BR112020008127A2 - anticorpos e conjugados de anticorpo-fármaco específicos para cd123 e seus usos - Google Patents

anticorpos e conjugados de anticorpo-fármaco específicos para cd123 e seus usos Download PDF

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Madan Katragadda
Nicole Melissa Piche-Nicholas
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Abstract

A presente invenção fornece anticorpos que se ligam especificamente a CD123. A presente invenção refere-se ainda a imunoconjugados (por exemplo, conjugados de anticorpo-fármaco ou ADCs) que compreendem tais anticorpos, ácidos nucleicos que codificam o anticorpo e métodos de obtenção de tais anticorpos. A invenção se refere ainda a métodos terapêuticos para o uso desses anticorpos e ADCs para o tratamento de uma condição associada com células que expressam CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS E CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO ESPECÍFICOS PARA CD123 E SEUS USOS". Referência à Listagem de Sequências
[001] Este pedido está sendo depositado eletronicamente via EFS-Web e inclui uma listagem de sequência enviada eletronicamente no formato.txt. O arquivo.txt contém uma listagem de sequência intitulada "PC72333_SEQ_LIST_ST25.txt" criada em 27 de outubro de 2017 e com um tamanho de 78 KB. A listagem de sequências contida neste arquivo.txt faz parte do pedido e está incorporada aqui por referência na sua totalidade.
CAMPO
[002] A presente invenção refere-se a anticorpos, por exemplo, anticorpos de extensão completa que se ligam especificamente a CD123. A invenção se refere ainda a conjugados (por exemplo, conjugados de anticorpo-fármaco, ou "ADCs") que compreendem os anticorpos anti-CD123, composições que compreendem os anticorpos anti-CD123 ou seus conjugados e métodos de utilização dos anticorpos anti-CD123 ou seus conjugados para o tratamento de condições associadas a células que expressam CD123 (por exemplo, câncer).
ANTECEDENTES
[003] CD123 é a cadeia alfa do receptor de interleucina-3 (IL-3Rα ou IL3RAa) que forma um heterodímero com a cadeia beta comum de CD131 para ajudar a transmitir o sinal de IL-3. O papel biológico de IL- 3 é estimular a sobrevivência e a proliferação de células multipotentes. CD123 é considerado estar envolvido na estimulação da proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) e tem uma função direta na biologia do tumor. O CD123 é frequentemente expresso em células-tronco leucêmicas (LSCs), uma população de células associada à recidiva em pacientes. Entre os tecidos humanos normais, a expressão de CD123 é principalmente limitada a células hematopoiéticas, particularmente células dendríticas plasmocitoides (pDC), que constituem < 0,4% das células mononucleares do sangue periférico em humanos. Como componentes da imunidade inata, as pDCs produzem grande quantidade de interferons do tipo 1 (IFN-α/β) em resposta a estímulos virais e bacterianos. É importante ressaltar que o CD123 não é expresso em células-tronco hematopoiéticas.
[004] Espera-se que novos casos de leucemia, linfoma e mieloma representem 10,2% de 1.688.780 novos casos estimados de câncer diagnosticados nos EUA em 2017. CD123 é expresso em células de câncer em uma variedade de neoplasias hematológicas, incluindo leucemia mieloide aguda (LMA), onde sua expressão é > 80%. Exemplos de células de câncer do sangue que expressam CD123 incluem blastos e células-tronco de leucemia. As doenças associadas com a expressão de CD123 incluem LMA, síndrome de mielodisplásica (MDS; risco baixo e alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, todos os subtipos), linfoma difuso de célula B grande (DLBCL), leucemia mieloide crônica (LMC) e neoplasia de célula dendrítica plasmocitoide blástica (BPDCN).
[005] Atualmente, os tratamentos para essas doenças incluem mais de 50 fármacos individuais com outros em estudo e em ensaios clínicos. A terapia com radiação também é comumente usada para tratar cânceres hematológicos e, às vezes, é administrada juntamente com a terapia medicamentosa. Também são utilizados imunoterapia, terapia com gene e medicina personalizada. No entanto, essas terapias podem ter efeitos colaterais e reações adversas significativos. Assim, são necessários tratamentos novos e aperfeiçoados para os cânceres hematológicos que expressam CD123 (IL-3Rα).
SUMÁRIO
[006] A invenção aqui descrita é direcionada a anticorpos que se ligam a CD123 e conjugados, tais como conjugados de anticorpo- fármaco (ADCs), compreendendo anticorpos que se ligam a CD123 e métodos de preparação e uso de tais anticorpos e ADCs para tratar distúrbios.
[007] São fornecidos aqui anticorpos que se ligam especificamente a CD123. Em algumas modalidades, a invenção fornece um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD123, em que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, 24, 32, 44, 51 ou 64, e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende três CDRs de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 17, 28, 39, 48, 57 ou 71 Em algumas modalidades, a VH pode compreender (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 7, 33, 52 ou 65; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8, 25, 34, 45, 53 ou 66; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9, 35, 46 ou 67. Em algumas modalidades, a região VL pode compreender (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 18, 40, 58 ou 72; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 19, 42, 60 ou 74; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20, 42, 60 ou 74. Em algumas modalidades, a VH pode compreender: (i) (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 7; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 25; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº:9. Em algumas modalidades, a região VL pode compreender (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 18; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 19; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20. Em algumas modalidades, a VH pode compreender a sequência mostrada na SEQ ID Nº:24 ou uma variante dessa com uma ou várias substituições conservativas de aminoácidos em resíduos que não estão dentro de uma CDR e/ou a VL pode compreender a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID Nº: 28 ou uma variante dessa com uma ou várias substituições de aminoácidos em aminoácidos que não estão dentro de uma CDR. Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 30 e uma cadeia pesada que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 27.
[008] Também é fornecido um anticorpo isolado que se liga especificamente a CD123 e compreende uma região variável da cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com o número de acesso ATCC PTA-124283 e uma região variável da cadeia leve produzida pelo vetor de expressão com o número de acesso ATCC PTA-124284.
[009] Também são fornecidos anticorpos isolados que se ligam especificamente a CD123 e competem pela ligação a CD123 com um anticorpo que compreende uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 6, 24, 32, 44, 51 ou 64; e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17, 28, 39, 48, 57 ou 71.
[0010] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 7, 8 e 9 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 18, 19 e 20.
[0011] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 7, 25 e 9 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 18, 19 e 20.
[0012] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 33, 34 e 35 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 40, 41 e 42.
[0013] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 33, 45 e 46 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 40, 41 e 42.
[0014] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 52, 53 e 54 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 58, 59 e 60.
[0015] Também são fornecidos anticorpos isolados para CD123 que compreendem uma VH que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 65, 66 e 67 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 72, 73 e 74.
[0016] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD123, como aqui descritos, podem compreender um marcador que contém glutamina doadora de acila, manipulado em um sítio específico. Em algumas modalidades, o marcador pode compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Q, LQG, LLQGG (SEQ ID Nº: 77), LLQG (SEQ ID Nº: 78), LSLSQG (SEQ ID Nº: 79), GGGLLQGG (SEQ ID Nº: 80), GLLQG (SEQ ID Nº: 81), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID Nº: 82), GLLQGGG (SEQ ID Nº: 83),
GLLQGG (SEQ ID Nº: 84), GLLQ (SEQ ID Nº: 85), LLQLLQGA (SEQ ID Nº: 86), LLQGA (SEQ ID Nº: 87), LLQYQGA (SEQ ID Nº: 88), LLQGSG (SEQ ID Nº: 89), LLQYQG (SEQ ID Nº: 90), LLQLLQG (SEQ ID Nº: 91), SLLQG (SEQ ID Nº: 92), LLQLQ (SEQ ID Nº: 93), LLQLLQ (SEQ ID Nº: 94), LLQGR (SEQ ID Nº: 95), LLQGPP (SEQ ID NO : 96), LLQGPA (SEQ ID Nº: 97), GGLLQGPP (SEQ ID Nº: 98), GGLLQGA (SEQ ID Nº: 99), LLQGPGK (SEQ ID Nº: 100), LLQGPG (SEQ ID Nº: 101), LLQGP (SEQ ID Nº: 102), LLQP (SEQ ID Nº: 103), LLQPGK (SEQ ID Nº: 104), LLQAPGK (SEQ ID Nº: 105), LLQGAPG (SEQ ID Nº: 106), LLQGAP (SEQ ID Nº: 107) e LLQLQG (SEQ ID Nº: 108).
[0017] Em algumas modalidades, o marcador contendo glutamina é LLQG (SEQ ID Nº: 78).
[0018] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD123, como aqui descritos, podem compreender uma modificação de aminoácidos na posição 222, 340 ou 370. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos pode ser uma substituição de lisina por arginina. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos pode ser K222R.
[0019] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD123 como aqui descritos podem compreender um ligante. Em algumas modalidades, o ligante pode ser clivável. Em algumas modalidades, o ligante pode ser selecionado do grupo que consiste em Ac-Lys-Gly (acetil-lisina-glicina), ácido aminocaproico, Ac-Lys-p-Ala (acetil-lisina-p- alanina), amino-PEG2 (polietileno glicol)-C2, amino-PEG3-C2, amino- PEG6-C2, Ac-Lis-Val-Cit-PABC (acetil-lisina-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila), amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2- aminoetóxi)etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S, 5S)-1-{3-[2-(2-aminoetóxi)etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit- PABC, putrescina e Ac-Lys-putrescina. Em algumas modalidades, o ligante pode ser Ac-Lis-Val-Cit-PABC (acetil-lisina-valina-citrulina-p- aminobenziloxicarbonila).
[0020] Em algumas modalidades, o anticorpo como aqui descrito compreende uma região constante. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é da subclasse de lgG1, lgG2 ou lgG2Aa, lgG3 ou lgG4 humanas. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo para lgG1. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma mutação N60G.
[0021] Também são fornecidos conjugados que compreendem um anticorpo para CD123 como aqui descrito conjugado com um agente. Em algumas modalidades, o agente pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em um agente citotóxico, um agente imunomodulador, um agente de imagem, uma proteína terapêutica, um biopolímero e um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o agente pode ser um agente citotóxico. Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode ser selecionado do grupo que consiste em uma antraciclina, uma auristatina, uma camptotecina, uma combretastatina, um dímero de CBI, um dímero de ciclopropilpirroloindolina (CPI), um dímero de CTI, uma dolastatina, uma duocarmicina, uma enediina, uma geldanamicina, um dímero de indolino-benzodiazepina, uma maitansina, uma puromicina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, um taxano, um alcaloide da vinca, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma espliceostatina, um pladienolídeo e seus estereoisômeros, isósteros, análogos ou derivados. Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode ser um dímero de CPI. Em algumas modalidades, o dímero de CPI é CPI-8314. Em algumas modalidades, o dímero de CPI pode ter a seguinte estrutura:
.
[0022] Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode ter o nome lUPAC: di-hidrogênio fosfato de (8S)-8-(clorometil)-6- [(3-{[(1S)- 1-(clorometil)-5-hidróxi-8-metil-,6-di-hidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)- il]carbonila}biciclo[1.1.1]pent-1-il)carbonil]-1-metil-3,6,7,8- tetrahidropirrolo[3,2-e]indol-4-ila. Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode ser C31H31Cl2N4O7P, ou um sal ou solvato farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o agente citotóxico pode estar na forma de sal de ácido trifluoracético (TFA): C31H31Cl2N4O7P C2HF3O2.
[0023] Em outras modalidades, o agente citotóxico pode ser MMAD (monometil auristatina D), 0101 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3- metóxi-1-{(2S)-2[(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3- tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-N- metil-L-valinamida), 3377 (N,2-dimetilalanil-N-{(1S,2R-4-{(2S)-2-[(1R, 2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1-[(1S)-1-Metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L- valinamida), 0131 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin- 1-il}-3-metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) ou 0121 (2-metil-L-proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metóxi-1- oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1- il}-3-metóxi-5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida).
[0024] Em algumas modalidades, o conjugado pode compreender a fórmula: anticorpo-(marcador contendo glutamina doadora de acila)-
(ligante)-(agente citotóxico). Em algumas modalidades, o marcador que contém glutamina doadora de acila pode compreender uma sequência de aminoácidos LLQG (SEQ ID Nº: 78) e o ligante pode compreender acetil-lisina-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila. Em algumas modalidades, o marcador que contém glutamina doadora de acila pode ser inserido no anticorpo na posição E294-N297. Em algumas modalidades, o conjugado pode ainda compreender uma substituição de aminoácidos de lisina para arginina na posição do anticorpo 222, de acordo com a numeração do índice da UE de Kabat (K222R).
[0025] Também são fornecidas composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo para CD123 aqui descrito ou um CD123 ADC aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0026] Também são fornecidos polinucleotídeos isolados que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo para CD123 aqui descrito. Também são fornecidos vetores que compreendem esses polinucleotídeos.
[0027] Também são fornecidas células hospedeiras isoladas que produzem recombinantemente qualquer um dos anticorpos anti-CD123 aqui descritos. Também são fornecidos métodos de produção de um anticorpo, que compreendem cultivar essas células hospedeiras sob condições que resultem na produção do anticorpo e isolar o anticorpo das células hospedeiras ou cultura.
[0028] Também são fornecidos métodos de tratamento de uma condição associada a células que expressam CD123 em um indivíduo que compreendem a administração a um indivíduo necessitado de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD123 aqui descritos ou o conjugado de qualquer um dos anticorpos e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Em algumas modalidades, a condição é o câncer.
Em algumas modalidades, o câncer pode ser um câncer selecionado do grupo que consiste em leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), Neoplasia de Células Dendríticas Plasmacitoides Blásticas (BPDCN), leucemia de células pilosas, linfoma de células B não-Hodgkin (NHL), mieloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin com predominância linfocitária nodular, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma da zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de célula B precursora, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B grandes difusas, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de grandes células mediastinais (tímicas), linfoma linfoplasmacítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma esplênico da zona marginal, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células T/histiócitos, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma cutâneo difuso primário de células B grandes (tipo perna), linfoma de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de células B grandes associado a inflamação, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHV8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico e outros linfomas relacionados às células B. Em algumas modalidades, o câncer é AML.
[0029] Também são fornecidos métodos para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD123 aqui fornecidos, ou o conjugado de qualquer dos anticorpos e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0030] Também são fornecidos métodos de inibição de metástases de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD123 aqui fornecidos ou o conjugado de qualquer um dos anticorpos e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0031] Também são fornecidos métodos para induzir a regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica que compreende qualquer um dos anticorpos anti-CD123 aqui fornecidos ou o conjugado de qualquer um dos anticorpos e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0032] Em outro aspecto, a invenção fornece uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, conforme descrito aqui para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, conforme descrito aqui para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, conforme descrito aqui para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, como descritos aqui para induzir regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123.
[0033] Em outro aspecto, a invenção fornece os anticorpos anti- CD123 ou o CD123 ADCs, como aqui descrito, para uso no tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CDC CDC3 como aqui descritos para inibir o crescimento ou a progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, como aqui descritos para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CDC CDC3 como aqui descritos para induzir regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123.
[0034] Em outro aspecto, a invenção fornece um uso dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como descrito aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123. Em algumas modalidades, é fornecida uma utilização dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como aqui descritos para a fabricação de um medicamento para inibir o crescimento ou progressão do tumor. Em algumas modalidades, é fornecida uma utilização dos anticorpos anti-CD123 ou dos CD123 ADCs, como descrito aqui na fabricação de um medicamento para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, é fornecida uma utilização dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como aqui descritos para a fabricação de um medicamento para induzir regressão do tumor.
[0035] Também são fornecidos aqui métodos para conjugar um anticorpo a AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 (AcLysPABC-CPI-8314). Em algumas modalidades, o método compreende a preparação de uma composição que compreende um anticorpo e AcLysPABC-CPI-8314 em um tampão que compreende 30 a 100 mM de KPO4 e 150 a 200 mM de NaCI; adição de tranglutaminase bacteriana à composição; e incubação da composição para permitir a conjugação do anticorpo com AcLysPABC-CPI-8314. Em algumas modalidades, o pH da composição é 7. Em algumas modalidades, a composição compreende 0,5 a 2 unidades (U) de transglutaminase bacteriana por mg de anticorpo. Em algumas modalidades, a composição compreende 1 U de transglutaminase bacteriana por mg de anticorpo. Em algumas modalidades, AcLysPABC-CPI-8314 está presente em um excesso molar de 10 vezes em relação ao anticorpo. Em algumas modalidades, a composição é incubada a 25°C durante a noite com misturação contínua. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda
7,5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO). Em algumas modalidades, o tampão compreende KPO4 30 mM e NaCI 150 mM. Em algumas modalidades, o tampão compreende KPO4 100 mM e NaCI 200 mM. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo antitumor. Em algumas modalidades, o anticorpo antitumor é um anticorpo para CD123. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS/DESENHOS
[0036] A Figura 1 representa os resultados de Western blot a partir da análise de células tratadas com IL-3 mais anticorpos ("Ab"). 7G3 é um anticorpo de referência e 3D1, 18G3 e 16D6 são anticorpos anti- CD123; 8.8 é um anticorpo de controle negativo que não se liga a CD123. Foram analisados os níveis de STAT5, STAT5 fosforilada e actina.
[0037] A Figura 2 ilustra uma análise representativa por citometria de fluxo, que mostra o percentual de células tumorais remanescentes no sangue periférico (gráfico a esquerda) e medula óssea (gráfico a direita) em um modelo animal após tratamento com veículo ou CD123- ADC (CD123-18G3-CPI).
[0038] A Figura 3 representa um gráfico que resume a duração da sobrevida (em dias) de animais tratados com veículo ou CD123 ADC nas doses indicadas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0039] A invenção descrita neste documento fornece anticorpos e conjugados anticorpo-fármaco (ADCs) que se ligam especificamente a CD123 (por exemplo, CD123 humano). A invenção também fornece polinucleotídeos que codificam esses anticorpos, composições que compreendem esses anticorpos e métodos para fabricar e usar esses anticorpos. A invenção também fornece métodos para o tratamento de distúrbios associados à expressão de CD123 em um indivíduo, tal como câncer ou doença autoimune.
TÉCNICAS GERAIS
[0040] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura, tal como em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)
DEFINIÇÕES
[0041] Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Como usada aqui, a expressão abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticorpos de cadeia simples (ScFv) e anticorpos de domínio (incluindo, por exemplo, anticorpos de tubarão e camelídeos) e proteínas de fusão que compreendem um anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um local de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse), e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe particular. Dependendo da sequência de aminoácidos da região constante das cadeias pesadas do anticorpo, as imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias delas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
[0042] A expressão "fragmento de ligação ao antígeno" ou "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, como aqui utilizada, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo intacto que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um determinado antígeno (por exemplo, CD123). As funções de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser realizadas por fragmentos de um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pela expressão "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem Fab; Fab'; F(ab')2; um fragmento Fd que consiste nos domínios da região variável da cadeia pesada (VH) e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; um fragmento de anticorpo de domínio único (dAb) (Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989) e uma região determinante de complementaridade isolada (CDR).
[0043] Um anticorpo, um ADC ou um polipeptídeo que "se liga preferivelmente" ou "se liga especificamente" (aqui utilizado de forma alternativa) a um alvo (por exemplo, proteína CD123) é uma expressão bem conhecida na técnica e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial também são bem conhecidos na técnica. Diz-se que uma molécula exibe "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reagir ou se associar mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substância específica do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" ou "se liga preferencialmente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que com outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epítopo de CD123 é um anticorpo que se liga a esse epítopo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se ligaria a outros epítopos de CD123 ou epítopos diferentes de CD123. É entendido também que, pela leitura dessa definição, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epítopo) que se liga especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa incluir) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, referência à ligação significa ligação preferencial.
[0044] Uma "região variável" de um anticorpo se refere à região variável da cadeia leve do anticorpo ou à região variável da cadeia pesada do anticorpo, isoladamente ou em combinação. Como conhecido na técnica, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve consistem em quatro regiões estruturais (FR) conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antígeno dos anticorpos. Existem pelo menos duas técnicas para determinar as CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade de sequência entre as espécies (isto é, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest (5ª ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD). )); e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo (Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948). Como usado aqui, uma CDR pode se referir às CDRs definidas por qualquer abordagem ou por uma combinação de ambas as abordagens.
[0045] Uma "CDR" de um domínio variável são resíduos de aminoácidos na região variável que são identificados de acordo com as definições de Kabat, Chothia, o acúmulo de Kabat e Chothia, AbM, definições de contato e/ou conformacionais ou qualquer método de determinação de CDR bem conhecido na técnica. As CDRs de anticorpos podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis originalmente definidas por Kabat et al. Veja, por exemplo, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., Public Health Service, NIH, Washington DC. As posições das CDRs também podem ser identificadas como as estruturas em alça estruturais originalmente descritas por Chothia e outros. Veja, por exemplo, Chothia et al., Nature 342: 877-883, 1989. Outras abordagens para a identificação de CDR incluem a "definição AbM", que é um compromisso entre Kabat e Chothia e é derivada do programa de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular (agora Accelrys®) ou a "definição de contato" de CDRs com base em contatos de antígenos observados, apresentado em MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262: 732-745, 1996. Em outra abordagem, aqui referida como a "definição conformacional" de CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas à ligação ao antígeno. Ver, por exemplo, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1 166, 2008. Ainda outras definições de limites de CDR podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, mas, no entanto, se sobrepõem com pelo menos uma porção das CDRs da Kabat, embora possam ser encurtadas ou prolongadas à luz de previsões ou descobertas experimentais de resíduos ou grupos de resíduos específicos ou mesmo CDRs inteiras não impactam significativamente a ligação ao antígeno. Como usado aqui, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos aqui utilizados podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer modalidade dada que contenha mais do que uma CDR, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer uma das definições de Kabat, Chothia, estendida, AbM, contato e/ou conformacionais.
[0046] As expressões "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usadas aqui de forma alternativa para se referir a cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, preferencialmente, relativamente curtas (por exemplo, 10-100 aminoácidos). A cadeia pode ser linear ou ramificada, pode compreender aminoácidos modificados e/ou pode ser interrompida por não aminoácidos. As expressões também abrangem uma cadeia de aminoácidos que foi modificada naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos na definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), bem como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias únicas ou cadeias associadas.
[0047] Os anticorpos da invenção podem ser produzidos utilizando técnicas bem conhecidas, por exemplo, tecnologias recombinantes, tecnologias de apresentação em fagos, tecnologias sintéticas ou combinações de tais tecnologias ou outras tecnologias facilmente conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Jayasena, SD, Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999 e Fellouse, F.A., et ai., J. Mol. Biol., 373 (4): 924-40, 2007).
[0048] Como conhecido na técnica, "polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como usado aqui de forma alternativa, se refere a cadeias de nucleotídeos de qualquer comprimento e inclui DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificados e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a uma cadeia pela DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação da estrutura de nucleotídeos pode ser realizada antes ou após a montagem da cadeia. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação.
Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações de inter-nucleotídeos, tais como, por exemplo, aqueles com ligações não carregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles que contêm porções pendentes, como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos etc.), aqueles que contêm alquilantes e aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer um dos grupos hidroxila normalmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padronizados ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais ou podem ser conjugados a suportes sólidos.
A OH 5' e 3' terminal pode ser fosforilada ou substituída por aminas ou porções orgânicas do grupo de cobertura com 1 a 20 átomos de carbono.
Outras hidroxilas também podem ser derivatizados para grupos protetores padronizados.
Os polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-2'-O-alil, 2'- fluor- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa ou beta-anoméricos, açúcares epiméricos, tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo- heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos,
tais como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila (1-20 C) substituído ou não substituído (1 -20 C), opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior se aplica a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo RNA e DNA.
[0049] Como conhecido na técnica, uma "região constante" de um anticorpo se refere à região constante da cadeia leve do anticorpo ou à região constante da cadeia pesada do anticorpo, isoladamente ou em combinação.
[0050] Como usado aqui, "substancialmente puro" se refere a um material que é pelo menos 50% puro (ou seja, livre de contaminantes), mais preferivelmente, pelo menos 90% puro, mais preferivelmente, pelo menos 95% puro, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98% puro e, mais preferivelmente, pelo menos 99% puro.
[0051] Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou cultura de células que pode ser ou foi um receptor de vetores para incorporação de insertos de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a progênie de uma única célula hospedeira, e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (na morfologia ou no complemento do DNA genômico) à célula original, devido a mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com um polinucleotídeo desta invenção.
[0052] Como conhecido na técnica, a expressão "região Fc" é usada para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fc" pode ser uma região Fc da sequência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida por se estender entre um resíduo de aminoácido na posição Cys226 ou de Pro230, até sua terminação carboxila. A numeração dos resíduos na região Fc é aquela do índice da UE como em Kabat. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md, 1991. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende duas regiões constantes, CH2 e CH3.
[0053] A expressão "competir", como usada aqui em relação a um anticorpo, significa que um primeiro anticorpo ou seu fragmento (ou porção) de ligação ao antígeno, se liga a um epítopo de uma maneira suficientemente semelhante à ligação de um segundo anticorpo, ou sua porção de ligação ao antígeno, tal que o resultado da ligação do primeiro anticorpo com seu epítopo cognato seja detectavelmente diminuído na presença do segundo anticorpo, em comparação com a ligação do primeiro anticorpo na ausência do segundo anticorpo. A alternativa, onde a ligação do segundo anticorpo ao seu epítopo também está detectavelmente diminuída na presença do primeiro anticorpo, pode ocorrer, mas não precisa ser o caso. Ou seja, um primeiro anticorpo pode inibir a ligação de um segundo anticorpo ao seu epítopo sem que esse segundo anticorpo iniba a ligação do primeiro anticorpo ao seu respectivo epítopo. No entanto, onde cada anticorpo inibe de forma detectável a ligação do outro anticorpo com seu epítopo ou ligante cognato, seja na mesma, maior ou menor extensão, diz-se que os anticorpos "competem de forma cruzada" entre si pela ligação de seus respectivos epítopos. Os anticorpos competidores e competidores cruzados são abrangidos pela presente invenção. Independentemente do mecanismo pelo qual essa competição ou competição cruzada ocorra (por exemplo, impedimento estérico, alteração conformacional ou ligação a um epítopo comum ou parte dele), o profissional qualificado apreciará, com base nos ensinamentos aqui fornecidos, que tais anticorpos competidores e/ou de competição cruzada são abrangidos e podem ser úteis para os métodos aqui descritos.
[0054] Uma "região Fc de sequência nativa" compreende uma sequência de aminoácidos idêntica à sequência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere da região Fc da sequência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácidos, mas ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc da sequência nativa. Em algumas modalidades, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de aminoácidos em comparação com uma região Fc de sequência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, entre cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos e, preferivelmente, entre cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de sequência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante possuirá preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade de sequência com ele, mais preferencialmente, em pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de sequência com a mesma.
[0055] Como usado aqui, a expressão "CD123" se refere a qualquer forma de CD123 e suas variantes que retêm pelo menos parte da atividade de CD123. A menos que indicado de forma diferente, tal como por referência específica a CD123 humano, CD123 inclui todas as espécies de mamíferos da sequência nativa de CD123, por exemplo, humano, canino, felino, equino e bovino. Sequências de CD123 exemplificadoras são mostradas na Tabela 1. TABELA 1
SEQ DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA ID Nº: 1 CD123 METDTLLLWVLLLWVPGSTG humana, TKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYS isoforma longa MPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENS (Peptídeo de GKPWAGAENLTCWIHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLY sinal LNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQS sublinhado) SHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKCNKTH
SFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQ LLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANT RAWRTSLLIALGTLLALVCVFVICRRYLVMQRLFPRIPHMKD
PIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT 2 CD123 METDTLLLWVLLLWVPGSTG humana, TKEDPNPPITNLRMKAKAQQLTWDLNRNVTDIECVKDADYS isoforma ECD MPAVNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVANPPFSTWILFPENS longa com Flag GKPWAGAENLTCWIHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQYDLY e tags Avi LNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGSQS (Peptídeo de SHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKCNKTH sinal e tags SFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTSFQ sublinhados) LLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGANT
RAWR
GGPPDYKDDDDKGGGLNDIFEAQKIEWHE 3 CD123 METDTLLLWVLLLWVPGSTG humana, TKEGKPWAGAENLTCWIHDVDFLSCSWAVGPGAPADVQY isoforma curta DLYLNVANRRQQYECLHYKTDAQGTRIGCRFDDISRLSSGS (Peptídeo de QSSHILVRGRSAAFGIPCTDKFVVFSQIEILTPPNMTAKCNK sinal THSFMHWKMRSHFNRKFRYELQIQKRMQPVITEQVRDRTS sublinhado) FQLLNPGTYTVQIRARERVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGA
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KDPIGDSFQNDKLVVWEAGKAGLEECLVTEVQVVQKT 4 CD123 METDTLLLWVLLLWVPGSTGQ cinomolgus, TKEDPNAPIRNLRMKEKAQQLMWDLNRNVTDVECIKGTDY isoforma ECD SMPAMNNSYCQFGAISLCEVTNYTVRVASPPFSTWILFPEN longa com Flag SGTPRAGAENLTCWVHDVDFLSCSWVVGPAAPADVQYDL e tags Avi YLNNPNSHEQYRCLHYKTDARGTQIGCRFDDIARLSRGSQ (Peptídeo de SSHILVRGRSAAVSIPCTDKFVFFSQIERLTPPNMTGECNET sinal e tags HSFMHWKMKSHFNRKFRYELRIQKRMQPVRTEQVRDTTS sublinhados) FQLPNPGTYTVQIRARETVYEFLSAWSTPQRFECDQEEGA
SSRAWRGGPPDYKDDDDKGGGLNDIFEAQKIEWHE
[0056] Como usado aqui, "anticorpo para CD123" se refere a um anticorpo que se liga especificamente a CD123 e modula a atividade biológica e/ou eventos a jusante mediados por CD123. Em algumas modalidades, o anticorpo para CD123 é um anticorpo antagonista. Os anticorpos antagonistas de CD123 abrangem anticorpos que bloqueiam, antagonizam, suprimem ou reduzem (em qualquer grau, incluindo significativamente) a atividade biológica de CD123, incluindo eventos a jusante mediados por CD123, tais como, por exemplo, a ligação a IL-3 e/ou a sinalização a jusante, fosforilação de STAT5 e sobrevida de células multipotentes. Exemplos de anticorpos anti- CD123 e conjugados de fármaco-anticorpo para CD123 ("CD123 ADCs") são aqui fornecidos.
[0057] Como usado aqui, "tratamento" é uma abordagem para a obtenção de resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os propósitos desta invenção, os resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes: reduzir a proliferação de (ou destruir) células neoplásicas ou cancerosas, inibir as metástases de células neoplásicas, remissão de uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune), diminuição dos sintomas resultantes de uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune), aumento da qualidade de vida daqueles que sofrem de uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune), diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune), retardo da progressão de uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune), curando uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune) ) e/ou prolongamento da sobrevivência de indivíduos com uma doença associada a CD123 (por exemplo, câncer ou doença autoimune).
[0058] "Melhora" significa uma diminuição ou melhora de um ou mais sintomas em comparação com a não administração de um anticorpo para CD123 ou um CD123 ADC. "Melhorar" também inclui encurtamento ou redução na duração de um sintoma.
[0059] Como usado aqui, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz" de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para afetar qualquer um ou mais resultados benéficos ou desejados. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tais como redução da incidência ou melhora de um ou mais sintomas de várias doenças ou condições associadas a CD123 (tal como, por exemplo, sem limitação, câncer), diminuição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, aumento do efeito de outro medicação e/ou retardo da progressão da doença associada a CD123 de indivíduos. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os propósitos desta invenção, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, diretamente ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um medicamento, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro medicamento, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "dosagem eficaz" pode ser considerada no contexto da administração de um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado administrado em quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou for alcançado.
[0060] Um "indivíduo" ou um "paciente" é um mamífero, mais preferivelmente, um humano. Os mamíferos também incluem, entre outros, animais de fazenda, animais esportivos, animais de estimação, primatas, cavalos, cães, gatos, camundongos e ratos.
[0061] Como usado aqui, "vetor" significa um construto que é capaz de liberar e, preferivelmente, expressar um ou mais genes ou sequências de interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a vetores virais, vetores de expressão de DNA ou RNA nus, plasmídeos, cosmídeos ou vetores de fagos, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes de condensação catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em lipossomas e certas células eucarióticas, tais como células produtoras.
[0062] Como usada aqui, "sequência de controle de expressão" significa uma sequência de ácido nucleico que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Uma sequência de controle de expressão pode ser um promotor, tal um promotor constitutivo ou induzível ou um intensificador. A sequência de controle da expressão está operativamente ligada à sequência de ácido nucleico a ser transcrita.
[0063] Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "excipiente farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permita que o ingrediente retenha atividade biológica e não seja reativo ao sistema imunológico do indivíduo. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a qualquer um dos veículos farmacêuticos padronizados, tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes umectantes. Os diluentes preferidos para administração em aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina normal (0,9%). As composições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice Pharmacy 21 ed Ed. Mack Publishing, 2005).
[0064] A expressão "marcador contendo glutamina doadora de acila" ou "marcador de glutamina", como usada aqui, se refere a um polipeptídeo ou uma proteína que contém um ou mais resíduos de Gln que atuam como um aceptor de transglutaminase amina. Veja, por exemplo, as Publicações PCT WO2012059882 e WO2015015448, que estão aqui incorporados por referência na sua totalidade.
[0065] A expressão "kon", como usada aqui, se refere à taxa da constante de associação de um anticorpo a um antígeno. Especificamente, as taxas constantes (kon e koff) e constantes de equilíbrio de dissociação são medidas usando proteínas IgGs e CD123 (por exemplo, proteína de fusão CD123-Fc).
[0066] A expressão "koff", como usado aqui, se refere à taxa constante para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.
[0067] A expressão "KD", como usada aqui, se refere à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno.
[0068] A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro inclui aqui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo.
[0069] Como usado aqui, CPI se refere a 1,2,8,8a-tetra- hidrociclopropa[c]pirrolo[3,2-e]indol-4(5H)-ona ou sua forma substituída ou derivatizada. CPI também pode se referir à forma sec de CPI ou sec-CPI, que também é conhecida como 8-(clorometil)-1- metil-3,6,7,8-tetra-hidropirrolo[3,2-e]indol-4-ol, ou sua(s) forma(s) substituída(s) ou derivatizada(s).
[0070] É entendido que sempre que as modalidades são descritas aqui com a linguagem "compreendendo", também são fornecidas modalidades análogas descritas em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essencialmente em".
[0071] Onde aspectos ou modalidades da invenção são descritos em termos de um grupo Markush ou outro agrupamento de alternativas, a presente invenção abrange não apenas o grupo inteiro listado como um todo, mas cada membro do grupo individualmente e todos os subgrupos possíveis do grupo principal, mas também o grupo principal com ausência de um ou mais membros do grupo. A presente invenção também prevê a exclusão explícita de um ou mais de qualquer um dos membros do grupo na invenção reivindicada.
[0072] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como comumente entendido por aquele versado na técnica ao qual esta invenção pertence. Em caso de conflito, a presente especificação, incluindo definições, prevalecerá. Ao longo deste pedido e reivindicações, a palavra "compreender" ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo" serão entendidas como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros. A menos que requerido pelo contexto, as expressões no singular devem incluir pluralidades e as expressões no plural devem incluir o singular.
[0073] Métodos e materiais exemplificadores estão aqui descritos, embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos também possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser limitantes. ANTICORPOS ANTI-CD123 E CONJUGADOS DE ANTICORPO-FÁRMACO
[0074] A presente invenção fornece anticorpos que se ligam a CD123 (por exemplo, CD123 humano (por exemplo, SEQ ID Nº: 1)) e conjugados (tais como conjugados de anticorpo-fármaco ou ADCs) que compreendem um anticorpo anti-CD123, caracterizado por qualquer uma ou mais das seguintes características: (a) tratar, prevenir, melhorar um ou mais sintomas de uma condição associada a células malignas que expressam CD123 em um indivíduo (por exemplo, câncer tal como, sem limitação, AML, B-ALL, HCL, etc.) ; (b) inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo (que tem um tumor maligno que expressa CD123); (c) inibir a metástase de células cancerosas (malignas) que expressam CD123 em um indivíduo (que possui uma ou mais células malignas que expressam CD123); (d) induzir a regressão (por exemplo, regressão a longo prazo) de um tumor que expressa CD123; e (e) exercer atividade citotóxica em células malignas que expressam CD123.
[0075] Os anticorpos úteis na presente invenção podem abranger anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc, etc.), anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos heteroconjugados, anticorpos de cadeia simples (ScFv), seus mutantes, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo (por exemplo, um anticorpo de domínio), anticorpos humanizados e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno da especificidade necessária, incluindo variantes de glicosilação de anticorpos, variantes de sequência de aminoácidos de anticorpos e anticorpos modificados covalentemente. Os anticorpos podem ser de murino, de rato, humanos ou qualquer outra origem (incluindo anticorpos quiméricos ou humanizados). Em algumas modalidades, o anticorpo para CD123 como aqui descrito é um anticorpo monoclonal. Por exemplo, o anticorpo para CD123 pode ser um anticorpo monoclonal humanizado, anticorpo humano ou um anticorpo monoclonal quimérico.
[0076] Em algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma região constante modificada, tal como, por exemplo, sem limitação, uma região constante que tem potencial aumentado para provocar uma resposta imune. Por exemplo, a região constante pode ser modificada para ter maior afinidade por um receptor Fc gama, tal como, por exemplo, FcyRI, FcyRIIA ou Fcylll. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende ou pode compreender uma região constante que é imunologicamente inerte, ou seja, tem um potencial reduzido para provocar uma resposta imune. Em algumas modalidades, a região constante é modificada como descrito em Eur. J. Immunol., 29: 2613-2624, 1999; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK No. 98099518. Fc pode ser de lgG1 humano, lgG2 humano, lgG3 humano ou lgG4 humano. Fc pode ser de lgG2 humano contendo a mutação A330P331 para S330S331 (lgG2Δa), na qual os resíduos de aminoácidos são numerados com referência à sequência de lgG2 do tipo selvagem. EUR. J. Immunol., 29:2613-2624, 1999. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de lgG4 que compreende as seguintes mutações (Armour et al., Molecular Immunology 40 585-593, 2003): E233F234L235 para P233V234A235 (lgG4Δc), em que a numeração é referente a lgG4 de tipo selvagem. Em ainda outra modalidade, Fc é E233F234L235 para P233V234A235 de lgG4 humana com deleção de G236 (lgG4Δb). Em outra modalidade, Fc é qualquer Fc de lgG4 humana (lgG4, lgG4Δb ou lgG4Δc) que contenha a mutação estabilizadora da dobradiça S228 para P228 (Aalberse et al., Immunology 105, 9-19, 2002). Em outra modalidade, Fc pode ser Fc aglicosilado.
[0077] Em algumas modalidades, a região constante pode ser aglicosilada através da mutação do resíduo de ligação de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou resíduos de flanqueamento que fazem parte da sequência de reconhecimento de glicosilação na região constante. Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N enzimaticamente. A região constante pode ser aglicosilada para glicosilação ligada a N enzimaticamente ou por expressão em uma célula hospedeira deficiente em glicosilação.
[0078] Uma maneira de determinar a afinidade de ligação de anticorpos a CD123 é pela medida da afinidade de ligação de fragmentos Fab monofuncionais do anticorpo. Para obter fragmentos Fab monofuncionais, um anticorpo (por exemplo, IgG) pode ser clivado com papaína ou expresso de forma recombinante. A afinidade de um fragmento Fab de CD123 de um anticorpo pode ser determinada por ressonância de plasma de superfície (sistema de ressonância de plasma de superfície (SPR) Biacore™3000™, Biacore™, INC, Piscataway NJ) equipado com chips sensores pré-imobilizados de estreptavidina (SA) ou Fc anti-camundongo ou Fc anti-humano usando tampão de corrida HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, Surfactant P20 0,005% v/v). CD123 humano biotinilado ou Fc de fusão pode ser diluído em tampão HBS-EP em uma concentração menor do que 0,5 µg/mL e injetado através dos canais individuais do chip usando tempos de contato variáveis, para obter duas faixas de densidade de antígeno, 50-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados ou 800-1000 RU para ensaios de triagem. Os estudos de regeneração mostraram que NaOH 25 mM em etanol 25% v/v remove efetivamente o Fab ligado, mantendo a atividade de CD123 no chip por mais de 200 injeções.
Tipicamente, diluições em série (concentrações abrangentes de 0,1 a 10 x KD estimado) de amostras de Fab purificadas são injetadas por 1 min a 100 μΙ/minuto e são permitidos tempos de dissociação de até 2 horas.
As concentrações das proteínas Fab são determinadas por ELISA e/ou eletroforese por SDS-PAGE usando um Fab de concentração conhecida (como determinado pela análise de aminoácidos) como um padrão.
As taxas de associação cinética (kon) e as taxas de dissociação (koff) são obtidas simultaneamente ajustando os dados globalmente a um modelo de ligação Langmuir 1:1 (Karlsson, R.
Roos, H.
Fagerstam, L.
Petersson, B. (1994). Métodos Enzymology 6. 99- 110) usando o programa BIAevaluation.
Os valores da constante de equilíbrio de dissociação (KD) são calculados como koff/kon.
Este protocolo é adequado para uso na determinação da afinidade de ligação de um anticorpo a qualquer CD123, incluindo CD123 humano, CD123 de outro mamífero (como CD123 de camundongo, CD123 de rato ou CD123 de primata), bem como diferentes formas de CD123 (por exemplo, CD123 glicosilado). A afinidade de ligação de um anticorpo é geralmente medida a 25°C, mas também pode ser medida a 37°C.
A afinidade de ligação (KD) do anticorpo para CD123 como aqui descrito para CD123 (tal como CD123 humano (por exemplo, (SEQ ID Nº: 1) pode ser de cerca de 0,002 nM a cerca de 6500 nM.
Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 6500 nm, 6000 nm, 5986 nm, 5567 nm, 5500 nm, 4500 nm, 4000 nm, 3500 nm, 3000 nm, 2500 nm, 2134 nm, 2000 nm, 1500 nm, 1000 nm, 750 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 250 nm, 200 nM, 193 nM, 100 nM, 90 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 19 nm, 18 nm, 17 nm, 16 nm, 15 nM, 10 nM, 8 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5,5 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,3 nM, 0,1 nM, 0,01 nM ou
0,002 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é menor que cerca de 6500 nm, 6000 nm, 5500 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm, 2000 nm, 1000 nm, 900 nm, 800 nm, 250 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 7,5 nM, 7 nM, 6,5 nM, 6 nM, 5 nM, 4,5 nM, 4 nM, 3,5 nM, 3 nM, 2,5 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1 nM ou 0,5 nM.
[0079] Os anticorpos anti-CD123 como aqui descritos podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica. Para a produção de linhagens de células de hibridoma, a via e o esquema de imunização do animal hospedeiro estão geralmente de acordo com as técnicas estabelecidas e convencionais para estimulação e produção de anticorpos, conforme descrito aqui mais adiante. As técnicas gerais para produção de anticorpos humanos e de camundongos são conhecidas e/ou estão descritas aqui.
[0080] Em algumas modalidades, um anticorpo para CD123 pode compreender uma região variável da cadeia pesada (VH) que compreende três CDRs de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 6, 24, 32, 44, 51 ou 64. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compreende uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende três CDRs de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 17, 28, 39, 48, 57 ou 71. Em alguns aspectos da invenção, um anticorpo compreende uma VH que compreende três CDRs de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 6, 24, 32, 44, 51 ou 64 e uma VL que compreende três CDRs de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 17, 28, 39, 48, 57 ou 71. Em outras modalidades, um anticorpo para CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 7, 8 e 9 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 18, 19 e 20. Em outras modalidades, um anticorpo para CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 7, 25 e 9 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 18, 19 e
20.
[0081] Em outras modalidades, um anticorpo para CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 33, 34 e 35 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 40, 41 e 42. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 33, 45 e 46 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 40, 41 e 42. Em outras modalidades, um anticorpo anti-CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 52, 53 e 54 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 58, 59 e 60. Em outras modalidades, um anticorpo para CD123 pode compreender uma VH que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 65, 66 e 67 e uma VL que compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID Nºs: 72, 73 e 74.
[0082] As regiões variáveis da cadeia pesada e as regiões variáveis da cadeia leve do anticorpo para CD123 representativas podem compreender as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 6, 24, 32, 44, 51 e 64 e SEQ ID Nºs: 17, 28, 39, 48, 57 e 71, respectivamente. As cadeias pesadas e as cadeias leves representativas do anticorpo para CD123 podem compreender as sequências de aminoácidos das SEQ ID Nºs: 15, 27, 37, 47, 55 e 69 e SEQ ID Nºs: 23, 30, 43, 49, 62 e 76, respectivamente. As sequências representativas de anticorpos anti-CD123 são mostradas na Tabela
2.0.
Tabela 2.0 Sequências de Anticorpo para CD123 Representativas Sequências da Cadeia Pesada Sequências da Cadeia Leve Anticorpo HC HC HC VH HC LC LC LC VL LC CDR2 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR3
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 18G3 Nº: 7 Nº: 8 Nº: 9 Nº: 6 Nº: 15 Nº: 18 Nº: 19 Nº: 20 Nº: 17 Nº: 23
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID h18G3 Nº: 7 Nº: 25 Nº: 9 Nº: 24 Nº: 27 Nº: 18 Nº: 19 Nº: 20 Nº: 28 Nº: 30
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 16D6 Nº: 33 Nº: 34 Nº: 35 Nº: 32 Nº: 37 Nº: 40 Nº: 41 Nº: 42 Nº: 39 Nº: 43
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID h16D6 Nº: 33 Nº: 45 Nº: 46 Nº: 44 Nº: 47 Nº: 40 Nº: 41 Nº: 42 Nº: 48 Nº: 49
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 3D1 Nº: 52 Nº: 53 Nº: 54 Nº: 51 Nº: 55 Nº: 58 Nº: 59 Nº: 60 Nº: 57 Nº: 62
SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID 20D7 Nº: 65 Nº: 66 Nº: 67 Nº: 64 Nº: 69 Nº: 72 Nº: 73 Nº: 74 Nº: 71 Nº: 76
[0083] Anticorpos anti-CD123 exemplificadores fornecidos aqui incluem 18G3, 18G3 humanizado (h18G3), 16D6, 16D6 humanizado (h16D6), 3D1 e 20D7 mostrados na Tabela 2.1. A sequências mostradas na Tabela 2.1 são sequências de aminoácidos a menos que indicadas de outra maneira.
Tabela 2.1
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 5 sequência de CAGGTGAAACTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCGCACAGAGTCTGTCCATTACCTG nucleotídeos de VH CACTGTCTCTGGATTCTCATTAACCAGTGGTGACATAAGTTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGT de 18G3 CTGGAGTGGCTTGGAGTAATATGGTCTGGCGGAGGCACAAATTATAATTCTCGTCTCATGTCCAGAC
TGAGCATCACCAAGGACAACTCCAGGAGTCAAGTGTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGA CACCGCCATATATTATTGTGTAAGAGATTGGGGTAACTTTTACTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCA
CTCTCACAGTCTCCTCA 6 VH de 18G3 com QVKLKESGPGLVAPAQSLSITCTVSGFSLTSGDISWIRQPPGKGLEWLGVIWSGGGTNYNSRLMSRLSIT CDRs sublinhadas KDNSRSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRDWGNFYFDYWGQGTTLTVSS 7 18G3 CDRH1 GFSLTSGDIS 8 18G3 CDRH2 VIWSGGGTNYNSRLMS 9 18G3 CDRH3 DWGNFYFDY 10 18G3 JH WGQGTTLTVSS 11 CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVV
TVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV 12 Dobradiça EPKSCDRTHTCPPCP 13 CH2 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGST
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 14 CH3 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK
LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 15 18G3 HC QVKLKESGPGLVAPAQSLSITCTVSGFSLTSGDISWIRQPPGKGLEWLGVIWSGGGTNYNSRLMSRLSIT
KDNSRSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCVRDWGNFYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSN TKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 16 sequência de GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAGTAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCT nucleotídeos de VL GCAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAGCAGTGGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCAGCAGA de 18G3 AACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATC
GCTTCACAGGCGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAGGACC TGGCAGTTTATTACTGCAGTCAATCTTATAATCTATACACATTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT
AAAA 17 VL de 18G3 com DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFT CDRs sublinhadas GGGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCSQSYNLYTFGGGTKLEIK 18 18G3 CDRL1 KSSQSLLSSGTRKNYLA 19 18G3 CDRL2 WASTRQS 20 18G3 CDRL3 SQSYNLYT 21 18G3 JK FGGGTKLEIK 22 CL (R)TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 23 18G3 LC DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFT
GGGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCSQSYNLYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC 24 VH de h18G3 com EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGGTNYGSRLMSRFT CDRs sublinhadas ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGNFYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 25 h18G3 CDRH2 VIWSGGGTNYGSRLMS 26 h18G3 JH WGQGTLVTVSS 27 h18G3 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVAVIWSGGGTNYGSRLMSRFT
ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDWGNFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 28 VL de h18G3 com DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRQSGVPSRFS CDRs sublinhadas GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTFGQGTKLEIK 29 h18G3 JK FGQGTKLEIK 30 h18G3 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRQSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC 31 sequência de CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATAACCTG nucleotídeos de VH CACTGTCTCTGGGTTCTCATTAACCAACTTTGATATAAGTTGGATTCGCCAGCCACCAGGAAAGGGT de 16D6 CTGGAGTGGCTTGGAGTAATGTGGACTGGTGGAGGCACAAATTATAATTCAGCTTTCATGTCCAGAC
TGAGCATCAGCAGGGACATCTCCAAAAGCCAAGTTTCCTTAAAAATGAGCAGTCTGCAAACTGATGA CACAGCCATATATTACTGTGTAAGAGGGGATACTTACTTCTTTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGA
ACCTCCGTCACCGTCTCATCAG 32 VH de 16D6 com QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNFDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSAFMSRLSI CDRs sublinhadas SRDISKSQVSLKMSSLQTDDTAIYYCVRGDTYFFAMDYWGQGTSVTVSS 33 16D6 CDRH1 GFSLTNFDIS 34 16D6 CDRH2 VMWTGGGTNYNSAFMS 35 16D6 CDRH3 GDTYFFAMDY 36 16D6 JH WGQGTSVTVSS
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 37 16D6 HC QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTNFDISWIRQPPGKGLEWLGVMWTGGGTNYNSAFMSRLSI
SRDISKSQVSLKMSSLQTDDTAIYYCVRGDTYFFAMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 38 sequência de GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTG nucleotídeos de VL CAAATCCAGTCAGAGTCTGCTCAGCAGTGGAACCCGAAAGAACTTCTTGTCTTGGTATCAGCAGAAAC de 16D6 CAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTGGGCATCCACTAGGGGATCTGGGGTCCCATCAAGGTTC
AGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACT
TACTACTGTAAACAATCTTATAATCTATACACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA 39 VL de 16D6 com DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKTGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFT CDRs sublinhadas GSGSGTDFTLTISSVQTEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIK 40 16D6 CDRL1 KSSQSLLSSGTRKNFLS 41 16D6 CDRL2 WASTRGS 42 16D6 CDRL3 KQSYNLYT 43 16D6 LC DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKTGQSPKLLIYWASTRGSGVPDRFT
GSGSGTDFTLTISSVQTEDLAVYYCKQSYNLYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC 44 VH de h16D6 com EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNFDISWVRQAPGKGLEWVAVMWTGGGTNYQSAFMSRF CDRs sublinhadas TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDVYFFAMDYWGQGTLVTVSS 45 h16D6 CDRH2 VMWTGGGTNYQSAFMS 46 h16D6 CDRH3 GDVYFFAMDY
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 47 h16D6 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTNFDISWVRQAPGKGLEWVAVMWTGGGTNYQSAFMSRF
TISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGDVYFFAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKST SGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 48 VL de h16D6 com DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKPGKAPKLLIYWASTRGSGVPSRFS CDRs sublinhadas GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLYTFGQGTKLEIK 49 h16D6 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNFLSWYQQKPGKAPKLLIYWASTRGSGVPSRFS
GSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCKQSYNLYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC 50 sequência de GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGT nucleotídeos de VH AAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTGACTACTTCATGAAGTGGGTGAAACAGAGCCATGGAAAGAGAC de 3D1 TTGAGTGGATTGGAGATATTAATCCTAACAATGGTGAAACTTTCTACAACCATCATTTCAAGGGCAAG
GCCACATTGACAATAGACAAATCCTCCAGTACAGCCTACATGCAGCTCAACAGCCTGACATCTGACG ACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACCCCGGCGGGGGAATGCTATGGACTTCTGGGGTCAAGGAA
CCTCAGTCACCGTCTCCTCA 51 VH de 3D1 com EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSDYFMKWVKQSHGKRLEWIGDINPNNGETFYNHHFKGKA CDRs sublinhadas TLTIDKSSSTAYMQLNSLTSDDSAVYYCARPRRGNAMDFWGQGTSVTVSS 52 3D1 CDRH1 GYTFSDYFMK 53 3D1 CDRH2 DINPNNGETFYNHHFKG 54 3D1 CDRH3 PRRGNAMDF 55 3D1 HC EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFSDYFMKWVKQSHGKRLEWIGDINPNNGETFYNHHFKGKA
TLTIDKSSSTAYMQLNSLTSDDSAVYYCARPRRGNAMDFWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTS GGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 56 sequência de GACATTGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACCATGAGCT nucleotídeos de VL GCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGAGGCAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAA de 3D1 ACCAGGACAGTCTCCTAAATTTCTGGTATATTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGC
TTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGG CAGATTATTTTTGTCAGCAACATTATAGTATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAT
ACAA 57 VL de 3D1 VL com DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRGNQKNYLAWYQQKPGQSPKFLVYFASTRESGVPDRF CDRs sublinhadas IGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIQ 58 3D1 CDRL1 KSSQSLLNRGNQKNYLA 59 3D1 CDRL2 FASTRES 60 3D1 CDRL3 QQHYSIPYT 61 3D1 JK FGGGTKLEIQ 62 3D1 LC DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNRGNQKNYLAWYQQKPGQSPKFLVYFASTRESGVPDRF
IGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSIPYTFGGGTKLEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVV CLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS
SPVTKSFNRGEC 63 sequência de GAAGTACAGCTGCAGCAGTCTGGGCCCGAGCTTCGGAGACCTGGGACCTCAGTCAAGCTGTCTTGT nucleotídeos de VH AAGGCTTCTGGCTACAGTATTACAGATTTCCTTATGTACTGGGTAAAACATAGGCCAGAATACGGCC de 20D7 TGGAATGGATTGGATGGATTGATCCTGAGGATGGTGAAACAAAATATGCTCAGAAGTTCCAAAGCAA
GGCCCGACTGACTGCAGATACGTCCTCCAAAACAGCCTACATGGAACTCAGCAGCCTGACGTCTGA GGACACAGCAACCTATTTTTGTGCTAGATGGGGCTATATCACGGATTATTTCTATGGCGGGTTTACTT
ACTGGGGCCGAGGCACTCTGGTCACTGTCTCTTCA 64 VH de 20D7 com EVQLQQSGPELRRPGTSVKLSCKASGYSITDFLMYWVKHRPEYGLEWIGWIDPEDGETKYAQKFQSKA CDRs sublinhadas RLTADTSSKTAYMELSSLTSEDTATYFCARWGYITDYFYGGFTYWGRGTLVTVSS 65 20D7 CDRH1 GYSITDFLMY 66 20D7 CDRH2 WIDPEDGETKYAQKFQS 67 20D7 CDRH3 WGYITDYFYGGFTY 68 20D7 JH WGRGTLVTVSS
SEQ ID DESCRIÇÃO SEQUÊNCIA Nº: 69 20D7 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSITDFLMYWVRQAPGKGLEWVAWIDPEDGETKYAQKFQSKA
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWGYITDYFYGGFTYWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 70 sequência de GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTCCAGTCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACTCTCAGCT nucleotídeos de VL GCAAAGCAAGTCAGAATATTAATAAGAACTTAGACTGGTATCAGCAAAAGCATGGAGAAGCTCCAAA de 20D7 ACTCCTGATATATCATACAAACACTTTGCAAATGGGCATCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCT
GGTACAGATTACGCACTCACCATCACCAGCCTGCAGCCTGAAGATGTTGCCACATATTACTGCTATC
AATATAACAGTGGGCCCACGTTTGGAGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAGA 71 VL de 20D7 VL com DIQMTQSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWYQQKHGEAPKLLIYHTNTLQMGIPSRFSGSGSGT CDRs sublinhadas DYALTITSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELR 72 20D7 CDRL1 KASQNINKNLD 73 20D7 CDRL2 HTNTLQM 74 20D7 CDRL3 YQYNSGPT 75 20D7 JL FGAGTKLELR 76 20D7 LC DIQMTQSPPVLSASVGDRVTLSCKASQNINKNLDWYQQKHGEAPKLLIYHTNTLQMGIPSRFSGSGSGT
DYALTITSLQPEDVATYYCYQYNSGPTFGAGTKLELRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC
[0084] As variantes por substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido removido na molécula de anticorpo e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações na estrutura também são contempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 3, sob o título "substituições conservativas". Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica, poderão ser introduzidas alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplificadoras" na Tabela 3, ou conforme descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos e os produtos selecionados. Tabela 3: Substituições de Aminoácidos Substituições Substituições Resíduo Original Conservativas Exemplificadoras Ala (A) Val Val; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn Asn (N) Gln Gln; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Phe; Ile (I) Leu Norleucina Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Leu (L) Ile Phe Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Val (V) Leu Norleucina
[0085] Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do arcabouço do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha β ou conformação helicoidal, (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) da maior parte da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) Não polares: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, mentira; (2) Polares sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3) Ácidos (negativamente carregados): Asp, Glu; (4) Básico (positivamente carregados): Lys, Arg; (5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe, His.
[0086] As substituições não conservativas são feitas pela troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[0087] Um tipo de substituição, por exemplo, que pode ser feito é trocar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que podem ser quimicamente reativas, para outro resíduo, tal como sem limitação, alanina ou serina. Por exemplo, pode haver uma substituição de uma cisteína não canônica. A substituição pode ser feita em uma CDR ou em uma região estrutural de um domínio variável ou na região constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, a cisteína é canônica. Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e impedir a reticulação aberrante. Por outro lado, as ligações de cisteína podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv.
[0088] A presente invenção também fornece um conjugado do anticorpo para CD123 como aqui descrito, ou do seu fragmento de ligação ao antígeno, em que o anticorpo é conjugado a um agente (por exemplo, um agente citotóxico) para imunoterapia direcionada (por exemplo, conjugados anticorpo-fármaco ou ADCs), diretamente ou indiretamente, através de um ligante. Por exemplo, um agente citotóxico pode ser ligado ou conjugado ao anticorpo para CD123, como descrito aqui para a liberação local direcionada da porção do agente citotóxico em tumores (por exemplo, tumor que expressa CD123).
[0089] Métodos para conjugar o agente citotóxico ou outros agentes terapêuticos aos anticorpos foram descritos em várias publicações. Por exemplo, a modificação química pode ser feita nos anticorpos através de aminas da cadeia lateral da lisina ou através de grupos sulfidrila da cisteína ativados pela redução das ligações dissulfeto entre cadeias para que a reação de conjugação ocorra. Veja, por exemplo, Tanaka et ai., FEBS Letters 579: 2092-2096, 2005, e Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004. Resíduos de cisteína reativa manipulados em sítios específicos de anticorpos para conjugação específica de fármacos com estequiometria definida também foram descritos. Veja, por exemplo, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26: 925-932, 2008. A conjugação usando um marcador que contém glutamina doadora de acila ou uma glutamina endógena tornada reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente como um doador de acila) pela manipulação de polipeptídeo na presença de transglutaminase e uma amina (por exemplo, um agente citotóxico que compreende ou está ligado a uma amina reativa) também é descrita nos pedidos internacionais WO2012/059882 e WO2015015448, que estão aqui incorporados por referência em sua totalidade. As transglutaminases são proteína-glutamina γ- glutamiltransferases (EC 2.3.2.13), que catalisam tipicamente a transamidação dependente de pH de resíduos de glutamina com resíduos de lisina. A transglutaminase usada na invenção aqui descrita pode ser obtida ou fabricada a partir de uma variedade de fontes ou manipulada para catalisar a transamidação de um ou mais resíduos de glutamina endógena com um ou mais resíduos de lisina ou agentes doadores de amina que contêm uma ou mais aminas reativas. Os métodos para usar a transglutaminase para preparar ADCs são descritos, por exemplo, em Publicação do Pedido de Patente US Nº. 20170043033, incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[0090] Os ADCs compreendem um componente de anticorpo conjugado com um agente farmacológico, tipicamente através do uso de um ligante. Em algumas modalidades, os ADCs aqui divulgadas compreendem um anticorpo especifico para o sítio conjugado com um agente doador de amina (por exemplo, uma molécula pequena acoplada a um ligante com uma unidade doadora de amina) marcador que contém glutamina manipulada, uma glutamina endógena (isto é, glutaminas nativas sem manipulação, tais como glutaminas nos domínios variáveis, CDRs, etc.) e/ou uma glutamina endógena reativa.
[0091] A glutamina endógena pode ser tornada reativa (isto é, a capacidade de formar uma ligação covalente tal como um doador de acila na presença de uma amina e uma transglutaminase) pela modificação de um ou mais aminoácidos (por exemplo, deleção, inserção, substituição ou mutação de aminoácidos) no anticorpo, por desglicosilação enzimática ou pela reação com uma transglutaminase manipulada. Consequentemente, em um aspecto, é fornecido um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) que compreende a fórmula: anticorpo-(T-(XY-Za)b)c, em que: T é 1) um marcador que contém glutamina manipulada em um sítio específico, 2) uma glutamina endógena e/ou 3) uma glutamina endógena tornada reativa pela manipulação do anticorpo ou uma transglutaminase manipulada; X é uma unidade doadora de amina; Y é um ligante; e Z é uma porção de um agente; X-Y-Z é um agente doador de amina especifico para o sítio conjugado ao marcador que contém glutamina, glutamina endógena e/ou glutamina endógena reativa; a é um número inteiro de 1 a 6; b é um número inteiro de 1 a 6; c é um número inteiro de 1 a 20; e em que o produto (proporção fármaco-anticorpo) de a, b e c é pelo menos cerca de 1. O marcador que contém glutamina, a glutamina endógena e/ou a glutamina reativa no anticorpo e o agente doador de amina (XYZ) aqui descritos, são substratos para a transglutaminase e a ligação entre o marcador que contém glutamina e/ou a glutamina endógena/reativa e o agente doador de amina, tem a fórmula CH2- CH2-CO-NH-, em que NH- está ligado a um ligante e uma porção do agente.
[0092] Em algumas modalidades, o anticorpo para CD123 ou o conjugado como descrito aqui compreendem um marcador que contém uma glutamina doadora de acila manipulado em um sítio específico do anticorpo (por exemplo, uma terminação carboxila, uma terminação amino ou em outro local no anticorpo para CD123). Em algumas modalidades, o marcador compreende um aminoácido glutamina (Q) ou uma sequência de aminoácidos LQG, LLQGG (SEQ ID Nº: 77), LLQG (SEQ ID Nº: 78), LSLSQG (SEQ ID Nº: 79), GGGLLQGG ( SEQ ID Nº: 80), GLLQG (SEQ ID Nº: 81), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID Nº: 82), GLLQGGG (SEQ ID Nº: 83), GLLQGG (SEQ ID Nº: 84), GLLQ (SEQ ID NO : 85), LLQLLQGA (SEQ ID Nº: 86), LLQGA (SEQ ID Nº: 87), LLQYQGA (SEQ ID Nº: 88), LLQGSG (SEQ ID Nº: 89), LLQYQG (SEQ ID Nº: 90), LLQLLQG (SEQ ID Nº: 91), SLLQG (SEQ ID Nº: 92), LLQLQ (SEQ ID Nº: 93), LLQLLQ (SEQ ID Nº: 94), LLQGR (SEQ ID Nº: 95), LLQGPP (SEQ ID Nº: 96), LLQGPA (SEQ ID Nº: 97), GGLLQGPP (SEQ ID Nº: 98), GGLLQGA (SEQ ID Nº: 99), LLQGPGK (SEQ ID Nº: 100), LLQGPG (SEQ ID Nº: 101), LLQGP ( SEQ ID Nº: 102), LLQP (SEQ ID Nº: 103), LLQPGK (SEQ ID Nº: 104), LLQAPGK (SEQ ID Nº: 105), LLQGAPG (SEQ ID
Nº: 106), LLQGAP (SEQ ID Nº: 107 ) e LLQLQG (SEQ ID Nº: 108).
[0093] Em algumas modalidades, o marcador que contém uma glutamina doadora de acila compreende, por exemplo, LLQG (SEQ ID Nº: 78) que substitui os resíduos de aminoácidos E294-N297 na cadeia pesada de anticorpo.
[0094] Também é fornecido um anticorpo isolado que compreende um marcador que contém uma glutamina doadora de acila e uma modificação de aminoácidos na posição 222, 340 ou 370 do anticorpo (esquema de numeração EU) em que a modificação é uma deleção, inserção, substituição, mutação de aminoácido ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a modificação de aminoácidos é uma substituição de lisina por arginina (por exemplo, K222R, K340R ou K370R).
[0095] Os agentes que podem ser conjugados com os anticorpos anti-CD123 ou os fragmentos de ligação ao antígeno da presente invenção incluem, mas não estão limitados a agentes citotóxicos, agentes imunomoduladores, agentes de imagem, proteínas terapêuticas, biopolímeros ou oligonucleotídeos.
[0096] Exemplos de um agente citotóxico incluem mas não estão limitados a antraciclina, auristatina, dolastatina, combretastatina, duocarmicina, dímero de pirrolobenzodiazepina, dímero de indolino- benzodiazepina, enedina, geldanamicina, maitansina, puromicina, puromicina, taxano, um alcaloide da vinca, uma camptotecina, uma tubulisina, um hemiasterlina, uma espliceostatina, um pladienolídeo e seus estereoisômeros, isósteros, análogos ou derivados.
[0097] Em alguns aspectos, o fármaco/agente é um dímero de ciclopropilpirroloindolina (CPI), dímero de CTI ou dímero de CBI. Os dímeros de CPI induzem a reticulação de DNA entre as cadeias e citotoxicidade potente. A Publicação Internacional PCT Nº WO2015/110935, que está incorporada aqui por referência na sua totalidade, descreve os dímeros de CPI e CBI que são úteis nos CD123 ADCs da presente invenção e fornece métodos para produzir os dímeros de CPI e CBI. Por exemplo, o agente di-hidrogênio fostato de (8S)-8-(clorometil)-6-[(3-{[(1S)-1-(clorometil)-5-hidróxi-8-metil-1,6-di- hidropirrolo[3,2-e]indol-3 (2H)-il] carbonil}biciclo [1.1.1]pent-1- il)carbonil]-1-metil-3,6,7,8-tetra-hidropirrolo[3,2-e]indol-4-ila (também conhecido como "dímero CPI-8314") tem a estrutura: que possui a fórmula C31H31Cl2N4O7P.
[0098] As antraciclinas são derivadas das bactérias Streptomyces e têm sido usadas para tratar uma ampla variedade de cânceres, tais como leucemias, linfomas, câncer de mama, útero, ovário e pulmão. Antraciclinas exemplificadoras incluem, mas não estão limitadas a daunorrubicina, doxorrubicina (isto é, adriamicina), epirrubicina, idarubicina, valrubicina e mitoxantrona.
[0099] As dolastatinas e seus análogos e derivados peptídicos, auristatinas, são agentes antimitóticos altamente potentes que têm demonstrado ter atividade anticâncer e antifúngica. Veja, por exemplo, Pat. No. 5.663.149 e Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, 1998. Dolastatinas e auristatinas exemplificadoras incluem, mas não estão limitadas a dolastatina 10, auristatina E, auristatina EB (AEB), auristatina EFP(AEFP), MMAD (monometil auristatina D ou monometil dolastatina 10), MMAF (Monometil
Auristatina F ou N-metilvalina-valina-dolaisoleuina-dolaprolina- fenilalanina), MMAE (Monometil Auristatina E ou N-metilvalina-valina- dolaisoleucina-dolaprolina-norefedrina), éster 5-benzoilvalérico de AE (AEVB) e outras novas auristatinas (tais como aquelas descritas na publicação US N. 2013/0129753). Em algumas modalidades, a auristatina é 0101 (2-metilalanil-N- [(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2- [(1R,2R)-1-metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2- il)etil]amino}propil]pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L- valinamida) com a seguinte estrutura: .
[00100] Em algumas modalidades, a auristatina é 3377 (N,2- dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-2-metóxi-1- [(1S)-1-metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida) com a seguinte estrutura:
[00101] Em algumas modalidades, a auristatina é 0131-OMe (N,2- dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metilL-valinamida) com a seguinte estrutura:
[00102] Em outras modalidades, a auristatina é 0131 (2-metil-L- proli-N- [(3R,4S,5S)-1{(2S)-2-[(1R,2R)-3 - {[(1S)-1-carbóxi-2-feniletil] amino} -1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5-metil-1- oxo-heptan-4-il]- N-metil-L-valinamida) com a seguinte estrutura:
[00103] Em outras modalidades, a auristatina é 0121 (2-metil-L- proli-N-[(3R, 4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3- {[( 2S)-1-metóxi-1-oxo-3- fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- metóxi-5-metil-1-oxoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamida) com a seguinte estrutura:
[00104] A camptotecina é um alcaloide citotóxico de quinolina que inibe a enzima topoisomerase I. Os exemplos de camptotecina e seus derivados incluem, mas não estão limitados a topotecan e irinotecan e seus metabolitos, tal como SN-38.
[00105] As combretastatinas são fenóis naturais com propriedades de ruptura vascular em tumores. Combretastatinas exemplificadoras e seus derivados incluem, mas não estão limitadas a combretastatina A- 4 (CA-4) e ombrabulina.
[00106] A duocarmicina e CC-1065 são agentes alquilantes de DNA com potência citotóxica. Veja Boger e Johnson, PNAS 92: 3642-3649 (1995). Exemplos de duocarmicina e CC-1065 incluem, mas não estão limitados a (+)-duocarmicina A e (+)-duocarmicina SA, (+)-CC-1065 e os compostos descritos no pedido internacional PCT/IB2015/050280 incluindo, mas não limitado a N~2~-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~- carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(1S)-1)-(clorometil)-3-[(5-{[(1S)-1-(clorometil)-5- (fosfonoóxi)-1,2-di-hidro-3H-benzo[e]indol-3-il]carbonil}tiofen-2-il) carbonil]-2,3-di-hidro-1H-benzo[e]indol-5-il}óxi)carbonil](metil)amino} etil)(metil)carbamoil]óxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que possui a estrutura:
[00107] N~2~-acetil-L-lisil-L-valil-N~5~-carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)- 8-(clorometil)-6-[(3-{[(1S)-1-(clorometil) -8-metil-5-(fosfonoóxi)-1,6-di- hidropirrolo[3,2-e]indol-3(2H)-il] carbonil}biciclo [1,1,1] pent-1-il) carbonil]-1-metil-3,6,7,8-tetra-hidropirrolo[3,2-e]indol-4-il}óxi)carbonil] (metil)amino}etil)(metil)carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida que possui a estrutura:
[00108] Enediina é uma classe de produtos bacterianos antitumor caracterizados por anéis de nove e dez membros ou pela presença de um sistema cíclico de ligações conjugadas triplas-duplas-triplas. Enediinas exemplificadoras incluem, mas não estão limitadas a caliqueamicina, esperamicina, uncialamicina, dinemicina e seus derivados.
[00109] As geldanamicinas são antibióticos de ansamicina benzoquinona que se ligam à Hsp90 (Proteína de Choque Térmico 90) e têm sido usadas como fármacos antitumor. Geldanamicinas exemplifcadoras incluem, mas não são limitadas a 17-AAG (17-N- alilamino-17-desmetoxigeldanamicina) e 17-DMAG (17- dimetilaminoetilamino-17-desmetóxi-glicanamicina).
[00110] A hemiasterlina e seus análogos (por exemplo, HTI-286) se ligam à tubulina, interrompem a dinâmica normal dos microtúbulos e, em quantidades estequiométricas, despolimerizam os microtúbulos.
[00111] As maitansinas ou seus derivados maitansinoides inibem a proliferação celular pela inibição da formação de microtúbulos durante a mitose através da inibição da polimerização da tubulina. Ver Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975. Maitansinas e maitansinoides exemplificadores incluem, mas não estão limitados a mertansina (DM1) e seus derivados, bem como ansamitocina.
[00112] Os dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBDs) e dímeros de indolino-benzodiazepina (IGNs) são agentes antitumor que contêm um ou mais grupos funcionais imino ou seus equivalentes, que se ligam ao dúplice de DNA. As moléculas de PBD e IGN são baseadas no produto natural atramicina e interagem com o DNA de maneira seletiva de sequência, com preferência pelas sequências de purina-guanina- purina. PBDs exemplificadoras e seus análogos incluem, mas não estão limitados a SJG-136.
[00113] Espliceostatinas e pladienolideos são compostos antitumor que inibem o splicing e interagem com o espliceossoma SF3b. Exemplos de spliceostatinas incluem, mas não estão limitados a espliceostatina A, FR901464 e acetato de (2S, 3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)- 6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrazinil-2-oxoetil)-4-hidróxi-1,6- dioxaspiro[2.5]oct-5-il]-3-metilpenta-2,4-dien-1-il}-2,5-dimetiltetra-hidro- 2H-piran-3-il]amino}-5-oxopent-3-2-ila, que possui a estrutura: .
[00114] Exemplos de pladienolídeos incluem, mas não são limitados a Pladienolídeo B, Pladienolídeo D ou E7107.
[00115] Os taxanos são diterpenos que atuam como agentes anti- tubulina ou inibidores mitóticos. Os taxanos exemplificadores incluem, mas não estão limitados a paclitaxel (por exemplo, TAXOL®) e docetaxel (TAXOTERE®).
[00116] Tubulisinas são produtos naturais isolados de uma cepa de mixobactérias que demonstrou despolimerizar microtúbulos e induzir parada mitótica. Tubulisinas exemplificadoras incluem, mas não estão limitadas a tubulisina A, tubulisina B e tubulisina D.
[00117] Os alcaloides da vinca também são agentes anti-tubulina.
Alcaloides de vinca exemplificadores incluem, mas não estão limitados a vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina.
[00118] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em MMAD (Monometil Auristatina D), 0101 (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2[(1R,2R)-1- metóxi-2-metil-3-oxo-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida), 3377 (N, 2-dimetilalanil-N-{(1S,2R)-4-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carboxil-2- feniletil] amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-2-metóxi- -[(1S)-1-Metilpropil]-4-oxobutil}-N-metil-L-valinamida), 0131 (2-metil-L- proli-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-carbóxi-2- feniletil]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3-metóxi-5- metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida), 0131-OMe (N,2- dimetilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metóxi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metóxi-3- {[(2S)-1-metóxi-1-oxo-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oxopropil] pirrolidin-1-il}-5-metil-1-oxoheptan-4-il]-N-metilL-valinamida),0121 (2- metil-L-proli-N-[(3R,4S, 5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(2S)-1-metóxi-1-oxo- 3-fenilpropan-2-il]amino}-1-metóxi-2-metil-3-oxopropil]pirrolidin-1-il}-3- met5-metil-1-oxo-heptan-4-il]-N-metil-L-valinamida) e acetato de (2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-hidrazinil- 2-oxoetil)-4-hidróxi-1,6-dioxaspiro[2.5]oct-5-il]-3-metilpenta-2,4-dien-1- il}-2,5-dimetiltetra-hidro-2H-piran-3-il] amino}-5-oxopent-3-em-2-ila.
[00119] Em algumas modalidades, o agente é um agente imunomodulador. Exemplos de agente imunomodulador incluem, mas não estão limitados a ganciclovir, etanercept, tacrolimus, sirolimus, voclosporina, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetila, metotrextrate, glicocorticoides e seus análogos, citocinas, fatores de crescimento de célula-tronco, linfotoxinas, fator de necrose tumoral (TNF), fatores hematopoiéticos, interleucinas (por exemplo, interleucina-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10,
IL-12, IL-18 e IL-21), fatores estimuladores de colônias (por exemplo, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) e fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos (GM-CSF)), interferons (por exemplo, interferons-α, -β e -γ), fator de crescimento de célula-tronco designado "fator S1", eritropoietina e trombopoietina ou uma combinação dos mesmos.
[00120] Em algumas modalidades, a porção do agente é um agente de imagens (por exemplo, um fluoróforo ou um quelante), tal como fluoresceína, rodamina, fósforos de lantanídeos e seus derivados, ou um radioisótopo ligado a um quelante. Exemplos de fluoróforos incluem, mas não são limitados a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por exemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por exemplo, 5- FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por exemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ou 750), carboxitetrametil-rodamina (TAMRA) (por exemplo, 5-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR) e sulforodamina (SR) (por exemplo, SR101). Exemplos de quelantes incluem, mas não estão limitados a ácido 1,4,7,0- tetraazaciclododecano-N,N',N",N"’-tetraacético (DOTA), ácido 1, 4,7- triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA), ácido 1, 4,7- triazaciclononano, ácido 1-glutárico, ácido 4,7-acético (deferoxamina), ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) e ácido 1,2-bis (o- aminofenóxi)etano-Ν, Ν, Ν',Ν'-tetraacético) (BAPTA).
[00121] Exemplos de fluoróforos incluem, entre outros, isotiocianato de fluoresceína (FITC) (por exemplo, 5-FITC), amidita de fluoresceína (FAM) (por exemplo, 5-FAM), eosina, carboxifluoresceína, eritrosina, Alexa Fluor® (por exemplo, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ou 750), carboxitetrametil-rodamina (TAMRA) (por exemplo, 5-TAMRA), tetrametilrodamina (TMR) e sulforodamina (SR) (por exemplo, SR101).
[00122] Em algumas modalidades, radioisótopos terapêuticos ou de diagnóstico ou outros marcadores (por exemplo, marcadores de PET ou SPECT) podem ser incorporados no agente para conjugação com os anticorpos anti-CD123 ou com os fragmentos de ligação ao antígeno, como descrito aqui. Exemplos de radioisótopos ou outros marcadores incluem, mas não são limitados a 3H, 11 C, 13 N, 14 C, 15 N, 15 35 18 32 33 47 51 57 58 59 62 64 67 O, S, F, P, P, Sc, Cr, Co, Co, Fe, Cu, Cu, Cu, 67 68 75 Ga, Ga, Se, 76Br, 77 Br, 86 Y, 89 Zr, 90 Y, 94 Tc, 95 Ru, 97 Ru, 99 Tc, 103 Ru, 105 105 107 109 111 111 113 121 122 123 124 125 Rh, Ru, Hg, Pd, Ag, In, In, Te, Te, I, I, I, 125 126 131 131 133 142 143 153 Te, I, I, In, I, Pr, Pr, Pb, 153Sm, 161 Tb, 165 Tm, 166 Dy, 166 167 168 169 177 186 188 189 197 198 199 H, Tm, Tm, Yb, Lu, Re, Re, Re, Pt, Au, Au, 201 Tl, 203Hg, 211At, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra, 224Ac ou 225Ac.
[00123] Em algumas modalidades, o agente é uma proteína terapêutica que inclui, mas não está limitada a uma toxina, um hormônio, uma enzima e um fator de crescimento.
[00124] Exemplos de uma toxina proteica (ou polipeptídeo) incluem, mas não estão limitados a difteria (por exemplo, cadeia A da difteria), exotoxina e endotoxina de Pseudomonas, ricina (por exemplo, cadeia A de ricina), abrina (por exemplo, cadeia A de abrina), modecina (por exemplo, cadeia A de modecina), alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de Phytolaca, gelonina, toxina da diftérica, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, mitogelina, restritocina, fenomicina, enomicina, tricotecenos, peptídeos inibidores de nó de cistina (ICK) (por exemplo, ceratotoxinas) e conotoxina (por exemplo, KIIIA ou Smllla).
[00125] Em algumas modalidades, o agente é um polímero biocompatível. Os anticorpos anti-CD123 ou os fragmentos de ligação ao antígeno, como aqui descritos, podem ser conjugados com o polímero biocompatível para aumentar a bioatividade e a meia-vida sérica e/ou prolongar as meias-vidas in vivo. Exemplos de polímeros biocompatíveis incluem um polímero solúvel em água, tal como polietileno glicol (PEG) ou seus derivados e polímeros biocompatíveis que contêm zwitterion (por exemplo, um polímero que contém fosforilcolina).
[00126] Em algumas modalidades, o agente é um oligonucleotídeo, como oligonucleotídeos antissenso.
[00127] Em outro aspecto, a invenção fornece um conjugado do anticorpo como aqui descrito, em que o conjugado compreende a fórmula: anticorpo-(marcador que contém glutamina doadora de acila)- (ligante)-(agente citotóxico), em que marcador que contém glutamina doadora de acila é manipulado em um sítio específico do anticorpo (por exemplo, em uma terminação carboxila da cadeia pesada ou leve, após o resíduo T135 na cadeia pesada de anticorpo ou em outro sítio), em que o marcador é conjugado a um ligante (por exemplo, um ligante contendo uma ou mais aminas reativas (por exemplo, amina primária NH2)) e em que o ligante é conjugado com um agente citotóxico (por exemplo, MMAD ou outras auristatinas, como 0101, 0131 ou 3377).
[00128] Exemplos de um ligante que contém uma ou mais aminas reativas incluem, mas não estão limitados a Ac-Lys-Gly (acetil-lisina- glicina), ácido aminocaproico, Ac-Lys-β-Ala (acetil-lisina-β-alanina), amino-PEG2 (polietileno glicol)-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2 (ou amino PEG6-propionil), Ac-Lys-Val-Cit-PABC (acetil-lisina-valina- citrulina-p-aminobenziloxicarbonil), amino-PEG6-C2-Val-Cit-PABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2- aminoetóxi)etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2-aminoetóxi)etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis- Val-Cit-PABC, putrescina ou Ac-Lys-putrescina.
[00129] Em algumas modalidades, o (ligante)-(agente citotóxico) é
N2-acetil-L-lisil-L-valil-N5-carbamoil-N-[4-({[(2-{[({(8S)-8-(clorometil))-6- [(3-{[(1S)-1-(clorometil))-8-metil-5-(fosfonoóxi) -1, 6-di-hidropirrolo [3,2- e] indol-3(2H)-il]carbonil}biciclo[1.1.1]pent-1-il)carbonil]-1-metil-3,6,7,8- tetra-hidropirrolo [3,2-e] indol-4-il}óxi)carbonil] (metil) amino} etil) (metil) carbamoil]oxi}metil)fenil]-L-ornitinamida, fórmula molecular C63H82Cl2N13015P, que possui a estrutura:
[00130] Em algumas modalidades, o (ligante)-(agente citotóxico) é o sal de ácido trifluoracético com a fórmula C63H82Cl2N13O15P, que possui a seguinte estrutura:
[00131] A fórmula para a forma de sal do ácido trifluoracético acima é C63H82CI2N13O15Pׄ ׄ.C2HF3O2.
[00132] Em algumas modalidades, o ADC é 1) anticorpo-LLQG (SEQ ID Nº: 78)-Ac-Lys-Val-Cit-PABC-CPI-8314. Em algumas modalidades, o marcador que contém glutamina doadora de acila que compreende, por exemplo, LLQG (SEQ ID Nº: 78) que substitui os resíduos de aminoácidos E294-N297 na cadeia pesada do anticorpo. Em algumas modalidades, o ADC compreende uma modificação de aminoácidos na posição K222 (na dobradiça). Em algumas modalidades, a modificação é K222R. Exemplos do anticorpo incluem, mas não estão limitados a h18G3, 18G3, h18G3, 16D6, h16D6, 3D1 e 20D7.
[00133] Em algumas modalidades, a invenção abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem anticorpos ou ADCs aqui descritos ou fabricados pelos métodos e com as características aqui descritas. Como usado aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos ou ADCs que se ligam a CD123. Estas composições podem ainda compreender excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica. Métodos de Uso dos Anticorpos anti-CD123 e seus ADCs
[00134] Os anticorpos e os ADCs da presente invenção são úteis em várias aplicações incluindo, mas não estão limitados a métodos de tratamento terapêutico e métodos de tratamento diagnóstico.
[00135] Em um aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de uma condição associada à expressão de CD123 em um indivíduo. Em algumas modalidades, o método de tratamento de uma condição associada à expressão de CD123 em um indivíduo compreende administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADcs, como aqui descrito. As condições associadas à expressão de CD123 incluem, mas não estão limitadas a expressão anormal de CD123, expressão de CD123 alterada ou aberrante, células malignas que expressam CD123 e um distúrbio proliferativo (por exemplo, câncer) ou distúrbio autoimune.
[00136] Consequentemente, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de um câncer em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, como aqui descrito.
Como usado aqui, o câncer pode ser, por exemplo, sem limitação, mieloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin nodular com predominância de linfócitos, doença de Kahler e Mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmocitoma, leucemia pró-linfocítica de células B, leucemia de células pilosas (HCL), linfoma não Hodgkin de células B (NHL), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia linfocítica aguda (LLA, B-ALL), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, Linfoma de Burkitt, linfoma de zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de célula B precursora, Neoplasia de Célula Dendríticas Plasmacitoide Blástica (BPDCN), leucemia mieloide, macroglobulienemia de Waldenstrom, linfoma difuso de células B grandes, linfoma da zona marginal, linfoma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de células B grandes mediastinais (tímicas), linfoplasma linfoplasmacítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma da zona marginal esplênica, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de efusão primário, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células T/histiócitos, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma cutâneo difuso primário de células B grandes (tipo perna), linfoma de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de células B grandes associado a inflamação, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHV8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico e outros linfomas relacionados às células B. Em algumas modalidades, o câncer é AML, B-ALL, BPDCN, NHL ou HCL.
[00137] Em algumas modalidades, é fornecido um método para inibir o crescimento ou a progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, compreendendo administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, conforme aqui descrito. Em outras modalidades, é fornecido um método para inibir as células de metástase que expressam CD123 em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição que compreendendo os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, conforme aqui descrito. Em outras modalidades, é fornecido um método para induzir a regressão do tumor em células malignas em um indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, conforme aqui descrito.
[00138] Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de um distúrbio autoimune em um indivíduo compreendendo a administração ao indivíduo necessitado de uma quantidade eficaz de uma composição que compreende os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs como aqui descrito.
[00139] Como usado aqui, os distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitados a lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, diabetes (Tipo I), esclerose múltipla, doença de Addison, doença celíaca, dermatomiosite, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, encefalopatia de Hashimoto, miastenia gravis, anemia perniciosa, artrite reativa, síndrome de Sjögren, encefalomielite disseminada aguda, agamaglobulinemia, esclerose lateral amiotrófica, espondilite anquilosante, síndrome antifosfolipídica, síndrome antissintetase, alergia atópica, dermatite atópica, enteropatia autoimune, anemia hemolítica autoimune, hepatite autoimune, doença autoimune do ouvido interno, síndrome linfoproliferativa autoimune, neuropatia periférica autoimune, pancreatite autoimune, síndrome poliendócrina autoimune, dermatite autoimune por progesterona, púrpura trombocitopênica autoimune, urticária autoimune, uveíte autoimune, doença de Bechet, doença de Castleman, doença de aglutinina fria, doença de Crohn, dermatomiosite, fascite eosinofílica, penfigoide gastrointestinal, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain- Barre, hidradenite supurativa, púrpura trombocitopênica idiopática, narcolepsia, pênfigo vulgar, anemia perniciosa, polimiosite, pênfigo vulgar, cirrose biliar primária, policondrite recidivante, febre reumática, arterite temporal, mielite transversa, colite ulcerativa, doença indiferenciada do tecido conjuntivo, vasculite e granulomatose de Wegener.
[00140] Em outro aspecto, a invenção fornece uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica), que compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, conforme descrito aqui para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123
ADCs, conforme descrito aqui para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, conforme descrito aqui para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, é fornecida uma quantidade eficaz de uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) que compreende os anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, conforme descrito aqui para induzir regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123
[00141] Em outro aspecto, a invenção fornece os anticorpos anti- CD123 ou CD123 ADCs, como aqui descrito, para uso no tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCS como aqui descritos para inibir o crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, como aqui descritos para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo necessitado. Em algumas modalidades, são fornecidos os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCS como aqui descritos para induzir regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123
[00142] Em outro aspecto, a invenção fornece um uso dos anticorpos anti-CD123 ou dos CDC123 ADCs, como descrito aqui para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma condição (por exemplo, câncer ou distúrbio autoimune) associada à expressão de CD123. Em algumas modalidades, é fornecido o uso dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como aqui descrito para a fabricação de um medicamento para inibir o crescimento ou progressão do tumor. Em algumas modalidades, é fornecida uma utilização dos anticorpos anti-CD123 ou dos CD123 ADCs, como descrito aqui na fabricação de um medicamento para inibir a metástase de células malignas que expressam CD123. Em algumas modalidades, é fornecida uma utilização dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como aqui descrito para a fabricação de um medicamento para induzir regressão do tumor.
[00143] Em outro aspecto, é fornecido um método para detectar, diagnosticar e/ou monitorar uma condição associada à expressão de CD123. Por exemplo, os anticorpos anti-CD123 como aqui descritos podem ser marcados com uma porção detectável, tal como um agente de imagem e um marcador de enzima-substrato. Os anticorpos como aqui descritos também podem ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo, tal como imagem in vivo (por exemplo, PET ou SPECT) ou um reagente de coloração.
[00144] Em algumas modalidades, os métodos aqui descritos compreendem ainda uma etapa de tratamento de um indivíduo com uma forma adicional de terapia. Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia é uma terapia anticâncer adicional, incluindo, mas não limitada a quimioterapia, radiação, cirurgia, terapia hormonal e/ou imunoterapia adicional.
[00145] Em algumas modalidades, a forma adicional de terapia compreende a administração de um ou mais agentes terapêuticos, além dos anticorpos anti-CD123 ou dos CDC CDC3, como aqui descrito. O um ou mais agentes terapêuticos podem ser, por exemplo, mas não se limitam a um segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti-VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) (por exemplo, AVASTIN®), um anticorpo anti-HER2 (por exemplo, HERCEPTINA®), um anticorpo anti-CD25, um anticorpo anti-CD33, um anticorpo anti-CD20 (por exemplo, RITUXAN®), um anticorpo anti- glicoproteína semelhante à mucina, um anticorpo anti-TNF, um anticorpo anti-PD-1 ou PD-L1, e/ou um anticorpo para receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) (por exemplo, ERBITUX®)), um inibidor da angiogênese, um agente citotóxico (por exemplo, antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarubicina, valrubicina e mitoxantrona), taxano (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), dolastatina, duocarmicina, enediina, geldanamicina, maitansina, puromicina, alcaloide da vinca (por exemplo, vincristina), um inibidor da topoisomerase (por exemplo, etoposídeo), tubulisina, um análogo de pirimidina (por exemplo, fluorouracil), agentes contendo platina (por exemplo, cisplatina, carboplatina e oxaliplatina), agentes alquilantes (por exemplo, melfalan, ciclofosfamida ou carmustina) e hemiasterlin), agente imunomodulador (por exemplo, prednisona), um agente anti- inflamatório (por exemplo, dexametasona), um inibidor da aromatase (por exemplo, anastrozol, exemestano, letrozol, vorozol, formestano ou testolactona), um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomib tal como VELCADE® ácido ([(1R)-3-metil-1-[[(2S)-1-oxo-3-fenil-2- [(pirazinilcarbonil) amino]propil-amino]butil] borônico) e outros agentes tais como o tamoxifeno.
[00146] Por exemplo, em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de LMA, que compreende administrar a um indivíduo necessitado uma quantidade eficaz de uma composição compreendendo os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, conforme aqui descrito e um outro agente terapêutico, como um agente quimioterapêutico ou talidomida ou seu derivado (por exemplo, lenalidomida). Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é selecionado do grupo que consiste em bortezomib (por exemplo, VELCADE®), melfalan, prednisona, doxorrubicina, lenalidomida, talidomida, prednisona, carmustina, etoposídeo, cisplatina, ciclofosfamida e vincristina. Em algumas modalidades, o outro agente terapêutico é o bortezomib (por exemplo, VELCADE®), melfalan ou prednisona. Em algumas modalidades, o indivíduo é recidivante ou refratário à terapia prévia contra AML.
[00147] O anticorpo anti-CD123 ou os CD123 ADCs podem ser administrados a um indivíduo por qualquer via adequada. Deverá ser entendido pelas pessoas versadas na técnica que os exemplos aqui descritos não pretendem ser limitantes, mas ilustrativos das técnicas disponíveis. Por conseguinte, em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC é administrado a um indivíduo de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa, por exemplo, em bolus ou por infusão contínua durante um período de tempo, por via intramuscular, intraperitoneal, intracerebrospinal, intracraniana, transdérmica, subcutânea, intra-articular, sublingual, intra-sinovial, através de insuflação, intratecal, oral, inalação ou tópica. A administração pode ser sistêmica, por exemplo, administração intravenosa ou localizada. Nebulizadores comercialmente disponíveis para formulações líquidas, incluindo nebulizadores a jato e nebulizadores ultrassônicos são úteis para administração. As formulações líquidas podem ser diretamente nebulizadas e o pó liofilizado pode ser nebulizado após a reconstituição. Alternativamente, o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC pode ser aerossolizado usando uma formulação de fluorocarboneto e um inalador dosimetrado, ou inalado como um pó liofilizado e moído.
[00148] Em uma modalidade, o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC é administrado através de técnicas de liberação específicas para o sítio ou direcionadas ao local. Exemplos de técnicas de liberação específicas para o sítio ou direcionadas ao local incluem várias fontes de depósito implantáveis do anticorpo Trop ou do CD123 ADC ou cateteres para liberação local, tais como cateteres de infusão, cateteres de permanência ou cateteres de agulha, enxertos sintéticos, bandas adventícias, derivações e stents ou outros dispositivos implantáveis, veículos específicos para o local, injeção direta ou aplicação direta. Veja, por exemplo, a Publicação PCT No. WO 00/53211 e Pat. No. 5.981.568.
[00149] Várias formulações do anticorpo anti-CD123 ou do CD123 ADC podem ser usadas para administração. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC pode ser administrado puro. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 (ou o CD123 ADC) e um excipiente farmaceuticamente aceitável podem estar em várias formulações. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou agir como um diluente. Os excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a agentes estabilizantes, umectantes e emulsificantes, sais para variar a osmolaridade l, agentes de encapsulação, tampões e intensificadores de penetração na pele. Excipientes, assim como formulações para administração parenteral e não parenteral de medicamentos, são apresentados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed. Mack Publishing, 2005.
[00150] Em algumas modalidades, esses agentes são formulados para administração por injeção (por exemplo, por via intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). Por conseguinte, estes agentes podem ser combinados com veículos farmaceuticamente aceitáveis, tais como solução salina, solução de Ringer, solução de dextrose e similares. O regime de dosagem específico, isto é, dose, tempo e repetição, dependerá do indivíduo em particular e do histórico médico desse indivíduo.
[00151] Os anticorpos anti-CD123 ou os CD123 ADCs, como aqui descritos, podem ser administrados utilizando qualquer método adequado, inclusive por injeção (por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intramuscular, etc.). O anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC também pode ser administrado por inalação, como aqui descrito. Geralmente, para administração de um anticorpo anti- CD123 e um CD123 ADC, uma dosagem candidata inicial pode ser de cerca de 2 mg/kg. Para os fins da presente invenção, uma dosagem diária típica pode variar entre cerca de 3 g/kg a 30 g/kg a 300 g/kg a 3 mg/kg, a 30 mg/kg, a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Por exemplo, pode ser utilizada uma dose de cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg e cerca de 25 mg/kg. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas ou até que níveis terapêuticos suficientes sejam alcançados, por exemplo, para inibir ou retardar o crescimento/progressão do tumor ou a metástase das células cancerígenas. Um regime de dosagem exemplificador compreende a administração de uma dose inicial de cerca de 2 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg/kg do anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC, ou seguida por uma dose de manutenção de cerca de 1 mg/kg em semanas alternadas. Outro regime de dosagem exemplificador compreende a administração de uma dose inicial de cerca de 0,21, cerca de 0,5 ou cerca de 0,8 mg/kg a cada semana ou a cada três semanas. Outro regime de dosagem exemplificador compreende a administração de doses crescentes (por exemplo, dose inicial de 1 mg/kg e aumento gradual para uma ou mais doses mais altas a cada semana ou período de tempo mais longo). Outros regimes de dosagem também podem ser úteis, dependendo do padrão de decaimento farmacocinético que o médico deseja alcançar. Por exemplo, em algumas modalidades, a dosagem de uma a quatro vezes por semana é contemplada. Em outras modalidades, é contemplada a dosagem uma vez por mês ou uma vez a cada dois meses ou a cada três meses. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem (incluindo o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC usado) pode variar ao longo do tempo.
[00152] Para os propósitos da presente invenção, a dosagem apropriada de um anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC dependerá do anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC (ou composições dos mesmos) empregado, o tipo e a gravidade dos sintomas a serem tratados, se o agente é administrado para fins terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico e resposta do indivíduo ao agente, taxa de depuração no indivíduo para o agente administrado e a critério do médico assistente. Tipicamente, o clínico administrará um anticorpo anti-CD123 ou um CD123 ADC até que uma dosagem seja alcançada que atinja o resultado desejado. A dose e/ou a frequência podem variar ao longo do tratamento. Considerações empíricas, tais como a meia-vida, geralmente contribuirão para a determinação da dosagem. Por exemplo, anticorpos que são compatíveis com o sistema imunológico humano, tais como anticorpos humanizados ou anticorpos totalmente humanos, podem ser utilizados para prolongar a meia-vida do anticorpo e impedir que o anticorpo seja atacado pelo sistema imunológico do hospedeiro. A frequência da administração pode ser determinada e ajustada ao longo da terapia e é geralmente, mas não necessariamente, com base no tratamento e/ou supressão e/ou melhora e/ou retardo dos sintomas, por exemplo, inibição ou retardo no crescimento do tumor, etc. Alternativamente, as formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para alcançar liberação sustentada são conhecidos na técnica.
[00153] Em uma modalidade, as dosagens para um anticorpo anti- CD123 ou CD123 ADC podem ser determinadas empiricamente em indivíduos aos quais foram dadas uma ou mais administrações do anticorpo anti-CD123 ou seu CD123 ADC. Os indivíduos recebem doses crescentes de um anticorpo anti-CD123 ou um antagonista de CD123. Para avaliar a eficácia, um indicador da doença pode ser seguido.
[00154] A administração de um anticorpo anti-CD123 ou de CD123 ADC de acordo com o método da presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, da condição fisiológica do destinatário, se o objetivo da administração é terapêutico ou profilático e outros fatores conhecidos para profissionais qualificados. A administração de um anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC pode ser essencialmente contínua durante um período de tempo pré- selecionado ou pode estar em uma série de doses espaçadas.
[00155] Em algumas modalidades, mais do que um anticorpo anti- CD123 ou CD123 ADC podem estar presentes. Pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADC diferentes ou mais podem estar presentes. Geralmente, esses anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs podem ter atividades complementares que não afetem adversamente um ao outro. Por exemplo, um ou mais dos seguintes anticorpos anti- CD123 podem ser utilizados: um primeiro anticorpo anti-CD123 direcionado para um epítopo em CD123 e um segundo anticorpo anti- CD123 direcionado para um epítopo diferente em CD123.
[00156] As formulações terapêuticas do anticorpo anti-CD123 ou
CD123 ADC utilizadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura de um anticorpo com o grau de pureza desejado com veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21 Ed. Mack Publishing, 2005), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e podem compreender tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; sais como cloreto de sódio; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos, como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS ™ ou polietilenoglicol (PEG).
[00157] Os lipossomas contendo o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC são preparados por métodos conhecidos na técnica, tais como descritos em Epstein et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688, 1985; Hwang et ai., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030, 1980; e Pat.
4.485.045 e 4.544.545. Os lipossomas com tempo de circulação aumentado são descritos na Pat. 5.013.556. Lipossomas particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa com uma composição lipídica que compreende fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivatizada com PEG (PEG-PE). Os lipossomas são extrusados através de filtros de tamanho de poro definido para produzir lipossomas com o diâmetro desejado.
[00158] Os ingredientes ativos também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, micro-emulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macro-emulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Ed. Mack Publishing, 2005.
[00159] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool poli(vinílico)), polilactides (Patente US Nº. 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e 7 etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros degradáveis de ácido lático-ácido glicólico, tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolide), isobutirato de acetato de sacarose e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[00160] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente conseguido, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. As composições terapêuticas de anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC são geralmente colocadas em um recipiente com uma porta de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frasco de solução intravenosa com uma rolha que possa ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00161] As composições de acordo com a presente invenção podem estar em formas de dosagem unitárias, tais como comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões ou supositórios, para administração oral, parenteral ou retal, ou administração por inalação ou insuflação.
[00162] Para preparar as composições sólidas, tais como comprimidos, o ingrediente ativo principal é misturado com um veículo farmacêutico, por exemplo, ingredientes convencionais para comprimidos, tais como amido de milho, lactose, sacarose, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, fosfato dicálcico ou gomas e outros diluentes farmacêuticos, por exemplo, água, para formar uma pré-formulação de uma composição sólida que contém uma mistura homogênea de um composto da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável não tóxico do mesmo. Ao se referir a estas composições de pré-formulação como homogêneas, é entendido que o ingrediente ativo é disperso uniformemente por toda a composição, de modo que a composição possa ser facilmente subdividida em formas de dosagem unitária igualmente eficazes, tais como comprimidos, pílulas e cápsulas. Esta composição de pré- formulação sólida é então subdividida em formas de dosagem unitárias do tipo descrito acima, contendo de 0,1 a cerca de 500 mg do ingrediente ativo da presente invenção. Os comprimidos ou pílulas da nova composição podem ser revestidos ou compostos de outra maneira para proporcionar uma forma de dosagem que ofereça a vantagem de ação prolongada. Por exemplo, o comprimido ou pílula pode compreender um componente de dosagem interna e um de dosagem externa, estando o último na forma de um envelope sobre o anterior. Os dois componentes podem ser separados por uma camada entérica que serve para resistir à desintegração no estômago e permite que o componente interno passe intacto para o duodeno ou tenha sua liberação retardada. Uma variedade de materiais pode ser usada para tais camadas ou revestimentos entéricos, tais materiais incluindo vários ácidos poliméricos e misturas de ácidos poliméricos com materiais tais como goma-laca, álcool cetílico e acetato de celulose.
[00163] Agentes tensoativos adequados incluem, em particular, agentes não iônicos, tais como polioxietilenosorbitanas (por exemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 ou 85) e outras sorbitanas (por exemplo Span™ 20, 40, 60, 80 ou 85). As composições com um agente tensoativo compreenderão convenientemente entre 0,05 e 5% do agente tensoativo e podem estar entre 0,1 e 2,5%. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo manitol ou outros veículos farmaceuticamente aceitáveis, se necessário.
[00164] Emulsões adequadas podem ser preparadas usando emulsões graxas disponíveis comercialmente, tais como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ e Lipiphysan™. O ingrediente ativo pode ser dissolvido em uma composição de emulsão pré- misturada ou, alternativamente, pode ser dissolvido em um óleo (por exemplo, óleo de soja, óleo de cártamo, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de milho ou óleo de amêndoa) e uma emulsão formada por mistura com um fosfolipídeo (por exemplo, fosfolípideos do ovo, fosfolípideos de soja ou lecitina de soja) e água. Será apreciado que outros ingredientes podem ser adicionados, por exemplo glicerol ou glicose, para ajustar a tonicidade da emulsão.
Emulsões adequadas conterão tipicamente até 20% de óleo, por exemplo, entre 5 e 20%. A emulsão graxa pode compreender gotículas de gordura entre 0,1 e 1 µm, particularmente 0,1 e 0,5 µm e tem um pH na faixa de 5,5 a 8,0.
[00165] As composições de emulsão podem ser aquelas preparadas pela mistura de um anticorpo anti-CD123 ou um CD123 ADC com Intralipid™ ou seus componentes (óleo de soja, fosfolipídios de ovo, glicerol e água).
[00166] As composições para inalação ou insuflação incluem soluções e suspensões em solventes aquosos ou orgânicos farmaceuticamente aceitáveis ou suas misturas e pós. As composições líquidas ou sólidas podem conter excipientes farmaceuticamente aceitáveis adequados, como estabelecido acima. Em algumas modalidades, as composições são administradas pela via respiratória oral ou nasal para efeito local ou sistêmico. As composições em solventes preferivelmente estéreis farmaceuticamente aceitáveis podem ser nebulizadas pelo uso de gases. As soluções para nebulização podem ser respiradas diretamente do dispositivo de nebulização ou o dispositivo de nebulização pode ser conectado a uma máscara facial, tenda ou aparelho de respiração com pressão positiva intermitente. As composições de solução, suspensão ou pó podem ser administradas, preferencialmente por via oral ou nasal, a partir de dispositivos que administram a formulação de maneira apropriada.
COMPOSIÇÕES
[00167] As composições utilizadas nos métodos da invenção compreendem uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD123 ou um CD123 ADC como aqui descrito. Exemplos de tais composições, assim como a formulação, também são descritos em uma seção anterior e abaixo. Em algumas modalidades, a composição compreende um ou mais anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs. Por exemplo, o anticorpo anti-CD123 reconhece CD123 humano. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 é um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 compreende uma região constante que é capaz de desencadear uma resposta imune desejada, tal como a lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD123 compreende uma região constante que não desencadeia uma resposta imune inesperada ou indesejável, tal como a lise mediada por anticorpo ou ADCC. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD123 compreende uma ou mais CDR(s) do anticorpo (tal como uma, duas, três, quatro, cinco ou, em algumas modalidades, todas as seis CDRs).
[00168] É entendido que as composições podem compreender mais do que um anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC (por exemplo, uma mistura de anticorpos anti-CD123 que reconhecem diferentes epítopos de CD123). Outras composições exemplificadoras compreendem mais do que um anticorpo anti-CD123 ou CD123 ADC que reconhecem o mesmo epítopo ou diferentes espécies de anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADC que se ligam a diferentes epítopos de CD123 (por exemplo, CD123 humano).
[00169] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD123 pode ser administrado em combinação com a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Estes incluem, entre outros, a administração de um agente quimioterapêutico, uma vacina, uma terapia baseada em célula CAR-T, radioterapia, uma terapia com citocina, uma vacina, um anticorpo biespecífico para CD123, um inibidor de outras vias imunossupressoras, um inibidores da angiogênese, um ativador de células T, um inibidor de uma via metabólica, um inibidor de mTOR, um inibidor de uma via de adenosina, um inibidor de tirosina-quinase que inclui mas não limita a inlyta, inibidores de ALK e sunitinib, inibidor de BRAF, um modificador epigenético, um inibidor de IDO1, um inibidor ou depletor de células Treg e/ou de células supressoras derivadas de células mieloides, um inibidor de JAK, um inibidor de STAT, um inibidor de quinase dependente de ciclina, um agente bioterapêutico (incluindo mas não limitado a anticorpos para VEGF, VEGFR, EGFR, Her2/neu, outros receptores de fator de crescimento, CD20, CD40, CD-40L, CTLA-4, OX-40, 4-1 BB, CD123, PD-L1, TIGIT e ICOS), um agente imunogênico (por exemplo, células cancerígenas atenuadas, antígenos tumorais, células que apresentam antígeno tais como células dendríticas pulsadas com antígeno derivado de tumor ou ácidos nucléicos, citocinas imuno-estimulantes (por exemplo, IL-2, IFNα2, GM-CSF) e células transfectadas com genes que codificam citocinas imuno-estimulantes, tais como, sem limitação, GM-CSF). Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes tais como tiotepa e ciclosfosfamida; alquilsulfonatos tais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bullatacin e bullatacinone); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatina; calistatina; CC- 1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina e bizelesína); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictiina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina,
fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediinas (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 1l e caliqueamicina phil1, veja, por exemplo, Agnew, Chem.
Intl.
Ed.
Engl., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; assim como cromóforo da neocarzinostatina e cromóforos de antibióticos relacionados à cromoproteína enediina), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicina, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina (incluindo morfolino-doxorrubicina, cianomorfolino-doxorrubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), doxorrubicina lipossomal peguilada, epirrubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tais como metotrexate e 5- fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexate, pteropterina, trimetrexate; análogos de purina tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor de ácido fólico, como ácido frolínico; aceglatone; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformitina; acetato de eliptinio; um epotilone; etoglucid; nitrato de gálio; hidroxiureia;
lentinano; lonidamina; maitansinoides tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2- etil-hidrazida; procarbazina; razoxano; rizoxina; sizofurano; espirogermanio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2, 2',2 "- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosídeo (" Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por exemplo, paclitaxel e doxetaxel; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexate; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposideo (VP-16); vinorelbina; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tais como ácido retinoico; capecitabina; e quaisquer sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
Também estão incluídos agentes anti-hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal em tumores tais como anti- estrógenos e moduladores seletivos de receptores de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno, raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY1 17018, onapristona e toremifeno (Fareston); inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas suprarrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol, exemestano, formestano, fadrozol, vorozol, letrozol e anastrozol; e anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de qualquer um dos acima.
[00170] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com um ou mais outros agentes terapêuticos direcionados a um modulador de checkpoint imune, tal como, por exemplo, sem limitação um agente direcionado a CD123, PD-1, PD- L1, CTLA-4, LAG-3, B7-H3, B7-H4, B7-DC (PD-L2), B7-H5, B7-H6, B7- H8, B7-H2, B7-1, B7-2, ICOS, ICOS-L, TIGIT, CD2, CD47, CD80, CD86, CD48, CD58, CD226, CD155, CD1 12, LAIR1, 2B4, BTLA, CD160, TIM1, TIM-3, TIM4, VISTA (PD-H1), OX40, OX40L, GITR, GITRL, CD70, CD27, 4-1BB, 4-BBL, DR3, TL1A, CD40, CD40L, CD30, CD30L, LIGHT, HVEM, SLAM (SLAMF1, CD150), SLAMF2 (CD48), SLAMF3 (CD229), SLAMF4 ( 2B4, CD244), SLAMF5 (CD84), SLAMF6 (NTB-A), SLAMCF7 (CS1), SLAMF8 (BLAME), SLAMF9 (CD2F), CD28, CEACAM1 (CD66a), CEACAM3, CEACAM4, CEACAM5, CEACAM6, CEACAM7, CEACAM1 -3AS CEACAM3C2, CEACAM1- 15, PSG1-11, CEACAM1-4C1, CEACAM1-4S, CEACAM1-4L, IDO, TDO, CCR2, CD39-CD73-adenosina (A2AR), BTKs, TIKs, CXCR2, CCR4, CCR8, CCR5, via de VEGF, CSF-1 ou um modulador da resposta imune inata.
Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD123 é usado em conjunto com, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-PD-L1, como, por exemplo, BMS-936559 (MDX-1105; um anticorpo anti-CD123, como por exemplo, nivolumab, pembrolizumab e pidilizumab; um anticorpo antagonista anti-CTLA-4, tal como por exemplo ipilimumab; um anticorpo antagonista anti-LAG- 3, tal como BMS-986016 e IMP701; um anticorpo antagonista anti- TIM-3; um anticorpo antagonista anti-B7-H3 tal como, por exemplo, MGA271; anticorpo antagonista anti-VISTA; anticorpo antagonista anti- TIGIT; anticorpo antagonista anti-CD28; anticorpo anti-CD28; anticorpo anti-CD80; anticorpo anti-CD86; anticorpo antagonista anti-B7-H4; um anticorpo agonista anti-ICOS; um anticorpo agonista anti-CD28; um modulador de resposta imune inata (por exemplo, TLRs, KIR, NKG2A)
e um inibidor de IDO. Em algumas modalidades, um anticorpo anti- CD123 é usado em conjunto com um agonista de 4-1BB (CD137), tal como, por exemplo, PF-05082566 ou BMS-663513. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com um agonista de OX40, tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti- OX-40. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com um agonista de GITR, tal como, por exemplo, um anticorpo agonista anti-GITR, tal como, por exemplo, sem limitação, TRX518. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com um inibidor de IDO. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com uma terapia de citocinas, tal como, por exemplo, sem limitação, IL-15, CSF-1, MCSF- 1, etc
[00171] Em algumas modalidades, um anticorpo anti-CD123 é usado em conjunto com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tal como, por exemplo, sem limitação, um anticorpo direcionado para CD19, CD22, CD40, CD40, CD52 ou CCR4.
[00172] Em algumas modalidades, a terapia com anticorpo anti- CD123 pode preceder ou seguir o tratamento com outro agente por intervalos que variam de minutos a semanas. Nas modalidades em que os outros agentes e/ou proteínas ou polinucleotídeos são administrados separadamente, geralmente se assegura que um período de tempo significativo não expire entre cada liberação, de modo que o agente e a composição da presente invenção ainda sejam capazes de exercer um efeito vantajoso combinado sobre o indivíduo. Em tais circunstâncias, é contemplado que se possa administrar ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24 h uma da outra e, mais preferivelmente, dentro de cerca de 6-12 h uma da outra. Entretanto, em algumas situações, pode ser desejável estender o período de administração significativamente, onde vários dias (2, 3, 4,
5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) decorrem entre as respectivas administrações.
[00173] Em algumas modalidades, uma composição de anticorpo anti-CD123 compreende um segundo agente selecionado de crizotinib, palbociclib, gemcitabina, ciclofosfamida, fluorouracil, FOLFOX, ácido folínico, oxaliplatina, axitinib, malato de sunitinib, tofacitinib, bevacizumabe, rituximab e traztuzumab.
[00174] Em algumas modalidades, uma composição de anticorpo anti-CD123 é combinada com um regime de tratamento que compreende ainda uma terapia tradicional selecionada do grupo que consiste em: cirurgia, terapia de radiação, quimioterapia, terapia direcionada, imunoterapia, terapia hormonal, inibição da angiogênese e cuidados paliativos.
[00175] A composição usada na presente invenção pode ainda compreender veículos, excipientes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21 ed., 2005, Lippincott Williams e Wilkins, Ed. KE Hoover), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações e podem compreender tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina,
arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrans; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, Complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG). Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são adicionalmente descritos aqui. POLINUCLEOTÍDEOS, VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[00176] A invenção também fornece polinucleotídeos isolados que codificam os anticorpos da invenção e vetores e células hospedeiras que compreendem o polinucleotídeo. Em outro aspecto, a invenção fornece composições (tais como composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos aqui descritos. Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos.
[00177] Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais sequências também são abrangidos pela presente invenção. Os polinucleotídeos podem ser de fita simples (codificadora ou antissenso) ou de fita dupla e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. As moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de maneira individual, e moléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Sequências codificadoras ou não codificadoras adicionais podem, mas não precisam, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas não precisa, estar ligado a outras moléculas e/ou materiais de suporte.
[00178] Os polinucleotídeos podem compreender uma sequência nativa (isto é, uma sequência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção do mesmo) ou pode compreender uma variante dessa sequência. As variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções, de modo que a imuno-reatividade do polipeptídeo codificado não seja diminuída em relação a uma molécula imunorreativa nativa. O efeito na imuno- reatividade do polipeptídeo codificado pode geralmente ser avaliado como aqui descrito. As variantes exibem preferivelmente pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80% de identidade, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90% de identidade e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% de identidade com uma sequência de polinucleotídeos que codifica um anticorpo nativo ou uma porção deste.
[00179] Duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos são ditas serem "idênticas" se a sequência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas sequências for a mesma quando alinhada para correspondência máxima como descrito abaixo. As comparações entre duas sequências são normalmente realizadas pela comparação das sequências em uma janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. Uma "janela de comparação", como aqui utilizada, se refere a um segmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente 30 a cerca de 75 ou 40 a cerca de 50, nas quais uma sequência pode ser comparada a uma sequência de referência com o mesmo número de posições contíguas após as duas sequências estarem otimamente alinhadas.
[00180] O alinhamento ótimo das sequências para comparação pode ser conduzido usando o programa Megalign no pacote Lasergene de programas de bioinformática (DNASTAR, Inc., Madison, Wl), usando parâmetros padronizados. Este programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referências: Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626- 645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
[00181] Preferivelmente, o "percentual de identidade de sequência" é determinado pela comparação de duas sequências otimamente alinhadas em uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (ou seja, lacunas) de 20% ou menos, geralmente de 5 a 15% ou 10 a 12%, em comparação com as sequências de referência (que não compreendem adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. O percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais as bases de ácido nucleico idênticas ou o resíduo de aminoácido ocorrem em ambas as sequências para fornecer o número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na sequência de referência (ou seja, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para gerar o percentual de identidade da sequência.
[00182] As variantes também podem, ou alternativamente, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou a uma porção ou complemento deste. Tais variantes de polinucleotídeos são capazes de hibridizar sob condições moderadamente estringentes com uma sequência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma sequência complementar).
[00183] As "condições moderadamente estringentes" adequadas incluem a pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 10 mM (pH 8,0); hibridização a 50° C-65°C, 5 X SSC, durante a noite; seguida por duas lavagens a 65°C por 20 minutos com SSC 2X, 0,5X e 0,2X contendo SDS 0,1%.
[00184] Como aqui utilizado, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M/ citrato de sódio 0,0015 M/dodecilsulfato 0,1% a 50ºC; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina de soro bovino 0,1%/ Ficoll 0,1%/ polivinilpirrolidona 0,1%/tampão fosfato de sódio 50 mM em pH 6,5 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida 50%, 5 x SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 µg/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextran a 10% a 42°C, com lavagens em 42°C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) e formamida 50% a 55°C, seguido de uma lavagem de alta estringência que consiste em 0,1 x SSC contendo EDTA a 55°C. Aquele versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, força iônica etc., conforme necessário, para acomodar fatores tais como o comprimento da sonda e similares.
[00185] Será apreciado por aqueles versados na técnica que, como resultado da degeneração do código genético, existem muitas sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, como descrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos apresentam uma homologia mínima com a sequência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças na utilização de códons são especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, os alelos dos genes que compreendem as sequências de polinucleotídeos aqui fornecidas estão dentro do escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não precisam, ter uma estrutura ou função alterada. Os alelos podem ser identificados usando técnicas padronizadas (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de sequência de banco de dados).
[00186] Os polinucleotídeos desta invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Os métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem conhecidos na técnica e não precisam ser descritos em detalhes aqui. Aquele versado na técnica pode usar as sequências aqui fornecidas e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma sequência de DNA desejada.
[00187] Para preparar polinucleotídeos usando métodos recombinantes, um polinucleotídeo que compreende uma sequência desejada pode ser inserido em um vetor adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada para replicação e amplificação, como discutido aqui mais adiante. Os polinucleotídeos podem ser inseridos nas células hospedeiras por qualquer meio conhecido na técnica. As células são transformadas pela introdução de um polinucleotídeo exógeno por captação direta, endocitose, transfecção, F-mating ou eletroporação. Uma vez introduzido, o polinucleotídeo exógeno pode ser mantido dentro da célula como um vetor não integrado (tal como um plasmídeo) ou integrado ao genoma da célula hospedeira. O polinucleotídeo assim amplificado pode ser isolado da célula hospedeira por métodos bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989.
[00188] Alternativamente, a PCR permite a reprodução de sequências de DNA. A tecnologia de PCR é bem conhecida e está descrita nas Patentes U.S. Nos. 4.683.195, 4.800.159, 4.754.065 e
4.683.202, assim como PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994.
[00189] O RNA pode ser obtido usando o DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula se replica e o DNA é transcrito para RNA, o RNA pode então ser isolado usando métodos bem conhecidos daqueles versados na técnica, como descrito em Sambrook et al., 1989, supra, por exemplo.
[00190] Os vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padronizadas ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica. Embora o vetor de clonagem selecionado possa variar de acordo com a célula hospedeira a ser usada, os vetores de clonagem úteis geralmente têm a capacidade de auto-replicar, podem possuir um único alvo para uma endonuclease de restrição específica e/ou podem transportar genes para um marcador que pode ser usado na seleção de clones que contêm o vetor. Exemplos adequados incluem plasmídeos e vírus bacterianos, por exemplo, pUC18, pUC19, Bluescript (por exemplo, pBS SK+) e seus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, DNAs de fago e vetores shuttle, como pSA3 e pAT28. Esses e muitos outros vetores de clonagem são disponibilizados por fornecedores comerciais, como BioRad, Strategene e Invitrogen.
[00191] Os vetores de expressão são geralmente construtos de polinucleotídeos replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implícito que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras como epissomas ou como parte integrante do DNA cromossômico. Os vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a vetores virais, incluindo adenovírus, vírus adeno-associados, retrovírus, cosmídeos e vetores de expressão descritos na Publicação PCT Nº WO 87/04462. Os componentes do vetor geralmente podem incluir, mas não estão limitados a um ou mais dos seguintes itens: uma sequência de sinal; uma origem de replicação; um ou mais genes marcadores; elementos de controle transcricionais adequados (tais como promotores, intensificadores e terminadores). Para expressão (isto é, tradução), um ou mais elementos de controle de tradução também são geralmente necessários, tais como sítios de ligação ao ribossomo, sítios de iniciação da tradução e códons de parada.
[00192] Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextran ou outras substâncias; bombardeio de micro-projéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso como o vírus Vaccinia). A escolha entre introduzir vetores ou polinucleotídeos dependerá frequentemente das características da célula hospedeira.
[00193] A invenção também fornece células hospedeiras que compreendem qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos. Quaisquer células hospedeiras capazes de super-expressar DNAs heterólogos podem ser usadas com o objetivo de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não limitantes de células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não estão limitados a células COS, HeLa e CHO. Veja também a Publicação PCT Nº WO 87/04462. As células hospedeiras de não mamíferos adequadas incluem procariotos (tais como E. coli ou B. subtillis) e leveduras (como S. cerevisae, S. pombe; ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente, 10 vezes maior, ainda mais preferivelmente, 20 vezes maior que o do anticorpo ou proteína endógena correspondente de interesse, se presente, nas células hospedeiras. O rastreamento das células hospedeiras quanto a uma ligação específica a CD123 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou a proteína de interesse pode ser identificada.
KITS
[00194] A invenção também fornece kits para uso nos presentes métodos. Os kits da invenção incluem um ou mais recipientes que compreendem o anticorpo anti-CD123 ou o CD123 ADC, como descrito aqui e instruções para uso de acordo com qualquer um dos métodos da invenção aqui descritos. Geralmente, estas instruções compreendem uma descrição da administração do anticorpo anti- CD123 ou do CD123 ADC para os tratamentos terapêuticos descritos acima.
[00195] As instruções relativas ao uso dos anticorpos anti-CD123 ou CD123 ADCs, como descrito aqui, geralmente incluem informações sobre a dosagem, regime de dosagem e via de administração para o tratamento pretendido. Os recipientes podem ser doses unitárias, embalagens a granel (por exemplo, embalagens com múltiplas doses) ou doses de subunidades. As instruções fornecidas nos kits da invenção são geralmente instruções escritas em uma bula ou folheto (por exemplo, uma folha de papel incluída no kit), mas instruções legíveis por máquina (por exemplo, instruções veiculadas por um disco de armazenamento magnético ou óptico) também são aceitáveis.
[00196] Os kits desta invenção estão em embalagens adequadas. A embalagem adequada inclui, mas não está limitada a ampolas, garrafas, frascos, embalagens flexíveis (por exemplo, Mylar selado ou bolsas de plástico) e similares. Também são contempladas embalagens para uso em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, um dispositivo de administração nasal (por exemplo, um atomizador) ou um dispositivo para infusão, tal como uma minibomba. Um kit pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco com uma rolha que pode ser perfurada por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um ingrediente ativo na composição é um anticorpo anti-CD123. O recipiente pode ainda compreender um segundo agente farmaceuticamente ativo.
[00197] Os kits podem opcionalmente fornecer componentes adicionais, como buffers e informações interpretativas. Normalmente, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula ou associados ao recipiente.
DEPÓSITO BIOLÓGICO
[00198] Os materiais representativos da presente invenção foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC) em 29 de junho de 2017. O vetor que possui o número de acesso ATCC PTA- 124283 é um polinucleotídeo que codifica uma sequência de cadeia pesada de um anticorpo anti-CD123 humanizado e o vetor com o número de acesso ATCC PTA-124284 é um polinucleotídeo que codifica uma sequência de cadeia leve do anticorpo anti-CD123 humanizado. Os depósitos foram feitos de acordo com as disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins de Procedimentos e Regulamentos de Patentes (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC nos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Pfizer Inc. e a ATCC, que garante disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante a emissão da patente U.S. pertinente ou ao disponibilizar para o público qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeira, o que ocorrer primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie para aqueles determinados pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks de acordo com 35 USC A Seção 122 e as regras do Comissário conforme a mesma (incluindo 37 C.F.R. Seção 1.14, com particular referência a 886 OG 638).
[00199] O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais depositados morrer ou for perdida ou destruída quando cultivada em condições adequadas, os materiais serão prontamente substituídos mediante notificação por outra igual. A disponibilidade do material depositado não deve ser interpretada como uma licença para praticar a invenção em violação dos direitos concedidos sob a autoridade de qualquer governo, de acordo com suas leis de patentes.
EXEMPLOS
[00200] Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da presente invenção de forma alguma. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas mostradas e descritas aqui, ficarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e estarão dentro escopo das reivindicações em anexo. Exemplo 1: Citotoxicidade in vitro de Conjugados de Anticorpo anti- CD123-Fármaco
[00201] Este exemplo ilustra a citotoxicidade de vários CD123 ADCs.
[00202] Neste estudo, a citotoxicidade de vários CD123 ADCs foi testada usando um ensaio de citotoxicidade 2D in vitro nas seguintes linhagens celulares de LMA: MOLM13, MV41 1, JVM3, Granata519, OCI-AML3, NB4 e HL60. A Tabela 4 indica o nível de expressão de CD123 para cada uma das respectivas células utilizadas. Tabela 4. Nível de expressão de CD123 em várias linhagens celulares de LMA Linhagem Celular OCI- MOLM13 MV411 JVM3 Granta519 NB4 HL60 AML3 Nível de Expressão +++ +++ ++ ++ + + - CD123
[00203] O primeiro grupo de ADCs testados foi o CD123 ADC conjugado à CPI com um ligante AcLysValCitPABC. Esses ADCs foram: 18G3-CPI, 16D6-CPI, 3D1-CPI e 20D7-CPI, cada um dos quais com uma Proporção de Anticorpo:Fármaco (DAR) de ~ 2. A preparação de CD123 ADCs é descrita em detalhes no Exemplo 5, infra. Uma IgG de controle (IgG que não se liga a CD123) com o agente CPI com um DAR de ~ 2 ("Neg.8.8") foi usada como controle negativo.
[00204] Para o ensaio de citotoxicidade 2D in vitro, as células AML foram incubadas com ADC ou controle nas seguintes doses: 100 ng/ml, 25 ng/ml, 6,25 ng/ml, 1,56 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,09 ng/ml, 0,024 ng/ml, 0,006 ng/ml, 0,002 ng/ml e 0,0004 ng/ml por 96 horas. A viabilidade celular foi medida com CelltiterGlo (Promega, Madison, Wl) e a luminescência foi determinada usando um leitor de placas Victor (Perkin Elmer, Waltham, MA). Os cálculos do valor de 50% de inibição (IC50) foram gerados usando ajuste de curva de 4 parâmetros XLfit (IDBS, Boston, MA). Os resultados estão resumidos na Tabela 5.
Tabela 5. Valores de IC50 de CD123-CPI ADC em células de LMA IC50 (ng/mL) em células de LMA
ADC MOLM13 MV411 JVM3 Granta519 OCI-AML3 NB4 HL60 63,92 ± 18G3-CPI 0,25 ± 0,04 0,41 ± 0,07 0,69 ± 0,22 0,38 ± 0,01 2,65 ± 0,12 >84,4 ± 33,30 36,08 16D6-CPI 0,22 ± 0,05 0,4 ± 0,15 0,59 ± 0,24 - - - >105,34 ± 94,66 3D1-CPI 0,33 ± 0,06 - - - - - >104,68 ± 95,32 20D7-CPI 0,32 ± 0,14 - - - - - - Neg.8.8-CPI >88,43 ± 18,66 >90,82 ± 8,64 >77 ± 14,3 >87,85 ± 12,14 >100 ± 0 >100 ± 0 >113,43 ± 19,09
[00205] Os resultados mostram que CD123-CPIs são citotóxicos para células que expressam CD123 e são mais citotóxicos que um CP1 não específico (Neg8.8-CPI). Por exemplo, nas células MOLM13, a IC50 de CD123 ADCs 18G3-CPI, 16D6-CPI e 3D1 -CPI é de 0,25 ± 0,04 ng/ mL, 0,22 ± 0,05 ng/mL, 0,33 ± 0,06 ng/mL e 0,32 ± 0,14 ng/mL, respectivamente. Por outro lado, a IC50 do Neg.8.8-CPI foi > 88,43 ± 18,66 (Tabela 5, última linha). O CPI Neg.8.8 com um DAR de ~ 2 foi substancialmente menos ativo nas doses mais altas testadas (Tabela 5, última linha). Os valores de IC50 dos CD123 ADCs indicados estão bem correlacionados com o nível de expressão de CD123 nas células (Tabelas 4 e 5). Por exemplo, a IC50 de 18G3-CPI nas células MV411 que expressam altos níveis de CD123 é de 0,41 ± 0,07. Em contraste, a IC50 de 18G3-CPI em células NB4 que expressam baixos níveis de CD123 é 63,92 ± 36,08 e a IC50 de 18G3- CPI em células HL60 que não expressam CD123 é > 84,4 ± 33,30.
[00206] CD123-18G3 ADC foi conjugado com um agente diferente, iPr-caliqueamicina ou o CTI (glicuronídeo) tem um efeito citotóxico semelhante. Os resultados do ensaio de citotoxicidade para 18G3 conjugado com iPr-caliqueamicina ("iPr") estão resumidos na Tabela 6. Os resultados do ensaio de citotoxicidade para 18G3 conjugado com CTI (glicuronídeo) estão resumidos na Tabela 7.
Tabela 6: Valores de IC50 de CD123-iPr ADC em cálulas de LMA IC50 (ng/mL) em células de LMA Linhagem Celular MOLM13 MV4-11 Nível de Expressão CD123 +++ +++ 18G 3- iPr 0,05075 ± 0.01 0,125 ± 0,06 Neg 8.8 -iPr 96,23 >100 Tabela 3: Valores de IC50 de CD123-CTI ADC em células de LMA IC50 (ng/mL) em células de LMA Granta51 OCI- Linhagem Celular MOLM13 MV411 JVM3 NB4 HL60 9 AML3 Nível de Expressão +++ +++ ++ ++ + + - CD123 0,33 ± 0,26 ± 1,3 ± 38,60 ± >100 ± 18G3-CTI 0,51 ± 0,06 2,58 ± 0,6 0,05 0,04 0,36 9,18 0 84,96 ± >100 ± Neg.8.8-CTI >100 ± 0 >100 ± 0 >100 ± 0 >100 ± 0 >100 ± 0 15,04 0
[00207] Estes dados demonstram que CD123-ADCs com um DAR de ~ 2 são ativos e induzem a morte celular em linhagens celulares de câncer que expressam CD123, mas inativos em células que não expressam CD123. Isso demonstra a potência e a especificidade desses ADCs. Exemplo 2: Via de sinalização da Interleucina-3 (IL-3) e citotoxicidade de anticorpos anti-CD123 e ADCs
[00208] Este exemplo ilustra a capacidade dos anticorpos anti- CD123 para bloquear a sinalização de IL-3 e a citotoxicidade dos CD123 ADCs.
[00209] Este estudo foi realizado para determinar se algum dos clones de anticorpo anti-CD123 se liga competitivamente aos sítios de ligação a IL-3 nas células TF-1 que expressam CD123/IL-3Rα. As células TF-1 que expressam CD123/IL-3Rα foram incubadas conjuntamente com 20 ng/ml de IL-3 e os seguintes anticorpos anti- CD123: 3D1, 18G3 e 16D6 com doses a 100 ng/ml, 25 ng/ml, 6,25 ng/ml, 1,56 ng/ml, 0,39 ng/ml, 0,09 ng/ml, 0,024 ng/ml, 0,006 ng/ml, 0,002 ng/ml e 0,0004 ng/ml. O anticorpo anti-CD123 7G3 foi usado como um anticorpo de referência que demonstrou bloquear a via de sinalização de IL-3 e o anticorpo Neg 8.8 foi usado como controle negativo. Para o ensaio CTG que mede a sobrevivência das células, as células foram tratadas durante quatro dias a 37°C. Após o período de tratamento, as células foram coletadas e a proteína preparada. Os níveis de STAT5, STAT5 fosforilada e actina foram analisados utilizando análise de Western blot. Os resultados de Western blot são mostrados na Figura 1
[00210] A presença da proteína de sinalização a jusante STAT5 fosforilada ("Fosfo-Stat5") indica a ativação da via de sinalização de IL-
3. O tratamento das células TF-1 com IL-3 sozinha ou com o anticorpo de controle anti-IL-3 mais o anticorpo de controle Neg.8.8 ("8.8") ativou a sinalização de IL-3, como mostrado pela presença de Fosfo-Stat5 (Figura 1). O tratamento com o anticorpo anti-CD123 7G3 bloqueia a sinalização de IL-3. O anticorpo anti-CD123 3D1 também bloqueou essa via. Em contraste, os anticorpos anti-CD123 18G3 e 16D6 não bloquearam a fosforilação de STAT5 mediada por IL-3.
[00211] As citotoxidades de CD123-18G3-CPI e CD123-16D6-CPI ainda são mantidas na presença de IL-3 (Tabela 8).
Tabela 8 IC50 (ng/mL) em células de LMA IL-3 (ng/ml) Neg.8.8-CPI CD123-18G3-CPI CD123-16D6-CPI Linhagem Celular MOLM13 0 44,24 ± 0,0 0,14 ± 0,0 0,23 ± 0,0 MOLM13 0,3 42,93 ± 0,0 0,12 ± 0,0 0,23 ± 0,0 MOLM13 1 28,38 ± 0,0 0,14 ± 0,0 0,19 ± 0,0 MV4-11 0 >200 1,07 ± 0,0 1,25 ± 0,0 MV4-11 0,3 >200 1,05 ± 0,0 1,13 ± 0,0 MV4-11 1 >200 0,21 ± 0,0 1,13 ± 0,0 Exemplo 3: Eficácia In Vivo de CD123-ADCs
[00212] Este exemplo ilustra a eficácia de CD123 ADCs in vivo.
[00213] A atividade antitumor de CD123 ADCs foi testada in vivo usando modelos de xenoenxerto da linhagem celular de Leucemia Mieloide Aguda (LMA). Para cada modelo descrito abaixo, a primeira dose foi administrada no dia 0. Os tumores foram medidos pelo menos uma vez por semana e seu volume foi calculado com a fórmula: volume do tumor (mm3) = 0,5 x (largura do tumor2) (comprimento do tumor). Os volumes médios do tumor (± S.E.M.) para cada grupo de tratamento foram calculados com 10 animais a serem incluídos. Todos os experimentos com animais foram conduzidos em uma instalação credenciada de acordo com as diretrizes da Association for Assessment of Laboratory Animal Care under Institutional Animal Care and Use Committee e aprovação apropriada de pesquisas com animais. CD123 ADCs demonstraram uma alta eficácia em linhagens celulares com mutações genéticas variadas ou genes super-expressos e/ou proteínas de uma maneira dependente da dose. Xenoenxertos de H1 MOLM13 AML
[00214] A atividade antitumor de CD123 ADCs foi examinada em camundongos imuno-deficientes NOD/SCID no crescimento in vivo de tumores humanos. Para modelos de AML subcutânea (sc), 5 x 106 células MOLM13 foram implantadas por via subcutânea no flanco de camundongos fêmeas. Quando os tumores atingiram um volume médio de 200 mm3, os animais foram estadiados para garantir a uniformidade do tamanho do tumor entre os vários grupos de tratamento. O modelo de xenoenxerto sc de MOLM13 AML foi administrado por via intravenosa quatro vezes a cada quatro dias (Q4dx4) com veículo PBS, CD123-CPI (18G3, 16D6 ou 3D1) a 0,3 mg/kg ou 1 mg/kg ou controle Neg-8,8-CPI a 0,3 mg/kg ou 1 mg/kg. Os dados estão resumidos na Tabela 9. Tabela 9 Xenoenxertos de MOLM-13 AML, volume médio do tumor (mm3 +/- SEM) Q4dx4 PBS CD123-CPI Neg 8.8-CPI 18G3-CPI 16D6-CPI 3D1-CPI
DOSE 0 0.3 1 0.3 1 0.3 1 0.3 1 (mg/kg) Dia 0 248 ± 10 251 ± 7 250 ± 13 241 ± 17 248 ± 6 249 ± 5 247 ± 12 252 ± 14 246 ± 14 Dia 2 660 ± 38 407 ± 25 386 ± 35 391 ± 43 319 ± 24 337 ± 18 405 ± 43 553 ± 49 448 ± 52 Dia 5 1313 ± 51 322 ± 27 239 ± 36 293 ± 37 173 ± 19 261 ± 15 261 ± 30 651 ± 60 388 ± 43 Dia 9 2802 ± 90 123 ± 14 95 ± 8 136 ± 17 64 ± 7 127 ± 7 96 ± 13 486 ± 64 193 ± 38 Dia 12 - 16 ± 11 0±0 28 ± 14 0±0 20 ± 11 0±0 374 ± 72 83 ± 15 Dia 17 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 169 ± 67 0±0 Dia 20 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 354 ± 115 0±0 Dia 25 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 1148 ± 307 0±0 Dia 27 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 1010 ± 324 0±0 Dia 33 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 2015 ± 487 0±0 Dia 40 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 2703 ± 590 0±0 Dia 48 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 Dia 54 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 Dia 54 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0 Dia 60 - 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 0±0 - 0±0
[00215] CD123-CPI inibiu o tumor significativamente em comparação com Neg.8.8-CPI (Tabela 9). Na dose de 0,3 mg/kg,
todos os três CD123 ADCs: 18G3-CPI, 16D6-CPI e 3D1-CPI foram citotóxicos. No dia 17, dez em cada dez animais em cada grupo mostraram regressão do tumor. Todos esses camundongos permaneceram livres de tumor pelo menos até o dia 60, quando o estudo terminou. Na dose de 1 mg/kg de CD123 ADC, a regressão do tumor ocorreu mais cedo, no dia 12.
[00216] Estes dados demonstram que CD123-CPI inibe o crescimento de tumores de xenoenxerto de MOLM13 AML.
[00217] Para testar a eficácia do CD123-ADC em doses mais baixas, foi realizado um estudo de eficácia in vivo usando o mesmo modelo MOLM13. Os animais foram tratados como descrito acima. Como mostrado abaixo na Tabela 10, CD123-CPIs a 0,1 mg/kg, inibe muito efetivamente o crescimento do tumor em todos os camundongos e de maneira dependente da dose (Tabela 10, colunas centrais "18G3- CPI" e "16D6-CPI"). Em contraste, os tumores nos ratos tratados com Neg.8.8-CPI continuaram a crescer (Tabela 10, coluna da direita "Neg
8.8-CPI"). Tabela 10 Xenoenxertos de MOLM-13 AML, volume médio do tumor (mm3 +/- SEM) Q4dx4 PBS CD123 -CPI Neg 8.8- CPI 18G3-CPI 16D6-CPI Controle dose  0 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 (mg/kg) Dia 0 177 ± 10 187 ± 14 183 ±15 181 ± 11 184 ± 13 181 ± 12 182 ± 9 181 ± 15 183 ±14 188 ± 24 Dia 4 551 ± 47 199 ± 21 147 ± 21 112 ± 14 226 ± 22 178 ± 20 87 ± 9 494 ± 43 324 ± 56 209 ± 50 Dia 9 1614 ± 125 120 ± 19 40 ± 13 4±4 169 ± 27 51 ± 13 0±0 1530 ± 123 1060 ± 159 157 ± 38 Dia 11 2216 ± 149 110 ± 29 13 ± 10 0±0 217 ± 52 10 ± 10 0±0 2075 ± 79 1253 ± 170 78 ± 25 Dia 14 - 112 ± 45 0±0 0±0 371 ± 94 0±0 0±0 - 2217 ± 219 77 ± 31 Dia 16 - 106 ± 49 0±0 0±0 411 ± 104 0±0 0±0 - 1749 ± 280 38 ± 23 Dia 22 - 385 ± 143 0±0 0±0 1319 ± 275 0±0 0±0 - - 147 ± 67 0±0 356 ± Dia 25 - 859 ± 308 0±0 0±0 1470 ± 344 0±0 - - 136 0±0 865 ± Dia 29 - 720 ± 273 0±0 0±0 1948 ± 653 0±0 - - 298 0±0 577 ± Dia 31 - 805 ± 349 0±0 0±0 - 0±0 - - 251 0±0 1154 ± Dia 37 - 927 ± 653 0±0 0±0 - 0±0 - - 352 0±0 2363 ± Dia 42 - 747 ± 747 0±0 0±0 - 0±0 - - 158 Dia 47 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - Dia 53 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - Dia 57 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - - Dia 65 - - 0±0 0±0 - 0±0 0±0 - - -
[00218] Para testar a eficácia de CD123-18G3-CTI, foi realizado um estudo de eficácia in vivo usando o mesmo modelo MOLM13. Os animais foram tratados como descrito acima. Como mostrado na Tabela 11, o tratamento com CD123-18G3-CTI inibiu o crescimento do tumor em camundongos de maneira dependente da dose. Em contraste, os tumores nos camundongos tratados com Neg.8.8-CTI continuaram a crescer. Tabela 11 Xenoenxertos de MOLM-13 AML, volume médio do tumor (mm3 +/- SEM) Q4dx4 Neg.8.8-CTI CD123-18G3-CTI (Glicuronideo) CD123-18G3-CTI (Galactosideo)
DOSE 0,1 (Glu) 0,3 (Gal) 0,01 0,03 0,1 0,01 0,03 0,1 0,3 (mg/kg) Dia -1 207 ± 12 213 ± 12 205 ± 11 211 ± 9 213 ± 11 208 ± 8 202 ± 7 209 ± 14 213 ± 15 Dia 5 698 ± 46 805 ± 67 702 ± 41 640 ± 48 358 ± 32 808 ± 88 688 ± 46 391 ± 30 320 ± 34 Dia 8 1264 ± 80 1304 ± 106 1215 ± 71 834 ± 77 307 ± 27 1500 ± 113 1191 ± 85 354 ± 33 248 ± 31 Dia 12 2551 ± 117 2062 ± 142 2338 ± 118 1196 ± 133 147 ± 17 - 2165 ± 160 278 ± 27 127 ± 17 Dia 15 - - - 1214 ± 128 61 ± 6 - - 175 ± 21 59 ± 14 Dia 19 - - - 1583 ± 192 38 ± 12 - - 142 ± 28 13 ± 8 Dia 22 - - - - 0±0 - - 115 ± 36 18 ± 12 Dia 26 - - - - 0±0 - - 194 ± 58 0±0 Dia 29 - - - - 0±0 - - 266 ± 93 0±0 Dia 36 - - - - 0±0 - - 635 ± 194 0±0 Dia 39 - - - - 0±0 - - 906 ± 254 0±0 Dia 42 - - - - 0±0 - - - 0±0 Dia 49 - - - - 0±0 - - - 0±0 Dia 54 - - - - 0±0 - - - 0±0 Dia 60 - - - - 0±0 - - - 0±0 B. Xenoenxertos de H.2 MV4-11 AML
[00219] O efeito de CD123 ADCs no crescimento de tumores humanos foi avaliado usando camundongos imuno-deficientes. Para modelos de LMA subcutânea (sc), 5 x 106 células MV4-11 foram implantadas por via subcutânea no flanco de camundongos fêmeas NOD-SCID. Quando os tumores atingiram um volume médio de 200 mm3, os animais foram estadiados para garantir uniformidade do tamanho do tumor entre os vários grupos de tratamento. Os animais do xenoenxerto de MV4-11 AML sc foram tratados por via intravenosa quatro vezes a cada quatro dias (Q4dx4) com veículo PBS, CD123- CPI ou 8,8-CPI nas seguintes doses: 0,1, 0,3 e 0,6 mg / kg. Os dados estão resumidos na Tabela 12. CD123-18G3-H16-CPI em comparação com o veículo Neg 8.8-CPI e PBS.
[00220] A dose de 0,6 mg/kg de CD123-CPI foi o ADC mais potente testado neste estudo e, no dia 65, dez em cada dez animais ainda em estudo permaneceram livres de tumor. Mesmo na dose de 0,3 mg/kg, nove em cada dez ratos mostraram regressão do tumor por volta do dia 25 e permanecem livres de tumor até o estudo terminar no dia 65. Os dados demonstram que CD123-CPI inibe o crescimento de tumores de xenoenxerto de MV4-11. Tabela 12 Xenoenxertos de MV4-11 AML, volume médio do tumor (mm3 +/- SEM) q4dx4 PBS CD123-18G3-H16-CPI Neg 8.8-H16-CPI DOSE (mg/kg) 0 0,1 0,3 0,6 0,1 0,3 0,6 Dia 0 235 ± 14 236 ± 17 232 ± 13 232 ± 15 236 ± 9 233 ± 11 228 ± 12 Dia 3 373 ± 19 225 ± 19 183 ± 11 174 ± 16 310 ± 20 289 ± 13 204 ± 16 Dia 8 579 ± 62 142 ± 15 114 ± 9 101 ± 7 509 ± 41 230 ± 39 118 ± 11 Dia 11 961 ± 112 161 ± 24 98 ± 9 79 ± 7 767 ± 72 289 ± 55 107 ± 16 Dia 15 1876 ± 200 189 ± 63 70 ± 18 57 ± 12 1428 ± 157 395 ± 77 60 ± 20 Dia 18 1781 ± 467 226 ± 84 60 ± 17 57 ± 12 1773 ± 136 615 ± 123 77 ± 23 Dia 21 - 392 ± 144 96 ± 23 67 ± 14 2560 ± 220 954 ± 186 112 ± 32 Dia 25 - 729 ± 271 111 ± 56 49 ± 20 - 1632 ± 230 168 ± 87 Dia 28 - 626 ± 337 125 ± 101 67 ± 30 - 1684 ± 688 301 ± 150 Dia 32 - 215 ± 197 208 ± 183 113 ± 79 - 1645 ± 677 431 ± 197 Dia 36 - 385 ± 367 40 ± 16 198 ± 177 - 1541 494 ± 129 Dia 39 - 0±0 21 ± 11 265 ± 249 - 1901 603 ± 153 Dia 44 - 15 ± 15 29 ± 12 31 ± 15 - - 1346 ± 348 Dia 51 - 0±0 20 ± 10 32 ± 18 - - 711 ± 411 Dia 58 - 40 ± 23 20 ± 10 27 ± 13 - - 1450 ± 818 Dia 65 - 0±0 9±6 19 ± 10 - - Dia 73 0±0 0±0 0±0
[00221] Para testar a eficácia do CD123-CTI, foi realizado um estudo de eficácia in vivo usando o mesmo modelo MV4-11. Os animais foram tratados como descrito acima. Como mostrado na Tabela 13, o CD123-CTI também inibe o crescimento de tumores em camundongos de maneira dependente da dose, enquanto os tumores nos camundongos tratados com Neg.8.8-CTI continuam a crescer. Tabela 13 Xenoenxertos de MV4-11 AML, volume médio do tumor (mm3 +/- SEM) Q4dx4 Neg.8.8-CTI CD123-18G3-CTI (Glicuronídeo) CD123-18G3-CTI (Galactosídeo) DOSE 0,3 0,3 0,03 0,1 0,3 0,03 0,1 0,3 (mg/kg) (Glu) (Gal) Dia -1 229 ± 14 232 ± 10 235 ± 21 232 ± 11 235 ± 14 233 ± 11 232 ± 14 229 ± 13 Dia 4 307 ± 18 301 ± 18 299 ± 28 221 ± 15 189 ± 9 270 ± 23 260 ± 14 216 ± 18 Dia 7 361 ± 37 408 ± 49 468 ± 37 193 ± 10 122 ± 9 333 ± 19 214 ± 23 163 ± 12 Dia 12 458 ± 58 759 ± 74 804 ± 85 215 ± 30 96 ± 12 625 ± 52 325 ± 52 121 ± 25 Dia 15 513 ± 57 868 ± 78 1165 ± 128 214 ± 35 83 ± 14 873 ± 86 425 ± 68 114 ± 25 Dia 18 640 ± 85 1367 ± 179 1551 ± 107 229 ± 43 75 ± 11 1348 ± 104 519 ± 88 96 ± 19 Dia 21 867 ± 108 1970 ± 227 2263 ± 90 311 ± 60 94 ± 19 2140 ± 162 716 ± 124 86 ± 20 Dia 25 1264 ± 179 - - 391 ± 85 50 ± 14 - 900 ± 170 70 ± 16 Dia 28 1497 ± 159 - - 484 ± 99 73 ± 16 - 1192 ± 251 64 ± 16 Dia 32 - - - 627 ± 121 107 ± 19 - - 82 ± 21 Dia 35 - - - 771 ± 144 89 ± 17 - - 92 ± 21 Dia 40 - - - 1056 ± 205 65 ± 16 - - 74 ± 24 Dia 43 - - - - 46 ± 11 - - 113 ± 44 Dia 47 - - - - 58 ± 10 - - 135 ± 72 Dia 50 - - - - 67 ± 12 - - 198 ± 107 Dia 54 - - - - 49 ± 9 - - 339 ± 210 Dia 61 - - - - 61 ± 8 - - 337 ± 273 Dia 70 - - - - 41 ± 7 - - - Dia 78 - - - - 23 ± 7 - - - Dia 84 - - - - 35 ± 8 - - - Dia 92 - - - - 16 ± 6 - - - Dia 99 - - - - 11 ± 5 - - -
[00222] Esses resultados demonstram que CD123 ADCs são altamente eficazes no tratamento de tumores.
Exemplo 4: Eficácia de CD123-ADCs in vivo
[00223] Esse Exemplo ilustra a eficácia de CD123 ADcs in vivo usando xenoenxertos disseminados derivados de pacientes com LMA (AML PDX).
[00224] A potência de CD123-CPI foi examinada em camundongos imuno-deficentes sobre o crescimento n vivo de um modelo disseminado estabelecido com células da medula óssea do paciente obtidas de acordo com os procedimentos de consentimento apropriados. A Tabela 14 fornece um resumo das amostras dos pacientes usadas nesse estudo. Tabela 14 Modelo Risco Subtipo Anormalidade Citogenética PDX2407 Fraco, Recidivado M2 FLT3-ITD 46, XY NPM-1 FLT3- PDX0407 Intermediário M2 46, XY
ITD 46,XY,add(6)(p21),del(8)(p21),add(12)(q2
4.1)[13]/46,XY,del(1)(q32),del(7)(q 22q32),der(6;12)(q10;p10), FLT3-ITD CTG 2226 Fraco, Refratário M4 add(22)(q?11.2),+mar[3]/45,XY,t(1;2)(p?2 Citogenética 2;q11.2), -21[1]/46,XY[3] 46,XY,del(2)(p13p?23),t(4;13)(q31;q34), CTG 2229 Fraco, Refratário M1 Citogenética add(4)(q?25),del(6)(q13q25),t(9;22)(q34; q11.2),del(10)(q24),add(16)(q24)[20] CTG 2235 Intermediário, De Novo AML-MLD Citogenética 46,XY,del(20)(q11.2q13.1)[20] CTG 2238 Fraco De Novo Não selecionado FLT3-ITD Não disponível 46,XY,t(9;11)(p22;q23),?add(10)(q?24)[5]/ CTG2240 Intermediário, De Novo AML-MLD Citogenética 46,XY[5] 50170 Fraco, Refratário M1 FLT3-ITD 46, XY 50102 Favorável Ambíguo Não Detectado Não Detectado
[00225] Para os estudos, 1,0 x 106 células da medula óssea do paciente foram injetadas por via intravenosa na veia lateral da cauda de camundongos NSG irradiados. O estudo foi estadiado e randomizado com base no enxerto de células CD45+/CD123+/CD33+ humanas (12-55% no sangue periférico, medido pela coloração por citometria de fluxo). Os camundongos AML PDX foram tratados por via intravenosa 2 vezes a cada sete dias (Q7dx2) com veículo PBS ou 18G3-CPI. Cerca de 3-5 dias após a segunda/última dose, o sangue periférico e a medula óssea foram coletados de camundongos sacrificados. As células tumorais remanescentes na medula óssea e no sangue dos animais sacrificados foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados estão resumidos no gráfico na Figura 2 e tabela
15. Na Tabela 15, os números representam o percentual de células tumorais restantes no sangue periférico e medula óssea.
[00226] Cada estudo teve cerca de 6 a 10 camundongos por grupo. Os dados demonstram que o CD123 ADC é eficaz na redução do número de células tumorais no sangue periférico e na medula óssea de uma maneira dependente da dose (Figura 2 e Tabela 15).
Tabela 15 Modelo Dose CD123-CPI Sangue Periférico Medula Óssea mg / kg % Tratado / % Veículo (% ± SEM) % Tratado / % Veículo (% ± SEM) 0,1 0,56 ± 0,1 / 88 ± 1,1 3,04 ± 0,7 / 90 ± 2 PDX2407 0,5 0,3 ± 0,05 / 88 ± 1,1 0,14 ± 0,03 / 90 ± 2 0,03 1,1 ± 0,2 / 29 ± 4,8 1,3 ± 0,4 / 30 ± 14 PDX0407 0,1 0,16 ± 0,04 / 29 ± 4,8 0,8 ± 0,3 / 30 ± 14 0,03 1,5 ± 0,4 / 21 ± 2 18 ± 1,9 / 77 ± 7,4 CTG 2226 0,1 0,9 ± 0,3 / 22 ± 2 8 ± 1,6 / 77 ± 7,4 0,03 54 ± 9 / 65 ± 3,2 83 ± 6,9 / 84 ± 6 CTG 2229 0,1 16 ± 2,5 / 65 ± 3,2 50 ± 9,7 / 84 ± 6 0,03 1,8 ± 0,6 / 31 ± 6 73 ± 6,1 / 83 ± 4,5 CTG 2235 0,1 0,7 ± 0,23 / 31 ± 6 59 ± 6,3 / 83 ± 4,5 0,03 5,8 ± 0,7 / 32 ± 2 45 ± 9,7 / 95 ± 0,6 CTG 2238 0,1 1,7 ± 0,5 / 32 ± 2 12 ± 1,6 / 95 ± 0,6 0,03 1 ± 0,4 / 52 ± 2,9 60 ± 12 / 99 ± 0,1 CTG2240 0,1 0,2 ± 0,07 / 52 ± 2,9 16 ± 6,7 / 99 ± 0,1 PDX 50170 0,03 0,4 ± 0,1/ 14 ± 1,4 24 ± 7,3 / 46 ± 9,6 0,03 53 ± 0,8 / 58 ± 0,8 83 ± 1,9 / 77 ± 2,6 PDX 50120 0,1 40 ± 4,2 / 58 ± 0,8 83 ± 4,7 / 77 ± 2,6 0,3 31 ± 2,4 / 58 ± 0,8 78 ± 1,9 / 77 ± 2,6
[00227] Para determinar se CD123-18G3-CPI pode aumentar a sobrevida global de camundongos portadores de tumor, foi realizado um estudo de sobrevida usando PDX2407 quando o sangue periférico mostra um alto enxerto, ou seja, ~ 32% em média. Os camundongos foram tratados por via intravenosa 2 vezes a cada sete dias (Q7dx2) com veículo PBS ou CD123-CPI, e monitorados diariamente. Quando um camundongo mostrava sinais clínicos, tais como letargia e perda de peso (de acordo com as diretrizes da Association for Assessment of Laboratory Animal Care under Institutional Animal Care and Use Committee), o camundongo era sacrificado.
[00228] Os resultados estão resumidos no gráfico da Figura 3. O tratamento com CD123-18G3-CPI prolonga a sobrevida global de animais portadores de tumor de maneira dependente da dose. Especificamente, o tratamento com CD123-18G3-CPI na dose de 0,1 mg/kg estendeu a sobrevida em cerca de 25%, e o tratamento com CD123-18G3-CPI na dose de 0,3 mg/kg dobrou aproximadamente o tempo de sobrevida (Figura 3)
[00229] Estes resultados demonstram que o tratamento com um CD123-ADC induz regressão e inibe a progressão da LMA e prolonga a sobrevida. Exemplo 5: Preparação do Conjugado de Anticorpo Anti-CD123- Fármaco (ADC)
[00230] Este exemplo ilustra a conjugação e preparação de h18G3- AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314, um CD123 ADC, também aqui referido como "18G3-CPI" ou "CD123-18G3-CPI".
[00231] 18G3-CPI é um ADC composto por mAb humanizado de CD123 18G3 (consulte as Tabelas 2.0 e 2.1, supra, "h18G3"), ligante AcLysValCitPABC e o agente ciclopropilpirroloindolina (CPI). As mutações K222R, E295L, Q295L, Y296Q, N297G foram introduzidas na dobradiça superior e Fc para permitir a conjugação específica para o sítio do agente CPI, catalisada pela transglutaminase. As sequências de aminoácidos de cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo IgG1 humanizado CD123-18G3-H16-N60G-K222R (aqui referido como "h18G3") são as seguintes:
[00232] Cadeia leve:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKSSQSLLSSGTRKNYLAWYQQKPGKAPK LLIYWASTRQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSYNLYTF GQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK
VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID Nº: 30)
[00233] Cadeia pesada:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLTSGDISWVRQAPGKGLEWVA VIWSGGGTNYGSRLMSRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDW GNFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDRTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL MISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRELLQGSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID Nº: 27)
[00234] A sequência da mutação específica para o sítio de H16 está em itálico e negrito acima e inclui cinco mutações de transglutaminase K222R (na dobradiça), E294L, Q295L, Y296Q e N297G específicas para o sítio de H16. A sequência LLQG é o marcador de reconhecimento da transglutaminase e o agente ligante é conjugado em Q296. G em CDR-H2 (sublinhado) é uma mutação N60G.
[00235] O ligante-agente, AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI, é um conjugado específico para o sítio no aminoácido Q296. A estrutura do agente-ligante AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 é mostrada abaixo.
[00236] h18G3 foi conjugado ao ligante-agente AcLysValCitPABC- DMAE-CO_CPI-000638314 através do uso de transglutaminase bacteriana (Sigma, 45U/mg de proteína). Em particular, o anticorpo foi trocado em tampão contendo KPO4 100 mM, NaCl 200 mM, pH 7. O ligante-agente foi adicionado em excesso molar de 10 vezes ao anticorpo na presença de 7,5% (v/v) de dimetilsulfóxido (DMSO). A reação enzimática foi iniciada pela adição de 1 U de transglutaminase bacteriana por mg de anticorpo e incubada a 25°C durante a noite com mistura contínua.
[00237] A mistura de reação foi incubada com álcool isopropílico 15% por 30 min em temperatura ambiente. Foi então diluída em 4 volumes de tampão KPO4 1 M e purificada por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando coluna HP Butil-Sepharose HP (GE Lifesciences). O método utilizou KPO4 1 M, Tris 50 mM, pH 7 para ligação e o ADC foi eluído com Tris 50 mM, pH 7 acima de 10 CV. O composto purificado por HIC foi dialisado em um tampão final de histidina 20 mM, 85 mg/ml de sacarose, pH 5,8. O ADC foi ainda caracterizado através de SEC quanto a pureza e cromatografia em fase reversa para calcular a proporção fármaco-anticorpo. A concentração de proteína foi determinada através de um espectrofotômetro UV.
[00238] O anticorpo principal tem uma expressão muito boa de até
700 mg/L, conforme avaliado em pools de CHO, 88% de recuperação de rendimento e 99% de pureza após três etapas de purificação. 18G3 teve um desempenho muito bom nas conjugações, como avaliado pela obtenção de DAR 1.9-2.0 e 55 a 60% de rendimento de conjugação depois da purificação. O ADC resultante, CD123-18G3-H16-N60G- K222R-hG1-(Q)AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI, exibiu estabilidade térmica e integridade molecular boas. Exemplo 6: Métodos de conjugação do anticorpo a AcLvsValCitPABC- DMAE-CO CPI-000638314 usando transglutaminase
[00239] Este exemplo ilustra a conjugação do anticorpo com o ligante-agente AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314, também aqui referido como AcLysPABC-CPI-8314.
[00240] Conjugação do ligante CPI-agente citotóxico. A conjugação de AcLysPABC-CPI-8314 (estrutura mostrada acima no Exemplo 5) ao sítio H16 de um anticorpo foi otimizada pela variação de uma variedade de parâmetros diferentes, tais como molaridade e composição de sal, pH, concentração de enzimas, tempo e temperatura (Tabela 16) Resumidamente, o anticorpo foi trocado por tampão em tampão apropriado e pH em cada uma das condições mostradas na Tabela 16. Foi adicionado ao anticorpo um excesso molar de 10 vezes de ligante-agente AcLysPABC-CPI-8314 e 5-10% de dimetilsulfóxido foram adicionados para solubilizar o ligante-agente na mistura de reação. Após adição de transglutaminase bacteriana (0,5-5 U/mg de anticorpo), a mistura de reação foi continuamente misturada por um tempo e temperatura estipulados. O ligante-agente e a enzima transglutaminase não reagidos foram removidos por cromatografia de exclusão de tamanho e/ou cromatografia de interação hidrofóbica. A proporção fármaco-anticorpo foi calculada por LCMS ou RP-HPLC.
[00241] A eficiência da conjugação, medida pela proporção anticorpo-fármaco (DAR) para as várias condições, é mostrada na Tabela 16. Por exemplo, quando o anticorpo foi trocado em tampão contendo KPO4 30 mM, NaCI 150 mM a pH 7, foi atingido um DAR de 1,6.
[00242] Os anticorpos direcionados para CD33, CD123, Her2, PRLR, CD22 e outros antígenos, incluindo antígenos que foram conjugados ao ligante-agente AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI- 000638314 usando essas condições otimizadas. Tabela 16 Proporção Força iônica Concentração UnidadesTG/mg pH Fármaco do tampão de NaCl, mM Ab Anticorpo(DAR) 20 mM NaAc 75 5,8 1 0,3 30 mM KPO4 150 6,5 1 1,3 30 mM KPO4 150 7,0 0,5 1,6 30 mM KPO4 150 7,0 2 1,6 30 mM KPO4 150 7,0 5 1,4 30 mM KPO4 150 7,5 1 1,5 30 mM KPO4 150 8,0 1 0,6 25 mM Tris 150 8,0 1 0,6
[00243] Embora os ensinamentos divulgados tenham sido descritos com referência a várias aplicações, métodos, kits e composições, será apreciado que várias alterações e modificações podem ser feitas sem se afastar dos ensinamentos e da invenção reivindicada abaixo. Os exemplos anteriores são fornecidos para melhor ilustrar os ensinamentos descritos e não se destinam a limitar o escopo dos ensinamentos aqui apresentados. Embora os presentes ensinamentos tenham sido descritos em termos dessas modalidades exemplificadoras, aquele versado na técnica entenderá prontamente que inúmeras variações e modificações dessas modalidades exemplificadoras são possíveis sem experimentação indevida. Todas essas variações e modificações estão dentro do escopo dos ensinamentos atuais.
[00244] Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes, pedidos de patente, jornais, livros de texto e similares, e as referências citadas, mesmo que ainda não sejam, são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de um ou mais das literaturas incorporadas e de materiais semelhantes diferirem ou contradizerem este pedido, incluindo, mas não se limitando a termos definidos, uso de termos, técnicas descritas ou similares, esse pedido predomina.
[00245] A descrição e os exemplos anteriores detalham certas modalidades específicas da invenção e descrevem o melhor modo contemplado pelos inventores. Deverá ser apreciado, no entanto, que não importa o quão detalhado o exposto possa aparecer no texto, a invenção pode ser praticada de várias maneiras e a invenção deve ser interpretada de acordo com as reivindicações em anexo e quaisquer equivalentes das mesmas.

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo isolado que se liga especificamente a CD123, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada (VH) que compreende três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 6, 24, 32, 44, 51 ou 64, e uma região variável da cadeia leve (VL) que compreende três CDRs de uma VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 17, 28, 39, 48, 57 ou 71.
    2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a VH compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 7, 33, 52 ou 65; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 8, 25, 34, 45, 53 ou 66; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9, 35, 46 ou 67; e/ou a região VL compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 18, 40, 58 ou 72; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 19, 42, 60 ou 74; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20, 42, 60 ou 74.
    3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a VH compreende (i) uma CDR1 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 7; (ii) uma CDR2 de VH que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 25,; e (iii) uma CDR3 de VH que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 9; e/ou a região VL compreende (i) uma CDR1 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 18; (ii) uma CDR2 de VL que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nº: 19; e (iii) uma CDR3 de VL que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID Nº: 20.
    4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a VH compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 24 ou uma variante dessa com uma ou várias substituições conservativas de aminoácidos nos resíduos que estão dentro de uma CDR e/ou a VL compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 28 ou uma variante dessa com uma ou várias substituições conservativas de aminoácidos nos resíduos que estão dentro de uma CDR.
    5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma cadeia leve que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº: 30 e uma cadeia pesada que compreende a sequência mostrada na SEQ ID Nº:
    27.
    6. Anticorpo isolado que se liga especificamente a CD123, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada produzida pelo vetor de expressão com Nº. de Acesso ATCC PTA-124283 e uma região variável de cadeia leve produzida pelo vetor de expressão com No. de Acesso ATCC PTA-
    124284.
    7. Anticorpo isolado que se liga especificamente a CD123, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete com o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 pela ligação a CD123.
    8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um marcador que contém glutamina doadora de acila manipulada em um sítio específico.
    9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o marcador que contém glutamina doadora de acila compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em Q, LQG, LLQGG (SEQ ID Nº: 77), LLQG (SEQ ID Nº: 78), LSLSQG (SEQ ID Nº: 79), GGGLLQGG (SEQ ID Nº: 80), GLLQG (SEQ ID Nº: 81), LLQ, GSPLAQSHGG (SEQ ID Nº: 82), GLLQGGG (SEQ ID Nº: 83), GLLQGG (SEQ ID Nº: 84), GLLQ (SEQ ID Nº: 85), LLQLLQGA (SEQ ID Nº: 86), LLQGA (SEQ ID Nº: 87), LLQYQGA (SEQ ID Nº: 88), LLQGSG (SEQ ID Nº: 89), LLQYQG (SEQ ID Nº: 90), LLQLLQG (SEQ ID Nº: 91), SLLQG (SEQ ID Nº: 92), LLQLQ (SEQ ID Nº: 93), LLQLLQ (SEQ ID Nº: 94), LLQGR (SEQ ID Nº: 95), LLQGPP (SEQ ID Nº : 96), LLQGPA (SEQ ID Nº: 97), GGLLQGPP (SEQ ID Nº: 98), GGLLQGA (SEQ ID Nº: 99), LLQGPGK (SEQ ID Nº: 100), LLQGPG (SEQ ID Nº: 101), LLQGP (SEQ ID Nº: 102), LLQP (SEQ ID Nº: 103), LLQPGK (SEQ ID Nº: 104), LLQAPGK (SEQ ID Nº: 105), LLQGAPG (SEQ ID Nº: 106), LLQGAP (SEQ ID Nº: 107) e LLQLQG (SEQ ID Nº: 108).
    10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador que contém glutamina doadora de acila é LLQG (SEQ ID Nº: 78).
    11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende ainda uma modificação de aminoácido na posição 222, 340 ou 370.
    12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a modificação de aminoácido é uma substituição de lisina por arginina.
    13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a modificação de aminoácido é K222R.
    14. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um ligante.
    15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o ligante é um ligante clivável.
    16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o ligante é selecionado do grupo que consiste em Ac-Lys-Gly (acetil-lisina-glicina), ácido aminocaproico, Ac- Lys-p-Ala (acetil-lisina-p-alanina), amino-PEG2 (polietileno glicol)-C2, amino-PEG3-C2, amino-PEG6-C2, Ac-Lis-Val-Cit-PABC (acetil-lisina- valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila), amino-PEG6-C2-Val-Cit- PABC, aminocaproil-Val-Cit-PABC, [(3R,5R)-1-{3-[2-(2-aminoetóxi) etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, [(3S,5S)-1-{3-[2-(2- aminoetóxi)etóxi]propanoil}piperidina-3,5-diil]bis-Val-Cit-PABC, putrescina e Ac-Lys-putrescina.
    17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o ligante é Ac-Lis-Val-Cit-PABC (acetil- lisina-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonila).
    18. Conjugado de anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o anticorpo está conjugado com um agente.
    19. Conjugado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado do grupo que consiste em um agente citotóxico, um agente imunomodulador, um agente de imagem, uma proteína terapêutica, um biopolímero e um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, o agente pode ser um agente citotóxico.
    20. Conjugado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste em uma antraciclina, uma auristatina, uma camptotecina, uma combretastatina, um dímero de CBI, um dímero de ciclopropilpirroloindolina (CPI), um dímero de CTI, uma dolastatina, uma duocarmicina, uma enedina, uma geldanamicina, um dímero de indolino-benzodiazepina, uma maitansina, uma puromicina, um dímero de pirrolobenzodiazepina, um taxano, um alcaloide da vinca, uma tubulisina, uma hemiasterlina, uma espliceostatina, um pladienolídeo e seus estereoisômeros, isósteros, análogos ou derivados.
    21. Conjugado de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é um dímero de CPI.
    22. Conjugado de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dímero de CPI é C31H31Cl2N4O7P ou seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitáveis incluindo C31H31Cl2N4O7PC2HF302.
    23. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende a fórmula: anticorpo-(marcador que contém glutamina doadora de acila)-(ligante)-agente citotóxico.
    24. Conjugado de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o marcador que contém glutamina doadora de acila compreende uma sequência de aminoácidos LLQG (SEQ ID Nº: 78) e em que o ligante compreende acetil-lisina-valina- citrulina-p-aminobenziloxicarbonila.
    25. Conjugado de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o marcador que contém glutamina doadora de acila está inserido no anticorpo na posição E294-N297.
    26. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 25, caracterizado pelo fato de que o conjugado compreende uma substituição de aminoácidos de lisina para arginina na posição 222 de anticorpo, de acordo com a numeração do índice EU de Kabat.
    27. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 26 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
    28. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
    29. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 28.
    30. Célula hospedeira isolada, caracterizada pelo fato de produzir recombinantemente o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
    31. Método de produção de um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira como definida na reivindicação 30 sob condições que resultem na produção do anticorpo e isolar o anticorpo da célula hospedeira ou da cultura.
    32. Método de tratamento de uma condição associada com células que expressam CD123 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 27.
    33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a condição é um câncer.
    34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocítica aguda (LLA), Neoplasia de Células Dendríticas Plasmacitoides Blásticas (BPDCN), leucemia de células pilosas, linfoma de células B não-Hodgkin (NHL), mieloma múltiplo, neoplasia maligna de células plasmáticas, linfoma de Hodgkin, linfoma de Hodgkin com predominância linfocitária nodular, doença de Kahler e mielomatose, leucemia de células plasmáticas, plasmacitoma, leucemia prolinfocítica de células B, leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia mieloide crônica (LMC), linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma da zona marginal, linfoma de células do manto, linfoma de células grandes, linfoma linfoblástico de célula B precursora, leucemia mieloide, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B grandes difusas, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células, linfoma de células do manto, linfoma de Burkitt, linfoma primário de grandes células mediastinais (tímicas), linfoma linfoplasmacítico, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma de células B da zona marginal nodal, linfoma esplênico da zona marginal, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de efusão primária, granulomatose linfomatoide, linfoma de células B grandes rico em células T/histiócitos, linfoma primário do sistema nervoso central, linfoma cutâneo difuso primário de células B grandes (tipo perna), linfoma de células B grandes positivo para EBV dos idosos, linfoma difuso de células B grandes associado a inflamação, linfoma intravascular de células B grandes, linfoma de células B grandes positivo para ALK, linfoma plasmablástico, linfoma de células B grandes que surge na doença de Castleman multicêntrica associada ao HHV8, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Burkitt, linfoma de células B não classificado com características intermediárias entre linfoma difuso de células B grandes e linfoma de Hodgkin clássico e outros linfomas relacionados às células B.
    35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é LMA.
    36. Método de inibição do crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 27 ao indivíduo.
    37. Método de inibição de metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 27 ao indivíduo.
    38. Método de indução da regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo necessitado uma quantidade eficaz da composição farmacêutica como definida na reivindicação 27 ao indivíduo.
    39. Método de conjugação de um anticorpo a AcLysValCitPABC-DMAE-CO_CPI-000638314 (AcLysPABC-CPI- 8314), caracterizado pelo fato de que compreende: - preparar uma composição que compreende um anticorpo e AcLysPABC-CPI-8314 em um tampão que compreende KPO4 30 a 100 mM e NaCl 150 a 200 mM; - adicionar transglutaminase bacteriana à composição; e - incubar a composição para permitir a conjugação do anticorpo à AcLysPABC-CPI-8314.
    40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o pH da composição é 7.
    41. Método de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 0,5 a 2 unidades (U) de transglutaminase bacteriana por mg de anticorpo.
    42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a composição compreende 1 U de transglutaminase bacteriana por mg de anticorpo.
    43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, caracterizado pelo fato de que AcLysPABC-
    CPI-8314 está presente em um excesso molar de 10 vezes em relação ao anticorpo.
    44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 43, caracterizado pelo fato de que a composição é incubada a 25ºC por uma noite com misturação contínua.
    45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 44, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda 7,5% (v/v) de dimetil sulfóxido (DMSO).
    46. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, caracterizado pelo fato de que o tampão compreende KPO4 30 mM e NaCl 150 mM.
    47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 45, caracterizado pelo fato de que o tampão compreende KPO4 100 mM e NaCl 200 mM.
    48. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17 ou o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 26, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica, opcionalmente em que a composição farmacêutica é para tratamento de uma condição associada com células que expressam CD123, inibição do crescimento ou progressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123, inibição de metástase de células malignas que expressam CD123 em um indivíduo, e/ou indução da regressão do tumor em um indivíduo que possui células malignas que expressam CD123.
    49. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou quaisquer categorias de reivindicação aplicáveis, por exemplo, produto, processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente revelada, descrita ou ilustrada no pedido de patente.
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