KR20230136406A - Fast 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터 및 암 유전자치료제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 gag 유전자, pol 유전자, env 유전자, IRES(internal ribosomal entry site) 서열 및 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터에 관한 것으로, 본 발명자는 p10(PuV)을 포함하는 RCR 벡터가 293 T 세포에서 유의한 합포체 형성을 유도한다는 것을 확인하였으며, 본 발명의 FAST 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터는 다양한 암세포주에 감염되어 합포체 형성을 통한 암세포 사멸을 유도하므로, 암치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

FAST 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터 및 암 유전자치료제로서의 용도{RETROVIRAL VECTOR COMPRISING FAST GENE AND AND THEIR USE AS GENE THERAPY FOR CANCER}

본 발명은 gag 유전자, pol 유전자, env 유전자, IRES(internal ribosomal entry site) 서열 및 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.

Orthoreovirus 속은 레오바이러스과(Reoviridae) 계통 내에서 속하는 15개 속 중 하나이며 두 개의 하위 그룹(융합 및 비융합)으로 나뉜다(Duncan, 1999, 2019). 레오바이러스는 10~12개의 이중 가닥 RNA 세그먼트로 구성된 게놈을 가진 20면체이고 외피가 존재하지 않는다. 레오바이러스는 포유류, 조류 및 파충류를 포함한 다양한 종에서 분리되었다.

레오바이러스과의 대부분의 구성원은 합포체(syncytium) 형성을 유도하지 않지만 모든 조류 레오바이러스(ARV, avian reovirus)는 세포 융합을 유도한다. 합포체 형성은 융합 관련 작은 막관통(FAST, fusion-associated small transmembrane) 단백질에 의해 매개된다(Boutilier and Duncan, 2011; Ciechonska and Duncan, 2014; Clancy and Duncan, 2009; Dawe and Duncan, 2002).

이러한 FAST 단백질에는 조류 레오바이러스(ARV, avian reovirus), 박쥐 레오바이러스(NBV, Nelson Bay), 풀라우 바이러스(PuV, Pulau virus)의 p10, 박쥐 레오바이러스(BroV, Broome reovirus)의 p13, 파충류 레오바이러스(RRV, reptilian reovirus)의 p14, 개코 원숭이 레오바이러스(BRV, baboon reovirus)의 p15, 아쿠아레오바이러스 그룹 C 및 G(AqRV-C 및 -G)의 p16, 아쿠아레오바이러스 그룹 A의 p22(Pritchard et al., 2006; Thalmann et al., 2010; Top et al., 2012)가 포함된다. 풀라우 바이러스를 형성하는 합포체는 말레이시아의 과일박쥐에서 분리된 Nelson Bay orthoreovirus의 새로운 구성원이다(Pritchard et al., 2006).

FAST 단백질은 비구조적 바이러스 단백질이며 가장 작은 바이러스 합포체는 95~198개 잔기 범위이다. 그들의 기능은 바이러스에 감염된 세포와 감염되지 않은 인접 세포의 융합 및 합포체 형성을 매개하는 것이다. 외피 바이러스 융합 단백질과 달리 FAST 단백질은 바이러스 진입에 관여하지 않는다. FAST 단백질은 N_exoplasmic/C_cytoplasmic 토폴로지에서 원형질막으로 소포체(ER)-Golgi 경로를 통해 트래피킹된다(Salsman et al., 2005). 조류 레오바이러스 S1 유전자의 첫 번째 ORF는 p10으로 지정된 10.3 kDa 비구조 단백질을 발현한다. p10은 레오바이러스에 감염된 세포에서 합성되는 type-1 transmembrane protein이다. 형질감염된 세포에서 p10의 발현은 효율적인 세포-세포 융합을 유도한다(Shmulevitz et al., 2003). p14는 바이시스트로닉(bicistronic) S1 게놈 세그먼트 RRV의 첫 번째 ORF에 의해 인코딩되는 것으로 나타났다. p14 단백질은 표면에 국한된 유형 III 통합 막 단백질이다. 암세포에서 p14 단백질의 발현은 광범위한 세포 융합과 광범위한 합포체 형성을 초래한다(Corcoran et al., 2006).

FAST 단백질이 종양 용해성 바이러스 요법의 효능을 증가시킬 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 p14 FAST 단백질을 발현하는 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)가 개발되었다(Ebert et al., 2004). p14 FAST를 발현하는 VSV는 암 세포 사멸 및 감염의 전파를 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 p14 FAST 단백질을 암호화하는 종양 용해성 VSV와 이중 삭제 백시니아 바이러스와의 동시 감염은 상승적으로 암세포 사멸을 촉진했다(Brown et al., 2009).

이전 연구에서는 p14 FAST를 발현하는 초기 영역 1(E1)이 삭제된 아데노바이러스(Ad)가 시험관 내 암세포 사멸을 향상시킬 수 있지만 A549 종양 모델에서 세포 간 융합을 유도하지 않는 것으로 나타났다(Del Papa et al., 2019).

여러 그룹에서 융합성 막 당단백질(FMG) 매개 세포-세포 융합 및 합포체 형성이 종양 세포 사멸을 유의하게 향상시킨다는 것을 입증했다(Guedan et al., 2012). 종양 내 FMG 발현은 바이러스 방출 및 확산을 향상시킬 수 있다(Bateman et al., 2000; Chung et al., 1999; Diaz et al., 2000; Lin et al.,2010). 최근 연구에 따르면 FMG와 FAST는 융합 후 경로를 공유한다. FAST가 독성 인자로 작용할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 우리는 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 기반 MoMLV-10A1 RCR 벡터를 사용했다(Kubo et al., 2007; Lee et al., 2019).

RCR 벡터는 효율적인 복제 및 유전자 전달을 달성하는 것으로 나타났다(Hiraoka et al., 2007; Huang et al., 2015; Kubo et al., 2019; Solly et al., 2003; Tai et al., 2005; Twitty et al., 2016).

레트로바이러스를 이용하는 유전자 치료에는 복제 결손 레트로바이러스 (Replication-deficient retrovirrus ; RDR) 벡터가 일반적으로 사용되었지만 이들 벡터로는 임상적으로 의미 있는 형질도입 효율을 달성하기 어려워 최근 마우스 백혈병 바이러스(MLV)-기반 복제 가능 레트로바이러스(RCR) 벡터가 개발되었다. RCR 벡터는 Moloney MLV 전장 게놈에서 env 유전자를 amphotropic 4070A MLV env로 대체하여 대부분의 인간 종양 세포주를 감염하도록 재조합한 벡터이다.

RCR 벡터는 분열하는 세포만 감염시킬 수 있고 숙주 염색체에 삽입되기 때문에 다른 벡터와는 달리 외부 유전자가 종양내에서 오랫동안 발현 가능한 장점이 있기 때문에 RCR 벡터의 개발은 꼭 필요한 연구 분야라고 할 수 있다. 이 벡터는 세포 용해(cytolytic)를 일으키지 않으므로 종양세포에서 치료 효과를 얻기 위해 약물 전구체(pro-drug)를 독성을 가진 화학 요법제로 변환시키는 효소 암호 유전자를 벡터에 삽입한다. 이들 유전자는 독성이 없는 기질로부터 독성을 가진 대사산물을 세포내에서 생성하기 때문에 약물 전구체의 연속적 투여로 종양세포를 사멸시킬 수 있다. 현재 Ganciclover를 Ganciclover phosphate로 변환시키는 HSV-1 thymidine kinase 유전자와 5-fluorocytidine(5-FC)를 5-fluorouracil (5-FU)로 변환시키는 cytosine deaminase 유전자 등의 자살 유전자가 많이 사용되고 있다. 자살 유전자를 탑재한 RCR 벡터는 광범위한 동물 종양 모델에서 효율적인 종양 감소를 나타내는 것으로 확인되으나 사람을 대상으로한 임상에서는 실패하였다. 이는 사람에서는 종양 진행이 동물모델에서 보다는 느리게 진행되기 때문인 것으로 판단된다.

대한민국 공개특허 제10-2020-0074283호

본 발명자는 p10(PuV)이 다른 FAST 단백질보다 더 광범위한 합포체 형성을 유도한다는 것을 확인하였다. 또한, p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터는 인간 암 세포주에서 바이러스 확산과 합포체 형성을 모두 유도했다.

MLV를 기반으로 하는 레트로바이러스 벡터에 삽입되는 외부 유전자(transgene)의 크기가 1.6kb 이상이 되면 자체적 돌연변이로 외부 유전자가 제거되거나 바이러스 복제 효율이 급격히 감소하는 것으로 알려져 있다. 이에 본 발명자는 285-594bp의 크기가 작은 유전자를 사용함으로써 안정적으로 외부유전자의 발현이 가능하도록 벡터를 제작하였다.

본 발명은 gag 유전자; pol 유전자; env 유전자; IRES(internal ribosomal entry site) 서열 및 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

상기 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자는 조류 레오바이러스(ARV, avian reovirus), 박쥐 레오바이러스(NBV, Nelson Bay), 풀라우 바이러스(PuV, Pulau virus)의 p10, 박쥐 레오바이러스(BroV, Broome reovirus)의 p13, 파충류 레오바이러스(RRV, reptilian reovirus)의 p14, 개코 원숭이 레오바이러스(BRV, baboon reovirus)의 p15, 아쿠아레오바이러스 그룹 C 및 G(AqRV-C 및 -G)의 p16 및 아쿠아레오바이러스 그룹 A의 p22 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 상기 레트로바이러스 벡터는 [서열번호 1]의 gag 유전자; [서열번호 2]의 pol 유전자; [서열번호 3]의 10A1 env 유전자 및 [서열번호 4]의 IRES(internal ribosomal entry site) 서열을 포함한다.

상기 FAST 유전자는 ARV p10(서열번호 5), PuV p10(서열번호 6), BroV p13(서열번호 7), RRV p14(서열번호 8) 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 벡터는 pCLXSN일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레트로바이러스 벡터는 서열번호 9의 염기서열을 갖는다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 레트로바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스를 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 레트로바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 암은 점액상 세포 암종, 둥근 세포 암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙(Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장 직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관 암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 섬유육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포 암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종 또는 카포시 육종일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

유전자 치료는 1980년대부터 대중에게 알려졌으며 지난 몇 년 동안 질병에 대한 기존 치료법의 중요한 대안이나 새로운 치료법으로 여겨지고 있다. 종양 환자의 생존율을 증가시키기 위해서는 유전자 치료제 같은 새로운 접근법이 필요하며 기존의 바이러스 벡터보다 안전하면서 효율적인 벡터의 개발이 절실한 상황이다. 본 연구를 통해 개발된 레오바이러스 융합 관련 작은 막 통과(FAST) 단백질을 사용한 종양 치료용 벡터는 종양 유전자 치료에 유용한 도구가 될 수 있다.

도 1은 FAST의 발현에 의한 합포체 형성을 나타내는 이미지이다. Vero 세포는 pcDNA3.1(a), pcDNA3.1-p10(b), pcDNA3.1-p10(PuV)(c), pcDNA3.1-p13(d) 및 pcDNA3.1-p14(e)로 형질감염되었다. 융합체 형성은 형질감염 후 2일째에 광학 현미경을 사용하여 모니터링하였다.
도 2는 FAST 단백질을 암호화하는 복제가능한 레트로바이러스 벡터의 다양한 구조를 나타낸다.
도 3은 FAST를 발현하는 복제 가능한 레트로바이러스 벡터에 의한 융합체 형성을 나타내는 이미지로, 293개의 T 세포를 MoMLV-10A1-p10 + pCLXSNEGFP(a), MoMLV-10A1-p10(PuV) + pCLXSN-EGFP(b), MoMLV-10A1-p10 + pCLXSN-EGFP(c), and MoMLV-10A1-p14 + pCLXSN-EGFP(d)로 형질감염시켰다.
도 4는 FAST 매개 세포독성을 나타내는 결과로, Vero 세포를 p10(PuV)에 의해 일시적으로 형질감염시키고 5일 후에 MTT 분석에 의해 세포 생존율을 측정하였다. pcDNA3.1(+)을 음성 대조군으로 사용했다. 결과는 3회 수행된 3개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표시된다.
도 5는 p10(PuV)에 의해 매개되는 합포체 형성 이미지를 나타내며, HeLa, HT1080 및 U87 세포를 pcDNA3.1-p10(PuV)으로 형질감염시켰다. 합포체 형성은 형질감염 후 2일째에 광학 현미경을 사용하여 모니터링하였다.
도 6은 p10(PuV)을 발현하는 복제 가능한 레트로바이러스 벡터의 융합체 형성을 유도 결과를 나타내는 이미지로, HT1080 세포를 MoMLV-10A1-p10(PuV) + pCLXSN-EGFP 형질감염된 293 T 세포로부터 수집된 상청액으로 감염시켰다. HT1080 세포는 감염 후 1일, 14일 및 20일에 광학 현미경(상단 패널) 또는 형광 현미경을 사용하여 관찰되었다.
도 7은 1.3 Х 10⁴ sfu/mL의 p10(PuV) 발현 RCR 벡터로 감염된 인간 암 세포주에서 융합체 형성의 정량화를 나타내는 그래프이다. 결과는 융합 지수의 백분율로 표시된다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 제한되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명의 일 실시예에서, gag 유전자; pol 유전자; env 유전자; IRES(internal ribosomal entry site) 서열 및 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

구체적으로 상기 레트로바이러스 벡터는 gag 유전자; pol 유전자; env 유전자; IRES(internal ribosomal entry site) 서열 및 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 순차적으로 포함할 수 있다.

상기 Gag 유전자는 레트로바이러스 코어를 구성하는 4종의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 한편, 상기 Pol 유전자는 레트로바이러스의 역전사 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 상기 env 유전자는 레트로바이러스의 외피 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

레트로바이러스 벡터의 표적 세포에의 감염은 바이러스 외피(env) 단백질과 세포 수용체간의 특이적 상호 작용을 통하여 일어나고 이런 상호작용이 숙주 범위(host range)과 감염효율(efficiency of infection)을 결정한다. "슈도타입 레트로바이러스(pseudotyped retrovirus)"은 바이러스 게놈의 env 유전자 전체 또는 일부분을 이종의 다른 유전자로 교체 혹은 치환된 레트로바이러스를 의미하며, 이러한 경우 원래의 바이러스가 가지는 숙주 범위가 확장되거나 변할 수 있고 감염성을 증가시킬 수 있다.

바람직한 실시예에서, 외피는 암포트로픽(amphotropic), 폴리트로픽(polytropic), 제노트로픽(xenotropic), 10A1, GALV, 개코원숭이 내생 바이러스, RD114, 라브도바이러스, 알파 바이러스, 홍역 또는 인플루엔자 바이러스 외피 중 하나로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 상기 레트로바이러스 벡터는 [서열번호 1]의 gag 유전자; [서열번호 2]의 pol 유전자; [서열번호 3]의 10A1 env 유전자 및 [서열번호 4]의 IRES(internal ribosomal entry site) 서열을 포함할 수 있다.

상기 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자는 조류 레오바이러스(ARV, avian reovirus), 박쥐 레오바이러스(NBV, Nelson Bay), 풀라우 바이러스(PuV, Pulau virus)의 p10, 박쥐 레오바이러스(BroV, Broome reovirus)의 p13, 파충류 레오바이러스(RRV, reptilian reovirus)의 p14, 개코 원숭이 레오바이러스(BRV, baboon reovirus)의 p15, 아쿠아레오바이러스 그룹 C 및 G(AqRV-C 및 -G)의 p16 및 아쿠아레오바이러스 그룹 A의 p22 중 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게 상기 FAST 유전자는 ARV p10(서열번호 5), PuV p10(서열번호 6), BroV p13(서열번호 7), RRV p14(서열번호 8) 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서 "벡터"란 목적 유전자를 코딩하는 DNA, RNA 등의 핵산 서열을 숙주 세포로 도입되기 위한 수단을 의미한다. 특히, 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물이다. 상기한 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 핵산 발현 조절 서열과 목적 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다.

"목적 단백질"이란 숙주세포에서 발현하고자 하는 또는 발현할 수 있는 단백질로, 본 발명에서 목적 단백질은 FAST(fusion-associated small transmembrane) 단백질이다.

본 발명에 사용된 발현 벡터는 레트로바이러스계 벡터이다. 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 목적하는 단백질을 코딩하는 방법은 비바이러스성 방법(nonviral delivary technique)에 비하여 외래유전자의 전이 및 발현 효율이 월등히 높다는 장점이 있다. 유전자 도입을 위한 바이러스 벡터의 개념은 문헌(Verma and Somia (1997) Nature 389:239-242)에 잘 알려져 있다. 이는 바이러스 벡터 시스템이 바이러스 고유한 증식기전으로 인하여 세포질로 유전자를 전달하는 효율이 높고, 유입된 유전자가 라이소좀(lysosome)를 거치지 않기 때문에 분해되지 않고 핵 내로 수송되기 때문이다. 특히, 레트로바이러스 벡터의 경우 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되는 특징이 있어서 세포의 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되는 장점이 있다. 특히, 본 발명의 가금의 형질전환에 사용되는 벡터는 MLV-유래(MLV-derived) 레트로바이러스 벡터이다.

레트로바이러스 게놈은 입자 형성과 복제에 관여하는 유전자인 gag, pol 및 env라고 불리는 유전자를 포함한다. gag 유전자는 MA (matrix), CA (capsid) 및 NC (nucleocapsid)의 단백질로 프로세싱된다. pol 유전자는 역전사 효소 및 인터그레이즈(integrase) 유전자등 복제에 필요한 효소를 코딩하고 있다. env 유전자는 바이러스 외피의 표면 당단백질을 코딩하고 있다. env당단백질은 숙주세포의 세포 수용체 단백질과 상호작용하여 바이러스 막과 세포막의 융합이 유도되고 이에 의해 바이러스 감염이 일어나게 한다. 이들 유전자는 프로바이러스의 2개의 LTR(long terminal repeat) 사이에 위치한다. LTR은 레트로바이러스 DNA의 양 끝에 위치하는 것으로 U5, R 및 U3를 나타내는 3개의 요소로 나뉜다. 이들 요소는 레트로바이러스의 생물학적 활성에 필요한 다양한 서열을 포함한다. U3는 프로모터와 인핸서 서열과 같은 프로바이러스의 전사 조절요소의 대부분을 가진다. R 영역은 레트로바이러스의 역전사에 중용한 역할을 하고 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. U5는 레트로바이러스 게놈의 패키징에 중요한 서열을 포함한다.

레트로바이러스 벡터는 U5 및 gag 유전자 사이에 패키징 신호(ψ)가 위치할 수 있으며, 상기 패키징 신호(ψ)는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화를 위해 필요한 레트로바이러스 게놈 내에 위치되는 비암호 서열을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol. 69, No. 4; pp. 2101-2109] 참조).

레트로바이러스 벡터는 외부 유전자를 세포 내로 효율적으로 도입하여 숙주세포의 게놈내로 안정하게 삽입시킬 수 있는 장점에도 불구하고 감염된 세포 내에서 자유롭게 복제 및 재생산되어 다른 세포를 감염시키기 때문에 문제가 있다. 본 발명에서는 이러한 레트로바이러스의 안전성(bio-safety)에 관한 문제점들을 극복하기 위하여 레트로바이러스의 gag, pol 및 env 유전자를 제거한 복제-결핍 레트로바이러스 벡터를 제조하고, gag, pol 및 env 유전자를 따로 발현하는 패키징 세포를 사용하여 최종적으로 복제-결핍 바이러스를 제조하였다. 본 발명에서 사용한 레트로바이러스 벡터는 MLV(murine leukemia virus)-유래 복제-결핍 바이러스 벡터이다.

본 발명에서 "내부 이종 프로모터"는 바이러스 벡터로서 사용되는 레트로바이러스 자체의 LTR 서열 중의 프로모터가 아닌 다른 생물체로부터 유래하는 프로모터를 일컫으며, 이러한 프로모터가 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 작동가능하게 연결되어 목적 단백질의 전사를 유도한다. 본 발명의 내부 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 MLV-유래 복제 결핍 바이러스 벡터의 제작을 위해 사용된 벡터는 pCLXSN(Novus Biologicals, Littleton, USA)이다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 서열번호 9의 염기서열을 갖는다.

상기 레트로바이러스 벡터는 복제가능한 레트로바이러스 벡터로 핵막이 깨지는 틈을 타 핵 안으로 들어가기 때문에 분열하는 세포, 즉 암세포에 특이적으로 감염될 수 있어 삽입된 유전자가 다른 정상세포에서 발현되는 것을 막을 수 있다. 따라서, 상기 벡터는 암세포로 안전하게 유전자를 전달할 수 있고, 바이러스의 복제가 가능하기 때문에 유전자의 전달 효율도 증대시킬 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 레트로바이러스 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 제공한다.

또한 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 레트로바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 레트로바이러스는 분열 중인 모든 세포를 포적할 수 있으며, 구체적으로 상기 세포는 암세포일 수 있다.

상기 암세포는 점액상 세포 암종, 둥근 세포암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙 (Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평 상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성 골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출 림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소 세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소 세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광 암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 섬유육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종, 또는 카포시 육종과 같은 암으로부터 유래된 세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.

<서열목록>

서열 번호	유전자	서열
1	MuLV-gag	atgggccagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgccaaacctaaacctcaagttctttctgacagtggggggccgctcatcgacctacttacagaagaccccccgccttatagggacccaagaccacccccttccgacagggacggaaatggtggagaagcgacccctgcgggagaggcaccggacccctccccaatggcatctcgcctacgtgggagacgggagccccctgtggccgactccactacctcgcaggcattccccctccgcgcaggaggaaacggacagcttcaatactggccgttctcctcttctgacctttacaactggaaaaataataacccttctttttctgaagatccaggtaaactgacagctctgatcgagtctgttctcatcacccatcagcccacctgggacgactgtcagcagctgttggggactctgctgaccggagaagaaaaacaacgggtgctcttagaggctagaaaggcggtgcggggcgatgatgggcgccccactcaactgcccaatgaagtcgatgccgcttttcccctcgagcgcccagactgggattacaccacccaggcaggtaggaaccacctagtccactatcgccagttgctcctagcgggtctccaaaacgcgggcagaagccccaccaatttggccaaggtaaaaggaataacacaagggcccaatgagtctccctcggccttcctagagagacttaaggaagcctatcgcaggtacactccttatgaccctgaggacccagggcaagaaactaatgtgtctatgtctttcatttggcagtctgccccagacattgggagaaagttagagaggttagaagatttaaaaaacaagacgcttggagatttggttagagaggcagaaaagatctttaataaacgagaaaccccggaagaaagagaggaacgtatcaggagagaaacagaggaaaaagaagaacgccgtaggacagaggatgagcagaaagagaaagaaagagatcgtaggagacatagagagatgagcaagctattggccactgtcgttagtggacagaaacaggatagacagggaggagaacgaaggaggtcccaactcgatcgcgaccagtgtgcctactgcaaagaaaaggggcactgggctaaagattgtcccaagaaaccacgaggacctcggggaccaagaccccagacctccctcctgaccctagatgactag
2	MuLV-pol	caaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtccaaaaatcccgatcgttttggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgagaatatgggccagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgccaaacctaaacctcaagttctttctgacagtggggggccgctcatcgacctacttacagaagaccccccgccttatagggacccaagaccacccccttccgacagggacggaaatggtggagaagcgacccctgcgggagaggcaccggacccctccccaatggcatctcgcctacgtgggagacgggagccccctgtggccgactccactacctcgcaggcattccccctccgcgcaggaggaaacggacagcttcaatactggccgttctcctcttctgacctttacaactggaaaaataataacccttctttttctgaagatccaggtaaactgacagctctgatcgagtctgttctcatcacccatcagcccacctgggacgactgtcagcagctgttggggactctgctgaccggagaagaaaaacaacgggtgctcttagaggctagaaaggcggtgcggggcgatgatgggcgccccactcaactgcccaatgaagtcgatgccgcttttcccctcgagcgcccagactgggattacaccacccaggcaggtaggaaccacctagtccactatcgccagttgctcctagcgggtctccaaaacgcgggcagaagccccaccaatttggccaaggtaaaaggaataacacaagggcccaatgagtctccctcggccttcctagagagacttaaggaagcctatcgcaggtacactccttatgaccctgaggacccagggcaagaaactaatgtgtctatgtctttcatttggcagtctgccccagacattgggagaaagttagagaggttagaagatttaaaaaacaagacgcttggagatttggttagagaggcagaaaagatctttaataaacgagaaaccccggaagaaagagaggaacgtatcaggagagaaacagaggaaaaagaagaacgccgtaggacagaggatgagcagaaagagaaagaaagagatcgtaggagacatagagagatgagcaagctattggccactgtcgttagtggacagaaacaggatagacagggaggagaacgaaggaggtcccaactcgatcgcgaccagtgtgcctactgcaaagaaaaggggcactgggctaaagattgtcccaagaaaccacgaggacctcggggaccaagaccccagacctccctcctgaccctagatgactagggaggtcagggtcaggagcccccccctgaacccaggataaccctcaaagtcggggggcaacccgtcaccttcctggtagatactggggcccaacactccgtgctgacccaaaatcctggacccctaagtgataagtctgcctgggtccaaggggctactggaggaaagcggtatcgctggaccacggatcgcaaagtacatctagctaccggtaaggtcacccactctttcctccatgtaccagactgtccctatcctctgttaggaagagatttgctgactaaactaaaagcccaaatccactttgagggatcaggagctcaggttatgggaccaatggggcagcccctgcaagtgttgaccctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaaacagggctacgccaaaggcgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtctaaaaagctagacccagtggcagctggctggcccccttgcctacggatggtggcagccattgcagttctgacaaaagatgctggtaagctcactatgggacagccattagtcattctggccccccatgccgtagaggcactagttaagcaaccccctgatcgctggctctccaacgcccggatgacccattaccaagccctgctcctggacacggaccgggtccagttcgggccagtagtggccctaaatccagctacgctgctccctctgcctaaggaggggctgcaacatgactgtcttgacatcttggctgaagcccacggaactagatcagatcttacggaccagcccctcccagacgccgaccacacctggtacacggatgggagcagcttcctgcaagaagggcagcgcaaggccggagcagcggtgaccaccgagactgaggtaatctgggccagggcattgccagccgggacatcggcccaaagagctgaactgatagcgctcacccaagccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgccaccgctcatattcatggagaaatatacagaagacgcgggttgctcacatcagaaggaaaagaaatcaagaacaagggcgagatcttagccctactaaaggctctcttcttgcccaaaagacttagcataattcattgcccggggcatcaaaaaggaaacagcgcagaggccaggggcaaccggatggccgaccaagcggcccgagaagtagccactagagaaactccagacacttccacacttctgatagaaaattcaaccccctatacccatgaacactttcactatacagtaactgatataaaagatctgaccaaactaggagccacttatgacagtgcaaagaaatattgggtctatcaaggaaagcgtgttatgcctgatcaattcacctttgggttactagactttcttcatcaaatgacccacctcagcttctcaaaaacaaaggctctcctagagagaagccccagtccctactacatgctgaaccgagatcgaacactcaaaaatatcactgagacctgcaaagcttgtgcccaagtcaatgccagcaagtctgccgtcaagcaaggaactagggtccgcgggcaccggcctggcacacattgggagattgattttaccgaagtaagacctggattgtatggctataaatatcttttagtttttgtagatactttctctggctgggtagaagctttcccaaccaagaaagaaaccgccaaggtcgtaaccaagaaactgttagaggagatcttccccaggttcggcatgcctcaggtgttgggaactgacaatgggcctgccttcgtctccaaggtgagtcagacagtggccgatctgctggggattgattggaaattacattgtgcgtaccgaccccaaagctcaggtcaggtagaaagaatgaataggaccatcaaggagactttaactaaattaacgcttgcaactggcactagagactgggtactcctacttcccttagccctctaccgagcccgcaacactccgggcccccatggactcactccgtatgaaatcctgtatggggcgcccccgccccttgttaatttccatgatcctgaaatgtcaaagtttactaatagcccctctctccaagctcacttacaggccctccaagcagtacaacgagaggtctggaagccactggccgctgcctatcaggaccagctggaccagccagtgataccacaccccttccgtgtcggcgacaccgtgtgggtacgccggcaccagactaagaacttggaacctcgctggaaaggaccctacaccgtcctgctgaccacccccaccgctctcaaagtagacggcatcgctgcgtggatccacgccgctcacgtaaaggcggcgacaacccctccggccggaacagcatcaggaccgacatggaaggtccagcgttctcaaaaccccttaaagataagattaacccgtggaagtccttaa
3	10A1 env	tggtcatgggggtcctattaagagtagggatggcagagagcccccatcaggtctttaatgtaacctggagagtcaccaacctgatgactgggcgtaccgccaatgccacctcccttttaggaactgtacaagatgccttcccaagattatattttgatctatgtgacctggtcggagaagagtgggacccttcagaccaggaaccatatgtcgggtatggctgcaaataccccggagggagaaagcggacccggacttttgacttttacgtgtgccctgggcataccgtaaaatcggggtgtggggggccaagagaaggctactgtggtgaatggggttgtgaaaccaccggacaggcttactggaagcccacatcatcatgggacctaatctcccttaagcgcggtaacaccccctgggacacgggatgctccaaaatggcttgtggcccctgctatgacctctccaaggtatccaattccttccaaggggctactcgagggggcagatgcaaccctctagtcctagaattcactgatgcaggaaaaaaggctaattgggacgggcccaaatcgtggggactgagactgtaccggacaggaacagatcctattaccatgttctccctgacccgccaggtcctcaatatagggccccgcatccccattgggcctaatcccgtgatcactggtcaactacccccctcccgacccgtgcagatcaggctccccaggcctcctcagcctcctcctacaggcgcagcctctatagtccctgagactgccccaccttctcaacaacctgggacgggagacaggctgctaaacctggtagaaggagcctatcaggcgcttaacctcaccaatcccgacaagacccaagaatgttggctgtgcttagtgtcgggacctccttattacgaaggagtagcggtcgtgggcacttataccaatcattctaccgccccggccagctgtacggccacttcccaacataagcttaccctatctgaagtgacaggacagggcctatgcatgggagcactacctaaaactcaccaggccttatgtaacaccacccaaagtgccggctcaggatcctactaccttgcagcacccgctggaacaatgtgggcttgtagcactggattgactccctgcttgtccaccacgatgctcaatctaaccacagactattgtgtattagttgagctctggcccagaataatttaccactcccccgattatatgtatggtcagcttgaacagcgtaccaaatataagagggagccagtatcgttgaccctggcccttctgctaggaggattaaccatgggagggattgcagctggaatagggacggggaccactgccctaatcaaaacccagcagtttgagcagcttcacgccgctatccagacagacctcaacgaagtcgaaaaatcaattaccaacctagaaaagtcactgacctcgttgtctgaagtagtcctacagaaccgaagaggcctagatttgctcttcctaaaagagggaggtctctgcgcagccctaaaagaagaatgttgtttttatgcagaccacacgggactagtgagagacagcatggccaaactaagggaaaggcttaatcagagacaaaaactatttgagtcaggccaaggttggttcgaagggcagtttaatagatccccctggtttaccaccttaatctccaccatcatgggacctctaatagtactcttactgatcttactctttggaccctgcattctcaatcgat
4	IRES	ctcgagctcgaggcccctctccctcccccccccctaacgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
5	FAST p10	ccatggtgcgtatgcctcccggttcgtgtaacggtgcgactgctgtatttggtaacgttcattgtcaggcagctcaaaacacggcaggtggtgatttgcaagctacgtcatccataattgcatattggccttatctagcggcgggtggtggtttcttattaattgttatcattttcgctcttctatactgttgtaaggctaaggtcaaggcggacgctgcacgtagtgtcttccatcgtgagctggtagcgttgagttctggtaagcacaatgcaatggctccgccatacgacgtttgagcggccgc
6	FAST p10(PuV)	ccatgggcggtgattgtgctggtctggtttccgtgtttggtagtgtccattgtcaatcttctaagaataaggccggaggagatctacaggctacatccattttgactacttactggccccatcttgccattggtggtggtattatcctggttatctttctgcttgggctgttttactgctgctatctcaagtggaagacgtctcatatcaggcgtacttaccataaagaattggttgcgttaacccgcggatatgtcaggccgatctcggcggacgttaccagtgtctgagcggccgc
7	FAST p13	ccatggggagcggtccttcaaacttcgtgaataaggtggacggagcgagtgcacctattaaggagcatgctataccctcgctaactagtgatttgaaagattacttatatactatagtaacggcagtcattttgttagttatattgtggttcttatatcgatattacaaagataagaaggcgcggaaaaagaaagaagatatacttttgcgtttatatgggcgtgggctgaatttgtcacggttagaccctagtgttatatgttcgttaggtggttctgctccaaatttacagcatagaggactggaacgaacggaggataaattagtgaacccttttatataggcggccgc
8	FAST p14	ccatggggagtggaccctctaatttcgtcaatcacgcacctggagaagcaattgtaaccggtttggagaaaggggcagataaagtagctggaacgatatcacatacgatttgggaagtgatcgccggattagtagccttgctgacattcttagcgtttggcttctggttgttcaagtatctccaaaagagaagagaaagaaggagacaactcactgagttccaaaaacggtatctacggaatagctacaggttgagtgagatccagagacctatatcacagcacgaatacgaagacccatacgagccaccaagtcgtaggaaaccaccccctcctccttatagcacatacgtcaacatcgataatgtctcagccatttagcggccgc

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예>

1. 세포주

293 T 인간 배아 신장 세포주(ATCC CRL-11,268), HeLa 자궁경부암 세포(ATCC CCL-2), HT1080 인간 섬유육종 세포(ATCC CCL-121), U-87 인간 신경교종 세포(ATCC HTB-14), TE671 인간 횡문근 육종 세포 (ATCC CRL-8805) 및 Vero 원숭이 신장 세포(ATCC CCL-81)는 10% 소태아 혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 Eagle 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 1시간 동안 유지되었다.

2. 서로 다른 4개의 FAST 유전자 클로닝

Avian reovirus strain 176 p10(GenBank accession number AF218358), Pulau reovirus p10(AY357730), Broome virus p13(GQ258986), Reptilian reovirus p14(AY238887)는 Cosmogene Tech(Seoul, Korea)에서 합성하였다. p10(PuV) 및 p13을 EcoRI/NotI로 처리하고 포유류 발현 벡터인 pcDNA3.1(+)에 클로닝하여 각각 pcDNA3.1-p10(PuV) 및 pcDNA3.1-p13을 제조하였다. 3개의 혈구응집소(HA, hemagglutinin) 에피토프 태그가 p10(ARV) 및 p14의 C-말단에 추가되었다. 에피토프 태그에 사용된 프라이머는 다음과 같다; p10 F 5'AAGCTT GCCACCATGCTGCGTATGCCTCCCGGTTCGTG-3'(HindIII 제한 부위는 밑줄, Kozak 서열은 기울임꼴), p10 R 5'-CTCGAGTTAACGTCGTATGGCGGAGCCAT-3'(XhoI 제한 사이트 밑줄), p14 F 5'-AAGCTT GCACCATGGGGAGTGGACCCTCTAATTTC-3' p14 R 5'-CTCGAGTTATGGCTGAGACATTATCGATGTTGACG-3'. FAST의 PCR 산물은 pGEM-T Easy Vector System(Promega, Madison, USA)에 연결되었다. 상기 FAST-결찰된 벡터는 제한 효소 HindIII 및 XhoI로 절단되었다. 프라이머에 존재하는 HindIII 및 XhoI 부위를 사용하여 PCR 생성물을 pcDNA3-mCAT-HA 벡터에 도입함으로써 C-말단 HA-태그된 FAST를 생성하였다. FAST에 대한 발현 플라스미드는 pcDNA3-p10(ARV)-HA 및 pcDNA3-p14-HA로 명명되었다. FAST의 발현은 293 T 세포의 일시적 형질감염 후 항-HA 항체(Sigma-Aldrich, MO, USA)를 사용한 웨스턴 블롯으로 평가하였다.

3. 서로 다른 4개의 FAST 단백질을 암호화하는 플라스미드의 형질감염

4개의 서로 다른 FAST 단백질이 합포체(syncytium) 형성을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 각 재조합 플라스미드 2㎍을 Calphos Mammalian Transfection Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 6웰 플레이트에서 Vero 세포의 융합 단층(1 Х 10⁶ cells/well)에 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간에, 광학 현미경을 사용하여 합포체 형성을 모니터링하였다. Vero 세포에 대한 p10(PuV) 발현 플라스미드의 세포독성 효과를 시험하기 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 MTT assay kit(Intron, Seoul, Korea)를 사용하여 상대적인 세포 생존율을 측정하였다.

p10(PuV)을 암 유전자 치료를 위한 치료 세포독성 단백질로 활용하기 위해, 1 Х 10⁶ HeLa 자궁경부암 세포, HT1080 인간 섬유육종 세포, U87 인간 신경교종 세포를 6-웰 플레이트에 2㎍의 pcDNA3.1-p10(PuV)으로 형질감염시켰다.

4, 서로 다른 4개의 FAST 단백질을 코딩하는 RCR 벡터의 구축

(1) EGFP를 포함하는 RCR의 제조

Moloney murine leukemia virus(MoMLV)의 full length 클론인 pBR322-MoMLV로부터 제한효소 EagI을 처리하여 gag-pol 유전자를 얻었으며, 이 gag-pol유전자를 pCLXSN vector에 EagI을 이용하여 삽입하였다. pBR322-MoMLV에 있는 MoMLV의 env 유전자와 3' 말단은 제한효소 SalI과 NheI을 이용하여 분리하였으며, 분리하여 얻은 MoMLV의 env 유전자와 3' 말단은 MoMLV의 gag-pol을 삽입해 놓은 pCLXSN vector에 SalI과 NheI효소를 이용하여 삽입하여 완전한 MoMLV 클론을 가진 pCLSXN vector를 완성하였다. 인간 세포를 감염시킬 수 있게 하기 위해 pCL-10A1(IMGENEX, USA)으로부터 제한효소 SalI과 ClaI을 이용해서 amphotropic env (4.1kb)를 얻어 MoMLV의 ecotropic env 유전자와 교체하였다. 마지막으로, 형광표지를 위해 기존에 구축된 pLPCX-IRES-EGFP 클론으로부터 NheI을 처리하여 IRES-EGFP를 얻었고, 이를 pCLXSN-MLV-10A1 클론의 3' LTR부분에 NheI으로 삽입하여 최종적으로 pCLXSN-MLV-10A1-IRES-EGFP 클론을 완성하였다. 이 full-length molecular clone이 복제 가능한지를 알아보기 위해 293T 세포주와 Mus dunni 세포주에 각각 transfection 하였으며 시간이 지나면서 모든 세포에서 형광을 관찰할 수 있었으며 이는 바이러스 벡터가 복제가능하다는 것을 증명한다.

(2) EGFP를 FAST 유전자로 대체

RCR 벡터로부터 FAST 단백질의 발현이 합포체 형성을 유도할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, MoMLV-10A1-EGFP의 EGFP(enhanced-GFP)를 합성 FAST 유전자로 대체하여 MoMLV-10A1-p10, MoMLV-10A1-p10(PuV), MoMLV-10A1-p13 및 MoMLV-10A1-p14를 제조하였다.

p10을 인코딩하는 RCR 벡터의 구축을 위해, IRES-p10 단편을 XhoI/NotI 소화된 pCMV-HA-C(Clontech, Mountain View, USA)로 옮겨 pCMV-HA-C-IRES-P10을 제조하였다. 다음으로 IRES-p10을 포함하는 EcoRINotI 단편을 MoMLV-10A1-EGFP RCR 벡터에 연결하여 MoMLV-10A1-p10을 제조하였다. MoMLV-10A1-p10(PuV), MoMLV-10A1-p13 및 MoMLV-10A1-p14는 위에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 구성되었다.

5. 세포 배양에서 p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터의 종양 용해 활성(Oncolytic activity)

바이러스 생산을 위해, Calphos Mammalian Transfection Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 6웰 플레이트에 있는 293 T 세포(1 x 10⁶ cells/well)에 2㎍의 MoMLV-10A1-p10(PuV) 및 1㎍의 pCLXSN-EGFP를 일시적으로 형질감염시켰다.

바이러스 역가(융합 형성 단위[sfu]/mL)는 형질감염된 293 T 세포로부터 얻은 바이러스 상청액의 10배 연속 희석액으로 293 T 표적 세포를 감염시켜 결정했다. p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터의 종양 용해 활성을 조사하기 위해, MoMLV-10A1-p10(PuV) + pCLXSN-EGFP로 형질감염시킨 지 48시간 후에 바이러스 함유 상등액을 수확하고, MOI = 0.01에서 HT1080, TE671 및 U87 세포를 감염시키는 데 사용했다. 세포를 폴리브렌(8㎍/mL)의 존재하에 3시간 동안 바이러스로 감염시키고, 2mL의 신선한 배지를 각 웰에 첨가하였다. 광현미경에 의해 합포체 형성이 관찰되었다. 합포체 형성을 융합 지수로 정량화하였다. 융합 지수는 (N-S)/T Х 100으로 정의되었으며, 여기서 N은 합포체의 핵 수, S는 합포체 수, T는 계수된 핵의 총 수이다.

<실시예>

1. 다른 4가지 FAST 단백질 유도 합포체 형성

각각의 FAST 단백질은 서로 다른 융합 활성(fusion activities)을 나타내는 것으로 알려져 있기 때문에, 각 FAST 단백질의 융합 활성은 연구에서 다른 세 가지 FAST 단백질과 비교되었다. 4개의 서로 다른 FAST 단백질(p10(ARV), p10(PuV), p13 및 p14)은 Vero 세포에서 합포체 형성을 유도했다(도 1). p13-형질감염된 세포는 다른 FAST 단백질보다 더 광범위한 합포체 형성을 유도하였다. p13-매개 합포체는 >50개의 핵을 포함했다. FAST의 발현은 헤마글루티닌(HA) 태그에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다(데이터 미도시).

2. FAST 단백질을 인코딩하는 RCR 벡터의 합포체 형성 유도

이전 연구에서 본 발명자는 다양한 숙주 범위를 가진 10A1 MLV에서 파생된 새로운 복제 가능 레트로바이러스 벡터를 개발했다(Lee et al., 2019). 10A1 MLV는 인간 세포 진입을 위해 인간 Pit1(SLC20A1) 또는 인간 Pit2(SLC20A2)를 사용할 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 4개의 상이한 FAST를 인코딩하는 RCR 벡터가 구축되었다. FAST 단백질이 RCR 벡터에서 발현되는지 확인하기 위해, 본 발명자는 293 T 세포를 MoMLV-10A1-p10, MoMLV-10A1-p10(PuV), MoMLV-10A1-p13 및 MoMLV-10A1-p14로 형질감염했다. 흥미롭게도 MoMLV-10A1-p10(PuV) 형질감염된 293 T 세포는 강한 합포체 형성을 유도했다(도 3). 비리온이 형질감염된 293 T 세포에서 방출되었는지 여부를 조사하기 위해 무세포 상청액을 사용하여 Vero 세포를 감염시켰다. 형질감염 24시간 후, 합포체 형성이 위상차 현미경으로 관찰되었다(데이터 미도시). 그러나 FAST를 발현하는 RCR 벡터에 의해 유도된 합포체는 pcDNA3.1-FAST에 의해 유도된 것보다 작았다. p10(PuV) 매개 합포체 형성을 정량적으로 확인하기 위해 Vero 세포를 pcDNA3.1-p10(PuV)으로 일시적으로 형질감염시키고 MTT 분석에 의해 세포 생존율을 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이 p10(PuV)은 형질감염 5일 후에 Vero 세포의 40%를 사멸시켰다.

3. p10(PuV) 매개 세포독성

암 세포주에서 p10(PuV) 매개 합포체 형성을 평가하기 위해 HeLa, HT1080 및 U-87 세포에 pcDNA3.1-p10(PuV)을 형질감염시켰다. 도 5에 도시된 바와 같이, p10(PuV)은 인간 암 세포주에서 합포체 형성을 야기하였다. 다른 세포주에 비해 U87 세포에서 광범위한 합포체 형성이 감지되었다. 시간이 지남에 따라 p10(PuV) 발현 수준을 증가시키기 위해 p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터를 구축했다. p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터의 역가는 1.3 X 10⁴ sfu/mL이었다. 바이러스 역가 측정을 위해 합포체에 4개 이상의 핵이 포함되어 있으면 양성으로 간주하였다. EGFP 리포터 유전자(pCLXSN-EGFP)를 포함하는 결함 있는 레트로바이러스를 MoMLV-10A1-p10(PuV)으로 공동형질감염시켜 p10(PuV)-매개 합포체 형성이 wt MLV의 복제를 방해하는지 여부를 조사했다. 이 헬퍼-의존적 벡터 시스템에서 EGFP 유전자의 전파는 wt MLV의 복제에 의존한다. 도 6에 도시된 바와 같이, pCLXSN-EGFP의 헬퍼(RCR 벡터) 의존적 증식이 HT1080 세포에서 최대 20일 동안 검출되었다. 이러한 데이터는 p10(PuV) 매개 합포체 형성이 세포-세포 바이러스 전파를 향상시킨다는 것을 시사한다. 또한, p10(PuV)을 발현하는 RCR 벡터는 감염 후 5일째에 TE671 및 U87 세포에서 합포체 형성을 유도하였다(도 7). pcDNA3.1-p10(PuV)를 사용한 이전 결과와 일관되게, p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터가 U87 세포에서 발현되었을 때, 감염된 세포에서 강한 세포변성 효과가 관찰되었다.

<검토>

이전 연구에 따르면 융합형 레오바이러스(fusogenic reoviruses)는 병원성과 관련이 있지만 비융합형 레오바이러스 감염은 무증상이다. FAST 단백질은 융합성 레오바이러스의 독성 결정인자이며 FAST 단백질 패밀리의 구성원은 중요한 아미노산 동일성을 거의 공유하지 않는다. 융합유전자와 비융합 레오바이러스의 아미노산 서열을 비교하여 동정한 결과, FAST 단백질은 작은 엑토도메인과 같은 크기 또는 더 긴 세포질 엔도도메인이 있는 단일 통과 막횡단 단백질이다. 세 도메인 모두 세포 간 융합에서 직접적인 역할을 한다. 공동 면역 침전 분석은 세포 내 아넥신 A1(AX1)이 칼슘 의존적 방식으로 RRV p14와 상호 작용하는 것으로 나타났다(Ciechonska et al., 2014). FAST는 합포체 형성을 유도하기 때문에 암 유전자 치료의 후보이다. 최근 연구에 따르면 암세포의 합포체 형성은 항암 면역을 촉진하는 엑소좀과 유사한 입자(합포체)의 방출을 유발한다. 융합 막 당단백질(FMG, fusogenic membrane glycoprotein)의 큰 크기는 종양 용해성 바이러스 요법에서의 사용을 제한하지만 FAST 단백질의 작은 크기는 FAST 유전자를 종양 용해성 바이러스에 통합하는 것을 촉진한다.

본 발명자는 어떤 FAST 단백질이 가장 강한 합포체를 형성하는지 비교하기 위해 각 FAST를 발현하는 플라스미드를 구성했다. 도 1에 도시된 바와 같이, p13은 다른 FAST보다 Vero 세포에서 더 강한 합포체를 형성하였다. 높은 수준의 FAST 단백질 발현을 달성하기 위해 FAST 단백질 유전자가 합포체를 형성하지 않는 레트로바이러스의 게놈에 삽입되었다(도 2).

본 발명자는 p10(PuV)을 포함하는 RCR 벡터가 293 T 세포에서 유의한 합포체 형성을 유도한다는 것을 보여주었다(도 3). 이러한 결과는 IRES 의존성 p13의 발현이 cap 의존성 FAST(pCDNA3.1-p13)의 발현보다 덜 효율적임을 시사한다(Mizuguchi et al., 2000).

FAST를 발현하는 RCR 벡터가 Vero 세포에서 합포체 형성을 유도하는지 여부를 확인하기 위해 Vero 세포를 형질감염된 293 T 세포에서 수집한 상등액으로 감염시켰다. 예상대로 합포체 형성이 감지되었다(데이터 미도시).

pcDNA3.1-p10(PuV) 및 p10(PuV)을 발현하는 RCR 벡터는 모두 Vero 및 293 T 세포에서 합포체를 형성하기 때문에, p10(PuV)은 인간 암 세포주에서 합포체 형성에 대한 후속 연구를 위해 FAST 중에서 선택되었다.

FAST 유전자의 상대적인 세포-세포 융합 활성 및 p10(PuV)을 인코딩하는 RCR 벡터의 역가

FAST genes	Fusion	Fusion Index (%)	Titer (sfu/mL)
p10	++	ND	ND
p10(PuV)	++	ND	ND
p13	+++	ND	ND
p14	++	ND	ND
MoMLV-10A1-p10	+/-	ND	ND
MoMLV-10A1-p10(PuV)	++	TE671 (10 %), U87 (30 %)	1.3 104
MoMLV-10A1-p13	+/-	ND	ND
MoMLV-10A1-p14	+/-	ND	ND

p10(PuV)의 세포독성 활성을 정량적으로 확인하기 위해 Vero 세포에 p10(PuV)을 발현하는 플라스미드를 형질감염시켰다. p10(PuV)의 형질감염은 세포 생존율의 40% 감소와 관련이 있었다(도 4). 이 결과는 p10(PuV)이 다른 FMG만큼 효율적으로 합포체 형성을 유도했음을 나타낸다.

p10(PuV)을 치료 세포독성 단백질로 활용하기 위해 HeLa, HT1080 및 U87 세포에 pcDNA3.1-p10(PuV)을 형질감염시켰다. 도 5에 도시된 바와 같이, pcDNA3.1-p10(PuV)-형질감염된 U87 세포는 강한 합포체 형성을 유도하였다. 이 결과는 FAST 의존성 세포독성이 세포주 특이적임을 시사한다.

p10(PuV) 단백질 발현이 RCR 복제에 영향을 미치는지 알아보기 위해 helper-dependent system을 사용하였다. 결함이 있는 레트로바이러스 벡터는 헬퍼 레트로바이러스에 의해 효율적으로 전파된다는 것이 이전에 밝혀졌다(Solly et al., 2003).

HT1080 세포가 pCLXSN-EGFP 및 MoMLV-10A1-p10(PuV) 공동형질감염된 293 T 세포의 상층액으로 감염되었을 때, EGFP 양성 세포의 비율이 증가하고 합포체 형성이 관찰되었다(도 6). 이 관찰은 p10(PuV) 발현이 바이러스 복제에 영향을 미치지 않음을 시사한다. p14를 발현하는 종양 용해성 아데노바이러스 벡터 또는 p14를 발현하는 VSV(Brown et al., 2009; Del Papa et al., 2019)와 달리 MoMLV-10A1-p10(PuV)은 더 긴 잠복 기간(20일)과 함께 점진적인 합포체 형성을 보여주었다.

이러한 결과는 IRES-의존 p10(PuV) 발현이 광범위한 세포-세포 융합을 유도하기에 충분히 효율적이지 않음을 시사한다. 또한, EGFP 양성 세포의 점진적인 증가는 바이러스 확산이 p10(PuV) 매개 세포-세포 융합에 의해 유발되었음을 시사한다. 더 많은 암 세포주를 스크리닝하기 위해 TE671 및 U87 세포를 MoMLV-10A1-p10(PuV) RCR 벡터로 감염시켰다. 예상대로 MoMLV-10A1-p10(PuV)은 TE671 및 U87 세포에서 합포체 형성을 유도했다(도 7).

MLV에 기반한 RCR 벡터는 분명히 숙주에서 가능한 병원성 영향에 대한 질문을 제기한다. 숙주 게놈 전체에 레트로바이러스 DNA가 안정적으로 통합되면 인근 숙주 유전자의 비정상적인 발현이 발생할 수 있다. 최근 연구는 MLV 통합을 위한 핫스팟의 존재를 보여주었다(Tsuruyama et al., 2017). 그러나 생체 내에서 종양 형질도입을 위해 RCR 벡터를 사용한 많은 연구에서 종양 외 RCR 벡터 확산이 검출 가능한 수준이 아니라고 보고했다(Chen et al., 2020; Logg et al., 2001; Wang et al., 2006).

또한, 127명의 고급 신경아교종 환자에게 Toca 511(Yeast cytosine deaminase(CD) 유전자를 운반하는 RCR 벡터)을 투여했을 때, RCR 치료는 부적절한 통합 부위 및 악성 형질전환과 관련이 없었다(Hogan et al., 2018).

본 발명자는 FAST 단백질의 세포 독성이 FAST 단백질 발현 수준 및 세포 유형 특이성과 관련이 있음을 보여주었다. 4가지 다른 FAST 중 p10(PuV)은 인간 암 세포에서 고도로 융합성(fusogenic)을 보였다. 또한, p10(PuV)을 암호화하는 RCR 벡터는 복제 가능하고 합포체 형성을 유도하였다. 따라서 p10(PuV)을 암호화하는 본 발명 RCR 벡터는 암 유전자 치료의 유망한 후보이다.

이상에서 본 발명의 대표적인 실시예들을 상세하게 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상술한 실시예에 대하여 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도 내에서 다양한 변형이 가능함을 이해할 것이다. 그러므로 본 발명의 권리범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Dankook University <120> RETROVIRAL VECTOR COMPRISING FAST GENE AND AND THEIR USE AS GENE THERAPY FOR CANCER <130> DPn-0008 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MuLV-gag <400> 1 atgggccaga ctgttaccac tcccttaagt ttgaccttag gtcactggaa agatgtcgag 60 cggatcgctc acaaccagtc ggtagatgtc aagaagagac gttgggttac cttctgctct 120 gcagaatggc caacctttaa cgtcggatgg ccgcgagacg gcacctttaa ccgagacctc 180 atcacccagg ttaagatcaa ggtcttttca cctggcccgc atggacaccc agaccaggtc 240 ccctacatcg tgacctggga agccttggct tttgaccccc ctccctgggt caagcccttt 300 gtacacccta agcctccgcc tcctcttcct ccatccgccc cgtctctccc ccttgaacct 360 cctcgttcga ccccgcctcg atcctccctt tatccagccc tcactccttc tctaggcgcc 420 aaacctaaac ctcaagttct ttctgacagt ggggggccgc tcatcgacct acttacagaa 480 gaccccccgc cttataggga cccaagacca cccccttccg acagggacgg aaatggtgga 540 gaagcgaccc ctgcgggaga ggcaccggac ccctccccaa tggcatctcg cctacgtggg 600 agacgggagc 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ttctgctagg aggattaacc atgggaggga 7800 ttgcagctgg aatagggacg gggaccactg ccctaatcaa aacccagcag tttgagcagc 7860 ttcacgccgc tatccagaca gacctcaacg aagtcgaaaa atcaattacc aacctagaaa 7920 agtcactgac ctcgttgtct gaagtagtcc tacagaaccg aagaggccta gatttgctct 7980 tcctaaaaga gggaggtctc tgcgcagccc taaaagaaga atgttgtttt tatgcagacc 8040 acacgggact agtgagagac agcatggcca aactaaggga aaggcttaat cagagacaaa 8100 aactatttga gtcaggccaa ggttggttcg aagggcagtt taatagatcc ccctggttta 8160 ccaccttaat ctccaccatc atgggacctc taatagtact cttactgatc ttactctttg 8220 gaccctgcat tctcaatcga ttagtccaat ttgttaaaga caggatatca gtggtccagg 8280 ctctagtttt gactcaacaa tatcaccagc tgaagcctat agagtacgag ccatagataa 8340 aataaaagat tttatttagt ctccagaaaa aggggggaat gaaagacccc acctgtaggt 8400 ttggcaagct agcgctaccg gactcagatc tcgagctcga ggcccctctc cctccccccc 8460 ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt 8520 attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt 8580 cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa 8640 tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac 8700 cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg 8760 tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt 8820 tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca 8880 gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt 8940 ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg 9000 aaaaacacga tgataatatg gccacaacca tgggcggtga ttgtgctggt ctggtttccg 9060 tgtttggtag tgtccattgt caatcttcta agaataaggc cggaggagat ctacaggcta 9120 catccatttt gactacttac tggccccatc ttgccattgg tggtggtatt atcctggtta 9180 tctttctgct tgggctgttt tactgctgct atctcaagtg gaagacgtct catatcaggc 9240 gtacttacca taaagaattg gttgcgttaa cccgcggata tgtcaggccg atctcggcgg 9300 acgttaccag tgtctgagcg gccgcctcgg ccaaacatcg ataaaataaa agattttatt 9360 tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta 9420 agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc 9480 aaggtcagga acagatggaa cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag 9540 ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat 9600 atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg 9660 gtccagccct cagcagtttc tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct 9720 gaaatgaccc tgtgccttat ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg 9780 cgcttctgct ccccgagctc aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc 9840 tccgattgac tgagtcgccc gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc 9900 cgacttgtgg tctcgctgtt ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag 9960 cgggggtctt tcatttgggg gctcgtccgg gatcgggaga cccctgccca gggaccaccg 10020 acccaccacc gggaggtaag ctggctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct 10080 ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag 10140 acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca 10200 gtcacgtagc gatagcggag tgtataccta gctaggtagc tagaggatct ttgtgaagga 10260 accttacttc tgtggtgtga cataattgga caaactacct acagagattt aaagctctaa 10320 ggtaaatata aaatttttaa gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttgtgt 10380 attttagatt ccaacctatg gaactgatga atgggagcag tggtccaatg cctttaatga 10440 ggaaaacctg ttttgctcag aagaaatgcc tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 10500 caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 10560 gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 10620 atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatatttg 10680 atgtatagtg ccttgactag agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 10740 tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 10800 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 10860 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 10920 tgtatcttat catgtctgat cccgccatgg tatcaacgcc atatttctat ttacagtagg 10980 gacctcttcg ttgtgtaggt accgctgtat tcctagggaa atagtagagg caccttgaac 11040 tgtctgcatc agccatatag cccccgctgt tcgacttaca aacacaggca cagtactgac 11100 aaacccatac acctcctctg aaatacccat agttgctagg gctgtctccg aactcattac 11160 accctccaaa gtcagagctg taatttcgcc atcaagggca gcgagggctt ctccagataa 11220 aatagcttct gccgagagtc ccgtaagggt agacacttca gctaatccct cgatgaggtc 11280 tactagaata gtcagtgcgg ctcccatttt gaaaattcac ttacttgatc agcttcagaa 11340 gatggcggag ggcctccaac acagtaattt tcctcccgac tcttaaaata gaaaatgtca 11400 agtcagttaa gcaggaagtg gactaactga cgcagctggc cgtgcgacat cctcttttaa 11460 ttagttgcta ggcaacgccc tccagagggc gtgtggtttt gcaagaggaa gcaaaagcct 11520 ctccacccag gcctagaatg tttccaccca atcattacta tgacaacagc tgtttttttt 11580 agtattaagc agaggccggg gacccctggc ccgcttactc tggagaaaaa aaacattgta 11640 gaggcttcca gaggcaactt gtcaaaacag gactgcttct atttctgtca cactgtctgg 11700 ccctgtcaca aggtccagca cctccatacc ccctttaata agcagtttgg gaacgggtgc 11760 gggtcttact ccgcccatcc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 11820 gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc 11880 agaagtagtg aggaggcttt tttggaggct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 11940 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 12000 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 12060 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 12120 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 12180 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 12240 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 12300 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 12360 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 12420 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 12480 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 12540 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 12600 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 12660 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 12720 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 12780 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 12840 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 12900 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 12960 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 13020 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 13080 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 13140 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 13200 caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 13260 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 13320 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 13380 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 13440 ttctgtgact ggtgaactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 13500 gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 13560 tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 13620 ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 13680 gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 13740 cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 13800 gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 13860 ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga 13920 cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg 13980 acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg 14040 atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct 14100 ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa 14160 taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc 14220 gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgcc 14268

Claims (8)

1. gag 유전자;
   pol 유전자;
   env 유전자;
   IRES(internal ribosomal entry site) 서열;및
   FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자를 포함하는 레트로바이러스 벡터.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 FAST(fusion-associated small transmembrane) 유전자는 조류 레오바이러스(ARV, avian reovirus), 박쥐 레오바이러스(NBV, Nelson Bay), 풀라우 바이러스(PuV, Pulau virus)의 p10, 박쥐 레오바이러스(BroV, Broome reovirus)의 p13, 파충류 레오바이러스(RRV, reptilian reovirus)의 p14, 개코 원숭이 레오바이러스(BRV, baboon reovirus)의 p15, 아쿠아레오바이러스 그룹 C 및 G(AqRV-C 및 -G)의 p16 및 아쿠아레오바이러스 그룹 A의 p22 중 어느 하나인 레트로바이러스 벡터.
   
3. 제1항에 있어서,
   [서열번호 1]의 gag 유전자; [서열번호 2]의 pol 유전자; [서열번호 3]의 10A1 env 유전자 및 [서열번호 4]의 IRES(internal ribosomal entry site) 서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 FAST 유전자는 ARV p10(서열번호 5), PuV p10(서열번호 6), BroV p13(서열번호 7), RRV p14(서열번호 8) 중 어느 하나인 레트로바이러스 벡터.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 pCLXSN인 레트로바이러스 벡터.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 레트로바이러스 벡터를 포함하는 레트로바이러스.
   
7. 제6항의 레트로바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 암은 점액상 세포 암종, 둥근 세포 암종, 국소적 진행 종양, 전이성 암, 어윙(Ewing) 육종, 암전이, 림프성 전이, 편평상피 세포 암종, 식도 편평상피 세포 암종, 경구 암종, 다발성골수종, 급성 림프구성 백혈병, 급성 비림프구성 백혈병, 만성 림프구 백혈병, 만성 골수구 백혈병, 모양 세포성 백혈병, 유출림프종 (체강계 림프종), 흉선 림프종 폐암, 소세포 폐암종, 피부 T 세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨성 림프종, 부신 피질 암, ACTH-생성 종양, 비소세포 폐암, 유방암, 소세포 암종, 도관 암종, 위암, 결장암, 결장 직장암, 결장직장 종양 형성과 관련된 용종, 췌장암, 간암, 방광암, 1차 표면 방광 종양, 방광의 침습성 전이 세포 방광암종, 근 침윤성 방광암, 전립선암, 대장암, 신장암, 간암, 식도암, 난소 암종, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 원발성 복막상피 신생물, 자궁 경관 암종, 질암, 외음부암, 자궁암, 난포 중 고형 종양, 고환암, 음경암, 신장 세포 암종, 뇌암, 두경부암, 구경부암, 신경아세포종, 뇌간 신경교종, 신경교종, 중추신경계 중 전이성 종양 세포 침윤, 골종, 골육종, 섬유육종, 악성 흑색종, 인간 피부 케라티노사이트의 종양 진행, 편평상피 세포 암종, 갑상선 암, 망막아종, 신경아세포종, 중피종, 빌름스 종양, 담낭암, 영양아세포 종양, 혈관주위세포종 또는 카포시 육종인 암 치료용 약학적 조성물.