efectividad de los oligonucleótidos antisentido individuales se ensayaría por modulación del gen reportero. Los genes reporteros útiles en los métodos de la presente divulgación incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa

(NOS), octopina sintasa (OCS) y sus derivados. Hay disponibles múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a la ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los métodos para determinación de la modulación de un gen reportero son muy conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, procedimientos fluorimétricos (por ejemplo, espectroscopía de fluorescencia, Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS), microscopía de fluorescencia), determinación de la resistencia a antibióticos.

La expresión de la proteína SIRT1 y del ARNm se pueden valorar usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia y descritos en otra parte en el presente documento. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos tales como ELISA para medir los niveles de proteínas. Los anticuerpos SIRT1 para ELISA están disponibles comercialmente, p. ej., en R&D Systems (Minneapolis, MN), Abcam, Cambridge, MA.

En aspectos, la expresión de SIRT1 (p. ej., ARNm o proteína) en una muestra (por ejemplo, células o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleótido antisentido de la divulgación se evalúa comparando con la expresión de SIRT1 en una muestra de control. Por ejemplo, la expresión de la proteína o ácido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia con aquella en una muestra tratada con vector simulado o sin tratar. De forma alternativa, puede hacerse una comparación con una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido control (p. ej., uno que tenga una secuencia modificada o diferente) dependiendo de la información deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresión de la proteína SIRT1 o ácido nucleico en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresión de un ácido nucleico diferente (incluyendo cualquier patrón que el investigador considere apropiado, p. ej. un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.

Las diferencias observadas pueden expresarse como se desee, p. ej. en forma de proporción o fracción, para su uso en comparación con un control. En unos aspectos, el nivel de ARNm o proteína de S ir T 1, en una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido de la presente divulgación, aumenta o disminuye entre aproximadamente 1,25 veces a unas 10 veces o más en relación con una muestra sin tratar o una muestra tratada con un ácido nucleico de control. En unos aspectos, el nivel de ARNm de SIRT1 o proteína aumenta o disminuye en al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o más.-

Kits, Reactivos de Investigación, Diagnósticos y Agentes Terapéuticos

Los compuestos de la presente divulgación pueden utilizarse para diagnósticos, agentes terapéuticos y profilaxis, y como reactivos de investigación y componentes de kits. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con exquisita especificidad, son usados con frecuencia por los expertos en la materia para dilucidar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una vía biológica.

Para su uso en kits y diagnósticos y en diversos sistemas biológicos, los compuestos de la presente divulgación, tanto solos como en combinación con otros compuestos o agentes terapéuticos, son útiles como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para dilucidar patrones de expresión de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de células y tejidos.

Como se usa en este documento, la expresión «sistema biológico» o «sistema» se define como cualquier organismo, célula, cultivo de célula o tejido que se expresa, o se hace competente para expresar los productos de los genes de Sirtuina 1 (SIRT1). Estos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, animales transgénicos, células, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.

Como un ejemplo no limitante, los patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido se comparan con células o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresión génica, ya que están relacionados, por ejemplo, con la asociación a la enfermedad, la vía de señalización, la localización celular, el nivel de expresión, el tamaño, la estructura o la función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresión.

Ejemplos de procedimientos de análisis de la expresión génica conocidos en la técnica incluyen matrices o micromatrices de ADN, (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, et al., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (análisis en serie de expresión génica) (Madden, et al., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415-425), READS (amplificación con enzimas de restricción de los ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, Methods Enzymol., 1999, 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe, et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 1976-81), matrices de proteínas y proteómica (Celis, et al., (2000) FEBS Lett., , 480, 2-16; Jungblut, et al., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciación de la etiqueta de secuencia expresada (EST) (Celis, et al., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et al., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huellas de ARN sustractivas (SuRF) (Fuchs, et al., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, et al., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonación sustractiva, visualización diferencial (DD) (Reciclar y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21, hibridación genómica comparativa (Carulli, et al., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31,286-96), técnicas FISH (hibridación fluorescente in situ) (Going y Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y métodos de espectrometría de masas (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41

Los compuestos de la divulgación son útiles para la investigación y el diagnóstico, debido a que estos compuestos se hibridan con ácidos nucleicos que codifican Sirtuina 1 (SIRT1). Por ejemplo, los oligonucleótidos que hibridan con dicha eficiencia y en dichas condiciones que se han divulgado en el presente documento como moduladores eficaces de Sirtuina 1 (SIRT1) son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificación génica o detección, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácidos nucleicos que codifican Sirtuina 1 (SIRT1) y en la amplificación de dichas moléculas de ácidos nucleicos para la detección o para su uso en estudios adicionales de Sirtuina 1 (SIRT1). La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, en particular los cebadores y las sondas, de la descripción con un ácido nucleico que codifica Sirtuina 1 (SIRT1) puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También pueden prepararse kits que usan dichos medios de detección para detectar el nivel de Sirtuina 1 (SIRT1) en una muestra.

La especificidad y sensibilidad del antisentido también es aprovechada por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado compuestos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales, que incluyen seres humanos. Los fármacos de oligonucleótidos antisentido se han administrado con seguridad y de forma eficaz a seres humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en marcha. Así, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

Para agentes terapéuticos, un animal, preferiblemente un ser humano, que se sospecha o tiene una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta divulgación. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los métodos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva del modulador de Sirtuina 1 (SIRT1). Los moduladores de Sirtuina 1 (SIRT1) de la presente divulgación modulan de manera efectiva la actividad de Sirtuina 1 (SIRT1) o modulan la expresión de la proteína Sirtuina 1 (SIRT1). En un aspecto, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en un animal se inhibe aproximadamente el 10% en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en un animal se inhibe aproximadamente el 30%. Más preferiblemente, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en un animal se inhibe en un 50% o más. De este modo, los compuestos oligoméricos modulan la expresión del ARNm de Sirtuina 1 (SIRT1) en al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% en comparación con un control.

En un aspecto, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) y/o en un animal se incrementa en aproximadamente un 10% en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en un animal se aumenta en aproximadamente 30%. Más preferiblemente, la actividad o expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en un animal se aumenta en 50% o más. De este modo, los compuestos oligoméricos modulan la expresión del ARNm de Sirtuina 1 (SIRT1) en al menos el 10%, al menos el 50%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, o el 100% en comparación con un control.

Por ejemplo, la reducción de la expresión de Sirtuina 1 (SIRT 1) puede medirse en suero, sangre, tejido adiposo, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferiblemente, las células contenidas dentro de dichos fluidos, tejidos u órganos que se analizan contienen una molécula de ácido nucleico que codifica péptidos Sirtuina 1 (SIRT 1) y/o la propia proteína Sirtuina 1 (SIRT 1).

Los compuestos de la divulgación pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgación también pueden ser útiles profilácticamente.

Conjugados

Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular, o la captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la divulgación incluyen intercaladores, moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas de los oligómeros, y grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas de los oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Los grupos que mejoran las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta descripción, incluyen grupos que mejoran la captación, mejoran la resistencia a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Los grupos que mejoran las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta divulgación incluyen grupos que mejoran la captación, la distribución, el metabolismo o la excreción de los compuestos de la presente divulgación. Grupos conjugados representativos se divulgan en la solicitud de patente internacional No. PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y la Patente de EE.UU. 6,287,860.

Los restos conjugados incluyen, pero no se limitan a, restos de lípidos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, p. ej., hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, p. ej., restos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, p. ej., di-hexadecil-rac--glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicerol-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol. Los oligonucleótidos de la divulgación también pueden conjugarse con sustancias farmacológicas activas, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbiturato, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótidos comprenden, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. Nos. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5, 465; 5 313; 5545 730; 5 538; 5578717, 5580, 731; 5580 731; 5591 584; 5109 124; 5118 ,802 5, 138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608, 046; 4587 044; 4605 735; 4667 4 762 ,779 4, 737; 4 941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958, 013; 5082 830; 5112 963; 5214 136; 5082 ,830 5, 112 963; 5214 136; 5245 022; 5254469; 5258506; 5262, 536; 5272250; 5292 873; 5317 5 371 ,241 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941.

Formulaciones

Los compuestos de la divulgación también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otra manera a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de tales formulaciones que asisten a la ingesta, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, las patentes de EE. UU. Nos.

5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,165; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; y 5,595,756.

Aunque los oligonucleótidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresión y/o función de una diana, los aspectos de la divulgación se refieren a constructos de vectores de expresión para la expresión de oligonucleótidos antisentido, que comprenden promotores, secuencias de genes promotores híbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.

En un aspecto, la práctica de la divulgación implica administrar al menos uno de los oligonucleótidos antisentido anteriores con un sistema de suministro de ácidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no viral enlazado operativamente al polinucleótido. Los ejemplos de tales vectores no virales incluyen el oligonucleótido solo (por ejemplo, uno cualquiera o más de las SEQ ID NOS: 9 a 66) o en combinación con una formulación adecuada de proteína, polisacárido o lípido.

Los sistemas de suministro de ácidos nucleicos adecuados adicionales incluyen un vector viral, típicamente la secuencia de al menos uno de un adenovirus, un virus asociado a adenovirus (Aa V), un adenovirus dependiente de auxiliar, un retrovirus, o un complejo de virus hemaglutinante de Japón-liposoma (HVJ). Preferiblemente, el vector viral comprende un promotor eucariota fuerte enlazado operativamente al polinucleótido, p, ej., un promotor del citomegalovirus (CMV).

Los vectores preferidos adicionales incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el VIH. Un vector viral basado en el VIH preferido comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma del VIH y el gen env es de otro virus. Se prefieren los vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de pox tales como vectores de ortopox o avipox, vectores del virus del herpes tales como un vector del virus del herpes simple I (HSV) [Geller, A.I. et al., (1995) J. Neurochem, 64: 487; Lim, F., et al., en DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A.I. et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A.:907603; Geller, A.I., et al., (1990) Proc Natl. Acad. Sci USA: 87:1149], Adenovirus Vectors (LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., (1993) Nat. Genet. 3: 219; Yang, et al., (1995) J. Virol. 69: 2004) y Adeno-associated Virus Vectors (Kaplitt, M.G., et al., (1994) Nat. Genet. 8:148).

Los compuestos antisentido de la descripción abarcan cualquier sal, éster o sal de tales ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o resto del mismo.

La expresión «sales farmacéuticamente aceptables» se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la divulgación: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. Para los oligonucleótidos, ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE.Uu . No. 6,287,860.

La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgación. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse de varias formas dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (tal como a las membranas de mucosas, lo que incluye la administración vaginal y rectal), pulmonar, p. ej., mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y trasdérmica); oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o la infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal (p. ej., intratecal o intraventricular).

Para el tratamiento de los tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede realizarse, p. ej. por inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo. La administración de ARN antisentido en el líquido cefalorraquídeo se describe, p. ej., en la publicación de la solicitud de patente de EE.UU. No. 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression".

Cuando se pretende que el oligonucleótido antisentido de la presente divulgación se administre a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes capaces de promover la penetración del oligonucleótido antisentido objeto a través de la barrera hematoencefálica. La inyección puede realizarse, p. ej., en la corteza entorrinal o en el hipocampo. La aplicación de factores neurotróficos mediante la administración de un vector adenovirus en las neuronas motoras del tejido muscular se describe en, p. ej., la patente de EE.UU. No. 6,632,427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons". La aplicación de vectores directamente al cerebro, p. ej., el cuerpo estriado, el tálamo, el hipocampo, o la sustancia negra es conocida en la técnica y se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. No. 6,756,523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain". La administración puede ser rápida como por inyección o realizarse a lo largo de un período de tiempo como por infusión lenta o administración de formulaciones de liberación lenta.

Los oligonucleótidos antisentido sujeto también pueden unirse o conjugarse con agentes que proporcionen unas propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la técnica por favorecer la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse por inyección intravenosa. El compuesto antisentido puede unirse a un vector viral, por ejemplo, que hace que el compuesto antisentido resulte más eficaz y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a través de la barrera hematoencefálica. La alteración de la barrera hematoencefálica osmótica también puede llevarse a cabo mediante perfusión, p. ej. de azúcares incluyendo, pero sin limitarse a, mesoeritritol, xilitol, D(+) galactosa, D(+) lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-) fructosa, D(-) manitol, D(+) glucosa, D(+) arabinosa, D(-) arabinosa, celobiosa, D(+) maltosa, D(+) rafinosa, L(+) ramnosa, D(+) melibiosa, D(-) ribosa, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucosa, L(-) fucosa, D(-) lixosa, L(+) lixosa y L(-) lixosa o aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, glutamina, lisina, arginina, asparagina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, valina, tirosina y taurina. Los métodos y materiales para potenciar la penetración de la barrera hematoencefálica se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. No.4,866,042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier," 6,294,520,"Material for passage through the blood-brain barrier" y 6,936,589, "Parenteral delivery systems".

Los compuestos antisentido sujetos también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópica u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Por ejemplo, pueden incluirse lípidos catiónicos en la formulación para facilitar la captación de oligonucleótidos. Una de dichas composiciones que se ha demostrado que facilita la absorción es LIPOFECTIN (disponible en GIBCO-BRL, Bethesda, MD).

Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para la administración por vía oral. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizadores, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Tales técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los principios activos con el(los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme e íntimamente los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente divulgación pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgación también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender uno o más potenciadores de la penetración, vehículos, excipientes u otros principios activos o inactivos.

Las emulsiones normalmente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que normalmente superan 0,1 pm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente bien como una solución en la fase acuosa, la fase oleosa o bien el mismo como una fase independiente. Las microemulsiones están incluidas como un aspecto de la presente divulgación. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. 6,287,860.

Las formulaciones de la presente divulgación incluyen formulaciones liposomales. Como se usa en la presente divulgación, el término «liposoma» significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que va a suministrarse. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interactúan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan el ADN en vez de formar complejos con él. Se han usado tanto liposomas catiónicos como no catiónicos para suministrar ADN a las células.

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", una expresión que, tal como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lípidos especializados producen liposomas con vidas en circulación mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos donde parte de la parte lipídica formadora de vesícula del liposoma comprende uno o más glucolípidos o se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones es bien conocido en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE.UU. No. 6,287,860.

En un aspecto, la presente divulgación emplea diversos potenciadores de la penetración para efectuar el suministro eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los potenciadores de la penetración también mejoran la permeabilidad de los fármacos lipófilos. Los potenciadores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los potenciadores de la penetración y sus usos se describen adicionalmente en la pat. de EE.UU.

6,287,860.

Un experto en la materia reconocerá que las formulaciones se diseñan rutinariamente según su uso previsto, es decir, su vía de administración.

Las formulaciones preferidas para la administración tópica incluyen aquellas donde los oligonucleótidos de la divulgación están en mezcla con un agente de suministro tópico tal como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos. Los lípidos y liposomas preferidos incluyen neutros (p. ej., dioleoil-fosfatidiletanolamina DOPe , dimiristoilfosfatidilcolina DMPc , diestearoilfosfatidilcolina) negativos (p. ej., dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (p. ej., dioleoiltetrametilaminopropilo DOTAP y dioleoilfosfatidiletanolamina DOTMA).

Para la administración tópica u otra, los oligonucleótidos de la divulgación pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Como alternativa, los oligonucleótidos pueden formar complejos con lípidos, en particular con lípidos catiónicos. Ácidos grasos y ésteres preferidos, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, adyuvantes de dispersión o aglutinantes. Las formulaciones orales preferidas son aquellas donde los oligonucleótidos de la divulgación se administran conjuntamente con uno o más potenciadores de la penetración, tensioactivos y quelantes. Los tensioactivos preferidos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Ácidos biliares/sales y ácidos grasos preferidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

También se prefieren combinaciones de potenciadores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos biliares/sales. Una combinación particularmente preferida es la sal de sodio de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Los potenciadores de la penetración adicionales incluyen éter polioxietilen-9-laurílico, éter polioxietilen-20-cetílico. Los oligonucleótidos de la divulgación pueden suministrarse por vía oral, en forma granulada que incluye partículas secadas por pulverización, o en complejos para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en la patente de EE.UU. No. 6,287,860.

Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no se limitan a, potenciadores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Determinados aspectos de la divulgación proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más compuestos oligoméricos y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, aunque no se limitan a, fármacos quimioterapéuticos para el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la descripción, tales agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (p. ej., 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (p. ej., 5-FU y oligonucleótido durante un período de tiempo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de otros de tales agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, pero no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivirales, que incluyen, pero no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la divulgación. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del alcance de esta descripción. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgación pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a una segunda diana de ácido nucleico. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular del gen de la Sirtuina 1 (SIRT1), y la segunda diana puede ser una región de otra secuencia de nucleótidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgación pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones de la misma diana de nucleico de Sirtuina 1 (SIRT1). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en este documento y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la técnica. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Dosificación:

Se cree que la formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración (dosificación) está dentro de la experiencia de los expertos en la materia. La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta de la patología a tratar, con el curso del tratamiento que dura desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúe una cura o se logre una disminución de la patología. Pueden calcularse programas de dosificación óptimos a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos pueden determinar fácilmente dosificaciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosificación es de 0,01 |jg a 100 g por kg de peso corporal, y puede administrarse una vez o más diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la materia pueden estimar fácilmente las tasas de repetición para la dosificación basándose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos corporales o tejidos. Tras el tratamiento satisfactorio, puede desearse que el paciente se someta a terapia de mantenimiento para evitar la reaparición de la patología, en donde el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 jg a 100 g por kg de peso corporal, una vez o más diariamente, a una vez cada 20 años.

En aspectos, un paciente se trata con una dosificación de fármaco que es al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10 , al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90, o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosis inyectadas de oligonucleótidos antisentido se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. No. 7,563,884, "Antisense modulation of PTP1B expression".

Por su citación en diversas referencias en este documento, los solicitantes no admiten que ninguna referencia particular sea «técnica anterior» a su invención. Las realizaciones de composiciones y métodos inventivos se ilustran en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invención. Se apreciará que las variaciones en las proporciones y alternativas en los elementos de los componentes mostrados serán evidentes para los expertos en la materia y están dentro del alcance de los aspectos de la presente divulgación.

Ejemplo 1: Diseño de oligonucleótidos antisentido específicos para una molécula de ácido nucleico antisentido a un polinucleótido de Sirtuina 1 (SIRT1) y/o una cadena con sentido de un polinucleótido de Sirtuina 1 (SIRT1).

Tal como se ha indicado anteriormente, la expresión “oligonucleótido específico para” o “dianas de oligonucleótido” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.

La selección de oligonucleótidos adecuados se facilita usando programas informáticos que alinean automáticamente secuencias de ácido nucleico e indican regiones de identidad u homología. Tales programas se usan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de un intervalo de especies permite la selección de secuencias de ácidos nucleicos que muestran un grado de identidad adecuado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinación del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Al realizar Southern blots a grados de rigurosidad variables, como es bien conocido en la técnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay una libertad considerable en la selección de regiones adecuadas de genes para su uso en la presente descripción.

Un compuesto antisentido es «específicamente hibridable» cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o actividad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a las secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones donde se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones donde se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro .

Las propiedades de hibridación de los oliginucleótidos descritos en este documento pueden determinarse mediante uno o más ensayos in vitro como se conoce en la técnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleótidos descritos en este documento pueden obtenerse mediante la determinación de la fuerza de unión entre el antisentido natural diana y una posible molécula de fármaco utilizando el ensayo de curva de fusión.

La fuerza de unión entre el antisentido natural diana y una posible molécula de fármaco (Molécula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medición de la fuerza de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de curva de fusión.

El ensayo de curva de fusión determina la temperatura a la que se produce una rápida transición de conformación bicatenaria a monocatenaria para el complejo antisentido/Molécula natural. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la fuerza de interacción entre las dos moléculas.

Puede realizarse un ensayo de curva de fusión usando una copia de ADNc de la molécula de ARN antisentido natural real o un nucleótido de ADN o ARN sintético correspondiente al sitio de unión de la Molécula. Están disponibles múltiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (p. ej., kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una solución tampón adecuada que contiene uno de los colorantes de unión a ADN bicatenario (ADNds) (tales como los colorantes Ab I HRM, SYb R Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de ADNds son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a ADNds.

Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleótido correspondiente se mezclan con la Molécula en concentraciones definidas por los protocolos particulares del fabricante. La mezcla se calienta a 95 °C para disociar todos los complejos de ADNds previamente formados, a continuación, se enfría lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moléculas de ADN. Los complejos nuevamente formados a continuación se calientan lentamente a 95°C con recogida de datos continua simultánea en la cantidad de fluorescencia que es producida por la reacción. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de ADNds presentes en la reacción. Los datos pueden recopilarse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (p. ej., sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, RU).

Los picos de fusión se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(fluorescencia)/dT) sobre el eje y) frente a la temperatura (eje x) usando el software adecuado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Dissociation Curve, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rápida transición del complejo de ADNds a moléculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la fuerza de la interacción entre las dos moléculas. Típicamente, la Tm superará los 40 °C.

Ejemplo 2: Modulación de polinucleótidos SIRT1

Tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos antisentido:

Se cultivaron células HepG2 de ATCC (cat # HB-8065) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone cat # SH30024, o Mediatech cat # MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech cat # MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech cat # MT30-002-CI)) a 37°C y 5% de CO2. Un día antes del experimento las células se volvieron a cultivar a la densidad de 1,5 x l05/ml en placas de 6 pocilios y se incubaron a 37°C y 5% CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a medio de crecimiento fresco. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos |j I de esta solución con 400 |j I de medio Opti-MEM (Gibco, cat# 31985­ 070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, cat# 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células HepG2. Se usó una mezcla similar que incluye 2 ^j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. 3-18 h después de la incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de cultivo reciente. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat# 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat#AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (cat# 4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorizar la expresión génica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresión génica Taqman de ABI (cat#4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Ensayo de Expresión Génica Taqman de Applied Biosystems: Hs00202021_m1 por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) usando la Máquina de PCR en Tiempo Real StepOne Plus (Applied Biosystems).

El cambio de veces en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferente de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados:

Los resultados de la PCR en tiempo real que muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con algunos de los oligonucleótidos antisentido para CV396200 antisentido de SIRT1 (Figura 2, 3A).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se incrementan significativamente en uno de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT1 (Figura 6).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 en células HepG2 se incrementan significativamente en dos de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT1 (Figura 7).

Los resultados muestran un aumento significativo en los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 48 horas después del tratamiento con uno de los oligonucleótidos diseñados para BE717453 antisentido de SIRT. (Fig. 8).

Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AV718812 antisentido de SIRT1 respectivamente (Figura 9).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oligos diseñados para AW169958 antisentido de SIRT1 (Figura 10).

Tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos antisentido

Se cultivaron células 3T3 de ATCC (cat# CRL-1658) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone cat#SH30024, o Mediatech cat# MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech cat# MT30-002-CI)) a 37°C y el 5% de CO2. Un día antes del experimento las células se volvieron a cultivar a una densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y 5% CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a medio de crecimiento fresco. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos j I de esta solución con 400 j I de medio Opti-MEM (Gibco, cat#31985-070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, cat#11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células 3T3. Se usó una mezcla similar que incluye 2 ^j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat#74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat#AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (cat#4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorizar la expresión génica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresión génica Taqman de ABI (cat#4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Ensayo de Expresión Génica Taqman de Applied Biosystems: Hs00202021_m1 por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems).

El cambio de veces en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células 3T3 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT1 (Figura 11).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células 3T3 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con cinco de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de SIRT1 (Figura 12).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células 3T3 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón de SIRT1 (Figura 13).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células 3T3 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón de SIRT1 (Figura 14).

Tratamiento de células Vero 76 con oligonucleótidos antisentido

Se cultivaron células Vero76 de ATCC (cat# CRL-1587) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclonecat #SH30024, o Mediatech cat # MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech cat# MT30-002-CI)) a 37°C y el 5% de CO2. Un día antes del experimento las células se volvieron a cultivar a la densidad de 1,5 * 105/ml en placas de 6 pocillos incubadas a 37°C y 5% CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a medio de crecimiento fresco. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron en agua a la concentración de 20 pM. Se incubaron 2 |j I de esta solución con 400 |j I de medio Opti-MEM (Gibco, cat#31985-070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, cat# 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células Vero76. Se usó una mezcla similar que incluye 2 ^j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados con de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat# 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat#AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorizar la expresión génica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresión génica Taqman de ABI (cat#4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayo de expresión génica Taqman de Applied Biosystems: Hs00202021_m1 por Applied Biosystems Inc., Foster City c A). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El nivel de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células Vero se incrementaron significativamente 48 h después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido para CV396200 antisentido de SIRT 1 (Figura 3B).

Ejemplo 3: Modulación de la expresión del gen SIRT1

Materiales y Métodos

Tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos antisentido desnudos:

Se cultivaron células HepG2 de ATCC (cat# HB-8065) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, o Mediatech cat # MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech cat# MT30-002-CI)) a 37°C y 5% de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse en placas a la densidad de 0,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y 5% de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se reemplazó con 1,5 ml/pocillo de medio de crecimiento fresco. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron en agua a la concentración de 20 pM. Se incubaron 2 j I de esta solución con 400 j I de medio Opti-MEM (Gibco, cat#31985-070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, cat#11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células HepG2. Se usó una mezcla similar que incluye 2 j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. 72 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, las células se volvieron a dosificar como se describe anteriormente. 48 h después de la segunda dosificación de oligonucleótidos antisentido el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat# 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat#AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorizar la expresión génica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresión génica Taqman de ABI (cat#4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayo de expresión génica Taqman de Applied Biosystems: Hs00202021_ml por Applied Biosystems Inc., Foster City c A). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50 °C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando la máquina de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). El nivel de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Cebadores y sonda para el ensayo Taqman diseñado a medida para el exón 4: AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (SEQ ID NO: 67) el CV396200 antisentido natural SIRT1.

Sec. cebador directo. CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (SEQ ID NO: 68)

Sec. cebador inverso ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (SEQ ID NO: 69)

Sec. Reportera CAGAGTTTCAATTCCC (SEQ ID NO:70)

Resultados:

Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los RNAsi diseñados para sirtas (sirtas_5, P=0,01). En las mismas muestras, los niveles de ARN de sirtas disminuyeron significativamente después del tratamiento con sirtas_5, pero no se modificaron después del tratamiento con sirtas_6 y sirtas_7, que tampoco tuvieron efecto sobre los niveles de ARNm de SIRT1 (Fig. 1B). sirtas_5, sirtas_6 y sirtas_7 corresponden a SEQ ID NO: 32, 33 y 34 respectivamente.

Tratamiento de hepatocitos primarios de mono.

Se introdujeron hepatocitos primarios de mono en el cultivo por RxGen Inc. y se colocaron en placas de 6 pocillos. Se trataron con oligonucleótidos de la siguiente manera. Los medios en las placas de 6 pocillos se cambiaron a medios de crecimiento frescos que consisten en Medio de William (Sigma cat#W4128) suplementado con 5% de FBS, 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina, 4 pg/ml de insulina, dexametasona 1 pM, 10 ug/ml de Fungin (InVivogen, San Diego CA). Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron 2 j I de esta solución con 400 j I de medio Opti-MEM (Gibco, cat#31985-070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, cat#11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento fresco. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (cat # Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat # 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat # AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorizar la expresión génica por PCR en tiempo real usando la mezcla de expresión génica Taqman de ABI (cat# 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (ensayo de expresión génica Taqman de Applied Biosystems: Hs00978340_m1 por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se usó el siguiente ciclo: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) utilizando el termociclador Mx4000 (Stratagene). El nivel de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados:

Los resultados se muestran en la Figura 5. Los resultados de la PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 después del tratamiento con un oligonucleótido contra SIRT1 antisentido.

Ejemplo 4: Estudio de la eficacia y duración de la acción de CUR 963 en el mono verde africano

El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar el efecto de la inactivación antisentido de las secuencias antisentido no codificantes discordantes que regulan los genes SIRT1 después de la administración intravenosa en un modelo de primate no humano. Los artículos de ensayo de oligonucleótidos antisentido diseñados para inhibir las secuencias reguladoras de SIRT1 se designaron como CUR 963.

CUR 963: G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (SEQ ID NO: 28).

CUR 962 (control): G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (SEQ ID NO: 71).

DIRECTRICES REGULADORAS DE ENSAYOS

Este estudio se diseñó de acuerdo con principios toxicológicos aceptados y para cumplir con las directrices tripartitas armonizadas de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) (estudios de seguridad no clínicos para la realización de ensayos clínicos en seres humanos para productos farmacéuticos ICH M3(m), 9 de noviembre de 2000), y procedimientos generalmente aceptados para el ensayo de agentes terapéuticos.

ARTÍCULOS DE ENSAYOS Y CONTROL

Ensayo de identidad y preparación del artículo

El artículo de ensayo, CUR-963, es un oligonucleótido antisentido químicamente estabilizado. El vehículo para el suministro intravenoso es solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Caracterización de vehículo

Para el vehículo PBS, la composición, el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento (temperatura y luz/oscuridad) se obtuvieron del proveedor.

Ensayo de almacenamiento y manipulación de artículos

La sustancia de ensayo y el vehículo se almacenaron de acuerdo con las condiciones de almacenamiento recibidas proporcionadas por el patrocinador y el fabricante, en consecuencia.

Análisis de las formulaciones del artículo de ensayo

Las muestras de la formulación del artículo de ensayo se crioconservaron para el análisis de la concentración, la estabilidad y la homogeneidad de las formulaciones de la sustancia de ensayo.

SISTEMA DE ENSAYO DE RACIONALIZACIÓN

El primate es una especie adecuada no roedora, aceptable para las autoridades reguladoras como un indicador de peligros potenciales, y para la cual se dispone de exhaustivos datos de antecedentes. El mono verde africano específicamente es un modelo altamente relevante clínicamente de múltiples estados fisiológicos y patológicos humanos.

La vía de administración intravenosa corresponde a una posible vía terapéutica humana. La dosis de los artículos de ensayo se basó en los resultados de los estudios de búsqueda de dosis de compuestos análogos realizados previamente en el mono verde africano.

Se eligió el mono verde africano como el primate de elección, ya que la secuencia diana de las sustancias de ensayo se conserva en todas las especies con el 100% de homología en primates. Además, la sustancia de ensayo es un oligonucleótido sintético. En consecuencia, la dosificación en primates permite una evaluación superior de la eficacia de estos compuestos que reflejaría más la captación que probablemente se observará en seres humanos que en cualquier otra especie.

ANIMALES

Especie

Chlorocebus sabaeus, primate no humano

Raza

Mono verde africano originario de St Kitts.

Fuente

RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, Indias Occidentales.

Edad esperada

Los animales de ensayo eran adultos.

Peso corporal esperado

Los monos pesan aproximadamente 3-4 kg. El intervalo real puede variar, pero se documentará en los datos.

Sexo

Los animales de ensayo eran hembras adultas.

Número de animales

Se seleccionaron diez animales para asegurar la identificación de 8 animales adecuados para la inclusión en el estudio.

Número en estudio

Mujeres: 8

Justificación para el número en estudio

Este estudio se diseñó para utilizar el menor número posible de animales, de acuerdo con el objetivo principal de evaluar la eficacia terapéutica del artículo de ensayo en el mono verde africano y los estudios previos de la administración sistémica de este tipo de oligonucleótido en esta especie.

Especificación de animales

Se emplearon en el estudio diez monos verdes africanos adultos en el intervalo de peso de 3 a 4 kg. Los monos eran animales adultos que no habían consumido fármacos y que habían sido atrapados por la población salvaje que habita la isla. Los monos atrapados fueron tratados con antihelmínticos para eliminar cualquier posible carga parasitaria intestinal y se observaron en cuarentena durante un mínimo de 4 semanas antes de la selección para la inclusión en el estudio. La edad de los monos atrapados se estimó por tamaño y dentación, con la exclusión de los animales más viejos del estudio. Antes de la inclusión en el estudio, se realizó un examen clínico en cada mono, incluida la evaluación de la locomoción y la destreza. Se tomaron muestras de sangre y se enviaron a Antech Diagnostics (Memphis, TN) para obtener datos químicos clínicos completos y un hemograma completo y perfiles de lípidos (véase las especificaciones en las secciones 9.2 y 319567928). Los monos con valores de laboratorio anormales, de acuerdo con lo determinado en comparación con el intervalo normal establecido para los monos en la colonia de St. Kitts, se excluyeron del estudio. Para identificar 8 monos que satisfacen este criterio, se cribaron 10 monos, con el cribado de animales adicionales conforme sea necesario. Antes de iniciar el estudio, los monos seleccionados serán transferidos a jaulas individuales para que se aclimaten a los alojamientos individuales durante un período de una semana. Solo los animales considerados adecuados para la experimentación serán incluidos en el estudio. Los intervalos reales (o estimados) de edad y peso al inicio del estudio se detallarán en los datos sin procesar y en el informe final.

Sanidad y bienestar animal

Se siguieron los patrones más altos de bienestar animal y se respetaron las directrices estipuladas por el Departamento de Agricultura de St. Kitts y el Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. Todos los estudios se realizarán de acuerdo con estos requisitos y todos los códigos de práctica aplicables para el cuidado y alojamiento de animales de laboratorio. Todos los patrones aplicables para el cuidado, operación y revisión veterinarios, tal como los contenidos en la Guía de NIH Para el Cuidado y Uso de Animales. Las instalaciones de St. Kitts mantienen un comité de investigación con animales que revisa los protocolos e inspecciona las instalaciones de acuerdo con lo exige la Guía. La fundación tiene una garantía aprobada depositada ante la oficina de bienestar de los animales de laboratorio, de acuerdo con lo requiere la Guía, #A4384-01 (Fundación de Investigación Axion/Fundación Biomédica de St. Kitts). No hay problemas especiales de atención veterinaria de primates no humanos ni problemas de riesgo biológico planteados por la investigación especificada en este estudio.

Alojamiento y Medio Ambiente

Para permitir la detección de cualquier signo clínico relacionado con el tratamiento, los animales se alojaron individualmente antes de la cirugía y después de la operación hasta el sacrificio. El edificio de primates donde estaban situadas las jaulas individuales se iluminó completamente con luz ambiental, que a 17 grados de latitud norte se aproxima a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas:12 horas, de acuerdo con lo recomendado en las directrices D.H.H.S. de EE.UU. El edificio de primates RxGen estaba completamente ventilado hacia el exterior. Los ventiladores de techo aseguraron un movimiento de aire adicional para mantener una temperatura diana constante de 23-35°C, como es típico de St. Kitts durante todo el año. Veinticuatro horas extremas de temperatura y humedad relativa (que tampoco se controlarán) se midieron diariamente. Durante el estudio, las jaulas se limpiaron a intervalos regulares.

Dieta y Agua

A cada animal se le ofrecieron aproximadamente 90 gramos por día de una dieta estándar de chow de mono (TekLad, Madison, WI). Se registró la composición nutricional específica de la dieta. El agua fue analizada periódicamente para la pureza microbiológica. Los criterios para los niveles aceptables de contaminantes en la dieta común y el suministro de agua estaban dentro de las especificaciones analíticas establecidas por el fabricante de la dieta y las evaluaciones periódicas de agua en las instalaciones, respectivamente. El agua cumplió con todos los criterios necesarios para la certificación como aceptable para el consumo humano.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Identificación y Aleatorización de Animales

La asignación se realizó mediante un procedimiento de aleatorización estratificado basado en el peso corporal y los perfiles de colesterol en plasma. Antes y después de la asignación a un grupo, cada animal fue identificado por un tatuaje en el abdomen. Los tatuajes se colocan en todos los animales de la colonia como un medio de identificación en el curso de las inspecciones de salud habituales. Se elaboró un plan de jaula para identificar a los individuos alojados en el interior, y los monos individuales se identificaron aún más mediante una etiqueta marcada en su jaula respectiva. Tamaños de grupos, dosis y números de identificación.

Números

Los animales fueron asignados a 2 grupos de tratamiento, compuestos por 4 monos en cada grupo. Se proporcionaron números de identificación de animales específicos a cada mono de acuerdo con el sistema de numeración de las instalaciones. Este sistema identifica de forma única a cada mono mediante una letra seguida de un número de tres dígitos, p. ej., Y032.

Vía y Frecuencia de Administración

Los animales recibieron dosis una vez al día en los Días 1, 3 y 5, suministrados por vía intravenosa mediante infusión manual durante aproximadamente ~10 min. La velocidad de infusión será de 24 ml/kg/h. Los animales se sedaron con ketamina y xilazina antes y durante el procedimiento de dosificación. Se insertó un catéter venoso (equipo de infusión de venas Terumo mini, aguja de calibre 20 o equipo de infusión adecuado similar) en la vena safena. La dosificación se realizó en cada mono entre las 8:00 y las 10:00 am, poco después de que los animales se despertaran y antes de la alimentación. Se recogió una muestra de sangre para evaluar el colesterol en plasma y otros niveles de lípidos como se describe en la sección de Química de la Sangre a continuación, justo antes de cada infusión. La recogida de sangre precedió a la alimentación a ambos intervalos de muestreo para minimizar los efectos dietéticos en las mediciones de colesterol.

Observaciones Clínicas

Todos los signos visibles de reacción al tratamiento se registraron en cada día de dosificación. Además, los animales fueron examinados al menos una vez a la semana en busca de atributos físicos como el aspecto y el estado general.

Pesos Corporales

Los pesos corporales se registraron a intervalos semanales durante los períodos de tratamiento y postratamiento.

Consumo de Alimentos

El consumo individual de alimentos no fue cuantificado. Sin embargo, los patrones de alimentación se monitorearon y se hizo una nota de cualquier cambio importante.

Mortalidad y Morbilidad

Se registrará la mortalidad y la morbilidad. Cualquier decisión con respecto al sacrificio prematuro se tomará después de consultar con el director del estudio y con el científico de monitorización del patrocinador, si es posible. Los animales que se encuentren muertos o muertos prematuramente se someterán a una necropsia con la recogida de tejidos de hígado, riñón, corazón, bazo y pulmón para histopatología. En caso de un sacrificio prematuro, también se tomará una muestra de sangre (si es posible) y se determinarán los parámetros. Los animales que se encuentren muertos después de las horas normales de trabajo se refrigerarán durante la noche y se realizarán las necropsias al comienzo del siguiente día laborable. Si el estado de un animal requiere un sacrificio prematuro, será sacrificado por una sobredosis intravenosa de pentobarbital de sodio. Toda investigación está regida por los Principios de Uso de Animales. Se requiere por ley que RxGen cumpla con los estándares del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. para las instalaciones de primates, que dictan los niveles de gravedad que deben cumplir los procedimientos dentro de este estudio, especificados como leves.

ESTUDIOS DE LABORATORIO CLÍNICO

Biopsias Grasas

Se realizó una biopsia de grasa subcutánea en todos los monos del estudio excepto en Y775 en los días 26 del estudio mediante extracción de tejido a través de una incisión en la línea media de 1 cm por debajo del ombligo. Las biopsias se sumergieron inmediatamente en un criotubo etiquetado que contenía 2 ml de RNAlater (Qiagen) y se incubaron a 4°C durante la noche, después de lo cual se aspiró el RNAlater y el tubo de muestra se congelo instantáneamente en nitrógeno líquido. Después del transporte en nitrógeno líquido, se aisló el ARN total para qPCR en tiempo real de los genes diana.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 en biopsias de grasa de monos que recibieron CUR-963, un oligonucleótido diseñado para CV396200.1 antisentido de SIRT1, en comparación con monos que recibieron CUR-962 (SEQ ID NO .: 71), un oligonucleótido que no tenía efecto sobre la expresión de SIRT1 in vitro (diseñado para DA327409 antisentido de ApoA1, datos no mostrados). Los niveles de ARNm se determinaron mediante PCR en tiempo real (Figura 4).

Ejemplo 5: Modulación in vivo de Sirtuina 1 (SIRT1) por oligonucleótidos de ADN antisentido

Tratamiento con oligonucleótidos de ADN antisentido (ASO)

Se administran oligonucleótidos antisentido (ASO) específicos para SIRT1 AS (por ejemplo, CUR-1098 o CUR1099) a ratones C57B1/6J que se alimentan con una dieta alta en grasas durante 12 semanas para inducir obesidad y diabetes. (Purushotham A. et al., (2009) Cell Metabolism 9, pág. 327-338). El tratamiento de los ratones con ASO se iniciará en el momento de la implementación de la dieta alta en grasas. A los ratones se les inyecta IP una vez a la semana con ASO preparado en solución salina normal, a una concentración de 5 mg/kg.

Mediciones de peso corporal e ingesta alimentaria.

El peso corporal y la ingesta de alimentos de los ratones se miden dos veces por semana, antes de la inyección IP del ASO.

Mediciones de glucosa en sangre

Las concentraciones de glucosa en sangre alimentadas y en ayunas se miden cada semana tomando una muestra de sangre de la vena de la cola.

Ensayos de Tolerancia a la Glucosa (GTT)

El GTT se realizará totalmente dos veces por ratón, a la mitad de la dieta (en la semana 4) y cerca del final (en la semana 10) de la dieta alta en grasas. El GTT nos informará sobre la tolerancia a la glucosa de los ratones, es decir, la capacidad de eliminar rápidamente un bolo de glucosa del torrente sanguíneo. Esta es una medida de la diabetes.

Los ratones se dejan en ayunas durante la noche durante 16 horas. A los ratones se les inyecta 2 g/kg de glucosa IP. esto se traduce en un volumen final de 0,2ml 30% (p/v) de solución de glucosa para un ratón de 30 g de peso. Las mediciones de glucosa se toman antes de la inyección de glucosa y a los 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. La glucosa se mide cortando la punta de la cola a 1 mm del extremo de la cola bajo anestesia con isoflurano antes de la inyección de glucosa IP. La gota de sangre se aspira a una tira y se mide la concentración de glucosa con un glucómetro. El GTT se realizará totalmente dos veces por ratón, a la mitad de la dieta (en la semana 4) y cerca del final (en la semana 10) de la dieta alta en grasas. El GTT nos informará sobre la tolerancia a la glucosa de los ratones, es decir, la capacidad de eliminar rápidamente un bolo de glucosa del torrente sanguíneo. Esta es una medida de la diabetes.

Ensayo de tolerancia a la insulina (ITT)

Los ratones se dejan en ayunas durante 6 horas desde las 9 am hasta las 3 pm. A los ratones se les inyecta IP 0,5-1U de Insulina/kg. La concentración de insulina se ajustará de forma que el volumen final inyectado es de 0,1-0,15ml. Las mediciones de glucosa en sangre se toman antes de la inyección y a los 5, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección. La sangre se recolecta exactamente como se describe en GTT. Además de monitorear los niveles de glucosa, el comportamiento de los ratones se observa constantemente durante el ITT. La hipoglucemia puede manifestarse como un cambio de comportamiento y los animales se vuelven muy tranquilos y muestran malestar. Para prevenir la hipoglucemia, se inyecta glucosa (1g/kg) IP a un volumen final de 0,1-0,15 ml tan pronto como la concentración de glucosa en sangre cae por debajo de 50 mg/ml o se observen signos de malestar.

Recolección de sangre por Punción de la Vena Facial

Los ratones son inmovilizados por la nuca del cuello y la base de la cola, comprimiendo ligeramente los vasos sanguíneos del cuello a través de la tensión del agarre en la piel del cuello. El sitio de muestreo está en la mandíbula, ligeramente por delante del ángulo de la mandíbula. La piel en el lugar de la muestra se perfora con una aguja de 18G o una lanceta en un ángulo de 90° hasta que la punta de la aguja/lanceta apenas atraviesa la piel. Las muestras de sangre se recogen utilizando tubos de microhematocrito. Después de que se ha recogido la sangre, el agarre del cuello se afloja y la presión se aplica en el sitio de inserción con una esponja calibrada para asegurar la hemostasis. Se recogerán 0,05-0,2 ml de sangre mediante este método. Este procedimiento se realizará solo una vez en la semana 5 de la dieta alta en grasas y, finalmente, en la semana 12 si la punción intracardíaca no funciona (ver más abajo). Las hormonas sanguíneas que regulan el metabolismo de la glucosa y los lípidos (tales como insulina, adiponectina y leptina) se miden utilizando kits de ELISA disponibles comercialmente. (p. ej., R&D Systems, Minneapolis, MN, Assay Pro St. Charles, MO, Mabtech, Mariemont, OH)

Punción Intracardiaca

Al final de la dieta alta en grasas de 12 semanas, los ratones serán anestesiados por inhalación continua de isoflurano. La anestesia se induce colocando a los ratones en una caja de inducción, que se suministra con isoflurano y oxígeno. Los ratones se sujetarán boca arriba. El corazón se perfora con una aguja 27G. Después de la exanguinación, se decapita la cabeza para asegurar la muerte. Se recogen tejidos (hígado, páncreas, tejido adiposo blanco y marrón y músculo esquelético) para investigaciones adicionales (mediciones de ARN y proteínas e histología). Alrededor de 0,5-1 ml de sangre se obtendrá y se usará para determinar diversos parámetros críticos de la glucosa y el metabolismo de lípidos (glucosa, insulina, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos libres, leptina, adipoquinas, corticosteroides, hormonas tiroideas). Si surgen dificultades con este método, recolectaremos sangre por punción en la vena facial bajo anestesia con isoflurano (ver arriba).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido antisentido que se une a un transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 (SIRT1) humano para uso como compuesto terapéutico, en donde el transcrito antisentido natural de Sirtuina (SIRT1) es SEQ ID NO: 7, y en donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) humana correspondiente a SEQ ID NO: 1.

2. Un oligonucleótido antisentido que se une a una transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 (SIRT1) humana para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico asociado a Sirtuina 1 (SIRT1) seleccionado entre resistencia a la insulina, diabetes, diabetes de inicio en el adulto, nefropatía diabética, diabetes tipo 2 , obesidad, intolerancia a la glucosa, colesterol alto en sangre, hiperglucemia, dislipidemia o hiperlipidemia, o para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa asociada a SIRT1, en la que el transcrito antisentido natural de Sirtuina (SIRT1) es SEQ ID NO: 7, y en donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de la Sirtuina 1 humana (SIRT1) correspondiente a la SEQ ID NO: 1.

3. Uso de un oligonucleótido antisentido que se une a un transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 (SIRT1) humana para la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad o trastorno metabólico asociado con Sirtuina 1 (SIRT1) seleccionado de resistencia a la insulina, diabetes, diabetes de inicio en el adulto, nefropatía diabética, diabetes tipo 2 , obesidad, intolerancia a la glucosa, colesterol alto en sangre, hiperglucemia, dislipidemia o hiperlipidemia, o para la prevención o tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa asociada a SIRT1, en donde el transcrito antisentido natural de Sirtuina (SIRT1) es SEQ ID NO: 7, y en donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de la Sirtuina 1 humana (SIRT1) correspondiente a SEQ ID NO: 1.

4. Un oligonucleótido antisentido para uso según la reivindicación 2 o uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad neurodegenerativa se selecciona de Alzheimer, Huntington, Parkinson, Esclerosis Lateral Amiotrófica, Esclerosis Múltiple y trastornos causados por agregación de poliglutamina, demencia o neuropatía relacionada con SIDA (p. ej., neuropatía sensorial, neuropatía autonómica, neuropatía motora, retinopatía).

5. Un método para aumentar la expresión de Sirtuina 1 (SIRT1) en células o tejidos de pacientes in vitro que comprende: poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido que se une a un transcrito antisentido natural de Sirtuina humana (SIRT1), en donde el transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 humana (SIRT1) es SEQ ID NO: 7; aumentando así la expresión de la Sirtuina 1 (SIRT1) humana correspondiente a SEQ ID NO: 1.

6. Un oligonucleótido antisentido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 4 o uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, o un método de acuerdo con la reivindicación 5, en donde:

a. el oligonucleótido antisentido es un compuesto de ARNsi; o

b. . el oligonucleótido antisentido es monocatenario.

7. Un oligonucleótido antisentido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 6, o uso de un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6, o un método de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una de SEQ ID NOs: 52 o 54.

8. Un oligonucleótido antisentido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 o 7, o un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4, 6 o 7 o un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la expresión de Sirtuina 1 (SIRT 1) humana correspondiente a SEQ ID NO: 1 se aumenta en al menos 10%.

9. Un oligonucleótido antisentido para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 6 a 8, o un oligonucleótido antisentido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3, 4 o 6 a 8, o un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde el oligonucleótido antisentido comprende además una o más modificaciones que comprenden:

a. al menos un enlace internucleosídico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'-O-metoxietilo (MOE), 2 '-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato, éster carboximetílico, y combinaciones de los mismos;

b. al menos un nucleótido modificado seleccionado de entre: un ácido nucleico peptídico (ANP), un ácido nucleico bloqueado (ANB), un ácido arabino-nucleico (FANA), un análogo, un derivado, y combinaciones de los mismos; o c. al menos un resto de azúcar modificado seleccionado de entre: un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azúcar modificado con 2'-metoxi, un resto de azúcar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azúcar bicíclico, y combinaciones de los mismos.

10. Un oligonucleótido antisentido que tiene las características de un oligonucleótido antisentido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un oligonucleótido antisentido de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el oligonucleótido antisentido tiene una longitud de entre 10 a 30 nucleótidos.

12. Un oligonucleótido antisentido según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el oligonucleótido antisentido tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural de Sirtuina 1 (SIRT1) como se establece en SEQ ID NO: 7.

13. Una composición farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido antisentido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.