KR20030074115A - 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입레트로바이러스 벡터 - Google Patents

헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입레트로바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제공한다. 본 발명자 등은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 의해 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터를 구축했다. 상기 바이러스 벡터는, 숙주세포로의 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 특히, 조혈간세포를 포함하는 혈구계 ·조혈계 세포 및 점막 상피세포를 포함하는 점액을 갖는 세포 등의, 종래에는 유전자 도입이 곤란했던 세포에 대해 높은 효율로 유전자를 도입할 수 있는 것이 나타내어졌다. 본 발명의 바이러스 벡터는 유전자 치료용 벡터로서 지극히 유용하다.

Description

헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터{Pseudo-type retrovirus vector containing membrane protein having hemagglutinin activity}
기술분야
본 발명은, 파라믹소바이러스의 HN 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
배경기술
연구목적이나 유전자 치료 등에 있어서 외래유전자를 표적세포에서 발현시키기 위해, 레트로바이러스 벡터가 사용되고 있다. 레트로바이러스 벡터는 비교적 용이하게 제조하는 것이 가능하여, 도입 유전자를 숙주의 염색체에 삽입할 수 있는 등의 이점을 가지고 있다. 레트로바이러스 벡터의 감염에는, 일반적으로 바이러스의 엔벨로프에 존재하는 바이러스 단백질이 중요한 역할을 하고 있다. 지금까지, 레트로바이러스 벡터의 엔벨로프 단백질을 개변함으로써, 감염 가능한 숙주세포를 확대시키거나, 또는 특이적인 세포에만 감염하는 바이러스의 개발이 시도되어 왔다.
예를 들면, 보다 넓은 숙주세포에 대해 높은 감염성을 실현하기 위해, 레트로바이러스 벡터의 엔벨로프에 VSV-G 단백질을 삽입하는 계가 개발되어 있다(H. Yu et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1876-1883). VSV-G는, 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)의 엔벨로프 표면에 발현하는 단백질로, 매우 넓은 숙주세포에 대해 감염성을 나타낸다. 이것 이외에도, 예를 들면 센다이 바이러스(Sendai virus)의 F 단백질을 엔벨로프 단백질로서 사용하는 시도도 행해지고 있다. F 단백질에 의해 슈도타입화된 레트로바이러스는, 아시알로글리코프로틴수용체 양성 세포(asaloglycoprotein receptor positive cell)에 대해 특이적인 감염성을 나타냈다(M. Spiegel et al., 1998, Hepatology, 28, 1429-1429; M. Spiegel et al., 1998, J. Virology, 72, 5296-5302).
그러나, 이러한 종래의 슈도타입 레트로바이러스에 있어서도, 여러 조직이나 세포에 대해 충분한 감염성을 실현하고 있지는 않다. 예를 들면, 조혈간세포를 비롯한 각종 간세포는, 유전자 치료 등에 있어서의 표적 세표로서 중요하지만(Y. Hanazono, Molecular Medicine, Vol.36, No.7, 1999), 간세포의 대부분은 비분열상태에 있어(Abkowitz, J. L. et al., Nat Med, 2(2), 190-7, 1996), 비분열세포에 대한 감염효율이 낮은 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자 도입은 일반적으로 곤란하다. 또한, 종래의 기술을 이용한 벡터 시스템에서는, 폐의 기도점막 상피세포 등, 세포외 매트릭스가 풍부한 세포로의 유전자 도입은 곤란했었다. 이들 세포에 대해 유전자를 도입하는 경우, 점액 등의 세포외 매트릭스를 세척하여 물리적으로 제거하는 방법이 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 번잡하여, 조직을 상하게 할 위험이 존재한다.
발명의 개시
본 발명은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자 등은, 레트로바이러스를 슈도타입화하기 위한 단백질로서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질을 선택했다. 헤마글루티닌(hemagglutinin, HAin; 적혈구 응집소)이란 헤마글루티네이션(Hemagglutination, HA; 적혈구 응집반응)을 일으키는 단백질로, 많은 바이러스가 이 활성을 갖는 것이 알려져 있다. 본 발명자 등은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 엔벨로프에 포함하는 레트로바이러스를 제작함으로써, 여러 타입의 세포나 조직에 대해 높은 유전자 도입력을 갖는 레트로바이러스 벡터를 구축할 수 있다고 생각했다. 이러한 레트로바이러스를 제조하기 위해, 본 발명자 등은, 넓은 숙주역을 갖는 파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백질을 사용했다. 먼저, 센다이 바이러스(SeV)의 엔벨로프 단백질을 발현하는 벡터를 이용하여, 마우스 레트로바이러스 유래의 바이러스 벡터를 SeV F 및/또는 HN 단백질로 슈도타입화했다. 구체적으로는, 마우스 간세포 바이러스(MSCV)를 재료로, 에코트로픽 엔벨로프 단백(ecotropic envelope protein) 또는 암포트로픽 엔벨로프 단백(amphotropic envelope protein)에 더하여, SeV의 F 및/또는 HN 단백을 갖는 레트로바이러스를 구축하여, 인간 세포에 대한 유전자 도입효율을 조사했다(실시예 1 및 2).
인간의 세포에 감염성이 없는 엔벨로프 단백질인 에코트로픽 엔벨로프 단백에 의해 팩키징을 행한 경우, F 단백 또는 HN 단백 단독으로 슈도타입화한 바이러스는 인간 세포로의 유전자 도입은 인정되지 않았지만, F 단백과 HN 단백을 동시에 발현시켜 슈도타입화한 바이러스에서는 본래 감염성이 없는 인간 세포로의 유전자 도입이 인정되었다(도 1 Eco). 이 결과로부터 센다이 바이러스 이외의 바이러스 유래의 벡터를 센다이 바이러스의 F 단백과 HN 단백으로 슈도타입화함으로써 그 바이러스 벡터의 감염 숙주역을 확대할 수 있는 것이 명확해졌다.
인간의 세포에 감염성을 갖는 엔벨로프 단백질인 암포트로픽 엔벨로프 단백에 의해 팩키징을 행한 경우, HN 단백질 단독, 또는 F 단백과 HN 단백을 동시에 발현시켜 슈도타입화시킨 경우 어느 쪽에 있어서도, 유전자 도입효율이 현저히 향상하는 것이 명확해졌다(도 1 Ampho). 이 결과로부터 레트로바이러스 벡터를 센다이 바이러스 HN 단백 단독으로도 슈도타입화할 수 있는 것, 센다이 바이러스 HN 단백 단독에 의한 슈도타입화 또는 센다이 바이러스 F 단백과 HN 단백으로 슈도타입화함으로써 레트로바이러스 벡터의 유전자 도입효율을 향상할 수 있는 것이 명확해졌다.
본 발명자 등은, 또한, HN 단백으로 슈도타입화한 암포트로픽 레트로바이러스 벡터를 생산하여, 조혈간세포를 포함하는 인간 골수세포에 대한 유전자 도입효율을 검토했다(실시예 3). 인간 골수 CD34 양성 세포에 HN 단독으로 슈도타입화한 벡터를 감염시키고, 플로 사이토미터(flow cytometer)에 의해 CD34를 마커로 하여 세포를 분획하여 유전자가 도입된 세포를 검출한 바, HN 단백에 의한 슈도타입화에 의해, CD34 양성 세포 및 CD34 음성 세포 모두 유전자 도입효율이 현저히 상승하는것이 판명되었다(도 3). CD34 양성 세포는 조혈간세포를 포함하는 세포분획이라 불리고 있어, HN 단백에 의한 슈도타입화가 조혈간세포를 포함하는 혈구계 ·조혈계 세포로의 유전자 도입에도 유효한 것이 나타내어졌다.
본 발명자 등은 이어서, 레트로바이러스 중에서도 유전자 치료 벡터로서의 이용이 기대되고 있는 렌티바이러스(lentivirus)를 사용하여, 파라믹소바이러스의 F 단백질 및/또는 HN 단백질로 슈도타입화한 벡터의 구축을 행했다. 렌티바이러스로서는, 유전자 치료분야에 있어서 종래부터 사용되어 온 인간 면역부전 바이러스(HIV)와 비교하여, 안전성이 높은 등 여러 이점을 갖는 원숭이 면역부전 바이러스(SIV)를 사용했다(실시예 5). 센다이 바이러스(SeV)로부터 엔벨로프를 재구성시킨 비로솜 또는 불활화 센다이 바이러스를 조제하고, 이들을, VSV-G 단백으로 슈도타입화되어 있는 SIV와 융합시켜 SeV의 엔벨로프 단백질을 갖는 SIV 바이러스를 제작했다. 이 바이러스를 인간 세포와 함께 인큐베이트하여, 벡터의 감염효율을 검정했다(실시예 6 및 7). 그 결과, VSV-G 단백으로 슈도타입화된 SIV의 경우와 비교하여, SeV의 엔벨로프를 융합시킨 SIV는 보다 높은 감염효율을 나타내는 것이 판명되었다(도 8). 감염효율의 상승에는, 센다이 바이러스의 HN 단백의 기여가 높은 것이 시사되었다.
SeV의 엔벨로프 단백의 기여를 상세하기 조사하기 위해, 본 발명자 등은 FHN 비로솜, F 비로솜 및 HN 비로솜을 조제하여, 각각을 VSV-G 슈도타입화 SIV와 융합시킨 벡터를 제작하여, 그 감염실험을 행했다(실시예 7). FHN 비로솜을 융합시킨 벡터는, SIV 단독 보다도 유의하게 높은 유전자 도입효율을 나타냈다(도 10). HN비로솜을 사용한 경우에도 유전자 도입효율의 상승이 인정되었지만, F 비로솜을 융합시킨 경우는, FHN 비로솜에서 인정된 것과 같은 유전자 발현의 상승은 얻어지지 않아, 유전자 도입효율의 상승에는 HN 단백질이 중요한 것이 증명되었다.
본 발명자 등은 더욱이, SeV의 엔벨로프 단백질의 발현벡터를 사용하여, 팩키징 단계에서 SeV의 엔벨로프 단백에 의해 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터의 제조를 행했다(실시예 8). VSV-G 단백에 더하여, F 단백 및 HN 단백으로 슈도타입화된 SIV 벡터는 높은 역가로 생산되고, 이 바이러스 벡터는 원심에 의해 더욱이 농축하는 것이 가능했다. 본 발명자 등은, 이 벡터를 사용하여 인 비보에 있어서의 유전자 도입시험을 행했다.
기관 상피 점막세포는, 종래의 바이러스 벡터로는 유전자 도입이 곤란하여, 도입시에 있어서 물리적 장해를 제거하는 처리가 되어 있어, 예를 들면 VSV-G 슈도타입 HIV 벡터를 사용한 유전자 도입으로는 이산화황 등에 의해 상해하지 않으면 충분한 도입효과가 인정되고 있지 않다(L. G. Johnson et al., Gene Therapy, 7, 568-574, 2000). VSV-G 단백 및 센다이 바이러스의 F 및 HN 단백에 의해 슈도타입화한 SIV 벡터가, 상해를 부여할 필요 없이 기관 상피 점막세포에 효율 좋게 유전자를 도입할 수 있는지를 검토했다(실시예 9). GFP를 발현하는 상기의 슈도타입 SIV 벡터를 마우스에 경비적으로 투여하고, 3일째의 기관의 조직절편에 있어서의 GFP 단백을 관찰한 바, 기관 상피세포에 GFP의 형광이 관찰되었다(도 11). 또한, 동일한 개체의 비중격점막(鼻中隔粘膜)에 있어서도 점막 상피에 발현이 관찰되고, 다열선모상피(多列線毛上皮)에도 GFP의 형광이 인정되었다(도 12). 이와 같이, 본발명의 바이러스 벡터는, 점막 상피 등의 점액을 갖는 세포에 대해서도, 세포나 조직을 상해하지 않고 유전자를 도입할 수 있는 것이 증명되었다.
더욱이 본 발명자 등은, HN 단백질의 세포질 영역을 개변한 단백질을 발현하는 벡터를 구축하고, 이를 사용하여 새로운 슈도타입화 바이러스 벡터의 생산을 행했다. 구체적으로는, SIV 엔벨로프 단백질의 세포질 영역을 SeV HN 단백질에 부가, 또는 HN 단백질의 세포질 영역을 SIV 엔벨로프 단백질의 세포질 영역으로 치환한 단백질, 더욱이 SeV F 단백질의 세포질 영역의 전부 또는 일부를 결실 또는 SIV 엔벨로프 단백질의 세포질 영역으로 치환한 단백질을 발현하는 벡터를 구축하여, 이들 단백질을 갖는 슈도타입화 SIV 벡터를 구축했다(실시예 11~12). 그 결과, 이들 벡터는, 293T 세포나 BEAS-2B 세포 등의 인간 세포에 유전자 도입하는 능력을 가지고 있어, HN 슈도타입화 벡터가, VSV-G 등의 다른 엔벨로프 단백질을 공존시키지 않고 인간 세포로 유전자를 도입할 수 있는 것이 판명되었다. 또한, 이들 개변 HN 단백질 발현 플라스미드를 사용하여 구축한, MSCV를 베이스로 한 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 인간 세포에 대해 유전자를 도입할 수 있는 것이 명확해졌다(실시예 13). 개변 HN 단백질을 갖는 슈도타입화 SIV 벡터를 대량 조제 ·농축하여, 인간 골수세포로 감염시킨 바, CD34+골수세포에 높은 효율로 유전자를 도입할 수 있는 것이 판명되었다(실시예 14).
더욱이 본 발명자 등은, 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(HA)단백질의 발현벡터를 사용하여, HA 슈도타입화 렌티바이러스 벡터를 제작했다. 얻어진 바이러스는 인간 세포에 유전자를 도입하는 능력을 가지고 있어, 원심에 의한 고도의 농축이 가능했다(실시예 16). 또한, 인플루엔자바이러스 HA 단백질과 센다이 바이러스 HN 개변 단백질을 갖는 HA/HN 슈도타입화 렌티바이러스 벡터를 제작하여, 이 벡터가 인간 세포에 유전자를 도입하는 능력을 갖는 것을 확인했다(실시예 17).
이상과 같이, 본 발명자 등은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 의해 레트로바이러스를 슈도타입화함으로써, 높은 유전자 도입효율을 갖는 바이러스 벡터를 구축하는 것에 성공했다. 더욱이 상기 바이러스 벡터가, 조혈간세포를 포함하는 혈구계 및 조혈계 세포 및 점막 상피세포 등의 점액을 갖는 세포에 대해, 엑스 비보 또는 인 비보 투여에 있어서 높은 효율로 유전자를 도입할 수 있는 것을 증명했다.
본 발명은, 보다 상세하게는,
(1) 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는, 실질적으로 순수한 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(2) (1)에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 단일 가닥 음성 가닥(single stranded negative strand) RNA 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(3) (2)에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 파라믹소바이러스의 HN 단백질 및/또는 오르토믹소바이러스 HA 단백질에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(4) (2)에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 단일 가닥 음성 가닥 RNA 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 단백질인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(5) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 파라믹소바이러스의 F 단백질을 더욱이 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(6) (5)에 있어서, 상기 F 단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가 결실 및/또는 부가에 의해 개변되어 있는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(7) (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 인간 세포에 감염하는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 더욱이 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(8) (7)에 있어서, 레트로바이러스 유래의 암포트로픽 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(9) (7) 또는 (8)에 있어서, 수포성 구내염 바이러스 유래의 VSV-G 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(10) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 온코바이러스(oncovirus)에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(11) (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(12) (11)에 있어서, 렌티바이러스가 원숭이 면역부전 바이러스에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(13) (3) 또는 (5)에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(14) (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 외래유전자를 발현 가능하게 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(15) (14)에 있어서, 점액을 갖는 세포로의 유전자 도입용인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(16) (15)에 있어서, 점액을 갖는 세포가 점막 상피세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(17) (16)에 있어서, 점막 상피세포가 비강 또는 폐 기관지의 점막 상피세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(18) (14)에 있어서, 혈구계 또는 조혈계 세포로의 유전자 도입용인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(19) (18)에 있어서, 혈구계 또는 조혈계 세포가 조혈간세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터,
(20) (14) 내지 (19) 중 어느 하나의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 포함하는 유전자 도입용 조성물,
(21) (20)에 있어서, 의약인 조성물.
(22) (14) 내지 (19) 중 어느 하나의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 외래유전자를 세포에 도입하는 방법,
(23) 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 발현 가능하게 포함하는 (1) 내지 (19) 중 어느 하나의 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 생산용 팩키징 세포,
(24) (1) 내지 (19) 중 어느 하나의 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 제조방법으로서, (23)의 팩키징 세포 내에서 레트로바이러스 유래의 진 트랜스퍼 벡터 DNA를 전사시키는 공정을 포함하는 방법,
에 관한 것이다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 의해 슈도타입화되어 있는 것을 특징으로 하는, 실질적으로 순수한 슈도타입 레트로바이러스 벡터이다. 본 발명에 있어서 「바이러스 벡터」란, 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 가리킨다. 「레트로바이러스 벡터」란, 벡터가 레트로바이러스의 백본을 갖는 것을 가리킨다. 「레트로바이러스의 백본을 갖는」이란, 상기 벡터를 구성하는 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 레트로바이러스 게놈을 토대로 하는 것을 말한다. 예를 들면, 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 레트로바이러스 게놈 유래의 팩키징 시그날서열을 갖는 벡터는, 본 발명에 있어서 레트로바이러스 벡터에 포함된다.
「헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 의해 슈도타입화되어 있는 레트로바이러스 벡터」란, 상기 레트로바이러스 벡터의 천연형이 보유하고 있지 않은 하나 또는 그 이상의 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 보유하고 있는 레트로바이러스 벡터를 말한다. 본 발명에 있어서 「실질적으로 순수한 슈도타입 레트로바이러스 벡터」란, 상기 슈도타입 레트로바이러스 벡터가, 레트로바이러스 이외의 헤마글루티닌 활성을 갖는 복제형 바이러스를 실질적으로 갖지 않는 것을 가리킨다. 본발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터로서는, 레트로바이러스 이외의 복제능을 갖는 바이러스를 실질적으로 갖지 않는 것이 바람직하다. 복제능을 갖는다는 것은, 바이러스 벡터가 숙주세포에 감염한 경우, 상기 세포에 있어서 바이러스가 복제되어, 감염성 바이러스 입자가 생산되는 것을 가리킨다. 예를 들면, 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 감염시킨 세포에 있어서, 벡터의 감염 후에 헤마글루티닌 활성을 나타내는 HA가(적혈구 응집반응)가 감염 초기의 값 보다 유의하게 상승하지 않으면, 이 벡터는, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 갖는 복제능을 갖는 바이러스를 실질적으로 갖지 않는 것으로 판정된다.
헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질로서는, 천연 단백질인가 인공적인 단백질인가는 특별히 제한되지 않지만, 바이러스가 갖는 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질이 적합하다. 지금까지 여러 바이러스에 있어서 헤마글루티닌 활성이 검출되어 있다. 헤마글루티닌 활성의 검출에 사용되는 적혈구의 종류 및 반응의 최적온도는, 각 바이러스에 따라 다양하다. 또한, 풍진바이러스 등에 있어서는, 반응에 칼슘이온이 필요하다고 말하여지고 있다. 아르보바이러스(arbovirus)에 있어서는, 반응의 최적 pH는 엄밀하다. 바이러스의 헤마글루티닌으로서는, 엔테로, 풍진바이러스 등에서는 빌리온(virion) 그 자체, 아르보, 아데노 등에서는 빌리온 이외에도 빌리온 보다 작은 입자로서도 존재한다. 폭스바이러스의 헤마글루티닌은 빌리온과는 다른 지질을 포함하는 입자로서 존재한다. 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스에 있어서는, 이러한 단백질을 포함하는 것이더라도 좋다. 아데노 III아군의 바이러스 등은, 래트의 적혈구를 부분응집시키는 불완전응집을 일으키지만, 이러한 단백질도 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질로서 사용할 수 있다.
헤마글루티닌 활성(적혈구 응집반응; HA가)은 공지의 방법에 의해 시험할 수 있다(국립 예방위생연구소 학우회편, 개정2판 바이러스실험학 총론, pp.214-225, 마루젠주식회사). 적혈구로서는, 예를 들면 닭(병아리 및 성계를 포함한다), 거위, 래트, 모르모트, 빨간털원숭이, 녹색원숭이, 또는 인간 등의 적혈구가 사용될 수 있다. 반응온도는, 0℃, 4℃, 실온, 또는 37℃ 등의, 단백질에 의해 적합한 조건으로 행한다. 각 바이러스의 적혈구 응집반응의 반응조건의 예를 아래에 나타낸다.
<표 1>
본 발명 슈도타입 레트로바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질로서는, 특히 바이러스 단백에 유래하는 단백질이 바람직하고, 이러한 단백질로서는, 구체적으로는, 파라믹소바이러스의 HN 단백질, 오르토믹소바이러스의 HA 단백질, 인플루엔자바이러스의 HA 단백질, 토가바이러스(togavirus)의 E1 단백질, 백시니아바이러스의 A27L, H3L, D8L 단백질, 플라비바이러스(flavivirus)의 M, E 단백질, 코로나바이러스(coronavirus)의 E1, E2 단백질, 분야바이러스(bunyavirus)의 G1 단백질 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명 슈도타입 레트로바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질로서는, 단일 가닥 음성 가닥 RNA 바이러스가 갖는 단백질이 바람직하고, 특히 파라믹소바이러스의 HN 단백질이 바람직하다.
본 발명에 있어서 「단일 가닥 음성 가닥 RNA 바이러스」란, 단일 가닥 음성 가닥[즉, (-)가닥] RNA를 게놈에 갖는 바이러스를 말한다. 이러한 바이러스로서는, 파라믹소바이러스(Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbillivirus, Rubulavirus 및 Pneumovirus속 등을 포함한다), 라브도바이러스(Rhabdoviridae; Vesiculovirus, Lyssavirus 및 Ephemerovirus속 등을 포함한다), 피로바이러스 (Firoviridae), 오르토믹소바이러스(Orthomyxoviridae; Infuluenzavirus A, B, C 및 Thogoto-like viruses속 등을 포함한다), 분야바이러스(Bunyaviridae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairovirus 및 Phlebovirus속 등을 포함한다), 아레나바이러스(Arenaviridae) 등의 과에 속하는 바이러스가 포함된다.
본 발명에 있어서 「파라믹소바이러스」란, 파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae)에 속하는 바이러스를 가리킨다. 파라믹소바이러스로서는, 예를 들면 센다이 바이러스(Sendai virus), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle diseasevirus), 유행성 이하선염 바이러스(Mumps virus), 홍역 바이러스(Measles virus), RS 바이러스(Respiratory syncytial virus), 우역 바이러스(rinderpest virus), 디스템퍼 바이러스(distemper virus), 원숭이 파라인플루엔자 바이러스(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 1, 2, 3형 등을 들 수 있다. 센다이 바이러스는, 야생주, 변이주, 라보계대주 및 인위적으로 구축된 주 등이 포함된다. DI 입자(J. Virol. 68, 8413-8417(1994)) 등의 불완전 바이러스나, 합성한 올리고뉴클레오티드 등도, 본 발명의 백신을 제조하기 위한 재료로서 사용할 수 있다. HN 단백질은 파라믹소바이러스가 갖는 바이러스 단백의 하나이다. 파라믹소바이러스의 바이러스 단백질을 코드하는 유전자로서는, NP, P, M, F, HN 및 L 유전자가 알려져 있다. 「NP, P, M, F, HN 및 L 유전자」란, 각각 뉴클레오캡시드, 포스포, 매트릭스, 퓨젼, 헤마글루티닌-뉴라미니다아제 및 라지 단백질을 코드하는 유전자를 가리킨다. 파라믹소바이러스아과에 속하는 각 바이러스에 있어서의 각 유전자는, 일반적으로 다음과 같이 표기된다. 일반적으로, NP 유전자는 「N 유전자」라고 표기되는 경우도 있다.
파라믹소바이러스속NPP/C/VMFHN-L
루블라바이러스속NPP/VMFHN(SH)L
모빌리바이러스속NPP/C/VMFH-L
예를 들면 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)의 파라믹소바이러스속 (Paramyxovirus)으로 분류되는 센다이 바이러스의 각 유전자의 염기서열의 데이터 베이스의 승인번호는, NP 유전자에 대해서는 M29343, M30202, M30203, M30204, M51331, M55565, M69046, X17218, P 유전자에 대해서는 M30202, M30203, M30204,M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M 유전자에 대해서는 D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F 유전자에 대해서는 D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN 유전자에 대해서는 D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L 유전자에 대해서는 D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886을 참조할 것.
예를 들면, 파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백질에 의해 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터는, 예를 들면 실시예에 기재된 바와 같이, 불활화 파라믹소바이러스, 또는 파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백질을 갖는 비로솜 등을 조제하여, 이들을 레트로바이러스에 융합시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 파라믹소바이러스의 엔벨로프 단백질을 발현하는 발현벡터를, 레트로바이러스의 팩키징 세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 예를 들면 파라믹소바이러스의 HN 단백질 등의 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 더하여 파라믹소바이러스의 F 단백질을 더욱이 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, HN 및 F 단백질을 갖는 슈도타입 레트로바이러스 벡터가, 높은 유전자 도입효율을 나타내는 것이 실증되었다. 본 발명에는, 이 F 및 HN 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터가 포함된다. 또한, 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 파라믹소바이러스의 M 단백질을 더욱이 포함하더라도 좋다.
더욱이, 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 다른 바이러스 유래의엔벨로프 단백질을 더욱이 포함할 수 있다. 예를 들면, 이러한 단백질로서, 인간 세포에 감염하는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질이 적합하다. 이러한 단백질로서는, 특별히 제한은 없지만, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질, 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 G 단백질 등을 들 수 있다. 또한, 헤르페스바이러스과의 단백질로서는, 예를 들면 단순 헤르페스바이러스의 gB, gD, gH, gp85 단백질, EB 바이러스의 gp350, gp220 단백질 등을 들 수 있다. 헤파드나바이러스과(hepadna viridae)의 단백질로서는, B형 간염 바이러스의 S 단백질 등을 들 수 있다.
예를 들면, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프(암포트로픽 env) 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터는, 본 발명의 벡터로서 적합하다. 또한, 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus; VSV)의 표면 당단백질인 VSV-G 단백질을 포함할 수 있다. VSV-G는 대부분의 동물세포에 존재하는 인지질을 리셉터로 하고 있다고 생각되고 있어, VSV-G 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터를 사용함으로써 유전자 도입할 수 있는 세포종이 비약적으로 증가하여, 도입효율도 상승한다. 실제로, VSV-G 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터는, VSV-G 단독을 갖는 벡터 보다도 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 따라서, VSV-G 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터는 본 발명의 벡터로서 적합하다. 이들 벡터는, 더욱이 파라믹소바이러스의 F 단백질을 포함할 수 있다. 즉, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질, F 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터 및 VSV-G 단백질, F 단백질 및 HN 단백질을 포함하는 벡터는 본 발명에 포함된다. 더욱이, 이들 벡터는, 파라믹소바이러스의 M 단백질을 포함할 수 있다. 즉, 레트로바이러스의 암포트로픽엔벨로프 단백질, F 단백질, HN 단백질 및 M 단백질을 포함하는 벡터 및 VSV-G 단백질, F 단백질, HN 단백질 및 M 단백질을 포함하는 벡터는, 본 발명에 포함된다. 상기와 같은, 파라믹소바이러스 유래의 F 및 HN 단백질을 포함하는 벡터 및 F, HN 및 M 단백질을 포함하는 벡터는, 점액을 갖는 세포나 조혈간세포를 포함하는 세포분획 등, 종래에는 유전자의 도입이 곤란했었던 세포에 대해서도 높은 유전자 도입능을 나타냈다.
VSV-G 단백질은 1종류의 당단백이 안정한 3량체를 형성하여 막상에 존재하기 때문에, 정제과정에서의 벡터입자의 파괴가 일어나기 어려워, 원심에 의한 고농도의 농축이 가능해진다(Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13. 1995). 본 발명자 등은 VSV-G 및 F, HN으로 슈도타입화한 SIV 벡터가 원심농축 가능한 것을 확인했다.
벡터의 슈도타입화를 위해 사용하는 파라믹소바이러스의 HN, F 및 M 단백질로서는 특별히 제한은 없다. 특히, 센다이 바이러스를 포함하는 레스피로바이러스속의 단백질은 적합하게 사용될 수 있다. 센다이 바이러스의 HN, F 및 M 단백질로서는, 예를 들면 Z주 유래의 단백질을 사용할 수 있다. 또한, 레트로바이러스의 암포트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스(MuLV) 4070A주 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수 있다. 또한, MuMLV 10A1 유래의 엔벨로프 단백질을 사용하는 것도 가능하다(예를 들면 pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705(1996)). 에코트로픽 엔벨로프 단백질로서는, 예를 들면 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMuLV) 유래의 엔벨로프 단백질을 사용할 수있다. 수포성 구내염 바이러스 G 단백(VSV-G)로서는, 예를 들면 Indiana 혈청형 주(J. Virology 39: 519-528(1981)) 유래의 단백을 사용할 수 있다. 이들 이외에도, 목적으로 하는 주 유래의 단백질을 사용할 수 있다.
HN, F, M, VSV-G 및 레트로바이러스 엔벨로프 단백질 등, 상기 엔벨로프 단백질은, 야생형 바이러스가 갖는 원래 그대로의 단백질이더라도 좋고, 천연 또는 인위적으로 변이가 도입되어 있더라도 좋다. 예를 들면, 구조체 단백질의 하나인 HN 단백질은, 적혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin) 활성과 뉴라미니다아제(neuraminidase) 활성과의 양자의 활성을 갖지만, 예를 들면 전자의 활성을 약하게 할 수 있다면, 혈액 속에서의 바이러스의 안정성을 향상시키는 것이 가능할 것이고, 예를 들면 후자의 활성을 개변함으로써, HN 단백질에 의한 감염능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 막융합에 관한 F 단백질을 개변함으로써 융합능을 조절하는 것도 가능하다. 또한, 예를 들면, 세포표면의 항원분자가 될 수 있는 F 단백질이나 HN 단백질의 항원제시 에피토프 등을 해석하고, 이것을 이용하여 항원제시능을 약하게 한 단백질을 사용하여 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스를 작성하는 것도 가능하다. 또한, 병원성 파라믹소바이러스 등에 있어서의 약독주 유래의 엔벨로프 단백질 등을 사용하는 것도 가능하다.
예를 들면, 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질이나, 다른 엔벨로프 단백질의 세포질쪽 영역을 결실, 치환 및/또는 부가에 의해 개변한 단백질을 사용하여 본 발명의 레트로바이러스 벡터를 슈도타입화함으로써, 보다 높은 유전자 도입능을 갖는 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 본 발명은, 천연에 존재하는 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가, 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 단백질을 포함하는, 슈도타입 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다. 구체적으로는, 예를 들면 파라믹소바이러스의 HN 단백질 및/또는 F 단백질의 세포질쪽 영역을 결실시키거나, 다른 막단백질(예를 들면 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질)의 세포질쪽 영역에서 치환 또는 부가한 개변 단백질은, 감염효율이 높은 바이러스 벡터를 제조하기 위해 적합하게 사용된다. 본 발명은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질으로서, 상기 단백질의 천연형 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가, 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변되어 있는 단백질 및 이 단백질을 코드하는 핵산(DNA 또는 RNA 등)을 제공한다. 특히 본 발명은, 바이러스가 갖는 헤마글루티닌 단백질의 세포질쪽 영역이, 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변되어 있는 단백질 및 이 단백질을 코드하는 핵산을 제공한다. 예를 들면, 서열번호: 40 또는 41에 기재의 아미노산서열을 포함하는 개변 HN 단백질은 적합하다. 이들 개변 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 핵산은, 본 발명의 슈도타입화 바이러스의 제조를 위해 유용하다.
구체적으로는, 파라믹소바이러스의 HN 단백질의 세포질쪽 영역을, SIV 등의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역으로 치환한 단백질(예를 들면 실시예 11에 기재의 pCAGGS-SIVct/HN이 코드하는 단백질) 및 파라믹소바이러스의 HN 단백질에 렌티바이러스 등의 레트로바이러스의 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역을 부가한 단백질(예를 들면 실시예 11에 기재의 pCAGGS-SIVct+HN) 등으로 레트로바이러스를 슈도타입화함으로써, 인간 세포를 포함하는 넓은 세포에 높은 효율로 외래유전자를 도입하는 것이 가능해진다. HN 단백질에 있어서 결실시키는 세포질쪽 영역의 범위 및 부가되는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역의 범위는 특별히 제한은 없고, 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부를 결실, 치환 및/또는 부가시킬 수 있다.
이러한 바이러스 벡터는, 더욱이 파라믹소바이러스가 개변된 F 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 파라믹소바이러스의 F 단백질의 세포질쪽 영역을 결실시킨 단백질 및 이러한 결실단백질에 SIV 등의 렌티바이러스 또는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역을 부가한 단백질 등이 사용될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 F 단백 세포질쪽 영역의 아미노산을 결실시킨 단백질을 발현하는 플라스미드를 구축한다. 결실시키는 범위는 특별히 제한은 없고, 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부를 결실시킬 수 있다. 센다이 바이러스 F 단백질을 세포질쪽 영역을 4 아미노산 남긴 결실쪽 F 단백질(Fct4)을 갖는 슈도타입 바이러스는, 유의하게 높은 유전자 도입효율을 나타냈다. 따라서, 0~수개의 아미노산을 남기고 세포질쪽 영역을 결실시킨 단백질은, 본 발명의 슈도타입화 바이러스의 제조에 적합하다고 생각된다. 이들 결실형 F 단백질에, 다른 바이러스 엔벨로프 단백질(예를 들면 렌티바이러스 엔벨로프 단백질)의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부를 부가함으로써, F 단백질의 세포질쪽 영역을 다른 펩티드로 치환한 단백질을 제조할 수 있다. 예를 들면, SIV의 엔벨로프 단백질의 세포질쪽 영역의 5'측에서 11아미노산(SIVct11)을 부가한 단백질 등을 예시할 수 있다. 이와 같이 본 발명은, 파라믹소바이러스의 F 단백질로서, 상기 단백질의 천연형 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가, 치환, 결실및/또는 부가에 의해 개변되어 있는 단백질 및 이 단백질을 코드하는 핵산을 제공한다. 특히 본 발명은, F 단백질의 세포질쪽 영역이, 렌티바이러스를 포함하는 레트로바이러스의 엔벨로프 단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부와 치환되어 있는 단백질 및 이 단백질을 코드하는 핵산을 제공한다. 예를 들면, 서열번호: 42, 43, 44, 45, 46, 또는 47에 기재의 아미노산서열을 포함하는 개변 F 단백질은 적합하다. 이들 개변 단백질 및 상기 단백질을 코드하는 핵산은, 본 발명의 슈도타입화 바이러스의 제조를 위해 유용하다.
또한, 헤마글루티닌 활성을 갖는 바이러스의 엔벨로프 단백질로서, 오르토믹소바이러스과 바이러스의 HA 단백질을 사용하는 것도 바람직하다. 예를 들면, 인플루엔자바이러스의 엔벨로프 단백 발현 플라스미드를 사용하여 제조된 슈도타입 바이러스는, 인간 세포를 포함한 넓은 포유동물세포에 감염 가능하다. 인플루엔자바이러스 엔벨로프에는 목적으로 하는 단리주 유래의 것이 사용될 수 있다. 인플루엔자바이러스의 budding에 있어서는, 뉴라미니다아제가 시알산(sialic acid)과의 결합을 절단하는 역할을 담당하고 있다. 이 때문에, HA 슈도타입 제작에 있어서는 뉴라미니다아제로 처리함으로써 감염성 바이러스를 얻을 수 있다. 또는, 뉴라미니다아제 활성을 갖는 단백질을 공존시킨 바이러스 벡터를 제작함으로써, 자동적으로 시알산과의 결합을 절단시킬 수 있다. 이 경우, 파라믹소바이러스의 HN 단백질 등의, 뉴라미니다아제 활성을 갖는 바이러스 엔벨로프 단백질을 사용하는 것이 특히 적합하다. 이와 같이 본 발명은, HA/HN 단백질로 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터를 제공한다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 온코바이러스에 유래하는 것이 포함된다. 「온코바이러스」란, 온코바이러스아과(Oncovirus)에 속하는 레트로바이러스를 가리킨다. 온코바이러스에는, 육종 바이러스, 백혈병 바이러스 및 유방암 바이러스 등, 발암에 관련하는 레트로바이러스가 포함된다. 예를 들면, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukaemia Virus; MoMLV)는, 처음부터 초기에 개발된 레트로바이러스 벡터의 하나로, 지금까지 많은 개량이 이루어져 널리 사용되고 있다. MoMLV를 파라믹소바이러스 HN 단백질 등의 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질로 슈도타입화한 바이러스 벡터는 본 발명에 있어서 적합하게 사용될 수 있다. 또한, 실시예에서 사용된 마우스 간세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus; MSCV)도, 특히 혈구계 ·조혈계 세포 및 태아성 간세포 등에 대한 유전자 도입을 위한 벡터로서 적합하다.
또한, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 렌티바이러스에 유래하는 것이 포함된다. 렌티바이러스는, 렌티바이러스아과(Lentivirus)에 속하는 레트로바이러스를 가리킨다. 렌티바이러스에는, 인간 면역부전 바이러스(human immunodeficiency virus; HIV)(예를 들면 HIV1 또는 HIV2), 원숭이 면역부전 바이러스(simian immunodeficiency virus; SIV), 고양이 면역부전 바이러스(FIV), 마에디 ·비스나바이러스(Maedi-Visna virus), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV) 등이 포함된다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 목적으로 하는 주 및 서브타입에 유래하는 것으로 좋다. 예를 들면 HIV-1로서는, 모든 메이저(M) 서브타입(A~J를 포함한다), N 및 outlier(O)가 포함된다(Hu, D. J. et al., JAMA1996; 275: 210-216; Zhu, T. et al, Nature 1998, 5; 391(6667): 594-7; Simon, F. et al., Nat. Med. 1998, 4(9): 1032-7). SIV 단리주로서는, SIVagm, SIVcpz, SIVmac, SIVmnd, SIVsnm, SIVsyk 등을 예시할 수 있다.
렌티바이러스의 특징은, 비분열세포에 대해서도 감염하고, 숙주세포의 염색체로 바이러스 게놈을 삽입하는 성질을 갖는 것이다. 여기에는 gag 및 vpr에 코드되어 있는 핵이행 시그날이 중요한 작용을 하고 있는 것으로 생각되고 있다. 이 성질을 이용하여, 렌티바이러스를 베이스로 한 본 발명의 바이러스 벡터를 만들면, 생체내 조직의 비분열세포, 여러 조직의 간세포와 같이 거의 분열하지 않는 세포로도 유전자를 도입하여, 장기간의 유전자 발현이 가능해지는 것으로 생각된다.
렌티바이러스 중에서 가장 빨리 벡터화의 시도가 행해진 것은 인간 면역부전 바이러스 Human Immunodeficiency Virus(HIV)로, 본 발명에 있어서도 적합하게 사용될 수 있다. 또한, 고양이 면역부전 바이러스 Feline Immunodeficiency Virus(FIV)(Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998)나 염소 관절염 뇌염 바이러스 Caprine Arthritis Encephalitis Virus(CAEV)(Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998)를 베이스로 한 벡터의 개발이 행해지고 있다. 이들 벡터를 본 발명의 벡터의 제조에 사용하는 것도 가능하다.
원숭이 면역부전 바이러스(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)는 원숭이에 있어서의 HIV 유사 바이러스로서 발견되어, HIV와 함께 Primates Lentivirus 그룹을 형성하고 있다(E. Ido, M. Hayamizu, 원숭이 면역부전 바이러스의 유전자와 감염 ·병원성, 단백질 핵산 효소: Vol.39, No.8, 1994). 이 그룹은 더욱이 크게 4개의 그룹으로 분류되어, 1) 인간에 있어서 후천성 면역부전 증후군(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)의 원인이 되는 HIV-1과 침팬지로부터 분리된 SIVcpz를 포함하는 HIV-1 그룹, 2) 수티 망가베이Cerocebus atys로부터 분리된 SIVsmm과 빨간털원숭이Macaca mulatta로부터 분리된 SIVmac 및 인간에 대해 저빈도이기는 하지만 병원성을 나타내는 HIV-2(Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997)로 된 HIV-2 그룹, 3) 아프리카녹색원숭이Cercopithecus aethiops로부터 분리된 SIVagm으로 대표되는 SIVagm 그룹, 4) 만드릴Papio sphinx로부터 분리된 SIVmnd로 대표되는 SIVmnd 그룹으로 되어 있다.
이 중, SIVagm 및 SIVmnd에서는 자연숙주에 있어서의 병원성의 보고는 없고(Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1998; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; M. Hayamizu, 일본임상, 47, 1, 1989), 특히 본 실시예에서 사용한 SIVagm의 일종인 TYO-1주는 자연숙주이더라도, 게잡이원숭이Macaca facicularis, 빨간털원숭이Macaca mulatta에 대한 실험감염에서도 병원성을 나타내지 않는 것이 보고되어 있다(Ali, M. et al., Gene Therapy, 1(6); 367-84, 1994; Honjo, S et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990). SIVagm의 인간에 대한 감염, 발증에 대해서는 보고가 없어, 인간에 대한 병원성은 알려져 있지 않지만, 일반적으로 영장류에 있어서의 렌티바이러스는 종특이성이 높아, 자연숙주로부터 타종에 감염, 발증한 예는 적고, 그 발증도 저빈도 또는 진행이 느리다고 하는 경향이 있다(Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997). 따라서, SIVagm, 특히 SIVagm TYO-1을 베이스로 하여 제작한 바이러스 벡터는, HIV-1이나 다른 렌티바이러스를 베이스로 한 벡터와 비교하여 안전성이 높다고 생각되어, 본 발명에 있어서 적합하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 스푸마바이러스(Spumavirus)에 유래하는 것이 포함된다. 스푸마바이러스에는, 예를 들면 포미바이러스(foamyvirus)가 포함된다(DE4318387; WO9607749; Virology (1995) 210, 1, 167-178; J. Virol. (1996) 70, 1, 217-22). 포미바이러스에 유래하는 본 발명의 벡터는, 인간 세포로의 외래유전자 도입, 특히 유전자치료 및 재조합 백신의 투여 등에 이용될 수 있다.
본 발명의 레트로바이러스 벡터로서는, LTR(long terminal repeat)에 개변을 가하는 것도 가능하다. LTR은 레트로바이러스에 특징적인 서열로, 바이러스 게놈의 양단에 존재하고 있다. 5'LTR은 프로모터로서 작용하여, 프로바이러스로부터의 mRNA의 전사를 촉진한다. 따라서, 진 트랜스퍼 벡터의 5'LTR의 프로모터 활성을 갖는 부분을 별도의 강력한 프로모터와 치환하면, 진 트랜스퍼 벡터의 mRNA 전사량이 증대하여, 팩키징 효율이 상승, 벡터 역가를 상승시킬 가능성이 있다. 더욱이, 예를 들면 렌티바이러스의 경우, 5'LTR은 바이러스 단백질 tat에 의한 전사활성의 증강을 받는 것이 알려져 있어, 5'LTR을 tat 단백질에 의존하지 않는 프로모터로 치환함으로써, 팩키징 벡터로부터 tat를 삭제하는 것이 가능해진다. 또한, 세포에 감염하여 세포 내에 침입한 바이러스 RNA는 역전사된 후, 양단의 LTR을 결합시킨 고리상 구조로 되어, 결합부위와 바이러스의 인테그라아제(integrase)가 공역하여 세포의 염색체 내에 인테그레이트된다. 프로바이러스로부터 전사되는 mRNA는 5'LTR 내의 전사 개시점 보다 하류, 3'LTR의 polyA 서열까지이고, 5'LTR의 프로모터 부분은 바이러스 내에 팩키징되지 않는다. 따라서, 프로모터를 치환했다고 하더라도 표적세포의 염색체에 삽입되는 부분에는 변화가 없다. 이상의 사실로부터, 5'LTR의 프로모터의 치환은, 보다 고역가이고 안전성이 높은 벡터를 작성하는 것으로 이어진다고 생각된다. 따라서, 진 트랜스퍼 벡터의 5'측 프로모터의 치환을 행하여, 팩키징되는 벡터의 역가를 상승시킬 수 있다.
또한, 3'LTR의 서열을 부분적으로 삭제하고, 표적세포로부터 전장의 벡터 mRNA가 전사되는 것을 방지하는 Self Inactivating Vector(SIN 벡터)(자기 불활성화형 벡터)의 작성에 의해, 안전성을 상승시키는 것도 가능하다. 표적세포의 염색체에 침입한 렌티바이러스의 프로바이러스는, 3'LTR의 U3 부분을 5'단에 결합한 형태로 된다. 따라서 진 트랜스퍼 벡터는, 표적세포의 염색체에서는 5'단에 U3이 배치되고, 그곳으로부터 진 트랜스퍼 벡터 전체의 RNA가 전사되게 된다. 만일, 표적세포 내에 렌티바이러스 또는 그 유사의 단백질이 존재한 경우, 진 트랜스퍼 벡터가 다시 팩키징되어, 다른 세포에 재감염할 가능성이 있다. 또한 3'LTR의 프로모터에 의해, 바이러스 게놈의 3'측에 위치하는 숙주 유래의 유전자가 발현되어 버릴 가능성이 있다(Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997). 이 현상은 레트로바이러스 벡터에 있어서 이미 문제가 되어, 회피 방법으로서 SIN 벡터가 개발되었다(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(10), 3194-8, 1986). 진 트랜스퍼 벡터 상의 3'LTR의 U3 부분을 결실시킴으로써, 표적세포 내에서는 5'LTR이나 3'LTR의 프로모터가 없어지기 때문에, 전장의 RNA나 숙주유전자의 전사가 일어나지 않는다. 그리고, 내부 프로모터로부터의 목적유전자의 전사만이 행해짐으로써, 안전성이 높고, 고발현의 벡터로 되는 것이 기대된다. 이러한 벡터는, 본 발명에 있어서 적합하다. SIN 벡터의 구축은, 공지의 방법 및 실시예 5에 기재의 방법 등에 따르면 좋다.
레트로바이러스의 생산에는, 숙주세포에서 팩키징 시그날을 갖는 진 트랜스퍼 벡터 DNA를 전사시켜, gag, pol 단백질 및 엔벨로프 단백질의 존재하에서 바이러스 입자를 형성시킨다. 진 트랜스퍼 벡터 DNA는, 플라스미드와 같은 DNA 벡터이더라도 좋고, 또는 팩키징 세포의 염색체 DNA에 삽입되어 있더라도 좋다. 진 트랜스퍼 벡터 DNA에 코드되는 팩키징 시그날서열은, 이 서열에 의해 형성되는 구조를 유지할 수 있도록 가능한 한 길게 삽입하는 것이 바람직한 한편으로, 상기 벡터 DNA 상의 팩키징 시그날과, gag, pol 단백질을 공급하는 팩키징 벡터와의 사이에서 일어나는 재조합에 의한 야생형 바이러스의 출현빈도를 억제하기 위해서는 이들 벡터 사이의 서열의 중복을 최소한으로 할 필요가 있다. 따라서, 진 트랜스퍼 벡터 DNA의 구축에 있어서는, 팩키징 효율 및 안전성 양자를 만족시키기 위해, 팩키징에 필요한 서열을 포함할 수 있는 한 짧은 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
팩키징 시그날로서는, 팩키징 벡터가 도입된 세포에 의해 팩키징되는 한 제한은 없고, 팩키징 벡터의 종류에 맞춰, 레트로바이러스 유래, 렌티바이러스 유래,면역부전 바이러스 유래의 시그날 등이 사용된다.
예를 들면, 실시예에서 사용한 SIVagm 유래의 팩키징 벡터의 경우는, HIV 벡터는 팩키징되지 않기 때문에, 사용되는 시그날의 유래로서는 SIV에만 제한되는 것으로 생각된다. 단, HIV 유래의 팩키징 벡터를 사용한 경우, SIV 유래의 진 트랜스퍼 벡터도 팩키징되기 때문에, 재조합 바이러스의 출현빈도를 저하시키기 때문에, 다른 렌티바이러스 유래의 진 트랜스퍼 벡터와 팩키징 벡터를 조합하여 벡터 입자를 형성시키는 것이 가능하다고 생각된다. 이 경우, 영장류의 렌티바이러스 사이의 조합(예를 들면, HIV와 SIV)인 것이 바람직하다.
진 트랜스퍼 벡터 DNA에서는, gag 단백질이 발현하지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 바이러스 gag 단백질은, 생체에 있어 이물질로서 인식되어, 항원성이 나타날 가능성이 있다. 또한, 세포의 기능에 영향을 미칠 가능성도 있다. gag 단백질을 발현하지 않도록 하기 위해서는, gag의 개시코돈의 하류에 염기의 부가나 결실 등에 의해 프레임 시프트함으로써 개변할 수 있다. 또한, gag 단백질의 코드영역의 일부를 결실시키는 것이 바람직하다. 일반적으로 바이러스의 팩키징에는, gag 단백질의 코드영역의 5'측이 필요하다고 되어 있다. 따라서, 진 트랜스퍼 벡터에 있어서는, gag 단백질 코드영역의 C 말단을 결실하고 있는 것이 바람직하다. 팩키징 효율에 커다란 영향을 주지 않는 범위에서 가능한 한 넓은 gag 코드영역을 결실시키는 것이 바람직하다. 또한, gag 단백질의 개시코돈(ATG)을 ATG 이외의 코돈으로 치환하는 것도 바람직하다. 치환하는 코돈은, 팩키징 효율에 대한 영향이 적은 것을 적절히 선택한다. 이로써 구축된 팩키징 시그날을 갖는 진 트랜스퍼 벡터DNA를, 적당한 팩키징 세포에 도입함으로써 진 트랜스퍼 벡터 DNA의 전사산물이 삽입된 바이러스 벡터를 생산시킬 수 있다. 생산시킨 바이러스 벡터는, 팩키징 세포의 배양상청 등으로부터 회수할 수 있다.
팩키징 세포에 사용되는 세포로서는, 일반적으로 바이러스의 생산에 사용되는 세포주라면 제한은 없다. 인간의 유전자 치료용으로 사용하는 것을 생각하면, 세포의 유래로서는 인간 또는 원숭이가 적당하다고 생각된다. 팩키징 세포로서 사용될 수 있는 인간 세포주로서는, 예를 들면 293 세포, 293T 세포, 293EBNA 세포, SW480 세포, u87MG 세포, HOS 세포, C8166 세포, MT-4 세포, Molt-4 세포, HeLa 세포, HT1080 세포, TE671 세포 등을 들 수 있다. 원숭이 유래 세포주로서는, 예를 들면, COS1 세포, COS7 세포, CV-1 세포, BMT10 세포 등을 들 수 있다. 또한, 기존의 팩키징 세포를 사용하는 것도 가능하다. 팩키징 세포로서는, 예를 들면 Bosc23 세포, PE501 세포 등을 들 수 있다.
벡터가 보유하는 외래유전자로서는 특별히 제한은 없고, 단백질을 코드하는 핵산에 더하여, 예를 들면, 안티센스 또는 리보자임 등의 단백질을 코드하지 않는 핵산이더라도 좋다.
최근, 유전자치료의 표적으로서 조혈간세포를 비롯한 각종 간세포가 주목받고 있다(Y. Hanazono, Molecular Medicine, Vol.36, No.7, 1999). 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 인간 골수 유래 CD34 양성 세포에 대해 높은 효율로 유전자를 도입할 수 있지만, 이 CD34 양성 세포는 조혈간세포를 포함하는 분획으로서 최근 주목받고 있다. CD34 양성 세포는, 메틸셀룰로오스를 포함하는 배지를 사용한 콜로니 어세이(colony assay)에 있어서 다분화능을 갖는 것(Kirshenbaum, A. S. et al., J. Immunol., 148(3), 772-7, 1992)과, 복합 면역부전 계통인 NOD/SCID 마우스에 CD34 양성 세포를 이식하면 마우스 골수에 생착하여 조혈계의 재건이 인정되는 것(Larochelle, A. et al., Nat. Med., 2(12), 1329-37(1996)이 보고되어 있어, 적어도 CD34 양성 세포 분획 중에 아주 미숙하여 간세포에 가까운 상태의 세포가 존재하는 것으로 생각되고 있다. 또한, CD34 양성 세포 중의 조혈간세포는 비분열상태로, 일반적으로 레트로바이러스 벡터에서는 유전자 도입효율이 낮지만(Kiem, H. P. et al., Curr. Opin. Oncol., 7(2), 107-14, 1995), 본 발명의 슈도타입화 벡터에 의해 감염효율을 대폭으로 개선하는 것이 가능하다고 생각된다. 특히, HIV나 SIV 벡터 등의 렌티바이러스 벡터를 사용하면, 비분열세포에 대한 유전자 도입효율은 더욱 상승하는 것이 기대된다. 본 발명은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 혈구계 또는 조혈계 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 혈구계 또는 조혈계 세포로 유전자를 도입하는 방법 및 혈구계 또는 조혈계 세포로의 유전자 도입을 위한, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 사용에 관한 것이다. 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질에 의해 슈도타입화된 본 발명의 레트로바이러스 벡터는, 혈구계 세포 및 조혈계 세포에 대한 높은 효율의 유전자 도입이 가능하기 때문에, ADA 결손증(Blaese, R. M., Pediatr. Res., 33(1 Suppl), S49-53, 1993), 혈우병(Kay, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(18), 9973-5, 1999) 및 Fanconi 빈혈증 등의 혈액세포를 대상으로 한 유전자 치료에 있어서 유용하다. 투여는 예를 들면 엑스 비보법에 의해 행할 수 있다.
혈구계 및 조혈계 세포에 대한 외래유전자 도입의 평가는, 예를 들면 기지의 여러 표면항원에 대한 항체를 사용한 플로 사이토미터에 의한 해석이나 콜로니 어세이, 조혈계를 파괴한 마우스 등에 조혈세포를 이식하여 행하는 조혈계 재구축 등에 의해 검증하는 것이 가능하다.
본 발명의 벡터가 적용 가능한 조혈세포계를 대상으로 한 유전자 치료로서는, 예를 들면, 종양을 화학 항암제 치료할 때의 간세포의 보호를 목적으로 한 약제내성 유전자 MDR1의 이용(Licht, T. et al., Gene Ther. (2000) 7, 4, 348-58), 판코니 빈혈증(Fanconi anemia)을 위한 정상 FANCC 유전자의 도입(Liu, J. M. et al., Hum. Gene Ther. (1999) 10, 14, 2337-46), 엑스 비보 간세포 증식을 보조하기 위한 사이토카인의 조합(트롬보포에틴(thrombopoietin), 인터루킨 6 및 11 및 Flt-3 리간드)의 도입(WO9907831), 혈구 감소증을 치료하기 위한 Flt-3 아고니스트(agonist) 등의 키메라 단백질의 발현(WO9846750), β세라미아 (βthalassemia)를 치료하기 위한 인간 β글로빈 유전자의 도입(WO9741141), IL-6 의존적인 다발성 골수종 치료를 위한 IL-6 안다고니스트와 자살 유전자의 발현의 조합치료(독일특허 DE19704979), 조혈인자의 조합에 의한 수용체 아고니트스 [인터루킨(GM-CSF, G-CSF-Ser17, M-CSF, 에리스로포에틴(erythropoietin), IL-1, IL-14, IL-2, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15), 백혈병 억제인자(LIF), flt3/flk2 리간드, 인간 소마토트로핀(human somatotropin), B 세포 증식인자, B 세포 분화인자, 적혈구 분화인자(EDF), 또는 간세포인자(SCF)](WO9712985), 간세포 배양 및 조혈질환의 유전자 치료에 사용되는 c-mpl 수용체 아고니스트(WO9712978), 인간 조혈시원세포의 증식에 사용되는 IL-6 및 IL-6 가용형 수용체의 융합단백질(Nat. Biotechnol. (1997) 15, 2, 142-45), 조혈시원세포의 증식에 사용되는 IL-6 슈퍼 아고니스트 및 슈퍼 안타고니스트(WO9618648), 혈액질환의 치료에 사용되는 Factor-X(J. Cell. Bioche. (1995) Suppl. 21A, 410), 인간 조혈시원세포의 증식에 사용되는 간세포인자, IL-6 및 가용형 IL-6 수용체 복합체(Gene Ther. (1995) 2, 9, 694), RNA 바이러스를 표적으로 하는 리보자임 및 HIV 감염방어 및 세포내 면역에 유용한 안티센스 및/또는 RNA 데코이(decoy) (WO9622368) 등의 유전자 도입을 들 수 있다.
또 본 발명의 HN 단백 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 비강의 점막 상피세포 및 폐의 기관지 점막 상피세포 등, 점액을 갖는 세포에 대한 감염능력이 높다. 본 발명의 벡터는, 종래에는 유전자 도입이 곤란했던 점액을 갖는 세포로의 높은 효율의 외래유전자의 도입에 유용하다. 본 발명은, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 점액을 갖는 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 점액을 갖는 세포로 유전자를 도입하는 방법 및 점액을 갖는 세포로의 유전자 도입을 위한, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스의 사용에 관한 것이다. 점액을 갖는 세포로서는, 특히 점막 상피세포, 구체적으로는, 예를 들면 비강 또는 폐의 기관지의 점막 상피세포 등을 들 수 있다.
구체적인 적용예로서는, 예를 들면 항원제시세포(APC)의 농도가 높은 것을이점으로 하여 응용한 피부 ·점막으로의 유전자(IL-2, IFN-γ, TGF-β등) 도입에 의한 면역유도(WO9505853), 유전자의 경구적 점막투여에 의한 로타바이러스 백신(J. Virol. (1998) 72, 7, 5757-61), 자기면역질환을 치료하기 위한 점막투여 (WO9746253), 감염 예방을 위한 점막투여(WO9621356), 성병 또는 파필로마 바이러스 감염(papilloma virus infection)에 의한 자궁경암(cancer of the cervix uteri)을 예방하기 위한, 여성 성기 점막으로의 유전자 투여(Infect. Immun. (1998) 66, 1, 322-29), 점막투여에 의한 투여의 용이성과 안전성의 향상(Proc. Am. Assoc. Cancer Res. (1995) 36, 86 Meet., 418) 등을 들 수 있다.
본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터는, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체와 적절히 조합하여 조성물로 할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 멸균수, 생리식염수, 배양액, 혈청, 인산완충생리식염수(PBS) 등과 적절히 조합하여 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 더욱이, 그 밖에도, 안정제, 살생물제 등이 함유되어 있더라도 좋다. 본 발명의 조성물은, 수용액, 캡슐, 현탁액, 시럽 등의 형태일 수 있다. 본 발명의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 포함하는 조성물은 시약 또는 의약으로서 유용하다. 예를 들면, 각종 세포에 대한 인 비트로 또는 인 비보에서의 유전자 도입시약으로서, 또는, 엑스 비보 또는 인 비보에서의 유전자 치료를 위한 시약으로서, 본 발명의 조성물을 사용할 수 있다. 환자로의 투여는, 일반적으로는, 예를 들면 동맥내 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 경장 투여, 경구 투여, 비강내 투여, 엑스 비보 투여 등 당업자에게 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 특히 비강 또는 기관지 점막으로의 투여 및 혈구계 ·조혈계 세포로의 엑스 비보 투여는 적합하다.
본 발명의 바이러스 벡터는, 그 밖의 각종 유전성 질환의 유전자 치료에도 응용이 가능하다. 대상이 되는 질환은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대상이 될 수 있는 질환과 그의 단일 원인 유전자로서는, 고세병에 있어서는 β-세레브로시다아제(β-cerebrosidase)(제20염색체), 혈우병에 있어서는 혈액응고 제8인자(X염색체) 및 혈액응고 제9인자(X염색체), 아데노신 데아미나아제 결손증(adenosine deaminase deficiency)에 있어서는 아데노신 데아미나아제, 페닐케톤요증 (phenylketon uria)에 있어서는 페닐알라닌 히드록시라아제(phenylalanine hydroxylase)(제12염색체), Duchenne형 근디스트로피(Duchenne muscular dystrophy)에 있어서는 디스트로핀(dystropin)(X염색체), 가족성 고콜레스테롤혈증에 있어서는 LDL 리셉터(제19염색체), 낭포성 섬유증에 있어서는 CFTR 유전자의 염색체로의 삽입 등을 들 수 있다. 그들 이외의 복수의 유전자가 관여하고 있는 것으로 생각되고 있는 대상질환으로서는, 알츠하이머, 파킨슨병 등의 신경변성질환, 허혈성 뇌장애, 치매, 또한 에이즈 등의 난치성 감염증 등을 생각할 수 있다. 에이즈환자의 조혈간세포를 세포밖으로 꺼내 in vitro에서 SIV 베이스의 본 발명의 벡터를 작용시켜, HIV의 감염이 일어나기 전에 SIV에 유래하는 게놈전사를 우세하게 하여, 환자의 몸으로 되돌려, HIV의 전사인자를 무효로 하는 치료방법을 생각할 수 있다. 더 나아가서는, 만성 질환으로의 응용으로서, 허혈성 심질환에 있어서는 VEGF 및 FGF2 유전자, 동맥경화의 유전자 치료에 관해서는, 세포증식관련 유전자, 예를 들면 세포증식인자(PDGF, TGF-β등), Cyclin-dependent kinase 등의 발현억제로의 응용이 가능해진다. 또한 당뇨병에 있어서는 BDNF 유전자가 후보가 될 수 있다. 또한 이 방법에 의해, 유전자 변이가 암화를 일으키는 암 억제 유전자 p53 등의 유전자를 염색체에 삽입하는 보충치료로의 응용, 다제내성 유전자를 in vitro에서 골수 유래 조혈간세포에 도입한 후, 환자의 혈액에 되돌림으로써, 암의 약물치료의 한계를 뛰어 넘은 치료가 가능해진다. 자기면역질환, 예를 들면 다발성 경화증, 만성 관절 류마치스, SLE, 사구체신염 등의 유전자 치료에 관해서는, T 세포 리셉터, 각종 접착인자(예를 들면 ICAM-1, LFA-1, VCAM-1, LFA-4 등), 사이토카인 및 사이토카인 리셉터(예를 들면, TNF, IL-8, IL-6, IL-1 등) 세포증식인자(예를 들면 PDGF, TGF-β등), 작용인자(예를 들면 MMP 등)의 안티센스 발현에 의한 발현억제로의 응용이 가능해진다. 알레르기성 질환의 유전자 치료에 관해서는, IL-4, FcεR-I 등의 안티센스 발현에 의한 발현억제로의 응용이 가능해진다. 장기이식에 관련된 유전자 치료에 관해서는, 인간 이외의 동물 도너의 조직 적합성 항원을 인간형으로 바꿔 이종이식의 성공률을 높이는 응용이 가능해진다. 더 나아가서는 인간 ES 세포의 염색체에 외래 유전자를 도입하고, 배(胚)의 단계에서 결손하는 유전자를 보충하여, 체순환하는 효소, 성장인자 등의 부족을 보충하는 치료를 생각할 수 있다.
예를 들면, IL-4는 헬퍼 T 림프구의 Th2 림프구로의 분화를 촉진한다. Th2 림프구는 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13이라고 하는 천식의 염증을 매개하는 사이토카인을 분비한다. IL-4는 호흡장애에 관여하는 폐 점액막으로부터의 점액분비를 유도하는 분자의 하나이다. IL-4는, 호산구 표면에 존재하는 VLA 4분자와 상호작용하는세포접착분자인 VCAM-1의 발현을 제어하고 있다. 이 상호작용에 의해, 호산구는 혈액 중으로부터 폐조직의 염증부위로 이동할 수 있다. IL-4는 B 세포의 증강과, 알레르기 반응을 일으키기 위해 필요한 항원 특이적 IgE의 생산을 유도한다. 항원 특이적 IgE는 마스트 세포(mast cell)가 히스타민, 로이코트리엔(leukotriene)이라고 하는 염증의 매개가 되는 물질의 방출을 일으켜, 이들이 기관지 수축을 일으키는, 이러한 IL-4의 역할로부터, 천식환자를 대상으로 한 가용성 인터루킨 4(IL-4) 수용체 등을 발현하는 벡터도 유용하다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 센다이 바이러스 F, HN, 또는 F, HN 단백질로 슈도타입화한 마우스 간세포 바이러스(MSCV)를, 293T 세포에 감염시킨 결과를 나타내는 사진이다. EGFP를 발현하는 진 트랜스퍼 벡터(pMSCV EGFP)를 사용하여 바이러스의 팩키징을 행했다. 패널 상부의 「F」,「HN」및「F/HN」은, 각각, 팩키징 세포로 센다이 바이러스의 F, HN 및 F 및 HN을 발현시켜 생산시킨 바이러스를 감염시킨 결과를 나타낸다. 「VSV-G/Null」의 란은, 상단은 VSV-G에 의해 슈도타입화한 양성 대조, 중단 및 하단은 F, HN 및 VSV-G 등의 슈도타입화를 위한 env 단백을 발현시키지 않은 비슈도타입화의 음성 대조를 나타낸다. 패널 오른쪽의 「Eco」및「Ampho」는, 팩키징 세포에, 각각 에코트로픽 env 및 암포트로픽 env를 발현시켜 생산한 바이러스를 사용한 결과를 나타낸다. 「Null」은 레트로바이러스 env를 발현시키지 않은 것을 나타낸다.
도 2는, 센다이 바이러스 HN으로 슈도타입화한 암포트로픽 env를 갖는 레트로바이러스의 HA 어세이의 결과를 나타내는 사진이다. 바이러스의 생산을 위해 사용한 pMSCV EGFP, pCl-Ampho 및 pCAGGS-HN의 양을 병기했다(도 중의 MSCV : AMPHO : HN). 대조의 암포트로픽 env를 갖는 레트로바이러스(도 중의 Ampho-Retro)에서는 적혈구 응집은 일어나지 않았지만, 센다이 바이러스 HN으로 슈도타입화한 레트로바이러스(도 중의 HN-Ampho-Retro)에서는 응집반응을 일으키는 것이 확인되었다.
도 3은, 센다이 바이러스 HN 단백질로 슈도타입화한 암포트로픽 env를 갖는 MSCV(도 중 HN-ampho)를 인간 골수세포에 감염시키고, 플로 사이토미터로 CD34를 마커로 분획하여 각각의 감염세포(GFP 발현세포)의 비율을 측정한 결과를 나타내는 도이다. 도 중의 ampho는 HN 단백질로 슈도타입화하지 않은 대조이다. 각각의 컬럼은, CD34 음성(CD34-)세포 및 CD34 양성(CD34+)세포에 대한 GFP 양성세포율을 나타낸다.
도 4는, 구축의 베이스가 된 SIVagm 게놈 플라스미드(a) 및 구축한 팩키징 벡터(b), 진 트랜스퍼 벡터(c), VSV-G 공급 벡터(d)의 구조모식도이다.
도 5는, SIVagm 벡터에 의한 293T 세포에 대한 β갈락토시다아제 유전자 도입결과를 나타내는 사진이다. 상단은 벡터 플라스미드를 트랜스펙션한 세포로부터 취한 상청을 사용하여, 293T 세포에 대해 벡터 감염을 행하고 48시간 후에 X-gal 염색을 행한 결과를 나타낸다. 많은 세포에서 β갈락토시다아제의 발현이 보인다. 하단은 무처리 대조세포의 X-gal 염색이다.
도 6은, SIVagm SIN 벡터에 의해, G2-M기에서 정지상태의 293T 세포 및 레티노인산에 의해 분화를 유도한 SH-SY5Y 세포에 대해 EGFP 유전자를 도입, 형광현미경으로 발현을 확인한 결과를 나타내는 사진이다. 상단: 293T ×100, 하단: SH-SY5Y ×200
도 7은, 입자경을 갖춘 FHN 비로솜 및 F 비로솜의 웨스턴 블로팅의 결과를 나타내는 사진이다.
도 8은, 불활화 센다이 바이러스(SeV), FHN 비로솜, 또는 F 비로솜과 융합시킨 SIV(각각 도 중의 SIV-SeV 융합, SIV-FHN 비로솜 융합, 또는 SIV-F 비로솜 융합)를 HeLa 세포의 배양상청에 MOI=10으로 첨가하여, 10분, 30분 및 180분 인큐베이트하여 감염시키고, 그 후 신선한 배양액으로 치환하여 감염처리 개시의 48시간 후에 감염세포(GFP 발현세포)를 관찰한 결과를 나타내는 사진이다. SIV는 VSV-G로 슈도타입화되어 있는 것을 사용했다. 도 중의 SIV는 센다이 바이러스 엔벨로프를 융합시키지 않은 음성 대조이다.
도 9는, FHN 비로솜, F 비로솜 및 HN 비로솜의 샘플을 전기영동하여, 은염색을 행한 결과를 나타내는 사진이다. 레인 1: SeV(인택트), 레인 2: DTT 처리 SeV, 레인 3: 트립신 처리 SeV, 레인 4: FHN 비로솜, 레인 5: F 비로솜, 레인 6: HN 비로솜.
도 10은, LacZ를 발현하는 SIV 벡터(VSV-G로 슈도타입화한 것) 및 그것을 더욱이 비로솜과 Fusion시킨 벡터를 293T 세포로 도입하여, LacZ 상대활성을 측정한 결과를 나타내는 도이다. 아스터리스크(asterisk)는 t검정에 의해 SIV에 대해 유의한 차가 있는 것을 나타낸다(p<0.05).
도 11은, SIV-F/HN/M-EGFP 108T.U.를 코로부터 100 ㎕ 투여하고, 3일째의 기관의 동결표본의 소견을 나타내는 사진이다. (b)의 화살표는 기관 상피세포를 나타내고, EGFP의 형광이 인정되지만, (c)의 무처리 마우스에서는 약간의 백그라운드가 관찰되는데 지나지 않는다. (a)는 연속절편의 헤마톡시린 ·에오신(H.E.)염색을 나타낸다.
도 12는, 도 11과 동일한 개체의 비중격 점막의 소견을 나타내는 사진이다(b). 화살표는 다열선모상피로, EGFP의 형광이 인정된다. (a)는 연속절편의 H.E.염색을 나타내는 사진이다.
도 13은, 마우스 비강절편에 있어서의 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 EGFP의 형광의 비교를 나타내는 사진이다. VSV-G로 슈도타입화한 SIV(SIV-VSV-EGFP), F, HN, M으로 슈도타입화한 암포트로픽 env를 갖는 MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP) 및 F, HN, M으로 슈도타입화한 VSV-G SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)의 EGFP의 형광상을 나타낸다. F, HN, M 단백을 갖는 MSCV-F/HN/M-EGF 및 SIV-F/HN/M-EGFP에 있어서 비교적 강한 시그날이 관찰되고, 특히 SIV-F/HN/M-EGFP에 의한 시그날이 높은 것이 판명되었다.
도 14는, 세포질쪽 영역 치환형 HN 발현 플라스미드가 코드하는 단백질의 SIV 세포질쪽 영역과 HN 단백 막관통 영역(표준자체(standard font))의 경계부분의 아미노산서열(서열번호:40)을 나타내는 도이다.
도 15는, SIV 세포질쪽 영역 부가형 HN 발현 플라스미드가 코드하는 단백질의 세포질쪽 영역(하선부)와 HN 단백 막관통 영역(표준자체)의 경계부분의 아미노산서열(서열번호: 41)을 나타내는 도이다.
도 16은, 세포질쪽 영역 결실형 F 발현 플라스미드가 코드하는 단백질의 F 단백 막관통 영역(이태릭)과 F 단백 세포질쪽 영역(표준자체)의 경계부분의 아미노산서열(서열번호:42~44)을 나타내는 도이다.
도 17은, SIV 세포질쪽 영역을 부가한 세포질쪽 결실형 F 발현 플라스미드가 코드하는 단백질의 F 단백 막관통 영역(하선 없는 이태릭) 및 F 단백 세포질쪽 영역(표준자체)과 SIV 세포질쪽 영역 11 아미노산(SIVc11)(하선)의 경계부분의 아미노산서열(서열번호: 45~47)을 나타내는 도이다.
도 18은, SeV F/HN 슈도타입 SIV 벡터의 293T 세포에 있어서의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
도 19는, SeV F/HN 슈도타입 SIV 벡터의 BEAS-2B 세포에 있어서의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
도 20은, SIVc11부가형 SeV F/HN 슈도타입 SIV 벡터의 293T 세포에 있어서의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
도 21은, SeV F/HN 슈도타입 SIV 벡터의 농축을 나타내는 사진이다.
도 22는, MSCV를 베이스로 한 SeV F/HN 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
도 23은, 인플루엔자바이러스 엔벨로프 슈도타입 바이러스 벡터의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
도 24는, 인플루엔자바이러스 엔벨로프 슈도타입 바이러스 벡터의 농축을 나타내는 사진이다.
도 25는, 인플루엔자바이러스 엔벨로프 및 각종 HN 단밸질과의 슈도타입 바이러스 벡터의 유전자 도입을 나타내는 사진이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱이 상세하게 설명하지만, 본 발명은, 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에 인용된 문헌은, 모든 본 명세서의 일부로서 삽입된다.
[실시예 1] 센다이 바이러스 엔벨로프 단백에 의한 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 조제
센다이 바이러스 Z주의 전장 게놈 DNA pSeV18+b(+)(Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)로부터 잘라낸 F, HN 및 M 단백 유전자를 pCAGGS(Niwa, H. et al., Gene: 108, 193-9, 1991)의 XhoI 사이트에 도입함으로써, 센다이 바이러스 유래 F, HN 및 M 단백 발현 벡터(각각 pCAGGS F, pCAGGS HN 및 pCAGGS M이라고 칭한다)를 제작했다.
레트로바이러스 생산에 사용한 인간 태아 신세포 유래 세포주 293T 세포(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.90, pp.8392-8396, 1993)는, 10% 비동화 소태아혈청을 포함하는 D-MEM(GibcoBRL)에서 배양했다. 배양은 모두 플라스틱 플레이트(스미토모 베이크라이트)에서 행했다. 벡터의 트랜스펙션은 LIPOFECTAMINE PLUS(GibcoBRL)를 사용하여 첨부 설명서에 따라 행했다. 293T 세포를 6웰의 플라스틱 플레이트(스미토모 베이크라이트)로 1웰당 1 ×106개의 세포밀도로 뿌리고, 탄산가스 인큐베이터 중(37℃, 10% 탄산가스 존재하)에서 48시간 배양했다. 트랜스펙션의 30분 전에 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민(GibcoBRL)을 포함하는 D-MEM(GibcoBRL)으로 배지교환하여 배양을 계속했다.
진 트랜스퍼 벡터로서는, 마우스 간세포 바이러스(Murine Stem Cell Virus; MSCV)(CLONTECH사제)(R. G. Hawley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10297-10302(1996); R. G. Hawley et al., Gene Therapy 1: 136-138(1994))를 베이스로 하는 벡터에서 리포터 유전자로서 EGFP 유전자를 삽입한 것을 사용했다. 트랜스펙션에 사용하는 DNA량은 1웰당 700 ng의 진 트랜스퍼 벡터와, 300 ng의 팩키징 벡터(pCL-Eco, pCL-Ampho(MuMLV 4070A), 공히 IMGENEX사)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705(1996))를 사용하고, 그들에 더하여 200 ng의 센다이 바이러스 엔벨로프 단백 발현 벡터(pCAGGS F와 pCAGGS HN)나 200 ng의 센다이 바이러스 M 단백 발현 벡터(pCAGGS M)를 조합하여 사용했다(표 2). DNA를 100 ㎕의 OptiMEM에 용해 후에 6 ㎕의 PLUS reagent(GibcoBRL)를 가하여 교반 후 15분 실온에서 정치했다. DNA와 PLUS reagent(GibcoBRL)와의 혼합액에, 100 ㎕의 OptiMEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE을 첨가하여 교반 후 더욱이 15분 실온에서 정치했다. 이상의 방법에 의해 조제한 DNA와 LIPOFECTAMINE과의 복합체를 포함하는 용액을 6웰플레이트에서 배양하고 있는 293T 세포로 적하하여 완만하게 교반한 후에 탄산가스 인큐베이터 중(37℃, 10% 탄산가스 존재하)에서 3시간 배양했다. 배양 후 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민(GibcoBRL)과 15 ㎍/ml 농도의 트립신(GibcoBRL)을 포함하는 D-MEM(GibcoBRL)을 첨가하여, 탄산가스 인큐베이터 속(37℃, 10% 탄산가스 존재하)에서 24시간 배양한 후에 배양상청을 0.45 ㎛ 포아사이즈의 필터(DISMIC-25CS 필터, ADVANTEC)로 여과하여 벡터 용액으로서 사용했다.
[실시예 2] 센다이 바이러스 엔벨로프 단백에 의한 레트로바이러스 벡터의 슈도타입화의 효과
센다이바이러스 엔벨로프 단백에 의해 슈도타입화한 레트로바이러스 벡터를 상기와 같이 하여 제조하여, 그 효과를 검토했다.
표적세포인 293T 세포를 6웰의 플라스틱 플레이트(스미토모 베이크라이트)로 1웰당 1 ×106개의 세포밀도로 뿌리고, 탄산가스 인큐베이터 속(37℃, 10% 탄산가스 존재하)에서 48시간 배양했다. 표적세포에는 바이러스 벡터를 포함하는 용액에 비동화 소태아혈청을 최종농도 10%, 폴리브렌(Sigma)을 최종농도 8 ㎍/ml가 되도록 첨가한 용액을 중층함으로써 바이러스 벡터의 도입을 행했다. 벡터를 도입한 후 48시간 후에 표적세포를 2% 포름알데히드와 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하고, PBS(Invitrogen사)로 1회 세척 후에 형광도립형 현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 검경하여 표적세포에서의 EGFP의 발현을 검출했다.
먼저 레트로바이러스베이스의 진 트랜스퍼 벡터(pMSCV EGFP)를 팩키징 벡터의 비존재 하에서 293T 세포에 도입할 때에 센다이 바이러스의 엔벨로프 단백인 F 단백 발현 플라스미드(pCAGGS F), 또는 HN 단백 발현 플라스미드(pCAGGS HN) 중 어느 하나, 또는 양자를 동시에 도입하여 배양상청을 회수하고, 표적세포인 293T 세포로 EGFP 유전자의 도입이나 EGFP 단백의 도입이 인정되는지를 검토했다. 표 2의 아래 반쪽 "(①)" 이후의 12종류의 조합으로 제작한 벡터를 293T 세포로 감염시킨 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1의 Null의 패널에 나타내는 바와 같이 F 단백, HN 단백을 발현시키더라도 팩키징 벡터의 비존재하에서는 인간 세포로의 유전자나 단백의 도입은 인정되지 않았다. 따라서 F 단백이나 HN 단백만의 발현에서는 유전자 도입능을 갖는 레트로바이러스 벡터의 생산이나, EGFP 단백의 표적세포로의 도입은 일어나지 않는다고 생각되었다.
인간의 세포에 감염성이 없는 엔벨로프 단백질인 에코트로픽 엔벨로프 단백에 의해 팩키징을 행한 경우, 도 1의 Eco의 패널에 나타내는 바와 같이 F 단백 또는 HN 단백 단독으로 슈도타입화한 경우는 인간 세포로의 유전자 도입은 인정되지 않았지만, F 단백과 HN 단백을 동시에 발현시켜 슈도타입화한 경우에는 본래 감염성이 없는 인간 세포로의 유전자 도입이 인정되었다. 이 결과로부터 센다이 바이러스 이외의 바이러스 유래의 벡터를 센다이 바이러스의 F 단백과 HN 단백으로 슈도타입화할 수 있는 것, 그것에 의해 센다이 바이러스 이외의 벡터의 감염숙주역을 확대할 수 있는 것이 명확해졌다.
인간의 세포에 감염성을 갖는 엔벨로프 단백질인 암포트로픽 엔벨로프 단백에 의해 팩키징을 행한 경우, 도 1의 Ampho의 패널에 나타내는 바와 같이 HN 단백 단독, 또는 F 단백과 HN 단백을 동시에 발현시켜 슈도타입화시킨 경우에 유전자 도입효율이 향상하는 것이 명확해졌다. 이 결과로부터 센다이 바이러스 이외의 바이러스 유래의 벡터를 센다이 바이러스 HN 단백 단독으로도 슈도타입화할 수 있는 것, 센다이 바이러스 HN 단백 단독에 의한 슈도타입화 또는 센다이 바이러스 F 단백과 HN 단백으로 슈도타입화함으로써 센다이 바이러스 이외의 바이러스 유래의 벡터의 유전자 도입효율을 향상할 수 있는 것이 명백해졌다.
또한 센다이 바이러스는 본래 폐의 기관지 점막 상피세포 등 점액을 갖는 세포에 대한 감염능력이 높은 것으로부터, HN 단백 단독, 또는 F 단백과 HN 단백을 사용하여 다른 벡터를 슈도타입화하는 것은 점액을 갖는 세포로의 유전자 도입에 유용하다고 생각된다.
[실시예 3] HN-Ampho 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 생산 및 조혈간세포를 포함하는 인간 골수세포에 대한 유전자 도입효율의 암포트로픽 레트로바이러스 벡터와의 비교
1. 293T 세포의 배양
293T 세포는 10% FCS, 800 ㎍/ml G418 첨가 달벡코 변법 이글배지(DMEM)에서 통상의 방법을 사용하여 배양했다. 트랜스펙션 전날에 8 ×106세포/10 cm 플레이트가 되도록 희석하고, 10% FCS 첨가 DMEM에서 배양했다.
2. 트랜스펙션
pMSCV EGFP, pCl-Ampho(IMGENEX사), pCAGGS-HN을, 각각 5.6, 2.4, 1.6 ㎍을 함께 혼합하여 OPTIMEM을 800 ㎕ 가하고, 더욱이 Lipofectamine plus(GIBCOBRL)키트의 plus액을 48 ㎕ 가하여 함께 혼합한 후 15분 방치했다. 다른 튜브에 OPTIMEM 800 ㎕와 Lipofectamine액 32 ㎕를 함께 혼합해 두었다. DNA 혼합액과 Lipofectamine 혼합액을 함께 혼합하여, 15분 방치했다. 배지를 제거하고, 1% BSA 첨가 DMEM을 500 ㎕ 가한 293T 세포에 트랜스펙션 혼합액을 골고루 적하하여, 37℃, 5% 탄산가스 환경하에서 배양했다. 대조로서는, pMSCV EGFP, pCl-Ampho를 5.6 ㎍, 4.0 ㎍을 사용하여 트랜스펙션을 행했다. 트랜스펙션 3시간 후에 배지를 10% FCS 첨가 이스코프 변법 DMEM(Iscove's modified DMEM)(IMDM) 10 ml로 치환했다. 다음날 다시 10% FCS가 든 IMDM으로 배지를 교환하고, 더욱이 24시간 배양을 계속했다.
3. 바이러스액의 회수
트랜스펙션 48시간 후에 세포배양상청을 회수하고, 0.45 ㎛의 필터로 여과하여, -80℃에서 보존했다.
4. 헤마글루티닌 활성의 측정
pMSCV EGFP, pCl-Ampho, pCAGGS-HN의 양비를 몇가지로 변경하여, 상기와 동일하게 HN에 의해 슈도타입화된 암포트로픽 env를 갖는 레트로바이러스를 조제했다. 이 바이러스의 헤마글루티닌 활성(적혈구 응집활성; HA 활성)을 조사했다. 대조로서, 암포트로픽 env를 갖는 레트로바이러스의 헤마글루티닌 활성도 조사했다. HA 활성의 측정은 상법에 따라 행했다. 그 결과, HN 및 암포트로픽 env에 의해 슈도타입화된 레트로바이러스에 있어서 HA가가 확인되어, 바이러스 입자에 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질이 포함되어 있는 것이 확인되었다(도 2).
5. 인간 골수 CD34+세포로의 유전자 도입
인간 골수 CD34+세포는 BIO WHITTAKER사로부터 구입했다. 해동 후, 50 ng/ml IL-6, 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml Stem Cell Factor(GIBCO BRL), 100 ng/ml Flt-3 리간드(Research Diagnostics, Flanders, NJ)(모두 인간 리콤비넌트), 10% FCS 첨가 IMDM에서, 3에서 회수한 재조합 바이러스 1 ×105/ml에서 37℃, 5% CO2하에서 하룻밤 배양했다. 배양 개시 48, 51, 72, 75시간 후 배지를 새롭게 해동한 바이러스액으로 교환하여 50 ng/ml IL-6, 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml Stem Cell Factor, 100 ng/ml Flt-3 리간드를 첨가했다. 배양 개시 120시간 후, 세포를 회수했다.
6. 플로 사이토미터에 의한 해석
회수한 세포는 PE 표지 항인간 CD34 항체(Becton Dickinson)를 사용하여 염색한 후, 플로 사이토미터(EPICS ELITE, Coulter)로 GFP, PE의 2 형광으로 해석을 행했다. 그 결과, 야생형 엔벨로프를 갖는 암포트로픽 레트로바이러스 벡터(ampho)의 CD34 음성 세포(CD34-) 및 CD34 양성 세포(CD34+)에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율은 각각 0.3% 및 3.6%에 지나지 않았던 것에 대해, 슈도타입 엔벨로프를 갖는 HN-암포트로픽 레트로바이러스 벡터(HN-ampho)의 CD34 음성 세포 및 CD34 양성 세포에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율은 각각 33% 및 25%에 달하고, HN 단백질에 의한 슈도화에 의해, 조혈간세포를 포함하는 인간 골수 세포에 대한 유전자 도입효율이 유의하게 상승하는 것이 판명되었다(도 3).
[실시예 4] 슈도타입 바이러스 벡터의 제작방법
진 트랜스퍼 벡터로서, 상기 pMSCV EGFP 또는 몰로니 마우스 육종 바이러스(Moloney murine sarcoma virus) 유래의 LTR의 제어하에 lacZ를 발현하는 pLZRNL(Yee, J.-K. et al., Methods In Cell Biology, vol. 43, pp.99-112(1994); Xu, L. et al., Virology 171, 331-341(1989))을 사용하여, 여러 엔벨로프 단백질로 슈도타입화한 레트로바이러스 벡터를 제작했다.
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(inactivated calf serum)(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고글루코오스(Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다. 이 293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터(pMSCV EGFP 또는 pLZRNL) 700 ng, VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G(Indiana 혈청형 주 유래) (Clontech) 100 ng, Sendai virus HN, F 및 M 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-F 및 pCAGGS-M을 각각 200 ng 및 마우스 레트로바이러스 외각 단백 발현 플라스미드(coat protein expression plasmid) pCL-Eco 및 pCL-Ampho(Imgenex)(Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705(1996)) 300 ng를, 아래의 표 2와 같은 조합으로, 100 ㎕의 Opti MEM에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100 ㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE Reagent(Gibco BRL)를 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 48시간 배양 후에 배양상청을 회수하여, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 벡터 부유액으로 했다.
<표 2>
(식중, 「Env」의 란은, 바이러스의 제조에 사용한 레트로바이러스(Retro), 센다이 바이러스(SeV), 또는 수포성 구내염 바이러스(VSV) 유래의 엔벨로프 단백질 등을 나타낸다. 진 트랜스퍼 벡터로서는 pMSCV EGFP 또는 pLZRNL을 사용하여, 표에 나타낸 바와 같이 인 비트로 및 인 비보에 있어서의 유전자 도입에 사용했다. 진 트랜스퍼 벡터에 pMSCV EGFP를 사용하여 제작한 상단의 "⑨"의 벡터는 도 13의 실험에서 사용한 벡터이다. pLZRNL을 사용하여 제작한 하단의 "(①)" 이후의 12종류의 벡터는 도 1의 실험에서 사용한 벡터이다.)
[실시예 5] VSV-G 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 구축
벡터계의 구축에는, 비병원성의 아프리카녹색원숭이 면역부전 바이러스의 클론인 SIVagm TYO-1주를 사용했다. 뉴클레오티드의 번호는 아래 모든 바이러스 RNA의 전사 개시점을 +1로서 표기했다. SIVagm TYO-1을 삽입한 플라스미드로서는 pSA212(J. Viol., vol.64, pp.307-312, 1990)를 사용했다. 또한, 라이게이션반응은, 모두 Ligation High(도요보)를 사용하여 첨부 설명서에 따라 행했다. 합성 올리고 뉴클레오티드는, 모두 (주)그라이너 재팬(Greiner Japan) DNA 수탁합성사업부에 의뢰하여, 일본제분(주) 생물화학연구부에서 합성, 역상카트리지정제 또는 역상 HPLC 정제한 것을 사용했다. 합성 올리고뉴클레오티드의 서열은 아래와 같다.
1F(VTRF-BglII):5'-GCAGATCTCAACCAGGAGGCGAGGCTGCATTTTGGG-3'(서열번호:1)
1R(VTRR-EcoRI):5'-GCGAATTCTACTTACTGGTGCTGTAAAGGAGCCAAA-3'(서열번호:2)
2F(RRE6964E):5'-ATCGGAATTCTTTTATTGTAAGATGGATTGGTTTTTAAAT-3'(서열번호:3)
2R(RRE-SA+BN):5'-CGGGATCCGCGGCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATAT-3'(서열번호:4)
3F(SDFXhoSpe):5'-TCGAGACTAGTGACTTGGTGAGTAGGCTT-3'(서열번호:5)
3R(SDR-Sal):5'-TCGAAAGCCTACTCACCAAGTCACTACTC-3'(서열번호:6)
4F:5'-AATTTCTCGAGCGGCCGCA-3'(서열번호:7)
4R:5'-AATTTGCGGCCGCTCGAGA-3'(서열번호:8)
5-1F(5LTRU3FKpn):5'-GCGGTACCTGGATGGGATTTATTACTCCGATAGGA-3'(서열번호:9)
5-1R(GAGR-2Eco):5'-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3'(서열번호:10)
5-2F(RREF-EcoRI):5'-GCGAATTCCCGTTTGTGCTAGGGTTCTTAGGCTTCT-3'(서열번호:11)
5-2R(RRESA+Rsac):5'-TCCCCGCGGATATGGATCTGTGGAGATAGAGGAACATATC-3'(서열번호:12)
5-3F(3LTRF BS):5'-GCGCGGCCGCGGATCCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGA-3'(서열번호: 13)
5-3R(3LTRR-SacI):5'-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3'(서열번호:14)
6F(CMVFEcoSac):5'-GGAATTCCCGCGGTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGG-3'(서열번호:15)
6R(EGFPRstoNB):5'-CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'(서열번호:16)
9-1F(LTRF1 CMVU3F):5'-TATATAAGCAGAGCTCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3'(서열번호: 17)
9-2F(LTRF2 EF1aU3F):5'-TATATAAGTGCAGTACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3'(서열번호: 18)
9-3F(CAGU3F):5'-TATAAAAAGCGAAGCCGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTA-3'(서열번호:19)
9R(GAGR-2Eco):5'-GCGAATTCGATAGGGCTTGAAACATGGGTACTATTTCTGC-3'(서열번호:20)
10-1F:5'-CGGGGTACCTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATT-3'(서열번호:21)
10-1R(U3CMVR):5'-AGTTACAAGCCAGCGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCCAC-3'(서열번호:22)
11F(LTRF LdU3FSalSC):5'-ATGCGAGCTCGTCGACGCACTTTTTAAAAGAAAAGGGAGGACTGGATGGGATT TATTACTCCGATAGGACGCTGGCTTGTAACTCAGTCTCTTACTAGG-3'(서열번호:23)
11R(3LTRR-SacI):5'-GCGAGCTCTAATGCAGGCAAGTTTATTAGCTTTCTA-3'(서열번호:24)
<PCR에 의한 DNA 단편의 조정>
PCR은 모두 PCR Supermix High Fidelity(Gibco BRL)를 사용하여 행했다. 반응액 90 ㎕에 1 ㎍의 템플레이트 DNA, 프라이머로서 2종의 합성 올리고뉴클레오티드를 최종농도 1 nmol/ml가 되도록 첨가하고, 증류수로 전량을 100 ㎕로 한 후, GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer)을 사용하여 반응을 행했다. 94℃ 1분간의 반응 후에 94℃ 30초 →55℃ 30초 →68℃ 90초의 반응을 10사이클 행하고, 마지막으로 68℃에서 5분간의 반응을 행했다. 반응 후의 샘플을 Wizard DNA Clean-up System(Promega)으로 정제하고, 말단을 각각의 제한효소로 절단하여, 1% 저융점 아가로우즈 겔(SeaPlaque GTG agarose, FMC Biochem, TAE 버퍼에 용해)로 분리 후에 목적 사이즈의 DNA 단편을 겔로부터 잘라내어 Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)으로 정제하여, 라이게이션에 사용했다.
<벡터의 구축>
벡터의 기본구조가 되는 플라스미드를 구축했다(도 4). 벡터 입자 형성에 필수인 단백질을 트랜스로 공급하는 「팩키징 벡터」, 벡터에 팩키징되는 mRNA를 공급하여, 표적세포에 대해 목적 유전자를 운반, 도입하는 「진 트랜스퍼 벡터」, 슈도타입 벡터 입자를 형성하기 위한 외각 단백질 공급 벡터의 VSV-G이다.
벡터 입자 형성에 필요한 단백질을 공급하기 위해, gag, pol, tat, rev, vif, vpr/x의 각 서열을 프로모터 하류에 배치한 발현 플라스미드를 구축했다. 야생형 바이러스의 생산을 회피하기 위해 팩키징 시그날 ψ및 env의 대부분을 제거했다. gag 상류에 SD 서열, tat/rev의 제1 엑손의 하류에 PRE 서열을 삽입하여, 팩키징 벡터상의 모든 유전자가 발현할 수 있도록 했다. 더욱이, 벡터의 팩키징에 필수가 아니라고 생각되었기 때문에 nef의 전서열을 제외했다(도 4b).
벡터 내에 팩키징되는 RNA를 공급하는 진 트랜스퍼 벡터에는, 게놈 양단의 LTR 서열, SD, ψ, RRE를 삽입했다. 더욱이, 진 트랜스퍼 벡터의 5'LTR 프로모터 영역을 외래 프로모터와 치환했다. 또한, 3'LTR의 서열을 부분적으로 삭제하고, 표적세포로부터 전장 벡터 mRNA가 전사되는 것을 방지하는 Self Inactivating Vector(SIN 벡터)를 제작하여, 리포터 유전자의 프로모터로서 CMV 프로모터, 리포터 유전자로서 β갈락토시다아제 유전자를 삽입했다(도 4c).
VSV-G 공급 벡터로서, 지금까지 레트로바이러스 벡터, HIV 벡터의 슈도타입화에 있어서 실적이 있는 pVSV-G를 사용했다(도 4d)(Burns, J. C. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037).
아래에 그 상세한 내용을 기재한다.
<팩키징 벡터의 구축>
vif와 tat/rev의 제1 엑손을 포함하는 영역(5337-5770)에 상당하는 DNA 단편을 프라이머 1F 및 1R을 사용하여 pSA212를 템플레이트로 한 PCR에 의해 얻었다. PCR 프라이머에 제한효소부위인 EcoRI 부위를 부가함으로써 DNA 단편의 3'단에 EcoRI 부위를 갖는 단편을 조절했다. PCR 단편을 BglII와 EcoRI에 의해 절단한 후, 아가로우즈겔 전기영동과 Wizard PCR PrepsDNA Purification System(Promega)으로 정제했다. 이상과 같이 하여 얻은 DNA 단편과, gag/pol 영역을 코드하는 DNA 단편(XhoI(356)부위로부터 BglII(5338)부위까지)을, pBluescript KS+(Stratagene)의 XhoI-EcoRI부위로 라이게이션했다. 이어서, Rev responsive element(RRE)와 tat/rev의 제2 엑손을 포함하는 영역(6964-7993)에 상당하는 DNA 단편을 PCR로 증폭했다. 상기의 PCR 단편과 동일하게 프라이머 2F와 2R을 사용하여 pSA212를 템플레이트로 한 PCR에 의해 3'단에 NotI 부위를 부가하고, EcoRI와 NotI로 절단 후에 정제하여, gag-tat/rev를 삽입한 pBluescript KS+의 EcoRI-NotI 부위로 삽입했다.
스프라이싱 도너(SD)부위는, 이 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성(3F와 3R)하여, 합성시에 5'단에 XhoI 부위, 3'단에 SalI 부위를 부가하여, 상기의 gag-RRE-tat/rev를 삽입한 pBluescript KS+의 XhoI 부위에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 XhoI와 NotI에 의해 절단하여, SD-gag-RRE-tat/rev를 포함하는 단편을 정제했다. pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)의 EcoRI 부위에 XhoI/NotI 링커(4F와 4R)를 삽입한 플라스미드를 제작하여, XhoI-NotI 부위에 상기의 SD-gag-RRE-tat/rev 단편을 삽입했다. 이상의 방법에 의해 얻어진 플라스미드를 팩키징 벡터 pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev로서 사용했다.
<진 트랜스퍼 벡터의 구축>
SIVagmTYO1 유래의 5'LTR 영역(8547-9053 + 1-982, 5'단에 KpnI 부위, 3'단에 EcoRI 부위를 부가)을 프라이머 5-1F와 5-1R로, 3'LTR을 포함하는 영역(8521-9170, 5'단에 NotI 부위와 BamHI 부위, 3'단에 SacI 부위를 부가)을 프라이머 5-3F와 5-3R로, RRE 서열(7380-7993, 5'단에 EcoRI 부위, 3'단에 SacII 부위를 부가)을 프라이머 5-2F와 5-2R로, pSA212를 템플레이트로 한 PCR로 각각 증폭했다. pEGFPN2(Clontech) 유래의 CMV 프로모터 영역(1-600, 5'단에 SacII 부위, 3'단에 NotI 부위를 부가)을 프라이머 6F와 6R로 증폭했다. 이들 DNA 단편의 말단을 절단, 정제 후에 pBluescript KS+의 KpnI-SacI 부위에 5'LTR →RRE →CMV 프로모터→3'LTR의 순으로 라이게이션하여 삽입했다. 리포터 유전자로서 pCMV β(Clontech)유래의 β갈락토시다아제 유전자를 포함하는 NotI 단편을 NotI 부위로 삽입하여, KpnI-SacI로 절단하고 5'LTR에서 3'LTR까지를 포함하는 DNA 단편을 잘라내고, pGL3 Control 벡터의 KpnI-SacI 부위로 삽입하여, 진 트랜스퍼 벡터 pGL3C/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3'LTR로 했다.
또한, pEGFPC2(Clontech) 유래의 CMV 프로모터 영역과 EGFP를 코드하는 영역(1-1330, 5'단에 SacII 부위, 3'단에 NotI 부위와 BamHI 부위와 번역 스톱 코돈을 부가)을 프라이머 6F와 6R을 사용하여 pEGFPC2를 템플레이트로 한 PCR에 의해 증폭했다. 4종의 PCR 단편을 각각 제한효소 KpnI와 EcoRI, EcoRI와 SacII, BamHI와 SacI, SacII와 BamH 절단한 후에 정제하여, pBluescript KS+의 KpnI-SacI의 사이에 5'LTR →RRE →CMV 프로모터 EGFP →3'LTR의 순으로 라이게이션하여 삽입했다(pBS/5'LTR. U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR). 플라스미드 pBS/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR을 KpnI-SacI로 절단하여 5'LTR-3'LTR을 포함하는 DNA 단편을 조제하여, pGL3 Control(Promega) 벡터의 KpnI-SacI 부위로 삽입하여, 벡터(p-GL3C/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR)를 구축했다.
<5'LTR의 개변>
5'LTR의 TATA 박스의 하류로부터 gag 영역(9039-9170 + 1-982)을 포함하는 단편을 프라이머 9-1F, 2F, 3F와 9R을 사용하여 pSA212를 템플레이트로 한 PCR로 증폭했다. 사이토메갈로바이러스 유래의 CMV L 프로모터(pCI(Promega) 유래, 1-721)를 프라이머 10-1F와 10-1R을 사용하여 PCR에 의해 증폭했다. 5'LTR의 TATA 박스 하류를 포함하는 단편과, 프로모터를 포함하는 단편을 혼합하여, 이를 템플레이트로 하여, 프로모터의 5'측 프라이머(10-1F)와 LTR의 3'측 프라이머(9R)를 사용하여 PCR을 행하고, 프로모터와 5'LTR과의 키메라 프로모터의 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3'LTR)의 KpnI-EcoRI 부위에 삽입했다(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3'LTR). 마찬가지로, 상기의 PCR에 의해 얻어진 DNA 단편을, 벡터 pGL3C/5'LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR의 KpnI-EcoRI 부위에도 삽입했다 (pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR).
<3'LTR의 개변 SIN(self inactivating vector) 벡터의 제작>
3'LTR의 U3 영역 5'측 27bp와 3'측 15bp 및 R 영역을 포함하는 DNA 단편을 프라이머 11F와 11R을 사용하여 pSA212를 템플레이트로 한 PCR로 증폭했다. 이 단편을, 전절에서 얻어진 키메라 프로모터 도입 진 트랜스퍼 벡터 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/WT3'LTR의 SalI-SacI 부위에 삽입했다 (pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3'LTR△U3). 마찬가지로, 이 단편을 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3'LTR의 SalI-SacI 부위로도 삽입했다 (pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTR△U3).
<구축한 플라스미드 조제 및 구조확인>
플라스미드를 정법에 따라 DH5α(도요보)에 트랜스포밍하고, 한천배지 상에서 배양, 출현한 콜로니를 템플레이트로 하여, 삽입한 DNA 단편과, 플라스미드의 삽입 부위 주변의 DNA 서열을 인식하는 프라이머를 사용하여 PCR을 행했다. PCR에는 PLATINUM PCR Supermix(Gibco BRL)를 사용했다. 증폭된 산물의 유무, 사이즈를 아가로우즈겔에 의한 전기영동으로 확인하고, 예상되는 산물이 검출된 클론을 선택하여, 10 ml의 LB 배지 중에서 배양, QIAprep miniprep Kit(QIAGEN)로 플라스미드를 정제했다. 정제한 플라스미드를 삽입한 DNA 단편의 양단을 절단하는 제한효소로 처리하여, 아가로우즈겔 전기영동으로 DNA 단편의 크기를 확인했다. 여기에서 바른 크기의 단편의 삽입이 확인된 클론에 대해서, 100 ml의 LB 배지에서 배양하여, QIAGEN Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)를 사용하여 플라스미드를 정제했다. PCR에 의해 증폭한 단편을 삽입한 플라스미드는, 3 클론 이상에 대해서 시퀀스를 행하여, pSA212의 서열과 비교하여, 변이가 없는 것을 선택했다.
<벡터의 회수>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 Opti MEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 상기의 진 트랜스퍼 벡터 300 ng, 상기의 팩키징 벡터 600 ng, VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G(Clontech) 100 ng을, 100 ㎕의 Opti MEM에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE reagent(Gibco BRL)를 가한 100 ㎕의 Opti MEM을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하고, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 20% 비동화 소혈청을 포함하는 D-MEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 12시간 컬쳐한 후에, 1웰당 2 ml의 10% 비동화 소혈청을 포함하는 D-MEM으로 배지 교환하고, 24시간 배양한 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 사용했다.
<SIVagm 벡터에 의한 유전자 도입>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 컬쳐에 의해 배양액을 제거하고, 벡터액에 polybrane(Sigma)을 최종농도 8 ㎍/ml로 첨가한 것을 1 ml 중층하여, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐하고, 벡터를 감염시켰다. 3시간 후에 배양액을 1 ml 가하고, 1일 후에 배양액을 교환했다. 더욱이 하루 후에, β-Gal 발현벡터의 경우는, β-Gal Staining Kit(Invitrogen)를 사용하여 X-gal을 기질로 한 염색을 행하여, 표적세포에서의 β갈락토시다아제의 발현을 광학현미경에 의한 검경으로 확인했다. EGFP 발현벡터의 경우는, 형광현미경에 의해 해석했다.
<벡터의 역가 측정>
벡터의 역가 측정은, 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 계산했다. 293T 세포를 1 ×106/플레이트로 6웰의 컬쳐 플레이트에 뿌리고, 48시간 컬쳐했다. 여기에, 상기와 동일한 방법으로 1 ml의 벡터액을 감염, 감염 후 48시간 후에 X-gal 염색을 행했다. 광학현미경으로 200배의 배율로 검경, 시야 내의 유전자 도입세포수를 측정하여, 3시야의 평균을 구해, 시야의 면적과 플레이트의 면적으로 구한 계수 854.865를 곱함으로써 역가의 산출을 행했다. 역가의 단위는Transducing Unit(T.U.)/ml로 표기하기로 했다. 또한, 벡터액에 포함되는 p27 단백질량을 SIV core antigen EIA kit(Coulter)에 의해 정량했다.
<벡터의 평가>
진 트랜스퍼 벡터의 5'프로모터 활성의 증강에 의해 RNA의 전사량이 증가하고, 팩키징 효율이 올라, 벡터 역가가 상승한다고 생각된다. 따라서, 5'프로모터를 치환한 벡터의 평가는, 293T 세포에 대한 유전자 도입효율을 봄으로써 행했다. 상술한 방법으로 유전자 도입을 행하여, β갈락토시다아제의 발현을 X-gal 염색과 광학현미경에 의한 검경으로 확인했다.
3'LTR의 프로모터를 결실시킨 SIN 진 트랜스퍼 벡터로부터, SIN SIV 벡터를 제작했다. 동시에 종래형의 야생형 3'LTR을 갖는 진 트랜스퍼 벡터에 의해 SIV 벡터를 제작하여, 양자에 의한 293T 세포에 대한 도입역가를 비교했다. 또한 p27 단백질량을 측정하여, 단백질량당 도입역가를 비교했다. 또한, 방사선 조사하여 세포주기를 정지시킨 293T 세포, 레티노인산에 의해 종말분화시킨 SH-SY5Y 세포에 대한 EGFP 유전자의 도입을 형광현미경에 의한 검경으로 확인했다.
<293T 세포에 대한 유전자 도입의 결과>
SIVagm 벡터에 의해, 인간 태아 신장 유래 세포 293T에 대해 β갈락토시다아제 유전자를 도입했다. 도입세포를 X-gal을 기질로서 염색한 바, 도 5에 보여지는 바와 같이 파랗게 염색되는 세포가 검출되어, β갈락토시다아제 유전자의 발현이 확인되었다. 실험시의 유전자 도입효율은, 벡터액 1 ml당 0.5~1 ×106T.U.였다. 또한 벡터액 중의 p27량은 0.5~1 ㎍/ml이고, p27량 100 ng당의 도입역가는 105T.U.였다.
<SIN 벡터의 성능확인의 결과>
SIN 벡터의 도입역가를 동일조건으로 제작한 종래의 야생형 3'LTR을 갖는 벡터와 비교했다. 종래형의 역가가 2.4~2.8 T.U./ml, SIN 벡터에서는 2.5~2.9 T.U./ml로, 종래형의 도입역가를 100%로 한 경우 SIN 벡터는 105%였다. 또한, 도입역가와 p27 단백질량의 관계를 293T 세포에 대한 도입역가의 측정 및 EIA에 의한 p27량의 측정에 의해 검토한 바, SIN 벡터에서는 p27 100 ng당 7 ×105T.U.였다.
SIN 벡터에 의해, 세포주기를 정지한 293T 세포 및 종말분화한 SH-SY5Y 세포에 대한 EGFP 유전자의 도입을 시도했다. 293T 세포를 DMEM 10% FCS, 37℃, 10% CO2에서 배양하고, 세포주기를 정지시키기 위해, G1-S기 정지에서는 어피디콜린 (Calbiochem-Novabiochem International, Inc.)을 최종농도 20 ㎍/ml로 첨가했다(Huberman, J. A. et al., Cell: Vol.23, 647-648. 1981; Byrnes, J. J., Mol. Cell. Biochem.: Apr, 62(1), :13-24. 1984). G2-M기 정지에서는, 2 ×107의 세포에 대해, X선을 4000 rad 조사했다(Kastan, M. B. et al., Cell: Nov 13, 71(4), : 587-97, 1992). 분열정지 처리 후 24시간 후에 콜라겐 I 코팅 6웰 컬쳐 플레이트(스미론)에 1 ×106/웰로 뿌리고, 24시간 후에 유전자 도입을 행했다. 또한, 인간 유래 신경아세포주 SH-SY5Y(Koshizawa, S. H. et al., Cancer Lett.: Jan1, 111(1-2), 117-25. 1997)를, 10% 비동화 송아지혈청을 포함하는 RPMI1640, 37℃, 5% CO2에서 배양한 후, 배지에 전 트랜스형 레티노인산(SIGMA)을 최종농도 5 μM으로 첨가하여, 7일간 배양하고, 그 후 유전자 도입을 행했다(Odelstad, L. et al., Brain Res.: Nov 9, 224(1), 69-82. 1981).
도 6 상단은, 293T 세포에 있어서의 EGFP의 발현을 형광현미경으로 본 것이다. 높은 효율로 유전자의 발현이 인정되었다. 도 6 하단은 SH-SY5Y에 있어서의 EGFP의 발현을 나타내고 있다. 신경세포로 분화하고 있다고 생각되는, 돌기를 신장한 세포에 있어서의 EGFP의 발현이 확인되었다.
본 실시예에서 제작한 SIVagm 벡터는, 배양세포에 있어서 높은 유전자 도입능을 갖는 것이 확인되었다. 3종의 독립한 플라스미드의 코트랜스펙션에 의한 벡터의 팩키징에 있어서는, 야생형 바이러스의 재구성의 확률은 지극히 낮다고 생각된다. 또한, 베이스인 SIVagmTYO-1은, 자연감염 및 실험적인 감염 양쪽에 있어서 병원성을 나타내지 않는 것이 확인되어 있다(Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer: 41, 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol.: 18(3-4), 255-9. 1989; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol. 19(1), 9-20, 1990). 더욱이, 일반적으로 렌티바이러스는 종특이성이 강하여, 타종 동물에서는 병원성이 낮은 경향이 있는(Novembre, F. J. et al., J. Virol.: 71(5), 4086-91. 1997) 것으로부터도 벡터의 안전성은 높은 것으로 생각된다.
본 실시예의 벡터 구축에 있어서, 팩키징 벡터 위로부터는 팩키징 시그날서열이 삭제되어 있기 때문에, 바이러스 단백질을 코드하는 RNA는 입자 내에 팩키징되지 않는다. 또한, rev 단백질은 RRE에 결합하여, RNA의 세포질로의 수송이나 스프라이싱의 억제 등을 행함으로써 바이러스 단백질의 발현, 전장 RNA의 바이러스 내로의 삽입이 행해지기 때문에, 팩키징 벡터 및 진 트랜스퍼 벡터 쌍방에 RRE를 삽입한 것으로 인해, 팩키징 벡터의 mRNA 스프라이싱이 억제되어, 모든 유전자의 발현이 가능해진다고 생각된다. 더욱이, 진 트랜스퍼 벡터의 mRNA가 세포질에 운반되어, 벡터 입자 내에 팩키징된다고 생각된다. vif, vpr/x에 대해서는, HIV-1 벡터에서는 제거하고 있는 경우도 있어(Dull, T. et al., J. Virol.: Nov, 72(11), 8463-71. 1998), 벡터 입자의 팩키징 및 기능에 있어서 필수가 아닐 가능성이 있다. vpr은 비분열세포에 대한 감염성의 한 원인으로도 생각되고 있어(Heinzinger, N. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: Jul 19, 91(15), 7311-5, 1994), HIV-1 벡터에서는 vpr의 유무에 의해 유전자 도입할 수 있는 세포가 다르다고 하는 보고가 있다(Kim, V. N. et al., J. Virol.: Jan, 72(1), 811-6, 1998). 금번 팩키징 벡터로부터 완전히 제거한 nef는, SIV에 의한 면역부전증을 일으키는 원인의 하나인 것이 원숭이를 이용한 감염실험에서 보고되어 있다(von Gegerfelt, A. S. et al., J. Virol. 73, 6159-65, 1999; Kestler, H. W. 3d., Naidu, Y. N., Kodama, T., King, N. W., Daniel, M. D., Li, Y., Desrosiers, R. C. Use of infectious molecular clones of simian immunodeficiency virus for pathogenesis studies., J. Med. Primatol. 18(3-4): 305-9, 1989). 본 실시예에서 구축한 SIVagm 벡터에서는 이 서열을 완전히 제거하고 있기 때문에, 만일 팩키징 벡터 유래의 바이러스 유전자를 포함하는 재구성 바이러스 입자가 생겼다고 해도, 병원성을 가질 위험성이 더욱 저하되어 있다고 생각된다.
렌티바이러스를 베이스로 한 벡터는, 베이스의 바이러스가 비분열상태의 세포에 대해 감염성을 갖는 것으로부터, 세포주기를 정지한 배양세포나 신경세포에 대해 유전자 도입능을 갖는 것이 기대된다(Naldini, L. et al., Science: 272, 263-267, 1996; Sutton, R. E. et al., J. Virol., 73(5), 3649-60, 1999). 더욱이, VSV-G에 의한 슈도타입화를 행한 것으로 인해, 감염지향성은 베이스인 SIV와 같이 CD4 및 케모카인리셉터 양성 세포에 한정되지 않는다. VSV-G의 리셉터는 인지질의 일종인 포스파티딜세린(phosphatidylserine)인 것이 알려져 있어, 이 분자는 여러 세포상에 존재한다(Schlegel, R. et al., Cell, 32(2), 639-46, 1983). 이 때문에 VSV-G에 의해 슈도타입화를 행한 SIVagm 벡터의 감염지향성은 매우 넓다. 이 벡터를 토대로 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질에 의해 슈도타입화된 바이러스를 제작함으로써, 거의 모든 동물세포에 높은 효율로 유전자 도입이 가능해진다고 예상된다.
[실시예 6] 비로솜(virosome)의 조제
야생형 SeV(Z주)의 시드(seed)를 유성란(fertile egg)(10일란)에 접종하여, 35.3℃에서 3일간 배양하여, 장뇨액을 회수했다. 4,000 rpm, 15분의 원심 후, 상청을 10,000 rpm, 1시간 원심하여 바이러스를 침전시켰다. BSS에 재현탁하고, 수크로오스 밀도 구배(30%/50%)에 중층하여, 25,000 rpm, 1시간 원심했다. 30%와 50% 수크로오스의 계면에 형성된 바이러스의 밴드를 회수하여, 대량의 BSS로 희석한 후,9,000 rpm, 1시간 원심처리하여 바이러스를 침전시켰다. 바이러스는 BSS에 재현탁하여 -80℃에서 사용시까지 보존했다.
얻어진 센다이 바이러스로부터, F, HN 비로솜 및 F 비로솜을 문헌(Bagai et al., 1993, Biochem. Biophys. Acta 1152, 15-25)에 따라 조제했다. 즉, 센다이 바이러스를 계면활성제로 가용화한 후, 불용성 RNP를 원심 제거했다. F, HN 단백질 및 막질(엘벨로프 지질)을 포함하는 가용화액으로부터 계면활성제를 제거함으로써 입자를 재구성시켜, F, HN 비로솜을 조제했다. 원심분리 전의 트리톤 X-100(Triton X-100)의 농도는 1%(v/v)인 것 이외에는, 실시예 7과 동일한 조건으로 조제했다. 센다이 바이러스를 미리 DTT(dithiothreitol)처리하여, HN 단백질을 환원한 후, 상기와 동일하게 계면활성제로 가용화했다. 불용성이 된 HN 단백질을 RNP와 함께 원심 제거했다. 상기와 동일하게 가용화액으로부터 계면활성제를 제거함으로써 입자를 재구성시켜, F 비로솜을 조제했다.
얻어진 비로솜은 입자경이 불균일했다. 따라서, 원심분리(12000 rpm, 10분)에 의해 입자 사이즈가 다른 비로솜(small virosome: 평균입자경 140 nm 및 large virosome: 평균입자경 1.4 ㎛)으로 분리했다. 분리된 비로솜을 SDS-PAGE로 평가한 결과, F, HN 비로솜에서는 F 단백질 및 HN 단백질이, F 비로솜에서는 F 단백질이 검출되어, 거의 목적으로 하는 비로솜이 얻어진 것이 확인되었다(도 7).
상기와 같이 하여 조제한 비로솜 또는 UV 조사에 의해 불활화한 센다이 바이러스를, 아래 표의 조성으로 37℃, 2시간의 조건으로, 실시예 7 (3) 기재의 방법에 의해 얻어진 농축된 EGFP 발현 SIV 바이러스와 융합(fusion)시켰다. VSV-G와 리포솜과의 융합효율은 약산성에서 높아지는 것이 보고되어 있기 때문에, pH 조건으로서 pH 5.5 및 중성으로 융합을 행했다(Yamada, S. et al., 1986, Biochemistry, 25, 3703-3708).
<표 3>
상기 혼합물을 HeLa 세포의 배양상청에 MOI=10으로 첨가했다. SIV와 센다이 바이러스를 단순히 공존시켜 감염시키는 대조실험도 행했다. 이 경우, 먼저 SIV를 배지에 첨가하고, 5분 후에 센다이 바이러스를 SIV의 10배량 첨가했다. 배지에 첨가 후, 10분, 30분 및 180분 인큐베이트하여 감염시켰다. 시간경과 후 신선한 배양액으로 치환하여, 감염처리 개시의 48시간 후에 GFP의 형광을 관찰했다(도 8).
그 결과, SIV 단독으로 HeLa 세포에 감염시킨 경우, 30분 이내의 접촉에서는, 감염효율이 매우 낮았다. SIV와 UV 불활화 센다이 바이러스를 융합시킨 혼합물의 경우, SIV 단독에 비해 감염이 빨라지는 경향이 인정되었다. pH는, 5.5 보다도 중성쪽이 높은 감염효율을 나타냈다. 이것은, 중성 부근이 SIV로의 영향이 적은 것에 의한 것일지도 모른다.
F, HN 비로솜과의 융합에서도, 단시간으로의 감염이 촉진되어, 감염효율의 유의한 개선이 보였다. F 비로솜은, F, HN 비로솜 보다도 감염의 개선이 작았다. SIV와 센다이 바이러스를 단순히 공존시켜 감염한 경우는, SIV 단독과 거의 동일한 감염을 나타낸 것에 지나지 않았다.
이들 결과로부터, 센다이 바이러스 또는 F, HN 비로솜과 SIV를 융합시킴으로써, SIV의 감염성이 상승하는 것이 실증되었다. 또한, 감염효율의 상승에는, 센다이 바이러스의 HN 단백질의 기여가 큰 것이 시사되었다.
[실시예 7] SIV-SeV fusion 벡터의 조제와 평가
(1) 야생형 SeV의 조제
야생형 SeV(Z주)의 시드를 유성란(10일란)에 접종하고, 35.3℃에서 3일간 배양하여, 장뇨액을 회수했다. 4,000 rpm, 15분의 원심 후, 상청을 10,000 rpm, 1시간 원심하여 바이러스를 침전시켰다. BSS에 재현탁하고, 수크로오스 밀도 구배(30%/50%)에 중층하여, 25,000 rpm, 1시간 원심했다. 30%와 50% 수크로오스의 계면에 형성된 바이러스의 밴드를 회수하여, 대량의 BSS로 희석한 후, 9,000 rpm, 1시간 원심처리하여 바이러스를 침전시켰다. 바이러스는 BSS에 재현탁하여 -80℃에서 사용시까지 보존했다.
(2) SeV 막단백으로부터의 비로솜의 재구성
1. FHN 비로솜
SeV(OD540=5, BBS) 1.8 mL에 20%(V/V) 트리톤 X-100/BBS 0.2 mL를 가하고, 실온에서 1시간 방치하여 SeV를 가용화했다. 실시예 6에서 비로솜 입자경이 불균일했기 때문에, 원심분리 전에 트리톤 X-100 농도를 2%(v/v)로 했다. 불용성 RNP를 원심침전시켜(100,000 ×g, 1시간, 4℃), F 및 HN 단백의 가용화 상청을 회수했다. 상청에 바이오비드 SM-2(BIORAD)를 3회에 나눠 가하여(0.5 g ×2회, 실온 1시간, 1 g ×1회, 4℃ 15시간 + 실온 1시간 인큐베이션) 계면활성제를 흡착 제거했다. 비드를 제거하고, FHN 비로솜을 약 1.5 mL 얻었다.
2. F 비로솜
SeV(OD540=5, BBS) 2 mL에 30 mM 디티오슬레이톨(dithiothreitol)/BSS 0.2 mL를 가하고, 37℃, 2시간 처리하여 HN 단백을 비가역적으로 환원했다. BSS 희석 후, 바이러스를 원심분리하여, 1.8 mL의 BSS에 재현탁했다. 바이러스 현탁액에 20%(V/V) 트리톤 X-100/BSS를 0.2 mL 가하고, 실온에서 1시간 방치하여 SeV를 가용화한 후, 불용성 RNP 및 환원된 HN 단백질을 상기와 동일하게 제거하여, F 단백의 가용화 상청을 회수했다. 이하 FHN 비로솜과 동일하게 처리하여 F 비로솜을 약 1.5 mL 얻었다.
3. HN 비로솜
SeV(OD540=5, BBS) 2 mL에 150 units/mL의 트립신(Sigma)/BSS 2 mL를 가하고, 37℃, 2시간 처리하여 F 단백을 분해한 후, 1 mg/mL의 트립신-키모트립신 인히비터(trypsin-chymotrypsin inhibitor)(Sigma)/BSS를 가하여, 반응을 정지시켰다. BBS로 희석 후, 바이러스를 원심분리하고, 1.8 mL의 BBS에 재현탁했다. 이하, FHN 비로솜과 동일하게 처리하여, F 단백의 기능을 불활화시킨 HN 비로솜을 약 1.5 mL 얻었다.
아래 표에 3종의 비로솜의 특성을 나타낸다. F 및 HN 단백의 기능을 나타내는 HA 활성, 용혈활성 및 전기영동 패턴의 결과로부터 목적으로 하는 비로솜이 얻어진 것이 확인되었다(도 9).
<표 4>
(3) SIV-LacZ의 조제
LacZ 유전자를 탑재한 SIV(SIV-LacZ)의 조제는 아래의 3종류의 플라스미드를 사용했다.
·팩키징 벡터: pCAGGS / SIVagm gag-tat /rev
·진 트랜스퍼 벡터: pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTR△U3 또는 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3LTR△U3
·VSV-G 플라스미드: pVSV-G
팩키징 벡터 150 ㎍, 진 트랜스퍼 벡터 300 ㎍, VSV-G 플라스미드 50 ㎍을 75 mL의 DMEM에 용해했다. 2 mL의 Plus reagent(라이프텍 오리엔탈(주))를 가하여 실온에서 15분 방치했다. 75 mL의 DMEM에 현탁한 3 mL의 LipofectAMINE reagent(라이프텍 오리엔탈(주))를 가하여, 실온에서 15분간 방치하여 DNA 컴플렉스를 형성시켰다. 3 mL의 DNA 컴플렉스 용액을 293T 세포(트랜스펙션 2일 전에 2.5 ×106cells/150 mm 샬레 ×50매, 10% FCS/DMEM으로 준비)에 적하하여, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 트랜스펙션했다. 10 mL의 10% FCS/DMEM을 가하고, 더욱이 배양을 계속했다. 48시간 후에 배양상청을 회수하여, 0.45 ㎛의 멤브랜필터로 여과하고, 여과액을 42500 ×g 1.5시간 원심하여 바이러스를 침전시켰다. 침전을 합쳐 15 mL의 역전사반응액(100 μM dNTPs, 3 mM Spermine, 0.3 mM Spermidine, 10 mM MgCl2/TBS)에 재현탁하여, 37℃, 2시간 역전사반응을 행했다. 그 후, 바이러스를 원심분리(42500 ×g, 2시간)하여, 500 μL의 PBS(5% FCS, 2 ㎍/mL 폴리브렌 함유)에 재현탁하여 SIV-LacZ의 농축액을 얻었다. SIV-LacZ의 타이터는 약 5 ×108T.U./mL였다(293T 세포).
(4) Fusion 벡터의 조제
SIV-LacZ를 BBS로 희석하여 1 ×108T.U./mL에 조제했다. 이 용액에 등용(等容)의 Virosome/BSS 용액을 가하고, 4℃에서 30분 정치하여 흡착시켰다. 그 후, 37℃에서 2시간 Fusion을 행한 후, 빙냉한 PBS로 10배 희석하여(SIV 종농도 5 ×106T.U./mL), 바로 감염실험에 사용했다.
(5) 감염실험
293T 세포를 12웰 플레이트에 1 ×105cells/well, 10% FCS/DMEM(이하 배지) 1 mL로 뿌리고, 37℃, 10% CO2하에서 48시간 배양하여, 감염 직전에 배지를 0.5 mL로 줄였다. SIV 및 Virosome과의 Fusion 벡터를 5 ×106T.U./mL, 100 μL/웰로 가하고, 37℃, 10% CO2하에서 10분간 감염을 행했다. 배지에서 2회 세척한 후, 2 mL의 배지를 가하여 배양을 계속했다. 48시간 후에 세포를 PBS로 2회 세척 후, 세포용해액(피카딘 LC-β; 동양잉크제조(주)) 0.25 mL로 용해했다. 12,000 rpm, 3분 원심분리를 행하여, 상청을 적절히 희석하고, LacZ 유전자의 발현량을 Galacto-Light Plus™(TROPIX, Inc.)를 사용하여 측정했다. 결과는 세포단백 1 ㎍당 LacZ 상대활성(RLU/㎍ protein)을 3예의 평균값 ±표준오차로 나타냈다.
FHN-Virosome으로 Fusion함으로써 LacZ 발현량이 SIV 단독에 비해 유의하게 증가했다(p<0.05). F-Virosome의 경우, FHN에서 인정된 유전자 발현의 상승은 얻어지지 않았다. HN-Virosome에서도 상승하는 경향이 인정되었지만, 그 정도는 FHN에 비하면 작았다(도 10).
상기 벡터에 있어서는, Fusion의 역할을 담당하는 단백으로서, SIV의 VSV-G 및 Virosome의 F 단백이 존재한다. VSV-G 단백의 Fusion은 약산성 pH역에 최적값이있고, 한편 F 단백은 중성역에서도 Fusion 가능한 것이 보고되어 있다. 본 실시예에서는, Fusion을 중성 pH로 행하고 있는 것으로부터, 주로 SeV의 F 단백이 Fusion의 메인을 담당하고 있다고 생각된다. SeV와 리포솜의 Fusion에서는 F 단백의 기능이 유지되어 있으면 성립하는 것이 보고되어 있다. 따라서, FHN 및 F-Virosome의 Fusion 효율은 같은 정도라고 가정하면, FHN-Virosome에서만 유전자 발현의 상승이 인정된 것은 부가된 HN의 기여가 크다고 추측되었다. HN-Virosome에서도 약간의 효과가 보인 것으로부터, VSV-G측으로부터의 Fusion도 어느 정도 생겨, HN 단백이 SIV에 부여되었다고 추측되었다.
한편, 단순히 SIV와 Virosome을 공존시켰을 때에는, SIV 단독과 같은 정도였다(도 10). 이 사실로부터, 양자를 혼합하여 37℃에서 반응시킴으로써 Fusion이 성립하고, SIV의 엔벨로프 상에 SeV의 막단백이 부가되어, 주로 HN 단백의 기여에 의해 감염속도가 향상되었다고 생각되었다.
[실시예 8] HN 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 조제 및 성능해석
1. 세포배양
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)고글루코오스 (GibcoBRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
2. 벡터의 제작
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTR△U3 또는 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/ CMVF β-gal/3LTR△U3) 1200 ng, 팩키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 360 ng, VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G(Clontech) 120 ng, Sendai virus HN, F 및 M 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-F 및 pCAGGS-M 각각 240 ng을, 아래의 표 5와 같은 조합으로 100 ㎕의 Opti MEM에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100 ㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE Reagent(Gibco BRL)를 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하고, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 48시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 벡터 부유액으로 했다.
<표 5>
(식중, 가한 플라스미드를 흑으로 표시했다. 「PV」는 팩키징 벡터pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev, 「GTV」는 진 트랜스퍼 벡터 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTR△U3 또는 pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF β-gal/3LTR△U3, 「VSV-G」는 VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G, 그리고 「HN」, 「F」및 「M」은 각각 센다이 바이러스 HN, F 및 M 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-F 및 pCAGGS-M을 나타낸다)
3. 벡터의 대량 조제 및 농축
293T 세포를 15 cm의 플라스틱 샬레로 1매당 5 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 10 ml의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 샬레 1매당 진 트랜스퍼 벡터 8 ㎍, 팩키징 벡터 2.4 ㎍, VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G(Clontech) 0.8 ㎍, Sendai virus HN 및 F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-F 및 pCAGGS-M 각각 1.6 ㎍을, 상기의 표 5의 조합으로 1.5 ml의 Opti MEM에 용해 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE Reagent(Gibco BRL)를 첨가한 1.5 ml의 Opti MEM을 가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하고, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 샬레 1매당 10 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 배양했다. 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과하여, 42,490 ×g(TOMY SRX-201, TA21BH), 4℃, 90분 원심했다. 펠릿을 1/100량의역전사반응액(TBS, 10 mM MgCl2, 3 mM SPERMINE, 0.3 nM SUPERMIDINE, 100 mM dNTPs)에 용해하여, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 역전사반응 후, 42,490 ×g(TOMY SRX-201, TA21BH), 4℃, 2시간 원심하고, 펠릿을 PBS(5% FCS, 2 ㎍/ml polybrene)에 용해하여, 사용까지 -80℃에 보존했다.
팩키징 벡터, 진 트랜스퍼 벡터 및 외각 단백 발현 벡터의 3종의 플라스미드를 세포에 코트랜스펙션하면, 진 트랜스퍼 벡터의 mRNA가 전사되어, 팩키징 벡터로부터 공급되는 바이러스 단백에 의해 ψ서열이 인식됨으로써 벡터 입자 내에 RNA가 팩키징된다. 이어서, 외각 단백 발현 벡터에 의해 공급되는 엔벨로프 단백에 의해 슈도타입화되어, 벡터 입자가 완성한다. 제작한 슈도타입 바이러스 벡터를 실험에 제공하여 세포에 대한 유전자 도입에 대해 검토했다.
<벡터의 역가측정 및 도입세포의 검출>
293T 세포를 실험에 제공하여, 상술한 방법에 의해 벡터에 의한 유전자 도입을 실시했다. 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 역가를 산출했다. 또한, 리포터 유전자로서 EGFP를 코드한 진 트랜스퍼 벡터를 실험에 제공한 경우는, 표적세포를 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하여, PBS로 1회 세척 후에 형광도립현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 검경하여 EGFP의 발현을 검색했다.
팩키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev), 진 트랜스퍼 벡터 (pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/3LTR△U3) 및 Sendai virus 유래의 외각 단백발현 벡터(pCAGGS-F, pCAGGS-HN 및 pCAGGS-M) 3종의 플라스미드를, 표 5의 ②~⑤와 같은 조합으로 세포에 코트랜스펙션한 결과, 어떤 경우도 293T 세포로의 유전자 도입은 인정되지 않았다. 그러나, VSV-G를 공발현시킴으로써 유전자 도입이 인정되었다. 이들 결과로부터, F 및 HN 단백만으로는 슈도타입 SIVagm 벡터의 충분한 유전자 도입효율은 얻어지지 않지만, VSV-G 등의 인간 세포 감염성 바이러스의 엔벨로프 단백질을 공존시킴으로써 높은 감염력을 갖는 슈도타입 바이러스 벡터가 생산되는 것이 판명되었다.
슈도타입 SIVagm 벡터에 의해, 293T 세포에 대해 EGFP 유전자를 도입하여, 벡터의 역가를 측정한 결과, 제작한 바이러스 벡터의 역가는, 벡터액 1 ml당 0.5~1 ×105T.U.였다. 더욱이, 원심에 의해 농축한 바이러스 벡터의 역가는, 농축에 의해 1.0 ×107T.U./ml로 높은 값을 나타냈다. 이 결과로부터, 센다이 바이러스 유래 F 및 HN 단백에 의해 슈도타입화한 SIVagm 벡터가 원심에 의해 농축 가능한 것이 나타내어졌다.
[실시예 9] 슈도타입 바이러스 벡터의 인 비보 투여
종래의 바이러스 벡터에 의해 유전자 도입이 곤란한 것으로 되어 있는 기관 상피 점막세포에 있어서는, 도입시에 물리적인 장애를 제거하는 처리가 되어 있어, VSV-G 슈도타입 HIV 벡터를 사용한 유전자 도입으로는 이산화황 등에 의해 상해하지 않으면 충분한 효과가 인정되고 있지 않다(L. G. Johnson et al., Gene Therapy: 7, 568-574, 2000). 센다이 바이러스 유래 F 및 HN 단백에 의해 슈도타입화한 SIVagm 벡터는, 상해를 줄 필요 없이 기관 상피 점막세포에 효율 좋게 유전자를 도입할 수 있는지의 여부를 검증했다.
6주령의 C57BL/6 마우스(수컷)를 seboflurene 흡입 마취하에, 상기와 같이 제조한 EGFP를 발현하는 FHN 슈도타입 SIV 벡터(표 5의 "⑪"의 EGFP 발현 벡터)(SIV-F/HN/M-EGFP라고 칭한다)를 경비적으로 투여했다. 조직은 OCT compound에서 동결절편을 작성하여, 형광현미경(Zeiss)으로 관찰했다.
SIV-F/HN/M-EGFP 108T.U.를 코로 100 ㎕ 투여하여, 3일째의 기관을 관찰한 바, 기관 상피세포에 EGFP의 형광이 관찰되었다(도 11). 또한, 동일한 개체의 비중격점막에 있어서도, 점막 상피에 발현이 관찰되고, 다열선모상피에도 형광이 인정되었다(도 12).
[실시예 10] 슈도타입 바이러스 벡터의 인 비보 투여에 있어서의 장기간의 외래유전자 발현
EGFP를 발현하는 진 트랜스퍼 벡터를 사용하여, 상기와 동일하게 F 및 HN 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스를 제조했다. 구체적으로는, 표 2의 "⑨"에 상당하는 슈도타입 MSCV(MSCV-F/HN/M-EGFP) 및 표 5의 "⑪"에 상당하는 슈도타입 SIV(SIV-F/HN/M-EGFP)를 제조했다. 대조로서, 표 5의 "①"에 상당하는 VSV-G 슈도타입 SIV(SIV-VSV-EGFP)를 사용했다. 마우스에 경비적으로 이들의 EGFP 발현 바이러스 벡터를 투여하고, 투여 90일 후에 비점막조직 절편을 제작하여, EGFP의 발현을 관찰했다.
그 결과, 어떤 벡터에 있어서도 EGFP의 발현이 관찰되었지만, F, HN 단백을 갖는 MSCV-F/HN/M-EGFP 및 SIV-F/HN/M-EGFP의 투여에 있어서 EGFP의 강한 형광이 확인되었다. 특히, SIV-F/HN/M-EGFP 벡터를 투여한 경우에는 다른 벡터에 비해 강한 형광이 관찰되어, 이 벡터가 높은 유전자 도입능을 갖는 것이 확인되었다(도 13).
[실시예 11] 신규 센다이 바이러스 엔벨로프 단백 발현 플라스미드의 구축
① 세포질쪽 영역 치환형 HN 발현 플라스미드의 구축
HN 단백의 세포질쪽 영역을 SIV 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역으로 치환한 HN 발현 플라스미드를 구축했다(도 14). 3쌍의 합성 올리고뉴클레오티드 (Xho+Xma/Xma-Xho, Xma+131/135-Xma, 132+Bam/Bam-136)를 어닐링 후, 순서대로 pBluescript KS+(Stratagene)의 XhoI-BamHI 부위로 삽입했다. pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)의 XhoI-Bsu36I 부위에 상기 재조합 플라스미드를 XhoI와 DraIII로 절단한 합성 올리고뉴클레오티드 연속 단편을 정제한 것, HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN을 DraIII와 Bsu36I로 절단한 HN 단백 3'측을 포함하는 단편을 정제한 것을 삽입했다. 이상의 방법에 의해 얻어진 플라스미드를 SIV 세포질쪽 영역 치환형 HN 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct/HN으로 했다.
② SIV 세포질쪽 영역 부가형 HN 발현 플라스미드의 구축
SIV 엔벨로프 단백의 세포질쪽 영역을 HN 단백에 부가한 HN 발현 플라스미드를 구축했다(도 15). SIV 엔벨로프 단백의 세포질쪽과 일부의 HN 단백을 포함하는 영역을 상기 세포질쪽 영역 치환형 HN 플라스미드를 템플레이트로 하여, 프라이머FSIVhn 및 RhnSIV를 사용한 PCR에 의해 증폭했다. 증폭단편을 XhoI 및 AccI에 의해 절단 후, 상기 ①에서 제작한 3쌍의 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입한 pBluescript KS+(Stratagene)의 XhoI-AccI 부위로 삽입하고, SIV 엔벨로프의 세포질쪽 영역을 포함하는 단편과 치환했다.
이 재조합 플라스미드를 XhoI와 DraIII로 절단한 합성 올리고뉴클레오티드 연속단편을 정제한 것, HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN을 DraIII와 Bsu36I로 절단한 HN 단백 3'측을 포함하는 단편을 pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)의 XhoI-Bsu36I 부위에 삽입했다. 이상의 방법에 의해 얻어진 플라스미드를 SIV 세포질쪽 영역 부가형 HN 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct+HN으로 했다.
③ 세포질쪽 영역 결실형 F 단백 발현 플라스미드의 구축
F 단백 세포질쪽 영역의 아미노산을 5'측으로부터 27, 14 및 4개 남기고, 각각 15, 28 및 38개의 아미노산을 결실시킨 F 단백 발현 플라스미드를 구축했다(도 16). F 단백의 전영역을 pBluescript KS+(Stratagene)의 SmaI 부위로 삽입한 플라스미드 pBluescript KS+/SmaI/F를 템플레이트로 하여, 15, 28 및 38 아미노산 결실형을 각각 프라이머 XhFF와 NotF1650, NotF1611 및 NotF1581을 사용한 PCR에 의해 증폭했다. 증폭단편을 XhoI 및 NotI에 의해 절단 후, pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)의 EcoRI 부위에 XhoI/NotI 링커를 삽입한 플라스미드의 XhoI-NotI 부위에 삽입하여, 플라스미드(15 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct27, 28 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct14 및 38 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct4)를 구축했다.
④ SIV 세포질쪽 영역을 부가한 세포질쪽 영역 결실형 F 단백 발현 플라스미드의구축
세포질쪽 영역 결실형 F 단백(F 단백 세포질쪽 영역의 아미노산수는 ③에서 제작한 플라스미드와 동수)에 SIV 세포질쪽 영역 5'측으로부터 11 아미노산(SIVct11)을 부가한 플라스미드를 구축했다(도 17). F 단백의 전영역을 pBluescript KS+(Stratagene)의 SmaI 부위로 삽입한 플라스미드 pBluescript KS+/SmaI/F를 템플레이트로 하여, 상기 3종의 아미노산 결실형에 SIV 세포질쪽 영역을 부가한 것을 각각 프라이머 XhFF와 SA-F1650, SA-F1611 및 SA-F1581을 사용한 PCR로 증폭했다. 증폭단편을 XhoI 및 NotI에 의해 절단 후, pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)의 EcoRI 부위에 XhoI/NotI 링커를 삽입한 플라스미드의 XhoI-NotI 부위에 삽입하여, 플라스미드(SIVct11 부가 15 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct27/SIVct11, SIVct11 부가 28 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct14/SIVct11 및 SIVct11 부가 38 아미노산 결실형: pCAGGS-Fct14/SIVct11)를 구축했다.
[실시예 12] 센다이 바이러스 엔벨로프 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 조제 및 성능해석
<세포배양>
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고글루코오스(Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
BEAS-2B 세포(인간 기관 상피 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIOWHITTAKER)을 포함하는 Minimum Essential Medium(MEM)(Gibco BRL)과 RPMI1640을 1:1의 비율로 혼합한 것을 사용하여, 37℃, 5% CO2에서 배양했다.
<벡터의 제작>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3) 1200 ng, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 360 ng, Sendai virus HN, F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct/HN, pCAGGS-SIVct+HN, pCAGGS-Fct4, pCAGGS-Fct14, pCAGGS-Fct27, pCAGGS-Fct4/SIVct11, pCAGGS-Fct14/SIVct11 및 pCAGGS-Fct27/SIVct11을 각각 아래의 표 6에 나타내는 조합으로 100 ㎕의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 1웰당 2 ml의 1% 소혈청 알부민 및 7.5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수,0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 사용했다.
<표 6>
<SIVagm 벡터에 의한 유전자 도입>
표적이 되는 293T 및 BEAS-2B 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 293T 세포는 48시간, BEAS-2B 세포는 24시간 컬쳐했다. 컬쳐 플레이트로부터 배양액을 제거하고, 벡터액에 폴리브렌(Sigma)을 최종 농도 8 ㎍/ml로 첨가한 것을 1 ml 중층하고, 37℃에서 293T 세포는 10%, BEAS-2B 세포는 5% CO2에서 3시간 컬쳐하여, 벡터를 감염시켰다. 3시간 후에 20% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 배양액을 1 ml 가하여, 37℃에서 293T 세포는 10%, BEAS-2B 세포는 5% CO2에서 48시간 배양했다.
<벡터의 역가 측정>
벡터의 역가 측정은, 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 계산했다. 상기의 방법으로 1 ml의 벡터액을 감염, 감염 후 48시간 후에 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하고, PBS로 1회 세척 후에 형광도립현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 2000배의 배율로 검경, 시야 내의 유전자 도입세포수를 측정하여, 3시야의 평균을 구해, 시야의 면적과 플레이트의 면적으로 구한 계수 854.865를 곱함으로써 역가의 산출을 행했다. 역가의 단위는 Transducing Unit(T.U.)/ml로 표기하기로 했다.
<벡터의 대량 조제 및 농축>
293T 세포를 15 cm의 플라스틱 샬레로 1매당 5 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 샬레 1매당 10 ml의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 샬레 1매당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF LacZ/3LTR△U3) 8 ㎍, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 2.4 ㎍, Sendai virus HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct+HN 및 F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-Fct4 각각 1.6 ㎍을 1.5 ml의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 1.5 ml의 Opti MEM으로 희석한 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 샬레 1매당 10 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 샬레 1매당 20 ml의 1% 소혈청 알부민 및 7.5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과했다. 16,000 ×g(Beckman J-25I, JA-18), 4℃, 1시간 원심했다. 펠릿을 PBS(5% FCS, 2 ㎍/ml 폴리브렌을 포함한다)에 용해하여, -80℃에서 보존했다.
<결과>
진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3), 팩키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 및 Sendai virus HN(pCAGGS-SIVct/HN 또는 pCAGGS-SIVct+HN), F 단백 발현 플라스미드(pCAGGS-Fct4, pCAGGS-Fct14, pCAGGS-Fct27, pCAGGS-Fct4/SIVct11, pCAGGS-Fct14/SIVct11, pCAGGS-Fct27/SIVct11)를 조합하여 세포에 코트랜스펙션한 결과, 293T 및 BEAS-2B 세포로의 유전자 도입이 인정되고(도 18, 19 및 20), HN 및 F 단백 발현 플라스미드에 있어서의 개변에 의해 VSV-G를 공발현시키지 않고 유전자 도입이 인정되는 것으로부터, Sendai virus F 및 HN 단백에 의한 SIVagm을 베이스로 한 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 제작이 가능한 것이 나타내어졌다. 이들 슈도타입 벡터의 293T 세포를 사용한 역가는 약 3.6 ×104T.U./ml이고, F 단백 발현 플라스미드에 있어서는 pCAGGS-Fct4 및 Fct4/SIVct11을 사용한 경우가 가장 높고, 이들 2종의 F 단백 발현 플라스미드와 HN 단백 발현 플라스미드 3종과의 조합에 있어서는, HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct+HN과의 조합에서 가장 높았다.
가장 벡터 역가가 높았던 F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-Fct4 및 HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct+HN을 코트랜스펙션하여 제작한 벡터에 대해서 원심에 의한 농축에 대해 검토했다. 그 결과, F, HN 슈도타입 벡터는 원심에 의해 고도의 농축이 가능한 것이 확인되었다(도 21).
<실험에 제공한 올리고뉴클레오티드>
합성 올리고뉴클레오티드는, SA-F1611 및 SA-F1581을 제거하고 (주)그라이너 재팬 DNA 수탁합성사업부에 의뢰하여, 일본제분(주)생물화학연구부에서 합성, 역상 카트리지정제 또는 PAGE 정제한 것을 사용했다. SA-F1611 및 SA-F1581은, (주)사와디 ·테크놀로지(Sawady Technology Co.,)에 의뢰하여, HPLC 정제한 것을 사용했다.
Xho+Xma:5'-TCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGGAGCAACGACGGAGGTGAAGGACCAGACGCCAACGAC CC(서열번호:25)
Xma-Xho:5'-CCGGGGGTCGTTGGCGTCTGGTCCTTCACCTCCGTCGTTGCTCCTGATTTTTAACTCAGACCACA TC(서열번호:26)
Xma+131:5'-CCGGGGAAAGGGGGTGCAACACATCCATATCCAGCCATCTCTACCTGTTTATGGACAGA(서열번호:27)
135-Xma:5'-ACCCTCTGTCCATAAACAGGTAGAGATGGCTGGATATGGATGTGTTGCACCCCCTTTCC(서열번호:28)
132+Bam:5'-GGGTTAGGTGGTTGCTGATTCTCTCATTCACCCAGTGGG(서열번호:29)
Bam-136:5'-GATCCCCACTGGGTGAATGAGAGAATCAGCAACCACCTA(서열번호:30)
FSIVhn:5'-GAGACTCGAGATGTGGTCTGAGTTAAAAATCAGG-3'(서열번호:31)
RhnSIV:5'-AGAGGTAGACCAGTACGAGTCACGTTTGCCCCTATCACCATCCCTAACCCTCTGTCCATAAAC-3'(서열번호:32)
XhFF:5'-CCGCTCGAGCATGACAGCATATATCCAGAGA(서열번호:33)
NotF1650:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCATCTGATCTTCGGCTCTAATGT(서열번호:34)
NotF1611:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCAACGGTCATCTGGATTACCCAT(서열번호:35)
NotF1581:5'-ATAGTTTAGCGGCCGCTCACCTTCTGAGTCTATAAAGCAC(서열번호:36)
SA-F1650:
5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTTCTGATCTTCGGCTCTAATGT(서열번호:37)
SA-F1611:
5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTACGGTCATCTGGATTACCCAT(서열번호:38)
SA-F1581:
5'-ATAGTTTAGCGGCCGCCTATGGAGATAGAGGAACATATCCCTGCCTAACCCTCCTTCTGAGTCTATAAAGCAC(서열번호:39)
[실시예 13] 센다이 바이러스 엔벨로프 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 조제 및 성능해석
<세포배양>
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)고글루코오스(Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
<벡터의 제작>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터 pMSCV EGFP 700 ng, 에코트로픽 엔벨로프 및 gag-pol 발현 플라스미드(IMGENEX사) 300 ng, Sendai virus F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-Fct4 200 ng, HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-SIVct/HN 및 pCAGGS-SIVct+HN 200 ng을 각각 아래의 표 7에 나타내는 조합으로 100 ㎕의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100 ㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 15 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 1웰당 2 ml의 1% 소혈청 알부민 및 7.5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM으로 배지 교환하고, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 사용했다.
<표 7>
<SIVagm 벡터에 의한 유전자 도입>
표적이 되는 293T를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 1 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 컬쳐 플레이트로부터 배양액을 제거하고, 벡터액에 폴리브렌(Sigma)을 최종 농도 8 ㎍/ml로 첨가한 것을 1 ml 중층하고, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐하여, 벡터를 감염시켰다. 3시간 후에 20% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 배양액을 1 ml 가하여, 37℃, 10% CO2에서 48시간 배양했다.
<벡터의 역가 측정>
벡터의 역가 측정은, 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 계산했다. 상기의 방법으로 1 ml의 벡터액을 감염, 감염 후 48시간 후에 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하고, PBS로 1회 세척 후에 형광도립현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 200배의 배율로 검경, 시야 내의 유전자 도입세포수를 측정하여, 3시야의 평균을 구해, 시야의 면적과 플레이트의 면적으로 구한 계수 854.865를 곱함으로써 역가의 산출을 행했다. 역가의 단위는 Transducing Unit(T.U.)/ml로 표기하기로 했다.
<결과>
진 트랜스퍼 벡터 pMSCV EGFP, 에코트로픽 엔벨로프 및 gag-pol 발현 플라스미드, Sendai virus F 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-Fct4, HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-SIVct/HN 및 pCAGGS-SIVct+HN을 조합하여 세포에 코트랜스펙션한 결과, 293T 세포로의 유전자 도입이 인정되었다(도 22). HN 및 F 단백 발현 플라스미드에 있어서의 개변에 의해, 에코트로픽 엔벨로프를 보유하는 바이러스가 감염성을 나타내지 않는 인간 유래 293T 세포에 대해 유전자 도입이 인정되는 것으로부터, Sendai virus F 및 HN 단백에 의한 MSCV를 베이스로 한 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 제작이 가능한 것이 나타내어졌다. 더욱이 F 단백 발현 플라스미드에 pCAGGS-Fct4를 사용한 경우, 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 역가는, HN 단백 발현 플라스미드 3종과의 조합에 있어서 HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-SIVct+HN과의 조합에서 가장 높아, 1.1 ×105T.U./ml였다.
[실시예 14] VSV-G/HN 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 생산 및 조혈간세포를 포함하는 인간 골수 세포에 대한 유전자 도입효율의 VSV-G 슈도 타입 렌티바이러스 벡터와의 비교
<세포배양>
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고글루코오스(Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
<벡터의 역가 측정>
벡터의 역가 측정은, 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 계산했다. 상기의 방법으로 1 ml의 벡터액을 감염, 감염 후 48시간 후에 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하고, PBS로 1회 세척 후에 형광도립현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 200배의 배율로 검경, 시야 내의 유전자 도입세포수를 측정하여, 3시야의 평균을 구해, 시야의 면적과 플레이트의 면적으로 구한 계수 854.865를 곱함으로써 역가의 산출을 행했다. 역가의 단위는 Transducing Unit(T.U.)/ml로 표기하기로 했다.
<벡터의 대량 조제 및 농축>
293T 세포를 15 cm의 플라스틱 샬레로 1매당 5 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 샬레 1매당 10 ml의 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 샬레 1매당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3) 8 ㎍, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 2.4 ㎍, VSV-G 발현 플라스미드 pVSV-G와 Sendai virus HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-SIVct/HN 및 pCAGGS-SIVct+HN 1.6 ㎍의 3종을 아래의 표 8에 기재의 조합으로 1.5 ml의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 1.5 ml의 Opti MEM으로 희석한 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하고 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 샬레 1매당 20 ml의 20% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 DMEM을 가하고, 37℃ 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 샬레 1매당 20 ml의 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과했다. 42,390 ×g(TOMY SRX-201, TA21BH), 4℃, 90분 원심했다. 펠릿을 1/100의 역전사반응액(TBS, 10 mM MgCl2, 3 mM SPERMINE, 0.3 nM SUPERMIDINE, 100 mM dNTPs)에 용해하여, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 역전사반응 후, 42,390 ×g(TOMY SRX-201, TA21BH), 4℃, 2시간 원심하고, 펠릿을 PBS(5% FCS, 2 ㎍/ml 폴리브렌을 포함한다)에 용해하여, 사용까지 -80℃에서 보존했다.
<표 8>
<인간 골수 CD34+세포로의 유전자 도입>
인간 골수 CD34+세포는 BIO WHITTAKER사로부터 구입했다. 해동 후, 50 ng/ml IL-6, 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml Stem Cell Factor(GIBCO BRL), 100 ng/ml Flt-3 리간드(Research Diagnostics, Flanders, NJ)(모두 인간 리콤비넌트), 10% FCS 첨가 이스코프 변법 DMEM(IMDM)에서 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양했다. 배양 후, 세포 2 ×105개에 대해, 바이러스 벡터를 2 ×106및 107T.U./ml로 조제한 바이러스액으로 교환하여, 50 ng/ml IL-6, 100 ng/ml TPO, 100 ng/ml Stem Cell Factor(GIBCO BRL), 100 ng/ml Flt-3 리간드를 첨가했다. 배양 개시 96시간 후에 세포를 회수했다.
<플로 사이토미터에 의한 해석>
회수한 세포는 PE 표지 항인간 CD34 항체(Becton Dickinson)를 사용하여 염색한 후, 플로 사이토미터(EPICS ELITE, Coulter)로 GFP 및 PE의 2 형광으로 해석했다.
<결과>
m.o.i=10에 있어서 VSV-G 슈도타입 벡터의 CD34+세포에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율이 9.7%였던 것에 대해, VSV-G와 HN, SIVct/HN 및 SIVct+HN과의 슈도타입 벡터의 CD34+세포에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율은 각각 43.9, 25.2 및 19.7%였다(표 9). 한편, m.o.i=50에 있어서는 VSV-G 슈도타입 벡터의 CD34+세포에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율은 51.4%이고, VSV-G와 HN, SIVct/HN 및 SIVct+HN과의 슈도타입 벡터의 CD34+세포에 있어서의 GFP 양성 세포의 비율은 각각 43.0, 70.8 및 68.4%였다(표 10).
이상의 결과로부터, VSV-G 단백에 가하여 HN 단백을 공발현시킴으로써 제작한 슈도타입 벡터는 조혈간세포를 포함하는 인간 골수세포에 대한 유전자 도입의 효율이 상승하는 것이 확인되었다.
<표 9>
GFP 양성 세포의 비율(%) m.o.i=10
<표 10>
GFP 양성 세포의 비율(%) m.o.i=50
[실시예 15] 인플루엔자바이러스 엔벨로프 단백 발현 플라스미드의 구축
인플루엔자바이러스(H1N1) 유래 헤마글루티닌 단백(HA) 발현 플라스미드를 구축했다. 플라스미드 pDREF HisD(Microbiol. Immunol., 44(8), 677-685, 2000)를 템플레이트로 하여, 프라이머 HAFNot 및 HARNot를 사용한 PCR에 의해 증폭했다. 증폭단편을 NotI에 의해 절단 후, pCAGGS(Gene, vol.108, pp.193-200, 1991)에 XhoI-NotI 부위를 부가한 벡터의 NotI 부위에 삽입했다. 이상의 방법에 의해 얻어진 플라스미드를 HA 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HA로 했다.
실험에 제공한 합성 올리고뉴클레오티드는, (주)그라이너 재팬 DNA 수탁합성사업부에 의뢰하여, 일본제분(주) 생물화학연구부에서 합성, 역상 카트리지 정제 또는 PAGE 정제한 것을 사용했다.
HAFNot:5'-GAGAGCGGCCGCCCAAAATGAAGGCAAAACTACTG-3'(서열번호:48)
HARNot:5'-GATGCGGCCGCTCAGATGCATATTCTGCAC-3'(서열번호:49)
[실시예 16] 인플루엔자바이러스 엔벨로프 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 조제 및 성능해석
<세포배양>
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포주)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고글루코오스(Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
<벡터의 제작>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3) 1200 ng, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 360 ng, HA 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HA 240 ng을 100 ㎕의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하여, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하고 완만하게 교반하여, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 10 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 1웰당 2 ml의 1% 소혈청 알부민, 5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL) 및 50 unit의 뉴라미니다아제(Roche)를 포함하는 DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 사용했다.
<SIVagm 벡터에 의한 유전자 도입>
표적이 되는 293T를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 1 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 컬쳐 플레이트로부터 배양액을 제거하여, 벡터액에 폴리브렌(Sigma)을 최종 농도 8 ㎍/ml로 첨가한 것을 1 ml 중층하고, 37℃, 10% CO2에서 3시간 컬쳐하여, 벡터를 감염시켰다. 3시간 후에 20% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 배양액을 1 ml 가하여, 37℃, 10% CO2에서 48시간 배양했다.
<벡터의 역가 측정>
벡터의 역가 측정은, 벡터액 1 ml에 의해 유전자 도입되는 세포의 수로 계산했다. 상기의 방법으로 1 ml의 벡터액을 감염, 감염 후 48시간 후에 2% 포름알데히드 및 0.2% 글루타르알데히드를 포함하는 PBS(Invitrogen사)로 실온에서 20분간 고정하고, PBS로 1회 세척 후에 형광도립현미경(DMIRB(SLR), Leica)으로 200배의 배율로 검경, 시야 내의 유전자 도입세포수를 측정하여, 3시야의 평균을 구해, 시야의 면적과 플레이트의 면적으로 구한 계수 854.865를 곱함으로써 역가의 산출을 행했다. 역가의 단위는 Transducing Unit(T.U.)/ml로 표기하기로 했다.
<벡터의 대량 조제 및 농축>
293T 세포를 15 cm의 플라스틱 샬레로 1매당 5 ×106개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 샬레 1매당 10 ml의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 샬레 1매당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF LacZ/3LTR△U3) 8 ㎍, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 2.4 ㎍, HA 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HA 1.6 ㎍을 1.5 ml의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후, 40 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 1.5 ml의 Opti MEM으로 희석한 60 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하고, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 샬레 1매당 10 ml의 1% 소혈청 알부민 및 10 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하고, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 샬레 1매당 20 ml의 1% 소혈청 알부민, 5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL) 및 500 unit의 뉴라미니다아제(Roche)를 포함하는 DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과했다. 16,000 ×g(Beckman J-25I, JA-18), 4℃, 1시간 원심했다. 펠릿을 PBS(5% FCS, 2 ㎍/ml 폴리브렌을 포함한다)에 용해하여, -80℃에서 보존했다.
<결과>
진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3), 팩키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 및 HA 단백 발현 플라스미드(pCAGGS-HA)를 세포에 코트랜스펙션한 결과, 293T 세포로의 유전자 도입이 인정되어(도 23), VSV-G를 공발현시키지 않고 유전자 도입이 인정되는 것으로부터, Influenza virus HA 단백에 의한 SIVagm을 베이스로 한 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 제작이 가능한 것이 나타내어졌다. 이들 슈도타입 벡터의 293T 세포를 사용한 역가는 1.3 ×104T.U./ml였다. 더욱이, 이와 같이 하여 제작한 벡터에 대해 원심에 의한 농축에 대해 검토한 결과, HA 슈도타입 벡터는 원심에 의해 고도의 농축이 가능한 것이 확인되었다(도 24).
[실시예 17] 인플루엔자바이러스 및 센다이 바이러스 엔벨로프 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 조제 및 성능해석
<세포배양>
293T 세포(인간 태아 신장 유래 세포)는, 10% 비동화 송아지혈청(BIO WHITTAKER)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)고글루코오스 (Gibco BRL)를 사용하여, 37℃, 10% CO2에서 배양했다.
<벡터의 제작>
293T 세포를 6웰의 플라스틱 컬쳐 플레이트로 1웰당 5 ×105개로 뿌리고, 37℃, 10% CO2에서 48시간 컬쳐했다. 배양액을 1웰당 800 ㎕의 1% 소혈청 알부민을 포함하는 DMEM으로 치환하여 트랜스펙션에 사용했다. 1웰당 진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3) 1200 ng, 팩키징 벡터 (pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev) 360 ng, Sendai virus HN 단백 발현 플라스미드 pCAGGS-HN, pCAGGS-SIVct/HN, pCAGGS-SIVct+HN 및 HA 단백 발현 플라스미드 240 ng을 각각 아래의 표 11에 나타내는 조합으로 100 ㎕의 Opti MEM(Gibco BRL)에 용해 후 6 ㎕의 PLUS Reagent(Gibco BRL)를 가하여 교반, 15분간 실온에서 정치했다. 여기에, 100 ㎕의 Opti MEM으로 희석한 4 ㎕의 LIPOFECTAMINE(Gibco BRL)을 첨가하여 교반 후 더욱이 실온에서 15분간 정치하고, 이것을 상기의 293T 세포에 적하하여 완만하게 교반하고, 37℃, 10% CO2하에서 3시간 컬쳐했다. 1웰당 1 ml의 1% 소혈청 알부민 및 10 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL)을 포함하는 DMEM을 가하여, 37℃, 10% CO2에서 16~24시간 컬쳐한 후에, 1웰당 2 ml의 1% 소혈청 알부민, 5 ㎍/ml의 트립신(Gibco BRL) 및 50 unit의 뉴라미니다아제(Roche)를 포함하는 DMEM으로 배지 교환하여, 그 24시간 배양 후에 배양상청을 회수, 0.45 ㎛의 필터로 여과한 것을 사용했다.
<표 11>
<결과>
진 트랜스퍼 벡터(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVF EGFP/3LTR△U3), 팩키징 벡터(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev), HA 단백 발현 플라스미드(pCAGGS-HA) 및 Sendai virus HN 단백 발현 플라스미드(pCAGGS-HN, pCAGGS-SIVct/HN, pCAGGS-SIVct+HN)을 세포에 코트랜스펙션한 결과, 293T 세포로의 유전자 도입이 인정되었다(도 25). Influenza virus의 budding에 있어서의 시알산과의 결합을 절단하는 역할을 뉴라미니다아제가 담당하고 있기 때문에, HA 슈도타입 제작에 뉴라미니다아제가 필요했다. 따라서, Sendai virus HN 단백의 뉴라미니다아제 활성을 이용할 목적으로 각종 HN 발현 플라스미드를 사용하여 HN 단백을 공존시킨 바, 벡터 생산이 인정되었다. 이 결과로부터, 신규 HA/HN 슈도타입 렌티바이러스 벡터의 제작이 가능한 것이 나타내어졌다.
산업상이용가능성
본 발명에 의해, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질로 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터가 제공되었다. 본 발명의 벡터는, 유전자 치료 등에 적합하게 사용된다. 특히, 기도로의 인 비보 투여 및 조혈간세포를 표적으로 한 엑스 비보 투여에 유용하다.

Claims (24)

  1. 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질을 포함하는, 실질적으로 순수한 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 단일 가닥 음성 가닥 RNA 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 파라믹소바이러스의 HN 단백질 및/또는 오르토믹소바이러스 HA 단백질에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 헤마글루티닌 활성을 갖는 막단백질이 단일 가닥 음성 가닥 RNA 바이러스에 포함되는 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 개변된 단백질인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 파라믹소바이러스의 F 단백질을 더욱이 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 F 단백질의 세포질쪽 영역의 일부 또는 전부가 결실 및/또는 부가에 의해 개변되어 있는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 세포에 감염하는 바이러스에 유래하는 엔벨로프 단백질을 더욱이 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 레트로바이러스 유래의 암포트로픽 엔벨로프 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 수포성 구내염 바이러스 유래의 VSV-G 단백질을 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 온코바이러스에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 렌티바이러스가 원숭이 면역부전 바이러스에 유래하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  13. 제3항 또는 제5항에 있어서, 파라믹소바이러스가 센다이 바이러스인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 외래유전자를 발현 가능하게 포함하는 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 점액을 갖는 세포로의 유전자 도입용인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 점액을 갖는 세포가 점막 상피세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 점막 상피세포가 비강 또는 폐 기관지의 점막 상피세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  18. 제14항에 있어서, 혈구계 또는 조혈계 세포로의 유전자 도입용인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 혈구계 또는 조혈계 세포가 조혈간세포인 슈도타입 레트로바이러스 벡터.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 포함하는 유전자 도입용 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 의약인 조성물.
  22. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항의 슈도타입 레트로바이러스 벡터를 세포에 접촉시키는 공정을 포함하는, 외래유전자를 세포에 도입하는 방법.
  23. 헤마글루티닌 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA를 발현 가능하게 포함하는 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 생산용 팩키징 세포.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항의 슈도타입 레트로바이러스 벡터의 제조방법으로서, 제23항의 팩키징 세포 내에서 레트로바이러스 유래의 진 트랜스퍼 벡터 DNA를 전사시키는 공정을 포함하는 방법.
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