TW201831193A

TW201831193A - 轉形生長因子β(TGF-β)誘餌受體

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Publication number: TW201831193A
Application number: TW107102534A
Authority: TW
Inventors: 約翰寇那里; 理查霍普金斯; 易捷黃; 史文 H. 彼得生
Original assignee: 新加坡商泰莎治療私人有限公司
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2018-09-01
Also published as: US20190352373A1; WO2018138003A1; JP2020505069A; KR20190111058A; CN110709416A; EP3574006A1; SG11201906552WA; AU2018212403A1

Abstract

揭示了包含TGF-β結合區和脂質錨定物區的TGF-β誘餌受體。亦揭示了包含TGF-β結合區的嵌合抗原受體(CAR)。亦揭示了包含TGF-β誘餌受體和CARs的組成物和使用方法。

Description

轉形生長因子β　(TGF-β)誘餌受體

發明領域本發明關於轉形生長因子β (TGF-β)誘餌受體。

發明背景以離體擴增或基因修飾的T細胞的免疫治療在治療血液惡性腫瘤中顯示出很大的希望。然而，轉移的T細胞的長期持久性係受限於其活化狀態及與宿主相關因子的交互作用。此外，克服腫瘤微環境的抑止本質仍然是T細胞免疫療法的主要挑戰。

轉形生長因子β (TGF-β)是免疫抑制細胞介素，其表現在各式各樣癌症是向上調控的。TGF-β係經由異型二聚體TGF-β受體複合物發出信號，該複合物是由第1型和第2型次單元組成。已顯示經由TGF-β受體的信號傳導抑制了T細胞增生、體內持久性、和效應物的功能。

發明概要在一態樣中，本發明提供了一種TGF-β誘餌受體，其包含TGF-β結合區和細胞膜錨定物區或由TGF-β結合區和細胞膜錨定物區構成。在一些具體例中，該細胞膜錨定物區包含脂質錨定物或由脂質錨定物構成。在一些具體例中，該脂質錨定物是GPI錨定物。

在另一態樣中，本發明提供了一種TGF-β誘餌受體，其包含TGF-β結合區和脂質錨定物區或由TGF-β結合區和脂質錨定物區構成。

該TGF-β誘餌受體可為包含任擇地透過聯接子共價聯接至細胞膜錨定物區的TGF-β受體的胞外域或由任擇地透過聯接子共價聯接至細胞膜錨定物區的TGF-β受體的胞外域構成的融合蛋白。

在一些具體例中，該脂質錨定物區包含脂質錨定物或由脂質錨定物構成。在一些具體例中，該脂質錨定物是GPI錨定物。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少跨膜域。

在一些具體例中，該脂質錨定物區包含脂質錨定物信號序列的胺基酸序列或由脂質錨定物信號序列的胺基酸序列構成。在一些具體例中，該脂質錨定物信號序列是多醣磷脂肌醇(GPI)信號序列。

在一些具體例中，該TGF-β結合區包含對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列或由對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列構成。在一些具體例中，該TGF-β受體是第II型TGF-β受體(TGF-βR2)。

在一些具體例中，該TGF-β結合區包含與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列或由與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列構成。

在一些具體例中，該細胞膜錨定物區包含對應於CD48、CD44、CD55、CD90或胎盤型鹼性磷酸酶之一者的GPI信號序列的胺基酸序列或由對應於CD48、CD44、CD55、CD90或胎盤型鹼性磷酸酶之一者的GPI信號序列的胺基酸序列構成。

在一些具體例中，該脂質錨定物區包含下列或由下列構成：(i)與SEQ ID NOs:15至18之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；或(ii) GPI錨定物，以及與SEQ ID NOs:19至22之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含下列或由下列構成：(i)與SEQ ID NOs:5至8之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；或(ii)與SEQ ID NOs:11至14之一者具有至少80%序列一致性的胺基酸序列，以及GPI錨定物。

在另一態樣中，本發明提供了一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含TGF-β結合區，該TGF-β結合區包含對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列或由對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列構成。

在一些具體例中，該TGF-β受體是第II型TGF-β受體(TGF-βR2)。在一些具體例中，該TGF-β結合區包含與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列或由與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列構成。

在另一態樣中，本發明提供了一種核酸，其根據本發明編碼該TGF-β誘餌受體或CAR。

在另一態樣中，本發明提供了一種載體，其包含本發明的核酸。

在另一態樣中，本發明提供了一種細胞，其包含根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸或該載體。

在另一態樣中，本發明提供了一種用於製造表現TGF-β誘餌受體或CAR的細胞的方法，該方法包含將根據本發明的該核酸或該載體導入細胞中，並在適合該細胞表現該核酸或載體的條件下培養該細胞。

在另一態樣中，本發明提供了一種細胞，其藉由根據本發明用於製造表現TGF-β誘餌受體或CAR的細胞的方法獲得或可獲得。

在另一態樣中，本發明提供了一種藥學組成物，其包含根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、該載體、或該細胞、以及藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑或稀釋劑。

在另一態樣中，本發明提供了用於治療或預防疾病或病況的方法的一些具體例、根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、該載體、該細胞或該藥學組成物。

在另一態樣中，本發明提供了一種根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、該載體、該細胞或該藥學組成物的用途，該用途係製造用於治療或預防疾病或病況的藥劑。

在另一態樣中，本發明提供了一種治療或預防疾病或病況的方法，該方法包含將治療或預防有效量的根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、該載體、該細胞或該藥學組成物投予個體。

在另一態樣中，本發明提供了一種治療或預防個體的疾病或病況的方法，包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)修飾該至少一個細胞，以表現或包含根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、或該載體；以及 (c)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。

在另一態樣中，本發明提供了一種治療或預防個體的疾病或病況的方法，包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)將根據本發明的該核酸或該載體導入該至少一個細胞中，藉此修飾該至少一個細胞以及； (c)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。

在依據本發明的各式態樣的一些具體例中，該疾病或病況是癌症。

在另一態樣中，本發明提供了一種部件套組，其包含預定份量的根據本發明的該TGF-β誘餌受體或CAR、該核酸、該載體、該細胞或該藥學組成物。說明

本發明關於能夠結合並抑制TGF-β介導的信號傳導的TGF-β誘餌受體、編碼此類TGF-β誘餌受體的核酸及表現該等的細胞。本發明的TGF-β誘餌受體係用作為TGF-β的誘餌受體。亦說明了該多肽、核酸和細胞的治療用途。 TGF-β和TGF-β介導的信號傳導

轉形生長因子β (TGF-β)是一種多功能細胞介素，有三種形式，命名為TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β1至3在細胞介素的TGF-β超家族內形成高度相似蛋白質的亞家族。

人類TGF-β1 (NCBI參考序列：NP_000651.3)是390個胺基酸的蛋白質，而TGF-β2 (NCBI參考序列：NP_001129071.1)是442個胺基酸的蛋白質，以及TGF-β3 (NCBI參考序列：NP_001316868.1)含有412個胺基酸。TGF-β1-3的各者在分泌所需的N端具有20-30個胺基酸信號肽，稱為潛伏期相關肽(LAP)的前體區，以及112-114個胺基酸的C端區，其在從該前體區蛋白水解切割後變成成熟的TGF-β分子(Khalil et al. 1999 Microbes Infect. 1 (15): 1255–63)。成熟的單體TGF-β二聚化以產生該生物活性的25 KDa蛋白質。TGF-β1至3可與相同類型的TGF-β形成同型二聚體，或可與另一類型的TGF-β形成異型二聚體(譬如TGF-β1:TGF-β2異型二聚體)。TGF-β包含九個保守的半胱胺酸殘基，其中八個形成二硫鍵，以形成TGF-β超家族特有的半胱胺酸節結結構。其餘的半胱胺酸與另一個TGF-β單體交互作用形成二聚體。在第五個和第六個保守半胱胺酸殘基之間的表面暴露區是TGF-β1至3蛋白質之間保守性最低的區，並被認為對於TGF-β的受體結合和特異性是重要的。

在本說明書中，「TGF-β」是指來自任何物種的TGF-β，並包括來自任何物種的TGF-β的同功型、片段、變化型或同系物。在一些具體例中，該TGF-β是人類TGF-β、靈長類TGF-β、非人類靈長類TGF-β、囓齒動物TGF-β、鼠類TGF-β、或哺乳動物TGF-β。在一些具體例中，該TGF-β受體是TGF-β1 (TGF-β1)、TGF-β2 (TGF-β2)、或TGF-β3 (TGF-β3)。

TGF-β是經由結合至TGF-β受體並經由TGF-β受體激活信號來發揮其功能性後果。TGF-β受體包含具有TGF-β結合區的胞外域、單程跨膜域和包含絲胺酸/蘇胺酸激酶域的胞內域。有三個主要類型的TGF-β受體；TGF-βR1 (NCBI參考序列：NP_004603.1)、TGF-βR2 (NCBI參考序列：NP_001020018.1)和TGF-βR3 (NCBI參考序列：NP_003234.2)。

在本說明書中，「TGF-β受體」是指來自任何物種的TGF-β受體，並包括來自任何物種的TGF-β受體的同功型、片段、變化型或同系物。在一些具體例中，該TGF-β受體是人類TGF-β受體、靈長類TGF-β受體、非人類靈長類TGF-β受體、囓齒動物TGF-β受體、鼠類TGF-β受體、或哺乳動物TGF-β受體。在一些具體例中，該TGF-β受體是TGF-β受體1 (TGF-βR1)、TGF-β受體2 (TGF-βR2)、或TGF-β受體3 (TGF-βR3)。

人類TGF-βR1 (包括33個胺基酸信號肽)是503個胺基酸的蛋白質，成熟形式是470個胺基酸，包含93個胺基酸的胞外域、21個胺基酸的跨膜域、和356個胺基酸的胞內域。該蛋白質的胞外域包含TGF-βR1的TGF-β結合區。人類TGF-βR1 (NCBI參考序列：NP_004603.1)的胺基酸序列及其域係如下所示：

人類TGF-βR1 (NP_004603.1)MEAAVAAPRPRLLLLVLAAAAAAAAALLPGATA LQCFCHLCTKDNFTCVTDGLCFVSVTETTDKVIHNSMCIAEIDLIPRDRPFVCAPSSKTGSVTTTYCCNQDHCNKIELPTTVKSSPGLGPVEL AAVIAGPVCFVCISLMLMVYI CHNRTVIHHRVPNEEDPSLDRPFISEGTTLKDLIYDMTTSGSGSGLPLLVQRTIARTIVLQESIGKGRFGEVWRGKWRGEEVAVKIFSSREERSWFREAEIYQTVMLRHENILGFIAADNKDNGTWTQLWLVSDYHEHGSLFDYLNRYTVTVEGMIKLALSTASGLAHLHMEIVGTQGKPAIAHRDLKSKNILVKKNGTCCIADLGLAVRHDSATDTIDIAPNHRVGTKRYMAPEVLDDSINMKHFESFKRADIYAMGLVFWEIARRCSIGGIHEDYQLPYYDLVPSDPSVEEMRKVVCEQKLRPNIPNRWQSCEALRVMAKIMRECWYANGAARLTALRIKKTLSQLSQQEGIKM (SEQ ID NO:1)

信號肽 (殘基1-33)；胞外域 (殘基34-126)；跨膜域 (殘基127-147)；胞內域 (殘基148-503)。

人類TGF-βR2 (包括22個胺基酸信號肽)是592個胺基酸的蛋白質，成熟形式是570個胺基酸，包含169個胺基酸的胞外域、21個胺基酸的跨膜域、和380個胺基酸的胞內域。該蛋白質的胞外域包含TGF-βR2的TGF-β結合區(Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8；pfam08917: ecTbetaR2)。人類TGF-βR2 (NCBI參考序列：NP_001020018.1)及其域的胺基酸序列係如下所示：

人類TGF-βR2 (NP_001020018.1)MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEE YNTSNPDLLLVIFQ VTGISLLPPLGVAISVIIIFY CYRVNRQQKLSSTWETGKTRKLMEFSEHCAIILEDDRSDISSTCANNINHNTELLPIELDTLVGKGRFAEVYKAKLKQNTSEQFETVAVKIFPYEEYASWKTEKDIFSDINLKHENILQFLTAEERKTELGKQYWLITAFHAKGNLQEYLTRHVISWEDLRKLGSSLARGIAHLHSDHTPCGRPKMPIVHRDLKSSNILVKNDLTCCLCDFGLSLRLDPTLSVDDLANSGQVGTARYMAPEVLESRMNLENVESFKQTDVYSMALVLWEMTSRCNAVGEVKDYEPPFGSKVREHPCVESMKDNVLRDRGRPEIPSFWLNHQGIQMVCETLTECWDHDPEARLTAQCVAERFSELEHLDRLSGRSCSEEKIPEDGSLNTTK (SEQ ID NO:2)

信號肽 (殘基1-22)；胞外域 (殘基23-191)； TGF-β 結合區 (殘基74-177)；跨膜域 (殘基192-212)；胞內域 (殘基213-592)。

人類TGF-βR3 (包括18個胺基酸信號肽)是851個胺基酸的蛋白質，成熟形式是833個胺基酸，包含769個胺基酸的胞外域、22個胺基酸的跨膜域、和42個胺基酸的胞內域。該蛋白質的胞外域包含TGF-βR3的TGF-β結合區。人類TGF-βR3 (NCBI參考序列：NP_003234.2)及其域的胺基酸序列係如下所示：

人類TGF-βR3 (NP_003234.2)MTSHYVIAIFALMSSCLA TAGPEPGALCELSPVSASHPVQALMESFTVLSGCASRGTTGLPQEVHVLNLRTAGQGPGQLQREVTLHLNPISSVHIHHKSVVFLLNSPHPLVWHLKTERLATGVSRLFLVSEGSVVQFSSANFSLTAETEERNFPHGNEHLLNWARKEYGAVTSFTELKIARNIYIKVGEDQVFPPKCNIGKNFLSLNYLAEYLQPKAAEGCVMSSQPQNEEVHIIELITPNSNPYSAFQVDITIDIRPSQEDLEVVKNLILILKCKKSVNWVIKSFDVKGSLKIIAPNSIGFGKESERSMTMTKSIRDDIPSTQGNLVKWALDNGYSPITSYTMAPVANRFHLRLENNAEEMGDEEVHTIPPELRILLDPGALPALQNPPIRGGEGQNGGLPFPFPDISRRVWNEEGEDGLPRPKDPVIPSIQLFPGLREPEEVQGSVDIALSVKCDNEKMIVAVEKDSFQASGYSGMDVTLLDPTCKAKMNGTHFVLESPLNGCGTRPRWSALDGVVYYNSIVIQVPALGDSSGWPDGYEDLESGDNGFPGDMDEGDASLFTRPEIVVFNCSLQQVRNPSSFQEQPHGNITFNMELYNTDLFLVPSQGVFSVPENGHVYVEVSVTKAEQELGFAIQTCFISPYSNPDRMSHYTIIENICPKDESVKFYSPKRVHFPIPQADMDKKRFSFVFKPVFNTSLLFLQCELTLCTKMEKHPQKLPKCVPPDEACTSLDASIIWAMMQNKKTFTKPLAVIHHEAESKEKGPSMKEPNPISPPIFHGLDTLTV MGIAFAAFVIGALLTGALWYIY SHTGETAGRQQVPTSPPASENSSAAHSIGSTQSTPCSSSSTA (SEQ ID NO:3)

信號肽 (殘基1-18)；胞外域 (殘基19-787)；跨膜域 (殘基788-809)；胞內域 (殘基810-851)。

已說明了其他TGF-β結合蛋白。Onichtchouk et al. 1999, Nature 401(6752):480-485說明BMP和活化膜結合抑制劑(BAMBI)蛋白質，一種在胞外域中與TGF-β家族的第I型受體密切相關的跨膜糖蛋白，但其具有較短的胞內域且無酶活性。已顯示BAMBI藉由阻斷TGF-βR1和TGF-βR2之間的交互作用來抑制TGF-β信號傳導。Bollard et al. 2002, Blood 99(9): 3179-3187 and Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580說明抗原反應性T細胞的改造，以表現顯性負向TGF-βR2 (DN-TGF-βR2)，其包含TGF-βR2的胞外域以及跨膜區，但缺少信號傳導所需的細胞質域。Penafuerte et al. 2011, J Immunol. 186(12):6933-6944說明了IL-2與TGF-βR2的可溶性胞外域的嵌合融合蛋白，其在溶液中係作用為誘餌受體捕獲活性TGF-β並與IL-2-回應淋巴樣細胞交互作用，誘發IL-2R介導的信號傳導。Russo et al. 2009, Int J Biochem Cell Biol 41:472-476 and Zhang et al. 2013 (同上)說明了包含TGF-β受體的胞外TGF-β結合域的可溶性TGF-β受體分子。在一些情況下，該可溶性TGF-β受體分子亦包含Fc域。

TGF-β介導的信號傳導係涉及胚胎發生和組織穩態，並經由調控細胞增生、分化、細胞凋亡、黏附、侵入和細胞微環境來介導其效應，舉例來說，描述於Meulmeester and ten Dijke 2011, J Pathol 223: 205–218。

活性TGF-β二聚體係經由TGF-β第I型和第II型受體(分別為TGF-βR1和TGF-βR2)介導信號傳導。TGF-βR2負責招募TGF-β進入異聚的TGF-β:TGF-βR1:TGF-βR2受體複合物，並以~ 5 pM的K_D 結合至TGF-β1和TGF-β3，及以~ 5 nM的K_D 結合TGF-β3 (De Crescenzo et al. 2003, J Mol Biol. 328(5):1173-83)。膜錨定的TGF-βR3協助TGF-β結合至TGF-βR2 (Lopez-Casillas et al., Cell 1993；73:1435–1444)。TGF-β高親和力結合至TGF-βR2導致與TGF-βR1形成異四聚體複合物，其繼而致使TGF-βR1被TGF-βR2磷酸化。

在大多數細胞類型中，TGF-βR1轉導信號傳導，而在某些細胞類型中，ALK1或其他TGF-β超家族第I型受體可介導信號傳導回應。TGF-βR1係藉由受體調控的Smad蛋白的募集和磷酸化來傳播信號傳導。激活的Smads與常見的Smad (共同-Smad；哺乳動物中的Smad4)形成複合物並穿梭進入細胞核，其中彼等與DNA結合轉錄因子交互作用以調控標靶基因的轉錄。Smad-非依賴性信號傳導亦可經由TRAF6–TAK1–p38/JNK途徑發生，TGF-βR1亦經由Shc在酪胺酸和絲胺酸殘基上的直接磷酸化而激活Erk-MAP激酶信號傳導(Lee et al., 2007 EMBO J 26: 3957–3967)。藉由Par6的直接磷酸化，TGF-wβR2亦可獨立於TGF-βR1發出信號(Ozdamar et al., Science；307: 1603–1609)。

如本案所用，「TGF-β介導的信號傳導」是指由TGF-β及/或TGF-β受體、TGF-β及/或TGF-β受體的片段、以及包含TGF-β、TGF-β受體及/或其片段的多肽複合物介導的信號傳導。

在本說明書中，TGF-β受體是指能夠結合TGF-β的多肽。TGF-β受體可來自任何物種並包括來自任何物種的TGF-β受體的同功型、片段、變化型或同系物。在較佳的具體例中，該物種是人類(智人(Homo sapiens))。在一些具體例中，該TGF-β受體可為TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3。TGF-β受體的同功型、片段、變化型或同系物可任擇地表徵為與來自給定物種，譬如人類的TGF-β受體的胺基酸序列具有至少70%、較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。TGF-β受體的同功型、片段、變化型或同系物可任擇地表徵為結合TGF-β (較佳來自相同物種)的能力並刺激表現該TGF-β受體的細胞中的信號傳導。TGF-β受體的片段可為任何長度(以胺基酸的數目計)，儘管可任擇地為成熟TGF-β受體的長度的至少25%並具有下列之一的最大長度：成熟TGF-β受體的長度的50%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。TGF-β受體片段的片段可具有10個胺基酸的最小長度，以及下列之一的最大長度：15、20、25、30、40、50、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、400、500、600、700或800個胺基酸。

在一些具體例中，該TGF-β受體可包含TGF-βR2的TGF-β結合區或由TGF-βR2的TGF-β結合區構成。根據Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8的定義，人類TGF-βR2的TGF-β結合區係對應於SEQ ID NO:2的胺基酸74至177 (pfam08917: ecTbetaR2)。在一些具體例中，該TGF-β受體可任擇地表徵為與來自給定物種的TGF-βR2的TGF-β結合區的胺基酸序列具有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。

在一些具體例中，該TGF-β受體可包含TGF-βR2的胞外域或由TGF-βR2的胞外域構成。人類TGF-βR2的胞外域係對應於SEQ ID NO:2的胺基酸23至191。在一些具體例中，該TGF-β受體可任擇地表徵為與來自給定物種的TGF-βR2的胞外域的胺基酸序列具有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96% 97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。

在一些具體例中，該TGF-β受體可包含TGF-βR1的胞外域或由TGF-βR1的胞外域構成。人類TGF-βR1的胞外域係對應於SEQ ID NO:1的胺基酸34至126。在一些具體例中，該TGF-β受體可任擇地表徵為與來自給定物種的TGF-βR1的胞外域的胺基酸序列具有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。

在一些具體例中，該TGF-β受體可包含TGF-βR3的胞外域或由TGF-βR3的胞外域構成。人類TGF-βR3的胞外域係對應於 SEQ ID NO:3的胺基酸19至787。在一些具體例中，該TGF-β受體可任擇地表徵為具有與來自給定物種的TGF-βR3的胞外域的胺基酸序列至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。

在一些具體例中，TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)是哺乳動物(譬如食蟹猴、人類及/或囓齒動物(譬如大鼠及/或小鼠) TGF-β)。TGF-β的同功型、片段、變化型或同系物可任擇地表徵為與來自給定物種，譬如人類的未成熟或成熟TGF-β的胺基酸序列具有至少70%，較佳為80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的胺基酸序列一致性。TGF-β的同功型、片段、變化型或同系物可任擇地表徵為結合TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3；較佳來自相同物種)的能力並刺激表現該TGF-β受體的細胞中的信號傳導。TGF-β的片段可為任何長度(以胺基酸的數目計) ，儘管可任擇地為成熟TGF-β的長度的至少25%並可具有下列之一的最大長度：成熟TGF-β的長度的50%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%。TGF-β的片段可具有10個胺基酸的最小長度，以及下列之一的最大長度：15、20、25、30、40、50、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425或440個胺基酸。 TGF-β介導的信號傳導和疾病

TGF-β/TGFβ受體信號傳導亦參與癌症，如同，舉例來說，於Nacif and Shaker 2014, J Cancer Ther 5:735-747, Meulmeester and ten Dijke 2011, J Pathol 223: 205–218，以及Akhurst and Hata 2012 Nat Rev Drug Discov. 11(10): 790-811中所述者。

在許多癌症中已觀察到TGF-β信號傳導組分的突變；舉例來說，在結腸癌、胃癌、膽道癌、肺癌、卵巢癌、食道癌、和頭頸癌中，TGF-β受體突變係高度呈現為微衛星不穩定性(MSI)，並且在胰腺癌和胃腸腫瘤中觀察到Smad4突變。TGF-β發揮腫瘤抑止效應，譬如經由調控細胞增生、凋亡、以及間接經由腫瘤間質。

雖然TGF-β對上皮細胞或在腫瘤發生的早期生長敏感階段期間發揮保護性或腫瘤抑止效應，但後來在腫瘤發展中，癌細胞對TGF-β介導的生長抑制並不起作用，並且在惡性腫瘤晚期階段期間，腫瘤發展是由TGF-β超載所驅使的。

在腫瘤微環境中，TGF-β透過血管與免疫細胞與纖維母細胞上的致瘤效應來刺激腫瘤進展，助長侵襲與轉移。一旦腫瘤細胞發生減弱TGF-β的生長抑止效應的遺傳及/或表觀遺傳變化，TGF-β1可驅動惡性進展與轉移(Connolly et al. 2012, Journal of Biological Sciences, 8, 964-978)。不同類型的腫瘤，例如神經膠質瘤與乳腺癌與前列腺癌似乎偏好獲得不在TGF-β信號傳導的核心組分中的突變，並保留利用TGF-β信號傳導的能力，以誘發促進上皮至間質轉形的途徑(EMT)、腫瘤侵襲、轉移性擴散、和逃避免疫系統的途徑。

Torre-Amione et al. 1990, Proc Natl Acad Sci USA 87: 1486–1490報導了TGF-β抑制腫瘤誘發的CD8+溶胞性T-淋巴細胞(CTL)介導的鼠類腫瘤排斥的能力，以及黑色素瘤或淋巴瘤細胞株的生長和轉移在所有T-細胞中表現顯性負向形式的TGF-βR2 (DN-TGF-βR2)的小鼠中係減少了(Gorelik et al. 2001 Nature Med 7:1118-1122)。已顯示TGF-β壓制CTLs中的促凋亡因子，例如穿孔素、顆粒酶A、顆粒酶B、FAS配體、和干擾素-γ (Thomas et al. 2005 Cancer Cell 8: 369–380)的產生。Bollard et al. 2002, Blood 99(9):3179-3187報導了經改造以表現DN-TGF-βR2的EBV-特異性CTLs對TGF-β的抗增生和抗細胞毒性效應具有抗性，並繼續分泌回應於抗原性刺激的細胞介素；此類CTLs將具有選擇性的功能和存活優勢(Bollard et al. 2002, Blood 99(9):3179-3187)。已顯示經改造以表現可溶性TGFβ-2R或DN-TGF-βR2的T細胞在體外對TGF-β誘發的Smad2磷酸化具有抗性，並已顯示DN-TGF-βR2在抗原特異性CD8+和CD4+ T細胞中的表現在黑色素瘤腫瘤模型中提高了腫瘤治療效率(Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580)。

亦顯示TGF-β壓制自然殺手(NK)細胞的活性；使用中和抗TGF-β抗體抑制TGF-β係增加了NK細胞活性且於是導致所接種乳腺癌細胞株的轉移形成的抑止(Arteaga et al. 1993, J Clin Invest 92: 2569–2576)。TGF-β係經由NKG2D和NKp30的轉錄抑止抑制NK介導的細胞毒性(和抗腫瘤活性) (Castriconi et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA 100: 4120–4125；Kopp et al. 2009 Cancer Res 69:7775–7783)。

TGF-β介導的信號傳導在其他疾病/病況的病理學亦是重要的，如同，舉例來說，於Nacif and Shaker 2014 (同上)和Akhurst and Hata 2012 (同上)所述者。TGF-β信號傳導係參與以纖維化為特徵的疾病的病理學，例如特發性肺纖維化(IPF)、腎纖維化、心臟纖維化(譬如與心肌梗塞有關的纖維化、缺血性、擴張性和肥大性心肌病以及充血性心衰竭)、硬皮病、骨髓增生異常症候群(MDS)、冠狀動脈搭橋術或血管成形術後的再狹窄、馬凡症候群(Marfan syndrome)、眼部病況手術後的瘢痕(譬如在治療青光眼的小梁切除術後、或角膜手術後)、糖尿病和肥胖症。 TGF-β誘餌受體

本發明提供了TGF-β誘餌受體。該TGF-β誘餌受體是能夠結合TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)的肽/多肽或其複數(譬如非共價複合物)。「受體」包括其片段和衍生物。「TGF-β誘餌受體」是能夠以細胞介素受體結合至其配體的方式來結合至TGF-β肽/多肽或其複數，並且其不能發出信號。該誘餌受體因此係經由結合至TGF-β並使得配體無法結合至有信號傳導能力的TGF-β受體而作用為TGF-β介導之信號傳導的抑制劑。

根據本發明的TGF-β誘餌受體可以單離形式提供。

TGF-β誘餌受體不是對於TGF-β具備特異性的抗體或抗體的抗原結合片段。TGF-β誘餌受體係缺少編碼能夠特異性結合至TGF-β的抗體或抗原結合片段的重鏈和輕鏈互補決定區(CDRs)及/或重鏈和輕鏈可變區的序列。

如本案所用，「肽」是藉由肽鍵聯接的兩或多個胺基酸單體的鏈。肽通常具有約2至50個胺基酸區的長度。「多肽」是兩或多個肽的聚合物鏈。多肽通常具有大於約50個胺基酸的長度。

根據本發明的TGF-β誘餌受體係結合至TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體係結合至人類TGF-β (譬如人類TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體係結合至非人類靈長類動物TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體係結合至鼠類TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體結合至含有TGF-β的分子/複合物，例如TGF-β:TGF-β受體複合物。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可結合至譬如TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)和TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的複合物。

根據本發明的TGF-β誘餌受體可結合TGF-β和含有TGF-β的複合物，藉此使該等物種無法結合至TGF-β受體(譬如內源性TGF-β受體)。

根據本發明的TGF-β誘餌受體是無法執行信號傳導的。該TGF-β誘餌受體較佳缺少TGF-β受體的信號轉導所需的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少編碼TGF-β受體的功能性催化域的胺基酸序列；舉例來說，該TGF-β誘餌受體可能缺少編碼功能性絲胺酸/蘇胺酸激酶域的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺乏募集或活化TGF-β受體的信號轉導所必需的因子所必需的胺基酸序列。

是以，本發明的TGF-β誘餌受體係作用為用於TGF-β和含有TGF-β的複合物的「誘餌」受體，與譬如在Bollard et al. 2002, Blood 99(9): 3179-3187所述的顯性負向TGF-βR2 (即DN-TGF-βR2)極為相似以及Zhang et al. 2013, Gene Therapy 20, 575-580係作用為TGF-β的誘餌受體。

如本案所用，「顯性負向TGF-βR2」和「DN-TGF-βR2」是指包含TGF-βR2的該TGF-β結合區和TGF-βR2的跨膜域且缺少功能性激酶域的物種。

相較於不表現本發明的TGF-β誘餌受體的細胞在譬如以TGF-β處理之後的信號傳導位準，表現本發明的TGF-β誘餌受體的細胞的TGF-β介導的信號傳導係減少了。

根據本發明的TGF-β誘餌受體係較佳經由一或多個TGF-β結合域結合至TGF-β。該TGF-β結合域是TGF-β的天然存在受體分子的TGF-β結合域或是衍生自或同源於TGF-β的天然存在受體分子的TGF-β結合域。舉例來說，本發明的TGF-β誘餌受體可包含一或多個TGF-β結合域或由一或多個TGF-β結合域構成，該一或多個TGF-β結合域係衍生自或同源於TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3的TGF-β結合域。

如本案所解釋的，TGF-β和含有TGF-β的複合物能夠經由結合至表現在細胞表面上的TGF-β受體來激活TGF-β介導的信號傳導。本發明的TGF-β誘餌受體能夠結合至TGF-β和含有TGF-β的物種，以抑制該等物種與細胞膜所結合的TGF-β受體交互作用的能力，並藉此抑制TGF-β介導的信號傳導。

此較佳經由使該TGF-β誘餌受體結合至結合TGF-β受體，譬如內源性地表現的TGF-β受體所需的TGF-β區(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)來實現。

亦即，TGF-β誘餌受體係減少了可用於結合至並激活經由細胞表現的功能強大的TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)的信號傳導的TGF-β及含TGF-β之物種的份量。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體能夠在被TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3結合的TGF-β區內結合至TGF-β。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體能夠在與被TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3結合的TGF-β區的相同TGF-β區、或重疊TGF-β區內結合至TGF-β。結合至與被TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3結合的相同區或重疊區內的TGF-β的能力可使用競爭性結合試驗，例如競爭ELISA分析。在此類試驗中，相較於沒有該TGF-β誘餌受體的交互作用位準，觀察在該GF-β誘餌受體的存在下─或在交互作用夥伴的一或兩者和該GF-β誘餌受體培育之後─的TGF-β與TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)之間的交互作用位準的降低/減少指出該TGF-β誘餌受體係結合至與被該TGF-β受體結合的區的TGF-β相同區或重疊區。根據本發明的TGF-β誘餌受體是否結合至與被TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3結合的區的TGF-β相同或重疊區內的TGF-β亦可藉由使用本領域眾所周知的各式各樣方法分析交互作用來測定，包括受體-配體複合物的X射線共晶術分析、肽掃描、突變定位、藉由質譜法的氫-氘交換分析、噬菌體表現與基於蛋白水解的「保護」方法。此類方法係描述於，舉例來說，Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156，茲此將其以參照方式整體併入。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列。在此，「對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列」可為TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列，或是能夠結合至TGF-β並與TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之一者的序列一致性的胺基酸序列。該TGF-β受體和TGF-β可來自任何物種，並包括來自任何物種的同功型、片段、變化型或同系物。在一些具體例中，該TGF-β受體是TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3。在一些具體例中，該TGF-β是TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含TGF-β受體的該TGF-β結合區。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與TGF-β受體的TGF-β結合區具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。

給定TGF-β受體的TGF-β結合區可藉由熟習此藝者眾所周知的常規方法辨別，譬如藉由與已知的TGF-β結合區比對、及/或藉由分析TGF-β受體的肽/多肽片段結合至TGF-β的能力，譬如藉由ELISA測定。

根據Hart et al. 2002, Nat Struct Biol. 9(3):203-8 (pfam08917: ecTbetaR2)的TGF-βR2的TGF-β結合區係對應於SEQ ID NO:2所顯示的人類TGF-βR2 (NCBI參考序列：NP_001020018.1)的74至177號位置，即： QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEE (SEQ ID NO:4)

熟習此藝者能夠藉由常規方法很好地辨別所給定的人類TGF-βR2同系物的TGF-β結合區。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的TGF-β結合區具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的TGF-β結合區具有大於70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與TGF-βR2的TGF-β結合區具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與TGF-βR2的TGF-β結合區具有大於70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與SEQ ID NO:4具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與SEQ ID NO:4具有大於70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

胺基酸序列之間的序列一致性可藉由熟習此藝者已知的方法測定。舉例來說，為了測定兩個胺基酸序列的一致性百分比，可將欲比對的序列對齊(譬如，為了最佳對齊，可在第一和第二胺基酸序列的一或兩者中引入空位)，以及可比對在對應位置的胺基酸。當第一序列中的位置被與第二序列中的對應位置相同的胺基酸佔據時，該序列在該位置具有「一致性」。兩個序列之間的一致性百分比是相同位置數目的函數，考慮到空位的數目、以及為了序列的最佳比對必要引入的各個空位的長度。序列一致性係較佳在欲比對的胺基酸序列的全長上測定。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與本案所述的TGF-β誘餌受體，譬如，圖1所示的TGF-β誘餌受體的TGF-β結合區具有至少70%序列一致性的胺基酸序列。

圖1中顯示的TGF-β誘餌受體包含衍生自TGF-βR2的一區，其包含TGF-β結合區。圖1的TGF-β誘餌受體的TGF-βR2-衍生區係顯示於下：

包含TGF-β結合區的TGF-βR2-衍生區： MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIASTIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP (SEQ ID NO:9)

它的殘基1至22代表TGF-βR2的信號肽，所以SEQ ID NO:9的成熟序列是：

TIPPHVQKSDVEMEAQKDEIICPSCNRTAHPLRHINNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNP (SEQ ID NO:10)

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與SEQ ID NO:9或10具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含與SEQ ID NO:9或10具有大於70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列。

本發明的TGF-β誘餌受體包含細胞膜錨定物區。如本案所用，「細胞膜錨定物區」是提供將TGF-β誘餌受體錨定至表現該TGF-β誘餌受體的細胞的細胞膜的區。「錨定」可為可逆的或不可逆的。

在一些具體例中，該細胞膜錨定物區可包含胺基酸序列或由胺基酸序列構成。在一些具體例中，該細胞膜錨定物區可包含脂質部分或由脂質部分構成。

錨定可經由該細胞膜錨定物區和該細胞膜或其組分(譬如磷脂)的非共價或共價連結直接地達成。在一些具體例中，錨定可經由該細胞膜錨定物區和膜結合因子或定位於該細胞膜的因子(譬如周邊或整合細胞膜相關蛋白)的共價或非共價結合而間接地達成。

該細胞膜錨定物區可經由該區和該細胞膜/其組分/因子的共價或非共價連結直接地提供錨定。

在一些具體例中，該細胞膜錨定物區可藉由編碼引導受體的加工(譬如轉譯後修飾)的信號序列來提供錨定，致使和該細胞膜/其組分/因子共價或非共價連結。舉例來說，該細胞膜錨定物區可包含引導受體加工以接附GPI錨定物的多醣磷脂肌醇(GPI)信號序列或由引導受體加工以接附GPI錨定物的多醣磷脂肌醇(GPI)信號序列構成。

細胞膜錨定物區較佳不是跨膜域。本發明的TGF-β誘餌受體較佳缺少跨膜域。亦即，該TGF-β誘餌受體缺少編碼跨膜域的胺基酸序列。在此，「跨膜域」是指在生物膜，譬如細胞膜中形成在熱力學上穩定的三維結構的胺基酸序列。跨膜域通常能夠譬如如同疏水性α螺旋或β筒跨越細胞膜的脂質雙層。跨膜域係記錄在資料庫，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白質資訊資源(Protein Information Resource)、蛋白質資料庫(Protein Data Bank)、Ensembl、和InterPro，以及/或可被識別/預測，譬如使用胺基酸序列分析工具，例如TMHMM (Krogh et al., 2001 J Mol Biol 305: 567-580)。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞膜錨定物區可為脂質錨定物區。在一些具體例中，脂質錨定物區包含脂質錨定物(譬如GPI錨定物)或由脂質錨定物(譬如GPI錨定物)構成。在一些具體例中，脂質錨定物區包含脂質錨定物信號序列或由脂質錨定物信號序列構成。

如本案所用，「脂質錨定物」是指能夠與生物膜(譬如細胞膜)的脂質組分(譬如共價性地)連結的部分。經由此類結合，接附有脂質錨定物的蛋白質被「錨定」在細胞膜內。脂質錨定物的例子包括異戊二烯基、肉荳蔻醯基、棕櫚醯基、脂肪醯基、二醯基甘油、硬脂醯基、磷脂和多醣磷脂肌醇(GPI)錨定物。

在一些具體例中，該脂質錨定物區包含脂質錨定物信號序列或由脂質錨定物信號序列構成。在此，「脂質錨定物信號序列」是指引導蛋白質加工以接附脂質錨定物的胺基酸序列。在此類加工後，TGF-β誘餌受體包含脂質錨定物。

脂質錨定物通常包含親脂性基團。脂質錨定物、其親脂基團以及修飾蛋白質以接附脂質錨定物係說明於，舉例來說，Resh 2013, Curr Biol. 23(10): R431–R435，茲此將其以參照方式整體併入。

脂質錨定物可包含異戊二烯基、肉荳蔻醯基、棕櫚醯基、脂肪醯基、二醯基甘油、硬脂醯基、或磷脂基、或多醣磷脂肌醇(GPI)錨定物或由其等構成。

異戊二烯基可包含透過硫醚鍵接附至蛋白質C端的半胱胺酸殘基的15個(法呢基(farnesyl))或20個(香葉基香葉基)碳原子。半胱胺酸的羧基亦可被甲基化。共價接附有異戊二烯基(譬如法呢基或香葉基香葉基)的蛋白質可稱為聚異戊二烯化蛋白質(prenylated protein)。

肉荳蔻醯基是可透過醯胺鍵接附至甘胺酸殘基的14碳飽和脂肪醯基。共價接附有肉荳蔻醇基的蛋白質可稱為肉荳蔻醯化蛋白質。

棕櫚醯基是16碳飽和脂肪醯基，其可透過硫醚鍵接附至蛋白質的半胱胺酸或殘基，或其可透過酯鍵接附至絲胺酸或蘇胺酸殘基。共價接附有棕櫚醯基的蛋白質可稱為棕櫚醯化蛋白質。

脂肪醯基和1,2-二醯基甘油基可分別透過醯胺和硫醚聯結接附至蛋白質的半胱胺酸殘基。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可為GPI錨定的、聚異戊二烯化、肉荳蔻醯化、棕櫚醯化、脂肪醯化、二醯基甘油化、硬脂醯化或磷脂化蛋白質。

在一些具體例中，該脂質錨定物信號序列可提供TGF-β誘餌受體的修飾，以接附異戊二烯基、肉荳蔻醯基、棕櫚醯基、脂肪醯基、二醯基甘油、硬脂醯基、或磷脂基團或多醣磷脂肌醇(GPI)。在加工經脂質錨定物信號序列引導的TGF-β誘餌受體後，該受體可包含脂質或含脂質部分。

在一些具體例中，該「脂質錨定物信號序列」是GPI錨定物信號序列。據此，在一些具體例中，本發明的脂質錨定物是GPI錨定物。

「GPI信號序列」是指引導蛋白質的修飾以將GPI錨定物接附至該蛋白質的胺基酸序列。GPI信號序列引導蛋白質的轉譯後修飾，以將GPI錨定物共價接附至該蛋白質的C端。GPI錨定物及其接附至蛋白質係在Vidal C.J. (Ed.) Protein Reviews 13, Springer Science 2011，於第2章，標題為"GPI-Anchored Proteins in Health and Disease"中描述，茲此將其以參照方式整體併入。

在此，「GPI錨定物」是指包含透過糖苷鍵聯接至四碳醣聚醣核心的磷脂酸肌醇基團的部分，其繼而接附至磷乙醇胺。

該四碳醣聚醣核心可為三甘露糖基-非乙醯化葡糖胺(Man3-GlcN)核心。該磷脂酸肌醇基團的脂質尾部可為譬如醯基或烷基脂肪酸、或神經醯胺。

GPI錨定物可經由磷乙醇胺橋至該核心聚醣: -6甘露糖(α1-2)甘露糖(α1-6)甘露糖(α1-4)葡糖胺(α1-6)肌 -肌醇來共價接附至蛋白質C端的α-羧基，其繼而藉由磷二酯橋經由該肌醇環聯接至脂質部分。該脂質部分可有所變化，但在大多數哺乳動物中，此為1-烷基-2-醯基甘油。該核心聚醣可藉由添加乙醇胺和糖側鏈來修飾，該肌醇環可以脂質基團修飾，該脂肪酸亦可重構。

引導將GPI錨定物加至蛋白質的GPI信號序列係位於胺基酸鏈的C端。該序列通常包含15-25個胺基酸殘基，在C端帶有一段疏水性殘基。在C端疏水序列前方的是引導GPI錨定物添加的共通序列：ω、ω+1和ω+2，其中ω=擁有小型側鏈的胺基酸(譬如Ala、Asn、Asp、Cys、Gly或Ser)，ω+1 =除了Pro或Trp以外的任何殘基，其中ω+2 = Gly或Ala (或偶爾為Ser或Thr)。

在切割ω和ω+1殘基之間的多肽之後，預先組裝的GPI錨定物係在ER中藉由轉醯胺酶接附至該ω殘基的C端側。轉醯胺酶是包含催化組分Gpi8P、和其他組分Gaa1p、Gpi16p (PIG-T)與Gpi17p (PIG-S)的多重蛋白複合物(Fraering et al. 2001 Molecular Biology of the Cell, 12, 3295–3306)。

在GPI錨定物接附之後，該GPI錨定蛋白就少了接至ω殘基的胺基酸C端序列。可取得GPI修飾位點的預測工具，包括，譬如大型PI預測伺服器(Eisenhaber et al. Protein Engineering (1998) 11, No.12, 1155-1161；Sunyaev et al. Protein Engineering (1999) 12, No.5, 387-394；Eisenhaber et al. JMB (1999) 292 (3), 741-758；以及Eisenhaber et al. TIBS (2000) 25 (7), 340-341)。此類工具可用來識別該ω殘基。

在圖1中，指示了使用該大型PI預測伺服器預測的對於不同GPI信號序列的ω殘基。圖2顯示在加工圖1所示胺基酸序列以接附GPI錨定物之後，成熟GPI-錨定蛋白的結構。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含GPI信號序列，譬如在加工以接附GPI錨定物之前。GPI信號序列是能夠引導過渡後加工以接附GPI錨定物的任何序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含直至並包括ω殘基的GPI信號序列，譬如在加工以接附GPI錨定物之後。

GPI信號序列及其ω殘基對於許多GPI-錨定蛋白而言是已知的，並記錄在資料庫，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白質資訊資源、蛋白質資料庫、Ensembl、和InterPro，以及/或可被識別/預測，譬如使用胺基酸序列分析工具，例如大型PI預測伺服器(如上)。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含GPI信號序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之前)，或包含直至並包括ω殘基的GPI信號序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之後)，對應於GPI-錨定蛋白質的GPI信號序列。在一些具體例中，該GPI-錨定蛋白是下列之一：歸巢細胞黏附分子(HCAM；CD44)、神經細胞黏附分子(NCAM；CD56)、5'核苷酸酶(CD73)、衰變加速因子(DAF；CD55)、CD90 (Thy1)、乙醯膽鹼酯酶(AchE)、腸鹼性磷酸酶、胎盤鹼性磷酸酶、MAC-抑制蛋白(CD59)、CD14、CD16、CD24、CD28、CD48、CDw52、CD58、CD66a、CD66c、CD66d、CD66E、CD67、CD87、 CD108、CD157、乙醯膽鹼酯酶(AchE)、尿激酶型纖溶酶原活化受體(uPAR)、JMH蛋白、GDNFR、CNTFR、TAG-1、PrP、磷脂醯肌醇聚醣蛋白、舍瑪穿膜蛋白7 (Semaphorin 7)、CEA、GFR、Ly6G、轉鐵蛋白受體、接觸蛋白(Contactin (F3))和T-鈣黏蛋白。該蛋白質可來自任何物種，並且包括來自任何物種的同功型、片段、變化型或同系物。

在一些具體例中，該GPI錨定蛋白是CD48 (BLAST-1)、CD44 (HCAM)、CD55 (DAF)、胎盤鹼性磷酸酶和CD90 (Thy1)之一者。

在此，「對應於參考GPI信號序列的GPI信號序列」是能夠引導GPI錨定物接附至包含該序列的蛋白質的胺基酸序列，其與該參考GPI信號序列具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含GPI信號序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之前)，或者包含直至包括ω殘基的GPI信號序列(譬如在加工以接附 GPI錨定物之後)，對應於SEQ ID NOs:15至18之一者的GPI信號序列(ω殘基劃底線)： CD48 GPI: DVCSPPCTLARS FGVEWIASWLVVTVPTILGLLLT (SEQ ID NO:15) 在加工以接附GPI之後的序列： DVCSPPCTLARS (SEQ ID NO:19) CD55 GPI: HETTPNKGSGTTS GTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT (SEQ ID NO:16) 在加工以接附GPI之後的序列： HETTPNKGSGTTS (SEQ ID NO:20) PLAC ALKPHOS GPI: TACDLAPPAGTTD AAHPGPSVVPALLPLLAGTLLLLGTATAP (SEQ ID NO:17) 在加工以接附GPI之後的序列： TACDLAPPAGTTD (SEQ ID NO:21) CD90 GPI: NVTVLRDKLVKC EGISLLAQNTSWLLLLLLSLSLLQATDFMSL (SEQ ID NO:18) 在加工以接附GPI之後的序列： NVTVLRDKLVKC (SEQ ID NO:22)

SEQ ID NO:15的CD48- 衍生序列係對應於 SEQ ID NO:15 的 4 至 35 號位置。 SEQ ID NO:19的CD48- 衍生序列係對應於 SEQ ID NO:19 的 4 至 12 號位置。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含GPI信號序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之前)，其與SEQ ID NOs:15至18、或SEQ ID NO:15 的4至35號位置具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含與SEQ ID NOs:19至22之一者或SEQ ID NO:19 的4至12號位置、以及GPI錨定物(譬如在加工以接附GPI錨定物之後)具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性的胺基酸序列。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可包含圖1或2所示結構或由圖1或2所示結構構成。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含TGF-β結合區，其包含與SEQ ID NO:9或10具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列；以及GPI信號序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之前)，其與SEQ ID NOs:15 至18之一者、或SEQ ID NO:15 的4至35號位置具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體包含TGF-β結合區，其包含與SEQ ID NO:9或10具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的胺基酸序列；以及與SEQ ID NOs:19至22之一者或SEQ ID NO:19 的4至12號位置及GPI錨定物(譬如在加工以接附GPI錨定物之後)具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性的胺基酸序列。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含TGF-β結合區、和GPI信號序列，並且包含下列或由下列構成：與SEQ ID NOs:5至8之一者具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性的胺基酸序列(譬如在加工以接附GPI錨定物之前)。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體包含TGF-β結合區和GPI錨定物或由TGF-β結合區和GPI錨定物構成，並且包含與SEQ ID NOs:11至14之一者具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性的胺基酸序列。

GPI錨定蛋白在細胞膜中以胺基酸序列N端定向至胞外空間(即頂表面)的ω殘基。根據本發明的TGF-β誘餌受體在GPI信號序列的N端設置有TGF-β結合區。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體可包含前導序列(亦稱為信號肽或信號序列)。前導序列通常由5-30個疏水性胺基酸的序列構成，其形成單一α螺旋。分泌蛋白質和在細胞表面表現的蛋白質經常包含前導序列。該前導序列可存在於該TGF-β誘餌受體的N端，並可存在於新合成的受體中(譬如在加工以除去前導序列之前)。該前導序列提供該TGF-β誘餌受體的有效胞內運輸。前導序列經常藉由切割除去，於是並不包含在成熟的TGF-β誘餌受體中。

前導序列對於許多蛋白是已知的，並且被記錄在資料庫，例如GenBank、UniProt、Swiss-Prot、TrEMBL、蛋白質資訊資源、蛋白質資料庫、Ensembl、和InterPro，及/或可被識別/預測，譬如使用胺基酸序列分析工具，例如SignalP (Petersen et al., 2011 Nature Methods 8: 785-786)或Signal-BLAST (Frank and Sippl, 2008 Bioinformatics 24: 2172-2176)。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體的前導序列包含下列或由下列構成：與SEQ ID NO:23的胺基酸序列具有至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%序列一致性的胺基酸序列。

TGF-βR2前導序列： MGRGLLRGLWPLHIVLWTRIAS (SEQ ID NO:23)

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可在該TGF-β結合區和脂質錨定物區之間包含一或多個聯接子。該聯接子可包含胺基酸序列或由胺基酸序列構成，並且可共價地鍵結(譬如藉由肽鍵)至TGF-β結合區和脂質錨定物區的胺基酸序列的末端。

聯接子可為肽或多肽聯接子。該聯接子可為撓性聯接子。撓性聯接子的胺基酸序列對於熟習此藝者是已知的，並描述，舉例來說，於Chen et al., Adv Drug Deliv Rev (2013) 65(10): 1357-1369，茲此將其以參照方式整體併入。在一些具體例中，該撓性聯接子序列包含絲胺酸和甘胺酸殘基。在一些具體例中，該聯接子是由1-100、1-50、1-20、1-10或1-5個胺基酸殘基的胺基酸序列構成的肽/多肽。

根據本發明的TGF-β誘餌受體係有別於天然存在的TGF-β結合分子，譬如天然存在的TGF-β受體。

根據本發明的TGF-β誘餌受體亦有別於DN-TGF-βR2；DN-TGF-βR2包含TGF-βR2的跨膜域，而根據本發明的TGF-β誘餌受體缺少跨膜域。

根據本發明的TGF-β誘餌受體亦有別於先前技術所揭示的可溶性TGF-βR2物種，其缺少細胞膜錨定物區。反之，根據本發明的TGF-β誘餌受體包含細胞膜錨定物區，例如脂質錨定物區。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於TGF-β受體的跨膜及/或胞內域(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的胺基酸序列。

在此，「對應」於參考區或給定肽/多肽的序列的胺基酸序列與該參考區/序列的胺基酸序列具有至少60%，譬如至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之一者的序列一致性。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:1的127-147號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:2的192-212號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:3的788-809號殘基的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:1的148-503號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:2的213-592號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:3的810-851號殘基的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:1的127-503號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:2的192-592號殘基的胺基酸序列。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體缺少對應於SEQ ID NO:3的788-851號殘基的胺基酸序列。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可包含另外的功能性胺基酸序列。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可包含有助於TGF-β誘餌受體的表現、折疊、運輸、加工、純化或偵測的(多個)胺基酸序列。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可包含，任擇在N端或C端，編碼蛋白質標籤的序列，譬如FLAG、His、(譬如6XHis)、Myc、GST、MBP、HA、E、或生物素標籤。

根據本發明的TGF-β誘餌受體可經可偵測方式標記或至少能夠偵測。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可以放射性原子或有色分子或螢光分子或以任何其他方式容易偵測的分子來標記。適宜的可偵測分子包括螢光蛋白、螢光素酶、酶受質、放射性標記和結合部分。標記可藉由共軛至TGF-β誘餌受體。該TGF-β誘餌受體可直接地以可偵測標記來標記，或其可間接地標記。在一些具體例中，該標記可選自：放射性核苷酸、正子發射放射性核素(譬如用於正子發射斷層攝影術(PET))、MRI造影劑或螢光標記。

根據本發明的TGF-β誘餌受體可共軛至藥物部分，譬如細胞毒性小分子。此類共軛物可用於靶向殺死表現該抗原分子的細胞。嵌合抗原受體

本發明亦提供了嵌合抗原受體(CAR)。該CAR包含如本案所述的TGF-β結合區。

嵌合抗原受體(CARs)是提供抗原結合和T細胞激活功能的重組受體。CAR結構和改造係在，舉例來說，Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1)回顧，茲此將其以參照方式整體併入。

CARs包含聯接至細胞膜錨定物區和信號傳導區的抗原結合區。任擇的鉸鏈區可提供該抗原結合區和細胞膜錨定物區之間的分離，並且可作用為撓性聯接子。

CAR的抗原結合區可基於就CAR所靶向的抗原而言特異的抗體的抗原結合區、或能夠結合至該標靶的其他劑。舉例來說，CAR的抗原結合域可包含特異地結合至標靶蛋白的抗體的互補決定區(CDRs)的胺基酸序列或完整的輕鏈和重鏈可變區的胺基酸序列。CARs的抗原結合域可靶向基於其他蛋白質：蛋白質交互作用的抗原，例如配體：受體結合；舉例來說，已使用基於IL-13的抗原結合域開發了IL-13Rα2-靶向的CAR (參閱，譬如Kahlon et al. 2004 Cancer Res 64(24): 9160-9166)。

在一些具體例中，本發明的該CAR包含如本案所述的TGF-β結合區。在一些具體例中，該TGF-β結合區包含對應於TGF-β受體，譬如第II型TGF-β受體(TGF-βR2)的TGF-β結合區的胺基酸序列或由對應於TGF-β受體，譬如第II型TGF-β受體(TGF-βR2)的TGF-β結合區的胺基酸序列構成。

該細胞膜錨定物區係設置在該CAR的抗原結合區和信號傳導區之間。該細胞膜錨定物區提供將該CAR錨定至表現CAR的細胞的細胞膜、胞外空間的抗原結合區、和胞內的信號傳導區。已說明CARs的細胞膜錨定物區，其係衍生自CD3-ζ、CD4、CD8或CD28的跨膜區序列。

在一些具體例中，本發明的該CAR包含如本案所述的細胞膜錨定物區。該細胞膜錨定物區可為譬如脂質錨定物區。

在一些具體例中，本發明的該CAR包含如本案所述的TGF-β結合區以及如本案所述的細胞膜錨定物區。在一些具體例中，該CAR包含如本案所述的TGF-β誘餌受體或由如本案所述的TGF-β誘餌受體構成。

該信號傳導區允許T細胞的激活。該CAR信號傳導區可包含CD3-ζ的胞內域的胺基酸序列，其提供用於表現CAR的T細胞的磷酸化和激活的基於免疫受體酪胺酸的激活模體(ITAMs)。包含其他含有ITAM的蛋白質的序列的信號傳導區亦已用於CARs，例如包含FcγRI之含有ITAM的區的域(Haynes et al., 2001 J Immunol 166(1):182-187)。包含衍生自CD3-ζ的胞內域的信號傳導區的CARs通常被稱為第一代CAR。

CARs的信號傳導區亦可包含衍生自共刺激分子的信號傳導區的共刺激序列，以有助於在結合至標靶蛋白後激活表現CAR的T細胞。適宜的共刺激分子包括CD28、OX40、4-1BB、ICOS和CD27。具有包括額外共刺激序列的信號傳導區的CARs通常被稱為第二代CARs。

在一些情況下，CARs被改造成提供對不同胞內信號傳導途徑的共刺激作用。舉例來說，與CD28共刺激相關的信號傳導係偏好激活磷脂酸肌醇3-激酶(P13K)途徑，而該4-1BB所介導的信號傳導係經由TNF受體相關因子(TRAF)銜接蛋白。CARs的信號傳導區因此有時含有衍生自超過一個共刺激分子的信號傳導區的共刺激序列。包含帶有多重共刺激序列的信號傳導區的CARs通常被稱為第三代CARs。

任擇的鉸鏈區可提供該抗原結合域與該跨膜域之間的分隔，並且可充當撓性聯接子。鉸鏈區可為允許該結合部分以不同方向取向的撓性域。鉸鏈區可衍生自IgG1或免疫球蛋白的CH₂ CH₃ 區。

CARs可與共刺激配體、嵌合共刺激受體或細胞介素合併，以進一步增強T細胞效力、特異性和安全性(Sadelain et al., The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388–398. doi:10.1158/2159-8290.CD-12-0548，特地以參照方式併入本案)。

亦提供了包含根據本發明的CAR的細胞。根據本發明的CAR可用於生成T細胞。將CARs改造成T細胞可在培養期間在體外進行，以用於轉導和擴增，例如在用於授受性T細胞療法的T細胞擴增期間發生。編碼該TGF-β誘餌受體與CARs的核酸

本發明提供了一種核酸，其編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體或CAR。在一些具體例中，該核酸是純化的或單離的，譬如來自其他核酸、或天然存在的生物材料。

本發明亦提供了一種載體，其包含編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體或CAR的核酸。

如本案所用的「載體」是用作將外源性核酸移入細胞內的載體的核酸(DNA或RNA)。載體可為用於在細胞中表現核酸的表現載體。此類載體可包括可操作地聯接至編碼待表現的序列的核酸的啟動子序列。載體亦可包括終止密碼子和表現增強子。本領域已知的任何適宜載體、啟動子、增強子和終止密碼子可用於從根據本發明的載體表現根據本發明的TGF-β誘餌受體/CAR。

在本說明書中，術語「可操作地聯接」可包括選定的核酸序列和調控核酸序列(譬如啟動子及/或增強子)以俾使該核苷酸序列的表現係受到調控序列的影響或控制的方式共價地聯接(藉此形成表現匣)的情況。於是，假使該調控序列能夠致效該核酸序列的轉錄，則該調控序列與該選定的核酸序列係可操作地聯接。倘若適當，所得的轉錄物隨後可轉譯成所欲的多肽。

根據本發明的核酸及/或載體較佳被提供用於引進細胞，譬如原代人類免疫細胞。適宜的載體包括質體、二元載體、DNA載體、mRNA載體、病毒載體(譬如γ反轉錄病毒載體(譬如鼠類白血病病毒(MLV)所衍生的載體)、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘病毒載體和皰疹病毒載體)、基於轉位子的載體、和人工染色體(譬如酵母人工染色體)，譬如Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225或Morgan and Boyerinas, Biomedicines 2016 4, 9所述，茲此將兩者以參照方式整體併入。在一些具體例中，該病毒載體可為慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、或單純皰疹病毒載體。在一些具體例中，該慢病毒載體可為pELNS，或可衍生自pELNS。在一些具體例中，該載體可為編碼CRISPR/Cas9的載體。包含/表現TGF-β誘餌受體與CARs的細胞

本發明亦提供了一種細胞，其包含或表現根據本發明的TGF-β誘餌受體或CAR。亦提供了一種細胞，其包含或表現根據本發明的核酸或載體。

該細胞可為真核細胞，譬如哺乳動物細胞。哺乳動物可為人類、或非人類哺乳動物(譬如兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其他囓齒動物(包括囓齒動物目中的任何動物)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛(包括母牛，譬如乳牛，或牛目中的任何動物)、馬(包括馬目中的任何動物)、驢、和非人類靈長類)。

在一些具體例中，該細胞可來自、或可獲自人類個體。

在一些具體例中，該細胞是通常對TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)有回應的細胞，譬如表現TGF-β受體的細胞(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)。

該細胞可為免疫細胞。該細胞可為造血起源的細胞，譬如嗜中性球、嗜伊紅球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴球、或單核球。淋巴球可為譬如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或先天淋巴細胞(ILC)、或其前體。該細胞可表現譬如CD3多肽(譬如CD3γ CD3ε CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。

在一些具體例中，該細胞是T細胞。在一些具體例中，該T細胞是CD3+ T細胞。在一些具體例中，該T細胞是CD3+、CD8+ T細胞。在一些具體例中，該T細胞是細胞毒性T細胞(譬如細胞毒性T淋巴細胞(CTL))。

在一些具體例中，該細胞可為包含/表現嵌合抗原受體(CAR)的細胞，譬如CAR-T細胞。在一些具體例中，該細胞可為包含/表現編碼CAR的核酸或載體的細胞。嵌合抗原受體(CARs)是提供抗原結合和T細胞激活功能的重組受體。CAR結構和改造係回顧，舉例來說，於Dotti et al., Immunol Rev (2014) 257(1)，其整體內容係以參照方式併入本案。

亦提供了一種細胞，其包含/表現CAR，並包含/表現根據本發明的TGF-β誘餌受體或CAR。該細胞可為CAR-T細胞。將CAR改造成T細胞可在培養期間在體外進行以供轉導和擴增，例如在用於授受性T細胞療法的T細胞擴增期間發生。

在一些具體例中，該細胞是抗原特異性T細胞。在本案的具體例中，「抗原特異性」T細胞是回應於T細胞特異性抗原而展現T細胞的某些功能特性的細胞，或表現該抗原的細胞。在一些具體例中，該特性是與效應物T細胞，譬如細胞毒性T細胞相關的功能特性。

在一些具體例中，抗原特異性T細胞可展現下列特性的一或多者：細胞毒性，譬如針對包含/表現T細胞特異性抗原的細胞；增生、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔素表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現、及/或FAS配體(FASL)表現，以回應於T細胞特異性抗原或包含/表現T細胞特異性抗原的細胞。

在此，IFNγ、CD107a、IL-2、TNFα、穿孔素、顆粒酶及/或FASL的「表現」可指基因表現或蛋白質表現。基因表現可藉由熟習此藝者已知的各種方式測量，舉例來說，藉由定量即時PCR (qRT-PCR)測量mRNA位準、或藉由以報導分子為基礎的方法。類似地，蛋白質表現可藉由本領域眾所周知的各種方法測量，譬如藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術、ELISA、ELISPOT、或以報導分子為基礎的方法。「增加的表現」是指大於下列的表現位準：未接觸就T細胞而言特異性的抗原或包含或表現就T細胞而言特異性的抗原的細胞的T細胞的基因/蛋白質表現位準、或回應於不包含或表現就T細胞而言特異性的抗原的細胞的T細胞的表現位準。

在一些具體例中，T細胞特異性抗原可為下列病毒的肽或多肽，譬如EB病毒(EBV)、流感病毒、麻疹病毒、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)、單純皰疹病毒(HSV)或乳突病毒(HPV)。

本發明亦提供了一種用於製造包含根據本發明的核酸或載體的細胞的方法，該方法包括將根據本發明的核酸或載體導入細胞中。本發明亦提供了一種用於製造表現根據本發明的TGF-β誘餌受體或CAR的細胞的方法，該方法包括將根據本發明的核酸或載體導入細胞中。在一些具體例中，該方法額外地包含在適合細胞表現核酸或載體的條件下培養細胞。在一些具體例中，該方法係於體外進行。

在一些具體例中，將根據本發明的單離核酸或載體導入細胞內係包含轉導，譬如反轉錄病毒的轉導。據此，在一些具體例中，單離核酸或載體被包含在病毒載體內，或該載體是病毒載體。在一些具體例中，該方法包含藉由電穿孔將根據本發明的核酸或載體導入，譬如 Koh et al., Molecular Therapy – Nucleic Acids (2013) 2, e114所述，茲此將其以參照方式整體併入。

本發明亦提供藉由根據本發明的用於製造細胞的方法所獲得或可獲得的細胞。組成物

本發明亦提供包含根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體或細胞的組成物。

根據本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體和細胞可配製成用於臨床使用的藥學組成物，並且可包含藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。

根據本發明，亦提供了用於製造藥學上有用的組成物的方法，此類製造方法可包含選自下列的一或多個步驟：單離本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、細胞、核酸或載體；及/或將本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、細胞、核酸或載體與藥學上可接受的載劑、佐劑、賦形劑或稀釋劑混合。

舉例來說，本發明的另一態樣關於配製或製造用於治療癌症的藥劑或藥學組成物的方法，該方法包含藉由混合本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、細胞、核酸或載體與藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑或稀釋劑來配製藥學組成物或藥劑。 TGF-β誘餌受體和表現該TGF-β誘餌受體的細胞的特性

本發明的TGF-β誘餌受體與CARs以及表現此類受體的細胞可藉由參照某些特性來表徵。

尤其，根據本發明的TGF-β誘餌受體可擁有下列特性的一或多者：結合至TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)；抑制TGF-β與TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)之間的交互作用；抑制TGF-β介導的信號傳導；抑制藉由TGF-β結合至TGF-β受體介導的信號傳導；接附至細胞膜；定位至脂膜筏；誘發脂膜筏聚集的能力；誘發脂質相關信號傳導的能力。

根據本發明的CAR亦可藉由參照此類特性的一或多者來表徵。

能夠結合至TGF-β的TGF-β誘餌受體係較佳以更大的親和力、及/或比其結合至除TGF-β以外的蛋白質更長的持續時間結合TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)。在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可以比TGF-β細胞介素超家族的一或多個其他成員更大的親和力結合至TGF-β。在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可以比TGF-α更大的親和力結合至TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)。

在一些具體例中，結合至除TGF-β以外的蛋白質的幅度係小於藉由ELISA、SPR、生物層干涉術(BLI)、微量級熱泳(MST)、或藉由放射免疫分析(RIA)所測得的TGF-β誘餌受體結合至TGF-β的約10%。或者，就TGF-β而言的結合特異性可以結合親和力的方式反映，其中本發明的TGF-β誘餌受體係以至少0.1數量級(即0.1 x 10n，其中n是代表數量級的整數)大於針對另一個非標靶分子之KD的KD結合至TGF-β。此可任擇地為至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、或2.0之一者。

結合親和力可用解離常數(KD)表示。結合親和力可藉由本領域已知的方法測量，例如藉由ELISA (舉例來說，如Antibody Engineering, vol. 1 (2nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665所述)、表面電漿共振(SPR；參閱，譬如Hearty et al., Methods Mol Biol (2012) 907:411-442；或Rich et al., Anal Biochem. 2008 Feb 1；373(1):112-20)、生物層干涉術(參閱，譬如Lad et al., (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507；或Concepcion et al., Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep；12(8):791-800)、微量級熱泳(MST)分析(參閱，譬如Jerabek-Willemsen et al., Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug；9(4): 342–353)或藉由放射性標記的抗原結合試驗(RIA)。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體係以5 µM或更小的KD結合至TGF-β，較佳為下列之一： ≤1 µM、≤500 nM、≤100 nM、≤75 nM、≤50 nM、≤40 nM、≤30 nM、≤20 nM、≤15 nM、≤12.5 nM、≤10 nM、≤9 nM、≤8 nM、≤7 nM、≤6 nM、≤5 nM、≤4 nM ≤3 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤500 pM。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體係以EC50 = 1000 ng/ml或更小的結合親和力(譬如藉由ELISA測定)結合至TGF-β，較佳為下列之一：≤900 ng/ml、≤800 ng/ml、≤700 ng/ml、≤600 ng/ml、≤500 ng/ml、≤400 ng/ml、≤300 ng/ml、≤200 ng/ml、≤100 ng/ml、≤90 ng/ml、≤80 ng/ml、≤70 ng/ml、≤60 ng/ml、≤50 ng/ml、≤40 ng/ml、≤30 ng/ml、≤20 ng/ml、≤15 ng/ml、≤10 ng/ml、≤7.5 ng/ml、≤5 ng/ml、≤2.5 ng/ml、或≤1 ng/ml。

根據本發明的TGF-β誘餌受體抑制TGF-β介導的信號傳導。在此，「抑制」是指相對於對照組條件的降低、減少或變少。舉例來說，TGF-β誘餌受體對過程的抑制是指在沒有TGF-β誘餌受體、及/或在適當對照組的存在下，該過程的幅度/程度降低、減少或變少。

熟習此藝者能夠識別給定試驗的適當對照組條件。舉例來說，對照組受體可為針對標靶蛋白的受體，已知其不具有涉及試驗中所調查的特性的作用。

本案的抑制亦可被稱為中和或拮抗。亦即，能夠抑制功能或過程(譬如交互作用、信號傳導或由TGF-β介導的其他活性)的TGF-β誘餌受體可被說是─就相關的功能或過程而言─「中和」或「拮抗」TGF-β誘餌受體。舉例來說，能夠抑制TGF-β介導的信號傳導的TGF-β誘餌受體可被稱為能夠中和TGF-β介導的信號傳導的TGF-β誘餌受體，或者可被稱為TGF-β介導的信號傳導的拮抗劑。

根據本發明的TGF-β誘餌受體係較佳與一或多個天然存在的TGF-β受體，譬如TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的變化型/同功型/同系物或TGF-β結合片段競爭與TGF-β的結合。在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體是結合TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3、和TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3的變化型/同功型/同系物或TGF-β結合片段的一或多者的競爭性抑制劑。亦即，在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體能夠抑制TGF-β與一或多個天然存在的TGF-β受體之間的交互作用。

如本案所用，「天然存在的受體」是在大自然中發現的受體。天然存在的受體及/或其構分肽/多肽可為來自給定宿主物種的內源性核酸的轉錄、mRNA加工(譬如剪接)、轉譯、和轉譯後加工(譬如蛋白水解切割、糖基化)的產物。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體是在被一或多個天然存在的TGF-β受體結合的區內結合至TGF-β。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體結合至與該被一或多個天然存在的TGF-β受體結合的區的相同區、或重疊區。在一些具體例中，該天然存在的TGF-β受體是TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3。在一些具體例中，該天然存在的TGF-β受體是TGF-βR2。

TGF-β誘餌受體與天然存在的TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的變化型/同功型/同系物或TGF-β結合片段)競爭與TGF-β的結合的能力(即抑制TGF-β與天然存在的受體之間的交互作用)可藉由，舉例來說，在TGF-β誘餌受體、或表現TGF-β誘餌受體的細胞的存在下或將TGF-β、或TGF-β與天然存在的受體和TGF-β誘餌受體、或表現TGF-β誘餌受體的細胞培育之後分析TGF-β與天然存在的受體之間的交互作用來測定。

用來測定給定的TGF-β誘餌受體是否與TGF-βR1、TGF-βR2、TGF-βR3、或TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的變化型/同功型/同系物或TGF-β結合片段競爭的適宜試驗的例子是競爭性結合試驗，舉例來說，競爭性ELISA試驗。

能夠抑制給定交互作用(譬如在TGF-β 與TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的一者之間)的TGF-β誘餌受體係藉由觀察在該TGF-β誘餌受體、或表現該TGF-β誘餌受體的細胞的存在下，或在交互作用夥伴的一或兩者和該TGF-β誘餌受體、或表現該TGF-β誘餌受體的細胞培育之後，交互作用夥伴之間的交互作用位準的降低/減少來識別，其係相較於沒有TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞(或在適當對照組受體/細胞的存在下)的交互作用位準。適宜的分析可在體外進行，譬如使用重組交互作用夥伴或使用表現交互作用夥伴的細胞。表現交互作用夥伴的細胞可內源地實行，或可從導入細胞的核酸實行。為了此類偵測目的，交互作用夥伴的一或兩者及/或該TGF-β誘餌受體可被標記或連同可偵測實體一起使用，以供偵測及/或測量交互作用的位準。

此類試驗亦可用於測定TGF-β誘餌受體是否結合至被一或多個天然存在的TGF-β受體結合的TGF-β的相同區或重疊區。亦即，觀察在該TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞的存在下，或在交互作用夥伴的一或兩者和該TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞培育之後，相較於沒有TGF-β誘餌受體/細胞的交互作用位準，TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)與譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3之間的交互作用位準的降低/減少表明了TGF-β誘餌受體係結合至被一或多個天然存在的TGF-β受體結合的區的TGF-β的相同區或重疊區。

根據本發明的TGF-β誘餌受體是否在與被天然存在的TGF-β受體結合的區的TGF-β的相同或相同區或重疊區內結合至TGF-β亦可藉由使用本領域眾所周知的各種方法分析交互作用來測定，包括受體-配體複合物的X射線共晶分析、肽掃描、突變定位、藉由質譜的氫-氘交換分析、噬菌體展示和基於蛋白水解的「保護」方法。此類方法係描述，舉例來說，於Gershoni et al., BioDrugs, 2007, 21(3):145-156，其以參照方式併入本案。

TGF-β誘餌受體抑制兩個交互作用夥伴之間的交互作用的能力亦可藉由分析該交互作用的下游功能性結果，譬如TGF-β受體信號傳導來測定。

TGF-β信號傳導的試驗是本領域已知的，並且包括，譬如對轉錄回應於TGF-β的刺激而被上調/下調的基因的基因表現試驗、分析TGF-β信號傳導的胞內介導物的激活(譬如藉由分析相關因子的磷酸化來測定)的試驗、用於分析表現/加工與TGF-β信號傳導有關的蛋白質的試驗、以及分析與TGF-β信號傳導有關的細胞表型變化的試驗。

舉例來說，TGF-β信號傳導的試驗可涉及以TGF-β處理細胞並分析SMAD2、SMAD3、SMAD1、SMAD5、SMAD9和p38中的一或多者的磷酸化、及/或分析CREB和NFκB中的一或多者的表現。可進行TGF-β信號傳導的試驗，譬如本揭示內容的實施例8所述。

此類試驗亦可用於分析藉由TGF-β介導的信號傳導，譬如由TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)結合至TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)介導的信號傳導。

如本案所用，由TGF-β介導的「TGF-β介導的信號傳導」及/或過程包括由TGF-β片段和包含TGF-β或其片段的多肽複合物介導的信號傳導。TGF-β介導的信號傳導可為由人類TGF-β及/或小鼠TGF-β介導的信號傳導。TGF-β介導的信號傳導可在TGF-β或含有TGF-β的複合物結合至TGF-β或該複合物所結合的受體之後發生。

基因表現可藉由熟習此藝者已知的各種方式測量，舉例來說，藉由定量即時PCR (qRT-PCR)或藉由以報導分子為基礎的方法測量mRNA位準。類似地，蛋白質表現可藉由本領域眾所周知的各種方法測量，舉例來說，藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術、ELISA、ELISPOT、或以報導分子為基礎的方法。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體、或表現該受體的細胞係能夠抑制TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)與TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)之間的交互作用至在沒有該TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞(或在適當對照組受體/細胞的存在下)之下的TGF-β與TGF-β受體之間的交互作用位準的少於100%，譬如下列之一：99%或更少、95%或更少、90%或更少、85%或更少、75%或更少、70%或更少、65%或更少、60%或更少、55%或更少、50%或更少、45%或更少、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少、或1%或更少。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體、或表現該受體的細胞係能夠抑制TGF-β與TGF-β受體之間的交互作用至在沒有該TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞(或在適當對照組受體/細胞的存在下)之下的少於1倍，譬如下列之一： ≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體能夠抑制TGF-β的生物活性。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體是在對於結合至TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)而言重要的一區內結合至TGF-β，藉此破壞與該受體的結合及/或經由該受體的信號傳導。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體是一或多個信號傳導途徑的拮抗劑，該信號傳導途徑係經由TGF-β的受體，譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3的信號轉導被激活。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體能夠抑制經由一或多個包含TGF-β受體的免疫受體複合物的信號傳導。

在一些具體例中，根據本發明的TGF-β誘餌受體、或表現該受體的細胞係能夠抑制TGF-β介導的信號傳導抑制至在沒有TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞(或在適當對照組受體/細胞的存在下)之下的少於100%，譬如下列之一：99%或更少、95%或更少、90%或更少、85%或更少、75%或更少、70%或更少、65%或更少、60%或更少、55%或更少、50%或更少、45%或更少、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少、或1%或更少的信號傳導位準。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體、或表現該受體的細胞係能夠抑制TGF-β介導的信號傳導抑制至在沒有該TGF-β誘餌受體或表現該TGF-β誘餌受體的細胞(或在適當對照組受體/細胞的存在下)之下的少於1倍，譬如下列之一：≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍。

此類信號傳導可藉由譬如處理表現TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的細胞並以TGF-β處理來分析。

根據本發明的TGF-β誘餌受體可在表現該TGF-β誘餌受體的細胞中，譬如經由細胞膜錨定物區接附至該細胞膜。在一些具體例中，該細胞膜錨定物區可為脂質錨定物區，其可包含脂質錨定物，譬如GPI錨定物或由脂質錨定物，譬如GPI錨定物構成。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可經由接合(譬如共價接合)受體和細胞膜或其組分(譬如磷脂)來接附至表現該TGF-β誘餌受體的細胞的細胞膜。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可接附至該細胞膜雙層的外層。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可經由接合GPI錨定物和細胞膜或其組分來接附至表現該TGF-β誘餌受體的細胞的細胞膜。在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可經由GPI錨定物的脂質組分與細胞膜的脂質組分之間的交互作用來接附至表現該TGF-β誘餌受體的細胞的細胞膜。

GPI錨定蛋白的釋放可經由以磷脂酶C (PLC)處理來實現，該磷脂酶C水解磷脂醯肌醇的磷二酯鍵。

在一些具體例中，該TGF-β誘餌受體可定位於表現該TGF-β誘餌受體的細胞的細胞膜內的脂膜筏。定位至脂膜筏可經由該脂質錨定物區(譬如GPI錨定物)。

脂膜筏是細胞膜區塊，其特徵在於富含膽固醇、鞘醣脂、鞘磷脂、帶有醯基鏈的磷脂、以及GPI聯接蛋白，還有其他膜蛋白，例如先天免疫受體(Lingwood and Simmons 2010, Science 327:46-50)。

給定因子至脂膜筏的定位可藉由本領域眾所周知的方式分析。舉例來說，活細胞的脂膜筏可以譬如螢光標記來標記，該因子至脂膜筏的定位可被分析並量化。脂膜筏標記套組的一個例子是Vybrant® Alexa Fluor® 555脂膜筏標記套組(ThermoFisher Scientfic)。給定因子的脂膜筏定位亦可藉由從表現該因子的細胞中單離脂膜筏組分，並稍後分析脂膜筏的因子(譬如藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、ELISA、免疫染色等等或以報導分子為基礎的方法)。脂膜筏的單離和分析係描述，舉例來說，於Lee, Methods Mol Biol. 2013; 1066:131-45與Lemaire-Vieille et al. (2013) Bio-protocol 3(16): e854，茲此將該兩者以參照方式整體併入。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可在表現該受體的細胞中誘導脂膜筏聚集。在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可誘發與脂質有關的信號傳導。

脂膜筏聚集可以譬如如同Janes et al. 1999, The Journal of Cell Biology, 147(2): 447–461所述般分析。脂質相關的信號傳導可為由下列脂質信號傳導分子介導的信號傳導，譬如：神經鞘脂(神經醯胺、鞘氨醇、鞘氨醇-1-磷酸、葡糖神經醯胺、神經醯胺-1-磷酸、磷脂醯肌醇二磷酸、溶血磷脂酸(LPA)、血小板活化因子(PAF)、內源性大麻素、前列腺素、羥基脂肪酸的脂肪酸酯(FAHFA)、視黃醇衍生物、類固醇激素、視黃酸或前列腺素。脂質相關的信號傳導可能涉及譬如src、ras或rac的下游的激活。脂質相關的信號傳導可譬如使用下列來分析：分析轉錄受到脂質相關信號傳導上調/下調的基因的基因表現試驗、分析脂質相關信號傳導的胞內介導物的激活的試驗(譬如藉由分析相關因子的磷酸化來測定)、分析蛋白質相關的脂質相關信號傳導的表現/加工的變化的試驗、以及分析與脂質相關的細胞的表型變化的試驗。

脂膜筏聚集和脂質相關的信號傳導可提供增強的T細胞受體信號傳導，並且亦可逆轉TGF-β介導的信號傳導的效應。脂膜筏聚集和脂質相關的信號傳導可致使src、ras、rac或sox之一或多者的下游激活，所以本發明的TGF-β誘餌受體可能能夠將抑制信號從TGF-β轉換成T細胞活化的信號。以此方式，對包含/表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞的TGF-β處理效應可為刺激性的，而非抑制性的。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可比另一個TGF-β結合蛋白更大程度地定位在表現TGF-β誘餌受體的細胞的脂膜筏。在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體比天然存在的TGF-β結合蛋白，例如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2更大程度地定位在表現TGF-β誘餌受體的細胞的脂膜筏。

給定分子定位在脂膜筏的程度可以譬如藉由分析表現該相關分子的細胞的脂膜筏和非脂膜筏組分，並測定與該脂膜筏及/或非脂膜筏組分有關的分子的比例來決定。

在一些具體例中，相較於另一個TGF-β結合蛋白，本發明的TGF-β誘餌受體可更大程度地誘發表現該受體的細胞的脂膜筏聚集。在一些具體例中，相較於另一個TGF-β結合蛋白，本發明的TGF-β誘餌受體可更大程度地誘發脂質相關的信號傳導。

在此，脂膜筏的定位、誘發脂膜筏聚集的能力、「更大程度上」誘發脂質相關信號傳導的能力可大於1倍，譬如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2在表現該TGF-β結合蛋白的細胞中所展示的定位、誘發脂膜筏聚集或誘發脂質相關信號傳導的程度。

在一些具體例中，相較於另一個TGF-β結合蛋白在表現該TGF-β結合蛋白的細胞表面的表現位準，本發明的TGF-β誘餌受體可展示在表現該TGF-β誘餌受體的細胞表面的增加之表現位準。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可展現到細胞表面的運輸改善了，可更穩定地與細胞膜相關聯，可展現來自該細胞表面的內化降低，或可展現來自細胞表面的釋放減少了。

TGF-β誘餌受體的表面表現位準的增加係與可用於結合至帶有信號傳導能力的TGF-β受體的TGF-β份量減少了，進而帶來對TGF-β介導的信號傳導的更大抑制的優點有關。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可展示表現該TGF-β誘餌受體的細胞上的增加之表面表現位準，其係相較於天然存在的TGF-β結合蛋白，例如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2在表現此類TGF-β結合蛋白的細胞上的表面表現位準。給定蛋白質的細胞表面表現可藉由本領域眾所周知的各種方法測量，譬如藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術、ELISA、ELISPOT、或以報導分子為基礎的方法。

舉例來說，TGF-β誘餌受體的細胞表面表現的試驗可涉及使用能夠辨識誘餌受體的TGF-β結合區的抗體的分析。試驗可譬如以本揭示內容的實施例7進行。

細胞表面表現位準的增加可大於1倍，譬如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2在表現該TGF-β結合蛋白的細胞中的所展示的表面表現位準。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體可能夠比另一個TGF-β結合蛋白更大程度地抑制表現TGF-β誘餌受體的細胞中的TGF-β介導的信號傳導。舉例來說，該TGF-β誘餌受體可展現與TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)的結合改善了(譬如更大的親和力及/或更大的結合性(avidity))、或抑制TGF-β與具有信號傳導能力的TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2或TGF-βR3)的交互作用的能力改善了。

表現給定TGF-β結合蛋白的細胞的TGF-β介導的信號傳導可譬如以TGF-β處理細胞之後如本案所述般分析。

「更大程度上」抑制TGF-β介導的信號傳導可大於1倍，譬如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2所展示的TGF-β介導的信號傳導的程度的抑制。

在一些具體例中，本發明的TGF-β誘餌受體從表現該誘餌受體的細胞分泌的程度可大於從表現該TGF-β結合蛋白的細胞分泌另一個TGF-β結合蛋白的位準。有利地，分泌的TGF-β誘餌受體能夠結合至可溶性TGF-β，藉此降低可用於接合有細胞信號傳導能力的TGF-β受體的的可溶性TGF-β的位準。

從細胞分泌給定蛋白質的位準可藉由測量表現該蛋白質的細胞的細胞培養上清液中的受體份量來分析，譬如藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術、ELISA、ELISPOT、或以報導分子為基礎的方法。

「更大程度上」的分泌可大於1倍，譬如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或如Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2在表現該TGF-β結合蛋白的細胞的分泌程度。

相較於不表現TGF-β誘餌受體的相仿細胞的TGF-β介導的信號傳導位準，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展示降低的TGF-β介導的信號傳導位準，譬如在以TGF-β處理之後。細胞的TGF-β介導的信號傳導可如本案所述般分析。

在一些具體例中，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體係展示未表現該TGF-β誘餌受體的相仿細胞的信號傳導位準的少於100%，譬如下列之一：99%或更少、95%或更少、90%或更少、85%或更少、75%或更少、70%或更少、65%或更少、60%或更少、55%或更少、50%或更少、45%或更少、40%或更少、35%或更少、30%或更少、25%或更少、20%或更少、15%或更少、10%或更少、5%或更少、或1%或更少的TGF-β介導的信號傳導位準(譬如回應於TGF-β的處理)。在一些具體例中，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體係展示未表現該TGF-β誘餌受體的相仿細胞的信號傳導位準的少於1倍，譬如下列之一：≤0.99倍、≤0.95倍、≤0.9倍、≤0.85倍、≤0.8倍、≤0.85倍、≤0.75倍、≤0.7倍、≤0.65倍、≤0.6倍、≤0.55倍、≤0.5倍、≤0.45倍、≤0.4倍、≤0.35倍、≤0.3倍、≤0.25倍、≤0.2倍、≤0.15倍、≤0.1倍的TGF-β介導的信號傳導位準(譬如回應於TGF-β的處理)。

類似地，譬如以TGF-β處理之後，相較於不表現TGF-β誘餌受體的相仿細胞的回應位準，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展現與TGF-β介導的信號傳導有關的回應位準降低了。亦即，相較於不表現TGF-β誘餌受體的相仿細胞，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展示以TGF-β處理的敏感性降低了。

在一些具體例中，表現TGF-β誘餌受體的細胞可展現對TGF-β介導的細胞活性抑止的降低之敏感性。譬如以TGF-β處理之後，相較於不表現TGF-β誘餌受體的相仿細胞，表現本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展示下列特性的一或多者：增生速度增加；一或多個生長因子(譬如IL-2)的表現增加；存活增加；一或多個細胞毒性/效應子(譬如IFNγ、顆粒酶、穿孔素、顆粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表現增加；細胞毒性增加；改良的抗癌效應。

在一些具體例中，相較於沒有以TGF-β處理的相同細胞的特性位準，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展現先前段落所述以TGF-β處理之後的特性的一或多者。

該細胞可為造血起源的細胞，譬如嗜中性球、嗜伊紅球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴球、或單核球。淋巴球可為譬如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或先天淋巴細胞(ILC)、或其前體。該細胞可表現譬如CD3多肽(譬如CD3γ CD3ε CD3ζ或CD3δ)、TCR多肽(TCRα或TCRβ)、CD27、CD28、CD4或CD8。在一些具體例中，該細胞可包含或表現CAR (或可包含/表現編碼CAR的核酸/載體)；譬如，該細胞可為CAR-T細胞。

該等特性可藉由熟習此藝者眾所周知的方法分析。

細胞或細胞群的增生或擴增速率可以譬如藉由測量不同時間點的細胞數目、或藉由分析³ H-胸苷的併入或CFSE稀釋試驗，譬如Fulcher and Wong, Immunol Cell Biol (1999) 77(6): 559-564中所述來分析。增生及/或擴增可在體內、或在體外或離體的培養物測量。

生長因子和細胞毒性/效應物因子的基因或蛋白質表現可以譬如藉由mRNA位準的qPCR分析、及/或藉由用於偵測相關蛋白的以免疫試驗為基礎的方法，例如ELISA、流式細胞術、免疫印跡等等來測量。

細胞的存活/持久性(譬如在體內、或體外或離體培養物的存活/持久性)可藉由監控隨著時間變化的細胞數、藉由偵測以可偵測標記物標記的細胞來測定。

細胞毒性可以，舉例來說，使用Zaritskaya et al., Expert Rev Vaccines (2011), 9(6):601-616所回顧方法的任一者研究，譬如藉由⁵¹ Cr釋放試驗，茲此將其以參照方式整體併入。

抗癌效應可以譬如藉由分析表現TGF-β誘餌受體的細胞譬如在體外殺死癌細胞的能力來研究。該癌症可表現就該細胞而言為特異性的抗原。抗癌效應亦可以癌症的動物模型在體內研究，譬如藉由分析在投予表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞之後，癌症症狀的發展、進展或嚴重程度、及/或動物的存活，並與適當的對照組條件比對。

表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞的基因或蛋白質表現、增生、擴增、存活、細胞毒性或抗癌效應之增加可為下列之一：大於1倍，譬如 ≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、 ≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、 ≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於不表現該TGF-β誘餌受體的相仿細胞所展示表現、增生、擴增、存活、細胞毒性或抗癌效應的位準。

在一些具體例中，相較於表現另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2的相仿細胞，表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞可展現TGF-β介導的細胞活性抑止的降低之敏感性。

在一些具體例中，譬如在以TGF-β處理之後，相較於表現另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2的相仿細胞，表現TGF-β誘餌受體的細胞可展現下列特性的一或多者：增生或擴增速度增加，譬如體外及/或體內；一或多個生長因子(譬如IL-2)的表現增加；存活增加；一或多個細胞毒性/效應子(譬如IFNγ、顆粒酶、穿孔素、顆粒溶素、CD107a、TNFα、FASL)的表現增加；細胞毒性增加；改良的抗癌效應。

表現根據本發明的TGF-β誘餌受體的細胞的增加之基因或蛋白質表現、增生、擴增、存活、細胞毒性或抗癌效應可為下列之一：大於1倍，譬如≥1.01倍、≥1.02倍、≥1.03倍、≥1.04倍、≥1.05倍、≥1.06倍、≥1.07倍、≥1.08倍、≥1.09倍、≥1.1倍、≥1.2倍、≥1.3倍、≥1.4倍、≥1.5倍、≥1.6倍、≥1.7倍、≥1.8倍、≥1.9倍、≥2倍、≥2.1倍、≥2.2倍、≥2.3倍、≥2.4倍、≥2.5倍、≥2.6倍、≥2.7倍、≥2.8倍、≥2.9倍、≥3倍、≥3.5倍、≥4倍、≥4.5倍、≥5倍、≥6倍、≥7倍、≥8倍、≥9倍、≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥25倍、≥30倍、≥35倍、≥40倍、≥45倍、≥50倍、≥60倍、≥70倍、≥80倍、≥90倍、≥100倍、≥200倍、≥300倍、≥400倍、≥500倍、≥600倍、≥700倍、≥800倍、≥900倍、≥1000倍於表現另一個TGF-β結合蛋白，譬如TGF-β受體(譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)、BAMBI (如Onichtchouk et al.所述，同上)、或Bollard et al.、Russo et al.、Zhang et al.或Penafuerte et al. (同上)所述的TGF-β結合蛋白，例如DN-TGF-βR2的相仿細胞所展示的表現、增生、擴增、存活、細胞毒性或抗癌效應的位準。治療應用

根據本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體、細胞和藥學組成物可用於治療和預防方法。

本發明提供根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或藥學組成物，其係用於醫學治療或預防的方法。本發明亦提供了根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或藥學組成物在製造用於治療或預防疾病或病況的藥劑的用途。本發明亦提供了治療或預防疾病或病況的方法，包含將治療或預防有效量的根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或藥學組成物投予個體。

尤其，根據本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體、細胞和藥學組成物可用來治療或預防與TGF-β介導的信號傳導有關的疾病/病況。如本案所解釋的，本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸，細胞和組成物可用來降低TGF-β介導的信號傳導位準。據此，本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體、細胞和組成物可用於治療或預防TGF-β介導的信號傳導的位準降低將提供治療或預防益處的疾病/病況。

「治療」，舉例來說，可為疾病/病況的發展或進展減少、疾病/病況的症狀減輕或疾病/病況的病理學減少。疾病/病況的治療或減輕可有效預防該疾病/病況的進展，譬如預防病況惡化或減緩發展速度。在一些具體例中，治療或減輕可得到疾病/病況的改善，譬如該疾病/病況的症狀減輕或該疾病/病況的嚴重性/活性的一些其他相關性的降低。疾病/病況的預防可指預防疾病/病況惡化或預防疾病/病況發展，譬如預防早期疾病/病況發展成晚期慢性階段。

在一些具體例中，欲治療或預防的疾病或病況可為與TGF-β介導的信號傳導有關的疾病/病況(譬如TGF-β介導的信號傳導在病理學上有所牽連的疾病/病況)、及/或就該疾病/病況而言，TGF β介導的信號傳導是一個風險因素。在一些具體例中，相較於對照組狀態，該疾病/病況可能與TGF-β介導的信號傳導位準增加有關。

該治療可旨在降低TGF-β介導的信號傳導位準、及/或降低與TGF-β介導的信號傳導有關的回應位準。

在一些具體例中，該治療可旨在降低TGF-β介導的信號傳導位準。投予本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體、細胞和組成物可經由封存TGF-β造成TGF-β介導的信號傳導位準的降低。

在一些具體例中，該治療可旨在降低個體或個體的細胞、細胞群、組織或器官中的TGF-β介導的信號傳導的位準。

在一些具體例中，該治療可包含修飾細胞或細胞群以包含/表現本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體，隨後其對TGF-β可較不敏感。在一些具體例中，該治療可包含將經修飾以包含/表現本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體的細胞或細胞群投予個體。

在一些具體例中，該治療旨在向個體提供對TGF-β介導的細胞/群活性的抑制較不敏感的免疫細胞或免疫細胞群，譬如藉由投予根據本發明的細胞或生成根據本發明的細胞。

欲治療的個體可為任何動物或人類。該個體較佳是哺乳動物，更佳是人類。該個體可為非人類哺乳動物，但更佳是人類。該個體可為男性或女性。該個體可為患者。個體可能已被診斷患有需要治療的疾病或病況，或被懷疑患有此類疾病或病況。

欲治療的個體可展示高位準的TGF-β介導的信號傳導，譬如藉由使用適當試驗分析個體、或從該個體獲得的樣本(譬如細胞、組織、血液樣本)來測定。

該個體可具有TGF-β介導的信號傳導的正調節劑/效應物，譬如TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)或TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)的增加之表現或活性位準，或者可具有被TGF-β介導的信號傳導上調的因子的增加之表現位準或活性。該個體可能具有被TGF-β介導的信號傳導上調的增加之活性位準。

該個體可能具有TGF-β介導的信號傳導的負調節劑的降低之表現或活性位準，或者可能具有被TGF-β介導的信號傳導下調的因子的降低之表現位準或活性。該個體可能具有被TGF-β介導的信號傳導下調的降低之活性位準。

增加/降低可相對於在沒有相關疾病/病況時的表現/活性位準，譬如在健康對照組個體或從健康對照組個體獲得的樣本中的表現/活性位準。

在一些具體例中，該個體可能處於發展/感染疾病或病況的風險中。

在一些具體例中，欲治療或預防的疾病或病況可為癌症。TGF-β介導的信號傳導係牽連到各種癌症的發展/進展。在癌症中的TGFβ信號傳導係在，舉例來說，Nacif and Shaker 2014、Akhurst and Hata 2012、與Meulmeester and ten Dijke 2011 (同上)回顧。

癌症可為任何不欲的細胞增生(或由不欲的細胞增生本身顯現的任何疾病)、贅生物或腫瘤或是不欲的細胞增生、贅生物或腫瘤的增多風險或傾向。癌症可能是良性或惡性的並可能是原發性或繼發性(轉移性)。贅生物或腫瘤可為細胞的任何異常生長或增生，並可位於任何組織中。組織的例子包括腎上腺、腎上腺髓質、肛門、闌尾、膀胱、血液、骨頭、骨髓、腦、乳房、盲腸、中樞神經系統(包括或不包括腦)、小腦、子宮頸、結腸、十二指腸、子宮內膜、上皮細胞(譬如腎上皮細胞)、膽囊、食道、神經膠質細胞、心臟、迴腸、空腸、腎臟、淚腺、喉、肝、肺、淋巴、淋巴結、淋巴母細胞、上頜骨、縱隔、腸繫膜、子宮肌層、鼻咽、網膜、口腔、卵巢、胰腺、腮腺、周圍神經系統、腹膜、胸膜、前列腺、唾液腺、乙狀結腸、皮膚、小腸、軟組織、脾臟、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、舌、扁桃腺、氣管、子宮、外陰、白血球。

欲治療的腫瘤可為神經或非神經系統腫瘤。神經系統腫瘤可源自中樞或周邊神經系統，譬如神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、腦膜瘤、神經纖維瘤、室管膜瘤、神經鞘瘤、神經纖維肉瘤、星形細胞瘤和少突神經膠質瘤。非神經系統癌症/腫瘤可源自任何其他非神經組織，例子包括黑色素瘤、間皮瘤、淋巴瘤、骨髓瘤、白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、霍奇金氏淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、急性骨髓性白血病(AML)、骨髓增生異常症候群(MDS)、皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、肝癌、表皮樣癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、卵巢癌、胰腺癌、胸腺癌、NSCLC、血液癌症和肉瘤。

在一些具體例中，欲治療的癌症是下列的一或多者：鼻咽癌(NPC；譬如E-B病毒(EBV)陽性NPC)、子宮頸癌(CC；譬如人類乳頭瘤病毒(HPV)陽性CC)、口咽癌(OPC；譬如HPV陽性OPC)、胃上皮癌(GC；譬如EBV陽性GC)、肝細胞癌(HCC；譬如B型肝炎病毒(HBV)陽性HCC)、肺癌(譬如非小細胞肺癌(NSCLC))和頭頸癌(譬如源於嘴唇、口腔、鼻子、鼻竇、咽或喉部組織的癌症，譬如頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC))。

在一些具體例中，癌症係與病毒有關或由病毒引起。在一些具體例中，該癌症是EBV陽性癌症。在一些具體例中，該癌症是HPV陽性癌症。

在一些具體例中，該癌症是頭頸癌、鼻咽癌(NPC)、口咽癌(OPC)、子宮頸癌(CC)、胃/胃癌(gastric/stomach cancer)、胃上皮癌(gastric carcinoma)或肺癌之一。

在一些具體例中，該癌症是表現TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)或TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)的癌症。可藉由熟習此藝者眾所周知的任何適宜方式測定癌症表現TGF-β或TGF-β受體。表現TGF-β或TGF-β受體的癌症可藉由偵測TGF-β或TGF-β受體的表現來識別。

在一些具體例中，癌症過度表現TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)或TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)。TGF-β或TGF-β受體的過度表現可藉由偵測TGF-β或TGF-β受體的表現位準來測定，該表現位準係高於等效的非癌細胞/非腫瘤組織的TGF-β或TGF-β受體的表現位準。

在一些具體例中，可基於偵測表現TGF-β或TGF-β受體的癌症、或在從個體獲得的樣本中過度表現TGF-β或TGF-β受體來選擇可接受根據本發明的治療的患者。

表現可為基因表現或蛋白質表現。基因表現可譬如藉由，舉例來說，藉由定量即時PCR (qRT-PCR)偵測編碼TGF-β或TGF-β受體的mRNA來測定。蛋白質表現可譬如藉由，舉例來說，藉由以抗體為基礎的方法，舉例來說，藉由西方墨點法、免疫組織化學、免疫細胞化學、流式細胞術、或ELISA偵測TGF-β或TGF-β受體蛋白。

癌症可能具有TGF-β介導的信號傳導的正向調節劑/效應物，例如TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)或TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF-βR3)的增加之表現或活性位準，或者可具有被TGF-β介導的信號傳導上調的因子的增加之表現或活性位準。癌症可能具有TGF-β介導的信號傳導的負向調節物的降低之表現或活性位準，或者可能具有被TGF-β介導的信號傳導下調的因子的降低之表現位準或活性。增加/減少可相對於等效的非癌細胞/組織中的表現或活性位準。

在一些具體例中，該癌症可能與TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2及/或TGF-β3)或TGF-β受體(譬如TGF-βR1、TGF-βR2及/或TGF- TGF-βR3)的突變有關。在一些具體例中，相對於在沒有突變時觀察到的表現/信號傳導位準，此類突變可能與基因或蛋白的表現位準增加有關，或可能與TGF-β介導的信號傳導位準增加有關。

在一些具體例中，欲治療的疾病/病況可為下列之一：以纖維化為特徵的疾病，例如特發性肺纖維化(IPF)、腎纖維化、心臟纖維化(譬如與心肌梗塞有關的纖維化、缺血性、擴張性和肥大性心肌病以及充血性心衰竭)、硬皮病、骨髓增生異常症候群(MDS)、冠狀動脈搭橋術或血管成形術後的再狹窄、馬凡症候群、眼部病況手術後的瘢痕(譬如在治療青光眼的小梁切除術後、或角膜手術後)、糖尿病和肥胖症。

在一些具體例中，該疾病/病況可為T細胞功能失調病症。T細胞功能失調病症可為正常T細胞功能受損，導致個體對於譬如感染外源劑，例如微生物、細菌和病毒所生成、或由宿主在某些疾病狀態，例如某些形式的癌症(譬如腫瘤相關抗原的形式)所生成的致病性抗原的免疫回應下調的疾病或病況。T細胞功能失調病症的功能受損可為下列的一或多者：細胞毒性，譬如針對包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞；增生、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔素表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現、及/或FAS配體(FASL)表現，譬如回應於就該T細胞而言為特異性的抗原或包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞。

在一些具體例中，該治療可旨在增加/增強T細胞的一或多個下列特性：細胞毒性，譬如針對包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞；增生、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔素表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現、及/或FAS配體(FASL)表現，譬如回應於就該T細胞而言為特異性的抗原或包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞。在一些具體例中，該治療可旨在提供或生成具有一或多個下列特性的增加/增強位準的T細胞或T細胞群：細胞毒性，舉例來說，細胞毒性，譬如針對包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞；增生、IFNγ表現、CD107a表現、IL-2表現、TNFα表現、穿孔素表現、顆粒酶表現、顆粒溶素表現、及/或FASL表現，譬如回應於就該T細胞而言為特異性的抗原或包含/表現就該T細胞而言為特異性的抗原的細胞。

T細胞功能失調病症可能顯現為感染，或無法建立針對感染的有效免疫回應。該感染可能是慢性、持續的、潛伏的或緩慢的，並且可能是細菌、病毒、真菌或寄生蟲感染的結果。是以，可向患有細菌、病毒或真菌感染的患者提供治療。細菌感染的例子包括感染幽門螺旋桿菌。病毒感染的例子包括感染HPV、EBV、HIV、HBV、和HCV。T細胞功能失調病症可能與癌症有關。

該治療可旨在預防T細胞功能失調病症，譬如預防感染、防止癌症的發展或進展。是以，本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體、細胞和組成物可用於預防疾病或疾病狀態的發展/進展。此可在疾病或疾病狀態的症狀發作之前發生，及/或可給予被認為處於疾病或疾病狀態的更大風險發展/進展的個體。

醫學治療方法亦可涉及體內、離體、和過繼性免疫療法，包括使用自體及/或異體細胞或永生化細胞系的那些。投藥

投藥係較佳以「治療有效量」，此係足以向個體顯示益處。實際投藥量、以及投藥速度與時程將取決於所治療疾病的本質與嚴重性。治療處方，譬如對於劑量等的決定係落在家庭醫師和其他專科醫師的責任內，並通常考慮欲治療的病況、個別患者的病況、遞送部位、投藥方法及執業醫師已知的其他因素。以上提及技術和流程的例子可在Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins找到。

根據本發明的TGF-β誘餌受體、CARs、核酸、載體和細胞可配製成用於臨床使用的藥學組成物或藥劑，並可包含藥學上可接受的載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。該組成物可配製用於可包括注射或輸注的局部、腸胃外、全身性、腔內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內、眼內、結膜內、瘤內、皮下、皮內、鞘內、口服或穿皮的投藥途徑。適宜的調配物可包含在無菌或等張介質中的該TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、或細胞。藥劑與藥學組成物可配製成流體，包括凝膠的形式。流體調配物可配製成用於藉由注射或輸注投藥(譬如透過導管)至人體或動物身體的選定區域。

根據本發明，亦提供了用於製造藥學上有用的組成物的方法，該製造方法可包含選自下列的一或多個步驟：單離本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體或細胞；及/或將本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸，載體或細胞與藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑或稀釋劑混合。

舉例來說，本發明的另一態樣關於一種配製或製造用於醫學治療方法的藥劑或藥學組成物的方法，該方法包含藉由混合如本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體或細胞與藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑或稀釋劑來配製藥學組成物或藥劑。

根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物的投藥係較佳以「治療有效」或「預防有效」的量，此係足以向該個體顯示益處。實際投藥量、以及投藥速度與時程將取決於所治療疾病或病況的本質與嚴重性。治療處方，譬如對於劑量等的決定係落在家庭醫師和其他專科醫師的責任內，並通常考慮欲治療的疾病/病況、個別患者的病況、遞送部位、投藥方法及執業醫師已知的其他因素。以上提及技術和流程的例子可在Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins找到。

取決於欲治療的病況，投藥可為單獨的或合併其他治療，同時或依序。根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物和治療劑可同時或依序投予。

在一些具體例中，以本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物治療可伴隨其他治療或預防干預措施，譬如化療、免疫療法、放療、手術、疫苗接種及/或激素療法。

同時投藥是指將TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物和治療劑一起投予，舉例來說，以含有兩劑(合併製劑)的藥學組成物、或緊接在彼此之後並任擇地透過相同的投藥途徑，譬如到相同的動脈、靜脈或其他血管。依序投藥是指在分開投予其餘治療劑的給定時間間隔之後，投予TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物之一。該兩劑不必藉由相同的途徑投予，儘管在一些具體例中是這樣的情況。該時間間隔可為任何時間間隔。

化療和放療分別指的是以藥物或電離輻射(譬如使用X射線或γ射線的放療)治療癌症。該藥物可為化學實體，譬如小分子醫藥品、抗生素、DNA嵌入劑、蛋白質抑制劑(譬如激酶抑制劑)或生物劑，譬如抗體、抗體片段、核酸或肽適體、核酸(譬如DNA、RNA)、肽、多肽、或蛋白質。該藥物可配製成藥學組成物或藥劑。該調配物可包含一或多個藥物(譬如一或多個活性劑)連同一或多個藥學上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑。

治療可涉及投予超過一個藥物。取決於欲治療的病況，藥物可單獨或與其他治療合併投予、同時或依序投予。舉例來說，化療可為涉及兩個藥物的共同療法，其中一或多者係意圖治療癌症。

化療可藉由一或多個投藥途徑投予，譬如腸胃外、靜脈內注射、口服、皮下、皮內或腫瘤內。

化療可根據治療方案投予。該治療方案可為化療投藥的預定時間表、計劃、方案或時程表，其可由醫師或醫務人員準備並且可為需要治療的患者量身訂作。

該治療方案可指明下列的一或多者：投予患者的化療類型；各個藥物或輻射的藥量；投藥之間的時間間隔；各次治療的長度；(如果有的話)任何治療假期的數目和性質等。對於共同治療，可提供單一治療方案，其指示如何施用各個藥劑。

化療藥物和生物製劑(biologics)可選自：烷化劑，例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環磷醯胺(ifosfamide)；嘌呤或嘧啶抗代謝物，例如硫唑嘌呤(azathiopurine)或巰基嘌呤(mercaptopurine)；生物鹼和萜類，例如長春花生物鹼類(譬如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine))、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉烷類，例如紫杉醇(paclitaxel) (TaxolTM)、多西他賽(docetaxel)；拓撲異構酶抑制劑，例如第I型拓撲異構酶抑制劑喜樹鹼(camptothecins)、伊立替康(irinotecan)與托泊替康(topotecan)、或第II型拓撲異構酶抑制劑安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷；抗腫瘤抗生素(譬如蒽環抗生素)，例如更生黴素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin) (阿黴素，AdriamycinTM)、表柔比星(epirubicin)、博來黴素(bleomycin)、雷帕黴素(rapamycin)；以抗體為基質之劑，例如抗-PD-1抗體、抗-PD-L1抗體、抗-TIM-3抗體、抗-CTLA-4、抗-4-1BB、抗-GITR、抗-CD27、抗-BLTA、抗-OX43、抗-VEGF、抗-TNFα、抗-IL-2、抗GpIIb/IIIa、抗-CD-52、抗-CD20、抗-RSV、抗-HER2/neu(erbB2)、抗-TNF受體、抗-EGFR抗體、單株抗體或抗體片段，例子包括：西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝伐單抗(bevacizumab) (Avastin®)、阿瓦西單抗(abciximab)、達克珠單抗(daclizumab)、吉姆單抗(gemtuzumab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab) (Mabthera®)、帕利珠單抗(palivizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、依那西普(etanercept)、阿達利單抗(adalimumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)；EGFR抑制劑，例如埃羅替尼(erlotinib)、西妥昔單抗(cetuximab)與吉非替尼(gefitinib)；抗血管生成劑，例如貝伐單抗(Avastin®)；癌症疫苗，例如Sipuleucel-T (Provenge®)。

另外的化療藥物可選自：13-順式-視黃酸、2-氯脫氧腺苷、5-阿扎胞苷、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、紫杉醇白蛋白微粒(Abraxane)、Accutane®、放射菌素-D (Actinomycin-D)、Adriamycin®、Adrucil®、Afinitor®、Agrylin®、Ala-Cort®、普留淨(Aldesleukin)、阿崙單抗、ALIMTA、阿利維甲酸(Alitretinoin)、Alkaban-AQ®、Alkeran®、全反式視黃酸、α干擾素、六甲蜜胺(Altretamine)、氨甲蝶呤(Amethopterin)、氨磷汀(Amifostine)、氨魯米特(Aminoglutethimide)、阿那格雷(Anagrelide)、Anandron®、阿那曲唑(Anastrozole)、阿拉伯糖基胞嘧啶、Aranesp®、Aredia®、Arimidex®、Aromasin®、Arranon®、三氧化二砷、(Asparaginase)、ATRA Avastin®、阿扎胞苷、BCG、BCNU、苯達莫司汀(Bendamustine)、貝伐單抗、蓓薩羅丁(Bexarotene)、BEXXAR®、比卡魯胺(Bicalutamide)、BiCNU、Blenoxane®、博來黴素、硼替佐米(Bortezomib)、白消安(Busulfan)、Busulfex®、亞葉酸鈣(Calcium Leucovorin)、Campath®、Camptosar®、喜樹鹼-11 (Camptothecin-11)、卡培他濱(Capecitabine)、Carac™、卡鉑、卡莫司汀(Carmustine)、Casodex®、CC-5013、CCI-779、CCNU、CDDP、CeeNU、Cerubidine®、西妥昔單抗、苯丁酸氮芥、順鉑、嗜橙乳酸菌因子(Citrovorum Factor)、克拉屈濱(Cladribine)、可的松(Cortisone)、Cosmegen®、CPT-11、癌德星(Cyclophosphamide)、Cytadren®、Cytarabine Cytosar-U®、Cytoxan®、達克金(Dacogen)、更生黴素(Dactinomycin)、達貝泊汀(Darbepoetin Alfa)、(Dasatinib)、道諾黴素(Daunomycin)、柔紅黴素(Daunorubicin)、柔紅黴素氫氯酸鹽(Daunorubicin Hydrochloride)、柔紅黴素脂質體(Daunorubicin Liposomal)、DaunoXome®、塞米松(Decadron)、地西他濱(Decitabine)、Delta-Cortef®、Deltasone®、地尼白介素(Denileukin Diftitox)、DepoCyt™、地塞米松(Dexamethasone)、地塞米松乙酸鹽、地塞米松磷酸鈉、地塞松(Dexasone)、右丙亞胺(Dexrazoxane)、DHAD、DIC、戴爾克斯(Diodex)、多西他賽(Docetaxel)、Doxil®、多柔比星(Doxorubicin)、多柔比星脂質體、Droxia™、DTIC、DTIC-Dome®、Duralone®、Eligard™、Ellence™、Eloxatin™、Elspar®、Emcyt®、表柔比星(Epirubicin)、宜保利(Epoetin Alfa)、愛必妥(Erbitux)、埃羅替尼(Erlotinib)、歐文氏菌L-天冬醯胺酶(Erwinia L-asparaginase)、雌莫司汀(Estramustine)、Ethyol Etopophos®、依托泊苷、依托泊苷磷酸鹽、Eulexin®、依維莫司(Everolimus)、Evista®、依西美坦(Exemestane)、Faslodex®、Femara®、非格司亭(Filgrastim)、氟尿苷(Floxuridine)、Fludara®、氟達拉濱(Fludarabine)、Fluoroplex®、氟尿嘧啶、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟他胺(Flutamide)、亞葉酸(Folinic Acid)、FUDR®、氟維司群(Fulvestrant)、吉非替尼(Gefitinib)、吉西他濱(Gemcitabine)、吉姆單抗奧佐米星(Gemtuzumab ozogamicin)、Gleevec™、Gliadel®晶片、戈舍瑞林(Goserelin)、顆粒球- 群落刺激因子、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子、Herceptin ®、海塞(Hexadrol)、Hexalen®、六甲基三聚氰胺、HMM、Hycamtin®、Hydrea®、Hydrocort Acetate®、氫化可的松(Hydrocortisone)、氫化可的松磷酸鈉、氫化可的松琥珀酸鈉、氫化可的松磷酸鹽、羥基脲、替伊莫單抗(Ibritumomab)、澤娃靈(Ibritumomab Tiuxetan)、Idamycin®、伊達比星(Idarubicin)、Ifex®、IFN-α、異環磷醯胺(Ifosfamide)、IL-11、IL-2、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)、咪唑羧醯胺(Imidazole Carboxamide)、干擾素α、干擾素α-2b (PEG共軛物)、白細胞介素-2、白細胞介素-11、Intron A® (干擾素α-2b)、Iressa®、伊立替康(Irinotecan)、異維A酸(Isotretinoin)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、Ixempra™、克崔酶(Kidrolase)、Lanacort®、拉帕替尼(Lapatinib)、L-天冬醯胺、LCR、來那度胺(Lenalidomide)、來曲唑(Letrozole)、若克瘤(Leucovorin)、瘤可寧(Leukeran)、Leukine™、亮丙瑞林(Leuprolide)、長春新鹼、Leustatin™、脂質體Ara-C、Liquid Pred®、洛莫司汀(Lomustine)、L-PAM、L-溶肉瘤素(L-Sarcolysin)、Lupron®、Lupron Depot®、Matulane®、目滴舒(Maxidex)、甲基二(氯乙基)胺、甲基二(氯乙基)胺氫氯酸鹽、Medralone®、Medrol®、Megace®、麥格斯(Megestrol)、麥格斯乙酸鹽、美法崙(Melphalan)、巰基嘌呤、優路保(Mesna)、Mesnex™、甲氨蝶呤、甲氨蝶呤鈉、甲潑尼龍(Methylprednisolone)、Meticorten®、絲裂黴素(Mitomycin)、絲裂黴素-C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、M-Prednisol®、MTC、MTX、Mustargen®、氮芥(Mustine)、Mutamycin®、Myleran®、Mylocel™、Mylotarg®、Navelbine®、奈拉濱(Nelarabine)、Neosar®、Neulasta™、Neumega®、Neupogen®、Nexavar®、Nilandron®、尼魯米特(Nilutamide)、Nipent®、甲氮芥(Nitrogen Mustard)、Novaldex®、Novantrone®、奧曲肽(Octreotide)、奧曲肽乙酸鹽(Octreotide acetate)、Oncospar®、Oncovin®、Ontak®、Onxal™、Oprevelkin、Orapred®、Orasone®、Oxaliplatin、紫杉醇、紫杉醇蛋白結合型、帕米膦酸(Pamidronate)、帕尼單抗(Panitumumab)、Panretin®、Paraplatin®、Pediapred®、PEG干擾素、培門冬酶(Pegaspargase)、培非司亭(Pegfilgrastim)、PEG-INTRON™、PEG-L-門冬醯胺酶、PEMETREXED、噴司他丁(Pentostatin)、苯丙氨酸芥子氣、Platinol®、Platinol-AQ®、潑尼松龍(Prednisolone)、潑尼松(Prednisone)、Prelone®、丙卡巴肼(Procarbazine)、PROCRIT®、Proleukin®、帶有卡莫司汀植入劑Purinethol®的Prolifeprospan 20、雷洛昔芬(Raloxifene)、Revlimid®、Rheumatrex®、Rituxan®、利妥昔單抗(Rituximab)、Roferon-A® (干擾素α-2a)、Rubex®、銣黴素氫氯酸鹽(Rubidomycin hydrochloride)、Sandostatin®、Sandostatin LAR®、沙格司亭(Sargramostim)、Solu-Cortef®、Solu-Medrol®、索拉非尼(Sorafenib)、SPRYCEL™、STI-571、鏈脲佐菌素(Streptozocin)、SU11248、舒尼替尼(Sunitinib)、Sutent®、他莫昔芬(Tamoxifen)、Tarceva®、Targretin®、Taxol®、Taxotere®、Temodar®、替莫唑胺(Temozolomide)、替西羅莫司(Temsirolimus)、替尼泊苷(Teniposide)、TESPA、沙利度胺(Thalidomide)、Thalomid®、TheraCys®、硫代鳥嘌呤、Thioguanine Tabloid®、塞替派(Thiophosphoamide)、Thioplex®、噻替哌(Thiotepa)、TICE®、Toposar®、托泊替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、Torisel®、托西莫單抗(Tositumomab)、曲妥珠單抗、Treanda®、維甲酸(Tretinoin)、Trexall™、Trisenox®、TSPA、TYKERB®、VCR、Vectibix™、Velban®、Velcade®、VePesid®、Vesanoid®、Viadur™、Vidaza®、長春鹼、長春鹼硫酸鹽、Vincasar Pfs®、長春新鹼、長春瑞濱、長春瑞濱酒石酸鹽、VLB、VM-26、伏立諾他(Vorinostat)、VP-16、Vumon®、Xeloda®、Zanosar®、Zevalin™、Zinecard®、Zoladex®、唑來膦酸(Zoledronic acid)、左林扎(Zolinza)、Zometa®。

可提供多重藥量的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物。該等藥量的一或多者或各者可伴隨同時或依序投予的另一個治療劑。

多個藥量可以預定的時間區間分開，其可選定為下列之一：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16 ，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、或31天、或1、2、3、4、5、或6個月。舉例而言，可以每7、14、21或28天(加或減3、2、或1天)給藥一次。過繼性轉移

在本發明的具體例中，治療或預防的方法可包括免疫細胞的過繼性轉移。

過繼性細胞轉移(ACT)一般是指從個體獲得細胞(譬如免疫細胞)，通常藉由從單離細胞汲取血液樣本的過程。該等細胞隨後通常以一些方式處理或改變，隨後投至相同的個體或不同的個體。該治療通常旨在向個體提供帶有某些所欲特徵的細胞群，或增加該個體中帶有此類特徵的細胞的頻率。

在本發明中，過繼性轉移可以將細胞或細胞群導入個體、及/或增加個體的細胞或細胞群的頻率為目的來進行。

T細胞的過繼性轉移係描述，舉例來說，於Kalos and June 2013, Immunity 39(1): 49-60，茲此將其以參照方式整體併入。NK細胞的過繼性轉移係描述，舉例來說，於Davis et al. 2015, Cancer J. 21(6): 486–491，茲此將其以參照方式整體併入。

該細胞可譬如為嗜中性球、嗜伊紅球、嗜鹼性球、樹突細胞、淋巴球、或單核球。淋巴球可為譬如T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞或先天淋巴細胞(ILC)、或其前體。在一些具體例中，該細胞為T細胞。在一些具體例中，該T細胞為CD3+T細胞。在一些具體例中，該T細胞為CD3+、CD8+T細胞。在一些具體例中，該T細胞為細胞毒性T細胞(譬如細胞毒性T淋巴球(CTL))。在一些具體例中，該T細胞為病毒特異性T細胞。在一些具體例中，該T細胞就EBV、HPV、HBV、HCV或HIV而言具特異性。

本發明提供了一種在個體治療或呈現疾病或病況的方法，該方法包含修飾從個體獲得的至少一個細胞，以表現或包含根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體，任擇地擴增該經修飾的至少一個細胞，以及將經修飾的至少一個細胞投予個體。

在一些具體例中，該方法包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)修飾該至少一個細胞，以表現或包含根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體， (c)任擇地擴增該經修飾的至少一個細胞，以及； (d)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。

在一些具體例中，細胞被單離的個體是被投予經修飾細胞的個體(即，過繼性轉移是自體細胞)。在一些具體例中，細胞被單離的個體是與被投予經修飾細胞的個體不同的個體(即，過繼性轉移是同種異體細胞)。

根據本發明修飾的該至少一個細胞可根據熟習此藝者眾所周知的方法修飾。該修飾可包含用於永久或瞬時表現所轉移的核酸的核酸轉移。

在一些具體例中，該細胞可額外地經修飾以包含或表現嵌合抗原受體(CAR)，或編碼CAR的核酸或載體。

根據本發明可使用任何適宜的遺傳工程平台來修飾細胞。用於修飾細胞的適宜方法包括使用遺傳工程平台，例如，γ反轉錄病毒載體、慢病毒載、腺病毒載體、DNA轉染、以轉位子為基礎的基因遞送和RNA轉染，舉例來說，說明於Maus et al., Annu Rev Immunol (2014) 32:189-225，將其藉由參照方式併入。

在一些具體例中，該方法可包含下列步驟中的一或多者：從個體採取血液樣本；從該血液樣本單離及/或擴增至少一個細胞；在體外或離體細胞培養物中培養該至少一個細胞；將根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體導入該至少一個細胞內，藉此修飾該至少一個細胞；擴增該至少一個經修飾的細胞；收集該至少一個經修飾的細胞；使該經修飾的細胞和佐劑、稀釋劑或載劑混合；將該經修飾的細胞投予個體。

在一些具體例中，該方法可額外地包含處理該細胞，以誘發/增強該TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體的表現。舉例來說，該核酸/載體可包含用於誘發上調來自該核酸/載體的TGF-β誘餌受體或CAR回應於特定劑處理的表現的調控元件。在一些具體例中，治療可藉由將該劑投予已經投予有根據本發明的經修飾細胞的個體而在體內。在一些具體例中，治療可藉由將該劑投予離體或體外培養的細胞而在離體或體外。

根據本發明，熟習此藝者能夠決定用於細胞過繼轉移的適當試劑和流程，舉例來說，藉由參照Dai et al., 2016 J Nat Cancer Inst 108(7): djv439，茲此將其以參照方式整體併入。

在一個相關態樣中，本發明提供了一種製備經修飾細胞的方法，該方法包含將根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體導入細胞中，由此修飾該至少一個細胞。該方法較佳在體外或離體進行。

在一態樣中，本發明提供了一種治療或預防個體的疾病或病況的方法，該方法包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)將根據本發明的該核酸或該載體導入該至少一個細胞中，藉此修飾該至少一個細胞；以及 (c)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。

在一些具體例中，該細胞可額外地被修飾，以導入編碼嵌合抗原受體(CAR)的核酸或載體。

在一些具體例中，該方法另外包含治療性或預防性干預，譬如用於治療或預防癌症。在一些具體例中，該治療性或預防性干預係選自化療、免疫療法、放療、手術、疫苗接種及/或激素療法。偵測方法

本案所述的TGF-β誘餌受體與CARs可用於涉及TGF-β誘餌受體或CAR結合至TGF-β (譬如TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3)的方法。此類方法可涉及偵測TGF-β誘餌受體或CAR與TGF-β的結合複合物。是以，在一個具體例中，提供了一種方法，該方法包含使含有─或疑似含有─TGF-β的樣本和本案所述的TGF-β誘餌受體或CAR接觸，以及偵測該TGF-β誘餌受體/CAR、和TGF-β的複合物的形成。

適宜的方法形式在本領域中是眾所周知的，包括免疫試驗，例如夾心式測定法，譬如ELISA。該方法可涉及以可偵測標記，譬如螢光、發光或放射性標記來標記該TGF-β誘餌受體/CAR、或TGF-β、或兩者。TGF-β表現可藉由，舉例來說，藉由活組織檢查獲得的組織樣本的免疫組織化學(IHC)來測量。在一些具體例中，該標記可選自：放射性核苷酸、正子發射放射性核素(譬如用於正子發射斷層攝影術(PET))、MRI造影劑或螢光標記。

由TGF-β介導的體外或體內分析的方法可涉及藉由正子發射斷層攝影術(PET)、磁共振成像(MRI)、或螢光成像，譬如藉由偵測經適當標記的物種的分析。

此種方法可提供診斷需要偵測及/或定量TGF-β的疾病或病況的方法的基礎。此類方法可在患者樣本上於體外進行，或者在處理患者樣本後進行。一旦收集了樣本，就不需要對患者進行體外診斷方法，因此該方法可為不在人體或動物身體上實行的方法。

此類方法可涉及測定存在於患者樣本中的TGF-β份量。作為達到診斷的過程的一部分，該方法可進一步包含將所測定的份量與標準或參考值做比對。其他診斷測試可連同本案所述的該等一起使用，以增強診斷或預後的準確性或者確認藉由使用本案所述的測試獲得的結果。

存在於患者樣本中的TGF-β位準可為患者可能對於根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物的治療有所回應的指標。樣本中存在高位準的TGF-β可用於選擇譬如以本案所述的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物進行如本案所述般治療的患者。本發明的TGF-β誘餌受體和CARs因此可用於選擇如本案所述般治療的患者。

TGF-β樣本的偵測可用於疾病或病況的診斷、疾病或病況的易患性、或用於提供疾病或病況的預後(觀測)的目的。診斷或預後可能關於既存的(先前診斷的)疾病/病況。

樣本可取自任何組織或體液。該樣本可包含或可衍生自：一定份量的血液；衍生自該個體血液的一定份量的血清，其可包含在除去纖維蛋白凝塊和血球細胞後獲得的血液的流體部分；組織樣本或活組織檢查；胸腔積液；腦脊液(CSF)；或從該個體單離的細胞。在一些具體例中，該樣本可從受到疾病/病況影響的組織或多個組織獲得或衍生(譬如出現疾病況狀、或涉及疾病/病況發病機制的組織或多個組織)。

根據本發明的方法可較佳在體外進行。術語「體外」係意圖涵蓋培養中細胞的實驗，而術語「體內」係意圖涵蓋完整的多細胞生物體的實驗及/或治療。套組

在本發明的一些態樣中，提供了一種套組部件。在一些具體例中，該套組可具有至少一個容器，其具有預定份量的根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞、或組成物。

該套組可提供該TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物連同用於投予患者以治療特定疾病/病況的說明書。該TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞或組成物可經配製，以適用於注射或輸注至腫瘤或血液。

在一些具體例中，該套組可包含用於製造根據本發明的細胞的材料。舉例來說，該套組可包含用於修飾細胞以表現或包含根據本發明的TGF-β誘餌受體、CAR、核酸或載體的材料或用於將根據本發明的核酸或載體導入細胞的材料。

在一些具體例中，該套組可進一步包含至少一個容器，其具有預定份量的另一個治療劑(譬如抗感染劑或化療劑)。在此類具體例中，該套組亦可包含第二藥劑或藥學組成物，俾使該兩個藥劑或藥學組成物可同時或分開投予，俾使彼等為特定疾病或病況提供合併治療。該治療劑亦可配製成適用於注射或輸注至腫瘤或至血液。蛋白質表現

適用於在細胞中製造根據本發明的蛋白質(譬如TGF-β誘餌受體與CARs)的分子生物學技術是本領域眾所周知的，例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989。多肽可從核酸序列表現。核酸序列可內含在存在於細胞中的載體內，或可併入該細胞的基因組內。

適用於表現多肽的任何細胞可用於製造根據本發明的蛋白質。該細胞可為原核生物或真核生物。適宜的原核細胞包括大腸桿菌。真核細胞的例子包括酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(譬如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)。在一些情況下，該細胞不是原核細胞，因為一些原核細胞不允許與真核生物相同的轉譯後修飾。此外，在真核生物中，極高的表現位準是可能的，並且使用適當的標籤可更容易地從真核生物純化蛋白質。亦可利用增強蛋白質分泌進入培養基的特定質體。

製造感興趣多肽的方法可涉及培養或發酵經修飾以表現該多肽的細胞。該培養或發酵可在提供有適當的養份供給、空氣/氧及/或生長因子的生物反應器中進行。分泌的蛋白質可藉由從細胞分配培養基/發酵液、萃取蛋白質含量、並分離個別蛋白質以單離分泌的多肽來收集。培養、發酵和分離技術為本領域技術人員所眾所周知。

生物反應器包括可培養細胞的一或多個容器。以反應物連續流入反應器並持續流入培養細胞，該生物反應器中的培養可連續進行。或者，該培養可分批發生。該生物反應器監測並控制環境條件，例如pH、氧、進出容器的流速、以及容器內的攪動，俾使為培養的細胞提供最佳條件。

在培養表現該感興趣多肽的細胞之後，該多肽係較佳被單離。可使用本領域已知用於從細胞培養物單離多肽的任何適宜的方法。為了從培養物單離感興趣多肽，可能有必要首先從含有該感興趣多肽的培養基中分離培養的細胞。假使該感興趣多肽係從細胞分泌出來，則可藉由離心從含有分泌多肽的培養基中分離該等細胞。假使該感興趣多肽係於細胞內，則將有必要在離心之前先擊碎細胞，舉例來說，使用超音波、快速凍融或滲透裂解。離心將產生含有該培養細胞、或培養細胞的細胞碎片的沉澱丸粒，以及含有培養基和該感興趣多肽的上清液。

隨後所欲的是從可能含有其他蛋白質和非蛋白質組分的上清液或培養基單離該感興趣多肽。從上清液或培養基分離多肽組分的常用方法是沉澱。不同溶解度的多肽/蛋白質係於不同濃度的沉澱劑，例如硫酸銨中沉澱。舉例來說，在低濃度的沉澱劑中，水溶性蛋白質被萃出。於是，藉由添加增加濃度的沉澱劑，可區分不同溶解度的蛋白質。隨後可使用透析從分離的蛋白質中除去硫酸銨。

用於區分不同多肽/蛋白質的其他方法在本領域是已知的，舉例來說，離子交換層析和尺寸層析。該等可用作沉澱的替代項目，或者可在沉澱後進行。

一旦將感興趣多肽從培養物中單離出來，可能有必要濃縮蛋白質。本領域已知用於濃縮感興趣的蛋白質的眾多方法，例如超濾或冷凍乾燥。序列一致性

為了測定兩個或更多個胺基酸或核酸序列之間的百分比一致性，成對和多重序列比對可以本領域技術人員已知的各種方式實現，舉例而言，使用公眾可取得的電腦軟體，例如ClustalOmega (Söding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960)、T-coffee (Notredame et al. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217)、Kalign (Lassmann and Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298))與MAFFT (Katoh and Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772–780軟體。當使用此類軟體時，較佳使用譬如用於空格扣分(gap penalty)和延長扣分(extension penalty)的預設參數。 ***

本發明包括所述態樣和較佳特徵的組合，除非此類組合明顯不被允許或明確地被避免。

本案使用的章節標題僅用於組織目的，而不應被解讀為限制所述標的。

現在將參照附圖舉例來例示本發明的態樣和具體例。進一步態樣和具體例對於熟習此藝者而言將是顯而易見的。本上下文所提及的全部文件皆藉由參照方式併入本案。

在通篇說明書中，包括隨後的專利申請範圍，除非上下文另有要求，否則用語「包含(comprise)」和諸如「包含(comprises)」和「包含(comprising)」的變化將被理解為暗示包括所述明的整數或步驟或一組整數或多個步驟，但不排除任何其他整數或步驟或一組整數或多個步驟。

必須注意，如說明書和隨附申請專利範圍所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」和「該(the)」包括複數個元件。範圍在本案中可表達成「約(about)」一個特定值、及/或「約」另一個特定值。當表達此類範圍時，另一具體例包括從一個特定值及/或到另一個特定值。類似地，當數值係以近似表達時，藉由使用先行詞「約」，應理解到的是，該特定值形成另一個具體例。

實施例

在下列實施例中，發明人說明了TGF-β結合誘餌受體分子的設計、及其功能表徵。實施例 1 ： TGF-β 誘餌受體設計

使用慢病毒載體來製備編碼TGF-β的第II型受體的TGF-β結合域和不同細胞膜錨定物區的TGF-β誘餌受體構築體。

TGF-β的第II型受體的胞外域的cDNA係和編碼用於CD48、CD44、CD55、CD90或胎盤型鹼性磷酸酶的cDNA(構築體所編碼的胺基酸序列係顯示於圖1)的多醣磷脂肌醇(GPI)錨定物序列的cDNA一起選殖在框內。實施例 2 ：表現 TGF-β 誘餌受體的人類 T 淋巴球的生成

就慢病毒的轉導而言，將5x10⁶ 個HEK 293T細胞鋪在預先塗有0.002%聚-L-賴胺酸(Sigma, St. Louis MO)的10 cm² 皿上。將慢病毒載體與編碼包裝與套膜蛋白基因的質體共同轉染，共同轉染數日後，收集含病毒的上清液並通過0.45 µm過濾器。隨後藉由 25,000 rpm超速離心濃縮上清液，滴定，隨後儲存在-80°C直至使用。

獲得從健康供給者單離的原代人類T淋巴球。T細胞係培養於完全培養基(RPMI 1640，補充有10%失活FBS、青黴素與鏈黴素硫酸鹽)，並藉由以包覆有抗-CD3與抗-CD28mAb-珠粒(Invitrogen)刺激而活化。活化12小時後，在聚凝胺的存在下用慢病毒載體轉導T細胞。藉由每隔一天添加IL-2，擴增並維持人類T淋巴球。實施例 3 ：表現該 TGF-β 誘餌受體的 T 細胞的功能表徵 3.1 表面表現

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞的誘餌受體的表面表現。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導，並使用能夠特異性結合至TGF-βR2胞外域的抗體，藉由流式細胞術分析來分析細胞表面的表現。

相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞係展示針對抗-TGF-βR2抗體的更多的表面染色。 3.2 可溶性表現

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞的誘餌受體的可溶性表現。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導，並使用能夠特異性結合至TGF-βR2胞外域的抗體，藉由細胞培養物上清液的ELISA來測量受體的可溶性表現。

相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞係分泌更加可溶的受體。 3.3 TGF-β介導的信號傳導

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞回應TGF-β刺激的能力。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後以TGF-β處理刺激細胞，並分析TGF-β介導的信號傳導的位準。

相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞係展示較少的TGF-β介導的信號傳導。 3.4 增生/擴增

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞的體外增生能力。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後以TGF-β處理刺激細胞，並分析細胞的增生。

相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞增生得更多。 3.5 存活

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞的持久性/存活能力。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後以TGF-β處理刺激細胞，並隨著時間監控細胞數目。

發現到相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞具有提高的存活率。 3.6 毒性

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞的體外細胞毒性。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後以TGF-β處理刺激細胞，並分析針對表現就T細胞而言為特異性的抗原的細胞的細胞毒性。亦分析該等細胞的細胞毒性/效應物的基因或蛋白質表現。

相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞係展示出改善的細胞毒性和增加的細胞毒性/效應物因子的表現。 3.7 在體外殺死腫瘤細胞的能力

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞在體外殺死腫瘤細胞的能力。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後分析該經修飾的細胞在體外裂解腫瘤細胞的能力。

發現到相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞更快地殺死腫瘤細胞。此即使在正規化效應物細胞：腫瘤細胞比例之後亦觀察得到。 3.8 體內治療癌症

分析經修飾以表現TGF-β誘餌受體的T細胞在小鼠模型體內治療癌症的能力。

簡言之，T細胞係以編碼根據本發明的TGF-β誘餌受體的構築體、陰性對照組、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導。隨後將該經修飾的細胞投予具有確立癌症模型的小鼠，並監控癌症進展和存活。

發現到相較於以陰性對照組構築體、或編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的T細胞，以編碼本揭示內容的TGF-β誘餌受體的構築體轉導的T細胞具有改善的存活率或降低的疾病進展嚴重性。實施例 4 ：表徵 TGF-β 誘餌受體 下文提供了下列實施例中所表徵的TGF-β誘餌受體分子的概述：

使用慢病毒載體pD2109-EFs: EF1a-ORF, Lenti-ElecD (ATUM, Newark, CA, USA)製備編碼該TGF-β誘餌受體的構築體，以及編碼GFP的對照組構築體。實施例 5 ：製備活化的 T 細胞 (ATCs)

藉由從不同供給者獲得的血液樣本的Ficoll梯度來純化PBMCs。然後使用CD3磁珠(Miltenyi)從PBMCs正向地選擇CD3+ T細胞。

隨後刺激T細胞。簡言之，將1x10⁶ 個T細胞種在含有IL-2 (40 U/ml)與CD3/CD28 Dynabeads (Gibco)的1 ml CTL培養基(50% RPMI，50% CLICK培養基，10% FBS)，達24至72小時，以獲得活化的T細胞(ATCs)。實施例 6 ：慢病毒的製造和標靶細胞的轉導 6.1 慢病毒的製造

將1.2-2.4 x 10⁶ 個293T細胞鋪在補充有10% FBS與抗生素的10 ml DMEM培養基的10 cm² 細胞培養皿中。

隔天，製備DNA混合物，其包含3 μg慢病毒載體構築體DNA、1.5 μg套膜蛋白質體pMD2.G、1.5 μg包裝質體pRSV-REV與1.5 μg包裝質體pMDLg/pRRE。製備18 μl Fugene 6 (Roche)與270 μl無FBS的DMEM或Opti-MEM的分開混合物，藉由渦旋混合10秒，離心並在室溫培育5 min。隨後將DNA與Fugene混合物合併，藉由渦旋混合10秒，離心並在室溫培育15-45 min。隨後將混合物加至293T細胞的培養物中。

隔天，將細胞培養基從培養中的細胞移出，並將8-10 ml新鮮細胞培養基加至該等細胞。根據欲以病毒轉導的細胞類型選擇新鮮細胞培養基。舉例來說，在將病毒用於轉導T細胞時，使用RPMI-1640培養基。

隔天，收集含有慢病毒的細胞培養基並儲存在4°C，將8-10 ml新鮮細胞培養基加至該細胞。第二天，再次收集含有慢病毒的細胞培養基並和前一天所收集的含有慢病毒的細胞培養基合併。隨後使用0.45 μm硝化纖維素膜過濾該混合物，並加入聚凝胺至5-8 μg/ml的最終濃度。隨後將該含有慢病毒的細胞培養基立即用於轉導，或儲存在-80°C。

在一些情況下，使用Amicon Ultra-100管(Millipore)將含有慢病毒的培養基濃縮10-20倍。簡言之，將管藉由UV光處理1h或過夜來滅菌，將含有慢病毒的培養基加至該等管並於2,500-3,500rpm離心10-30 min。 6.2 標靶細胞的轉導

簡言之，採收培養物中的標靶細胞並將0.25-1 x 10⁶ 個細胞再次懸浮於0.5-1 ml含有慢病毒的細胞培養基中(參見實施例6.1)。隨後將混合物移至24孔或12孔盤，並在30-35°C於2,500 rpm離心1.5小時(稱作「離心轉染(spinfection)」。隨後使該細胞在培育箱(5% CO₂ ，37°C)培育過夜。隔天採收細胞並再次懸浮於5-10 ml新鮮細胞培養基。在一些情況下，轉導36-48小時後，將嘌呤黴素(puromycin)加至培養中的細胞，以選擇轉導體。

如下轉導活化的T細胞(ACTs)。將2.5 x 10⁵ 個ATCs再次懸浮於含有8 μg/ml聚凝胺的500 μl濃縮病毒上清液(10x濃縮，MOI高達7000)，種在24孔盤並於800g、32°C離心90 min。在離心轉染後，使該細胞在37°C，5% CO2培育長達24 hrs，然後將上清液置換成含有IL-2與CD3/CD28 Dynabeads的CTL培養基(參見實施例5)。

就Hela細胞轉導而言，將4 x 10⁵ 個HeLa細胞再次懸浮於含有8 μg/ml聚凝胺的1 ml濃縮病毒上清液(10x濃縮，MOI高達7000)，種在24孔盤並於800g、32°C離心90 min。實施例 7 ：分析 TGF-β 誘餌受體在細胞表面的表現 7.1 以編碼TGF-β誘餌受體的構築體轉染的HeLa細胞的表現

發明人調查了用不同構築體轉染的HeLa細胞上的TGF-β誘餌受體的表面表現。

簡言之，HeLa細胞係以編碼TGF-β誘餌受體的構築體、作為轉染對照組編碼GFP的構築體、或根據製造商的說明書使用脂轉染胺(Lipofectamine)的編碼DN-TGF-βR2的構築體轉染。

轉染72小時後，使用結合至TGF-βR2胞外域的抗-人類TGF-β RII抗體選殖體REA903 (#130-115, Miltenyi)藉由流式細胞術分析細胞的細胞表面受體的表現。分析轉染對照組的GFP表現。

該等結果顯示在圖3A至3H。轉染後72小時在HeLa細胞表面上偵測到TGF-β誘餌受體的高度表現(~60-70%細胞的受體表現為陽性)。 7.2 以編碼TGF-β誘餌受體的構築體轉導的活化T細胞(ATCs)的表現

發明人接著調查了以不同慢病毒構築體轉導的ATCs上的TGF-β誘餌受體的表面表現，或在未轉導的細胞上的表現。

轉導72小時後(參見實施例6.2)，使用抗-人類TGF-β RII抗體選殖體REA903藉由流式細胞術分析細胞的細胞表面受體的表現。分析對照條件的GFP表現。

該等結果顯示在圖4A至4H。發現到以編碼CD48、CD55與CD90 GPI錨定物序列的TGF-β誘餌受體轉導的ATCs在細胞表面展示最高位準的TGF-β誘餌受體表現。該等誘餌受體的表現係高於以編碼DN-TGF-βR2的構築體轉導的細胞偵測到的表現位準(圖4A)。

發明人接著調查，如實施例6.2所述，藉由衍生自三個不同供給者的轉導ATCs而具有CD48或CD90 GPI錨定物序列的TGF-β誘餌受體在轉導72小時後的表現。

圖5A顯示在轉導的細胞培養物中的白血球的百分比。圖5B顯示在轉導的細胞培養物中的GFP+細胞的百分比。圖5C顯示在轉導的細胞培養物中的TGF-β RII+細胞的百分比。

圖6A顯示CD3+細胞佔白血球總數的比例的百分比，圖6B顯示GFP+CD3+細胞佔白血球總數的比例的百分比。

圖7A顯示CD4+、GFP+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比。圖7B顯示CD8+、GFP+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比。圖7C顯示CD4+、TGF-β RII+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比。圖7D顯示CD8+、TGF-β RII+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比。

在以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒轉導的細胞中偵測到高比例的表現TGF-β RII的細胞(參見圖5C、7C與7D)。實施例 8 ：分析表現 TGF-β 誘餌受體的細胞中 TGF-β 介導的信號傳導的抑制

發明人接著調查，回應於以TGF-β刺激而在表現TGF-β誘餌受體的細胞中激活的下游信號傳導。

以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒、或編碼GFP的構築體轉導細胞(參見實施例6.2)。

轉導細胞72小時後，將嘌呤黴素以2 μg/ml的最終濃度加至該細胞培養物，以選擇轉導的細胞。

在嘌呤黴素的存在下培養7天後，將細胞再次懸浮於新鮮細胞培養基並培養24小時，然後以不同濃度的TGF-β處理刺激。在37°C，5% CO₂ 刺激細胞30 min。隨後採收細胞並藉由流式細胞術(參見實施例8.1)與西方墨點法(參見實施例8.2)分析胞內信號傳導蛋白的磷酸化。用於流式細胞術或西方墨點法分析的樣本製備係於冰上進行。 8.1 Phosflow分析下列抗體係用於流式細胞術分析：

將100 μl已刺激的細胞(~200,000個細胞)移至96孔盤。隨後使細胞於3000 rpm、4°C離心30秒，將細胞沉澱丸粒再次懸浮於30 μL 1:200活/死染料中，並使細胞於室溫培育30秒。隨後添加100 μL染色緩衝液洗滌細胞並於3000 rpm、4°C離心30秒。隨後將細胞沉澱丸粒再次懸浮於細胞培養基混合物與預熱至37°C的BD phosflow緩衝液I (50 μl per well)的1:1混合物中，並於37°C培育10 min。細胞隨後藉由在1500 rpm離心5 min來採收，並用150 μL染色緩衝液洗滌兩次。隨後將細胞沉澱丸粒再次懸浮於50 μL Perm緩衝液III，並使細胞在冰上培育30 min。細胞隨後藉由在1500 rpm離心5 min來採收，並用150 μL染色緩衝液洗滌兩次。隨後將細胞沉澱丸粒再次懸浮於25 μL抗體組合並於室溫在黑暗中培育1小時。細胞隨後藉由在1500 rpm離心5 min來採收，並用150 μL染色緩衝液洗滌兩次。最後，將細胞沉澱丸粒再次懸浮於150 μL染色緩衝液，並藉由流式細胞術分析細胞。

圖8A至8E顯示未轉導的HeLa細胞(wt)、以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的HeLa細胞或以編碼GFP (GFP)的慢病毒轉導的HeLa細胞在以不同濃度的TGF-β刺激之後的信號傳導的分析結果。藉由磷酸化信號傳導蛋白(SMADs)陽性染色的細胞百分比減少、以及CREB轉錄因子的陽性染色的細胞百分比減少所證實的，以TGF-βRII-CD90 GPI錨定物轉導的細胞係顯示回應於TGF-β刺激的較少的TGF-β介導的信號傳導活化。

圖9與10顯示未轉導的ATCs (wt)、以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的ATCs、以編碼TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(CD48)的慢病毒轉導的,ATCs、以編碼DN-TGF-βR2 (DN)的慢病毒轉導的ATCs或以編碼GFP (GFP)的慢病毒轉導的ATCs在以不同濃度的TGF-β刺激之後的信號傳導的分析結果。圖9A至9C顯示在CD3+細胞群內對於不同標記物呈染色陽性的CD8+細胞的百分比，圖10A至10C顯示在CD3+細胞群內對於不同標記物呈染色陽性的CD4+細胞的百分比。

相較於以編碼DN-TGF-βR2的慢病毒轉導的細胞，以具有GPI錨定物序列的TGF-β誘餌受體轉導的細胞係展示回應於以TGF-β刺激的類似或減少之TGF-β介導的信號傳導位準。 8.2 西方墨點法

將已刺激的細胞再次懸浮於冰冷的PBS中，藉由在4℃下離心沉澱並在冰冷的PBS中洗滌兩次。隨後將細胞沉澱丸粒再次懸浮於含有磷酸酶/蛋白酶抑制劑組合(1:100，ThermoFisher, #78440)的冰冷RIPA裂解緩衝液，並在冰上培育30 min加上偶爾渦旋。隨後使用BCA蛋白質試驗套組(Pierce)測量蛋白質濃度，並將樣本之間的濃度正規化。隨後將含有10% MeEtOH的4x Laemmli緩衝液加至該等樣本，並於95°C煮沸10 min。隨後將樣本置於冰上冷卻，隨後投至SDS-PAGE。

使硝酸纖維素膜在5%牛奶溶液中固定2小時，然後與1:1000稀釋度的一級抗體(a-Smad2/3 Antibody, Cell Signaling, #5678)培育12 hrs。隨後將膜在TBS-T溶液中洗滌3次，之後與1:10 000稀釋度的二級抗兔-HRP-抗體培育。隨後將膜在TBS-T溶液中洗滌3次並使用增強型化學發光(ECL, Biorad)發展。使用Chemidoc MP成像系統(Bio-Rad)來顯現色帶。

圖11顯示藉由抗-CD3/CD28刺激活化並以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒轉導的原代人類T細胞、或未轉導的細胞在以TGF-β刺激之後偵測到的磷酸化SMAD2/3。

圖12顯示以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒、編碼GFP的慢病毒轉導的HeLa細胞、或未轉導的細胞在以TGF-β刺激之後偵測到的磷酸化SMAD2/3。

在編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒轉導的細胞偵測到磷酸化SMAD2/3的位準降低了。 8.3 螢光顯微鏡

以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物、DN-TGF-βR2 (參見實施例6.2)的慢病毒轉導HeLa細胞、或未轉導(WT)。隨後將該等細胞鋪在384孔盤的孔中並在逆時程實驗中用1 ng TGF-β刺激。

藉由螢光顯微鏡分析p38和SMAD2的磷酸化和亞細胞定位。已顯示以TGF-β刺激的白血球中的p38的磷酸化減少了，導致免疫功能降低。已顯示SMAD2磷酸化是TGF-β信號傳導的直接效應物並造成免疫功能下降。

實驗結果係顯示於圖13A與13B。發現到以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物的慢病毒轉導的細胞─回應於TGF-β的刺激─係展示定位於細胞核的磷酸化p38的最高位準，以及定位於細胞核的磷酸化SMAD2的最低位準。此指出表現TGF-βRII-CD90誘餌受體的細胞對TGF-β刺激的回應最小。

相較於以編碼DN-TGF-βR2的慢病毒轉導的細胞，以編碼TGF-βRII-CD48 GPI錨定物的慢病毒轉導的細胞係展示與以TGF-β刺激後位於細胞核的磷酸化p38和磷酸化SMAD2的類似位準。

現在將參照附圖討論例示本發明的原理的實施例和實驗，其中：

圖 1. 本發明的TGF-β誘餌受體構築體所編碼的胺基酸序列。

圖 2. 本發明的成熟TGF-β誘餌受體的示意圖。

圖 3A 至 3H. 顯示使用抗-人類TGF-β RII抗體選殖體REA903藉由流式細胞術偵測經轉導的HeLa細胞表面上的TGF-β誘餌受體表現的散佈圖。3A 至3E 顯示以編碼DN-TGF-βR2 (3A )、TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI錨定物(3B )、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(3C )、TGF-βRII-CD55 GPI錨定物(3D )或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(3E )的載體轉染之後，在細胞表面表現TGF-βR2胞外域的細胞的百分比。3F 與3G 顯示用抗-人類TGF-β RII抗體染色(3F )或未染色(3G )，在野生型、未轉導的HeLa細胞的細胞表面表現TGF-βR2胞外域的細胞的百分比。3H 顯示在以編碼GFP的載體轉染之後，表現GFP的細胞的百分比。

圖 4. 顯示使用抗-人類TGF-β RII抗體選殖體REA903藉由流式細胞術偵測經轉導的活化T細胞表面上的TGF-β誘餌受體表現的散佈圖。4A 至4E 顯示以編碼DN-TGF-βR2 (4A )、TGF-βRII-PLAC ALKPHOS GPI錨定物(4B )、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(4C )、TGF-βRII-CD55 GPI錨定物(4D )或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(4E )的慢病毒轉導之後，在細胞表面表現TGF-βR2胞外域的細胞的百分比。4F 顯示用抗-人類TGF-β RII抗體染色，在野生型、未轉導的活化T細胞的細胞表面表現TGF-βR2胞外域的細胞的百分比。4G 與4H 顯示以編碼GFP的慢病毒轉導之後，表現GFP的細胞的百分比，用抗-人類TGF-β RII抗體染色(4G )或未染色(4H )的活化T細胞的百分比。

圖 5A 至5C. 在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞，藉由流式細胞術測定表現不同蛋白質的白血球的百分比。5A 顯示白血球總數，5B 顯示GFP+細胞的百分比，以及5C 顯示在細胞表面表現TGF-βR2胞外域的細胞的百分比。

圖 6A 與6B. 顯示在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)、DN-TGF-βR2 (DN)、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞，藉由流式細胞術測定表現不同蛋白質的CD3+T細胞佔總白血球群的百分比的圖表。5A 顯示CD3+ T細胞的百分比且6B 顯示GFP+ CD3+ T細胞的百分比。

圖 7A 至7D. 顯示在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞，藉由流式細胞術測定表現不同蛋白質的CD4與CD8 T細胞子集佔CD3+細胞群的比例的百分比的圖表。7A 顯示CD4+、GFP+細胞的百分比，7B 顯示CD8+、GFP+細胞的百分比，7C 顯示在細胞表面表現TGF-βR2胞外域的CD4+細胞的百分比，以及7D 顯示顯示在細胞表面表現TGF-βR2胞外域的CD8+細胞的百分比。

圖 8A 至8E. 顯示在未轉導的HeLa細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的HeLa 細胞在以指定濃度的TGF-β刺激30 min之後，藉由流式細胞術測定表現不同蛋白質的HeLa細胞佔總細胞群的比例的百分比的圖表。8A 顯示對磷酸化SMAD2/3呈染色陽性的細胞的百分比，8B 顯示對磷酸化SMAD1/5/9呈染色陽性的細胞的百分比，8C 顯示對NFκB p65呈染色陽性的細胞的百分比，8D 顯示對磷酸化MAPKK呈染色陽性的細胞的百分比，以及8E 顯示對CREB呈染色陽性的細胞的百分比。

圖 9A 至9C. 顯示在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)、DN-TGF-βR2 (DN)、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞在以指定濃度的TGF-β刺激30 min之後，藉由流式細胞術測定的表現不同蛋白質的CD8+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比的圖表。9A 顯示對CD8與磷酸化SMAD2/3呈染色陽性的CD3+細胞的百分比，9B 顯示對CD8與NFκB p65呈染色陽性的CD3+細胞的百分比，以及9C 顯示對CD8與CREB呈染色陽性的CD3+細胞的百分比。

圖 10A 至10C. 顯示在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)、DN-TGF-βR2 (DN)、TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(CD48)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞在以指定濃度的TGF-β刺激30 min之後，藉由流式細胞術測定的表現不同蛋白質的CD4+細胞佔CD3+細胞群的比例的百分比的圖表。10A 顯示對CD4與磷酸化SMAD2/3呈染色陽性的CD3+細胞的百分比，10B 顯示對CD4與NFκB p65呈染色陽性的CD3+細胞的百分比，以及10C 顯示對CD4與CREB呈染色陽性的CD3+細胞的百分比。

圖 11. 顯示在未轉導的活化T細胞(wt)、或以編碼TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的活化T細胞在以指定濃度的TGF-β刺激30 min之後的磷酸化SMAD2/3位準的西方墨點分析結果的影像。顯示了加載對照組。

圖 12. 顯示在未轉導的HeLa細胞(wt)、或以編碼GFP (GFP)或TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(CD90)的慢病毒轉導的HeLa細胞在以指定濃度的TGF-β刺激30 min之後的磷酸化SMAD2/3位準的西方墨點分析結果的影像。顯示了加載對照組。

圖 13A 與 13B. 顯示藉由螢光顯微鏡分析未轉導的HeLa細胞(WT)、和以編碼TGF-βRII-CD48 GPI錨定物(48)、TGF-βRII-CD90 GPI錨定物(90)、或DN-TGF-βR2 (DN)的慢病毒轉導的HeLa細胞，在以TGF-β刺激之後，定位於細胞核的(13A )磷酸化p38與(13B )磷酸化SMAD2的位準的結果的圖表。

序列表<110> 泰莎治療私人有限公司 <120> 轉形生長因子β(TGF-β)誘餌受體<130> RIC/FP7334154<150> US 62/450,468<151> 2017-01-25<160> 23 <170> PatentIn 3.5版<210> 1<211> 503<212> PRT<213> 智人TGF-βR1<400> 1Met Glu Ala Ala Val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30 Ala Leu Gln Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 Val Thr Asp Gly Leu Cys Phe Val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60 Val Ile His Asn Ser Met Cys Ile Ala Glu Ile Asp Leu Ile Pro Arg 65 70 75 80 Asp Arg Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser Ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95 Thr Thr Tyr Cys Cys Asn Gln Asp His Cys Asn Lys Ile Glu Leu Pro 100 105 110 Thr Thr Val Lys Ser Ser Pro Gly Leu Gly Pro Val Glu Leu Ala Ala 115 120 125 Val Ile Ala Gly Pro Val Cys Phe Val Cys Ile Ser Leu Met Leu Met 130 135 140 Val Tyr Ile Cys His Asn Arg Thr Val Ile His His Arg Val Pro Asn 145 150 155 160 Glu Glu Asp Pro Ser Leu Asp Arg Pro Phe Ile Ser Glu Gly Thr Thr 165 170 175 Leu Lys Asp Leu Ile Tyr Asp Met Thr Thr Ser Gly Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Leu Pro Leu Leu Val Gln Arg Thr Ile Ala Arg Thr Ile Val Leu Gln 195 200 205 Glu Ser Ile Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg Gly Lys Trp 210 215 220 Arg Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg Glu Glu Arg 225 230 235 240 Ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu Ile Tyr Gln Thr Val Met Leu Arg His 245 250 255 Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ala Asp Asn Lys Asp Asn Gly Thr 260 265 270 Trp Thr Gln Leu Trp Leu Val Ser Asp Tyr His Glu His Gly Ser Leu 275 280 285 Phe Asp Tyr Leu Asn Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly Met Ile Lys 290 295 300 Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His Met Glu Ile 305 310 315 320 Val Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp Leu Lys Ser 325 330 335 Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys Cys Ile Ala Asp Leu 340 345 350 Gly Leu Ala Val Arg His Asp Ser Ala Thr Asp Thr Ile Asp Ile Ala 355 360 365 Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu Val Leu 370 375 380 Asp Asp Ser Ile Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys Arg Ala Asp 385 390 395 400 Ile Tyr Ala Met Gly Leu Val Phe Trp Glu Ile Ala Arg Arg Cys Ser 405 410 415 Ile Gly Gly Ile His Glu Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Tyr Asp Leu Val 420 425 430 Pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val Val Cys Glu Gln 435 440 445 Lys Leu Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Gln Ser Cys Glu Ala Leu 450 455 460 Arg Val Met Ala Lys Ile Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala Asn Gly Ala 465 470 475 480 Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Ser Gln Leu Ser 485 490 495 Gln Gln Glu Gly Ile Lys Met 500 <210> 2<211> 592<212> PRT<213> 智人TGF-βR2<400> 2Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser 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Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser 180 185 190 Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr 210 215 220 <210> 7<211> 225<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECD-PLAC ALKPHOS GPI<400> 7Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 85 90 95 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 115 120 125 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 130 135 140 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 145 150 155 160 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala 180 185 190 Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly Pro Ser Val Val Pro Ala Leu 195 200 205 Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Thr Ala 210 215 220 Pro 225 <210> 8<211> 226<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECD-CD90 GPI<400> 8Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 85 90 95 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 115 120 125 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 130 135 140 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 145 150 155 160 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu 180 185 190 Val Lys Cys Glu Gly Ile Ser Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu 195 200 205 Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met 210 215 220 Ser Leu 225 <210> 9<211> 183<212> PRT<213> 人工序列<220><223> 包含TGF-β結合區的TGF-βR2-衍生區<400> 9Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp 20 25 30 Val Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn 35 40 45 Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr 50 55 60 Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp 65 70 75 80 Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys 85 90 95 Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110 Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp 115 120 125 Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro 130 135 140 Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met 145 150 155 160 Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu 165 170 175 Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro 180 <210> 10<211> 161<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGF-βR2成熟序列<400> 10Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu 20 25 30 Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 50 55 60 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 65 70 75 80 Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 85 90 95 Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 100 105 110 Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 115 120 125 Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 130 135 140 Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 145 150 155 160 Pro <210> 11<211> 173<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECD CD48 GPI<400> 11Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu 20 25 30 Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 50 55 60 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 65 70 75 80 Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 85 90 95 Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 100 105 110 Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 115 120 125 Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 130 135 140 Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 145 150 155 160 Pro Asp Val Cys Ser Pro Pro Cys Thr Leu Ala Arg Ser 165 170 <210> 12<211> 174<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECD-CD55 GPI<400> 12Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu 20 25 30 Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 50 55 60 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 65 70 75 80 Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 85 90 95 Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 100 105 110 Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 115 120 125 Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 130 135 140 Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 145 150 155 160 Pro His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser 165 170 <210> 13<211> 174<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECD-PLAC ALKPHOS GPI<400> 13Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val Glu Met Glu Ala Gln 1 5 10 15 Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg Thr Ala His Pro Leu 20 25 30 Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val 35 40 45 Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys 50 55 60 Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys 65 70 75 80 Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu 85 90 95 Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His 100 105 110 Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu 115 120 125 Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp 130 135 140 Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn 145 150 155 160 Pro Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp 165 170 <210> 14<211> 178<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGFβR2 ECCD-CD90 GPI<400> 14Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Asp Val 1 5 10 15 Glu Met Glu Ala Gln Lys Asp Glu Ile Ile Cys Pro Ser Cys Asn Arg 20 25 30 Thr Ala His Pro Leu Arg His Ile Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp 35 40 45 Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val 50 55 60 Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser 65 70 75 80 Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp 85 90 95 Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro 100 105 110 Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys 115 120 125 Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys 130 135 140 Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu 145 150 155 160 Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val 165 170 175 Lys Cys <210> 15<211> 35<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD48 GPI<400> 15Asp Val Cys Ser Pro Pro Cys Thr Leu Ala Arg Ser Phe Gly Val Glu 1 5 10 15 Trp Ile Ala Ser Trp Leu Val Val Thr Val Pro Thr Ile Leu Gly Leu 20 25 30 Leu Leu Thr 35 <210> 16<211> 41<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD55 GPI<400> 16His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr 1 5 10 15 Arg Leu Leu Ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly 20 25 30 Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr 35 40 <210> 17<211> 42<212> PRT<213> 人工序列<220><223> PLAC ALKPHOS GPI<400> 17Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His 1 5 10 15 Pro Gly Pro Ser Val Val Pro Ala Leu Leu Pro Leu Leu Ala Gly Thr 20 25 30 Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ala Thr Ala Pro 35 40 <210> 18<211> 43<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD90 GPI<400> 18Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Lys Cys Glu Gly Ile Ser 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gln Asn Thr Ser Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu 20 25 30 Ser Leu Leu Gln Ala Thr Asp Phe Met Ser Leu 35 40 <210> 19<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD48 GPI<400> 19Asp Val Cys Ser Pro Pro Cys Thr Leu Ala Arg Ser 1 5 10 <210> 20<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD55 GPI<400> 20His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser 1 5 10 <210> 21<211> 13<212> PRT<213> 人工序列<220><223> PLAC ALKPHOS GPI<400> 21Thr Ala Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp 1 5 10 <210> 22<211> 12<212> PRT<213> 人工序列<220><223> CD90 GPI<400> 22Asn Val Thr Val Leu Arg Asp Lys Leu Val Lys Cys 1 5 10 <210> 23<211> 22<212> PRT<213> 人工序列<220><223> TGF-βR2前導序列<400> 23Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser 20

Claims

一種TGF-β誘餌受體，其包含TGF-β結合區和脂質錨定物區。
如請求項1之TGF-β誘餌受體，其中該脂質錨定物區包含脂質錨定物或由脂質錨定物構成。
如請求項2之TGF-β誘餌受體，其中該脂質錨定物是GPI錨定物。
如請求項1至3中任一項之TGF-β誘餌受體，其缺少跨膜域。
如請求項1之TGF-β誘餌受體，其中該脂質錨定物區包含脂質錨定物信號序列的胺基酸序列或由脂質錨定物信號序列的胺基酸序列構成。
如請求項5之TGF-β誘餌受體，其中該脂質錨定物信號序列是多醣磷脂肌醇(GPI)信號序列。
如請求項1至6中任一項之TGF-β誘餌受體，其中該TGF-β結合區包含對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列或由對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列構成。
如請求項7之TGF-β誘餌受體，其中該TGF-β受體是第II型TGF-β受體(TGF-βR2)。
如請求項1至8中任一項之TGF-β誘餌受體，其中該TGF-β結合區包含與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列或由與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列構成。
如請求項1至9中任一項之TGF-β誘餌受體，其中該細胞膜錨定物區包含對應於CD48、CD55、CD90或胎盤型鹼性磷酸酶之一者的GPI信號序列的胺基酸序列或由對應於CD48、CD55、CD90或胎盤型鹼性磷酸酶之一者的GPI信號序列的胺基酸序列構成。
如請求項1至10中任一項之TGF-β誘餌受體，其中該脂質錨定物區包含下列或由下列構成： (i)與SEQ ID NOs:15至18之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；或 (ii)GPI錨定物，以及與SEQ ID NOs:19至22之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列。
如請求項1至11中任一項之TGF-β誘餌受體，其包含下列或由下列構成： (i)與SEQ ID NOs:5至8之任一者具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列；或 (ii)與SEQ ID NOs:11至14之一者具有至少80%序列一致性的胺基酸序列，以及GPI錨定物。
一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含TGF-β結合區，該TGF-β結合區包含對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列或由對應於TGF-β受體的TGF-β結合區的胺基酸序列構成。
如請求項13之CAR，其中該TGF-β受體是第II型TGF-β受體(TGF-βR2)。
如請求項13或請求項14之CAR，其中該TGF-β結合區包含與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列或由與SEQ ID NO:4具有至少80%胺基酸序列一致性的胺基酸序列構成。
一種核酸，其編碼如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR。
一種載體，其包含如請求項16之核酸。
一種細胞，其包含如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、或如請求項17之載體。
一種用於製造表現TGF-β誘餌受體或CAR的細胞的方法，該方法包含將如請求項16之核酸或如請求項17之載體導入細胞中，並在適合該細胞表現該核酸或載體的條件下培養該細胞。
一種細胞，其藉由如請求項19之方法獲得或可獲得。
一種藥學組成物，其包含如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、如請求項17之載體、或如請求項18或請求項20之細胞、以及藥學上可接受的載體、佐劑、賦形劑、或稀釋劑。
如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、如請求項17之載體、如請求項18或請求項20之細胞或如請求項21之藥學組成物，其係供用於治療或預防疾病或病況的方法。
一種如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、如請求項17之載體、如請求項18或請求項20之細胞或如請求項21之藥學組成物於製造一藥劑的用途，該藥劑係用於治療或預防疾病或病況。
一種治療或預防疾病或病況的方法，包含將治療或預防有效量的如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、如請求項17之載體、如請求項18或請求項20之細胞或如請求項21之藥學組成物投予個體。
一種治療或預防個體的疾病或病況的方法，包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)修飾該至少一個細胞以表現或包含如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、或如請求項17之載體，以及； (c)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。
一種治療或預防個體的疾病或病況的方法，包含： (a)從個體單離至少一個細胞； (b)將如請求項16之核酸或如請求項17之載體導入該至少一個細胞中，藉此修飾該至少一個細胞以及； (c)將該經修飾的至少一個細胞投予個體。
如請求項22供用之TGF-β誘餌受體、CAR、核酸、載體、細胞、或藥學組成物、如請求項23之用途、或如請求項24至26中任一項之方法，其中該疾病或病況是癌症。
一種部件套組，其包含預定份量的如請求項1至15中任一項之TGF-β誘餌受體或CAR、如請求項16之核酸、如請求項17之載體、如請求項18或請求項20之細胞或如請求項21之藥學組成物。