ES2854004T3 - Tratamiento de enfermedades relacionadas con Sirtuina 6 (SIRT6) mediante inhibición del transcrito antisentido natural para SIRT6 - Google Patents

Abstract

Un oligonucleótido antisentido que se une a una transcripción antisentido natural de Sirtuina 6 humana (SIRT6) para su uso como compuesto terapéutico, donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de la Sirtuina 6 humana (SIRT6) (SEQ ID NO: 4), y donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 13 o 14.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento de enfermedades relacionadas con Sirtuina 6 (SIRT6) mediante inhibición del transcrito antisentido natural para SIRT6

Aspectos de la divulgación comprenden oligonucleótidos que modulan la expresión y/o la función de Sirtuina (SIRT) y moléculas asociadas.

ANTECEDENTES

La hibridación ADN-ARN y ARN-ARN son importantes para muchos aspectos de la función del ácido nucleico incluyendo replicación, transcripción y traducción del ADN. La hibridación también es fundamental para una variedad de tecnologías que tanto detectan un ácido nucleico particular como alteran su expresión. Los nucleótidos antisentido, por ejemplo, alteran la expresión génica hibridándose con ARN diana, interfiriendo así con el splicing, la transcripción, la traducción y la replicación de ARN. El ADN antisentido tiene la característica añadida de que los híbridos de ADN-ARN sirven de sustrato para la digestión por ribonucleasa H, una actividad que está presente en la mayoría de los tipos celulares. Las moléculas antisentido pueden suministrarse al interior de células, como es el caso para oligodesoxinucleótidos (ODN), o pueden expresarse a partir de genes endógenos como moléculas de ARN. La FDA recientemente aprobó un fármaco antisentido, VITRAVENE™ (para el tratamiento de retinitis por citomegalovirus), que refleja que el antisentido tiene utilidad terapéutica.

BASE DE DATOS GENBANK [en línea] NCBI; 26 de junio de 2007, anónimo: "Homo sapiens ankyrin repeat domain 24 (ANKRD24), mRNA", recuperado de http://ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, número de acceso a la base de datos NM_133475.

BASE DE DATOS ENA [en línea] EMBL; 26 de febrero de 2004, anónimo: "CM4-IT0042-131200-611-h08 IT0042 Homo sapiens cDNA, mRNA sequence.", recuperado del número de acceso de EBI. EMBL: BF772662, no de acceso a la base de datos. BF772662.

Mostoslavsky y col. (Cell, vol. 124, n° 2, 27 de enero de 2006, páginas 315-329) se refiere a la inestabilidad genómica y al fenotipo por envejecimiento en ausencia de SIRT6 de mamífero.

RESUMEN

La invención se define por las reivindicaciones. Aquellos aspectos/casos de la presente divulgación que constituyen la invención se definen por las reivindicaciones.

En un aspecto, la divulgación proporciona procedimientos de inhibición de la acción de un transcrito antisentido natural usando uno o más oligonucleótidos antisentido dirigidos a cualquier región del transcrito antisentido natural produciendo la regulación positiva del gen sentido correspondiente. También está contemplado en esta invención que la inhibición del transcrito antisentido natural pueda conseguirse mediante siRNA, ribozimas y moléculas pequeñas, que se considera que están dentro del alcance de la presente divulgación.

Un aspecto proporciona un procedimiento para modular la función y/o expresión de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud donde dicho oligonucleótido tiene al menos 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso de un polinucleótido que comprende de 5 a 30 nucleótidos consecutivos dentro de los nucleótidos 1 a 1028 de SEQ ID NO: 5 o nucleótidos 1 a 429 de SEQ ID NO: 6, o nucleótidos 1 a 156 de SEQ ID NO: 7 o nucleótidos 1 a 593 de SEQ ID NO: 8, 1 a 373 de SEQ ID NO: 9, 1 a 1713 de SEQ ID NO: 10, 1 a 660 de SEQ ID NO: 11, 1 a 589 de SEQ ID NO: 12, 1 a 428 de SEQ ID NO: 13 y 1 a 4041 de SEQ ID NO: 14 modulando así la función y/o expresión del polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos de pacientes in vivo o in vitro.

En otro aspecto, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT), por ejemplo, nucleótidos establecidos en SEQ ID NO: 5 a 14, y cualquier variante, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias. al mismo. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como SEQ ID NOS: 15 a 94.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulación de la función y/o la expresión de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud, donde dicho oligonucleótido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un complemento inverso del antisentido del polinucleótido de Sirtuina (SIRT), modulando de este modo la función y/o la expresión del polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

Otro aspecto proporciona un procedimiento de modulación de la función y/o la expresión de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro, que comprende poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido de 5 a 30 nucleótidos de longitud, donde dicho oligonucleótido tiene al menos un 50% de identidad de secuencia con un oligonucleótido antisentido para un polinucleótido antisentido de Sirtuina (SIRT), modulando de este modo la función y/o la expresión del polinucleótido de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos del paciente in vivo o in vitro.

En un aspecto, una composición comprende uno o más oligonucleótidos antisentido que se unen a polinucleótidos de Sirtuina (SIRT) sentido y/o antisentido.

En otro aspecto, los oligonucleótidos comprenden uno o más nucleótidos modificados o sustituidos.

En otro aspecto, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces modificados.

En otro aspecto más, los nucleótidos modificados comprenden bases modificadas que comprenden fosforotioato, metilfosfonato, ácidos nucleicos peptídicos, 2'-O-metilo, fluoro- o carbono, metileno u otras moléculas de ácido nucleico bloqueado (ANB). Preferiblemente, los nucleótidos modificados son moléculas de ácido nucleico bloqueado, que incluyen a-L-ANB.

En otro aspecto, los oligonucleótidos se administran a un paciente por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intravenosa o por vía intraperitoneal.

En otro aspecto, los oligonucleótidos se administran en una composición farmacéutica. Un régimen de tratamiento comprende administrar los compuestos antisentido al menos una vez al paciente; sin embargo, este tratamiento puede modificarse para incluir múltiples dosis durante un periodo de tiempo. El tratamiento puede combinarse con uno o varios de otros tipos de terapias.

En otro aspecto, los oligonucleótidos están encapsulados en un liposoma o unidos a una molécula vehículo (por ejemplo, colesterol, péptido TAT).

Otros aspectos se describen más adelante,

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las Figuras 1 y 2 muestran resultados de PCR en tiempo real de oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los siRNA diseñados para sirtas (sirtas_5, P=0,01). En las mismas muestras, los niveles de ARN de sirtas disminuyeron significativamente después del tratamiento con sirtas_5, pero no se modificaron después del tratamiento con sirtas_6 y sirtas_7, que tampoco tuvieron efecto sobre los niveles de ARNm de SIRT 1 (Fig. 2). sirtas_5, sirtas_6 y sirtas_7 corresponden a las SEQ ID NOS: 38, 39 y 40 respectivamente.

La Figura 3 muestra los resultados del recorrido del oligonucleótido a través del antisentido SIRT. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos antisentido diseñados para sirtas. CUR-0392 a CUR-0309 corresponden a las SEQ ID NOS: 15 a 32 respectivamente.

Las Figuras 4 y 5 muestran los resultados para los oligonucleótidos modificados con PS, ANB y 2'O Me en células HepG2 (Fig. 4) y Vero76 (Fig. 5). Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido diseñados por mezcladores de PS, ANB, 2'O Me y 2'O Me para antisentido de SIRT1. Los niveles de ARNm de SIRT1 en células Vero también aumentaron 48 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido modificados con PS y ANB a antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0245, CUR-0736, CUR 0688, CUR-0740 y CUR-0664 corresponden a las SEQ ID NOs: 33 a 37 respectivamente.

La Figura 6 muestra los resultados de PCR de Biopsias de Grasa de Mono. Los resultados de PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT 1 en biopsias de grasa de monos a los que se les administró CUR-963, un oligonucleótido diseñado para CV396200.1 antisentido de SIRT1. CUR-963 corresponde a SEQ ID NO: 34.

La Figura 7 muestra los resultados de PCR de hepatocitos primarios de hígado de mono. Los resultados de PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 después del tratamiento con un oligonucleótido frente a antisentido de SIRT1. La barra indicada como CUR-0245 corresponde a la SEQ ID NO: La Figura 8 muestra los resultados de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 en células HepG2 se incrementan significativamente en uno de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1230, CUR-1231, CUR-1232 y CUR-1233 corresponden a las SEQ ID NOS: 41 a 44. La Figura 9 muestra los resultados de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT 1 en células HepG2 se incrementan significativamente en uno de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 y CUR-1305 corresponden a las SEQ ID NOS: 45 y 48. La Figura 10 muestra los resultados de PCR en tiempo real. Los resultados muestran un aumento significativo en los niveles de ARNm de SIRT 1 en células HepG248 horas después del tratamiento con uno de los oligonucleótidos diseñados para BE717453 antisentido de SIRT. Las barras indicadas como CUR-1264, CUR-1265 y CUR-1266 corresponden a las SEQ ID NOS: 49 a 51 respectivamente.

La Figura 11 muestra los resultados de PCR en tiempo real. Los resultados muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AV718812 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 y CUR-1298 corresponden a las SEQ ID NOS: 52 a 56 respectivamente.

La Figura 12 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células HepG248 h después del tratamiento con dos de los oligos diseñados para AW169958 antisentido de SIRT1. Las barras indicadas como CUR-1381, CUR-1382, CUR-1383 y CUR-1384 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 57 a 60 respectivamente.

La Figura 13 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentaron significativamente en células 3T348 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0949, CUR-0842, CUR-1098 y CUR-1099 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 67, 61, 71 y 72 respectivamente.

La Figura 14 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células 3T348 h después del tratamiento con cinco de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0948, CUR-0949, CUR-C950, CUR-0951, CUR-0846 y CUR-0844 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 66 a 69, 65 y 63 respectivamente.

La Figura 15 es un gráfico de resultados de ^pC^r en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células HepG248 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0842, CUR-0844 y CUR-0845 se corresponden con muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 61, 63 y 64 respectivamente.

La Figura 16 es un gráfico de los resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT1 después del tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células HepG248 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1. Las barras indicadas como CUR-0843, CUR-0846 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 62 y 65 respectivamente.

La Figura 17 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de Sirtuin3 después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de RT PCR muestran que los niveles de sirt3 en las células HepG2 aumentan 48 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido de fosforotioato diseñados para Hs.683117 antisentido de sirt3 (CUR-1545-1550). Las barras indicadas como CUR-0551, CUR-1552, CUR-1555, CUR-1556, CUR-1553, CUR-1554, CUR-1545, CUR-1546, CUR-1548, CUR-1549, CUR-1550 y CUR-1547 corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 73 a 84 respectivamente. La Figura 18 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT6 después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del SIRT6 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los oligos diseñados para NM_133475 antisentido del SIRT6. Las barras indicadas como CUR-0873, CUR-0869 a CUR-0871, CUR-0874 y CUR-C872, corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 85 a 90 respectivamente.

La Figura 19 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT6 después del tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm del SIRT6 en células HepG2 se incrementan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los oligos diseñados para bf772662 antisentido del SIRT6. Las barras indicadas como CUR-0878, CUR-0876, CUR-0877 y CUR-0875 corresponden a muestras tratadas con las SEQ ID NOS: 91 a 94 respectivamente.

La Figura 20 es un gráfico de resultados de PCR en tiempo real que muestra la tasa de cambio la desviación estándar en ARNm de SIRT6 después del tratamiento de células ^d B^s -FCL-1 con oligonucleótidos de fosforotioato introducidos usando Lipofectamine 2000, en comparación con el control. Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT6 en las células DBS-FCL-1 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oligos diseñados para bf772662 antisentido de SIRT6 y un oligo diseñado para NM_133475. Las barras indicadas como CUR-0876, CUR-0878, CUR-0875 y CUR-0874, corresponden a muestras tratadas con SEQ ID NOS: 92, 91, 94 y 89 respectivamente.

Descripción de Lista de Secuencias

SEQ ID NO: 1: Sirtuina de Homo sapiens (homólogo de regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso) 1 (S. cerevisiae) (SIRT1), ARNm (Número de acceso NCBI: NM_012238.3)

SEQ ID NO: 2: Sirtuina de Mas musculus 1 (homólogo de regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso) 1 (S. cerevisiae) (SIRT1), ARNm (Número de acceso NCBI: NM_001159589)

SEQ ID NO: 3: Sirtuina de Homo sapiens (homólogo de regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso) 3 (S. cerevisiae) (SIRT3), variante de transcripción 1, ARNm (Número de acceso NCBI: NM_012239.5). SEQ ID NO: 4: Sirtuina de Homo sapiens 6 (SIRT6), variante de transcripción 1, ARNm (Número de acceso NCBI: NM_016539).

SEQ ID NO: 5: Secuencia antisentido natural expandida (CV396200 - expandida).

SEQ ID NO: 6: Secuencia antisentido natural (CV428275).

SEQ ID NO: 7: Secuencia antisentido natural (BE717453).

SEQ ID NO: 8: Secuencia antisentido natural (AV718812).

SEQ ID NO: 9: Secuencia antisentido SIRT1 natural (AW169958).

SEQ ID NO: 10: Secuencia antisentido de ratón SIRT1 natural (AK044604).

SEQ ID NO: 11: Secuencia antisentido SIRT3 natural (Hs.6831117).

SEQ ID NO: 12: Secuencia antisentido SIRT3 natural (DA645474).

SEQ ID NO: 13: Secuencia antisentido SIRT6 natural (BF772662).

SEQ ID NO: 14: Secuencia antisentido SIRT6 natural (ANKRD24).

SEQ ID NOS: 15 a 94: Oligonucleótidos antisentido.* indica enlace fosfotioato, indica ANB y m indica 2'O Me SEQ ID NO: 95 a 98 - SEQ ID NO: 95 corresponden al exón 4 del CV396200 antisentido natural SIRT1, SEQ ID NO: 96, 97 y 98 corresponden a la secuencia del cebador directo, secuencia del cebador inverso y la secuencia reportera respectivamente.

s Eq ID NO: 99 corresponde a CUR 962,* indica enlace fosfotioato y indica ANB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Varios aspectos de la divulgación se describen a continuación con referencia a aplicaciones de ejemplos para ilustración. Debe entenderse que los numerosos detalles, relaciones y procedimientos específicos se exponen para proporcionar un entendimiento completo de la divulgación. Un experto en la técnica pertinente, sin embargo, reconocerá fácilmente que la divulgación puede ponerse en práctica sin uno o más de los detalles específicos o con otros procedimientos. La presente divulgación no está limitada por el orden de actos o acontecimientos, ya que algunos actos pueden producirse en diferentes órdenes y/o simultáneamente con otros actos o acontecimientos. Además, no todos los actos o acontecimientos ilustrados son requeridos para implementar una metodología según la presente divulgación.

Todos los genes, nombres de genes, y productos génicos divulgados en esta invención pretenden corresponderse a homólogos de cualquier especie para la cual las composiciones y procedimientos divulgados en esta invención son aplicables. De este modo, los términos incluyen, aunque sin limitarse a, genes y productos génicos de seres humanos y ratones. Se entiende que cuando se divulga un gen o producto génico de una especie particular, esta divulgación pretende ser meramente ejemplar, y no se interpreta como una limitación a menos que el contexto en el que aparece lo indique claramente. De este modo, por ejemplo, para los genes divulgados en esta invención que en algunos aspectos se refieren a secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de mamífero pretenden englobar genes homólogos y/u ortólogos y productos génicos de otros animales que incluyen, entre otros, a otros mamíferos, peces, anfibios, reptiles y aves. En aspectos, los genes o secuencias de ácidos nucleicos son humanos.

Definiciones

La terminología usada en esta invención es con el fin de describir aspectos particulares solamente y no pretende ser limitante de la divulgación. Tal como se utilizan en esta invención, se pretende que las formas en singular “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” incluyan también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, siempre que las expresiones "que incluye", "incluye", "que tiene", "tiene", "con" o variantes de las mismas se usan en la descripción detallada y/o las reivindicaciones, dichas expresiones pretenden ser inclusivas de una manera similar a la expresión "que comprende".

El término “aproximadamente” significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor particular como se ha determinado por un experto habitual en la materia, que dependerá en parte de cómo se mide o determina el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" puede significar 1 o más de 1 de desviación estándar, conforme a la práctica de la técnica. Alternativamente, “aproximadamente” puede significar un intervalo de hasta el 20 %, preferiblemente hasta el 10 %, más preferiblemente hasta el 5 %, y más preferiblemente todavía hasta el 1 % de un valor dado. De manera alternativa, en particular con respecto a los sistemas o procedimientos biológicos, el término puede significar un orden de magnitud de un valor preferiblemente comprendido en 5 veces y más preferiblemente comprendido en 2 veces. En los casos en los que se describen valores particulares en la solicitud y las reivindicaciones, a menos que se exprese lo contrario el término "aproximadamente" significa que se debe asumir que el valor se encuentra comprendido en un intervalo de error aceptable para el valor particular. Tal como se usa en esta invención, el término “ARNm” significa el o los transcritos de ARNm actualmente conocidos de un gen elegido como diana, y cualquier transcrito adicional que pueda ser dilucidado.

Por “oligonucleótidos antisentido” o “compuesto antisentido” se indica una molécula de ARN o ADN que se une a otro ARN o ADN (ARN, ADN diana). Por ejemplo, si éste es un oligonucleótido de ARN, se une a otra diana de ARN por medio de interacciones ARN-ARN y altera la actividad del ADN diana. Un oligonucleótido antisentido puede regular positivamente o regular negativamente la expresión y/o función de un polinucleótido particular. La definición pretende comprender cualquier molécula de ARN o ^a Dⁿ extraña que es útil desde un punto de vista terapéutico, de diagnóstico u otro. Dichas moléculas incluyen, por ejemplo, moléculas de ADN o ADN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), micro ARN, moléculas de ARN señuelo, siRNA, ARN enzimático, ARN de edición terapéutica y ARN agonista y antagonista, compuestos oligoméricos antisentido, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia guía externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

En el contexto de esta divulgación, el término "oligonucleótido" se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. El término "oligonucleótido" también incluye oligómeros lineales o circulares de monómeros o enlaces naturales y/o modificados, que incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas sustituidas y alfa-anómeras de los mismos, ácidos nucleicos peptídicos (ANP), ácidos nucleicos bloqueados (ANB), fosforotioato, metilfosfonato y similares. Los oligonucleótidos son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana por medio de un patrón regular de interacciones monómero a monómero, tales como tipo de apareamiento base de Watson-Crick, tipos de apareamiento base de Hoogsteen o Hoogsteen inversa, o similares.

El oligonucleótido puede ser “quimérico”, es decir, estar compuesto de diferentes regiones. En el contexto de esta divulgación los compuestos «quiméricos» son oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicas, por ejemplo, una o más regiones de ADN, una o más regiones de ARN, una o más regiones de ANP, etc. Cada región química está compuesta por al menos un conjunto monomérico, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos normalmente comprenden al menos una región donde el oligonucleótido se modifica con el fin de presentar una o más propiedades deseadas. Las propiedades deseadas del oligonucleótido incluyen, entre otras, por ejemplo, resistencia incrementada a la degradación por nucleasas, captación celular incrementada, y/o afinidad de unión incrementada para el ácido nucleico diana. Las diferentes regiones del oligonucleótido pueden, por lo tanto, tener diferentes propiedades. Los oligonucleótidos quiméricos de la presente divulgación pueden formarse como estructuras mixtas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o análogos de oligonucleótido, tal como se ha descrito anteriormente.

El oligonucleótido puede estar compuesto de regiones que pueden enlazarse en “registro”, es decir, cuando los monómeros se enlazan consecutivamente, como en ADN nativo, o se enlazan mediante espaciadores. Se pretende que los espaciadores constituyan un «puente» covalente entre las regiones y tengan, en casos preferidos, una longitud que no supere aproximadamente los 100 átomos de carbono. Los espaciadores pueden llevar diferentes funcionalidades, por ejemplo, tener carga positiva o negativa, llevar propiedades de unión a ácido nucleico especiales (intercaladores, ligantes de surcos, toxinas, fluoróforos, etc.), ser lipófilos, inducir estructuras secundarias especiales como, por ejemplo, péptidos que contienen alanina que inducen hélices alfa.

Como se usa en esta invención, "Sirtuins (SIRT)" incluyen todos los miembros de la familia, mutantes, alelos, fragmentos, especies, secuencias codificantes y no codificantes, cadenas de polinucleótidos con sentido y antisentido, etc.

Tal como se utilizan en esta invención, las palabras Sirtuin1, SIRT1, sirtuina, homólogo de regulación 2 de información de tipo de apareamiento silencioso 1, hSIR2, hSIRT1, sirtuina-1 deacetilasa dependiente de NAD, SIR2L1, proteína similar a SIR21, se consideran iguales en la bibliografía y se usan indistintamente en la presente solicitud.

Como se usa en esta invención, las palabras 'Sirtuina 3', Sirtuina3, Sirtuina-3, SIRT3, SIRT-3, hSIRT3, desacetilasa sirtuina-3 dependiente de NAD, mitocondrial, SIR2L3, proteína similar a SIR2 3 se utilizan indistintamente en la presente solicitud.

Como se usa en esta invención, las palabras 'Sirtuina 6', Sirtuina6, Sirtuina-6, SIRT6, SIRT-6, desacetilasa dependiente de NAD sirtuina-6, SIR2L6, proteína similar a SIR26 se consideran iguales en la bibliografía y se usan indistintamente en la presente solicitud.

Como se usa en esta invención, el término "oligonucleótido específico para" u "oligonucleótido que se dirige" se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una porción del gen diana, o (ii) capaz de formar un dúplex con una porción de una transcripción de ARNm del gen diana. La estabilidad de los complejos y los dúplex puede determinarse mediante cálculos teóricos y/o ensayos in vitro. Ensayos ejemplares para determinar la estabilidad de complejos y dúplex de hibridación se describen en los Ejemplos más adelante.

Tal como se usa en esta invención, la expresión “ácido nucleico diana” engloba ADN, ARN (que comprende pre-ARNm y ARNm) transcrito a partir de dicho ADN, y también ADNc derivado de dicho ARN, secuencias codificantes, no codificantes, polinucleótidos sentido o antisentido. La hibridación específica de un compuesto oligomérico con su ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico. Esta modulación de la función de un ácido nucleico diana por compuestos, que se hibridan específicamente con él, se denomina generalmente "antisentido". Las funciones de a Dn con las que interferirán incluyen, por ejemplo, la replicación y transcripción. Las funciones de ARN con las que interferirán incluyen todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalización del ARN al sitio de traducción de proteína, traducción de proteína desde ARN, splicing del ARN para dar una o más especies de ARNm, y actividad catalítica que puede acoplarse en o facilitarse mediante el ARN. El efecto global de dicha interferencia con las funciones del ácido nucleico diana es la modulación de la expresión de un producto codificado u oligonucleótidos. La interferencia de ARN "iARN" está mediada por moléculas de ARN bicatenario (dsARN) que tienen homología específica de secuencia con sus secuencias de ácido nucleico "diana". En ciertos aspectos de la presente divulgación, los mediadores son dúplex de ARN "de interferencia pequeña" (siRNA) de 5-25 nucleótidos. Los siRNA se derivan a partir del procesamiento del ARNdc mediante una enzima conocida como Dicer. Los productos dúplex son reclutados en un siRNA multiproteína denominado RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Sin desear ceñirse a ninguna teoría particular, se cree entonces que un RISC es guiado a un ácido nucleico diana (adecuadamente ARNm), en el que el dúplex de siRNA interactúa de una forma específica de secuencia para mediar en la escisión en un modo catalítico. Los ARN de interferencia pequeños que pueden usarse según la presente divulgación pueden sintetizarse y usarse según procedimientos que son bien conocidos en la técnica y que serán familiares para el experto en la materia. Los ARN de interferencia pequeños para su uso en los procedimientos de la presente divulgación comprenden adecuadamente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos (nt). En los ejemplos de aspectos no limitantes, los siRNA pueden comprender de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nt, o aproximadamente 20-25 nucleótidos.

La selección de los oligonucleótidos apropiados se facilita usando programas informáticos que alinean automáticamente secuencias de ácido nucleico e indican regiones de identidad u homología. Dichos programas se usan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por ejemplo, buscando en bases de datos tales como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de un intervalo de especies permite la selección de secuencias de ácidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinación del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la técnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay libertad considerable en la selección de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente divulgación.

Por “ARN enzimático” se indica una molécula de ARN con actividad enzimática Los ácidos nucleicos enzimáticos (ribozimas) actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión se produce a través de la parte de unión a la diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene muy cerca de una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. De este modo, el ácido nucleico enzimático reconoce primero y luego se une a ARN diana mediante apareamiento base, y una vez unido al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. Por “ARN señuelo” se indica una molécula de ARN que imita el dominio de unión natural para un ligando. El ARN señuelo compite, por lo tanto, con la diana de unión natural para la unión de un ligando específico. Por ejemplo, se ha mostrado que la sobreexpresión de ARN de respuesta de activación en trans (TAR) de HIV puede actuar como un "señuelo" y se une de forma eficiente a la proteína tat de HIV, impidiendo de este modo que se una a secuencias TAR codificadas por el ARN de HIV Este pretende ser un ejemplo específico. Los expertos en la técnica reconocerán que este es solo un ejemplo, y fácilmente pueden generarse otros aspectos usando técnicas generalmente conocidas en la técnica.

Tal como se usa en esta invención, el término "monómeros" normalmente indica monómeros enlazados por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que varían en tamaño entre unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo, entre aproximadamente 3-4, y aproximadamente varios cientos de unidades monoméricas. Los análogos de enlaces fosfodiéster incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonatos, fosforoselenoato, fosforamidato y similares, tal como se describe más completamente más adelante.

El término “nucleótido” cubre nucleótidos de origen natural, así como nucleótidos no de origen natural. Debe ser evidente para el experto en la materia que diversos nucleótidos que se consideraron anteriormente “no de origen natural” se han descubierto posteriormente en la naturaleza. Así, "nucleótidos" incluye no sólo las moléculas conocidas que contienen heterociclos de purina y pirimidina, sino también análogos heterocíclicos y tautómeros de los mismos. Ejemplos ilustrativos de otros tipos de nucleótidos son moléculas que contienen adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurirte , 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deazaguanina, N4, N4-etanocitosina, N6, N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5- (C3-C6) -alquinilcitosina, 5 -fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudoisocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina, inosina y los nucleótidos "no naturales" descritos en la Pat. EE. UU. No. 5.432.272. El término "nucleótido" pretende cubrir todos y cada uno de estos ejemplos, además de análogos y tautómeros de los mismos. Nucleótidos especialmente interesantes son aquellos que contienen adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, que se consideran como los nucleótidos de origen natural en relación con la aplicación terapéutica y diagnóstica en seres humanos. Los nucleótidos incluyen los azúcares naturales 2'-desoxi y 2'-hidroxilo, por ejemplo, como se describe en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2a Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), además de sus análogos.

"Análogos" en referencia a nucleótidos incluye nucleótidos sintéticos que tienen restos de base modificados y/o restos de azúcar modificados. Dichos análogos incluyen nucleótidos sintéticos diseñados para mejorar propiedades de unión, p. ej., la estabilidad, especificidad del dúplex o el tríplex, o similares.

Tal como se usa en esta invención, "hibridación" significa el apareamiento de cadenas sustancialmente complementarias de compuestos oligoméricos. Un mecanismo de apareamiento implica la formación de puentes de hidrógeno, que pueden ser puentes de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o de Hoogsteen inverso, entre bases de nucleósidos o de nucleótidos (nucleótidos) complementarias de las cadenas de compuestos oligoméricos. Por ejemplo, la adenina y la timina son nucleótidos complementarios que se aparean mediante la formación de puentes de hidrógeno. La hibridación puede producirse en circunstancias variables.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o la actividad, y existe un grado de complementariedad suficiente para evitar unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Tal como se usa en esta invención, la frase "condiciones de hibridación astringentes" o "condiciones astringentes" se refiere a condiciones en las que un compuesto de la divulgación hibridará con su secuencia diana, pero con un número mínimo de otras secuencias. Las condiciones astringentes son dependientes de secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias y en el contexto de esta divulgación, las «condiciones astringentes» en las que compuestos oligoméricos hibridan con una secuencia diana se determinan mediante la naturaleza y la composición de los compuestos oligoméricos y los ensayos en los que están siendo investigados. En general, las condiciones de hibridación astringentes comprenden concentraciones bajas (<0,15 M) de sales con cationes inorgánicos como Na + o K + (es decir, fuerza iónica baja), una temperatura superior a 20°C - 25°C por debajo de la Tm del compuesto oligomérico, complejo de secuencia diana y la presencia de desnaturalizantes tales como formamida, dimetilformamida, dimetilsulfóxido o el detergente dodecilsulfato de sodio (SDS). Por ejemplo, la tasa de hibridación disminuye un 1,1% por cada 1% de formamida. Un ejemplo de una condición de hibridación de alta astringencia es tampón cloruro sódicocitrato sódico 0,1X (SSC)/0,1 % (peso/volumen) de SDS a 60°C durante 30 minutos.

“Complementario”, tal como se usa en esta invención, se refiere a la capacidad de apareamiento preciso entre dos nucleótidos en una o dos cadenas oligoméricas. Por ejemplo, si una nucleobase en cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar puentes de hidrógeno con una nucleobase en cierta posición de un ácido nucleico diana, siendo dicho ácido nucleico diana un ADN, ARN, o molécula de oligonucleótido, entonces la posición de la formación de puentes de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana se considera una posición complementaria. El compuesto oligomérico y el ADN, a Rn , o molécula de oligonucleótido, adicional son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones complementarias en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden formar puentes de hidrógeno entre sí. De este modo, «específicamente hibridable» y «complementariedad» son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de apareamiento preciso o complementariedad sobre un número suficiente de nucleótidos de modo que se produzca unión estable y específica entre el compuesto oligomérico y un ácido nucleico diana.

Se entiende en la técnica que no es necesario que la secuencia de un compuesto oligomérico sea un 100 % complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Además, un oligonucleótido puede hibridarse sobre uno o más segmentos, de modo que segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura en bucle, desapareamiento o estructura de horquilla). Los compuestos oligoméricos de la presente divulgación comprenden al menos aproximadamente el 70 %, o al menos aproximadamente el 75 %, o al menos aproximadamente el 80 %, o al menos aproximadamente el 85 %, o al menos aproximadamente el 90 %, o al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 %, de complementariedad de secuencia con una región diana dentro de la secuencia de ácidos nucleicos diana a la que se dirigen. Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de los 20 nucleótidos del compuesto antisentido son complementarios a una región diana y, por lo tanto, hibridarían específicamente, representaría el 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, los nucleótidos no complementarios restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleótidos complementarios y no necesitan ser contiguos entre sí o a nucleótidos complementarios. Por lo tanto, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleótidos de longitud que tiene 4 (cuatro) nucleótidos no complementarios que están flanqueados por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico diana tendría el 77,8% de complementariedad global con el ácido nucleico diana y de este modo estaría dentro del alcance de la presente divulgación. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana puede determinarse de forma rutinaria usando programas BLAST (herramientas básicas de búsqueda de alineación local) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica. El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), Utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl Math., (1981) 2, 482-489).

Tal como se usa en esta invención, la expresión "punto de fusión térmico (Tm)" se refiere a la temperatura, bajo fuerza iónica, pH y concentración de ácido nucleico definidas, a la que el 50 % de los oligonucleótidos complementarios a la secuencia diana hibridan con la secuencia diana en equilibrio. Normalmente, condiciones astringentes serán aquellas en las que la concentración de sales es la concentración de ion Na (u otras sales) de al menos aproximadamente 0,01 a 1,0 M a pH de 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente 30°C para oligonucleótidos cortos (por ejemplo, de 10 a 50 nucleótidos). Las condiciones astringentes también pueden lograrse con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida.

Tal como se usa en esta invención, "modulación" significa un incremento (estimulación) o una disminución (inhibición) de la expresión de un gen.

El término "variante", cuando se usa en el contexto de una secuencia de polinucleótidos, puede englobar una secuencia de polinucleótidos relacionada con un gen de tipo silvestre. Esta definición también puede comprender, por ejemplo, variantes «alélicas», de «splicing», de «especie» o «polimórficas». Una variante de splicing puede tener identidad significativa con una molécula de referencia, pero generalmente tendrá un mayor o menor número de polinucleótidos debido al splicing alterno de exones durante el procesamiento de ARNm. El polipéptido correspondiente puede poseer dominios funcionales adicionales o una ausencia de dominios. Las variantes de especie son secuencias de polinucleótidos que varían de una especie a otra. Son de particular utilidad en la divulgación variantes de productos génicos de tipo silvestre. Las variantes pueden resultar de al menos una mutación en la secuencia de ácidos nucleicos y pueden producir ARNm alterados o polipéptidos cuya estructura o función puede o puede no alterarse. Cualquier gen natural o recombinante dado puede tener ninguna, una o muchas formas alélicas. Cambios mutacionales comunes que dan lugar a variantes se atribuyen generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones naturales de nucleótidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede producirse solo, o en combinación con los otros, una o más veces en una secuencia dada.

Los polipéptidos resultantes generalmente tendrán identidad significativa de aminoácidos los unos con respecto a los otros. Una variante polimórfica es una variación en la secuencia de polinucleótidos de un gen particular entre individuos de una especie dada. Las variantes polimórficas también pueden englobar "polimorfismos de un solo nucleótido" (SNP), o mutaciones de una sola base en las que la secuencia de polinucleótidos varía en una base. La presencia de SNP puede ser indicativa de, por ejemplo, una cierta población con una propensión por una patología, es decir susceptibilidad contra resistencia.

Los polinucleótidos derivados incluyen ácidos nucleicos sometidos a modificación química, por ejemplo, sustitución de hidrógeno por un grupo alquilo, acilo o amino. Los derivados, por ejemplo, oligonucleótidos derivados, pueden comprender partes no de origen natural, tales como restos de azúcar alterados o enlaces inter-azúcar. Ejemplares entre estos son el fosforotioato y otras especies que contienen azufre conocidas en la técnica. Los ácidos nucleicos derivados también pueden contener etiquetas, que incluyen radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromógenos, sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas y similares.

Un polipéptido o péptido "derivado" es uno que se modifica, por ejemplo, por glucosilación, pegilación, fosforilación, sulfatación, reducción/alquilación, acilación, acoplamiento químico o tratamiento suave con formalina. Un derivado también puede modificarse para contener una etiqueta detectable, tanto directa como indirectamente, que incluye, entre otros, un radioisótopo, etiqueta fluorescente y enzimática.

Tal como se usa en esta invención, el término "animal" o "paciente" pretende comprender, por ejemplo, seres humanos, ovejas, alces, venados, ciervos mulos, visones, mamíferos, monos, caballos, ganado vacuno, cerdos, cabras, perros, gatos, ratas, ratones, aves, pollo, reptiles, peces, insectos y arácnidos.

"Mamífero" cubre mamíferos de sangre caliente que normalmente están bajo atención médica (por ejemplo, seres humanos y animales domesticados). Los ejemplos incluyen felinos, caninos, equinos, bovinos y humanos, además de solo humanos.

"Tratar" o "tratamiento" cubre el tratamiento de una patología en un mamífero, e incluye: a) prevenir que se produzca la patología en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero tiene predisposición a la patología, pero todavía no se ha diagnosticado que la tenga; (b) inhibir la patología, por ejemplo, detener el desarrollo; y/o (c) aliviar la patología, por ejemplo, causando la regresión de la patología hasta que se alcance un resultado deseado. Tratar también incluye la mejora de un síntoma de una enfermedad (por ejemplo, reducir el dolor o molestia), donde dicha mejora puede o puede no afectar directamente la enfermedad (por ejemplo, causa, transmisión, expresión, etc.).

Tal como se usa en esta invención, "cáncer" se refiere a todo tipo de cáncer o neoplasia o tumores malignos descubiertos en mamíferos, incluyendo, aunque sin limitarse a: leucemias, linfomas, melanomas, carcinomas y sarcomas. El propio cáncer se manifiesta como un "tumor" o tejido que comprende células malignas del cáncer. Los ejemplos de tumores incluyen sarcomas y carcinomas como tales, pero no limitado a: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomisarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conductos biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimona, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligondendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma. Los cánceres adicionales que se pueden tratar para la composición descrita de acuerdo a la divulgación incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primario, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores primarios de cerebro, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoma maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones premalignas cutáneas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer esofágico, cáncer de tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer endometrial, cáncer cortical adrenal, y cáncer de próstata.

"Enfermedad o trastorno neurológico" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno del sistema nervioso y/o sistema visual, "Enfermedad o trastorno neurológico" incluye enfermedades o trastornos que involucran al sistema nervioso central (cerebro, tronco encefálico y cerebelo), el sistema nervioso periférico (incluidos los nervios craneales) y el sistema nervioso autónomo (partes del cual se encuentran tanto en el sistema nervioso central como en el periférico). Los ejemplos de trastornos neurológicos incluyen, aunque sin limitarse a, cefalea, estupor y coma, demencia, convulsiones, trastornos del sueño, traumatismo, infecciones, neoplasias, neurooftalmología, trastornos del movimiento, enfermedades desmielinizantes, trastornos de la médula espinal, y trastornos de los nervios periféricos, el músculo y las uniones neuromusculares. La adicción y la enfermedad mental, incluyen, aunque sin limitarse a, trastorno bipolar y esquizofrenia, se incluyen también en la definición de trastorno neurológico. La siguiente es una lista de varios trastornos, síntomas, signos y síndromes neurológicos que pueden ser tratados usando las composiciones y procedimientos según la presente divulgación: afasia adquirida epileptiforme; encefalomielitis diseminada aguda; adrenoleucodistrofia; degeneración macular relacionada con la edad; agenesia del cuerpo calloso; agnosia; síndrome de Aicardi; enfermedad de Alexander; enfermedad de Alpers; hemiplejía alterna; demencia vascular; esclerosis lateral amiotrófica; anencefalia; síndrome de Angelman; angiomatosis; anoxemia; afasia; apraxia; quistes aracnoideos; aracnoiditis; malformación de Chiari Anronl; malformación arteriovenosa; síndrome de Asperger; ataxia telangiectasia; trastorno de hiperactividad y déficit de atención; autismo; disfunción autónoma; dolor de espalda; enfermedad de Batten; enfermedad de Behcet; parálisis de Bell; blefaroespasmo esencial benigno; focal benigna; amiotrofia; hipertensión intracraneal benigna; enfermedad de Binswanger; blefaroespasmo; síndrome de Bloch Sulzberger; lesión del plexo braquial; absceso cerebral; lesión cerebral; tumores cerebrales (incluyendo glioblastoma multiforme); tumor medular; síndrome de Brown-Sequard; enfermedad de Canavan; síndrome del túnel carpiano; causalgia; síndrome de dolor central; mielinólisis pontina central; trastorno encefálico; aneurisma cerebral; arteriosclerosis cerebral; atrofia cerebral; gigantismo cerebral; parálisis cerebral; enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; neuropatía inducida por quimioterapia y dolor neuropático; malformación de Chiari; corea; polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; dolor crónico; síndrome de dolor crónico regional; síndrome de Coffin Lowry; coma, incluyendo estado vegetativo persistente; diplejía facial congénita; degeneración corticobasal; arteritis craneal; craneosinostosis; enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; trastornos por traumatismo acumulativo; síndrome de Cushing; enfermedad de cuerpos de inclusión citomegálicos; infección por citomegalovirus; síndrome de ojos danzantes y pies danzantes; síndrome DandyWalker; enfermedad de Dawson; síndrome de Morsier; parálisis de Dejerine-Klumke; demencia; dermatomiositis; neuropatía diabética; esclerosis difusa; disautonomía; disgrafía; dislexia; distonías; encefalopatía epiléptica infantil temprana; síndrome de la silla vacía; encefalitis; encefaloceles; angiomatosis encefalotrigeminal; epilepsia; parálisis de Erb; temblor esencial; enfermedad de Fabry; síndrome de Fahr; desmayo; parálisis espástica familiar; convulsiones febriles; síndrome de Fisher; ataxia de Friedreich; demencia fronto-temporal y otras "tauopatías"; enfermedad de Gaucher; síndrome de Gerstmann; arteritis de células gigantes; enfermedad de inclusión de células gigantes; leucodistrofia de células globosas; síndrome de Guillain-Barré; mielopatía asociada HTLV-1; enfermedad Hallervorden-Spatz; traumatismo craneoencefálico; cefalea; espasmo hemifacial; paraplejia espástica hereditaria; heredopatía atáctica polineuritiforme; herpes zóster ótico; herpes zóster; síndrome de Hirayama; demencia y neuropatía asociadas a HIV (también manifestaciones neurológicas del SIDA); holoprosencefalia; enfermedad de Huntington y otras enfermedades de repetición de poliglutamina; hidranencefalia; hidrocefalia; hipercortisolismo; hipoxia; encefalomielitis mediada por inmunidad; miositis por cuerpos de inclusión; incontinencia pigmentaria; enfermedad de almacenamiento de ácido fitánico infantil; enfermedad de Refsum infantil; espasmos infantiles; miopatía inflamatoria; quiste intracraneal; hipertensión intracraneal; síndrome de Joubert; síndrome de Kearns-Sayre; enfermedad de Kennedy, síndrome de Kinsboume; síndrome de Klippel Feil; enfermedad de Krabbe; enfermedad Kugelberg-Welander; kuru; enfermedad de Lafora; síndrome miasténico de Lambert-Eaton; síndrome de Landau-Kleffner; síndrome lateral medular (Wallenberg); dificultades de aprendizaje; enfermedad de Leigh; síndrome de Lennox-Gustaut; síndrome de Lesch-Nyhan; leucodistrofia; demencia con cuerpos de Lewy; lisencefalia; síndrome de enclaustramiento; enfermedad de Lou Gehrig (es decir, enfermedad de las neuronas motoras o esclerosis lateral amiotrófica); enfermedad del disco lumbar; secuelas neurológicas de la enfermedad de Lyme; enfermedad de Machado-Joseph; macrocefalia; megalocefalia; síndrome de Melkelsson-Rosenthal; enfermedad de Meniere; meningitis; enfermedad de Menkes; leucodistrofia metacromática; microcefalia; migraña; síndrome de Miller Fisher; mini derrames; miopatías mitocondriales; síndrome de Moebius; amiotrofia monomélica; enfermedad de la neuronas motoras; enfermedad de Moyamoya; mucopolisacaridosis; demencia multiinfarto; neuropatía motora multifocal; esclerosis múltiple y otras enfermedades desmielinizantes; atrofia de múltiples sistemas con hipotensión postural; distrofia muscular; miastenia grave; esclerosis difusa mielinoclástica; encefalopatía mioclónica de los lactantes; mioclonía; miopatía; miotonía congénita; narcolepsia; neurofibromatosis; síndrome neuroléptico maligno; manifestaciones neurológicas del SIDA; secuelas neurológicas del lupus; neuromiotonía; lipofuscinosis ceroidea; trastornos de la migración neuronal; enfermedad de Niemann-Pick; síndrome de McLeod- O'Sullivan; neuralgia occipital; secuencia de espina bífida oculta; síndrome Ohtahara; atrofia olivopontocerebelosa; opsoclono-mioclono; neuritis óptica; hipotensión ortostática; síndrome de sobreuso; parestesia; enfermedad o trastorno neurodegenerativo (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), demencia, esclerosis múltiple y otras enfermedades y trastornos asociados con la muerte celular neuronal); paramiotonía congénita; enfermedades paraneoplásicas; ataques paroxísticos; síndrome de Parry Romberg; enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher; parálisis periódicas; neuropatía periférica; neuropatía dolorosa y dolor neuropático; estado vegetativo persistente; trastornos profundos del desarrollo; reflejo de estornudo fótico; enfermedad de almacenamiento de ácido fitánico; enfermedad de Pick; nervio pinzado; tumores de la hipófisis; polimiositis; porencefalia; síndrome post-polio; neuralgia postherpética; encefalomielitis postinfecciosa; hipotensión postural; síndrome de Prader-Willi; esclerosis lateral primaria; enfermedades priónicas; atrofia hemifacial progresiva; leucoencefalopatía multifocal progresiva; poliodistrofia esclerosante progresiva; parálisis supranuclear progresiva; seudotumor cerebral; síndrome de Ramsay-Hunt (tipos I y 11 ); encefalitis de Rasmussen; síndrome de distrofia simpática refleja; enfermedad de Refsum; trastornos por movimientos repetitivos; lesiones por esfuerzo repetitivo; síndrome de piernas inquietas; mielopatía asociada a retrovirus; síndrome de Rett; síndrome de Reye; baile de San Vito; enfermedad de Sandhoff; enfermedad de Schilder; esquizencefalia; displasia septo-óptica; síndrome del bebé zarandeado; herpes; síndrome de Shy-Drager; síndrome de Sjogren; apnea del sueño; síndrome de Soto; espasticidad; espina bífida; lesión de la médula espinal; tumores de la médula espinal; atrofia muscular en la columna; síndrome de la persona rígida; accidente cerebrovascular; síndrome de Sturge-Weber; panencefalitis esclerosante subaguda; encefalopatía arteriosclerótica subcortical; corea de Sydenham; síncope; siringomielia; discinesia tardía; enfermedad de Tay-Sachs; arteritis temporal; síndrome de médula espinal anclada; enfermedad de Thomsen; síndrome del opérculo torácico; Tic Douloureux; parálisis de Todd; Síndrome de Tourette; ataque isquémico transitorio; encefalopatías espongiformes transmisibles; mielitis transversa; lesión cerebral traumática; temblor; neuralgia trigeminal; paraparesia espástica tropical; esclerosis tuberosa; demencia vascular (demencia multiinfarto); vasculitis incluyendo arteritis temporal; enfermedad de Von Hippel-Lindau; síndrome de Wallenberg; enfermedad de Werdnig-Hoffman; síndrome de West; latigazo cervical; síndrome de Williams; enfermedad de Wildon; y síndrome de Zellweger.

"Enfermedad metabólica" se refiere a una amplia gama de enfermedades y trastornos del sistema endocrino que incluyen, por ejemplo, resistencia a la insulina, diabetes, obesidad, intolerancia a la glucosa, colesterol alto en sangre, hiperglucemia, dislipidemia e hiperlipidemia.

Una "inflamación" se refiere a condiciones inflamatorias sistémicas y condiciones asociadas localmente con migración y atracción de monocitos, leucocitos y/o neutrófilos. Ejemplos de la inflamación incluyen, pero no se limitan a, inflamación resultante de la infección con microorganismos patógenos (incluyendo bacterias gram-positivas y gramnegativas, virus, hongos y parásitos como protozoos y helmintos), rechazo al trasplante (incluido el rechazo a órganos sólidos como riñón, hígado, corazón, pulmón o córnea, así como rechazo a los trasplantes de médula ósea incluyendo enfermedad injerto-contra-huésped (EICH), o por reacciones alérgicas autoinmunitarias localizadas agudas o crónicas. Las enfermedades autoinmunitarias incluyen glomerulonefritis aguda; artritis reumatoide o reactiva; glomerulonefritis crónica; enfermedades inflamatorias del intestino como la enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y enterocolitis necrotizante; síndromes asociados a transfusión de granulocitos; dermatosis inflamatoria como dermatitis por contacto, dermatitis atópica, psoriasis; lupus eritematoso sistémico (LES), tiroiditis autoinmunitaria, esclerosis múltiple, y algunas formas de diabetes, u otro estado autoinmunitario donde el ataque del propio sistema inmunitario del sujeto resulte en destrucción patológica del tejido. Las reacciones alérgicas incluyen asma alérgico, bronquitis crónica y aguda de hipersensibilidad retardada. Los estados de enfermedad inflamatoria sistémica incluyen inflamación asociada con traumatismo, quemaduras, reperfusión después de eventos isquémicos (por ejemplo, eventos trombóticos en corazón, cerebro, intestinos o vasculatura periférica, incluyendo infarto de miocardio y accidente cerebrovascular), sepsis, SDRA o síndrome de disfunción en múltiples órganos. El reclutamiento de células inflamatorias también se produce en placas ateroscleróticas. La inflamación incluye, pero no se limita a, linfoma no Hodgkin, granulomatosis de Wegener, tiroiditis de Hashimoto, carcinoma hepatocelular, atrofia del timo, pancreatitis crónica, artritis reumatoide, linfoartitis reactiva, hiperplasia de osteoartritis, carcinoma papilar, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colecistitis aguda, colecistitis crónica, cirrosis, sialadenitis crónica, peritonitis, pancreatitis aguda, pancreatitis crónica, gastritis crónica, adenomiosis, endometriosis, cervicitis aguda, cervicitis crónica, hiperplasia linfoide, esclerosis múltiple, hipertrofia secundaria a púrpura trombocitopénica idiopática, nefropatía por IgA primaria, lupus sistémico eritematoso, psoriasis, enfisema pulmonar, pielonefritis crónica y cistitis crónica.

Una enfermedad o trastorno cardiovascular incluye aquellos trastornos que pueden causar isquemia o son causados por reperfusión del corazón. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis granulomatosa, miocarditis crónica (no granulomatosa), cardiomiopatía hipertrófica primaria, enfermedad arterial periférica (PAD), accidente cerebrovascular, angina de pecho, infarto de miocardio, daño tisular cardiovascular provocado por paro cardiaco, daño tisular cardiovascular provocado por bypass cardíaco, choque cardiógeno, y afecciones relacionadas que serían conocidas por los expertos en la materia o que implican disfunción de o daño tisular al corazón o la vasculatura, especialmente, aunque sin limitarse a, daño tisular relacionado con la activación de Sirtuin3. Las enfermedades cVs incluyen, aunque sin limitarse a, aterosclerosis, miocarditis granulomatosa, infarto de miocardio, fibrosis miocárdica secundaria a enfermedad valvular cardiaca, fibrosis miocárdica sin infarto, cardiomiopatía hipertrófica primaria, y miocarditis crónica (no granulomatosa).

Composiciones y Moléculas de Polinucleótidos y Oligonucleótidos

Dianas

En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de Sirtuina (SIRT), que incluyen, sin limitación, secuencias codificantes y/o no codificantes y/o antisentido asociadas con Sirtuina (SIRT).

En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de SIRTI, que incluyen, sin limitación, secuencias codificantes y/o no codificantes y/o antisentido asociadas con el gen SRTI.

En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de SIRT3, incluyendo sin limitación secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas con el gen SIRT3.

En un aspecto, las dianas comprenden secuencias de ácido nucleico de SIRT6, incluyendo sin limitación secuencias no codificantes y/o codificantes, sentido y/o antisentido asociadas con el gen SIRT6.

"Proteína SIRT1" se refiere a un miembro de la familia sir2 de sirtuina desacetilasas. En un aspecto, una proteína SIRT1 incluye levadura Sir2 (número de acceso de GenBank P53685), C. elegans Sir-2.I (número de acceso de GenBank NP.sub.--501912), SIRT1 humano (número de acceso de GenBank NM.sub.--012238 y NP.sub.--036370 (o AF083106))

"Sirtuinas" SIRT1 son proteínas que incluyen un dominio SIR2, un dominio definido como secuencias de aminoácidos que se puntúan como aciertos en la familia Pfam "SIR2" -PF02146 (adjunta al Apéndice). Esta familia se menciona en la base de datos de INTERPRO como descripción de INTERPRO (entrada IPR003000). Para identificar la presencia de un dominio "SIR2" en una secuencia de proteína y hacer la determinación de que un polipéptido o proteína de interés tiene un perfil particular, la secuencia de aminoácidos de la proteína se puede buscar en la base de datos Pfam de HMM (p. ej., la base de datos de Pfam, versión 9) utilizando los parámetros predeterminados (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). El dominio SIR2 está indexado en Pfam como PF02146 y en INTERPRO como descripción de INTERPRO (entrada IPR003000). Se puede encontrar una descripción de la base de datos Pfam en "The Pfam Protein Families Database" Bateman A y col. (2002) Nucleic Acids Research 30(1):276-280 y Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420 y se puede encontrar una descripción detallada de los HMM, por ejemplo, en Gribskov y col. (1990) Meth. Enzymol. 183: 146-159; Gribskov y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358: Krogh y col. (1994) J. Mol. Biol. 235: 1501-1531:, y Stultz y col. (1993) Protein Sci. 2:305-314.

Entre las sirtuinas mitocondriales, SIRT3 posee la actividad de desacetilasa más robusta. De hecho, se detectaron niveles significativamente más altos de acetilación de proteínas mitocondriales en los hígados de ratones sin SIRT3, en comparación con los de animales knockout para SIRT4 o SIRT5. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel fisiológico de SIRT3 a pesar de que se han identificado varios sustratos de SIRT3 y proteínas coprecipitantes: acetil-CoA sintetasa 2, Ku70, FOXO3a, subunidad 9 del complejo mitocondrial I (NDUFA9), glutamato deshidrogenasa e isocitrato deshidrogenasa 2.

SIRT3 es una desacetilasa mitocondrial importante. Las proteínas mitocondriales muestran hiperacetilación en ratones knockout SIRT3, pero no en ratones knockout SIRT4 o SIRT5. La acetil-CoA sintetasa 2 (AceCS2), una enzima mitocondrial que convierte el acetato en acetil-CoA, fue el primer sustrato mitocondrial de SIRT3 identificado. La desacetilación de AceCS2 en lisina 642 por SIRT3 activa la actividad acetil-CoA sintetasa, proporcionando un aumento de acetil-CoA para alimentar el ciclo del ácido tricarboxílico. La glutamato deshidrogenasa (GDH), otra proteína mitocondrial involucrada en la producción de energía, es desacetilada por SIRT3. GDH también puede ser ADP-ribosilado por SIRT4 a su vez para disminuir su actividad enzimática. Esto indica que SIRT3 podría desempeñar un papel importante en el metabolismo celular. También se ha demostrado que SIRT3 está implicado en vías de apoptosis selectiva y control del crecimiento celular SIRT3 y SIRT4, pero no SIRT5, se han implicado en la vía de rescate de NAD+ que regula el nivel de NAD+ relacionado con la supervivencia celular. Además, la variabilidad en el gen hSIRT3 se ha relacionado con la longevidad humana.

El gen Regulador-2 de información silenciosa (Sir2) codifica una histona desacetilasa dependiente de NAD que vincula la regulación de la cromatina, la estabilidad genómica y la duración de vida en S. cerevisiae. Al promover el silenciamiento de la cromatina, Sir2 inhibe la transcripción en varios loci genéticos y reprime la recombinación en las repeticiones del ADN ribosómico (ADNr). Las levaduras con mutaciones en Sir2 han aumentado la inestabilidad genómica en el contexto de la recombinación del ADNr, lo que a su vez acorta la duración de la vida replicativa, un marcador del envejecimiento reproductivo en este organismo. Por el contrario, las extracopias de Sir2 que suprimen la recombinación del ADNr aumentan la vida útil replicativa. Estos efectos de Sir2 sugieren paradigmas en los que los genes que promueven la estabilización del genoma a través de la modulación de la cromatina pueden contribuir de manera importante a la regulación de la duración de vida del organismo, el envejecimiento y la patología relacionada con la edad.

De acuerdo con un papel conservado de los factores Sir2 en la regulación del período de vida, el aumento de la actividad de las proteínas Sir2 en los organismos multicelulares C. elegans y D. melanogaster también aumenta el período de vida. Sin embargo, estos factores Sir2 pueden operar a través de mecanismos que son independientes de la estabilización del genoma, y sus sustratos moleculares fisiológicos aún no están claros. En los mamíferos, hay siete miembros de la familia Sir2, SIRT1-SIRT7. Los SIRT han sido de gran interés como reguladores candidatos de la duración de la vida de los mamíferos y los procedimientos relacionados con el envejecimiento. En este contexto, varios SIRT de mamíferos tienen funciones que influyen en las enfermedades y las vías moleculares asociadas al envejecimiento. Sin embargo, los estudios iniciales de SIRT de mamíferos vincularon estas enzimas a dianas bioquímicas y funciones celulares que son distintas de las de S. cerevisiae Sir2.

La generación de ratones deficientes para el gen SIRT6 de mamífero reveló un papel potencial para SIRT6 en la regulación de la vinculación de la duración de la vida, la cromatina y la estabilidad genómica. En este contexto, la deficiencia de SIRT6 en ratones conduce a una duración de vida dramáticamente acortada y fenotipos degenerativos agudos que se superponen con patologías del envejecimiento prematuro. Además, las células de ratón knockout SIRT6 tienen inestabilidad genómica e hipersensibilidad al daño del ADN. En los ensayos de fraccionamiento bioquímico, la proteína SIRT6 se asocia preferiblemente con una fracción celular enriquecida con cromatina. Juntas, estas observaciones sugirieron que SIRT6 podría acoplar la regulación de la cromatina con la reparación del ADN. Sin embargo, aún no se ha demostrado un papel fisiológico de SIRT6 en tal procedimiento.

En algunos aspectos, los oligonucleótidos antisentido se usan para impedir o tratar enfermedades o trastornos asociados con miembros de la familia de Sirtuina (SIRT). Ejemplos de enfermedades y trastornos mediados por Sirtuina (SIRT) que pueden tratarse con células/tejidos regenerados a partir de células madre obtenidas usando los compuestos antisentido comprenden; cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, cáncer colorrectal, LCC, LMC, cáncer de próstata), una enfermedad o trastorno neurodegenerativo (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple, y trastornos causados por la agregación de poliglutaminas); enfermedad del músculo esquelético (por ejemplo, distrofia muscular de Duchene, atrofia del músculo esquelético, distrofia de Becker o distrofia miotónica); una enfermedad o trastorno metabólico (por ejemplo, resistencia a la insulina, diabetes, diabetes tipo 2, obesidad, intolerancia a la glucosa, síndrome metabólico, diabetes de inicio en la edad adulta, nefropatía diabética, hiperglucemia, nefropatía diabética, Hipercolesterolemia, dislipidemia, hiperlipidemia y una enfermedad metabólica relacionada con la edad, etc.), una enfermedad o trastorno asociado con una regulación alterada del nivel de insulina, neuropatía (por ejemplo, neuropatía sensorial, neuropatía autonómica, neuropatía motora, retinopatía), una enfermedad o trastorno asociado con una condición cetogénica, una enfermedad o trastorno asociado con alteración de la homeostasis energética, una enfermedad o trastorno asociado con alteración de la actividad de la acetil-CoA sintetasa 2, una enfermedad o trastorno asociado con la homeostasis metabólica, una enfermedad o trastorno del metabolismo de los lípidos, una enfermedad o trastorno asociado con alteración de la termogénesis, una enfermedad o trastorno asociado con disfunción mitocondrial, neuropatía (por ejemplo, neuropatía sensorial, neuropatía autonómica, neuropatía motora, retinopatía), una enfermedad hepática (por ejemplo, debido al abuso de alcohol o hepatitis, enfermedad del hígado graso, etc.); degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de los huesos (por ejemplo, osteoporosis), enfermedad de la sangre (por ejemplo, leucemia); enfermedad del hígado (por ejemplo, debido al abuso de alcohol o hepatitis); obesidad; reabsorción ósea, degeneración macular relacionada con la edad, demencia relacionada con el SIDA, ELA, parálisis de Bell, aterosclerosis, una enfermedad cardíaca (p. ej., disrimias cardíacas, insuficiencia cardíaca congestiva crónica, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de las arterias coronarias y cardiomiopatía), enfermedad degenerativa crónica (p. ej., enfermedad del músculo cardíaco), insuficiencia renal crónica, diabetes tipo 2, ulceración, cataratas, presbicia, glomerulonefritis, síndrome de Guillan-Barre, accidente cerebrovascular hemorrágico, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria intestinal, LES, enfermedad de Crohn, osteoartritis, osteoporosis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), neumonía, envejecimiento de la piel, incontinencia urinaria, una enfermedad o trastorno asociado con disfunción mitocondrial (p. ej., miopatía mitocondrial, encefalopatía, enfermedad de Leber, encefalopatía de Leigh, enfermedad de Pearson, acidosis láctica, encefalopatía mitocondrial, acidosis láctica y síntomas similares a accidentes cerebrovasculares (MBLAS), etc.) y una enfermedad o trastorno asociado con la muerte de células neuronales, síndrome degenerativo, envejecimiento, una enfermedad o trastorno asociado con disfunción de los telómeros, una enfermedad o trastorno asociado con una regulación alterada de la cromatina, una enfermedad o trastorno asociado con senescencia celular prematura, una enfermedad o trastorno asociado con una reparación del ADN mediada por SIRT6 alterada y una afección caracterizada por una pérdida celular no deseada.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido modulan la expresión normal y/o la función normal de una Sirtuina (SIRT) en pacientes que padecen o están en riesgo de desarrollar enfermedades o trastornos asociados con Sirtuina (SIRT).

En los aspectos de la presente divulgación, se proporcionan regímenes terapéuticos y/o cosméticos y tratamientos personalizados relacionados a sujetos que requieren tratamientos cutáneos o que están en riesgo de desarrollar afecciones para las que requerirían tratamientos cutáneos. El diagnóstico se puede hacer, por ejemplo, en función del estado del SIRT del sujeto. Los niveles de expresión del gen SIRT de un paciente en un tejido dado tal como la piel se pueden determinar por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y descritos en otra parte en esta invención, por ejemplo, analizando tejido usando PCR o procedimien tos de detección basados en anticuerpos.

Un aspecto preferido de la presente divulgación proporciona una composición para el tratamiento de la piel y/o una aplicación cosmética que comprende oligonucleótidos antisentido de SIRT, por ejemplo, para regular en sentido ascendente la expresión de SIRt en la piel. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como las SEQ ID NOS: 4 a 16. Pta. EE. UU. No. 7.544.497, "Compositions for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms,"

describe el uso cosmético potencial de agentes que modulan la actividad de la sirtuina reduciendo la Km de la proteína Sirtuina para su sustrato. En algunos aspectos, las células se tratan in vivo con los oligonucleótidos de la presente divulgación, para aumentar la esperanza de vida celular o prevenir la apoptosis. Por ejemplo, la piel puede protegerse del envejecimiento, por ejemplo, del desarrollo de arrugas, tratando la piel, por ejemplo, las células epiteliales, como se describe en esta invención. En un aspecto ejemplar, la piel se pone en contacto con una composición farmacéutica o cosmética que comprende un compuesto antisentido de SIRT como se describe en esta invención. Lesiones cutáneas ejemplares o afecciones de la piel incluyen trastornos o enfermedades asociadas con o causadas por inflamación, daño solar o envejecimiento natural. Por ejemplo, las composiciones encuentran utilidad en la prevención o tratamiento de dermatitis de contacto (incluyendo dermatitis de contacto irritante y dermatitis de contacto alérgica), dermatitis atópica (también conocida como eccema alérgico), queratosis actínica, trastornos de queratinización (incluyendo eczema), enfermedades de epidermólisis bullosa (incluyendo pénfigo), dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritemas (incluyendo eritema multiforme y eritema nodoso), daño causado por el sol u otras fuentes de luz, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, cáncer de piel y efectos del envejecimiento natural.

Se ha informado que la Sirtuina interfiere con la señalización del receptor de andrógenos inducido por dihidrotestosterona. (Ver, p.ej., Fu, y col., 2006, "Hormonal Control of Androgen Receptor Function through SIRT1," Molecular and Cellular Biology 26(21): 8122-8135). En los aspectos de la presente divulgación, una composición que comprende oligonucleótidos antisentido de SIRT, por ejemplo, para regular en sentido ascendente la expresión de SIRT en el cuero cabelludo e inhibir la señalización del receptor de andrógenos, evitando así la alopecia androgenética (pérdida de cabello). En algunos aspectos, a un paciente que padece alopecia se le administra una formulación tópica o sistémica.

En un aspecto, un oligonucleótido antisentido descrito en esta invención se incorpora a una formulación tópica que contiene un vehículo tópico que es generalmente adecuado para la administración tópica de fármacos y que comprende cualquier material conocido en la técnica. El vehículo tópico puede seleccionarse para proporcionar la composición en la forma deseada, por ejemplo, como ungüento, loción, crema, microemulsión, gel, aceite, solución o similar, y puede estar compuesto de un material de origen natural o de origen sintético. Es preferible que el vehículo seleccionado no afecte adversamente al agente activo u otros componentes de la formulación tópica. Ejemplos de vehículos tópicos adecuados para su uso en esta invención incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, vaselina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenos, ceras y similares. Las formulaciones pueden ser ungüentos, lociones, cremas, microemulsiones y geles incoloros e inodoros.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación pueden incorporarse en ungüentos, que generalmente son preparaciones semisólidas que se basan típicamente en vaselina u otros derivados del petróleo. La base de ungüento específica a usar, como apreciarán los expertos en la técnica, es aquella que proporcionará una administración óptima del fármaco y, preferiblemente, proporcionará otras características deseadas también, por ejemplo, emoliencia o similar. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y sin sensibilidad. Como se explica en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.), las bases para ungüentos pueden agruparse en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsionables; bases de emulsión; y bases solubles en agua. Las bases oleaginosas para ungüentos incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de ungüentos emulsionables, también conocidas como bases de ungüentos absorbentes, contienen poca o nada de agua e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y vaselina hidrófila. Las bases de ungüentos en emulsión son emulsiones de agua en aceite (W/O) o emulsiones de aceite en agua (O/W) e incluyen, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de ungüento solubles en agua ejemplares se preparan a partir de polietilenglicoles (PEG) de peso molecular variable (ver, por ejemplo, Remington, supra).

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en lociones, que generalmente son preparaciones para aplicar a la superficie de la piel sin fricción, y son típicamente preparaciones líquidas o semilíquidas en las que partículas sólidas, incluido el agente activo, están presentes en una base de agua o alcohol. Las lociones son usualmente suspensiones de sólidos, y pueden comprender una emulsión oleosa líquida del tipo de aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas para tratar grandes áreas corporales, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. Generalmente, es necesario que la materia insoluble sea una loción que esté finamente dividida. Las lociones típicamente contendrán agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, así como compuestos útiles para localizar y mantener el agente activo en contacto con la piel, por ejemplo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica, o similares. Una formulación de loción ejemplar para usar junto con el presente procedimiento contiene propilenglicol mezclado con una vaselina hidrófila tal como la que se puede obtener con la marca comercial Aquaphor® de Beiersdorf, Inc. (Notwalk, Conn.).

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación pueden incorporarse en cremas, que generalmente son emulsiones líquidas viscosas o semisólidas, ya sea aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua, y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa está generalmente compuesta por vaselina y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa usualmente, aunque no necesariamente, excede la fase oleosa en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsionante en una formulación en crema, como se explica en Remington's, supra, es generalmente un tensioactivo no iónico, aniónico, catiónico o anfótero.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en microemulsiones, que generalmente son dispersiones isotrópicamente transparentes termodinámicamente estables de dos líquidos inmiscibles, como aceite y agua, estabilizados por una película interfacial de moléculas tensioactivas.(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volumen 9). Para la preparación de microemulsiones, se necesitan un tensioactivo (emulsionante), cotensioactivo (coemulsionante), una fase oleosa y una fase acuosa. Los tensioactivos adecuados incluyen cualquier tensioactivo que sea útil en la preparación de emulsiones, por ejemplo, emulsionantes que se usan típicamente en la preparación de cremas. El cotensioactivo (o "coemulsionante") generalmente se selecciona de entre el grupo de derivados de poliglicerol, derivados de glicerol y alcoholes grasos. Las combinaciones de emulsionante/coemulsionante preferidas generalmente se seleccionan, aunque no necesariamente, de entre el grupo que consiste en monoestearato de glicerilo y estearato de polioxietileno; polietilenglicol y palmitoestearato de etilenglicol; y triglicéridos caprílicos y cápricos y macrogolglicéridos de oleoílo. La fase acuosa incluye no solo agua sino también, típicamente, tampones, glucosa, propilenglicol polietilenglicoles, preferiblemente polietilenglicoles de bajo peso molecular (por ejemplo, PEG 300 y pEg 400), y/o glicerol, y similares, mientras que la fase oleosa generalmente comprenderá, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos, aceites vegetales modificados, aceites de silicona, mezclas de mono, di y triglicéridos, mono y diésteres de PEG (por ejemplo, oleoil-macrogol-glicéridos), etc.

Los oligonucleótidos antisentido de la divulgación se pueden incorporar en formulaciones de gel, que generalmente son sistemas semisólidos que consisten en suspensiones compuestas por pequeñas partículas inorgánicas (sistemas de dos fases) o moléculas orgánicas grandes distribuidas de manera sustancialmente uniforme a través de un vehículo líquido (geles de fase única). Los geles monofásicos se pueden preparar, por ejemplo, combinando el agente activo, un líquido portador y un agente gelificante adecuado tal como tragacanto (del 2 al 5 %), alginato sódico (al 2-10 %), gelatina (al 2-15 %), metilcelulosa (al 3-5 %), carboximetilcelulosa sódica (al 2-5 %), carbómero (al 0,3-5 %) o alcohol polivinílico (al 10-20 %) juntos y en mezcla hasta que se produce un producto semisólido característico. Otros agentes gelificantes adecuados incluyen metilhidroxicelulosa, polioxietileno-polioxipropileno, hidroxietilcelulosa y gelatina. Aunque los geles comúnmente emplean un vehículo líquido acuoso, también se pueden usar alcoholes y aceites como el vehículo líquido.

Se pueden incluir varios aditivos, conocidos por los expertos en la técnica, en formulaciones, por ejemplo, formulaciones tópicas. Ejemplos de aditivos incluyen, pero no se limitan a, solubilizantes, mejoradores de la permeación de la piel, opacificantes, conservantes (por ejemplo, antioxidantes), agentes gelificantes, agentes tamponadores, tensioactivos (particularmente tensioactivos no iónicos y anfóteros), emulsionantes, emolientes, agentes espesantes, estabilizadores, humectantes, colorantes, fragancias, y similares. La inclusión de solubilizantes y/o mejoradores de la permeación de la piel es particularmente preferida, junto con emulsionantes, emolientes y conservantes. Una formulación tópica óptima comprende aproximadamente: 2% en peso hasta 60% en peso, preferiblemente 2% en peso hasta 50% en peso, solubilizante y/o mejorador de la permeabilidad cutánea: 2% en peso hasta 50% en peso, preferiblemente 2% en peso, a 20% en peso, emulsionantes; 2 % en peso a 20 % en peso de emoliente; y 0,01 a 0,2% en peso de conservante, con el agente activo y el vehículo (por ejemplo, agua) formando el resto de la formulación.

Un mejorador de la permeación de la piel sirve para facilitar el paso de niveles terapéuticos de agente activo para pasar a través de un área de tamaño razonable de piel intacta. Mejoradores adecuados se conocen bien en la técnica e incluyen, por ejemplo: alcanoles inferiores tales como metanol, etanol y 2-propanol; alquil metil sulfóxidos tales como dimetilsulfóxido (DMSO), decilmetilsulfóxido (C.sub.10MSO) y tetradecilmetilsulfóxido; pirrolidonas tales como 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona y N-(-hidroxietil)pirrolidona; urea; N,N-dietil-m-toluamida; alcanodioles C.sub.2C.sub.6; diversos disolventes tales como dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA) y alcohol tetrahidrofurfurílico; y las azacicloheptan-2-onas 1-sustituidas, particularmente 1-n-dodecilcidazacidoheptan-2-ona (laurocapram; disponible bajo la marca registrada Azone.sup.RTM de Whitby Research Incorporated, Richmond, Va). Ejemplos de solubilizantes incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: éteres hidrófilos tales como dietilenglicol monoetil éter (etoxidiglicol, disponible comercialmente como Transcutol) y oleato de dietilenglicol monoetil éter (disponible comercialmente como Soficutol.sum.RTM); derivados de aceite de ricino de polietileno tales como aceite de ricino polioxi 35, aceite de ricino hidrogenado polioxi 40, etc.; polietilenglicol, particularmente polietilenglicoles de menor peso molecular tales como PEG 300 y PEG 400, y derivados de polietilenglicol tales como glicéridos caprílicos/cápricos PEG-8 (disponibles comercialmente como Labrasol); alquilmetilsulfóxidos tales como DMSO; pirrolidonas tales como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; y DMA. Muchos solubilizantes también pueden actuar como mejoradores de la absorción. Se puede incorporar un único solubilizante en la formulación, o se puede incorporar una mezcla de solubilizantes en la misma.

Los emulsionantes y coemulsionantes adecuados incluyen, sin limitación, los emulsionantes y coemulsionantes descritos con respecto a las formulaciones de microemulsiones. Los emolientes incluyen, por ejemplo, propilenglicol, glicerol, miristato de isopropilo, propionato de polipropilenglicol-2 (PPG-2) miristil éter, y similares.

Otros agentes activos también se pueden incluir en formulaciones, por ejemplo, otros agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes y bloqueadores solares que se encuentran comúnmente en formulaciones de protección solar incluyendo, pero no se limitan a, antranilatos , benzofenonas (particularmente benzofenona-3), derivados de alcanfor, cinamatos (por ejemplo, metoxicinamato de octilo), metanos de dibenzoílo (por ejemplo, butil metoxidibenzoílo metano ), ácido paminobenzoico (PABA) y derivados de los mismos, y salicilatos (por ejemplo, salicilato de octilo).

En un aspecto, los oligonucleótidos son específicos para polinucleótidos de una Sirtuina (SIRT), que incluye, sin limitación, regiones no codificantes. Las dianas de Sirtuin (SIRT) comprenden variantes de una Sirtuina (SIRT); mutantes de una Sirtuina (SIRT), incluidos los SNP; secuencias no codificantes de una Sirtuina (SIRT); alelos, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula de ARN antisentido.

De acuerdo con los aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no se limita a polinucleótidos de Sirtuina (SIRT) solos sino que se extiende a cualquiera de las isotoninas, receptores, homólogos, regiones no codificantes y similares de una Sirtuina (SIRT).

En otro aspecto, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural (antisentido natural de las regiones codificantes y no codificantes) de una diana de Sirtuina (SIRT), que incluye, sin limitación, variantes, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias. al mismo. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula de ARN o ADN antisentido.

En otro aspecto, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes en las que está presente una base diferente en una o más de las posiciones de nucleótidos en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina, citidina u otros nucleótidos naturales o no naturales en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones del compuesto antisentido.

En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencia o complementariedad entre el compuesto antisentido y la diana es de aproximadamente 50% a aproximadamente 60%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100%.

Un compuesto antisentido es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere en la función normal del ácido nucleico diana para producir una pérdida de actividad y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias de ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea la unión específica. Tales condiciones incluyen, es decir, condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y condiciones en las que se realizan los ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Un compuesto antisentido, ya sea ADN, ARN, quimérico, sustituido, etc., es específicamente hibridable cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o de ARN diana interfiere en la función normal del ADN o ARN diana para producir una pérdida de utilidad, y hay un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión inespecífica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en el caso de ensayos in vitro, en condiciones en las que se realizan los ensayos.

En otro aspecto, el direccionamiento de una Sirtuina (SIRT) que incluye, sin limitación, secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando por ejemplo, PCR, hibridación, etc., una o más de las secuencias establecidas como SEQ ID NO: 5 a 14 y similares, modulan la expresión o función de una Sirtuina (SIRT). En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En otro aspecto, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control.

En otro aspecto, los oligonucleótidos comprenden secuencias de ácido nucleico establecidas como SEQ ID NOS: 15 a 94 que incluyen secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridación, etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotídicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente divulgación puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, per se, también es conocida y no es necesario describirla aquí.

La especificidad y sensibilidad de antisentido también es empleada por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales y el ser humano. Los oligonucleótidos antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en marcha. De este modo, se establece que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

En aspectos de la presente divulgación, los compuestos antisentido oligoméricos, particularmente oligonucleótidos, se unen a moléculas de ácidos nucleicos diana y modulan la expresión y/o función de moléculas codificadas por un gen diana. Las funciones de ADN con las que interferirán comprenden, por ejemplo, replicación y transcripción. Las funciones de ARN con las que interferirán comprenden todas las funciones vitales tales como, por ejemplo, translocalización del ADN al sitio de traducción de proteína, traducción de proteína desde ARN, splicing del ARN para dar una o más especies de ARNm, y actividad catalítica que puede acoplarse en o facilitarse por el ARN. Las funciones pueden regularse positivamente o inhibirse dependiendo de las funciones deseadas.

Los compuestos antisentido incluyen compuestos antisentido oligoméricos, oligonucleótidos antisentido, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), agentes de splicing alternativos, cebadores, sondas, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana. Por lo tanto, estos compuestos pueden introducirse en forma de compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, parcialmente monocatenarios, o circulares.

El direccionamiento de un compuesto antisentido a una molécula de ácido nucleico particular, en el contexto de esta divulgación, puede ser un procedimiento multietapa. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de un ácido nucleico diana cuya función va a modularse. Este ácido nucleico diana puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o una molécula de ácido nucleico de un agente infeccioso. En la presente divulgación, el ácido nucleico diana codifica una Sirtuina (SIRT). El procedimiento de direccionamiento normalmente también incluye la determinación de al menos una región diana, segmento, o sitio dentro del ácido nucleico diana para que la interacción antisentido se produzca de forma que resulte el efecto deseado, por ejemplo, la modulación de la expresión. Dentro del contexto de la presente divulgación, el término "región" se define como una parte del ácido nucleico diana que tiene al menos una estructura, función o característica identificable. Dentro de las regiones de ácidos nucleicos diana están los segmentos. Los «segmentos» se definen como partes más pequeñas o sub-partes de regiones dentro de un ácido nucleico diana. «Sitios», tal como se usa en la presente divulgación, se define como posiciones dentro de un ácido nucleico diana.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a las secuencias antisentido naturales de una Sirtuina (SIRT) y modulan la expresión y/o función de una Sirtuina (SIRT) (SEQ ID NO: 1 a 3). Ejemplos de secuencias antisentido incluyen las SeQ ID NO: 4 a 29.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a uno o más segmentos de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) y modulan la expresión y/o función de una Sirtuina (SIRT). Los segmentos comprenden al menos cinco nucleótidos consecutivos de los polinucleótidos sentido o antisentido de una Sirtuina (SIRT).

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido son específicos para secuencias antisentido naturales de una Sirtuina (SIRT) donde la unión de los oligonucleótidos a las secuencias antisentido naturales de una Sirtuina (SIRT) modula la expresión y/o función de una Sirtuina (SIRT).

En otro aspecto, los compuestos de oligonucleótidos comprenden secuencias establecidas como SEQ ID NOS: 15 a 94, secuencias antisentido que se identifican y expanden, usando, por ejemplo, PCR, hibridación, etc. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares. Los ejemplos de enlaces modificados o enlaces internucleotídicos comprenden fosforotioato, fosforoditioato o similares. En otro aspecto, los nucleótidos comprenden un derivado de fósforo. El derivado de fósforo (o grupo fosfato modificado) que puede unirse al resto de azúcar o de análogo de azúcar en los oligonucleótidos modificados de la presente divulgación puede ser un monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfato, alcanofosfato, fosforotioato y similares. La preparación de los análogos de fosfato indicados anteriormente, y su incorporación en nucleótidos, nucleótidos modificados y oligonucleótidos, per se, también es conocida y no es necesario describirla aquí.

Dado que, como se conoce en la técnica, el codón de inicio de la traducción es típicamente 5'-AUG (en moléculas de ARNm transcrito; 5'-ATG en la molécula de ADN correspondiente), el codón de inicio de la traducción también se denomina "codón AUG," el "codón de inicio" o el "codón de inicio AUG". Una minoría de genes tiene un codón de iniciación de la traducción que tiene la secuencia de ARN 5'-GUG, 5'-UUG o 5'-CUG; y se ha demostrado que 5'-AUA, 5'-ACG y 5'-CUG funcionan in vivo. De este modo, las expresiones «codón de iniciación de la traducción» y «codón de iniciación» pueden englobar muchas secuencias de codón, aun cuando el aminoácido iniciador en cada caso normalmente sea metionina (en eucariotas) o formilmetionina (en procariotas). Los genes eucariotas y procariotas pueden tener dos o más codones de iniciación alternativos, uno cualquiera de los cuales puede utilizarse preferiblemente para la iniciación de la traducción en un tipo particular de célula o tejido, o en un conjunto particular de condiciones. En el contexto de la divulgación, "codón de iniciación" y "codón de iniciación de la traducción" se refieren al codón o codones que se usan in vivo para iniciar la traducción de un ARNm transcrito de un gen que codifica para una Sirtuina (SIRT), independientemente de las una o más secuencias de dichos codones. Un codón de terminación de la traducción (o "codón de terminación") de un gen puede tener una de tres secuencias, es decir, 5'-UAA, 5'-UAG y 5'-UGA (las secuencias de ADN correspondientes son 5'-TAA, 5'-TAG y 5'-TGA, respectivamente).

Las expresiones "región de codón de iniciación" y "región de codón de iniciación de la traducción" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de iniciación de la traducción. Análogamente, las expresiones "región de codón de parada" y "región de codón de terminación de la traducción" se refieren a una parte de dicho ARNm o gen que engloba de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 nucleótidos contiguos en cualquier dirección (es decir, 5' o 3') desde un codón de terminación de la traducción. Por consiguiente, la «región de codón de iniciación» (o «región de codón de iniciación de la traducción» y la «región de codón de parada» (o «región de codón de terminación de la traducción») son todas las regiones que pueden ser eficazmente elegidas como diana con los compuestos antisentido de la presente divulgación.

El marco de lectura abierta (MLA) o "región codificante", que se conoce en la técnica para referirse a la región entre el codón de iniciación de la traducción y el codón de terminación de la traducción, también es una región que puede ser eficazmente elegida como diana. Dentro del contexto de la presente divulgación, una región elegida como diana es la región intragénica que engloba el codón de iniciación o de terminación de la traducción del marco de lectura abierto (MLA) de un gen.

Otra región diana incluye la región no traducida 5' (5'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 5' desde el codón de iniciación de la traducción, y que incluye, por lo tanto, nucleótidos entre el sitio caperuza 5' y el codón de iniciación de la traducción de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). Otra región diana más incluye la región no traducida 3' (3'UTR), conocida en la técnica para referirse a la parte de un ARNm en la dirección 3' desde el codón de terminación de la traducción, y que incluye, por lo tanto, nucleótidos entre el codón de terminación de la traducción y el extremo 3' de un ARNm (o nucleótidos correspondientes en el gen). El sitio caperuza 5' de un ARNm comprende un residuo de guanosina N7-metilado unido al residuo más 5' del ARNm mediante un enlace trifosfato 5'-5'. La región caperuza 5' de un ARNm se considera que incluye la propia estructura caperuza 5', además de los primeros 50 nucleótidos adyacentes al sitio caperuza. Otra región diana para esta divulgación es la región caperuza 5'.

Aunque algunos transcritos de ARNm eucariotas se traducen directamente, muchos contienen una o más regiones, conocidas como "intrones", que se escinden de un transcrito antes de que se traduzca. Las regiones restantes (y, por tanto, traducidas) se conocen como «exones» y se someten a splicing juntas para formar una secuencia de ARNm continua. En un aspecto, la elección como diana de sitios de splicing, es decir, empalmes intrón-exón o empalmes exón-intrón, es particularmente útil en situaciones en las que el splicing aberrante participa en la enfermedad, o en las que una producción en exceso de un producto de splicing particular participa en la enfermedad. Un empalme de fusión aberrante debido a la transposición o deleción es otro aspecto de un sitio diana. Los ARNm transcritos producidos mediante el procedimiento de splicing de dos (o más) ARNm de diferentes fuentes de genes se conocen como "transcritos de fusión". Los intrones pueden ser eficazmente elegidos como diana usando compuestos antisentido dirigidos a, por ejemplo, ADN o pre-ARNm.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a regiones codificantes y/o no codificantes de un polinucleótido diana y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos antisentido naturales y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido se unen a polinucleótidos sentido y modulan la expresión y/o función de la molécula diana.

Pueden producirse transcritos de ARN alternativos a partir de la misma región genómica de ADN. Estos transcritos alternativos son generalmente conocidos como «variantes». Más específicamente, «variantes de pre-ARNm» son transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico que se diferencian de otros transcritos producidos a partir del mismo ADN genómico en su posición de inicio o de parada y contienen tanto secuencia intrónica como exónica. Tras la escisión de una o más regiones de exón o intrón, o partes de las mismas durante el splicing, las variantes de pre-ARNm producen "variantes de ARNm" más pequeñas. Por consiguiente, las variantes de ARNm son variantes de pre-ARNm procesadas y cada variante de pre-ARNm única siempre debe producir una variante de ARNm única como resultado del splicing. Estas variantes de ARNm también se conocen como "variantes de splicing alternativas". Si no se produce splicing de la variante de pre-ARNm, entonces la variante de pre-ARNm es idéntica a la variante de ARNm. Las variantes pueden producirse mediante el uso de señales alternativas para la transcripción de inicio o de parada. Los pre-ARNm y ARNm pueden poseer más de un codón de iniciación o codón de parada Las variantes que se originan a partir de un pre-ARNm o ARNm que usan codones de iniciación alternativos se conocen como «variantes de inicio alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Aquellos transcritos que usan un codón de parada alternativo se conocen como «variantes de parada alternativas» de ese pre-ARNm o ARNm. Un tipo específico de variante de parada alternativa es la «variante de poliA», en la que los múltiples transcritos producidos resultan de la selección alternativa de una de las «señales de parada de poliA» por la maquinaria de transcripción, produciendo de este modo transcritos que terminan en sitios de poliA únicos. Dentro del contexto de la divulgación, los tipos de variantes descritos en esta invención también son aspectos de ácidos nucleicos diana.

Las partes en el ácido nucleico diana con las que los compuestos antisentido hibridan se definen como al menos una parte de 5 nucleótidos de longitud de una región diana a la que se dirige un compuesto antisentido activo.

Aunque las secuencias específicas de ciertos segmentos diana a modo de ejemplo se exponen en esta invención, un experto en la materia reconocerá que éstas sirven para ilustrar y describir aspectos particulares dentro del alcance de la presente divulgación. Los segmentos diana adicionales son fácilmente identificables por un experto en la técnica en vista de esta divulgación.

Se considera que segmentos diana de 5-100 nucleótidos de longitud que comprenden un tramo de al menos cinco (5) nucleótidos consecutivos seleccionados de dentro de los segmentos diana preferidos ilustrativos también son adecuados para el direccionamiento.

Los segmentos diana pueden comprender secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 5' de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleótidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena arriba del extremo 5' del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). Los segmentos diana similarmente preferidos se representan por secuencias de ADN o ARN que comprenden al menos los 5 nucleótidos consecutivos desde el extremo 3 de uno de los segmentos diana preferidos ilustrativos (siendo los restantes nucleótidos un tramo consecutivo del mismo ADN o ARN que empieza inmediatamente cadena abajo del extremo 3 del segmento diana y que continúa hasta que el ADN o ARN contenga de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nucleótidos). Un experto en la técnica armado con los segmentos diana ilustrados en esta invención será capaz, sin excesiva experimentación, de identificar segmentos diana preferidos adicionales.

Una vez se han identificado una o más regiones, segmentos o sitios diana, se eligen compuestos antisentido que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, hibridan suficientemente bien y con suficiente especificidad, para dar el efecto deseado.

En aspectos de la divulgación, los oligonucleótidos se unen a una cadena antisentido de una diana particular. Los oligonucleótidos tienen al menos 5 nucleótidos de longitud y pueden sintetizarse de manera que cada oligonucleótido se dirija a secuencias solapantes de forma que los oligonucleótidos se sinteticen para cubrir toda la longitud del polinucleótido diana. Las dianas también incluyen regiones codificantes, además de no codificantes.

En un aspecto, los oligonucleótidos antisentido toman como diana ácidos nucleicos específicos. El direccionamiento de un compuesto antisentido a un ácido nucleico particular es un procedimiento multietapa. El procedimiento normalmente empieza con la identificación de una secuencia de ácido nucleico cuya función va a modularse. Esta puede ser, por ejemplo, un gen celular (o ARNm transcrito a partir del gen) cuya expresión está asociada a un trastorno o patología particular, o un polinucleótido no codificante tal como, por ejemplo, ^a Rⁿ no codificante (ARNnc).

Los ARN pueden clasificarse en (1) ARN mensajeros (ARNm), que se traducen en proteínas, y (2) ARN no codificantes de proteína (ARNnc). Los ARNnc comprenden microARN, transcritos antisentido y otras unidades transcripcionales (TU) que contienen una alta densidad de codones de terminación y que carecen de cualquier amplio "marco de lectura abierto". Muchos ARNnc parecen empezar a partir de sitios de iniciación en regiones no traducidas 3' (3'UTR) de loci codificantes de proteínas. Con frecuencia, los ARNnc son raros y al menos la mitad de los ARNnc que se han secuenciado por el consorcio FANTOM no parecen estar poliadenilados. La mayoría de los investigadores se han basado, por motivos obvios, en ARNm poliadenilados que se procesan y se exportan al citoplasma. Recientemente, se demostró que el conjunto de ARN nucleares no poliadenilados puede ser muy grande, y que muchos de dichos transcritos surgen de las regiones intergénicas. El mecanismo por el que los ARNnc pueden regular la expresión génica es por apareamiento de bases con transcritos diana. Los ARN que funcionan por apareamiento de bases pueden agruparse en (1) ARN codificados en cis que están codificados en la misma ubicación genética, pero en la cadena opuesta a los ARN en los que actúan y, por lo tanto, muestran complementariedad perfecta con su diana, y (2) ARN codificados en trans que están codificados en una ubicación cromosómica distinta de los ARN en los que actúan y generalmente no presentan potencial de apareamiento de bases perfecto con sus dianas.

Sin desear ceñirse a ninguna teoría, la perturbación de un polinucleótido antisentido por los oligonucleótidos antisentido descritos en esta invención puede alterar la expresión de los ARN mensajeros sentido correspondientes. Sin embargo, esta regulación puede tanto ser discordante (la inactivación antisentido produce elevación de ARN mensajero) como concordante (la inactivación antisentido produce reducción concomitante de ARN mensajero). En estos casos, los oligonucleótidos antisentido pueden ser dirigidos a partes solapantes o no solapantes del transcrito antisentido que producen su inactivación o secuestro. El antisentido codificante, así como no codificante, puede ser dirigido de una manera idéntica y esa categoría es capaz de regular los transcritos sentido correspondientes - tanto de una manera concordante como discordante. Las estrategias que se emplean en identificar nuevos oligonucleótidos para su uso contra una diana pueden basarse en la inactivación de transcritos de ARN antisentido por oligonucleótidos antisentido o cualquier otro medio de modulación de la diana deseada.

Estrategia 1: En el caso de regulación discordante, la inactivación del transcrito antisentido eleva la expresión del gen convencional (sentido). Si el último gen debe codificar un fármaco diana conocido o supuesto, a continuación la inactivación de su homólogo antisentido podría imitar posiblemente la acción de un agonista receptor o una enzima estimulante.

Estrategia 2. En el caso de regulación concordante, podrían inactivarse de forma concomitante tanto los transcritos antisentido como sentido y así lograr una reducción sinérgica de la expresión génica (sentido) convencional. Si, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido se usa para lograr la inactivación, a continuación esta estrategia puede usarse para aplicar un oligonucleótido antisentido dirigido al transcrito sentido y otro oligonucleótido antisentido al transcrito antisentido correspondiente, o un único oligonucleótido antisentido energéticamente simétrico que se dirige simultáneamente a transcritos sentido y antisentido solapantes.

Según la presente divulgación, los compuestos antisentido incluyen oligonucleótidos antisentido, ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia de ARN (iARN) mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Por lo tanto, pueden ser ADN, ARN, similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una única cadena con autocomplementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleótidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de ácido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molécula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulación específica de la expresión génica por expresión estable de horquillas de dsARN en líneas celulares transgénicas, sin embargo, en algunos casos, la expresión o función génica está regulada positivamente. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una única cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla autocomplementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos en un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para realizar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden funcionar a través de mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (que incluyen oligonucleótidos) pueden describirse como «de tipo ADN» (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en lugar de bases U) o «de tipo ARN» (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilo o azúcares modificados en 2' y, en general, bases U en lugar de bases T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma p son "de tipo ADN" y aquellos que tienen estructura de tipo forma A son «de tipo ARN". En algunos aspectos (quiméricos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones de forma A como B.

En un aspecto, los oligonucleótidos o compuestos antisentido deseados comprenden al menos un ARN antisentido, ADN antisentido, oligonucleótidos antisentido quiméricos, oligonucleótidos antisentido que comprenden enlaces modificados, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia pequeño (siRNA); un microARN de interferencia (miARN); un ARN temporal pequeño (ARNtp); o un ARN de horquilla corta (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); ARN activantes pequeños (ARNap), o combinaciones de los mismos.

Los dsARN también pueden activar la expresión génica, un mecanismo que se ha llamado "activación génica inducida por ARN pequeño" o aARN. Los promotores génicos que se dirigen a dsARN inducen la potente activación transcripcional de genes asociados. El ARNa se demostró en células humanas usando dsARN sintéticos, llamados «ARN activantes pequeños» (ARNap).

Se ha descubierto que el ARN bicatenario pequeño (dsARN), como el ARN interferente pequeño (siRNA) y el microARN (miARN), son el desencadenante de un mecanismo conservado evolutivo conocido como interferencia del ARN (ARNi), el ARNi conduce invariablemente al silenciamiento del gen. Sin embargo, en los aspectos descritos en detalle en la sección de ejemplos a continuación, se muestra que los oligonucleótidos aumentan la expresión y/o función de los polinucleótidos de S1RT y productos codificados por los mismos. Los dsARN también pueden actuar como ARN activantes pequeños (ARNap). Sin desear quedar ligado por la teoría, direccionando secuencias a promotores génicos, los ARNap inducirán la expresión de genes diana en un fenómeno denominado activación transcripcional inducida por dsARN (ARNa).

En un aspecto adicional, los "segmentos diana" identificados en esta invención pueden emplearse en un cribado de compuestos adicionales que modulan la expresión de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT). "Moduladores" son aquellos compuestos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica para Sirtuina (SIRT) y que comprenden al menos una parte de 5 nucleótidos que es complementaria a un segmento diana. El procedimiento de cribado comprende las etapas de poner en contacto un segmento diana de una molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos sentido o antisentido naturales de una Sirtuina (SiRT) con uno o más moduladores candidatos, y seleccionar uno o más moduladores candidatos que disminuyen o aumentan la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polinucleótido de Sirtuina (SIRT), p. ej. SEQ ID NOS: 15 a 94. Una vez que se demuestra que el modulador o moduladores candidatos son capaces de modular (por ejemplo, disminuir o aumentar) la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifica un polinucleótido de Sirtuina (SIRT), el modulador puede emplearse en estudios de investigación adicionales de la función de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT), o para su uso como agente de investigación, diagnóstico o terapéutico según la presente divulgación.

Direccionar la secuencia antisentido natural modula la función del gen diana. Por ejemplo, la Sirtuina (SIRT) (por ejemplo, números de acceso NM_012238.3, NM_001159589, NM_012239, NM_016539), en un aspecto, la diana es un polinucleótido antisentido de la Sirtuina (SIRT). En un aspecto, un oligonucleótido antisentido apunta a secuencias sentido y/o antisentido naturales de un polinucleótido Sirtuina (SIRT) (por ejemplo, números de acceso NM_012238.3, NM_001159589, NM_012239, NM_016539), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias a los mismos. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido y las dianas incluyen regiones codificantes y no codificantes de polinucleótidos antisentido y/o sentido de Sirtuina (SIRT).

Los segmentos diana preferidos de la presente divulgación también pueden combinarse con sus compuestos antisentido complementarios respectivos de la presente divulgación para formar oligonucleótidos (duplexados) bicatenarios estabilizados.

Se ha demostrado en la técnica que dichos restos de oligonucleótido bicatenario modulan la expresión de la diana y regulan la traducción, además del procesamiento de ARN mediante un mecanismo antisentido. Además, los restos bicatenarios pueden someterse a modificación química. Por ejemplo, se ha demostrado que dichos restos bicatenarios inhiben la diana mediante la hibridación clásica de la cadena antisentido del dúplex a la diana, desencadenando de este modo la degradación enzimática de la diana.

En un aspecto, un oligonucleótido antisentido se dirige a polinucleótidos de Sirtuina (SIRT) (por ejemplo, números de acceso NM_012238.3, NM_001159589, NM_012239, NM_016539), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias de los mismos. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

Según los aspectos de la divulgación, la molécula de ácido nucleico diana no se limita a Sirtuina (SIRT) sola sino que se extiende a cualquiera de las isoformas, receptores, homólogos y similares de una molécula de Sirtuina (SIRT). En otro aspecto, un oligonucleótido se dirige a una secuencia antisentido natural de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT), por ejemplo, polinucleótidos establecidos como SEQ ID NO: 5 a 14, y cualquier variante, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos y secuencias complementarias al mismo. Ejemplos de oligonucleótidos antisentido se exponen como SEQ ID NOS: 15 a 94.

En un aspecto, los oligonucleótidos son complementarios o se unen a secuencias de ácido nucleico de una Sirtuina (SIRT) antisentido, que incluyen, sin limitación, secuencias con sentido y/o antisentido no codificantes asociadas con un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) y modulan la expresión y/o función de una Molécula de Sirtuina (SIRT).

En otro aspecto, los oligonucleótidos son complementarios o se unen a secuencias de ácido nucleico de una Sirtuina (SIRT) antisentido natural, establecida como SEQ ID NO: 5 a 14 y modulan la expresión y/o función de una molécula de Sirtuina (SIRT).

En un aspecto, los oligonucleótidos comprenden secuencias de al menos 5 nucleótidos consecutivos de SEQ ID NOS: 15 a 94 y modulan la expresión y/o función de una molécula de Sirtuina (SIRT).

Las dianas de polinucleótidos comprenden Sirtuina (SIRT), incluidos los miembros de la familia de los mismos, variantes de Sirtuina (SIRT); mutantes de una Sirtuina (SIRT), incluidos los SNP; secuencias no codificantes de una Sirtuina (SIRT); alelos de una Sirtuina (SIRT); variantes de especies, fragmentos y similares. Preferiblemente, el oligonucleótido es una molécula antisentido.

En otro aspecto, los polinucleótidos de Sirtuina (SIRT) dirigidos a oligonucleótidos comprenden: ARN antisentido, ARN de interferencia (ARNi), ARN de interferencia corto (siRNA); micro ARN interferente (miARN); un pequeño ARN temporal (stRNA); o un ARN en horquilla corto (ARNhc); activación génica inducida por ARN pequeño (ARNa); o ARN activador pequeño (saARN).

En otro aspecto, el direccionamiento de polinucleótidos de Sirtuina (SIRT), p. ej. SEQ ID NO: 5 a 14, modula la expresión o función de estas dianas. En un aspecto, la expresión o función está regulada positivamente en comparación con un control. En otro aspecto, la expresión o función está regulada negativamente en comparación con un control.

En otro aspecto, los compuestos antisentido comprenden secuencias expuestas como las SEQ ID NOS: 15 a 94. Estos oligonucleótidos pueden comprender uno o más nucleótidos modificados, fragmentos más cortos o más largos, enlaces modificados y similares.

En otro aspecto, las SEQ ID NOS: 15 a 94 comprenden uno o más naspectoucleótidos de ABN.

La modulación de un ácido nucleico diana deseado puede realizarse de varias maneras conocidas en la técnica, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, siRNA, etc. Las moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos (por ejemplo, ribozimas) son moléculas de ácidos nucleicos capaces de catalizar una o más de diversas reacciones, que incluyen la capacidad para escindir repetidamente otras moléculas de ácidos nucleicos separadas en un modo específico de secuencia de bases de nucleótidos. Dichas moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos pueden usarse, por ejemplo, para dirigirse prácticamente a cualquier transcrito de ARN.

Debido a su especificidad de secuencia, las moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos que se escinden en trans son una promesa como agentes terapéuticos para enfermedades humanas. Las moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos pueden diseñarse para escindir dianas de ARN específicas dentro del fondo del ARN celular. Un evento de escisión de este tipo convierte al ARNm en no funcional y anula la expresión de proteínas de ese ARN. De este modo puede inhibirse selectivamente la síntesis de una proteína asociada a una patología.

En general, los ácidos nucleicos enzimáticos con actividad de escisión de ARN actúan uniéndose primero a un ARN diana. Dicha unión se produce mediante la parte de unión de diana de un ácido nucleico enzimático que se mantiene en estrecha proximidad a una parte enzimática de la molécula que actúa para escindir el ARN diana. De este modo, el ácido nucleico enzimático se reconoce primero y a continuación se une a ARN diana mediante apareamiento de bases complementario, y una vez se une al sitio correcto, actúa enzimáticamente para cortar el ARN diana. La escisión estratégica de dicho ARN diana destruirá su capacidad para dirigir la síntesis de una proteína codificada. Después de unirse un ácido nucleico enzimático y escindir su ARN diana, se libera de ese ARN para buscar otra diana y puede unirse repetidamente y escindir nuevas dianas.

Se han usado varias estrategias, tales como estrategias de selección in vitro (evolución) para desarrollar nuevos catalizadores de ácido nucleico capaces de catalizar diversas reacciones, tales como escisión y ligamiento de enlaces fosfodiéster y enlaces amida.

El desarrollo de ribozimas que son óptimas para la actividad catalítica contribuiría significativamente a cualquier estrategia que empleara ribozimas que escinden ARN con el fin de regular la expresión génica. La ribozima de cabeza de martillo, por ejemplo, funciona con una velocidad catalítica (kcat) de aproximadamente 1 min-1 en presencia de concentraciones saturantes (10 mM) de cofactor de Mg2+. Se ha demostrado que una ribozima de «ligasa de ARN» artificial cataliza la reacción de auto-modificación correspondiente con una velocidad de aproximadamente 100 min-1. Además, se sabe que ciertas ribozimas de cabeza de martillo modificadas que tienen brazos de unión al sustrato hechos de ADN catalizan la escisión de ARN con múltiples velocidades de recuperación que se aproximan a 100 min-1. Finalmente, la sustitución de un resto específico dentro del núcleo catalítico de la cabeza de martillo con ciertos análogos de nucleótido produce ribozimas modificadas que muestran una mejora de hasta 10 veces en la velocidad catalítica. Estos descubrimientos demuestran que las ribozimas pueden promover transformaciones químicas con velocidades catalíticas que son significativamente superiores a aquellas mostradas in vitro por la mayoría de las ribozimas que se auto-escinden naturales. Entonces es posible que las estructuras de ciertas ribozimas que se autoescinden puedan optimizarse para dar la máxima actividad catalítica, o que puedan prepararse motivos de ARN completamente nuevos que muestran velocidades significativamente más rápidas para la escisión de fosfodiéster de ARN.

La escisión intermolecular de un sustrato de ARN por un catalizador de ARN que se ajusta al modelo de "cabeza de martillo" se mostró por primera vez en 1987. Se recuperó el catalizador de ARN y se hizo reaccionar con múltiples moléculas de ARN, demostrando que era verdaderamente catalítico.

Se han usado ARN catalíticos diseñados basándose en el motivo de "cabeza de martillo" para escindir secuencias diana específicas haciendo cambios de base apropiados en el ARN catalítico para mantener apareamiento de bases necesarios con las secuencias diana. Esto ha permitido el uso del ARN catalítico para escindir secuencias diana específicas e indica que los ARN catalíticos diseñados según el modelo de "cabeza de martillo" pueden escindir posiblemente ARN de sustrato específico in vivo.

La interferencia de ARN (iARN) se ha convertido en una poderosa herramienta para modular la expresión génica en mamíferos y células de mamífero. Esta estrategia requiere la administración de ARN interferente pequeño (siRNA) bien como el propio ARN o bien como ADN, usando un plásmido de expresión o virus y la secuencia codificante para ARN de horquilla pequeño que se procesa a siRNA. Este sistema permite el eficaz transporte de los pre-siRNA al citoplasma en el que son activos y permiten el uso de promotores regulados y específicos de tejido para la expresión génica.

En un aspecto, un oligonucleótido o compuesto antisentido comprende un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (ADN), o un mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleótidos de origen natural, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (esqueleto), además de oligonucleótidos que tienen partes no de origen natural que funcionan similarmente. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son frecuentemente deseados con respecto a formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por un ácido nucleico diana y elevada estabilidad en presencia de nucleasas.

De acuerdo con la presente divulgación, los oligonucleótidos o "compuestos antisentido" incluyen oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, ARN, ADN, mimético, quimera, análogo u homólogo de los mismos), ribozimas, oligonucleótidos de secuencia de guía externa (EGS), compuestos de siRNA, compuestos de interferencia (iARN) de ARN mono- o bicatenario tales como compuestos de siRNA, ARNap, aARN, y otros compuestos oligoméricos que hibridan con al menos una parte del ácido nucleico diana y modulan su función. Por lo tanto, pueden ser ADN, ^a Rⁿ , similares a ADN, similares a ARN, o mezclas de los mismos, o pueden ser miméticos de uno o más de estos. Estos compuestos pueden ser compuestos oligoméricos monocatenarios, bicatenarios, circulares o de horquilla y pueden contener elementos estructurales tales como protuberancias internas o terminales, desapareamientos o bucles. Los compuestos antisentido se preparan de forma rutinaria linealmente, pero pueden unirse o prepararse de otro modo para ser circulares y/o ramificados. Los compuestos antisentido pueden comprender construcciones tales como, por ejemplo, dos cadenas hibridadas para formar un compuesto completa o parcialmente bicatenario o una única cadena con auto-complementariedad suficiente para permitir la hibridación y formación de un compuesto completa o parcialmente bicatenario. Las dos cadenas pueden enlazarse internamente, dejando los extremos 3' o 5' libres o pueden enlazarse para formar una estructura de horquilla continua o bucle. La estructura de horquilla puede contener un nucleótido protuberante en cualquiera de los extremos 5' o 3' que produce una extensión del carácter monocatenario. Los compuestos bicatenarios opcionalmente pueden comprender nucleótidos protuberantes en los extremos. Modificaciones adicionales pueden incluir grupos conjugados unidos a uno de los extremos, posiciones de nucleótido seleccionadas, posiciones de azúcar o a uno de los enlaces internucleosídicos. Como alternativa, las dos cadenas pueden enlazarse mediante un resto no de ácido nucleico o grupo conector. Cuando se forma a partir de solo una cadena, el dsARN puede tomar la forma de una molécula tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex. De este modo, el dsARN puede ser completa o parcialmente bicatenario. Puede lograrse modulación específica de la expresión génica por expresión estable de horquillas de dsARN en líneas celulares transgénicas. Cuando se forma a partir de dos cadenas, o una única cadena que adopta la forma de una molécula de tipo horquilla auto-complementaria que se dobla sobre sí misma para formar un dúplex, las dos cadenas (o regiones formadoras de dúplex de una sola cadena) son cadenas de ARN complementarias que se aparean con bases en el modo de Watson-Crick.

Una vez introducidos a un sistema, los compuestos de la divulgación pueden provocar la acción de una o más enzimas o proteínas estructurales para efectuar la escisión u otra modificación del ácido nucleico diana o pueden trabajar mediante mecanismos basados en la ocupación. En general, los ácidos nucleicos (incluyendo oligonucleótidos) pueden describirse como "de tipo ADN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-desoxiazúcares y, generalmente, bases T en vez de U) o "de tipo ARN" (es decir, que generalmente tienen uno o más 2'-hidroxilo o azúcares modificados en 2' y, generalmente bases U en vez de T). Las hélices de ácido nucleico pueden adoptar más de un tipo de estructura, más comúnmente las formas A y B. Se cree que, en general, los oligonucleótidos que tienen estructura similar a la forma B son "similares a ADN" y aquellos que tienen estructura similar a la forma A son "similares a ARN". En algunos aspectos (quiméricos), un compuesto antisentido puede contener tanto regiones de forma A como B.

Los compuestos antisentido según esta divulgación pueden comprender una parte antisentido de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleótidos (es decir, de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 nucleósidos enlazados) de longitud. Esto se refiere a la longitud de la cadena antisentido o parte del compuesto antisentido. En otras palabras, un compuesto antisentido monocatenario de la divulgación comprende de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos, y un compuesto antisentido bicatenario de la divulgación (tal como un dsARN, por ejemplo) comprende una cadena sentido y antisentido o parte de 5 a aproximadamente 80 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que éste comprenda partes antisentido de 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio.

En un aspecto, los compuestos antisentido de la divulgación tienen partes antisentido de 10 a 50 nucleótidos de longitud. Un experto habitual en la materia apreciará que éstos integran oligonucleótidos que tienen partes antisentido de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio. En algunos aspectos, los oligonucleótidos tienen 15 nucleótidos de longitud.

En un aspecto, los compuestos antisentido o de oligonucleótido de la divulgación tienen partes antisentido de 12 o 13 a 30 nucleótidos de longitud. Un experto en la técnica apreciará que estos integran compuestos antisentido que tienen partes antisentido de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud, o cualquier intervalo intermedio.

En un aspecto, los compuestos oligoméricos de la presente divulgación también incluyen variantes en las que una base diferente está presente en una o más de las posiciones de nucleótido en el compuesto. Por ejemplo, si el primer nucleótido es una adenosina, pueden producirse variantes que contienen timidina, guanosina o citidina en esta posición. Esto puede hacerse en cualquiera de las posiciones de los compuestos antisentido o de dsARN. Estos compuestos se ensayan a continuación usando los procedimientos descritos en esta invención para determinar su capacidad para inhibir la expresión de un ácido nucleico diana.

En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad, entre el compuesto antisentido y la diana, es de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 60 %. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 60% a aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 70% a aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 80% a aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la homología, identidad de secuencias o complementariedad es de aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 92 %, aproximadamente el 94 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %.

En otro aspecto, los oligonucleótidos antisentido, como por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico expuestas en SEQ ID NOS: 4 a 29 comprenden una o más sustituciones o modificaciones. En un aspecto, los nucleótidos están sustituidos por ácidos nucleicos bloqueados (ANB).

En otro aspecto, los oligonucleótidos se dirigen a una o más regiones de las moléculas de ácido nucleico sentido y/o antisentido de secuencias codificantes y/o no codificantes asociadas con Sirtain (SIRT) y las secuencias indicadas como SEQ ID NOS: 1 a 14. Los oligonucleótidos también se dirigen a regiones solapantes de las SEQ ID NO: 1 a 14.

Ciertos oligonucleótidos de esta divulgación son oligonucleótidos quiméricos. «Oligonucleótidos quiméricos» o «quimeras», en el contexto de esta divulgación, son oligonucleótidos que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una constituida por al menos un nucleótido. Estos oligonucleótidos normalmente contienen al menos una región de nucleótidos modificados que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasas incrementada, captación en células incrementada, afinidad de unión por la diana incrementada) y una región que es un sustrato para enzimas capaces de escindir híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la ARNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de RNasa H, por lo tanto, produce la escisión del ARN diana, potenciando así enormemente la eficiencia de la modulación antisentido de la expresión génica. Por consiguiente, frecuentemente pueden obtenerse resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fosforotioato que hibridan con la misma región diana. La escisión de la diana de ARN puede ser detectada de manera rutinaria mediante electroforesis y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas conocidas en la técnica. En un aspecto, un oligonucleótido quimérico comprende al menos una región modificada para aumentar la afinidad de unión de la diana, y, normalmente, una región que actúa como sustrato para RNasa H. La afinidad de un oligonucleótido por su diana (en este caso, un ácido nucleico que codifica ras) se determina rutinariamente midiendo la Tm de un par de oligonucleótido/diana, que es la temperatura a la que se disocian el oligonucleótido y la diana; la disociación se detecta por espectrofotometría. Cuanto mayor sea la Tm, mayor será la afinidad del oligonucleótido por la diana.

Se pueden formar compuestos antisentido quiméricos de la divulgación como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos, tal como se ha descrito anteriormente. Como tales, estos compuestos también se han referido en la técnica como híbridos o gapmeros. Las patentes representativas de EE.UU. que muestran la preparación de tales estructura híbridas comprenden, pero no se limitan a, Patentes EE. UU. Nos. 5.013.830; 5.149.797; 5.220.007; 5.256.775; 5.366.878; 5.403.711; 5.491.133; 5.565.350; 5.623.065; 5.652.355; 5.652.356; y 5.700.922.

En un aspecto, la región del oligonucleótido que se modifica comprende al menos un nucleótido modificado en la posición 2' del azúcar, de la forma más preferiblemente un nucleótido modificado con 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo o 2'-fluoro. En otro aspecto, las modificaciones de ARN incluyen modificaciones de 2'-flúor, 2'-amino y 2'-O-metilo en la ribosa de pirimidinas, residuos abásicos o una base invertida en el extremo 3' del ARN. Dichas modificaciones se incorporan rutinariamente en oligonucleótidos y se ha demostrado que estos oligonucleótidos tienen una mayor Tm (es decir, mayor afinidad de unión a diana) que los 2'-desoxioligonucleótidos contra una diana dada. El efecto de tal afinidad incrementada es potenciar enormemente la inhibición por oligonucleótidos de ARNi de la expresión génica. La RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de los dúplex de ARN:ADN: por lo tanto, la activación de esta enzima produce la escisión del ARN diana, y de este modo puede potenciar enormemente la eficiencia de inhibición de ARNi. La escisión del ARN diana puede demostrarse rutinariamente por electroforesis en gel. En otro aspecto, el oligonucleótido quimérico también se modifica para potenciar la resistencia a nucleasas. Las células contienen diversas exo- y endo-nucleasas que pueden degradar ácidos nucleicos. Se ha demostrado que varias modificaciones de nucleótidos y nucleósidos hacen que el oligonucleótido en el que se incorporan sea más resistente a la digestión por nucleasa que el oligodesoxinucleótido nativo. La resistencia a nucleasas se mide rutinariamente incubando oligonucleótidos con extractos celulares o soluciones de nucleasa aisladas y midiendo el grado de oligonucleótido intacto que queda con el tiempo, normalmente por electroforesis en gel. Los oligonucleótidos que se han modificado para potenciar su resistencia a nucleasas sobreviven intactos durante más tiempo que los oligonucleótidos sin modificar. Se ha demostrado que diversas modificaciones de oligonucleótidos potencian o confieren resistencia a nucleasas. Los oligonucleótidos que contienen al menos una modificación de fosforotioato son actualmente más preferidos. En algunos casos, las modificaciones de oligonucleótidos que potencian la afinidad de unión a diana son, también, independientemente, capaces de potenciar la resistencia a nucleasas. Algunas modificaciones deseables pueden encontrarse en De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374.

Ejemplos específicos de algunos oligonucleótidos preferidos concebidos por esta divulgación incluyen aquellos que comprenden esqueletos modificados, por ejemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, metilfosfonatos, enlaces entre azúcares de alquilo o cicloalquilo de cadena corta o enlaces entre azúcares heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Los más preferidos son oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y aquellos con esqueletos de heteroátomo, particularmente esqueletos de CH2-NH-O--CH2, CH,-N(CH3)--O--CH2 [conocido como esqueleto de metilen(metilimino) o MMI], CH2 --O--N (CH3)--CH2, CH2 -N (CH3)--N (CH3)--CH2 y O--N (CH3)--CH2 --CH2, donde el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como O--P--O-CH). Los esqueletos de amida divulgados por De Mesmaeker y col. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374 también son preferidos. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructi=uras de esqueleto de morfolino (Suramerton y Weller, Pat. EE. UU. No. 5.034.506). En otro aspecto, tal como la cadena principal de ácido nucleico peptídico (ANP), la cadena principal de fosfodiéster del oligonucleótido se sustituye por una cadena principal de poliamida, estando los nucleótidos unidos directamente o indirectamente a los átomos de nitrógeno aza de la cadena principal de poliamida. Los oligonucleótidos también pueden comprender uno o más restos de azúcar sustituidos. Los oligonucleótidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O (CH2) n CH3, O (CH2) n NH2 u O (CH2) n CH3 donde n es de 1 a aproximadamente 10; alquilo inferior C1 a C10, alcoxialcoxi, alquilo inferior sustituido, alcarilo o aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O-, S- o N-alquilo; O--, S--, o N-alquenilo; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3: NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN: un grupo indicador; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido; o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación incluye 2'-metoxietoxi [2'-O-CH2 CH2 OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo)]. Otras modificaciones incluyen 2'-metoxi (2'-O--CH3), 2'-propoxi(2'-OCH2 CH2CH3) y 2'-flúoro(2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones sobre el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como ciclobutilos en lugar del grupo pentofuranosilo.

Los oligonucleótidos también pueden comprender, adicionalmente o como alternativa, modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente "base"). Tal como se usa en esta invención, nucleótidos "no modificados" o "naturales" incluyen adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados incluyen nucleótidos encontrados solo poco frecuentemente o transitoriamente en ácidos nucleicos naturales, p. ej., hipoxantina, 6-metiladenina, 5-Me-pirimidinas, particularmente 5-metilcitosina (también denominada 5-metil-2'-desoxicitosina y frecuentemente denominada en la técnica 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosil HMC y gentobiosil HMC, además de nucleótidos sintéticos, p. ej., 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2-(imidazolilalquil)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina u otras alquiladeninas heterosustituidas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5-bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, p-azaguanina, 7-deazaguanina, N6 (6-aminohexil)adenina y 2,6-diaminopurina. Puede incluirse una base "universal" conocida en la técnica, por ejemplo, inosina. Se ha demostrado que las sustituciones de 5-Me-C aumentan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico en 0,6-1,2°C. (Sanghvi, Y. S., en Crooke, S. T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son sustituciones de bases.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que potencian la actividad o captación celular del oligonucleótido. Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lípido tales como un resto de colesterol, un resto de colesterilo, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético. Los oligonucleótidos que comprenden restos lipófilos, y procedimientos para preparar dichos oligonucleótidos, son conocidos en la técnica, por ejemplo, Pat. EE. UU. Nos.

5.138.045,5.218.105 y 5.459.255.

No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido dado estén uniformemente modificadas, y de hecho más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente puede incorporarse en un único oligonucleótido o incluso dentro de un único nucleósido dentro de un oligonucleótido. La presente divulgación también incluye oligonucleótidos que son oligonucleótidos quiméricos, tal como se ha definido anteriormente en esta invención. En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico de la presente divulgación está conjugada con otro resto que incluye, aunque no se limita a, nucleótidos abásicos, poliéter, poliamina, poliamidas, péptidos, hidratos de carbono, lípido, o compuestos de polihidrocarburos. Los expertos en la técnica reconocerán que estas moléculas pueden enlazarse a uno o más de cualquiera de los nucleótidos que comprenden la molécula de ácido nucleico en varias posiciones en el azúcar, base o grupo fosfato.

Los oligonucleótidos usados según esta divulgación pueden prepararse cómoda y rutinariamente mediante la técnica muy conocida de síntesis en fase sólida. Los equipos para dicha síntesis son comercializados por varios proveedores que incluyen Applied Biosystems. También puede emplearse cualquier otro medio para dicha síntesis; la síntesis real de los oligonucleótidos está perfectamente dentro de las aptitudes de un experto en la materia. También es muy conocido usar técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos tales como fosforotioatos y derivados alquilados. También es muy conocido usar técnicas similares y amiditos modificados disponibles en el mercado y productos de vidrio de poro controlado (CPG) tales como biotina, fluoresceína, acridina o amiditos modificados con psoraleno y/o CPG (disponible gracias a Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleótidos marcados de forma fluorescente, biotinilados u otros oligonucleótidos modificados tales como oligonucleótidos modificados con colesterol. Según la divulgación, el uso de modificaciones tales como el uso de monómeros de ANB para mejorar la potencia, especificidad y duración de la acción y ampliar las vías de administración de oligonucleótidos comprende químicas actuales tales como MOE, ANA, FANA, ^pS, etc. Esto puede lograrse al sustituir alguno de los monómeros en los oligonucleótidos actuales por monómeros de ANB. Los oligonucleótidos modificados con ANB pueden tener un tamaño similar al compuesto parental o puede ser más grandes o preferiblemente más pequeños. Se prefiere que dichos oligonucleótidos modificados con ANB contengan menos de aproximadamente el 70%, más preferiblemente menos de aproximadamente el 60%, de la manera más preferente menos de aproximadamente el 50% de monómeros de ANB y que sus tamaños estén entre aproximadamente 5 y 25 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 12 y 20 nucleótidos.

Esqueletos de oligonucleótidos modificados preferidos comprenden, aunque no se limitan a, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, metil y otros alquil fosfonatos que comprenden 3'-alquilenfosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que comprenden 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados en 2'-5' de estos, y aquellos que tienen polaridad invertida, donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos están enlazados 3'-5' a 5'-3' o 2'-5' a 5'-2'. También están incluidas diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de los enlaces que contienen fósforo anteriores comprenden, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 3.687.808; 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.

177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.

233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050. Los esqueletos de oligonucleótido modificados preferidos que no incluyen un átomo de fósforo en ellos tienen esqueletos que se forman por enlaces internucleosídicos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleosídicos de heteroátomo y alquilo o cicloalquilo mixtos, o uno o más enlaces internucleosídicos heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos comprenden aquellos que tienen enlaces morfolino (formados en parte a partir de la parte de azúcar de un nucleósido); cadenas principales de siloxano; cadenas principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; cadenas principales de formacetilo y tioformacetilo; cadenas principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; cadenas principales que contienen alquenos; cadenas principales de sulfamato; cadenas principales de metilenimino y metilenhidrazino; cadenas principales de sulfonato y sulfonamida; cadenas principales de amida; y otras que tienen partes de componentes de N, O, S y CH2 mixtos.

Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores comprenden, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444: 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264. 562; 5. 264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596. 086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

En otros miméticos de oligonucleótidos preferidos, tanto el azúcar como el enlace intemucleosídico, es decir, el esqueleto, de los conjuntos de nucleótidos se sustituyen por grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para la hibridación con un compuesto de ácido nucleico diana apropiado. Dicho compuesto oligomérico, un mimético de oligonucleótido que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, se denomina ácido nucleico peptídico (ANP). En compuestos de ANP, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido se sustituye por una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y se unen directamente o indirectamente a átomos de nitrógeno azo de la parte de amida del esqueleto. Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de compuestos de ANP comprenden, aunque no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262.

Enseñanzas adicionales de compuestos de ANP pueden encontrarse en Nielsen, y col. (1991) Science 254, 1497­ 1500.

En un aspecto de la divulgación, los oligonucleótidos con esqueletos de fosforotioato y oligonucleósidos con esqueletos de heteroátomo, y en particular -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-, conocidos como un esqueleto de metileno (metilimino) o MMI, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3)CH2- y -O-N(CH3)-CH2- CH2- donde el esqueleto de fosfodiéster nativo se representa como -O-P-O-CH2- de la Pat. EE. UU. No. 5.489.677, citada anteriormente, y los esqueletos de amida de la Pat. EE. UU. No. 5.602.240Citadacitada anteriormente. También se prefieren oligonucleótidos que tienen estructuras de esqueleto de morfolino de la Pat. EE. UU. No 5.034.506citada anteriormente.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos. los oligonucleótidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S-o N-alquinilo; u O alquil-O-alquilo, donde el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C a CO sustituido o no sustituido o alquenilo y alquinilo C2 a CO. Se prefieren particularmente O (CH2)n OmCH3, O(CH2)n,OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, y O(CH2nON(CH2)nCH3)2 en las que n y m pueden ser de 1 a aproximadamente 10. Otros oligonucleótidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': C a CO, (alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, alcaril aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, o Cf3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcaril aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo indicador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas de un oligonucleótido o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un oligonucleótido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. Una modificación comprende 2'-metoxietoxi (2'-O-CH2CH2OCH3, también conocido como 2'-O-(2-metoxietilo) o 2'-MOE) es decir, un grupo alcoxialcoxi. Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-dimetilaminooxietoxi, es decir, un grupo O(CH2)2ON(CH3)2, también conocido como 2-DMAOE, tal como se describe en los ejemplos en esta invención más adelante, y 2'-dimetilaminoetoxietoxi (también conocido en la técnica como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo o 2'-DMAEOE), es decir, 2-O-CH2-O-CH2-N(CH2)2.

Otras modificaciones preferidas comprenden 2'-metoxi (2'-OCH3), 2'-aminopropoxi (2'-OCH2CH2CH2NH2) y 2'-fluoro (2'-F). También pueden hacerse modificaciones similares en otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido del extremo 3' o en oligonucleótidos enlazados 2'-5' y la posición 5' del nucleótido del extremo 5'. Los oligonucleótidos también pueden tener miméticos de azúcar tales como restos ciclobutilo en lugar del azúcar pentofuranosilo. Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de dichas estructuras de azúcar modificadas comprenden, pero sin limitación, Pat. EE. UU. Nos.4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514. 785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.658.873; 5.670.633; y 5.700.920 .

Los oligonucleótidos también pueden comprender modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente denominadas en la técnica simplemente "base"). Tal como se usa en esta invención, nucleótidos "no modificados" o "naturales" comprenden las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Los nucleótidos modificados comprenden otros nucleótidos sintéticos y naturales tales como 5-metilcitosina (5-me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, derivados de 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, derivados de 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propiniluracilo y citosina, 6-azouracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halógeno, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas sustituidas en 8, 5-halógeno, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas sustituidos en 5, 7-metilquanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.

Además, los nucleótidos comprenden los divulgados en Pat. EE. UU. No. 3.687,808, los divulgados en 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pags. 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, aquellos divulgados en Englisch y col., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, pag. 613, y aquellos divulgados por Sanghvi, Y.S., Cap. 15, 'Antisense Research and Applications', pags. 289-302, Crooke, S.T. y Lebleu, B. ca., CRC Press, 1993. Algunos de estos nucleótidos son particularmente útiles para incrementar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la divulgación. Estos comprenden pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas sustituidas en N-2, N-6 y 0-6, que comprenden 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Se ha mostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina incrementan la estabilidad del dúplex de ácido nucleico alrededor de 0,6-1,2°C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) y actualmente son las sustituciones base preferidas, de manera aún más particular cuando se combinan con modificaciones de azúcar de 2'-Ometoxietilo.

Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de las nucleobases modificadas indicadas anteriormente, así como otras nucleobases modificadas, comprenden, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 3.687.808. así como 4.845.205; 5.130.302; 5.134.066; 5.175.273; 5.367.066; 5.432.272; 5.457.187; 5.459.255; 5.484.908; 5.502.177; 5.525.711; 5.552.540; 5.587.469; 5.596.091; 5.614.617; 5.750.692; y 5.681.941.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica unir químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados, que mejoran la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido.

Dichos restos comprenden, aunque no se limitan a, restos de lípido tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol.

Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados oligonucleotídicos comprenden, pero sin limitación, Pat. EE. UU. Nos.4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552. 538; 5.578.717.5.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.045; 5.414.077; 5.486. 603; 5.512.439; 5.578.718; 5.608.046; 4.587.044; 4.605.735; 4.667.025; 4.762.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5. 245.022; 5.254.469; 5.258.506; 5.262.536; 5.272.250; 5.292.873. 5.317.098; 5.317.241. 5.391.723; 5.416.203. 5.451.463; 5.510.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.552; 5.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923; 5.599.928 y 5.688.941.

Descubrimiento de fármacos: Los compuestos de la presente divulgación también pueden aplicarse en las áreas del descubrimiento de fármacos y validación de dianas. La presente divulgación comprende el uso de los compuestos y segmentos diana identificados en este documento en los esfuerzos de descubrimiento de fármacos para dilucidar las relaciones que existen entre un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) y un estado, fenotipo o afección de la enfermedad. Estos procedimientos incluyen detectar o modular un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) que comprende poner en contacto una muestra, tejido, célula u organismo con los compuestos de la presente divulgación, medir el nivel de ácido nucleico o proteína de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) y/o un resultado fenotípico o químico relacionado en algún momento después del tratamiento y, opcionalmente, comparar el valor medido con una muestra no tratada o una muestra tratada con un compuesto adicional de la divulgación. Estos procedimientos también pueden realizarse en paralelo o en combinación con otros experimentos para determinar la función de genes desconocidos para el procedimiento de validación de dianas o para determinar la validez de un producto génico particular como diana para el tratamiento o prevención de una enfermedad, afección o fenotipo particular.

Evaluación de la regulación positiva o inhibición de la expresión génica:

La transferencia de un ácido nucleico exógeno a una célula u organismo huésped puede evaluarse detectando directamente la presencia del ácido nucleico en la célula u organismo. Tal detección se puede lograr mediante varios métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la presencia del ácido nucleico exógeno puede detectarse mediante Southern blot o mediante una técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando cebadores que amplifican específicamente las secuencias de nucleótidos asociadas con el ácido nucleico. La expresión de los ácidos nucleicos exógenos también puede medirse usando procedimientos convencionales que incluyen análisis de expresión génica. Por ejemplo, el ARNm producido a partir de un ácido nucleico exógeno puede detectarse y cuantificarse usando un Northern blot y PCR con transcripción inversa (RT-PCR).

La expresión de ARN del ácido nucleico exógeno también puede detectarse midiendo una actividad enzimática o una actividad de proteína reportera. Por ejemplo, puede medirse la actividad moduladora antisentido indirectamente como una disminución o aumento en la expresión de ácido nucleico diana como una indicación de que el ácido nucleico exógeno está produciendo el ARN efector. Basándose en conservación de secuencias, pueden diseñarse cebadores y usarse para amplificar regiones codificantes de los genes diana. Inicialmente, la región codificante más altamente expresada de cada gen puede usarse para construir un gen de control modelo, aunque puede usarse cualquier región codificante o no codificante. Cada gen de control se ensambla insertando cada región de codificación entre una región de codificación informadora y su señal poli(A). Estos plásmidos producirían un ARNm con un gen reportero en la parte aguas arriba del gen y una potencial diana de ARNi en la región no codificante 3'. La eficacia de oligonucleótidos antisentido individuales se ensayaría por modulación del gen indicador. Genes reporteros útiles en los procedimientos de la presente divulgación incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta-galactosidasa (LacZ), beta-glucuronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), proteína roja fluorescente (RFP), proteína amarilla fluorescente (YFP), proteína cian fluorescente (CFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS), y derivados de los mismos. Están disponibles múltiples marcadores de selección que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Los procedimientos de determinación de la modulación de un gen reportero son muy conocidos en la técnica, e incluyen, aunque no se limitan a, procedimientos fluorimétricos (por ejemplo, espectroscopía de fluorescencia, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), microscopía de fluorescencia), determinación de la resistencia a antibióticos.

Las proteínas SIRT1, SIRT3 y SIRT6 y la expresión de ARNm pueden ensayarse usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica y descritos en otra parte en esta invención. Por ejemplo, pueden usarse inmunoensayos como ELISA para medir los niveles de proteínas. Los anticuerpos de sirtuina (SIRT) para ELISA están disponibles comercialmente, por ejemplo, en R&D Systems (Minneapolis, MN), Abcam, Cambridge, MA.

En aspectos, la expresión de SIRT1, SIRT3 y SIRT6 (por ejemplo, ARNm o proteína) en una muestra (por ejemplo, células o tejidos in vivo o in vitro) tratada usando un oligonucleótido antisentido de la divulgación se evalúa en comparación con la expresión de Sirtuina (SIRT) una muestra de control. Por ejemplo, la expresión de la proteína o ácido nucleico puede compararse usando procedimientos conocidos para los expertos en la materia con aquella en una muestra tratada con vector simulado o sin tratar. De forma alternativa, puede hacerse una comparación con una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido control (p. ej., uno que tenga una secuencia modificada o diferente) dependiendo de la información deseada. En otro aspecto, una diferencia en la expresión de la proteína SIRT o su ácido nucleico en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar puede compararse con la diferencia en la expresión de un ácido nucleico diferente (incluyendo cualquier estándar que el investigador considere apropiado, p. ej. un gen de mantenimiento) en una muestra tratada frente a una muestra sin tratar.

Las diferencias observadas pueden expresarse según se desee, por ejemplo, en forma de una relación o fracción, para su uso en una comparación con control. En casos, el nivel de ARNm o proteína de Sirtuina (SIRT), en una muestra tratada con un oligonucleótido antisentido de la presente divulgación, aumenta o disminuye en aproximadamente 1,25 veces hasta aproximadamente 10 veces o más en relación con una muestra no tratada o una muestra tratada con un ácido nucleico de control. En aspectos, el nivel de ARNm o proteína de Sirtuina (SIRT) aumenta o disminuye al menos aproximadamente 1,25 veces, al menos aproximadamente 1,3 veces, al menos aproximadamente 1,4 veces, al menos aproximadamente 1,5 veces, al menos aproximadamente 1,6 veces, al menos aproximadamente 1,7 veces, al menos aproximadamente 1,8 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 2,5 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 3,5 veces, al menos aproximadamente 4 - al menos aproximadamente 4,5 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 5,5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 6,5 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 7,5 - veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 8,5 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 9,5 veces, o al menos aproximadamente 10 veces o más.

Kits, reactivos de investigación, diagnósticos y terapéuticos

Los compuestos de la presente divulgación pueden utilizarse para diagnóstico, agentes terapéuticos y profilaxis, y como reactivos de investigación y componentes de kits. Además, los oligonucleótidos antisentido, que son capaces de inhibir la expresión génica con exquisita especificidad, son usados frecuentemente por los expertos en la técnica para aclarar la función de genes particulares o para distinguir entre funciones de diversos miembros de una vía biológica.

Para su uso en kits y diagnósticos y en diversos sistemas biológicos, los compuestos de la presente divulgación, tanto solos como en combinación con otros compuestos o terapéuticos, son útiles como herramientas en análisis diferenciales y/o combinatorios para aclarar patrones de expresión de una parte o de todo el complemento de genes expresados dentro de células y tejidos.

Como se usa en esta invención, el término "sistema biológico" o "sistema" se define como cualquier organismo, célula, cultivo celular o tejido que expresa, o se hace competente para expresar productos de la Sirtuina (SIRT). Estos incluyen, aunque no se limitan a, seres humanos, animales transgénicos, células, cultivos celulares, tejidos, xenoinjertos, trasplantes y combinaciones de los mismos.

Como ejemplo no limitante, patrones de expresión dentro de células o tejidos tratados con uno o más compuestos antisentido se comparan con células o tejidos de control no tratados con compuestos antisentido y los patrones producidos se analizan para niveles diferenciales de expresión génica, ya que están relacionados, por ejemplo, con asociación de enfermedad, vía de señalización, localización celular, nivel de expresión, tamaño, estructura o función de los genes examinados. Estos análisis pueden realizarse en células estimuladas o sin estimular y en presencia o ausencia de otros compuestos que afectan los patrones de expresión.

Los ejemplos de procedimientos de análisis de la expresión génica conocidos en la técnica incluyen matrices o micromatrices de ADN, (Brazma y Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, y col., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16), SAGE (análisis en serie de expresión génica) (Madden, y col., (2000) Drug Discov. Today, 5, 415- 425), READS (amplificación con enzimas de restricción de los ADNc digeridos) (Prashar y Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 258-72), TOGA (análisis de expresión génica total) (Sutcliffe, y col., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 1976­ 81), matrices de proteínas y proteómica (Celis, y col., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16; Jungblut, y col., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), secuenciación de la etiqueta de secuencia expresada (EST) (Celis, y col., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, y col., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), huellas de A^r N sustractivas (SuRF) (Fuchs, y col., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, y col., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonación sustractiva, visualización diferencial (DD) (Jurecic y Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridación genómica comparativa (Carulli, y col., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31, 286-96), técnicas de FISH (hibridación in situ fluorescente) (Going y Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) y procedimientos de espectrometría de masas (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).

Los compuestos de la divulgación son útiles para la investigación y el diagnóstico, porque estos compuestos hibridan con ácidos nucleicos que codifican una Sirtuina (SIRT). Por ejemplo, los oligonucleótidos que se hibridan con tal eficacia y en las condiciones descritas en esta ionvención que son moduladores eficaces de Sirtuina (SIRT) son cebadores o sondas eficaces en condiciones que favorecen la amplificación o detección de genes, respectivamente. Estos cebadores y sondas son útiles en procedimientos que requieren la detección específica de moléculas de ácido nucleico que codifican una Sirtuina (SIRT) y en la amplificación de dichas moléculas de ácido nucleico para la detección o para su uso en estudios adicionales de Sirtuina (SIRT). La hibridación de los oligonucleótidos antisentido, particularmente los cebadores y sondas, de la divulgación con un ácido nucleico que codifica una Sirtuina (SIRT) puede detectarse por medios conocidos en la técnica. Dichos medios pueden incluir la conjugación de una enzima con el oligonucleótido, el radiomarcaje del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. También se pueden preparar kits que utilicen tales medios de detección para detectar el nivel de una Sirtuina (SIRT) en una muestra.

La especificidad y sensibilidad del antisentido también son empleadas por los expertos en la materia para usos terapéuticos. Se han empleado oligonucleótidos antisentido como restos terapéuticos en el tratamiento de patologías en animales, que incluyen seres humanos. Los fármacos de oligonucleótido antisentido se han administrado con seguridad y eficazmente a seres humanos y numerosos ensayos clínicos están actualmente en marcha. De este modo, se establece que los compuestos antisentido pueden ser modalidades terapéuticas útiles que pueden configurarse para ser útiles en regímenes de tratamiento para el tratamiento de células, tejidos y animales, especialmente seres humanos.

Para terapéutica, un animal, preferiblemente un ser humano, del que se sospecha que padece una enfermedad o trastorno que puede tratarse modulando la expresión de un polinucleótido de Sirtuina (SIRT) se trata administrando compuestos antisentido de acuerdo con esta descripción. Por ejemplo, en un aspecto no limitante, los procedimientos comprenden la etapa de administrar al animal que necesita tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva del modulador de una Sirtuina (SIRT). Los moduladores de Sirtuina (SIRT) de la presente divulgación modulan efectivamente la actividad de una Sirtuina (SIRT) o modulan la expresión de una proteína Sirtuina (SIRT). En un aspecto, la actividad o expresión de una Sirtuina (SIRT) en un animal se inhibe aproximadamente el 10% en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de la Sirtuina (SIRT) en un animal se inhibe aproximadamente el 30%. Más preferiblemente, la actividad o expresión de la Sirtuina (SIRT) en un animal se inhibe el 50% o más. Así, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de un ARNm de Sirtuina (SIRT) en al menos un 10%, al menos un 50%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, en al menos 60%, en al menos 70%, en al menos 75%, en al menos 80%, en al menos 85%, en al menos 90%, en al menos 95%, en al menos 98%, en al menos al menos 99%, o en un 100% en comparación con un control.

En un aspecto, la actividad o expresión de la Sirtuina (SIRT) y/o en un animal aumenta aproximadamente el 10 % en comparación con un control. Preferiblemente, la actividad o expresión de la Sirtuina (SIRT) en un animal aumenta aproximadamente el 30%. Más preferiblemente, la actividad o expresión de la Sirtuina (SIRT) en un animal aumenta el 50% o más. Así, los compuestos oligoméricos modulan la expresión de un ARNm de Sirtuina (SIRT) en al menos un 10%, al menos un 50%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50%, en al menos 60%, en al menos 70%, en al menos 75%, en al menos 80%, en al menos 85%, en al menos 90%, en al menos 95%, en al menos 98%, en al menos al menos 99%, o en un 100% en comparación con un control.

Por ejemplo, la reducción de la expresión de una Sirtuina (SIRT) puede medirse en suero, sangre, tejido adiposo, hígado o cualquier otro fluido corporal, tejido u órgano del animal. Preferiblemente, las células contenidas dentro de dichos fluidos, tejidos u órganos que se analizan contienen una molécula de ácido nucleico que codifica péptidos de Sirtuina (SIRT) y/o la propia proteína Sirtuina (SIRT).

Los compuestos de la divulgación pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas añadiendo una cantidad efectiva de un compuesto a un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. El uso de los compuestos y procedimientos de la divulgación también pueden ser útiles profilácticamente.

Conjugados: Otra modificación de los oligonucleótidos de la divulgación implica enlazar químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados, que potencian la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Estos restos o conjugados pueden incluir grupos conjugados unidos de manera covalente a grupos funcionales tales como grupos hidroxilo primarios o secundarios. Los grupos conjugados de la divulgación incluyen intercaladores, moléculas reporteras, poliaminas, poliamidas, polietilenglicoles, poliéteres, grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas de oligómeros, y grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas de oligómeros. Grupos conjugados típicos incluyen colesteroles, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes. Grupos que potencian las propiedades farmacodinámicas, en el contexto de esta divulgación, incluyen grupos que mejoran la captación, mejoran la resistencia a la degradación y/o fortalecen la hibridación específica de secuencia con el ácido nucleico diana. Entre los grupos que potencian las propiedades farmacocinéticas, en el contexto de esta divulgación, se incluyen grupos que mejoran la captación, distribución, metabolismo o eliminación de los compuestos de la presente divulgación. Grupos conjugados representativos se describen en la solicitud de patente internacional No. PCT/US92/09196, presentada el 23 de octubre de 1992, y Pat. EE. UU. No. 6.287.860. Restos conjugados incluyen, aunque no se limitan a, restos de lípido tales como un resto colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo, hexil-5-tritiltiol, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, residuos de dodecanodiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecilrac-glicerol o 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido adamantano acético, un resto palmitilo, o un resto octadecilamina o hexilamino-carboniloxicolesterol. Los oligonucleótidos de la divulgación también pueden conjugarse con principios activos, por ejemplo, aspirina, warfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, ketoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, ácido 2,3,5-triyodobenzoico, ácido flufenámico, ácido folínico, una benzotiadiazida, clorotiazida, una diazepina, indometacina, un barbitúrico, una cefalosporina, un fármaco sulfa, un antidiabético, un antibacteriano o un antibiótico.

Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados oligonucleotidicos comprenden, pero sin limitación, Pat. EE. UU. Nos.4.828.979; 4.948.882; 5.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730 5.552.538 5.578.717. 5.580.731 ; 5.580.731 5.591.584 5.109.124 5.118.802; 5.138.045 5.414.077; 5.486.603; 5.512.439 5.578.718; 5.608.046 ; 4.587.044 4.605.735 4.667.025 ; 4.762.779; 4.789.737 4.824.941; 4.835.263; 4.876.335 4.904.582; 4.958.013 ; 5.082.830 5.112.963 5.214.136 ; 5.082.830; 5.112.963 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469 ; 5.258.506; 5.262.536 ; 5.272.250 5.292.873 5.317.098 5.371.241. 5.391.723 5.416.203. 5.451.463 5.510.475 5.512.667; 5.514.785 ; 5.565.552 5.567.810 5.574.142 5.585.481; 5.587.371 ; 5.595.726; 5.597.696; 5.599.923 5.599.928 y 5.688.941

Formulaciones: Los compuestos de la divulgación también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópica u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes representativas de los Estados Unidos que enseñan la preparación de tales formulaciones que asisten a la ingesta, distribución y/o absorción incluyen, pero no se limitan a, Pat. EE. UU. Nos. 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.165; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; y 5.595.756.

Aunque los oligonucleótidos antisentido no necesitan administrarse en el contexto de un vector con el fin de modular la expresión y/o función de una diana, aspectos de la divulgación se refieren a construcciones de vector de expresión para la expresión de oligonucleótidos antisentido, que comprende promotores, secuencias de genes promotores híbridos y poseen una fuerte actividad promotora constitutiva, o una actividad promotora que puede inducirse en el caso deseado.

En un aspecto, la práctica de la divulgación implica administrar al menos uno de los oligonucleótidos antisentido anteriores con un sistema de administración de ácidos nucleicos adecuado. En un aspecto, ese sistema incluye un vector no viral enlazado operativamente al polinucleótido. Ejemplos de dichos vectores no virales incluyen el oligonucleótido solo (por ejemplo, una cualquiera o más de SEQ ID NO: 15 to 94) o en combinación con una formulación de proteína, polisacárido o lípido adecuada.

Sistemas de administración de ácidos nucleicos adecuados adicionales incluyen vector viral, normalmente secuencia de al menos uno de un adenovirus, virus asociado a adenovirus (AAV), adenovirus dependiente de cooperador, retrovirus, o complejo de virus hemaglutinante de Japón-liposoma (HVJ). Preferiblemente, el vector viral comprende un promotor eucariótico fuerte operativamente enlazado al polinucleótido, p. ej., un promotor del citomegalovirus (CMV).

Además, los vectores incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de la leucemia murina de Moloney y virus basados en el VIH. Un vector viral basado en e1HIV preferido comprende al menos dos vectores donde los genes gag y pol son de un genoma de1HIV y el gen env es de otro virus. Se prefieren vectores virales de ADN. Estos vectores incluyen vectores de viruela tales como vectores de ortopox o avipox, vectores de herpesvirus tales como un vector de virus de herpes simplex 1 (HSV), vectores de adenovirus y vectores de virus adenoasociados.

Los compuestos antisentido de la divulgación engloban cualquier sal, éster o sal de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, que incluye un ser humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o residuo del mismo.

La expresión "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológicamente y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la divulgación: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confieren efectos toxicológicos no deseados al mismo. Para oligonucleótidos, ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. EE. UU. No.

6.287.860.

La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la divulgación. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse en varias formas que dependen de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que va a tratarse. La administración puede ser tópica (tal como a las membranas de mucosas, lo que incluye la administración vaginal y rectal), pulmonar, p. ej., mediante inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, que incluye mediante un nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica y trasdérmica); oral o parenteral. La administración parenteral incluye la inyección o la infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o intracraneal (p. ej., intratecal o intraventricular). Para tratar tejidos en el sistema nervioso central, la administración puede realizarse mediante, por ejemplo, inyección o infusión en el líquido cefalorraquídeo. La administración de ARN antisentido en el líquido cefalorraquídeo se describe, por ejemplo, en la Pub. de Solicitud de Pat. EE. UU. No. 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression," .

Cuando se pretende que el oligonucleótido antisentido de la presente divulgación se administre a células en el sistema nervioso central, la administración puede ser con uno o más agentes capaces de promover la penetración del oligonucleótido antisentido objeto a través de la barrera hematoencefálica. La inyección puede realizarse, por ejemplo, en la corteza entorrinal o en el hipocampo. La aplicación de factores neurotróficos mediante la administración de un vector adenovirus en las neuronas motoras del tejido muscular se describe en, p. ej., Pat. EE. UU. No. 6.632.427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons,". La aplicación de vectores directamente al cerebro, p. ej., el cuerpo estriado, el tálamo, el hipocampo, o la sustancia negra es conocida en la técnica y se describe, p. ej., en Pat. EE. ^u U. No. 6.756.523, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain,". La administración puede ser rápida como por inyección o realizarse a lo largo de un período de tiempo ya sea por infusión lenta o mediante la administración de formulaciones de liberación lenta. Los oligonucleótidos antisentido objeto también puede enlazarse o conjugarse con agentes que proporcionan propiedades farmacéuticas o farmacodinámicas deseables. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede acoplarse a cualquier sustancia, conocida en la técnica por favorecer la penetración o el transporte a través de la barrera hematoencefálica, como un anticuerpo contra el receptor de la transferrina, y administrarse por inyección intravenosa. El compuesto antisentido puede unirse a un vector viral, por ejemplo, que hace que el compuesto antisentido resulte más eficaz y/o aumente el transporte del compuesto antisentido a través de la barrera hematoencefálica. La alteración de la barrera hematoencefálica osmótica también puede llevarse a cabo mediante perfusión, p. ej. de azúcares incluyendo, pero sin limitarse a, mesoeritritol, xilitol, D(+)-galactosa, D(+)-lactosa, D(+) xilosa, dulcitol, mioinositol, L(-)-fructosa, D(-)-manitol, D(+)-glucosa, D(+)-arabinosa, D(-)-arabinosa, celobiosa, D(+)-maltosa, D(+)-rafinosa, L(+)-ramnosa, D(+)melibiosa, D(-)-ribosa, adonitol, D(+)-arabitol, L(-)-arabitol, D(+)-fucosa, L(-)-fucosa, D(-)-lixosa, L(+)-lixosa y L(-)-lixosa o aminoácidos, incluyendo, pero sin limitarse a, glutamina, lisina, arginina, asparagina, cisteína, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, Valina, tirosina y taurina. Procedimientos y materiales para potenciar la penetración de la barrera hematoencefálica se describen, por ejemplo, en Pat. EE. UU. No.4.866.042, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier," 6.294.520, "Material for passage through the blood-brain barrier," y 6.936.589, "Parenteral delivery systems," .

Los compuestos antisentido objeto pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o asociarse de otro modo a otras moléculas, estructuras de molécula o mezclas de compuestos, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptor, formulaciones orales, rectales, tópica u otras, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Por ejemplo, se pueden incluir lípidos catiónicos en la formulación para facilitar la captación de oligonucleótidos. Una de tales composiciones que se ha demostrado que facilita la captación es LIPOFECTIN (disponible de GIBCO-BRL, Bethesda, MD).

Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación de 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para administración por vía oral. Composiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden comprender parches transdérmicos, pomadas, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, aerosoles, líquidos y polvos. Pueden ser necesarios o deseables vehículos farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceitosas, espesantes y similares. También pueden ser útiles preservativos recubiertos, guantes y similares.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación, que pueden presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria, pueden prepararse según técnicas convencionales muy conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en asociación los principios activos con el (los) vehículo(s) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan poniendo en asociación uniforme y de manera estrecha los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones de la presente divulgación pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, aunque no se limitan a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, jarabes líquidos, geles blandos, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente divulgación también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas pueden contener adicionalmente sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación incluyen, aunque no se limitan a, soluciones, emulsiones, espumas y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden comprender uno o más mejoradores de la penetración, vehículos, excipientes u otros ingredientes activos o inactivos.

Las emulsiones normalmente son sistemas heterogéneos de un líquido dispersado en otro en forma de gotitas que normalmente superan 0,1 Dm de diámetro. Las emulsiones pueden contener componentes adicionales, además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una disolución en o bien la fase acuosa, fase oleosa o bien él mismo como una fase independiente. Las microemulsiones están incluidas como un aspecto de la presente divulgación. Las emulsiones y sus usos son muy conocidos en la técnica y se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las formulaciones de la presente divulgación incluyen formulaciones liposomales. Tal como se usa en la presente divulgación, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares que tienen una membrana formada por un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que va a administrarse. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que se cree que interactúan con moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan el ADN en vez de formar complejo con él. Se han usado tanto liposomas catiónicos como no catiónicos para administrar ADN a células.

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", una expresión que, tal como se usa en esta invención, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados. Cuando se incorporan en liposomas, estos lípidos especializados producen liposomas con vidas en circulación mejoradas con respecto a los liposomas que carecen de dichos lípidos especializados. Ejemplos de liposomas estéricamente estabilizados son aquellos en los que parte de la parte de lípido formado de vesícula del liposoma comprende uno o más glucolípidos o se derivatiza con uno o más polímeros hidrófilos, tales como un resto de polietilenglicol (PEG). Los liposomas y sus usos se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las formulaciones y composiciones farmacéuticas de la presente divulgación también pueden comprender tensioactivos. El uso de tensioactivos en productos farmacológicos, formulaciones y en emulsiones es bien conocido en la técnica. Los tensioactivos y sus usos se describen adicionalmente en la Pat. E^e . UU. No. 6.287.860.

En un aspecto, la presente divulgación emplea diversos mejoradores de la penetración para efectuar la administración eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Además de ayudar en la difusión de fármacos no lipófilos a través de membranas celulares, los mejoradores de la penetración también potencian la permeabilidad de fármacos lipófilos. Los mejoradores de la penetración pueden clasificarse como pertenecientes a una de cinco amplias categorías, es decir, tensioactivos, ácidos grasos, sales biliares, agentes quelantes y no tensioactivos no quelantes. Los mejoradores de la penetración y sus usos se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Un experto en la materia reconocerá que las formulaciones se diseñan rutinariamente según su uso previsto, es decir, su vía de administración.

Las formulaciones para administración tópica incluyen aquellas en las que los oligonucleótidos de la divulgación están mezclados con un agente de administración tópico como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos, esteroides, agentes quelantes y tensioactivos; los lípidos y liposomas incluyen neutros (p. ej., dioleoil- fosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidilcolina DMPC, diestearolifosfatidilcolina) negativos (por ejemplo, dimiristoilfosfatidilglicerol DMPG) y catiónicos (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoil-pliosfatidil etanolamina DOTMA).

Para administración tópica u otra, los oligonucleótidos de la divulgación pueden encapsularse dentro de liposomas o pueden formar complejos con los mismos, en particular con liposomas catiónicos. Alternativamente, los oligonucleótidos pueden completarse a lípidos, en particular a lípidos catiónicos, ácidos grasos y ésteres, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y sus usos se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No. 6.287.860. Las composiciones y formulaciones para administración por vía oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, sobres, comprimidos o minicomprimidos. Pueden ser deseables espesantes, agentes aromatizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersión o aglutinantes, las formulaciones orales son aquellas en las que los oligonucleótidos de la divulgación se administran junto con uno o más tensioactivos y quelantes mejoradores de la penetración, los tensioactivos incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos ácidos/sales biliares y ácidos grasos y sus usos se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No.

6.287.860. También hay combinaciones de mejoradores de la penetración, por ejemplo, ácidos grasos/sales en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación particularmente es la sal sódica de ácido láurico, ácido cáprico y UDCA. Otros mejoradores de la penetración incluyen polioxietilen-9-lauril éter, polioxietilen-20-cetil éter. Los oligonucleótidos de la divulgación pueden administrarse por vía oral, en forma granulada que incluye partículas secadas por pulverización, o complejados para formar micro o nanopartículas. Los agentes complejantes de oligonucleótidos y sus usos se describen adicionalmente en Pat. EE. UU. No. 6.287.860.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden comprender soluciones acuosas estériles que también pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, aunque no se limitan a, mejoradores de la penetración, compuestos portadores y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Ciertos aspectos de la divulgación proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen uno o más compuestos oligoméricos y uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por un mecanismo no antisentido. Ejemplos de dichos agentes quimioterapéuticos incluyen, aunque no se limitan a, fármacos quimioterapéuticos para el cáncer tales como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinósido, biscloroetil-nitrosurea, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucilo, metilciclohexilnitrosurea, mostazas de nitrógeno, melfalan, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiurea, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etopósido (VP-16), trimetrexato, irinotecán, topotecán, gemcitabina, tenipósido, cisplatino y dietilestilbestrol (DES). Cuando se usan con los compuestos de la divulgación, dichos agentes quimioterapéuticos pueden usarse individualmente (p. ej., 5-FU y oligonucleótido), secuencialmente (p. ej., 5-FU y oligonucleótido durante un periodo de tiempo seguido de MTX y oligonucleótido), o en combinación con uno o más de otros de dichos agentes quimioterapéuticos (p. ej., 5-FU, MTX y oligonucleótido, o 5-FU, radioterapia y oligonucleótido). Los fármacos antiinflamatorios, que incluyen, aunque no se limitan a, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides, y fármacos antivirales, que incluyen, aunque no se limitan a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también pueden combinarse en composiciones de la divulgación. Las combinaciones de compuestos antisentido y otros fármacos no antisentido también están dentro del alcance de la presente divulgación. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

En otro aspecto relacionado, las composiciones de la divulgación pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Por ejemplo, la primera diana puede ser una secuencia antisentido particular de una Sirtuina (SIRT), y la segunda diana puede ser una región de otra secuencia de nucleótidos. Como alternativa, las composiciones de la divulgación pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana de la Sirtuina (SIRT). Se ilustran numerosos ejemplos de compuestos antisentido en esta invención y otros pueden seleccionarse de entre compuestos adecuados conocidos en la técnica. Pueden usarse dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.

Dosificación:

Se cree que la formulación de composiciones terapéuticas y su posterior administración (dosificación) están dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado de enfermedad a tratar, y el curso del tratamiento dura desde varios días hasta varios meses, o hasta que se efectúa una curación o se logra una disminución del estado de enfermedad. Pueden calcularse programas de dosificación óptimos a partir de mediciones de acumulación de fármaco en el cuerpo del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, las metodologías de dosificación y las tasas de repetición. Las dosificaciones óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de oligonucleótidos individuales, y generalmente pueden estimarse basándose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, la dosis es de 0,01 |jg a 100 g por kg de peso corporal y puede administrarse una o más veces al día, semanalmente, mensualmente o anualmente, o incluso una vez cada 2 a 20 años. Los expertos en la técnica pueden estimar fácilmente tasas de repetición para la dosificación basándose en tiempos de residencia medidos y concentraciones del fármaco en fluidos corporales o tejidos. Después de un tratamiento exitoso, puede ser deseable que el paciente se someta a una terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de la enfermedad, en la que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0.01 jg a 100 g por kg de peso corporal, una o más veces al día , a una vez cada 20 años,

En casos, un paciente es tratado con una dosis de fármaco que es al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 25, al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 35, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 45, en al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 70, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 90 o al menos aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Ciertas dosis inyectadas de oligonucleótidos antisentido se describen, por ejemplo, en Pat. EE. UU. No. 7.563.884, "Antisense modulation of PTP1B expression,".

Por su citación de diversos antecedentes en esta invención, los solicitantes no admiten que ningún antecedente particular sea "técnica anterior" a su invención. En los siguientes ejemplos se ilustran realizaciones de composiciones y procedimientos de la invención.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos no limitantes sirven para ilustrar realizaciones seleccionadas de la invención. Se apreciará que variaciones en proporciones y alternativas en elementos de los componentes mostrados serán evidentes para los expertos en la materia y están dentro del alcance de aspectos de la presente divulgación.

Ejemplo 1: Diseño de oligonucleótidos antisentido específicos para una molécula de ácido nucleico antisentido para una Sirtuin (SIRT) y/o una hebra sentido de un polinucleótido Sirtuina (SIRT)

Tal como se ha indicado anteriormente, la expresión “oligonucleótido específico para” o “dianas de oligonucleótido” se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia (i) capaz de formar un complejo estable con una parte del gen elegido como diana, o (ii) capaz de formar un dúplex estable con una parte de un transcrito de ARNm del gen elegido como diana.

La selección de oligonucleótidos apropiados se facilita mediante el uso de programas informáticos que alinean automáticamente las secuencias de ácidos nucleicos e indican regiones de identidad u homología. Estos programas se utilizan para comparar secuencias de ácidos nucleicos obtenidas, por por ejemplo, buscando en bases de datos como GenBank o secuenciando productos de PCR. La comparación de secuencias de ácidos nucleicos de un intervalo de especies permite la selección de secuencias de ácidos nucleicos que muestran un grado de identidad apropiado entre especies. En el caso de genes que no han sido secuenciados, se realizan Southern blots para permitir una determinación del grado de identidad entre genes en especies diana y otras especies. Realizando Southern blots a grados de astringencia variables, tal como es muy conocido en la técnica, es posible obtener una medida aproximada de la identidad. Estos procedimientos permiten la selección de oligonucleótidos que muestran un alto grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico diana en un sujeto a controlar y un menor grado de complementariedad con secuencias de ácido nucleico correspondientes en otras especies. Un experto en la materia se dará cuenta de que hay libertad considerable en la selección de regiones apropiadas de genes para su uso en la presente invención.

Un compuesto antisentido es "específicamente hibridable" cuando la unión del compuesto al ácido nucleico diana interfiere con la función normal del ácido nucleico diana para causar una modulación de la función y/o actividad, y hay un grado suficiente de complementariedad para evitar - unión específica del compuesto antisentido a secuencias de ácido nucleico no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo o tratamiento terapéutico, y en condiciones en las que se realizan ensayos en el caso de ensayos in vitro.

Las propiedades de hibridación de los oligonucleótidos descritos en esta invención se pueden determinar mediante uno o más ensayos in vitro como se conoce en la técnica. Por ejemplo, las propiedades de los oligonucleótidos descritos en el presente documento pueden obtenerse mediante la determinación de la fuerza de unión entre el antisentido natural diana y las moléculas de un fármaco potencial usando un ensayo de curva de fusión.

La intensidad de unión entre el antisentido natural diana y una posible molécula de fármaco (Molécula) puede estimarse usando cualquiera de los procedimientos establecidos de medición de la intensidad de interacciones intermoleculares, por ejemplo, un ensayo de la curva de fusión.

El ensayo de la curva de fusión determina la temperatura a la que se produce una rápida transición de conformación bicatenaria a monocatenaria para el complejo de antisentido natural/molécula. Esta temperatura es ampliamente aceptada como una medida fiable de la intensidad de interacción entre las dos moléculas.

Puede realizarse un ensayo de la curva de fusión usando una copia de ADNc de la molécula de ARN antisentido natural real o un nucleótido de ADN o ARN sintético correspondiente al sitio de unión de la molécula. Están disponibles múltiples kits que contienen todos los reactivos necesarios para realizar este ensayo (por ejemplo, kit MeltDoctor de Applied Biosystems lnc.). Estos kits incluyen una disolución tampón adecuada que contiene uno de los colorantes de unión a ADN bicatenario (dsADN) (tales como los colorantes *ABI HRM, SYBR Green, SYTO, etc.). Las propiedades de los colorantes de dsADN son tales que casi no emiten fluorescencia en forma libre, pero son altamente fluorescentes cuando se unen a dsADN.

Para realizar el ensayo, el ADNc o un oligonucleótido correspondiente se mezclan con la molécula en concentraciones definidas por los protocolos del fabricante particulares. La mezcla se calienta a 95°C para disociar todos los complejos de ADNdc previamente formados, luego se enfría lentamente a temperatura ambiente u otra temperatura menor definida por el fabricante del kit para permitir que se hibriden las moléculas de ADN. A continuación, los complejos recientemente formados se calientan lentamente a 95°C con recopilación de datos continua simultánea sobre la cantidad de fluorescencia que se produce por la reacción. La intensidad de fluorescencia es inversamente proporcional a las cantidades de dsADN presentes en la reacción. Los datos pueden recogerse usando un instrumento de PCR en tiempo real compatible con el kit (por ejemplo, sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus de ABI o el instrumento LightTyper, Roche Diagnostics, Lewes, Reino Unido).

Los picos de fusión se construyen representando la derivada negativa de la fluorescencia con respecto a la temperatura (-d(Fluorescencia)/dT) sobre el eje y) contra la temperatura (eje x) usando software apropiado (por ejemplo, LightTyper (Roche) o SDS Curva de Disociación, ABI). Los datos se analizan para identificar la temperatura de la rápida transición del complejo de dsADN a moléculas monocatenarias. Esta temperatura se llama Tm y es directamente proporcional a la intensidad de la interacción entre las dos moléculas. Normalmente, la Tm superará los 40 °C.

Ejemplo 2: Modulación de polinucleótidos SIRT1

Tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos antisentido

Se cultivaron células HepG2 de ATCC (n° de cat HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) 10 % FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5 % de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió por medio de cultivo recién preparado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos |^jI de esta disolución con 400 j I de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 3198570) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células HepG2. Se usó una mezcla similar que incluye 2 ^j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados con vector simulado. Después de 3-18 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento recién preparado. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat. AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (n° de cat. 4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica mediante PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_ml, Hs00202030_ml y Hs00213036_ml por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se utilizó el siguiente ciclo de PCR: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de (95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 min) utilizando StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems) .

Se calculó la tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido basándose en la diferencia en los valores de dCt normalizados con 18S entre las muestras tratadas y transfectadas simuladamente.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con los oligos diseñados para en ARNm antisentido de SIRT1 CV396200 (Fig. 3,4).

Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente en uno de los oligonucleótidos diseñados para CV396200 antisentido de SIRT1 (Figura 8).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente en dos de los oligonucleótidos diseñados para CV428275 antisentido de SIRT1 (Figura 9).

Los resultados muestran un aumento significativo en los niveles de ARNm de SIRT1 en las células HepG248 horas después del tratamiento con uno de los oligonucleótidos diseñados para BE717453 antisentido de SIRT. (Fig 10). Los resultados muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AV718812 antisentido de SIRT1 respectivamente (Fig. 11).

Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oligos diseñados para AW169958 antisentido de SIRT1 (Fig. 12).

Los resultados de RT PCR muestran que los niveles de sirt3 en células HepG2 aumentan 48 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido de fosforotioato diseñados para Hs antisentido sirt3, 683117 (CUR-1545-1550) (Fig. 17).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT6 en células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los oliogs diseñados para NM_133475 antisentido de SIRT6 (Fig. 18).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT6 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los oligos diseñados para SIRT6 antisentido bf772662 (Fig 19)

Tratamiento de células 3T3 con oligonucleótidosantisentido

Se cultivaron células 3T3 de ATCC (n° de cat CRL-1658) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) 10 % FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y 5 % de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5 % de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió por medio de cultivo recién preparado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos |j I de esta disolución con 400 |j| de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células 3T3. Se usó una mezcla similar que incluye 2 j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados con vector simulado. Después de 3-18 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento recién preparado. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat. AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (n° de cat. 4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n.° de cat 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay; Hs00202021 ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se utilizó el siguiente ciclo de PCR: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de (95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 min) utilizando StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems) .

Se calculó la tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido basándose en la diferencia en los valores de dCt normalizados con 18S entre las muestras tratadas y transfectadas simuladamente.

Resultados:

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células 3T348 h después del tratamiento con tres de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1 (figura 13).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células 3T348 h después del tratamiento con cinco de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1 (Fig. 14).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células 3T348 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1 (Fig. 15).

Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT1 aumentan significativamente en las células 3T348 h después del tratamiento con dos de los oligonucleótidos diseñados para AK044604 antisentido de ratón SIRT1 (Figura 16). Tratamiento de células Vero 76 con oligonucleótidos antisentido:

Se cultivaron células Vero76 de ATCC (n° de cat CRL-1587) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) 10% de FBS (Mediatech n° de cat MT35-011- CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37 ° C y 5% de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5 % de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió por medio de cultivo recién preparado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 ^j M. Se incubaron 2 ^j I de esta solución con 400 ^j I de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 ^j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células Vero76. Se usó una mezcla similar que incluye 2 j I de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO2, el medio se cambió a medio de crecimiento recién preparado. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total de SV de. Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat. AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n.° de cat 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay; Hs00202021 ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se usó el siguiente ciclo de PCR; 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) usando StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Resultados: Los resultados de PCR en tiempo real muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en células Vero aumentaron significativamente 48 h después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido para CV396-700 antisentido de SIRT1 (Figura 5).

Tratamiento de células DBS con oligonuclleótidos antisentidos

Se cultivaron células DBS de ATCC (n° de cat CCL-161) en medio de crecimiento (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024 o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech n° de cat MT35-011- CV) penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37 ° C y 5% de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse a la densidad de 1,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37°C y con el 5 % de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió por medio de cultivo recién preparado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron dos |^jI de esta disolución con 400 ^j I de medio Opti-MEM (Gibco, N.° de cat 31985-070) y 4 ^j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, N.° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células 3T3. Se usó una mezcla similar que incluye 2 ^j I de agua en lugar de la solución de oligonucleótido para los controles transfectados con vector simulado. Después de 3-18 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento recién preparado. 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, se eliminó el medio y se extrajo el ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agregaron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat. AB1453B) o el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (n° de cat.

4368813) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica por PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n.° de cat 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay; Hs00213036 ml de Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se utilizó el siguiente ciclo de PCR: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de (95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 min) utilizando StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems) .

Se calculó la tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido basándose en la diferencia en los valores de dCt normalizados con 18S entre las muestras tratadas y transfectadas simuladamente.

Resultados: Los resultados de la PCR en tiempo real muestran que los niveles de ARNm de SIRT6 en las células DBS aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con dos de los oliogs diseñados para SIRT6 antisentido bf772662 y un oligo diseñado para NM_133475 (Fig. 20).

Ejemplo 3: Modulación de la expresión del gen SIRT

Materiales y Procedimientos

Tratamiento de células HepG2 con oligonucleótidos antisentido:

Se cultivaron células HepG2 de ATCC (n° de cat HB-8065) en medio de cultivo (MEM/EBSS (Hyclone n° de cat SH30024, o Mediatech n° de cat MT-10-010-CV) 10% FBS (Mediatech n° de cat MT35- 011-CV)+ penicilina/estreptomicina (Mediatech n° de cat MT30-002-CI)) a 37°C y 5% de CO2. Un día antes del experimento, las células volvieron a sembrarse a la densidad de 0,5 x 105/ml en placas de 6 pocillos y se incubaron a 37 °C y el 5 % de CO2. El día del experimento, el medio en las placas de 6 pocillos se cambió a 1,5 ml de medio de cultivo recién preparado. Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 j M. Se incubaron 2 j I de esta solución con 400 ^j I de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 ^j I de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células HepG2. Se usó una mezcla similar que incluye 2 j I de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5% de CO2 el medio se cambió a medio de crecimiento recién preparado. 72 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, las células se volvieron a dosificar como se describe anteriormente. 48 h después de la segunda dosificación de oligonucleótidos antisentido el medio se eliminó y el ARN se extrajo de las células usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n° de cat Z3105) o un kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (cat# 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante, se añadieron 600 ng de ARN extraído a la reacción de transcripción inversa realizada utilizando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (cat#AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica mediante PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n° de cat 4369510) y cebadores/sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_ml, Hso0202030_ml y Hs00213036_ml por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Se utilizó el siguiente ciclo de PCR: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos de (95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 1 min) utilizando StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems) . La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Cebadores y sonda para el ensayo Taqman diseñado a medida para el exón 4: AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (SEQ ID NO: 95) el CV396200 antisentido natural SIRT1.

Sec. Cebador Directo. CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (SEQ ID NO: 96)

Sec. Cebador Directo. ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (SEQ ID NO: 97)

Sec. Reportera. CAGAGTTTCAATTCCC (SEQ ID NO: 98)

Resultados:

Los resultados muestran que los niveles del ARNm de SIRT1 en las células HepG2 aumentan significativamente 48 h después del tratamiento con uno de los ARNip diseñados para sirtas (sirtas_5, P = 0,01). En las mismas muestras, los niveles de ARN de sirtas disminuyeron significativamente después del tratamiento con sirtas_5, pero no se modificaron después del tratamiento con sirtas_6 y sirtas_7, que tampoco tuvieron efecto sobre los niveles de ARNm de SIRT1 (Fig. 2). sirtas_5, sirtas_6 y sirtas_7 corresponden a SEQ ID NO: 38, 39 y 40 respectivamente.

Tratamiento de hepatocitos primarios de mono.

Se introdujeron hepatocitos primarios de mono en el cultivo por RxGen Inc. y se colocaron en placas de 6 pocillos. Se trataron con oligonucleótidos de la siguiente manera. Los medios en las placas de 6 pocillos se cambiaron a medios de crecimiento recién preparados que consisten en Medio E de William (Sigma cat#W4128) suplementado con 5% de FBS, 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina, 4 pg/ml de insulina, dexametasona 1 pM, 10 ug/ml de Fungin (InVivogen, San Diego CA). Todos los oligonucleótidos antisentido se diluyeron a la concentración de 20 pM. Se incubaron 2 pI de esta solución con 400 pI de medio Opti-MEM (Gibco, n° de cat 31985-070) y 4 pI de Lipofectamine 2000 (lnvitrogen, n° de cat 11668019) a temperatura ambiente durante 20 min y se aplicaron a cada pocillo de las placas de 6 pocillos con células. Se usó una mezcla similar que incluye 2 pI de agua en lugar de la disolución de oligonucleótido para los controles transfectados de forma simulada. Después de 3-18 h de incubación a 37°C y 5 % de CO2, el medio se cambió a medio de cultivo recién preparado 48 h después de la adición de oligonucleótidos antisentido, el medio se eliminó y se extrajo ARN de las células usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega (n.° de cat Z3105) o el kit de aislamiento de ARN total RNeasy de Qiagen (n.° de cat 74181) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se añadieron 600 ng de ARN a la reacción de transcripción inversa realizada usando el kit de ADNc Verso de Thermo Scientific (n° de cat. AB1453B) como se describe en el protocolo del fabricante. El ADNc de esta reacción de transcripción inversa se usó para monitorear la expresión génica mediante PCR en tiempo real usando ABI Taqman Gene Expression Mix (n° de cat 4369510) y cebadores / sondas diseñados por ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1 y Hs00213036_m1 por Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Fue usado el siguiente ciclo de PCR: 50°C durante 2 min, 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 1 min) usando el termociclador Mx4000 (Stratagene). La tasa de cambio en la expresión génica después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido se calculó basándose en la diferencia de valores de dCt normalizados contra 18S entre las muestras tratadas y las transfectadas de forma simulada.

Results: Los resultados se muestran en la Figura 7. Los resultados de PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 después del tratamiento con un oligonucleótido contra SIRT1 antisentido.

Ejemplo 4: Estudio de la eficacia y duración de la acción de CUR 963 en el mono verde africano

El objetivo de este estudio fue evaluar y comparar el efecto de la inactivación antisentido de las secuencias antisentido no codificantes discordantes que regulan los genes SIRT1 después de la administración intravenosa en un modelo de primate no humano. Los artículos de prueba de oligonucleótidos antisentido diseñados para inhibir las secuencias reguladoras de SIRT1 se designaron como CUR 963.

CUR 963: G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (SEQ ID NO: 34).

CUR 962 (control): G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (SEQ ID NO: 99).

DIRECTRICES REGULADORAS DE PRUEBAS

Este estudio se diseñó según principios toxicológicos aceptados y para cumplir con las directrices tripartitas armonizadas de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) (estudios de seguridad no clínicos para la realización de ensayos clínicos en seres humanos para productos farmacéuticos ICH M3(m), 9 de noviembre de 2000), y procedimientos generalmente aceptados para la prueba de agentes terapéuticos.

ARTÍCULOS DE PRUEBA Y CONTROL

Identidad y Preparación de Artículos de Prueba

El artículo de prueba, CUR-963, es un oligonucleótido antisentido químicamente estabilizado. El vehículo para el suministro intravenoso es solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Caracterización del Vehículo

Para el vehículo PBS, la composición, el número de lote, la fecha de caducidad y las condiciones de almacenamiento (temperatura y luz/oscuridad) se obtuvieron del proveedor.

Almacenamiento y Manipulación de Artículos de Prueba

La sustancia de prueba y el vehículo se almacenaron según las condiciones de almacenamiento recibidas proporcionadas por el patrocinador y el fabricante, en consecuencia.

Análisis de las formulaciones de Artículo de Prueba

Las muestras de la formulación del artículo de prueba se crioconservaron para el análisis de la concentración, la estabilidad y la homogeneidad de las formulaciones de la sustancia de prueba.

FUNDAMENTO DEL SISTEMA DE PRUEBA

El primate es una especie adecuada no roedora, aceptable para las autoridades reguladoras como un indicador de peligros potenciales, y para la cual se dispone de exhaustivos datos de antecedentes. El mono verde africano específicamente es un modelo altamente relevante clínicamente de múltiples estados fisiológicos y patológicos humanos.

La vía de administración intravenosa corresponde a una posible vía terapéutica humana. La dosis de los artículos de prueba se basó en los resultados de los estudios de búsqueda de dosis de compuestos análogos realizados previamente en el mono verde africano.

Se eligió el mono verde africano como el primate de elección, ya que la secuencia diana de las sustancias de prueba se conserva en todas las especies con el 100% de homología en primates. Además, la sustancia de prueba es un oligonucleótido sintético. En consecuencia, la dosificación en primates permite una evaluación superior de la eficacia de estos compuestos que reflejaría más la captación que probablemente se observará en seres humanos que en cualquier otra especie.

ANIMALES

Especie:Chlorocebus sabaeus, primate no humano

Raza: mono verde africano autóctono de St. Kitts.

Fuente: RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies.

Edad Esperada: Los animales de la prueba eran adultos.

Peso Corportal Esperado: Los monos pesan aproximadamente 3-4 kg. El intervalo real puede variar pero se documentará en los datos.

Sexo: Los animales de la prueba eran hembras adultas.

Número de Animales: Se seleccionaron diez animales para asegurar la identificación de 8 animales adecuados para la inclusión en el estudio.

Número en Estudio: Hembras: 8

Justificación de Número en Estudio: Este estudio se diseñó para utilizar el menor número posible de animales, según el objetivo principal de evaluar la eficacia terapéutica del artículo de ensayo en el mono verde africano y los estudios previos de la administración sistémica de este tipo de oligonucleótido en esta especie.

Especificación de los Animales: Se emplearon en el estudio diez monos verdes africanos adultos en el intervalo de peso de 3 a 4 kg. Los monos eran animales adultos que no habían consumido fármacos y que habían sido atrapados por la población salvaje que habita la isla. Los monos atrapados fueron tratados con antihelmínticos para eliminar cualquier posible carga parasitaria intestinal y se observaron en cuarentena durante un mínimo de 4 semanas antes de la selección para la inclusión en el estudio. La edad de los monos atrapados se estimó por tamaño y dentación, con la exclusión de los animales más viejos del estudio. Antes de la inclusión en el estudio, se realizó un examen clínico en cada mono, incluida la evaluación de la locomoción y la destreza. Se tomaron muestras de sangre y se enviaron a Antech Diagnostics (Memphis, TN) para obtener datos químicos clínicos completos y un hemograma completo y perfiles de lípidos (ver las especificaciones en las secciones 9.2 y 319567928). Los monos con valores de laboratorio anormales, según lo determinado en comparación con el intervalo normal establecido para los monos en la colonia de St. Kitts, se excluyeron del estudio. Para identificar 8 monos que satisfacen este criterio, se cribaron 10 monos, con el cribado de animales adicionales conforme fue necesario. Antes de iniciar el estudio, los monos seleccionados serían transferidos a jaulas individuales para que se aclimaten a los alojamientos individuales durante un período de una semana. Solo los animales considerados adecuados para la experimentación serán incluidos en el estudio. Los intervalos reales (o estimados) de edad y peso al inicio del estudio se detallarán en los datos sin procesar y en el informe final.

Salud y Bienestar de los Animales: Se siguieron los patrones más altos de bienestar animal y se respetaron las directrices estipuladas por el Departamento de Agricultura de St. Kitts y el Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. Todos los estudios se realizarán según estos requisitos y todos los códigos de práctica aplicables para el cuidado y alojamiento de animales de laboratorio. Todos los patrones aplicables para el cuidado, operación y revisión veterinarios, tal como los contenidos en la Guía de NIH Para el Cuidado y Uso de Animales. Las instalaciones de St. Kitts mantienen un comité de investigación con animales que revisa los protocolos e inspecciona las instalaciones según lo exige la Guía. La fundación tiene una garantía aprobada depositada ante la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio, según lo requiere la Guía, #A4384-0I (Fundación de Investigación Axion/Fundación Biomédica de St. Kitts). No hay problemas especiales de atención veterinaria de primates no humanos ni problemas de riesgo biológico planteados por la investigación especificada en este estudio.

Alojamiento y Ambiente: Para permitir la detección de cualquier signo clínico relacionado con el tratamiento, los animales se alojaron individualmente antes de la cirugía y después de la operación hasta el sacrificio. El edificio de primates donde estaban situadas las jaulas individuales se iluminó completamente con luz ambiental, que a 17 grados de latitud norte se aproxima a un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas:12 horas, según lo recomendado en las directrices D.H.H.S. de EE.UU. El edificio de primates RxGen estaba completamente ventilado hacia el exterior. Los ventiladores de techo aseguraron un movimiento de aire adicional para mantener una temperatura diana constante de 23-35°C, como es típico de St. Kitts durante todo el año. Veinticuatro horas extremas de temperatura y humedad relativa (que tampoco se controlarán) se midieron diariamente.

Dieta y Agua: A cada animal se le ofrecieron aproximadamente 90 gramos por día de una dieta estándar de chow de mono (TekLad, Madison, WI). Se registró la composición nutricional específica de la dieta. El agua fue analizada periódicamente para la pureza microbiológica. Los criterios para los niveles aceptables de contaminantes en la dieta común y el suministro de agua estaban dentro de las especificaciones analíticas establecidas por el fabricante de la dieta y las evaluaciones periódicas de agua en las instalaciones, respectivamente. El agua cumplió con todos los criterios necesarios para la certificación como aceptable para el consumo humano.

DISEÑO EXPERIMENTAL

Identificación y Randomización de los Animales: La asignación se realizó mediante un procedimiento de aleatorización estratificado basado en el peso corporal y los perfiles de colesterol en plasma. Antes y después de la asignación a un grupo, cada animal fue identificado por un tatuaje en el abdomen. Los tatuajes se colocan en todos los animales de la colonia como un medio de identificación en el curso de las inspecciones de salud habituales. Se elaboró un plano de las jaulas para identificar a los individuos alojados en el interior, y los monos individuales se identificaron aún más mediante una etiqueta marcada en su jaula respectiva.

Tamaños de grupos, dosis y números de identificación: Los animales fueron asignados a 2 grupos de tratamiento, comprendidos por 4 monos en cada grupo. Se proporcionaron números de identificación de animales específicos a cada mono según el sistema de numeración de las instalaciones. Este sistema identifica de forma única a cada mono mediante una letra seguida de un número de tres dígitos, p. ej., Y032.

Ruta y Frecuencia de Administración: Los animales recibieron dosis una vez al día en los Días 1, 3 y 5, suministrados por vía intravenosa mediante infusión manual durante aproximadamente ~10 min. La velocidad de infusión sería de 24 ml/kg/h. Los animales se sedaron con ketamina y xilazina antes y durante el procedimiento de dosificación. Se insertó un catéter venoso (conjunto de infusión de venas Terumo mini, aguja de calibre 20 o conjunto de infusión adecuado similar) en la vena safena. La dosificación se realizó en cada mono entre las 8:00 y las 10:00 am, poco después de que los animales se despertaran y antes de la alimentación. Se recogió una muestra de sangre para evaluar el colesterol en plasma y otros niveles de lípidos como se describe en la sección de Química de la Sangre a continuación, justo antes de cada infusión. La recogida de sangre precedió a la alimentación a ambos intervalos de muestreo para minimizar los efectos dietéticos en las mediciones de colesterol.

Observaciones Clínicas: Todos los signos visibles de reacción al tratamiento se registraron en cada día de dosificación. Además, los animales fueron examinados al menos una vez a la semana en busca de atributos físicos como el aspecto y el estado general.

Pesos Corporales: Los pesos corporales se registraron a intervalos semanales durante los períodos de tratamiento y postratamiento.

Consumo de Alimentos: El consumo individual de alimentos no fue cuantificado. Sin embargo, los patrones de alimentación se monitorearon y se hizo una nota de cualquier cambio importante.

Mortalidad y Morbididad: Se registraría la mortalidad y la morbilidad. Cualquier decisión con respecto al sacrificio prematuro se tomaría después de consultar con el director del estudio y con el científico de monitoreo del patrocinador, si posible. Los animales que se encontrasen muertos o sacrificados prematuramente se someterían a una necropsia con la recogida de tejidos de hígado, riñón, corazón, bazo y pulmón para histopatología. En caso de un sacrificio prematuro, también se tomaría una muestra de sangre (si posible) y se determinarían los parámetros. Los animales que se encontrasen muertos después de las horas normales de trabajo se refrigerarían durante la noche y se realizarían las necropsias al comienzo del siguiente día laborable. Si el estado de un animal requiriese un sacrificio prematuro, sería sacrificado por una sobredosis intravenosa de pentobarbital de sodio. Toda investigación está regida por los Principios de Uso de Animales. Se requiere por ley que RxGen cumpla con los estándares del Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE.UU. para las instalaciones de primates, que dictan los niveles de gravedad que deben cumplir los procedimientos dentro de este estudio, especificados como leves.

ESTUDIOS DE LABORATORIO CLÍNICO

Biopsias de Grasa: Se realizó una biopsia de grasa subcutánea en todos los monos del estudio excepto en Y775 en los días 26 del estudio mediante extracción de tejido a través de una incisión en la línea media de 1 cm por debajo del ombligo. Las biopsias se sumergieron inmediatamente en un criotubo etiquetado que contenía 2 ml de RNAlater (Qiagen) y se incubaron a 4°C durante la noche, después de lo cual se aspiró el RNAlater y el tubo de muestra se congelo instantáneamente en nitrógeno líquido. Después del transporte en nitrógeno líquido, se aisló el ARN total para qPCR en tiempo real de los genes diana.

Resultados: Los resultados de PCR en tiempo real muestran un aumento en los niveles de ARNm de SIRT1 en biopsias de grasa de monos que recibieron CUR-963, un oligonucleótido diseñado para CV396200.1 antisentido de SIRT1, en comparación con monos que recibieron CUR-962 (SEQ ID NO .: 99), un oligonucleótido que no tenía efecto sobre la expresión de SIRT1 in vitro (diseñado para DA327409 antisentido de ApoA1, datos no mostrados). Los niveles de ARNm se determinaron mediante PCR en tiempo real (Figura 6).

Ejemplo 5: Modulación in vivo de Sirtuina (SIRT1) por oligonucleótidos de ADN antisentido

Tratamiento con oligonucleótidos de ADN antisentido (ASO). Se administran oligonucleótidos antisentido (ASO) específicos para SIRT1 AS a ratones C57BI/6J que se alimentan con una dieta rica en grasas durante 12 semanas para inducir obesidad y diabetes. (Purushotham A. y col., (2009) Cell Metabolism 9, p. 327-338,). El tratamiento de los ratones con ASO se iniciará en el momento de la implementación de la dieta alta en grasas. A los ratones se les inyecta IP una vez a la semana con ASO preparado en solución salina normal, a una concentración de 5 mg/kg. Mediciones de peso corporal e ingesta: El peso corporal y la ingesta de alimentos de los ratones se miden dos veces por semana, antes de la inyección IP del ASO.

Mediciones de glucosa en sangre: Las concentraciones de glucosa en sangre alimentadas y en ayunas se miden cada semana tomando una muestra de sangre de la vena de la cola.

Pruebas de Tolerancia a Glucosa (PTG): La PTG se realizará totalmente dos veces por ratón, a la mitad de la dieta (en la semana 4) y cerca del final (en la semana 10) de la dieta alta en grasas. La PTG nos informará sobre la tolerancia a la glucosa de los ratones, es decir, la capacidad de eliminar rápidamente un bolo de glucosa del torrente sanguíneo. Esta es una medida de la diabetes. Los ratones se dejan en ayunas durante la noche durante 16 horas. A los ratones se les inyecta 2 g/kg de glucosa IP. Esto se traduce en un volumen final de 0,2 ml de solución de glucosa al 30% (p/v) para un ratón de 30 g de peso. Las mediciones de glucosa se toman antes de la inyección de glucosa y a los 5, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la inyección. La glucosa se mide cortando la punta de la cola a 1 mm del extremo de la cola bajo anestesia con isoflurano antes de la inyección de glucosa IP. La gota de sangre se aspira a una tira y se mide la concentración de glucosa con un glucómetro. La PTG se realizará totalmente dos veces por ratón, a la mitad de la dieta (en la semana 4) y cerca del final (en la semana 10) de la dieta alta en grasas. La PTG nos informará sobre la tolerancia a la glucosa de los ratones, es decir, la capacidad de eliminar rápidamente un bolo de glucosa del torrente sanguíneo. Esta es una medida de la diabetes.

Prueba de Tolerancia a la Insulina (PTI): Los ratones se dejan en ayunas durante 6 horas desde las 9 am hasta las 3 pm. A continuación, se inyecta a los ratones IP 0,5-1U de insulina/kg. La concentración de insulina se ajustará de forma que el volumen final inyectado es de 0,1-0,15ml. Las mediciones de glucosa en sangre se toman antes de la inyección y a los 5, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la inyección. La sangre se recolecta exactamente como se describe en la PTG. Además de monitorear los niveles de glucosa, el comportamiento de los ratones se observa constantemente durante la PTI. La hipoglucemia puede manifestarse como un cambio de comportamiento y los animales se vuelven muy tranquilos y muestran malestar. Para impedir la hipoglucemia, se inyecta glucosa (1g/kg) IP a un volumen final de 0,1-0,15 ml tan pronto como la concentración de glucosa en sangre cae por debajo de 50 mg/ml o se observen signos de malestar.

Recolección de Sangre por Punción de la Vena Facial: Los ratones son inmovilizados por la nuca del cuello y la base de la cola, comprimiendo ligeramente los vasos sanguíneos del cuello a través de la tensión del agarre en la piel del cuello. El sitio de muestreo está en la mandíbula, ligeramente por delante del ángulo de la mandíbula. La piel en el lugar del muestreo se perfora con una aguja de 180 o una lanceta en un ángulo de 90° hasta que la punta de la aguja/lanceta apenas atraviesa la piel. Las muestras de sangre se recogen utilizando tubos de microhematocrito. Después de que se ha recogido la sangre, el agarre del cuello se afloja y la presión se aplica en el sitio de inserción con una esponja calibrada para asegurar la hemostasis. Se recogerán 0,05-0,2 ml de sangre mediante este procedimiento. Este procedimiento se realizará solo una vez en la semana 5 de la dieta alta en grasas y, finalmente, en la semana 12 si la punción intracardíaca no funciona (ver más abajo). Las hormonas sanguíneas que regulan el metabolismo de la glucosa y los lípidos (tales como insulina, adiponectina y leptina) se miden utilizando kits de ELISA disponibles comercialmente. (p. ej., R&D Systems, Minneapolis, MN, Assay Pro St. Charles, MO, Mabtech, Mariemont, OH)

Punción Intracardiaca: Al final de la dieta alta en grasas de 12 semanas, los ratones serán anestesiados por inhalación continua de isoflurano. La anestesia se induce colocando a los ratones en una caja de inducción, a la que se suministra isoflurano y oxígeno. Los ratones se sujetarán boca arriba. El corazón se perfora con una aguja 27G. Después de la exanguinación, se decapita la cabeza para asegurar la muerte. Se recogen tejidos (hígado, páncreas, tejido adiposo blanco y marrón y músculo esquelético) para investigaciones adicionales (mediciones de ARN y proteínas e histología). Alrededor de 0,5-1 ml de sangre se obtendrá y se usará para determinar diversos parámetros críticos de la glucosa y el metabolismo de lípidos (glucosa, insulina, colesterol, triglicéridos, ácidos grasos libres, leptina, adipoquinas, corticosteroides, hormonas tiroideas). Si surgen dificultades con este procedimiento, recolectaremos sangre por punción en la vena facial bajo anestesia con isoflurano (ver arriba).

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleótido antisentido que se une a una transcripción antisentido natural de Sirtuina 6 humana (SIRT6) para su uso como compuesto terapéutico, donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de la Sirtuina 6 humana (SIRT6) (SEQ ID NO: 4), y donde la transcripción antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NO: 13 o 14.

2. Un oligonucleótido antisentido que se une a una transcripción antisentido natural de Sirtuina 6 (SIRT6) humana para su uso en la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a Sirtuina 6 (SIRT6) que es cáncer, donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de Sirtuina 6 (SIRT6) humana (SEQ ID NO: 4), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NOS: 13 o 14.

3. Uso de un oligonucleótido antisentido que se une a una transcripción antisentido natural de Sirtuina 6 (SIRT6) humana para la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a Sirtuina 6 (SIRT6) que es cáncer, donde dicho oligonucleótido antisentido aumenta la expresión de Sirtuina 6 humana (SIRT6) (SEQ ID NO: 4), y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NOS: 13 o 14.

4. Un oligonucleótido antisentido para su uso según la Reivindicación 2 o el uso de un oligonucleótido antisentido según la Reivindicación 3, donde el cáncer se selecciona entre cáncer de mama, cáncer colorrectal o cáncer de próstata.

5. Un procedimiento in vitro para aumentar la expresión de Sirtuina (SIRT) en células o tejidos de pacientes que comprende: poner en contacto dichas células o tejidos con un oligonucleótido antisentido que se une a una transcripción antisentido natural de Sirtuina 6 humana (SIRT6); aumentando de ese modo la expresión de la sirtuina 6 humana (SIRT6) (SEQ ID NO: 4) y donde el transcrito antisentido natural tiene la secuencia de ácido nucleico como se establece en las SEQ ID NOS: 13 o 14.

6. Un oligonucleótido antisentido para su uso según cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2 o 4, o el uso de un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, o un procedimiento según la Reivindicación 5, donde:

a. el oligonucleótido antisentido es un compuesto de siRNA; o

b. el oligonucleótido antisentido es monocatenario.

7. Un oligonucleótido antisentido para su uso según cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2, 4 o 6, o el uso de un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las Reivindicaciones 3, 4 o 6, o un procedimiento según las Reivindicaciones 5 o 6, donde el oligonucleótido antisentido comprende al menos una de las SEQ ID NOS: 89, 91 y 92.

8. Un oligonucleótido antisentido para su uso según una cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2, 4, 6 o 7, o uso de un oligonucleótido antisentido según una cualquiera de las Reivindicaciones 3, 4, 6 o 7, o un procedimiento según una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7, donde la expresión de dicha Sirtuina (SIRT) aumenta en al menos un 10%.

9. Un oligonucleótido antisentido para su uso según cualquiera de las Reivindicaciones 1, 2, 5, 6 a 8, o el uso de un oligonucleótido antisentido según cualquiera de las Reivindicaciones 3, 4 o 6 a 8, o un procedimiento según cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 8, donde el oligonucleótido antisentido comprende además una o más modificaciones que comprenden:

a. al menos un enlace internucleosídico modificado seleccionado de entre: un fosforotioato, 2'-O-metoxietilo (MOE), 2'-fluoro, alquilfosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidata, éster carboximetílico, y combinaciones de los mismos;

b. al menos un nucleótido modificado seleccionado de entre: un ácido nucleico peptídico (ANP), un ácido nucleico bloqueado (ANB), un ácido arabino-nucleico (FANA), análogos, derivados, y combinaciones de los mismos; o c. al menos un resto de azúcar modificado seleccionado de entre: un resto de azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo, un resto de azúcar modificado con 2'-metoxi, un resto de azúcar modificado con 2'-O-alquilo, un resto de azúcar bicíclico, y combinaciones de los mismos.

10. Un oligonucleótido antisentido que tiene las características de un oligonucleótido definido en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9.

11. Un oligonucleótido antisentido según la Reivindicación 10, donde el oligonucleótido antisentido tiene entre 10 y 30 nucleótidos de longitud.

12. Un oligonucleótido antisentido según la Reivindicación 10 o la Reivindicación 11, donde el oligonucleótido antisentido tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un complemento de un transcrito antisentido natural de una Sirtuina 6 (SIRT6) como se establece en las SEQ ID NOS: 13 y 14.

13. Una composición farmacéutica que comprende al menos un oligonucleótido antisentido como se define en una cualquiera de las Reivindicaciones 10 a 12 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.