CN102471381A - 自身免疫性脱髓鞘疾病的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过CLM-I激动剂对自身免疫性脱髓鞘疾病(诸如多发性硬化病(MS))的诊断和治疗。

Description

自身免疫性脱髓鞘疾病的诊断和治疗

发明领域

本发明涉及自身免疫性脱髓鞘疾病(autoimmune demyelinating disease)(诸如多发性硬化病(multiple sclerosis，MS))的诊断和治疗。

发明背景

骨髓细胞是自身免疫性脱髓鞘疾病中的主要效应细胞(Barnett等，Multiple Sclerosis(多发性硬化病)12，121-132，2006；Benveniste，Journal ofMolecular Medicine(分子医学杂志)75，165-173，1997)。CNS-浸润性骨髓群体由定居小胶质细胞、巨噬细胞、炎性树突细胞、类浆细胞树突细胞和常规的树突细胞组成。由于表达MHCII和CD86的骨髓树突细胞(DCs)重新激活抗原特异性T细胞的能力(Deshpande等，J Immunol(免疫学杂志)178，6695-6699，2007)和它们参与导致复发疾病的表位扩散(Miller等，J Immunol(免疫学杂志)178，6695-6699，2007)，它们已经受到特别的关注。除了作为抗原呈递细胞，炎性DCs通过分泌促炎性细胞因子和活性氧中间体而直接调节局部的细胞外环境，导致进行性的脱髓鞘和轴突损失。这些产生TNF-和iNOS的树突细胞的前体细胞，还称为TipDCs(Serbina等，Immunity(免疫性)19，59-70，2003)，其是循环中存在的炎性单核细胞，并且被募集到CNS炎症区域。通过乙酸格拉默(glatirameracetate，一种批准用于MS的药物)将炎性转化为II型抗炎症的单核细胞导致EAE严重性的逆转(Weber等，Nature Medicine(自然医学)13，935-943，2007)，这进一步强调这些骨髓细胞在调节疾病严重性中的重要作用。

先前已经鉴定了CNS浸润性骨髓细胞的其它负调节剂。例如，在定居小胶质细胞和浸润性骨髓细胞二者上表达的TREM-2在通过吞噬髓鞘质碎片消退CNS炎症方面起重要作用(Piccio等，European Journal ofImmunology(欧洲免疫学杂志)37，1290-1301，2007；Takahashi等，PLoSMedicine(PLoS医学)4，e124，2007；Takahashi等，The Journal ofExperimental Medicine(实验医学杂志)201，647-6572005，2005)。类似地，在骨髓细胞上的IFNAR下调CNS中的炎性反应(Prinz等，Immunity(免疫性)28，675-686，2008)。然而，没有一种受体对归巢于CNS的炎性骨髓来源的单核细胞是特异性的。

在寻找对于骨髓功能的负调节是重要的骨髓特异性细胞表面受体中鉴定了CLM-1(MAIR-V， LMIR-3，DigR2)。CLM-1是CMRF家族的一部分，CMRF家族是在人染色体17上的多基因簇，其小鼠直向同源物位于染色体11上。所有家族成员包含细胞外IgV结构域。在该簇中的两个家族成员(CLM-1和CLM-8)在细胞内结构域中包含ITIM序列，其余成员在跨膜区具有带电荷残基，其可以作为招募信号传导连接物。CLM-1，为人CD300f的鼠源直向同源物(Clark等，Trends in Immunology(免疫学趋势)30，209-217，2009)，最初描述为骨诱裂发生(osteoclastogenesis)的负调节剂(Chung等，J.Immunol(免疫学杂志)171，6541-6548，2003)。后续研究已经表明，CLM-1在Fc-受体介导的细胞反应中起抑制作用(Alvarez-Errico等，The Journal of Experimental Medicine(实验医学杂志)206，595-606，2004；Fujimoto等，International Immunology(国际免疫学)18，1499-1508，2006)。迄今为止，还没有记述在自身免疫性疾病中的生物学作用。

发明概述

本发明至少部分基于CLM-1的鉴定，其被鉴定为通过抑制炎性细胞因子和活性氧类别的释放而作为CNS中炎性DCs活性的负调节剂。因此，在本发明中，CLM-1被鉴定为CNS炎症和脱髓鞘(demyelination)的骨髓特异性负调节剂。

在一个方面中，本发明涉及治疗哺乳动物受试者中的脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的CLM-1激动剂。

在另一个方面中，本发明涉及用于治疗脱髓鞘疾病的药物组合物，其包含与药用赋形剂混合的有效量的CLM-1激动剂。

在另一个方面中，本发明涉及有效量的CLM-1激动剂在制备用于治疗脱髓鞘疾病的药物中的应用。

在另一个方面中，本发明涉及用于治疗脱髓鞘疾病的CLM-1激动剂。

在另一个方面中，本发明涉及用于诊断脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括检测CLM-1功能中的缺陷。

在另一个方面中，本发明涉及包括用于治疗脱髓鞘疾病的CLM-1激动剂和使用说明书的试剂盒。

在所有方面中，本发明特别包括下述实施方案：

在一个实施方案中，所述哺乳动物受试者是人。

在另一个实施方案中，所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

在另一个实施方案中，所述脱髓鞘自身免疫病影响中枢神经系统(CNS)。

在另一个实施方案中，所述脱髓鞘自身免疫病选自由下列组成的组：多发性硬化病(multiple sclerosis，MS)，复发性减轻的MS(relapsingremitting MS，RRMS)，原发性和继发性进行性形式的MS(primary andsecondary progressing forms of MS)，进行性复发形式的MS(progressicerelapsing forms of MS)，脑脊髓炎(encephalomyelitis)，白质脑炎(leukoencephalitis)，横贯性脊髓炎(transverse myelitis)，视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)(德维克病(Devic’s disease))，和视神经炎(opticneuritis)。

在另一个实施方案中，所述脱髓鞘自身免疫病是MS。

在不同的实施方案中，所述脱髓鞘自身免疫病影响外周神经系统，包括，但不限于，急性炎性脱髓鞘多神经病(acute inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)(AIDP；吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome))；慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatory demyelinatingpolyneuropathy)；抗-MAG外周神经病；以及运动和感觉神经病(Motorand Sensory Neuropathy)(HMSN)(还已知为遗传性感觉运动神经病(Hereditary Sensorimotor Neuropathy)(HSMN)，或腓骨肌萎缩症(Peroneal Muscular Atrophy)，和进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth Disease))。

在另一个实施方案中，所述CLM-1激动剂是激动剂抗-CLM-1抗体。

附图简述

图1.CLM-1在CNS炎性损伤中的炎性树突细胞上表达。

(A)在疾病最严重处在脊髓中增加的CLM-mRNA转录物。(B)在CNS定居CD11b+细胞上不存在CLM-1表达。(C)在CD11bCD11c+骨髓细胞上的CLM-1表达。(D)在疾病最严重处(胸段，背侧角)在CNS炎性损伤中的CLM-1 CD11c共表达DCs。(E)表达CLM-1的DCs表达iNOS和TNFα。数值表示为平均值+S.D.。(D)中刻度条是50μm。

图2.CLM-1在炎性单核细胞和树突细胞上表达。

(A)CLM-1在Cx3cr1^loCD11c⁺Ly6^hi阳性炎性单核细胞上表达，但不在Cx3cr1^hi常规DC前体上表达。(B)CLM-1在放射线敏感的骨髓来源的细胞上表达，但是不在辐射线抗性CNS定居小胶质细胞上表达。(C)CLM-1在Cx3cr1^lo炎性DCs但是不在Cx3cr1^hi小胶质细胞上表达。(D)在免疫后14天，Cx3cr1和CLM-1在脊髓切片上(胸段)表达。在髓膜外周观察到共染色(箭头)，而Cx3cr1hi小胶质细胞(箭形符号)不携带CLM-1。刻度条：B(100μm)，D(50μm)。

图3.缺乏CLM-1或用CLM-1融合蛋白治疗导致提高的EAE。

(A)在由CLM-1敲除(ko)小鼠获得的骨髓来源的DCs中缺乏CLM-1蛋白的表达(左侧图)。在由疾病最严重处的脊髓获得的DCs上有相似水平的MHC II和CD86(右侧图)。(B)与ko小鼠相比，在CLM-1wt中，缺少CLM-1染色，保持的形态学和相似的炎性细胞数目。(C)在用CLM-1-Fc融合蛋白治疗的CLM-1ko小鼠或(D)CLM-1wt小鼠中增加的疾病严重性。(B)中的刻度条是50μm。

图4.CLM-1缺乏不影响T细胞致敏。

(A)在CLM-1wt和ko小鼠中，重新刺激的抗原特异性外周淋巴结T细胞的增殖和细胞因子反应是相似的。(B)在野生型接受体中，来自CLM-1ko或wt供体小鼠的T细胞诱导相似的疾病(左侧图)。与CLM-1wt野生型接受体相比，在CLM-1ko接受体中，来自CLM-1wt供体的T细胞诱导提高的疾病严重性(右侧图)。

图5.CLM-1调节骨髓-而非T细胞特异性炎性调节剂的释放。

(A)当重新激活获自免疫的CLM-1wt和ko小鼠的MOG反应性脊髓T细胞时，在Th1，Th17和调节性T细胞的数目中没有差别。(B)在获自CNS炎性损伤的CLM-1wt和ko骨髓细胞中增加的DC活化。*p＜0.01。

图6.CLM-1调节自身免疫性脱髓鞘。

(A)CNS损伤中的CLM-1阳性细胞和MOG阳性髓鞘质的重叠合图像。(B)和(C)：与wt小鼠相比，在CLM-1ko中有增加的脱髓鞘作用(由在B中白线标记的区域所示并且在C中定量)。

图7.小鼠(SEQ ID NO：1)和人(SEQ ID NO：2)CLM-1多肽的氨基酸序列。

补充的图1.小鼠Clm-1基因的靶向破坏的策略。

通过同源重组产生Clm-1外显子-1被替换为新霉素抗性基因的ES细胞。显示了Clm-1基因的靶向区的结构。E1和E2表示Clm-1基因的的外显子1和外显子2。显示了用于通过Southern印迹筛选ES克隆的探针定位(5’和3’)。

补充的图2.CLM-1不影响T细胞增殖。

(A)在存在增加浓度的OVA肽的条件下，将由OVA转基因T细胞获得的T细胞用由CLM-1wt或ko小鼠获得的骨髓来源的树突细胞温育。(B)混合的淋巴细胞反应。将由Balb/c背景的CLM-1wt或ko小鼠获得的骨髓树突细胞用不同比率的获自C57B1/6背景的小鼠的T细胞温育。增殖由H3胸苷掺入量反映。

补充的图3.(A)Clm-1不影响外周淋巴结中调节性T淋巴细胞的产生。(B)Clm-1不影响CNS中T淋巴细胞的极化(polarization)。

优选实施方案详述

I.定义

术语“CLM-1”和“Cmrf-样分子-1”(还已知为MAIR-V， LMIR-3，DigR2和IgSF13)在本文中互换使用，指天然序列哺乳动物CLM-1受体，具体地包括，但不限于，小鼠CLM-1多肽SEQ ID NO：1(NCBI CAM21607)及其人直向同源物SEQ ID NO：2(NCBI AAH28188，还已知为CD300f，IREM1，IgSF13，35-L5，和CMRF-35A5)，以及它们天然存在的变体。关于进一步的详情和命名参见Clark等，2009，同前所述。

“天然序列”多肽是具有与天然来源的多肽(例如，ErbB受体或ErbB配体)相同的氨基酸序列的多肽。所述天然序列多肽可以由自然分离，或可以通过重组或合成方式产生。因此，天然序列多肽可以具有天然存在的人多肽、鼠多肽、或来自任何其它哺乳动物物种的多肽的氨基酸序列。

术语“氨基酸序列变体”是指具有在某种程度上不同于天然序列多肽的氨基酸序列的多肽。通常，氨基酸序列变体与天然ErbB配体的至少一个受体结合结构域或与天然ErbB受体的至少一个配体结合结构域具有至少约70％的同源性，优选地，它们与所述受体或配体结合结构域至少约80％、更优选至少约90％同源。所述氨基酸序列变体在天然氨基酸序列的氨基酸序列中的特定位置具有置换、缺失、和/或插入。

“同源性”定义为在比对序列并且在需要时引入缺口以获得最大同源性百分数之后在氨基酸序列变体中相同的残基的百分数。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是公知的。一种这样的计算机程序是″Align 2″，由Genentech，Inc.(健泰科生物技术公司公司)所有，其于1991年12月10日提交至华盛顿特区20559的美国版权局进行使用者备案。

术语“抗体”在本文中以最广义使用，并且具体涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两个完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们表现出所需要的生物学活性。

术语“单克隆抗体”用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即除了可能以极小量存在的可能天然存在的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，针对单个的抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对在抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于它们可以在不被其它抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表示抗体的特征在于由基本上同质的抗体群体获得，不应该解释为要求通过任何特定方法生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可以通过最初由Kohler等，Nature(自然)，256：495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(见，例如美国专利号4,816,567)。所述“单克隆抗体”还可以使用例如在Clackson等，Nature(自然)，352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。

单克隆抗体在本文中特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出所需要的生物学活性(美国专利号.4,816,567；和Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851-6855(1984))。本文的目的嵌合抗体包含“灵长类动物化(primatized)”抗体，所述“灵长类动物化”抗体包含衍生自非人灵长类动物(例如，猕猴(Old World Monkey)，猿等)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列。

″抗体片段″包含完整抗体的一部分，优选地包含完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)₂，和Fv片段；双抗体；直链抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

“完整”抗体是包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(C_L)和重链恒定结构域，C_H1，C_H2和C_H3的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整的抗体具有一种或多种效应子功能。

抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等

取决于它们重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以指定为不同的“类别”。存在五种主要类型的完整抗体：IgA，IgD，IgE，IgG，和IgM，并且这些中的一些可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA，和IgA2。与不同抗体类别相对应的重链恒定结构域分别称为α，δ，ε，γ，和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是公知的。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指这样的细胞介导的反应，即，其中表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所记载的测定法。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所公开的动物模型。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcRs并行使效应子功能的白细胞。优选地，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中优选PBMCs和NK细胞。如本文所述，效应细胞可以从其天然来源，例如从血液或PBMCs中分离。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见在Daёron，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)15：203-234(1997)中的综述M)。FcR的综述参见Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-92(1991)；Capel等，免疫方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；及de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)126：330-41(1995)。在本文中的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括未来将会鉴定的那些。该术语还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgGs转移给胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时分子裂解靶标的能力。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与相关抗原复合的分子(例如抗体)起始的。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所记载的。

“天然抗体”通常是一种约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键连接于重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链之间，二硫键的数目是不同的。每条重链和轻链也具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(V_H)，其后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(V_L)，在其另外一端具有恒定结构域。将轻链恒定结构域与重链的第一恒定结构域比对，将轻链可变结构域与重链可变结构域比对。认为特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。

术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛并且用于每种具体的抗体针对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性在抗体的整个可变结构域中并不是均匀分布的。其集中在轻链和重链可变结构域二者中的三个称为高变区的区段中。可变结构域的更加高度保守的部分称为构架区(FRs)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRs，它们大多采取β-折叠构型，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构的一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FRs非常接近地保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生局(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中的参与。

术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，和重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公共卫生局(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自“高变环”的残基(例如轻链可变结构域中残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)，和重链可变结构域中残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“Fab”片段的两个相同的抗原结合片段(每个具有单个抗原结合位点)，和一个残余“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别位点和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密的、非共价缔合的二聚体组成。以这种构型，每个可变结构域的三个高变区相互作用，从而在V_H-V_L二聚体表面上限定抗原结合位点。总的来说，六个高变区赋予抗体的抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个高变区的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，但是亲和性低于完整的结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是本文关于Fab’的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基具有至少一个游离硫醇基。F(ab’)₂抗体片段最初作为在它们之间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知抗体片段的其它化学偶联。

可以基于其恒定结构域的氨基酸序列，将来自任何脊椎动物物种的抗体“轻链”指定为两种明显不同的类型中的一种，所述两种明显不同的类型称为kappa(κ)和lambda(λ)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。优选的是，Fv多肽在V_H和V_L结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能够形成期望的抗原结合结构。关于scFv的综述参见Plückthun，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学)，卷113，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页(1994)。抗-ErbB2抗体scFv片段记述在WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号5,587,458中。

术语“双抗体(diabodies)”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包含在同一多肽链(V_H-V_L)中与可变轻链结构域(V_L)连接的可变重链结构域(V_H)。通过使用太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的接头，促使结构域与另一条链中的互补结构域配对，并且产生两个抗原结合位点。双抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：6444-6448(1993)中有更充分的描述。

非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式指包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在最大程度上，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(接受体抗体)，其中接受体的高变区残基用具有期望的抗体特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在接受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部或至少一个、典型地两个这样的可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，Nature(自然)321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.(结构生物学新观点)2：593-596(1992)。

“分离的”抗体是已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从中回收的抗体。抗体的天然环境的污染性成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)如通过Lowry法测定，超过95重量％的抗体，和最优选地超过99重量％的抗体，(2)足以通过使用转杯式测序仪(spinning cup sequenator)获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选地银染色在还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。由于不会存在抗体的天然环境的至少一种成分，故分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常通过至少一个纯化步骤来制备。

“结合”目的抗原的抗体是能够以足够的亲和力结合所述抗原的抗体，从而该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞的治疗剂。

术语“脱髓鞘疾病”在本文中用来指神经元的髓鞘被损坏的任何神经系统疾病。该定义包括影响少突胶质细胞的完整性及其产生和维持髓鞘质的能力的疾病和直接损坏髓鞘的疾病。所述疾病扰乱有髓鞘的白质途径的转导，并且产生宽泛的运动、感觉、和认知功能障碍，包括对感觉、运动、认知、和/或其它功能的损害，这取决于所涉及的是哪些神经，包括中枢神经系统(CNS)神经和外周神经。

本文的“自身免疫性疾病(autoimmune disease)”是这样的疾病或病症，由个体自身的组织引起和针对个体自身的组织或其共分离或表现或由其导致的病况。自身免疫性疾病或病症的实例包括，但不限于，关节炎(类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、青少年类风湿性关节炎(juvenilerheumatoid arthritis)、骨关节炎(osteoarthritis)、银屑病关节炎(psoriaticarthritis)、和强直性脊椎炎(ankylosing spondylitis))，银屑病(psoriasis)，皮炎(dermatitis)，其包括特应性皮炎(atopic dermatitis)；慢性特发性荨麻疹(chronic idiopathic urticaria)，其包括慢性自身免疫性荨麻疹(chronicautoimmune urticaria)、多肌炎(polymyositis)/皮肌炎(dermatomyositis)、中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis)、系统性硬皮病(systemicscleroderma)和硬化病(sclerosis)，与炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)相关的反应(局限性回肠炎(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis)、和具有坏疽性脓皮病(pyoderma gangrenosum)共分离的IBD、结节性红斑(erythema nodosum)、原发性硬化性胆管炎(primary sclerosingcholangitis)、和/或巩膜外层炎(episcleritis))，呼吸窘迫综合征(respiratorydistress syndrome)，包括成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distresssyndrome，ARDS)，脑膜炎(meningitis)，IgE-介导的疾病(IgE-mediateddiseases)，诸如过敏反应(anaphylaxis)与变应性鼻炎(allergic rhinitis)，脑炎(encephalitis)，诸如Rasmussen′s脑炎(Rasmussen′s encephalitis)，葡萄膜炎(uveitis)，结肠炎(colitis)，诸如微观结肠炎(microscopic colitis)和胶原性结肠炎(collagenous colitis)，肾小球肾炎(glomerulonephritis，GN)，诸如膜性GN(membranous GN)、特发性膜性GN(idiopathic membranous GN)、膜性增生性GN(membranous proliferative GN，MPGN)(其包括I型和II型)、和迅速进行性GN(rapidly progressive GN)，过敏性病症(allergicconditions)，湿疹(eczema)，哮喘(asthma)，涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症(conditions involving infiltration of T cells and chronicinflammatory responses)，动脉粥样硬化(atherosclerosis)，自身免疫性心肌炎(autoimmune myocarditis)，白细胞黏附不足(leukocyte adhesiondeficiency)，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)，如皮肤性SLE(cutaneous SLE)，狼疮(lupus)(包括肾炎(nephritis)，大脑炎(cerebritis)，儿童(pediatric)狼疮，非肾(non-renal)狼疮，盘状(discoid)狼疮，脱发(alopecia)狼疮)，青少年发作型糖尿病(juvenile onset diabetes)，多发性硬化病(multiple sclerosis，MS)，诸如脊髓-视觉MS(spino-opticalMS)，变应性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)，与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应(acute and delayed hypersensitivity)相关的免疫应答，肺结核(tuberculosis)，结节病(sarcoidosis)，肉芽肿病(granulomatosis)，包括韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)，粒细胞缺乏(agranulocytosis)，血管炎(vasculitis)(包括大血管血管炎(LargeVessel vasculitis)(包括风湿性多肌痛(Polymyalgia Rheumatica)和巨大细胞(高安)动脉炎(Giant Cell(Takayasu′s)Arteritis))，中血管血管炎(Medium Vessel vasculitis)(包括川崎病(Kawasaki′s Disease)和结节性多发性动脉炎(Polyarteritis Nodosa))，CNS血管炎，和ANCA-相关性血管炎，诸如丘-施血管炎或综合征(Churg-Strauss vasculitis or syndrome，CSS))，再生障碍性贫血(aplastic anemia)，Coombs阳性贫血(Coombspositive anemia)，戴-布贫血(Diamond Blackfan anemia)，免疫性溶血性贫血(immune hemolytic anemia)，包括自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehemolytic anemia，AIHA)，恶性贫血(pernicious anemia)，单纯红细胞性再生障碍(pure red cell aplasia，PRCA)，因子VIII缺乏症(Factor VIIIdeficiency)，血友病A(hemophilia A)，自身免疫性中性粒细胞减少(autoimmune neutropenia)，全血细胞减少(pancytopenia)，白细胞减少(leukopenia)，涉及白细胞血细胞渗出的疾病(diseases involvingleukocyte diapedesis)，CNS炎性病症，多器官损伤综合征(multiple organinjury syndrome)，重症肌无力(myasthenia gravis)，抗原-抗体复合物介导的疾病(antigen-antibody complex mediated diseases)，抗肾小球基底膜病(anti-glomerular basement membrane disease)，抗磷脂抗体综合征(anti-phospholipid antibody syndrome)，变应性神经炎(allergic neuritis)，Bechet病，卡斯尔曼综合征(Castleman′s syndrome)，古德帕斯丘综合征(Goodpasture′s Syndrome)，兰伯特-伊顿肌无力综合征(Lambert-EatonMyasthenic Syndrome)，Reynaud′s综合征，舍格伦综合征(Sjorgen′ssyndrome)，斯蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)，实体器官移植排异(solid organ transplant rejection)(包括对高组反应性抗体滴度(high panel reactive antibody titers)、组织中IgA沉积的预处理，和由肾脏移植、肝脏移植、肠移植、心脏移植引起的排异，等)，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，大疱性类天疱疮(pemphigoidbullous)，天疱疮(pemphigus)(包括寻常型(vulgaris)天疱疮，落叶型(foliaceus)天疱疮，和天疱疮粘膜性类天疱疮(pemphigusmucus-membrane pemphigoid))，自身免疫性多内分泌腺病(autoimmunepolyendocrinopathies)，莱特尔病(Reiter′s disease)，僵人综合征(stiff-mansyndrome)，免疫复合物肾炎(immune complex nephritis)，IgM多神经病(IgM polyneuropathies)或IgM-介导的神经病(IgM mediated neuropathy)，特发性血小板减少症性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic throbocytopenic purpura，TTP)，血小板减少症(thrombocytopenia)(如例如由心肌梗死患者发展的)，包括自身免疫性血小板减少症(autoimmune thrombocytopenia)，自身免疫性睾丸和卵巢疾病(autoimmune disease ofthe testis and ovary)，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎(autoimune orchitis and oophoritis)，原发性甲状腺机能减退症(primary hypothyroidism)；自身免疫性内分泌病(autoimmuneendocrine diseases)，包括自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)，慢性甲状腺炎(chronic thyroiditis)(桥本甲状腺炎(Hashimoto′sThyroiditis))，亚急性甲状腺炎(subacute thyroiditis)，特发性甲状腺机能减退症(idiopathic hypothyroidism)，艾迪生病(Addison′s disease)，格雷夫斯病(Grave′s disease)，自身免疫性多腺体综合征(autoimmunepolyglandular syndromes)(或多腺体内分泌综合征(polyglandularendocrinopathy syndromes))，I型糖尿病，还称为胰岛素依赖性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，包括儿童IDDM，和希恩综合征(Sheehan′s syndrome)；自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis)，淋巴样间质性肺炎(Lymphoid interstitial pneumonitis，HIV)，相对NSIP的闭塞性细支气管炎(非移植性)(bronchiolitis obliterans(non-transplant)vsNSIP)，吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome)，贝格尔病(Berger′sDisease)(IgA 肾病)，原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)，口炎性腹泻(celiac sprue)(麸质性肠病(gluten enteropathy))，具有共分离疱疹样皮炎的难治的口炎性腹泻(refractory sprue with co-segregatedermatitis herpetiformis)，冷球蛋白血症(cryoglobulinemia)，肌萎缩性侧索硬化(amylotrophic lateral sclerosis)(ALS；卢·盖里格病(Lou Gehrig′sdisease))，冠状动脉病(coronary artery disease)，自身免疫性内耳病(autoimmune inner ear disease，AIED)，自身免疫性听力丧失(autoimmune hearing loss)，视性眼阵挛肌阵挛综合征(opsoclonusmyoclonus syndrome，OMS)，多软骨炎(polychondritis)如难治性多软骨炎(refractory polychondritis)，肺泡蛋白沉积症(pulmonary alveolarproteinosis)，淀粉样变性(amyloidosis)，巨细胞性肝炎(giant cellhepatitis)，巩膜炎(scleritis)，不确定/未知重要性的单克隆丙球蛋白病(monoclonal gammopathy of uncertain/unknown significance，MGUS)，周围神经病(peripheral neuropathy)，副肿瘤综合征(paraneoplasticsyndrome)，通道病变(channelopathies)如癫痫症(epilepsy)，偏头痛(migraine)，心律不齐(arrhythmia)，肌肉病症(muscular disorders)，耳聋(deafness)，失明(blindness)，周期性瘫痪(periodic paralysis)，和CNS通道病变(channelopathies of the CNS)；孤独症(autism)，炎症性肌病(inflammatory myopathy)，和局灶性节段性肾小球硬化症(focalsegmental glomerulosclerosis，FSGS)。

术语“特征在于自身免疫性脱髓鞘的疾病”和“脱髓鞘自身免疫病”可互换使用，并且是指至少部分由自身免疫反应引起的脱髓鞘疾病。脱髓鞘自身免疫病包括复发性或慢性进行性脱髓鞘疾病，诸如多发性硬化病(MS)及其变异，和单相脱髓鞘疾病，诸如视神经炎(optic neuritis)，急性播散性脑脊髓炎(acute disseminated encephalomyelitis)，和横贯性脊髓炎(transverse myelitis)。中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘自身免疫病包括，但不限于，MS和MS变异，诸如复发性缓和型MS(relapsing remitting MS，RRMS)以及原发性和继发性进行性形式，和进行性复发性形式的MS，脑脊髓炎，白质脑炎(leukoencephalitis)，横贯性脊髓炎，视神经脊髓炎(neuromyelitis optica)(德维克病(Devic’s disease))，和视神经炎(opticneuritis)。影响外周神经系统的脱髓鞘自身免疫病包括，例如，急性炎性脱髓鞘多神经病(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy，AIDP；吉兰-巴雷综合征)；慢性炎性脱髓鞘多神经病(chronic inflammatorydemyelinating polyneuropathy)；抗-MAG周围神经病(anti-MAGperipheral neuropathy)；和运动与感觉神经病(Motor and SensoryNeuropathy，HMSN)，还已知为遗传学感觉运动神经病(HereditarySensorimotor Neuropathy，HSMN)，或腓骨肌萎缩症(Peroneal MuscularAtrophy)，或进行性神经性腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth Disease)。

“治疗”指治疗性治疗和预防性或防止性措施二者。需要治疗的那些包括已经患有疾病的那些以及其中疾病有待预防的那些。因此，本文中待治疗的哺乳动物可以已被诊断患有所述病症或可能是倾向于或易于患有所述病症。例如，预防性治疗包括防止完全发展的临床形式，或更严重的疾病形式，诸如防止MS发展为复发性缓和型MS(RRMS)。治疗性治疗可以目的在于减缓疾病的进展，减少疾病发生(疾病发作(attacks))的频率，在发作后恢复功能，防止新的发作，并且防止或减缓与所述病症相关或由所述病症导致的无能力(disabilities)的发展。

术语“CLM-1激动剂”在本文中以最广泛意义应用，并且包括在体外、原位或体内部分或完全增强、刺激或激活一种或多种CLM-1生物学活性的任何分子。例如，所述激动剂因其与CLM-直接结合可以行使功能在体外、原位或体内部分或完全增强、刺激或激活一种或多种CLM-1生物学活性，与CLM-的直接结合引起受体活化或信号转导。所述激动剂还可以因为例如刺激另一种效应分子(其然后引起CLM-1活化或信号转导)而间接行使功能在体外、原位或体内部分或完全增强、刺激或激活一种或多种CLM-1生物学活性。此处的生物学活性是脱髓鞘疾病(诸如上文定义的脱髓鞘自身免疫病)的负调节。激动剂具体包括CLM-1配体和针对CLM-1的激动剂抗体。

用于治疗目的的“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、非人高等灵长动物、家畜和农场动物，和动物园动物、竞技动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，所述哺乳动物是人。

术语“治疗有效量”指有效治疗哺乳动物中疾病或病症的药物量。在本情形中，治疗有效量是有效治疗(包括预防)脱髓鞘疾病(如前文定义的脱髓鞘自身免疫疾病)的CLM-1激动剂的量。

″脂质体″是由用于将药物(如本文公开的抗-ErbB2抗体，和任选地化疗剂)递送到哺乳动物的各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小泡。脂质体的成分通常以双分子层结构排列，类似于生物膜的脂质排列。

术语“包装插页”用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的使用说明，其包含关于适应证、应用、剂量、施用、禁忌症和/或关于所述治疗性产品应用的警告的信息。

II.详述

多发性硬化病(MS)及其潜伏性等价的实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)特征在于血管周炎症和脱髓鞘。来源于循环的祖细胞的骨髓细胞是炎性渗出物的主要成分，并且认为组成负责细胞因子生产、脱髓鞘、轴突损伤和运动功能障碍的最终效应细胞。对怎样调节这些骨髓细胞的细胞毒性活性理解得很少。本发明至少部分是基于将Cmrf-样分子-1(CLM-1)鉴定为自身免疫性脱髓鞘的负调节剂。在用MOG肽免疫小鼠后，CLM-1表达在外周血中的炎性单核细胞上和在CNS脱髓鞘区域中存在的炎性树突细胞上。在CNS浸润性炎性树突细胞上缺乏CLM-1导致显著增加的一氧化氮和促炎性细胞因子产生，以及增加的轴突脱髓鞘和变差的临床得分，而T细胞应答保持不受影响。因此，本文将CLM-1鉴定为骨髓细胞活化和自身免疫性脱髓鞘的负调节剂。

骨髓细胞是自身免疫性脱髓鞘疾病中的主要效应细胞(Barnett等，Multiple Sclerosis(多发性硬化病)(Houndmills，Basingstoke，England)12，121-132，2006；Benveniste，Journal of Molecular Medicine(分子医学杂志)(Berlin，德国)75，165-173，1997)。CNS-浸润性骨髓群体由定居小胶质细胞、巨噬细胞、炎性树突细胞、类浆细胞树突细胞和常规的树突细胞组成。由于表达MHCII和CD86的骨髓树突细胞(DCs)重新激活抗原特异性T细胞的能力(Deshpande等，J Immunol(免疫学杂志)178，6695-6699，2007)和它们参与导致复发疾病的表位扩散(Miller等，Annals of the New YorkAcademy of Sciences(纽约科学院年刊)1103，179-191，2007)，它们已经受到特别的关注。除了作为抗原呈递细胞，炎性DCs通过分泌促炎性细胞因子和活性氧中间体而直接调节局部的细胞外环境，导致进行性的脱髓鞘和轴突损失。这些产生TNF和iNOS的树突细胞的前体细胞，还称为TipDCs(Serbina等，Immunity(免疫性)19，59-70，2003)，其是循环中存在的炎性单核细胞，并且被募集到CNS炎症区域。通过乙酸格拉默(glatiramer acetate，一种批准用于MS的药物)将炎性转化为II型抗炎症的单核细胞导致EAE严重性的逆转(Weber等，Nature Medicine(自然医学)13，935-943，2007)，这进一步强调这些骨髓细胞在调节疾病严重性中的重要作用。

先前已经鉴定了CNS浸润性骨髓细胞的其它负调节剂。例如，在定居小胶质细胞和浸润性骨髓细胞二者上表达的TREM-2在通过吞噬髓鞘质碎片消退CNS炎症方面起重要作用(Piccio等，European Journal ofImmunology(欧洲免疫学杂志)37，1290-1301，2007)(Takahashi等，PLoSMedicine(PLoS医学)4，e124，2007)(Takahashi等，The Journal ofExperimental Medicine(实验医学杂志)201，647-657，2005)。类似地，在骨髓细胞上的IFNAR下调CNS中的炎性反应(Prinz等，Immunity(免疫性)28，675-686，2008)。然而，没有一种受体对归巢于CNS的炎性骨髓来源的单核细胞是特异性的。

在寻找对于骨髓功能的负调节是重要的骨髓特异性细胞表面受体中鉴定了CLM-1(MAIR-V， LMIR-3，DigR2)。CLM-1是CMRF家族的一部分，CMRF家族是在人染色体17上的多基因簇，其小鼠直向同源物位于染色体11上。所有家族成员包含细胞外IgV结构域。在该簇中的两个家族成员(CLM-1和CLM-8)在细胞内结构域中包含ITIM序列，其余成员在跨膜区具有带电荷残基，其可以作为招募信号传导连接物。CLM-1(SEQID NO：1)，为人CD300f(SEQ ID NO：2)的鼠源直向同源物(Clark等，Trends in Immunology(免疫学趋势)30，209-217，2009)，最初描述为骨诱裂发生(osteoclastogenesis)的负调节剂(Chung等，J.Immunol(免疫学杂志)171，6541-6548，2003)。后续研究已经表明，CLM-1在Fc-受体介导的细胞反应中起抑制作用(Alvarez-Errico等，2004；Fujimoto等，2006)。迄今为止，还没有记述在自身免疫性疾病中的生物学作用。在本发明中，我们将CLM-1鉴定为通过抑制炎性细胞因子和活性氧类别的释放而作为CNS中炎性DCs活性的负调节剂。因此，本研究将CLM-1鉴定为CNS炎症和脱髓鞘的骨髓特异性负调节剂。

本发明涉及用CLM-1拮抗剂诊断和治疗脱髓鞘疾病的方法，所述脱髓鞘疾病如脱髓鞘自身免疫病。

在具体的实施方案中，CLM-1激动剂是针对CLM-1的激动剂抗体。

抗体

本发明的抗体包括抗-CLM-1抗体或CLM-1的抗原-结合片段，或本文所述的其他抗体。示例性的抗体包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、人源化的抗体、片段、多特异性抗体、杂缀合物(heteroconjugate)抗体、多价抗体、效应子功能抗体等。在本发明的特定实施方案中，所述抗体是激动剂抗体。

多克隆抗体

本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是专业技术人员已知的。例如，针对CLM-1的多克隆抗体在动物中通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生。将相关抗原与在待免疫的物种中是免疫原性的蛋白缀合可以是有用的，例如，使用双官能或衍生化试剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、或SOCl₂)，所述抗原可以缀合于匙孔

血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对CLM-1、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。典型地，将动物用相同抗原但是缀合到不同的蛋白和/或通过不同的交联剂缀合的缀合物加强。缀合物还可在重组细胞培养物中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。

单克隆抗体

单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，自然(Nature)256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠或猕猴)以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页，(学术出版社，1986))。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若母体骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型地将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT-缺陷细胞的生长。

典型的骨髓瘤细胞是那些有效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对针对培养基(如HAT培养基)敏感的细胞。这些中优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从美国加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤衍生的那些及可从美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞衍生的那些。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志(J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，第51-63页，(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987))。

对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基进行测定，测定针对CLM-1的单克隆抗体的生成。通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。这样的技术和测定在本领域中是已知的。单克隆抗体的结合亲和性可通过例如Munson和Pollard，Anal.Biochem.(生物化学年刊)107：220(1980)所述的斯卡查德分析(Scatchard analysis)来确定。

在鉴定到生成具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社，1986))。适于这一目的的适合培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析法、凝胶电泳、透析或亲和层析法，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分离。

单克隆抗体还可以通过重组DNA法(诸如在美国专利号4,816,567中所述的那些)制备。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针进行)。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体重组生成将在下文中更详细地描述。

在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等，自然(Nature)348：552-554(1990)所记载的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids.Res.)，21：2265-2266(1993))，生成高亲和性(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。

还可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定结构域编码序列置换同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽编码序列的全部或部分共价连接进行。

典型地，用所述非免疫球蛋白多肽置换抗体的恒定结构域，或者用它们置换抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

人源化的和人抗体

本发明的抗体可以包括人源化的抗体或人抗体。人源化的抗体具有由非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其典型的取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones等，自然(Nature)，321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)，239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于整个人可变结构域用来自非人物种的相应序列置换。在实践中，人源化抗体典型地是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类动物抗体中类似位点的残基置换的人抗体。

用于制备人源化抗体的人可变结构域(轻链和重链二者)的选择对于减少抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变结构域序列。接受与啮齿类动物的序列最接近的人序列作为用于人源化的抗体的人构架(FR)(Sims等，J.Immunol.(免疫学杂志)，151：2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)，89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)，151：2623(1993))。

更重要的是，抗体应该被人源化，同时保留针对抗原的高亲和性和其他有利的生物学特性。为了获得该目标，按照典型的方法，人源化的抗体通过使用母体和人源化序列的三维建模分析母体序列和各种概念上的人源化产物的方法制备。通常可获得三维免疫球蛋白模型并且其对于本领域技术人员是熟悉的。可获得这样的计算机程序，其举例说明并且展示选定的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。以这种方法，可以选择并组合来自接受体和输入序列的FR残基，从而实现需要的抗体特征，如关于靶抗原的增加的亲和性。一般地，CDR残基直接并且最实质地参与影响抗原结合。

备选地，现在可以产生转基因动物(例如小鼠)，其在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下，能够在免疫后产生人抗体的完整全集。例如，已经描述在嵌合的和种系突变体小鼠中纯合缺失抗体重链连接区(JH)基因导致完全抑制内源抗体产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变体小鼠中导致在抗原攻击后产生人抗体。见，例如，Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，90：2551(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)，362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.，7：33(1993)；和Duchosal等Nature(自然)355：258(1992)。人抗体还可以来源于噬菌体展示文库(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581-597(1991)；Vaughan等Nature Biotech(自然生物技术)14：309(1996))。

人抗体还可以使用本领域已知的各种技术产生，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)，222：581(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson，K S，和Chiswell，D J.，结构生物学的当前观点(Current Opinion in Structural Biology)3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。例如，Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。例如，通过基本上遵循Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供体构建V基因全集和可以分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。Cole等和Boerner等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体与癌症治疗)，Alan R.Liss，第77页(1985)和Boerer等，J.Immunol.(免疫学杂志)，147(1)：86-95(1991))。还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。

抗体片段

本发明还包括抗体片段。已经开发了用于生产抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，生物化学和生物物理方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992)和Brennan等，科学(Science)229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，抗体片段可以从上文讨论的抗体噬菌体文库分离。备选地，可直接从大肠杆菌(E.coli)回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab′).sub.2片段(Carter等，生物/技术(Bio/Technology)10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′).sub.2片段。用于产生抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生效应子蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见抗体改造(Antibody Engineering)，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“直链抗体”，例如如美国专利号5,641,870中所记载的。此类直链抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

多特异性(例如，双特异性)抗体

本发明的抗体还包括，例如，多特异性抗体，其具有针对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常将仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，BsAbs)，但是，当用在本文中时，这一表述涵盖具有额外的特异性的抗体，如三特异性抗体。

用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，自然(Nature)305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的方法披露于WO 93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)。

依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选的是，融合体具有包含至少部分铰链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入不同的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供需要的双特异性抗体的最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了更大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO 94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，酶学方法(Methods in Enzymology)121：210(1986)。

依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定结构域CH3结构域的至少一部分。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物(诸如同型二聚体)提高异二聚体产量的机制。

文献中还记载了由抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，科学(Science)229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以产生F(ab’)₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab′片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

还记载了从重组细胞培养物直接产生和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志(J.Immunol.)，148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同型二聚体。Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头与轻链可变结构域(V_L)相连的重链可变结构域(V.sub.H)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，免疫学杂志(J.Immunol.)，152：5368(1994)。

预期具有超过两种效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志(J.Immunol.)147：60(1991)。

异源偶联抗体

双特异性抗体包括交联的或“异源偶联”抗体，它们是本发明的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可以与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，已经提议将此类抗体用于将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373，和EP 03089)。异源偶联抗体可以使用任何便利的交联方法进行制备。合适的交联剂在本领域中是公知的，并且与多种交联技术一起公开在美国专利号4,676,980中。

多价抗体

本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合的抗原的细胞的内在化(和/或异化(catabolized))。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(其是IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含Fc区或铰链区(或由其组成)。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含三个至约八个但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(和优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(和优选四条)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且任选进一步包含CL结构域。

效应子功能工程改造

可能希望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，例如，从而增强抗体的治疗疾病的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同型二聚体抗体可具有改善的内在化能力。参见Caron等，J.Exp.Med(实验医学杂志)176：1191-1195(1992)和Shopes，B.免疫学杂志(J.Immunol.)148：2918-2922(1992)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利号5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG.sub.1，IgG.sub.2，IgG.sub.3，或IgG.sub.4)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。

其他抗体修饰

本发明考虑抗体的其他修饰。例如，抗体可以连接到多种非蛋白质性质的聚合物上，例如，连接到聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧烯烃、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物上。抗体还可以被截留在制备的微胶囊中，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合法(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)进行，截留在胶质药物递送系统中(例如，脂质体、清蛋白微胶囊、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊中)，或截留在粗乳液中。此类技术公布于雷明顿药物科学(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第16版，Oslo，A.，Ed.，(1980)。

脂质体和纳米颗粒

本发明的CLM-1抗体还可以配制为免疫脂质体。包含多肽的脂质体通过本领域已知的方法制备，所述方法诸如记述在Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，82：3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)，77：4030(1980)；和美国专利号4,485,045与4,544,545中。具有增加的循环时间的脂质体公布于美国专利号5,013,556中。通常，脂质体的配制和应用对于本领域的技术人员是已知的。

特别有用的脂质体可以通过反相蒸发法产生，具有包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组成。脂质体通过限定孔尺寸的滤器挤压，以产生具有期望直径的脂质体。本发明的多肽可以通过二硫键交换反应缀合到脂质体上，如在Martin等J.Biol.Chem.(生物化学杂志)257：286-288(1982)中所述(例如，抗体的Fab′片段)。纳米颗粒或纳米胶囊也可以用来截留本发明的多肽。在一个实施方案中，生物可降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯(polyalky-cyanoacrylate)纳米颗粒可以用于本发明的多肽。

本发明的进一步的详情通过下述非限制性实施例举例说明。本说明书中所有引用的公布通过引用明确结合于此。

实施例

材料与方法

动物所有的动物保持在无菌无病原体条件下，并且动物实验得到Genentech机构动物护理和应用委员会的批准。为了产生Clm-1敲除(KO)小鼠，将包含新霉素抗性基因(Neo^r)的线性化的靶向载体电穿孔到C57Bl/6来源的C2胚胎干(ES)细胞中。选择新霉素抗性ES克隆用于同源重组的Southern印迹分析(补充的附图)。将Clm-1外显子1成功被Neo^r基因替换的ES克隆注射到C57BL/6胚细胞中，并且随后转移到假孕雌性中以产生嵌合后代。嵌合体与C57BL/6小鼠杂交以产生杂合体。将具有靶向的等位基因的种系传递的杂合体与C57BL/6回交至少10代，之后异种杂交以产生Clm-1野生型(WT)和KO小鼠。C57BL/6(在CD45.1或CD45.2同基因型背景下)小鼠购自Jackson实验室。Cx3cr1^gfp/+C57BL/6报道子小鼠在Genentech公司的无病原体动物机构中繁殖和保持。所有动物在8-12周龄使用，例外的是CD45.1/CD45.2骨髓嵌合体实验，其中使用6周龄的C57BL/6(CD45.1)作为骨髓接受体。所有实验流程得到Genentech公司机构动物护理和应用委员会的批准。

抗体和重组蛋白下述抗体购自BD生物科学(BD Biosciences)：抗-FcγRIII/II(CD32/16，克隆2.4G2)；PE-，APC-，APC-Cy7-标记的抗-CD11b(M1/70)；生物素-，PE-，APC-标记的抗-CD11c(HL3)；PE-，APC-标记的抗-CD4(GK1.5)；APC-标记的抗-CD3(145-2C11)；PE-Cy7-标记的抗-B220(RA3-6B2)；PE-标记的抗-I-A/I-E(M5/114.15.2)；生物素-，PE-标记的抗-CD86(GL1)；APC-Cy7-标记的抗-Gr-1(RB6-8C5)；PE-标记的抗-CD45.1(A20)；生物素-，FITC-标记的抗-CD45.2(104)；Alexa Fluor 488-标记的抗-FoxP3(MF23)；PE-标记的抗-IL-17(TC11-18H10)；FITC-标记的抗-IFN□(XMG1.2)；FITC-，PE-标记的抗-TNFα(MP6-XT22)；生物素-，PE-，PerCP-Cy5.5-标记的抗-CD45(30-F11)；多克隆兔抗-iNOS II型抗体。下述抗体购自eBioscience：Pacific blue-标记的抗-CD11b(M1/70)；PE-Cy7-标记的抗-CD 11c(N418)；PE-Cy5-标记的抗-I-A/I-E(M5/114.15.2)；APC-AlexaFluor 750-标记的抗-F4/80(BM8)。链霉抗生物素蛋白Pacific Orange购自Invitrogen。PE-标记的驴抗-兔IgG和Cy3-标记的抗-仓鼠IgG购自JacksonImmunoResearch。单克隆抗-肌动蛋白抗体(AC-40)购自Sigma-Aldrich。为了产生鼠Clm-1-Fc融合蛋白，将鼠Clm-1的细胞外结构域(ECD)克隆到修饰的编码鼠IgG1Fc片段的pRK5表达载体中。将该表达载体转染到CHO细胞中，并且通过蛋白质A亲和层析以及随后的Superdex 200凝胶过滤纯化细胞培养物上清中包含的Clm-1-Fc融合蛋白。纯化的蛋白的性质通过质谱分析验证，内毒素水平为＜0.05 EU/mg。将鼠抗-gp120抗体(IgG1)用作对照。针对鼠Clm-1的ECD的单克隆抗体通过用鼠Clm-1-ECD-His融合蛋白免疫亚美尼亚仓鼠产生。将来自免疫动物的脾B细胞与骨髓瘤融合，以产生杂交瘤。基于与鼠Clm-1的反应性，通过ELISA，FACS，Western印迹和免疫组织化学分析选择阳性克隆。基于上述标准选择克隆3F6用于研究中。Alexa荧光染料(488或647)-缀合的Clm-1抗体使用Alexa

蛋白标记试剂盒(Invitrogen)产生。

EAE的活性诱导和临床评估小鼠用在200μl乳液(包含100μl PBS和100μl完全弗氏佐剂(CFA))中的200μg MOG_35-55肽皮下免疫。CFA通过将不完全弗氏佐剂(DIFCO实验室)与8mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(无活力且干的；DIFCO实验室)混合而制备。每只小鼠还在第0天和免疫后第2天腹膜内注射在100μlPBS中的200ng百日咳毒素(Calbiochem)。使用下述分级系统评估临床迹象：0，无异常；1，软弱无力的尾部或后肢虚弱；2，软弱无力的尾部和后肢虚弱；3，部分后肢麻痹；4，完全的后肢麻痹；5，垂死状态。对于Clm-1-Fc融合蛋白实验，在免疫的第0天开始，将小鼠用在100μl PBS中的200μgClm-1-Fc融合蛋白或用对照Fc蛋白(抗-gp120)每周皮下处理三次。数据报告为平均每日临床得分和平均值的标准误差(SEM)。

骨髓嵌合体将6周龄的C57BL/6(CD45.1)接受体小鼠每只用两剂量的500rad致死性辐照。通过用注射器和27号针头将骨骼用含有5％FBS的Hanks平衡的盐溶液(HBSS；Hyclone)冲洗，由C57BL/6(CD45.2)供体小鼠无菌收集来自大腿骨和胫骨的骨髓细胞。红细胞通过ACK裂解缓冲剂裂解。将细胞在HBSS/FBS中以400g洗涤5分钟，重悬，并且通过尼龙网(BD Falcon)以去除碎片。然后，将细胞用PBS洗涤两次，并且以10⁸个细胞/ml的浓度重悬。将辐照的接受体小鼠通过尾静脉注射2x 10⁷个细胞/200μl。将重构的小鼠保持在无病原体机构中8周，以允许与供体骨髓的完全植入。骨髓的完全重构通过对于淋巴和骨髓区室中的CD45.1和CD45.2同基因型标记的外周血的FACS分析进行验证。如上述，在重构的接受体小鼠中诱导EAE。

EAE的过继转移如关于活性EAE的诱导所述，将Clm-1WT或KO小鼠用MOG_35-55肽免疫，不同的是，小鼠不注射百日咳毒素。免疫后10-12天，收集引流(腹股沟和臂)淋巴结，并且通过70-μm细胞粗滤器捣碎而获得单细胞悬液。细胞在完全培养基(RPMI 1640，10％FBS，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，1mM丙酮酸钠，0.05mMβ-巯基乙醇，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素)中以5x10⁶个细胞/ml用20μg/ml MOG_35-55肽和20ng/ml重组鼠IL-2(R&D系统)重新刺激4天。接受体小鼠通过尾静脉注射10⁷个细胞。在同一天和两天后，接受体小鼠还将注射200ng百日咳毒素，如上所述。EAE疾病的临床评估如上述进行。

脊髓和淋巴结的FACS分析在EAE疾病最严重时(免疫后第14-15天)，将小鼠麻醉并且用含有10U/ml肝素的PBS经心脏灌流。脊髓切开并且用胶原酶D(2mg/ml；Roche Diagnostics(罗氏诊断))消化。通过将组织通过70-μm细胞粗滤器(BD生物科学)，然后Percoll梯度(80％/70％/60％/30％)离心而分离单核细胞。从30％/60％界面处收集细胞并洗涤。还如上所述从引流淋巴结(DLNs)分离细胞。在FACS染色缓冲液(PBS，0.5％牛血清清蛋白，2mM EDTA)中，将细胞用抗-Fc□RIII/II在4℃Fc封闭30分钟。洗涤后，将细胞用荧光缀合的mAbs在4℃染色30分钟。对于iNOS的细胞内染色，将细胞用针对Clm-1(3F6)，CD45，CD11b和CD11c的抗体染色，然后用在PBS溶液中的3％多聚甲醛在室温下固定20分钟。然后，将细胞重悬在100μl透化溶液(在PBS中的0.1％Triton-X)中。将细胞用在透化溶液中的1μg/ml兔抗-iNOS抗体在室温下染色15分钟，然后用PE-标记的驴抗-兔IgG在室温下染色15分钟。为了分析Treg细胞，将如上述分离自脊髓和DLNs的单细胞悬液用CD45和CD4染色，然后用Cytofix/Cytoperm固定/透化试剂盒(BD生物科学)按照供应商的使用说明进行FoxP3的细胞内染色。对于细胞因子的细胞内染色，将细胞在96孔圆底平板中以4x10⁵个细胞/200μl完全培养基在37℃用100μg/ml MOG_35-55肽刺激18-20小时。在刺激的最后4小时内，将细胞用GolgiPlug(BD生物科学)以1∶1000稀释处理。IL-17和IFN□的细胞内染色基本上按FoxP3染色进行。染色的细胞用FACSCaliber或LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。

通过Western印迹的Clm-1表达按所述产生骨髓来源的树突细胞(BMDCs)(Inaba等，The Journal of Experimental Medicine(实验医学杂志)176，1693-1702，1992)。在存在10ng/ml GM-CSF(R&D系统(R&DSystems))条件下，培养BMDCs，每三天更换培养基。第7天，通过FACS分析细胞。BMDC纯度为90-95％CD11c⁺，CD11b⁺。通过用标准方法用抗-Clm-1Ab(3F6)免疫印迹分析来自BMDCs的全细胞裂解物。

Clm-1表达的实时PCR分析如上述，在EAE的第0，7，14和21天，由小鼠分离脊髓和DLNs。使用RNeasy保护迷你试剂盒(RNeasy ProtectMini Kit)(QIAGEN)分离总RNA。使用高能力cDNA反转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit)(Applied Biosystems(应用生物系统))，用1μgRNA合成cDNA。分别使用TaqMan通用PCRMaster混合物和验证引物和探针组(Mm00467508_m1与Hs03003631_g1)(Applied Biosystems(应用生物系统))测量Clm-1mRNA和18s rRNA。

细胞因子和一氧化氮产生的测量如上述，在EAE第15天，从脊髓分离单核细胞。将单细胞悬液在96孔圆底平板中在37℃在有或无100μg/ml MOG_35-55肽的完全培养基中(5x10⁵个细胞/200μl)培养。36小时后收集培养物上清。通过Luminex使用Bio-Plex小鼠细胞因子23-plex组(Bio-Rad)测量细胞因子释放。一氧化氮产生使用Griess测定法(Promega)按照供应商的使用说明进行测量。

体外抗原特异性回忆反应如上述，在EAE第14天，由小鼠收集引流淋巴结。将单细胞悬液在96孔圆底平板中在37℃在有或无滴定量的MOG_35-55肽的完全培养基中(5x10⁵个细胞/200μl)重新刺激3天。然后，将细胞用0.5μCi/孔[³H]胸苷脉冲培养的最后6小时。通过用Topcount微量平板液闪计数器(Topcount Microplate Scintillation Counter)(PackardInstruments(Packard仪器))检测的[³H]胸苷摄入而确定增殖。备选地，在第3天收集上清用于细胞因子分析。通过ELISA (BD Biosciences(BD生物科学))进行细胞因子测量。

免疫组织化学在所示的免疫后天数，如上述，将小鼠麻醉，并用30ml PBS灌流，然后用10ml 4％多聚甲醛(PFA)灌流。通过切开取出脊髓并且在4％PFA中固定过夜，然后依次浸没在10％，20％，40％蔗糖溶液中。然后，将脊髓在干冰上冷冻在OCT中，并且在塑料袋中保存在-80℃，以防止脱水。切割七微米厚的横截切片并且封固在Superfrost Plus载玻片(Fisher Scientific)上。对于Clm-1和CD45.2共染色，将载玻片用仓鼠血清和生物素封闭试剂盒(Sigma)封闭。将组织用仓鼠抗-Clm-1(3F6)和生物素-缀合的抗-CD45.2染色，然后用Cy3-抗-仓鼠IgG和Alexa Fluor 488-链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)检测。对于Clm-1和CD11c共染色，载玻片首先用抗-Clm-1染色，然后用Cy3-抗-仓鼠IgG检测。然后，将载玻片用生物素-抗-CD11c(HL3)染色并用Alexa Fluor 488-链霉抗生物素蛋白检测。对于髓鞘质和CD11c共染色，载玻片首先用生物素-抗-CD11c染色，并用Alexa Fluor 594-链霉抗生物素蛋白(Invitrogen)检测。然后，髓鞘质用FluoroMyelin^TM绿色荧光髓鞘质染色试剂盒(Invitrogen)染色。切片用具有DAPI的延长金抗衰退介质(Prolong Gold antifade medium)(Invitrogen)盖片。检验载玻片，并且使用Olympus BX61荧光显微镜捕获图片。为了检测脱髓鞘的程度，将颈段和胸段脊髓切片用FluoroMyelin^TM绿色荧光髓鞘质染色试剂盒染色。通过手工描摹总横切面积和每个切片的脱髓鞘化面积估算脱髓鞘面积。总的脱髓鞘表示为总脊髓面积的百分数。

统计学分析假定方差不相等，通过双尾配对斯氏t检验，进行任意两组小鼠之间的EAE临床得分、脱髓鞘或其它细胞计数和细胞因子产生的比较。p值＜0.05被认为是显著性的。

结果和讨论

在CNS炎症部位，Clm-1在产生TNF和iNOD的CD11c+细胞上表达

Clm-1最先通过搜索编码单跨膜、含有免疫-酪氨酸抑制基序(ITIM)的Ig-超家族成员的基因组预测序列的生物信息学途径鉴定(Abbas等，Genes and Immunity(基因和免疫性)6，319-331，2005)。然后，基于在用髓鞘质少突细胞糖蛋白(MOG)肽免疫后在脊髓中表达水平的变化选择候选的含有ITIM的基因的小鼠同源物。与首次用于实验的()小鼠相比，在疾病最严重时Clm-1表达增加超过100倍(图1A，左侧图)。产生针对CLM-1细胞外结构域的单克隆抗体，以确定CLM-1的细胞来源。在首次用于实验的小鼠中，在局部小胶质细胞群体上不存在CLM-1(图1B)。在来自MOG-免疫的小鼠的脊髓中，CLM-1表达在CD11b/CD11c双阳性细胞上，具有高的MHC II类和CD86表达(图1C)。在疾病发作时，CLM-1CD11c双阳性细胞沿髓膜和血管分布(结果未显示)。在疾病最严重时，Clm-1+细胞成簇位于胸段和腰段脊髓的背角和腹角的白质中(图1D)。进一步的分析表明，Clm-1+细胞表达iNOS和TNF(图1E)，并且因此在表型上类似于Tip-DCs，Tip-DCs最初描述为有效的病原体消除所需要的骨髓细胞子集(Serbina等，Immunity(免疫性)19，59-70，2003)。在后续EAE研究中已经将TipDCs及其前体鉴定为对EAE的发病机理起作用的致病效应细胞(King等，Blood(血液)113，3190-3197，2009)。因此，在CNS中在炎性骨髓细胞上增加的CLM-1表达可能表明在EAE发病机理中的调节功能。

在自身免疫性脱髓鞘疾病过程中，CLM-1在迁移到CNS的循环Ly6+骨髓前体上表达

为了进一步确定CLM-1阳性细胞所来源的骨髓谱系，我们利用Cx3cr1+/gfp报道株，其在单核细胞和巨噬细胞/树突细胞谱系的细胞中表达绿色荧光蛋白(Geissmann等，Immunity(免疫性)19，71-82，2003)。在外周血中，在MOG免疫后，CLM-1在Cx3cr1^loLy6C^hiCD115⁺CD62L⁺Ly6G^-炎性单核细胞上表达，但是在首次用于实验的小鼠和经免疫的小鼠中，不存在于Cx3cr1^hiCD11c⁺普通DC前体上(图2A)(Auffray等，The Journal of Experimental Medicine(实验医学杂志)206，595-606，2009；Liu等，Science(科学)，324，392-397，2009)。为了进一步确定发炎的CNS中的CLM-1阳性细胞是否确实来源于辐照-敏感性的骨髓来源的细胞并且不来源于辐照-抗性的CNS小胶质细胞，将具有CD45.1异型的小鼠进行辐照，并用具有CD45.2异型的供体细胞重建。CLM-1表达不存在于辐照-抗性的小胶质细胞上，但是存在于归巢于CNS的骨髓来源的供体细胞上(图2B)。验证了这些结果，CLM-1不存在于首次用于实验的脊髓的Cxcr3^hi定居小胶质细胞上，但是在疾病最严重时，在Cx3cr1⁺CD11c⁺细胞的分群体上高度表达(图2C)。发现CLM-1⁺Cx3cr1^lo双阳性细胞邻近胸段和腰段脊髓以及正中隆起的背角和腹角的髓膜，但是保持不存在于位于脊髓背角和腹角的灰质中的定居小胶质细胞上(图2D)。综合这些，这些结果表明，CLM-1在CNS炎性损伤中的炎性单核细胞和骨髓来源的DCs上表达，但是不在循环的普通DC前体或CNS定居小胶质细胞上表达。

缺乏CLM-1导致MOG-诱导的EAE增加的疾病严重性

由于CLM-1在其细胞质结构域中包含两个ITIM和一个ITSM基序(Chung等，J Immunol(免疫学杂志)171，6541-6548，2003)并且能够在受迫过表达系统中在与激活受体交联后募集SHP-1(Izawa等，The Journal ofBiological Chemistry(生物化学杂志)282，17997-18008，2007)，所以我们确定CLM-1是否能够起作用抑制MOG-诱导的EAE中的炎性反应。通过同源重组，产生缺乏CLM-1外显子1的小鼠，其导致转录体和蛋白的缺乏(补充的图1)。CLM-1ko小鼠是存活的，并且以预测的孟德尔比率出生。在6、9和12周龄测量时，小鼠在体重或骨骼参数方面没有区别(结果未显示)。在CLM-1ko和wt小鼠中，在腹股沟(inguinual)淋巴结、脾和血液中的骨髓和淋巴细胞子集是相似的(结果未显示)。通过流式细胞术和Western印迹分析验证在ko小鼠中CLM-1基因的成功消除(图3A，左侧图)。在来自于CLM-1wt和ko小鼠的骨髓来源的DCs(BMDCs)上，与抗原呈递和共刺激相关的细胞表面分子的表达水平相似(图3A，右侧图)，CMRF簇中其他成员的表达水平也相似(结果未显示)。在CLM-1wt和ko小鼠中，在疾病最严重时，各种炎性细胞群体的树突细胞形态(图3B，左侧图)和数目(图3B，右侧图)是相似的。当MOG免疫时，CLM-1wt和ko小鼠都以相似的发病率患病。然而，在缺乏CLM-1的小鼠中，疾病的严重性显著增加(图3C)。为了确定该表型是否是由于推定的配体对CLM-1的结合，将小鼠用CLM-1可溶性对应体(CLM-1-Fc融合蛋白)处理。与在CLM-1ko小鼠中获得的结果一致，与用对照融合蛋白处理的小鼠相比，在CLM-1-Fc处理的小鼠中，疾病严重性显著增加，而疾病发病率保持相似(图3D)。因此，缺乏CLM-1受体功能导致增加的疾病严重性，这指出在CNS炎症中潜在的抑制性作用。

Clm-1不调节T细胞致敏

CLM-1的剪截变体，即Digr1，先前鉴定为T细胞反应的负调节剂(Shi等，Blood(血液)108，2678-2686，2006)。由于EAE可以通过抗原特异性T细胞致敏所诱导，我们进一步确定CLM-1是否影响T细胞反应。将来源于CLM-1wt和ko小鼠的脾cDCs或BMDCs用同种异基因T细胞或用表达对OVA肽特异性的TCR的T细胞温育。增殖(补充的图2)和细胞因子反应(结果未显示)不依赖于CLM-1状态。为了进一步确定CLM-1是否在体内影响T细胞致敏，将在MOG免疫后7天由外周淋巴结分离的T细胞分离并且用MOG肽重新刺激。CLM-1状态不影响外周淋巴结(PLN)细胞中的T细胞增殖、细胞因子反应或Foxp3调节性T细胞的产生(图4A和补充的图3a)。最后，为了巩固CLM-1在体内调节T细胞效应子功能的作用，将来自CLM-1wt和ko供体的T细胞分别过继转移到ko和wt接受体中。在T细胞供体中，疾病严重性不受CLM-1状况的影响，但是在缺乏CLM-1的T细胞接受体中显著增加(图4B)。这表明，在MOG免疫后，CLM-1在效应子阶段而不是在起始的T细胞致敏阶段起作用调节疾病严重性。

接着，我们验证CLM-1是否影响CNS浸润性CD4+T细胞的重新激活和炎性DCs的细胞毒性活性。在疾病最严重时由脊髓收集并且在存在抗原呈递细胞的条件下用MOG肽重新刺激的CNS白细胞表现出针对Th1，Th17和Foxp3Treg细胞的相似的极化和相似的T细胞特异性细胞因子反应(图5A和补充的图3b)。相反，与wt小鼠相比，由CLM-1ko小鼠的脊髓获得的白细胞产生显著升高水平的一氧化氮和骨髓特异性促炎性细胞因子(图5B)。因此，在MOG-诱导的EAE中，CLM-1负调节骨髓效应子功能而不影响T细胞反应。

我们接着确定用MOG肽免疫的CLM-1ko小鼠的增加的麻痹是否是由脊髓中骨髓细胞增加的活性所导致。发现CLM-1阳性细胞在颈段和胸段脊髓的背角中的脱髓鞘部位簇集。发现细胞与髓鞘质折叠相对并且通常包绕髓鞘质折叠(图6A)，在一些情形中，MOG-阳性的髓鞘质残余物存在于CLM-1阳性细胞内(结果未显示)。由于CLM-1是抑制性受体，并且浸润性骨髓细胞的程度在CLM-1wt和ko小鼠中是相似的，我们推理，CLM-1的缺乏可能导致每个细胞增加的激活和效应子活性，这导致增加的脱髓鞘作用。CLM-1的缺乏导致增加的脱髓鞘作用(图6B和C)，这表明在缺乏CLM-1的CD11c+细胞中增加的细胞毒性活性。因此，CLM-1负调节骨髓细胞激活，这在脊髓的轴突脱髓鞘中产生中断。

尽管在其细胞内结构域中包含ITIM序列的受体的数目稳定递增，但是，对于多种这些受体的生物学作用仍然了解很少。本研究首次将CLM-1鉴定为CNS浸润性炎性DCs上的抑制性受体。我们进一步表明，该受体的可溶性对应体可以加重疾病严重性，这表明细胞外结构域作为针对某种尚未鉴定的配体的诱饵受体。尽管推定的配体的鉴定将无疑增加我们对CLM-1生物学的理解，但是，本研究清楚地说明CLM-1在控制CNS中的骨髓细胞激活和脱髓鞘作用方面起着并非冗余的作用。

Claims (26)

1.一种用于治疗哺乳动物受试者中的脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的CLM-1激动剂。

2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物受试者是人。

3.权利要求2的方法，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

4.权利要求3的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病影响中枢神经系统(CNS)。

5.权利要求4的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病选自由下列组成的组：多发性硬化病(MS)，复发性减轻的MS(RRMS)，原发性和继发性进行性形式的MS，进行性复发形式的MS，脑脊髓炎，白质脑炎，横贯性脊髓炎，视神经脊髓炎(德维克病)，和视神经炎。

6.权利要求5的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病是MS。

7.权利要求3的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病影响外周神经系统。

8.权利要求7的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病选自由下列组成的组：急性炎性脱髓鞘多神经病(AIDP；吉兰-巴雷综合征)；慢性炎性脱髓鞘多神经病；抗-MAG外周神经病；以及运动和感觉神经病(HMSN)(还已知为遗传性感觉运动神经病(HSMN)，或腓骨肌萎缩症，或进行性神经性腓骨肌萎缩症)。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述CLM-1激动剂是激动剂抗-CLM-1抗体。

10.用于治疗脱髓鞘疾病的药物组合物，其包含与药用赋形剂混合的有效量的CLM-1激动剂。

11.权利要求11的药物组合物，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

12.权利要求11的药物组合物，其中所述脱髓鞘自身免疫病是多发性硬化病(MS)。

13.有效量的CLM-1激动剂在制备用于治疗脱髓鞘疾病的药物中的应用。

14.权利要求13的应用，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

15.权利要求11的应用，其中14所述脱髓鞘自身免疫病是多发性硬化病(MS)。

16.权利要求13-15中任一项的应用，其中所述CLM-1激动剂是激动剂抗-CLM-1抗体。

17.用于治疗脱髓鞘疾病的CLM-1激动剂。

18.权利要求17的CLM-1激动剂，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

19.权利要求18的CLM-1激动剂，其中所述脱髓鞘自身免疫病是MS。

20.权利要求17-19中任一项的CLM-1激动剂，其中所述CLM-1激动剂是激动剂抗-CLM-1抗体。

21.一种用于诊断脱髓鞘疾病的方法，所述方法包括检测CLM-1功能的缺陷。

22.权利要求21的方法，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

23.权利要求22的方法，其中所述脱髓鞘自身免疫病是MS。

24.一种用于治疗脱髓鞘疾病的试剂盒，其包括CLM-1激动剂和使用说明书。

25.权利要求24的试剂盒，其中所述脱髓鞘疾病是脱髓鞘自身免疫病。

26.权利要求25的试剂盒，其中所述脱髓鞘自身免疫病是MS。

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