KR20190111058A - TGF-β 디코이 수용체 - Google Patents

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KR20190111058A
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receptor
cells
decoy receptor
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KR1020197023524A
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존 코놀리
리차드 홉킨스
이지에 필버트 옹
스벤 한스 피터슨
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테사 테라퓨틱스 피티이. 엘티디.
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Abstract

TGF-β 결합 영역 및 지질 앵커 영역을 포함하는 TGF-β 디코이 수용체가 개시된다. 또한, TGF-β 결합 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)가 개시된다. 또한, TGF-β 디코이 수용체 및 CAR을 포함하는 조성물 및 이를 사용하는 방법이 개시된다.

Description

TGF-β 디코이 수용체
본 발명은 형질전환 생장 인자 β (TGF-β)의 디코이 수용체(decoy receptor)에 관한 것이다.
생체외 확장되거나 유전자 변형된 T 세포를 이용한 면역요법이 혈액학적 악성 종양의 치료에 큰 가능성을 보여왔다. 그러나, 전달된 T 세포의 장기 지속성은 활성화 상태 및 숙주 관련 인자와의 상호 작용에 의해 제한된다. 또한, 종양 미세환경의 억제 성질을 극복하는 것이 T 세포 면역요법에 대한 주요 도전 과제로 남아있다.
형질전환 생장 인자 β (TGF-β)는 이의 발현이 다양한 암에서 상향조절되는 면역억제성 사이토킨이다. TGF-β는 타입-1 및 타입-2 서브유닛으로 구성된 이종이량체 TGF-β 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. TGF-β 수용체를 통한 신호전달은 T 세포 증식, 생체내 지속성, 및 효과기 기능을 억제하는 것으로 나타났다.
발명의 요지
하나의 측면에서, 본 발명은 TGF-β 결합 영역 및 세포막 앵커 영역을 포함하거나 이것으로 이루어진 TGF-β 디코이 수용체를 제공한다. 몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 지질 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 지질 앵커는 GPI 앵커이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TGF-β 결합 영역 및 지질 앵커 영역(lipid anchor region)을 포함하거나 이것으로 이루어진 TGF-β 디코이 수용체를 제공한다.
TGF-β 디코이 수용체는, 임의로 링커를 통해, 세포막 앵커 영역에 공유 결합된 TGF-β 수용체의 세포외 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어진 융합 단백질일 수 있다.
몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 지질 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 지질 앵커는 GPI 앵커이다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 막관통 도메인이 없다.
몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 지질 앵커 신호 서열인 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 지질 앵커 신호 서열은 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 신호 서열이다.
몇몇 양태에서, TGF-β 결합 영역은 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 타입 II TGF-β 수용체 (TGF-βR2)이다.
몇몇 양태에서, TGF-β 결합 영역은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 CD48, CD44, CD55, CD90 또는 태반형 알칼리성 포스파타제 중의 하나의 GPI 신호 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 다음을 포함하거나 이것으로 이루어진다: (i) 서열 번호 15 내지 18 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (ii) GPI 앵커, 및 서열 번호 19 내지 22 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 다음을 포함하거나 이것으로 이루어진다: (i) 서열 번호 5 내지 8 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는 (ii) 서열 번호 11 내지 14 중의 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 GPI 앵커.
또 다른 측면에서, 본 발명은 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 TGF-β 결합 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다.
몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 타입 II TGF-β 수용체 (TGF-βR2)이다. 몇몇 양태에서, TGF-β 결합 영역은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계, 및 세포에 의한 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하여, TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 발현하는 세포를 생산하기 위한 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 세포를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 벡터, 또는 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트(adjuvant), 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
(b) 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 또는 벡터를 발현하거나 포함하도록 적어도 하나의 세포를 변형시키는 단계, 및;
(c) 대상체에게 변형된 적어도 하나의 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
(b) 적어도 하나의 세포 내로 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 도입함으로써 적어도 하나의 세포를 변형시키는 단계, 및;
(c) 대상체에게 변형된 적어도 하나의 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다양한 측면에 따르는 몇몇 양태에서 질환 또는 병태는 암이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 예비결정된 양의 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 포함하는 부품 의 키트(kit)를 제공한다.
설명
본 발명은 TGF-β에 결합하여 TGF-β 매개된 신호전달을 억제할 수 있는 TGF-β 디코이 수용체, 이러한 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 핵산 및 이를 발현하는 세포에 관한 것이다. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β를 위한 디코이 수용체로서 기능을 한다. 폴리펩타이드, 핵산 및 세포의 치료학적 용도가 또한 기술되어 있다.
TGF -β 및 TGF -β 매개된 신호전달
형질전환 생장 인자 β (TGF-β)는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3으로 명명된 세 가지 형태를 갖는 다기능성 사이토킨이다. TGF-β1 내지 3은 사이토킨의 TGF-β 수퍼패밀리 내에서 매우 유사한 단백질의 서브패밀리를 형성한다.
인간 TGF-β1 (NCBI 기준 서열: NP_000651.3)은 390개 아미노산 단백질인 반면 TGF-β2 (NCBI 기준 서열: NP_001129071.1)는 442개 아미노산 단백질이고, TGF-β3 (NCBI 기준 서열: NP_001316868.1)은 412개 아미노산을 함유한다. TGF-β1-3의 각각은 분비에 필요한 N-말단에 20-30개 아미노산 신호 펩타이드, 잠재성 연관 펩타이드 (LAP)라고 불리는 프로-영역, 및 프로-영역으로부터의 단백질분해 절단 후 성숙한 TGF-β 분자로 되는 112-114개 아미노산 C-말단 영역을 갖는다 (Khalil et al. 1999 Microbes Infect. 1 (15): 1255-63). 성숙한 단량체성 TGF-β는 이량체화되어 생물학적으로 활성인 25 KDa 단백질을 생산한다. TGF-β1 내지 3은 동일한 유형의 TGF-β와 동형이량체를 형성할 수 있거나, 또는 다른 유형의 TGF-β와 이형이량체 (예를 들어, TGF-β1:TGF-β2 이형이량체)를 형성할 수 있다. TGF-β는 9개의 보존된 시스테인 잔기를 포함하며, 그중 8개는 디설파이드 결합을 형성하여 TGF-β 수퍼패밀리를 특징지우는 시스테인 매듭 구조를 형성한다. 남은 시스테인은 다른 TGF-β 단량체의 시스테인과 상호작용하여 이량체를 형성한다. 5번째 및 6번째 보존된 시스테인 잔기 사이의 표면-노출 영역은 TGF-β1 내지 3 단백질 간에 가장 보존되지 않은 영역이며, TGF-β의 수용체 결합 및 특이성에 중요하다고 여겨진다.
본 명세서에서, "TGF-β"는 임의의 종으로부터의 TGF-β를 가리키며 임의의 종으로부터의 TGF-β의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 몇몇 양태에서, TGF-β는 인간 TGF-β, 영장류 TGF-β, 비-인간 영장류 TGF-β, 설치류 TGF-β, 뮤린 TGF-β, 또는 포유류 TGF-β이다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-β1 (TGF-β1), TGF-β2 (TGF-β2), 또는 TGF-β3 (TGF-β3)이다.
TGF-β는 TGF-β 수용체에 결합하고 TGF-β 수용체를 통해 신호전달을 활성화시킴을 통해 이의 기능적 결과를 발휘한다. TGF-β 결합 영역을 갖는 세포외 도메인, 단일 통과 막관통 도메인 및 세린/트레오닌 키나제 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 TGF-β 수용체. TGF-β 수용체에는 세 가지 주요 유형이 있다; TGF-βR1 (NCBI 기준 서열: NP_004603.1) TGF-βR2 (NCBI 기준 서열: NP_001020018.1) 및 TGF-βR3 (NCBI 기준 서열: NP_003234.2).
본 명세서에서 "TGF-β 수용체"는 임의의 종으로부터의 TGF-β 수용체를 가리키며 임의의 종으로부터의 TGF-β 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 인간 TGF-β 수용체, 영장류 TGF-β 수용체, 비-인간 영장류 TGF-β 수용체, 설치류 TGF-β 수용체, 뮤린 TGF-β 수용체, 또는 포유류 TGF-β 수용체이다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-β 수용체 1 (TGF-βR1), TGF-β 수용체 2 (TGF-βR2), 또는 TGF-β 수용체 3 (TGF-βR3)이다.
(33개 아미노산 신호 펩타이드를 포함한) 인간 TGF-βR1은 503개 아미노산 단백질이며, 성숙한 형태는 93개 아미노산 세포외 도메인, 21개 아미노산 막관통 도메인, 및 356개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 470개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 TGF-βR1의 TGF-β 결합 영역을 포함한다. 인간 TGF-βR1 (NCBI 기준 서열: NP_004603.1) 및 이의 도메인의 아미노산 서열이 아래에 나타내어져 있다:
인간 TGF-βR1 (NP_004603.1)
MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATA LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVELAAVIAGPVCFVCISLMLMVYICHNRTVIHHRVPNEEDPSLDRPFISEGTTLKDLIYDMTTSGSGSGLPLLVQRTIARTIVLQESIGKGRFGEVWRGKWRGEEVAVKIFSSREERSWFREAEIYQTVMLRHENILGFIAADNKDNGTWTQLWLVSDYHEHGSLFDYLNRYTVTVEGMIKLALSTASGLAHLHMEIVGTQGKPAIAHRDLKSKNILVKKNGTCCIADLGLAVRHDSATDTIDIAPNHRVGTKRYMAPEVLDDSINMKHFESFKRADIYAMGLVFWEIARRCSIGGIHEDYQLPYYDLVPSDPSVEEMRKVVCEQKLRPNIPNRWQSCEALRVMAKIMRECWYANGAARLTALRIKKTLSQLSQQEGIKM (서열 번호 1)
신호 펩타이드 (잔기 1-33); 세포외 도메인 (잔기 34-126); 막관통 도메인 (잔기 127-147); 세포내 도메인 (잔기 148-503).
(22개 아미노산 신호 펩타이드를 포함한) 인간 TGF-βR2는 592개 아미노산 단백질이며, 성숙한 형태는 169개 아미노산 세포외 도메인, 21개 아미노산 막관통 도메인, 및 380개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 570개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역을 포함한다 (Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8; pfam08917: ecTbetaR2). 인간 TGF-βR2 (NCBI 기준 서열: NP_001020018.1) 및 이의 도메인의 아미노산 서열이 아래에 나타내어져 있다:
인간 TGF-βR2 (NP_001020018.1)
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFP QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEE YNTSNPDLLLVIFQVTGISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK (서열 번호 2)
신호 펩타이드 (잔기 1-22); 세포외 도메인 (잔기 23-191); TGF-β결합영역 (잔기 74-177 ); 막관통 도메인 (잔기 192-212); 세포내 도메인 (잔기 213-592).
(18개 아미노산 신호 펩타이드를 포함한) 인간 TGF-βR3은 851개 아미노산 단백질이며, 성숙한 형태는 769개 아미노산 세포외 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인, 및 42개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 833개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 TGF-βR3의 TGF-β 결합 영역을 포함한다. 인간 TGF-βR3 (NCBI 기준 서열: NP_003234.2) 및 이의 도메인의 아미노산 서열이 아래에 나타내어져 있다:
인간 TGF-βR3 (NP_003234.2)
MTSHYVIAIFALMSSCLA TAGPEPGALCELSPVSASHPVQALMESFTVLSGCASRGTTGLPQEVHVLNLRTAGQGPGQLQREVTLHLNPISSVHIHHKSVVFLLNSPHPLVWHLKTERLATGVSRLFLVSEGSVVQFSSANFSLTAETEERNFPHGNEHLLNWARKEYGAVTSFTELKIARNIYIKVGEDQVFPPKCNIGKNFLSLNYLAEYLQPKAAEGCVMSSQPQNEEVHIIELITPNSNPYSAFQVDITIDIRPSQEDLEVVKNLILILKCKKSVNWVIKSFDVKGSLKIIAPNSIGFGKESERSMTMTKSIRDDIPSTQGNLVKWALDNGYSPITSYTMAPVANRFHLRLENNAEEMGDEEVHTIPPELRILLDPGALPALQNPPIRGGEGQNGGLPFPFPDISRRVWNEEGEDGLPRPKDPVIPSIQLFPGLREPEEVQGSVDIALSVKCDNEKMIVAVEKDSFQASGYSGMDVTLLDPTCKAKMNGTHFVLESPLNGCGTRPRWSALDGVVYYNSIVIQVPALGDSSGWPDGYEDLESGDNGFPGDMDEGDASLFTRPEIVVFNCSLQQVRNPSSFQEQPHGNITFNMELYNTDLFLVPSQGVFSVPENGHVYVEVSVTKAEQELGFAIQTCFISPYSNPDRMSHYTIIENICPKDESVKFYSPKRVHFPIPQADMDKKRFSFVFKPVFNTSLLFLQCELTLCTKMEKHPQKLPKCVPPDEACTSLDASIIWAMMQNKKTFTKPLAVIHHEAESKEKGPSMKEPNPISPPIFHGLDTLTVMGIAFAAFVIGALLTGALWYIYSHTGETAGRQQVPTSPPASENSSAAHSIGSTQSTPCSSSSTA (서열 번호 3)
신호 펩타이드 (잔기 1-18); 세포외 도메인 (잔기 19-787); 막관통 도메인 (잔기 788-809); 세포내 도메인 (잔기 810-851).
또 다른 TGF-β 결합 단백질이 기술되었다. 문헌[Onichtchouk et al. 1999, Nature 401(6752):480-485]은 세포외 도메인에서 TGF-β 계열의 타입 I 수용체와 밀접하게 관련되어 있지만 효소 활성이 없는 더 짧은 세포내 도메인을 갖는 막관통 당단백질인 BMP 및 활성화 막-결합 억제제 (BAMBI) 단백질을 기술한다. BAMBI는 TGF-βR1과 TGF-βR2 간의 상호작용을 차단함으로써 TGF-β 신호전달을 억제하는 것으로 나타났다. 문헌[Bollard et al. 2002, Blood 99(9): 3179-3187 and Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580]은 TGF-βR2의 세포외 도메인 및 막관통 영역을 포함하지만 신호전달에 필요한 세포질 도메인은 없는 우성 음성 TGF-βR2 (DN-TGF-βR2)를 발현하기 위한 항원-반응성 T 세포의 조작을 기술한다. 문헌[Penafuerte et al. 2011, J Immunol. 186(12):6933-6944]은 용액에서 활성 TGF-β를 포획하고 IL-2-반응성 림프상 세포와 상호작용하여 IL-2R 매개된 신호전달을 유도하는 디코이 수용체로서 작용하는, IL-2 및 TGF-βR2의 가용성 세포외 도메인의 키메라 융합 단백질을 기술한다. 문헌[Russo et al. 2009, Int J Biochem Cell Biol 41:472-476 and Zhang et al. 2013 (supra)]은 TGF-β 수용체의 세포외 TGF-β 결합 도메인을 포함하는 가용성 TGF-β 수용체 분자를 기술한다. 몇몇 경우에 가용성 TGF-β 수용체 분자는 또한 Fc 도메인을 포함한다.
TGF-β 매개된 신호전달은 배아발생 및 조직 항상성에 관여하고, 세포 증식, 분화, 세포 사멸, 부착, 침입 및 세포 미세환경의 조절을 통해 그 효과를 매개하며, 이것은 예를 들면 문헌[Meulmeester and ten Dijke 2011, J Pathol 223: 205-218]에 기술되어 있다.
활성 TGF-β 이량체는 TGF-β 타입 I 및 타입 II 수용체 (각각 TGF-βR1 및 TGF-βR2)를 통해 신호전달을 매개한다. TGF-βR2는 TGF-β를 이형체성 TGF-β:TGF-βR1:TGF-βR2 수용체 복합체로 모집하는 책임이 있으며, ~ 5 pM의 KD로 TGF-β1 및 TGF-β3에 결합하고, ~ 5 nM의 KD로 TGF-β3에 결합한다 (De Crescenzo et al. 2003, J Mol Biol. 328(5):1173-83). 막-고정된 TGF-βR3은 TGF-βR2에 대한 TGF-β 결합을 돕는다 (Lopez-Casillas et al., Cell 1993; 73:1435-1444). TGF-βR2에 대한 TGF-β의 고친화성 결합은 TGF-βR1과의 이형-사량체 복합체 형성을 유도하며, 이것이 차례로 TGF-βR2에 의한 TGF-βR1의 인산화를 초래한다.
대부분의 세포 유형에서는 TGF-βR1이 신호를 전달하는 반면, 특정 세포 유형에서는 ALK1 또는 다른 TGF-β 수퍼패밀리 타입 I 수용체가 신호전달 반응을 매개할 수 있다. TGF-βR1은 수용체-조절된 Smad 단백질의 모집 및 인산화에 의해 신호전달을 전파한다. 활성화된 Smad는 공통 Smad (co-Smad; 포유류에서 Smad4)와 복합체를 형성하고 핵으로 셔플링되고, 여기서 DNA-결합 전사 인자와 상호작용하여 표적 유전자의 전사를 조절한다. Smad-비의존적 신호전달은 또한 TRAF6-TAK1-p38/JNK 경로를 통해 발생할 수 있으며, TGF-βR1은 또한 티로신 및 세린 잔기 상의 Shc의 직접 인산화를 통해 Erk-MAP 키나제 신호전달을 활성화시킨다 (Lee et al., 2007 EMBO J 26: 3957-3967). TGF-wβR2는 또한 Par6의 직접 인산화에 의해 TGF-βR1과 관계없이 신호전달할 수 있다 (Ozdamar et al., Science; 307: 1603-1609).
본원에서 사용되는 바와 같이, 'TGF-β 매개된 신호전달'은 TGF-β 및/또는 TGF-β 수용체, TGF-β 및/또는 TGF-β 수용체의 단편, 및 TGF-β, TGF-β 수용체 및/또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 복합체에 의해 매개되는 신호전달을 가리킨다.
본 명세서에서 TGF-β 수용체는 TGF-β에 결합할 수 있는 폴리펩타이드를 가리킨다. TGF-β 수용체는 임의의 종으로부터의 것일 수 있으며 임의의 종으로부터의 TGF-β 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 바람직한 양태에서 종은 인간 (호모 사피엔스)이다. 몇몇 양태에서 TGF-β 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3일 수 있다. TGF-β 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 임의로 소정의 종, 예를 들어 인간으로부터의 TGF-β 수용체의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. TGF-β 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 임의로 (바람직하게는 동일한 종으로부터의) TGF-β에 결합하고 TGF-β 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다. TGF-β 수용체의 단편은 (아미노산의 수에 의한) 임의의 길이일 수 있지만, 임의로 성숙한 TGF-β 수용체의 길이의 적어도 25%일 수 있으며 성숙한 TGF-β 수용체의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중의 하나의 최대 길이를 갖는다. TGF-β 수용체의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700 또는 800개 아미노산 중의 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 문헌[Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8]의 정의에 의하면, 인간 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역은 서열 번호 2의 아미노산 74 내지 177에 상응한다 (pfam08917: ecTbetaR2). 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 임의로 소정의 종으로부터의 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-βR2의 세포외 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 인간 TGF-βR2의 세포외 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 23 내지 191에 상응한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 임의로 소정의 종으로부터의 TGF-βR2의 세포외 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-βR1의 세포외 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 인간 TGF-βR1의 세포외 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 34 내지 126에 상응한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 임의로 소정의 종으로부터의 TGF-βR1의 세포외 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-βR3의 세포외 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 인간 TGF-βR3의 세포외 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 19 내지 787에 상응한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 임의로 소정의 종으로부터의 TGF-βR3의 세포외 도메인의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β (예를 들어 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)는 포유류 (예를 들어 시노몰구스, 인간 및/또는 설치류 (예를 들어, 래트 및/또는 뮤린) TGF-β)이다. TGF-β의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 임의로 소정의 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 TGF-β의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. TGF-β의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체는 임의로 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3; 바람직하게는 동일한 종으로부터의 것)에 결합하고 TGF-β 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다. TGF-β의 단편은 (아미노산의 수에 의한) 임의의 길이일 수 있지만, 임의로 성숙한 TGF-β의 길이의 적어도 25%일 수 있으며 성숙한 TGF-β의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중의 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. TGF-β의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425 또는 440개 아미노산 중의 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
TGF -β 매개된 신호전달 및 질환
TGF-β/TGFβ 수용체 신호전달은 또한, 예를 들면, 문헌[Nacif and Shaker 2014, J Cancer Ther 5:735-747, Meulmeester and ten Dijke 2011, J Pathol 223: 205-218, and Akhurst and Hata 2012 Nat Rev Drug Discov. 11(10): 790-811]에 기술된 바와 같이 암에 연관된다.
TGF-β 신호전달 성분의 돌연변이가 다수의 암에서 관찰되었다; 예를 들면, 결장, 위, 담관, 폐, 난소, 식도, 및 두경부 암종에서 TGF-β 수용체 돌연변이는 미세위성 불안정성 (MSI)을 높게 나타내며, Smad4 돌연변이는 췌장암 및 위장 종양에서 관찰되었다. TGF-β는 예를 들어 세포 증식의 조절, 아폽토시스를 통해, 및 간접적으로 종양 간질을 통해 종양-억제 효과를 발휘한다.
TGF-β가 상피 세포 상에서 또는 종양형성의 조기 성장-민감 단계 동안 보호 또는 종양 억제 효과를 발휘하지만, 종양 발생 후기에는 암종 세포가 TGF-β-매개된 성장 억제에 내성이며, 악성 종양의 후기 단계 동안 종양 진행이 TGF-β 과부하에 의해 유도된다.
종양 미세환경에서 TGF-β는 혈관 및 면역 세포 및 섬유아세포에 대한 부-종양형성 효과(pro-tumorigenic effect)를 통해 종양 진행을 자극하여, 침입 및 전이를 촉진한다. 일단 종양 세포가 TGF-β의 성장 억제 효과를 약화시키는 유전적 및/또는 후생적 변화를 거치면, TGF-β1이 악성 진행 및 전이를 유도할 수 있다 (Connolly et al. 2012, Journal of Biological Sciences, 8, 964-978). 신경교종과 유방암 및 전립선암과 같은 다른 유형의 종양은 TGF-β 신호전달의 핵심 성분에 우선적이지는 않지만 돌연변이를 획득하고 TGF-β 신호전달을 이용하여 상피-간엽 전이 (EMT), 종양 침입, 전이성 보급, 및 면역계의 회피를 촉진시키는 경로를 유도하는 능력을 보유하는 것으로 보인다.
문헌[Torre-Amione et al. 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1486-1490]은 TGF-β가 뮤린 종양의 종양-유도된 CD8+ 세포용해 T-림프구 (CTL)-매개된 거부를 억제하는 능력을 보고하였으며, 흑색종 또는 림프종 세포주의 성장 및 전이는 모든 T-세포에서 TGF-βR2의 우성 음성 형태 (DN-TGF-βR2)를 발현하는 마우스에서 감소된다 (Gorelik et al. 2001 Nature Med 7:1118-1122). TGF-β는 퍼포린, 그랜자임 A, 그랜자임 B, FAS 리간드, 및 인터페론-γ와 같은 CTL에서 프로-아폽토시스 인자의 생산을 억제하는 것으로 나타났다 (Thomas et al. 2005 Cancer Cell 8: 369-380). 문헌[Bollard et al. 2002, Blood 99(9):3179-3187]은 DN-TGF-βR2를 발현하도록 조작된 EBV-특이 CTL이 TGF-β의 항-증식 및 항-세포독성 효과에 내성이 있으며, 항원 자극에 대한 반응으로 계속해서 사이토킨을 분비한다는 것을 보고하였다; 이러한 CTL은 선택적인 기능 및 생존 이점을 갖는다 (Bollard et al. 2002, Blood 99(9):3179-3187). 가용성 TGFβ-2R 또는 DN-TGF-βR2를 발현하도록 조작된 T 세포는 시험관내에서 TGF-β 유도된 Smad2 인산화에 내성이 있는 것으로 나타났으며, 항원-특이 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 DN-TGF-βR2의 발현은 흑색종 종양 모델에서 종양 치료 효율을 향상시키는 것으로 나타났다 (Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580)
TGF-β는 또한 자연 살해 (NK) 세포의 활성을 억제하는 것으로 나타났으며; 중화 항-TGF-β 항체를 사용한 TGF-β의 억제가 NK 세포 활성을 증가시키고, 따라서 접종된 유방 암종 세포주의 전이 형성의 억제를 초래하였다 (Arteaga et al. 1993, J Clin Invest 92: 2569-2576). TGF-β는 NKG2D 및 NKp30의 전사 억제를 통해 NK-매개된 세포독성 (및 항종양 활성)을 억제한다 (Castriconi et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 4120-4125; Kopp et al. 2009 Cancer Res 69:7775-7783).
TGF-β 매개된 신호전달은 또한 예를 들면 문헌[Nacif and Shaker 2014 (supra) and Akhurst and Hata 2012 (supra)]에 기술된 바와 같이 다른 질환/병태의 병리학에서 중요하다. TGF-β 신호전달은 섬유증을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 특발성 폐 섬유증 (IPF), 신장 섬유증, 심장 섬유증 (예를 들어, 심근 경색, 허혈성, 확장성 및 비대증성 심근병증 및 울혈성 심부전증과 관련된 섬유증), 경피증, 골수이형성 증후군 (MDS), 관상 동맥 우회술 또는 혈관 성형술 후 재협착증, 마르팡 증후군, 안 질환에서 수술후 반흔 (예를 들어, 녹내장 치료를 위한 섬유주 절제술 후, 또는 각막 수술 후), 당뇨병 및 비만의 병리학에 연관된다.
TGF -β 디코이 수용체
본 발명은 TGF-β 디코이 수용체를 제공한다. TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3)에 결합할 수 있는 펩타이드/폴리펩타이드 또는 이의 다수 (예를 들어, 비공유 복합체)이다. '수용체'란, 그 단편 및 유도체를 포함한다. 'TGF-β 디코이 수용체'는 사이토킨 수용체가 이의 리간드에 결합하는 방식으로 TGF-β에 결합할 수 있고 신호전달은 할 수 없는 펩타이드/폴리펩타이드 또는 이의 다수이다. 따라서, 디코이 수용체는 TGF-β에 결합하여 리간드가 신호전달-능력이 있는 TGF-β 수용체에 결합하는데 이용 가능하지 않도록 함으로써 TGF-β 매개된 신호전달의 억제제로서 작용한다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 단리된 형태로 제공될 수 있다.
TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β에 대해 특이적인 항체 또는 항체의 항원-결합 단편이 아니다. TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및/또는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열이 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 둘 이상의 아미노산 단량체의 쇄이다. 펩타이드는 전형적으로 약 2 내지 50개 아미노산 영역의 길이를 갖는다. "폴리펩타이드"는 둘 이상의 펩타이드의 중합체 쇄이다. 폴리펩타이드는 전형적으로 약 50개 이상의 아미노산의 길이를 갖는다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3)에 결합한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 인간 TGF-β (예를 들어, 인간 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3)에 결합한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 비인간 영장류 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3에 결합한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 뮤린 TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3에 결합한다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β:TGF-β 수용체 복합체와 같은 TGF-β 함유 분자/복합체에 결합한다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 예를 들어, TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)와 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)의 복합체에 결합할 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 및 TGF-β 함유 복합체에 결합할 수 있으며, 이에 의해 이들 종을 TGF-β 수용체 (예를 들어, 내인성 TGF-β 수용체)에의 결합에 이용할 수 없게 만든다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 신호전달 능력이 없다. TGF-β 디코이 수용체는 바람직하게는 TGF-β 수용체에 의한 신호 전달에 필요한 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체의 기능성 촉매 도메인을 암호화하는 아미노산 서열이 없으며; 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 기능적 세린/트레오닌 키나제 도메인을 암호화하는 아미노산 서열이 없을 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체에 의한 신호 전달에 필요한 인자들의 모집 또는 활성화에 필요한 아미노산 서열이 없다.
이와 같이, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는, 예를 들어, 문헌[Bollard et al. 2002, Blood 99(9): 3179-3187 and Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580]에 기술된 우성 음성 TGF-βR2 (즉, DN-TGF-βR2)가 TGF-β를 위한 디코이 수용체로서 작용하는 것과 거의 동일한 방식으로 TGF-β 및 TGF-β 함유 복합체에 대한 '미끼' 수용체로서 작용한다.
본원에서 사용되는 바와 같이 '우성 음성 TGF-βR2' 및 'DN-TGF-βR2'는 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역 및 TGF-βR2의 막관통 도메인을 포함하고, 기능성 키나제 도메인은 없는 종을 가리킨다.
본 발명의 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에 의한 TGF-β 매개된 신호전달은, 예를 들어, TGF-β로의 처리 후 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 세포에 의한 신호 전달의 수준과 비교하여 감소된다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 바람직하게는 하나 이상의 TGF-β 결합 도메인을 통해 TGF-β에 결합한다. TGF-β 결합 도메인은 TGF-β에 대한 자연 발생적 수용체 분자의 TGF-β 결합 도메인이거나 이로부터 유래되거나 상동성이다. 예를 들면, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3의 TGF-β 결합 도메인으로부터 유래되거나 상동성인 하나 이상의 TGF-β 결합 도메인을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
본원에 설명된 바와 같이, TGF-β 및 TGF-β를 함유하는 복합체는 세포의 표면 상에 발현된 TGF-β 수용체에의 결합을 통해 TGF-β 매개된 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 및 TGF-β 함유 종에 결합하여 이들 종이 세포막 결합된 TGF-β 수용체와 상호작용하는 능력을 억제함으로써 TGF-β 매개된 신호전달을 억제할 수 있다.
이것은 바람직하게는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3), 예를 들어, 내인성으로 발현된 TGF-β 수용체에 결합하기 위해 필요한 TGF-β의 영역에의 TGF-β 디코이 수용체의 결합을 통해 달성된다.
즉, TGF-β 디코이 수용체는 세포에 의해 발현된 기능적으로-능력이 있는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)에 결합하여 이를 통한 신호전달을 활성화시키는데 이용 가능한 TGF-β 및 TGF-β 함유 종의 양을 감소시킨다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3에 의해 결합된 TGF-β의 영역에서 TGF-β에 결합할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3에 의해 결합된 TGF-β의 영역과 동일한 TGF-β 영역 또는 중첩한 TGF-β 영역에서 TGF-β에 결합할 수 있다. TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3에 의해 결합된 영역과 동일한 영역 또는 중첩한 영역에서 TGF-β에 결합하는 능력은 경쟁 ELISA와 같은 경쟁적 결합 검정을 사용하여 분석될 수 있다. 이러한 검정에서, TGF-β 디코이 수용체의 부재하에서의 상호작용의 수준과 비교하여, TGF-β 디코이 수용체의 존재하에서 - 또는 TGF-β 디코이 수용체와 상호작용 파트너 중의 하나 또는 둘 다의 배양 후 - TGF-β 및 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3) 간의 상호작용의 수준의 축소/감소의 관찰은 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-β 수용체에 의해 결합된 영역과 동일한 TGF-β 영역 또는 중첩한 TGF-β 영역에 결합한다는 것을 나타낸다. 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3에 의해 결합된 영역과 동일한 또는 중첩한 TGF-β 영역에서 TGF-β에 결합하는지의 여부는 또한 수용체-리간드 복합체의 X-선 동시-결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이유발 맵핑, 질량 분광법에 의한 수소-중수소 교환 분석, 파지 디스플레이 및 단백질 가수분해-기반 '보호' 방법을 포함하는 당업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용한 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156]에 기술되어 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다. 본원에서, "TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열"은 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역의 아미노산 서열, 또는 TGF-β에 결합할 수 있고 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. TGF-β 수용체 및 TGF-β는 임의의 종으로부터의 것일 수 있으며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3이다. 몇몇 양태에서, TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3이다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역을 포함한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
소정의 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역은 숙련가에게 널리 공지된 일반적인 방법에 의해, 예를 들어, 공지된 TGF-β 결합 영역과의 비교에 의해, 및/또는 TGF-β에 결합하는 TGF-β 수용체의 펩타이드/폴리펩타이드 단편의 능력의 분석에 의해, 예를 들어, ELISA 검정에 의해 확인될 수 있다.
문헌[Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8]에 따르는 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역 (pfam08917: ecTbetaR2)은 서열 번호 2에 나타낸 인간 TGF-βR2 (NCBI 기준 서열: NP_001020018.1)의 위치 74 내지 177에 상응한다, 즉:
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEE (서열 번호 4)
숙련가는 통상적인 방법에 의해 인간 TGF-βR2의 소정의 동족체에 대한 TGF-β 결합 부위를 잘 확인할 수 있다.
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3의 TGF-β 결합 영역과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3의 TGF-β 결합 영역과 70% 이상, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR2의 TGF-β 결합 영역과 70% 이상, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 4와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 4와 70% 이상, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
아미노산 서열 간의 서열 동일성은 당업계의 숙련가에게 알려진 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 두 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 비교하고자 하는 서열을 정렬할 수 있으며 (예를 들어, 갭을 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입할 수 있음), 상응하는 위치의 아미노산을 비교할 수 있다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산에 의해 점유될 때, 서열은 그 위치에서 "동일성"을 갖는다. 두 서열 간의 동일성 퍼센트는 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려한 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열 동일성은 바람직하게는 비교되는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 결정된다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체의 TGF-β 결합 영역과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
도 1에 도시된 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR2로부터 유래된 영역을 포함하며, 이것은 TGF-β 결합 영역을 포함한다. 도 1의 TGF-β 디코이 수용체의 TGF-βR2-유래된 영역이 아래에 나타내어져 있다:
TGF-β 결합 영역을 포함하는 TGF-βR2-유래된 영역:
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP (서열 번호 9)
이의 잔기 1 내지 22는 TGF-βR2에 대한 신호 펩타이드를 나타내므로, 서열 번호 9의 성숙 서열은 다음과 같다:
TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP (서열 번호 10)
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 9 또는 10과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 9 또는 10과 70% 이상, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 세포막 앵커 영역을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, '세포막 앵커 영역'은 TGF-β 디코이 수용체를 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 세포막에 고정함을 제공하는 영역이다. '고정(Anchoring)'은 가역적이거나 비가역적일 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다. 몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 지질 모이어티를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
고정은 세포막 앵커 영역과 세포막 또는 이의 성분 (예를 들어, 인지질)과의 비공유 또는 공유 결합을 통해 직접적으로 달성될 수 있다. 몇몇 양태에서, 고정은 세포막 앵커 영역과 막-결합된 인자 또는 세포막에 편재된 인자 (예를 들어, 말초 또는 일체형 세포막-관련 단백질)와의 공유 또는 비공유 결합을 통해 간접적으로 달성될 수 있다.
세포막 앵커 영역은 영역과 세포막/이의 성분/인자의 공유 또는 비공유 결합을 통해 직접적으로 고정함을 제공할 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 수용체의 가공 (예를 들어, 번역후 변형)을 지시하여 세포막/이의 성분/인자와의 공유 또는 비공유 결합을 야기하는 신호 서열을 암호화함으로써 고정함을 제공할 수 있다. 예를 들면, 세포막 앵커 영역은 GPI 앵커를 부착하도록 수용체의 가공을 지시하는 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 신호 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
세포막 앵커 영역은 바람직하게는 막관통 도메인이 아니다. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 바람직하게는 막관통 도메인이 없다. 즉, TGF-β 디코이 수용체는 막관통 도메인을 암호화하는 아미노산 서열이 없다. 본원에서, '막관통 도메인'은 생물학적 막, 예를 들어, 세포막에서 열역학적으로 안정한 삼차원 구조를 형성하는 아미노산의 서열을 가리킨다. 막관통 도메인은 전형적으로, 예를 들어, 소수성 알파 나선 또는 베타 배럴로서 세포막의 지질 이중층을 스패닝할 수 있다. 막관통 도메인은 GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 자원 (Protein Information Resource), 단백질 데이터 은행 (Protein Data Bank), Ensembl, 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되고/되거나, 예를 들어, TMHMM과 같은 아미노산 서열 분석 도구를 사용하여 확인/예측될 수 있다 (Krogh et al., 2001 J Mol Biol 305: 567-580).
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체에 따르는 세포막 앵커 영역은 지질 앵커 영역일 수 있다. 몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 지질 앵커 (예를 들어, GPI 앵커)를 포함하거나 이것으로 이루어진다. 몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 지질 앵커 신호 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, '지질 앵커'는 생물학적 막 (예를 들어, 세포막)의 지질 성분과 (예를 들어, 공유적으로) 결합할 수 있는 모이어티를 가리킨다. 이러한 결합을 통해, 지질 앵커가 부착된 단백질이 세포막에 '고정'된다. 지질 앵커의 예는 이소프레닐, 미리스토일, 팔미토일, 지방 아실, 디아실글리세롤, 스테로일, 인지질 및 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 포함한다.
몇몇 양태에서, 지질 앵커 영역은 지질 앵커 신호 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다. 본원에서, '지질 앵커 신호 서열'은 지질 앵커를 부착하도록 단백질의 가공을 지시하는 아미노산 서열을 가리킨다. 이러한 가공 후 TGF-β 디코이 수용체는 지질 앵커를 포함한다.
지질 앵커는 전형적으로 친유성 그룹을 포함한다. 지질 앵커, 이의 친유성 그룹 및 지질 앵커를 부착하기 위한 단백질의 변형은, 예를 들면, 문헌[Resh 2013, Curr Biol. 23(10): R431-R435]에 기술되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
지질 앵커는 이소프레닐, 미리스토일, 팔미토일, 지방 아실, 디아실글리세롤, 스테로일, 또는 인지질 그룹, 또는 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
이소프레닐 그룹은 티오에테르 결합을 통해, C-말단에서 단백질의 시스테인 잔기에 부착된 15개 (파네실) 또는 20개 (게라닐게라닐) 탄소원자를 포함할 수 있다. 시스테인의 카복실 그룹은 또한 메틸화될 수 있다. 이소프레닐 (예를 들어, 파네실 또는 게라닐게라닐) 그룹이 공유적으로 부착된 단백질을 프레닐화 단백질이라고 할 수 있다.
미리스토일 그룹은 아미드 결합을 통해 글리신 잔기에 부착될 수 있는, 14개 탄소, 포화된 지방 아실 그룹이다. 미리스톨 그룹이 공유적으로 부착된 단백질을 미리스토일화 단백질이라고 할 수 있다.
팔미토일 그룹은 티오에테르 결합을 통해 단백질의 시스테인 또는 잔기에 부착될 수 있거나, 에스테르 결합을 통해 세린 또는 트레오닌 잔기에 부착될 수 있는 16개 탄소, 포화된 지방 아실 그룹이다. 팔미토일 그룹이 공유적으로 부착된 단백질을 팔미토일화 단백질이라고 할 수 있다.
지방 아실 및 1,2-디아실글리세릴 그룹이 각각 아미드 및 티오에테르 결합을 통해 단백질의 시스테인 잔기에 부착될 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 GPI-고정된, 프레닐화된, 미리스토일화된, 팔미토일화된, 지방 아실화된, 디아실글리세릴화된, 스테아로일화된 또는 인지질화된 단백질일 수 있다.
몇몇 양태에서, 지질 앵커 신호 서열은 이소프레닐, 미리스토일, 팔미토일, 지방 아실, 디아실글리세롤, 스테아로일, 또는 인지질 그룹, 또는 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 수용체에 부착시키기 위한 TGF-β 디코이 수용체의 변형을 제공할 수 있다. 지질 앵커 신호 서열에 의해 지시된 TGF-β 디코이 수용체를 가공한 후 수용체는 지질 또는 지질-함유 모이어티를 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, '지질 앵커 신호 서열'은 GPI 앵커 신호 서열이다. 따라서, 몇몇 양태에서 본 발명의 지질 앵커는 GPI 앵커이다.
'GPI 신호 서열'은 단백질에 GPI 앵커를 부착하도록 단백질의 변형을 지시하는 아미노산 서열이다. GPI 신호 서열은 단백질의 C 말단에 GPI 앵커의 공유적 부착을 위한 단백질의 번역후 변형을 지시한다. GPI 앵커 및 단백질에의 이의 부착은, 예를 들면, 문헌[Vidal C.J. (Ed.) Protein Reviews 13, Springer Science 2011, at Chapter 2 entitled "GPI-Anchored Proteins in Health and Disease"]에 기술되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본원에서, 'GPI 앵커'는 포스포에탄올아민에 차례로 부착되는 사당류 글리칸 코어에 글리코시드 결합을 통해 연결된 포스파티딜이노시톨 그룹을 포함하는 모이어티를 가리킨다.
사당류 글리칸 코어는 트리만노실-비아세틸화 글루코사민 (Man3-GlcN) 코어일 수 있다. 포스파티딜이노시톨 그룹의 지질 꼬리는, 예를 들어, 아실 또는 알킬 지방산, 또는 세라미드일 수 있다.
GPI 앵커는 코어 글리칸: -6만노스(α1-2)만노스(α 1-6)만노스(α1-4)글루코사민(α1-6)myo-이노시톨에 대한 포스포에탄올아민 브릿지를 통해 단백질의 C-말단에서 알파-카복시 그룹에 공유 결합될 수 있으며, 이것은 차례로 이노시톨 환을 통해 포스포디에스테르 브릿지에 의해 지질 모이어티에 연결된다. 지질 모이어티는 달라질 수 있지만, 대부분의 포유 동물에서 이것은 1-알킬-2-아실글리세롤이다. 코어 글리칸은 에탄올아민 및 당 측쇄의 부가에 의해 변형될 수 있고, 이노시톨 환은 지질 그룹으로 변형될 수 있으며, 지방산은 또한 재형성될 수 있다.
단백질에 대한 GPI 앵커의 부가를 지시하는 GPI 신호 서열은 아미노산 쇄의 C-말단에 놓여있다. 서열은 전형적으로 C-말단에 소수성 잔기의 분지를 갖는 15-25개 아미노산 잔기를 포함한다. C-말단 소수성 서열은 GPI 앵커 부가를 지시하는 컨센서스 서열에 의해 선행된다: ω, ω+1 및 ω+2, 여기서 ω = 작은 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, Ala, Asn, Asp, Cys, Gly 또는 Ser), ω+1 = Pro 또는 Trp를 제외한 임의의 잔기, 여기서 ω+2 = Gly 또는 Ala (또는 종종 Ser 또는 Thr).
예비조립된 GPI 앵커는 ω 및 ω+1 잔기 사이의 폴리펩타이드의 절단 후 트랜스아미다제 효소에 의해 ER에서 ω 잔기의 C-말단 측에 부착된다. 트랜스아미다제는 촉매 성분 Gpi8P, 및 다른 성분 Gaa1p, Gpi16p (PIG-T) 및 Gpi17p (PIG-S)를 포함하는 다중단백질 복합체이다 (Fraering et al. 2001 Molecular Biology of the Cell, 12, 3295-3306).
GPI 앵커의 부착 후, GPI 고정된 단백질은 ω 잔기에 대한 아미노산 C-말단의 서열이 없다. 예를 들어, 빅-PI 예측 서버를 포함한 GPI 변형 부위에 대한 예측 도구가 이용 가능하다 (Eisenhaber et al. Protein Engineering (1998) 11, No.12, 1155-1161; Sunyaev et al. Protein Engineering (1999) 12, No.5, 387-394; Eisenhaber et al. JMB (1999) 292 (3), 741-758; and Eisenhaber et al. TIBS (2000) 25 (7), 340-341). 이러한 도구는 ω 잔기를 확인하는데 사용될 수 있다.
도 1에는, 다른 GPI 신호 서열에 대한 빅-PI 예측 서버를 사용하여 예측된 바와 같은 ω 잔기가 나타내어져 있다. 도 2는 GPI 앵커를 부착하기 위한 도 1에 도시된 아미노산 서열의 가공 후 성숙한 GPI-고정된 단백질의 구조를 보여준다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는, 예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전에 GPI 신호 서열을 포함한다. GPI 신호 서열은 GPI 앵커를 부착하기 위한 전이후 가공(post-transitional processing)을 지시할 수 있는 임의의 서열이다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는, 예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 후 ω 잔기까지 그리고 ω 잔기를 포함해서 GPI 신호 서열을 포함한다.
GPI 신호 서열 및 이의 ω 잔기는 다수의 GPI-고정된 단백질에 대해 알려져 있으며, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 자원, 단백질 데이터 은행, Ensembl, 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되고/되거나, 예를 들어, 빅-PI 예측 서버 (상기)와 같은 아미노산 서열 분석 도구를 사용하여 확인/예측될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 GPI 신호 서열을 포함하거나 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전), 또는 GPI-고정된 단백질의 GPI 신호 서열에 상응하는 ω 잔기까지 그리고 ω 잔기를 포함해서 GPI 신호 서열을 포함한다 (GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 후). 몇몇 양태에서, GPI-고정된 단백질은 다음 중의 하나이다: 귀소 세포 접착 분자 (HCAM; CD44) 신경 세포 접착 분자 (NCAM; CD56), 5'뉴클레오티다제 (CD73), 붕괴 촉진 인자 (DAF; CD55), CD90 (Thy1), 아세틸콜린에스테라제 (AchE), 장 알칼리성 포스파타제, 태반 알칼리성 포스파타제, MAC-억제 단백질 (CD59), CD14, CD16, CD24, CD28, CD48, CDw52, CD58, CD66a, CD66c, CD66d, CD66E, CD67, CD87, CD108, CD157, 아세틸콜린에스테라제 (AchE), 우로키나제 타입 플라스미노겐 활성화 수용체 (uPAR), JMH 단백질, GDNFR, CNTFR, TAG-1, PrP, 글리피칸 단백질, 세마포린 7, CEA, GFR, Ly6G, 트랜스페린 수용체, 콘택틴 (F3) 및 T-카데린. 단백질은 임의의 종으로부터의 것일 수 있으며, 임의의 종으로부터의 이소형, 단편, 변이체 또는 동족체를 포함한다.
몇몇 양태에서, GPI-고정된 단백질은 CD48 (BLAST-1), CD44 (HCAM), CD55 (DAF), 태반 알칼리성 포스파타제 및 CD90 (Thy1) 중의 하나이다.
본원에서, '기준 GPI 신호 서열에 상응하는 GPI 신호 서열'은 서열을 포함하는 단백질에 대한 GPI 앵커의 부착을 지시할 수 있고 기준 GPI 신호 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열이다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 GPI 신호 서열을 포함하거나 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전), 또는 서열 번호 15 내지 18 중의 하나의 GPI 신호 서열에 상응하는 ω 잔기까지 그리고 ω 잔기를 포함해서 GPI 신호 서열을 포함한다 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 후) (ω 잔기는 밑줄그어져 있다):
CD48 GPI:
DVCSPPCTLARSFGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT (서열 번호 15)
GPI를 부착하기 위한 가공 후의 서열:
DVCSPPCTLARS (서열 번호 19)
CD55 GPI:
HETTPNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT (서열 번호 16)
GPI를 부착하기 위한 가공 후의 서열:
HETTPNKGSGTTS (서열 번호 20)
PLAC ALKPHOS GPI:
TACDLAPPAGTTDAAHPGPSVVPALLPLLAGTLLLLGTATAP (서열 번호 17)
GPI를 부착하기 위한 가공 후의 서열:
TACDLAPPAGTTD (서열 번호 21)
CD90 GPI:
NVTVLRDKLVKCEGISLLAQNTSWLLLLLLSLSLLQATDFMSL (서열 번호 18)
GPI를 부착하기 위한 가공 후의 서열:
NVTVLRDKLVKC (서열 번호 22)
서열 번호 15의 CD48-유래된 서열은 서열 번호 15의 위치 4 내지 35에 상응한다. 서열 번호 19의 CD48-유래된 서열은 서열 번호 19의 위치 4 내지 12에 상응한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 15 내지 18 중의 하나, 또는 서열 번호 15의 위치 4 내지 35와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 GPI 신호 서열을 포함한다 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전).
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 19 내지 22 중의 하나 또는 서열 번호 19의 위치 4 내지 12와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 GPI 앵커를 포함한다 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 후).
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 도 1 또는 2에 도시된 바와 같은 구조를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있다.
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 9 또는 10과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TGF-β 결합 영역; 및 서열 번호 15 내지 18 중의 하나, 또는 서열 번호 15의 위치 4 내지 35와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 GPI 신호 서열 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전)을 포함한다.
몇몇 양태에서 TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 9 또는 10과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및 서열 번호 19 내지 22 중의 하나 또는 서열 번호 19의 위치 4 내지 12와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 TGF-β 결합 영역 및 GPI 앵커 (예를 들어, GPI 앵커를 부차하기 위한 가공 후)를 포함한다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 결합 영역, 및 GPI 신호 서열을 포함하고, 서열 번호 5 내지 8 중의 하나와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 (예를 들어, GPI 앵커를 부착하기 위한 가공 전)을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 결합 영역 및 GPI 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어지고, 서열 번호 11 내지 14 중의 하나와 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
GPI 고정된 단백질은 세포외 공간 (즉, 선단 표면)에서 ω 잔기에 대한 아미노산 서열 N-말단을 갖는 세포막에 배향된다. 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체에는 GPI 신호 서열에 대한 TGF-β 결합 영역 N-말단이 제공된다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 리더 서열 (신호 펩타이드 또는 신호 서열이라고도 알려져 있음)을 포함할 수 있다. 리더 서열은 정상적으로 단일 알파 나선을 형성하는 5-30개 소수성 아미노산의 서열로 구성된다. 분비된 단백질 및 세포 표면에서 발현된 단백질은 종종 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 TGF-β 디코이 수용체의 N-말단에 존재할 수 있으며, 새로 합성된 수용체 (예를 들어, 리더 서열을 제거하기 위해 가공하기 전에)에 존재할 수 있다. 리더 서열은 TGF-β 디코이 수용체의 효율적인 세포내 트래피킹(trafficking)을 제공한다. 리더 서열은 종종 절단에 의해 제거되며, 따라서 성숙한 TGF-β 디코이 수용체에 포함되지 않는다.
리더 서열은 다수의 단백질에 대해 알려져 있으며, GenBank, UniProt, Swiss-Prot, TrEMBL, 단백질 정보 자원, 단백질 데이터 은행, Ensembl, 및 InterPro와 같은 데이터베이스에 기록되고/되거나, 예를 들어, SignalP (Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786) 또는 Signal-BLAST (Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)와 같은 아미노산 서열 분석 도구를 사용하여 확인/예측될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체의 리더 서열은 서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 80%, 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다:
TGF-βR2 리더 서열:
MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS (서열 번호 23)
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 결합 영역과 지질 앵커 영역 사이에 하나 이상의 링커를 포함할 수 있다. 링커는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있으며, TGF-β 결합 영역과 지질 앵커 영역의 아미노산 서열의 말단에 (예를 들어, 펩타이드 결합에 의해) 공유적으로 결합될 수 있다.
링커는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 링커일 수 있다. 링커는 가요성 링커일 수 있다. 가요성 링커의 아미노산 서열은 숙련가에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369]에 기술되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함되어 있다. 몇몇 양태에서 가요성 링커 서열은 세린 및 글리신 잔기를 포함한다. 몇몇 양태에서 링커는 1-100개, 1-50개, 1-20개, 1-10개 또는 1-5개 아미노산 잔기의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드/폴리펩타이드이다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 자연-발생 TGF-β 결합 분자, 예를 들어, TGF-β에 대한 자연 발생 수용체와는 다르다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 또한 DN-TGF-βR2와는 다르며; DN-TGF-βR2는 TGF-βR2의 막관통 도메인을 포함하는 반면 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 막관통 도메인이 없다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 또한 세포막 앵커 영역이 없는 선행 기술에 개시된 가용성 TGF-βR2 종과는 다르다. 이와 달리, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 지질 앵커 영역과 같은 세포막 앵커 영역을 포함한다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)의 막관통 및/또는 세포내 도메인에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
본원에서, 소정의 펩타이드/폴리펩타이드의 기준 영역 또는 서열에 '상응하는' 아미노산 서열은 기준 영역/서열의 아미노산 서열과 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중의 하나의 서열 동일성을 갖는다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 1의 잔기 127-147에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 2의 잔기 192-212에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 3의 잔기 788-809에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 1의 잔기 127-147에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 2의 잔기 192-212에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 3의 잔기 788-809에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 1의 잔기 148-503에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 2의 잔기 213-592에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 3의 잔기 810-851에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 1의 잔기 127-503에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 2의 잔기 192-592에 상응하는 아미노산 서열이 없다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 서열 번호 3의 잔기 788-851에 상응하는 아미노산 서열이 없다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 추가의 기능성 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 디코이 수용체의 발현, 접힘, 트래피킹, 가공, 정제 또는 검출을 촉진시키기 위한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는, 임의로 N- 또는 C- 말단에서, 단백질 태그, 예를 들어, FLAG, His, (예를 들어, 6XHis), Myc, GST, MBP, HA, E, 또는 비오틴 태그를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 검출 가능하게 표지될 수 있거나, 적어도, 검출될 수 있다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 방사성 원자 또는 착색된 분자 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방식으로 용이하게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출 가능한 분자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질, 방사성 표지 및 결합 잔기를 포함한다. 표지화는 TGF-β 디코이 수용체와의 접합에 의해 이루어질 수 있다. TGF-β 디코이 수용체는 검출 가능한 표지로 직접 표지될 수 있거나 간접적으로 표지될 수 있다. 몇몇 양태에서, 표지는 방사성 뉴클레오티드, 양전자-방출 방사성 핵종 (예를 들면, 양전자 방사 단층촬영 (PET)의 경우), MRI 조영제 또는 형광 표지로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 약물 모이어티, 예를 들어, 세포독성 소분자에 접합될 수 있다. 이러한 접합체는 항원 분자를 발현하는 세포의 표적화된 사멸에 유용하다.
키메라 항원 수용체
본 발명은 또한 키메라 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. CAR은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 결합 영역을 포함한다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 둘 다를 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 조작은, 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1)]에 검토되어 있다.
CAR은 세포막 앵커 영역 및 신호전달 영역에 연결된 항원-결합 영역을 포함한다. 임의의 힌지 영역이 항원-결합 영역과 세포막 앵커 영역 사이의 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다.
CAR의 항원-결합 영역은 CAR이 표적으로 하는 항원, 또는 표적에 결합할 수 있는 다른 제제에 특이적인 항체의 항원-결합 영역에 기초할 수 있다. 예를 들면, CAR의 항원-결합 도메인은 상보성-결정 영역 (CDR)에 대한 아미노산 서열 또는 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체의 완전 경쇄 및 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 포함할 수 있다. CAR의 항원-결합 도메인은 리간드:수용체 결합과 같은 다른 단백질:단백질 상호작용에 기초하여 항원을 표적화할 수 있으며; 예를 들면 IL-13Rα2-표적화된 CAR은 IL-13에 기초한 항원-결합 도메인을 사용하여 개발되었다 (예를 들어, 문헌[Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64(24): 9160-9166] 참조).
몇몇 양태에서, 본 발명의 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 결합 영역을 포함한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 결합 영역은 TGF-β 수용체, 예를 들어, 타입 II TGF-β 수용체 (TGF-βR2)의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
세포막 앵커 영역은 CAR의 항원-결합 영역과 신호전달 영역 사이에 제공된다. 세포막 앵커 영역은 CAR을 발현하는 세포의 세포막에 CAR을 고정시키기 위해 세포외 공간에 항원-결합 영역을 제공하고 세포 내부에 신호전달 영역을 제공한다. CD3-ζ, CD4, CD8 또는 CD28에 대한 막관통 영역 서열로부터 유래되는 CAR의 세포막 앵커 영역이 기술된 바 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 세포막 앵커 영역을 포함한다. 세포막 앵커 영역은, 예를 들어, 지질 앵커 영역일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 결합 영역 및 본원에 기술된 바와 같은 세포막 앵커 영역을 포함한다. 몇몇 양태에서, CAR은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체를 포함하거나 이것으로 이루어진다.
신호전달 영역은 T 세포의 활성화를 가능하게 한다. CAR 신호전달 영역은 CD3-ζ의 세포내 도메인의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이것은 CAR-발현 T 세포의 인산화 및 활성화를 위한 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 제공한다. 다른 ITAM-함유 단백질의 서열을 포함하는 신호전달 영역, 예를 들어, FcγRI의 ITAM 함유 영역을 포함하는 도메인이 또한 CAR에서 사용되었다 (Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187). CD3-ζ의 세포내 도메인으로부터 유래된 신호전달 영역을 포함하는 CAR을 종종 1세대 CAR이라고 한다.
CAR의 신호전달 영역은 또한 표적 단백질에 결합시 CAR-발현 T 세포의 활성화를 촉진시키기 위해 공동-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공동-자극 서열을 포함할 수 있다. 적합한 공동-자극 분자는 CD28, OX40, 4-1BB, ICOS 및 CD27을 포함한다. 추가의 공동-자극 서열을 포함하는 신호전달 영역을 갖는 CAR을 종종 2세대 CAR이라고 한다.
일부 경우에 CAR은 상이한 세포내 신호전달 경로의 공동-자극을 제공하도록 조작된다. 예를 들면, CD28 공동자극과 관련된 신호전달은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (P13K) 경로를 우선적으로 활성화시키는 반면 4-1BB-매개된 신호전달은 TNF 수용체 관련 인자 (TRAF) 어댑터 단백질을 통해 이루어진다. 따라서, CAR의 신호전달 영역은 때때로 하나 이상의 공동-자극 분자의 신호전달 영역으로부터 유래된 공동-자극 서열을 함유한다. 다수의 공동-자극 서열을 갖는 신호전달 영역을 포함하는 CAR을 종종 3세대 CAR이라고 한다.
임의의 힌지 영역이 항원-결합 도메인과 막관통 도메인 사이의 분리를 제공할 수 있으며, 가요성 링커로서 작용할 수 있다. 힌지 영역은 결합 모이어티가 상이한 방향으로 배향할 수 있도록 하는 가요성 도메인일 수 있다. 힌지 영역은 면역글로불린의 IgG1 또는 CH2CH3 영역으로부터 유래될 수 있다.
CAR은 T 세포 효능, 특이성 및 안전성을 더욱 향상시키기 위해 공동자극 리간드, 키메라 공동자극 수용체 또는 사이토킨과 조합될 수 있다 (Sadelain et al., The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398. doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0548, 구체적으로 본원에 참고로 포함됨).
본 발명에 따르는 CAR을 포함하는 세포가 또한 제공된다. 본 발명에 따르는 CAR은 T 세포를 생성하는데 사용될 수 있다. T 세포로의 CAR의 조작은 입양 T 세포 요법을 위한 T 세포의 확장 동안 일어나는 것과 같은 형질도입 및 확장을 위해 시험관내에서 배양 동안 수행될 수 있다.
TGF-β 디코이 수용체 및 CAR을 암호화하는 핵산
본 발명은 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 제공한다. 몇몇 양태에서, 핵산은, 예를 들어, 다른 핵산, 또는 자연-발생 생물학적 물질로부터 정제되거나 단리된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "벡터"는 외인성 핵산을 세포내로 전달하기 위한 비히클로서 사용되는 핵산 (DNA 또는 RNA)이다. 벡터는 세포에서 핵산의 발현을 위한 발현 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 발현시키고자 하는 서열을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 종결 코돈 및 발현 인핸서를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 벡터, 프로모터, 인핸서 및 종결 코돈이 본 발명에 따르는 벡터로부터 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체/CAR을 발현시키는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된"은 선택된 핵산 서열 및 조절 핵산 서열 (예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서)이 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절 서열의 영향 또는 조절하에 두는 (이에 의해 발현 카세트를 형성함) 방식으로 공유적으로 연결되는 상황을 포함할 수 있다. 따라서 조절 서열은 핵산 서열의 전사를 수행할 수 있다면 선택된 핵산 서열에 작동적으로 연결된다. 경우에 따라, 생성된 전사체는 그후 원하는 폴리펩타이드로 번역될 수 있다.
본 발명에 따르는 핵산 및/또는 벡터는 바람직하게는 세포, 예를 들어, 일차 인간 면역 세포 내ㅍ로의 도입을 위해 제공된다. 적합한 벡터는, 예를 들어, 문헌[Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225 또는 Morgan and Boyerinas, Biomedicines 2016 4, 9, 이들 둘 다는 전문이 본원에 참고로 포함됨]에 기술된 바와 같이 플라스미드, 바이너리 벡터, DNA 벡터, mRNA 벡터, 바이러스 벡터 (예를 들어, 감마레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)-유래 벡터), 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 우두 바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 벡터), 트랜스포존-기반 벡터, 및 인공 염색체 (예를 들어, 효모 인공 염색체)를 포함한다. 몇몇 양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 단순 포진 바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 양태에서, 렌티바이러스 벡터는 pELNS일 수 있거나, pELNS로부터 유래될 수 있다. 몇몇 양태에서, 벡터는 CRISPR/Cas9를 암호화하는 벡터일 수 있다.
TGF-β 디코이 수용체 및 CAR을 포함/발현하는 세포
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 포함하거나 발현하는 세포를 제공한다. 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 포함하거나 발현하는 세포가 또한 제공된다.
세포는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포일 수 있다. 포유류는 인간, 또는 비-인간 포유류 (예를 들어, 토끼, 기니 피그, 래트, 마우스 또는 다른 설치류 (Rodentia 목의 모든 동물을 포함함), 고양이, 개, 돼지, 양, 염소, 소 (암소, 예를 들어, 젖소, 또는 Bos 목의 모든 동물을 포함함), 말 (Equidae 목의 모든 동물을 포함함), 당나귀, 및 비-인간 영장류)일 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포는 인간 대상체로부터의 것일 수 있거나, 이로부터 수득될 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에 통상적으로 반응하는 세포, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)를 발현하는 세포이다.
세포는 면역 세포일 수 있다. 세포는 조혈 기원의 세포, 예를 들어, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지상 세포, 림프구, 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는, 예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 선천적 림프상 세포 (ILC), 또는 이의 전구물질일 수 있다. 세포는, 예를 들어, CD3 폴리펩타이드 (예를 들어, CD3γ CD3ε CD3ζ 또는 CD3δ), TCR 폴리펩타이드 (TCRα 또는 TCRβ), CD27, CD28, CD4 또는 CD8을 발현할 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포는 T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 CD3+ T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 CD3+, CD8+ T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 림프구 (CTL))이다.
몇몇 양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함/발현하는 세포, 예를 들어, CAR-T 세포일 수 있다. 몇몇 양태에서, 세포는 CAR을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함/발현하는 세포일 수 있다. 키메라 항원 수용체 (CAR)는 항원-결합 및 T 세포 활성화 기능 둘 다를 제공하는 재조합 수용체이다. CAR 구조 및 조작은, 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1)]에 검토되어 있다.
CAR을 포함/발현하고 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 포함/발현하는 세포가 또한 제공된다. 세포는 CAR-T 세포일 수 있다. T 세포로의 CAR의 조작은 입양 T 세포 요법을 위한 T 세포의 확장 동안 일어나는 것과 같은 형질도입 및 확장을 위해 시험관내에서 배양 동안 수행될 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포는 항원-특이 T 세포이다. 본원의 양태에서, "항원-특이" T 세포는 T 세포가 특이적인 항원, 또는 상기 항원을 발현하는 세포에 반응하여 T 세포의 특정 기능적 특성을 나타내는 세포이다. 몇몇 양태에서, 특성은 효과기 T 세포, 예를 들어 세포 독성 T 세포와 관련된 기능적 특성이다.
몇몇 양태에서, 항원-특이 T 세포는 다음의 특성들 중의 하나 이상을 나타낼 수 있다: 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 대한 세포독성; 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 반응한 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그랜자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FAS 리간드 (FASL) 발현.
본원에서, IFNγ, CD107a, IL-2, TNFα, 퍼포린, 그랜자임 및/또는 FASL의 "발현"은 유전자 발현 또는 단백질 발현을 가리킬 수 있다. 유전자 발현은 당업계의 숙련가들에게 공지된 다양한 수단에 의해, 예를 들면, 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 mRNA의 수준을 측정함으로써, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포계측, ELISA, ELISPOT, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다. "증가된 발현"은 T 세포가 특이적인 항원, 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함하거나 발현하는 세포와 접촉하지 않은 T 세포에 의한 유전자/단백질의 발현의 수준, 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함하거나 발현하지 않는 세포에 반응하여 T 세포에 의한 발현의 수준보다 큰 발현의 수준을 가리킨다.
몇몇 양태에서, T 세포가 특이적인 항원은 바이러스, 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 림프구성 맥락수막염 바이러스 (LCMV), 단순 포진 바이러스 (HSV) 또는 인간 유두종 바이러스 (HPV)의 펩타이드 또는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입함을 포함하여, 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 포함하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입함을 포함하여, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 세포에 의한 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에 세포를 배양함을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 이 방법은 시험관내에서 수행된다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 단리된 핵산 또는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계는 형질도입, 예를 들어, 레트로바이러스 형질도입을 포함한다. 따라서, 몇몇 양태에서 단리된 핵산 또는 벡터는 바이러스 벡터에 포함되거나, 벡터가 바이러스 벡터이다. 몇몇 양태에서, 상기 방법은 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를, 예를 들어, 문헌[Koh et al., Molecular Therapy - Nucleic Acids (2013) 2, e114, 전문이 본원에 참고로 포함됨]에 기술된 바와 같은 전기천공에 의해 도입함을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 세포를 생산하기 위한 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 세포를 제공한다.
조성물
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터 또는 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터 및 세포는 임상 용도를 위한 약제학적 조성물로서 제형화될 수 있으며 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 아주반트를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면 약제학적으로 유용한 조성물의 제조를 위한 방법이 또한 제공되며, 이러한 제조방법은 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 세포, 핵산 또는 벡터를 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 세포, 핵산 또는 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계.
예를 들면, 본 발명의 추가의 측면은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 세포, 핵산 또는 벡터를 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 약제를 제형화하는 단계를 포함하여, 암의 치료에 사용하기 위한 약제 또는 약제학적 조성물을 제형화 또는 제조하는 방법에 관한 것이다.
TGF-β 디코이 수용체 및 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 특성
본 발명의 TGF-β 디코이 수용체 및 CAR 및 이러한 수용체를 발현하는 세포는 특정 특성들을 참조하여 특징지워질 수 있다.
특히, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 다음의 특성들 중의 하나 이상을 가질 수 있다:
TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에 대한 결합;
TGF-β와 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3) 간의 상호작용의 억제;
TGF-β에 의해 매개된 신호전달의 억제;
TGF-β 수용체에 TGF-β를 결합시킴으로써 매개된 신호전달의 억제.
세포막에의 부착;
지질 뗏목(lipid raft)에의 편재;
지질 뗏목 응집을 유도하는 능력;
지질 관련 신호전달을 유도하는 능력.
본 발명에 따르는 CAR은 또한 이러한 특성들 중의 하나 이상을 참조하여 특징지워질 수 있다.
TGF-β에 결합할 수 있는 TGF-β 디코이 수용체는 바람직하게는 TGF-β 이외의 단백질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 및/또는 더 큰 지속시간으로 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3)에 결합한다. 몇몇 양태에서 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 사이토킨 수퍼패밀리의 하나 이상의 다른 구성원에 대해서보다 TGF-β에 대해 더 큰 친화도로 결합할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-α에 대해서보다 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3)에 대해 더 큰 친화도로 결합할 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 이외의 단백질에 대한 결합의 정도는, 예를 들어, ELISA, SPR, 생물-층 간섭법 (BLI), 마이크로스케일 열영동 (MST)에 의해, 또는 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정되는 바와 같이 TGF-β에 대한 TGF-β 디코이 수용체의 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, TGF-β에 대한 결합 특이성은 결합 친화도의 측면에서 반영될 수 있으며, 여기서 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 또 다른, 비-표적 분자에 대한 KD보다 적어도 0.1 자릿수 (즉, 0.1 x 10n, 여기서 n은 크기 차수를 나타내는 정수이다) 더 큰 KD로 TGF-β에 결합한다. 이것은 임의로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중의 하나일 수 있다.
결합 친화도는 해리 상수 (KD)의 측면에서 표현될 수 있다. 결합 친화도는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어, ELISA (예를 들면, 문헌[Antibody Engineering, vol. 1 (2nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665.]에 기술된 바와 같음), 표면 플라스몬 공명 (SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442; 또는 Rich et al., Anal Biochem. 2008 Feb 1; 373(1):112-20] 참조), 생물-층 간섭법 (예를 들어, 문헌[Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507; 또는 Concepcion et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep; 12(8):791-800] 참조), 마이크로스케일 열영동 (MST) 분석 (예를 들어, 문헌[Jerabek-Willemsen et al., Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug; 9(4): 342-353] 참조)에 의해, 또는 방사성 표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 5 μM 이하, 바람직하게는 ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤500 pM 중의 하나의 KD로 TGF-β에 결합한다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 EC50 = 1000 ng/ml 이하, 바람직하게는 ≤900 ng/ml, ≤800 ng/ml, ≤700 ng/ml, ≤600 ng/ml, ≤500 ng/ml, ≤400 ng/ml, ≤300 ng/ml, ≤200 ng/ml, ≤100 ng/ml, ≤90 ng/ml, ≤80 ng/ml, ≤70 ng/ml, ≤60 ng/ml, ≤50 ng/ml, ≤40 ng/ml, ≤30 ng/ml, ≤20 ng/ml, ≤15 ng/ml, ≤10 ng/ml, ≤7.5 ng/ml, ≤5 ng/ml, ≤2.5 ng/ml, 또는 ≤1 ng/ml 중의 하나의 (예를 들어, ELISA에 의해 결정되는 바와 같은) 결합 친화도로 TGF-β에 결합한다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 매개된 신호전달을 억제한다. 본원에서, '억제'는 통제 조건에 비해 축소, 감소 또는 약화됨을 가리킨다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체에 의한 공정의 억제는 TGF-β 디코이 수용체의 부재하에 및/또는 적절한 대조 수용체의 존재하에 그 공정의 규모/정도를 축소, 감소 또는 약화시킴을 가리킨다.
숙련가는 주어진 검정에 대한 적절한 통제 조건을 확인할 수 있다. 예를 들면, 대조 수용체는 검정에서 조사되는 특성에 관련된 역할을 갖지 않는 것으로 알려진 표적 단백질에 대해 지시된 수용체일 수 있다.
억제를 본원에서는 또한 중화 또는 길항이라고 할 수 있다. 즉, 기능 또는 공정 (예를 들어, 상호작용, 산호전달 또는 TGF-β에 의해 매개되는 기타의 활성)을 억제할 수 있는 TGF-β 디코이 수용체는 관련 기능 또는 공정과 관련하여 '중화' 또는 '길항제' TGF-β 디코이 수용체라고 할 수 있다. 예를 들면, TGF-β 매개된 신호전달을 억제할 수 있는 TGF-β 디코이 수용체를 TGF-β 매개된 신호전달을 중화시킬 수 있는 TGF-β 디코이 수용체라고 할 수 있거나, TGF-β 매개된 신호전달의 길항제라고 할 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 바람직하게는 TGF-β에의 결합을 위해 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체, 예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2, TGF-βR3 또는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3의 변이체/이소형/동족체 또는 TGF-β 결합 단편과 경쟁한다. 몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2, TGF-βR3, 및 TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3의 변이체/이소형/동족체 및 TGF-β 결합 단편 중의 하나 이상의 결합의 경쟁적 억제제이다. 즉, 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β와 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체 간의 상호작용을 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, '자연 발생 수용체'는 자연에서 발견되는 수용체이다. 자연 발생 수용체 및/또는 이의 구성분 펩타이드/폴리펩타이드는 주어진 숙주 종의 내인성 핵산으로부터의 전사, mRNA 프로세싱 (예를 들어, 스플라이싱), 번역, 및 번역후 프로세싱 (예를 들어, 단백질가수분해성 절단, 글리코실화)의 산물일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체에 의해 결합된 영역에서 TGF-β에 결합한다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체에 의해 결합된 영역과 동일한 TGF-β 영역, 또는 중첩한 TGF-β 영역에 결합한다. 몇몇 양태에서, TGF-β에 대한 자연 발생 수용체는 TGF-βR1, TGF-βR2, TGF-βR3이다. 몇몇 양태에서, TGF-β에 대한 자연 발생 수용체는 TGF-βR2이다.
TGF-β에의 결합을 위해 TGF-β에 대한 자연 발생 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2, TGF-βR3, 또는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3의 변이체/이소형/동족체 또는 TGF-β 결합 단편)와 경쟁하는 (즉, TGF-β와 자연 발생 수용체 간의 상호작용을 억제하는) TGF-β 디코이 수용체의 능력은 예를 들면 TGF-β 또는 TGF-β와 자연 발생 수용체, TGF-β 디코이 수용체, 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 존재하에 또는 이의 배양한 후 TGF-β와 자연 발생 수용체 사이의 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다.
주어진 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-β에의 결합을 위해 TGF-βR1, TGF-βR2, TGF-βR3, 또는 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3의 변이체/이소형/동족체 또는 TGF-β 결합 단편과 경쟁하는지를 결정하기 위한 적합한 검정의 예는 경쟁 ELISA 분석과 같은 경쟁적 결합 분석이다.
(예를 들어, TGF-β와 TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3 중의 하나 사이의) 주어진 상호작용을 억제할 수 있는 TGF-β 디코이 수용체는, TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 부재하(또는 적절한 대조 수용체/세포의 존재하)에서의 상호작용의 수준과 비교하여, TGF-β 디코이 수용체, 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 존재하에서 - 또는 이들과 상호작용 파트너 중의 하나 또는 둘 다의 배양 후 - 상호작용 파트너 간의 상호작용의 수준에 있어서의 축소/감소의 관찰에 의해 확인된다. 적합한 분석은, 예를 들어, 재조합 상호작용 파트너를 사용하거나 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 내인성으로 그렇게 할 수 있거나, 세포 내로 도입된 핵산으로부터 그렇게 할 수 있다. 이러한 검정의 목적을 위해, 상호작용 파트너 및/또는 TGF-β 디코이 수용체 중 하나 또는 둘 다는 상호작용의 수준을 검출 및/또는 측정하는 목적을 위해 표지되거나 검출 가능한 개체와 함께 사용될 수 있다.
이러한 검정은 또한 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체에 의해 결합된 영역과 동일한 TGF-β 영역 또는 중첩한 TGF-β 영역에 결합하는지를 결정하는데 유용하다. 즉, TGF-β 디코이 수용체/세포의 부재하에서의 상호작용의 수준과 비교하여, TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 존재하에서 - 또는 이들과 상호작용 파트너 중의 하나 또는 둘 다의 배양 후 - TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)와 예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3 간의 상호작용의 수준의 축소/감소의 관찰은 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-β에 대한 하나 이상의 자연 발생 수용체에 의해 결합된 영역과 동일한 TGF-β 영역 또는 중첩한 TGF-β 영역에 결합한다는 것을 시사한다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체가 TGF-β에 대한 자연 발생 수용체에 의해 결합된 영역과 동일한 TGF-β 영역 또는 중첩한 TGF-β 영역에서 TGF-β에 결합하는지의 여부는 또한 수용체-리간드 복합체의 X-선 동시-결정학 분석, 펩타이드 스캐닝, 돌연변이유발 맵핑, 질량 분광법에 의한 수소-중수소 교환 분석, 파지 디스플레이 및 단백질 가수분해-기반 '보호' 방법을 포함하는 당업계에 널리 공지된 다양한 방법을 사용한 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면, 본원에 참고로 포함된 문헌[Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156]에 기술되어 있다.
두 개의 상호작용 파트너 간의 상호작용을 억제하는 TGF-β 디코이 수용체의 능력은 또한 상호작용, 예를 들어, TGF-β 수용체 신호전달의 다운스트림 기능적 결과의 분석에 의해 결정될 수 있다.
TGF-β 신호전달에 대한 검정은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, TGF-β로의 자극에 반응하여 전사가 상향조절/하향조절되는 유전자에 대한 유전자 발현 검정, TGF-β 신호전달의 세포내 매개인자의 활성화 (예를 들어, 관련 인자의 인산화의 분석에 의해 결정됨)를 분석하는 검정, 단백질 관련 TGF-β 신호전달의 발현/가공에 있어서의 변화를 분석하기 위한 검정, 및 TGF-β 신호전달과 관련된 세포에서의 표현형 변화를 분석하기 위한 검정을 포함한다.
예를 들면, TGF-β 신호전달의 검정은 세포를 TGF-β로 처리하고 SMAD2, SMAD3, SMAD1, SMAD5, SMAD9 및 p38 중의 하나 이상의 인산화를 분석하고/하거나 CREB 및 NFκB 중의 하나 이상의 발현을 분석함을 수반할 수 있다. TGF-β 신호전달의 검정은, 예를 들어, 본 발명의 실시예 8에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
이러한 검정은 또한 TGF-β에 의해 매개된 신호전달, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)에 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)를 결합시킴으로써 매개된 신호전달의 분석에 유용하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 'TGF-β 매개된 신호전달' 및/또는 TGF-β에 의해 매개되는 공정은 TGF-β의 단편 및 TGF-β 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 복합체에 의해 매개되는 신호전달을 포함한다. TGF-β 매개된 신호전달은 인간 TGF-β 및/또는 마우스 TGF-β에 의해 매개되는 신호전달일 수 있다. TGF-β에 의해 매개되는 신호전달은 TGF-β 또는 TGF-β 함유 복합체를 TGF-β 또는 상기 복합체가 결합하는 수용체에 결합시킨 후 일어날 수 있다.
유전자 발현은 당업계의 숙련가들에게 공지된 다양한 수단에 의해, 예를 들면 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 mRNA의 수준을 측정함으로써, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다. 유사하게, 단백질 발현은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포계측, ELISA, ELISPOT, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, 또는 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)와 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3) 간의 상호작용을 TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 부재하(또는 적절한 대조 수용체/세포의 존재하)에서의 TGF-β와 TGF-β 수용체 간의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중의 하나로 억제할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체, 또는 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β와 TGF-β 수용체 간의 상호작용을 TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 부재하(또는 적절한 대조 수용체/세포의 존재하)에서의 TGF-β와 TGF-β 수용체 간의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.85배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중의 하나로 억제할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β의 생물학적 활성을 억제할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)에 대한 수용체에의 결합에 중요한 영역에서 TGF-β에 결합하며, 이에 의해 수용체를 통한 결합 및/또는 신호전달을 방해한다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β에 대한 수용체, 예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3을 통한 신호 형질도입에 의해 활성화되는 하나 이상의 신호전달 경로의 길항제이다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 수용체를 포함하는 하나 이상의 면역 수용체 복합체를 통한 신호전달을 억제할 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, 또는 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 매개된 신호전달을 TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 부재하(또는 적절한 대조 수용체/세포의 존재하)에서의 신호전달의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중의 하나로 억제할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체, 또는 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 매개된 신호전달을 TGF-β 디코이 수용체 또는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 부재하(또는 적절한 대조 수용체/세포의 존재하)에서의 신호전달의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.85배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중의 하나로 억제할 수 있다.
이러한 신호전달은, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)를 발현하는 세포를 TGF-β로 처리함으로써 분석될 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체는, 예를 들어, 세포막 앵커 영역을 통해 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에서 세포막에 부착될 수 있다. 몇몇 양태에서, 세포막 앵커 영역은 지질 앵커, 예를 들어, GPI 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어질 수 있는 지질 앵커 영역일 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 수용체와 세포막 또는 이의 성분 (예를 들어, 인지질)의 결합 (예를 들어, 공유 결합)을 통해 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 세포막에 부착할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 세포막 이중층의 외층에 부착할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 GPI 앵커와 세포막 또는 이의 성분의 결합을 통해 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 세포막에 부착할 수 있다. 몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 GPI 앵커의 지질 성분과 세포막의 지질 성분 간의 상호작용을 통해 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 세포막에 부착할 수 있다.
GPI 고정된 단백질의 방출은 포스파티딜이노시톨의 포스포디에스테르 결합을 가수분해시키는 포스포리파제 C (PLC)로의 처리를 통해 달성될 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 세포막 내의 지질 뗏목에 편재할 수 있다. 지질 뗏목에의 편재는 지질 앵커 영역 (예를 들어, GPI 앵커)을 통해 이루어질 수 있다.
지질 뗏목은 콜레스테롤, 글리코스핑고지질, 스핑고미엘린, 아실 쇄를 갖는 인지질, 및 GPI-연결된 단백질 뿐만 아니라 선천적 면역 수용체와 같은 다른 막 단백질이 풍부한 것을 특징으로 하는 세포막의 부위이다 (Lingwood and Simmons 2010, Science 327:46-50).
지질 뗏목에의 주어진 인자의 편재는 당업계에 널리 공지된 수단에 의해 분석될 수 있다. 예를 들면, 살아있는 세포의 지질 뗏목은, 예를 들어, 형광 표지로 표지될 수 있으며, 지질 뗏목에의 인자의 편재를 분석 및 정량할 수 있다. 지질 뗏목 표지화 키트의 한 가지 예는 Vybrant® Alexa Fluor® 555 지질 뗏목 표지화 키트 (ThermoFisher Scientfic)이다. 주어진 인자의 지질 뗏목 편재는 또한 인자를 발현하는 세포로부터의 지질 뗏목 성분의 단리, 및 (예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면 웨스턴 블롯, ELISA, 면역염색, 등 또는 리포터 기반 방법에 의해) 인자에 대한 지질 뗏목의 후속적인 분석에 의해 분석될 수 있다. 지질 뗏목의 단리 및 분석은, 예를 들면, 문헌[Lee, Methods Mol Biol. 2013;1066:131-45 및 Lemaire-Vieille et al. (2013) Bio-protocol 3(16): e854]에 기술되어 있으며, 이들 둘 다는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 수용체를 발현하는 세포에서 지질 뗏목 응집을 유도할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 지질 관련 신호전달을 유도할 수 있다.
지질 뗏목 응집은, 예를 들어, 문헌[Janes et al. 1999, The Journal of Cell Biology, 147(2): 447-461]에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다. 지질 관련 신호전달은 지질 신호전달 분자, 예를 들어, 스핑고지질 (세라미드, 스핑고신, 스핑고신-1-포스페이트, 글루코실세라미드, 세라미드-1-포스페이트, 포스파티딜이노시톨 비스포스페이트, 리소포스파티드산 (LPA), 혈소판 활성화 인자 (PAF), 엔도칸나비노이드, 프로스타글란딘, 하이드록시 지방산의 지방산 에스테르 (FAHFA), 레티놀 유도체, 스테로이드 호르몬, 레티노산 또는 프로스타글란딘에 의해 매개된 신호전달일 수 있다. 지질 관련 신호전달은, 예를 들어, src, ras 또는 rac의 다운스트림 활성화를 포함할 수 있다. 지질 관련 신호전달은, 예를 들어, 지질 관련 신호전달에 의해 전사가 상향조절/하향조절되는 유전자에 대한 유전자 발현 검정, 지질 관련 신호전달의 세포내 매개인자의 활성화 (예를 들어, 관련 인자의 인산화의 분석에 의해 결정됨)를 분석하는 검정, 단백질 관련 지질 관련 신호전달의 발현/가공에 있어서의 변화를 분석하기 위한 검정, 및 지질 관련 신호전달과 관련된 세포에서의 표현형 변화를 분석하기 위한 검정을 사용하여 분석될 수 있다.
지질 뗏목 응집 및 지질 관련 신호전달은 향상된 T 세포 수용체 신호전달을 제공할 수 있으며, 또한 TGF-β 매개된 신호 전달의 효과를 역전시킬 수 있다. 지질 뗏목 응집 및 지질 관련 신호전달은 src, ras, rac 또는 sox 중의 하나 이상의 다운스트림 활성화를 야기할 수 있어서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β로부터의 억제 신호를 T 세포 활성화를 위한 신호로 전환시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 포함/발현하는 세포에 대한 TGF-β 처리의 효과는 억제성이기보다는 자극성일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 지질 뗏목에 또 다른 TGF-β 결합 단백질보다 더 큰 정도로 편재할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 지질 뗏목에 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2와 같은 자연 발생 TGF-β 결합 단백질보다 더 큰 정도로 편재할 수 있다.
지질 뗏목에의 주어진 분자의 편재의 정도는, 예를 들어, 관련 분자를 발현하는 세포의 지질 뗏목 및 비-지질 뗏목 분획을 분석하고, 지질 뗏목 및/또는 비-지질 뗏목 분획과 관련된 분자의 비율을 결정함으로써 결정될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 수용체를 발현하는 세포에서 지질 뗏목 응집을 또 다른 TGF-β 결합 단백질에 비해 더 큰 정도로 유도할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 지질 관련 신호전달을 또 다른 TGF-β 결합 단백질에 비해 더 큰 정도로 유도할 수 있다.
본원에서, '더 큰 정도로' 지질 뗏목에의 편재, 지질 뗏목 응집을 유도하는 능력, 지질 관련 신호전달을 유도하는 능력은 상기 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포에서 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌(Onichtchouk et al.)에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2에 의해 나타내어지는 편재, 지질 뗏목 응집의 유도 또는 지질 관련 신호전달의 유도의 정도의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 상기 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포의 표면에서의 또 다른 TGF-β 결합 단백질의 발현의 수준에 비해 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 표면에서 증가된 발현의 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 세포 표면에 대한 향상된 트래피킹을 나타낼 수 있거나, 세포막과 보다 안정적으로 결합할 수 있거나, 세포 표면으로부터 감소된 내재화를 나타낼 수 있거나, 세포 표면으로부터 감소된 방출을 나타낼 수 있다.
TGF-β 디코이 수용체의 표면 발현의 증가된 수준은 신호전달-능력이 있는 TGF-β 수용체에 결합하는데 이용 가능한 TGF-β의 양이 감소되어 TGF-β 매개된 신호전달이 더 크게 억제된다는 이점과 관련된다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 이러한 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포 상에서 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2와 같은 자연 발생 TGF-β 결합 단백질의 표면 발현의 수준에 비해, TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포 상의 표면 발현의 증가된 수준을 나타낼 수 있다. 주어진 단백질의 세포 표면 발현은 당업계에 널리 공지된 다양한 방법에 의해, 예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포계측, ELISA, ELISPOT, 또는 리포터-기반 방법에 의해 측정될 수 있다.
예를 들면, TGF-β 디코이 수용체의 세포 표면 발현의 검정은 디코이 수용체의 TGF-β 결합 영역을 인식할 수 있는 항체를 사용한 분석을 포함할 수 있다. 검정은 예를 들어, 본 발명의 실시예 7에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
세포 표면 발현의 증가된 수준은 상기 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포에서 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2에 의해 나타내어지는 표면 발현의 수준의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에서 TGF-β 매개된 신호전달을 또 다른 TGF-β 결합 단백질보다 더 큰 정도로 억제할 수 있다. 예를 들면, TGF-β 디코이 수용체는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에 대한 향상된 (예를 들어, 더 큰 친화성 및/또는 더 큰 결합성) 결합, 또는 TGF-β와 신호전달-능력이 있는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3)의 상호작용을 억제하는 향상된 능력을 나타낼 수 있다.
주어진 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포에 의한 TGF-β 매개된 신호전달은, 예를 들어, 세포를 TGF-β로 처리한 후 본원에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다.
'더 큰 정도'로의 TGF-β 매개된 신호전달의 억제는 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2에 의해 나타내어지는 TGF-β 매개된 신호전달의 억제 정도의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체는 디코이 수용체를 발현하는 세포로부터 그 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포로부터의 또 다른 TGF-β 결합 단백질의 분비 수준보다 더 큰 정도로 분비될 수 있다. 유리하게는, 분비된 TGF-β 디코이 수용체는 가용성 TGF-β에 결합할 수 있어, 세포 신호전달-능력이 있는 TGF-β 수용체와 맞물리는데 이용 가능한 가용성 TGF-β의 수준을 감소시킬 수 있다.
세포로부터의 주어진 단백질의 분비 수준은 단백질을 발현하는 세포의 세포 배양물 상청액에서 수용체의 양을 측정함으로써, 예를 들어, 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포계측, ELISA, ELISPOT, 또는 리포터-기반 방법에 의해 분석될 수 있다.
'더 큰 정도'로의 분비는 상기 TGF-β 결합 단백질을 발현하는 세포로부터의 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2의 분비 정도의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배일 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는, TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 의한 TGF-β 매개된 신호 전달의 수준에 비해, 예를 들어 TGF-β로 처리한 후 감소된 수준의 TGF-β 매개된 신호전달을 나타낼 수 있다. 세포에 의한 TGF-β 매개된 신호전달은 본원에 기술된 바와 같이 분석될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 의한 신호전달의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중의 하나인 (예를 들어, TGF-β로의 처리에 반응한) TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 나타낸다. 몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 의한 신호전달의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.85배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중의 하나인 (예를 들어, TGF-β로의 처리에 반응한) TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 나타낸다.
유사하게, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 의한 반응의 수준에 비해, 예를 들어, TGF-β로 처리한 후, TGF-β 매개된 신호전달과 관련된 반응의 감소된 수준을 나타낼 수 있다. 즉, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 비해 TGF-β 처리에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
몇몇 양태에서, TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 세포의 활성의 TGF-β 매개된 억제에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는, 예를 들어, TGF-β로 처리한 후, TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 비해 다음의 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
증가된 증식 속도;
하나 이상의 성장 인자 (예를 들어, IL-2)의 증가된 발현;
증가된 생존률;
하나 이상의 세포독성/효과기 인자 (예를 들어, IFNγ, 그랜자임, 퍼포린, 그라눌리신, CD107a, TNFα, FASL)의 증가된 발현;
증가된 세포독성;
향상된 항암 효과.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 TGF-β로의 처리의 부재하에서의 동일 세포에 의한 특성의 수준에 비해 TGF-β로 처리한 후 이전 단락에 기술된 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.
세포는 조혈 기원의 세포, 예를 들어, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지상 세포, 림프구, 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는, 예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포, 또는 선천적 림프상 세포 (ILC), 또는 이의 전구물질일 수 있다. 세포는, 예를 들어, CD3 폴리펩타이드 (예를 들어, CD3γ CD3ε CD3ζ 또는 CD3δ), TCR 폴리펩타이드 (TCRα 또는 TCRβ), CD27, CD28, CD4 또는 CD8을 발현할 수 있다. 몇몇 양태에서, 세포는 CAR를 포함하거나 발현할 수 있다 (또는 CAR을 암호화하는 핵산/벡터를 포함/발현할 수 있다); 예를 들어, 세포는 CAR-T 세포일 수 있다.
이러한 특성들은 숙련가에게 널리 알려진 방법에 의해 분석될 수 있다.
세포 또는 세포 집단의 증식 또는 확장의 속도는, 예를 들어, 상이한 시점에서 세포의 수를 측정함으로써, 또는 3H-티미딘의 혼입의 분석 또는, 예를 들어, 문헌[Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564]에 기술된 바와 같은 CFSE 희석 검정에 의해 분석될 수 있다. 증식 및/또는 확장은 생체내에서, 또는 시험관내 또는 생체외에서 배양물 중에서 측정할 수 있다.
성장 인자 및 세포독성/효과기 인자의 유전자 또는 단백질 발현은, 예를 들어, mRNA 수준의 qPCR 분석에 의해, 및/또는 ELISA, 유동 세포계측, 면역블롯 등과 같은 관련 단백질을 검출하기 위한 면역검정 기반 방법에 의해 측정될 수 있다.
세포의 생존/지속성 (예를 들어, 생체내에서, 또는 시험관내 또는 생체외 배양물에서의 생존/지속성)은 검출 가능한 표지로 표지된 세포를 검출함으로써 시간 경과에 따라 세포 수를 모니터링함으로써 결정될 수 있다.
세포독성은, 예를 들면, 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Zaritskaya et al., Expert Rev Vaccines (2011), 9(6):601-616]에 검토된 방법 중의 어느 것을 사용하여, 예를 들어, 51Cr 방출 검정에 의해 조사될 수 있다.
항암 효과는, 예를 들어, TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포가, 예를 들어, 시험관내에서 암세포를 사멸시키는 능력을 분석함으로써 조사될 수 있다. 암은 세포가 특이적인 항원을 발현할 수 있다. 항암 효과는 또한, 예를 들어, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포의 투여 및 적절한 통제 조건과의 비교 후 암의 발병, 진행 또는 증상의 중증도, 및/또는 동물의 생존률을 분석함으로써 암의 동물 모델에서 생체내에서 조사될 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에 대한 증가된 유전자 또는 단백질 발현, 증식, 확장, 생존률, 세포독성 또는 항암 효과는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하지 않는 필적하는 세포에 의해 나타내어지는 발현, 증식, 확장, 생존률, 세포독성 또는 항암 효과의 수준의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배 중의 하나일 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2를 발현하는 필적하는 세포에 비해 세포의 활성의 TGF-β 매개된 억제에 대해 감소된 감수성을 나타낼 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포는, 예를 들어, TGF-β로의 처리 후, 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2를 발현하는 필적하는 세포에 비해 다음의 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
증식 또는 확장의, 예를 들어, 시험관내 및/또는 생체내에서의 증가된 속도;
하나 이상의 성장 인자 (예를 들어, IL-2)의 증가된 발현;
증가된 생존률;
하나 이상의 세포독성/효과기 인자 (예를 들어, IFNγ, 그랜자임, 퍼포린, 그라눌리신, CD107a, TNFα, FASL)의 증가된 발현;
증가된 세포독성;
향상된 항암 효과.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에 대한 증가된 유전자 또는 단백질 발현, 증식, 확장, 생존률, 세포독성 또는 항암 효과는 또 다른 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어, TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 또는 TGF-βR3), BAMBI (상기 문헌[Onichtchouk et al.]에 기술된 바와 같음), 또는 문헌[Bollard et al., Russo et al., Zhang et al. 또는 Penafuerte et al. (상기)]에 기술된 TGF-β 결합 단백질, 예를 들어 DN-TGF-βR2를 발현하는 필적하는 세포에 의해 나타내어지는 발현, 증식, 확장, 생존률, 세포독성 또는 항암 효과의 수준의 1배 이상, 예를 들어, ≥1.01배, ≥1.02배, ≥1.03배, ≥1.04배, ≥1.05배, ≥1.06배, ≥1.07배, ≥1.08배, ≥1.09배, ≥1.1배, ≥1.2배, ≥1.3배, ≥1.4배, ≥1.5배, ≥1.6배, ≥1.7배, ≥1.8배, ≥1.9배, ≥2배, ≥2.1배, ≥2.2배, ≥2.3배, ≥2.4배, ≥2.5배, ≥2.6배, ≥2.7배, ≥2.8배, ≥2.9배, ≥3배, ≥3.5배, ≥4배, ≥4.5배, ≥5배, ≥6배, ≥7배, ≥8배, ≥9배, ≥10배, ≥15배, ≥20배, ≥25배, ≥30배, ≥35배, ≥40배, ≥45배, ≥50배, ≥60배, ≥70배, ≥80배, ≥90배, ≥100배, ≥200배, ≥300배, ≥400배, ≥500배, ≥600배, ≥700배, ≥800배, ≥900배, ≥1000배 중의 하나일 수 있다.
치료학적 용도
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 및 약제학적 조성물은 치료적 및 예방적 방법에서 사용된다.
본 발명은 의학적 치료 또는 예방의 방법에서 사용하기 위한 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 및 약제학적 조성물은 TGF-β 매개된 신호전달과 관련된 질환/병태를 치료 또는 예방하는데 사용된다. 본원에 설명된 바와 같이, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 세포 및 조성물은 TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 감소시키는데 사용된다. 따라서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 및 조성물은 TGF-β 매개된 신호전달 수준의 감소가 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 질환/병태의 치료 또는 예방에 유용하다.
'치료'는, 예를 들면, 질환/병태의 발병 또는 진행의 감소, 질환/병태의 증상의 완화 또는 질환/병태의 병리의 감소일 수 있다. 질환/병태의 치료 또는 완화는 질환/병태의 진행을 예방하고, 예를 들어, 병태의 악화를 예방하거나 발병 속도를 지연시키는데 효과적일 수 있다. 몇몇 양태에서 치료 또는 완화는 질환/병태의 개선, 예를 들어, 질환/병태의 증상의 감소 또는 질환/병태의 중증도/활성의 일부 다른 상관관계의 감소를 야기할 수 있다. 질환/병태의 예방은 병태의 악화의 예방 또는 질환/병태의 발병의 예방, 예를 들어, 초기 단계의 질환/병태가 나중에 만성 단계로 발전하는 것을 예방하는 것을 가리킬 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료 또는 예방되는 질환 또는 병태는 TGF-β 매개된 신호전달과 관련된 질환/병태 (예를 들어, TGF-β 매개된 신호전달이 병리학적으로 연관되는 질환/병태), 및/또는 TGF-β 매개된 신호전달이 위험 인자인 질환/병태일 수 있다. 몇몇 양태에서, 질환/병태는 대조 상태와 비교하여 TGF-β 매개된 신호전달의 증가된 수준과 관련될 수 있다.
치료는 TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 감소시키고/시키거나 TGF-β 매개 된 신호전달과 관련된 반응의 수준을 감소시키는 것을 목적으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료는 TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 감소시키는 것을 목적으로 할 수 있다. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 및 조성물의 투여는 TGF-β의 격리를 통해 TGF-β 매개된 신호전달의 수준의 감소를 유발할 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료는 대상체, 또는 대상체의 세포, 세포 집단, 조직 또는 장기에서 TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 감소시키는 것을 목적으로 할 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료는 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 포함/발현하도록 세포 또는 세포 집단을 변형시킴을 포함할 수 있으며, 이것은 그후 TGF-β에 덜 반응성일 수 있다. 몇몇 양태에서, 치료는 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 포함/발현하도록 변형된 세포 또는 세포 집단을 대상체에게 투여함을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료는, 예를 들어, 본 발명에 따르는 세포를 투여함으로써, 또는 본 발명에 따르는 세포를 생성함으로써, 세포/집단의 활성의 TGF-β 매개된 억제에 덜 민감한 면역 세포 또는 면역 세포 집단을 대상체에게 제공하는 것을 목적으로 한다.
치료되는 대상체는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 비-인간 포유류일 수 있지만, 보다 바람직하게는 인간이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 대상체는 치료를 요하는 질환 또는 병태로 진단되었을 수 있거나, 이러한 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심될 수 있다.
치료되는 대상체는, 예를 들어, 적절한 검정을 사용하여 대상체, 또는 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 세포, 조직, 혈액 샘플)의 분석에 의해 결정되는 바와 같이, 상승된 수준의 TGF-β 매개된 신호전달을 나타낼 수 있다.
대상체는 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3) 또는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)와 같은 TGF-β 매개된 신호전달의 양성 조절인자/효과기의 발현 또는 활성의 증가된 수준을 가질 수 있거나, TGF-β 매개된 신호전달에 의해 상향조절된 인자의 발현 또는 활성의 증가된 수준을 가질 수 있다. 대상체는 TGF-β 매개된 신호전달에 의해 상향조절된 활성의 증가된 수준을 가질 수 있다.
대상체는 TGF-β 매개된 신호전달의 음성 조절인자의 발현 또는 활성의 감소된 수준을 가질 수 있거나, TGF-β 매개된 신호전달에 의해 하향조절된 인자의 발현 또는 활성의 감소된 수준을 가질 수 있다. 대상체는 TGF-β 매개된 신호전달에 의해 하향조절된 활성의 감소된 수준을 가질 수 있다.
증가/감소는 관련 질환/병태의 부재하에서의 발현/활성의 수준, 예를 들어, 건강한 대조군 대상체 또는 건강한 대조군 대상체로부터 수득된 샘플에서의 발현/활성의 수준에 비한 것일 수 있다.
몇몇 양태에서 대상체는 질환 또는 병태를 발병/접촉할 위험이 있을 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료 또는 예방되는 질환 또는 병태는 암일 수 있다. TGF-β 매개된 신호전달은 다양한 암의 발생/진행에 관여한다. 암에서의 TGFβ 신호전달은, 예를 들면 문헌[Nacif and Shaker 2014, Akhurst and Hata 2012, and Meulmeester and ten Dijke 2011 (상기)]에 검토되어 있다.
암은 임의의 원치않는 세포 증식 (또는 원치않는 세포 증식으로 나타나는 임의의 질환), 신생물 또는 종양 또는 원치않는 세포 증식, 신생물 또는 종양의 증가된 위험 또는 경향일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있으며 1차 또는 2차 (전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있으며 임의의 조직에 위치할 수 있다. 조직의 예는 부신, 부신 수질, 항문, 맹장, 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장, 중추 신경계 (뇌를 포함하거나 배제함) 소뇌, 자궁경부, 결장, 십이지장, 자궁내막, 상피 세포 (예를 들어, 신장 상피), 담낭, 식도, 교질 세포, 심장, 회장, 공장, 신장, 눈물샘, 후두, 간, 폐, 림프, 림프절, 림프모구, 상악골, 종격, 장간막, 자궁근층, 비인두, 장막, 구강, 난소, 췌장, 이하선, 밀초 신경계, 복막, 흉막, 전립선, 타액선, S상 결장, 피부, 소장, 연조직, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 혀, 편도선, 기관, 자궁, 음문, 백혈구를 포함한다.
치료되는 종양은 신경계 또는 비-신경계 종양일 수 있다. 신경계 종양, 예를 들어, 신경교종, 수모세포종, 수막종, 신경섬유종, 뇌질피복 세포증, 신경집종, 신경섬유육종, 성상세포종 및 핍지교종은 중추 또는 말초 신경계에서 유래할 수 있다. 비-신경계 암/종양은 임의의 다른 비-신경 조직에서 유래할 수 있으며, 예는 흑색종, 중피종, 림프종, 골수종, 백혈병, 비호지킨 림프종 (NHL), 호지킨 림프종, 만성 골수성 백혈병 (CML), 급성 골수성 백혈병 (AML), 골수 이형성 증후군 (MDS), 피부 T-세포 림프종 (CTCL), 만성 림프성 백혈병 (CLL), 간암, 유표피암, 전립성 암종, 유방암, 폐암, 결장암, 난소암, 췌장암, 흉선 암종, NSCLC, 혈액 암 및 육종을 포함한다.
몇몇 양태에서, 치료되는 암은 비인두 암종 (NPC; 예를 들어, 엡스타인-바 바이러스 (EBV)-양성 NPC), 경부 암종 (CC; 예를 들어, 인유두종 바이러스 (HPV)-양성 CC), 구강인두 암종 (OPC; 예를 들어, HPV-양성 OPC), 위 암종 (GC; 예를 들어, EBV-양성 GC), 간세포 암종 (HCC; 예를 들어, B형 간염 바이러스 (HBV)-양성 HCC), 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)) 및 두경부암 (예를 들어, 입술, 입, 코, 부비동, 인두 또는 후두 조직으로부터 유래한 암, 예를 들어, 두경부 편평 세포 암종 (HNSCC)) 중의 하나 이상이다.
몇몇 양태에서 암은 바이러스와 관련이 있거나 바이러스에 의해 유발된다. 몇몇 양태에서 암은 EBV-양성 암이다. 몇몇 양태에서 암은 HPV-양성 암이다.
몇몇 양태에서, 암은 두경부암, 비인두 암종 (NPC), 구강인두암 (OPC), 자궁경부암 (CC), 위장/위 암, 위 암종 또는 폐암 중의 하나이다.
몇몇 양태에서 암은 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3) 또는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)를 발현하는 암이다. 암은 숙련가에게 널리 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 TGF-β 또는 TGF-β 수용체를 발현하는지를 알 수 있다. TGF-β 또는 TGF-β 수용체를 발현하는 암은 TGF-β 또는 TGF-β 수용체의 발현의 검출에 의해 확인될 수 있다.
몇몇 양태에서, 암은 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3) 또는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)를 과발현시킨다. TGF-β 또는 TGF-β 수용체의 과발현은 등가의 비-암성 세포/비-종양 조직에 의한 TGF-β 또는 TGF-β 수용체의 발현의 수준보다 큰 TGF-β 또는 TGF-β 수용체의 발현의 수준의 검출에 의해 결정될 수 있다.
몇몇 양태에서, 환자는, 예를 들어, 대상체로부터 수득된 샘플에서, TGF-β 또는 TGF-β 수용체를 발현하거나 TGF-β 또는 TGF-β 수용체를 과발현하는 암의 검출에 기초하여 본 발명에 따르는 치료를 위해 선택될 수 있다.
발현은 유전자 발현 또는 단백질 발현일 수 있다. 유전자 발현은 예를 들어, TGF-β 또는 TGF-β 수용체를 암호화하는 mRNA의 검출에 의해, 예를 들면 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 결정될 수 있다. 단백질 발현은 예를 들어, TGF-β 또는 TGF-β 수용체 단백질의 검출에 의해, 예를 들면 항체-기반 방법에 의해, 예를 들면 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 면역세포화학, 유동 세포계측, 또는 ELISA에 의해 결정될 수 있다.
암은 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3) 또는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)와 같은 TGF-β 매개된 신호전달의 양성 조절인자/효과기의 발현 또는 활성의 증가된 수준을 가질 수 있거나, TGF-β 매개된 신호전달에 의해 상향조절된 인자의 발현 또는 활성의 증가된 수준을 가질 수 있다. 암은 TGF-β 매개된 신호전달의 음성 조절인자의 발현 또는 활성의 감소된 수준을 가질 수 있거나, TGF-β 매개된 신호전달에 의해 하향조절된 인자의 발현 또는 활성의 감소된 수준을 가질 수 있다. 증가/감소는 등가의 비-암성 세포/조직에서의 발현 또는 활성의 수준에 비한 것일 수 있다.
몇몇 양태에서, 암은 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 및/또는 TGF-β3) 또는 TGF-β 수용체 (예를 들어, TGF-βR1, TGF-βR2 및/또는 TGF-βR3)에서의 돌연변이와 관련될 수 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 돌연변이는 증가된 수준의 유전자 또는 단백질 발현과 관련될 수 있거나, 돌연변이의 부재하에서 관찰된 발현/신호전달의 수준에 비해 증가된 수준의 TGF-β 매개된 신호전달과 관련될 수 있다.
몇몇 양태에서, 치료되는 질환/병태는 다음 중의 하나일 수 있다: 섬유증을 특징으로 하는 질환, 예를 들어 특발성 폐 섬유증 (IPF), 신장 섬유증, 심장 섬유증 (예를 들어, 심근 경색, 허혈성, 확장성 및 비대성 심근증 및 울혈성 심부전과 관련된 섬유증), 경피증, 골수 이형성 증후군 (MDS), 관상 동맥 우회술 또는 혈관 성형술 후 재협착, 마르팡 증후군, 안 질환에서 수술후 반흔 (예를 들어, 녹내장 치료를 위한 섬유주 절제술 후, 또는 각막 수술 후), 당뇨병 및 비만.
몇몇 양태에서, 질환/병태는 T 세포 기능 장애일 수 있다. T 세포 기능 장애는 T 세포 기능이 손상되어, 예를 들어, 미생물, 박테리아 및 바이러스와 같은 외인성 제제에 의한 감염에 의해 생성되거나, 몇 가지 형태의 암에서(예를 들어, 종양 관련 항원의 형태로)와 같은 몇몇 질환 상태에서 숙주에 의해 생성된 병원성 항원에 대한 대상체의 면역 반응의 하향조절을 일으키는 질환 또는 병태일 수 있다. T 세포 기능 장애의 손상된 기능은 다음 중의 하나 이상일 수 있다: 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 대한 세포독성; 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 반응한 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그랜자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FAS 리간드 (FASL) 발현.
몇몇 양태에서, 치료는 T 세포의 다음의 특성들 중의 하나 이상을 증가/향상시키는 것을 목적으로 할 수 있다: 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 대한 세포독성; 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 반응한 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그랜자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FAS 리간드 (FASL) 발현. 몇몇 양태에서, 치료는 다음의 특성들 중의 하나 이상의 증가된/향상된 수준을 갖는 T 세포 또는 T 세포 집단을 제공하거나 생성하는 것을 목적으로 할 수 있다: 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 대한 세포독성; 예를 들어, T 세포가 특이적인 항원 또는 T 세포가 특이적인 항원을 포함/발현하는 세포에 반응한 증식, IFNγ 발현, CD107a 발현, IL-2 발현, TNFα 발현, 퍼포린 발현, 그랜자임 발현, 그라눌리신 발현, 및/또는 FASL 발현.
T 세포 기능 장애는 감염, 또는 감염에 대한 효과적인 면역 반응 증가 불능으로서 나타날 수 있다. 감염은 만성, 지속성, 잠재성 또는 지연성일 수 있으며, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 기생충 감염의 결과일 수 있다. 이와 같이, 치료가 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 갖는 환자에게 제공될 수 있다. 박테리아 감염의 예는 헬리오박터 필로리(Helicobacter pylori)로의 감염을 포함한다. 바이러스 감염의 예는 HPV, EBV, HIV, HBV, 및 HCV로의 감염을 포함한다. T 세포 기능 장애는 암과 관련될 수 있다.
치료는 T 세포 기능 장애의 예방, 예를 들어, 감염의 예방, 암의 발병 또는 진행의 예방을 목적으로 할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 및 조성물은 질환 또는 질환 상태의 발병/진행에 대한 에방에 사용될 수 있다. 이것은 질환 또는 질환 상태의 증상의 개시 전에 일어날 수 있고/있거나 질환 또는 질환 상태의 발병/진행 위험이 더 큰 것으로 간주되는 대상체에게 주어질 수 있다.
의학적 치료의 방법은 또한 자가 및/또는 이종 세포 또는 무한증식 세포주를 사용한 것을 포함하여 생체내, 생체외 및 입양 면역요법을 포함할 수 있다.
투여
투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량"으로 이루어지며, 이것은 개체에게 이익을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간-경로는 치료되는 질환의 성질 및 중증도에 따라 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량 결정 등은 일반 의사 및 다른 의사의 책임하에 있으며, 전형적으로 치료하고자 하는 병태, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 종사자들에게 알려진 다른 요인들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터 및 세포는 임상적 사용을 위한 약제학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있으며 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 조성물은 주사 또는 주입을 포함할 수 있는 국소, 비경구, 전신, 강내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내, 안내, 결막내, 종양내, 피하, 피내, 경막내, 경구 또는 경피 투여 경로용으로 제형화될 수 있다. 적합한 제형은 멸균 또는 등장성 매질 중의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 또는 세포를 포함할 수 있다. 약제 및 약제학적 조성물은 겔 형태를 포함한 유체로 제형화될 수 있다. 유체 제형은 인간 또는 동물 신체의 선택된 부위에 (예를 들어, 카테터를 통한) 주사 또는 주입에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
본 발명에 따르면 약제학적으로 유용한 조성물의 제조방법이 또한 제공되며, 이러한 제조방법은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다: 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 또는 세포를 단리하는 단계; 및/또는 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트, 부형제 또는 희석제와 혼합하는 단계.
예를 들면, 본 발명의 추가의 측면은 의학적 치료의 방법에서 사용하기 위한 약제 또는 약제학적 조성물을 제형화 또는 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 또는 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트, 부형제 또는 희석제와 혼합함으로써 약제학적 조성물 또는 약제를 제형화하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물의 투여는 바람직하게는 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"으로 이루어지며, 이것은 대상체에게 이익을 보여주기에 충분하다. 투여되는 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간-경로는 질환 또는 장애의 성질 및 중증도에 따라 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투여량 결정 등은 일반 의사 및 다른 의사의 책임하에 있으며, 전형적으로 치료하고자 하는 질환/장애, 개별 대상체의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 종사자들에게 알려진 다른 요인들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 찾아볼 수 있다.
투여는 치료하고자 하는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로, 단독으로 또는 다른 치료와 함께 이루어질 수 있다. 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물 및 치료제는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
몇몇 양태에서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물로의 치료는 다른 치료적 또는 예방적 개입, 예를 들어, 화학요법, 면역요법, 방사선요법, 수술, 예방접종 및/또는 호르몬 요법을 동반할 수 있다.
동시 투여는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물 및 치료제를 함께, 예를 들면 두 제제를 모두 함유하는 약제학적 조성물 (조합된 제제)로서, 또는 서로의 직후 및 임의로, 예를 들어, 동일한 동맥, 정맥 또는 다른 혈관으로 동일한 투여 경로를 통해 투여함을 가리킨다. 순차 투여는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물 또는 치료제 중 하나의 투여에 이어 주어진 시간 간격 후에 다른 약제의 별도 투여에 의해 투여함을 가리킨다. 두 제제가 동일한 경로로 투여될 필요는 없지만, 몇몇 양태에서는 이것이 사실이다. 시간 간격은 임의의 시간 간격일 수 있다.
화학요법 및 방사선요법은 각각 약물 또는 전리 방사선으로의 암의 치료 (예를 들어, X선 또는 γ선을 이용한 방사선요법)을 가리킨다. 약물은 화학적 엔티티, 예를 들어, 소분자 약제, 항생제, DNA 삽입제, 단백질 억제제 (예를 들어, 키나제 억제제), 또는 생물학적 제제, 예를 들어, 항체, 항체 단편, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 핵산 (예를 들어, DNA, RNA), 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질일 수 있다. 약물은 약제학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있다. 제형은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 부형제 또는 담체와 함께 하나 이상의 약물 (예를 들어, 하나 이상의 활성제)을 포함할 수 있다.
치료는 하나 이상의 약물의 투여를 수반할 수 있다. 약물은 치료하고자 하는 병태에 따라 동시에 또는 순차적으로, 단독으로 또는 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 화학요법은 두 가지 약물의 투여를 포함하는 공동-요법일 수 있으며, 이들 중 하나 이상은 암을 치료하기 위한 것일 수 있다.
화학요법은 하나 이상의 투여 경로에 의해, 예를 들어, 비경구, 정맥내 주사, 경구, 피하, 피내 또는 종양내 투여될 수 있다.
화학요법은 치료 섭생에 따라 투여될 수 있다. 치료 섭생은 의사 또는 의료 종사자에 의해 준비될 수 있고 치료를 필요로 하는 환자에게 적합하도록 맞춤화될 수 있는 화학요법 투여의 예정된 시간표, 계획, 체계 또는 일정일 수 있다.
치료 섭생은 다음 중의 하나 이상을 나타낼 수 있다: 환자에게 투여하는 화학요법의 유형; 각 약물 또는 방사선의 용량; 투여 간의 시간 간격; 각 치료의 길이; 있다면, 치료 휴일의 횟수와 성격 등. 공동-요법을 위해 각 약물을 투여하는 방법을 나타내는 단일 치료 섭생이 제공될 수 있다.
화학요법 약물 및 생물제제는 다음으로부터 선택될 수 있다: 알킬화제, 예를 들어 시스플라틴, 카보플라틴, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 이포스파미드; 푸린 및 피리미딘 항-대사산물, 예를 들어 아자티오푸린 또는 머캅토푸린; 알칼로이드 및 테르페노이드, 예를 들어 빈카 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 빈데신), 포도필로톡신, 에포토시드, 테니포시드, 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 (TaxolTM), 도세탁셀; 토포이소머라제 억제제, 예를 들어 타입 I 토포이소머라제 억제제 캄프토테신 이리노테칸 및 토포테칸, 또는 타입 II 토포이소머라제 억제제 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드; 항종양 항생제 (예를 들어, 안트라사이클린 항생제) 예를 들어 닥티노마이신, 독소루비신 (AdriamycinTM), 에피루비신, 블레오마이신, 라파마이신; 항체 기반 제제, 예를 들어 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-TIM-3 항체, 항-CTLA-4, 항-4-1BB, 항-GITR, 항-CD27, 항-BLTA, 항-OX43, 항-VEGF, 항-TNFα, 항-IL-2, 항GpIIb/IIIa, 항-CD-52, 항-CD20, 항-RSV, 항-HER2/neu(erbB2), 항-TNF 수용체, 항-EGFR 항체, 단클론 항체 또는 항체 단편, 예는 다음을 포함한다: 세툭시맙, 파니투무맙, 인플릭시맙, 바실릭시맙, 베바시주맙 (Avastin®), 압식시맙, 다클리주맙, 겜투주맙, 아렘투주맙, 리툭시맙 (Mabthera®), 팔리비주맙, 트라스투주맙, 에타네르셉트, 아달리무맙, 니모투주맙; EGFR 억제제, 예를 들어 에를로티닙, 세툭시맙 및 게피티닙; 항-혈관형성제, 예를 들어 베바시주맙 (Avastin®); 암 백신, 예를 들어 시풀로셀(Sipuleucel)-T (Provenge®).
추가의 화학요법 약물은 다음으로부터 선택될 수 있다: 13-시스-레티노산, 2-클로로데옥시아데노신, 5-아자시티딘 5-플루오로우라실, 6-머캅토푸린, 6-티오구아닌, 아브락산, 아큐탄®, 악티노마이신-D 아드리아마이신®, 아드루실®, 아피니토르®, 아그릴린®, 알라-코트®, 알데스류킨, 알렘투주맙, ALIMTA, 알리트레티노인, 알카반-AQ®, 알케란®, 올-트랜스레티노산, 알파 인터페론, 알트레타민, 아메톱테린, 아미포스틴, 아미노글루테티미드, 아나그렐리드, 아난드론®, 아나스트로졸, 아라비노실시토신, 아라네스프®, 아레디아®, 아리미덱스®, 아로마신®, 아라논®, 삼산화비소, 아스파라기나제, ATRA 아바스틴®, 아자시티딘, BCG, BCNU, 벤다무스틴, 베바시주맙, 벡사로텐, BEXXAR®, 비칼루타미드, BiCNU, 블레녹산®, 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 부설펙스®, 칼슘 류코보린, 캄파트®, 캄프토사®, 캄프토테신-11, 카페시타빈, Carac™, 카보플라틴, 카르무스틴, 카소덱스®, CC-5013, CCI-779, CCNU, CDDP, CeeNU, 세루비딘®, 세툭시맙, 클로람부실, 시스플라틴, 시트로보룸 인자, 클라드리빈, 코르티손, 코스메겐®, CPT-11, 사이클로포스파미드, 시타드렌®, 시타라빈 시토사-U®, 시톡산®, 다코겐, 닥티노마이신, 다베포에틴 알파, 다사티닙, 다우노마이신, 다우노루비신, 다우노루비신 하이드로클로라이드, 리포솜 다우노루비신, 다우노솜®, 데카드론, 데시타빈, 델타-코르테프®, 델타손®, 데닐류킨, 디프티톡스, DepoCyt™, 덱사메타손, 덱사메타손 아세테이트, 덱사메타손 나트륨 포스페이트, 덱사손, 덱스라족산, DHAD, DIC, 디오덱스, 도세탁셀, 독실®, 독소루비신, 리포솜 독소루비신, 드록시아™, DTIC, DTIC-Dome®, 두랄론®, 엘리가드™, 엘렌스™, 엘록사틴™, 엘스파®, 엠시트®, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에르비툭스, 에를로티닙, 에르비니아 L-아스파라기나제, 에스트라무스틴, 에티올 에토포포스®, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트, 유렉신®, 에베롤리무스, 에비스타®, 엑세메스탄, 파슬로덱스®, 페마라®, 필그라스팀, 플록슈리딘, 플루다라®, 플루다라빈, 플루오로플렉스®, 플루오로우라실, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 폴린산, FUDR®, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 겜투주맙 오조가미신, 글리벡™, 글리아델® 웨이퍼, 고세렐린, 과립구-콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 헤르셉틴®, 헥사드롤, 헥살렌®, 헥사메틸멜라민, HMM, 히캄틴®, 히드레아®, 하이드로코르트 아세테이트®, 하이드로코르티손, 하이드로코르티손 나트륨 포스페이트, 하이드로코르티손 나트륨 석시네이트, 하이드로코르티손 포스페이트, 하이드록시우레아, 이브리투모맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다마이신®, 이다루비신, 이펙스®, IFN-알파, 이포스파미드, IL-11, IL-2, 이마티닙 메실레이트, 이미다졸 카복스아미드, 인터페론 알파, 인터페론 알파-2b (PEG 접합체), 인터류킨-2, 인터류킨-11, 인트론 A® (인터페론 알파-2b), 이레사®, 이리노테칸, 이소트레티노인, 익사베필론, 익셈프라™, 키드롤라제, 라나코르트®, 라파티닙, L-아스파라기나제, LCR, 레날리도미드, 레트로졸, 류코보린, 류케란, 류킨™, 류프롤리드, 류로크리스틴, 류스타틴™, 림포솜 Ara-C, 지질 프레드®, 로무스틴, L-PAM, L-사르콜리신, 루프론®, 루프론 데포트®, 마툴란®, 막시덱스, 메클로레타민 하이드로클로라이드, 메드랄론®, 메드롤®, 메게이스®, 메게스트롤, 메게스트롤 아세테이트, 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메스넥스™, 메토트렉세이트, 메토트렉세이트 나트륨, 메틸프레드니솔론, 메티코르텐®, 미토마이신, 미토마이신-C, 미톡산트론, M-프레드니솔®, MTC, MTX, 무스타르겐®, 무스틴, 무타마이신®, 마이레란®, 마이로셀™, 마이로타그®, 나벨빈®, 넬라라빈, 네오사®, 뉴라스타™, 뉴메가®, 뉴포겐®, 넥사바®, 닐란드론®, 닐루타미드, 니펜트®, 질소 머스타드, 노발덱스®, 노반트론®, 옥트레오타이드, 옥트레오타이드 아세테이트, 온코스파®, 온코빈®, 온타크®, 온살™, 오프레벨킨, 오라프레드®, 오라손®, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 단백질-결합된 파클리탁셀, 파미드로네이트, 파니투무맙, 판레틴®, 파라플라틴®, 페디아프레드®, PEG 인터페론, 페가스파가제, 페그필그라스팀, PEG-INTRON™, PEG-L-아스파라기나제, PEMETREXED, 펜토스타틴, 페닐알라닌 머스타드, 플라틴올®, 플라틴올-AQ®, 프레드니솔론, 프레드니손, 프렐론®, 프로카바진, PROCRIT®, 프로류킨®, 카르무스틴 이식물 퓨리네톨®을 갖는 프롤리페프로스탄 20, 랄록시펜, 레블리미드®, 류마트렉스®, 리툭산®, 리툭시맙, 로페론-A® (인터페론 알파-2a), 루벡스®, 루비도마이신 하이드로클로라이드, 산도스타틴® 산도스타틴 LAR®, 사그라모스팀, 솔루-코르테프®, 솔루-메드롤®, 소라페닙, SPRYCEL™, STI-571, 스트렙토조신, SU11248, 수니티닙, 수텐트®, 타목시펜, 타세바®, 타그레틴®, 탁솔®, 탁소테레®, 테모다®, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, TESPA, 탈리도미드, 탈로미드®, 테라시스®, 티오구아닌, 티오구아닌 타블로이드®, 티오포스포아미드, 티오플렉스®, 티오테파, TICE®, 토포사®, 토포테칸, 토레미펜, 토리셀®, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레안다®, 트레티노인, 트렉살™, 트리세녹스®, TSPA, TYKERB®, VCR, 벡티빅스™, 벨반®, 벤카드®, 베페시드®, 베사노이드®, 비아두르™, 비다자®, 빈블라스틴, 빈블라스틴 설페이트, 빈카사 Pfs®, 빈크리스틴, 비노렐빈, 비노렐빈 타르트레이트, VLB, VM-26, 보리노스타트, VP-16, 부몬®, 젤로다®, 자노사®, 제발린™, 지네카드®, 졸라덱스®, 졸레드론산, 졸린자, 조메타®.
다중 용량의 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물이 제공될 수 있다. 하나 이상의, 또는 각각의 용량은 다른 치료제의 동시 또는 순차 투여를 동반할 수 있다.
다중 용량은 예비결정된 시간 간격에 의해 분리될 수 있으며, 이것은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중의 하나이도록 선택될 수 있다. 예를 들자면, 용량은 7, 14, 21 또는 28일마다 한 번씩 (3일, 2일 또는 1일 플러스 또는 마이너스) 제공될 수 있다.
입양 전달
본 발명의 양태에서, 치료 또는 예방의 방법은 면역 세포의 입양 전달을 포함할 수 있다.
입양 세포 전달 (ACT)은 일반적으로 이로부터 세포가 단리되는 혈액 샘플을 추출함으로써 대상체로부터 세포 (예를 들어, 면역 세포)를 수득하는 과정을 가리킨다. 그후 세포를 전형적으로 어떠한 방식으로 치료하거나 변형한 다음 동일 대상체 또는 상이한 대상체에 투여한다. 치료는 전형적으로 대상체에 특정의 목적하는 특성을 갖는 세포 집단을 제공하거나 그 대상체에서 이러한 특성을 갖는 세포의 빈도를 증가시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명에서, 입양 전달은 세포 또는 세포 집단을 대상체에 도입하고/하거나 대상체에서 세포 또는 세포 집단의 빈도를 증가시키는 것을 목적으로 하여 수행될 수 있다.
T 세포의 입양 전달은, 예를 들면, 문헌[Kalos and June 2013, Immunity 39(1): 49-60]에 기술되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다. NK 세포의 입양 전달은, 예를 들면, 문헌[Davis et al. 2015, Cancer J. 21(6): 486-491]에 기술되어 있으며, 이것은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
세포는, 예를 들어, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지상 세포, 림프구 또는 단핵구일 수 있다. 림프구는, 예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포, NKT 세포 또는 선천적 림프상 세포 (ILC), 또는 이의 전구물질일 수 있다. 몇몇 양태에서, 세포는 T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 CD3+ T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 CD3+, CD8+ T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 세포독성 T 세포 (예를 들어, 세포독성 T 림프구 (CTL))이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 바이러스-특이 T 세포이다. 몇몇 양태에서, T 세포는 EBV, HPV, HBV, HCV 또는 HIV에 대해 특이적이다.
본 발명은 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하거나 제시하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상체로부터 수득된 적어도 하나의 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 발현하거나 포함하도록 변형하는 단계, 임의로 변형된 적어도 하나의 세포를 확장시키는 단계, 및 변형된 적어도 하나의 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
(b) 적어도 하나의 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 발현 또는 포함하도록 변형시키는 단계,
(c) 임의로 변형된 적어도 하나의 세포를 확장시키는 단계, 및;
(d) 변형된 적어도 하나의 세포를 대상체에 투여하는 단계.
몇몇 양태에서, 이로부터 세포가 단리되는 대상체는 변형된 세포가 투여된 대상체이다 (즉, 입양 전달은 자가 세포의 것이다). 몇몇 양태에서, 이로부터 세포가 단리되는 대상체는 변형된 세포가 투여되는 대상체와는 상이한 대상체이다 (즉, 입양 전달이 동종 세포의 것이다).
본 발명에 따라 변형된 적어도 하나의 세포는 숙련가에게 널리 공지된 방법에 따라 변형될 수 있다. 변형은 전달된 핵산의 영구적 또는 일시적 발현을 위한 핵산 전달을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR), 또는 CAR을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하거나 발현하도록 추가로 변형될 수 있다.
임의의 적합한 유전 공학 플랫폼이 본 발명에 따르는 세포를 변형시키는데 사용될 수 있다. 세포를 변형시키는데 적합한 방법은, 예를 들면 상기 본원에 참고로 포함된 문헌[Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225]에 기술된 바와 같이, 감마레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, DNA 형질감염, 트랜스포손-기반 유전자 전달 및 RNA 형질감염과 같은 유전 공학 플랫폼의 사용을 포함한다.
몇몇 양태에서 방법은 다음의 단계들 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: 대상체로부터 혈액 샘플을 채취하는 단계; 혈액 샘플로부터 적어도 하나의 세포를 단리 및/또는 확장시키는 단계; 시험관내 또는 생체외 세포 배양액에서 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계; 적어도 하나의 세포 내로 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 또는 벡터를 도입함으로써, 적어도 하나의 세포를 변형시키는 단계; 적어도 하나의 변형된 세포를 확장시키는 단계; 적어도 하나의 변형된 세포를 수집하는 단계; 변형된 세포를 아주반트, 희석제, 또는 담체와 혼합하는 단계; 변형된 세포를 대상체에 투여하는 단계.
몇몇 양태에서, 상기 방법은 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 또는 벡터의 발현을 유도/향상시키도록 세포를 처리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 핵산/벡터는 특정 제제로의 처리에 반응한 핵산/벡터로부터의 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR의 발현의 유도 가능한 상향조절을 위한 조절 요소를 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 처리는 본 발명에 따르는 변형된 세포가 투여된 대상체에 제제를 투여함으로써 생체내에서 이루어질 수 있다. 몇몇 양태에서, 처리는 생체외 또는 시험관내 배양액에서 세포에 제제를 투여함으로써 생체외 또는 시험관내 이루어질 수 있다.
숙련가는, 예를 들면 전문이 참고로 포함된 문헌[Dai et al., 2016 J Nat Cancer Inst 108(7): djv439]을 참고로 하여 본 발명에 따르는 세포의 입양 전달을 위한 적절한 시약 및 과정을 결정할 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 세포 내로 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 도입함으로써 적어도 하나의 세포를 변형시킴을 포함하여, 변형된 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 바람직하게는 시험관내 또는 생 체외에서 수행된다.
하나의 측면에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다:
(a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
(b) 적어도 하나의 세포 내로 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 도입함으로써, 적어도 하나의 세포를 변형시키는 단계; 및
(c) 변형된 적어도 하나의 세포를 대상체에 투여하는 단계.
몇몇 양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 암호화하는 핵산 또는 벡터를 도입하도록 추가로 변형될 수 있다.
몇몇 양태에서, 상기 방법은, 예를 들어, 암의 치료 또는 예방을 위한 치료적 또는 예방적 개입을 추가로 포함한다. 몇몇 양태에서, 치료적 또는 예방적 개입은 화학요법, 면역요법, 방사선요법, 수술, 예방접종 및/또는 호르몬 요법으로부터 선택된다.
검출 방법
본원에 기술된 TGF-β 디코이 수용체 및 CAR은 TGF-β (예를 들어, TGF-β1, TGF-β2 또는 TGF-β3)에의 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR의 결합을 수반하는 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR 및 TGF-β의 결합된 복합체의 검출을 수반할 수 있다. 이와 같이, 하나의 양태에서 TGF-β를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 본원에 기술된 바와 같은 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR과 접촉시키는 단계 및 TGF-β 디코이 수용체/CAR과 TGF-β의 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
샌드위치 검정, 예를 들어, ELISA와 같은 면역검정을 포함한 적합한 방법 포맷은 당업계에 널리 공지되어 있다. 방법은 TGF-β 디코이 수용체/CAR, 또는 TGF-β, 또는 둘 다를 검출 가능한 표지, 예를 들어, 형광, 발광 또는 방사-표지로 표지함을 포함할 수 있다. TGF-β 발현은, 예를 들면 생검에 의해 수득된 조직 샘플의 면역조직화학 (IHC)에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 양태에서, 표지는 방사성-뉴클레오티드, 양전자-방출 방사성 핵종 (예를 들면, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)의 경우), MRI 조영제 또는 형광 표지로부터 선택될 수 있다.
TGF-β에 의해 매개된 공정의 시험관내 또는 생체내 분석은 양전자-방출 단층촬영 (PET), 자기 공명 이미징 (MRI), 또는 형광 이미징에 의한, 예를 들어, 적절하게 표지된 화학종의 검출에 의한 분석을 포함할 수 있다.
이러한 종류의 방법은 TGF-β의 검출 및 또는 정량을 필요로 하는 질환 또는 병태의 진단 방법의 기초를 제공할 수 있다. 이러한 방법은 환자 샘플에서 시험관내에서 수행되거나, 환자 샘플의 가공 후에 수행될 수 있다. 일단 샘플이 수집되면, 환자가 진단의 시험관내 방법을 수행할 필요가 없으며 따라서 상기 방법은 인간 또는 동물 신체에서 수행되지 않는 방법일 수 있다.
이러한 방법은 환자 샘플에 존재하는 TGF-β의 양을 결정함을 포함할 수 있다. 상기 방법은 진단에 이르는 과정의 일부로서 상기 결정된 양을 표준 또는 기준 값과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 진단 또는 예후의 정확성을 향상시키거나 본원에 기술된 검사를 사용하여 수득된 결과를 확인하기 위해 본원에 기술된 진단 테스트와 함께 다른 진단 테스트가 사용될 수 있다.
환자 샘플에 존재하는 TGF-β의 수준은 환자가 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물로의 치료에 반응할 수 있음을 나타낼 수 있다. 샘플 중의 높은 수준의 TGF-β의 존재는, 예를 들어, 본원에 기술된 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물로의 본원에 기술된 바와 같은 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체 및 CAR은 본원에 기술된 바와 같은 치료를 위해 환자를 선택하는데 사용될 수 있다.
TGF-β의 샘플에서의 검출은 질환 또는 병태의 진단, 질환 또는 병태의 소인, 또는 질병 또는 병태의 예후 (예측)를 제공하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 진단 또는 예후는 기존의 (이전에 진단된) 질환/병태와 관련될 수 있다.
샘플은 임의의 조직 또는 체액으로부터 채취할 수 있다. 샘플은 다음을 포함하거나 다음으로부터 유래할 수 있다: 다량의 혈액; 피브린 응괴 및 혈액 세포의 제거 후에 수득된 혈액의 유체 부분을 포함할 수 있는 개체의 혈액으로부터 유래된 다량의 혈청; 조직 샘플 또는 생검; 흉수; 뇌척수액 (CSF); 또는 상기 개체로부터 단리된 세포. 몇몇 양태에서, 샘플은 질환/병태에 의해 영향을 받는 조직 또는 조직들 (예를 들어, 질환의 증상이 나타나거나 질환/병태의 발병기전에 관여하는 조직 또는 조직들)로부터 수득되거나 유래될 수 있다.
본 발명에 따르는 방법은 바람직하게는 시험관내에서 수행될 수 있다. 용어 "시험관내에서"는 배양액 중의 세포를 사용한 실험을 포함하는 것으로 의도되는 반면 용어 "생체내에서"는 온전한 다세포 생물을 사용한 실험 및/또는 처리를 포함하는 것으로 의도된다.
키트
본 발명의 몇몇 측면에서 부품의 키트가 제공된다. 몇몇 양태에서 키트는 예비결정된 양의 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포, 또는 조성물을 갖는 적어도 하나의 용기를 가질 수 있다.
키트는 명시된 질환/병태를 치료하기 위해 환자에게 투여하기 위한 지침서와 함께 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물을 제공할 수 있다. TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포 또는 조성물은 종양에 또는 혈액에 주사 또는 주입하기에 적합하도록 제형화될 수 있다.
몇몇 양태에서 키트는 본 발명에 따르는 세포를 생산하기 위한 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 키트는 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산 또는 벡터를 발현하거나 포함하도록 세포를 변형시키기 위한 물질, 또는 세포 내로 본 발명에 따르는 핵산 또는 벡터를 도입하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
몇몇 양태에서 키트는 예비결정된 양의 또 다른 치료제 (예를 들어, 항감염제 또는 화학요법제)를 갖는 적어도 하나의 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 양태에서, 키트는 또한 두 개의 약제 또는 약제학적 조성물이 특정 질환 또는 병태에 대한 병용 치료를 제공하도록 동시에 또는 별도로 투여될 수 있도록 제2 약제 또는 약제학적 조성물을 포함할 수 있다. 치료제는 또한 종양 또는 혈액에 주사 또는 주입하기에 적합하도록 제형화될 수 있다.
단백질 발현
세포에서 본 발명에 따르는 단백질 (예를 들어, TGF-β 디코이 수용체 및 CAR)을 생산하는데 적합한 분자 생물학 기술은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 제시된 것과 같이 당업계에 널리 공지되어 있다. 폴리펩타이드는 핵산 서열로부터 발현될 수 있다. 핵산 서열은 세포에 존재하는 벡터에 함유될 수 있거나, 세포의 게놈에 삽입될 수 있다.
폴리펩타이드의 발현에 적합한 임의의 세포가 본 발명에 따르는 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 세포는 원핵생물 또는 진핵생물일 수 있다. 적합한 원핵생물 세포는 이. 콜라이(E.coli)를 포함한다. 진핵 세포의 예는 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 또는 포유류 세포 (예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포)를 포함한다. 몇몇 경우에 세포는 원핵 세포가 아니며, 그 이유는 일부 원핵 세포는 진핵생물과 동일한 번역후 변형을 허용하지 않기 때문이다. 또한, 매우 높은 발현의 수준은 진핵생물에서 가능하며 단백질은 적절한 태그를 사용하여 진핵생물로부터 정제하기가 더 쉬울 수 있다. 배지로의 단백질의 분비를 향상시키는 특정 플라스미드가 또한 이용될 수 있다.
관심 폴리펩타이드를 생산하는 방법은 폴리펩타이드를 발현하도록 변형된 세포의 배양 또는 발효를 포함할 수 있다. 배양 또는 발효는 영양분, 공기/산소 및/또는 성장 인자의 적절한 공급이 제공된 생물반응기에서 수행될 수 있다. 분비된 단백질은 세포로부터 배양 배지/발효 브로스를 분배하고, 단백질 함량을 추출하고, 개별 단백질을 분리하여 분비된 폴리펩타이드를 단리시킴으로써 수집될 수 있다. 배양, 발효 및 분리 기술은 당업계의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
생물반응기는 세포가 배양될 수 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 생물반응기에서의 배양은 반응기로의 반응물의 연속적인 유동 및 반응기로부터의 배양된 세포의 연속적인 유동으로 연속적으로 발생할 수 있다. 대안적으로, 배양은 배치에서 일어날 수 있다. 생물반응기는 배양되는 세포에 최적의 조건이 제공되도록 pH, 산소, 유입 및 유출 속도, 및 용기내 교반과 같은 환경 조건을 모니터링하고 제어한다.
관심 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 배양 후, 그 폴리펩타이드는 바람직하게는 단리된다. 당업계에 공지된 세포 배양물로부터 폴리펩타이드를 분리하는데 적합한 방법이 사용될 수 있다. 배양물로부터 관심 폴리펩타이드를 단리하기 위해서는 관심 폴리펩타이드를 함유하는 배지로부터 배양된 세포를 먼저 분리할 필요가 있을 수 있다. 관심 폴리펩티드가 세포로부터 분비되면, 세포를 분비된 폴리펩타이드를 함유하는 배양 배지로부터 원심분리에 의해 분리할 수 있다. 관심 폴리펩타이드가 세포 내에서 수집되면, 예를 들면 초음파 처리, 급속 동결-해동 또는 삼투성 용해를 사용하여 원심분리 전에 세포를 파쇄할 필요가 있을 것이다. 원심분리는 배양된 세포, 또는 배양된 세포의 세포 잔해를 함유하는 펠렛, 및 배양 배지 및 관심 폴리펩타이드를 함유하는 상청액을 생성할 것이다.
그후 다른 단백질 및 비-단백질 성분을 함유할 수 있는 상청액 또는 배양 배지로부터 관심 폴리펩타이드를 단리하는 것이 바람직할 수 있다. 상청액 또는 배양 배지로부터 폴리펩타이드 성분을 분리하는 일반적인 접근법은 침전에 의한 것이다. 상이한 용해도의 폴리펩타이드/단백질을 상이한 농도의 침전제, 예를 들어 황산암모늄에서 침전시킨다. 예를 들면, 낮은 농도의 침전제에서는, 수용성 단백질이 추출된다. 따라서, 증가하는 농도의 침전제를 첨가함으로써, 상이한 용해도의 단백질이 구별될 수 있다. 후속적으로, 분리된 단백질로부터 황산암모늄을 제거하기 위해 투석을 사용할 수 있다.
상이한 폴리펩타이드/단백질을 구별하기 위한 다른 방법, 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 크로마토그래피는 당업계에 공지되어 있다. 이들은 침전의 대안으로 사용될 수 있거나, 침전에 이어서 수행될 수 있다.
일단 관심 폴리펩타이드가 배양물로부터 단리되면, 단백질을 농축하는 것이 필요할 수 있다. 한외여과 또는 동결건조와 같은 관심 단백질을 농축하기 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다.
서열 동일성
둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 간의 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적으로의 쌍별 및 다중 서열 정렬은 당업계의 숙련가에게 공지된 다양한 방법으로, 예를 들어 ClustalOmega (Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960), T-coffee (Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217), Kalign (Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)) 및 MAFFT (Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780) 소프트웨어와 같은 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용하는 경우, 예를 들어, 갭 페널티 및 익스텐션 페널티에 대한 기본 매개변수가 바람직하게 사용된다.
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본 발명은 이러한 조합이 명확히 허용될 수 없거나 명백히 회피되는 경우를 제외하고 설명된 측면 및 바람직한 특징의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 조직적인 목적만을 위한 것이며 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 측면 및 양태는 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 예로서 예시될 것이다. 추가의 측면 및 양태는 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다. 이 문서에 언급된 모든 문서는 본원에 참조로 포함된다.
후술하는 청구항을 포함하여, 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 의미하지는 않는 것으로 이해될 것이다.
명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다는 것을 주지해야 한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값에서 및/또는 "약" 다른 특정 값까지로서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 양태는 하나의 특정 값에서 및/또는 또 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게, 값이 근사값으로 표현될 때, "약"이라는 전제를 사용함으로써, 특정 값이 다른 양태를 형성한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 원리를 예시하는 양태들 및 실험이 이하에서 첨부된 도면을 참조하여 논의될 것이며, 여기서:
도 1. 본 발명의 TGF-β 디코이 수용체 작제물에 의해 암호화된 아미노산 서열.
도 2. 본 발명의 성숙한 TGF-β 디코이 수용체의 도식적 표현.
도 3a 내지 3h. 항-인간 TGF-β RII 항체 클론 REA903을 사용한 유동 세포 계측에 의해 검출되는 바와 같은, 형질감염된 HeLa 세포 표면에서의 TGF-β 디코이 수용체의 발현을 보여주는 산점도. 3a 내지 3e는 DN-TGF-βR2 (3a), TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI 앵커 (3b), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (3c), TGF-βRII-CD55 GPI 앵커 (3d) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (3e)를 암호화하는 벡터로 형질감염시킨 후 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 세포의 백분율을 보여준다. 3f 및 3g는 항-인간 TGF-β RII 항체로 염색된 (3f) 또는 염색되지 않은 (3g) 야생형, 비-형질감염된 HeLa 세포의 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 세포의 백분율을 보여준다. 3h는 GFP를 암호화하는 벡터로 형질감염 후 GFP를 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 4. 항-인간 TGF-β RII 항체 클론 REA903을 사용한 유동 세포계측에 의해 검출되는 바와 같은, 형질도입된 활성화된 T 세포의 표면에서의 TGF-β 디코이 수용체의 발현을 보여주는 산점도. 4a 내지 4e는 DN-TGF-βR2 (4a), TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI 앵커 (4b), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (4c), TGF-βRII-CD55 GPI 앵커 (4d) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (4e)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입 후 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 세포의 백분율을 보여준다. 4f는 항-인간 TGF-β RII 항체로 염색된 야생형, 비-형질도입된 활성화된 T 세포의 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 세포의 백분율을 보여준다. 4g 및 4h는 GFP를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입 후 GFP를 발현하는 세포, 항-인간 TGF-β RII 항체로 염색된 (4g) 또는 염색되지 않은 (4h) 활성화된 T 세포의 백분율을 보여준다.
도 5a 내지 5c. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 GFP (GFP) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서 상이한 단백질을 발현하는 백혈구의 백분율을 보여주는 그래프. 5a는 백혈구의 총 수를 보여주고, 5b는 GFP+ 세포의 백분율을 보여주며, 5c는 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a 및 6b. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 GFP (GFP), DN-TGF-βR2 (DN), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (CD48) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서의 총 백혈구 집단의 비율로서 상이한 단백질을 발현하는 CD3+ T 세포의 백분율을 보여주는 그래프. 6a는 CD3+ T 세포의 백분율을 보여주고 6b는 GFP+ CD3+ T 세포의 백분율을 보여준다.
도 7a 내지 7d. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 GFP (GFP) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서의 CD3+ 세포 집단의 비율로서 상이한 단백질을 발현하는 CD4 및 CD8 T 세포 하위세트의 백분율을 보여주는 그래프. 7a는 CD4+, GFP+ 세포의 백분율을 보여주고, 7b는 CD8+, GFP+ 세포의 백분율을 보여주고, 7c는 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 CD4+ 세포의 백분율을 보여주고, 7d는 세포 표면에서 TGF-βR2 엑토도메인을 발현하는 CD8+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 8a 내지 8e. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 나타낸 농도에서 TGF-β로 30 min 동안 자극한 후, 비-형질도입된 HeLa 세포 (wt), 또는 GFP (GFP) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포에서 총 세포 집단의 비율로서 상이한 단백질을 발현하는 HeLa 세포의 백분율을 보여주는 그래프. 8a는 인산화된 SMAD2/3에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율을 보여주고, 8b는 인산화된 SMAD1/5/9에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율을 보여주며, 8c는 NFκB p65에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율을 보여주고, 8d는 인산화된 MAPKK에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율을 보여주며, 8e는 CREB에 대해 양성으로 염색된 세포의 백분율을 보여준다.
도 9a 내지 9c. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 나타낸 농도에서 TGF-β로 30 min 동안 자극한 후, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 GFP (GFP), DN-TGF-βR2 (DN), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (CD48) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서 CD3+ 세포 집단의 비율로서 상이한 단백질을 발현하는 CD8+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프. 9a는 CD8 및 인산화된 SMAD2/3에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여주고, 9b는 CD8 및 NFκB p65에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여주며, 9c는 CD8 및 CREB에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 10a 내지 10c. 유동 세포계측에 의해 결정되는 바와 같이, 나타낸 농도에서 TGF-β로 30 min 동안 자극한 후, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 GFP (GFP), DN-TGF-βR2 (DN), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (CD48) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서 CD3+ 세포 집단의 비율로서 상이한 단백질을 발현하는 CD4+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프. 10a는 CD4 및 인산화된 SMAD2/3에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여주고, 10b는 CD4 및 NFκB p65에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여주며, 10c는 CD4 및 CREB에 대해 양성으로 염색된 CD3+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 11. 나타낸 농도에서 TGF-β로 30 min 동안 자극한 후, 비-형질도입된 활성화된 T 세포 (wt), 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 활성화된 T 세포에서 인산화된 SMAD2/3의 수준의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여주는 이미지. 부하 대조군이 나타내어져 있다.
도 12. 나타낸 농도에서 TGF-β로 30 min 동안 자극한 후, 비-형질도입된 HeLa 세포 (wt), 또는 GFP (GFP) 또는 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (CD90)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포에서 인산화된 SMAD2/3의 수준의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여주는 이미지. 부하 대조군이 나타내어져 있다.
도 13a 및 13b. TGF-β로 자극 후, 비-형질도입된 HeLa 세포 (WT), 및 TGF-βRII-CD48 GPI 앵커 (48), TGF-βRII-CD90 GPI 앵커 (90), 또는 DN-TGF-βR2 (DN)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포의 핵에 편재된 (13a) 인산화된 p38 및 (13b) 인산화된 SMAD2의 수준의 형광 현미경에 의한 분석의 결과를 보여주는 그래프.
실시예
하기 실시예에서, 본 발명자들은 TGF-β 결합 디코이 수용체 분자의 설계 및 이의 기능적 특성을 기술한다.
실시예 1: TGF -β 디코이 수용체 설계
렌티바이러스 벡터가 TGF-β에 대한 타입 II 수용체의 TGF-β 결합 도메인 및 상이한 세포막 앵커 영역을 암호화하는 TGF-β 디코이 수용체 작제물을 제조하는데 사용된다.
TGF-β에 대한 타입 II 수용체의 세포외 도메인에 대한 cDNA가 CD48, CD44, CD55, CD90 또는 태반형 알칼리성 포스파타제에 대한 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 암호화하는 cDNA와 인-프레임으로 클로닝된다 (작제물에 의해 암호화된 아미노산 서열은 도 1에 도시되어 있다).
실시예 2: 인간 T 림프구를 발현하는 TGF -β 디코이 수용체의 생성
렌티바이러스 형질도입을 위해, 5x106개 HEK 293T 세포를 0.002% 폴리-L-리신 (Sigma, St. Louis MO)으로 예비-피복된 10 cm2 디쉬 상에 평판배양한다. 렌티바이러스 벡터를 패키징 및 엔벨로프 유전자를 암호화하는 플라스미드로 공동-형질감염시키고, 공동-형질감염시킨지 수 일 후에 바이러스-함유 상청액을 수집하고 0.45 ㎛ 필터에 통과시킨다. 그후, 상청액을 25,000 rpm에서 초원심분리에 의해 농축시키고, 적정한 다음 사용할 때까지 -80℃에서 저장한다.
건강한 기증자로부터 단리된 일차 인간 T 림프구를 획득한다. T 세포를 완전 배지 (10% 불활성화 FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신 설페이트가 보충된 RPMI 1640)에서 배양하고, 항-CD3 및 항-CD28mAb-피복된 비드 (Invitrogen)로 자극하여 활성화시킨다. 활성화시킨지 12시간 후, T 세포를 폴리브렌의 존재하에서 렌티바이러스 벡터로 형질도입한다. IL-2를 격일로 첨가함으로써 인간 T 림프구를 확장시키고 유지시킨다.
실시예 3: TGF -β 디코이 수용체를 발현하는 T 세포의 기능적 특성화
3.1 표면 발현
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 디코이 수용체의 표면 발현에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입하고, 세포 표면에서의 발현을 TGF-βR2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 유동 세포계측 분석에 의해 분석한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포와 비교하여 항-TGF-βR2 항체로 염색된 더 많은 표면을 나타낸다.
3.2 가용성 발현
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 디코이 수용체의 가용성 발현에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입하고, 수용체의 가용성 발현을 TGF-βR2의 세포외 도메인에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 사용하여 세포 배양물 상청액의 ELISA에 의해 측정한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 더 많은 가용성 수용체를 분비한다.
3.3 TGF -β 매개된 신호전달
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 TGF-β로의 자극에 반응하는 능력에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 세포를 TGF-β로 처리하여 자극하고, TGF-β 매개된 신호전달의 수준을 분석한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 더 적은 TGF-β 매개된 신호전달을 나타낸다.
3.4 증식/확장
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 시험관내에서 증식하는 능력에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 세포를 TGF-β로 처리하여 자극하고 세포의 증식을 분석한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 더 많이 증식한다.
3.5 생존
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 지속성/생존 능력에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 세포를 TGF-β로 처리하여 자극하고 세포 수를 시간 경과에 따라 모니터링한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 증가된 생존률을 갖는 것으로 밝혀졌다.
3.6 세포독성
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 시험관내에서 세포독성에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 세포를 TGF-β로 처리하여 자극하고 T 세포가 특이적인 항원을 발현하는 세포에 대한 세포독성을 분석한다. 세포를 또한 세포독성/효과기 인자의 유전자 또는 단백질 발현에 대해 분석한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 개선된 세포독성 및 세포독성/효과기 인자의 증가된 발현을 나타낸다.
3.7 시험관내에서 종양 세포를 사멸시키는 능력
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 시험관내에서 종양 세포를 사멸시키는 능력에 대해 분석한다.
간력하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 변형된 세포를 시험관내에서 종양 세포를 용해시키는 이들의 능력에 대해 분석한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 T 세포는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 더 신속하게 종양 세포를 사멸시키는 것으로 밝혀졌다. 이것은 효과기 세포:종양 세포 비에 대한 정규화 후에도 관찰된다.
3.8 생체내 암의 치료
TGF-β 디코이 수용체를 발현하도록 변형된 T 세포를 마우스 모델에서 생체내에서 암을 치료하는 능력에 대해 분석한다.
간략하게, T 세포를 본 발명에 따르는 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입한다. 그후, 변형된 세포를 확립된 암 모델을 갖는 마우스에게 투여하고, 암 진행 및 생존을 모니터링한다.
본 기재내용의 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포로 처리된 마우스는 음성 대조군 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 T 세포에 비해 개선된 생존률 또는 질환 진행의 감소된 중증도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 특성화된 TGF -β 디코이 수용체
하기 실시예에서 특성화된 TGF-β 디코이 수용체 분자의 개요가 아래에 제공된다:
Figure pct00001
렌티바이러스 벡터 pD2109-EFs: EF1a-ORF, Lenti-ElecD (ATUM, Newark, CA, USA)가 TGF-β 디코이 수용체를 암호하하는 작제물, 및 GFP를 암호화하는 대조 작제물을 제조하는데 사용되었다.
실시예 5: 활성화된 T 세포 (ATC)의 제조
PBMC를 다른 기증자들로부터 수득된 혈액 샘플로부터 Ficoll 구배에 의해 정제하였다. 이어서, CD3+ T 세포를 CD3 자석 비드 (Miltenyi)를 사용하여 PBMC로부터 양성으로 선택하였다.
그후 T 세포를 자극하였다. 간략하게, 1x106개 T 세포를 IL-2 (40 U/ml) 및 CD3/CD28 Dynabead (Gibco)를 함유하는 1 ml의 CTL 배지 (50% RPMI, 50% CLICK 배지, 10% FBS)에 24 내지 72 hr 동안 접종하여 활성화된 T 세포 (ATC)를 수득하였다.
실시예 6: 렌티바이러스의 생산 및 표적 세포의 형질도입
6.1 렌티바이러스의 생산
1.2-2.4 x 106개 293T 세포를 10% FBS 및 항생제가 보충된 10 ml의 DMEM 배지에서 10 cm2 세포 배양 디쉬에 평판배양하였다.
다음날, 3 μg의 렌티바이러스 벡터 작제물 DNA, 1.5 μg의 엔벨로프 플라스미드 pMD2.G, 1.5 μg의 패키징 플라스미드 pRSV-REV 및 1.5 μg의 패키징 플라스미드 pMDLg/pRRE를 포함하는 DNA 혼합물을 제조하였다. 18 μl의 Fugene 6 (Roche) 및 270 μl의 FBS-비함유 DMEM 또는 Opti-MEM의 별도의 혼합물을 제조하고, 10초 동안 보텍싱에 의해 혼합하고, 원심분리하고 실온에서 5 min 동안 배양하였다. 그후 DNA 및 Fugene 혼합물을 배합하고, 10초 동안 보텍싱에 의해 혼합하고, 원심분리하고 실온에서 15-45 min 동안 배양하였다. 그후 혼합물을 293T 세포의 배양물에 첨가하였다.
다음날, 배양물 중의 세포로부터 세포 배양 배지를 제거하고, 8-10 ml의 신선한 세포 배양 배지를 세포에 첨가하였다. 신선한 세포 배양 배지는 바이러스로 형질도입하고자 하는 세포 유형에 따라 선택하였다. 예를 들면, T 세포를 형질도입하는데 바이러스를 사용하고자 하는 경우에는 RPMI-1640 배지가 사용되었다.
다음날, 렌티바이러스-함유 세포 배양 배지를 수집하고 4℃에서 저장하고, 8-10 ml 신선한 세포 배양 배지를 세포에 첨가하였다. 다음날, 렌티바이러스-함유 세포 배양 배지를 다시 수집하고 전날 수집한 렌티바이러스-함유 세포 배양 배지와 배합하였다. 그후 혼합물을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스 막을 사용하여 여과하고, 폴리브렌을 5-8 μg/ml의 최종 농도로 되도록 첨가하였다. 그후 렌티바이러스-함유 배지를 즉시 형질도입을 위해 사용하거나, -80℃에서 저장하였다.
어떤 경우에는 렌티바이러스-함유 배지를 Amicon Ultra-100 관 (Millipore)을 사용하여 10-20배 농축시켰다. 간략하게, 관을 1h 또는 밤새 UV 광 처리에 의해 멸균시키고, 렌티바이러스 함유 배지를 관에 첨가하고 2,500-3,500rpm에서 10-30 min 동안 원심분리하였다.
6.2 표적 세포의 형질도입
간략하게, 배양물 중의 표적 세포를 수확하고 0.25-1 x 106개 세포를 0.5-1 ml의 렌티바이러스-함유 세포 배양 배지에 재현탁시켰다 (실시예 6.1 참조). 그후 혼합물을 24 웰 또는 12 웰 플레이트로 옮기고, 30-35℃에서 1.5 시간 동안 2,500 rpm에서 원심분리하였다 ('스핀펙션(spinfection)'이라고 함). 그후 세포를 인큐베이터 (5% CO2, 37℃)에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포를 수확하고 5-10 ml의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁시켰다. 몇몇 경우에 형질도입체를 선택하기 위해 형질도입한지 36-48 시간 후에 배양물 중의 세포에 퓨로마이신을 첨가하였다.
활성화된 T 세포 (ACT)를 다음과 같이 형질도입하였다. 2.5 x 105개 ATC를 8 μg/ml 폴리브렌을 함유하는 500 μl의 농축된 바이러스 상청액 (10x 농축됨, 7000 이하의 MOI)에 재현탁시키고, 24 웰 플레이트에 접종하고 800g, 32℃에서 90 min 동안 원심분리하였다. 스핀펙션 후, 상청액을 IL-2 및 CD3/CD28 Dynabead를 함유하는 CTL 배지로 대체하기 전에 세포를 37℃, 5% CO2에서 24 hr 이하 동안 배양하였다 (실시예 5 참조).
Hela 세포 형질도입을 위해, 4 x 105개 HeLa 세포를 8 μg/ml 폴리브렌을 함유하는 1 ml의 농축된 바이러스 상청액 (10x 농축됨, 7000 이하의 MOI)에 재현탁시키고, 24 웰 플레이트에 접종하고 800g, 32℃에서 90 min 동안 원심분리하였다.
실시예 7: 세포 표면에서의 TGF -β 디코이 수용체의 발현의 분석
7.1 TGF -β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질감염된 HeLa 세포에 의한 발현
본 발명자들은 상이한 작제물로 형질감염된 HeLa 세포 상의 TGF -β 디코이 수용체의 표면 발현을 조사하였다.
간략하게, HeLa 세포를 제조자의 지침에 따라 리포펙타민을 사용하여 TGF-β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물, 형질감염 대조군으로서의 GFP를 암호화하는 작제물, 또는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질감염시켰다.
형질감염시킨지 72 시간 후 세포를 TGF-βR2의 세포외 도메인에 결합하는 항-인간 TGF-β RII 항체 클론 REA903 (#130-115, Miltenyi)을 사용하여 세포 표면에서 수용체의 발현에 대해 유동 세포계측에 의해 분석하였다. 형질감염 대조군은 GFP 발현에 대해 분석하였다.
결과는 도 3a 내지 3h에 도시되어 있다. TGF-β 디코이 수용체의 높은 발현이 형질감염시킨지 72 시간 후 HeLa 세포의 표면 상에서 검출되었다 (세포의 ~60-70%가 수용체 발현에 대해 양성이었다).
7.2 TGF -β 디코이 수용체를 암호화하는 작제물로 형질도입된 활성화된 T 세포 (ATC)에 의한 발현
본 발명자들은 다음으로 상이한 렌티바이러스 작제물로 형질도입된 ATC 상에서의 TGF-β 디코이 수용체의 표면 발현, 또는 비-형질도입된 세포 상에서의 발현을 조사하였다.
형질도입 (실시예 6.2 참조) 한지 72 시간 후 세포를 항-인간 TGF-β RII 항체 클론 REA903을 사용하여 세포 표면에서 수용체의 발현에 대해 유동 세포계측에 의해 분석하였다. 대조 조건을 GFP 발현에 대해 분석하였다.
결과가 도 4a 내지 4h에 나타내어져 있다. CD48, CD55 및 CD90 GPI 앵커 서열을 암호화하는 TGF-β 디코이 수용체로 형질도입된 ATC는 세포 표면에서 최고 수준의 TGF-β 디코이 수용체 발현을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이러한 디코이 수용체의 발현은 DN-TGF-βR2를 암호화하는 작제물로 형질도입된 세포에 대해 검출된 발현의 수준보다 높았다 (도 4a).
본 발명자들은 다음으로 실시예 6.2에 기술된 바와 같이 형질도입한지 72 시간 후에 세 명의 상이한 기증자로부터 유래된 형질도입된 ATC에 의해 CD48 또는 CD90 GPI 앵커 서열을 갖는 TGF-β 디코이 수용체의 발현을 조사하였다.
도 5a는 형질도입된 세포 배양물 중의 백혈구의 백분율을 보여준다. 도 5b는 형질도입된 세포 배양물 중의 GFP+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 5c는 형질도입된 세포 배양물 중의 TGF-β RII+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 6a는 백혈구의 총 수의 비율로서 CD3+ 세포의 백분율을 보여주고, 도 6b는 백혈구의 총 수의 비율로서 GFP+CD3+ 세포의 백분율을 보여준다.
도 7a는 CD3+ 세포 집단의 비율로서 CD4+, GFP+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 7b는 CD3+ 세포 집단의 비율로서 CD8+, GFP+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 7c는 CD3+ 세포 집단의 비율로서 CD4+, TGF-β RII+ 세포의 백분율을 보여준다. 도 7d는 CD3+ 세포 집단의 비율로서 CD8+, TGF-β RII+ 세포의 백분율을 보여준다.
TGF-β RII를 발현하는 세포의 높은 비율은 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 T 세포에서 검출되었다 (도 5c, 7c 및 7d 참조).
실시예 8: TGF -β 디코이 수용체를 발현하는 세포에서 TGF -β 매개된 신호전달의 억제의 분석
본 발명자들은 다음으로 TGF-β로의 자극에 반응한 TGF-β 디코이 수용체를 발현하는 세포에서의 다운스트림 신호전달의 활성화를 조사하였다.
세포를 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스, 또는 GFP를 암호화하는 작제물로 형질도입하였다 (실시예 6.2 참조).
형질도입된 세포에 대해 선택하기 위해 세포를 형질도입한지 72 시간 후 퓨로마이신을 2 μg/ml의 최종 농도로 세포 배양물에 첨가하였다.
퓨로마이신의 존재하에서 7일간의 배양 후, 세포를 신선한 세포 배양 배지에서 재현탁시키고 상이한 농도의 TGF-β로 처리하여 자극하기 전에 24시간 동안 배양하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 30 min 동안 자극하였다. 그후 세포를 수확하고 유동 세포계측 (실시예 8.1 참조) 및 웨스턴 블롯 (실시예 8.2 참조)에 의해 세포내 신호전달 단백질의 인산화에 대해 분석하였다. 유동 세포계측 또는 웨스턴 블롯 분석을 위한 샘플의 제조는 빙상에서 수행하였다.
8.1 Phosflow 분석
다음의 항체들이 유동 세포계측 분석에 사용되었다:
Figure pct00002
100 μl의 자극된 세포 (~200,000개 세포)를 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 그후 세포를 3000 rpm, 4℃에서 30초 동안 원심분리하고, 세포 펠렛을 30 μL의 1:200 생/사 염색에 재현탁시키고 세포를 실온에서 30초 동안 배양하였다. 그후 세포를 100 μL 염색 완충액의 첨가 및 3000 rpm, 4℃에서 30초간의 원심분리에 의해 세척하였다. 그후 세포 펠렛을 37℃로 예열된 세포 배양 배지와 BD phosflow 완충액 I (웰 당 50 μl)의 1:1 혼합물에 재현탁시키고 37℃에서 10 min 동안 배양하였다. 그후 세포를 1500 rpm에서 5 min 동안 원심분리에 의해 수확하고, 150 μL 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 그후 세포 펠렛을 50 μL Perm 완충액 III에 재현탁시키고, 세포를 30 min 동안 빙상에서 배양하였다. 그후 세포를 1500 rpm에서 5 min 동안 원심분리에 의해 수확하고, 150 μL 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 그후 세포 펠렛을 25 μL 항체 칵테일에 재현탁시키고 실온에서 1 시간 동안 암흑에서 배양하였다. 그후 세포를 1500 rpm에서 5 min 동안 원심분리에 의해 수확하고, 150 μL 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 마지막으로, 세포 펠렛을 150 μL 염색 완충액에 재현탁시키고, 세포를 유동 세포계측에 의해 분석하였다.
도 8a 내지 8e는 상이한 농도의 TGF-β로의 자극 후, 비-형질도입된 HeLa 세포 (wt), TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포 (CD90) 또는 GFP를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포 (GFP)에서의 신호전달의 분석 결과를 보여준다. TGF-βRII-CD90 GPI 앵커로 형질도입된 세포는, 인산화된 신호전달 단백질 (SMAD)에 대해 양성으로 염색된 세포의 감소된 백분율, 및 CREB 전사 인자에 대해 양성으로 염색된 세포의 감소된 백분율에 의해 입증되는 바와 같이, TGF-β로의 자극에 반응한 TGF-β 매개된 신호전달의 활성화가 덜한 것으로 나타났다.
도 9 및 10은 상이한 농도의 TGF-β로의 자극 후, 비-형질도입된 ATC (wt), TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 ATC (CD90), TGF-βRII-CD48 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 ATC (CD48), DN-TGF-βR2를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 ATC (DN) 또는 GFP를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 ATC (GFP)에서의 신호전달의 분석 결과를 보여준다. 도 9a 내지 9c는 CD3+ 세포 집단 내에서 상이한 마커에 대해 양성으로 염색된 CD8+ 세포의 백분율을 보여주고, 도 10a 내지 10c는 CD3+ 세포 집단 내에서 상이한 마커에 대해 양성으로 염색된 CD4+ 세포의 백분율을 보여준다.
GPI 앵커 서열을 갖는 TGF-β 디코이 수용체로 형질도입된 세포는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 세포에 비해 TGF-β로의 자극에 반응하여 유사한 또는 감소된 수준의 TGF-β 매개된 신호전달을 나타내었다.
8.2 웨스턴 블롯
자극된 세포를 빙냉 PBS에 재현탁시키고, 4℃에서 원심분리에 의해 펠렛화하고 빙냉 PBS에서 2회 세척하였다. 그후 세포 펠렛을 포스파타제/프로테아제 억제제 칵테일 (1:100, ThermoFisher, #78440)을 함유하는 빙냉 RIPA 용해 완충액에 재현탁시키고 가끔씩 보텍싱하면서 빙상에서 30 min 동안 배양하였다. 그후 단백질 농도를 BCA 단백질 검정 키트 (Pierce)를 사용하여 측정하고 농도를 샘플 간에 정규화하였다. 그후 10% MeEtOH를 함유한 4x Laemmli 완충액을 샘플에 첨가한 다음 95℃에서 10분간 끓였다. 그후 샘플을 빙상에서 냉각시킨 다음 SDS-PAGE에 적용하였다.
니트로셀룰로스 막을 5% 우유 용액에서 2시간 동안 차단시킨 다음 1:1000의 희석도로 1차 항체 (a-Smad2/3 항체, 세포 신호전달, #5678)와 12 hr 배양하였다. 그후 막을 TBS-T 용액에서 3회 세척한 다음 1:10 000의 희석도로 2차 항-토끼-HRP 항체와 배양하였다. 그후 막을 TBS-T 용액에서 3회 세척하고 향상된 화학발광 (ECL, Biorad)을 사용하여 전개시켰다. Chemidoc MP 이미징 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 밴드를 시각화하였다.
도 11은 TGF-β로의 자극 후, 항-CD3/CD28 자극에 의해 활성화되고 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 일차 인간 T 세포, 또는 비-형질도입된 세포에서 검출된 인산화 SMAD2/3를 보여준다.
도 12는 TGF-β로의 자극 후, TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스, GFP를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포, 또는 비-형질도입된 세포에서 검출된 인산화 SMAD2/3를 보여준다.
감소된 수준의 인산화 SMAD2/3이 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 세포에서 검출되었다.
8.3 형광 현미경
HeLa 세포를 TGF-βRII-CD90 GPI 앵커, TGF-βRII-CD48 GPI 앵커, DN-TGF-βR2 (실시예 6.2 참조)를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입하거나, 형질도입되지 않은채로 두었다 (WT). 그후 세포를 384 웰 플레이트의 웰에 평판배양하고 역 시간 코스 실험 (reverse time course experiment)에서 1 ng의 TGF-β로 자극하였다.
p38 및 SMAD2의 인산화 및 준세포 편재화는 형광 현미경으로 분석하였다. p38의 인산화는 TGF-β로 자극된 백혈구에서 감소되어, 면역 기능의 감소를 초래하는 것으로 나타났다. SMAD2 인산화가 TGF-β 신호전달의 직접적인 효과기인 것으로 나타났으며 면역 기능 저하의 원인이 된다.
실험의 결과는 도 13a 및 13b에 나타내어져 있다. TGF-βRII-CD90 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 세포는 TGF-β로의 자극에 반응하여 핵에 편재된 인산화된 p38의 최고 수준 및 핵에 편재된 인산화된 SMAD2의 최저 수준을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이것은 TGF-βRII-CD90 디코이 수용체를 발현하는 세포가 TGF-β 자극에 대해 가장 덜 반응성임을 나타내었다.
TGF-βRII-CD48 GPI 앵커를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 세포는 DN-TGF-βR2를 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 세포에 비해 TGF-β로의 자극 후 핵에 편재된 인산화 p38 및 인산화 SMAD2의 유사한 수준을 나타내었다.

Claims (28)

  1. TGF-β 결합 영역 및 지질 앵커 영역(lipid anchor region)을 포함하는 TGF-β 디코이 수용체(decoy receptor).
  2. 제1항에 있어서, 지질 앵커 영역이 지질 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  3. 제2항에 있어서, 지질 앵커가 GPI 앵커인 TGF-β 디코이 수용체.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인이 없는 TGF-β 디코이 수용체.
  5. 제1항에 있어서, 지질 앵커 영역이, 지질 앵커 신호 서열인 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  6. 제5항에 있어서, 지질 앵커 신호 서열이 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 신호 서열인 TGF-β 디코이 수용체.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, TGF-β 결합 영역이 TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  8. 제7항에 있어서, TGF-β 수용체가 타입 II TGF-β 수용체 (TGF-βR2)인 TGF-β 디코이 수용체.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, TGF-β 결합 영역이 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포막 앵커 영역이 CD48, CD55, CD90 또는 태반형 알칼리성 포스파타제 중의 하나의 GPI 신호 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, 지질 앵커 영역이
    (i) 서열 번호 15 내지 18 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (ii) GPI 앵커, 및 서열 번호 19 내지 22 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열 번호 5 내지 8 중의 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열 번호 11 내지 14 중의 하나와 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및 GPI 앵커를 포함하거나 이것으로 이루어지는 TGF-β 디코이 수용체.
  13. TGF-β 수용체의 TGF-β 결합 영역에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 TGF-β 결합 영역을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
  14. 제13항에 있어서, TGF-β 수용체가 타입 II TGF-β 수용체 (TGF-βR2)인 CAR.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, TGF-β 결합 영역이 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이것으로 이루어지는 CAR.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 암호화하는 핵산.
  17. 제16항의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 또는 제17항에 따르는 벡터를 포함하는 세포.
  19. 제16항에 따르는 핵산 또는 제17항에 따르는 벡터를 세포 내로 도입하는 단계, 및 세포에 의한 핵산 또는 벡터의 발현에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하여, TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR을 발현하는 세포를 생산하는 방법.
  20. 제19항에 따르는 방법에 의해 수득되거나 수득될 수 있는 세포.
  21. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 제17항에 따르는 벡터, 또는 제18항 또는 제20항에 따르는 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체, 아주반트(adjuvant), 부형제, 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항; 제16항; 제17항; 제18항 또는 제20항; 또는 제21항에 있어서, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR; 핵산; 벡터; 세포; 또는 약제학적 조성물.
  23. 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 제17항에 따르는 벡터, 제18항 또는 제20항에 따르는 세포 또는 제21항에 따르는 약제학적 조성물의 용도.
  24. 대상체에게 치료학적 또는 예방학적 유효량의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 제17항에 따르는 벡터, 제18항 또는 제20항에 따르는 세포 또는 제21항에 따르는 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  25. (a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 세포를 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 또는 제17항에 따르는 벡터를 발현 또는 포함하도록 변형시키는 단계, 및;
    (c) 변형된 적어도 하나의 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  26. (a) 대상체로부터 적어도 하나의 세포를 단리하는 단계;
    (b) 적어도 하나의 세포 내로 제16항에 따르는 핵산 또는 제17항에 따르는 벡터를 도입함으로써, 적어도 하나의 세포를 변형시키는 단계 및;
    (c) 변형된 적어도 하나의 세포를 대상체에 투여하는 단계를 포함하여, 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법.
  27. 제22항; 제23항; 또는 제24항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 병태가 암인, 사용을 위한 TGF-β 디코이 수용체, CAR, 핵산, 벡터, 세포, 또는 약제학적 조성물; 용도; 또는 방법.
  28. 예비결정된 양의 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 따르는 TGF-β 디코이 수용체 또는 CAR, 제16항에 따르는 핵산, 제17항에 따르는 벡터, 제18항 또는 제20항에 따르는 세포 또는 제21항에 따르는 약제학적 조성물을 포함하는 부품의 키트(kit).
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