CN111902534A - 病毒载体生产系统 - Google Patents

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Abstract

本文公开了分泌用于在病毒载体生产过程中降解残留核酸的核酸酶的病毒载体生产系统及其生产方法。此类病毒载体生产系统包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产过程中降解残留核酸。另一种此类病毒载体生产系统包含：1)病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，所述核酸酶辅助细胞包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。

Description

病毒载体生产系统
发明领域
本发明涉及病毒载体生产系统。特别地，本发明涉及病毒载体细胞生产系统，其被工程化改造以在载体生产过程中将核酸酶表达并分泌至细胞培养基中。
背景技术
如上所述，本发明涉及生产细胞，其制备及其用途。生产细胞有时也称为宿主细胞或宿主生产细胞。生产细胞尤其可用于基因治疗。
基因治疗广泛地涉及使用遗传物质治疗疾病。其包括提供具有缺陷基因的细胞(例如，携带突变的那些)、具有那些基因的功能性拷贝的细胞、将不正确的功能性基因失活和引入新的治疗性基因。
可以使用载体将治疗性遗传物质掺入宿主的靶细胞中，以使核酸转移。此类载体通常可分为病毒和非病毒类别。
病毒天然地会将其遗传物质引入宿主的靶细胞中，作为其复制周期的一部分。经工程化改造的病毒载体利用这种能力使目标核苷酸(NOI)能够递送至靶细胞。迄今为止，已将很多病毒工程化改造为用于基因治疗的载体。这些包括逆转录病毒、腺病毒(AdV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和牛痘病毒。
除了修饰以携带目标核苷酸外，病毒载体通常还被进一步工程化为复制缺陷型。这样，重组载体能够直接感染靶细胞，但不能产生更多代感染性病毒体。其他类型的病毒载体可以仅在癌细胞内条件性地复制，并且可以另外地编码毒性转基因或酶原。
病毒载体用于递送治疗性基因的用途是众所周知的，并且适应证广泛。特别地，基因疗法的进步和产品现在已成为我们全球医疗保健市场的重要组成部分。基于RNA病毒(如γ-逆转录病毒和慢病毒)以及DNA病毒(如腺病毒和腺相关病毒(AAV))的当代基因疗法载体已在越来越多的人类疾病适应证中显示出希望。这些包括针对血液疾病的患者细胞离体修饰，以及眼科、心血管、神经退行性疾病的体内治疗和肿瘤治疗或免疫治疗。其他病毒载体(如基于痘病毒和禽病毒的病毒)已广泛用于人和动物的疫苗接种。
作为多种遗传病症的疗法而开发的逆转录病毒载体，在临床试验中持续显示出越来越大的希望，现在有少数已成为获批的治疗性产品的基础。目前，在基因医学杂志数据库中注册了超过459项涉及逆转录病毒基因治疗的人体临床试验；158种基因疗法的临床试验使用慢病度载体(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php，于2017年4月更新)。Strimvelis于2016年5月26日获得欧盟委员会的上市许可；Strimvelis是一种用于治疗ADA-SCID的产品，其基于使用表达ADA基因的逆转录病毒载体离体转导的患者CD34+细胞。Kymriah(USAN：tisagenlecleucel)于2017年8月30日获得FDA批准；Kymriah是一种用于治疗25岁以下难治性ALL患者的产品。关于逆转录病毒基因疗法的文章包括Wang X,NaranjoA,Brown CE,Bautista C,Wong CW,Chang WC,Aguilar B,Ostberg JR,Riddell SR,FormanSJ,Jensen MC(2012)J Immunother.35(9):689-701；Hu Y,Wu Z,Luo Y,Shi J,Yu J,Pu C,Liang Z,Wei G,Cui Q,Sun J,Jiang J,Xie J,Tan Y,Ni W,Tu J,Wang J,Jin A,Zhang H,Cai Z,Xiao L,Huang H.(2017)Clin Cancer Res.23(13):3297-3306；Galy,A.和A.J.Thrasher(2010)Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6):545-550；Porter,D.L.,B.L.Levine,M.Kalos,A.Bagg和C.H.June(2011)N Engl J Med 365(8):725-733；Campochiaro,P.A.(2012)Gene Ther 19(2):121-126；Cartier,N.,S.Hacein-Bey-Abina,C.C.Bartholomae,P.Bougneres,M.Schmidt,C.V.Kalle,A.Fischer,M.Cavazzana-Calvo和P.Aubourg(2012)Methods Enzymol 507:187-198；Sadelain,M.,I.Riviere,X.Wang,F.Boulad,S.Prockop,P.Giardina,A.Maggio,R.Galanello,F.Locatelli和E.Yannaki(2010)Ann N Y Acad Sci 1202:52-58；DiGiusto,D.L.,A.Krishnan,L.Li,H.Li,S.Li,A.Rao,S.Mi,P.Yam,S.Stinson,M.Kalos,J.Alvarnas,S.F.Lacey,J.K.Yee,M.Li,L.Couture,D.Hsu,S.J.Forman,J.J.Rossi and J.A.Zaia(2010)Sci Transl Med 2(36):36ra43以及Segura MM,M.M.,Gaillet B,Garnier A.(2013)Expert opinion inbiological therapy。
此类载体的重要实例包括γ-逆转录病毒载体系统(基于MMLV)、灵长类动物慢病毒载体系统(基于HIV-1)和非灵长类动物慢病度载体系统(基于EIAV)。
反向遗传学已经使这些基于病毒的载体被大量工程化改造，从而可以通过利用适当的DNA序列转染哺乳动物细胞来产生编码大的异源序列(大约10kb)的载体(参见综述Bannert,K.(2010)Caister Academic Press:347-370)。
在研究阶段，逆转录病毒载体的工程改造和使用通常涉及生产报告基因载体，其编码例如GFP或lacZ。这些临床上不相关载体的滴度通常在1×106至1×107转导单位每mL(TU/mL)粗收集物的范围内。
在过去几十年中，科学期刊充分记录了用于人类基因疗法和疫苗接种的病毒载体的生产。众所周知的病毒载体生产方法包括用载体DNA组分转染(如瞬时转染)原代细胞或哺乳动物/昆虫细胞系，然后孵育有限的一段时间，随后从培养基和/或细胞中收获粗载体。瞬时转染需要通过转染经由质粒将生产病毒载体所需的病毒基因引入生产细胞(例如，HEK293)。通常，部分出于安全性的原因，载体生产所需的每种组分均由单独的质粒编码，因为这将使得随后需要发生很多重组事件，才能通过生产过程形成具有复制能力的病毒颗粒。
转染、孵育和收获后，然后使用包括下述一些或全部步骤的通用方法从粗物质中纯化和浓缩病毒载体病毒体：1)澄清，2)消化不需要的或污染的核酸(例如，
Figure BDA0002680207430000031
处理)，3)柱层析(例如，离子交换)，4)缓冲液交换/浓缩(例如，超滤)和进一步去除核酸(例如，第二次
Figure BDA0002680207430000032
处理)，5)精制(例如，体积排阻)和6)无菌过滤。
尽管经过数十年的改进，但瞬时转染仍具有固有的缺陷。转染剂/质粒和/或处理剂的成本很高，再加上转染技术的劳动强度大，这使得瞬时转染成为用于临床/商业载体生产的昂贵且技术上复杂的过程。
因此，本领域中需要提供生产病毒载体的替代方法，其有助于解决与瞬时转染过程相关的已知问题。
近年来，已经尝试产生稳定的包装细胞系，其中将病毒包装基因和选择标记物一起引入真核宿主细胞中，使得这些基因能够稳定地整合到细胞中。类似地，还存在稳定生产细胞系，其中逆转录病毒基因组也是稳定整合的。这两种方法都能够规避瞬时转染过程的很大一部分缺陷。
亦参见题为“逆转录病毒载体”的共同待决申请号EP 17210359.0，其全部内容通过引用并入本文，其描述了病毒载体生产系统和方法，所述系统和方法采用了包含病毒载体生产所必需的至少两种核酸组分的模块化构建体。发现此类模块化构建体提供了与传统多质粒瞬时过程具有可比性的载体生产水平，但是能够显著减少例如转染剂的使用。
因此，在载体生产领域，改善瞬时载体生产工艺以及用于生产稳定包装和生产细胞系的工艺是所需要的。
从最终药品中除去来自生产细胞或病毒载体组分的核酸是安全性的重要方面，也是病毒载体生产领域亟待改进的方面。当使用转化的真核细胞系，如HEK293T细胞(其还含有腺病毒E1和SV40 T抗原基因)进行生产时，这些细胞通常带有具有(原)癌性性质的基因。在病毒载体生产过程中不可避免的细胞死亡和生产细胞DNA的释放导致在粗收获物质中存在此类(部分和污染的)序列。因此，使一般DNA污染最小化(例如，更长的污染dsDNA在最终产物中降解成短形式)，以防止在载体递送期间将不必要的和潜在有害的功能基因序列整合到患者细胞中是所需要的。此外，用大量编码病毒载体组分的质粒DNA(pDNA)瞬时转染生产细胞的典型病毒载体生产方法将导致大多数污染性DNA来自载体组分。因此，还希望去除污染的残留pDNA，否则这些残留pDNA可能会被患者细胞摄取并表达。
从实验室规模到工业规模，病毒载体的生产厂商已转向使用重组核酸酶(如来自粘质沙雷氏菌的核酸酶(例如，
Figure BDA0002680207430000041
)或其他市售水解核酸酶)来处理粗载体材料并除去上游和下游纯化过程中的污染核酸。对于在上游处理过程中的核酸酶处理，通常将蛋白形式的重组核酸酶添加到收获材料中，然后在小于或等于37°的温度下孵育一段有限的时间。然而，这代表了潜在可避免的附加处理步骤，其中升高的温度和增加的孵育时间可能导致载体稳定性的损失。为避免在收获后作为独立步骤进行操作，通常在载体生产后期将重组核酸酶添加到生产细胞培养物中。然而，如果核酸酶的半衰期相对较短或活性不足以降解所需量的残留核酸，则可能需要在培养这些的后期中一次或连续添加大量核酸酶。不幸的是，在该过程的这一阶段使用市售重组核酸酶实际上变得繁琐且成本昂贵，特别是当规模增加到数百或数千升时。
因此，需要改进病毒载体的生产和制备过程，以简化和更有效地进行病毒载体生产过程中降解残留核酸的一个或多个关键步骤。
发明内容
本文公开的发明描述了高效和简化的病毒载体生产细胞和生产方法，其在病毒载体生产期间在病毒载体生产细胞中表达和分泌一种或多种水解核酸酶。这样，核酸酶的分泌在病毒载体生产期间降解了不需要的或污染的(残留的)核酸。在这种载体生产系统和方法中，由核苷酸表达盒编码的核酸酶与一个或多个病毒载体组分表达盒瞬时共转染，或稳定整合在生产细胞基因组或核酸酶辅助细胞基因组中，或者核酸酶辅助细胞可以通过用核酸酶表达盒的瞬时转染产生。
由于病毒载体生产过程的复杂性，与病毒载体生产系统结合和/或在病毒载体生产过程中从基因表达盒表达和分泌核酸酶与现有技术相反，现有技术中仅证明了在细菌细胞中表达/共表达核酸酶，以及在病毒载体的背景下利用添加市售核酸酶作为在繁冗的上游和/或下游时间点对病毒载体进行基于重组蛋白的酶促处理方法。因此，在本文所公开的发明之前，认为在病毒载体生产系统中由与一个或多个病毒载体组分表达盒结合的核酸表达盒编码的核酸酶的表达和分泌将导致必需载体组分DNA的降解，从而导致载体组分表达减少、产生的病毒载体滴度降低和/或对病毒载体生产细胞的毒性。
然而，为了改善病毒载体生产过程的生产，发明人提供了本文公开的发明：病毒载体生产系统和生产病毒载体的方法，其在治疗性病毒载体生产期间在病毒载体生产细胞(生产细胞核/或核酸酶辅助细胞)中表达和分泌核酸酶。与目前商业化的核酸酶技术相比，本发明提供了更有效(和更具成本效益)的病毒载体生产系统/方法。而且，与常规载体生产技术相比，本发明通过简化核酸酶的分泌以简化病毒载体生产过程中不需要的或污染的残留核酸的降解，从而提供了以简化方式生产病毒载体，而不影响病毒滴度和/或导致对病毒载体生产细胞的毒性。发明人发现，对于慢病毒载体的生产，在生产的上游阶段应用分泌的核酸酶能够导致在粗收获物质中残留DNA的这种有效降解，从而使得在下游过程中不需要进一步的核酸酶处理。重要的是，与标准商业化核酸酶相比，当使用分泌型核酸酶时，可以大大降低纯化/浓缩的慢病毒载体材料中的残留DNA水平，这在基因治疗领域中具有重要意义，因为对调节剂产品质量/安全性的要求不断提高。
因此，本文公开的是经工程化改造以分泌核酸酶的病毒载体生产系统。
在一个实施方式中，病毒载体生产系统包含病毒生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
在另一个实施方式中，病毒载体生产系统包含1)病毒载体生产细胞，其包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，其包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
而且，本文公开了生产病毒载体的方法，所述方法包括在病毒载体生产期间表达和分泌核酸酶。特别地，此类生产病毒载体的方法包括下述步骤：使用编码下述的核酸序列转染(有时称为接触)病毒生产细胞：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
另外，本文公开了一种共培养的方法，所述方法包括使表达载体组分的病毒载体生产细胞与表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触。在一个进一步的实施方式中，使来自辅助细胞的液体进料与表达载体组分的病毒载体生产细胞接触。
在本文公开的本发明的另一个实施方式中，是一种生产病毒载体的改进方法，改进包括将核酸序列引入病毒载体生产细胞，其中所述核酸序列编码：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
本文还公开了一种生产病毒载体的改进方法，改进包括在共培养物中使包含病毒载体组分的病毒载体生产细胞与表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
在本文公开的病毒载体生产系统或方法的另一个实施方式中，细胞培养物保持在6.5至7.2的pH范围内。
在本文公开的病毒载体生产系统或方法的另一个实施方式中，所述核酸酶是糖非特异性核酸酶。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在主病毒载体生产容器中达到的核酸酶活性是至少约1
Figure BDA0002680207430000061
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在主病毒载体生产容器中达到的核酸酶活性是至少约10
Figure BDA0002680207430000062
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在主病毒载体生产容器中达到的核酸酶活性是至少约50
Figure BDA0002680207430000071
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在主病毒载体生产容器中达到的核酸酶活性是至少约100
Figure BDA0002680207430000072
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约10
Figure BDA0002680207430000073
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约50
Figure BDA0002680207430000074
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约100
Figure BDA0002680207430000075
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约1000
Figure BDA0002680207430000076
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约1500
Figure BDA0002680207430000077
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在本文公开的本发明病毒载体生产系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，在接种到主病毒载体生产容器之前，在核酸酶辅助细胞培养物中达到的核酸酶活性是至少约2000
Figure BDA0002680207430000081
单位等效物/mL，优选地其中所述核酸酶活性可通过本文提供的测定1所示的DNAse AlertTM测定确定。
在病毒载体生产系统或方法的另一个实施方式中，核酸酶选自下组：SmNucA、VsEndA、VcEndA和BacNucB。
在一个进一步的实施方式中，核酸酶是SEQ ID NO:1所示的霍乱弧菌核酸内切酶I或与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸同一性的变体。
在又一个进一步的实施方式中，核酸酶变体是SEQ ID NO:5-11的任一项所示的VcEndA变体。
在一个进一步的实施方式中，核酸酶包含盐活性核酸酶。
在一个进一步的实施方式中，盐活性核酸酶是SEQ ID NO:2所示的杀鲑弧菌核酸内切酶I或与SEQ ID NO:2具有至少90％氨基酸同一性的变体。
在一个进一步的实施方式中，核酸酶包含SEQ ID NO:3所示的粘质沙雷氏菌核酸酶A或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的变体。
在一个进一步的实施方式中，核酸酶包含SEQ ID NO:3所示的芽孢杆菌BacNucB或与SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸同一性的变体。
在另一个实施方式中，核酸酶包含N末端分泌信号。
在本文公开的本发明的另一个实施方式中，编码核酸酶的所述核酸序列是经优化以除去潜在的剪接位点和/或不稳定元件的序列。
在另一个实施方式中，编码核酸酶的所述核酸序列进行密码子优化以在生产细胞中表达。
在一个进一步的实施方式中，所述生产系统和/或方法还包括一种或多种另外的核酸酶。
在一个进一步的实施方式中，所述生产系统和/或方法包括两种或更多种核酸酶或核酸酶结构域的融合蛋白。
在一个甚至进一步的实施方式中，所述融合蛋白包含核酸内切酶和核酸外切酶。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约5升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约10升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约15升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约20升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约25升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约30升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约35升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约40升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约45升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约50升(L)培养基的体积。
在系统或方法的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约60升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约70升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约80升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约90升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约100升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约200升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含至少约500升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含可达或至少约1000升(L)培养基的体积。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞是贴壁的。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞是悬浮的。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞在悬液中贴壁。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物包含血清。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述细胞培养物是无血清的。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，宿主细胞是哺乳动物宿主细胞。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，宿主细胞是人宿主细胞。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，人宿主细胞是HEK293细胞或其衍生物。HEK293衍生物的实例包括HEK293S、HEK293SG、HEK293SGGD、HEK293FTM和HEK293T。也可以将这些衍生物称为HEK293的变体。
在本发明的系统或方法或其他方面的一个实施方式中，所述HEK293细胞是HEK293T细胞。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述病毒载体组分包含目标核苷酸(NOI)。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述病毒载体组分是逆转录病毒载体组分。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述逆转录病毒载体组分是慢病毒载体组分。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述病毒载体组分包含i)gag-pol；ii)env；iii)任选地，逆转录病毒载体的RNA基因组；和iv)任选地，rev或其功能性替代品。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，其中编码所述病毒载体组分的至少两个所述核酸序列位于同一遗传基因座。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，编码所述病毒载体组分的至少两个所述核酸序列在反相和/或交替方向。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，编码gag-pol和/或env的至少两个所述核酸序列是与至少一个调节元件结合的。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述env是VSV-G env。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述病毒载体是腺病毒载体。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述病毒载体是腺相关病毒载体。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述核酸酶从瞬时转染后的细胞表达和分泌。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述核酸酶在细胞稳定整合后从所述细胞表达和分泌。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述核酸酶的表达是可诱导的或条件性的，并且其中编码核酸酶的核酸包含可诱导的或条件性的启动子或调控元件。
在本发明的系统或方法或其他方面的另一个实施方式中，所述核酸酶是核酸外切酶。
在一个另外的实施方式中，本文公开的发明提供了一种用于生产病毒载体的瞬时或稳定生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留DNA。
在另一个实施方式中，本文公开的发明提供了一种用于生产病毒载体的瞬时或稳定生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶融合蛋白，其中所述核酸酶融合蛋白包含与核酸内切酶结构域融合的核酸外切酶结构域，并且其中所述核酸酶融合蛋白在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
在另一个实施方式中，本文公开的发明提供了一种细胞培养装置(如生物反应器)，其包含表达和分泌核酸酶的病毒载体生产细胞。
此外，本文公开了一种在病毒载体生产期间能够降解残留核酸的分泌型核酸酶变体，所述变体包含SEQ ID NOS:5-11中任一项所述的氨基酸序列。特别地，所述变体包含SEQID NO:7、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。
本文还公开了一种具有增加的细胞保留和/或细胞结合的修饰的核酸酶，所述核酸酶通过真核细胞的分泌途径表达，所述修饰的核酸酶在其C末端包含保留信号。
在另一个实施方式中，所述修饰的核酸酶位于内质网(ER)和/或高尔基体室，从而导致与相应的未修饰核酸酶的细胞保留相比具有增加的细胞保留。在一个另外的实施方式中，所述修饰的核酸酶与ER保留缺陷互补基团的ER受体结合。
在另一个实施方式中，所述保留信号在其共有序列[KRHQSA]-[DENQ]-E-L或KKXX的C末端，和在一个进一步的实施方式中，所述保留信号在其共有序列KDEL的C末端。
在其他实施方式中，真核细胞表达所述修饰的核酸酶，和病毒载体生产系统包含表达所述修饰的核酸酶的所述细胞。
附图说明
图1A-1B示出了本文公开的本发明的两个概念，其显示了在病毒载体生产系统生产期间从真核细胞中分泌核酸酶。在这些概念中，表达分泌型核酸酶的细胞可以是使用核酸酶表达盒瞬时转染的，或者可以是稳定整合至细胞的基因组中且任选地可以是可诱导的。在任一概念中，病毒载体生产的模式可以是贴壁细胞培养或悬浮细胞培养。图1A显示了使用能够表达分泌型核酸酶的核酸酶辅助细胞加标的病毒载体生产细胞培养物。图1B显示了病毒载体生产系统，其中生产细胞本身能够表达分泌型核酸酶，而不需要使用核酸酶辅助细胞。
图2示出了在用于本文公开的发明中使用的生产细胞中的遗传工程修饰核酸酶的工作流程逐步方法。
图3A-3D示出了用于本文公开的发明中的示意性核酸酶表达盒。图3A显示了但不限于SmNucA的示例性表达盒。图3B显示了但不限于VsEndA和VcEndA的示例性表达盒。图3C显示了但不限于BacNucB的示例性表达盒。图3D显示了但不限于稳定细胞发育的调控性分泌型核酸酶表达盒的示例性表达盒。
图4A-4C显示了HEK293T细胞中核酸酶的转染后表达和分泌与培养基中DNA减少相关。图4A显示了针对抗组氨酸标记的smNucAH6进行免疫印迹的转染细胞裂解物。图4B显示了使用抗组氨酸标记的SmNucAH6探测的转染细胞培养基的免疫斑点印迹。图4C显示了培养基中的残留DNA分析。
图5显示了在粘附或悬浮HEK293T细胞培养物中瞬时慢病毒载体的产生，所述细胞培养物包含来自表达盒的分泌型标记和未标记核酸酶(SmNucA)对比
Figure BDA0002680207430000131
和未经处理的载体收获物。
图6显示了使用具有和不具有天然信号肽的SmNucA表达盒的在贴壁HEK293T中的瞬时慢病毒载体生产情况，其中使用示例性真核ER信号肽替代天然信号。
图7显示了但不限于在用载体组分瞬时转染期间在贴壁HEK293T细胞培养物中产生慢病毒载体期间通过表达盒(占总输入pDNA的1％)的分泌型核酸酶(例如，VsEndA&SmNucA)的实例。
图8显示了但不限于在用核酸酶质粒瞬时转染期间通过dox诱导载体组分在贴壁HEK293T生产细胞系培养物中慢病毒载体生产期间通过表达盒(占总输入pDNA的1％)的分泌型核酸酶(例如，VsEndA&SmNucA)的实例。
图9A-9B显示了在悬浮培养的载体生产期间的分泌型核酸酶。图9A显示了但不限于在载体组分瞬时转染期间在悬浮HEK293T细胞培养物中慢病毒载体生产期间通过表达盒(占总输入pDNA的5％)的分泌型核酸酶(例如，VsEndA &SmNucA)的实例。图9B显示了通过SDS-PAGE和免疫印迹使用抗组氨酸标签抗体以检测分泌型核酸酶蛋白的浓缩载体上清液。
图10A-D显示了计算机分析，不限于用于本文公开的发明中对BacNucB的示例性修饰。图10A显示了BacNucB的一级序列和跨膜预测分析。图10B显示了BacNucB的分泌肽信号分析。图10C显示了对α-螺旋、β-链和卷曲的BacNucB区域的分析，以及被工程化为四个不同变体的新型NxS/T序列子的位置。图10D显示了具有四个NxS/T序列子变体位置的BacNucB一级序列的分析，以及其作为N-聚糖位点的预测用途。
图11A-11B显示了通过工程化改造的BacNucB提供了慢病毒载体生产细胞培养物中残留质粒DNA的清除率。图11A显示了在通过瞬时转染的慢病毒载体生产期间在悬浮、无血清HEK293T细胞中BacNucB变体表达质粒(占总pDNA的5％)的用途，以减少pDNA同时保持较高的载体滴度。图11B显示了通过SDS-PAGE和免疫印迹使用抗组氨酸标签抗体以检测分泌型核酸酶蛋白的浓缩载体上清液。
图12A-12C显示了通过使用含有突变的NxS/T序列子的工程化变体“VcEndA-1glc”，在慢病毒载体生产细胞培养物中提高残留质粒DNA的清除率。图12A显示了在通过瞬时转染的慢病毒载体生产期间在悬浮、无血清HEK293T细胞中的VcEndA变体表达质粒(占总pDNA的5％)，同时保持较高的载体滴度。图12B显示了通过琼脂糖电泳从载体上清液中检测的残留DNA的程度。图12C显示了通过SDS-PAGE和免疫印迹使用抗组氨酸标签抗体以检测分泌型核酸酶蛋白的浓缩载体上清液或生产后细胞裂解物。
图13显示了使用来自表达盒的分泌型VsEndA以0.5L规模从慢病毒载体生产生物反应器中降解残留(质粒)DNA。
图14A-14B：图14A显示了使用来自表达盒的VsEndA以5L规模从慢病毒载体生产生物反应器中降解残留DNA，以及通过下游生产工艺的总KanR/TU。图14B显示了通过凝胶电泳(DNA的溴化乙锭染色)分析的一些工艺步骤(在A中)的浓缩样品的分析结果。
图15A-15B显示了在共转染期间使用tetR调控的VsEndA表达盒在慢病毒载体生产细胞培养物中残留DNA的降解。图15A显示了载体生产滴度仍较高。图15B显示了通过琼脂糖电泳检测的载体上清液中残留DNA的程度。
图16A-16B显示了在与表达tetR调控的VsEndA或SmNucA的核酸酶辅助细胞共培养的慢病毒载体生产细胞培养物中残留DNA的降解。图16A显示了载体生产滴度仍较高。图16B显示了通过琼脂糖电泳检测的载体上清液中残留DNA的程度。
图17A-17B总结了VcEndA的NxS/T N-聚糖序列子突变。图17A显示了VsEndA和VcEndA的蛋白比对结果，突出显示了当在真核细胞中表达时VcEndA中的NxS/T序列子(潜在的N-糖基化位点)。仅VcEndA的第一个N-糖基化序列子(位置102NCT)与VsEndA共享，这样在与VcEndA的序列子2、3和4相关的VsEndA中的等效位置的氨基酸序列为这些序列子的突变提供了有用的指导。因此，产生了VcEndA的变体(在图17B中显示；[构建体9、19-25])，其含有包含119NLT>NLV、和/或130NRS>DRS和/或133NFS>NFR的修饰的组合，得到SEQ ID NO:1、5-11。
图18A-18B显示了在生产后细胞裂解物中和在无血清、悬浮模式LV生产培养物的培养基中VcEndAH6变体相对于SmNucAH6和VsEndAH6的表达。图18A显示了针对微管蛋白(上样对照)和抗-His6(核酸酶)检测的LV生产后细胞裂解物的免疫印迹。图18B显示了针对VSVG(分泌对照)和抗-His6(核酸酶)检测的浓缩粗载体收获物的免疫印迹。核酸酶的分子量受N-聚糖状态调节(通常添加～2.5kDa的单个聚糖)；未经修饰的核酸酶尺寸为：VcEndAH6-27.6kDa；VsEndAH6-27.9kDa；SmNucAH6-29.7kDa。转染时，以占总质粒DNA的0.5％或5％加入分泌型核酸酶质粒。VcEndAH6变体如图17以及SEQ ID NO:1、5-11中所示。
图19A-19B显示了在图17和18中所述的分泌型核酸酶存在的条件下产生的LV-CMV-GFP载体滴度，以及对粗载体收获物中残留DNA的最终影响。在收获LV时，通过离心除去生产细胞，并过滤上清液(0.22μm)，然后通过转导HEK293T细胞并随后进行流式细胞术进行滴定；相应地计算LV滴度(图19A)。进一步地，使用3K截止值的Amicon-15装置通过离心浓缩上清液，并将50％这种材料上样到2％琼脂糖凝胶上进行残留DNA电泳(图19B；溴化乙锭染色的凝胶)。数据表明，LV滴度受分泌型核酸酶的影响最小，对VcEndA N-聚糖序列子的工程化改造可改善核酸酶的分泌，并增强残留DNA清除率。
图20A-20B显示了在酸性或碱性培养条件下在无血清、悬浮培养物中生产LV时，在评价VcEndAH6-1glc、VsEndAH6和SmNucAH6期间，已确认的pH设定点(图20A)和细胞活力(图20B)。
图21A-21B显示了在酸性或碱性培养条件下在生产后细胞裂解物中和在无血清、悬浮模式LV生产培养物的培养基中VcEndAH6-1glc、SmNucAH6和VsEndAH6的表达。图21A显示了针对微管蛋白(上样对照)和抗-His6(核酸酶)检测的LV生产后细胞裂解物的免疫印迹。图21B显示了针对VSVG(分泌对照)和抗-His6(核酸酶)检测的浓缩粗载体收获物的免疫印迹。核酸酶的分子量受N-聚糖状态调节(通常添加～2.5kDa的单个聚糖)；未经修饰的核酸酶尺寸为：VcEndAH6-27.6kDa；VsEndAH6-27.9kDa；SmNucAH6-29.7kDa。转染时，以占总质粒DNA的5％加入分泌型核酸酶质粒。
图22A-22B显示了在分泌型核酸酶VcEndAH6-1glc、SmNucAH6和VsEndAH6存在的条件下产生的LV-CMV-GFP载体滴度，以及对粗载体收获物中残留DNA的最终影响。在收获LV时，通过离心除去生产细胞，并过滤上清液(0.22μm)，然后通过转导HEK293T细胞并随后进行流式细胞术进行滴定；相应地计算LV滴度(图22A)。进一步地，使用3K截止值的Amicon-15装置通过离心浓缩上清液，并将50％这种材料上样到2％琼脂糖凝胶上进行残留DNA电泳(图19B；溴化乙锭染色的凝胶)。数据表明，与VsEndAH6相比，在酸性条件下，VcEndAH6-1glc变体显示出改善的残留DNA清除率，同时保持较高滴度的LV生产。
图23A-23B显示了在酸性或碱性培养条件下在无血清、悬浮培养物中生产LV时，在评价VcEndAH6-124glc、VcEndAH6-1glc和VsEndAH6期间，已确认的pH设定点(图23A)和细胞活力(图23B)。有趣的是，这些数据表明了在LV生产后期基于VcEndAH6的核酸酶表达对细胞活力的潜在获益(也在图20中观察到)。
图24A-24B显示了在分泌型核酸酶VcEndAH6-124glc、VcEndAH6-1glc和VsEndAH6存在的条件下产生的LV-CMV-GFP载体滴度，以及对粗载体收获物中残留DNA的最终影响。在收获LV时，通过离心除去生产细胞，并过滤上清液(0.22μm)，然后通过转导HEK293T细胞并随后进行流式细胞术进行滴定；相应地计算LV滴度(图24A)。进一步地，使用3K截止值的Amicon-15装置通过离心浓缩上清液，并将50％这种材料上样到2％琼脂糖凝胶上进行残留DNA电泳(图24B；溴化乙锭染色的凝胶)。数据表明，与VsEndAH6相比，在酸性条件下，VcEndAH6-124glc和VcEndAH6-1glc变体显示出改善的残留DNA清除率，同时保持较高滴度的LV生产。
图25显示了表明如何能够修饰核酸酶以便在细胞内保留更多的用于生产与细胞相关的病毒载体(如AAV和AdV)的核酸酶的示意图。对于本发明的一些实施方式，应通过使用在蛋白N-末端编码的功能性ER信号肽(SP)，将一些(优选全部)的核酸酶靶向于分泌途径，所述核酸酶被信号肽酶(SPase)切割，以使其释放到ER内腔中。然而，任选地通过在核酸酶的C末端附加ER保留信号，如序列“KDEL”(从N到C读取)，修饰的核酸酶将与“ER保留缺陷型[ERD]互补基团”蛋白受体之一结合，从而将允许在载体生产细胞内保留更多的核酸酶。对于与细胞相关的病毒载体(如AAV和AdV)的生产，其允许在细胞裂解之前将生产细胞从培养基中分离出来(即，过滤、沉淀或离心)，同时使核酸酶与细胞一起保留在细胞中，并在细胞裂解时存在以降解生产细胞DNA。
图26A-26B显示了在悬浮、无血清HEK293T细胞中的scAAV2-GFP载体生产期间使用分泌型和ER保留型核酸酶的数据。通过使用基因组、Repcap2和辅助质粒转染细胞建立复制型scAAV2载体生产培养物，以及上述质粒占所示核酸酶质粒的5％(总输入pDNA)或无核酸酶(pBlueScript；AAV-NEG)。任选地，使用C末端ER保留信号(KDEL；见图25)对核酸酶vcEndAH6[wt]和vcEndAH6-1glc进行工程化改造，并与smNucAH6比较。转染后两天，通过离心收集细胞并进行裂解。向裂解物中加入氯化镁并孵育1小时；对于阳性对照，将SAN添加到AAV-NEG裂解物中并平行地孵育。通过离心沉淀碎片，过滤上清液并直接在HEK293T细胞上分析载体滴度[图26A]，或上样到琼脂糖凝胶上以评估残留DNA的降解[图26B]。不希望受到理论的束缚，“AAV-NEG”样品泳道中的残留DNA水平可能低于未处理细胞裂解物中实际存在的残留DNA水平，因为在样品过滤过程中会损失很多释放的DNA，由于粘度而难以进行过滤。因而，尽管与其他核酸酶变体相比，vcEndAH6[wt]变体对残留DNA的影响较小，但实际上其可能具有很强活性。
图27显示了图26B中所示的残留DNA琼脂糖凝胶图像的光密度分析。使用ImageLab，将凝胶图像分成多个通道，以使得每个样品泳道被2-3个通道覆盖。给出了用于给定样品泳道的代表性通道，该通道显示了与空泳道(背景)相比的相对条带强度(任意单位)。所得条带的“图谱”显示了在凝胶孔中和样品泳道中的残留DNA。从图26B的凝胶图像中可以看出，可见较短的DNAse抗性形式，并且可以在泳道图谱中观察到相关峰。与其他变体和SAN相比，vcEndAH6-1glc-KDEL变体能够达到更高的残留DNA清除率。
图28A-28B显示了转染优化实验的结果，以鉴定在核酸酶辅助细胞培养物中达到接近最大核酸酶表达水平的条件。通过将lipofectamine 2000CD(在每种条件下质粒DNA与质量的比例相同)与编码质粒的核酸酶以100、300、500、700或900ng/mL最终转染细胞培养物混合来介导无血清、悬浮HEK293T细胞的转染。使用由强CMV或弱SV40启动子驱动的VcEndAH6-1glc或SmNucAH6表达质粒。作为比较，也将重复的培养物与每种核酸酶质粒共转染(总质粒输入占5％和pBluescript输入占95％)，以模拟当共转染细胞以用于病毒载体生产时(即，在同一细胞中制备核酸酶和载体)转染混合物的类型；62ng核酸酶质粒/mL是有效的。转染后约20小时，通过丁酸钠(终浓度10mM)诱导重复的转染，以模拟在病毒载体生产培养物中的条件。转染两天后，过滤辅助细胞培养物上清液(0.2μm)，并通过3K截止值离心柱浓缩，并产生细胞裂解物，随后进行针对核酸酶(抗-His标签)和GAPDH(仅系列裂解物)的免疫印迹。[A]在所有条件下绘制标准化的免疫印迹条带强度。[B]在辅助细胞培养物中分泌型核酸酶蛋白的免疫印迹。
图29A-29C显示了在40mL摇瓶规模的无血清、悬浮HEK293T培养物中使用通过瞬时转染产生的核酸酶辅助细胞与主载体生产培养物平行进行的慢病毒载体(LV-CMV-GFP)生产的结果。在此前实施例使用的条件下，通过使用750ng(每mL最终培养物)pSV40-VcEndAH6-1glc or pSV40-SmNucAH6转染HEK293T细胞以及平行地使用载体组分转染HEK293T细胞产生核酸酶辅助细胞。在转染约20小时后，对培养物进行计数并向主载体生产容器中添加辅助细胞，以在主载体生产容器中达到总细胞所需的目标百分百比比例。在该实例中，辅助细胞的比例为总细胞的1％至10％。同时加入丁酸钠至终浓度为10mM。转染后两天，收获载体上清液，澄清(0.2μm)并进行进一步分析。[A]通过转导贴壁的HEK293T细胞，随后在转导后两天进行FACS，滴定载体上清液。[B]通过3K截止值离心柱浓缩辅助细胞和载体上清液，并对核酸酶表达进行分析(抗-His标签)，或者在琼脂糖凝胶上进行残留DNA分析(溴化乙锭；仅载体上清液)[C]。
图30A-30B显示了当使用核酸酶辅助细胞清除残留DNA时，在无血清、悬浮HEK293T细胞中慢病毒载体(LV-CMV-GFP)产生情况的分析。与主载体生产培养平行，使用pCMV-VcEndAH6-1glc以750ng/mL培养基转染无血清、混悬HEK293T细胞。在丁酸钠诱导时，将核酸酶辅助细胞以指定比例(占总细胞的百分比)接种到主载体生产容器中。标准载体生产一直持续到转染后两天，然后将载体上清液在贴壁HEK293T细胞上通过FACS滴定[A]，还通过3K截止值离心柱浓缩以进行琼脂糖凝胶分析(溴化乙锭)[B]。
图31A-31B显示了当掺入核酸酶辅助细胞时，在慢病毒载体生产培养基中可达到的核酸酶分泌水平与特定核酸酶活性之间的相关性；载体制剂的生产与图30相同。通过DNAse Alert测定，使用
Figure BDA0002680207430000181
作为标准曲线，针对核酸酶活性对培养上清液进行分析[A]。通过对核酸酶(抗-His标签)的免疫印迹分析了实验中浓缩的培养上清液[B]。
图32A-32B显示了在5L生物反应器规模，使用VcEndAH6-1glc共转染，在无血清、悬浮HEK293T培养物中慢病毒载体(LV-CMV-GFP)生产的结果。将pSV40-VcEndAH6-1glc与LV组分质粒以5％总输入混合，使用pBlueScript以5％总输入转染“标准”对照生物反应器。如实施例21中所述进行载体的制备，将转染后的pH保持在6.7[A]。在整个下游工艺中采集约2.5L澄清的收获物，并在每个所述阶段进行采样：In-bio(使用MgCl2+/-
Figure BDA0002680207430000191
孵育1小时之前)、CLH(澄清收获物；使用MgCl2+/-
Figure BDA0002680207430000192
处理后)、IEX洗脱液(从IEX柱洗脱物质[稀释至0.6M NaCl])、HFF前(在添加
Figure BDA0002680207430000193
之前，使用中空纤维滤芯通过渗滤/超滤进行缓冲液交换的IEX洗脱液)、HFF后(
Figure BDA0002680207430000194
处理后，缓冲液交换)。通过3K截止值离心柱浓缩样品，然后上样至2％含溴化乙锭的琼脂糖凝胶上[B]。
图33显示了使用用pSV40-VcEndAH6-1glc、pSV40-VcEndAH6-1glc-KDEL转染的无血清、悬浮HEK293T细胞或未转染细胞的细胞裂解物上样的染色SDS-PAGE凝胶。与VcEndAH6-1glc相比，VcEndAH6-1glc-KDEL在细胞提取物中富集。
具体实施方式
除非另有说明，否则本文公开的本发明的实施将使用化学、分子生物学、微生物学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在文献中解释。参见，例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第二版，1-3册，冷泉港实验室出版社；Ausubel,F.M.等(1995年，定期增印)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,New York,NY；B.Roe,J.Crabtree和A.Kahn(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee(1990)In SituHybridization:Principles and Practice；牛津大学出版社；M.J.Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL出版社；和D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg(1992)Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis andPhysical Analysis of DNA Methods in Enzymology，科学出版社。这些文献的全部内容通过引用并入本文。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常的理解相同的含义。除非另有说明，否则“rev”和“gag-pol”指慢病毒载体的蛋白和/或基因。
分泌核酸酶的病毒载体生产系统
本文公开的发明是一种分泌核酸酶的病毒载体生产系统，其包含一组核酸序列，所述核酸序列编码生产病毒载体以及表达和分泌至少一种核酸酶所需的组分，从而在病毒载体生产期间降解不需要/污染的(即，残留的)核酸。
因此，本文公开的发明提供了一种改进的载体生产系统，该系统在病毒载体或基于病毒的疫苗生产期间通过病毒载体生产细胞表达和分泌核酸酶。结果，在生产过程中以简化的方式降解了原本与粗收获物质相关的不需要的(污染的)残留核酸(例如，pDNA)，而不是繁琐的上游和/或下游商业化核酸酶酶促处理步骤通常所需的降解方式，其有时会在某种程度上损害所生产的病毒载体的质量和数量。参见在Merten,O-W.,Schweizer,M.,Chahal,P.,&Kamen,A.A.Manufacturing of viral vectors for gene therapy:partI.Upstream processing.Pharmaceutical Bioprocessing 2,183-203(2014)；Merten,O-W.,Schweizer,M.,Chahal,P.,&Kamen,A.A.Manufacturing of viral vectors:partII.Downstream processing and safety aspects Pharmaceutical Bioprocessing 2,237-251(2014)；Gousseinov,E.,Kools,W.和Pattnaik,P.Nucleic Acid ImpurityReduction in Viral Vaccine Manufacturing.BioProcess International 12,59-68(2014)中的熟知的上游和下游工艺步骤。出于相同原因，本文公开的发明还用于提供改进的外泌体和囊泡生产系统。
编码本文公开的发明的核酸酶的核酸序列可以是核苷酸表达盒或质粒形式。此类表达盒与病毒载体组分表达盒共转染盒/或稳定整合在病毒载体生产细胞DNA(或细胞基因组)中。
在一个实施方式中，本文公开的发明的核酸序列是编码一种或多种核酸酶的表达构建体。在另一个实施方式中，核酸酶可以以这样的方式表达为融合蛋白，以使得在病毒载体生产期间分泌两种核酸酶(或核酸酶结构域)。在一个进一步的实施方式中，核酸酶融合蛋白包含核酸内切酶结构域和核酸外切酶结构域，从而在病毒载体生产期间，分泌型核酸内切酶降解环状、质粒DNA，而分泌型核酸外切酶靶向并降解5’和/或3’末端的线性DNA，以便更有效地降解包裹在组蛋白周围的DNA，否则核酸内切酶可能无法接近这些DNA。
核酸酶表达盒包含驱动所述核酸酶表达的启动子序列和/或调控元件。此类启动子可以驱动核酸酶的组成型、诱导型和/或有条件的表达。此外，核酸酶包含用于将核酸酶分泌至细胞培养物的天然和/或非天然N末端分泌信号。
在本文公开的本发明的替代实施方式中，核酸酶表达盒用于瞬时转染或稳定整合在用于与病毒载体生产细胞结合(或共培养)的核酸酶辅助细胞中。然后，在病毒载体生产过程中将此类核酸酶辅助细胞掺入病毒载体生产细胞中，并共培养直至病毒载体生产结束。
在上游病毒载体生产过程中使用本文公开的发明的培养细胞分泌核酸酶的方法具有以下优点：1)一旦产生病毒载体病毒粒子，立即在培养基中降解不需要的或污染的(残留的)核酸，2)在整个病毒生产过程中永久分泌核酸酶，而无需进行进一步的繁琐操作，3)除去使用商业化核酸酶(例如，
Figure BDA0002680207430000211
)处理病毒载体粗收获物质的步骤，4)大大减少了纯化载体产物中的残留DNA，和5)降低了下游病毒载体纯化/处理过程中添加重组核酸酶的相关成本。
本文公开的发明提供了病毒载体生产系统(在瞬时和稳定载体生产发明中)，其在贴壁和/或悬无血清细胞培养物中表达分泌型核酸酶。令人吃惊的是，考虑到在病毒载体生产期间在病毒载体病毒体组装中涉及的复杂生物学，发明人在本文中发现在病毒载体生产期间在细胞培养物中表达和分泌核酸酶克服了在上游和下游病毒生产中的很多问题，同时仍保持了较高的生产滴度。发明人在本文中还证明了从实验室规模或小规模病毒载体生产到生物反应器中病毒载体生产的可扩展性。
本文公开的发明提供了证据，表明分泌型核酸酶使粗载体收获物中残留DNA降解，其性能优于市售核酸酶，如
Figure BDA0002680207430000212
和SAN(盐活性核酸酶)。本文公开的发明表明，在病毒载体生产期间，差异很大的核酸酶(例如，衍生自革兰氏阴性和阳性细菌)降解了残留DNA。因为本文显示了附加核酸酶的C末端组氨酸标签不影响核酸酶分泌的功能，所以基于抗组氨酸标签的ELISA用于测量最终病毒载体制剂中的残留核酸酶。
重要的是，本文公开的发明提供了核酸酶分泌的时机与来自共转染的病毒载体组分表达盒的基因表达在时间上相关的证据。以这种方式，核酸酶表达在所需残留质粒DNA降解的最早时间点开始。而且，在另一个实施方式中，核酸酶的诱导型表达允许本文公开的病毒载体生产系统中核酸酶表达的时间控制。
在本发明的一个方面中，用病毒载体表达盒和诱导型核酸酶表达盒转染病毒载体生产细胞系，如基于四环素的方法，其允许在病毒载体生产期间添加诱导剂后核酸酶稳定分泌至细胞培养基中。
在本发明的另一个方面中，将核酸酶表达盒引入稳定表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞中。以这种方式，取决于选择的调控元件，核酸酶的稳定分泌可以是组成型分泌或诱导型分泌至细胞培养基中。在某些载体组分也被调控的方面中，核酸酶表达盒可以在相同或单独的病毒载体组分调控元件的控制下，后者分别在时间上控制核酸酶和载体组分。
在本发明的另一个方面中，核酸酶表达盒在逆转录病毒或慢病毒载体生产系统中表达和分泌核酸酶，以便在载体生产期间降解残留的核酸。
在涉及在延迟背景下调控核酸酶表达的替代方面中，代替或除了使用转录调节控制元件以调控核酸酶表达以外，将HIV-1 rev或类似逆转录病毒RNA输出蛋白用于调节核酸酶分泌。以这种方式，编码核酸酶的mRNA包含HIV-1 rev-应答元件(RRE，其与HIV-1 rev结合)或类似逆转录病毒RNA输出蛋白应答元件。核酸酶ORF和RRE置于表达盒的同一内含子中，因此，在缺乏HIV-1 rev(或类似逆转录病毒RNA输出蛋白)的条件下，与存在rev的条件下核酸酶的量相比，在胞质中编码核酸酶的mRNA的量减少。在载体生产期间的所需时间点，HIV-1 rev或类似逆转录病毒RNA输出蛋白共表达，以增加核酸酶的表达。
本文公开了可以在病毒载体生产上游工艺期间引入核酸酶辅助细胞以与病毒载体生产细胞共培养的证据。在这方面，核酸酶是平行提供的。
在本发明的另一个方面中，可以将核酸酶辅助细胞或辅助细胞与病毒载体生产培养物平行培养，然后将包含分泌型核酸酶的培养基加入病毒载体生产细胞培养物中。
在另一个方面中，可以将核酸酶辅助细胞或辅助细胞与外泌体生产培养物平行培养，然后将包含分泌型核酸酶的培养基加入外泌体生产细胞培养物中。
在另一个方面中，可以将核酸酶辅助细胞或辅助细胞与囊泡生产培养物平行培养，然后将包含分泌型核酸酶的培养基加入外泌体囊泡细胞培养物中。
在本文公开的发明的另一个方面中，核酸酶表达盒在AAV或腺病毒载体生产系统中表达和分泌核酸酶，以便在载体生产期间降解残留的核酸。
通常，在哺乳动物细胞系(例如，基于HEK293的)或通过使用杆状病毒/Sf9昆虫细胞系统生产基于AAv的载体。AAV载体可以通过瞬时转染编码DNA的载体组分(通常与来自腺病毒或单纯疱疹病毒(HSV)的辅助功能一起)，或通过使用稳定表达AAV载体组分的细胞系生产。腺病毒载体通常在稳定表达腺病毒E1功能的哺乳动物细胞系(例如，基于HEK293的)中生产。腺病毒载体通常还使用生产细胞系通过连续轮次的“感染”通过依赖于辅助功能的复制来“扩增”。对于本文公开的发明，AAV载体和腺病毒载体生产的共同特征是细胞裂解步骤，以便更有效地释放与细胞相关的载体病毒体。一些方法(如冻融)允许在收获培养基中进行细胞裂解，而在更大规模上，在通过冻融或者机械或化学处理进行细胞裂解前浓缩生产细胞(例如，通过离心或过滤)可能是所需要的。在细胞裂解步骤中，粗载体通常会被生产细胞DNA严重污染，并且通常在细胞裂解之前和/或之后立即使用商业来源的重组核酸酶蛋白(如
Figure BDA0002680207430000231
或SAN-HQ)，以最小化DNA的量；这降低了粘度并有利于后续的下游处理。
因此，本文公开的发明包括但不限于在AAV和腺病毒载体生产系统和生产工艺中使用分泌型核酸酶代替商业核酸酶。在这种系统和工艺中，分泌型核酸酶作为“稳态”蛋白混合物存在于培养基(如果在培养基中发生细胞裂解)中和/或载体生产细胞中，因为核酸酶作为成熟的核酸酶连续表达并分泌至ER-高尔基体网络中。如果将细胞从培养基中浓缩出来，但在细胞裂解后释放，则存在存在于生产细胞中的核酸酶，因此其可以接触到污染(或残留)DNA。或者，可以将包含分泌型核酸酶以及“游离”载体病毒体的澄清培养物上清液“加回”到细胞裂解物原料中，以便在进一步进行下游处理之前引起DNA裂解。在本发明的一个方面中，在需要细胞裂解的这种基于AAV或腺病毒的载体(或实际上任何病毒载体平台，其中载体病毒体仍主要与细胞结合)生产中的核酸分泌可以利用包含可诱导的、稳定的核酸酶表达盒的真核细胞系。在另一个方面中，当在转染细胞内(例如，
Figure BDA0002680207430000232
系统)进行重组时，可以通过核酸酶质粒(与其他载体组分一起)瞬时转染，以用于AAV载体生产或腺病毒载体主种子库的生产，实现核酸酶分泌。
核酸酶
核酸酶的结构和功能在本领域中是众所周知的(Yang,Q.Rev.Biophys.2011 Feb；44(1)L1-93)。核酸酶是水解核酸-DNA和RNA的一种普遍存在的酶。这些酶介导多核苷酸骨架内磷酸二酯键的水解，导致切割。很多核酸酶需要金属离子才能发挥最大活性。可以根据其脱落攻击模式将核酸酶分为两大类：[1]核酸内切酶和[2]核酸外切酶。
核酸内切酶攻击多核苷酸链内(内部/“内”)的磷酸二酯键；一些核酸内切酶是非特异性的，这意味着其在任何核苷酸之间切割，而其他核酸内切酶可能在特定的二核苷酸处具有位点偏好。
核酸外切酶从多核苷酸链5’或3’末端存在的核酸末端消化。一些核酸酶(例如，核酸酶Bal-31)可以同时具有内切和外切核酸酶性质，能够从末端和多核苷酸内消化DNA，具体取决于靶点的性质(即，靶点是dsDNA或ssDNA)。
由于不需要靶多核苷酸具有游离5’或3’末端，因而核酸内切酶能够消化环状DNA(如质粒DNA)。这样，本文公开的发明的核酸酶是来自“糖非特异性”核酸酶的核酸酶，因为这些酶能够以不依赖于序列的方式非特异性地降解ssDNA、dsDNA、ssRNA和/或dsRNA。该组包括“沙雷氏菌属”家族核酸酶，其中包括细菌核酸酶(NucA)和真核线粒体核酸内切酶G(Endo G)，其在酵母中也称为Nuc1p。沙雷氏菌属核酸酶在结构上非常相似；催化性ββα基序形成一个结构性子结构域，并堆积在六链反平行β-片层的一个面上。“糖非特异性”核酸酶还包括细菌周质核酸内切酶I核酸酶家族(例如，VsEndA)。
从真核或原核细胞分泌的核酸酶共有相似的分泌途径，这些途径受与经典分泌途径的所有分泌蛋白的相似特征支配。位于核糖体的成熟前核酸酶蛋白N末端相对较短的肽(通常少于30个残基)被细胞机制识别，并从胞质/胞质溶胶分别重新定位到内质网(ER)的膜或者真核生物或原核生物的质膜上，其中翻译继续通过该膜进入独立的细胞室。蛋白翻译后，分泌肽在蛋白折叠完成的位置被切割，成熟的核酸酶包含在ER(真核生物)或周质(原核生物)中。然后，核酸酶通常将释放到胞外空间中。
本文公开的发明包括但不限于能够在病毒载体生产中分泌的野生型和经修饰的或突变的(即，变体)核酸酶的用途。此类核酸酶可任选地包含真核分泌信号以替代细菌或天然分泌肽。示例性分泌信号肽包括但不限于下表中列出的那些：
Figure BDA0002680207430000241
Figure BDA0002680207430000251
用于本文公开的发明的核酸酶可以包含与N-聚糖序列子的功能破坏相关的修饰和/或突变或形成新的N-聚糖序列子位点。能够通过经典分泌途径从真核细胞中有效分泌的具有核酸酶活性的蛋白的分泌必须存在以开放阅读框架(ORF)作为起始编码的功能性分泌信号肽，并且通常分泌型蛋白将包含至少一个天冬酰胺链接的(N-连接的)聚糖，从而使分泌更加有效。糖基化发生在通过真核细胞中发现的分泌途径输出的NxS或NxT序列子(其中x可以是除脯氨酸以外的任何氨基酸)的天冬酰胺残基上，细菌的分泌型核酸酶不以这种方式糖基化。然而，由于NxS/T基于也经常出现在细菌核酸酶中，因而根据本文公开的发明，如果从真核细胞表达细菌核酸酶，则原则上可以利用这些位点。N-聚糖位点预测程序(如NetNGlyc)能够有助于鉴定哪个NxS/T位点最有可能被利用。另外，可以确定N-聚糖与DNAse活性位点的接近程度以及对DNA活性的任何影响。实际上，发明人发现，可以对核酸酶进行突变，以调节或修饰NxS/T序列子，从而在如本文公开的病毒载体生产系统背景下和/或每个生产细胞中改善分泌。
本文公开的发明的核酸酶可以包括使用保留信号(如ER保留信号)附加在核酸酶C末端的修饰，其通过将核酸酶定位于ER和/或高尔基体室来改善细胞保留或细胞结合。以这种方式，核酸酶与ER保留缺陷互补基团的ER受体结合。这种修饰改善了在载体生产期间(特别是在AAV载体生产期间)从细胞裂解物中残留DNA的清除率。保留信号包括但不限于共有序列[KRHQSA]-[DENQ]-E-L或KKXX的保留信号，和/或共有序列KDEL的保留信号。具有KDEL基序的C末端保留信号是本领域公知的(例如，Raykhel等，J.Cell.Biol.,2007Dec 7,179(6):1193-1204)。
用于实现细胞保留/结合的本发明核酸酶的替代修饰包括但不限于在核酸酶的C末端使用GPI锚定或跨膜结构域。这样，在替代实施方式中，修饰的核酸酶在其C末端包含GPI锚定和/或跨膜结构域。
本文公开的发明的核酸酶非限制性地是对于病毒载体生产系统的功能而言具有最佳pH或pH范围的核酸酶。本发明的分泌型核酸酶在最佳pH或最佳pH范围内起作用，以在病毒载体生产期间降解残留核酸。本文公开的发明的分泌型核酸酶的最佳pH是但不限于约pH6、约pH6.5、约pH6.6、约pH6.8、约pH7、约pH7.2、约pH7.5。本发明的分泌型核酸酶的最佳pH范围是但不限于约pH6-约pH7、约pH6-约pH6.5、约pH6-约pH7.2、约pH6.5-约pH7.2、约pH6.5-约pH7.5、约pH6.5-约pH7、约pH6.5-约pH6.8、约pH6.6-约pH7.2、约pH6.6-约pH7.5、约pH6.6-约pH7.2、约pH6.6-约pH7、约pH6.6-约pH6.8、约pH6.8-约pH7、约pH6.8-约pH7.2、约pH7-约pH7.2、约pH7-约pH7.5、约pH7.2-约pH7.5。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于能够在病毒载体生产系统中分泌的水解核酸酶，例如但不限于，胞外核酸酶或被修饰以充当胞外核酸酶的核酸酶。
当需要从生产系统中除去尽可能多的污染(或残留)核酸(DNA和RNA)时，在生产环境中会广泛使用商业核酸酶(蛋白形式)。众所周知，如果在细胞内进行生产或在生产期间裂解细胞时，则除去核酸的要求就特别重要。结果，由于例如样品粘度增加，释放出大量污染核酸，这使得进一步的纯化过程(如过滤和/或层析)更具挑战性。
这样，本文公开的发明的核酸酶是但不限于裂解(即，降解)污染的(或不需要的)残留核酸(优选DNA，但也可能具有RNAse活性)的核酸酶，同时在病毒载体生产系统背景下显示出核酸酶的功能性和稳定性。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于能够降解病毒载体生产系统中残留核酸的原核核酸酶、真核核酸酶和/或其功能性变体或衍生物。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于能够在病毒载体生产系统中降解dsDNA、ssDNA、dsRNA和/或ssRNA的糖非特异性核酸酶和/或其功能性变体、结构域或衍生物。
本发明的核酸酶是但不限于来源于选自下组的生物体的核酸酶及其变体和及其组合：霍乱弧菌、杀鲑弧菌、粘质沙雷氏菌和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
本发明的核酸酶是但不限于来源于已知生物体的任何已知的核酸酶。(参见wang，同上)。例如，但不限于，本发明的核酸酶是来源于霍乱弧菌、杀鲑弧菌、粘质沙雷氏菌和地衣芽孢杆菌的核酸酶。此外，但不限于，本发明的核酸酶是下述列表中的任何已知的核酸酶：
食肉细菌核酸酶，例如噬菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)Bd1244，Bd1934
植物核酸酶，例如大麦(Hordeum vulgare)L小孢子核酸酶(大麦)
Snase家族核酸酶，例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)NucA
肠核酸酶，例如胰腺DNAse I
低pH活性，例如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)Rv0888(低pH核酸酶)
本文公开的发明的核酸酶是但不限于选自下组的核酸酶及其变体和及其组合：smNucA(NCBI参考序列：WP_047571650.1)、VsEndA(GenBank：CAQ78235.1)、VcEndA(NCBI参考序列：WP_000972597.1)、BacNucB(NCBI参考序列：WP_003182220.1)。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于来自霍乱弧菌的核酸内切酶I的修饰变体(本文中称为VcEndA)。野生型VcEndA的参考序列[预测真核信号肽以粗体表示，NxS/T序列子以下划线表示]在本文中以SEQ ID NO:1提供：
Figure BDA0002680207430000271
没有限制的，具有参考突变的VcEndA变体如下所示：
SEQ ID NO:5‘VcEndA-12glc’:
Figure BDA0002680207430000272
SEQ ID NO:6‘VcEndA-123glc’:
Figure BDA0002680207430000273
SEQ ID NO:7‘VcEndA-124glc’:
Figure BDA0002680207430000274
Figure BDA0002680207430000281
SEQ ID NO:8‘VcEndA-134glc’:
Figure BDA0002680207430000282
SEQ ID NO:9‘VcEndA-13glc’:
Figure BDA0002680207430000283
SEQ ID NO:10‘VcEndA-14glc’:
Figure BDA0002680207430000284
SEQ ID NO:11‘VcEndA-1glc’:
Figure BDA0002680207430000285
VcEndA是弧菌科的弧形杆状革兰氏阴性细菌。该细菌核酸酶包含以真核分泌信号肽起作用的细菌分泌信号。该核酸酶的最佳盐浓度是150-200mM，并且在广泛的pH范围内均具有活性，这使其成为分泌到病毒载体生产细胞培养基中的理想的候选胞外核酸酶。尽管当从载体生产细胞中表达时未经修饰的VcEndA具有可检测的分泌和DNAse活性，但是在本文公开的发明中从N119、N130、N133(相对于成熟前天然VcEndA的残基编号)开始缺失NxS/T基序能够改善VcEndA分泌和DNA清除。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于“盐活性”核酸酶，其通常来源于嗜盐微生物生物体。与其他核酸酶不同，盐活性核酸酶在超生理盐浓度下(例如，>0.15M[NaCl])保持活性。这样，收获后澄清的载体物质和盐活性核酸酶可以与超生理盐浓度一起孵育，以潜在地帮助与收获物质中的蛋白结合的核酸解离，使其更易于被核酸酶切割。
本文公开的发明的盐活性核酸酶是但不限于来自杀鲑弧菌的“核酸内切酶I”(在本文中称为“VsEndA”)。参见Altermark B1,Niiranen L,Willassen NP,
Figure BDA0002680207430000286
AO,MoeE.Comparative studies of endonuclease I from cold-adapted Vibrio salmonicidaand mesophilic Vibrio cholerae.FEBS J.274(1):252-63(2007)。
野生型VsEndA的参考序列(上述预测真核信号肽以粗体表示，NxS/T序列子以下划线表示)在本文中以SEQ ID NO:2提供：
核酸内切酶I[V.Salmonicida](‘VsEndA’)
Figure BDA0002680207430000291
VsEndA是弧菌科的弯曲杆状革兰氏阴性细菌。该细菌核酸酶包含以真核分泌信号肽起作用的细菌分泌信号。
本文公开的发明的核酸酶是但不限于来自粘质沙雷氏菌的“核酸酶A”(以下简称“SmNucA”)，其是肠杆菌科的杆状革兰氏阴性细菌。野生型SmNucA的参考序列(上述预测真核信号肽以粗体表示，NxS/T序列子以下划线表示)在本文中以SEQ ID NO:3提供：
核酸酶A[S.marcescens](‘SmNucA’)
Figure BDA0002680207430000292
本文公开的发明的核酸酶是但不限于来自地衣芽孢杆菌的“核酸酶B”，以下简称“BacNucB”，其是肠杆菌科的杆状革兰氏阳性细菌。野生型BacNucB的参考序列(上述预测真核信号肽以粗体表示)在本文中以SEQ ID NO:4提供：
核酸内切酶B[Bacillus sp.E.g.B.licheniformis](‘BacNucB’)
Figure BDA0002680207430000293
载体
本文公开的发明涉及病毒载体及其制备和/或生产。
载体是一种工具，其允许或促进物质从一种环境转移到另一种环境。根据本发明，并以举例的方式，在重组核酸技术中使用的一些载体使得实体，如核酸区段(例如，异源性DNA区段，如异源性cDNA区段)，转移到靶细胞中并由靶细胞表达。载体可以促进核酸/靶核苷酸(NOI)的整合以维持NOI及其在靶细胞内的表达。或者，载体可以在瞬时系统中通过NOI的表达促进载体复制。
本发明的载体是病毒载体，特别是逆转录病毒载体，其具有用于表达所属NOI的启动子和任选地NOI的调节剂。载体可以含有一个或多个选择性标记物基因(例如，新霉素抗性基因)和/或可追踪标记物基因(例如，编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因)。例如，可以使用载体感染和/或转导靶细胞。
病毒载体可以用于在体外在相容性靶细胞中表达NOI。因此，本发明提供了一种通过在体外将本发明的载体引入相容性靶细胞并在导致NOI表达的条件下使靶细胞生长而在体外制备蛋白的方法。可以通过本领域熟知的方法从靶细胞中回收蛋白和NOI。适宜的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其他真核细胞系。
载体可以是表达载体。如本文所述的表达载体包含含有能够被转录的序列的核酸区域。因此，在该定义中包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。
在一些方面中，载体可以具有“绝缘子”(阻断启动子和增强子之间相互作用的遗传序列)，并充当减少相邻基因的通读的屏障。
在一个实施方式中，绝缘子存在于一个或多个逆转录病毒核酸序列之间，以防止启动子干扰和从相邻基因的通读。如果在一个或多个逆转录病毒核酸序列之间的模块构建体中存在绝缘子，则这些绝缘基因中的每一个可以作为单独的表达单元排布。
在一个方面中，本发明提供了一种用于生产逆转录病毒载体的细胞，其包含编码下述的核酸序列：
i)gag-pol；
ii)env；
iii)任选地，逆转录病毒载体的RNA基因组；和
iv)任选地，rev或其功能性替代物，
在另一个方面中，本发明的载体包含至少两个位于相同遗传基因座的核酸序列；其中所述至少两个核酸序列出于相反的和/或交替的方向上；和其中编码gag-pol和/或env的所述核酸序列与至少一个调控元件相关。
在另一个实施方式中，逆转录病毒来源于泡沫病毒。
在另一个实施方式中，逆转录病毒载体来源于慢病毒。
在另一个实施方式中，慢病毒载体来源于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或Visna慢病毒。
逆转录和慢病毒载体
本文公开的发明的逆转录病毒可以来源于任何适宜的逆转录病毒，或者是由任何适宜的逆转录病毒衍生得到的。已经鉴定了大量不同的逆转录病毒。实例包括：小鼠白血病病毒(MLV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼小鼠白血病病毒(Mo MLV)、FBR小鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼小鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson小鼠白血病病毒(A-MLV)、禽类成髓细胞瘤病毒-29(MC29)和禽类成红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin等，(1997)“Retroviruses”,Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SMHughes,HE Varmus pp 758-763。
逆转录病毒可以广泛地分为两大类：即，“简单的”和“复杂的”。逆转录病毒甚至可以进一步分为7小类。其中的5小类代表具有致癌可能的逆转录病毒。其余的两小类是慢病毒属和泡沫病毒属。这些逆转录病毒的综述见Coffin等，1997(出处同上文)。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，如5’LTR和3’LTR，在其之间或内部具有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到靶细胞基因组中的整合位点、和编码包装组件的gag/pol和env基因-所述包装组件是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有其他特征，如HIV中的rev基因和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核输出到细胞质。
在原病毒中，这些基因两端的侧翼是称作长末端重复(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。
LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，称作U3、R和U5。U3衍生自RNA的3’末端特有的序列。R衍生自在RNA的两端重复的序列，U5衍生自RNA的5’末端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。
在本发明的典型逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去一种或多种编码复制所必须的区域的蛋白的至少一部分；例如，可以不存在gag/pol和env基因或者这些基因是功能丧失的。这使病毒载体成为复制缺陷型病毒。
慢病毒是较大一类的逆转录病毒的一部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin等(1997)“Retroviruses”Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SMHughes,HE Varmus pp 758-763。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物类和非灵长类动物类。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物慢病毒类包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血症病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科和逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(Lewis等(1992)EMBO J 11(8):3053-3058以及Lewis和Emerman(1994)J Virol 68(1):510-516)。相反，其他逆转录病毒(如MLV)不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，例如组成诸如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。
如在本文中所使用的，慢病毒载体是包含至少一种可衍生自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染或转导靶细胞以及表达NOI的生物学机制。
慢病毒载体可以衍生自灵长类慢病毒(例如，HIV-1)或非灵长类慢病毒(例如，EIAV)。
一般地，典型的逆转录病毒载体生产系统涉及从必要的病毒包装功能体中分离病毒基因组。这些载体组分通常以单独的DNA表达盒(或者被称为质粒、表达质粒、DNA构建体或表达构建体)的方式被提供给生产细胞。
载体基因组包含NOI。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、含有NOI的内部表达盒、(任选的)后转录元件(PRE)、3’-ppu和自失活(SIN)LTR。R-U5区是载体基因组RNA和目的核苷酸mRNA进行正确多腺苷酸化、以及逆转录加工所必须的。载体基因组可选的包括开放阅读框，如在WO 2003/064665中有所描述，其允许在不存在rev的条件下进行载体生产。
包装功能包括gag/pol和env基因。这些基因是生产细胞产生载体颗粒所必须的。将这些功能基因反式赋予基因组有利于产生复制缺陷型病毒。
γ逆转录病毒载体的生产系统通常是需要基因组、gag/pol和env表达构建体的3组分系统。基于HIV-1的慢病毒载体的生产系统还需要以反式提供辅助基因rev，并且对于载体基因组而言，要包括rev-应答元件(RRE)。基于EIAV的慢病毒载体如果在基因组中存在开放阅读框(ORF)的话，则不需要反式提供rev(参见WO 2003/064665)。
通常来说，在载体基因组盒内编码的“外部”启动子(其驱动载体基因组盒)和“内部”启动子(其驱动目的核苷酸盒)是强的真核或病毒启动子，就像驱动其他载体系统组分的那些启动子一样。此类启动子的实例包括CMV、EF1α、PGK、CAG、TK、SV40和泛素启动子。强“合成”启动子，如由DNA文库产生的那些启动子(例如，JeT启动子)，还可以用于驱动转录。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，这些启动子例如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5’启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、Endoglin启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
逆转录病毒载体的生产涉及利用这些DNA组分来瞬时共转染生产细胞，或者使用稳定的生产细胞系，其中所有组分稳定整合到了生产细胞基因组内(例如，Stewart HJ,Fong-Wong L,Strickland I,Chipchase D,Kelleher M,Stevenson L,Thoree V,McCarthyJ,Ralph GS,Mitrophanous KA和Radcliffe PA.(2011).Hum Gene Ther.Mar；22(3):357-69)。可替代的途径是用稳定的包装细胞(其中已经稳定的整合有包装组分)，然后根据需要在载体基因组质粒中进行瞬时转染(例如，Stewart,H.J.,M.A.Leroux-Carlucci,C.J.Sion,K.A.Mitrophanous和P.A.Radcliffe(2009).Gene Ther.Jun；16(6):805-14)。替代地，可以产生不完整的包装细胞系(仅将一个或两个包装组分稳定整合至细胞系中)，并将所产生的缺失组分的载体瞬时转染，也是可行的。生产细胞还可以表达调控蛋白，如转录调控因子的tet阻遏物(TetR)蛋白组的成员(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)、转录调控因子的cumate诱导型开关系统组的成员(例如，cumate阻遏物(CymR)蛋白)或者提供可在生产期间抑制转基因表达的RNA结合蛋白(例如，TRAP-色氨酸激活的RNA结合蛋白)。
在本文公开的发明的一个实施方式中，病毒载体衍生自EIAV。EIAV具有慢病毒的最简单的基因组结构。除了gag/pol和env基因之外，EIAV还编码其他三种基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活物(Derse和Newbold(1993)Virology 194(2):530-536以及Maury等(1994)Virology 200(2):632-642)，rev通过rev-应答元件(RRE)调控和协调病毒基因的表达(Martarano等，(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。这两种蛋白的作用机制据认为大体上相似于灵长类动物病毒中的类似机制(Martarano等，(1994)J Virol 68(5):3102-3111)。S2的功能是拮抗SERINC3/5(Chande等，PNAS,2016 Nov 15；113(46):13197-13202)。此外，已鉴定了称为Ttm的EIAV蛋白，其由在跨膜蛋白起始处被剪接到env编码序列的tat的第一个外显子编码。在本文公开的发明的一个替代实施方式中，病毒载体衍生自HIV：HIV与EIAV的差异在于其不编码S2，但是与EIAV不同，其编码vif、vpr、vpu和nef。
术语“重组逆转录病毒或慢病毒载体”(RRV)指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒遗传信息，以让RNA基因组在包装组件存在下得以包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可包括逆转录、以及整合到靶细胞基因组中。RRV携带着要通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能够进行独立复制以在靶细胞中产生感染性慢病毒颗粒。通常，RRV缺乏复制所必需的功能性gag/pol基因和/或env基因和/或其他基因。
优选地，本发明的RRV载体具有最低限度的病毒基因组。
如在本文中所使用的，术语“最低限度的病毒基因组”意指病毒载体已经过操作，从而去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导和递送NOI到靶细胞所需的功能性。这个策略的更多细节可见WO 1998/17815和WO 99/32646。最低限度EIAV载体缺少tat、rev和S2基因，并且这些基因也都没有反式出现在生产系统中。最低限度HIV载体缺少vif、vpr、vpu、tat和nef。
用于在生产细胞内生产载体基因组的表达质粒可以包括与逆转录病毒基因组可操作连接的转录调控序列，以指导基因组在生产细胞/包装细胞中的转录。这些调控序列可以是与所转录的逆转录病毒序列相关联的天然序列，即5’U3区域，或其可以是异源启动子，如其他病毒启动子，例如CMV启动子，如下所述。一些慢病毒载体基因组为了有效的产生病毒，因此需要额外的序列。例如，特别在HIV的情况中，可以包括RRE序列。然而，可以通过密码子优化减少或消除对于RRE的需求(以及对反式提供的rev的依赖性)。这一策略的进一步细节可以参见WO 2001/79518。
与rev/RRE系统执行相同功能的可替代的序列也是已知的。例如，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能性类似物。其被称为组成型转运元件(CTE)，并且在基因组内包括据信与被感染的细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可被用作rev/RRE系统的替代。已知的或者可获得的Rev蛋白的任何其他功能等价物都可以与本发明相关。例如，还已知，HTLV-I的Rex蛋白能够功能性地代替HIV-1的Rev蛋白。在本文公开的发明的方法中使用的载体中，Rev和RRE可以不存在或者是无功能的；在可替代的方案中，可以将rev和RRE或功能等价系统加入本文的载体系统中。
如在本文中所使用的，术语“功能性替代物”是指具有与另一蛋白或序列执行相同功能的替代序列的蛋白或序列。术语“功能性替代物”在本文中以相同的含义与“功能性等价物”和“功能性类似物”互换使用。
SIN载体
本发明的逆转录病毒载体可以以自灭活(SIN)构型使用，其中病毒增强子和启动子序列已被删除。可以产生SIN载体，并以与非SIN载体相似的功效在体内、离体或体外转导非分裂靶细胞。SIN原病毒的长末端重复(LTR)的转录失活将会抑制由具有复制能力的病毒的活化。这通过消除LTR的任意顺式作用效果，还能够调控由内部启动子启动的基因表达。
举例来说，自失活的逆转录病毒载体系统已经被构建为删除了转录增强子或3’LTR的U3区内的增强子和启动子。在载体逆转录和整合一轮之后，这些变化将被拷贝到产生无转录活性的原病毒的5’和3’LTR中。然而，在这种载体中的LTR的任意内部启动子将仍然保持转录活性。这一策略已被用来消除病毒LTR内的增强子和启动对由内部放置的基因的转录的影响。这些影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可用于消除从3’端LTR下游转录成基因组DNA。在人类基因治疗中，这是受到特别关注的，在该治疗中，重要的是防止任何内源致癌基因的外来激活。Yu等，(1986)PNAS 83:3194-98；Marty等，(1990)Biochimie 72:885-7；Naviaux等，(1996)J.Virol.70:5701-5；Iwakuma等，(1999)Virol.261:120-32；Deglon等，(2000)Human Gene Therapy 11:179-90。SIN慢病毒载体在US 6,924,123和US7,056,699中有所描述。
复制缺陷型慢病毒载体
在复制缺陷型慢病毒载体的基因组中，gag/pol和/或env的序列可以突变和/或没有功能。
在本文公开的发明的典型慢病毒载体中，可以从载体中除去为病毒复制所必需的蛋白的一个或多个编码区的至少一部分。这制造了复制缺陷型病毒载体。病毒基因组的部分也可以由NOI替换，以产生包含NOI的载体，该NOI能够转导非分裂靶细胞和/或将其基因组整合到靶细胞基因组中。
在一个实施方式中，如WO 2006/010834和WO 2007/071994中所描述的那样，慢病毒载体是非整合型载体。
在进一步的实施方式中，载体具有递送没有或缺少病毒RNA序列的能力。在进一步的实施方式中，位于待递送的RNA上的异源结合域(与gag异源)和位于Gag或GagPol上的同源结合域可以被用来确保待递送RNA的包装。这些载体在WO 2007/072056中有所描述。
腺病毒和腺相关病毒载体
重组腺相关病毒(AAV)和基于腺病毒的病毒载体在基因治疗中的应用已广泛使用，并且其生产已被充分证明。通常，在哺乳动物细胞系中(例如，基于HEK293)或通过使用杆状病毒/Sf9昆虫细胞系统生产基于AAV载体。可以通过瞬时转染编码DNA的载体组分(通常与来自腺病毒或单纯疱疹病毒(HSV)的辅助功能一起)，或通过使用稳定表达AAV载体组分的细胞系来生产AAV载体。
通常将AAV载体理解为衍生自腺相关病毒血清型的载体，包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7和AAV-8。AAV载体可以具有一个或多个全部或部分缺失的AAV野生型基因(优选rep和/或cap基因)，但保留功能性ITR侧翼序列。功能性ITR序列对于AAV病毒体的挽救、复制和包装是必需的。因此，本文中定义的AAV载体至少包含顺式复制和包装病毒所需的那些序列(例如，功能性ITR)。ITR不必是野生型核苷酸序列，并且可以例如通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，只要该序列提供功能性挽救、复制和包装即可。“AAV载体”也指其蛋白外壳或衣壳，其为将载体核酸传递到靶细胞核提供了有效的载体。AAV生产系统需要辅助功能，其通常是指AAV衍生的编码序列，其可被表达以提供AAV基因产物，而AAV基因产物又反过来起作用以用于生产性AAV复制。这样，AAV辅助功能包括两个主要的AAV开放阅读框架(ORF)、rep和cap。Rep表达产物已被证明具有很多功能，其中包括：DNA复制AAV原点的识别、结合和切刻；DNA解旋酶活性；和由AAV(或其他异源性)启动子的转录控制。Cap表达产物提供必要的包装功能。AAV辅助功能在本文中用于补充AAV载体缺失的反式AAV功能。应当理解的是，AAV辅助构建体通常指这样的核酸分子，其包括提供了从AAV载体中缺失的提供AAV功能的核苷酸序列，该核苷酸序列将用于生产用于递送目的核苷酸序列的转导载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充AAV复制所需的缺失的AAV功能；然而，辅助构建体缺乏AAV ITR，并且其本身既不能复制也不能包装。AAV辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒体形式。已经描述了很多AAV辅助构建体，如编码Rep和Cap表达产物的常用质粒pAAV/Ad和plM29+45。参见，例如，Samulski等，(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McCarty等，(1991)J.Virol.65:2936-2945，其通过引用并入本文。已描述了编码Rep和/或Cap表达产物的多种其他载体。参见，例如，美国专利号5,139,941和6,376,237，其通过引用并入本文。此外，众所周知，术语“辅助功能”指非AAV衍生的病毒和/或细胞功能，AAV依赖于其复制。因此，该术语捕获AAV复制所需的蛋白和RNA，包括参与AAV基因转录激活、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物合成和AAV衣壳组装的那些部分。基于病毒的辅助功能可以源自任何已知的辅助病毒，如腺病毒、疱疹病毒(1型单纯疱疹病毒除外)和牛痘病毒。
通过引用并入本文的下述出版物描述了与腺相关病毒载体的生产相关的腺相关病毒的生物学和/或技术的各个方面。Aponte-Ubillus等，Molecular design forrecombinant adeno-associated virus(rAAV)vector production.Appl MicrobiolBiotechnol.2018；102(3):1045–1054；Wang Q等，A Robust System for Production ofSuperabundant VP1 Recombinant AAV Vectors.Mol Ther Methods Clin Dev.2017Dec15；7:146–156；Adamson-Small L等，A scalable method for the production of high-titer and high-quality adeno-associated type 9 vectors using the HSVplatform.Mol Ther Methods Clin Dev.2016；3:16031；Clément N和GriegerJC.Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors for clinicaltrials.Mol Ther Methods Clin Dev.2016；3:16002；Guo P等，Rapid and simplifiedpurification of recombinant adeno-associated virus.J Virol Methods.2012 Aug；183(2):139–146；Shin J-H等，Recombinant Adeno-Associated Viral VectorProduction and Purification.Methods Mol Biol.2012；798:267–284；Cecchini S等，Reproducible High Yields of Recombinant Adeno-Associated Virus Produced UsingInvertebrate Cells in 0.02-to 200-Liter Cultures.Hum.Gene Ther.22(8)2011:1021–1030；Wright JF.Adeno-Associated Viral Vector Manufacturing:Keeping Pacewith Accelerating Clinical Development.Hum.Gene Ther.22(8)2011:913–915；KotinRL.Large-scale recombinant adeno-associated virus production.Hum MolGenet.2011 Apr 15；20(R1):R2–R6；Thomas DL等，Scalable Recombinant Adeno-Associated Virus Production Using Recombinant Herpes Simplex Virus Type 1Coinfection of Suspension-Adapted Mammalian Cells.Hum.Gene Ther.20(8)2009:861–870；Thorne BA等，Manufacturing Recombinant Adeno-Associated Viral Vectorsfrom Producer Cell Clones.Hum.Gene Ther.20(7)2009:707–714；Wright F.TransientTransfection Methods for Clinical Adeno-Associated Viral VectorProduction.Hum.Gene Ther.20(7)2009:698–706；Urabe M等，Insect Cells As aFactory to Produce AdenoAssociated Virus Type 2 Vectors.Hum.Gene Ther.13(16)2002:1935–1943。
腺病毒载体通常在稳定表达腺病毒E1功能(例如，基于HEK293)的哺乳动物细胞系中生产。腺病毒载体通常还通过生产细胞系通过“感染”的连续轮次，通过辅助功能依赖性复制来“扩增”。腺病毒载体及其生产系统包含含有腺病毒基因组的全部或部分的多核苷酸。众所周知，腺病毒是但不限于源自Ad2、Ad5、Ad12和Ad40的腺病毒。腺病毒载体通常是包封在腺病毒外壳中的DNA形式或包装在另一种病毒或病毒样形式(如单纯疱疹和AAV)中的腺病毒DNA。
通过引用并入本文的下述出版物描述了与腺病毒载体的生产相关的腺病毒的生物学和/或技术的各个方面。Graham和Van de Eb(1973)Virology 52:456-467；Takiff等，(1981)Lancet ii:832-834；Berkner和Sharp(1983)Nucleic Acid Research 6003-6020；Graham(1984)EMBO J 3:2917-2922；Bett等，(1993)J.Virology 67:5911-5921；和Bett等，(1994)Proc.Natl.Acad Sci.USA 91:8802-8806。已对腺病毒进行基因修饰以产生复制缺陷型基因转移载体。在此类载体中，早期的腺病毒基因产物E1A和E1B被Frank Graham(Graham等，(1987)J.Gen.Birol.36:59-72和Graham(1977)J.Genetic Virology 68:937-940)开发的包装细胞系293缺失并反式提供。通常将要转导的基因掺入病毒基因组的E1A和E1B区缺失的腺病毒中。Bett等，(1994),同上。已在下述文献中描述了腺病毒载体及其生产Stratford-Perricaudet(1990)Human Gene Therapy 1:2-256；Rosenfeld(1991)Science252:431-434；Wang等，(1991)Adv.Exp.Med.Biol.309:61-66；Jaffe等，(1992)Nat Gent.1:372-378；Quantin等，(1992)Proc Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584；Rosenfeld等，(1992)Cell 68:143-155；Stratford-Perricaudet等，(1992)J.Clin.Invest.90:626-630；Le Gal La Salle等，(1993)Science 259:988-990；Mastrangeli等，(1993)J.Clin.Invest.91:225-234；Ragot等，(1993)Nature 361:647-650；Hayaski等，(1994)J.Biol.Chem.269:23872-23875；Lee CS等，Adenovirus-Mediated Gene Delivery:Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era ofPersonalized Medicine.Genes Dis.2017Jun；4(2):43-63；Kallel H,Kamen AA.Large-Scale Adenovirus and Poxvirus-Vectored Vaccine Manufacturing to EnableClinical Trials.Biotechnol.J.10(5)2015:741–747；Miravet S等，Construction,production,and purification of recombinant adenovirus vectors.Methods MolBiol.2014；1089:159-73；Silva AC等，Scalable production of adenovirusvectors.Methods Mol Biol.2014；1089:175-96；Kreppel F.Production of high-capacity adenovirus vectors.Methods Mol Biol.2014；1089:211-29；Xie L等，Large-Scale Propagation of a Replication-Defective Adenovirus Vector in Stirred-Tank Bioreactor PER.C6TM Cell Culture Under SpargingConditions.Biotechnol.Bioeng.83(1)2003:45–52；Garnier A等，Scale-Up of theAdenovirus Expression System for the Production of Recombinant Protein inHuman 293S Cells.Cell Culture Engineering IV.Buckland BC,Ed.Springer Scienceand Business Media:Rotterdam,The Netherlands,1994；145–155。
NOI和多核苷酸
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。其可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，有许多不同的多核苷酸可编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术进行不会影响由本发明的多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸替代，以反映在其中表达本发明多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。
多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
多核苷酸如DNA多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。其还可通过标准的技术进行克隆。
通常使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术。这涉及到制备一对能侧接于需要克隆的靶序列的引物(例如，约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如，通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。可将引物设计成含有合适的限制性内切酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的载体中。
蛋白
如在本文中所使用的，术语“蛋白”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述复合物中各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。如在本文中所使用的，术语“多肽”和“肽”指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键连接在一起的聚合物。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的具体蛋白和核苷酸之外，本文公开的发明还涵盖使用其的变体、衍生物、类似物、同源物和片段。
在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式进行了改变：所涉及的多肽或多核苷酸保持了其内源功能中的至少一种。可通过对天然蛋白中存在的至少一个残基进行添加、缺失、替代、修饰、替换和/或改变，来获得变体序列。
如在本文中所使用的，与本发明的蛋白或多肽相关的术语“衍生物”包括对序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何替代、改变、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所产生的蛋白或多肽能保持其内源功能中的至少一种即可。
如在本文中所使用的，与多肽或多核苷酸相关的术语“类似物”包括任何模拟物，即这样的化合物，其具有其所模拟的多肽或多核苷酸的内源性功能中的至少一种。
通常，可进行(例如)1、2或3至10或20个替换以进行氨基酸替换，只要被改变的序列能保持所需的活性或能力即可。氨基酸替换可包括非天然类似物的使用。
用于本文公开的发明的蛋白还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或替代，即缺失、插入或替代能产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性的基础上作出谨慎的氨基酸替代，只要内源性功能得以保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含有具有相似亲水性值的无电荷极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
保守替代可例如按下表作出。第二列同一格中的氨基酸、优选第三列同一行中的氨基酸可互相替代：
Figure BDA0002680207430000411
术语“同系物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有特定同源性的实体。术语“同源性”可以与“同一性”互换。
在本发明的背景下，同源序列包括可与题述序列至少具有50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与题述序列至少具有95％或97％或99％的同一性。通常，同源性包括与题述氨基酸序列相同的活性位点等。虽然还可根据相似性(即，具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的正文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
在本发明的背景下，同源序列包括可与题述序列至少具有50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与题述序列至少具有95％或97％或99％的同一性。虽然还可根据相似性来考虑同源性，但在本发明的正文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以借助目测来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可以计算出两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。
同源性百分比可以对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅对相对短数目的残基进行。
虽然这是一种非常简单而相容的方法，但其不能考虑例如在其他情况下相同的一对序列中，一个核苷酸的插入或缺失将引起随后的密码子不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分比大大降低。因此，大多数的序列比较方法被设计为产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和缺失，而对整体同源性分值不会处以过高的罚分。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来实现这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位并反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。“Affine空位罚分”通常用来对存在空位处以相对高的罚分，而对该空位的每种后来残基的罚分较低。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位处罚会产生具有较少空位的最佳比对。大多数的序列比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，每个延长为-4。
因此，最大同源性百分比的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种序列比对的合适计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(University ofWisconsin,U.S.A.；Devereux等，(1984)Nucleic Acids Research 12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，(1999)ibid–Ch.18)、FASTA(Atschul等，(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于线下和在线检索(参见Ausubel等，(1999)ibid，第7-58至7-60页)。然而，对于一些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2 Sequences的工具也可用来比较蛋白和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett(1999)174(2):247-50；FEMSMicrobiol Lett(1999)177(1):187-8)。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分比，但序列比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果供应的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其他软件的情况中，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则可以计算出同源性百分比，优选序列同一性百分比。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数值结果。
“片段”也是变体，这个术语通常指多肽或多核苷酸中的在功能上或者在例如测定上所感兴趣的选定区域。因此“片段”指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
此类变体可用标准的重组DNA技术如定点诱变来制备。在要进行插入的情况中，可以制备合成DNA，其编码该插入以及对应于该插入位点任一侧的天然序列的5’和3’侧翼区。所述侧翼区含有对应于天然序列中的位点的便利的限制位点，使得该序列可用适当的酶进行切割，并且所述合成DNA可连接到该切口中。然后按照本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是举例说明许多本领域已知的用于操作DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
适用于本发明的细胞和/或模块化构建体的调控蛋白的所有变体、片段或同源物将保持结合NOI的同源结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止NOI的翻译。
结合位点的所有变体片段或同源物将保留结合同源RNA结合蛋白的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止NOI的翻译。
密码子优化
本发明中所用的多核苷酸(包括NOI和/或载体生产系统的组分)可经过密码子优化。之前，密码子优化在WO 1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在其对具体密码子的使用上存在差异。这种密码子偏好对应于特定tRNA在该细胞类型中的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，将其定制成匹配相应的tRNA的相对丰度，可以提高表达。同样地，通过有意选择相应的tRNA已知在特定细胞类型中稀有的密码子，可以降低表达。因此，可以更大程度地进行翻译控制。
许多病毒(包括逆转录病毒)使用大量的稀有密码子，通过将这些密码子改变以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现目的基因(例如NOI或包装组分)在哺乳动物生产细胞中的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子用法表。
病毒载体成分的密码子优化具有许多其他优点。对于编码在生产细胞/包装细胞中病毒颗粒的装配所必需的病毒颗粒包装组件的核苷酸序列，由于其序列的改变，可使RNA不稳定性序列(INS)从中去除。同时，保留了包装组件的氨基酸序列编码序列，从而使得由所述序列编码的病毒成分保持相同或至少充分相似，从而包装组件的功能不受损害。在慢病毒载体中，密码子优化还能克服输出对Rev/RRE的需要，从而使得经优化的序列不依赖于Rev。密码子优化还能减少载体系统中的不同构建体之间(例如，gag-pol开放阅读框和env开放阅读框的重叠区域之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体效果是病毒滴度明显提高和安全性改善。
在一个实施方式中，仅对与INS相关的密码子进行密码子优化。但是，在更为优选和实用的实施方式中，对序列全部都进行密码子优化，但有一些例外，例如包含gag-pol的移码位点的序列(参见下文)。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达都依赖于翻译过程中的移码。该移码是因为核糖体在翻译过程中“滑动”而产生的。这个滑动据认为至少部分地由核糖体停靠(ribosome-stalling)RNA二级结构造成。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区域从gag起始端下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag ATG的A)延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，横跨两个阅读框的移码位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段将使得能够更有效地表达Gag-Pol蛋白。对于EIAV，据认为重叠的起始端是nt 1262(其中核苷酸1为gag ATG的A)，且重叠的末端在1461bp。为了确保保留移码位点和gag-pol重叠，已保留了野生型序列的nt1156至1465。
可作出与最佳密码子用法的偏差以(例如)适应便利的限制位点，并且可将保守氨基酸变化引入到Gag-Pol蛋白中。
在一个实施方式中，密码子优化基于轻表达的(lightly expressed)哺乳动物基因。可改变第三个碱基，有时可改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，应理解，技术人员可获得许多种gag-pol序列。另外，有许多所描述的逆转录病毒变体可用作用于产生经密码子优化的gag-pol序列的起始点。慢病毒基因组可以是十分可变的。例如，存在着许多仍能发挥功能的HIV-1类似物质。对于EIAV情况也是一样。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。HIV-1变体的例子可在LosAlamos National Security,LLC运营的HIV数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中找到。有关EIAV克隆的细节可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到。
用于经密码子优化的gag-pol序列的策略可针对任意逆转录病毒使用。这将适用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，这个方法可用于提高来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源逆转录病毒(HERV)、MLV及其他逆转录病毒的基因的表达。
密码子优化可使gag-pol表达不依赖于Rev。但是，为了使得能够在慢病毒载体中使用抗rev或RRE因子，有必要使病毒载体生产系统完全不依赖于Rev/RRE。因此，基因组还需要加以修饰。这通过优化载体基因组成分来实现。有利地，这些修饰还导致在生产细胞和被转导的细胞中产生了不存在所有额外蛋白的更安全的系统。
常见载体元件
启动子和增强子
NOI和多核苷酸的表达可用控制序列进行控制，例如转录调控元件或翻译抑制元件，其包括启动子、增强子和其他表达调控信号(例如，tet阻遏物(TetR)系统)或在载体生产细胞系统中的转基因抑制(TRIP)或本文所述的其他NOI调控因子。
可以使用原核生物启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。还可使用包含来自两种或更多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
适宜的启动序列是强启动子，包括那些衍生自病毒(如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组的启动子，或者衍生自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子、EF1α、CAG、TK、SV40、泛素、PGK或核糖体蛋白启动子)的启动子。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5’启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子、纤连蛋白启动子、Endoglin启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
可通过将增强序列插入到载体中，来进一步提高NOI的转录。增强子相对不依赖于取向和位置；但是，可以采用来自真核细胞病毒的增强子，如SV40增强子和CMV早期启动子增强子。增强子可在相对于启动子的5’或3’的位置剪接到载体中，但优选位于相对于启动子的5’位点。
启动子可另外包括用以确保或提高在合适的靶细胞中表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，例如Pribnow盒或TATA盒。启动子可含有用以影响(如维持、增强或降低)核苷酸序列的表达水平的其他序列。合适的其他序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其他序列包括可诱导元件，如温度、化学、光和应激可诱导元件。还可存在用以增强转录或翻译的合适元件。
NOI的调控因子
在产生逆转录病毒包装/生产细胞系和逆转录病毒载体生产中的复杂因素是某些逆转录病毒载体组分和NOI组成型表达的细胞毒性导致表达这些组分的细胞的死亡，因而不能生产载体。因此，对于本发明的一些实施方式，必须调控这些组分(例如，gag-pol和包膜蛋白，如VSV-G)的表达。还可以调控其他非细胞毒性载体组分的表达以最小化细胞的代谢负担。本发明的模块化构建体和/或细胞可以包含与至少一种调控元件结合的细胞毒性和/或非细胞毒性载体组分。如在本文中所使用的，术语“调控元件”指能够影响(增加或减少)相关基因或蛋白表达的任何元件。调控元件包括基因开关系统、转录调控元件和翻译抑制元件。
很多原核调控系统已被用于在哺乳动物细胞中产生基因开关。很多逆转录病毒包装和生产细胞系已使用基因开关系统(例如，四环素和cumate诱导型开关系统)进行控制，因此能够在载体生产时开启一种或多种逆转录病毒载体组分的表达。基因开关系统包括转录调控因子(TetR)蛋白组的那些(例如，T-Rex、Tet-On和Tet-Off)，以及转录调控因子cumate诱导型开关系统组的那些(例如，CymR蛋白)。
一种此类四环素诱导型系统是基于T-RExTM系统的四环素阻遏物(TetR)系统。举例来说，在此类系统中，将四环素操纵子(TetO2)置于这样的位置，以使得第一个核苷酸距离人巨细胞病毒主要立即早期启动子(hCMVp)TATATAA元件最后一个核苷酸的3’末端10bp，然后仅TetR才能作为阻遏物起作用(Yao F,Svensjo T,Winkler T,Lu M,Eriksson C,Eriksson E.Tetracycline repressor,tetR,rather than the tetR-mammalian celltranscription factor fusion derivatives,regulates inducible gene expressionin mammalian cells.1998.Hum Gene Ther；9:1939-1950)。在此类系统中，NOI的表达能够由CMV启动子控制，CMV启动子已串联插入两个拷贝的TetO2序列。在缺乏诱导剂(四环素或其类似物多西环素[dox])的情况下，TetR同型二聚体与TetO2序列结合并物理阻断上游CMV启动子的转录。当存在时，诱导剂与TetR同型二聚体结合，引起变构变化，从而使其不再与TetO2序列结合，从而导致基因表达。已经对本文公开的实施例中使用的TetR基因进行了密码子优化，因为发现其可以提高翻译效率，从而可以更严格地控制TetO2控制的基因表达。
在WO 2015/092440中描述了TRiP系统，并提供了在载体生产期间抑制NOI在生产细胞中表达的另一种方法。当组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)驱动转基因是所需要的时，且特别地当在生产细胞中表达转基因蛋白导致载体滴度降低和/或由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时，TRAP结合序列(例如，TRAP-tbs)相互作用形成用于生产逆转录病毒载体的转基因蛋白阻遏系统的基础(Maunder等，NatCommun.(2017)Mar 27；8)。
简言之，TRAP-tbs相互作用形成翻译阻滞，抑制转基因蛋白的翻译(Maunder等，Nat Commun.(2017)Mar 27；8)。翻译阻滞仅在生产细胞中有效，因此不会阻碍基于DNA或RNA的载体系统。当从组成型和/或强启动子，包括来自单顺反子或多顺反子mRNA的组织特异性启动子表达转基因蛋白时，TRiP系统能够抑制翻译。已经证明，转基因蛋白的表达不受调控会降低载体滴度并影响载体产品质量。对于瞬时和稳定的PaCL/PCL载体生产系统，在下述情况下，转基因蛋白的抑制对于生产细胞是有利的以防止载体滴度降低：当毒性或分子负荷问题可能导致细胞应激时；由于转基因来源蛋白的病毒载体递送在体内激发免疫应答时；使用基因编辑转基因可能导致影响靶点开/关时；转基因蛋白可能会影响载体和/或包膜糖蛋白排斥时。
包膜和假毒粒化
在一个优选的方面中，本文所述的发明的逆转录病毒载体已经被假毒粒化。在这一点上，假毒粒化可以赋予一个或多个优点。例如，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其他有包膜病毒的env序列替代，那么其可能具有更宽的感染谱(Verma和Somia(1997)Nature389(6648):239-242)。例如，工作者已经用来自VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假毒粒化(Verma和Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。
在另一种可选的方式中，Env蛋白可以是修饰的Env蛋白，如突变的或工程化的Env蛋白。可以进行修饰或对修饰进行选择，以导入靶定能力或减少毒性或用于其他目的(Valsesia-Wittman等，1996J Virol 70：2056-64；Nilson等，(1996)Gene Ther 3(4):280-286；和Fielding等，(1998)Blood 91(5):1802-1809；及其中引用的参考文献)。
可以用任何选择的分子使载体假毒粒化。
如在本文中所使用的，“env”是指如本文所述的内源性慢病毒包膜或异源性包膜。
VSV-G
水疱性口腔炎病毒(VSV，一种棒状病毒)的包膜糖蛋白(G)是已被证实能够对某些包膜病毒和病毒载体病毒粒子进行假毒粒化的包膜蛋白。
Emi等，(1991)Journal of Virology 65:1202-1207首先证明了在不存在任何逆转录病毒包膜蛋白的情况下，其对基于MoMLV的逆转录病毒载体进行假毒粒化的能力。WO1994/294440教导了逆转录病毒载体可成功地用VSV-G进行假毒粒化。这些经假毒粒化的VSV-G载体可用于转导广范围的哺乳动物细胞。最近，Abe等，(1998)J Virol 72(8)6356-6361教导了可通过加入VSV-G使非感染性逆转录病毒颗粒变成感染性。
Burns等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-7成功地用VSV-G对逆转录病毒MLV进行假毒粒化，这导致产生与天然形式的MLV相比改变了宿主范围的载体。已经证实VSV-G假毒粒化的载体不仅感染哺乳动物细胞，而且还感染衍生自鱼类、爬行动物和昆虫的细胞系(Burns等，(1993)，出处同上)。还证实了其对于多种细胞系而言比传统的兼嗜性包膜更有效(Yee等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568、Emi等，(1991)Journalof Virology 65:1202-1207)。VSV-G蛋白可用于对某些逆转录病毒进行假毒粒化，因为其胞质尾巴能够与逆转录病毒核心发生相互作用。
提供非逆转录病毒假毒粒化包膜(如VSV-G蛋白)可得到这样的优点，即载体颗粒能被浓缩至高滴度而不损失感染性(Akkina等，(1996)J.Virol.70:2581-5)。逆转录病毒包膜蛋白显然不能够承受超离心过程中的剪切力，这很可能是因为其由两个非共价连接的亚单位组成。离心可破坏亚单位之间的相互作用。相比之下，VSV糖蛋白由单一单位组成。因此，VSV-G蛋白假毒粒化可以为有效的靶细胞感染/转导以及在生产过程中提供潜在的优点。
WO 2000/52188描述了由具有水疱性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)作为膜结合性病毒包膜蛋白的稳定生产细胞系产生假毒粒化的逆转录病毒载体，并提供了VSV-G蛋白的基因序列。
罗斯河病毒
用罗斯河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(FIV)进行假毒粒化，并且按照系统给药主要转导肝(Kang等，(2002)J Virol 76(18):9378-9388)。据报道，效率比用VSV-G假毒粒化载体获得的效率高20倍，并且通过测量提示肝中毒的肝酶血清水平得知，导致的细胞毒性更低。
杆状病毒GP64
已经证明了杆状病毒GP64蛋白是VSV-G的替代方案，其用于在临床和商业应用所需的高滴度病毒的大规模生产中使用的病毒载体(Kumar M,Bradow BP,Zimmerberg J(2003)Hum Gene Ther.14(1):67-77)。与VSV-G假毒粒化载体相比，GP64假毒粒化载体具有相似的广泛嗜性和相似的天然滴度。由于GP64的表达不杀死细胞，因此可以制备组成型表达GP64的基于HEK293T的细胞系。
替代的包膜
当用于假毒粒化EIAV时提供适当的滴度的其他包膜包括Mokola、Rabies、Ebola和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。向小鼠体内静脉输注利用4070A进行假毒粒化的慢病毒导致在肝脏内具有最大的基因表达。
包装序列
在本发明的背景下所使用的术语“包装信号”可与“包装序列”或“psi”互换使用，其用来指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化作用所需的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，该序列已被定位于从主要剪接供体位点(SD)上游至少延伸到gag起始密码子的基因座。在EIAV中，包装信号包括R区域到Gag的5’编码区。
如在本文中所使用的，术语“延伸的包装信号”或“延伸的包装序列”指在psi序列的周围使用进一步延伸到gag基因中的序列。包含这些额外的包装序列可提高载体RNA插入到病毒颗粒中的效率。
已经证明猫免疫缺陷病毒(FIV)RNA的衣壳化作用决定簇是离散的、非连续的，其包括位于基因组mRNA的5’末端的一个区域(R-U5)和定位在gag的大约311nt中的另一个区域(Kaye等，J Virol.Oct；69(10):6588-92(1995))。
内部核糖体进入位点(IRES)
IRES元件的插入允许由单一启动子表达多个编码区(Adam等，(同上)；Koo等，(1992)Virology 186:669-675；Chen等，1993 J.Virol 67:2142-2148)。IRES元件首次发现于小核糖核酸病毒的非翻译5’末端，在此其促进病毒蛋白的不依赖于帽的翻译(Jang等，(1990)Enzyme 44:292-309)。当在RNA中位于开放阅读框之间时，IRES元件通过促进在IRES元件处的核糖体进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
Mountford和Smith介绍了关于IRES的综述(TIG May 1995 vol 11,No 5:179-184)。许多不同的IRES序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(EMCV)(Ghattas,I.R.等，Mol.Cell.Biol.,11:5848-5859(1991)；BiP蛋白[Macejak和Sarnow,Nature 353:91(1991)]；果蝇触角足基因(外显子d和e)[Oh等，Genes&Development,6:1643-1653(1992)]的那些，以及在脊髓灰质炎病毒(PV)[Pelletier和Sonenberg,Nature 334:320-325(1988)；还参见Mountford和Smith,TIG 11,179-184(1985)]中的那些序列。
来自PV、EMCV和猪水疱病病毒的IRES元件之前被用于逆转录病毒载体中(Coffin等，如上所述)。
术语“IRES”包括发挥IRES功能或改善IRES功能的任何序列或序列的组合。IRES可以是病毒来源的(如EMCV IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞来源的(如FGF2IRES、NRFIRES、Notch 2IRES或EIF4 IRES)。
为了使IRES能够启动各多核苷酸的翻译，其应位于模块化构建体中的多核苷酸之间或在多核苷酸之前。
用于开发稳定细胞系的公开的载体构建体需要添加选择性标记物以选择发生稳定整合的细胞。这些选择性标记物可以表达为模块化构建体重的单个转录单位，或者可能更优选的是使用IRES元件启动多顺反子信息中选择性标记物的翻译(Adam等，1991J.Virol.65,4985)。这样，设计了多种模块化构建体，以是的使用IRES元件将选择性标记物置于逆转录病毒载体组分之一的下游。
基因方向和绝缘子
众所周知，核酸是有方向性的，其最终会影响细胞中诸如转录和复制等的机制。因此，当作为同一核酸构建体的一部分时，基因可以相对于彼此具有相对的方向。
这样，存在于细胞或构建体中相同基因座上的至少两个核酸序列可以处于反向和/或交替方向。换言之，在这个特定基因座上，顺序基因对将不具有相同取向。当载体生产所需的核酸基于生产细胞内相同的遗传基因座时，交替方向有利于逆转录病毒载体的生产。当该区域在生产细胞的同一物理位置内表达时，这可以帮助防止转录和翻译通读。反过来，这也能够提高所得构建体的安全性，以防止产生具有复制能力的逆转录病毒载体。当核酸序列处于相反和/或交替方向时，使用绝缘子能够防止NOI在其遗传环境中表达不当或沉默。
术语“绝缘子”是指当与绝缘子结合蛋白结合时具有保护基因免受周围调节子信号影响能力的一类DNA序列元件。有两种类型的绝缘子：增强子阻断功能和染色质屏障功能。当绝缘子位于启动子和增强子之间时，绝缘子的增强子阻断功能使启动子免受增强子转录增强的影响(Geyer和Corces 1992；Kellum和Schedl 1992)。染色质屏障绝缘子通过阻止附近浓缩染色质的前进而起作用，其会导致转录活性染色质区域变成转录无效染色质区域并导致基因表达沉默。抑制异染色质扩散从而抑制基因沉默的绝缘子会募集参与组蛋白修饰的酶，以阻止这一过程(Yang J,Corces VG.Chromatin Insulators:A Role inNuclear Organization and Gene Expression.Advances in cancer research.2011；110:43-76.doi:10.1016/B978-0-12-386469-7.00003-7；Huang,Li等，2007；Dhillon,Raab等，2009)。绝缘子可以具有这些功能中的一种或两种，且鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS4)就是一个这样的实例。这种绝缘子是研究最广泛的脊椎动物绝缘子，富含G+C，并且具有增强子阻断和异染色质屏障功能(Chung J H,Whitely M,Felsenfeld G.Cell.1993；74:505–514)。具有增强子阻断功能的其他此类绝缘子不限于但包括下述：人β-珠蛋白绝缘子5(HS5)、人β-珠蛋白绝缘子1(HS1)和鸡β-珠蛋白绝缘子(cHS3)(Farrell CM1,West AG,FelsenfeldG.,Mol Cell Biol.2002 Jun；22(11):3820-31；J Ellis等，EMBO J.1996 Feb 1；15(3):562–568)。除了减少不需要的远端相互作用以外，绝缘子还有助于防止临近逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单位的启动子损害相邻转录单位的表达)。如果在每个逆转录病毒载体核酸序列之间使用绝缘子，则直接通读的减少将有助于防止具有复制能力的逆转录病毒载体颗粒的形成。绝缘子可以存在于每个逆转录病毒核酸序列之间，并且使用绝缘子可以防止来自一个NOI表达盒的启动子-增强子相互作用与模块化构建体中的另一个NOI表达盒相互作用。载体基因组和gag-pol序列之间可以存在绝缘子。因此，这限制了产生具有复制能力的逆转录病毒载体和“野生型”DNA转录物的可能性，从而改善了构建体的安全性性质。Moriarity等人(Modular assembly of transposonintegratable multigene vectors using RecWay assembly,Nucleic Acids Res.2013Apr；41(8):e92)引用了使用绝缘子元件改善稳定整合的多基因载体表达的方法。
载体滴度
技术人员将理解的是，存在很多不同的确定病毒载体滴度的方法。通常将滴度描述为转导单位/mL(TU/mL)。滴度可以通过增加载体颗粒的数量和通过增加载体制剂的比活性来增加。
模块化构建体
本文公开的分泌型核酸酶的病毒载体生产系统和方法可以结合在共同待决的申请号为EP 17210359.0，发明名称为“逆转录病毒载体”的申请中公开的模块化核酸构建体(模块化构建体)，其通过引用整体并入本文。模块化构建体是DNA表达构建体，其包含用于生产逆转录病毒载体的两种或更多种核酸。模块化构建体可以是包含两种或更多种用于生产逆转录病毒载体的核酸的DNA质粒。例如，核酸可以编码gag-pol、rev、env、载体基因组。此外，设计用于产生包装和生产细胞系的模块化构建体可能还需要编码转录调控蛋白(例如，TetR、CymR)和/或翻译抑制蛋白(例如，TRAP)和选择性标记物(例如，ZeocinTM、潮霉素、杀稻瘟素、嘌呤霉素、新霉素抗性基因)。
DNA表达构建体可以是DNA质粒(超螺旋、缺口或线性化)、小圆环DNA(线性或超螺旋)、通过限制性内切酶消化和纯化除去质粒骨架而仅包含目标区域的质粒DNA、使用酶促DNA扩增平台产生的DNA，例如doggybone DNA(dbDNATM)，其中最终使用的DNA是封闭的连接形式，或已制备(例如，限制性酶切)末端开放的DNA。
如本文所述，目前用于逆转录病毒载体生产的方法利用遗传构建体，其中通过瞬时转染方法将对逆转录病毒生产必不可少的基因引入分离质粒上的生产细胞中。这会产生批次间的差异，且由于转染试剂和质粒较昂贵，进一步增加了成本。通过使用这种模块化构建体，减少了转染过程中所需质粒的数量，从而减少了劳动和材料成本的负担。
使用这种模块化构建体也能够有助于生产有效包装和生产细胞系。特别地，将两种或更多种逆转录病毒载体基因引入一个模块化构建体中，随后将减少为建立最终包装/生产细胞所需的稳定转染/转导、整合和选择步骤的数量。
特别地，令人吃惊地发现细菌质粒能够执行该功能，因为通常认为所涉及的大基因将不允许多个基因稳定地掺入细菌质粒中。
根据本发明的一个方面，用于生产逆转录病毒载体的稳定细胞系(包装或生产)包含位于相同遗传基因座的至少两个逆转录病毒基因。下表列出了可以位于本文公开的发明的稳定载体生产细胞中的相同位点并由单个模块构建体表达的核酸的示例性组合。每个组分核酸的顺序也如上所述。星号(*)标记了适用于生产基于EIAV的逆转录病毒载体的组分，因为Rev不是此类载体的必要组分。双星号(**)标记了与调控元件相关或在载体中处于相反和/或交替方向的组合。
Figure BDA0002680207430000531
Figure BDA0002680207430000541
当使用此类模块化构建体时，本发明的细胞或载体不包含来源于PAC、BAC、YAC、粘粒或福斯质粒的复制起点序列。PAC、BAC、YAC、粘粒或福斯质粒是人工产生的核酸载体，旨在保持大量DNA。因此，其核心序列是本领域所熟知和定义的。
病毒载体生产系统和细胞
一般而言，“病毒载体生产系统”或“载体生产系统”或“生产系统”应理解为包含用于病毒载体生产的必要组分的系统。
在本发明的一个实施方式中，病毒载体生产系统是逆转录病毒载体生产系统，其包含编码Gag和Gag/Pol蛋白及其Env蛋白的核酸序列和载体基因组序列。生产系统可以任选地包含编码Rev蛋白或其功能性替代物的核酸序列。
在另一个实施方式中，逆转录病毒载体来源于慢病毒。在另一个实施方式中，逆转录病毒载体来源于HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或Visna慢病毒。本发明的另一个方面涉及在本发明的逆转录病毒载体生产系统中使用的一组DNA构建体，其包含本发明的模块化构建体。在本发明的一个实施方式中，该DNA构建体组另外包含编码Rev蛋白或其功能性替代物的DNA构建体。
本发明的另一个方面涉及逆转录病毒载体生产细胞，其包含编码所述病毒载体组分的核酸序列，如表达盒和/或一些或所有模块化构建体。
在本发明的另一个实施方式中，病毒载体生产系统是AAV病毒载体生产系统或腺病毒载体生产系统。
“病毒载体生产细胞”、“载体生产细胞”或“生产细胞”应理解为能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。逆转录病毒载体生产细胞可以是“生产细胞”或“包装细胞”。病毒载体系统的一种或多种DNA构建体可以在病毒载体生产细胞中稳定整合或游离维持。或者，病毒载体系统的所有DNA组分可以瞬时转染至病毒载体生产细胞中。在另一个替代方案中，可以用载体生产所需的其余组分瞬时转染稳定表达一些组分的生产细胞。
如在本文中所使用的，术语“包装细胞”是指包含生产逆转录病毒载体颗粒所必需的元件但缺乏载体基因组的细胞。任选地，此类包装细胞包含一个或多个能够表达病毒结构蛋白(如gag、gag/pol和env)的表达盒。
生产细胞/包装细胞可以是任何适宜的细胞类型。生产细胞通常是哺乳动物细胞，但可以是例如昆虫细胞。
如在本文中所使用的，术语“生产者/生产细胞”或“载体生产/生产细胞”指包含生产逆转录病毒载体颗粒所需的所有元件的细胞。生产细胞可以是稳定的生产细胞系，也可以是瞬时生产的，也可以是稳定包装的细胞，其中所述逆转录病毒基因组是瞬时表达的。
载体生产细胞可以是体外培养的细胞，如组织培养细胞系。适宜的细胞系包括但不限于哺乳动物细胞，如小鼠成纤维细胞来源的细胞系或人细胞系。优选地，载体生产细胞来源于人细胞系。
细胞和生产方法
本发明涉及一种用于生产病毒载体的方法，其包括将本文所述的核酸序列引入细胞(例如，生产细胞)，并在适于生产病毒载体的条件下培养所述细胞。
在一个进一步的方面中，本文公开的发明提供了一种通过本发明的任何方法生产的复制缺陷型逆转录病毒载体。
适宜的生产细胞是那些在适当条件下培养能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。其通常是真核细胞，如哺乳动物细胞或人细胞，例如HEK293T、HEK293、CAP、CAP-T、CHO细胞或PER.C6细胞，但也可以是，例如，昆虫细胞，如SF9细胞。
用于将核酸引入生产细胞的方法在本领域中是众所周知的，并且先前已被描述。
适宜的细胞可以是包装细胞或生产细胞。为了从包装细胞生产生产细胞，可以稳定地或瞬时地引入载体基因组DNA构建体。
可以通过使用具有逆转录病毒载体的适宜细胞系转导产生包装/生产细胞，所述逆转录病毒载体表达包装/生产细胞(即，基因组)的组分、gag-pol组分和包膜之一，如WO2004/022761中所述的。
或者，可以将核酸转染到细胞中，然后不经常地随机整合到生产细胞基因组中。可以使用本领域熟知的方法进行转染方法。例如，转染过程可以使用磷酸钙或可商购的制剂LipofectamineTM 2000CD(Invitrogen,CA)、
Figure BDA0002680207430000561
或聚乙烯亚胺(PEI)进行。或者，可以通过电穿孔将本发明的模块化构建体引入生产细胞。技术人员将知晓促进核酸整合至生产细胞的方法。例如，如果其天然是环形的，则将核酸构建体线性化可能会有所帮助。较少随机整合的方法可以参与包含与哺乳动物宿主细胞的内源染色体具有共享同源性区域的核酸构建体，以指导整合到内源基因组内的选定位点。此外，如果重组位点存在于构建体上，则可以将这些位点用于靶向重组。例如，核酸构建体可以包含loxP位点，当与Cre重组酶结合时(即，使用来源于P1噬菌体的Cre/lox系统)，其允许靶向整合。或者或另外地，重组位点是att位点(例如，来自λ噬菌体)，其中所述att位点允许在λ整合酶存在下进行位点定向整合。这将允许逆转录病毒基因靶向宿主细胞基因组内的基因座，从而允许较高和/或稳定表达。
靶向整合的其他方法是本领域所熟知的。例如，诱导基因组DNA靶向切割的方法可用于促进在选定的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用方法或系统来诱导双链断裂(DSB)，例如在内源性基因组中的缺口，以通过生理机制(如非同源末端连接(NHEJ))来诱导断裂修复。可以通过使用位点特异性核酸酶，如工程化锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)，使用利用工程化crRNA/tracr RNA(“单向导RNA”)以引导特异性切割的CRISPR/Cas9系统，和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如，来自T.thermophilus)进行切割。此类基因编辑型核酸酶不适用于用于在载体生产期间的非特异性降解残留核酸目的的载体生产细胞，因为其是靶向核酸酶的位点特异性酶，并且不像本文公开的发明的非特异性核酸酶那样分泌。
可以通过使用逆转录病毒转导或核酸转染或其组合的方法整合核酸产生包装/生产细胞系。用于由生产细胞产生慢病毒载体的方法，特别是用于慢病毒载体加工的方法在WO 2009/153563中有所描述。
生产细胞可以任选地包含RNA结合蛋白(例如，色氨酸RNA结合衰减蛋白，TRAP)和/或Tet阻遏物(TetR)蛋白或其他调控蛋白(例如，CymR)。
从生产细胞生产逆转录病毒载体可以通过转染方法，从稳定细胞系生产可以包括诱导步骤(例如，多西环素诱导)或通过两者的组合。可以使用本领域熟知的方法进行转染方法，并且已经在此前描述了实例。
培养生产细胞(包装或生产细胞系或用编码组分的逆转录病毒载体瞬时转染的那些)以增加细胞核病毒数量和/或病毒滴度。进行细胞培养，以使其能够代谢、和/或生长和/或分裂和/或生产根据本发明的目标病毒载体。这可以采用本领域技术人员熟知的方法来完成，包括但不限于例如在适当的培养基中为细胞提供营养。所述方法可以包括贴壁在表面上生长、悬浮生长或其组合。例如，可以使用分批、补料分批、连续系统等在组织培养瓶、组织培养多孔板、培养皿、滚瓶、波浪袋或生物反应器中进行培养。为了通过细胞培养实现大规模生产病毒载体，在本领域中优选具有能够悬浮生长的细胞。用于培养细胞的适宜条件是已知的(参见例如，Tissue Culture,Academic Press,Kruse和Paterson编著(1973)，以及R.I.Freshney,Culture of animal cells:A manual of basic technique，第4版(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9))。
在一个实施方式中，细胞最初在组织培养瓶或生物反应器中“堆积”，然后在多层培养容器或大型生物反应器(大于50L)中生长，以产生本文公开的发明的载体生产细胞。
在另一个实施方式中，细胞以贴壁模式生长，以产生本发明的载体生产细胞。
在又一个实施方式中，细胞以悬浮模式生长，以产生本发明的载体生产细胞。
用途
本发明的另一个方面涉及本发明的病毒载体或者转导有本发明病毒载体的细胞或组织用于药物。
本发明的另一个方面涉及本发明的病毒载体、本发明的生产细胞或用本发明的病毒载体转导的细胞或组织在制备药物中的用途，所述药物将目标核苷酸递送至需要其的靶位点。本发明的病毒载体或转导细胞的这种用途可以用于治疗性或诊断性目的，如此前所述。
本发明的另一个方面涉及由本发明的病毒载体转导的细胞。
应将“由病毒载体颗粒转导的细胞”理解为已被病毒载体颗粒携带的核酸转移到其中的细胞(特别是靶细胞)。
药物组合物
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的病毒载体或者转导有本发明的病毒载体的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本文公开的发明还提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的病毒载体。该药物组合物可用于人体或动物用途。
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定的给药途径和标准的药物实践来进行。所述药用组合物可以包含载体、赋形剂或稀释剂，或除此之外还包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或促进载体进入靶位点的其他载体试剂(诸如脂质递送系统)。
在适当的情况下，所述药用组合物可以通过以下任何一种或多种方式施用：吸入；栓剂或阴道栓剂形式；以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式局部施用；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或与赋形剂混合的胶囊或原卵(ovule)形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮剂形式；或其可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内、颅内、眼内或皮下注射。对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，使得溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给药，所述组合物可以用常规方法配制的片剂或锭剂形式施用。
本发明的载体还可用于离体转导靶细胞或靶组织，然后将所述靶细胞或靶组织转移到需要治疗的患者体内。这种靶细胞的实例可以为自体T细胞，这种组织的实例可以是供体角膜。
本发明可用于生产囊泡(gesicle)或外泌体。在这方面，通常通过在(来源于HEK293的)细胞系中过表达VSV-G包膜制备囊泡，其产生囊泡(vesicle)。外泌体可以从细胞内源性地诱导/表达。囊泡或外泌体均能够装载RNA和蛋白，如CRISPR-cas9或其他基因编辑组件。
编号的段落
本文公开了分泌用于在病毒载体生产期间降解残留核酸的核酸酶的病毒载体生产系统及其方法。此类病毒载体生产系统包含病毒载体生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。另一种此类病毒载体生产系统包含：1)病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，所述核酸酶辅助细胞包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
现将通过编号的段落1-26来描述本发明的方面——以第1组编号的段落呈现。
第1组编号的段落：
1.一种病毒载体生产系统，其包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
2.一种病毒载体生产系统，其包含：1)病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，所述核酸酶辅助细胞包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
3.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使用编码下述的核酸序列转染(有时称为接触)病毒载体生产细胞：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
4.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述辅助细胞中表达和在所述生产细胞与所述辅助细胞的共培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
5.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)来自表达核酸酶的核酸酶辅助细胞的液体进料接触，其中所述核酸酶在所述细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物包含至少约5升培养基的体积。
7.根据段落1-6中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物包含至少约50升培养基的体积。
8.根据段落1至7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是HEK293细胞或其衍生物。
9.根据段落8所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述HEK293生产细胞是HEK293T细胞。
10.根据段落1-9中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分包含目标核苷酸(NOI)。
11.根据段落1-10中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分是逆转录病毒载体组分。
12.一种用于生产病毒载体的生产细胞，所述病毒载体包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，和其中所述生产细胞是真核生产细胞。
13.一种用于生产病毒载体的生产细胞，所述病毒载体包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶融合蛋白，其中所述核酸酶融合蛋白包含与核酸内切酶结构域融合的核酸外切酶结构域，和其中所述核酸酶融合蛋白在病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
14.一种细胞培养装置，其包含病毒载体生产系统，所述病毒载体生产系统包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
15.一种具有增加的细胞保留和/或细胞结合的修饰的核酸酶，所述核酸酶通过真核细胞的分泌途径表达，其中所述修饰的核酸酶在其C末端包含保留信号。
16.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约1单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000611
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
17.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000612
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
18.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000613
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
19.根据段落16-18所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由病毒载体生产细胞提供。
20.根据段落16-18所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由核酸酶辅助细胞提供。
21.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000621
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
22.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000622
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
23.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约2000单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000623
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
24.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶表达盒利用强启动子，优选CMV启动子。
25.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中在补充丁酸钠时或之后将所述核酸酶辅助细胞添加到主病毒载体生产容器中。
26.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中在病毒载体生产容器中核酸酶的表达使得无需进一步的核酸酶处理即可用于下游处理。
现将通过编号的段落1-82来描述本发明的这些和其他方面——以第2组编号的段落呈现。
第2组编号的段落：
1.一种病毒载体生产系统，其包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
2.一种病毒载体生产系统，其包含：1)病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，所述核酸酶辅助细胞包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
3.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使用编码下述的核酸序列转染(有时称为接触)病毒载体生产细胞：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
4.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述辅助细胞中表达和在所述生产细胞与所述辅助细胞的共培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
5.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)来自表达核酸酶的核酸酶辅助细胞的液体进料接触，其中所述核酸酶在所述细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
6.一种生产病毒载体的改进方法，改进包括将核酸序列引入病毒载体生产细胞，其中所述核酸序列编码：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
7.一种生产病毒载体的改进方法，改进包括在共培养物中使表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
8.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中细胞培养物保持在6.5至7.2的pH范围内。
9.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中胞外核酸酶选自下组：smNucA、VsEndA、VcEndA和BacNucB。
10.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是胞外核酸酶。
11.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是糖非特异性核酸酶。
12.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:3所示的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶A或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的变体。
13.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:1所示的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)核酸内切酶I或与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸同一性的变体。
14.根据段落13所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是选自下组的核酸酶变体：SEQ ID NO:5所示的VcEndA-12glc、SEQ ID NO:6所示的VcEndA-123glc、SEQID NO:7所示的VcEndA-124glc、SEQ ID NO:8所示的VcEndA-134glc、SEQ ID NO:9所示的VcEndA-13glc、SEQ ID NO:10所示的VcEndA-14glc和SEQ ID NO:11所示的VcEndA-1glc。
15.根据段落13所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是SEQ ID NO:11所示的核酸酶变体VcEndA-1glc。
16.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含盐活性核酸酶。
17.根据段落16所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述盐活性核酸酶包含SEQID NO:2所示的杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)核酸内切酶I或与SEQ ID NO:2具有至少90％氨基酸同一性的变体。
18.根据段落1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:4所示的BacNucB或与SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸同一性的变体。
19.根据段落1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含天然或非天然的N末端分泌信号。
20.根据段落1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中编码核酸酶的所述核酸序列是经优化以除去潜在的剪接位点和/或不稳定元件的序列。
21.根据段落1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中编码核酸酶的所述核酸序列进行密码子优化以在生产细胞中表达。
22.根据段落1-21中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产系统和/或方法还包括一种或多种另外的核酸酶。
23.根据段落22所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶与所述一种或多种另外的核酸酶的至少一种融合。
24.根据段落1-23中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物包含至少约5升培养基的体积。
25.根据段落1-24中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞是悬浮的或贴壁的。
26.根据段落1-25中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物是无血清的。
27.根据段落1-26中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是真核细胞。
28.根据段落27所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是哺乳动物细胞。
29.根据段落求28所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是人细胞。
30.根据段落1-29中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是HEK293细胞或其衍生物。
31.根据段落30所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述HEK293生产细胞是HEK293T细胞。
32.根据段落1-31中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分包含目标核苷酸(NOI)。
33.根据段落1-32中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分是逆转录病毒载体组分。
34.根据段落33所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述逆转录病毒载体组分是慢病毒载体组分。
35.根据段落34所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分包含i)gag-pol；ii)env；iii)任选地，逆转录病毒载体的RNA基因组；和iv)任选地，rev或其功能性替代品。
36.根据段落35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是编码位于同一遗传基因座的病毒载体组分的模块化构建体。
37.根据段落35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是以反向和/或交替方向编码病毒载体组分的模块化构建体。
38.根据段落35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是编码gag-pol和/或env的模块化构建体，其中所述模块化构建体是与至少一个调控元件结合的。
39.根据段落35-38中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述env是VSV-G env。
40.根据段落1-39中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶从瞬时转染后的细胞表达和分泌。
41.根据段落1-39中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶在细胞稳定整合后从所述细胞表达和分泌。
42.根据段落41所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶的表达是可诱导的或条件性的，并且其中编码所述核酸酶的核酸包含可诱导的或条件性的启动子或调控元件。
43.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
44.根据段落43所述的细胞，其中所述核酸酶是核酸内切酶。
45.根据段落44所述的细胞，其还包含编码核酸外切酶的核酸序列。
46.根据段落45所述的细胞，其中所述核酸内切酶与所述核酸外切酶融合。
47.根据段落43所述的细胞，其中所述核酸酶是核酸外切酶。
48.根据段落48所述的细胞，其中所述核酸外切酶与所述核酸内切酶融合。
49.段落43所述的细胞，其中所述细胞是瞬时生产细胞。
50.段落43所述的细胞，其中所述细胞是稳定生产细胞。
51.段落50所述的细胞，其中核酸酶的表达和分泌是在所述稳定生产细胞中可诱导的表达和分泌。
52.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶融合蛋白，其中所述核酸酶融合蛋白包含与核酸内切酶结构域融合的核酸外切酶结构域，并且其中所述核酸酶融合蛋白在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
53.段落52所述的细胞，其中所述核酸内切酶是VcEndA或其变体。
54.段落52所述的细胞，其中所述核酸内切酶是SEQ ID NO:11所示的VcEndA-1glc。
55.一种细胞培养装置，其包含病毒载体生产系统，所述病毒载体生产系统包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
56.段落46所述的细胞培养装置，其是搅拌釜式生物反应器或者波浪袋或
Figure BDA0002680207430000671
生物反应器。
57.一种能够在病毒载体生产期间降解残留核酸的分泌型核酸酶变体，所述变体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
58.一种具有增加的细胞保留和/或细胞结合的修饰的核酸酶，所述核酸酶通过真核细胞的分泌途径表达，其中所述修饰的核酸酶在其C末端包含保留信号。
59.段落58所述的修饰的核酸酶，其中所述修饰的核酸酶位于内质网(ER)和/或高尔基体室，从而导致与相应的未修饰核酸酶的细胞保留相比具有增加的细胞保留。
60.段落58所述的修饰的核酸酶，其中所述修饰的核酸与ER保留缺陷互补基团的ER受体结合。
61.段落58所述的修饰的核酸酶，其中所述保留信号在其共有序列[KRHQSA]-[DENQ]-E-L或KKXX的C末端。
62.段落58所述的修饰的核酸酶，其中所述保留信号在其共有序列KDEL的C末端。
63.一种表达段落58的修饰的核酸酶的真核细胞。
64.一种包含段落63的细胞的病毒载体生产系统。
65.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含如在段落1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
66.根据段落43或其任何从属段落所述的生产细胞，其包含如段落1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
67.根据段落52或其任何从属段落所述的生产细胞，其包含如段落1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
68.一种细胞培养装置，其包含如段落1至42中任一项所定义的生产细胞。
69.一种细胞培养装置，其包含如段落43或其任何从属段落所定义的生产细胞。
70.一种细胞培养装置，其包含如段落52或其任何从属段落所定义的生产细胞。
71.根据段落1至42中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其包含如段落57-62中任一项所定义的核酸酶。
72.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约1单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000681
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
73.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000682
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
74.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000683
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
75.段落72-74的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由病毒载体生产细胞提供。
76.段落72-74的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由核酸酶辅助细胞提供。
77.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000684
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
78.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000691
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
79.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约2000单位/mL等效的
Figure BDA0002680207430000692
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
80.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶表达盒利用强启动子，如CMV。
81.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其利用核酸酶辅助细胞，其中在补充丁酸钠时或之后将所述核酸酶辅助细胞添加到主病毒载体生产容器中。
82.前述任一段落所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中在病毒载体生产容器中核酸酶的表达使得无需进一步的核酸酶处理即可用于下游处理。
现将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方式。
实施例
实施例1：编码用于在病毒载体生产细胞培养期间减少残留DNA的差异很大的核酸酶的表达构建体
根据图3构建了用于粘质沙雷氏菌核酸内切酶A(SmNucA)、VsEndA和BacNucB的表达质粒。所有构建体均包含SV40启动子和聚腺苷酸化信号。对ORF进行密码子优化(智人)，并在其C末端标记6x组氨酸(H6)。SmNucA表达质粒编码具有其自身细菌分泌序列的野生型smNucA，或者其细菌分泌序列被人白蛋白或VSV-G取代，或者在指定位置还包含NxS/T序列子突变。VsEndA或VcEndA表达质粒编码具有其自身细菌分泌序列的野生型核酸酶，或者其细菌分泌序列被人白蛋白替代，或者还包含在T121V、N130D、S135R处的NxS/T序列子突变。BacNucB表达质粒编码具有其自身细菌分泌序列的野生型BacNucB，或在指定位置另外包含y>N突变，从而导致产生NxS/T序列子。
实施例2：证明HEK293T细胞中核酸酶的表达和分泌与培养基中残留DNA的减少相关
使用不同比例的填充DNA(pBluescript)和pSV40-smNucAH6，用固定量的质粒DNA(总μg)转染HEK293T细胞，pSV40-smNucAH6编码与C末端His标签融合的SmNucA，以进行蛋白检测。通过对His标签进行免疫印迹分析细胞裂解物和培养基(将内源性His标记的蛋白“TRAPH6”用作上样对照)，这表明SmNucAH6以剂量依赖性方式在培养物中表达和分泌。通过PicoGreen测定对澄清的培养物上清液中的残留DNA进行分析，这表明在DNA检测中的减少仅在培养基中存在SmNucAH6的条件下发生。结果如图4中所示。
实施例3：慢病毒载体生产期间C末端组氨酸标记的和未标记的分泌型核酸酶
通过以占总pDNA 10％的输入将分泌型核酸酶质粒瞬时共转染至贴壁或悬浮HEK293T细胞中生产基于HIV-1的慢病毒载体。澄清前，“未处理”慢病毒载体收获物，或将其用
Figure BDA0002680207430000701
处理1小时。未使用
Figure BDA0002680207430000702
处理分泌型核酸酶培养物。通过PicoGreen测定分析过滤的培养基。在培养基中，分泌型核酸酶与
Figure BDA0002680207430000703
相比产生相当或更好的DNA减少作用。结果如图5中所示。
实施例4：真核ER信号肽能够替代smNucA的细菌分泌肽
通过以占总pDNA1％的输入将分泌型核酸酶质粒瞬时共转染至贴壁HEK293T细胞中生产基于HIV-1的慢病毒载体(HIV-CMV-GFP)。SmNucA ORF包含其天然细菌分泌信号(天然)或人白蛋白ER信号肽(Hu白蛋白ER-SP)或VSV-G ER信号肽(VSV-G ER-SP)。未使用
Figure BDA0002680207430000704
处理慢病毒载体收获物。通过PicoGreen测定分析过滤的培养基(黑色柱子)，并通过转导HEK293T细胞然后通过流式细胞术来滴定慢病毒载体。结果如图6中所示。
实施例5：在瞬时转染载体组分期间在贴壁HEK293T细胞培养物中产生慢病毒载体期间不同的分泌型核酸酶
通过以占总pdNA 1％的输入将SmNucAH6或VsEndAH6核酸酶质粒瞬时共转染至贴壁HEK293T中生产基于HIV-1的慢病毒载体(HIV-CMV-GFP)。载体收获前，“未处理”慢病毒载体收获物，或将其用
Figure BDA0002680207430000705
处理1小时。未使用
Figure BDA0002680207430000706
处理分泌型核酸酶培养物。通过PicoGreen测定分析过滤的培养基(黑色柱子)，并通过转导HEK293T然后通过流式细胞术来滴定LV。结果如图7中所示。
实施例6：在贴壁稳定生产细胞系培养物中产生慢病毒载体期间不同的分泌型核酸酶
以占总pDNA 1％的输入(加入pBluescript作为标准填充)使用SmNucAH6或VsEndAH6核酸酶质粒瞬时转染生产细胞系生产基于HIV-1的慢病毒载体(HIV-CMV-GFP)。转染后约18小时，通过加入多西环素(终浓度1000ng/ml)诱导培养物，这导致了由CMV-tetO启动子驱动的包装组分的表达(GFP基因组组成型表达)。通过PicoGreen测定分析过滤的培养基(黑色柱子)，并通过转导HEK293T然后通过流式细胞术来滴定LV。结果如图8中所示。
实施例7：在悬浮细胞培养物中产生慢病毒载体期间不同的分泌型核酸酶
在混悬的HEK293T细胞中生产基于HIV-1的慢病毒载体(HIV-CMV-GFP)。以占总pDNA 5％的输入使用SmNucAH6或VsEndAH6核酸酶质粒瞬时共转染细胞。载体收获前，“未处理”慢病毒载体收获物，或将其用
Figure BDA0002680207430000711
处理1小时。未使用
Figure BDA0002680207430000712
处理分泌型核酸酶培养物。通过PicoGreen测定分析过滤的培养基(黑色柱子)，并通过针对18SDNA的qPCR针对生产细胞DNA分析纯化的总DNA(浅灰色柱子)。通过转导HEK293T随后通过流式细胞术滴定慢病毒载体上清液(深灰色柱子)。将浓缩的载体上清液进行SDS-PAGE，并使用抗His Tag抗体进行免疫印迹，以检测分泌型核酸酶蛋白。结果如图9中所示。
实施例8：使用BacNucB和BacNucB变体清除慢病毒载体生产上清液、无血清细胞培养物中的残留质粒DNA
芽孢杆菌BacNucB蛋白(SEQ ID No:4)不包含任何NxS/T序列子，因此当靶向真核细胞中的分泌途径时不能被N-糖基化。因此，尚不清楚BacNucB是否能有效用于清除载体生产培养物中的残留DNA，因为缺乏N-糖基化可能会阻碍分泌水平。将在图2中概述的工作流程应用于BacNucB的一级序列(SEQ ID NO:4)。分析序列，并使用TMHMM(CBS)确定信号肽(预计为TM)的C末端侧不存在TM(跨膜)结构域。通过SignalP(CBS)对BacNucB的分析证实，细菌分泌肽预计可充当ER信号肽，预计其切割可产生完整的成熟核酸酶。通过YAPIN(综合生物信息学VU(IBIVU)中心)的进一步分析预测了α螺旋、β链和螺旋的区域，这些区域精确定位了可以将NxS/T基序引入BacNucB蛋白序列而不破坏较小折叠的区域。这样，鉴定了下述4个BacNucB变体：P43N(序列子＝NAS)是变体“N1”、G61N(序列子＝NHS)是“N2”、V65N(序列子＝NCT)是变体“N3”和D133N(序列子＝NGT)是变体“N4”。将在43、61、65和133具有“N”突变的BacNucB的一级序列提交至NetNGlyc(CBS)进行分析。所有四种NxS/t序列子的评分均高于阈值(0.5)，其中N65和N133变体均获得了改进功能性的最高概率。结果如图10中所示。
根据上述分析，通过将NxS/T序列子插入其一级氨基酸序列产生BacNucB的四种变体(N1、N2、N3和N4)，所述一级氨基酸序列在天然蛋白序列中的四个YxS/T位点由Y残基突变为N。这是在预计不会参与二级折叠的位置进行的，以使得潜在的N-糖基化不会影响蛋白折叠的可能性最大化。
将所有BacNucB表达质粒在其C末端His标签化，以使其易于检测。以占总pDNA 5％的输入使用HIV-CMV-GFP载体组分和核酸酶质粒转染悬浮的、无血清HEK293T细胞。通过针对KanR序列的qPCR针对残留质粒分析来自载体收获物的纯化的总DNA(黑色柱子)。通过转导HEK293T随后通过流式细胞术滴定慢病毒载体上清液(灰色柱子)。将浓缩的载体上清液进行SDS-PAGE，并使用抗His Tag抗体进行免疫印迹，以检测分泌型核酸酶蛋白。数据表明，BacNucBH6仅适度清除残留质粒DNA，但是两种N-聚糖变体显示出增强的残留质粒DNA清除。值得注意的是，就残留DNA清除而言，编码VsEndAH6的表达质粒优于编码BacNucB的所有表达质粒。
实施例9：使用VcEndA变体清除慢病毒载体生产上清液、无血清细胞培养物中的残留质粒DNA
VcEndA和VsEndA的氨基酸序列具有68％同一性(分泌型)。已发现，VcEndA在150至200mM之间的盐中(即，接近于在典型真核细胞培养物中的盐浓度)具有最佳活性，并且在pH6.5和pH7时比VsEndA的活性更高。对VcEndA的分析(按照如图2中所示的工作流程)揭示了其四种NxS/T序列子中的三种在VsEndA中不存在。通过在所有三个位置消除这些序列子产生“1glc”VcEndA变体(如图3中所示)。使用人白蛋白ER信号肽以及任选地C末端His标签产生其他VcEndA变体。(注：wt＝VcEndA，1＝VcEndA-1glc，2＝AlbVcEndA，3＝AlbVcEndA-1glyc；4，5，6，7＝分别是His标签化形式的wt，1，2，3)。以占总输入pDNA 5％使用核酸酶质粒共转染在悬浮、无血清培养物中制备HIV-CMV-GFP载体。通过转导HEK293T细胞随后通过流式细胞术滴定慢病毒载体上清液(柱子)。使用抗-His标签抗体对浓缩的载体上清液(VcEndA变体4-7)进行SDS-PAGE/免疫印迹，以检测分泌型核酸酶蛋白以及VSV-G(慢病毒载体病毒体)。还检测了生产后细胞裂解物的核酸酶表达情况。通过琼脂糖电泳目测检查来自载体上清液的残留DNA。VcEndA(wt)很少分泌到培养基中，但是有效分地分泌了“1glc”变体，从而有效清除了残留DNA。结果如图12中所示。
实施例10：以0.5L规模在慢病毒载体生产生物反应器中降解残留DNA
将悬浮、无血清的适应性HEK293T细胞接种到六个0.5升(L)生物反应器中，并使用基于HIV-1的慢病毒载体组分(表达GFP的基因组)以及pBluescript(在图13中称为
Figure BDA0002680207430000731
)或pSV40-VsEndAH6(占5％总质粒输出)转染一式三份生物反应器。转染二十小时后，以10mM的终浓度将丁酸钠(NaBut)加入所有生物反应器。NaBut诱导四小时后，取样(生物反应器[NaBut 4hr后])。在收获载体前1小时，用终浓度为5U/ml的
Figure BDA0002680207430000732
接种pBluescript共转染的生物反应器。未处理pSV40-VsEndAH6共转染的生物反应器。然后，将来自一式三份生物反应器的收获物原液混合以产生～1L收获物，对其进行0.45μm过滤，并取样进行分析(CL收获物)。进行该混合，以使其能够以允许使用反映典型的大规模下游过程的设备/流速的规模执行下游过程。对材料进行离子交换(IEX)层析，收集样品(IEX流过、IEX洗涤、IEX洗脱物和使用2M盐的IEX柱清洁)，随后使用利用中空纤维滤芯的透析/超滤进行进一步处理。第一步进行缓冲液交换(HFF前-
Figure BDA0002680207430000734
)，然后将400U/ml
Figure BDA0002680207430000735
加入“标准
Figure BDA0002680207430000736
”处理载体和VsEndAH6处理载体中，作为第二个核酸酶步骤。最后，进行缓冲液交换，以除去
Figure BDA0002680207430000737
(HFF-后
Figure BDA0002680207430000738
)。对样品进行滴定以产生慢病毒载体滴度(GFP/FACS；TU/ml)，纯化残留DNA，并通过针对KanR序列的qPCR进行质粒拷贝数分析。通过将每个步骤的总体积分解，针对每个步骤产生总TU和总KanR拷贝数。结果如图13中所示。数据表明，早在转染后24小时，分泌的VsEndAAH6可使生物反应器中的KanR检测降低10倍，而慢病毒载体滴度在生物反应器中和下游处理过程中不受影响。尽管
Figure BDA0002680207430000739
处理的收获物似乎将KanR的检测降至相似的、与VsEndAH6相比略高的水平，但是在下游过程中，在VsEndAH6材料中KanR的检测更低。这表明，尽管这两种方法相比在CL收获物中检测到KanR的拷贝数相似，但是这两种条件之间存在质的差异，即在VsEndAH6物质中残留DNA可能尺寸更小(该证据参见图14)，并且在下游过程中更易于除去。
实施例11：以5L规模在慢病毒载体生产生物反应器中降解残留DNA
以与针对0.5L生物反应器的描述(实施例10)类似的方法，但是以5L规模的单一生物反应器生产表达GFP的基于HIV-1的慢病毒载体。还采用对
Figure BDA0002680207430000741
和分泌型核酸酶方法平行地对SAN-HQ进行了检测(以占总质粒输入5％共转染pSV40-VsEndAH6)。图14A显示了在每个工艺步骤的总慢病毒载体TU和可检测的质粒(KanR)，以及图14B显示了通过凝胶电泳(针对DNA的溴化乙锭染色)分析的来自上游和下游工艺步骤的浓缩样品。如图13中所示，表达质粒表达的分泌型核酸酶在减少质粒DNA方面与商业化核酸酶(如
Figure BDA0002680207430000742
)相比相当或更好，但是另外地，将总DNA(其将包含生产细胞DNA)消化成更小的片段似乎可以更有效地被在HFF滤芯上进行的最后的核酸酶步骤除去。
实施例12：使用tetR调控的核酸酶表达质粒在慢病毒载体生产培养物中降解残留DNA
通过分别以1％或5％总质粒DNA输入使用载体组分和pCMV-TO-VsEndAH6对无血清、悬浮适应性HEK293T.tetR细胞瞬时转染生产编码GFP的基于HIV-1的载体(图15)。将未接受核酸酶质粒的培养物与pBluescript共转染。转染后约20小时，所有培养物均使用丁酸钠和1000ng/mL多西环素(第1、3-6道；当存在时诱导VsEndAH6表达)，但使用5％pCMV-TO-VsEndAH6转染的培养物重复设置除外，其仅接受丁酸钠(无dox；第2道)。对照培养物或者未经处理(无Nuc)，或者在收获前1小时用5U/mL终浓度的
Figure BDA0002680207430000743
或SAN处理。在收获前1小时，所有培养物均接受终浓度为2mM的MgCl2。所有条件均重复三次。收获时，通过离心除去生产细胞，并过滤上清液(0.22μm)，随后通过转导HEK293T细胞之后进行流式细胞术进行滴定。合并一式三份培养物的上清液，并通过使用3K截止值Amicon-15装置离心将～2mL浓缩至0.12mL，并将50％这种物质上样至2％琼脂糖凝胶，对残留DNA进行电泳(溴化乙锭)。数据表明，tetR调控的核酸酶表达可用于瞬时控制核酸酶表达；转染后20小时添加多西环素可导致分泌型核酸酶具有足够的活性水平，与商业化核酸酶相比，其残留DNA的清除率提高了。在存在分泌型核酸酶的条件下产生的慢病毒载体的滴度均高于1x106TU/mL，表明对载体输出的影响极低。
实施例13：通过与表达分泌型核酸酶的辅助细胞共培养在慢病毒载体生产培养物中降解残留DNA
通过使用载体组分对无血清、悬浮适应性HEK293T-1.65S细胞瞬时转染生产编码GFP的基于HIV-1的载体。平行地且以相同规模，使用tetR调控的核酸酶质粒pCMV-TO-VsEndAH6或pCMV-TO-smNucAH6转染无血清、悬浮适应性HEK293T.tetR细胞。转染后约20小时，用10％辅助细胞培养物以及丁酸钠和1000ng/mL dox接种培养物，以诱导从辅助细胞中表达核酸酶。对照培养物或者未经处理(无Nuc)，或者在收获前1小时用5U/mL终浓度的
Figure BDA0002680207430000751
或SAN处理。在收获前1小时，所有培养物均接受终浓度为2mM的MgCl2。所有条件均重复三次。收获时，通过离心除去生产细胞，并过滤上清液(0.22μm)，随后通过转导HEK293T细胞之后进行流式细胞术进行滴定。合并一式三份培养物的上清液，并通过使用3K截止值Amicon-15装置离心将～2mL浓缩至0.12mL，并将50％这种物质上样至2％琼脂糖凝胶，对残留DNA进行电泳(溴化乙锭)。结果如图16中所示。数据表明，表达核酸酶的辅助细胞可以与载体生产细胞共培养，从而允许分泌型核酸酶的活性水平足够高，这是通过与商业化核酸酶相比残留DNA清除率提高所表明的。在存在分泌型核酸酶的条件下产生的慢病毒载体的滴度均高于1x106TU/mL，表明对载体输出的影响极低。
实施例14：表达用于在需要冻融步骤的载体生产期间降解残留核酸的分泌型核酸酶的基于AAV和基于腺病毒的载体生产系统
A.在通过瞬时转染生产AAV载体中使用分泌型核酸酶的工作流程：
1.向培养瓶(贴壁或悬浮)中接种生产细胞(例如，HEK293)
2.将载体组分与核酸酶质粒瞬时共转染：
i.载体组分pAAV基因组:pRepCap:p辅助(例如，以1:1:1的比例)多质粒转染，以及作为总pDNA的一部分与p核酸酶共转染
ii.通过试剂(Lipofectamine或PEI)进行转染
3.孵育转染细胞培养物几天(例如，2-4天)
4.细胞裂解：
i.直接冻融在培养基中的生产细胞，或
ii.浓缩生产细胞，随后化学裂解或物理裂解，例如微流化/冻融
iii.孵育有限的时间，以使得分泌型核酸酶消化污染DNA
5.过滤和任选地冷冻原料原液
6.下游纯化/浓缩，例如层析(离子交换)、透析/超滤和/或体积排阻。
B.在通过扩增表达腺病毒E1的细胞生产腺病毒载体中使用分泌型核酸酶的工作流程：
1.向培养瓶(贴壁或悬浮)中接种生产细胞(例如，HEK293)
2.以MOI＝1接种腺病毒载体原种
3.孵育培养物24-72小时，或直至～50％可见的细胞病变效应(cpe)
4.细胞裂解：
i.直接冻融在培养基中的生产细胞，或
ii.浓缩生产细胞，随后化学裂解或物理裂解，例如微流化/冻融
iii.孵育有限的时间，以使得分泌型核酸酶消化污染DNA
5.过滤和任选地冷冻原料原液
6.任选地，连续放大步骤1-5
7.下游纯化/浓缩，例如层析(离子交换)、透析/超滤和/或体积排阻
实施例15：在慢病毒载体生产无血清、悬浮培养物中降解残留DNA的含有NxS/T序列子切除突变的VcEndA变体的产生和评价
使用编码与LV组分pDNA共转染的质粒(0.5％或5％的总输入pDNA)的不同分泌型核酸酶由无血清、悬浮的适应性HEK293T-1.65S细胞生产编码GFP的基于HIV-1的载体。所检测的分泌型核酸酶在其C末端均被His标记，以便于通过免疫印迹检测。检测了图17B中所示的所有序列子突变的变体以及野生型VcEndA(“1234-glc”)、SmNucA和VsEndA。
使用针对His6-标签(核酸酶)、微管蛋白(细胞对照)或VSVG(分泌对照，即在LV病毒体上的VSVG)的抗血清，对生产结束时的细胞裂解物和浓缩的上清液进行SDS-PAGE和Western印迹-见图18A&B。这些免疫印迹表明，分泌型核酸酶(均以其糖基化形式)在细胞中表达，并在LV生产期间分泌至一定水平。野生型VcEndAH6-1234glc核酸酶(和VcEndAH6-123glc变体)分泌较差，这表明NxS/T序列子切除法可用于产生新的和改进的分泌核酸酶变体。总而言之，1glc和12glc变体主要是单糖基化的，而所有其他形式的VcEndAH6则是双糖基化的。通过推论，可以得出结论：如果存在，则使用VcEndAH6(wt)和VcEndAH6-134glc之外的在102NCT(#1)、130NRS(#3)和133NFS(#4)的序列子，其实际上只使用了这些序列子中的两个。LV滴度均高于1x107TU/mL，表明在分泌型核酸酶存在的条件下能够生产交给滴度的载体(图19A)。
还对培养物上清液进行处理，以得到浓缩样品，然后通过凝胶电泳显像分析残留DNA的含量(图19B)。这项分析揭示了残留DNA降解与分泌改善之间的一般相关性。然而，当在VcEndAH6中存在130NRS序列子(#3)时，即使有效分泌核酸酶，DNA降解的效率也低得多；这表明VcEndA中的NRS序列子优选用于N-糖基化，但这种修饰会导致核酸酶活性减弱。
实施例16：在不同设定的pH条件下使用分泌型核酸酶在慢病毒载体生产无血清、悬浮培养物中降解残留DNA
使用编码与LV组分pDNA共转染的质粒(5％的总输入pDNA)的不同分泌型核酸酶由无血清、悬浮的适应性HEK293T-1.65S细胞生产编码GFP的基于HIV-1的载体，转染后将培养物设定为两个不同pH水平；pH7.2(弱碱性)和pH6.6(弱酸性)-见图20-22。使用AMBR-15系统设置重复的12mL培养物，并在生产运行的每一天测量pH水平(图20A)和细胞活力(图20B)。转染当天(第2天)，在添加pDNA/lipofectamine转染混合物后，pH设定点为6.6±0.15或7.2±0.15，这些pH设定点一直保持到第4天收获LV时。所使用的分泌型核酸酶质粒为pSV40-VcEndAH6-1glc(SEQ ID NO:11，具有C末端His6标签)、pSV40-VsEndAH6(SEQ ID NO:2，具有C末端His6标签)和pSV40-SmNucAH6(SEQ ID NO:3，具有C末端His6标签)。其余12个转染/培养物掺入5％pBluescript，并且不接受任何分泌型核酸酶。在收获LV之前，将这些剩余的12个培养物用
Figure BDA0002680207430000771
(4个培养物)、SAN(4个培养物)处理1小时，或未进行处理(4个培养物)；对于每个pSecNuc转染的培养物(每种情况下为4个)，将其配对至pH6.6和pH7.2设定点检测条件。
使用针对His6-标签(核酸酶)、微管蛋白(细胞对照)或VSVG(分泌对照，即在LV病毒体上的VSVG)的抗血清，对生产结束时的细胞裂解物和浓缩的上清液进行SDS-PAGE和Western印迹-见图21A&B。这些免疫印迹表明，分泌型核酸酶(均以其糖基化形式)在细胞中表达，并在LV生产期间有效地分泌。
在HEK293T细胞上滴定LV-CMV-GFP上清液，其表明所有条件均能够使LV产量超过1x106TU/mL，且在两个pH设定点的生产滴度基本相似(图22A)。还对培养物上清液进行处理，得到浓缩样品，然后通过凝胶电泳显像分析残留DNA含量(图22B)。与未经处理相比，用分泌型核酸酶或
Figure BDA0002680207430000781
/SAN处理的所有培养物均显示出较低的残留DNA量，此外分泌型核酸酶通常优于商业化核酸酶。与pH6.6相比，在pH7.2时，VsEndAH6显示出更好的残留DNA清除性质。然而，VcEndAH6-1glc和SmNucAH6似乎都可以在两个pH设定点上有效清除残留DNA；值得注意的是，VcEndAH6-1glc实现了这一目标，且同时似乎对LV滴度的影响最小。
实施例17：在不同设定pH条件下载慢病毒载体生产无血清、混悬培养物中残留DNA的降解：比较两种不同VcEndA的N-聚糖突变体的活性
实施例15鉴定了三种VcEndA变体，其与野生型VcEndA相比具有改善的分泌和残留DNA清除率，并且对LV滴度的影响最小/没有影响。其为VcEndAH6-1glc、-14glc和-124glc。实施例16在碱性或酸性培养条件下在搅拌釜式微型生物反应器中与VsEndAH6和SmNucAH6一起检测了VcEndAH6-1glc变体，证明在酸性pH下，VsEndAH6的效率比VcEndAH6-1glc低。由于VcEndAH6-1glc具有基于VsEndA的残基发生突变的突变NxS/T序列子，因而尚不清楚如果“重新设置”其他NxS/T序列子是否能够进一步改善在酸性条件下改善的VcEndAH6-1glc活性。进行与实施例16中概述的类似的实验(在pH6.6或7.2下，在搅拌釜式微型生物反应器[AMBR-15]中，生产LV-CMV-GFP载体和分泌型核酸酶)，以及对VcEndAH6-124glc、VcEndAH6-1glc和VsEndAH6与商业化核酸酶进行比较(图23&24)。记录pH设定点和细胞活力(图24A&B)，以及滴定LV，结果表明这些核酸酶对生产滴度没有影响(图24A)。还对培养物上清液进行处理，得到浓缩样品，然后通过凝胶电泳显像分析残留DNA含量(图24B)。这项分析表明，VcEndAH6-1glc和VcEndAH6-124glc的残留DNA清除水平非常相似，两个变体均胜过VsEndAH6，并且在酸性条件下显示出增强的活性。这些数据表明，尽管在其一级序列中引入了修饰，但VcEndAH6-1glc变体在酸性pH下仍具有完整的活性特征，这可能表明改变后的残基对核酸酶活性没有贡献，从而使VcEndA与VsEndA区分开来。
实施例18：在基于AAV的载体生产期间使用分泌型和细胞保留型核酸酶降解残留DNA
对于其中载体病毒体仍与生产细胞结合的病毒载体(如AAV和AdV)的生产，预计可以通过添加破坏细胞的试剂(如去垢剂)直接在生物反应器内原位裂解生产细胞。在这种情况下，培养基中存在分泌型核酸酶以降解污染DNA。然而，如果将生产细胞从培养基中分离(例如，通过沉淀或离心或更换培养基)，则希望共表达的核酸酶保持与细胞结合，以便在细胞裂解后存在并具有活性。该实施例显示了使用已知ER保留信号“KDEL”附接在核酸酶的C末端如何在scAAV2-GFP生产期间提高细胞裂解物的残留DNA清除率。图25显示了(以非限制性术语)ER-保留信号如何能够附接至核酸酶，所述核酸酶分泌至ER腔导致其结合至“ER保留缺陷型[ERD]互补基团”蛋白受体，以使得不断循环回到ER腔。为检测这种方法，对VcEndAH6[wt](在基于HEK293T的细胞中分泌很少；见图18AB)和VcEndAH6-1glc进行工程化改造，以使其含有C末端“KDEL”序列。图26显示了通过将悬浮、无血清HEK293T细胞与所示核酸酶表达质粒(占总输入的5％)以及AAV2载体组分质粒(基因组：RepCap2：辅助的比例为1:1:1)共转染生产scAAV2-GFP载体的结果。还检测了SmNucAH6核酸酶。包括两个不包含核酸酶表达质粒的对照(即，5％pBluescript：“AAV-NEG”)。两天后，将细胞离心并与上清液分离，以及在存在基于去垢剂的裂解缓冲液的条件下进行三次冻融事件。将氯化镁添加到所有条件下(最终为2mM)，并将SAN添加到其中一个对照中，以使得能够与商业化核酸酶(效力为75U/0.5mL细胞球团)进行比较。通过低速离心除去碎片，并将所得到的裂解物过滤，随后在HEK293T细胞上滴定含粗载体的上清液(图26A)，以及通过琼脂糖凝胶电泳(溴化乙锭)分析残留DNA(图26B)。该实施例表明在存在共表达的核酸酶的条件下能够产生高滴度的scAAV2-GFP，但是在该质粒输入水平下SmNucAH6将滴度降低3-4倍。在5％输入水平下，所检测的其他核酸酶不影响载体生产。对残留DNA清除率的分析表明，实际上，使用VKEndAH6-1glc和smNucAH6而无KDEL序列，可以达到非常好的DNA消化水平。与细胞裂解物结合的这两种分泌型核酸酶的水平(见图18B)似乎足以能够有效进行DNA清除，并且表明这些具有完全活性的蛋白“在路上”从细胞中分泌出来。尽管如此，与非KDEL变体相比，将KDEL附接至VcEndAH6[wt]和VcEndAH6-1glc似乎能够改善DNA清除率。如使用慢病毒载体生产所观察到的，当比较图26B中凝胶图像的密度曲线(图27)时发现，VcEndAH6-1glc比VcEndAH6[wt]形式更有效，且VcEndAH6-1glc-KDEL变体能够将残留DNA水平降至接近背景水平。变体在消除凝胶分析中通常观察到的小的“抗性”形式DNA方面，胜过其他检测的分泌型核酸酶和SAN。该实施例表明分泌型核酸酶具有与细胞结合的方式清除残留DNA的作用，但是可以通过使用ER保留信号对其进行改善。
实施例19：优化转染参数以通过瞬时转染产生核酸酶辅助细胞
在一个优选的实施方式中，应用分泌型核酸酶技术的一个主要方式是采用分开产生的核酸酶辅助细胞，并且在病毒载体颗粒产生后将其应用于主病毒载体生产培养物中。一种方法是在GMP生产活动期间平行地瞬时转染细胞，理想的情况下，使用将用于通过病毒载体编码质粒瞬时转染的相同基本细胞系。可以想到，可以产生瞬时转染的核酸酶辅助细胞的GMP库(在冻存前进行表征和验证)，然后可以将其复苏并应用于主病毒载体生产培养物中。与稳定的、tet调控的核酸酶辅助细胞相比，使用瞬时转染的核酸酶辅助细胞的公认优势是不需要化学诱导剂，如四环素或多西环素。然而，应用了辅助细胞法(瞬时的或稳定的)，在一个优选的实施方式中，重要参数将是添加到主病毒载体生产培养物中的辅助细胞的总数，以达到在主病毒载体生产培养物中分泌型核酸酶活性的所需(有效)水平。
将分泌型核酸酶质粒与病毒载体质粒一起共转染的方法(参见前面的实施例)表明，输入水平百分比(相对于转染的质粒DNA的总量)的一般范围为1-5％，具体取决于使用的启动子的强度。然而，在这种方法中，病毒载体质粒彼此之间以及分泌型核酸酶质粒均作为“载体”DNA。为了使辅助细胞方法与GMP生产兼容，在一个优选的实施方式中，仅分泌型核酸酶质粒能够转染至细胞中(没有任何“填充”DNA)，而且，达到从辅助细胞中获得分泌型核酸酶的最大表达/分泌将是理想的，以使得能够将少量的辅助细胞应用到主病毒载体生产培养物中以实现残留DNA的最大清除。为了对此进行评价，使用编码VcEndAH6-1glc或SmNucAH6的质粒对无血清悬浮HEK293T细胞进行瞬时转染，该质粒由一定范围输入量(每mL最终培养物100至900ng)的弱SV40启动子或强CMV启动子驱动。转染分为两组：使用或不使用丁酸钠诱导(终浓度为10mM)。在转染后20小时内进行丁酸钠诱导(丁酸钠诱导慢病毒载体生产的典型方案)，以模拟在丁酸钠诱导时(或之后)向主病毒载体生产培养物中添加辅助细胞的作用(已知丁酸钠在基于HEK293的细胞中上调由启动子(如CMV)驱动的基因表达)。每种分泌型核酸酶质粒均包含一个共转染对照，从而将pSecNuc(占总量的5％；每mL最终培养物62ng)与pBlueScript(占总量的95％)混合；这样做是为了能够将辅助细胞培养物中分泌型核酸酶的表达与本文其他实施例中举例说明的共转染方法进行比较。转染后两天，收获转染辅助细胞的上清液，并通过免疫印迹分析分泌型核酸酶(抗-His标签)；还通过对分泌型核酸酶和GAPDH进行免疫印迹来分析细胞裂解物。还对分泌型核酸酶的条带强度进行量化并归一化至GAPDH条带，以评估细胞中表达的分泌型核酸酶水平(图28A)，并将其与上清液中分泌型核酸酶的免疫印迹进行比较(图28B)。
数据表明(如预期的那样)，启动子强度的选择与细胞中分泌型核酸酶的表达水平相关，CMV启动子驱动的表达盒比SV40启动子相应的表达盒的表达水平更高。可以确定，≥700ng质粒DNA的转染输入(每mL细胞培养物中含≥8x105个活细胞)达到了接近最大的分泌型核酸酶表达水平。通常在CMV启动子驱动的表达盒中观察到了丁酸钠的诱导作用；与SmNucAH6相比，VcEndAH6-1glc对VcEndAH6-1glc表达的增强更为明显。这与此前的工作一致，表明SmNucAH6表达可能在某种程度上是“自我限制的”，从而进一步证明了VcEndAH6-1glc核酸酶是本发明应用中的最佳选择。将使用pSV40-VcEndAH6-1glc(主要用于本文其他实施例中示例的“共转染”方法)与pCMV-VcEndAH6-1glc构建体在≥700ng/mL输入水平下获得的VcEndAH6-1glc表达水平进行比较时，后者的表达能力至少比前者高10倍。
实施例20：当掺入病毒载体生产培养物中时对核酸酶辅助细胞的核酸酶活性输出的定量
实施例19证明，能够产生具有极高水平核酸酶分泌和核酸酶活性的核酸酶辅助细胞培养物。显然，本发明描述了多种产生核酸酶辅助细胞的方法，并且可以想象，给定辅助细胞培养物的核酸酶输出活性可以改变。因此，为了通过掺入辅助细胞使用病毒载体生产培养物达到所需/有效的核酸酶活性水平，将根据所使用的辅助细胞的核酸酶活性输出改变补充的辅助细胞的数量。然而，最理想的方法是在添加到主病毒载体生产培养物中时需要尽可能少的辅助细胞，以最大程度地减少对载体生产过程的影响(例如，对病毒载体生产细胞的影响，如稀释作用和/或竞争生长代谢产物)。为了实现这一点，在一个优选的实施方式中，分泌型核酸酶的最大表达将是所需的，或者在一些情况下是必需的；在实施例19中对此进行了举例说明。为评价通过掺入辅助细胞在病毒载体生产培养物中DNA清除的效率，进行了一项初步实验，即通过使用每mL培养物中的750ng质粒DNA瞬时转染无血清、悬浮HEK293T细胞来产生核酸酶辅助细胞，并以相对于主慢病毒载体生产容器中的细胞总数以不同输入百分比掺入慢病毒载体生产培养物；其分别是10％、5％、2.5％和1％。在该初步实验中，使用了针对VcEndAH6-1glc和SmNucAH6的SV40启动子驱动的核酸酶质粒。将主病毒载体生产和辅助培养物中的细胞用相关组分平行地转染，然后在转染后约20小时计数，随后添加适当体积的辅助细胞培养物悬液(以上述百分比表示)，以复制从原始载体生产培养物中分离出来的病毒载体生产培养物。然后，从此时开始继续进行正常的载体生产(在这种情况下，伴随添加辅助细胞进行丁酸钠诱导)，对载体收获物进行滴定并通过免疫印迹和针对残留DNA含量进行核酸酶分泌分析(图29)。使用或不使用辅助细胞产生的载体滴度均为>1x107TU/mL，在辅助细胞输入为10％和5％时影响最小(<2倍)，这可能表明向病毒载体生产培养物中添加大于10％的辅助细胞可能是不理想的(图29A)。在辅助细胞培养物中获得的分泌型核酸酶水平极高(如免疫印迹上的条带烧坏(burn-out)所示)，并且在载体生产培养物中所得的分泌型核酸酶的水平与输入百分比密切相关(图29B)。而且，与SmNucAH6相比，获得了更高水平的VcEndAH6-1glc蛋白水平。令人吃惊的是，即使在最低输入水平1％的情况下，在所有分泌型核酸酶条件下也观察到了极佳的残留DNA清除水平(图29C)。这表明可以使用利用分泌型核酸酶表达盒的核酸酶辅助细胞法，该表达盒使用活性适度的启动子，但重要的是在一个优选的实施方式中，如果使用更强的启动子，则可以将更少的核酸酶辅助细胞添加到病毒载体生产培养物中，潜在地避免了对载体滴度的任何可观察到的影响。
通过着眼于pCMV-VcEndAH6-1glc质粒的使用，并减少添加到主病毒载体生产培养物中的辅助细胞的数量，对核酸酶辅助细胞法进行了进一步评价。分别用质粒平行地转染辅助细胞和慢病毒载体生产细胞，然后在丁酸钠诱导时间点转染后约20小时，将不同比例的辅助细胞掺入载体生产培养物中。与此前类似，通过使用每mL培养物750ng质粒DNA瞬时转染无血清、悬浮HEK293T细胞来产生核酸酶辅助细胞。由于此前已证明CMV启动子驱动的表达盒产生的VcEndAH6-1glc蛋白比SV40启动子高10倍以上，因此辅助细胞的细胞输入范围减少为高达0.1％(相对于载体生产培养物中的细胞数)。考虑活细胞计数后，这相当于将30μL辅助细胞培养物添加到40mL载体生产培养物中。在该实验中，其他对照包括收获前1hr使用标准Benzonase/SAN(5U/mL)处理，并包括5％“共转染”对照(pSV40-VcEndAH6-1glc与LV组分混合)，以直接比较辅助细胞法和“共转染”法。以此前一样，继续正常进行载体的生产，并采集载体收获物用于滴定和分析残留DNA含量(图30)。使用或不使用辅助细胞产生的载体滴度均为>1x107TU/mL，并且在辅助细胞输入为5％和1％时影响最小(<3倍)(图30A)。
在浓缩(44倍)载体生产培养物中对残留DNA清除率的评估表明，分泌的VcEndAH6-1glc对残留DNA的清除非常好，这似乎与Benzonase/SAN处理的载体样品相同或更好(图30B)。值得注意的是，当在载体生产培养物中仅0.1％的细胞总数包含辅助细胞时，表观残留DNA清除水平与高输入水平的辅助细胞一样有效。有趣的是，在所有浓缩载体上清液中均观察到了“核酸酶抗性”条带(“进料特异性”)，但在浓缩辅助细胞上清液中没有观察到。这表明该条带对含有慢病毒载体的上清液具有特异性，表明其可能是(细胞中的)RNA，其可能位于病毒体内，以使其免受VcEndAH6-1glc的RNAse活性的影响。回顾慢病毒载体生产期间使用分泌型核酸酶的很多其他实例，有时可以观察到类似的条带。在该实施例中，载体上清液的折叠浓度大于此前的实施例，这可能增加了该实验中对该条带的检测灵敏度。然而，在纯化的载体材料中未观察到这样的条带(参见实施例11和21)，这表明该材料不太可能在病毒体中，并且可以通过进一步的处理(如缓冲液交换)来除去。鉴于在实施例21中所示的在5L生物反应器生产规模中VcEndAH6-1glc能够极其有效地除去所有明显的溴化乙锭染色的污染物，因此琼脂糖凝胶分析中偶尔出现该条带的原因可能是由于一些可变且未鉴定的污染物所致，其可能是游离的细胞/核糖体RNA，其通常在下游处理的载体中未检测到。
为了能够将在辅助细胞和病毒载体生产细胞培养物中获得的分泌型核酸酶的水平与单位定义的核酸酶活性联系起来，通过DNAse Alert测定针对核酸酶活性对培养物上清液进行评价，并对VcEndAH6-1glc进行免疫印迹评价(抗-His标签)。将已知核酸酶活性的商业化
Figure BDA0002680207430000831
酶储备液用作测定中的标准曲线。图31显示了这种关系，并使本发明能够根据目的核酸酶活性单位描述所需的分泌型核酸酶的表达范围。核酸酶活性(图31A)和免疫印迹(图31B)数据非常相关，不仅在两种测定类型之间，而且对于掺入载体生产培养物中的核酸酶辅助细胞的比例也是如此。重要的是，经验证DNAse Alert测定是一种高度准确的方法，因为经计算用5U/mL
Figure BDA0002680207430000841
处理的对照载体培养物平均含4.5U/mL。数据表明，对于包含5％核酸酶辅助细胞的载体生产培养物，培养基中核酸酶的活性为相当于每mL约100
Figure BDA0002680207430000842
单位。包含1％、0.5％和0.1％核酸酶辅助细胞的培养物的核酸酶活性为每mL 15.2、8.8和2.1
Figure BDA0002680207430000843
单位当量，这与添加到载体生产培养物中的辅助细胞的成比例减少非常一致。在该实验中，“共转染”的载体生产培养物达到每mL 26.3
Figure BDA0002680207430000844
单位当量。重要的是，尽管每mL含0.1％核酸酶辅助细胞的载体生产培养物“仅”达到2.1
Figure BDA0002680207430000845
单位当量，但与用5U/mL
Figure BDA0002680207430000846
或SAN处理的“标准”载体培养物相比，残留DNA的清除率至少与这些标准处理一样好。这表明，使用分泌型核酸酶与使用商业化核酸酶相比具有优势，不仅从达到更高水平的核酸酶活性(以大大降低成本)的角度来看，而且还在于其在整个载体生产期间也提供了高水平的核酸酶(即使为较低水平)，这提供了残留DNA清除更有效的模式。使用在载体生产培养物中测得的核酸酶活性，可以反算在辅助培养物中分泌型核酸酶活性的量；其为每mL约2000
Figure BDA0002680207430000847
单位当量。
实施例21：使用VcEndAH6-1glc将无血清、混悬生物反应器中的残留DNA降解至在下游工艺中无需进一步处理核酸酶的水平
实施例10和11表明，将分泌型核酸酶应用于在中型至大型悬浮生物反应器中的慢病毒载体生产培养物中有助于残留DNA的清除。在5L规模使用VsEndAH6表明，在较低pH下的培养物中该特异性核酸酶的活性可能受到限制，因为仍可通过使用添加到中空纤维滤芯上的商业化核酸酶来辅助在下游工艺材料中残留DNA的最大清除。随后验证了这种pH敏感性，并导致开发了“耐pH”的VcEndAH6-1glc核酸酶(实施例15-17)。为评估在上游工艺阶段应用VcEndAH6-1glc核酸酶是否能够在相同的下游工艺阶段(透析/超滤过程中)取消商业化核酸酶的处理，以下述方式生产了编码GFP的慢病毒载体。将悬浮、无血清适应性HEK293T细胞接种到两个5L生物反应器中，其已以5％总质粒输出使用基于HIV-1的慢病毒载体组分(表达GFP基因组)以及pBluescript(对照；进行标准
Figure BDA0002680207430000848
处理)或pSV40-VcEndAH6-1glc转染。转染后20小时，将丁酸钠以10mM的终浓度加入所有生物反应器中。收获载体前1小时，采集“In Bio”样品(移除细胞并过滤上清液)，然后使用5U/ml终浓度的
Figure BDA0002680207430000851
以及2mM MgCl2接种对照生物反应器。pSV40-VcEndAH6-1glc共转染的生物反应器仅接受2mM MgCl2。收获前，将两个生物反应器在标准生长条件下孵育1小时，然后澄清5L培养物(10μm>0.45μm)并取样(CLH)。然后，将约2.5L收获物进行下游处理。对材料进行离子交换(IEX)层析，产生约215mL IEX洗脱物，随后使用中空纤维滤芯通过透析/超滤进行进一步处理，将该体积降至65-70mL。第一步是使用“HFF前”盐进行离子交换(前-
Figure BDA0002680207430000852
处理)，取样，然后将400U/ml
Figure BDA0002680207430000853
添加到标准
Figure BDA0002680207430000854
处理的载体和VcEndAH6-1lgc处理的载体中；进行此操作以评估HFF上核酸酶步骤的任何其他获益，确定分泌型核酸酶材料是否需要其。最后，进行缓冲液交换以除去
Figure BDA0002680207430000855
(“HFF后”)。图32A显示了在生产期间两个生物反应器的pH曲线，表明达到了6.7的目标pH。通过FACS测定滴定澄清的收获载体(CLH)样品，表明标准和VcEndAH6-1glc载体的滴度分别为1.7x107和1.0x107TU/mL。通过在3K截止值的离心装置上离心对整个生产过程的样品进行浓缩，随后上样至琼脂糖凝胶(溴化乙锭)进行残留DNA分析(图32B)。残留DNA分析表明，使用VcEndAH6-1glc可以很好地清除残留DNA，并且在上游生产中使用这种核酸酶基本上可以在透析/超滤步骤中除去绝大部分污染性残留DNA，无需进一步使用商业化核酸酶。作为扩展，尽管在来自IEX柱的VcEndAH6-1glc载体洗脱液中存在可检测的残留DNA，但显然这是能够在缓冲液交换过程中从载体材料中提取出来的形式。鉴于透析/超滤中空纤维的孔径为0.2μm，这表明与载体共洗脱的残留DNA比载体颗粒更小(或在较小的蛋白复合物中)。还值得注意的是，未处理样品中存在“进料特异性”条带(参见实施例20)，其毫无疑问在透析/超滤步骤或之前丢失。在“HFF后”对照(
Figure BDA0002680207430000856
处理)载体材料中仍能够观察到残留DNA。这首次代表了使用不依赖于商业化重组核酸酶的核酸酶方法从慢病毒载体生产中除去残留DNA的能力。
实施例22：使用KDEL保留信号富集细胞组分中的VcEndAH6-1glc-KDEL
实施例18证明了在AAV载体上游生产期间使用分泌型和ER保留型核酸酶清除残留DNA。图33显示了用pSV40-VcEndAH6-1glc或pSV40-VcEndAH6-1glc-KDEL转染无血清、悬浮HEK293T细胞后收获细胞裂解物的SDS-PAGE分析。该分析支持了此前的工作，其表明能够指导核酸酶的表达，以便通过使用附加在核酸酶蛋白C末端的ER保留信号在细胞内保留/富集核酸酶。
材料和方法
核酸酶表达构建体
利用GeneArt.smNucA(NCBI参考序列：WP_047571650.1)、VsEndA(GenBank:CAQ78235.1)、VcEndA(NCBI参考序列：WP_000972597.1)、BacNucB(NCBI参考序列：WP_003182220.1)对核酸酶的开放阅读框架进行密码子和序列优化，以便在智人中高表达。通过设计使用SV40启动子和SV40多聚腺苷酸化信号的基因表达盒来评价所有核酸酶(图3A-C)。通常，将这个表达盒合成为一个片段，其编码启动子-5’utr-核酸酶-3’utr-polyA，并被接纳在GeneArt的pMK骨架中。将3’utr区设计为可容纳与6xHis-标签融合的另一个C末端，这样每个核酸酶的His标签化变体都可以通过简单的限制酶消化和质粒重新连接产生。ER信号肽变体和NxS/T序列子缺失/插入变体的构建通常通过将重新获得的合成片段(GeneArt)克隆到上述现有核酸酶质粒中进行。使用标准克隆技术，通过HindIII/NotI将核酸酶ORF插入重新获得的pf pcDNA5/TO形式中，从而克隆出诱导型核酸酶表达盒(图3D)。概括地说，用酶(每微克pDNA 5-10单位)在37’C下消化1-2小时，随后对骨架片段(Roche)进行10分钟的“快速”脱磷酸化反应，然后在100V下在1％琼脂糖凝胶中运行1小时。使用QIAQuick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)提取相关条带。在推荐条件下，使用“快速”DNA连接试剂盒(Roche)在20μL体积中以1:3的骨架:插入物比例进行连接。用2-3μL连接反应物转化约25-50μL Turbo(NEB)或Stbl2(Thermo)感受态细胞。在LBKAN琼脂糖平板上培养细菌，并在LBKAN培养基中进行微量制备。在限制性酶分析和序列确认后，通过Plus Mega试剂盒(QIAGEN)制备质粒DNA。
贴壁细胞培养、转染和慢病毒载体的生产
HEK293T细胞用于载体生产和滴定。将该细胞保持在37℃、5％CO2条件下的完全培养基(补充了10％热灭活(FBS)(Gibco)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)和1％非必需氨基酸(NEAA)(Sigma)的经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)(Sigma))中。
贴壁模式的HIV-1载体的标准规模生产在下述条件下在10cm培养皿中进行(以其他形式进行时，所有条件均按照面积缩放)：以3.5×105个细胞/mL将HEK293T细胞接种在完全培养基中，约24hr后，使用每10cm培养板下述质量比的质粒转染细胞：4.5μg基因组、1.5μg Gag-Pol、1.1μg Rev、0.7μg VSV-G(即，总计7.8μg/板)。在适当情况下，将核酸酶表达质粒以所示的占总pDNA的输入％(通常范围从0.001至10％)掺入该载体混合物中。
根据生产厂商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。约18hr后，加入丁酸钠，使其终浓度为10mM，保持5-6h，随后使用10mL新鲜无血清培养基替代转染培养基。通常，在20-24h后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃下冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前以5U/mL将
Figure BDA0002680207430000871
加入收获物1小时。
使用已建立的HEK293T.tetR14贴壁细胞系在内部开发了HEK293T.GFP.PrCL(稳定细胞系)。预先将所有包装组分和HIV-GFP基因组与选择性标记物一起稳定转染到HEK293T.TetR细胞中。将Rev和VSV-G置于Zeocin(Zeo)的选择下，将Gag-Pol置于Blasticidin(Bsr)的选择下，而将GFP基因组置于潮霉素(Hyg)的选择下。对于在基于HIV-1的载体生产细胞系中评价分泌型核酸酶的方法而言，以所示的占总输入％将核酸酶表达质粒转染至培养物中(其中将pBlueScript作为填充物添加到共计7.8μg/10cm的培养板或同等比例的量/面积中)。为了诱导载体生产，在丁酸钠诱导步骤添加多西环素，其终浓度为1μg/mL。
悬浮细胞培养、转染和慢病毒载体的生产
在37℃、5％CO2条件下，在振荡培养箱中(25mm轨道，设定为190RPM)，在Freestyle+0.1％CLC(Gibco)中培养HEK293T.TetR14S(稳定整合的密码子优化的tetR)和HEK293T.1-65s悬浮细胞。使用悬液的所有载体生产均在125ml摇瓶中以25ml工作体积进行，或在AMBR-15生物反应器中以12mL工作体积进行。在整个载体生产期间，以8x 105个细胞/ml将HEK293T细胞接种在无血清培养基中，并在37℃、5％CO2条件下振荡孵育。对于AMBR-15生物反应器生产，将培养物设定为pH7.2。接种后约24hr，使用编码基因组(GFP)、gagpol、rev和VSVG的载体组分质粒混合物转染细胞。在适当情况下，将核酸酶表达质粒以所示的占总pDNA的输入％(通常范围从0.1至10％)掺入该载体混合物中。
根据生产厂商的方案(Life Technologies)，通过在Opti-MEM中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。对于AMBR-15生物反应器生产，转染后立即将培养物设定为pH6.6或pH7.2。约18hr后，加入丁酸钠(Sigma)，使其终浓度为10mM。通常，在20-24h后收获载体上清液，然后过滤(0.22μm)并在-20/-80℃下冷冻。作为核酸酶处理的阳性对照，通常在过滤前以5U/mL将
Figure BDA0002680207430000881
或SAN加入收获物1小时。对于AMBR-15生物反应器生产，在整个过程中监测pH和细胞活力。
在0.5或5L搅拌釜式生物反应器中生产慢病毒载体以及下游处理
将悬浮适应性HEK293T细胞系克隆1.65s和补充的无血清培养基用于生物反应器研究。复苏由MCB培养的细胞，并在锥形瓶中按比例放大，然后在预先平衡的含5％CO2的空气培养箱中在37℃下以及湿润气氛中培养。将细胞保持在轨道摇床平台上的悬液中。
始终积极管理生物反应器中的溶解氧和pH；还监测代谢产物和副产物的水平。监测细胞活力，并在适当情况下使用消泡剂。使用转染试剂，将生物反应器培养物与四种质粒pHIV-CMV-GFP(基因组)、pSynGPK(gagpol)、pOB-Rev和pOB-VSVG共转染。其中，通常以占总量5％将所示的p核酸酶加入pDNA混合物中。转染后20小时，使用10mM丁酸钠诱导生物反应器培养物。诱导后24小时收获载体，指示在收获前任选用5U/mL或25U/mL商业化核酸酶(
Figure BDA0002680207430000882
或SAN-HQ)处理1小时。
将载体上清液预澄清(≥10μm)，然后通过0.22-0.45μm过滤进一步澄清。通过使用Sarto-Q柱的离子交换层析处理至少1L澄清的载体收获物，通常包括低浓度盐洗涤和预洗脱洗涤缓冲液，然后在含有>1M NaCl的缓冲液中洗脱并立即稀释洗脱物以保持载体病毒体的活性。然后，对洗脱物迅速进行中空纤维透析/超滤处理，先将缓冲液交换为低盐条件，然后再添加400U/mL商业化核酸酶和2mM氯化镁作为第二核酸酶精细处理步骤。最后，进行最终的缓冲液交换以除去商业化核酸酶。
通过瞬时转染产生核酸酶辅助细胞实现最大核酸酶表达
以8x105个细胞/mL将悬浮适应性、无血清HEK293T细胞平行接种至主病毒载体生产培养物中，并在37℃、5％CO2条件下在Freestyle+0.1％CLC(Gibco)中培养过夜。次日，使用Lipofectamine 2000CD，用>750ng pCMV-VcEndAH6-1glc每mL培养物转染细胞(使用载体组分转染载体生产培养物)。丁酸钠诱导时(最终10mM)，以靶细胞输入水平接种核酸酶辅助细胞，以达到在主载体生产容器中所述总细胞计数的百分比。然后，如上所述继续进行载体生产。
慢病毒载体滴定测定
对于慢病毒载体滴定，以1.2x 104个细胞/孔将HEK293T细胞接种在96孔板中。将编码GFP的病毒载体用于在含有8mg/ml聚丙烯和1x青霉素链霉素的完全培养基中转导细胞约5-6hr，然后加入新鲜培养基。将转导的细胞在37℃、5％CO2条件下孵育2天。然后，制备用于通过FACSVerse(BD Biosciences)进行流式细胞术的培养物，测量GFP表达百分比，并在孵育2天后使用预计细胞数来估算载体滴度。
AAV载体的生产
对于AAV载体的生产，在转染前约20小时，以8x105个细胞/mL将HEK293T-1.65S无血清、悬浮适应性细胞接种到培养瓶中。转染时，通过使用等质量的pscAAV-CMV-GFP(基因组)、pRepCap2(编码所有必须的病毒包装组分，包括组装激活蛋白[AAP])和p辅助(AdenoE2A、E4和VA RNA功能)以及占总pDNA质量5％的核酸酶编码质粒或pBluescript(阴性对照)转染细胞启动自互补(sc)AAV-GFP载体的生产。根据生产厂商的方案(LifeTechnologies)，通过在无血清培养基中将DNA与Lipofectamine 2000CD混合来介导转染。两天后，通过低速离心收集细胞，并在存在去垢剂裂解缓冲液的条件下通过三个冻融循环裂解细胞。接下来，在8个细胞球团体积的无血清DMEM中吹打裂解物。以2mM的终浓度将氯化镁加入裂解物中，并在37℃下孵育1小时。对于“商业化”阳性对照，以25U每0.5mL有效细胞球团体积的重复阴性对照裂解物加入盐活性核酸酶(SAN-HQ；Articzymes)，并在存在2mMMgCl2的条件下在37℃下孵育1小时。不使用核酸酶孵育阴性对照裂解物。低速离心经处理的细胞裂解物以除去碎片，然后滤过上清液(0.45μm)，随后在≤-20C下贮存，之后进行进一步分析。
AAV载体滴定测定
对于AAV载体滴定，以1.2x 104个细胞/孔将HEK293T细胞接种在96孔板中。使用编码GFP的病毒载体在含有1x青霉素链霉素的无血清培养基中转导细胞约5hr，然后加入新鲜的含血清培养基。将转导的细胞在37℃、5％CO2条件下孵育3天。然后，制备用于通过AttuneNxT(Thermofisher)进行的流式细胞术的培养物；测量GFP表达百分比，并使用细胞计数和载体稀释度估算载体滴度。
通过
Figure BDA0002680207430000901
测定进行残留DNA检测
将Quant-iTTM
Figure BDA0002680207430000902
dsDNA测定试剂盒(Life Technologies)用于测定收获的载体材料中的残留DNA。将λ储备DNA在Tris和EDTA(TE)缓冲液中连续稀释以制备DNA标准品。还使用TE缓冲液以1:10的比例稀释收获的载体样品，然后添加PicoGreen测定试剂(根据生产厂商的方案制备)并避光孵育样品2至5min。使用EM酶标仪(Gemini)进行顶部读数，测量样品中PicoGreen试剂的荧光。
通过定量PCR测定进行残留DNA检测
使用QIAamp DNA Mini试剂盒(QIAGEN)从载体样品中提取DNA。在提取过程中，将含有无核酸酶水(NFW)(Gibco)的模拟样品作为过程对照(IPC)。
对提取DNA进行18S定量聚合酶链反应(PCR)(qPCR)；反应扩增了细胞来源的18SDNA短片段。混合物包含
Figure BDA0002680207430000903
Green PCR Mastermix(Life Technologies)、18S引物(在10mM Tris-HCl中制备，pH 7)(Sigma)和NFW。
正向引物：5’ACCGCAGCTAGGAATAATGG3’
反向引物：5’CTCAGTTCCGAAAACCAACA3’
为产生DNA标准品，将线性化18S质粒从1x 106个拷贝/5μl连续稀释至1x 102个拷贝/5μl。将样品以1:5的比例稀释，随后添加反应混合物。在标准化学qPCR条件下，使用using QuantStudioTM 6 Flex系统(Life Technologies)进行反应。使用QuantStudioTM6Flex系统软件(Life Technologies)设置并分析qPCR运行。
对照设置包括无模板对照(NTC)(用于控制PRC反应混合物的污染)、IPC样品(用于控制在提取过程中的DNA污染，以及最后用于监测PCR抑制)、包括加标PCR抑制剂对照(SPIC)(通过将1x 104个拷贝的18S标准DNA加入IPC样品中)。
对提取DNA进行KanR定量聚合酶链反应(PCR)(qPCR)；反应扩增了质粒来源的KanRDNA短片段。混合物包含
Figure BDA0002680207430000904
通用PCR Master Mix(Life Technologies)、KanR引物和探针集合(在10mM Tris-HCl中制备，pH 7)(Sigma)和NFW。
正向引物：5’AGATGGATTGCACGCAGGTT3’
反向引物：5’TGCCCAGTCATAGCCGAATAG3’
探针：5’(FAM)CTCCACCCAAGCGGCCGGA(TAMRA)3’
为产生DNA标准品，将线性化KanR+质粒从1x 106个拷贝/5μl连续稀释至1x 102个拷贝/5μl。将样品以1:5的比例稀释，随后添加反应混合物。在标准化学qPCR条件下，使用using QuantStudioTM 6 Flex系统(Life Technologies)进行反应。使用QuantStudioTM6Flex系统软件(Life Technologies)设置并分析qPCR运行。
对照设置包括无模板对照(NTC)(用于控制PRC反应混合物的污染)、IPC样品(用于控制在提取过程中的DNA污染，以及最后用于监测PCR抑制)、包括加标PCR抑制剂对照(SPIC)(通过将1x 104个拷贝的KanR标准DNA加入IPC样品中)。
通过凝胶电泳的可视化残留DNA检测
将LV粗载体上清液过滤澄清，并任选地在37℃下用蛋白酶K处理1小时。在AmiconUltra-15 3K截止值过滤单元中离心澄清的样品，以将DNA浓缩高达150倍。在2％琼脂糖/TBL凝胶上对样品进行标准电泳(通过溴化乙锭对DNA显影)，并平行地运行1kbp/100bp DNA梯。
通过DNAse AlertTM测定(在本文中称为“测定法1”)对核酸酶活性的定量DNAseAlertTM测定(IDT)可以用于在病毒载体培养基中对核酸酶活性进行定量。该测定的基础是使用荧光标记和淬灭的核苷酸探针，该探针仅在被核酸酶降解时才发出荧光信号。按照生产厂商的建议使用该试剂盒，使用的标准曲线由从5U/mL至0.08U/mL的连续稀释的
Figure BDA0002680207430000911
组成。应对含有分泌型核酸酶的病毒载体培养基上清液进行连续稀释，以使荧光活性落在标准曲线的上限和下限之内。
Figure BDA0002680207430000912
的单位定义(在本工作进行时)为“一个单位将在37℃、pH 8.0下在30min内将超声处理的鲑鱼精子DNA消化成酸溶性寡核苷酸相当于ΔA260为1.0(反应体积为2.625ml)”。预期该单位定义将来不会改变，因而已经针对该标准单位活性进行了QC确认的商业上可获得的
Figure BDA0002680207430000913
可用于DNAse Alert分析中，以验证本发明中获得的分泌型核酸酶的活性。如果
Figure BDA0002680207430000914
的供应商出于任何原因改变了单位定义，则可以预期“旧的”和“新的”单位定义之间的关系是已知的，因而也适用于本发明中报告和要求保护的分泌型核酸酶的活性。
上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和主旨的前提下，本发明所描述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方式描述了本发明，但是应当理解的是，要求保护的本发明不应不适地限于这些特定的实施方式。

Claims (82)

1.一种病毒载体生产系统，其包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
2.一种病毒载体生产系统，其包含：1)病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码病毒载体组分的核酸序列；和2)核酸酶辅助细胞，所述核酸酶辅助细胞包含编码核酸酶的核酸序列，其中所述核酸酶在1)所述生产细胞和2)所述辅助细胞的共培养物中表达和分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
3.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使用编码下述的核酸序列转染病毒载体生产细胞：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述病毒载体组分和所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
4.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述辅助细胞中表达和在所述生产细胞与所述辅助细胞的共培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
5.一种生产病毒载体的方法，所述方法包括使1)表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与2)来自表达核酸酶的核酸酶辅助细胞的液体进料接触，其中所述核酸酶在所述细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
6.一种生产病毒载体的改进方法，该改进包括将核酸序列引入病毒载体生产细胞，其中所述核酸序列编码：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
7.一种生产病毒载体的改进方法，该改进包括在共培养物中使表达病毒载体组分的病毒载体生产细胞与表达核酸酶的核酸酶辅助细胞接触，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中细胞培养物保持在6.5至7.2的pH范围内。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中胞外核酸酶选自下组：smNucA、VsEndA、VcEndA和BacNucB。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是胞外核酸酶。
11.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是糖非特异性核酸酶。
12.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:3所示的粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)核酸酶A或其与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的变体。
13.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:1所示的霍乱弧菌(Vibrio cholerae)核酸内切酶I或与其SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸同一性的变体。
14.根据权利要求13所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是选自下组的核酸酶变体：SEQ ID NO:5所示的VcEndA-12glc、SEQ ID NO:6所示的VcEndA-123glc、SEQID NO:7所示的VcEndA-124glc、SEQ ID NO:8所示的VcEndA-134glc、SEQ ID NO:9所示的VcEndA-13glc、SEQ ID NO:10所示的VcEndA-14glc和SEQ ID NO:11所示的VcEndA-1glc。
15.根据权利要求13所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶是SEQ ID NO:11所示的核酸酶变体VcEndA-1glc。
16.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含盐活性核酸酶。
17.根据权利要求16所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述盐活性核酸酶包含SEQID NO:2所示的杀鲑弧菌(Vibrio salmonicida)核酸内切酶I或与其SEQ ID NO:2具有至少90％氨基酸同一性的变体。
18.根据权利要求1-7中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含SEQ ID NO:4所示的BacNucB或与其SEQ ID NO:4具有至少90％氨基酸同一性的变体。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶包含天然或非天然的N末端分泌信号。
20.根据权利要求1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中编码核酸酶的所述核酸序列是经优化以除去潜在的剪接位点和/或不稳定元件的序列。
21.根据权利要求1-18中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中编码核酸酶的所述核酸序列进行密码子优化以在生产细胞中表达。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产系统和/或方法还包括一种或多种另外的核酸酶。
23.根据权利要求22所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶与所述一种或多种另外的核酸酶的至少一种融合。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物包含至少约5升培养基的体积。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞是悬浮的或贴壁的。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述细胞培养物是无血清的。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是真核细胞。
28.根据权利要求27所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是哺乳动物细胞。
29.根据权利要求28所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是人细胞。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述生产细胞是HEK293细胞或其衍生物。
31.根据权利要求30所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述HEK293生产细胞是HEK293T细胞。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分包含目标核苷酸(NOI)。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分是逆转录病毒载体组分。
34.根据权利要求33所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述逆转录病毒载体组分是慢病毒载体组分。
35.根据权利要求34所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述病毒载体组分包含i)gag-pol；ii)env；iii)任选地，逆转录病毒载体的RNA基因组；和iv)任选地，rev或其功能性替代品。
36.根据权利要求35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是编码位于同一遗传基因座的病毒载体组分的模块化构建体。
37.根据权利要求35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是以反向和/或交替方向编码病毒载体组分的模块化构建体。
38.根据权利要求35所述的病毒载体生产系统或方法，其中至少两个所述核酸序列是编码gag-pol和/或env的模块化构建体，其中所述模块化构建体是与至少一个调控元件结合的。
39.根据权利要求35-38中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述env是VSV-G env。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶从瞬时转染后的细胞表达和分泌。
41.根据权利要求1-39中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶在所述细胞的稳定整合后从所述细胞表达和分泌。
42.根据权利要求41所述的病毒载体生产系统或方法，其中所述核酸酶的表达是可诱导的或条件性的，并且其中编码所述核酸酶的核酸包含可诱导的或条件性的启动子或调控元件。
43.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述核酸酶是核酸内切酶。
45.根据权利要求44所述的细胞，其还包含编码核酸外切酶的核酸序列。
46.根据权利要求45所述的细胞，其中所述核酸内切酶与所述核酸外切酶融合。
47.根据权利要求43所述的细胞，其中所述核酸酶是核酸外切酶。
48.根据权利要求47所述的细胞，其中所述核酸外切酶与所述核酸内切酶融合。
49.权利要求43所述的细胞，其中所述细胞是瞬时生产细胞。
50.权利要求43所述的细胞，其中所述细胞是稳定生产细胞。
51.权利要求50所述的细胞，其中核酸酶的表达和分泌是在所述稳定生产细胞中可诱导的表达和分泌。
52.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶融合蛋白，其中所述核酸酶融合蛋白包含与核酸内切酶结构域融合的核酸外切酶结构域，并且其中所述核酸酶融合蛋白在所述病毒载体生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸，并且其中所述生产细胞是真核生产细胞。
53.权利要求52所述的细胞，其中所述核酸内切酶是VcEndA或其变体。
54.权利要求52所述的细胞，其中所述核酸内切酶是SEQ ID NO:11所示的VcEndA-1glc。
55.一种细胞培养装置，其包含病毒载体生产系统，所述病毒载体生产系统包含病毒载体生产细胞，所述病毒载体生产细胞包含编码下述的核酸序列：1)病毒载体组分；和2)核酸酶，其中所述核酸酶在所述生产细胞中表达和在细胞培养物中分泌，从而在病毒载体生产期间降解残留核酸。
56.权利要求46所述的细胞培养装置，其是搅拌釜式生物反应器或者波浪袋或
Figure FDA0002680207420000051
生物反应器。
57.一种能够在病毒载体生产期间降解残留核酸的分泌型核酸酶变体，所述变体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
58.一种具有增加的细胞保留和/或细胞结合的修饰的核酸酶，所述核酸酶通过真核细胞的分泌途径表达，其中所述修饰的核酸酶在其C末端包含保留信号。
59.权利要求58所述的修饰的核酸酶，其中所述修饰的核酸酶定位到内质网(ER)和/或高尔基体室，从而导致与相应的未修饰核酸酶的细胞保留相比具有增加的细胞保留。
60.权利要求58所述的修饰的核酸酶，其中所述修饰的核酸酶与ER保留缺陷互补基团的ER受体结合。
61.权利要求58所述的修饰的核酸酶，其中所述保留信号在其共有序列[KRHQSA]-[DENQ]-E-L或KKXX的C末端。
62.权利要求58所述的修饰的核酸酶，其中所述保留信号在其共有序列KDEL的C末端。
63.一种表达权利要求58的修饰的核酸酶的真核细胞。
64.一种包含权利要求63的细胞的病毒载体生产系统。
65.一种用于生产病毒载体的生产细胞，其包含如在权利要求1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
66.根据权利要求43或其任何从属权利要求所述的生产细胞，其包含如权利要求1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
67.根据权利要求52或其任何从属权利要求所述的生产细胞，其包含如权利要求1至42中任一项所定义的病毒生产细胞。
68.一种细胞培养装置，其包含如权利要求1至42中任一项所定义的生产细胞。
69.一种细胞培养装置，其包含如权利要求43或其任何从属权利要求所定义的生产细胞。
70.一种细胞培养装置，其包含如权利要求52或其任何从属权利要求所定义的生产细胞。
71.根据权利要求1至42中任一项所述的病毒载体生产系统或方法，其包含如权利要求57-62中任一项所定义的核酸酶。
72.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约1单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000061
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
73.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000062
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
74.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中病毒载体生产培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000063
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
75.权利要求72-74的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由病毒载体生产细胞提供。
76.权利要求72-74的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶活性由核酸酶辅助细胞提供。
77.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约10单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000071
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
78.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约100单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000072
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
79.一种核酸酶辅助细胞，其中辅助细胞培养物中的分泌型核酸酶活性是至少约2000单位/mL等效的
Figure FDA0002680207420000073
核酸酶活性，如通过本文中的测定1所示的测定所确定的。
80.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中所述核酸酶表达盒利用强启动子，如CMV。
81.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其利用核酸酶辅助细胞，其中在丁酸钠补充点时或之后将所述核酸酶辅助细胞添加到主病毒载体生产容器中。
82.前述任一项权利要求所述的病毒载体生产系统、方法、生产细胞、细胞培养装置、分泌型核酸酶变体、修饰的核酸酶或真核细胞，其中在病毒载体生产容器中核酸酶的表达使得无需进一步的核酸酶处理即可用于下游处理。
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