DE69018460T2

DE69018460T2 - Markierung mit liposomen von ischämischen geweben.

Info

Publication number: DE69018460T2
Application number: DE69018460T
Authority: DE
Inventors: John Baldeschwieler
Original assignee: Vestar Inc
Current assignee: Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1989-04-18
Filing date: 1990-04-13
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2010-04-14
Also published as: JPH04507090A; EP0469082B1; WO1990012595A1; US5527538A; DE69018460D1; ATE120640T1; AU639925B2; EP0469082A4; ES2073574T3; AU5543490A; DK0469082T3; EP0469082A1; JP3010500B2

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Biochemie und der Medizin und spezieller die Verwendung von Liposomen bei der Herstellung von Verbindungen für die Diagnose und Behandlung von ischämischem Gewebe.
Ischämie ist ein Mangel an Blut im Gewebe und ein bedeutendes medizinisches Problem. So ist z.B. Herzleiden einer der führenden Gründe von Morbidität und Mortalität, und zwei verwandte Bedingungen, die eine bedeutende Besorgnis darstellen, sind myokardiale Ischämie (Gewebeanämie im Herzmuskel als Ergebnis der Blockierung der Blutzufuhr wie durch Gefäß verengung), und myokardialer Infarkt oder Infarzierung (ein ischämischer Zustand, resultierend im lokalen Absterben des Herzmuskels und verursacht durch die partikuläre Blockierung des arteriellen Blutflusses). Während in der Behandlung von ischämischem Gewebe Fortschritte gemacht worden sind, gibt es viel Platz für Verbessungen.
Ein Problem mit potentiellen antiischämischen Agenzien ist die Wirkung dieser Agenzien auf anderes als ischämisches Gewebe. Zum Beispiel sind viele potente koronare Gefäßerweiterer bei myokardialer Ischämie unwirksam, da sie nichtischämische koronare Blutgefäße ebenso verdünnen wie die ischämischen Gefäße, was Blutfluß von der ischämischen Region abzieht. Des weiteren wären viele antiischämische Verbindungen (z.B. Calcium-Eintrittsblocker) effektiver, wenn das Agens direkt auf die ischämische Region gerichtet werden könnte.
Daher ist es wünschenswert gewesen, ein Medikament- Transportsystem zum selektiven Transport einer Verbindung in eine ischämische myokardiale Umgebung vorzusehen, d. h. ein aktives Agens bevorzugt zu infarziertem Herzgewebe eher als zu nicht-ischämischem Gewebe zu transportieren. In diesem Zusammenhang beziehen sich die Begriffe "ischämisch oder "Ischämie", wie hier verwendet, auf Gewebe im Zustand traumatischer Gewebeanämie und umfassen infarziertes Gewebe.
Phospholipidvesikel (Liposome) sind in der Hoffnung verfolgt worden, daß sie sich in ausgewähltem Gewebe konzentrieren würden und zu zusätzlicher Verstärkung des Transportes von aktivem Agens von dieser Gewebeart führen würde. Entsprechend wurde versucht, Lipsome für den Transport aktiver Agenzien an myokardiales Gewebe einzusetzen. So wurden z.B. in einer Veröffentlichung von Caride und Zaret in Science 198, 735-738 (1977) nach der Herbeiführung einer embolischen geschlossenen Brustkasten-Innenwand-Myokardial-Infarzierung multilamellare Liposome mit einem Durchmesser von ungefähr 1 000 nm mit entweder gesamt positiver, negativer oder neutraler Ladung Säugetieren verabreicht. Die Liposome wurden mit &sup9;&sup9;mTc-DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure) markiert. Während diese Veröffentlichung über eine Anhäufung positiver und neutraler MLVS in infarziertem myokardialem Gewebe berichtet, ist gezeigt worden, daß freies &sup9;&sup9;mTc-DTPA sich in ischämischem Herzmuskel ansammelt (zehn mal so viel wie in normalem Herzumuskel nach einer Zirkulationszeit von einer Stunde), und weitere Daten haben gezeigt, daß die Anhäufung von &sup9;&sup9;mTc-DTPA in dem in dem Versuchsobjekt beobachteten infarzierten Herzmuskel tatsächlich auf die Freigabe des Vesikelinhaltes in die Zirkulation und darauffolgende Anhäuf ung von freiem &sup9;&sup9;mTc-DTPA im beschädigten Herzmuskel zurückzuführen war.
Die Veröffentlichung von Mueller et al. in Circulation Research 49, 405-415 (1981) berichtet über die Verwendung einer Proteinmarkierungssubstanz (¹³¹I-Albumin), zurückgehalten in 400 bis 700 Nanometer kleinen, unilamellaren Liposomen. Die Ergebnisse zeigen eine leichte Anhäufung positiver Liposome in ischämischem Herzmuskel, verglichen mit gewöhnlichem Herzmuskel (ischämisch/normal gleich 1,38:1), und bei neutralen Liposomen (Verhältnis 0,81:1) konnte keine Nettoanhäufung in ischämischem Herzmuskel beobachtet werden.
Ein Artikel in Kardiovascular Research 16, 516-523 (1982) Cole et al., beschreibt myokardiale Liposomenaufnahme in frühen Stadien myokardialer Infarzierung und folgert, daß 75 bis 125 nm-Liposome keine Anzeichen für bevorzugte Aufnahme durch ischämischen Herzmuskel zeigen. Die Autoren schlagen vor, daß die Liposome damit ein begrenztes Potential als Mittel für den Medikamententransport bei myokardialer Infarzierung aufweisen. Auch Antikörper sind bei dem Versuch, solche Vesikel bevorzugt an bestimmte Gewebe zu transportieren, kovalent an Liposome gebunden worden, aber die Ergebnisse waren in vielen Fällen alles andere als erfolgreich.
EP-A-0200068 offenbart die Verwendung von 20-1000 nm (bevorzugt 50-250 nm) Liposomen, um die Wassersuspendierbarkeit und -dispergierbarkeit von Dihydropyrin für die parenterale Anwendung auf Patienten, die an ischämischen, zerebralen Krankheiten leiden, zu verbessern. Die Pharmazeutika werden in der Membran der Liposome dispergiert. Es gebt jedoch keine Anzeichen dafür, daß solche liposomale Assoziation der Pharmazeutika irgendein bevorzugtes Anvisieren bestimmter Gewebe durch die Pharmazeutika verursacht.
Chemical Abstracts, Vol. 109 (1988) No. 85657m offenbart die Verwendung von Liposomen im allgemeinen zur Einkapselung von [³H]ATP vor der Anwendung auf den Herzmuskel bei Hunden mit induzierter Herzischämie. Die Verwendung von Liposomen einer bestimmten Größe oder Lamellarität wird nicht besprochen. Freies ATP wird im Blutstrom schnell metabolisiert, so daß sein Potential in der Behandlung von Herzinfarkten, wenn es in freier Form vorliegt, nicht realisiert werden kann. Die Quelle deutet an, daß Liposom-eingeschlossenes ATP der Zersetzung widersteht und besser im Herzmuskel verteilt wird als freies ATP. Wiederum gibt es kein Anzeichen dafür, daß solche liposomale Assoziation des aktiven Agens irgendein bevorzugtes Anvisieren des Agens von bestimmtem Gewebe verursacht.
Bioscience Reports 4 (1984) 327-334 und Biochim. et Biophys. Acta 797 (1984) 363-368 offenbaren die Ergebnisse von Studien zur Anhäufung multilamellarer Liposome in ischämischem Gewebe. Diese Studien berichten, daß Anhäufung solcher liposome nur in nekrotischem (d.h. irreversibel ischämischem) Gewebe stattfindet. Der erste Artikel folgert, daß Liposome wahrscheinlich von geringem Wert für die Diagnose und Behandlung ischämischer Störungen sind. Der zweite Artikel bestätigt den ersten und untersucht die zugrundeliegenden Mechanismen.

Zusammenfassung der Erfindung

Entsprechend der Erfindung ist ein Verfahren zum Anvisieren von ischämischem Gewebe bei einem Patienten vorgesehen, umfassend das Einführen einer Menge an Liposomen einer Größe kleiner als 200 nm (unilamellare Vesikel) in den Blutstrom des Patienten und bevorzugterweise gekennzeichnet dadurch, daß sie aus chemisch reinen synthetischen Phospholipiden aufgebaut sind, die sehr bevorzugterweise aliphatische Seitenketten einer Länge von wenigstens 16 Kohlenstoffen aufweisen und ein therapeutisches oder diagnostisches Agens enthalten, ausreichend, um bevorzugt eine Menge des Agens zum ischämischen Gewebe zu transportieren (d.h. (auf das Gewebe) gezielt abzugeben, im Text kurz mit "anvisieren" wiedergegeben), und zwar in der im-wesentlichen-Abwesenheit von an die Liposome gebundenen Antikörpern, um den Transport zu bewirken. Der Ausdruck "chemisch reine Phospholipide" soll Phospholipide definieren, die im wesentlichen frei von schädlichen Detergenseinheiten und Verunreinigungen sind, die eine Aggregation kleiner, daraus gebildeter unilamellarer Vesikel (SUVS) verursachen und die eine Reinheit von mehr als 97 % aufweisen.
Bevorzugterweise haben die SUVs einen Durchmesser von überwiegend zwischen 50 bis 100 nm, sind im wesentlichen neutral hinsichtlich der Ladung und umfassen Phospholipide mit einer Seitenkettenlänge von 16 bis 18 Kohlenstoffatomen. Noch bevorzugter werden die Liposome aus Distearoylphospatidylcholin hergestellt und umfassen Cholesterin (am vorteilhaftesten in einer Menge von 10 bis 50 % des Geamtlipids) als einen Vesikelstabilisator.
Das gezielt anvisierte ischämische Gewebe ist bevorzugterweise ischämisches Herzmuskelgewebe wie reversibel infarziertes Herzmuskelgewebe, und das Verfahren hat Wirksamkeit im Anvisieren desselben durch aktives Agens gezeigt. Während ich nicht auf irgendeine bestimmte Theorie hinsichtlich des Anvisierens eines intensiv myokardialen ischämischen Gewebes durch die Liposome festgelegt werden möchte, scheint es, daß die Liposome mit erhöhter Permeabilität (erhöhter Porengröße) durch die Kapillaren passieren und bevorzugt ischämisches Gewebe - wie ischämischen Herzmuskel - im Verhältnis zu nichtischämischen Regionen durchdringen können.
Eine Vielfalt diagnostischer Agenzien kann in den Liposomen eingeschlossen werden und in dem Verfahren der Erfindung Verwendung finden. In den untenstehenden Beispielen wird ein radioaktives Isotop von lndium (¹¹¹In) in die Liposome eingeführt und erlaubt Gammaabbildung von intensiver myokardialer Ischämie. Zusätzlich können geeignete liposomale NMR- Kontrastmittel, wie sie im U.S.-Patent Nr. 4 728 575 beschrieben sind, zur Abbildung myokardialer Ischämie durch magnetische Resonanztechniken angewendet werden.
Was die therapeutischen Agenzien betrifft, so können Enzyme, die die Zersetzung von Superoxiden oder Sauerstoffradikalverbindungen (z .B. Superoxiddismutase) katalysieren, in geeignete Vesikel eingeführt werden, wie auch therapeutische Agenzien wie Katalase oder Glukose-Oxidase oder Dihydropyridin-Verbindungen wie Nicardipin. Die besonderen diagnostischen oder therapeutischen Agenzien, die für die Erfindung verwendet werden können, sind den Fachleuten auf dem Gebiet, folgend der Bekanntgabe dieser Entdeckung, bekannt und stellen per se keinen Teil der Erfindung dar.
In den erläuternden Beispielen werden radiomarkierte Liposome verwendet, um ischämisches Gewebe darzustellen und damit die Fähigkeit des Verfahrens der Erfindung zu demonstrieren, selektiv therapeutische oder diagnostische Agenzien zu traumatisiertem ischämischem Herzmuskel zu transportieren. Mit dieser Veröffentlichung wird die Verwendung von zusätzlichen diagnostischen oder therapeutischen Agenzien in Verbindung mit der Behandlung von myokardialer Ischämie oder Infarkt für einen Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein.

Kurzbeschreibung der Zeichnung

Figur 1 zeigt Blutreinigungsdaten bei Hunden von ¹¹¹Inmarkierten Liposomen über der Zeit. Die Daten sind dargestellt als die Radioaktivität (CPM)/g Blut. Für jeden Punkt ist N = 4. Die Werte sind als Mittel ± Standardabweichung angegeben.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG

Darstellung der Liposome

Die Liposome, die in der Erfindung verwendet werden, sind kleine unilamellare Liposome von einer Größe kleiner als 200 nm, bevorzugterweise von einem Durchmesser von 50 bis 100 nm. Wie oben beschrieben, umfassen die Vesikel bevorzugterweise chemisch reine systhetische Phospholipide, die gesättigte aliphatische Seitenketten aufweisen und am vorteilhaftesten aus Phopholipiden wie Distearoylphoshatidylcholin hergestellt werden. Cholesterin ist bevorzugterweise in die Liposome eingefügt, um die Stabilität der Vesikel, die in dem offenbarten Verfahren verwendet werden, zu erhöhen.
Eine breite Vielfalt therapeutischer oder diagnostischer Agenzien kann in den inneren wäßrigen Raum der Lipid-Doppelschicht der Liposome mit Verfahren, die einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, eingefügt werden. In den folgenden Beispielen werden eine Chelatverbindung und ein Ionophor zur Ladung externer Kationen zur Radiomarkierung in die Vesikeln verwendet. Das bevorzugte Ionophor ist A23187, aber andere nützliche Ionophore sind Polyether wie Lasalocid A(X-537A) und 5-Brom-Derivate des Lasalocids; cyclische Depsipeptide wie Beauvericin; und cyclische Peptide wie Valinomylin. Das Chelatagens ist bevorzugterweise Nitriloessigsäure (NTA), obwohl auch andere Chelatbildner verwendet werden können.
Die Liposome werden dargestellt durch Lösen des Phospholipids und Cholesterins in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, und Abdampfen des Lösungsmittel zur Bildung eines Lipidfilms. Wenn, wie in den folgenden Beispielen, ein Ionophor zur Beladung des diagnostischen oder therapeutischen Agens in die Liposome verwendet wird, kann diese Verbindung vor dem Eindampfen der Lipidlösung hinzugefügt werden.
Der getrocknete Lipidfilm wird dann in einer geeigneten wäßrigen Phase wie Phosphat-gepufferter Salzlösung oder einer anderen physiologisch geeigneten Lösung rehydratisiert. Wasserlösliche Medikamente oder therapeutische Agenzien können in der Hydratisierungslösung enthalten sein, obwohl, wenn entfernte Beladung gewünscht ist, ein Beladungsagens wie ein oben beschriebenes Chelatbildungsagens der Hydratisierungslösung hinzugefügt werden kann, um in dem inneren wäßrigen Raum des Liposoms eingeschlossen zu werden.
Bei Hinzufügen der Hydratisierungslösung bilden sich spontan Liposome unterschiedlicher Größe und schließen einen Teil der wäßrigen Phase ein. Danach werden die Liposome und die suspendierende wäßrige Lösung einer Trennkraft wie Beschallung ausgesetzt oder entsprechend der im U.S. Patent Nr. 4 753 788 beschriebenen Methode in einem Homogenisator verarbeitet, um Vesikel innerhalb der spezifizierten Größe herzustellen. Die Liposome werden dann verarbeitet, um unerwünschte Verbindungen aus der Suspensionslösung zu entfernen, zum Beispiel das Chelatisierungsagens oder nicht eingeschlossenes Medikament, was durch Prozesse wie Gelchromatography oder Ultrafiltration erreicht werden kann. Wenn nötig, wird das Produkt dann konzentriert, um überschüssige Pufferlösung zu entfernen. Da die Liposome in der Größe kleiner sind als 0,2 um, werden sie dann durch ein steriles 0,22 um-Filter geschickt, um irgendwelche Mikroorganismen, die in der Suspension vorhanden sein können, zu entfernen. Danach werden die Liposome in sterilisierte Glasbehälter gefüllt und mit einem sterilisierten elastomeren Verschluß verschlossen.

Beispiel 1

SUVs wurden hergestellt durch Zubereitung einer organischen Lösung aus Distearoylphosphatidylcholin und Cholesterin in einem Molverhältnis von 2:1, Eindampfen der Lösung zur Tockne zur Bildung eines Lipidfilms und weiteres Trocknen des Lipids unter Vakuum. Um das anschließende Beladen des ¹¹¹In in die Vesikel zuzulassen, wurde ein zweiwertiges Ionophor (A23187) zu der Lipidlösung vor Eindampfung hinzugefügt. In einer typischen Darstellung wurden 20 umol Diasteroylphos-20 phatidylcholin, 10 umol Cholesterin und 0,04 pmol A23187 in Chloroform gelöst, unter einem Stickstoff strom bei 60ºC zu einem dünnen Film getrocknet und dann über Nacht in vacuo getrocknet.
Der getrocknete Lipidfilm wurde dann mit einer geeigneten wäßrigen Phase, zum Beispiel Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (0,9 % NaCl und 5 mM Natriumphosphat, pH 7,4), die ein Chelatisierungsagens für das Beladen des ¹¹¹In³&spplus; enthält, rehydratisiert und zur Bildung der SUVs eine Trenn- bzw. Scherkraft darauf ausgeübt. Bei einer typischen Darstellung wurden die getrockneten Lipide mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, die 1mM Nitrilotriessigsäure (NTA) als Chelatisierungsagens enthielt, rehydratisiert, und die Mischung wurde dann bei ungefähr 65ºC beschallt, bis die Suspension aufklarte (ungefähr fünf Minuten), und dann auf 400 g zentrifugiert. Nicht eingeschlossene NTA wurde durch Filtern der Mischung durch eine Sephadex G-50 Säule von den Vesikeln entfernt. Der durchschnittliche Durchmesser der Liposome wurde mit Hilfe eines Nicomp Model 270 Submikronteilchengrößen-Analysengerätes zu weniger als 100 nm bestimmt.

Beispiel 2

Eine Mischung mit einem Molverhältnis von 2:1 von Distearoylphosphatidylcholin und Cholesterin wurde zusammen mit dem Ionophor A23187 in Chloroform gelöst. Diese Bestandteile wurden gründlich vermischt, bis sie vollständig gelöst waren. Diese Lösung wurde dann in einen Rotationsverdampfer gegeben, um das Chloroform zu entfernen und einen Lipidfilm auf der Oberfläche des Verdampferkolbens abzulagern. Wahlweise könnten andere bekannte Trocknungsmethoden verwendet werden, um den Lipidfilm oder das -pulver zu bilden.
Das Chelatisierungsmaterial (NTA) wurde dann in Phophatgepufferter Kochsalzlösung vermischt, und die resultierende Lösung wurde zu dem Lipidfilm hinzugegeben. Die so gebildeten Liposome wurden in einem Homogenisator verarbeitet, entsprechend dem in U.S.-Patent Nr. 4 753 788 von Gamble dargelegten Verfahren, um Vesikel zu liefern, die einen durchschnittlichen Durchmesser aufwiesen, der 100 Nanometer nicht überschritt. Die Liposome wurden dann über eine Gelchromatographiesäule geschickt, um das Chelatisierungsagens, das in der Suspensionslösung außerhalb der Liposome zurückblieb, zu entfernen. Das Produkt wurde dann durch einen hohlen Faserkonzentrator konzentriert, um überschüssigen Puffer zu entfernen und die Liposom-Suspension zur konzentrieren.
Danach wurden die Liposome durch ein steriles 0,22 um- Filter gefiltert und in sterilisierte Glasbehälter in einen Klasse 100 Abzug überführt und mit sterilisierten elastomeren Verschlüssen verschlossen. Während dieses gesamten Prozesses wurden geeignete QA/QC-Verfahren angewendet, um sterile Herstellungsbedingungen sicherzustellen.

Vesikelbeladung

Wie oben angemerkt, können Vesikel während der Lipidbildung mit amphiphilen Agenzien, während der Hydratisierung mit wasserlöslichen Agenzien oder mit anderen bekannten Beladungsverfahren beladen werden. Da das Anvisieren myokardialen Gewebes durch die Liposome am besten anhand des Transports von radioaktivem Agenz demonstriert wird, wurde das gammabildende Agens ¹¹¹Indium³&spplus; direkt vor der Verwendung in die Liposome geladen.

Beispiel 3

Das Beladen wurde durch die Verwendung von Inkubationsgemischen von 500 ul Vesikeln, 35 ul 3,4 pM InCl&sub3; in 104mM Natriumcitrat (ph 7,4) und 1-50 ul ¹¹¹In³&spplus;, abhängig von der geforderten Aktivität, erreicht. Das Volumen von PBS, das zweimal dem des ¹¹¹In³&spplus;-Zugabe entsprach, war in der Inkubationsmischung enthalten. Inkubationszeit und -temperatur können entsprechend den veröffentlichten Verfahren wie von Mauk et al, Analytical Biochemistry 94, 302-307 (1979), gewählt werden. Allgemein wird das Beladen durch Inkubation bei 60 bis 80ºC über 15 bis 60 Minuten durchgeführt. Die Inkubation wird durch Abkühlung der Probe, gefolgt von der Zugabe von 10 mM EDTA in PBS, beendet. Bis zu 90 % des zugefügten ¹¹¹indiums können mit dieser Methode in die vorgeformten Liposome eingefügt werden, und die Liposome produzieren spezifische Aktivitäten von bis zu 300 uCi/mg Lipid.

Beispiel 4

Probenfläschen, die nach dem Prozeß von Beispiel 2 hergestellt wurden, enthielten jeweils 4,7 ml der Liposom- Suspension (25 mg Liposome pro ml) und enthielten kleine unilamellare Liposome, vorwiegend mit einem Durchmesser von 50 bis 100 nm. Die Liposome in diesen Probenfläschen wurden entsprechend dem folgenden Prozeß beladen. 0,2 ml 0,1 M Natriumcitrat zur Injektion wurde jedem Probenfläschchen zugegeben und gut vermischt. Standard-radiopharmazeutischen Verfahren folgend, um die radiopharmazeutische Dosierung zu berechnen, wurde dann eine Menge ¹¹¹Indiumchloridlösung, ausreichend, um die vorgeschriebene Dosis ¹¹¹In³&spplus; zur Zeit der Injektion zu erreichen, zugefügt. Diese Mischung wurde dann bei 80ºC für 30 Minuten inkubiert, gefolgt von einer Abkühlung auf Raumtemperatur.
0,1 ml 0,1 M Natriumedetat zur Injektion wurde dann hinzugefügt, um die Liposombeladung durch Chelatisierung jeglichen überschüssigen ¹¹¹In zu beenden. Während dieses Prozesses wurde die radioaktive Beladungswirksamkeit durch Entnahme von 0,5 ml der Liposomlösung vor Beendigung der Liposom-Beladungsprozedur und Überführung der Lösung in ein 1,5 ml Zentrifugengläschen, das 0,5 g Chelex 100 enthielt, getestet. Der Inhalt des Zentrifugenfläschchens wurde unter gelegentlichem Mischen für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, und die Gesamtradioaktivität des zentrifugierten Gläschens wurde unter Verwendung eines Dosenkalibrators bestimmt. 0,5 ml 0,1 M Natriumcitrat zur Injektion wurde dem Zentrifugengläschen anschließend zugefügt und dann gemischt. Das Gläschen wurde 5 Minuten bei mäßiger Geschwindigkeit zentrifugiert, um das Chelex 100 zu kompaktieren. 0,5 ml überstehendes wurden mit einer geeigneten Spritze entfernt und die Radioaktivität des Überstehenden bestimmt. Die Beladungswirksamkeit wurde durch Teilung der doppelten Radioaktivität des Überstehenden durch die Gesamtradioaktivität mal 100 berechnet, um die Ladungswirksamkeit in Prozent zu ergeben. In allen Fällen war die Beladungswirksamkeit größer als 90 %.

Anvisieren des ischämischen Herzmuskelgewebes

Beispiel 5

Ein Beispiel für den bevorzugten Transport der kleinen unilamellaren Liposome der Erfindung zu ischämischem Herzmuskel bei Abwesenheit von Antikörper-Anvisiergewebe wird durch die Verwendung der markierten Liposome gezeigt, die in Übereinstimmung mit den Verfahren der Beispiele 2 und 4 hergestellt wurden. Die Liposome wurden bei Tieren angewendet und zeigten ein Anvisieren solchen Gewebes.
Alle verwendeten Tiere waren Hundemischlinge beiden Geschlechts (16-20 kg, N = 4). Die Tiere wurden vor der Operation unter Verwendung von 30 mg/kg Natriumpentobarbital als i.v.-Injektion betäubt. Polyethylenkatheter wurden zur Messung des Blutdruck und der Herzfrequenz, zur Blutprobenentnahme und zur Injektion der Liposome in femorale Arterien und Venen eingeführt. Die Luftröhre wurde kanüliert, und das Tier wurde mit einem Harbard Beatmungsgerät unter Verwendung von Raumluft künstlich beatmet. Eucapnia wurde aufrechterhalten und mit einem Godart-Statham-Capnographen beobachtet und aufgezeichnet. Es wurde eine linke Thorakotomie am fünften interkostalen Raum durchgeführt, eine teilweise Perikardiotomie, legte das Herz frei, und es wurde eine perkardiale Wiege gebildet. Ungefähr ein cm der linken vorderen absteigenden Herzarterie (LAD) wurde gerade distal zu ihrem ersten Hauptzweig isoliert, und es wurde eine Seiden-Unterbindung lose um das Blutgefäß herum plaziert. Der aortalische Druck sowie die Herzfrequenz wurden unter Verwendung eines Statham P23AA Meßwertwandlers gemessen und auf einem Beckmann R-411-Rekorder aufgezeichnet. Blutproben, die von dem femoralen Arterienkatheter erhalten wurden, wurden elektrometrisch auf Blutgase und ph untersucht (Radiometer BMS3 Blutgas-Analysator).
Zu dieser Zeit wurden 6 mg/kg der ¹¹¹In markierten Liposome, die wie in den Beispielen 2 und 3 hergestellt wurden, i.v. injiziert. Nach Injektion der Liposome in die Tiere wurden arterielle Blutproben 1, 2, 3, 4, 5, 10 Minuten und 1, 2, 3, 4, 5, 6 Stunden nach der Injektion entnommen, und die Blutradioaktivität wurde später bestimmt. Zehn Minuten nach der Liposomeninjektion wurde die LAD über die chirurgische seidenschlinge verschlossen und der Verschluß wurde für zwei Stunden fortgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurde der Verschluß freigegeben, und es wurde ermöglicht, daß die Reperfusion über 4 Stunden fortdauerte.
Am Ende des Experiments wurden wiederum Blutgas und hämodynamische Variablen bestimmt, und dann wurde das Herz entfernt. Die Aorta wurde bei einem Druck von 100 mm Hg mit Salzlösung durchspült, um die Herzgefäße von Blut zu reinigen. Die linke ventrikulare freie Wand wurde dann in 6 transmurale Stücke von der ischämischen Zone und 6 von der nichtischämischen Region zerschnitten. Diese Stücke wurden dann in subepikardiale und subendokardiale Hälften zerteilt. Proben der Leber und des Gracilismuskels wurden ebenfalls entnommen. Dann wurde die Radioaktivität sowohl in den Blut- als auch in den Gewebeproben unter Verwendung eines Hewlett-Packard Gammazählers bestimmt.
Alle Daten wurden unter Verwendung eines gepaarten T- Testes analysiert. Die Gewebe- und Blutreinigungsdaten wurden als Zählungen pro Minute (counts per minute = CPM) der Radioaktivität pro Gramm Gewebe oder Blut ausgedrückt. Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung abgebildet.
Hermodynamische Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Werte lagen innerhalb des für Hunde normalen Bereiches. Für keine dieser Variablen gab es während des Verlaufs des Experimentes irgendwelche Unterschiede. Während des Experimentes konnten keine Veränderungen in den Blutgasen beobachtet werden.
Die Blutreinigungsdaten für die Liposome sind in Fig. 1 gezeigt. Wie daraus entnommen werden kann, gibt es eine schnelle anfängliche Reinigung, gefolgt von einer 1angsameren Reinigungsphase. Die Daten sind als die CPM Radioaktivität (CPM)/g Blut ausgedrückt. Es ist erkennbar, daß mehr als die Hälfte der Liposome am Ende des Experimentes aus dem Blut gereinigt sind.
Daten für Herzmuskelreinigung von Liposomen sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Daten sind als CPM/g Gewebe angegeben. die ischämische Region enthielt in allen Tieren bedeutend mehr Radioaktivität im Vergleich zu ihrer gepaarten nicht ischämischen Region. Diese Differenz war 5 - 10-fach. Innerhalb der ischämischen Region enthielt das Subendokardium zweimal die Readioaktivität, die im Subepikardium enthalten war, und dieser Unterschied war bedeutend. Die Leber reinigte aktiv Liposome, wobei das gereinigte CPM/g 12,34 x 10&sup4; ± 5,49 x 10&sup4; PM/g betrug, und die Skelettmuskulatur reinigte einen Betrag ähnlich dem der nicht ischämischen Region des Herzens 0,11 x 10- + 0,01 x 10- CPM/g.

Zusammenfassung Bioverteilung markierter Liposome in caniner Ischämie

Tiere: 16-20 kg schwere Hunde - 4 untersucht
Durchschnittliche Gesamtlipiddosis: 6 mg/kg x 18 kg = 108 mg Lipid
Durchschnittliche Gesamtradioaktivität (berechnet vom durchschnittlichen Blutpegel bei Injektion): 1300 x 10&sup4; cpm
Durchschnittliche Bioverteilung bei 6 Stunden: cpm/gm (x 10&sup4;)
ischämisches Subendokardium 2,2 + 1,1
ischämisches Subepikardium 1,6 + 0,9
nicht ischämisches Subendokardium 0,26 + 0,10
nicht ischämisches Subepikardium 0,27 + 0,14
Blut 2,0 + 0,5
Skelettmuskulatur 0,11 + 0,01
Leber 12,3 + 5,5
Myokardiale Ischämie und Infarzierung sind neben anderen Dingen durch eine Zunahme der Kapillaren-Permeabilität gekennzeichnet. Diese erhöhte Permeabilität kann selektiven Medikamententransport zur ischämischen Region durch Verwendung von Liposomen geeigneter Größe als Transportvehikel erlauben. In der vorliegenden Studie war die Lokalisierung der ischämischen Region gegen Radioaktivität (und wahrscheinlich Liposomen) im Vergleich zu dem nicht ischämischen Herzmuskel 5 -10 mal größer. Während ich nicht auf irgendeine bestimmte Theorie festgelegt werden möchte, scheint es, daß die Liposome aufgrund von erhöhter Kapillarpermeabilität in der ischämischen Region lokalisiert wurden. Interessanterweise neigte das ischämische Subendokardium dazu, im Vergleich zu dem ischämischen Subepikardium mehr Liposome zu lokalisieren. Dies kann die Tatsache wiederspiegeln, daß das Subendokardium normalerweise während Ischämie einem höheren Risiko ausgesetzt ist. Der nicht ischämische Subepikardial-Subendokardial-Unterschied bei der Lokalisierung von Liposomen war nicht bedeutend unterschiedlich.
Die hohe Leberreinigung von Liposomen ist nicht erstaunlich, da dieses Organ einer der Hauptorte für die Entfernung von vom Blut getragenen Partikeln ist. Dies deutet auch an, daß das ¹¹¹In an Liposome gebunden war, da freies ¹¹¹In wahrscheinlich nicht von der Leber gereinigt werden würde. Die geschätzte Markierungseffizienz betrug 70 - 80 %. Das nicht ischämische Myokardium und die Skelettmuskulatur wiesen eine verhältnismäßig geringe Liposomlokalisierung auf.
Aus der oben gegebenen Beschreibung ist es ersichtlich, daß Liposome mit einer Größe von weniger als ungefähr 200 Nanometern, vorzugsweise von 60 bis 100 nm, bevorzugt ischämische Herzmuskelregion durch aktive Agenzien wie diagnostische oder therapeutische Agenzien anvisieren und besonders die selektive Lokalisierung der Liposomen in das ischämische Subendokardium, das üblicherweise einem höheren Risiko ausgesetzt ist, erlauben und somit den Medikamententransport zu der Region der höchsten ischämischen Belastung erleichtern werden. Tabelle 1 Hermodynamische Daten für Liposom-behandelte Tiere vor und nach LAD-Verschluß und -Reperfusion vor Verstopfung nach Verstopfung + Reperfusion Systolischer Blutdruck 137 + 22 136 + 22 (mm Hg) Diastolischer Blutdruck 116 + 27 100 + 20 (mm Hg) Herzfrequenz 160 + 28 182 + 21 (Schläge/Minute) Alle Werte sind als Mittelwert +- Standardabweichung (N = 4) Tabelle 2 Lokalisierung von ¹¹¹In-markierten Lipsomen im ischämischen und nicht ischämischen Myokardium ischämische Region (x 10&sup4;) nicht ischämische Region (x 10&sup4;) Subepikardium Subendokardium Radioaktivität- (CPM/g) Alle Werte sind als Mittelwert +- Standardabweichung (N = 4) angegeben * Signifikant unterschiedlich vom jeweiligen Wert für die subepikardiale Region (P 0,05) ** Signifikant unterschiedlich vom jeweiligen Wert für die ischämische Region (P 0,05)

Claims

1. Verwendung unilamellarer Liposome einer Größe kleiner als 200 Nanometer, die ein Agens enthalten und bei denen im wesentlichen an die Liposome gebundene Antikörper fehlen, bei der Herstellung einer Verbindung zum Plazieren des therapeutischen oder diagnostischen Agens an reversibel ischämisches Gewebe in einem Patienten.

2. Die Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Liposome bei Einführung in den Blutstrom des Patienten in ausreichender Menge verwendet werden, um bevorzugt eine Menge des Agens dem ischämischen Gewebe zuzuführen.

3. Die Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das ischämische Gewebe myokardiales Gewebe ist und das Agens bevorzugt eher dem ischämischen Gewebe als dem nicht-ischämischen Herzmuskel zugeführt wird.

4. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Liposome eine Größe zwischen ungefähr 50 und ungefähr 100 Nanometern haben.

5. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Liposome dadurch gekennzeichnet sind, daß in chemisch reinen, synthetischen Phospholipiden enthalten sind.

6. Die Verwendung nach Anspruch 5, wobei die chemisch reinen synthetischen Phospholipide aliphatische Seitenketten einer Länge von mindestens 16 Kohlenstoffatomen aufweisen.

7. Die Verwendung unilamellarer Liposome, im wesentlichen in der Abwesenheit von an die Liposome gebundenen Antikörpern, einer Größe kleiner als 200 Nanometer zum Beinhalten eines therapeutischen oder diagnostischen Agens, das gezielt an reversibel ischämisches Gewebe in einem Patienten herangeführt werden soll.

8. Die Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Liposome in ausreichender Menge verwendet werden, um, wenn sie in den Blutstrom des Patienten gebracht werden, eine Menge des Agens bevorzugt eher zu einem ischämisch myokardialem Gewebe als einem nicht-ischämischen Herzmuskel(gewebe) zu führen.