KR20220097492A - 생산 시스템 - Google Patents

생산 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20220097492A
KR20220097492A KR1020227019258A KR20227019258A KR20220097492A KR 20220097492 A KR20220097492 A KR 20220097492A KR 1020227019258 A KR1020227019258 A KR 1020227019258A KR 20227019258 A KR20227019258 A KR 20227019258A KR 20220097492 A KR20220097492 A KR 20220097492A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
sequence
viral vector
trap
Prior art date
Application number
KR1020227019258A
Other languages
English (en)
Inventor
다니엘 팔리
Original Assignee
옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1916452.4A external-priority patent/GB201916452D0/en
Priority claimed from GBGB2001998.0A external-priority patent/GB202001998D0/en
Application filed by 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 filed Critical 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Publication of KR20220097492A publication Critical patent/KR20220097492A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/102—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation inhibiting translation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/55—Vectors comprising a special translation-regulating system from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 관심 뉴클레오티드 및 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위, 및 선택적으로 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열에 관한 것으로, 여기서 상기 TRAP 결합 부위는 Kozak 서열 및/또는 관심 뉴클레오티드의 ATG 시작 코돈과 중첩된다. 본 발명은 또한 관심 뉴클레오티드 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열에 관한 것으로, 상기 Kozak 서열은 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위의 일부를 포함한다. 본 발명은 또한 관심 뉴클레오티드 및 TRAP 결합 부위를 포함하는 핵산 서열에 관한 것으로, 여기서 TRAP 결합 부위는 상기 관심 뉴클레오티드의 시작 코돈 ATG의 일부를 포함하거나 여기서 ATG 시작 코돈은 TRAP 결합 부위의 일부를 포함한다. 본 발명은 또한 관심 뉴클레오티드, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)에 대한 결합 부위, 다중 클로닝 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열에 관한 것으로, 여기서 상기 다중 클로닝 부위는 TRAP 결합 부위의 3' KAGN2-3 반복부의 하류 및 Kozak 서열의 상류에 위치하거나 이와 중첩된다.

Description

생산 시스템
본 발명은 바이러스 벡터의 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바이러스 벡터 생산 세포에서 바이러스 벡터에 의해 암호화되는 관심 뉴클레오티드의 번역의 변형에 관한 것이다.
유전자 요법은 질병을 치료하기 위한 유전 물질의 사용을 광범위하게 포함한다. 여기에는 결함이 있는 유전자(예: 돌연변이가 있는 유전자)가 있는 세포에 그러한 유전자의 기능적 사본을 보충하는 것, 부적절하게 기능하는 유전자의 비활성화 및 새로운 치료 유전자의 도입이 포함된다.
치료 유전 물질은 핵산의 전달을 가능하게 하는 벡터를 사용하여 숙주의 표적 세포에 통합될 수 있다. 이러한 벡터는 일반적으로 바이러스 및 비-바이러스 카테고리로 나눌 수 있다.
바이러스는 복제 주기의 일부로 숙주의 표적 세포에 그들의 유전 물질을 자연적으로 도입한다. 조작된 바이러스 벡터는 이 능력을 이용하여 관심 뉴클레오티드(nucleotide of interest, NOI) 또는 전이유전자(transgene)를 표적 세포로 전달할 수 있다. 현재까지, 많은 바이러스가 유전자 치료를 위한 벡터로 조작되었다. 여기에는 레트로바이러스, 아데노바이러스(AdV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 및 백시니아 바이러스가 포함된다.
NOI를 운반하기 위한 변형 외에도, 바이러스 벡터는 전형적으로 복제 결함이 되도록 추가로 조작된다. 이와 같이, 재조합 벡터는 표적 세포를 직접 감염시킬 수 있지만, 감염성 비리온의 추가 세대를 생성할 수는 없다. 다른 유형의 바이러스 벡터는 암세포 내에서만 조건부로 복제할 수 있으며, 독성 전이유전자 또는 전구효소(pro-enzyme)를 추가로 암호화할 수 있다.
레트로바이러스 벡터는 다양한 유전 질환에 대한 치료법으로 개발되었으며 현재 임상 시험에서 점점 더 가능성을 보여주고 있다(예를 들어, Galy, A. and A. J. Thrasher (2010) Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6): 545-550; Porter, D. L., B. L. Levine, M. Kalos, A. Bagg and C. H. June (2011) N Engl J Med 365(8): 725-733; Campochiaro, P. A. (2012) Gene Ther 19(2): 121-126; Cartier, N., S. Hacein-Bey-Abina, C. C. Bartholomae, P. Bougneres, M. Schmidt, C. V. Kalle, A. Fischer, M. Cavazzana-Calvo and P. Aubourg (2012) Methods Enzymol 507: 187-198; Sadelain, M., I. Riviere, X. Wang, F. Boulad, S. Prockop, P. Giardina, A. Maggio, R. Galanello, F. Locatelli and E. Yannaki (2010) Ann N Y Acad Sci 1202: 52-58; DiGiusto, D. L., A. Krishnan, L. Li, H. Li, S. Li, A. Rao, S. Mi, P. Yam, S. Stinson, M. Kalos, J. Alvarnas, S. F. Lacey, J. K. Yee, M. Li, L. Couture, D. Hsu, S. J. Forman, J. J. Rossi and J. A. Zaia (2010) Sci Transl Med 2(36): 36ra43 and Segura MM, M. M., Gaillet B, Garnier A. (2013) Expert opinion in biological therapy).
이러한 벡터의 중요한 예로는 감마-레트로바이러스 벡터 시스템(MMLV 기반), 영장류 렌티바이러스 벡터 시스템(HIV-1 기반) 및 비영장류 렌티바이러스 벡터 시스템(EIAV 기반)이 있다.
역 유전학(Reverse genetics)은 이러한 바이러스 기반 벡터를 고도로 조작함으로써 적절한 DNA 서열로 포유동물 세포의 형질감염에 의해 대규모 이종 서열(약 10 kb)을 암호화하는 벡터가 생성될 수 있도록 하였다(Bannert, K. (2010) Caister Academic Press: 347-370에서 리뷰됨).
연구 단계에서 레트로바이러스 벡터의 조작 및 사용은 전형적으로 예를 들어 GFP 또는 lacZ를 암호화하는 리포터-유전자 벡터의 생산을 포함한다. 이러한 임상적으로 관련이 없는 벡터의 역가는 일반적으로 조 수확 물질의 mL당 1×106 내지 1×107 형질도입 단위(TU/mL)의 영역에 있다. 이 물질을 추가로 농축하고 정제하면 1×1010 TU/mL를 초과하는 작업 스톡을 달성할 수 있다. 그러나, 치료적으로 관련된 NOI를 암호화하는 벡터의 생성은 종종 이러한 리포터 벡터에 비해 실질적으로 감소된 역가를 초래한다.
이 효과에 잠재적으로 책임이 있는 몇 가지 요인이 있다:
1. 치료 게놈의 크기. 매우 큰 게놈은 레트로바이러스에 의해 패키징될 수 있지만, 크기가 증가함에 따라 역전사 및/또는 통합 단계의 효율성이 떨어지는 것으로 생각된다.
2. 벡터 게놈 RNA의 안정성. 이것은 NOI의 예측할 수 없는 불안정 요소의 존재에 의해 감소될 수 있다.
3. 벡터 게놈 RNA 내에서 최적이 아닌(suboptimal) 뉴클레오티드 사용. 야생형 바이러스 게놈에는 종종 특정 뉴클레오티드 편향이 있다(예: HIV-1은 AT가 풍부함). 벡터 게놈은 AT가 덜 풍부한 경향이 있어 패키징 및/또는 성숙 후 단계에 영향을 미칠 수 있다.
4. 바이러스 벡터 생산 세포에서 NOI의 발현. (과)발현된 단백질은 벡터 비리온 어셈블리 및/또는 감염성에 간접적 또는 직접적인 영향을 미칠 수 있다.
바이러스 벡터 생산 세포 내에서 NOI에 의해 암호화된 단백질의 발현이 치료 벡터 역가에 악영향을 미칠 수 있다는 것이 경험적으로 밝혀졌다(WO2015/092440에 기술됨).
NOI에 의해 암호화된 단백질(관심 단백질, protein of interest, POI)의 벡터 비리온으로의 통합은 벡터 입자의 다운스트림 처리에도 영향을 미칠 수 있는데; 예를 들어, 막횡단 POI를 암호화하는 NOI는 바이러스 벡터 비리온에서 막횡단 단백질의 높은 표면 발현에 이르게 하여, 잠재적으로 비리온의 물리적 특성을 변경할 수 있다. 또한, 이러한 통합은 전달 부위에서 환자의 면역계에 POI를 제시할 수 있으며, 이는 생체 내에서 치료 유전자의 형질도입 및/또는 장기간 발현에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. NOI는 또한 생산, 정제, 회수 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있는 바람직하지 않은 2차 단백질 또는 대사산물의 생산을 유도할 수 있으므로 이를 최소화하는 것이 바람직하다.
표적 세포에서는 NOI의 효과적인 발현을 유지하면서 바이러스 벡터 생산 세포에서는 NOI의 발현을 억제하는 능력이 또한 바람직하다. 어떤 메커니즘이 사용되든, 어셈블리의 '자연적인' 경로 및 이에 따른 바이러스 벡터 입자의 기능이 방해되어서는 안된다. 이것은 비리온으로 패키징될 바이러스 벡터 게놈 분자가 반드시 NOI 발현 카세트를 암호화해야 하기 때문에 간단하지 않다. 다시 말해서, 벡터 게놈 분자와 NOI 발현 카세트가 작동 가능하게 연결되어 있기 때문에, NOI 발현 카세트의 변형은 세포에서 벡터 게놈 분자를 생성하는 능력에 불리한 결과를 가질 수 있다. 예를 들어, 물리적 전사 블록(예: TetR 억제 시스템)을 사용하여 NOI 발현 카세트를 억제하는 경우, 벡터 게놈 분자의 생산도 입체 장애(steric hindrance)를 통해 억제될 가능성이 있다. 또한, 제어 메커니즘 변형은 비리온 성숙 및 방출 후 벡터 게놈 분자의 기능(즉, 표적 세포의 형질도입의 지시(directing)와 관련하여)에 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 게놈 RNA 분자는 역전사 및 통합 과정을 수행할 수 있어야 하며 - NOI 발현 카세트에 대한 어떠한 변형도 형질도입 과정에서 이러한 단계를 방해해서는 안된다.
바이러스 벡터 생산 세포 내에서 NOI 발현의 억제는 추가 이점을 제공할 수 있다. 만약 NOI 발현이 벡터 생산 세포의 생존력의 감소에 이르게 한다면, 그것의 억제는 많은 세포 수가 필요한 대규모 제조에 도움이 될 수 있다. 세포 사멸로 인한 세포 파편의 감소는 또한 조 벡터 수확 물질 내의 불순물을 감소시킬 것이다. 벡터 플랫폼(즉, 동일한 벡터 시스템 내에서 암호화되는 서로 다른 치료 유전자)의 처리, 정제 및 농축이 표준화될 수 있다; 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 발현되는 유일한 이종 유전자가 벡터 생산에 필요한 유전자라면, 다운스트림 처리는 치료 벡터의 전체 플랫폼에 대해 더 쉽게 최적화될 수 있으며, 결과적으로 벡터 제조의 매우 유사한 물리적 사양을 생성한다. 생체 내에서 생성된 벡터에 대한 면역 반응의 가변성 및 독성은 최소화될 수 있으며, 이는 표적 세포에서 보다 지속적인 치료적 NOI 발현을 유발할 수 있다.
생산 세포에서 NOI의 발현을 제한하는 조직 특이적 프로모터는 이 문제에 대한 가능한 해결책이지만, 이러한 프로모터의 누출은 전이유전자 단백질의 불리한 수준으로 이어질 수 있다. 그러나, 표적 세포에서 NOI의 더 크고 강력한 발현은 구성적 프로모터를 사용하여 달성할 수 있다. 실제로, 이러한 강력한 발현은 생체내 효능을 위해 필요할 수 있다. 또한, 조직 특이적 프로모터는 동물 모델을 통해 치료 벡터 제품을 팔로우하여 전임상 및 임상 개발 동안 인간에게 적용할 때 예측하기 어려울 수 있다.
WO2015/092440(본원에 참고로 포함됨)은 바이러스 벡터 생산 동안 NOI의 번역을 억제하여(전이유전자 발현을 억제하여) NOI에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 억제하거나 방지하기 위한 진핵 세포 배양에서 이종 번역 제어 시스템의 사용을 개시하고 있다. 이 시스템을 벡터 생산 세포에서 전이유전자 억제 시스템(Transgene Repression In vector Production cell system) 또는 TRIP 시스템이라고 지칭한다. 한 형태에서, TRIP 시스템은 박테리아 trp 오페론 조절 단백질, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(tryptophan RNA-binding attenuation protein, TRAP), 및 TRAP 결합 부위/서열(TRAP binding site/sequence, tbs)을 이용하여 전이유전자 억제를 매개한다. 놀랍게도, 이 시스템의 사용은 패키징가능한 벡터 게놈 분자의 생성이나 벡터 비리온의 활성을 방해하지 않으며, 표적 세포에서 NOI의 장기간 발현을 방해하지 않는다.
발명의 요약
본 발명은 TRAP에 의한 번역 억제의 개선된 수준을 가능하게 하는 전이유전자 mRNA에 만들어진 변형에 관한 것으로, TRIP 시스템을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 개선된 핵산 서열은 예를 들어 다음과 같은 특징을 가질 수 있다:
1. EF1α 유전자의 첫 번째 (비-코딩) 엑손으로부터 유래된 뉴클레오티드로 구성된 개선된 5'UTR 리더 서열(tbs의 상류)은 놀랍게도 다양한 구성적 프로모터 유래의 5'UTR 리더 서열과 비교하여 TRAP-tbs 복합체에 의해 매개되는 전이유전자 발현의 '억제된' 수준을 일관되게 낮출 수 있는 것으로 나타났다.
2. 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)와 tbs 사이에 삽입된 개선된 UTR 또는 '스페이서(spacer)' 서열은 놀랍게도 배수-억제(fold-repression) 수준과 비-억제 수준(즉, TRAP이 없는 경우)을 모두 개선하는 것으로 나타났다.
3. tbs의 3' 말단과 중첩되는 변이체 Kozak 서열은 놀랍게도 TRAP-tbs 복합체에 의한 전이유전자 개시 코돈의 개선된 폐색(occlusion)에 이르게 하는 것으로 나타났다.
4. tbs와 전이유전자 Kozak 서열(전이유전자 시작 코돈(ATG)) 사이에 압축된 중첩되는 다중 클로닝 부위(multi-cloning site)를 포함하는 서열은 놀랍게도 TRAP에 의해 억제될 때 낮은 수준의 전이유전자 발현을 유지하면서 클로닝의 용이성을 가능하게 하는 것으로 나타났다.
5. tbs의 3' 말단과 전이유전자 시작 코돈 ATG의 중첩은 놀랍게도 TRAP-tbs 복합체에 의한 전이유전자 개시 코돈의 개선된 폐색에 이르게 하는 것으로 나타났다.
일 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 TRAP 결합 부위는 Kozak 서열과 중첩된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 Kozak 서열은 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위의 일부를 포함한다.
일 측면에서 본 발명은 관심 뉴클레오티드(전이유전자) 및 TRAP 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 제공하고, 여기서 TRAP 결합 부위는 전이유전자 시작 코돈 ATG의 일부를 포함하거나 그 반대도 마찬가지이다.
일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질과 상호작용할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질이 결여된 표적 세포에서 번역된다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2-3의 다중 반복부(repeat)를 포함한다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 다중 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 적어도 6개의 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2-3의 적어도 8개의 반복부를 포함한다. KAGNNN 반복부의 수는 1개 이하일 수 있다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 적어도 8-11개의 반복부를 포함한다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN2-3의 11개의 반복부를 포함하고, 여기서 KAGNNN 반복부의 수는 3개 이하이다.
일부 구현예에서, Kozak 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단과 중첩된다. Kozak 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부와 중첩될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 Kozak 서열은 서열 RNNATG를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 Kozak 서열은 서열 RVVATG를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 중첩되는 Kozak 서열 및 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGATG;
(b) KAGVATG;
(c) KAGVVATG;
(d) KAGRVVATG; 또는
(e) KAGNRVVATG.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) KAGCCGAGATG;
(b) KAGGCGAGCATG;
(c) KAGNGGAGCCATG; 또는
(d) KAGNNGAGACCATG.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) KAGCCGAGATG; 또는
(b) KAGNGGAGCCATG.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 서열번호 69-92 또는 108-112에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 시작 사이의 거리는 34개 뉴클레오티드 미만이다.
일부 구현예에서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 시작 사이의 거리는 13개 뉴클레오티드 미만이다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에는 II형 제한 효소 부위, 바람직하게는 SapI 제한 효소 부위가 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 상류에 5' 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 비-코딩 EF1α 엑손 1 영역으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 리더 서열은 서열번호 25 또는 서열번호 26에 정의된 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함한다. 상기 핵산 서열은 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부 사이에 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 스페이서의 길이는 0 내지 30개 뉴클레오티드일 수 있다. 스페이서의 길이는 15개 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 스페이서는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 및 관심 뉴클레오티드의 하류 개시 코돈으로부터 3 또는 9개 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 38-44 중 어느 하나에 정의된 서열을 포함하고, 바람직하게는 스페이서는 서열번호 38에 정의된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 치료 효과를 발생시킨다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 RRE 서열 또는 그의 기능적 대체물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 핵산 서열은 벡터 전이유전자 발현 카세트이다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 ATG 시작 코돈의 적어도 첫 번째 뉴클레오티드와 중첩된다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 ATG 시작 코돈의 처음 2개의 뉴클레오티드와 중첩된다.
일부 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 본원에 정의된 바와 같은 코어(core) Kozak 서열 내에서 ATG 시작 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드와 중첩된다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 114 또는 서열번호 116에 정의된 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의(more than one) 관심 뉴클레오티드를 포함하고 여기서 적어도 하나의 관심 뉴클레오티드는 본원에 정의된 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 배큘로바이러스로부터 유래된다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 바이러스 벡터의 생산에 필요한 구성요소를 암호화하는 핵산 서열 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템을 제공하며, 여기서 벡터 게놈은 본 발명의 핵산 서열을 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이고 바이러스 벡터 생산 시스템은 Gag 및 Pol 단백질, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, 및 Env 단백질, 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 rev 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 작제물, Gag 및 Pol 단백질을 암호화하는 DNA 작제물, 및 Env 단백질, 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물의 세트를 제공한다.
일부 구현예에서, DNA 작제물의 세트는 rev 서열 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 추가로 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열, 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 본 발명의 DNA 작제물을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 제공한다.
일부 구현예에서, 세포는 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 암호화하는 벡터로 일시적으로 형질감염된다. 세포는 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 안정적으로 발현할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열, 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 본 발명의 DNA 작제물을 바이러스 벡터 생산 세포에 도입하는 단계 및 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건 하에서 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하거나 본 발명의 방법에 의해, 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해 생산된 바이러스 벡터를 제공한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본 발명의 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래된다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 세포를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 세포의 용도를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 핵산 결합 부위에 작동가능하게 연결되었을 때 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 부위 및/또는 핵산 결합 단백질을 확인하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 핵산 결합 부위 및 핵산 결합 단백질 둘 다를 포함하는 세포에서 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 바이러스 벡터 생산 세포에 본 발명의 핵산 서열, 및 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질(TRAP)을 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포에서 관심 뉴클레오티드(NOI)의 번역을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하여 NOI의 번역을 억제한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 진핵생물 벡터 생산 세포에 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 및 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질(TRAP)을 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하는 진핵생물 벡터 생산 세포에서 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 방법을 제공하며, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하여 NOI의 번역을 억제함으로써, TRAP 결합 부위가 없는 바이러스 벡터에 비해 바이러스 벡터 역가를 증가시킨다.
추가의 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)에 대한 결합 부위, 다중 클로닝 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 다중 클로닝 부위는 TRAP 결합 부위의 하류와 Kozak 서열의 상류에 위치한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 프로모터를 추가로 포함한다. TRAP 결합 부위 또는 그의 일부 및 Kozak 서열 또는 TRAP 결합 부위, 다중 클로닝 부위 및 Kozak 서열은 프로모터의 5' UTR 내에 위치할 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 인트론을 추가로 포함하고, 바람직하게는 인트론은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 상류에 있다. 프로모터는 5' UTR 내에 이종 인트론을 포함하는 조작된 프로모터일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 서열번호 117, 118 또는 120 내지 124 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 바이러스 벡터의 RNA 게놈은 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 바이러스 벡터의 RNA 게놈 내에 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열은 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 핵산 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템의 일부 구현예에서, 여기서 바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위(major splice donor site)는 불활성화된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위 및 주요 스플라이스 공여자 부위의 3'의 잠복(cryptic) 스플라이스 공여자 부위는 불활성화된다.
일부 구현예에서, 잠복 스플라이스 공여자 부위는 주요 스플라이스 공여자 부위의 3'의 첫 번째 잠복 스플라이스 공여자 부위이다.
일부 구현예에서, 상기 잠복 스플라이스 공여자 부위 또는 서열은 주요 스플라이스 공여자 부위 또는 서열의 6개 뉴클레오티드 내에 있다.
일부 구현예에서, 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위는 돌연변이되거나 결실된다.
일부 구현예에서, 스플라이스 부위의 불활성화 전에 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나에 기재된 서열에 비해 돌연변이 또는 결실이 있는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 13 및 14에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 주요 스플라이스 공여자 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 불활성화 전의 주요 스플라이스 공여자 부위의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 97에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 불활성화 전의 잠복 스플라이스 공여자 부위의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 103에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 17 및 18에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 95, 98, 99, 100, 101, 104, 105 및/또는 107 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 102에 기재된 서열을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈의 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱 활성은 억제되거나 제거된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈의 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱 활성은 형질감염된 세포 또는 형질도입된 세포에서 억제되거나 제거된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다.
도 1. tbs의 상류의 5'UTR 서열에 대한 개선 사항의 개요. 전이유전자 5'UTR 내에서 tbs 서열([KAGNN]×11)의 상류에 배치된, EF1α 유전자 엑손 1으로부터 유래된 5'리더 서열의 위치를 나타내는 개략도. 놀랍게도, 다른 프로모터로부터의 리더 서열과 비교할 때, 이러한 리더 서열의 사용은 TRAP-tbs에 의한 전이유전자의 억제 수준을 개선시킨다는 것이 발견되었다(TRAP은 도넛 모양으로 표시됨). 이론에 얽매이지 않고, 이러한 리더 서열은 리보솜 스캐닝의 억제가 최대화되도록 보다 안정적인 TRAP-tbs 복합체를 가능하게 하는 것으로 추정된다.
도 2. tbs의 하류의 5'UTR 서열에 대한 개선 사항의 개요.
A. TRAP-tbs 억제가능 전이유전자 카세트의 5'UTR 암호화 영역의 DNA 발현 카세트를 보여주는 개략도로서, 다중클로닝 부위(MCS)가 tbs와 전이유전자의 개시 코돈 사이에 삽입되어 있음(TRAP은 도넛 모양으로 표시됨). 본 발명은 tbs의 말단 KAGNN 반복부에서/상에서 시작하고 전이유전자 개시 코돈의 상류에 최대 5개의 클로닝 부위를 함유하는 선호되는 중첩되는 제한 효소 부위를 기술한다.
B. 전이유전자의 Kozak 서열이 tbs의 3' KAGNN 반복부와 대부분 또는 부분적으로 중첩되도록 위치할 수 있는 방법을 보여주는 개략도; 그렇게 하면 TRAP-tbs 복합체 내에 주요 개시 코돈을 효과적으로 '숨길' 수 있어 번역 기계(translation machinery)에 훨씬 더 접근하기 어렵게 만들어, 전이유전자 발현의 '억제된' 수준을 훨씬 더 낮출 수 있다.
C. 선호되는 중첩되는 tbs 및 Kozak 컨센서스 서열을 요약하는 표. tbs의 3' KAGNN 반복부는 박스로 표시하였고 코어 Kozak 서열은 굵게 표시하였다
도 3. 천연 UTR 서열을 함유하는 다양한 구성적 프로모터와 비교하여 L33 개선된 리더 서열을 사용할 때 TRAP-tbs에 의한 강화된 억제.
A. GFP 테스트 리포터 플라스미드의 조직을 나타내는 개략도. 사용된 서로 다른 프로모터와 tbs의 상류에 있는 서로 다른 리더 서열(이들은 표 I의 패널 I에 나타내었음)을 제외하고, 5'UTR은 동일한 tbs 서열 및 기타 요소를 포함하였다. 다음을 주의하라(표 I에따라), 인트론 함유 EF1α(EF1a) 및 UBC 프로모터는 각각 '짧은' 인트론이 없는 대응물인 EFS 및 UBC와 직접 비교할 수 있는 것으로 간주되는데, 이는 인트론 서열이 mRNA에 존재하지 않기 때문이다. 34nt 리더는 대조군으로서 CMV 프로모터 함유 리포터 내에 존재하였다(이것은 이전에 TRAP-tbs에 의해 >100배 억제를 가능하게 하는 것으로 나타났다). 다른 구성적 프로모터는 천연 리더 서열과 일부 합성 서열을 포함하는 리더를 함유하거나, 또는 이 연구에서 EF1α 프로모터의 엑손 1으로부터 유래된 L33 개선된 리더 서열을 보유하도록 조작되었다.
B. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하였고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도(median fluorescence intensity))를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 차트의 데이터는 왼쪽에서 오른쪽으로 일반 프로모터 강도(TRAP 없음의 수준)에 의해 표시하였으며, Mock 형질감염(pBlueScript 만) 또는 형질감염되지 않은 세포(UNT)와 비교하였다. 천연 리더를 L33 개선된 리더와 비교하는 각 경우에, L33 개선된 리더는 TRAP의 존재하에서 실질적으로 더 낮은 수준의 GFP 발현을 가능하게 하여 - TRAP-tbs에 의한 억제의 >10배 개선을 가능하게 한다. 대부분의 경우, 발현된 GFP의 비-억제 수준은 L33 개선된 리더를 사용할 때 약간 개선되었다. (표준 편차 막대, n=3).
도 4. AAV 벡터 게놈 내에서 전이유전자 카세트의 tbs와 Kozak 서열 사이에 삽입된 다중클로닝 부위(MCS)의 설계 및 평가, 그리고 TRAP-tbs에 의한 전이유전자 억제에 대한 영향.
A. 5'UTR-tbs 서열로 테스트한 MCS 변이체를 나타내는 개략도; 7개의 변이체에는 NcoI 부위를 포함하지 않는 2-4개의 클로닝 부위가 포함되었는데, 이는 특정 Kozak 서열의 존재와 전이유전자의 두 번째 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드에 따라 다르다(따라서 모든 전이유전자 카세트에 반드시 존재하지 않을 수도 있음). MCS 변이체 리포터 작제물은 EFS 프로모터에 의해 구동되고 L33 개선된 리더를 포함하는 반면, 'No MCS' 대조군 리포터 작제물은 CMV 프로모터에 의해 구동되고 원래의 34nt 리더를 보유하였다(L33 개선된 리더와 유사하게 수행하도록 도 4에 표시됨). 전이유전자 카세트를 scAAV2 벡터 게놈 플라스미드 내로 클로닝하였다(ITR는 나타내지 않음).
B. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1a-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터 AAV 게놈 플라스미드를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하였고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 모든 MCS 변이체 리포터는 TRAP-tbs에 의해 ~1000배 이상 억제되었고 7개 변이체 중 6개는 전이유전자 수준을 감소시키는 데 적어도 10배 더 우수하였다. 또한, 변이체 MCS2.1, MCS4.1 및 MCS4.4는 TRAP-tbs가 GFP 수준을 검출 한계까지 억제할 수 있게 하였다(형질감염되지 않은 [UNT]와 비교). (표준 편차 막대, n=3).
도 5. L33 개선된 리더, tbs 및 최적화된 다중클로닝 부위를 포함하는 5'UTR이 있는 다양한 구성적 프로모터에 의해 구동되는 전이유전자 카세트를 사용하여 TRAP-tbs에 의한 일관되게 강력한 전이유전자 억제의 입증. 다양한 구성적 프로모터를 L33-tbs 서열을 포함하는 MCS2.1-GFP 및 MCS4.1-GFP scAAV2 리포터 게놈 플라스미드에 클로닝하였다. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하였고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 데이터는 L33 개선된 리더 및 최적화된 MCS 부위가 동일한 카세트에 통합될 수 있고, 광범위한 구성적 프로모터의 맥락에서 TRAP-tbs에 의한 고도의 전이유전자 억제를 허용할 수 있음을 입증한다. 실험 전반에 걸친 평균 억제 수준은 ~5000배였다. (표준 편차 막대, n=3).
도 6. tbs를 ATG 개시 코돈에 더 가깝게 배치하기 위해 전이유전자 5'UTR 내에서 tbs의 3' 말단과 중첩되는 최적의 Kozak 서열의 식별.
A. Kozak이 tbs의 3'말단과 중첩되어 KAGNN 반복부(들)이 유지되도록 배치된 코어 컨센서스 'RVVATG' 및 더 넓은 컨센서스 'GNNRVVATG'를 준수하는 조작된 변이체에서 Kozak 서열의 위치와 서열을 나타내는 개략도. 이것은 tbs가 ATG 개시 코돈에 더 가깝게 위치하도록 하여 TRAP-tbs 복합체 내에 ATG 개시 코돈을 '숨김'으로써 개선된 전이유전자 억제 수준(+TRAP)을 가능하게 하는 tbs-Kozak 접합 변이체를 식별할 수 있게 한다. 컨센서스 Kozak 서열의 유지는 전이유전자 비억제 수준(TRAP 없음)이 높은 수준에서 유지될 수 있도록(즉, 벡터 형질도입된 세포에서의 발현을 모델링) 한다.
B. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 세포를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 모든 tbs-Kozak 접합 변이체 리포터는 원래 구성과 비교하여 동일한 비억제 GFP 수준을 유지하였다. 변이체 '0', '2' 및 '3'은 원래 구성에 비해 개선된 억제 수준을 나타내었다(표준 편차 막대, n=3).
도 7. TRAP-tbs에 의한 IRES 의존성 전이유전자의 더 나은 억제를 부여하기 위해 IRES와 tbs 서열 사이의 개선된 스페이서 서열의 식별.
A. 스페이서 서열 테스트에서 전이유전자 카세트 구성을 나타내는 개략도. pCMV-루시퍼라제-IRES-(스페이서)-tbs-GFP 리포터 작제물을 설계하고(표 III 참조) 테스트하였다.
B. 원래(Original) [26nt] 스페이서 또는 변이체(Variant) [26nt] 또는 두 스페이서의 절단(truncation)을 포함하는 리포터를 테스트하였다. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 HEK293T 세포에 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 세포를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 연구 결과 'Original [trunc-15nt]' 스페이서가 Original 스페이서에 비해 개선된 'ON' 및 감소된 'OFF' 수준을 가지는 변이체로 밝혀졌다.
C. 그런 다음 'Original [trunc-15nt]' 스페이서를 11xKAGNN 반복부 tbs 또는 8xKAGNN 반복부 tbs를 보유하고 tbs의 3'말단 및 하류 전이유전자 ATG 개시 코돈으로부터 9nt 또는 3nt 거리를 가지는 리포터와 통합하였다. GFP 발현을 이전과 같이 측정하였다. 데이터는 개선된 'Original [trunc-15nt]' 스페이서가 다양한 tbs 구성과 함께 사용되고 주요 전이유전자 ATG 개시 코돈에 근접성으로 사용될 수 있음을 나타낸다(표준 편차 막대, n=3).
도 8. EF1α 엑손 1 서열로부터 유래된 두 개의 개선된 리더 비교. 절단된 리더 'L12'는 인간 EF1α 유전자의 엑손 1을 포함하는 L33 개선된 리더 서열로부터 유래되었다(표 I 참조). L12 개선된 리더를 tbs와 Kozak 서열 사이에 MCS2.1 또는 MCS4.1 서열을 보유하는 scAAV2 벡터 게놈 플라스미드 내의 6개의 구성적 프로모터 함유 GFP 리포터 카세트에 클로닝하였다. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 데이터는 L12 및 L33 개선된 리더가 TRAP-tbs에 의한 완전한 억제를 허용하고 GFP 수준을 배경 수준으로 억제함을 입증한다. 흥미롭게도 GFP의 'ON'(억제 없음) 수준이 다양한 프로모터에서 L12 또는 L33에 대해 약간 더 높았다; 이것은 다양한 프로모터에서 TRIP 시스템의 활용을 고려할 때 L12 또는 L33 중에서 선택할 수 있는 유연성을 허용하므로, 벡터 생산 동안 TRAP-tbs에 의해 달성되는 상당한 수준의 억제를 잃지 않으면서, TRAP 부재 하에서(즉, 벡터 형질도입된 세포에서) 유전자 발현 수준이 최대화될 수 있다. (표준 편차 막대, n=3).
도 9. 중첩되는 tbs- Kozak 변이체를 사용하여 AAV 벡터 게놈 플라스미드에서 전이유전자 억제의 개선. 2개의 'tbs-Kozak' 변이체(0 및 3)를 EFS 또는 huPGK 프로모터 GFP 리포터 카세트에 클로닝하였고, 추가로 L33 또는 L12 개선된 리더 서열을 포함하였다. 중첩되지 않는 tbs/Kozak 변이체도 EFS/huPGK-L33 카세트에 클로닝하였다; 이들은 tbs-Kozak 영역에서만 달랐다(Original = [tbs]-ACAGCCACCATG; HpaI 변이체 = [tbs-GAGTT]AACGCCACCATG). 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다. 데이터는 tbs를 Kozak 서열과 중첩시키면 비중첩 tbs/Kozak 변이체와 비교하여 TRAP에 의한 전이유전자 발현의 개선된 억제를 허용한다는 것을 입증한다. (표준 편차 막대, n=3).
도 10. 전장 EF1a 프로모터의 맥락에서 TRAP 매개 전이유전자 억제의 개선.
A. 3개의 'tbs-Kozak' 변이체(0, 2 및 3)를 EF1a 프로모터 GFP 리포터 카세트에 클로닝하였다. 스플라이싱 후 리더 서열은 L33 서열(엑손1)과 tbs의 바로 상류에 있는 엑손2로부터의 짧은 12 nt 서열을 포함한다.
B. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드를 공동-형질감염시켜 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 2일 후 유세포 분석에 의해 분석하고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다.
C. GFP 전이유전자 카세트를 HIV-1 렌티바이러스 벡터 게놈에 클로닝하고, B에 설명된 바와 같이 GFP 발현의 비억제 또는 억제 수준에 대해 테스트하였다. 데이터는 tbs를 Kozak 서열과 중첩시키는 것이 TRAP에 의한 전이유전자 발현의 개선된 억제를 허용한다는 것을 입증한다. (표준 편차 막대, n=3).
도 11: 렌티바이러스 벡터 생산 동안 전이유전자를 발현하는 비정상적으로 스플라이싱된 mRNA가 MSD - 2KO 렌티바이러스 벡터에서 제거되어, TRiP 시스템을 사용할 때 TRAP에 의해 표적이 되는 전이유전자 mRNA의 양을 감소시킨다.
A EF1a-GFP 전이유전자 카세트를 암호화하는 'TRiP' 렌티바이러스 벡터 게놈의 개략도로서, 여기서 TRAP 결합 부위(tbs)는 카세트의 5'UTR 내에 위치함(벡터 생산 중 TRAP의 공급은 전이유전자 발현 수준을 감소시킴). MSD-2KO 렌티바이러스 벡터를 생산하는 동안, 전장의 스플라이싱되지 않은 패키징가능한 vRNA 및 전이유전자 mRNA가 렌티바이러스 벡터 카세트로부터 생산된 세포질 RNA의 주요 형태이다 (i)(전이유전자 프로모터가 생산 중 활성화된 경우). 그러나, 표준 렌티바이러스 벡터 게놈에서 MSD의 무차별적인(promiscuous) 활성으로 인해 전이유전자를 암호화할 수 있는 추가적인 '비정상적인' 스플라이스 산물이 생성된다 (ii); 이것은 내부 전이유전자 프로모터, 즉 조직 특이적 프로모터와 독립적으로 발생할 수 있다. (기호 풀이: Pro, 프로모터; 5'R에서 gag까지의 영역은 패키징 요소 {Ψ}를 포함함; msd, 주요 스플라이스 공여자; cppt, 중앙 폴리퓨린 트랙(central polypurine tract); Int, 인트론; sd/sa, 스플라이스 공여자/수용체; GOI, 관심 유전자; 회색 화살표는 3세대 렌티바이러스 벡터 생산 동안 생성된 스플라이싱되지 않은 vRNA의 비율을 평가하기 위한 정방향 {f} 및 역방향 {r} 프라이머의 위치를 나타냄; 전사 후 조절 요소(Post-transcriptional regulatory element) {PRE}는 명확성을 위해 표시하지 않음). B EF1a-GFP 카세트를 포함하는 표준 또는 MSD-2KO 렌티바이러스 벡터 게놈 플라스미드를 사용하여 HEK293T 세포에서 렌티바이러스 벡터를 생성하고, GFP 발현 점수를 생성하였다(%GFP × MFI). 표준 렌티바이러스 벡터 생산 동안 배양물에서 생산된 GFP의 총량에 비해, MSD-2KO 변형은 TRAP가 없는 경우에도 생산된 GFP의 양을 감소시키는 실질적인 효과가 있었다(~5배). 따라서, TRAP의 억제 효과는 MSD-2KO 렌티바이러스 벡터 게놈의 사용에 의해 증대되었고, 이는 배양물에서 훨씬 더 낮은 수준의 GFP로 이어졌다. C '야생형' HIV-1(NL4-3; 현재 렌티바이러스 벡터 게놈 내의 '표준' 서열)의 스템 루프 2(SL2) 영역의 서열을 상단에 나타내었다. 서열은 주요 스플라이스 공여자 부위(MSD: 컨센서스 = CTGGT) 및 잠복 스플라이스 공여자 부위(이는 MSD 부위가 자체적으로 돌연변이될 때 활용됨(crSD: 컨센서스 = TGAGT)를 포함한다. 스플라이스 공여자 부위가 사용될 때 스플라이싱 위치의 뉴클레오티드를 굵게 및 화살표로 식별하였다. MSD 및 crSD 부위 스플라이싱 활성을 모두 제거하는 4가지 기능적 MSD 돌연변이를 기재하였다: MSD 및 crSD 부위로부터 2개의 'GT' 모티프를 돌연변이시키고 (대부분의 실시예에서 널리 사용되는) MSD-2KO; MSD 및 crSD 부위를 모두 제거하는 돌연변이를 또한 포함하는 MSD-2KOv2; 스플라이스 공여자 부위가 전혀 없는 완전히 새로운 스템-루프 구조를 도입한 MSD-2KOm5; 및 SL2 서열을 완전히 결실시키는 ΔSL2. MSD-2KO, MSD-2KOv2 및 MSD-2KOm5 돌연변이에서 SL2 서열에 도입된 치환은 소문자 이택릭체로 표시하였다.
도 12: HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 내 주요 스플라이스 공여자 부위( MSD )로부터의 비정상적인 스플라이싱의 의미. 표준 3세대 렌티바이러스 벡터 생산을 HEK293T 세포에서 +/- rev로 수행하였으며 생산 후 세포에서 총 RNA를 추출하였다. 총 RNA에 대하여 2개의 프라이머 세트를 사용하여 qPCR(SYBR green)을 수행하였다: f+rT는 렌티바이러스 벡터 발현 카세트로부터 생성된 전체 전사체를 증폭하였고, f+rUS는 스플라이싱되지 않은 전사체를 증폭하였다; 따라서 스플라이싱되지 않은-대-전체(Unspliced-to-Total) vRNA 전사체의 비율을 계산하고 플롯팅하였다. 데이터는 표준 3세대 렌티바이러스 벡터 생산 동안 전체 대비 스플라이싱되지 않은 vRNA의 비율이 미미(modest)하고 내부 전이유전자 카세트(이 경우 서로 다른 프로모터 및 GFP 유전자를 포함함)에 따라 다르다는 것을 나타낸다; 게다가, 이 비율은 rev의 작용에 의해 최소한으로만 증가한다.
도 13. 현탁액( 무혈청 ) HEK293T 세포에서 중첩되는 tbs- Kozak 변이체의 TRAP 매개 전이유전자 억제 테스트. 표 IV의 중첩되는 tbs-Kozak 변이체를 pEF1a-GFP 리포터 플라스미드 내로 클로닝하고 HEK293T 세포 +/- pTRAP에 형질감염시키고, 형질감염 2일 후에 유세포 분석을 수행하였다. A . GFP 발현 점수(% GFP 양성 × MFI)를 +/- TRAP에 대해 생성하고, 배수 억제 값을 생성하고 플롯팅하였다. 변이체를 x축을 따라 표시하였으며, 3' tbs KAGNN 반복부와 코어 Kozak 서열의 상대적 중첩에 따라 그룹화하였다('중첩 그룹' - KAGatg, KAGNatg, KAGNNatg); KAGNN은 검은색 대괄호로 표시하였고 코어 Kozak 뉴클레오티드는 회색 선으로 표시하였다. 하기의 중첩 그룹을 비교하여 통계 분석을 수행하였다(중첩 그룹 내의 등분산은 F-Test에 의해 확인하였다): 배수 억제는 양측 T-검정을 사용하여 KAGNatg보다 KAGatg에 대해 통계적으로 더 컸고(*p= 0.0293); KAGNNatg보다 KAGNatg에 대해 더 컸으며(**p=0.00000482); 비-중첩 tbs보다 KAGNNatg에 대해 더 컸다(***p= 0.000259). B. 비-억제 GFP 발현 점수를 최고에서 최저(왼쪽에서 오른쪽)로 플롯팅하였고, 두 개의 KAGatg 중첩 그룹 변이체 tbskzkV0.G 및 tbskzkV0.T(A에서 모든 변이체 중 가장 큰 억제를 나타냄)를 강조표시하였는데 'G' 변이체가 'T' 변이체보다 선호됨을 보여주며 이는 전자가 더 나은 'ON'(비-억제) 수준을 가지기 때문이다.
도 14. 최적의 중첩되는 tbs- Kozak 변이체를 사용한 인트론 함유 프로모터의 개선된 억제. A. 중첩되지 않는 tbs-Kozak 변이체와 비교하여 중첩되는 tbs-Kozak 변이체의 사용을 예시하는 데 사용되는 발현 카세트의 개략도. 널리 사용되는 EF1a 프로모터 서열은 널리 사용되는 CAG 프로모터와 마찬가지로 자체 인트론을 포함한다(도 10 및 실시예 5 참조). CAG 프로모터는 CMV 인핸서, 코어 프로모터 및 닭 β-액틴 유전자로부터의 엑손1/인트론 서열 및 토끼 β-글로빈 유전자로부터의 스플라이스 수용체/엑손 서열을 포함하는 매우 강력한 인공 프로모터이다. 이 작업에서, EF1a 프로모터(엑손 1[L33] 포함)로부터의 'EF1a-INT' 서열, 모든 EF1a 인트론 및 스플라이스 수용체, 및 EF1a 엑손 2로부터의 12개 뉴클레오티드를 CAG 프로모터 내로 클로닝하여, CAG 엑손/인트론 서열을 대체하였다. 'EF1a-INT' 서열은 또한 CMV 프로모터 작제물 내로 클로닝하였다. B. 바이러스 벡터 생산 동안 전이유전자 발현을 모델링하기 위해 현탁액(무혈청) HEK293T 세포에서 GFP 발현 및 TRAP에 의한 억제에 대해 작제물을 평가하였다. GFP 발현 점수(%GFP × MFI)를 생성하고 플롯팅하였으며, 뿐만 아니라 TRAP의 존재 하에서 배수 억제 점수를 표시하였다.
본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구현예는 이제 비제한적인 예로서 설명될 것이다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당업자의 능력 범위 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: J.　Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press. 이들 일반 교과서 각각은 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용은 본원에 개시된 예시적인 방법 및 물질에 의해 제한되지 않으며, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시내용의 구현예의 실시 또는 테스트에서 사용될 수 있다. 수치 범위(numeric range)에는 범위를 한정하는 수치가 포함된다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 핵산 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재되며; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기재된다.
값(value)의 범위가 제공되는 경우, 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 해당 범위의 상한과 하한 사이의 각 중간 값도 하한 단위의 10분의 1까지 구체적으로 개시되는 것으로 이해된다. 명시된 범위의 임의의 명시된 값 또는 중간 값과 해당 명시된 범위의 임의의 다른 명시된 값 또는 중간 값 사이의 각각의 더 작은 범위는 본 개시내용 내에 포함된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 배제될 수 있으며, 어느 한 한계, 둘 다 포함되지 않거나, 둘 모두가 더 작은 범위에 포함되는 각 범위는 또한 본 개시내용에 포함되며, 명시된 범위에서 구체적으로 제외된 한계의 적용을 받는다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 배제하는 범위도 본 개시내용에 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprise)" 및 "~를 포함하는(comprised of)"은 "포함하는(including)", "포함하다(include)" 또는 "함유하는(containing)", "함유하다(contain)"와 동의어이며, 포괄적이거나 개방형(open-ended)이며 추가의 명시되지 않은 구성원, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는(comprising)", "포함하다(comprise)" 및 "~를 포함하는(comprised of)"은 또한 "~로 구성되는(consisting of)"이라는 용어를 포함한다.
본원에 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 공개된 점를 위해서만 제공된다. 본원에 있는 어떤 것도 그러한 간행물이 여기에 첨부된 청구범위에 대한 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
핵산 서열
일 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 TRAP 결합 부위(tbs)는 Kozak 서열과 중첩된다.
일 측면에서 본 발명은 관심 뉴클레오티드(전이유전자) 및 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위(tbs)를 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 TRAP 결합 부위는 전이유전자 시작 코돈 ATG와 중첩된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 Kozak 서열은 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP) 결합 부위(tbs)의 일부를 포함한다.
일 측면에서 본 발명은 관심 뉴클레오티드(전이유전자) 및 TRAP 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 TRAP 결합 부위(tbs)는 전이유전자 시작 코돈 ATG의 일부를 포함하거나 그 반대도 마찬가지이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 tbs 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 TRAP가 결여된 표적 세포에서 번역된다.
tbs 또는 그의 일부는 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 TRAP와 상호작용할 수 있다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열 및 TRAP를 암호화하는 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포에 도입하는 것을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포에서 NOI의 번역을 억제하는 방법을 제공하며, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하여 NOI의 번역을 억제한다.
트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)
트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서 광범위하게 특성화된 박테리아 단백질이다. 이것은 전사 감쇠 또는 번역 제어 메커니즘에 참여하여 trpEDCFBA 오페론에서 지시하는 트립토판 생합성을 조절한다(Gollnick, B., Antson, and Yanofsky (2005) Annual Review of Genetics 39: 47-68에서 리뷰됨).
자연적 맥락에서 TRAP는 세 가지 별개의 메커니즘에 의해 트립토판 생합성과 수송을 조절한다:
1. trpEDCFBA 오페론의 전사 감쇠(Shimotsu H, K. M., Yanofsky C, Henner DJ. (1986) Journal of Bacteriology 166: 461-471).
2. trpE 및 trpD 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 블로킹 헤어핀의 형성 촉진(Yakhnin H, B. J., Yakhnin AV, Babitzke P. (2001) Journal of Bacteriology 183(20): 5918-5926).
3. trpG 및 yhaG 리보솜 결합 부위에 대한 리보솜 접근 차단(Yang M, d. S. A., van Loon APGM, Gollnick P. (1995) Journal of Bacteriology 177: 4272-4278).
바실러스 서브틸리스에서 TRAP은 단일 유전자(mtrB)에 의해 암호화되고 기능성 단백질은 토로이드 고리(toroid ring)로 배열되는 11개의 동일한 서브유닛으로 구성된다(Antson AA, D. E., Dodson G, Greaves RB, Chen X, Gollnick P. (1999) Nature 401(6750): 235-242). 그것은 인접한 서브유닛 사이의 포켓에서 최대 11개의 트립토판 분자에 결합하여 RNA와 상호작용하도록 활성화된다. 표적 RNA는 이 4차 고리 구조의 외부에 감긴다(Babitzke P, S. J., Shire SJ, Yanofsky C. (1994) Journal of Biological Chemistry 269: 16597-16604).
이론에 얽매이지 않고, 트립토판 합성을 감지하고 조절하는 자연적 기전에서, TRAP은 새로 합성된 RNA 리더의 결합 부위에 결합함으로써 전사 종결 수준에서 작용하는 것으로 이해된다. 이것은 중첩되는 안티-터미네이터(anti-terminator) 서열을 불안정하게 만들어 하류의 rho-독립적 터미네이터가 활성화되어 짧은 RNA만 생성하도록 하게 한다. 트립토판이 박테리아 내에서 제한되면, TRAP 고리는 더 이상 RNA 결합 부위에 결합할 수 없다. 따라서, 안티-터미네이터가 활성화되고 전사는 트립토판 합성 유전자 오페론으로 계속된다. TRAP는 번역 수준에서도 작용할 수 있다: RNA 전사체의 5'-UTR에 있는 결합 부위에 대한 TRAP의 트립토판-의존적 결합은 anti-샤인-달가르노 서열을 해방시키며, 이는 샤인-달가르노 서열과 안정적인 스템을 형성하여 리보솜 번역 개시가 억제된다. 마지막으로, 다른 상황에서 TRAP가 tbs에 결합되면 이것은 40S 스캐닝 리보솜 복합체가 개시 코돈에 도달하기 전에 40S 스캐닝 리보솜 복합체를 물리적으로 차단함으로써 번역 개시를 억제할 수 있으며, 만약 그렇지 않으면 더 안정적이고 친화도가 높은 번역 기계가 형성될 것이다.
TRAP 오픈 리딩 프레임은 포유류(예: 호모 사피엔스) 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있는데, 그 이유는 박테리아 유전자 서열이 포유류 세포에서의 발현에 최적이 아닐 가능성이 있기 때문이다. 잠재적인 불안정한 서열 및 스플라이싱 부위를 제거하여 서열을 최적화할 수도 있다. TRAP 단백질에서 C-말단에 발현되는 HIS-태그의 사용은 번역 억제의 측면에서 이점을 제공하는 것으로 보이며 선택적으로 사용될 수 있다. 이 C-말단 HIS-태그는 개선된 기능적 이점을 배제할 수 없지만 진핵 세포 내에서 TRAP의 용해도 또는 안정성을 개선할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HIS-태깅된 TRAP 및 태깅되지 않은 TRAP 양자 모두 전이유전자 발현의 강력한 억제를 허용하였다. TRAP 전사 단위 내의 특정 시스-작용 서열도 최적화될 수 있는데; 예를 들어, EF1α 프로모터 구동 작제물은 일시적 형질감염의 맥락에서 CMV 프로모터 구동 작제물에 비해 TRAP 플라스미드의 낮은 입력(input)으로 더 나은 억제를 가능하게 한다.
일 구현예에서, TRAP는 박테리아로부터 유래된다.
본 발명의 일 구현예에서, TRAP는 바실러스 종, 예를 들어 바실러스 서브틸리스로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MNQKHSSDFVVIKAVEDGVNVIGLTRGTDTKFHHSEKLDKGEVIIAQFTEHTSAIKVRGEALIQTAYGEMKSEKK (서열번호 1)
본 발명의 바람직한 구현예에서, 서열번호 1은 6개의 히스티딘 아미노산으로 C-말단에 태깅된다(HISx6 태그).
대안적인 구현예에서, TRAP는 Aminomonas paucivorans로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MKEGEEAKTSVLSDYVVVKALENGVTVIGLTRGQETKFAHTEKLDDGEVWIAQFTEHTSAIKVRGASEIHTKHGMLFSGRGRNEKG (서열번호 2)
대안적인 구현예에서, TRAP는 Desulfotomaculum hydrothermale로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MNPMTDRSDITGDYVVVKALENGVTIIGLTRGGVTKFHHTEKLDKGEIMIAQFTEHTSAIKIRGRAELLTKHGKIRTEVDS (서열번호 3)
대안적인 구현예에서, TRAP는 B. stearothermophilus로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIESEGKK (서열번호 4)
대안적인 구현예에서, TRAP는 B. stearothermophilus S72N으로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIENEGKK (서열번호 5)
대안적인 구현예에서, TRAP는 B. halodurans로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MNVGDNSNFFVIKAKENGVNVFGMTRGTDTRFHHSEKLDKGEVMIAQFTEHTSAVKIRGKAIIQTSYGTLDTEKDE (서열번호 6)
대안적인 구현예에서, TRAP는 Carboxydothermus hydrogenoformans로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 하기 서열을 포함할 수 있다:
MVCDNFAFSSAINAEYIVVKALENGVTIMGLTRGKDTKFHHTEKLDKGEVMVAQFTEHTSAIKIRGKAEIYTKHGVIKNE (서열번호 7)
일 구현예에서, TRAP는 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질 유전자 패밀리 mtrB(TrpBP 슈퍼패밀리, 예를 들어 NCBI 보존 도메인 데이터베이스 # cl03437)에 의해 암호화된다.
바람직한 구현예에서, TRAP는 6개의 히스티딘 아미노산으로 C-말단에 태깅된다(HISx6 태그).
바람직한 구현예에서, TRAP는 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일성을 가지고, 작동가능하게 연결된 NOI의 발현이 바이러스 벡터 생산 세포에서 변형, 예를 들어 억제 또는 방지되도록 RNA-결합 부위와 상호작용할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, TRAP는 서열번호 1 내지 7 중 어느 하나에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 동일성을 가지고, 작동가능하게 연결된 NOI의 발현이 바이러스 벡터 생산 세포에서 변형, 예를 들어 억제 또는 방지되도록 RNA-결합 부위와 상호작용할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, TRAP는 작동가능하게 연결된 NOI의 발현이 바이러스 벡터 생산 세포에서 변형, 예를 들어 억제 또는 방지되도록 RNA-결합 부위와 상호작용할 수 있는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, TRAP는 서열번호 1 내지 7의 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명에 사용하기 위한 TRAP의 모든 변이체, 단편 또는 동족체는 NOI(마커 유전자일 수 있음)의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제 또는 방지되도록 본원에 기재된 바와 같은 TRAP 결합 부위에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
TRAP 결합 부위
용어 "결합 부위"는 특정 단백질과 상호작용할 수 있는 핵산 서열로 이해되어야 한다.
TRAP에 결합할 수 있는 컨센서스 TRAP 결합 부위 서열은 [KAGNN]이 여러 번 반복되는데(예: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상); 이러한 서열은 천연 trp 오페론에서 발견된다. 자연적 맥락에서, 때때로 AAGNN이 허용되고 때때로 추가적인 "스페이싱" N 뉴클레오티드가 기능적 서열을 생성한다. 시험관 내 실험은 TRAP-RNA 결합에 적어도 6개 이상의 컨센서스 반복부가 필요함을 입증하였다(Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 따라서, 바람직하게는 일 구현예에서 tbs 내에 6개 이상의 연속적인 [KAGN≥2] 서열이 존재하며, 여기서 K는 DNA에서 T 또는 G이고 RNA에서 U 또는 G일 수 있다.
RNA-결합 단백질로서 TRAP의 경우, 바람직하게는 TRIP 시스템은 적어도 8개의 KAGNN 반복부를 함유하는 tbs 서열로 최대로 작동하지만, 7개의 반복부는 여전히 강력한 전이유전자 억제를 얻는 데 사용될 수 있고, 6개의 반복부는 벡터 역가를 구제할 수 있는 수준으로 전이유전자를 충분히 억제하는데 사용될 수 있다. KAGNN 컨센서스 서열은 TRAP 매개 억제를 유지하기 위해 다양할 수 있지만, 바람직하게는 선택된 정확한 서열은 억제되지 않은 상태에서 높은 수준의 번역을 보장하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, tbs 서열은 TRAP의 부재에서(즉, 표적 세포에서) mRNA의 번역 효율을 방해할 수 있는 스플라이싱 부위, 불안정한 서열 또는 스템-루프를 제거함으로써 최적화될 수 있다. 주어진 tbs의 KAGNN 반복부의 구성과 관련하여, KAG 반복부 사이의 N "스페이싱" 뉴클레오티드의 수는 바람직하게는 2이다. 그러나, 적어도 2개의 KAG 반복부 사이에 2개를 초과하는 N 스페이서를 함유하는 tbs가 허용될 수 있다(3개의 N을 포함하는 반복부의 50%는 시험관 내 결합 연구에 의해 판단되는 바와 같이 기능적 tbs를 생성할 수 있다; Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 실제로, 11x KAGNN tbs 서열은 KAGNNN 반복부로의 최대 3번의 교체를 허용할 수 있으며 여전히 TRAP 결합과 협력하여 잠재적으로 유용한 번역 차단 활성을 유지하는 것으로 나타났다.
본 발명의 일 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN≥2(예를 들어, KAGN2 - 3)를 포함한다. 이에 대한 의심의 소지를 없애기 위해, 이 tbs 또는 그의 일부는 예를 들어 UAGNN, GAGNN, TAGNN, UAGNNN, GAGNNN 또는 TAGNNN과 같은 반복부 서열 중 하나를 포함한다.
"N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드의 수는 바람직하게는 2이지만 최대 3, 예를 들어 1, 2 또는 3이다. 11x 반복부 tbs의 KAG 반복부 또는 그의 일부는 3개의 스페이싱 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있으며 번역 억제를 유도하는 일부 TRAP-결합 활성을 여전히 유지한다. 번역 억제를 유도하는 최대 TRAP-결합 활성을 유지하기 위해서는 바람직하게는 1개 이하의 N3 스페이서가 11x 반복부 tbs 또는 그의 일부에 사용될 것이다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN≥2의 다중 반복부(예를 들어, KAGN2 -3의 다중 반복부)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 다중 반복부를 포함한다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN≥2의 적어도 6개의 반복부(예를 들어, KAGN2 -3의 적어도 6개의 반복부)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN2의 적어도 6개의 반복부를 포함한다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 KAGN2의 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개 이상의 반복부를 포함할 수 있다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8-19 또는 22 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN≥2의 적어도 8개의 반복부(예를 들어, KAGN2 -3의 적어도 8개의 반복부)를 포함한다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14-17, 20-24 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
바람직하게는, tbs 또는 그의 일부에 존재하는 KAGNNN 반복부의 수는 1 이하이다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14-17, 19-24 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN≥2의 11개의 반복부(예를 들어, KAGN2 -3의 11개의 반복부)를 포함한다. 바람직하게는, 이 tbs 또는 그의 일부에 존재하는 KAGNNN 반복부의 수는 3개 이하이다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14, 20-22 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN≥2의 12개의 반복부(예를 들어, KAGN2-3의 12개의 반복부)를 포함한다.
바람직한 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 KAGN2의 8-11개의 반복부(예를 들어, KAGN2의 8, 9, 10 또는 11개의 반복부)를 포함한다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14-17, 20-24 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열번호 8-24 중 임의의 것을 포함할 수 있다.
예를 들어, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 하기 서열 중 하나를 포함할 수 있다:
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGUGGAGCU (서열번호 8); 또는
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGAAGAGCU (서열번호 9)
"KAGN≥2의 반복부"는 일반적인 KAGN≥2(예: KAGN2 -3) 모티프가 반복되는 것으로 이해되어야 한다. 이 모티프의 기준을 만족하는 상이한 KAGN≥2 서열이 tbs 또는 그의 일부를 구성하기 위해 결합될 수 있다. 수득되는 tbs 또는 그의 일부가 이 모티프의 요구 사항을 충족하는 단 하나의 서열의 반복으로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 비록 이 가능성이 정의에 포함되어 있긴 하지만 그러하다. 예를 들어, "KAGN≥2의 6개의 반복부"에는 하기 서열이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다:
UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU (서열번호 10);
UAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU (서열번호 11);
GAGUUU-GAGUU-GAGUU-GAGUUU-GAGUU-GAGUU (서열번호 12)
및:
UAGUUU-GAGUU-UAGUU-GAGUUU-UAGUU-GAGUU (서열번호 13)
(명확성을 위해 반복부 사이에 여기서는 대시를 포함하였다.)
1개의 KAGNNN 반복부 및 7개의 KAGNN 반복부를 포함하는 8개-반복부 tbs 또는 그의 일부는 TRAP 매개 억제 활성을 유지한다. 1개 이상의 KAGNNN 반복부를 포함하는 8개 미만-반복부 tbs 서열 또는 그의 일부(예: 7개- 또는 6개-반복부 tbs 서열 또는 그의 일부)는 TRAP 매개 억제 활성이 더 낮을 수 있다. 따라서, 8개 미만-반복부가 존재할 때, tbs 또는 그의 일부는 KAGNN 반복부만을 포함하는 것이 바람직하다.
KAGNN 반복부 컨센서스에서 사용하기에 바람직한 뉴클레오티드는 다음과 같다:
● NN 스페이서 위치 중 적어도 하나에 피리미딘;
● NN 스페이서 위치의 첫 번째 위치에 피리미딘;
● NN 스페이서 위치 모두에 피리미딘;
● K 위치에 G.
또한 NN 스페이서 위치가 AA일 때 K 위치에서 G를 사용하는 것이 바람직하다(즉, 컨센서스 서열에서 TAGAA가 반복부로 사용되지 않는 것이 바람직하다).
"상호작용할 수 있는"이란 핵산 결합 부위(예: tbs 또는 그의 일부)가 세포, 예를 들어 진핵생물 바이러스 벡터 생산 세포에서 마주치는 조건 하에서 단백질, 예를 들어 TRAP에 결합할 수 있음으로 이해되어야 한다. TRAP와 같은 RNA-결합 단백질과의 이러한 상호작용은 핵산 결합 부위(예: tbs 또는 그의 일부)가 작동가능하게 연결된 NOI의 번역의 억제 또는 방지를 초래한다.
"작동가능하게 연결된"이란 기재된 구성요소가 의도된 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있음으로 이해되어야 한다. 따라서 NOI에 작동가능하게 연결된 본 발명에서 사용하기 위한 tbs 또는 그의 일부는 TRAP가 tbs 또는 그의 일부에 결합할 때 NOI의 번역이 변형되는 방식으로 위치된다.
주어진 오픈 리딩 프레임(ORF)의 NOI 번역 개시 코돈의 상류에서 TRAP와 상호작용할 수 있는 tbs 또는 그의 일부의 배치는 해당 ORF로부터 유래된 mRNA의 특이적 번역 억제를 허용한다. tbs 또는 그의 일부와 번역 개시 코돈을 분리하는 뉴클레오티드의 수는 억제의 정도에 영향을 미치지 않으면서 예를 들어 0 내지 34개의 뉴클레오티드로 다양할 수 있다. 추가의 예로서, 0 내지 13개의 뉴클레오티드를 사용하여 TRAP-결합 부위 또는 그의 일부와 번역 개시 코돈을 분리할 수 있다.
tbs 또는 그의 일부는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 하류에 배치되어 멀티시스트론(multicistronic) mRNA에서 NOI의 번역을 억제할 수 있다. 실제로, 이것은 tbs-결합 TRAP가 40S 리보솜의 통과를 차단할 수 있다는 추가의 증거를 제공한다; IRES 요소는 전체 번역 복합체가 형성되기 전에 CAP-독립적인 방식으로 40S 리보솜 서브유닛을 mRNA에 격리시키는 기능을 한다(IRES 번역 개시에 대한 검토를 위해 Thompson, S. (2012) Trends in Microbiology 20(11): 558-566 참조). 따라서, TRIP 시스템은 바이러스 벡터 게놈으로부터 발현되는 단일 mRNA로부터의 다중 오픈 리딩 프레임을 억제하는 것이 가능하다. 여러 치료 유전자를 암호화하는 벡터를 생성할 때, 특히 모든 전이유전자 산물이 벡터 역가에 어느 정도 부정적인 영향을 미칠 수 있는 경우에, 이것은 TRIP 시스템의 유용한 특징이 될 것이다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 IRES와 tbs 또는 그의 일부 사이에 스페이서 서열을 포함한다. IRES는 "내부 리보솜 진입 부위"라는 소제목으로 본원에 기술된 바와 같은 IRES일 수 있다. 스페이서 서열은 0 내지 30개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 15개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 스페이서는 서열번호 38-44 중 어느 하나에 정의된 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게는 스페이서는 서열번호 38에 정의된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, IRES와 tbs 또는 그의 일부 사이의 스페이서 서열은 tbs 또는 그의 일부의 3' 말단 및 NOI의 하류 개시 코돈으로부터 3 또는 9개의 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부에는 II형 제한 효소 부위가 결여되어 있다. 바람직한 구현예에서, tbs 또는 그의 일부에는 SapI 제한 효소 부위가 결여되어 있다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 RRE 서열 또는 그의 기능적 대체물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 벡터 전이유전자 발현 카세트이다.
중첩되는 Kozak 서열과 TRAP 결합 부위
본 발명자들은 놀랍게도 중첩되지 않는 tbs 및 Kozak 서열의 사용에 비해 tbs 또는 그의 일부의 3' 말단 내에 Kozak 서열을 '숨김'으로써(중첩되는 tbs 및 Kozak 서열의 사용; 도 2B 및 2C 참조) 개선된 수준의 억제가 달성될 수 있음을 발견하였다. 또한, 테스트된 모든 중첩되는 Kozak 및 tbs 서열은 예기치 않게 효율적인 번역 개시 수준을 지시하였다. 즉, 테스트된 중첩되는 서열은 TRAP의 부재 하에 중첩되지 않는 Kozak 및 tbs 서열과 유사한 수준의 전이유전자 발현을 나타내었다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 개선된 수준의 억제는 tbs 또는 그의 일부가 Kozak 서열과 중첩될 때 TRAP-tbs 복합체에 의한 전이유전자 개시 코돈의 개선된 폐색에 기인할 수 있다.
"Kozak 서열"이라는 용어는 번역 개시 부위로서 리보솜에 의해 인식되는 진핵생물 mRNA의 컨센서스 서열로 이해되어야 한다. Kozak 서열은 DNA에서 ATG(mRNA에서는 AUG) 개시(시작) 코돈을 포함한다. 진핵생물 mRNA에 존재하는 정확한 Kozak 서열은 번역 개시의 효율성을 결정한다. 즉, 특정 Kozak 서열은 효율적인 번역 개시로 이어지지 않는다.
전체 Kozak 서열은 전형적으로 DNA의 경우 (gcc)gccRccATGG 및 RNA의 경우 (gcc)gccRccAUGG인 컨센서스 서열을 갖는 것으로 이해되며, 여기서; 소문자는 이 위치에서 가장 일반적인 염기를 나타내고 이 위치의 염기는 변할 수 있으며; 대문자는 이 위치에서 고도로 보존된 염기를 나타내고; "R"은 퓨린(즉, A 또는 G)이 전형적으로 이 위치에서 최적임을 나타내고; 괄호 안의 서열 (gcc)는 불확실한 의미를 가진다. T/U는 일반적으로 개시 코돈의 상류에 있는 Kozak 서열 컨센서스의 모든 위치에서 가장 덜 선호되는 뉴클레오티드이다.
전체 Kozak 서열의 처음 3개 염기가 불확실한 의미를 가지므로, Kozak 서열은 본원에서 "확장된 Kozak 서열"로 지칭되는 컨센서스 서열을 가지는 것으로 또한 이해될 수 있고, DNA의 경우 GNNRVVATGG(서열번호 27) 및 RNA의 경우 GNNRVVAUGG이며, 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A, 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하며, "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, "N"은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다. 위치 -1의 "R" 및 위치 +3의 "G"(위치 0에 해당하는 ATG의 "A"에 대하여)은 Kozak 강도의 측면에서 가장 중요한 위치로 간주됨을 유의해야 한다. 그러나, 전이유전자 서열의 +3 위치에 "G"가 있는지 여부는 암호화되는 ORF에 따라 다르므로, 사양의 목적상 +3 위치는 '코어' Kozak 서열의 일부로 간주되지 않는다.
전체 Kozak 서열의 처음 6개 위치에서 발견된 염기는 모든 염기가 해당 위치에서 발견될 수 있을 정도로 다양하다(위에서 (gcc)gcc로 표시됨). 따라서, 전체 Kozak 컨센서스 서열은 위의 RccAUG로 표시된 감소된 가변성을 가지는 전체 Kozak 서열의 일부로 이루어진 '코어' Kozak 서열을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. '코어' Kozak 컨센서스 서열은 본원에서 mRNA의 경우 RVVAUG 및 DNA의 경우 RVVATG로 정의되며, 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고 "V"는 G, A 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에서, Kozak 서열은 서열 RVVATG(서열번호 28)을 포함하고; 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고 "V"는 G, A 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, Kozak 서열은 서열 RNNATG(서열번호 125)를 포함하고; 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고 "N"은 G, A, T/U 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하며, "T/U"의 사용은 TRAP가 없을 때 발현 수준을 감소시킬 수 있음을 인식해야 한다.
일부 구현예에서, Kozak 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부와 중첩된다. 따라서, 코어 Kozak 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부와 중첩될 수 있다.
바람직한 중첩되는 tbs 및 Kozak 컨센서스 서열의 요약을 도 2C에 나타내었다.
바람직한 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 코어 Kozak 서열 내의 ATG 트리플렛의 적어도 첫 번째 또는 처음 두 개의 뉴클레오티드와 중첩된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 일 측면에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 관심 뉴클레오티드(전이유전자 ORF)의 ATG 시작 코돈과 중첩된다. 일 측면에서 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 관심 뉴클레오티드(전이유전자 ORF)의 ATG 시작 코돈의 처음 1개 또는 2개와 중첩된다.
일 측면에서 중첩되는 tbs-Kozak 서열은 컨센서스 서열 KAGNNG(서열번호 113)를 가질 수 있으며, 여기서 "NN"은 Kozak 서열의 ATG 트리플렛 내의 처음 2개의 뉴클레오티드이다.
컨센서스 서열은 KAGATG(서열번호 114)일 수 있고; 여기서 "K"는 G 또는 T/U이다.
일 측면에서, 중첩되는 tbs-Kozak 서열은 도 2C에 도시된 바와 같이 GAGATG(서열번호 29)일 수 있다.
일 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부는 관심 뉴클레오티드 내의 ATG 트리플렛의 첫 번째 뉴클레오티드와 중첩된다.
일 측면에서 서열은 서열 KAGNNTG(서열번호 115)를 포함할 수 있고, 여기서 두 번째 "N"은 ATG 트리플렛 내의 첫 번째 뉴클레오티드이다. 컨센서스 서열은 KAGNATG(서열번호 116)일 수 있고; 여기서 "K"는 서열의 해당 위치에서 G 또는 T/U를 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "N"은 G, A, T, U 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하지만 바람직하게는 "V"이고, 즉, G, A 또는 C로부터이다. 예를 들어, 중첩되는 서열은 도 2C에 도시된 바와 같이 KAGVATG(서열번호 30)일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산에 사용하기 위한 중첩되는 Kozak 서열 및 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGATG (서열번호 29);
(b) KAGVATG (서열번호 30);
(c) KAGVVATG (서열번호 31);
(d) KAGRVVATG (서열번호 32); 또는
(e) KAGNRVVATG (서열번호 33);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있고, "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A, 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 "N"은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGATG (서열번호 29) 또는 KAGATG (서열번호 114);
(b) KAGVATG (서열번호 30);
(c) KAGVVATG (서열번호 31);
(d) KAGRVVATG (서열번호 32); 또는
(e) KAGNRVVATG (서열번호 33);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있고, "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A, 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 "N"은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다.
본 발명의 핵산에 사용하기 위한 컨센서스 서열 GAGATG(서열번호 29), KAGVATG(서열번호 30) 및 KAGVVATG(서열번호 31)에 해당하는 바람직한 중첩되는 tbs 또는 그의 일부 및 코어 Kozak 서열(본원에 정의된 바와 같은 KAGNN의 컨센서스 tbs 반복부 서열 및 본원에 정의된 바와 같은 컨센서스 '코어' Kozak 서열 RVVATG를 기반으로 함)은 하기를 포함한다:
(a) GAGATG (서열번호 29);
(b) GAGAATG (서열번호 69);
(c) GAGCATG (서열번호 70);
(d) GAGGATG (서열번호 71);
(e) TAGAATG (서열번호 72);
(f) TAGCATG (서열번호 73);
(g) TAGGATG (서열번호 74);
(h) GAGAAATG (서열번호 75);
(i) GAGACATG (서열번호 76);
(j) GAGAGATG (서열번호 77);
(k) GAGCAATG (서열번호 78);
(l) GAGCCATG (서열번호 79);
(m) GAGCGATG (서열번호 80);
(n) GAGGAATG (서열번호 81);
(o) GAGGCATG (서열번호 82);
(p) GAGGGATG (서열번호 83);
(q) TAGAAATG (서열번호 84);
(r) TAGACATG (서열번호 85);
(s) TAGAGATG (서열번호 86);
(t) TAGCAATG (서열번호 87);
(u) TAGCCATG (서열번호 88);
(v) TAGCGATG (서열번호 89);
(w) TAGGAATG (서열번호 90);
(x) TAGGCATG (서열번호 91);
(y) TAGGGATG (서열번호 92).
일부 구현예에서, 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) KAGCCGAGATG (서열번호 34);
(b) KAGNGGAGCCATG (서열번호 35); 또는
(c) KAGNNGAGACCATG (서열번호 36);
(d) KAGGCGAGCATG (서열번호 37);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있고 "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다.
바람직하게는, 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) KAGCCGAGATG (서열번호 34); 또는
(b) KAGNGGAGCCATG (서열번호 35);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있고 "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 하기의 중첩되는 tbs 및 Kozak 서열을 포함한다:
GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAGATG (서열번호 60).
NOI 번역의 억제 또는 방지는 바이러스 벡터 생산 동안 번역되는 NOI 산물(예: 단백질)의 양을 동등한 시점에서 본 발명의 핵산 서열이 없을 때 발현되는 양과 비교하여 변경하는 것으로 이해되어야 한다. 번역의 이러한 변경은 결과적으로 NOI에 의해 암호화되는 단백질 발현의 억제 또는 방지를 초래한다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 TRAP와 상호작용할 수 있다.
벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%로 감소될 수 있다.
벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만으로 감소될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 (본 발명의 핵산 서열과 대조적으로) 중첩되지 않는 Kozak 및 tbs 서열을 포함하는 핵산 서열의 존재 하에 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%로 감소될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 (본 발명의 핵산 서열과 대조적으로) 중첩되지 않는 Kozak 및 tbs 서열을 포함하는 핵산 서열의 존재 하에 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만으로 감소될 수 있다.
NOI의 번역을 방지하는 것은 번역의 양을 실질적으로 0으로 줄이는 것으로 이해되어야 한다.
벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%로 감소될 수 있다.
벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만으로 감소될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 (본 발명의 핵산 서열과 대조적으로) 중첩되지 않는 Kozak 및 tbs 서열을 포함하는 핵산 서열의 존재 하에 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1%로 감소될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 벡터 생산 동안 임의의 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 (본 발명의 핵산 서열과 대조적으로) 중첩되지 않는 Kozak 및 tbs 서열을 포함하는 핵산 서열의 존재 하에 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 미만으로 감소될 수 있다.
NOI로부터 단백질의 발현을 방지하는 것은 발현되는 단백질의 양을 실질적으로 0으로 감소시키는 것으로 이해되어야 한다.
NOI 번역의 분석 및/또는 정량화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
용해된 세포로부터의 단백질 산물은 Coomassie 또는 은 염색에 의한 시각화와 함께 SDS-PAGE 분석과 같은 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 대안적으로 단백질 산물은 단백질 산물에 결합하는 항체 프로브를 사용한 웨스턴 블롯팅 또는 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 분석할 수 있다. 손상되지 않은 세포의 단백질 산물은 면역형광법으로 분석할 수 있다.
개선된 리더 서열
TRIP 시스템을 다양한 프로모터(서로 다른 길이 및 조성의 다양한 천연 5'UTR을 함유함)에 적용할 때, TRAP에 의한 효율적인 억제를 제공하면서도 또한 TRAP 없이 우수한 수준의 발현을 유지하기 위해서는 프로모터-UTR 컨텍스트 내에서 tbs 서열을 간단하게 적용할 수 있는 것이 바람직하다. 이 작업의 시초에는, tbs가 다양한 구성적 프로모터의 천연 UTR에 삽입될 때 TRAP-tbs에 의해 매개되는 달성 가능한 억제 수준이 무엇인지 알려지지 않았다. 이상적으로는, 천연 5'UTR 서열에 의해 지시될 수 있는 억제 수준의 잠재적인 변동성을 피하기 위해 선택한 프로모터를 수정할 때 tbs와 함께 단일의 보존된 5'UTR 리더 서열을 제공할 수 있는 것이 유리할 것이다. 놀랍게도, EF1α 프로모터의 첫 번째 엑손(서열번호 25)이 천연의 리더 서열을 포함하는 5'UTR 리더와 비교하여 TRAP에 의해 일관되게 우수한 수준의 전이유전자 억제를 제공하고, 이 리더는 또한 TRAP가 없는 경우 우수한 수준의 전이유전자 발현을 제공한다는 것이 발견되었다.
일부 구현예에서, 핵산 서열은 tbs 또는 그의 일부의 상류에 5' 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 바로 상류에 있을 수 있으며, 즉 리더 서열과 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부를 분리하는 추가의 서열이 없을 수 있다. 5' 리더가 스플라이싱 이벤트에서 파생된 경우, 엑손/엑손 접합에서 tbs까지의 서열은 최소 길이(바람직하게는 ≤12nt)로 유지되어야 한다. 리더 서열은 비-코딩 EF1α 엑손 1 영역으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 리더 서열은 서열번호 25, 일 구현예 또는 서열번호 93에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다.
다중 클로닝 부위
TRIP 시스템의 취급성(tractability)을 개선하기 위해 여러 다른 제한 효소(RE)의 옵션을 통해, 즉 tbs와 Kozak 서열 사이에 다중 클로닝 부위(MCS)를 통합하여 프로모터-5'UTR-tbs 서열을 포함하는 발현 카세트에 NOI를 직접 클로닝하는 능력을 가질 수 있는 것이 바람직하다(도 2A 참조). 본 발명자들은 여러 상이한 MCS가 TRIP 시스템에 의해 허용될 수 있다는 것을, 즉 MCS가 사용될 때 전이유전자 억제가 여전히 얻어진다는 것을 입증하였다. 이는 5'UTR 리더 서열이 TRAP 매개 억제의 정도를 조절할 수 있고, ATG 개시 코돈에 대한 tbs의 근접성이 중요하고, 효율적인 번역 개시를 보장하기 위해서는 효율적인 Kozak 서열이 MCS와 NOI의 개시 코돈과 함께 또는 그 사이에서 유지되어야 한다는 점을 감안할 때 예상치 못한 일이었다. 또한, TRAP 매개 억제를 유지하면서 사용할 수 있는 RE 부위의 수 및/또는 조합을 예측할 수 없었다.
이와 같이, 여러 (중첩되는) RE 부위가 tbs에서부터 ATG 개시 코돈까지 가능한 한 짧은 거리에 통합될 수 있도록 하는 한편(ATG에 대한 tbs의 근접성을 유지하기 위해) RVVATG의 효율적인 코어 Kozak 서열을 유지하도록 하는 서열 '압축'이 필요하였다.
추가의 측면에서, 본 발명은 관심 뉴클레오티드, 본원에 기재된 tbs 또는 그의 일부, 다중 클로닝 부위(MCS) 및 본원에 기재된 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공하며, 여기서 상기 MCS는 tbs 또는 그의 일부의 하류 및 Kozak 서열의 상류에 위치한다. 적합하게는, tbs 또는 그의 일부와 Kozak 서열은 중첩되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "다중 클로닝 부위"는 서로 매우 근접한 여러 제한 효소 인식 부위(제한 효소 부위)를 포함하는 DNA 영역으로 이해되어야 한다. 일 구현예에서, RE 부위는 본 발명에서 사용하기 위한 MCS에서 중첩될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제한 효소 부위" 또는 "제한 효소 인식 부위"는 제한 효소에 의해 인식되는 4-8개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드의 특정 서열을 함유하는 DNA 분자 상의 위치이다. 제한 효소는 특정 RE 부위(즉, 특정 서열)를 인식하고 RE 부위 내부 또는 근처에서 DNA 분자를 절단한다.
TRAP에 결합할 수 있는 컨센서스 TRAP 결합 부위 서열은 [KAGNN]이 여러 번 반복되고(예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12회 이상); 여기서 K는 DNA에서 T 또는 G이고 RNA에서 U 또는 G일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부는 서열 KAGN≥2(예를 들어, KAGN2 - 3)를 포함한다. 이에 대한 의심의 소지를 없애기 위해, 이 tbs 또는 그의 일부는 예를 들어 UAGNN, GAGNN, TAGNN, UAGNNN, GAGNNN 또는 TAGNNN과 같은 반복부 서열 중 하나를 포함한다. "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드의 수는 바람직하게는 2이지만 최대 3, 예를 들어 1, 2 또는 3이다. 11x 반복부 tbs의 KAG 반복부 또는 그의 일부는 3개의 스페이싱 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있으며 번역 억제를 유도하는 일부 TRAP-결합 활성을 여전히 유지한다. 번역 억제를 유도하는 최대 TRAP-결합 활성을 유지하기 위해서는 바람직하게는 1개 이하의 N3 스페이서가 11x 반복부 tbs 또는 그의 일부에 사용될 것이다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGCTCTAGAVVATG (서열번호 45);
(b) GAGCTCGTCGACVATG (서열번호 46);
(c) GAGCTCGAATTCGAAVVATG (서열번호 47);
(d) GAGCTCTAGACGTCGACVATG (서열번호 48);
(e) GAGCTCTAGAATTCGAAVVATG (서열번호 49);
(f) GAGCTCTAGATATCGATRVVATG (서열번호 50);
(g) KAGACTAGTACTTAAGCTTRVVATG (서열번호 51);
(h) GAGCTCTAGACCATG (서열번호 52);
(i) GAGCTCGTCGACCATG (서열번호 53);
(j) GAGCTCGAATTCGAACCATG (서열번호 54);
(k) GAGCTCTAGACGTCGACCATG (서열번호 55);
(l) GAGCTCTAGAATTCGAACCATG (서열번호 56);
(m) GAGCTCTAGATATCGATACCATG (서열번호 57); 또는
(n) KAGACTAGTACTTAAGCTTACCATG (서열번호 58);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있고, "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGCTCTAGACCATG (서열번호 52);
(b) GAGCTCGTCGACCATG (서열번호 53);7
(c) GAGCTCGAATTCGAACCATG (서열번호 54);
(d) GAGCTCTAGACGTCGACCATG (서열번호 55);
(e) GAGCTCTAGAATTCGAACCATG (서열번호 56);
(f) GAGCTCTAGATATCGATACCATG (서열번호 57); 또는
(g) KAGACTAGTACTTAAGCTTACCATG (서열번호 58);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 하기 서열 중 하나를 포함한다:
(a) GAGCTCTAGACCATG (서열번호 52);
(b) GAGCTCTAGACGTCGACCATG (서열번호 55); 또는
(c) KAGACTAGTACTTAAGCTTACCATG (서열번호 58);
여기서 "K"는 T 또는 G일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 하기의 중첩되는 tbs-MCS-Kozak 서열을 포함한다:
GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGAAGAGCTCTAGACCATG (서열번호 61).
일 구현예에서, NOI는 tbs 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 TRAP와 상호작용할 수 있다.
일 구현예에서, NOI는 TRAP가 결여된 표적 세포에서 번역된다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2 -3의 다중 반복부를 포함한다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 다중 반복부를 포함한다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 적어도 6개의 반복부를 포함한다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8-19 또는 22 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2 -3의 적어도 8개의 반복부를 포함한다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14-17, 20-24 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, KAGNNN 반복부의 수는 1 이하이다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14-17, 19-24 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2의 적어도 8-11개의 반복부를 포함한다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부는 서열 KAGN2 -3의 11개의 반복부를 포함한다. 적절하게는, KAGNNN 반복부의 수는 3개 이하이다. 예를 들어, tbs 또는 그의 일부는 서열번호 8, 9, 14, 20-22 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, Kozak 서열은 서열 RVVATG(서열번호 28)를 포함하고; 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에서, Kozak 서열은 서열 RNNATG(서열번호 125)를 포함하고; 여기서 "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "N"은 G, A, T/U 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다.
일 구현예에서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 tbs 또는 그의 일부의 시작까지의 거리는 34개 뉴클레오티드 미만이다.
일 구현예에서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 tbs 또는 그의 일부의 시작까지의 거리는 13개 뉴클레오티드 미만이다.
일 구현예에서, tbs 또는 그의 일부에는 II형 제한 효소 부위, 바람직하게는 SapI 제한 효소 부위가 결여되어 있다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 tbs 또는 그의 일부의 상류에 5' 리더 서열을 포함한다. 리더 서열은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 바로 상류에 있을 수 있으며, 즉 리더 서열과 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부를 분리하는 추가의 서열이 없을 수 있다.
일 구현예에서, 리더 서열은 비-코딩 EF1α 엑손 1 영역으로부터 유래된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 리더 서열은 서열번호 25 또는 서열번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 IRES를 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 IRES와 tbs 또는 그의 일부 사이에 스페이서 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 스페이서는 길이가 0 내지 30개 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 스페이서는 길이가 15개 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 스페이서는 tbs 또는 그의 일부의 3' 말단 및 NOI의 하류 개시 코돈으로부터의 3 또는 9개의 뉴클레오티드이다.
일 구현예에서, 스페이서는 서열번호 38-44 중 어느 하나에 정의된 서열을 포함하고, 바람직하게는 스페이서는 서열번호 38에 정의된 서열을 포함한다.
일 구현예에서, NOI는 치료 효과를 발생시킨다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 RRE 서열 또는 그의 기능적 대체물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 벡터 전이유전자 발현 카세트이다.
일 구현예에서, 본 발명의 핵산 서열은 프로모터를 추가로 포함한다. 전형적으로, 프로모터의 전사는 생성된 mRNA 전사체에 암호화된 5' UTR을 초래한다. 프로모터는 당해 분야에 공지되어 있고 관심 뉴클레오티드의 발현을 제어하기에 적합한 임의의 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 EF1α, EFS, CMV 또는 CAG일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 중첩되는 tbs 및 Kozak 서열은 프로모터의 5' UTR 내에 위치하며, 여기서 5' UTR은 연관된 프로모터로부터의 천연 서열을 포함할 수 있거나, 보다 바람직하게는 5' UTR은 본원에 기재된 5' UTR 서열로 구성된다.
바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 tbs와 Kozak 서열 사이에 압축된/중첩되는 MCS를 포함하는 서열은 상기 5' UTR 내에 위치한다.
본원에 기재된 바와 같은 중첩되는 tbs 및 Kozak 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 tbs와 Kozak 서열 사이에 압축된/중첩되는 MCS를 포함하는 서열은 상기 5' UTR의 3' 말단에 위치할 수 있다.
바람직하게는, 5' UTR은 하기 서열 중 하나를 포함한다: 서열번호 29-37, 45-58, 69-92 및 108-116. 더욱 바람직하게는, 5' UTR은 서열번호 29 또는 서열번호 108을 포함한다. 훨씬 더 바람직하게는 5' UTR은 서열번호 29를 포함한다.
프로모터-5' UTR 영역은 인트론을 포함할 수 있다. 인트론은 천연 인트론 또는 이종 인트론일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 EF1α 또는 CAG일 수 있다.
프로모터는 인트론이 없는 바이러스 벡터 게놈에서 전형적으로 사용되는 프로모터, 예를 들어 CMV일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 프로모터-5' UTR 영역은 이종 인트론을 포함하는 인공 5' UTR을 포함하도록 조작되었다. 따라서, 프로모터-5' UTR 영역은 이종 엑손-인트론-엑손 서열을 포함하도록 조작되었으며, 여기서 mRNA 전사체 내에 암호화된 성숙한 5' UTR은 인트론의 스플라이싱-아웃으로부터 발생한다. 프로모터-5' UTR 서열은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 조작될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 본원에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다(실시예 8 참조).
바람직하게는, 인트론 또는 이종 인트론의 스플라이싱-아웃으로 인한 성숙한 mRNA로부터의 전이유전자 단백질의 발현은 TRAP에 의해 효율적으로 억제된다. 적합하게는, 인트론 또는 이종 인트론은 서열번호 122에 따른 EF1α 인트론 서열일 수 있다.
인트론 또는 이종 인트론은 본원에 기재된 바와 같은 중첩되는 tbs 및 Kozak 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 tbs와 Kozak 서열 사이에 MCS를 포함하는 서열의 상류, 즉 5'에 위치할 수 있다.
5' UTR은 하기 서열을 포함할 수 있다(닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 키메라 5'UTR-인트론, 엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨)):
CGGCGGGCGGGAACGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTTTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAAA (서열번호 121)
5' UTR은 하기 서열을 포함할 수 있다(EF1a 5'UTR-인트론, 엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨)):
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAAAA (서열번호 122)
일 구현예에서, 프로모터는 하기 서열을 포함한다(엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨), tbs 컨센서스는 이탤릭체로 표시):
CGGCGGGCGGGAACGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTTTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAAA [KAGN 2-3 ] 10-11 (서열번호 123)
일 구현예에서, 프로모터는 하기 서열을 포함한다(엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨), tbs 컨센서스는 이탤릭체로 표시):
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAAAA [KAGN 2-3 ] 10-11 (서열번호 124)
일 구현예에서, 프로모터는 하기 서열을 포함한다(닭 β-액틴/토끼 β-글로빈 키메라 5'UTR-인트론과 tbs-kzkV0.G 변이체, 엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨), tbskzkV0.G는 이탤릭체로 표시):
CGGCGGGCGGGAACGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTTTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAAA GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAG ATG (서열번호 117)
일 구현예에서, 프로모터는 하기 서열을 포함한다(EF1a 5'UTR-인트론과 중첩되는 tbs 및 Kozak 서열(tbskzkV0.G 변이체), 엑손 서열은 굵게 표시(함께 스플라이싱되어 5'UTR 리더가 됨), tbskzkV0.G는 이탤릭체로 표시):
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGTGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGTGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCAGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGCCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCACAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCCAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAAAA GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAG ATG (서열번호 118)
서열번호 117에 상응하는 스플라이싱된 서열; 5'UTR 리더 서열은 굵게 표시, tbskzkV0.G은 이탤릭체로 표시:
CGGCGGGCGGGAACGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGCTCCTGGGCAAA GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAG ATG (서열번호 119)
서열번호 118에 상응하는 스플라이싱된 서열; 5'UTR 리더 서열은 굵게 표시, tbskzkV0.G은 이탤릭체로 표시:
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGAAAA GAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAG ATG (서열번호 120)
예시적인 핵산 서열
본 발명의 예시적인 핵산 서열을 하기에 나타내었다.
서열번호 62 - L33 개선된 리더, 최적의 (중첩되는) tbs ([ KAGNN ] 8 )-Kozak 접합을 포함하는 예시적인 핵산 서열 1
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGA GCCGAGAT G
서열번호 63 - L33 개선된 리더, 최적의 (중첩되는) tbs ([ KAGNN ] 11 )-Kozak 접합을 포함하는 예시적인 핵산 서열 2
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGA GCCGAGAT G
서열번호 64 - L12 개선된 리더, 최적의 (중첩되는) tbs ([ KAGNN ] 11 )-Kozak을 포함하는 예시적인 핵산 서열 3
CTTTTTCGCAACGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGA GCCGAGAT G
서열번호 65 - L33, 최적의 (중첩되는) tbs ([ KAGNN ] 11 )-Kozak 접합을 포함하는 스플라이싱된 리더를 생성하는 인트론 함유 5'UTR에 대한 예시적인 핵산 서열 4
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTGTCGTGAAAAGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGCCGAGATG
서열번호 66 - 개선된 스페이서, 최적의 (중첩되는) tbs ([ KAGNN ] 8 )-Kozak 접합을 포함하는 예시적인 핵산 서열 5
ATAGCAGAGACGGCTGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGA GCCGAGAT G
서열번호 67 - L33 개선된 리더 tbs ([ KAGNN ] 11 )-MCS-Kozak을 포함하는 예시적인 핵산 서열 6
CTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGAA GAGCTC TAG A CCATG
서열번호 68 - 개선된 스페이서, tbs ([ KAGNN ] 11 )-MCS-Kozak을 포함하는 예시적인 핵산 서열 7
ATAGCAGAGACGGCTGAGTTTAGCGGAGTGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCTAGCAGAGACGAGAA GAGCTC TAG A CCATG
일 구현예에서, 핵산 서열은 서열번호 62-68 중 어느 하나를 포함한다.
일 구현예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다:
(a) (i) 서열번호 25 또는 26; 및/또는
(ii) 서열번호 38-44 중 어느 하나;
(b) 서열번호 10-13, 15-19, 23, 24 중 어느 하나; 및
(c) (i) 서열번호 29-36 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 34-36 중 어느 하나; 또는
(ii) 서열번호 45-58 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 52-58 중 어느 하나.
일 구현예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 25 또는 26;
(b) 서열번호 10-13, 16-19, 23, 24 중 어느 하나; 및
(c) 서열번호 29-36 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 34-36 중 어느 하나.
일 구현예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 38-44 중 어느 하나;
(b) 서열번호 10-13, 16-19, 23, 24 중 어느 하나; 및
(c) 서열번호 29-36 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 34-36 중 어느 하나.
일 구현예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 25 또는 26;
(b) 서열번호 10-13, 15-19, 23, 24 중 어느 하나; 및
(c) 서열번호 45-58 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 52-58 중 어느 하나.
일 구현예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 38-44 중 어느 하나;
(b) 서열번호 10-13, 15-19, 23, 24 중 어느 하나; 및
(c) 서열번호 45-58 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 52-58 중 어느 하나.
관심 뉴클레오티드
본 발명의 일 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 TRAP가 결여된 표적 세포에서 번역된다.
"표적 세포"는 NOI를 발현하고자 하는 세포로 이해되어야 한다. NOI는 본 발명의 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 표적 세포로의 전달은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 관심 뉴클레오티드는 치료 효과를 발생시킨다.
NOI는 치료 또는 진단 용도를 가질 수 있다. 적합한 NOI는 효소, 보조인자(co-factor), 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 항체, 항산화 분자, 조작된 면역글로불린-유사 분자, 단일 사슬 항체, 융합 단백질, 면역 공동-자극 분자, 면역조절 분자, 키메라 항원 수용체, 표적 단백질의 트랜스도메인 음성 돌연변이, 독소, 조건부 독소, 항원, 전사 인자, 구조 단백질, 리포터 단백질, 세포내(subcellular) 국소화 신호, 종양 억제 단백질, 성장 인자, 막 단백질, 수용체, 혈관 활성(vasoactive) 단백질 및 펩티드, 항바이러스성 단백질 및 리보자임(ribozyme), 및 이의 유도체(예컨대 관련 리포터 그룹을 가지는 유도체)를 암호화하는 서열을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다. NOI는 또한 마이크로-RNA를 암호화할 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 마이크로-RNA의 처리는 TRAP에 의해 억제될 것으로 믿어진다.
일 구현예에서, NOI는 신경퇴행성 장애의 치료에 유용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 파킨슨병의 치료에 유용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 도파민 합성에 관여하는 효소 또는 효소들을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 효소는 티로신 히드록실라제, GTP-시클로히드록실라제 I 및/또는 방향족 아미노산 도파 데카르복실라제 중 하나 이상일 수 있다. 세 가지 유전자의 서열은 모두 이용가능하다(각각 GenBank® Accession Nos. X05290, U19523 및 M76180).
또 다른 구현예에서, NOI는 소포성 모노아민 수송체 2(vesicular monoamine transporter 2, VMAT2)를 암호화할 수 있다. 대안적인 구현예에서 바이러스 게놈은 방향족 아미노산 도파 데카르복실라제를 암호화하는 NOI 및 VMAT2를 암호화하는 NOI를 포함할 수 있다. 이러한 게놈은, 특히 L-DOPA의 말초 투여와 함께, 파킨슨병의 치료에 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서 NOI는 치료 단백질 또는 치료 단백질의 조합을 암호화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 신경교 세포 유래 신경영양 인자(glial cell derived neurotophic factor, GDNF), 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 모양체 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인터루킨-1 베타(IL-1β), 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인슐린 성장 인자-2, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C/VEGF-2, VEGF-D, VEGF-E, PDGF-A, PDGF-B, PDFG-A 및 PDFG-B의 이종이량체 및 동종이량체으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 단백질들을 암호화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 혈소판 인자 4, 색소 상피 유래 인자(PEDF), 태반 성장 인자, 레스틴(restin), 인터페론-α, 인터페론-유도성 단백질, 그로-베타(gro-beta) 및 튜브다운-1(tubedown-1), 인터류킨(IL)-1, IL-12, 레티노산, 항-VEGF 항체 또는 이의 단편/변이체, 예컨대 애플리버셉트(aflibercept), 트롬보스폰딘, VEGF 수용체 단백질, 예컨대 US 5,952,199 및 US 6,100,071에 기재된 것들, 및 항-VEGF 수용체 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-혈관신생 단백질 또는 항-혈관신생 단백질들을 암호화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 NF-kB 억제제, IL1베타 억제제, TGF베타 억제제, IL-6 억제제, IL-23 억제제, IL-18 억제제, 종양 괴사 인자 알파 및 종양 괴사 인자 베타, 림프독소 알파 및 림프독소 베타, LIGHT 억제제, 알파 시누클레인(synuclein) 억제제, Tau 억제제, 베타 아밀로이드 억제제, IL-17 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 항염증성 단백질, 항체 또는 단백질 또는 항체의 단편/변이체를 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서 NOI는 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절인자(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)를 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서 NOI는 안구 세포에서 정상적으로 발현되는 단백질을 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서, NOI는 광수용체 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포에서 정상적으로 발현되는 단백질을 암호화할 수 있다.
또 다른 구현예에서, NOI는 RPE65, 아릴탄화수소-상호작용 수용체 단백질 유사 1(AIPL1), CRB1, 레시틴 레티날 아세틸트랜스퍼라제(LRAT), 광수용체-특이적 호메오 박스(CRX), 레티날 구아닐레이트 사이클리제(retinal guanylate cyclise, GUCY2D), RPGR 상호작용 단백질 1(RPGRIP1), LCA2, LCA3, LCA5, 디스트로핀(dystrophin), PRPH2, CNTF, ABCR/ABCA4, EMP1, TIMP3, MERTK, ELOVL4, MYO7A, USH2A, VMD2, RLBP1, COX-2, FPR, 하모닌(harmonin), Rab 에스코트 단백질 1, CNGB2, CNGA3, CEP 290, RPGR, RS1, RP1, PRELP, 글루타티온 경로 효소 및 옵티신(opticin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서, NOI는 인간 응고 인자 VIII 또는 인자 IX를 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서, NOI는 페닐알라닌 히드록실라제(PAH), 메틸말로닐 CoA 뮤타제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 이소발레릴 CoA 탈수소효소(dehydrogenase), 분지쇄 케토산(ketoacid) 탈수소효소 복합체, 글루타릴 CoA 탈수소효소, 아세틸 CoA 카르복실라제, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 3 메틸 크로토닐(crotonyl) CoA 카르복실라제, 피루브산 카르복실라제, 카르바모일-포스페이트 합성효소(synthase) 암모니아, 오르니틴 트랜스카르바밀라제(transcarbamylase), 글루코실세라미다제 베타, 알파 갈락토시다제 A, 글루코실세라미다제 베타, 시스티노신(cystinosin), 글루코사민(N-아세틸)-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸-알파-글루코사미니다제, N-설포글루코사민 설포하이드롤라제, 갈락토스아민-6 설파타제, 아릴설파타제 A, 시토크롬 B-245 베타, ABCD1, 오르니틴 카르바모일트랜스퍼라제, 아르기니노숙시네이트 합성효소, 아르기니노숙시네이트 리아제(lysase), 아르기나제 1, 알라닌 글리코실레이트(glycoxhylate) 아미노 트랜스퍼라제, ATP-결합 카세트, 서브-패밀리 B 멤버를 포함하는 군으로부터 선택되는 대사에 관여하는 단백질 또는 단백질들을 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서, NOI는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 암호화할 수 있다. 일 구현예에서, CAR은 항-5T4 CAR이다. 다른 구현예에서, NOI는 B-세포 성숙 항원(BCMA), CD19, CD22, CD20, CD138, CD30, CD33, CD123, CD70, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 루이스 Y 항원(LeY), 티로신-단백질 키나제 막횡단 수용체(ROR1), Mucin 1, 세포 표면 관련(cell surface associated, Muc1), 상피 세포 부착 분자(EpCAM), 내피 성장 인자 수용체(EGFR), 인슐린, 단백질 티로신 포스파타제, 비-수용체 유형 22, 인터류킨 2 수용체 알파, 헬리카제 C 도메인 1로 유도된 인터페론, 인간 표피 성장 인자 수용체(HER2), 글리피칸 3(glypican 3, GPC3), 디시알로강글리오시드(disialoganglioside, GD2), 메시오텔린(mesiothelin), 수포 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2)를 암호화할 수 있다.
다른 구현예에서, NOI는 ULBP1, 2 및 3, H60, Rae-1a, b, g, d, MICA, MICB를 포함하는 군으로부터 선택되는 NKG2D 리간드에 대한 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화할 수 있다.
추가의 구현예에서 NOI는 SGSH, SUMF1, GAA, 공통 감마 사슬(CD132), 아데노신 데아미나제(deaminase), WAS 단백질, 글로빈, 알파 갈락토시다제 A, δ- 아미노레불린산(aminolevulinate, ALA) 합성효소, δ-아미노레불린산 탈수효소(dehydratase)(ALAD), 하이드록시메틸빌란(Hydroxymethylbilane, HMB) 합성효소, 우로포르피리노겐(Uroporphyrinogen, URO) 합성효소, 우로포르피리노겐(URO) 데카르복실라제, 코프로포르피리노겐(Coproporphyrinogen, COPRO) 산화효소, 프로토포르피리노겐(Protoporphyrinogen, PROTO) 산화효소, 페로킬라타제(Ferrochelatase), α-L-이두로니다제(α-L-iduronidase), 이두로네이트 설파타제(Iduronate sulfatase), 헤파란 설파미다제(Heparan sulfamidase), N-아세틸글루코사미니다제, 헤파란-α-글루코사미니드 N-아세틸트랜스퍼라제, 3 N-아세틸글루코사민 6-설파타제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, β-갈락토시다제, N-아세틸갈락토스아민-4-설파타제, β-글루쿠로니다제 및 히알루로니다제를 암호화할 수 있다.
NOI 외에도 벡터는 또한 siRNA, shRNA, 또는 조절된 shRNA를 포함하거나 암호화할 수 있다. (Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288).
적응증
본 발명에 따른 레트로바이러스 및 AAV 벡터를 포함하는 벡터는 WO 1998/05635, WO 1998/07859, WO 1998/09985에 열거된 장애의 치료에 유용한 하나 이상의 NOI(들)을 전달하는데 사용될 수 있다. 관심 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 그러한 질병의 예는 다음과 같다:
사이토카인 및 세포 증식/분화 활성에 반응하는 장애; 면역억제제 또는 면역자극제 활성(예: 인간 면역결핍 바이러스에 의한 감염을 포함한 면역 결핍 치료, 림프구 성장 조절, 암 및 여러 자가면역 질환 치료, 및 이식 거부반응 방지 또는 종양 면역 유도); 조혈 조절(예: 골수성 또는 림프계 질환의 치료); 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 신경 조직의 성장 촉진(예: 상처 치유용, 화상, 궤양 및 치주 질환 및 신경변성(neurodegeneration) 치료); 난포-자극 호르몬의 억제 또는 활성화(가임력 조절); 화학주성/화학동역학적(chemotactic/chemokinetic) 활성(예: 특정 세포 유형을 손상 또는 감염 부위로 이동시키기 위한); 지혈(haemostatic) 및 혈전 용해(thrombolytic) 활성(예: 혈우병 및 뇌졸중(stroke) 치료); 항염증 활성(예를 들어, 패혈성 쇼크 또는 크론병 치료용); 대식세포 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 이에 따른 항염증 활성; 항-면역 활성(즉, 염증과 관련되지 않은 반응을 포함하는 세포성 및/또는 체액성 면역 반응에 대한 억제 효과); 대식세포 및 T 세포가 세포외 기질 성분 및 피브로넥틴에 부착하는 능력의 억제, 뿐만 아니라 T 세포에서 상향 조절된 fas 수용체 발현.
암, 백혈병, 양성 및 악성 종양 성장, 침윤 및 확산, 혈관신생, 전이, 복수(ascites) 및 악성 흉막 삼출(pleural effusion)을 포함하는 악성 장애.
류마티스 관절염을 비롯한 관절염, 과민증, 알레르기 반응, 천식, 전신성 홍반성 루푸스, 콜라겐 질환 및 기타 질환을 포함하는 자가면역 질환.
동맥경화증, 동맥경화성 심장질환, 재관류 손상, 심정지, 심근경색증, 혈관염증질환, 호흡곤란증후군(respiratory distress syndrome), 심혈관계 영향, 말초혈관질환, 편두통 및 아스피린 의존성 항혈전증, 뇌졸중, 뇌허혈(cerebral ischaemia), 허혈성 심장질환 또는 기타 질병을 포함하는 혈관 질환.
소화성 궤양(peptic ulcer), 궤양성 대장염, 크론병 및 기타 질병을 포함하는 위장관 질환.
간 섬유증, 간경화를 포함하는 간 질환.
페닐케톤뇨증 PKU, 윌슨병, 유기산혈증(organic acidemias), 요소 순환 장애, 담즙정체(cholestasis), 및 기타 질병을 포함하는 유전성 대사 장애.
갑상선염 또는 기타 선(glandular) 질환, 사구체신염 또는 기타 질병을 포함하는 신장 및 비뇨기과 질환.
중이염 또는 기타 이비인후과 질환을 포함하는 귀, 코 및 인후 장애, 피부염 또는 기타 피부 질환.
치주 질환, 치주염, 치은염 또는 기타 치과/구강 질환을 포함하는 치과 및 구강 질환.
고환염 또는 부고환-고환염(epididimo-orchitis), 불임, 고환 외상(orchidal trauma) 또는 기타 고환 질환을 포함하는 고환 질환.
태반 기능 장애, 태반 기능 부전, 습관성 유산, 자간증(eclampsia), 전자간증, 자궁내막증 및 기타 부인과 질환을 포함하는 부인과 질환.
안과 장애, 예컨대 LCA10을 포함하는 레버 선천적 흑암증(Leber Congenital Amaurosis, LCA), 후방포도막염, 중간포도막염, 전방포도막염, 결막염, 맥락망막염(chorioretinitis), 포도막망막염(uveoretinitis), 시신경염, 개방각 녹내장 및 청소년 선천성 녹내장을 포함하는 녹내장, 안내 염증, 예를 들어 망막염 또는 낭포성 황반부종, 교감성 안과(sympathetic ophthalmia), 공막염(scleritis), 색소성 망막염, 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 청소년 황반 변성을 포함하는 황반 변성, 베스트병(Best Disease), 베스트 난황 황반변성(Best vielliform macular degeneration), 스타가르트병(Stargardt's Disease), 어셔 증후군, Doyne's 벌집형 망막 이영양증(Doyne's honeycomb retinal dystrophy), Sorby's 황반 이영양증(Sorby's Macular Dystrophy), 소아 망막 분열증(Juvenile retinoschisis), 원추간상 이영양증(Cone-Rod Dystrophy), 각막 이영양증(Corneal Dystrophy), Fuch's 이영양증(Fuch's Dystrophy), Leber's 선천적 흑암증(Leber's congenital amaurosis), Leber's 유전성 시신경병증(Leber's hereditary optic neuropathy, LHON), Adie 증후군, 오구치병(Oguchi disease), 퇴행성 폰더스병, 안구 외상, 감염에 의한 안구 염증, 증식성 유리체-망막병증(vitreo-retinopathies), 급성 허혈성 시신경병증, 과도한 흉터, 예를 들어 녹내장 여과 수술 후, 안구 이식물에 대한 반응, 각막 이식편 이식 거부, 및 기타 안과 질환, 예컨대 당뇨병성 황반 부종, 망막 정맥 폐쇄, RLBP1 관련 망막 이영양증, 맥락막 혈증(choroideremia)및 색맹.
파킨슨병, 파킨슨병의 치료로 인한 합병증 및/또는 부작용, AIDS 관련 치매 복합성 HIV 관련 뇌병증(encephalopathy), 데빅병(Devic's disease), 시드넘 무도병(Sydenham chorea), 알츠하이머병 및 기타 퇴행성 질환, 중추신경계(CNS)의 병태 또는 장애, 뇌졸중, 소아마비 후 증후군, 정신 질환, 척수염, 뇌염(encephalitis), 아급성 경화성 범뇌염(subacute sclerosing pan-encephalitis), 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경병증, 만성 신경병증, 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher disease), 시스틴증(Cystinosis), 폼페병(Pompe disease), 이색성 백혈이영양증(metachromatic leukodystrophy), 비스콧 알드리치 증후군(Wiscott Aldrich Syndrome), 부신백질이영양증(adrenoleukodystrophy), 베타 지중해 빈혈(beta-thalassemia), 겸상적혈구병, 길랑-바레 증후군(Guillaim-Barre syndrome), 시드넘 무도병, 중증 근무력증(myasthenia gravis), 가성 뇌종양(pseudo-tumour cerebri), 다운 증후군, 헌팅턴병, 중추신경계(CNS) 압박 또는 중추신경계 외상 또는 중추신경계의 감염, 근위축 및 이영양증, 중추 및 말초 신경계의 질병, 병태 또는 장애, 근위축성 측삭 경화증, 척수성 근위축증, 척수 및 박리 손상(spinal cord and avulsion injury)을 포함하는 운동 신경 질환을 포함하는 신경학적 및 신경퇴행성 장애.
기타 질병 및 병태, 예컨대 낭포성 섬유증, 산필리포(Sanfilipo) 증후군 A, 산필리포 증후군 B, 산필리포 증후군 C, 산필리포 증후군 D를 포함하는 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 헌터 증후군, 헐러-샤이 증후군(Hurler-Scheie syndrome), 모르퀴오 증후군(Morquio　syndrome), ADA-SCID, X-연관 SCID, X-연관 만성 육아종성(granulomatous) 질환, 포르피린증(porphyria), 혈우병 A, 혈우병 B, 외상 후 염증, 출혈, 응고 및 급성기 반응, 악액질(cachexia), 식욕부진(anorexia), 급성 감염, 패혈성 쇼크, 감염성 질환, 당뇨병, 수술의 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 기타 이식의 합병증 및/또는 부작용, 유전자 치료의 합병증 및 부작용, 예를 들어 바이러스 매개체의 감염 또는 AIDS로 인한 것, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응 억제 또는 저해, 천연 또는 인공 세포, 조직 및 장기, 예컨대 각막, 골수, 장기, 렌즈, 심박 조율기(pacemaker), 천연 또는 인공 피부 조직의 이식의 경우 이식 거부의 예방 및/또는 치료.
siRNA , 마이크로-RNA 및 shRNA
특정 다른 구현예에서, NOI는 마이크로-RNA를 포함한다. 마이크로-RNA는 유기체에서 자연적으로 생성되는 small RNA의 매우 큰 그룹으로, 그 중 적어도 일부는 표적 유전자의 발현을 조절한다. 마이크로 RNA 패밀리의 창립 멤버는 let-7과 lin -4이다. let-7 유전자는 벌레 발달 동안 내인성 단백질-코딩 유전자의 발현을 조절하는 작고 고도로 보존된 RNA 종을 암호화한다. 활성 RNA 종은 초기에 ~70 nt 전구체로 전사되며, 이는 전사 후 성숙한 ~21 nt 형태로 처리된다. let-7과 lin -4 양자 모두 헤어핀 RNA 전구체로 전사되고 이는 Dicer 효소에 의해 이들의 성숙한 형태로 처리된다.
NOI 외에도 벡터는 또한 siRNA, shRNA, 또는 조절된 shRNA를 포함하거나 암호화할 수 있다(Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37:1281-1288).
이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 매개되는 전사 후 유전자 사일런싱(PTGS)은 외래 유전자의 발현을 제어하기 위한 보존된 세포 방어 메커니즘이다. 트랜스포존 또는 바이러스와 같은 요소의 무작위 통합은 상동 단일 가닥 mRNA 또는 바이러스 게놈 RNA의 서열 특이적 분해를 활성화하는 dsRNA의 발현을 유발하는 것으로 생각된다. 사일런싱 효과는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려져 있다(Ralph et al. (2005) Nature Medicine 11:429-433). RNAi의 메커니즘은 긴 dsRNA를 프로세싱하여 약 21-25개 뉴클레오티드(nt) RNA의 이중체(duplex)가 되게하는 것을 포함한다. 이러한 산물을 작은 간섭 또는 사일런싱 RNA(siRNA)라고 하며 이는 mRNA 분해의 서열-특이적 매개체이다. 분화된 포유동물 세포에서, dsRNA >30 bp는 인터페론 반응을 활성화하여 단백질 합성 및 비-특이적 mRNA 분해를 중단(shut-down)시키는 것으로 밝혀졌다(Stark et al., Annu Rev Biochem 67:227-64 (1998)). 그러나 이 반응은 21 nt siRNA 이중체를 사용하여 우회할 수 있으며(Elbashir et al., EMBO J. Dec 3;20(23):6877-88 (2001), Hutvagner et al., Science.Aug 3, 293(5531):834-8. Eupub Jul 12 (2001)) 배양된 포유동물 세포에서 유전자 기능 분석을 가능하게 한다.
NOI 및 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 수많은 서로 다른 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 축퇴의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 통상의 기술자가 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 수행하여 본 발명의 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
DNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 이용가능한 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 표준 기술에 의해 클로닝될 수도 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 생산될 것이다. 이것은 클로닝하고자 하는 표적 서열을 플랭킹하는 한 쌍의 프라이머(예: 약 15-30개 뉴클레오티드)를 만들고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득한 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 영역을 증폭시키는 조건에서 PCR을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(예: 반응 혼합물을 아가로스 겔로 정제함으로써), 그리고 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 적절한 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.
주요 스플라이스 공여자(Major splice donor)
RNA 스플라이싱은 5개의 작은 핵 리보핵단백질(small nuclear ribonucleoprotein, snRNP)로 구성된 스플라이세오솜(spliceosome)이라고 하는 큰 RNA-단백질 복합체에 의해 촉매된다. 인트론과 엑손 사이의 경계는 스플라이싱이 발생할 위치를 나타내는 pre-mRNA 내의 특정 뉴클레오티드 서열로 표시된다. 이러한 경계를 "스플라이스 부위"라고 지칭한다. 용어 "스플라이스 부위"는 절단 및/또는 다른 스플라이스 부위에 결찰하기에 적합한 것으로 진핵 세포의 스플라이싱 기계(splicing machinery)에 의해 인식될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
스플라이스 부위는 pre-mRNA 전사체에 존재하는 인트론의 절제를 허용한다. 전형적으로, 5' 스플라이스 경계는 "스플라이스 공여자 부위" 또는 "5' 스플라이스 부위"라고 지칭되고, 3' 스플라이스 경계는 "스플라이스 수용체 부위(splice acceptor site)" 또는 "3' 스플라이스 부위"라고 지칭된다. 스플라이스 부위는, 예를 들어, 자연 발생 스플라이스 부위, 조작된 또는 합성 스플라이스 부위, 표준(canonical) 또는 컨센서스 스플라이스 부위, 및/또는 비-표준(non-canonical) 스플라이스 부위, 예를 들어 잠복 스플라이스 부위를 포함한다.
스플라이스 수용체 부위는 일반적으로 분기점 또는 분기 부위, 폴리피리미딘 관(polypyrimidine tract) 및 수용체 컨센서스 서열의 세 가지 개별 서열 요소로 구성된다. 진핵생물의 분기점 컨센서스 서열은 YNYTRAC(여기서 Y는 피리미딘이고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, R은 퓨린임)이다. 3' 수용체 스플라이스 부위 컨센서스 서열은 YAG(여기서 Y는 피리미딘임)이다 (예를 들어, 하기 문헌 참조 Griffiths et al., eds., Modern Genetic Analysis, 2nd edition, W.H. Freeman and Company, New York (2002)). 3' 스플라이스 수용체 부위는 전형적으로 인트론의 3' 말단에 위치한다.
이와 같이, 본 발명에 사용하기 위한 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에서 주요 스플라이스 공여자 부위는 불활성화될 수 있다.
일 측면에서 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 서열을 제공하며, 여기서 핵산 서열은 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 내에 포함되고, 여기서 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위는 불활성화되고, 예를 들어 돌연변이 또는 결실된다.
일 측면에서 본 발명은 또한 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 핵산 서열을 제공하며, 여기서 핵산 서열은 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈에 작동가능하게 연결되고, 여기서 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위는 불활성화되고, 예를 들어 돌연변이 또는 결실된다.
일 측면에서 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 여기서 상기 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위는 불활성화되고, 예를 들어 돌연변이되거나 결실된다.
"표준 스플라이스 부위" 또는 "컨센서스 스플라이스 부위"라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 종에 걸쳐 보존되는 스플라이스 부위를 지칭한다.
진핵생물 RNA 스플라이싱에 사용되는 5' 공여자 스플라이스 부위 및 3' 수용체 스플라이스 부위에 대한 컨센서스 서열은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 컨센서스 서열은 인트론의 각 말단에 거의 변하지 않는 디뉴클레오티드를 포함한다: 인트론의 5' 말단에 GT, 및 인트론의 3' 말단에 AG.
표준 스플라이스 공여자 부위 컨센서스 서열은 (DNA의 경우) AG/GTRAGT(여기서 A는 아데노신이고, T는 티민이고, G는 구아닌이고, C는 시토신이고, R은 퓨린이고, "/"는 절단 부위를 나타냄)일 수 있다. 스플라이스 공여자가 이러한 컨센서스에서 벗어날 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있는데, 이는 특히 예를 들어 vRNA 패키징 영역 내에서 2차 구조와 같이 다른 제약 조건(constraint)이 동일한 서열에 적용되는 바이러스 게놈에서 그러하다. 비-표준 스플라이스 부위는 표준 스플라이스 공여자 컨센서스 서열과 비교하여 드물게 발생하기는 하지만 이들 또한 당업계에 잘 알려져 있다.
"주요 스플라이스 공여자 부위"는 바이러스 벡터 뉴클레오티드 서열의 5' 영역에 전형적으로 위치하는 천연 바이러스 RNA 패키징 서열 내에 암호화되고 내장된, 바이러스 벡터 게놈의 첫 번째(우세한) 스플라이스 공여자 부위를 의미한다.
일 측면에서 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 활성인 주요 스플라이스 공여자 부위를 함유하지 않으며, 즉 상기 뉴클레오티드 서열의 주요 스플라이스 공여자 부위로부터 스플라이싱이 발생하지 않고, 주요 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱 활성이 제거된다.
주요 스플라이스 공여자 부위는 렌티바이러스 게놈의 5' 패키징 영역에 있다.
HIV-1 바이러스의 경우, 주요 스플라이스 공여자 컨센서스 서열은 (DNA의 경우) TG/GTRAGT(여기서 A는 아데노신이고, T는 티민이고, G는 구아닌이고, C는 시토신이고, R은 퓨린이고, "/" 절단 부위를 나타냄)이다.
본 발명의 일 측면에서, 스플라이스 공여자 영역, 즉 돌연변이 이전의 주요 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 벡터 게놈의 영역은 하기 서열을 가질 수 있다:
GGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAAT (서열번호 94)
본 발명의 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGGGCGGCGACTGCAGACAACGCCAAAAAT (서열번호 95 - MSD-2KO)
본 발명의 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGGGCGGCGAGTGGAGACTACGCCAAAAAT (서열번호 104 - MSD-2KOv2)
본 발명의 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGGGAAGGCAACAGATAAATATGCCTTAAAAT (서열번호 105 - MSD-2KOm5)
본 발명의 일 측면에서 변형 전의 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGCGACTGGTGAGTACGCC (서열번호 102)
이 서열은 또한 본원에서 "스템 루프 2" 영역(SL2)으로 지칭된다. 이 서열은 벡터 게놈의 스플라이스 공여자 영역에서 스템 루프 구조를 형성할 수 있다. 본 발명의 일 측면에서 이 서열(SL2)은 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열로부터 결실될 수 있다.
이와 같이, 본 발명은 SL2를 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 서열번호 102에 따른 서열을 포함하지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 일 측면에서 주요 스플라이스 공여자 부위는 하기 컨센서스 서열을 가질 수 있으며, 여기서 R은 퓨린이고 "/"는 절단 부위이다:
TG/GTRAGT (서열번호 96)
일 측면에서, R은 구아닌(G)일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 영역은 하기 코어 서열을 가질 수 있으며, 여기서 "/"는 주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 부위에서의 절단 부위이다:
/GTGA/GTA (서열번호 106).
본 발명의 일 측면에서 MSD-돌연변이된 벡터 게놈은 주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 '영역'(서열번호 106)에서 적어도 2개의 돌연변이를 가질 수 있으며, 여기서 첫 번째 및 두 번째 'GT' 뉴클레오티드는 각각 주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 뉴클레오티드의 3' 바로이다.
본 발명의 일 측면에서 주요 스플라이스 공여자 컨센서스 서열은 CTGGT(서열번호 97)이다. 주요 스플라이스 공여자 부위는 CTGGT 서열을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 스플라이스 부위의 불활성화 이전의, 뉴클레오티드 서열은 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함한다.
일 측면에서 뉴클레오티드 서열은 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 13 및 14에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 주요 스플라이스 공여자 부위를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따르면, 뉴클레오티드 서열은 불활성인 잠복 스플라이스 공여자 부위를 또한 함유한다. 일 측면에서 뉴클레오티드 서열은 주요 스플라이스 공여자 부위(의 3')에 인접한 활성인 잠복 스플라이스 공여자 부위를 함유하지 않으며, 이는 다시 말하면 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터 스플라이싱이 발생하지 않고, 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱이 제거된다.
"잠복 스플라이스 공여자 부위"라는 용어는 인접한 서열 맥락(예를 들어, 가까운 '선호되는' 스플라이스 공여자의 존재)으로 인해 스플라이스 공여자 부위로서 정상적으로 기능하지 않거나 스플라이스 공여자 부위로서 덜 효율적으로 활용되지만, 인접한 서열의 돌연변이(예를 들어, 가까운 '선호되는' 스플라이스 공여자의 돌연변이)에 의해 더 효율적으로 기능하는 스플라이스 공여자 부위가 되도록 활성화될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다.
일 측면에서 잠복 스플라이스 공여자 부위는 주요 스플라이스 공여자의 3'의 첫 번째 잠복 스플라이스 공여자 부위이다.
일 측면에서 잠복 스플라이스 공여자 부위는 주요 스플라이스 공여자 부위의 3' 측에 있는 주요 스플라이스 공여자 부위의 6개 뉴클레오티드 내에 있다. 바람직하게는 잠복 스플라이스 공여자 부위는 주요 스플라이스 공여자 절단 부위의 4개 또는 5개, 바람직하게는 4개 뉴클레오티드 내에 있다.
본 발명의 일 측면에서 잠복 스플라이스 공여자 부위는 컨센서스 서열 TGAGT(서열번호 103)를 가진다.
일 측면에서 뉴클레오티드 서열은 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 17 및 18에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함한다.
본 발명의 일 측면에서 주요 스플라이스 공여자 부위 및/또는 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위는 "GT" 모티프를 함유한다. 본 발명의 일 측면에서 주요 스플라이스 공여자 부위 및 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위 양자 모두는 돌연변이된 "GT" 모티프를 함유한다. 돌연변이된 GT 모티프는 주요 스플라이스 공여자 부위와 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위 양자 모두로부터의 스플라이스 활성을 불활성시킬 수 있다. 이러한 돌연변이의 예는 본원에서 "MSD-2KO"로 지칭된다.
일 측면에서 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
CAGACA (서열번호 98)
예를 들어, 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGCGACTGCAGACAACGCC (서열번호 99)
불활성화 돌연변이의 추가의 예는 본원에서 "MSD-2KOv2"로 지칭된다.
일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GTGGAGACT (서열번호 100)
예를 들어, 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
GGCGAGTGGAGACTACGCC (서열번호 101)
예를 들어, 일 측면에서 돌연변이된 스플라이스 공여자 영역은 하기 서열을 포함할 수 있다:
AAGGCAACAGATAAATATGCCTT (서열번호 107)
일 측면에서 상기 기재한 바와 같은 스템 루프 2 영역은 스플라이스 공여자 영역으로부터 결실될 수 있고, 그 결과 주요 스플라이스 공여자 부위와 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위 양자 모두가 불활성화된다. 이러한 결실은 본원에서 "ΔSL2"로 지칭된다.
주요 및 인접한 잠복 스플라이스 공여자 부위를 불활성화시키기 위해 다양한 서로 다른 유형의 돌연변이가 핵산 서열에 도입될 수 있다.
일 측면에서 돌연변이는 스플라이스 영역에서 스플라이싱 활성을 제거하거나 억제하는 기능적 돌연변이이다. 본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나의 임의의 뉴클레오티드에서 돌연변이 또는 결실을 함유할 수 있다.
적합한 돌연변이는 당업자에게 공지되어 있을 것이며, 본원에 기재되어 있다.
예를 들어, 점 돌연변이가 핵산 서열에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "점 돌연변이"는 단일 뉴클레오티드에 대한 임의의 변화를 지칭한다. 점 돌연변이에는, 예를 들어, 결실, 전이(transition) 및 전환(transversion)이 포함되며; 이들은 단백질 코딩 서열 내에 존재할 때 넌센스(nonsense) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이, 또는 침묵(silent) 돌연변이로 분류될 수 있다. "넌센스" 돌연변이는 정지 코돈을 생성한다. "미스센스" 돌연변이는 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 생성한다. "침묵" 돌연변이는 동일한 아미노산 또는 단백질의 기능을 변경하지 않는 다른 아미노산을 암호화하는 코돈을 생성한다. 하나 이상의 점 돌연변이가 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 핵산 서열 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 잠복 스플라이스 부위를 포함하는 핵산 서열은 그 안에 2개 이상의 점 돌연변이를 도입함으로써 돌연변이될 수 있다.
적어도 2개의 점 돌연변이가 스플라이스 공여자 영역으로부터의 스플라이싱의 감쇠를 달성하기 위해 주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 핵산 서열 내의 여러 위치에 도입될 수 있다. 일 측면에서 돌연변이는 스플라이스 공여자 절단 부위에서 4개의 뉴클레오티드 내에 있을 수 있고; 표준 스플라이스 공여자 컨센서스 서열에서 이것은 A1G2/G3T4이며, 여기서 "/"가 절단 부위이다. 스플라이스 공여자 절단 부위가 이러한 컨센서스에서 벗어날 수 있다는 것이 당업계에 잘 알려져 있는데, 이는 특히 예를 들어 vRNA 패키징 영역 내의 2차 구조와 같이 다른 제약 조건(constraint)이 동일한 서열에 적용되는 바이러스 게놈에서 그러하다. G3T4 디뉴클레오티드는 일반적으로 표준 스플라이스 공여자 컨센서스 서열 내에서 가장 가변성이 적은 서열이며, G3 및/또는 T4에 대한 돌연변이가 가장 큰 감쇠 효과를 달성할 가능성이 가장 높다는 것이 잘 알려져 있다. 예를 들어, HIV-1 바이러스 벡터 게놈의 주요 스플라이스 공여자 부위의 경우 이것은 T1G2/G3T4일 수 있으며, 여기서 "/"가 절단 부위이다. 예를 들어, HIV-1 바이러스 벡터 게놈의 잠복 스플라이스 공여자 부위의 경우 이것은 G1A2/G3T4일 수 있으며, 여기서 "/"가 절단 부위이다. 추가로, 점 돌연변이(들)는 스플라이스 공여자 부위에 인접하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 점 돌연변이는 스플라이스 공여자 부위의 상류 또는 하류에 도입될 수 있다. 주요 및/또는 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 핵산 서열이 그 안에 다중 점 돌연변이를 도입함으로써 돌연변이되는 구현예에서, 점 돌연변이는 잠복 스플라이스 공여자 부위의 상류 및/또는 하류에 도입될 수 있다.
스플라이스 부위 돌연변이의 구축
본 발명에서 사용하기 위한 스플라이스 부위 돌연변이는 다양한 기술을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 천연 서열의 단편에 결찰을 가능하게 하는 제한 부위가 플랭킹된 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 돌연변이를 특정 유전자좌에 도입할 수 있다. 결찰 후, 생성된 재구성된 서열은 원하는 뉴클레오티드 삽입, 치환 또는 결실을 가지는 유도체를 포함한다.
DNA 서열의 변경을 허용하는 다른 알려진 기술은 Gibson 어셈블리, 골든-게이트 클로닝(Golden-gate cloning) 및 인-퓨전과 같은 재조합 접근법을 포함한다.
대안적으로, 올리고뉴클레오티드-지정 부위-특이적(또는 세그먼트 특이적) 돌연변이유발 절차를 사용하여 요구되는 치환, 결실 또는 삽입에 따라 변경된 특정 코돈을 가지는 변경된 서열을 제공할 수 있다. 스플라이스 부위 돌연변이의 결실 또는 절단 유도체는 또한 원하는 결실에 인접한 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 이용하여 작제될 수 있다.
제한(restriction) 후, 돌출부(overhang)가 채워지고, DNA가 다시 연결될 수 있다.
위에서 설명한 변경을 수행하는 예시적인 방법은 Sambrook et al.에 의해 공개된다(Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
스플라이스 부위 돌연변이는 또한 PCR 돌연변이유발, 화학적 돌연변이유발, 강제 뉴클레오티드 오혼입(misincorporation)(예: Liao and Wise, 1990)에 의한 화학적 돌연변이유발(Drinkwater and Klinesinst, 1986) 기술, 또는 무작위로 돌연변이된 올리고뉴클레오티드(Horwitz et al., 1989)의 사용에 의해 작제될 수 있다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 렌티바이러스 벡터 뉴클레오티드 서열을 생산하는 방법을 제공한다:
(i) 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및
상기 뉴클레오티드 서열에서 본원에 기재된 바와 같이 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위를 돌연변이시키는 단계.
변형된 U1과의 조합
MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터는 LV 생산 동안 및 표적 세포 모두에서 비정상적인 스플라이싱 이벤트에 참여하는 능력이 감소하기 때문에 유전자 치료 벡터로 사용하기에 현재의 표준 렌티바이러스 벡터보다 바람직하다. 그러나, 본 발명이 있기까지, MSD-돌연변이된 벡터의 생산은 HIV-1 tat 단백질의 공급에 의존하거나(1세대 및 2세대 렌티바이러스 벡터) 또는 (3세대 벡터에서) 벡터 RNA 수준에 대한 MSD 돌연변이의 불안정한 효과로 인해 효율성이 낮았다. 안전상의 이유로 tat를 현대의 3세대 LV 시스템에 다시 '재도입'하려는 요구나 정당화가 없으며, 결과적으로 현재 임상 사용을 위한 MSD-돌연변이된 벡터의 생산 역가의 감소에 대한 해결책이 없다.
본 발명자들은 MSD-돌연변이된 3세대(즉, tat-독립적인) LV가 생산 동안 벡터 게놈 RNA의 5'패키징 영역에 결합하도록 지시된 변형된 U1 snRNA의 공동-발현에 의해 높은 역가로 생산될 수 있음을 보여준다. 놀랍게도 이러한 변형된 U1 snRNA가 5'R 영역 내의 5'polyA 신호의 존재와 무관한 방식으로 MSD-돌연변이된 LV의 생산 역가를 향상시킬 수 있다는 것이 밝혀졌으며, 이는 다른 사람들이 폴리아데닐화를 억제하기 위해 변형된 U1 snRNA 사용하는 것(소위 U1 간섭, [Ui])에 비해 새로운 메커니즘을 나타낸다. 놀랍게도 변형된 U1 snRNA를 패키징 영역의 중요한 서열에 표적화하는 것이 MSD-돌연변이된 LV 역가에서 가장 큰 향상을 생성한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 또한 MSD-돌연변이된 LV 역가의 감소를 덜 뚜렷하게 하고 변형된 U1 snRNA에 의한 이러한 MSD-돌연변이된 LV 변이체의 역가의 증가가 최대가 되게 하는 주요 스플라이스 공여자 영역 내의 신규한 서열 돌연변이를 개시한다.
본 발명자들은 놀랍게도 더 이상 내인성 서열(스플라이스 공여자 부위)을 표적으로 하지 않고 이제 vRNA 분자 내의 서열을 표적화하도록 변형된 U1 snRNA를 기반으로 하는 비-코딩 RNA를 공동-발현시킴으로써 렌티바이러스 벡터의 출력(output) 역가가 향상될 수 있다는 것을 발견하였다. 본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 본 발명자들은 상기 변형된 U1 snRNA에 의한 주요 스플라이스 공여자 영역(주요 스플라이스 공여자 및 잠복 스플라이스 공여자 부위를 함유함) 내에 약독화 돌연변이를 보유하는 렌티바이러스 벡터의 출력 역가의 상대적인 향상이 돌연변이되지 않은 주요 스플라이스 공여자 영역을 포함하는 표준 렌티바이러스 벡터보다 크다는 것을 보여준다.
본 실시예에서 입증되는 바와 같이, 감소된 역가를 유도하는 주요 스플라이스 공여자 영역 내에 광범위한 돌연변이 유형(점 돌연변이, 영역 결실 및 서열 교체)을 보유하는 벡터 게놈은 변형된 U1 snRNA와 조합하여 사용될 수 있다. 이 접근법은 벡터 생산 동안 다른 벡터 구성요소와 함께 변형된 U1 snRNA의 공동-발현을 포함할 수 있다. 변형된 U1 snRNA는 벡터 게놈 vRNA 내의 표적 서열에 상보적인 이종 서열로 대체함으로써 컨센서스 스플라이스 공여자 부위에 대한 결합이 제거되도록 설계된다. 본 발명은 표적 서열 및 상보성 길이, 설계 및 발현 방식을 포함하는 변형된 U1 snRNA의 다양한 적용 방식 및 최적 특성을 설명한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 일 측면에서, 벡터는 변형된 U1 snRNA와 조합하여 사용될 수 있다. 이것은 아래에서 더 논의된다.
스플라이싱 및 폴리아데닐화는 특히 대부분의 단백질 코딩 전사체가 다중 인트론을 포함하는 고등 진핵생물에서 mRNA 성숙을 위한 핵심 프로세스이다. 스플라이싱에 필요한 pre-mRNA 내의 요소로는 5' 스플라이스 공여자 신호, 분기점을 둘러싼 서열 및 3' 스플라이스 수용체 신호가 포함된다. 이 세 가지 요소와 상호 작용하는 스플라이세오솜은 U1 snRNA를 포함한 5개의 작은 핵 RNA(snRNA) 및 관련 핵 단백질(snRNP)에 의해 형성된다. U1 snRNA는 폴리머라제 II 프로모터에 의해 발현되며 대부분의 진핵 세포에 존재한다(Lund et al., 1984, J. Biol. Chem., 259:2013-2021). 인간 U1 snRNA(작은 핵 RNA)는 4개의 스템-루프로 이루어진 잘 정의된 구조를 가지는 164 nt 길이이다(West, S., 2012, Biochemical Society Transactions, 40:846-849). U1 snRNA는 엑손-인트론 접합부에서 5' 스플라이스 공여자 부위에 광범위하게 상보적인 짧은 서열을 그의 5'-말단에 포함한다. U1 snRNA는 5' 스플라이스 공여자 부위에 염기쌍을 형성하여 스플라이스-부위 선택 및 스플라이세오솜 어셈블리에 참여한다. 스플라이싱 외의 U1 snRNA에 대한 알려진 기능은 3'-말단 mRNA 처리 조절에 있다; 이는 초기 polyA 신호에서 조기(premature) 폴리아데닐화(polyA)를 억제한다.
인간 U1 snRNA(작은 핵 RNA)는 4개의 스템-루프로 이루어진 잘 정의된 구조를 가지는 164 nt 길이이다(도 1 참조). 내인성 비-코딩 RNA인 U1 snRNA는 인트론 스플라이싱의 초기 단계에서 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열(예: 5'-ACUUACCUG-3')을 통해 컨센서스 5' 스플라이스 공여자 부위(예: 5'-MAGGURR-3' 여기서 M은 A 또는 C이고, R은 A 또는 G이다)에 결합한다. 스템 루프 I은 polyA 억제에 중요한 것으로 밝혀진 U1A-70K 단백질에 결합한다. 스템 루프 II는 U1A 단백질에 결합하고, 5'-AUUUGUGG-3' 서열은 Sm 단백질에 결합하는데, 이는 스템 루프 IV와 함께 U1 snRNA 프로세싱에 중요하다. 본원에 정의된 바와 같이, 본 발명에 따라 사용하기 위한 변형된 U1 snRNA는 천연 스플라이스 공여자 표적화/어닐링 서열의 부위에서 벡터 게놈 vRNA 분자 내의 표적 서열에 상보적인 이종 서열을 도입하도록 변형된다(도 1 참조)
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형된 U1 snRNA", "재지정된(re-directed) U1 snRNA", "재표적화된 U1 snRNA", "재목적화된(re-purposed) U1 snRNA" 및 "돌연변이 U1 snRNA"는 표적 유전자의 스플라이싱 과정을 개시하기 위해 사용하는 컨센서스 5' 스플라이스 공여자 부위 서열(예: 5'-MAGGURR-3')에 더 이상 상보적이지 않도록 변형된 U1 snRNA를 의미한다. 따라서, 변형된 U1 snRNA는 스플라이스 공여자 부위 서열(예: 5'-MAGGURR-3')에 더 이상 상보적이지 않도록 변형된 U1 snRNA이다. 대신에, 변형된 U1 snRNA는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역(표적 부위) 내 고유한 RNA 서열을 가지는 뉴클레오티드 서열, 즉 vRNA의 스플라이싱과 관련이 없는 서열을 표적으로 하거나 이에 상보적이도록 설계된다. MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 미리 선택될 수 있다. 따라서, 변형된 U1 snRNA는 5' 말단이 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적이도록 변형된 U1 snRNA이다. 그 결과, 이론에 얽매이고자 함이 없이, 변형된 U1 snRNA는 변형된 U1 snRNA의 5' 말단에 있는 짧은 서열과 표적 부위 서열의 상보성에 기초하여 표적 부위 서열에 결합하고, 따라서 vRNA 안정화시켜 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터의 출력 벡터 역가를 증가시키는 것으로 생각된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열" 및 "천연 스플라이스 공여자 표적화 서열"이라는 용어는 인트론의 컨센서스 5' 스플라이스 공여자 부위에 대해 광범위하게 상보적인 내인성 U1 snRNA의 5'-말단에 있는 짧은 서열을 의미한다. 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열은 5'-ACUUACCUG-3'일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "컨센서스 5' 스플라이스 공여자 부위"는 스플라이스 부위 선택에 사용되는 인트론의 5' 말단에 있는 컨센서스 RNA 서열을 의미하며, 예를 들어 서열 5'-MAGGURR-3'을 가진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 서열의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열", "표적 서열" 및 "표적 부위"라는 용어는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역 내에 특정 RNA 서열을 가지는 부위를 의미하며 이는 변형된 U1 snRNA에 결합/어닐링하기 위한 표적 부위로 사전 선택된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역" 및 "MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 서열의 패키징 영역"이라는 용어는 5' U5 도메인의 시작부분(beginning)에서부터 gag 유전자로부터 유래된 서열의 말단까지의 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 5' 말단에 있는 영역을 의미한다. 따라서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역은 5' U5 도메인, PBS 요소, 스템 루프(SL) 1 요소, SL2 요소, SL3ψ 요소, SL4 요소 및 gag 유전자로부터 유래된 서열을 포함한다. 복제-결함 바이러스 벡터 입자의 생산을 가능하게 하기 위해 렌티바이러스 벡터 생산 동안 게놈에 트랜스로(in trans) 완전한 gag 유전자를 제공하는 것은 당업계에서 일반적이다. 트랜스로 제공되는 gag 유전자의 뉴클레오티드 서열은 야생형 뉴클레오티드에 의해 암호화될 필요는 없지만 코돈 최적화될 수 있으며; 중요하게도 트랜스로 제공되는 gag 유전자의 주요 속성은 그것이 gag 및 gagpol 단백질의 발현을 암호화하고 지시한다는 것이다. 따라서, 완전한 gag 유전자가 렌티바이러스 벡터 생산 동안 트랜스로 제공되는 경우, "렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 패키징 영역"이라는 용어는 5' U5 도메인의 시작부분에서부터 SL3ψ 요소에 있는 '코어' 패키징 신호까지의 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 분자의 5' 말단에 있는 영역, 그리고 ATG 코돈(SL4 내에 존재)에서부터 벡터 게놈에 존재하는 나머지 gag 뉴클레오티드 서열의 말단까지의 천연 gag 뉴클레오티드 서열을 의미할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "gag 유전자로부터 유래된 서열"은 벡터 게놈에 존재할 수 있는, 예를 들어 남아있는, ATG 코돈에서부터 뉴클레오티드 688까지로부터 유래된 gag 유전자의 임의의 천연 서열을 의미한다(Kharytonchyk, S. et. al., 2018, J. Mol . Biol ., 430:2066-79).
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열을 포함하는 U1 snRNA의 처음 11개 뉴클레오티드 내에 이종 서열을 도입한다", "위치 3 내지 11에서 9개의 뉴클레오티드 내에 상기 이종 서열을 도입한다" 및 "U1 snRNA의 5' 말단에 있는 처음 11개의 뉴클레오티드 내에 이종 서열을 도입한다"라는 용어는 U1 snRNA의 처음 11개의 뉴클레오티드 또는 위치 3 내지 11에서 9개의 뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 상기 이종 서열로 치환하거나 U1 snRNA의 처음 11개의 뉴클레오티드 또는 위치 3 내지 11에서 9개의 뉴클레오티드를 상기 이종 서열과 동일한 서열을 가지도록 변형시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열 내에 이종 서열을 도입한다" 및 "U1 snRNA의 5' 말단의 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열 내에 이종 서열을 도입한다"라는 용어는 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열의 전부 또는 일부를 상기 이종 서열로 치환하거나 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열을 상기 이종 서열과 동일한 서열을 가지도록 변형시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "렌티바이러스 벡터 역가를 향상시킨다"는 "렌티바이러스 벡터 역가를 증가시킨다", "렌티바이러스 벡터 역가를 회복한다" 및 "렌티바이러스 벡터 역가를 개선한다"를 포함한다.
따라서, 일 구현예에서, 변형된 U1 snRNA는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈 서열의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 변형된다.
일부 구현예에서, 변형된 U1 snRNA는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열을 도입하도록 내인성 U1 snRNA에 비해 5' 말단에서 변형된다.
일부 구현예에서, 변형된 U1 snRNA는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열을 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열 내에 도입하도록 내인성 U1 snRNA에 비해 5' 말단에서 변형된다.
변형된 U1 snRNA는 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열을 포함하는 서열을 상기 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 치환하도록 내인성 U1 snRNA에 비해 5' 말단에서 변형될 수 있다.
변형된 U1 snRNA는 변형된 U1 snRNA 변이체일 수 있다. 본 발명에 따라 변형된 U1 snRNA 변이체는 천연 발생 U1 snRNA 변이체, U1-70K 단백질 결합을 제거하는 스템 루프 I 영역 내에 돌연변이를 함유하는 U1 snRNA 변이체, 또는 U1A 단백질 결합을 제거하는 스템 루프 II 영역 내 돌연변이를 함유하는 U1 snRNA 변이체일 수 있다. U1-70K 단백질 결합을 제거하는 스템 루프 I 영역 내에 돌연변이를 함유하는 U1 snRNA 변이체는 U1_m1 또는 U1_m2, 바람직하게는 U1A_m1 또는 U1A_m2일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA는 본원에 기재된 U1_256 서열의 주요 U1 snRNA 서열 [클로버 잎](nt 410-562)과 적어도 70% 동일성(적합하게는 적어도 75%, 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성)을 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 U1 snRNA는 본원에 기재된 U1_256 서열의 주요 U1 snRNA 서열 [클로버 잎](nt 410-562)을 포함한다. U1_256 서열의 주요 U1 snRNA 서열 [클로버 잎](nt 410-562)은 다음과 같다:
GCAGGGGAGATACCATGATCACGAAGGTGGTTTTCCCAGGGCGAGGCTTATCCATTGCACTCCGGATGTGCTGACCCCTGCGATTTCCCCAAATGTGGGAAACTCGACTGCATAATTTGTGGTAGTGGGGGACTGCGTTCGCGCTTTCCCCTG. (서열번호 131)
일부 바람직한 구현예에서, 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열을 포함하는 U1 snRNA의 처음 11개 뉴클레오티드는 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 전부 또는 부분적으로 치환될 수 있다. 적합하게는, U1 snRNA의 처음 11개 뉴클레오티드의 1-11(적합하게는 2-11, 3-11, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11) 핵산이 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 치환된다.
일부 구현예에서, 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열은 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 전부 또는 부분적으로 치환될 수 있다. 적합하게는, 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열의 1-11(적합하게는 2-11, 3-11, 5-11, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11) 핵산이 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 치환된다. 바람직한 구현예에서, 전체 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열이 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열로 치환되며, 즉 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열(예를 들어, 5'-ACUUACCUG- 3')이 본원에 기재된 바와 같은 이종 서열로 전부 치환된다.
일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열은 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성인 적어도 7개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 이종 서열은 상기 뉴클레오티드 서열에 대해 상보성인 적어도 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 이종 서열은 상기 뉴클레오티드 서열에 상보성인 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
적합하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 이종 서열은 7-25(적합하게는 7-20, 7-15, 9-15, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25)개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적합하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 이종 서열은 25개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 5' U5 도메인, PBS 요소, SL1 요소, SL2 요소, SL3ψ 요소, SL4 요소 및/또는 gag 유전자로부터 유래된 서열 내에 위치한다. 적합하게는, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 SL1, SL2 및/또는 SL3ψ 요소(들) 내에 위치한다. 일부 바람직한 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 SL1 및/또는 SL2 요소(들) 내에 위치한다. 일부 특히 바람직한 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 SL1 요소 내에 위치한다.
일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 적어도 7개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 적어도 9개의 뉴클레오티드를 포함한다. 적합하게는, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 7-25(적합하게는 7-20, 7-15, 9-15, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15)개의 뉴클레오티드를 포함한다.
적합하게는, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열은 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 대한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 결합은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 부재 하에서의 렌티바이러스 벡터 생산에 비해 렌티바이러스 벡터 생산 동안 렌티바이러스 벡터 역가를 향상시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 존재 하에서의 렌티바이러스 벡터의 생산은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 부재 하에서의 렌티바이러스 벡터 생산에 비해 렌티바이러스 벡터 역가를 향상시킨다. 렌티바이러스 벡터 역가의 측정을 위한 적합한 분석은 본원에 기재된 바와 같다. 적합하게는, 렌티바이러스 벡터 생산은 gag, env, rev 및 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈을 포함하는 벡터 구성요소와 상기 변형된 U1 snRNA의 공동-발현을 포함한다. 렌티바이러스 벡터의 RNA 게놈은 MSD-2KO RNA 게놈일 수 있다. 일부 구현예에서, 렌티바이러스 벡터 역가의 향상은 기능적 5'LTR polyA 부위의 존재 또는 부재 하에 발생한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 U1 snRNA에 의해 매개되는 렌티바이러스 벡터 역가의 향상은 벡터 게놈의 5'LTR에서 polyA 부위 억제와 무관하다.
일부 구현예에서, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 대한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 결합은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 부재 하에서의 렌티바이러스 벡터 생산에 비해 렌티바이러스 벡터 생산 동안 렌티바이러스 벡터 역가를 적어도 30% 증가시킬 수 있다. 적합하게는, MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내의 뉴클레오티드 서열에 대한 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 결합은 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA의 부재 하에서의 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 생산에 비해 생산 동안 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 역가를 적어도 35%(적합하게는 적어도 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500%, 550%, 600%, 650%, 700%, 750%, 800%, 850%, 900%, 950%, 1,000%, 2,000%, 5,000%, 또는 10,000%) 증가시킬 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA는 (a) 변형된 U1 snRNA에 결합을 위한 MSD-돌연변이된 렌티바이러스 벡터 게놈의 패키징 영역 내 표적 부위(미리 선택된 뉴클레오티드 부위)를 선택하는 단계; 및 (b) 단계 (a)에서 선택된 미리 선택된 뉴클레오티드 부위에 상보적인 이종 서열을 U1 snRNA의 5' 말단에 있는 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열(예: 5'-ACUUACCUG-3') 내에 도입하는 단계에 의해 설계될 수 있다.
분자 생물학의 통상적인 기술을 사용하여 내인성 U1 snRNA의 5' 말단에 있는 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열(예: 5'-ACUUACCUG-3') 내에, 또는 그 대신에, 표적 부위에 상보적인 이종 서열을 도입하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 일반적으로 말해서, 적절한 일상적인 방법은 지시된(directed) 돌연변이유발 또는 상동 재조합을 통한 치환을 포함한다.
분자 생물학의 통상적인 기술을 사용하여 내인성 U1 snRNA의 5' 말단에 있는 천연 스플라이스 공여자 어닐링 서열(예: 5'-ACUUACCUG-3')을 표적 부위에 상보적인 이종 서열과 동일한 서열을 가지도록 변형시키는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 예를 들어, 적합한 방법은 지시된 돌연변이유발 또는 무작위 돌연변이유발에 이어서 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA를 제공하는 돌연변이에 대한 선택을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA는 당업계에 일반적으로 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 변형된 U1 snRNA는 화학적 합성 또는 재조합 DNA/RNA 기술에 의해 제조될 수 있다.
일 측면에서 변형된 U1 snRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상이한 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 상이한 플라스미드 상에 있을 수 있다.
통상적인 분자 및 세포 생물학 기술을 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 변형된 U1 snRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
벡터
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다.
벡터는 한 환경에서 다른 환경으로 엔터티(entity)를 전달할 수 있도록 하거나 용이하게 하는 도구이다. 본 발명에 따르면, 그리고 예로서, 재조합 핵산 기술에 사용되는 일부 벡터는 핵산의 세그먼트(예: 이종 DNA 세그먼트, 예컨대 이종 cDNA 세그먼트)와 같은 엔터티가 표적 세포로 전달되도록 한다. 벡터는 세포 내에서 이종 핵산(DNA 또는 RNA)을 유지하거나, DNA 또는 RNA의 세그먼트를 포함하는 벡터의 복제 또는 핵산의 세그먼트에 의해 암호화되는 단백질의 발현을 촉진하는 목적을 제공할 수 있다.
본 발명의 벡터는 예를 들어 복제 기점이 제공되고, 임의로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 임의로 프로모터의 조절인자가 제공되는 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자(예: 네오마이신 내성 유전자) 및/또는 추적 가능한 마커 유전자(예: GFP를 암호화하는 유전자)를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어 표적 세포를 감염 및/또는 형질도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 시험관내에서 양립가능한(compatible) 표적 세포에서 NOI를 복제하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 시험관내에서 양립가능한 표적 세포에 본 발명의 벡터를 도입하고 NOI의 발현을 초래하는 조건하에서 표적 세포를 성장시킴으로써 시험관내에서 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 단백질은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 표적 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 표적 세포는 포유동물 세포주 및 기타 진핵 세포주를 포함한다.
벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본원에 기재된 발현 벡터는 전사될 수 있는 서열을 함유하는 핵산의 영역을 포함한다. 따라서, mRNA, tRNA 및 rRNA를 암호화하는 서열이 이 정의에 포함된다. 바람직하게는, 발현 벡터는 표적 세포에 의한 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바이러스 벡터
본 발명의 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 벡터, 벡터 비리온 또는 벡터 입자라고 부를 수도 있다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해 생산된다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터는 하나 이상의 NOI를 포함하며, 여기서 적어도 하나의 NOI는 본원에 기재된 바와 같은 tbs 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결되어 있다.
또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스, 백시니아 바이러스 또는 배큘로바이러스로부터 유래된다.
본 발명의 억제 시스템은 임의의 바이러스 벡터 시스템에 유용할 것으로 예상된다. 시스템은 예를 들어 바이러스 벡터 생산 세포에서 또는 비리온 어셈블리 중에 관심 뉴클레오티드가 역효과를 일으키는 경우에 특히 유용할 것이다.
또 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 거품성(foamy) 바이러스로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래된다.
벡터 역가
당업자는 바이러스 벡터의 역가를 결정하는 다수의 서로 다른 방법이 있음을 이해할 것이다. 역가는 종종 형질도입 단위/mL(TU/mL)로 기재된다. 감염성 입자의 수를 증가시키고 벡터 제제의 비활성(specific activity)을 증가시킴으로써 역가를 증가시킬 수 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있거나 유래가능할 수 있다. 다수의 서로 다른 레트로바이러스가 확인되었다. 예로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), Rous 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨슨(Abelson) 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수세포종증(myelocytomatosis) 바이러스-29(MC29) 및 조류 적혈구모세포증 바이러스(AEV)가 포함된다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763 에서 찾을 수 있다.
레트로바이러스는 크게 "단순"과 "복잡"의 두 가지 범주로 나눌 수 있다. 레트로바이러스는 7개 그룹으로 더 나눌 수 있다. 이 그룹 중 5개는 발암 가능성이 있는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두 그룹은 렌티바이러스와 스푸마바이러스(spumavirus)이다. 이러한 레트로바이러스에 대한 리뷰는 Coffin et al (1997) ibid에 나와 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 게놈의 기본 구조는 5' LTR 및 3' LTR과 같은 많은 공통적인 구성을 공유하며, 이들 사이 또는 이들 내에 게놈이 패키징되게 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 표적 세포 게놈으로의 통합을 가능하게 하는 통합 부위 및 패키징 구성요소를 암호화하는 gag/ pol 및 env 유전자가 위치하며, 이들은 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 폴리펩티드다. 렌티바이러스는 HIV에서 rev 유전자 및 RRE 서열과 같은 추가의 구성을 가지며, 이는 통합된 프로바이러스의 RNA 전사체를 감염된 표적 세포의 핵으로부터 세포질로 효율적으로 내보낼 수 있게 한다.
프로바이러스에서, 이들 유전자는 양쪽 끝에서 긴 말단 반복부(long terminal repeat, LTR)라고 하는 영역에 의해 플랭크된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열의 역할을 하며 바이러스 유전자의 발현을 제어할 수 있다.
LTR 자체는 U3, R 및 U5라고 하는 세 가지 요소로 나눌 수 있는 동일한 서열이다. U3는 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래한다. R은 RNA의 양 말단에서 반복되는 서열로부터 유래하고 U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래한다. 세 가지 요소의 크기는 서로 다른 레트로바이러스에 따라 상당히 다를 수 있다.
본 발명의 전형적인 레트로바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부가 바이러스로부터 제거될 수 있고; 예를 들어, gag/pol 및 env가 없거나 작동하지 않을 수 있다. 이것은 바이러스 벡터를 복제-결함으로 만든다.
바이러스 게놈의 일부는 또한 표적 비분열 세포를 형질도입하고/하거나 그의 게놈을 숙주 게놈에 통합할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 후보 핵산 결합 서열을 포함하는 벡터를 생성하기 위하여 벡터 게놈에서 조절 제어 영역 및 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 본원에 기재된 바와 같은 후보 핵산 결합 서열을 암호화하는 라이브러리로 대체될 수 있다.
렌티바이러스는 더 큰 레트로바이러스 그룹의 일부이다. 렌티바이러스의 상세한 목록은 Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763 에서 찾을 수 있다. 간단히 말해서, 렌티바이러스는 영장류 그룹과 비영장류 그룹으로 나눌 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예에는 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 인자인 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. 비영장류 렌티바이러스 그룹에는 프로토타입 "느린 바이러스(slow virus)" 비스나/메디 바이러스(visna/maedi virus)(VMV), 뿐만 아니라 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)가 포함된다.
렌티바이러스 패밀리는 렌티바이러스가 분열 세포와 비분열 세포 모두를 감염시키는 능력이 있다는 점에서 레트로바이러스와 다르다(Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058 및 Lewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516). 대조적으로, MLV와 같은 다른 레트로바이러스는 예를 들어 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 것과 같은 비분열 또는 천천히 분열하는 세포를 감염시킬 수 없다.
본원에서 사용되는 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래할 수 있는 적어도 하나의 구성요소 일부를 포함하는 벡터이다. 바람직하게는, 그 구성요소 일부는 벡터가 세포를 감염시키거나, 유전자를 발현하거나, 복제되는 생물학적 메커니즘에 관여한다.
렌티바이러스 벡터는 영장류 렌티바이러스(예: HIV-1) 또는 비영장류 렌티바이러스로부터 유래할 수 있다.
비영장류 렌티바이러스의 예는 영장류를 자연적으로 감염시키지 않는 렌티바이러스과의 임의의 구성원일 수 있고, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 메디 비스나(Maedi visna) 바이러스(MVV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함할 수 있다.
일반적으로, 전형적인 레트로바이러스 벡터 생산 시스템은 필수적인 바이러스 패키징 기능으로부터 바이러스 게놈의 분리를 수반한다. 이러한 구성요소는 전형적으로 별도의 DNA 발현 카세트(다르게는 플라스미드, 발현 플라스미드, DNA 작제물 또는 발현 작제물로 알려짐) 상에서 생산 세포에 제공된다.
벡터 게놈은 NOI를 포함한다. 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 신호(ψ), 중앙 폴리퓨린 트랙(cppt), rev-반응 요소(rev-response element, RRE), NOI를 포함하는 내부 발현 카세트, (선택적으로) 전사 후 요소(post-transcriptional element, PRE), 전형적으로 중앙 폴리퓨린 트랙(cppt), 3'-ppu 및 자가-불활성화(elf-inactivating, SIN) LTR을 필요로 한다. R-U5 영역은 벡터 게놈 RNA와 NOI mRNA 양자 모두의 올바른 폴리아데닐화뿐만 아니라 역전사 과정에 필요하다. 벡터 게놈은 WO 2003/064665에 기술된 바와 같이 오픈 리딩 프레임을 선택적으로 포함할 수 있다.
일 측면에서 뉴클레오티드 서열은 벡터 생산을 위해 tat-독립적 시스템에서 렌티바이러스 벡터에 사용하기에 적합할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 3세대 렌티바이러스 벡터는 tat-독립적이고, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 3세대 렌티바이러스 벡터의 맥락에서 사용될 수 있다. 본 발명의 일 측면에서 tat는 렌티바이러스 벡터 생산 시스템에 제공되지 않으며, 예를 들어 tat는 트랜스로 제공되지 않는다. 일 측면에서 본원에 기재된 바와 같은 세포 또는 벡터 또는 벡터 생산 시스템은 tat 단백질을 포함하지 않는다.
패키징 기능에는 gag/ pol 및 env 유전자가 포함된다. 이들은 생산 세포에 의한 벡터 입자의 생산에 필요하다. 게놈에 트랜스로 이러한 기능을 제공하는 것은 복제-결함 바이러스의 생산을 용이하게 한다.
감마-레트로바이러스 벡터의 생산 시스템은 전형적으로 게놈, gag/ pol 및 env 발현 작제물을 필요로 하는 3성분 시스템이다. HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터의 생산 시스템은 액세서리 유전자 rev가 트랜스로 제공되고 벡터 게놈이 rev-반응 요소(RRE)를 포함할 것을 추가로 요구한다. EIAV 기반 렌티바이러스 벡터는 오픈 리딩 프레임(ORF)이 존재하는 경우 rev를 필요로 하지 않는다(WO 2003/064665 참조).
일반적으로 벡터 게놈 카세트 내에 암호화된 "외부" 프로모터(벡터 게놈 카세트를 구동함) 및 "내부" 프로모터(NOI 카세트를 구동함) 양자 모두는 다른 벡터 시스템 구성요소를 구동하는 프로모터와 마찬가지로 강력한 진핵생물 또는 바이러스 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예는 CMV, EF1α, PGK, CAG, TK, SV40 및 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. DNA 라이브러리에 의해 생성된 것(예: JeT 프로모터)과 같은 강력한 '합성' 프로모터도 전사를 유도하는 데 사용할 수 있다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나제(RhoK), 원추형(cone-rod) 호메오박스 함유 유전자(CRX), 신경 망막-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황 황반 이영양증 2(Vitelliform Macular Dystrophy 2, VMD2), 티로신 하이드록실라제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 성상교세포-특이적 신경교 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 프로모터, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40 / hAlb 프로모터, SV40 / CD43, SV40 / CD45, NSE / RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 데스민(Desmin) 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터를 사용하여 전사를 구동할 수 있다.
레트로바이러스 벡터의 생산은 생산 세포를 이러한 DNA 구성요소로 일시적으로 형질감염시키거나 구성요소가 생산 세포 게놈 내에 통합된 안정적인 생산자 세포주(producer cell line, PCL)의 사용을 포함한다(예: Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous and P. A. Radcliffe (2009) Gene Ther . 16(6): 805-814 Epub 2009 Mar 2005). 대안적인 접근법은 안정적인 패키징 세포(이 안에 패키징 구성요소가 안정적으로 통합됨)를 사용한 다음 필요에 따라 벡터 게놈 플라스미드에 일시적으로 형질감염시키는 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터를 생성하기 위해서는 생산 세포가 TRAP를 발현할 수 있어야 한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 안정적으로 발현할 것이다. 본 발명의 다른 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 일시적으로 발현할 것이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 안정적으로 발현하고 또한 TRAP 작제물을 일시적으로 발현할 것이다.
TRIP 시스템이 주로 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위해 설명되었지만, 유사한 전략을 다른 바이러스 벡터에도 적용할 수 있다는 점에 유의해야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 EIAV로부터 유래된다. EIAV는 렌티바이러스 중 가장 단순한 게놈 구조를 가지며 본 발명에서 사용하기에 특히 바람직하다. gag/ pol 및 env 유전자 외에도, EIAV는 tat, rev 및 S2의 세 가지 다른 유전자를 암호화한다. Tat는 바이러스 LTR의 전사 활성제로 작용하고(Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536 및 Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642), rev는 rev-반응 요소(RRE)를 통해 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 조정한다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). 이들 두 단백질의 작용 기전은 영장류 바이러스의 유사한 기전과 대체로 유사한 것으로 생각된다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). S2의 기능은 알려져 있지 않다. 또한, EIAV 단백질인 Ttm이 확인되었는데, 이는 막횡단 단백질의 시작부분의 env 코딩 서열에 스플라이싱되는 tat의 첫 번째 엑손에 의해 암호화된다. 본 발명의 대안적인 구현예에서 바이러스 벡터는 HIV로부터 유래된다: HIV는 S2를 암호화하지 않는다는 점에서 EIAV와 상이하지만 EIAV와 달리 vif, vpr, vpu 및 nef를 암호화한다.
용어 "재조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터"(RRV)는 패키징 구성요소의 존재 하에 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자로 RNA 게놈의 패키징을 허용하기에 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 가지는 벡터를 지칭한다. 표적 세포의 감염은 역전사 및 표적 세포 게놈으로의 통합을 포함할 수 있다. RRV는 벡터에 의해 표적 세포로 전달될 비-바이러스성 코딩 서열을 운반한다. RRV는 표적 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생성하기 위한 독립적인 복제는 불가능하다. 일반적으로 RRV는 기능적 gag/ pol 및/또는 env 유전자, 및/또는 복제에 필수적인 기타 유전자를 결여한다.
바람직하게는 본 발명의 RRV 벡터는 최소 바이러스 게놈을 가진다.
본원에서 사용되는 용어 "최소 바이러스 게놈"은 바이러스 벡터가 표적 세포를 감염, 형질도입 및 관심 뉴클레오티드 서열을 전달하는 데 필요한 기능을 제공하는 데 필수적인 요소를 유지하면서 비필수 요소를 제거하도록 조작되었음을 의미한다. 이 전략에 대한 추가의 자세한 내용은 WO 1998/17815 및 WO 99/32646에서 찾을 수 있다. 최소 EIAV 벡터는 tat, rev 및 S2 유전자를 결여하며, 이러한 유전자가 생산 시스템에서 트랜스로 제공되지도 않는다. 최소 HIV 벡터는 vif, vpr, vpu, tat 및 nef를 결여한다.
그러나, 생산 세포 내에서 벡터 게놈을 생산하기 위해 사용되는 발현 플라스미드는 생산 세포/패키징 세포에서 게놈의 전사를 지시하기 위해 레트로바이러스 게놈에 작동가능하게 연결된 전사 조절 제어 서열을 포함할 것이다. 이러한 조절 서열은 전사된 레트로바이러스 서열과 연관된 천연 서열, 즉 5' U3 영역일 수 있거나, 아래에서 논의되는 바와 같이 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터와 같은 이종 프로모터일 수 있다. 일부 렌티바이러스 벡터 게놈은 효율적인 바이러스 생산을 위해 추가 서열을 필요로 한다. 예를 들어, 특히 HIV의 경우, RRE 서열이 포함될 수 있다. 그러나 RRE에 대한 요구(및 트랜스로 제공되는 rev에 대한 의존성)는 코돈 최적화에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이 전략에 대한 추가의 자세한 내용은 WO 2001/79518에서 찾을 수 있다. rev/RRE 시스템과 동일한 기능을 수행하는 대체 서열도 알려져 있다. 예를 들어, rev/RRE 시스템의 기능적 유사체는 Mason Pfizer 원숭이 바이러스에서 발견된다. 이것은 구성적 수송 요소(constitutive transport element, CTE)로 알려져 있으며 감염된 세포의 인자와 상호작용하는 것으로 믿어지는 게놈의 RRE 유형 서열을 포함한다. 세포 인자는 rev 유사체로 생각할 수 있다. 따라서, CTE는 rev/RRE 시스템의 대안으로 사용될 수 있다. 알려져 있거나 이용가능하게 된 다른 기능적 등가물은 본 발명과 관련될 수 있다. 예를 들어, HTLV-1의 Rex 단백질이 HIV-1의 Rev 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다는 것도 알려져 있다. Rev 및 RRE는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 벡터에서 부재하거나 비기능적일 수 있으며; 대체 rev 및 RRE, 또는 기능적으로 동등한 시스템이 존재할 수 있다.
SIN 벡터
본 발명의 방법에 사용하기 위한 벡터는 바람직하게는 바이러스 인핸서 및 프로모터 서열이 결실된 자가-불활성화(self-inactivating, SIN) 구성으로 사용된다. SIN 벡터는 야생형 벡터와 유사한 효능으로 생성되고 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 비분열 표적 세포를 형질도입할 수 있다. SIN 프로바이러스에서 긴 말단 반복부(LTR)의 전사 불활성화는 vRNA의 이동을 방지해야 하며, 이는 복제-가능 바이러스의 형성 가능성을 더욱 감소시키는 구성이다. 이것은 또한 LTR의 시스-작용 효과를 제거함으로써 내부 프로모터로부터 유전자의 조절된 발현을 가능하게 해야 한다.
예를 들어, 자가-불활성화 레트로바이러스 벡터 시스템은 3' LTR의 U3 영역에서 전사 인핸서 또는 인핸서 및 프로모터를 결실시킴으로써 구축되었다. 벡터 역전사 및 통합 라운드 후, 이러한 변화는 5' 및 3' LTR 양자 모두 내로 복사되며 전사적으로 불활성인 '프로바이러스'를 생성한다. 그러나, 이러한 벡터에서 LTR 내부의 모든 프로모터는 여전히 전사적으로 활성일 것이다. 이 전략은 내부에 배치된 유전자의 전사에 대한 바이러스 LTR의 인핸서 및 프로모터의 영향을 제거하는 데 사용되었다. 이러한 효과에는 증가된 전사 또는 전사의 억제가 포함된다. 이 전략은 3' LTR에서 게놈 DNA로의 다운스트림 전사를 제거하는 데에도 사용할 수 있다. 이것은 내인성 종양유전자(oncogene)의 우발적 활성화를 방지하는 것이 중요한 인간 유전자 치료에서 특히 중요하다. Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90. SIN 렌티바이러스 벡터는 US 6,924,123 및 US 7,056,699에 기재되어 있다.
비-복제 렌티바이러스 벡터
복제-결함 렌티바이러스 벡터의 게놈에서 gag/ pol 및/또는 env의 서열은 돌연변이되거나, 부재 및/또는 기능적이지 않을 수 있다.
본 발명의 전형적인 렌티바이러스 벡터에서, 바이러스 복제에 필수적인 단백질에 대한 하나 이상의 코딩 영역의 적어도 일부는 벡터로부터 제거될 수 있다. 이것은 바이러스 벡터를 복제-결함으로 만든다. 바이러스 게놈의 일부는 또한 비-분할 표적 세포를 형질도입하고/하거나 표적 세포 게놈 내로 그의 게놈을 통합할 수 있는 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함하는 벡터를 생성하기 위해 NOI로 치환될 수 있다.
일 구현예에서 렌티바이러스 벡터는 WO 2006/010834 및 WO 2007/071994에 기재된 바와 같은 비-통합 벡터이다.
추가의 구현예에서 벡터는 바이러스 RNA가 없거나 결여된 서열을 전달하는 능력을 갖는다. 추가의 구현예에서, 전달될 RNA 상에 위치한 이종 결합 도메인(gag에 대해 이종) 및 Gag 또는 GagPol 상의 동족(cognate) 결합 도메인이 전달될 RNA의 패키징을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이들 벡터 모두는 WO 2007/072056에 기재되어 있다.
아데노바이러스 벡터
본 발명의 다른 구현예에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스는 RNA 중간체를 통해 복제되지 않는 이중 가닥의 선형 DNA 바이러스이다. 아데노바이러스에는 50가지가 넘는 다양한 인간 혈청형이 있으며 유전자 서열에 기초하여 6개의 하위 그룹으로 나뉜다.
아데노바이러스는 인간 및 비인간 기원의 광범위한 세포 유형의 생체내, 생체외 및 시험관내 형질도입이 가능한 이중 가닥 DNA 비-외피 바이러스이다. 이러한 세포에는 호흡기도 상피 세포, 간세포, 근육 세포, 심장 근육 세포(cardiac myocyte), 윤활막 세포(synoviocyte), 원발성 유선 상피 세포 및 뉴런과 같은 유사분열 후 말단 분화된 세포가 포함된다.
아데노바이러스 벡터는 또한 비분열 세포를 형질도입할 수 있다. 이것은 폐 상피에서 영향을 받은 세포가 느린 회전율을 갖는 낭포성 섬유증과 같은 질병에 매우 중요하다. 실제로, 고통받는 성인 낭포성 섬유증 환자의 폐로 낭포성 섬유증 수송체(CFTR)의 아데노바이러스 매개 전달을 활용하는 여러 시험이 진행 중이다.
아데노바이러스는 유전자 치료 및 이종 유전자의 발현을 위한 벡터로 사용되어 왔다. 큰(36 kb) 게놈은 최대 8 kb의 외래 삽입 DNA를 수용할 수 있으며 보완(complementing) 세포주에서 효율적으로 복제하여 ml 당 최대 1012 형질도입 단위의 매우 높은 역가를 생성할 수 있다. 따라서 아데노바이러스는 1차 비복제 세포에서 유전자 발현을 연구하는 최고의 시스템 중 하나이다.
아데노바이러스 게놈으로부터 바이러스 또는 외래 유전자의 발현은 복제하는 세포를 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터는 수용체 매개 엔도사이토시스에 의해 세포에 들어간다. 일단 세포 내부에 들어가면, 아데노바이러스 벡터는 숙주 염색체에 거의 통합되지 않는다. 대신, 그들은 숙주 핵에서 선형 게놈으로서 에피솜으로(episomally)(숙주 게놈과 독립적으로) 기능한다.
아데노 -관련 바이러스 벡터
아데노-관련 바이러스(AAV)는 통합 빈도가 높고 비분열 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 본 발명에서 사용하기에 매력적인 벡터 시스템이다. 이것은 포유류 세포에 유전자를 전달하는 데 유용하다. AAV는 감염성에 있어서 광범위한 숙주 범위를 가진다. rAAV 벡터의 생성 및 사용에 관한 세부사항은 각각 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제5,139,941호 및 미국 특허 제4,797,368호에 기재되어 있다.
재조합 AAV 벡터는 마커 유전자 및 인간 질병에 관련된 유전자의 시험관내, 생체외 및 생체내 형질도입에 성공적으로 사용되었다.
큰 유효 탑재량(payload)(최대 8-9 kb)를 효율적으로 통합할 수 있는 특정 AAV 벡터가 개발되었다. 이러한 벡터 중 하나는 AAV5 캡시드 및 AAV2 ITR을 갖는다(Allocca M, et al J. Clin Invest (2008) 118: 1955-1964).
단순 포진 바이러스 벡터
단순 포진 바이러스(HSV)는 자연적으로 뉴런을 감염시키는 외피 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 그것은 외래 DNA의 큰 섹션을 수용할 수 있어 벡터 시스템으로 매력적이며, 뉴런으로의 유전자 전달을 위한 벡터로 사용되었다(Manservigiet et al Open Virol J. (2010) 4:123-156).
치료 절차에서 HSV를 사용하려면 균주가 용해 주기를 설정할 수 없도록 균주를 약독화해야 한다. 특히, HSV 벡터가 인간에서 유전자 치료에 사용된다면, 폴리뉴클레오티드는 필수 유전자에 삽입되는 것이 바람직하다. 이는 바이러스 벡터가 야생형 바이러스를 만나는 경우, 이종 유전자의 야생형 바이러스로의 전달이 재조합에 의해 발생할 수 있기 때문이다. 그러나, 폴리뉴클레오티드가 필수 유전자에 삽입되는 한, 이러한 재조합적 전달은 수용자 바이러스의 필수 유전자도 삭제하고 이종 유전자가 복제 가능한 야생형 바이러스 개체군으로 "도주(escape)"하는 것을 방지한다.
백시니아 바이러스 벡터
본 발명의 벡터는 MVA 또는 NYVAC와 같은 백시니아 바이러스 벡터일 수 있다. 백시니아 벡터에 대한 대안은 인간 세포에서 재조합 단백질을 감염 및 발현할 수 있지만 복제할 수 없는 조류폭스(avipox) 벡터, 예컨대 계두(fowlpox) 또는 ALVAC로 알려진 카나리아폭스(canarypox) 및 이들로부터 유래된 균주를 포함한다.
배큘로바이러스 벡터
본 발명의 벡터는 또한 배큘로바이러스 벡터일 수 있다. 포유동물 세포 내에서 암호화된 NOI의 발현을 가능하게 하는 배큘로바이러스의 변형은 당업계에 잘 알려져 있다. 이것은 예를 들어 NOI의 상류에 포유류 프로모터의 사용을 통해 달성될 수 있다.
다중 NOI를 암호화하는 벡터
일 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 NOI를 포함하며, 여기서 하나 이상의 NOI는 본원에 기재된 바와 같은 tbs 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된다.
내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 벡터는 하나 이상의 NOI를 포함할 수 있다. 이러한 NOI가 발현되기 위해서는, 벡터 게놈 내에 각 NOI에 대해 하나씩 2개 이상의 전사 단위가 있을 수 있다. 그러나, 레트로바이러스 벡터가 유전적으로 단순하게 유지된다면 이들이 가장 높은 역가와 가장 강력한 유전자 발현 특성을 달성한다는 것이 문헌으로부터 분명하며(WO 96/37623; Bowtell et al., 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll et al., 1994 Blood 84, 1812; Emerman and Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 1991 Mol.Cell.Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al., 1991 J.Biol.Chem 266, 8416; Hatzoglou et al., 1988 J.Biol.Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum.Gen.Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al., 1988 Mol.Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1, 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197), 따라서 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하여 폴리시스트론 메시지에서 두 번째 (및 후속) 코딩 서열(들)의 번역을 개시하는 것이 바람직하다(Adam et al 1991 J.Virol. 65, 4985).
IRES 요소의 레트로바이러스 벡터로의 삽입은 레트로바이러스 복제 주기와 양립가능하며 단일 프로모터로부터 여러 코딩 영역의 발현을 허용한다(Adam et al (상기와 같음); Koo et al (1992) Virology 186:669-675; Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148). IRES 요소는 피코르나바이러스(picornavirus)의 비-번역 5' 말단에서 처음 발견되었는데 여기서 이들은 바이러스 단백질의 cap-독립적 번역을 촉진한다(Jang et al (1990) Enzyme 44: 292-309). RNA의 오픈 리딩 프레임 사이에 위치하는 경우, IRES 요소는 IRES 요소에서 리보솜의 진입을 촉진하고 이어서 하류의 번역 개시를 촉진함으로써 하류 오픈 리딩 프레임의 효율적인 번역을 허용한다.
IRES에 대한 리뷰는 Mountford와 Smith가 제공한다(TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184). 다수의 상이한 IRES 서열이 알려져 있으며 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus, EMCV)로부터의 서열(Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991); BiP 단백질 [Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; 초파리(Drosophila)의 Antennapedia 유전자(엑손 d 및 e) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)] 뿐만 아니라 소아마비 바이러스(polio virus, PV)의 서열 [Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); 또한 Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985) 참조]을 포함한다.
PV, EMCV 및 돼지 수포성 질병 바이러스로부터의 IRES 요소는 이전에 레트로바이러스 벡터에 사용되었다(Coffin et al, 상기와 같음).
용어 "IRES"는 IRES로 작용하거나 IRES의 기능을 향상시키는 임의의 서열 또는 서열의 조합을 포함한다.
IRES(들)는 바이러스 기원(예컨대 EMCV IRES(서열번호 59), PV IRES, 또는 FMDV 2A-유사 서열) 또는 세포 기원(예컨대 FGF2 IRES, NRF IRES, Notch 2 IRES 또는 EIF4 IRES)일 수 있다.
IRES가 각 폴리뉴클레오티드의 번역을 개시할 수 있으려면 벡터 게놈에서 폴리뉴클레오티드 사이 또는 그 앞에 위치해야 한다.
프로모터
NOI의 발현은 프로모터/인핸서 및 기타 발현 조절 신호를 포함하는 조절 서열을 사용하여 조절될 수 있다. 원핵생물 프로모터 및 진핵생물 세포에서 기능하는 프로모터가 사용될 수 있다. 조직 특이적 또는 자극 특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 2개 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하는 키메라 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
적합한 프로모터 서열은 강력한 프로모터로서, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 레트로바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 유래된 것들, 또는 액틴 프로모터, EF1α, CAG, TK, SV40, 유비퀴틴, PGK 또는 리보솜 단백질 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터로부터 유래된 것들을 포함한다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나제(RhoK), 원추형(cone-rod) 호메오박스 함유 유전자(CRX), 신경 망막-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황 황반 이영양증 2(VMD2), 티로신 하이드록실라제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 성상교세포-특이적 신경교 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 프로모터, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40 / hAlb 프로모터, SV40 / CD43, SV40 / CD45, NSE / RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 데스민(Desmin) 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터를 사용하여 전사를 구동할 수 있다.
인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 유전자의 전사를 더욱 증가시킬 수 있다. 인핸서는 상대적으로 방향- 및 위치-독립적이다; 그러나 복제 기점의 후반(late side)(bp 100-270)에 있는 SV40 인핸서 및 CMV 초기 프로모터 인핸서와 같은 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 5' 부위에 위치한다.
프로모터는 적절한 표적 세포에서 발현을 보장하거나 증가시키기 위한 구성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 구성은 보존된 영역, 예를 들어 프리브나우(Pribnow) 박스 또는 TATA 박스일 수 있다. 프로모터는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준에 영향을 미치는(예컨대 유지, 향상 또는 감소시키는) 다른 서열을 함유할 수 있다. 적합한 다른 서열은 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열에는 온도, 화학, 빛 또는 응력 유도 요소와 같은 유도 요소가 포함된다. 또한, 전사 또는 번역을 향상시키기에 적합한 요소가 존재할 수 있다.
조직-특이적 프로모터를 포함한 구성적 및/또는 강력한 프로모터가 전이유전자를 구동하는 것이 선호되는 경우 그리고 특히 생산 세포에서 전이유전자 단백질의 발현이 벡터 역가의 감소를 초래하고/하거나 전이유전자-유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체내 면역 반응을 유도하는 경우, TRAP-tbs 상호작용은 레트로바이러스 벡터 생산을 위한 전이유전자 단백질 억제 시스템의 기초를 형성하는 데 유용할 수 있다.
NOI의 조절자
레트로바이러스 패키징/생산자 세포주의 생성 및 레트로바이러스 벡터 생산에 있어서 복잡한 요인은 특정 레트로바이러스 벡터 구성요소와 NOI의 구성적 발현이 세포독성을 일으켜 이러한 구성요소를 발현하는 세포를 사멸시켜 벡터를 생산할 수 없다는 것이다. 따라서, 이러한 구성요소(예: gag-pol 및 VSV-G와 같은 외피 단백질)의 발현이 조절될 수 있다. 다른 비-세포독성 벡터 구성요소, 예를 들어 rev의 발현 또한 세포에 대한 대사 부담을 최소화하기 위해 조절될 수 있다. 따라서 본원에 기재된 바와 같은 벡터 구성요소 및/또는 세포를 암호화하는 모듈식 작제물(modular construct) 또는 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 조절 요소(regulatory element)와 관련된 세포독성 및/또는 비-세포독성 벡터 구성요소를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "조절 요소"는 관련 유전자 또는 단백질의 발현을 증가시키든 또는 감소시키든 영향을 미칠 수 있는 임의의 요소를 지칭한다. 조절 요소는 유전자 스위치 시스템, 전사 조절 요소 및 번역 억제 요소를 포함한다.
여러 원핵생물 조절 시스템이 포유류 세포에서 유전자 스위치를 생성하도록 조정되었다. 많은 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주를 유전자 스위치 시스템(예: 테트라사이클린 및 큐메이트 유도성 스위치 시스템)을 사용하여 제어함으로써 하나 이상의 레트로바이러스 벡터 구성요소의 발현이 벡터 생산 시에 스위치 온(switch on)될 수 있도록 하였다. 유전자 스위치 시스템에는 전사 조절자의 (TetR) 단백질 그룹의 것들(예: T-Rex, Tet-On 및 Tet-Off), 전사 조절자의 큐메이트 유도성 스위치 시스템 그룹의 것들(예: CymR 단백질) 및 RNA-결합 단백질에 관련된 것들(예: TRAP)이 포함된다.
이러한 테트라사이클린-유도성 시스템 중 하나는 T-REx™ 시스템을 기반으로 하는 테트라사이클린 억제인자(TetR) 시스템이다. 예로써, 이러한 시스템에서 테트라사이클린 오퍼레이터(TetO2)는 첫 번째 뉴클레오티드가 인간 사이토메갈로바이러스 주요 즉시 초기 프로모터(hCMVp)의 TATATAA 요소의 마지막 뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 10 bp가 되는 위치에 배치되고 그러면 TetR 단독으로 억제인자 역할을 할 수 있다(Yao F, Svensjo T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E., 1998, Hum Gene Ther; 9: 1939-1950). 이러한 시스템에서 NOI의 발현은 TetO2 서열의 2개 카피가 나란히(in tandem) 삽입된 CMV 프로모터에 의해 제어될 수 있다. TetR 동종이량체는, 유도제(테트라사이클린 또는 그 유사체 독시사이클린[dox]) 부재 시, TetO2 서열에 결합하고 상류 CMV 프로모터로부터의 전사를 물리적으로 차단한다. 존재하는 경우, 유도제는 TetR 동종이량체에 결합하여 알로스테릭 변화를 일으켜 TetO2 서열에 더 이상 결합할 수 없도록 하여 유전자 발현을 유발한다. TetR 유전자는 코돈 최적화될 수 있으며 이는 이것이 번역 효율을 개선하여 TetO2 제어된 유전자 발현을 더 엄격하게 제어하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
TRiP 시스템은 WO 2015/092440에 기술되어 있으며 벡터 생산 동안 생산 세포에서 NOI의 발현을 억제하는 또 다른 방법을 제공한다. 조직-특이적 프로모터를 포함한 구성적 및/또는 강력한 프로모터가 전이유전자를 구동하는 것이 선호되는 경우 그리고 특히 생산 세포에서 전이유전자 단백질의 발현이 벡터 역가의 감소를 초래하고/하거나 전이유전자-유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체내 면역 반응을 유도하는 경우, TRAP-결합 서열(예: TRAP-tbs) 상호작용은 레트로바이러스 벡터 생산을 위한 전이유전자 단백질 억제 시스템의 기초를 형성한다(Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8).
간단히 말해서, TRAP-tbs 상호작용은 번역 블록을 형성하여 전이유전자 단백질의 번역을 억제한다(Maunder et al, Nat Commun. (2017) Mar 27; 8). 번역 블록은 생산 세포에서만 효과적이며 따라서 DNA- 또는 RNA-기반 벡터 시스템을 방해하지 않는다. TRiP 시스템은 전이유전자 단백질이 단일 또는 다중 시스트론 mRNA로부터 조직-특이적 프로모터를 포함한 구성적 및/또는 강력한 프로모터로부터 발현될 때 번역을 억제할 수 있다. 전이유전자 단백질의 조절되지 않은 발현이 벡터 역가를 감소시키고 벡터 생성물 품질에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다. 일시적 및 안정적 PaCL/PCL 벡터 생산 시스템 양자 모두에 대한 전이유전자 단백질의 억제는 생산 세포가 벡터 역가의 감소를 방지하는 데 유익하며: 이는 독성 또는 분자 부담 문제가 세포 스트레스로 이어질 수 있는 경우; 전이유전자-유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 전이유전자 단백질이 생체내 면역 반응을 유도하는 경우; 유전자-편집 전이유전자의 사용이 on/off 표적 영향을 초래할 수 있는 경우; 전이유전자 단백질이 벡터 및/또는 외피 당단백질 배제에 영향을 미칠 수 있는 경우 그러하다.
패키징 서열
본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같이, "패키징 서열" 또는 "psi"로 상호교환적으로 지칭되는 "패키징 신호"라는 용어는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화(encapsidation)에 필요한 비-코딩, 시스-작용 서열과 관련하여 사용된다. HIV-1에 있어서, 이 서열은 주요 스플라이스 공여자 부위(SD)의 상류에서부터 적어도 gag 시작 코돈까지 연장되는 유전자좌에 매핑되어 있다. EIAV에서 패키징 신호는 Gag의 5' 코딩 영역 내로의 R 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "연장된 패키징 신호" 또는 "연장된 패키징 서열"은 gag 유전자 내로 추가로 확장된 psi 서열 주위의 서열의 사용을 지칭한다. 이러한 추가 패키징 서열의 포함은 벡터 RNA를 바이러스 입자에 삽입하는 효율성을 증가시킬 수 있다.
고양이 면역결핍 바이러스(FIV) RNA 캡슐화 결정인자는 게놈 mRNA의 5' 말단(R-U5)에 하나의 영역을 포함하고 gag의 근위(proximal) 311 nt 내에 매핑된 다른 영역을 포함하여, 분리되고 불연속적인 것으로 나타났다(Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995)).
위형화 ( Pseudotyping )
하나의 바람직한 측면에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 위형화(슈도타입핑, pseudotype)된 것이다. 이와 관련하여, 위형화는 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, HIV 기반 벡터의 env 유전자 산물은 이들 벡터가 CD4라고 하는 단백질을 발현하는 세포만을 감염시키는 것으로 제한한다. 그러나 이러한 벡터의 env 유전자가 다른 외피 바이러스로부터의 env 서열로 치환된 경우, 이들은 더 넓은 감염 스펙트럼을 가질 수 있다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242). 예를 들어, 연구자들은 VSV로부터의 당단백질을 사용하여 HIV 기반 벡터를 위형화하였다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242).
다른 대안에서, Env 단백질은 돌연변이 또는 조작된 Env 단백질과 같은 변형된 Env 단백질일 수 있다. 표적화 능력을 도입하거나 독성을 감소시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 변형이 이루어지거나 선택될 수 있다(Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64; Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286; 및 Fielding et al (1998) Blood 91(5):1802-1809 및 거기에 인용된 참조문헌).
벡터는 선택한 분자로 위형화될 수 있다.
VSV -G
라브도바이러스(rhabdovirus)인 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)의 외피 당단백질(G)은 특정 외피 바이러스 및 바이러스 벡터 비리온을 위형화할 수 있는 것으로 밝혀진 외피 단백질이다.
레트로바이러스 외피 단백질이 없는 상태에서 MoMLV-기반 레트로바이러스 벡터를 위형화하는 이의 능력은 Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207에 의해 최초로 개시되었다. WO 1994/294440은 레트로바이러스 벡터가 VSV-G를 사용하여 성공적으로 위형화될 수 있음을 교시하고 있다. 이러한 위형화된 VSV-G 벡터는 광범위한 포유동물 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 보다 최근에, Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361은 비-감염성 레트로바이러스 입자가 VSV-G의 첨가에 의해 감염성으로 만들어질 수 있다고 교시하고 있다.
Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7은 VSV-G를 사용하여 레트로바이러스 MLV를 성공적으로 위형화하였으며, 이는 원래 형태의 MLV와 비교하여 변경된 숙주 범위를 가지는 벡터를 생산하였다. VSV-G 위형화된 벡터는 포유동물 세포뿐만 아니라 어류, 파충류 및 곤충에서 유래한 세포주도 감염시키는 것으로 나타났다(Burns et al. (1993) ibid). 이들은 또한 다양한 세포주에 대해 기존의 양쪽성(amphotropic) 외피보다 더 효율적인 것으로 나타났다(Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568, Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207). VSV-G 단백질은 그의 세포질 꼬리가 레트로바이러스 코어와 상호작용할 수 있기 때문에 특정 레트로바이러스를 위형화하는데 사용할 수 있다.
VSV-G 단백질과 같은 비-레트로바이러스 위형화 외피의 제공은 벡터 입자가 감염성 손실 없이 높은 역가로 농축될 수 있다는 이점을 제공한다(Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5). 레트로바이러스 외피 단백질은 초원심분리 동안 분명히 전단력을 견딜 수 없고, 이는 아마도 이들이 2개의 비-공유적으로 연결된 서브유닛으로 구성되어 있기 때문일 것이다. 서브유닛 간의 상호작용이 원심분리에 의해 방해될 수 있다. 이에 비해 VSV 당단백질은 단일 단위로 구성된다. 따라서 VSV-G 단백질 위형화는 잠재적인 이점을 제공할 수 있다.
WO 2000/52188은 안정적인 생산자 세포주로부터, 수포성 구내염 바이러스-G 단백질(VSV-G)을 막-연관 바이러스 외피 단백질로 가지는 위형화된 레트로바이러스 벡터의 생성을 기재하고 있으며, VSV-G 단백질에 대한 유전자 서열을 제공한다.
로스 리버 바이러스(Ross River Virus)
로스 리버 바이러스 외피는 비영장류 렌티바이러스 벡터(FIV)를 위형화하는 데 사용되었으며 전신 투여 후 주로 간에 형질도입하였다(Kang et al (2002) J Virol 76(18):9378-9388). 효율성은 VSV-G 위형화된 벡터로 얻은 것보다 20배 더 큰 것으로 보고되었으며, 간독성(hepatotoxicity)을 시사하는 간 효소의 혈청 수준으로 측정했을 때 세포독성이 더 적었다.
배큘로바이러스 GP64
배큘로바이러스 GP64 단백질은 임상 및 상업적 적용에 필요한 고역가 바이러스의 대규모 생산에 사용되는 바이러스 벡터에 대해서 VSV-G의 대안인 것으로 밝혀졌다(Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77). VSV-G-위형화된 벡터와 비교하여, GP64-위형화된 벡터는 유사한 넓은 지향성(tropism) 및 유사한 고유 역가를 가진다. GP64 발현은 세포를 죽이지 않기 때문에, GP64를 구성적으로 발현하는 293T-기반 세포주가 생성될 수 있다.
대체 외피
EIAV를 위형화하기 위해 사용될 때 합리적인 역가를 제공하는 다른 외피로는 모콜라(Mokola), 광견병(Rabies), 에볼라 및 LCMV(림프구성 맥락수막염 바이러스)를 포함한다. 4070A를 사용하여 위형화한 렌티바이러스의 마우스로의 정맥내 주입은 간에서 최대 유전자 발현을 유도하였다.
바이러스 벡터 생산 시스템 및 세포
본 발명의 또 다른 측면은 바이러스 벡터의 생산에 필요한 구성요소를 암호화하는 핵산 서열 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템에 관한 것으로, 여기서 벡터 게놈 서열은 본 발명의 핵산 서열을 포함한다.
"바이러스 벡터 생산 시스템" 또는 "벡터 생산 시스템" 또는 "생산 시스템"은 렌티바이러스 벡터 생산을 위한 필요한 구성요소를 포함하는 시스템으로 이해되어야 한다.
따라서, 벡터 생산 시스템은 바이러스 벡터 입자를 생성하는 데 필요한 구성요소를 암호화하는 핵산 서열 세트를 포함한다. 그러한 핵산 서열 중 하나는 TRAP를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서 RNA 결합 단백질은 박테리아 TRAP이다.
본 발명의 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터 생산 시스템은 Gag 및 Gag/Pol 단백질, 및 Env 단백질, 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 핵산 서열, 및 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈 서열을 추가로 포함한다. 생산 시스템은 선택적으로 Rev 단백질을 암호화하는 핵산 서열 및/또는 TRAP를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래된다.
본 발명의 또 다른 측면은 진핵생물 벡터 생산 세포에서 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 진핵생물 벡터 생산 세포에 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 및 TRAP를 암호화하는 핵산 서열을 도입하는 것을 포함하고, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하고 NOI의 번역을 억제함으로써, TRAP 결합 부위가 없는 바이러스 벡터에 비해 바이러스 벡터 역가를 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물에 관한 것이다. 이러한 DNA 작제물(예: 플라스미드)은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈 작제물을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 TRAP를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 DNA 작제물 및 Gag 및 Gag/Pol 단백질 및 Env 단백질 또는 이들의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물의 세트에 관한 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA 작제물의 세트는 TRAP를 암호화하는 DNA 작제물을 추가로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, DNA 작제물의 세트는 Rev 단백질 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 모듈식 핵산 작제물(모듈식 작제물)을 포함한다. 모듈식 작제물은 렌티바이러스 벡터의 생산에 사용되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 DNA 발현 작제물이다. 모듈식 작제물은 렌티바이러스 벡터의 생산에 사용되는 2개 이상의 핵산을 포함하는 DNA 플라스미드일 수 있다. 플라스미드는 박테리아 플라스미드일 수 있다. 핵산은 예를 들어 gag-pol, rev, env, 벡터 게놈을 암호화할 수 있다. 또한, 패키징 및 생산자 세포주의 생성을 위해 설계된 모듈식 작제물은 전사 조절 단백질(예: TetR, CymR) 및/또는 번역 억제 단백질(예: TRAP) 및 선택 가능한 마커(예: Zeocin™, 하이그로마이신(hygromycin), 블라스티시딘(blasticidin), 퓨로마이신(puromycin), 네오마이신 내성 유전자)를 추가로 암호화해야 할 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 모듈식 작제물은 그 전체가 참고로 본 명세서에 포함된 EP 3502260에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 모듈식 작제물은 하나의 작제물에 2개 이상의 레트로바이러스 구성요소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하기 때문에, 이러한 모듈식 작제물의 안전성 프로파일이 고려되었고 추가적인 안전성 구성이 작제물에 직접 조작되었다. 이러한 구성에는 레트로바이러스 벡터 구성요소의 다중 오픈 리딩 프레임을 위한 인슐레이터의 사용 및/또는 모듈식 작제물에서 레트로바이러스 유전자의 특정 방향 및 배열이 포함된다. 이러한 구성을 사용함으로써 복제 가능한 바이러스 입자를 생성하는 직접적인 리드-스루(read-through)가 방지될 것으로 믿어진다.
바이러스 벡터 구성요소를 암호화하는 핵산 서열은 모듈식 작제물에서 역방향 및/또는 교대 전사 배향일 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터 구성요소를 암호화하는 핵산 서열이 동일한 5'에서 3' 방향으로 제시되지 않으므로, 바이러스 벡터 구성요소가 동일한 mRNA 분자로부터 생산될 수 없다. 역방향 배향은 서로 다른 벡터 구성요소에 대한 적어도 2개의 코딩 서열이 '머리-대-머리(head-to-head)' 및 '꼬리-대-꼬리(tail-to-tail)' 전사 방향으로 제시됨을 의미할 수 있다. 이것은 모듈식 작제물의 한 가닥에는 하나의 벡터 구성요소, 예를 들어 env에 대한 코딩 서열을 제공하고, 모듈식 작제물의 반대 가닥에는 다른 벡터 구성요소, 예를 들어 rev에 대한 코딩 서열을 제공함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 2개 이상의 벡터 구성요소에 대한 코딩 서열이 모듈식 작제물에 존재할 때, 코딩 서열 중 적어도 2개는 역 전사 배향으로 존재한다. 따라서, 2개 이상의 벡터 구성요소에 대한 코딩 서열이 모듈식 작제물에 존재할 때, 각 구성요소는 그것이 인접하고 있는 다른 벡터 구성요소에 대한 모든 인접 코딩 서열(들)에 대해 반대 5'에서 3' 배향으로 존재하도록 배향될 수 있으며, 즉 각 코딩 서열에 대해 5'에서 3'(또는 전사) 배향을 교대로 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 모듈식 작제물은 하기 벡터 구성요소들 중 2개 이상을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다: gag-pol, rev, env, 벡터 게놈. 모듈식 작제물은 벡터 구성요소의 임의의 조합을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 모듈식 작제물은 하기를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다:
i) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 rev, 또는 이의 기능적 대체물
ii) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 gag-pol;
iii) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈 및 env;
iv) gag-pol 및 rev, 또는 이의 기능적 대체물;
v) gag-pol 및 env;
vi) env 및 rev, 또는 이의 기능적 대체물;
vii) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈, rev, 또는 이의 기능적 대체물, 및 gag-pol;
viii) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈, rev, 또는 이의 기능적 대체물, 및 env;
ix) 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈, gag-pol 및 env; 또는
x) gag-pol, rev, 또는 이의 기능적 대체물, 및 env,
여기서 핵산 서열은 역방향 및/또는 교대 배향이다.
일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위한 세포는 상기 조합 i) 내지 x) 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 핵산 서열은 동일한 유전적 유전자좌(genetic locus)에 위치하고 역방향 및/또는 교대 배향이다. 동일한 유전적 유전자좌는 세포 내 단일 염색체외(extrachromosomal) 유전자좌를 지칭할 수 있으며, 예를 들어 단일 플라스미드, 또는 세포 게놈의 단일 유전자좌(즉, 단일 삽입 부위)일 수 있다. 세포는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 안정하거나 일시적인 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 본 발명의 DNA 작제물의 일부 또는 전부를 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 생산 세포"는 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포로 이해되어야 한다. 바이러스 벡터 생산 세포는 "생산자 세포" 또는 "패키징 세포"일 수 있다. 바이러스 벡터 시스템의 하나 이상의 DNA 작제물은 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 안정적으로 통합되거나 에피솜으로 유지될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 시스템의 모든 DNA 구성요소는 바이러스 벡터 생산 세포 내로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 또 다른 대안에서, 구성요소 중 일부를 안정적으로 발현하는 생산 세포는 나머지 구성요소로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
TRAP를 암호화하는 DNA 발현 카세트는 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 안정적으로 통합되거나 에피솜으로 유지될 수 있다. 대안적으로, TRAP를 암호화하는 DNA 발현 카세트는 바이러스 벡터 생산 세포 내로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 안정적으로 발현할 것이다. 본 발명의 다른 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 일시적으로 발현할 것이다.
요구되는 억제 수준은 NOI에 따라 다를 수 있으므로 생산 세포에서 요구되는 TRAP의 수준 또한 NOI에 따라 달라질 수 있다. 따라서 일부 상황에서는 안정적이고 일시적인 TRAP 발현의 조합이 필요할 수 있다. 안정적인 발현은 생산 세포에서 지속적인 수준의 TRAP 발현을 제공할 수 있는 반면, 일시적인 발현은 더 짧은 기간의 증가된 수준의 TRAP 발현을 제공할 수 있다. 예를 들어, 더 문제가 있거나 독성이 있는 전이유전자의 억제는 벡터 생산 동안 기존 수준의 TRAP(예: 안정적인 발현에 의해 제공됨) 및 높은 수준의 TRAP 모두로부터 이점을 얻는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서 생산 세포는 TRAP 작제물을 안정적으로 발현하고 또한 TRAP 작제물을 일시적으로 발현할 것이다. 일시적인 발현은 안정적인 발현에 의해 제공되는 것보다 단기적으로 더 높은 수준의 TRAP 발현을 제공할 수 있다.
"안정적인 발현"이란 안정적인 발현을 제공하는 작제물로부터의 TRAP의 발현이 장기간에 걸쳐 실질적으로 변하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
"일시적인 발현"이란 일시적인 발현을 제공하는 작제물로부터의 TRAP의 발현이 장기간에 걸쳐 안정하지 않은 것으로 이해되어야 한다. 바람직하게는, 일시적인 발현을 제공하는 TRAP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 생산 세포 게놈 내로 통합되지 않고 생산 세포에서 에피솜으로 유지되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "패키징 세포"는 감염성 벡터 입자의 생산에 필요한 요소를 포함하지만 벡터 게놈이 결여된 세포를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 패키징 세포는 바이러스 구조 단백질(예컨대 gag, gag/ pol 및 env)을 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 카세트를 함유한다.
생산자 세포/패키징 세포는 임의의 적합한 세포 유형일 수 있다. 생산자 세포는 일반적으로 포유동물 세포이지만, 예를 들어 곤충 세포일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생산자/생산 세포" 또는 "벡터 생산하는/생산 세포"는 레트로바이러스 벡터 입자의 생산 및 TRAP의 발현에 필요한 모든 요소를 함유하는 세포를 지칭한다.
생산자 세포는 안정적인 생산자 세포주이거나 일시적으로 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 외피 및 뉴클레오캡시드, TRAP 및 존재하는 경우 rev 뉴클레오티드 서열은 모두 생산자 및/또는 패키징 세포에 안정적으로 통합된다. 그러나, 이들 서열 중 임의의 하나 이상은 에피솜 형태로 존재할 수도 있고 유전자 발현이 에피솜으로부터 일어날 수 있거나 생산 세포 내로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
벡터 생산 세포는 조직 배양 세포주와 같이 시험관 내에서 배양된 세포일 수 있다. 적합한 세포주는 뮤린 섬유아세포 유래 세포주 또는 인간 세포주와 같은 포유동물 세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 벡터 생산 세포는 인간 세포주로부터 유래된다.
일 구현예에서 본 발명의 벡터는 NOI에 작동가능하게 연결된 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈, gag- pol 성분, 외피 및 TRAP를 발현하는 4개의 전사 단위를 그의 생산 시스템으로 사용한다. 외피 발현 카세트는 VSV-G와 같은 다수의 이종 외피 중 하나를 포함할 수 있다. 선택적으로 rev 구성 요소도 포함될 수 있다.
바이러스 벡터 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 본 발명의 DNA 작제물의 일부 또는 전부를 바이러스 벡터 생산 세포에 도입하고 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건 하에서 생산 세포를 배양하는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
적합한 "생산 세포"는 적절한 조건 하에서 배양될 때 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포이다. 이들은 일반적으로 포유동물 또는 인간 세포이며, 예를 들어 HEK293T, HEK293, CAP, CAP-T 또는 CHO 세포이지만, 예를 들어 SF9 세포와 같은 곤충 세포일 수 있다.
생산 세포는 또한 조류 세포, 예를 들어 EB66®(Sigma) 세포일 수 있다. 조류 세포는 인간 및 수의학용 바이러스 기반 백신, 예를 들어 인플루엔자 및 뉴캐슬병 바이러스 백신의 생산에 특히 유용할 수 있다.
핵산을 생산 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고 이전에 설명되었다.
일 구현예에서, 생산 세포는 TRAP를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해, 본 발명의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하거나, 또는 본 발명의 방법에 의해 생산된 바이러스 벡터에 관한 것이다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는 본 발명의 핵산 서열을 포함한다. 바이러스 벡터 입자는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법 및 특히 렌티바이러스 벡터를 처리하는 방법은 WO 2009/153563에 기재되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된 세포"는 바이러스 벡터 입자에 의해 운반되는 핵산이 전달된 세포, 특히 표적 세포로 이해되어야 한다.
용도
본 발명의 또 다른 측면은 의약에 사용하기 위한 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 의약에서의 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 관심 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 생산 세포 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포의 이러한 용도는 본원에 기재된 바와 같이 치료 또는 진단 목적을 위한 것일 수 있다.
치료 벡터
레트로바이러스 치료 벡터
일 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 파킨슨병을 치료하기 위해 도파민 합성 경로의 3가지 효소를 암호화하는 3가지 유전자를 도입하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인간 티로신 하이드록실라제(TH*) 유전자(TH의 피드백 조절과 관련된 N 말단 160개 아미노산이 결여되어 있음), 인간 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC), 및 인간 GTP-시클로하이드롤라제 1(CH1) 유전자의 절단된(truncated) 형태를 포함할 수 있다. 3개의 효소는 3개의 개별 오픈 리딩 프레임에서 레트로바이러스 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 벡터는 제1 오픈 리딩 프레임에서 TH 및 CH1 효소의 융합을 제2 오픈 리딩 프레임에서 AADC 효소를 암호화할 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 발현 카세트는 하나 이상의 IRES 요소를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 뇌의 선조체(striatum)에 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 MYO7A 유전자를 광수용체에 도입하고 망막 색소 상피(RPE) 세포를 지지함으로써 어셔 1B 증후군과 관련된 시력 저하를 약화시키거나 역전시키도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 MYO7A 단백질을 암호화하는 MYO7A cDNA이다(길이가 100 mb가 넘는 큰 유전자). 큰 MYO7A 유전자의 발현은 CMV 프로모터, CMV/MYO7A 키메라 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술(vitrectomy) 후 직접 망막하(subretinal) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 ATP-결합 카세트 유전자 ABCA4(ABCR로도 알려짐)를 광수용체에 도입함으로써 스타가르트병을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 ABCA4 단백질을 암호화하는 ABCA4 cDNA이다. ABCA4 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나제와 같은 광수용체 특이적 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성(wet-form) 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관신생 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일 구현예에서 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현한다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀(bestrophin) 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 부종의 비정상적인 혈관 성장의 재발을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관신생 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일 구현예에서 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현한다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 이식 전에 항-혈관신생 유전자(들)를 공여자 각막에 전달함으로써 신혈관신생(neovascularization)의 결과로서 각막 이식 거부를 예방하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G, 에볼라 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 각막 이식편에 생체 외 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자와 같은 항-혈관신생 유전자(들)을 발현할 것이다. 레트로바이러스 벡터는 생체 외에서 각막 이식편 조직에 적용될 수 있으며, 형질도입된 공여자 조직은 또한 이식 전에 보관될 수 있다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터와 같은 구성적 프로모터에 의해 구동될 수 있다; 그러나 대체 프로모터가 사용될 수도 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 fms-유사 티로신 키나제의 가용성 형태(가용성 Flt-1)를 암호화하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 가용성 Flt-1 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 색소 상피 유래 인자 단백질(PEDF)을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. PEDF 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제제, 예컨대 항-VEGF 항체 또는 이의 결합 단편(예: 애플리버셉트), VEGF 특이적 앱타머(aptamer) 또는 VEGF 수용체의 가용성 형태를 포함하지만 이에 국한되지 않는 VEGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드, 및/또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)의 억제제, 예컨대 항-PDGF 항체 또는 그의 결합 단편, PDGF 특이적 앱타머 또는 PDGF 수용체의 가용성 형태를 포함하지만 이에 국한되지 않는 PDGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일 구현예에서 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 VEGF의 억제제 및 PDGF의 억제제를 발현한다. 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 유전자 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 및 VMD2의 질병 관련 형태에 특이적인 마이크로-RNA(miRNA)를 암호화하는 카세트, 또는 교정 페리페린 2(Peripherin 2) 암호화 RDS 유전자 및 RDS의 질병 관련 형태에 특이적인 miRNA를 암호화하는 카세트를 망막 색소 상피 세포에 도입함으로써 베스트(Best)병 또는 베스트 난황 황반 변성(BVMD)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 레틴알데히드 결합 단백질 1 유전자, RLBP1을 망막 색소 상피 세포에 도입함으로써 RLBP1-관련 망막 이영양증을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RLBP1 단백질을 암호화하는 RLBP1 cDNA이다. RLBP1 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 녹내장을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 안압을 낮추는 역할을 하는 COX-2 및/또는 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR)를 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 일 구현예에서 레트로바이러스 벡터는 눈의 전방(anterior chamber)으로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하는 바이시스트론 구성으로 COX-2 및 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR) 유전자를 발현한다. 유전자(들)의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 경각막(transcorneal) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 하모닌 유전자를 도입하여 어셔 증후군 1c를 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하모닌 단백질을 암호화하는 하모닌 cDNA이다. 하모닌 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 Rab 에스코트 단백질 1(REP1) 유전자를 도입하여 맥락막혈증을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 REP1 단백질을 암호화하는 REP1 cDNA이다. REP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 환형 뉴클레오티드 개폐형 채널 베타 2(CNGB2) 및/또는 환형 뉴클레오티드 개폐형 채널 알파 3(CNGA3) 유전자(들)를 눈에 도입하여 완전색맹(Achromatopsia)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자(들)은 CNGB2 및/또는 CNGA3 단백질을 암호화하는 CNGB2 및/또는 CNGA3 유전자(들)이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 CEP290 유전자를 눈에 도입하여 레버 선천성 흑암증(LCA)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 290 kDa의 중심체 단백질을 암호화하는 CEP290 유전자이다. CEP290 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 색소성 망막염(retinitis pigmentosa) GTPase 조절자(RPGR) 유전자를 눈에 도입하여 x-연관 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RPGR 단백질을 암호화하는 RPGR cDNA이다. RPGR 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 레티노스키신(retinoschisin) 1(RS1) 유전자를 눈에 도입하여 x-연관 망막층간분리증(retinoschisis)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RS1 단백질을 암호화하는 RS1 cDNA이다. RS1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 색소성 망막염 1(RP1) 유전자를 눈에 도입하여 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RP1 단백질을 암호화하는 RP1 cDNA이다. RP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나제와 같은 광수용체 특이적 프로모터, 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65) 유전자를 도입하여 레버 선천적 흑암증(LCA) 2형을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RPE65 단백질을 암호화하는 RPE65 cDNA이다. RPE65 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 인간 프롤린/아르기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복 단백질(PRELP) 유전자를 도입하여 습성 연령 관련 황반 변성(AMD), 건성 AMD, 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 PRELP 단백질을 암호화하는 PRELP cDNA이다. PRELP 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 합성 미오실린(myocilin)-특이적 miRNA를 암호화하는 핵산 서열을 눈에 도입하여 미오실린의 발현을 녹다운함으로써 소아 개방각 녹내장을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 합성 미오실린-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 글루타티온 생합성 경로로부터의 속도-제한 효소(들), 글루타메이트-시스테인 리가제(GCL) 및/또는 글루타티온 합성효소(GSS), 및/또는 합성 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT) 특이적 miRNA를 암호화하는 핵산 서열을 눈에 도입하여 유전자 증대 및/또는 녹다운에 의해 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. GCL 및/또는 GSS 유전자(들) 및/또는 합성 GGT 특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 멀티시스트론 구성으로 유전자(들) 및/또는 합성 miRNA를 발현할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 전방에 직접 전달함으로써 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 신경퇴행성 장애, 예컨대 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 운동 뉴런 장애, 예컨대 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 VEGF 단백질을 암호화하는 유전자를 전달하며; 이는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 이소형일 수 있고; 또는 VEGF-B, VEGF-C 또는 VEGF-D일 수 있으며, 이러한 유전자는 신경보호 효과를 갖는다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, 광견병 G(Rabies G) 또는 VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 큰 근육군에 직접 주사하거나 척수강내 또는 뇌실내 주사를 통해 뇌척수액에 직접 주사하여 투여할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 낭포성 섬유증을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR)를 암호화하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, 독감-HA, 센다이 바이러스 외피 F 또는 HN, 에볼라, 배큘로바이러스 GP64 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 비강 내로, 네뷸라이저를 사용하여, 또는 기관지 폐포 세척을 통해 폐로 직접 전달하여 투여할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(SGSH) 및/또는 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 유전자(들)를 뇌에 도입하여 산필리포 증후군 A를 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자(들)은 SGSH 단백질을 암호화하는 SGSH cDNA 및/또는 SUMF1 단백질을 암호화하는 SUMF1 유전자이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 SGSH 및 SUMF1 유전자를 발현할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 직접적인 뇌내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 산-알파 글리코시다제(GAA) 유전자를 큰 근육군 및/또는 폐에 도입하여 폼페병을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 이 레트로바이러스 벡터는 GAA 단백질을 암호화하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, 독감-HA, 센다이 바이러스 외피 F 또는 HN, 에볼라, 배큘로바이러스 GP64, 광견병 G, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 (i) 큰 근육군에 직접 주사 및/또는 (ii) 비강 내로, 네뷸라이저를 사용하여, 또는 기관지 폐포 세척을 통해 폐로 직접 전달하여 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 CD19-특이적 키메라 항원 수용체(CAR19)를 암호화하는 핵산 서열로 자가 또는 동종이계(allogeneic) T 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 T 세포를 대상체에 주입하여 CD19를 발현하는 암 및 백혈병을 치료한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. CAR 암호화 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열로 자가 또는 동종이계 T 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 T 세포를 대상체에 주입하여 5T4를 발현하는 암 및 백혈병을 치료한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 5T4 CAR 암호화 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 다양한 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)가 생산될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 생체외에서 임의의 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드에 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열로 자가 또는 동종이계 T 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 T 세포를 대상체에 주입하여 CAR이 결합하는 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드를 발현하는 암 및 백혈병을 치료한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. CAR 암호화 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 상기 CAR에 의해 표적화될 수 있는 적합한 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드는 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 메조텔린, 엽산(folate) 수용체 α, 면역글로불린의 카파 경쇄, CD30, 암배아 항원(CEA), CD138, 강글리오사이드 G2(GD2), CD33, CD22, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 예컨대 EGFR VIII, IL-13Rα2, CD20, ErbB 예컨대 Her2, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 루이스 Y 항원 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAB).
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 생체외에서 질병, 백혈병 또는 암 세포에서 발현되는 펩티드-MHC에 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산 서열로 자가 또는 동종이계 T 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질감염된 T 세포를 대상체에 주입하여 TCR이 결합하는 펩티드-MHC의 발현과 관련된 질병, 암 또는 백혈병을 치료한다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. TCR 암호화 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 벡터에 의해 암호화되는 TCR은 단일쇄 TCR(scTCR) 또는 이량체 TCR(dTCR)일 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이 적합한 dTCR은 WO 2003/020763에 기재된 것을 포함하고 적합한 scTCR은 WO 1999/018129에 기재된 것을 포함한다. 이 구현예의 특정 측면에서, TCR로 형질감염된 T 세포는 AIDS, 백혈병, 및 골수종 및 육종을 비롯한 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 공통 감마 사슬(CD132)을 암호화하는 유전자를 도입하여 x-연관 중증 복합 면역결핍증(SCID)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 골수 줄기 세포를 대상체에 주입하여 질병을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 아데노신 데아미나제를 암호화하는 유전자를 도입하여 ADA 중증 복합 면역결핍증(SCID)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 골수 줄기 세포를 대상체에 주입하여 질병을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 비스콧-알드리치 증후군(WAS) 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하여 비스콧-알드리치 증후군(WAS)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 골수 줄기 세포를 대상체에 주입하여 질병을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 야생형 β-글로빈, 야생형 태아 글로빈, 및 돌연변이된 "항-겸상(anti-sickling)" 글로빈을 포함하는 여러 글로빈 중 하나를 암호화하는 유전자를 도입하여 겸상 적혈구병(Sickle Cell disease) 또는 지중해 빈혈을 치료하는 데 사용될 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 항-겸상 글로빈의 예는 WO 2014/043131 및 WO 1996/009385에 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 골수 줄기 세포를 대상체에 주입하여 질병을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 유전자 인자 VIII를 간, 근육 또는 지방 세포에 도입하여 A형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인자 VIII이다. 인자 VIII 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 교정 유전자 인자 IX를 간, 근육 또는 지방 세포에 도입하여 B형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인자 IX이다. 인자 IX 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 알파 갈락토시다제 A(α-GAL A)를 암호화하는 유전자를 도입하여 파브리병을 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 α-GAL A 단백질을 암호화하는 GLA cDNA이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 조혈 CD34+ 줄기 세포를 형질도입하기 위해 생체외에서 사용될 수 있다. 그런 다음 이러한 형질도입된 조혈 CD34+ 줄기 세포를 대상체에 주입하어 질병을 치료할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 결핍된 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 포르피린증(porphyria)의 한 형태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하기 표에서 선택되는 치료할 포르피린증 유형과 관련된 결핍 효소를 암호화하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure pct00001
또 다른 구현예에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 결핍된 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 점액다당류증의 한 형태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 또는 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자가 비활성화 최소 렌티바이러스 벡터로, VSV-G 또는 대체 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하기 표에서 선택되는 치료할 점액다당류증 유형과 관련된 결핍 효소를 암호화하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure pct00002
레트로바이러스 치료 벡터의 생산
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 4개의 플라스미드로 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산될 수 있다:
(1) 요구되는 전이유전자(들) 및 본 발명의 핵산 서열을 암호화하는 재조합 레트로바이러스 벡터 게놈 플라스미드,
(2) 합성 레트로바이러스 gag/pol 발현 플라스미드,
(3) 예를 들어 VSV-G를 발현할 수 있는 외피(env) 발현 플라스미드, 및
(4) RNA-결합 단백질 발현 플라스미드.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터, 예컨대 HIV는 5개의 플라스미드로 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산될 수 있다:
(1) 요구되는 전이유전자(들), 본 발명의 핵산 서열, 및 RRE 서열을 암호화하는 재조합 HIV 벡터 게놈 플라스미드,
(2) 합성 gag/pol 발현 플라스미드,
(3) 예를 들어 VSV-G를 발현할 수 있는 외피(env) 발현 플라스미드, 및
(4) RNA-결합 단백질 발현 플라스미드, 및
(5) REV 발현 플라스미드.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터, 예컨대 HIV는 바이러스 벡터의 생산에 필요한 구성요소 및 TRAP를 암호화하는 적어도 하나의 모듈식 작제물로 HEK293T 세포의 일시적 형질감염에 의해 생산될 수 있으며, 여기서 바이러스 게놈은 본 발명의 핵산 서열을 포함한다. 적합한 모듈식 작제물은 EP3502260A에 기재된 것들을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대안적으로 일시적 형질감염 시스템은 TRAP를 안정적으로 발현하는 세포주를 이용할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 (1) gag/pol, (2) env 및 (3) TRAP, 및 HIV 벡터의 경우 Rev를 안정적으로 발현하는 패키징 세포를 사용하여 생산될 수 있으며, 여기서 요구되는 전이유전자(들) 및 본 발명의 핵산 서열, 그리고 HIV 벡터의 경우 RRE 서열을 포함하여 이들을 암호화하는 재조합 레트로바이러스 벡터 게놈을 암호화하는 플라스미드는 일시적 형질감염에 의해 이러한 세포 내로 도입된다.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 (1) gag/pol, (2) env, (3) TRAP, (4) 요구되는 전이유전자(들) 및 본 발명의 핵산 서열을 암호화하는 재조합 EIAV 벡터 게놈을 안정적으로 발현하는 생산자 세포에서 생산될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 HIV 벡터는 (1) gag/pol, (2) env, (3) TRAP, (4) 요구되는 전이유전자(들), 본 발명의 핵산 서열, 및 RRE 서열을 암호화하는 재조합 HIV 벡터 게놈, 및 (5) REV를 안정적으로 발현하는 생산자 세포에서 생산될 수 있다.
AAV 치료 벡터
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 파킨슨병을 치료하기 위해 도파민 합성 경로의 3가지 효소를 암호화하는 3가지 유전자를 도입하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인간 티로신 하이드록실라제(TH*) 유전자(TH의 피드백 조절과 관련된 N 말단 160개 아미노산이 결여되어 있음), 인간 방향족 L-아미노산 데카르복실라제(AADC), 및 인간 GTP-시클로하이드롤라제 1(CH1) 유전자의 절단된 형태를 포함할 수 있다. 3개의 효소는 3개의 개별 오픈 리딩 프레임에서 AAV 벡터에 의해 암호화될 수 있다. 대안적으로, AAV 벡터는 제1 오픈 리딩 프레임에서 TH 및 CH1 효소의 융합을 제2 오픈 리딩 프레임에서 AADC 효소를 암호화할 수 있다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 발현 카세트는 하나 이상의 IRES 요소를 포함할 수 있다. AAV 벡터는 뇌의 선조체에 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 MYO7A 유전자를 광수용체에 도입하고 망막 색소 상피(RPE) 세포를 지지함으로써 어셔 1B 증후군과 관련된 시력 저하를 약화시키거나 역전시키도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 MYO7A 단백질을 암호화하는 MYO7A cDNA이다(길이가 100 mb가 넘는 큰 유전자). 큰 MYO7A 유전자의 발현은 CMV 프로모터, CMV/MYO7A 키메라 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 ATP-결합 카세트 유전자 ABCA4(ABCR로도 알려짐)를 광수용체에 도입함으로써 스타가르트병을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 ABCA4 단백질을 암호화하는 ABCA4 cDNA이다. ABCA4 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나제와 같은 광수용체 특이적 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관신생 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 구현예에서 AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현한다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 이식 전에 항-혈관신생 유전자(들)를 공여자 각막에 전달함으로써 신혈관신생의 결과로서 각막 이식 거부를 예방하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 일 구현예에서, AAV 벡터는 각막 이식편에 생체 외 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자와 같은 항-혈관신생 유전자(들)을 발현할 것이다. AAV 벡터는 생체 외에서 각막 이식편 조직에 적용될 수 있으며, 형질도입된 공여자 조직은 또한 이식 전에 보관될 수 있다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터와 같은 구성적 프로모터에 의해 구동될 수 있다; 그러나 대체 프로모터가 사용될 수도 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 fms-유사 티로신 키나제의 가용성 형태(가용성 Flt-1)를 암호화하는 유전자를 전달한다. 가용성 Flt-1 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 색소 상피 유래 인자 단백질(PEDF)을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. PEDF 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD), 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하고, 및/또는 건성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제제, 예컨대 항-VEGF 항체 또는 그의 결합 단편(예: 애플리버셉트), VEGF 특이적 앱타머 또는 VEGF 수용체의 가용성 형태를 포함하지만 이에 국한되지 않는 VEGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드, 및/또는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)의 억제제, 예컨대 항-PDGF 항체 또는 그의 결합 단편, PDGF 특이적 앱타머 또는 PDGF 수용체의 가용성 형태를 포함하지만 이에 국한되지 않는 PDGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 구현예에서 AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 VEGF의 억제제 및 PDGF의 억제제를 발현한다. 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 유전자 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 및 VMD2의 질병 관련 형태에 특이적인 마이크로-RNA(miRNA)를 암호화하는 카세트, 또는 교정 페리페린 2 암호화 RDS 유전자 및 RDS의 질병 관련 형태에 특이적인 miRNA를 암호화하는 카세트를 망막 색소 상피 세포에 도입함으로써 베스트병 또는 베스트 난황 황반 변성(BVMD)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 레틴알데히드 결합 단백질 1 유전자, RLBP1을 망막 색소 상피 세포에 도입함으로써 RLBP1-관련 망막 이영양증을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RLBP1 단백질을 암호화하는 RLBP1 cDNA이다. RLBP1 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 녹내장을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 COX-2 및/또는 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR)를 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 구현예에서 AAV 벡터는 눈의 전방으로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하는 바이시스트론 구성으로 COX-2 및 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR) 유전자를 발현한다. 유전자(들)의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 경각막 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 하모닌 유전자를 도입하여 어셔 증후군 1c를 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하모닌 단백질을 암호화하는 하모닌 cDNA이다. 하모닌 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 Rab 에스코트 단백질 1(REP1) 유전자를 도입하여 맥락막혈증을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 REP1 단백질을 암호화하는 REP1 cDNA이다. REP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 환형 뉴클레오티드 개폐형 채널 베타 2(CNGB2) 및/또는 환형 뉴클레오티드 개폐형 채널 알파 3(CNGA3) 유전자(들)를 눈에 도입하여 완전색맹을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자(들)은 CNGB2 및/또는 CNGA3 단백질을 암호화하는 CNGB2 및/또는 CNGA3 유전자(들)이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 CEP290 유전자를 눈에 도입하여 레버 선천성 흑암증(LCA)을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 290 kDa의 중심체 단백질을 암호화하는 CEP290 유전자이다. CEP290 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 색소성 망막염 GTPase 조절자(RPGR) 유전자를 눈에 도입하여 x-연관 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RPGR 단백질을 암호화하는 RPGR cDNA이다. RPGR 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 레티노스키신(retinoschisin) 1(RS1) 유전자를 눈에 도입하여 x-연관 망막층간분리증을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RS1 단백질을 암호화하는 RS1 cDNA이다. RS1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 색소성 망막염 1(RP1) 유전자를 눈에 도입하여 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RP1 단백질을 암호화하는 RP1 cDNA이다. RP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나제와 같은 광수용체 특이적 프로모터, 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65) 유전자를 도입하여 레버 선천적 흑암증(LCA) 2형을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 RPE65 단백질을 암호화하는 RPE65 cDNA이다. RPE65 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 인간 프롤린/아르기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복 단백질(PRELP) 유전자를 도입하여 습성 연령 관련 황반 변성(AMD), 건성 AMD, 당뇨병성 황반 부종 또는 망막 정맥 폐색을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 PRELP 단백질을 암호화하는 PRELP cDNA이다. PRELP 유전자의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐) 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 합성 미오실린-특이적 miRNA를 암호화하는 핵산 서열을 눈에 도입하여 미오실린의 발현을 녹다운함으로써 소아 개방각 녹내장을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 합성 미오실린-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 글루타티온 생합성 경로로부터의 속도-제한 효소(들), 글루타메이트-시스테인 리가제(GCL) 및/또는 글루타티온 합성효소(GSS), 및/또는 합성 감마-글루타밀트랜스퍼라제(GGT) 특이적 miRNA를 암호화하는 핵산 서열을 눈에 도입하여 유전자 증대 및/또는 녹다운에 의해 색소성 망막염을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. GCL 및/또는 GSS 유전자(들) 및/또는 합성 GGT 특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 구현예에서, AAV 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 멀티시스트론 구성으로 유전자(들) 및/또는 합성 miRNA를 발현할 수 있다. AAV 벡터는 눈의 전방에 직접 전달함으로써 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 신경퇴행성 장애, 예컨대 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 운동 뉴런 장애, 예컨대 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 VEGF 단백질을 암호화하는 유전자를 전달하며; 이는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 이소형일 수 있고; 또는 VEGF-B, VEGF-C 또는 VEGF-D일 수 있으며, 이러한 유전자는 신경보호 효과를 갖는다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 큰 근육군에 직접 주사하거나 척수강내 또는 뇌실내 주사를 통해 뇌척수액에 직접 주사하여 투여할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 낭포성 섬유증을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 낭포성 섬유증 막관통 전도도 조절자(CFTR)를 암호화하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 비강 내로, 네뷸라이저를 사용하여, 또는 기관지 폐포 세척을 통해 폐로 직접 전달하여 투여할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 N-설포글루코사민 설포하이드롤라제(SGSH) 및/또는 설파타제 변형 인자 1(SUMF1) 유전자(들)를 뇌에 도입하여 산필리포 증후군 A를 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자(들)은 SGSH 단백질을 암호화하는 SGSH cDNA 및/또는 SUMF1 단백질을 암호화하는 SUMF1 유전자이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 구현예에서, AAV 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 SGSH 및 SUMF1 유전자를 발현할 수 있다. AAV 벡터는 직접적인 뇌내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 산-알파 글리코시다제(GAA) 유전자를 큰 근육군 및/또는 폐에 도입하여 폼페병을 유발하는 병태생리학을 약화시키거나 역전시키는 데 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 GAA 단백질을 암호화하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 (i) 큰 근육군에 직접 주사 및/또는 (ii) 비강 내로, 네뷸라이저를 사용하여, 또는 기관지 폐포 세척을 통해 폐로 직접 전달하여 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 유전자 인자 VIII를 간, 근육 또는 지방 세포에 도입하여 A형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인자 VIII이다. 인자 VIII 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 교정 유전자 인자 IX를 간, 근육 또는 지방 세포에 도입하여 B형 혈우병을 치료하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 인자 IX이다. 인자 IX 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 결핍된 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 포르피린증의 한 형태를 치료하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하기 표에서 선택되는 치료할 포르피린증 유형과 관련된 결핍 효소를 암호화하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure pct00003
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 결핍된 효소를 암호화하는 유전자를 도입하여 점액다당류증의 한 형태를 치료하는 데 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 운반되는 유전자는 하기 표에서 선택되는 치료할 점액다당류증 유형과 관련된 결핍 효소를 암호화하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure pct00004
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성 연령 관련 황반변성(AMD) 환자의 눈에서 부종의 비정상적인 혈관 성장의 재발을 방지하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관신생 단백질 또는 단백질들을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 구현예에서 AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포로의 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성으로 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현한다. 항-혈관신생 유전자(들)의 발현은 CMV, RPE 특이적 프로모터, 예컨대 난황 황반 이영양증 2(VMD2) 프로모터(보다 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려짐), 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제술 후 직접 망막하 주사에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 AAV 벡터는 신경퇴행성 장애, 예컨대 전두측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 운동 뉴런 장애, 예컨대 근위축성 측삭 경화증(ALS)을 치료하도록 설계된 유전자 치료 제품으로서 사용될 수 있다. 이 AAV 벡터는 VEGF 단백질을 암호화하는 유전자를 전달하며; 이는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 이소형일 수 있고; 또는 VEGF-B, VEGF-C 또는 VEGF-D일 수 있으며, 이러한 유전자는 신경보호 효과를 갖는다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대체 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 뇌실내 또는 척수강내 주사를 통해 척수를 목욕시키는 뇌척수액으로의 직접 주사에 의해 투여될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
본원에서 치료에 대한 모든 언급은 치유적, 완화적(palliative) 및 예방적 치료를 포함하며; 다만 본 발명의 맥락에서 예방에 대한 언급은 보다 일반적으로 예방적 치료와 관련된다는 것이 이해되어야 한다. 치료는 질병 진행을 예방하거나 늦추는 것도 포함할 수 있다. 포유동물의 치료가 특히 바람직하다. 인간 및 수의학적 치료 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자는 백신으로서 사용하기 위한 것일 수 있다. 백신은 예를 들어 인간 또는 수의학용 바이러스 기반 백신(예: 인플루엔자 및 뉴캐슬병 바이러스 백신)일 수 있다.
본 발명은 전이유전자를 보유하는 변형된 컴피턴트(competent) 바이러스를 기반으로 하는 백신인 경우에 특히 유용할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 조류 생산 세포는 백신으로 사용하기 위한 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자의 생산에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직을 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 치료학적 유효량의 벡터를 포함하는, 유전자 요법에 의해 개체를 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 약제학적 조성물은 인간 또는 동물용일 수 있다.
조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 애쥬번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 관행과 관련하여 이루어질 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하거나, 또는 이에 더하여 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들) 및 표적 부위로의 벡터 진입을 돕거나 증가시킬 수 있는 기타 담체 제제(예컨대 예를 들어 지질 전달 시스템)를 포함할 수 있다.
적절한 경우, 조성물은 흡입; 좌약 또는 페서리(pessary)의 형태로; 로션, 용액, 크림, 연고 또는 더스팅 분말 형태로 국소적으로; 피부 패치를 사용하여; 전분 또는 락토스와 같은 부형제를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독으로 또는 부형제와 혼합하여 캡슐 또는 난자(ovules)로, 또는 향미제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액 형태로 경구적으로 임의의 하나 이상에 의해 투여될 수 있고; 또는 이들은 비경구적으로, 예를 들어 해면체내(intracavernosally), 정맥내, 근육내, 두개내(intracranially), 안구내 또는 피하로 주사될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 조성물은 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있으며 이는 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성으로 만들기에 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있다. 협측(buccal) 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 벡터는 또한 생체외에서 표적 세포 또는 표적 조직을 형질도입시킨 후 상기 표적 세포 또는 조직을 이를 필요로 하는 환자에게 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 세포의 예는 자가(autologous) T 세포일 수 있고 이러한 조직의 예는 공여자 각막일 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 측면은 핵산 결합 부위에 작동가능하게 연결된 경우 바이러스 벡터 생산 세포에서 관심 뉴클레오티드의 번역이 억제되거나 방지되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 부위 및/또는 동족 핵산 결합 단백질을 확인하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 방법은 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 핵산 결합 부위 및 핵산 결합 단백질 모두를 포함하는 세포에서 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함한다.
방법은 본 발명에서 유용한 새로운 RNA-결합 단백질 및 이들의 상응하는 결합 부위의 식별을 허용할 수 있다. 방법은 또한 알려진 RNA-결합 단백질 또는 결합 부위의 변이체의 식별을 허용할 수 있다.
일 구현예에서, 방법은 TRAP와 상호작용하는 결합 부위의 식별을 허용한다.
또 다른 구현예에서, 방법은 TRAP에 결합할 수 있는 결합 부위와 상호작용하는 핵산 결합 단백질의 식별을 허용한다.
일 구현예에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 암호화한다.
또 다른 구현예에서, 리포터 유전자는 양성 세포 성장 선택 마커, 예를 들어 Zeocin™에 대한 세포 내성을 가능하게 하는 sh ble 유전자 산물을 암호화한다.
또 다른 구현예에서, 리포터 유전자는 음성 세포 성장 선택 마커, 예를 들어 간시클로비르의 존재 하에 세포 사멸을 유발하는 HSV 티미딘 키나제 유전자 산물을 암호화한다.
개선된 기능을 위한 TRAP 결합 부위(tbs)를 스크리닝하는 예는 다음과 같을 수 있다:
o 서열 KAGNN의 8-11개 반복부 또는 KAGNN 및 KAGNNN의 총 8-11개 반복부를 포함하는 축퇴 DNA 라이브러리를 합성한다.
o GFP와 같은 리포터 유전자 카세트의 5' UTR 내에 라이브러리를 클로닝한다(바람직하게는 ORF의 12개 뉴클레오티드 내). 라이브러리-연결된 리포터 유전자는 선택적으로 레트로바이러스 벡터 게놈 및 생산된 레트로바이러스 벡터 라이브러리 내로 클로닝될 수 있다.
o 라이브러리-연결된 리포터 유전자 카세트를 세포주에 안정적으로 도입하고(이는 형질감염 또는 레트로바이러스 벡터 전달을 통해 달성할 수 있음) 단일 클론을 분리한다.
o 대조 DNA(예: pBlueScript) 또는 TRAP-발현 플라스미드 DNA를 사용한 병렬 형질감염으로 클론을 스크리닝한다. 두 시나리오 모두에서 리포터 유전자 발현을 측정하고, 높은 억제되지 않는 리포터 유전자 수준을 갖는 클론(대조군) 및 낮은 억제된 리포터 유전자 수준을 갖는 클론(TRAP)을 식별한다.
o PCR 증폭을 통해 tbs 서열을 식별하고 후보 클론의 표적 세포 게놈 DNA로부터 tbs 서열을 시퀀싱한다.
본 발명은 이제 실시예를 통해 추가로 설명될 것이며, 이는 당업자가 본 발명을 수행하는 데 도움을 주기 위한 것이며 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 수많은 서로 다른 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 축퇴의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 것이 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다. 또한, 통상의 기술자가 일상적인 기술을 사용하여 본 발명에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 치환을 수행하여 본 발명에서 사용하기 위한 폴리펩티드가 발현될 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영할 수 있다는 것을 이해하여야 한다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
DNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 이용가능한 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 표준 기술에 의해 클로닝될 수도 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 생산될 것이다. 이것은 클로닝하고자 하는 표적 서열을 플랭킹하는 한 쌍의 프라이머(예: 약 15-30개 뉴클레오티드)를 만들고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포로부터 수득한 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 원하는 영역을 증폭시키는 조건에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하고, 증폭된 단편을 분리하고(예: 반응 혼합물을 아가로스 겔로 정제함으로써), 그리고 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 적절한 제한 효소 인식 부위를 포함하도록 설계될 수 있다.
단백질
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 단일 사슬 폴리펩티드 분자 뿐만 아니라 개개의 구성 폴리펩티드가 공유 또는 비공유 수단에 의해 연결된 다중 폴리펩티드 복합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 단량체가 아미노산이고 이들이 펩티드 또는 이황화 결합을 통해 함께 연결된 폴리머를 지칭한다.
변이체 , 유도체, 유사체, 상동체 (homologue) 및 단편
본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본 발명은 또한 그의 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 단편의 사용을 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 임의의 주어진 서열의 변이체란 해당 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 내인성 기능 중 적어도 하나를 유지하는 방식으로 잔기(아미노산 잔기이든 핵산 잔기이든)의 특정 서열이 변형된 서열이다. 변이체 서열은 천연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 부가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 생성된 단백질 또는 폴리펩티드가 그의 내인성 기능 중 적어도 하나를 유지하는 것을 제공하는, 서열로부터 또는 서열에 대하여 하나(또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 부가를 포함한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 임의의 모방체(mimetic), 즉 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 보유하는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 아미노산 치환은 변형된 서열이 필요한 활성 또는 능력을 유지한다면, 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 비-천연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 단백질은 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 또한 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양전하를 띤 아미노산에는 라이신 및 아르기닌이 포함되고; 유사한 친수성 값을 갖는 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 가지는 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신이 포함된다.
보존적 치환이, 예를 들어 하기 표에 따라, 이루어질 수 있다. 두 번째 컬럼의 동일한 블록에 있는 아미노산, 그리고 바람직하게는 세 번째 컬럼의 동일한 라인에 있는 아미노산은 서로 치환될 수 있다:
Figure pct00005
용어 "상동체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 일정한 상동성을 가지는 엔터티를 의미한다. "상동성"이라는 용어는 "동일성"과 동일시될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 전형적으로, 상동체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 가지는 아미노산 잔기)의 측면에서도 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서는 서열 동일성의 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 발명의 맥락에서, 상동성 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 상동성은 유사성의 측면에서도 고려될 수 있지만, 본 발명의 맥락에서는 서열 동일성의 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 눈으로, 또는 보다 일반적으로 쉽게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행할 수 있다. 이러한 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 퍼센트 상동성 또는 동일성을 계산할 수 있다.
퍼센트 상동성은 연속적인 서열에 대해 계산될 수 있다. 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 한 서열의 각 아미노산은 한 번에 한 잔기씩 다른 서열의 상응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이것을 "ungapped(갭이 없는)" 정렬이라고 한다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 상대적으로 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이것은 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어, 그렇지 않으면 동일한 쌍의 서열에 있어서, 뉴클레오티드 서열의 1개의 삽입 또는 결실로 인해 다음 코돈들을 정렬에서 벗어나게 하고, 따라서 전역(global) 정렬이 수행될 때 퍼센트 상동성이 크게 감소하는 결과를 잠재적으로 초래할 수 있다는 점을 고려하지 못한다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 점수에 부당한 불이익을 주지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계된다. 이것은 로컬 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당함으로써, 동일한 아미노산이 동일한 개수인 경우, 2개의 비교된 서열 간의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 가지는 서열 정렬이 많은 갭을 가지는 서열 정렬에 비하여 더 높은 점수를 얻게 한다. "아핀 갭 비용(Affine gap cost)"은 갭의 존재에 대해서는 상대적으로 높은 비용을 부과하고 갭 내의 각 후속 잔기에 대해서는 더 작은 패널티를 부과하는 데 전형적으로 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 패널티는 당연히 더 적은 갭을 가지는 최적화된 정렬을 생성한다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티를 수정하는 것을 허용한다. 그러나, 이러한 소프트웨어를 서열 비교에 사용할 때는 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용하는 경우 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12이고 각 확장에 대해 -4이다.
따라서 최대 퍼센트 상동성을 계산하기 위해서는 먼저 갭 패널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성하는 것이 필요한다. 이러한 정렬을 수행하는 데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예에는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 비교 도구 제품군(suite)이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA는 양자 모두 오프라인 및 온라인 검색에 사용할 수 있다(Ausubel et al. (1999) ibid, 페이지 7-58 내지 7-60 참조). 그러나, 일부 응용의 경우, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequences라고 하는 또 다른 도구는 단백질과 뉴클레오티드 서열을 비교하는 데도 사용할 수 있다(FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1):187-8 참조).
최종 퍼센트 상동성은 동일성의 측면에서 측정할 수 있지만, 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 all-or-nothing 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 각 쌍별 비교에 점수를 할당하는 척도화된 유사성 점수 매트릭스(scaled similarity score matrix)가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스로, 이는 BLAST 프로그램 제품군의 디폴트 매트릭스이다. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 값을 사용하거나 또는 제공되는 경우 사용자 지정 기호 비교 테이블을 사용한다(자세한 내용은 사용자 설명서 참조). 일부 응용의 경우, GCG 패키지에 대해 공개 디폴트 값을 사용하거나, 또는 다른 소프트웨어의 경우, BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면, 퍼센트 상동성, 바람직하게는 퍼센트 서열 동일성을 계산할 수 있다. 소프트웨어는 전형적으로 서열 비교의 일부로 이 작업을 수행하고 수치 결과를 생성한다.
"단편" 또한 변이체이고 이 용어는 전형적으로 기능적으로 또는 예를 들어 분석에서 관심 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서 "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
이러한 변이체는 부위-지정 돌연변이유발과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 삽입을 수행하고자 하는 경우, 삽입 부위의 어느 한 쪽의 자연 발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 플랭킹 영역과 함께 삽입을 암호화하는 합성 DNA를 만들 수 있다. 플랭킹 영역은 자연 발생 서열의 부위에 상응하는 편리한 제한 부위를 포함함으로써 서열이 적절한 효소(들)로 절단되고 합성 DNA가 절단부에 결찰될 수 있다. 그런 다음 DNA는 암호화된 단백질을 만들기 위해 본 발명에 따라 발현된다. 이들 방법은 DNA 서열의 조작을 위해 당업계에 공지된 수많은 표준 기술의 예시일 뿐이며 다른 공지된 기술도 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA-결합 단백질의 모든 변이체, 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 본 발명의 동족 결합 부위에 결합하는 능력을 유지할 것이다.
본 발명의 결합 부위의 모든 변이체, 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 동족 RNA-결합 단백질에 결합하는 능력을 유지할 것이다.
코돈 최적화
본 발명에서 사용되는 폴리뉴클레오티드(NOI 및/또는 벡터 생산 시스템의 구성요소 포함)는 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 WO 1999/41397 및 WO 2001/79518에서 이전에 설명되었다. 서로 다른 세포는 특정 코돈의 사용법이 다르다. 이러한 코돈 편향(bias)은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 풍부도의 편향에 대응한다. 서열의 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적 풍부도와 일치하도록 맞춤화함으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 같은 이유로, 상응하는 tRNA가 특정 세포 유형에서 드문 것으로 알려진 코돈을 의도적으로 선택하여 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가 수준의 번역 제어를 사용할 수 있다.
HIV 및 기타 렌티바이러스를 포함한 많은 바이러스는 많은 수의 희귀 코돈을 사용하며 일반적으로 사용되는 포유류 코돈에 해당하도록 이들을 변경하여 포유동물 생산 세포에서 관심 유전자, 예를 들어, NOI 또는 패키징 구성요소의 증가된 발현을 달성할 수 있다. 코돈 사용법 표는 포유동물 세포 뿐만 아니라 다양한 기타 유기체에 대해 당업계에 공지되어 있다.
바이러스 벡터 구성요소의 코돈 최적화는 여러 가지 다른 이점을 가진다. 그들의 서열의 변경으로 인해, 생산자 세포/패키징 세포에서 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 바이러스 입자의 패키징 구성요소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 RNA 불안정성 서열(INS)이 이들로부터 제거된다. 동시에, 패키징 구성요소에 대한 서열을 코딩하는 아미노산 서열은 서열에 의해 암호화된 바이러스 구성요소가 동일하게 유지되거나 또는 패키징 구성요소의 기능이 손상되지 않도록 적어도 충분히 유사하도록 유지된다. 렌티바이러스 벡터에서 코돈 최적화는 내보내기(export)에 대한 Rev/RRE 요구사항을 극복하여, 최적화된 서열이 Rev-독립적이 되게 한다. 코돈 최적화는 또한 벡터 시스템 내에서 서로 다른 작제물 간의(예를 들어 gag- pol 및 env 오픈 리딩 프레임에서 중첩되는 영역 간의) 상동 재조합을 감소시킨다. 따라서 코돈 최적화의 전반적인 효과는 바이러스 역가의 현저한 증가와 개선된 안전성이다.
일 구현예에서 INS와 관련된 코돈만이 코돈 최적화된다. 그러나, 훨씬 더 바람직하고 실용적인 구현예에서는, 서열은 전체적으로 코돈 최적화되며, 일부 예외, 예를 들어 gag- pol의 프레임시프트 부위를 포함하는 서열은 제외한다(하기 참조).
gag- pol 유전자는 gag- pol 단백질을 암호화하는 2개의 중첩되는 리딩 프레임을 포함한다. 두 단백질의 발현은 번역 동안 프레임시프트에 의존한다. 이 프레임시프트는 번역 동안 리보솜 "미끄러짐(slippage)"의 결과로 발생한다. 이 미끄러짐은 적어도 부분적으로는 리보솜을 지연시키는 RNA 2차 구조에 의해 발생하는 것으로 생각된다. 이러한 2차 구조는 gag- pol 유전자에서 프레임시프트 부위의 하류에 존재한다. HIV의 경우, 중첩 영역은 gag의 시작부분의 하류의 뉴클레오티드 1222(여기서 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A이다)에서부터 gag의 끝(nt 1503)까지 확장된다. 결과적으로, 프레임시프트 부위와 2개의 리딩 프레임의 중첩 영역에 걸쳐 있는 281 bp 단편은 바람직하게는 코돈 최적화되지 않는다. 이 단편을 유지하면 Gag-Pol 단백질을 보다 효율적으로 발현할 수 있다.
EIAV의 경우 중첩의 시작부분은 nt 1262(여기서 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A이다)인 것으로 간주되었다. 중첩의 끝은 nt 1461이다. 프레임시프트 부위와 gag-pol 중첩이 보존되는 것을 보장하기 위해, 야생형 서열은 nt 1156에서 1465까지 유지되었다.
예를 들어, 편리한 제한 부위를 수용하기 위해, 최적의 코돈 사용법으로부터 파생(derivation)이 적용될 수 있으며, 보존적 아미노산 변화가 Gag-Pol 단백질에 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 코돈 최적화는 약하게 발현된 포유동물 유전자에 기초한다. 세 번째 및 때로는 두 번째 및 세 번째 염기가 변경될 수 있다.
유전자 코드의 축퇴 특성으로 인해, 다수의 gag- pol 서열이 숙련된 작업자에 의해 달성될 수 있음이 이해될 것이다. 또한 코돈-최적화된 gag- pol 서열을 생성하기 위한 시작점으로 사용할 수 있는 많은 레트로바이러스 변이체가 설명되어 있다. 렌티바이러스 게놈은 매우 다양할 수 있다. 예를 들어, 여전히 기능하는 많은 유사 종(quasi-species)의 HIV-1이 있다. 이는 EIAV의 경우에도 마찬가지다. 이러한 변이체는 형질도입 과정의 특정 부분을 향상시키는 데 사용될 수 있다. HIV-1 변이체의 예는 http://hiv-web.lanl.gov 에서 Los Alamos National Security, LLC에서 운영하는 HIV 데이터베이스에서 찾을 수 있다. EIAV 클론의 세부사항은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 있는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스에서 찾을 수 있다.
코돈-최적화된 gag- pol 서열에 대한 전략은 모든 레트로바이러스와 관련하여 사용될 수 있다. 이는 EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 및 HIV-2를 포함한 모든 렌티바이러스에 적용된다. 또한 이 방법은 HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV 및 인간 내인성 레트로바이러스(HERV), MLV 및 기타 레트로바이러스로부터 유전자 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
코돈 최적화는 gag- pol 발현을 Rev-독립적으로 만들 수 있다. 그러나, 렌티바이러스 벡터에서 항-rev 또는 RRE 인자의 사용을 가능하게 하기 위해서는, 바이러스 벡터 생성 시스템을 완전히 Rev/RRE-독립적으로 만드는 것이 필요할 것이다. 따라서, 게놈 또한 변형되어야 한다. 이것은 벡터 게놈 구성요소를 최적화함으로써 달성된다. 유리하게는, 이러한 변형은 또한 생산자 및 형질도입된 세포 모두에서 모든 추가적인 단백질이 없는 보다 안전한 시스템의 생산을 유도한다.
표 1은 서열을 나타내며, 여기서 K는 T 또는 G일 수 있고, "R"은 서열의 해당 위치에서 퓨린(즉, A 또는 G)을 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "V"는 G, A, 또는 C로부터의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 하고, "N"은 서열의 해당 위치에서 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다. TRAP 결합 부위(tbs) 서열 또는 3' tbs 서열은 이탤릭체로 표시하였고, 다중 클로닝 부위(MCS)는 밑줄로 표시하였으며, Kozak 서열은 굵게 표시하였다.
표 1
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
실시예
실험 절차
DNA 클로닝
표준 분자 클로닝 기술에 의해 발현 작제물을 생성하였다; 전형적으로, 삽입물을 재합성(GeneArt)에 의해 또는 짧은 올리고 어댑터에 의해 생성하고 제한 효소 분해에 의해 리포터(GFP) 플라스미드에 삽입하여 표시된 작제물을 생성하였다. 약독화된 E. coli 균주의 표준 형질전환 및 성장에 의해 플라스미드 DNA를 생성하였다.
부착 세포 배양 및 형질감염
HEK293T 세포를 부착 모드에서 형질감염에 사용하였다 - 이는 전형적으로 바이러스 벡터 제조에 사용되고, 따라서 이의 사용은 관련 맥락에서 전이유전자 발현/억제를 모델링하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 10% 열-불활성화 소태아혈청(FBS)(Gibco), 2 mM L-글루타민(Sigma) 및 1% 비필수적 아미노산(NEAA)(Sigma)이 보충된 완전 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(Sigma))에서 유지하였다.
HEK293T 세포를 0.175 cm2 용기 면적당 완전 배지 mL당 3.5 × 105개 세포로 시딩하고, 약 24시간 후 하기의 플라스미드의 질량비를 사용하여 세포를 형질감염시켰다: '+TRAP' = 34.25 ng/cm2 리포터 플라스미드, 34.25 ng/cm2 pEF1α-TRAP1 및 68.5 ng/cm2 pBluescript; 'TRAP 없음' = 34.25 ng/cm2 리포터 플라스미드 및 102.8 ng/cm2 pBluescript. 형질감염은 제조사의 프로토콜(Life Technologies)에 따라 FreeStyle 무혈청 배지에서 DNA를 리포펙타민 2000CD와 혼합하여 매개하였다. 나트륨 부티레이트(Sigma)를 ~18시간 후에 10 mM 최종 농도로 5-6시간 동안 첨가한 후, 10 ml의 새로운 무혈청 배지로 형질감염 배지를 교체하였다. 형질감염 후 대략 2일에 GFP 발현(또는 대조군이 포함된 경우 루시퍼라제 발현이 표시됨)의 분석을 위해 세포를 취하였다.
현탁 세포 배양 및 형질감염
HEK293T 현탁 세포를 현탁 모드에서 형질감염에 사용하였다 - 이는 전형적으로 바이러스 벡터 제조에 사용되고, 따라서 이의 사용은 관련 맥락에서 전이유전자 발현/억제를 모델링하였다. 세포를 진탕 인큐베이터(190 RPM으로 설정된 25 mm 궤도)에서 37℃, 5% CO2에서 Freestyle + 0.1% CLC(Gibco)에서 성장시켰다. 세포를 무혈청 배지에서 mL당 8 × 105개 세포로 시딩하고 24시간 후 하기의 플라스미드의 mL당 질량(최종 배양 cvol) 비율을 사용하여 세포를 형질감염시켰다: '+TRAP' = 300 ng/mL 리포터 플라스미드, 300 ng/mL pEF1a-TRAP1 및 600 ng/mL pBluescript; 'TRAP 없음' = 300 ng/mL 리포터 플라스미드 및 900 ng/mL pBluescript. 형질감염은 제조사의 프로토콜(Life Technologies)에 따라 FreeStyle에서 DNA를 리포펙타민 2000CD와 혼합하여 매개하였다. 나트륨 부티레이트(Sigma)를 ~18시간 후에 10 mM 최종 농도로 첨가하였다. 형질감염 후 대략 2일에 GFP 발현(또는 대조군이 포함된 경우 루시퍼라제 발현이 표시됨)의 분석을 위해 세포를 취하였다.
GFP 발현 분석
Attune-NxT(Thermofisher)를 사용하여 유세포 분석을 위해 형질감염된 세포를 준비하고 GFP 발현의 백분율과 중앙 형광 강도(MFI)를 측정하였다. 각 실험에 대해, % GFP 및 MFI 값을 곱하여 상대적인 GFP 발현 점수를 제공하였다. 이 점수를 TRAP 공동-형질감염이 있거나 없는 조건과 비교하여 GFP 억제의 수준을 평가하였다.
루시퍼라제 분석
복제 배양에서, 실온에서 웰당 첨가된 100 ul의 1× 수동 용해 완충액(Passive Lysis Buffer)에서 세포를 인큐베이션하였다. 세포를 실온에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 용해물을 3x ~30 ul 분취량으로 분할하고 -80℃에서 동결하였다. 루시퍼라제 분석을 위해, 세포 용해물(PLB 중) 및 루시퍼라제 분석 시약(LAR)을 해동하고 실온으로 평형을 유지한 후 10 ul의 용해물을 백색 96 웰 플레이트에 형질감염시켰다. MLX 판독기를 사용하여 12초 판독 동안 80 ul LAR/반응을 사용하여 루시퍼라제 활성을 분석하였다. (SUM FLUORESCENT UNITS/READ TIME)을 사용하여 루시퍼라제 활성을 계산하였다.
실시예 1: 천연 프로모터 5'UTR 리더 서열과 비교하여 개선된 리더를 사용한 TRAP-tbs에 의한 보편적으로 강화된 억제의 입증.
TRIP 시스템을 다양한 프로모터(서로 다른 길이 및 조성의 다양한 천연 5'UTR을 함유함)에 적용할 때, TRAP에 의한 효율적인 억제를 제공하면서도 또한 (TRAP이 없는 경우) 우수한 'ON' 수준의 발현을 유지하기 위해서는 프로모터-UTR 컨텍스트 내에서 tbs 서열을 간단하게 적용할 수 있는 것이 바람직하다.
이 작업의 시초에는, tbs가 다양한 구성적 프로모터의 천연 UTR에 삽입될 때 TRAP-tbs에 의해 매개되는 달성 가능한 억제 수준이 무엇인지 알려지지 않았다. 이상적으로는, 천연 5'UTR 서열에 의해 지시될 수 있는 억제 수준의 잠재적인 변동성을 피하기 위해 선택한 프로모터를 수정할 때 tbs와 함께 단일의 보존된 5'UTR 리더 서열을 제공할 수 있는 것이 유리할 것이다. 놀랍게도, EF1α 프로모터의 첫 번째 엑손(서열번호 25)이 천연의 리더 서열을 포함하는 5'UTR 리더와 비교하여 TRAP에 의해 일관되게 우수한 수준의 전이유전자 억제를 제공하고, 이 리더는 또한 TRAP가 없는 경우 우수한 'ON' 수준의 전이유전자 발현을 제공한다는 것이 발견되었다(도 3).
EF1α 엑손의 처음 33nt - 본원에서 "L33 개선된 리더"라고 함 - 는 tbs의 상류 바로에 위치하였으며, 이 서열을 사용하여 하기 프로모터들의 천연 리더의 전체 5'UTR을 대체하였다: RSV, EF1α/EFS, 유비퀴틴/UBC, SV40, 인간 PGK 및 HSV TK(도 3A). CMV의 경우, L33 개선된 리더를 WO2015/092440에서 사용된 원래의 34nt 리더(본원에서 "원래 리더"라고 함)와 비교하였다. tbs를 또한 이종 NotI 부위에서 이러한 프로모터의 천연 5'UTR에 직접 클로닝하였다(서열에 대한 자세한 내용은 표 I-패널 I/II 참조). 이러한 GFP-암호화 작제물을 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시키고, GFP 발현을 형질감염 후 2일에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(% GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 3B).
데이터는 L33 개선된 리더가 테스트한 모든 구성적 프로모터에 대해 천연 5'UTR 리더보다 성능이 우수함을 보여준다. TRAP의 존재는 모든 tbs-함유 작제물에 대하여 측정가능한 억제를 매개하였으나 달성된 억제 수준은 L33 개선된 리더를 함유하는 작제물에 비해 천연 5'UTR-tbs 작제물에서는 좋지 않았다. 또한, L33 개선된 리더 함유 작제물에 대한 'ON' 발현 수준(TRAP이 없는 경우)은 일반적으로 천연 5'UTR-tbs 작제물보다 컸다. L33 개선된 리더는 CMV 프로모터에서 원래의 리더와 비슷한 수준으로 수행하였으며, 이는 TRAP에 의한 더 큰 억제 수준이 원래의 리더와 L33 개선된 리더 구성 모두에서 달성되었음을 나타낸다.
두 번째 개선된 리더 - 본원에서 "L12 개선된 리더"라고 함 - 는 L33 개선된 리더를 12nt(즉, EF1α 엑손 1의 처음 12nt)로 절단하여 생성하였으며, tbs와 Kozak 서열 사이에 MCS2.1 또는 MCS4.1 서열(아래 참조)을 포함하는 6개의 구성적 프로모터 함유 GFP 리포터 카세트로 클로닝하였다. 각각 pBlueScript(TRAP 없음) 또는 pEF1α-TRAP(TRAP)와 함께 리포터 플라스미드의 공동-형질감염에 의해 GFP 발현의 비-억제 또는 억제 수준에 대해 리포터를 테스트하였다. 형질감염된 HEK293T 세포(현탁액, 무혈청)를 형질감염 후 2일에 유세포 분석에 의해 분석하였고, GFP 발현 점수(% GFP × 중앙 형광 강도)를 생성하고 log-10으로 전환하였다(도 8).
데이터는 L12 개선된 리더가 L33 개선된 리더와 유사하게 수행하였음을 - TRAP-tbs에 의한 완전한 억제를 허용하며 GFP 수준이 배경 수준으로 억제되었음을 보여준다. 흥미롭게도 GFP의 'ON'(억제되지 않음/TRAP 없음) 수준은 사용된 프로모터에 따라 L12 또는 L33에서 약간 더 높았다. 예를 들어, 'ON' 수준이 EFS 작제물에서는 L12에서 더 컸지만, huPGK의 경우에는 L33 개선된 리더가 큰 'ON' 수준을 제공하였다.
이것은 TRIP 시스템을 다양한 프로모터와 함께 사용하는 것을 고려할 때 L12 또는 L33 중에서 선택할 수 있는 유연성을 허용하여, TRAP가 없을 때(즉, 벡터 형질도입된 세포에서) 유전자 발현 수준이 최대화되는 한편, 벡터 생산 동안 TRAP-tbs에 의해 달성되는 절대적 억제가 L12 또는 L33 개선된 리더에서 매우 우수할 것이라는 점을 알고 있다.
Figure pct00021
표 I: UTR -리더, tbs 및 MSC 변이체 서열
[패널 I] 개선된 리더와 비교하여 다양한 프로모터의 5'UTR-tbs 영역에서 테스트된 리더들. 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터는 WO2015/092440에 요약된 합성 리더 서열(원래의 리더)과 함께 이전에 사용되었으며, 이는 전형적으로 TRAP-tbs 복합체가 전이유전자 발현을 >100배 억제할 수 있게 한다. 테스트한 프로모터는 다음과 같다: Rous 육종 바이러스(RSV), 연장 인자 1α(EF1a), 유비퀴틴 C(UBC), 유인원 바이러스 40(SV40), (인간) 포스포글리세레이트 키나제(huPGK), 및 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제(hsvTK). EF1a 및 UBC 천연 5'UTR은 인트론의 스플라이싱-아웃에 의해 발생된 것으로, 그 결과 스플라이싱된 접합이 생성되고 이는 두 개의 굵은 GG 디뉴클레오티드로 서열에 표시됨을 유의하라. 또한 연구가 번역 수준에서 전이유전자의 발현/억제(TRAP-tbs에 의해 조절됨)에 초점을 맞추기 때문에, EF1a 및 UBC '긴' pre-mRNA 내의 인트론의 존재는 고려되지 않으며, 이는 이들이 스플라이싱된 mRNA에는 존재하지 않기 때문이라는 점을 유의해야 하며; 따라서 EF1a 프로모터는 인트론이 없는 '짧은' 변이체(EFS)와 직접 비교할 수 있으며, 마찬가지로 UBC는 '짧은' UBC 프로모터와 비교할 수 있다. EF1a 프로모터(인트론 함유)와 관련하여 본 발명의 추가의 변이체는 실시예 5에 기재되어 있다. 연구에서 평가된 구성적 프로모터는 천연 리더 서열(밑줄 친 부분)을 포함하는 5'UTR 리더를 보유하였으며, 그 다음에 NotI 부위를 포함하는 데까지 합성 서열이 뒤따르고; tbs 서열이 NotI 부위 바로 다음에 뒤따랐다. 개선된 리더 L33 및 L12는 EF1a 프로모터의 첫 번째 엑손에서 유래된 서열을 포함한다. [패널 II] TRAP-tbs에 의한 전이유전자(GFP) 억제 수준에 대한 UTR 리더 서열의 영향을 비교하기 위해 연구에서 주로 사용된 tbs 서열, 및 반-축퇴(semi-degenerate) tbs 컨센서스 서열. [패널 III] WO2015092440에서 사용된 MCS 없음(No MCS)과 비교하여 연구에서 평가된 다중 클로닝 부위 서열을 포함하는 서열. 밑줄 친 서열은 tbs의 3' 말단을 포함하고, 이탤릭체 서열은 제한 효소(RE) 부위를 포함하고(일부는 tbs와 코어 Kozak 서열 사이의 서열을 최소화하기 위해 서열 압축을 허용하도록 tbs와 중첩되고/거나 서로 중첩됨), 코어 Kozak 서열은 굵게 표시하였다.
실시예 2: 최적의 tbs-MCS-전이유전자 구성의 확인.
TRIP 시스템의 취급성(tractability)을 개선하기 위해 - 특히 '키트' 내에서 상용화를 위해 - 여러 다른 제한 효소(RE), 즉 다중 클로닝 부위(MCS)의 옵션을 통해 프로모터-5'UTR-tbs 서열을 포함하는 발현 카세트에 관심 전이유전자를 직접 클로닝하는 능력을 가질 수 있는 것이 바람직하다(도 2A 참조). 그러나, 5'UTR 리더 서열이 TRAP 매개 억제의 정도를 조절할 수 있고, ATG 개시 코돈에 대한 tbs의 근접성이 중요하다는 점을 감안할 때, 이 작업의 초기에는 TRAP 매개 억제를 유지하면서 얼마나 많은 RE 부위 및/또는 RE 부위의 어떤 조합을 사용할 수 있는지 여부가 명확하지 않았다.
또한, 추가의 요구사항은 전이유전자의 'ON' 수준(TRAP이 없는 경우)이 높은 것을 보장하는 것으로, 즉 효율적인 코어 Kozak 서열이 MCS와 ATG 내에서 또는 그 사이에서 유지되어야 한다. 이것은 여러 (중첩되는) RE 부위가 tbs에서부터 ATG까지 가능한 한 짧은 거리에 통합될 수 있도록 하는 한편(ATG에 대한 tbs의 근접성을 유지하기 위해), 또한 컨센서스 RVVATG의 효율적인 코어 Kozak 서열을 유지하도록 하는 서열 '압축'을 요구하였다. tbs와 전이유전자(이 경우 GFP)의 ATG 코돈 사이에 클로닝된 7개의 MCS 변이체의 디자인은 표 I-패널 III(서열; 서열번호 52-58) 및 도 4A에 보고되어 있다. 변이체 MCS2.1 내지 MCS4.4는 tbs와 ATG 코돈 사이에 비교적 짧은 거리(<15nt)를 보장하면서 tbs와 코어 Kozak 서열 사이에 점진적으로 더 많은 (중첩되는) RE 부위를 통합한다. 모든 경우에 최종 1-2 반복부의 컨센서스(KAGNN)를 방해하지 않고 tbs의 3' 말단과 중첩되는 SacI 또는 SpeI 부위를 배치하는 것이 가능하였다. NcoI 부위가 전이유전자 코어 Kozak 서열에 유지되는 경우 2 내지 4개의 RE 부위 또는 3 내지 5개의 RE 부위 사이에 도입된 MCS 변이체(ATG의 하류의 G에 따라 다름); 모든 MCS 변이체에 걸쳐 총 15개 RE 부위(NcoI를 포함하여 16개)를 이 맥락에서 MCS의 일부로 테스트하였으며, 또한 관찰된 어떠한 차이도 tbs 상류의 서열의 영향으로 인한 것이 아님을 보장하기 위해 실시예 1에 기재된 L33 개선된 리더를 사용하여 EFS 프로모터의 맥락에서 테스트하였다. 이러한 GFP-암호화 MCS 변이체(scAAV2 벡터 게놈 카세트 내에 클로닝됨)를 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시키고, GFP 발현을 형질감염 2일 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(% GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 4B).
데이터는 7개의 MCS 변이체 모두가 tbs와 ATG 코돈 사이에 MCS를 포함하지 않는(tbs와 ATG는 원래 리포터에서 9nt로 떨어져있다) 원래 리포터 작제물(더 강력한 CMV 프로모터에 의해 구동됨)과 유사한 수준으로 억제될 수 있음을 확인한다. 중요하게도, 7개의 변이체 중 6개는 원래 리포터 작제물과 비교하여 TRAP에 의한 더 나은 억제를 나타내었고, 변이체 MCS2.1, MCS4.1 및 MCS4.4는 'ON' 수준(TRAP가 없는 경우)에 거의 영향을 미치지 않으면서 감지할 수 없는 수준으로 억제되었다.
MCS2.1 및 MCS4.1 변이체를 추가로 검증하기 위해, 이러한 서열을 L33 개선된 리더와 함께 구성적 프로모터 - CMV, RSV, EFS, UBC, SV40, huPGK 및 HSVTK - 를 암호화하는 scAAV2 벡터 게놈 리포터 작제물에 클로닝하였다. 이러한 GFP-암호화 리포터 작제물을 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시켰고, GFP 발현을 형질감염 2일 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(%GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 5).
데이터는 MCS2.1 및 MCS4.1 변이체가 사용되는 프로모터와 상관없이 우수한 TRIP 억제 프로파일을 나타낸다는 것을 입증한다. 두 MCS 변이체 중 하나를 포함하는 작제물 세트 전체에 걸친 평균 배수 억제는 ~5000배였으며, 많은 작제물의 경우 분석에서 GFP 검출 한계에 가까웠다.
실시예 3: tbs- Kozak 접합의 최적화.
실시예 2에서 MCS 변이체의 시험은 tbs의 말단과 ATG 코돈 사이의 서열 컨텍스트가 또한 TRAP에 의해 달성되는 억제 정도에서 역할을 할 수 있음을 입증하였다. 또한, (WO2015092440의 원래 구성에 비해) 개선된 수준의 억제가 tbs의 3' 말단 내에 Kozak 서열을 '숨김'으로써 달성될 수 있다고 가정하였다(도 2B 참조). 이를 달성하려면, tbs의 말단 1-2 반복부 컨센서스(KAGNN)가 반드시 Kozak 서열과 부분적으로 중첩되어야 한다.
4개의 tbs-Kozak 변이체를 설계하였고(표 II-패널 I 참조) 도 6A에 표시된 대로 GFP 리포터 작제물에 클로닝하였다. 변이체 0, 1 및 2는 확장된 Kozak 서열(컨센서스 GNNRVVATG 준수)이 마지막 2개의 tbs 반복부 서열과 중첩되도록 설계한 반면, 변이체 3은 단지 마지막 tbs 반복부 서열과 중첩되도록 설계하였다. Kozak 서열이 마지막 tbs 반복부 서열의 3개 뉴클레오티드 하류인 원래의 리포터(즉, 중첩 없음)와 함께 이들 변이체를 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시키고, GFP 발현을 형질감염 2일 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(%GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 6B).
이러한 tbs-Kozak 변이체 중 2개를 scAAV2 벡터 게놈 발현 카세트 내에서 2개의 상이한 프로모터(EFS 및 huPGK)와 함께 테스트하고, tbs/Kozak 서열이 중첩되지 않는 tbs 함유 카세트와 비교하였다. 이러한 GFP 리포터 벡터 게놈 플라스미드를 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시키고, GFP 발현을 형질감염 2일 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(%GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 9). 중첩되지 않는 tbs/Kozak 변이체(원래 변이체 및 tbs와 Kozak 사이에 HpaI 부위를 포함하는 두 번째 변이체)는 50배 내지 100배 억제가 가능한 반면, 새로운 tbs-Kozak 변이체(tbs_V0 및 tbs_V3)는 이의 적어도 10배(500배 내지 3500배)만큼 억제되었다. 이들 tbs-Kozak 변이체는 또한 L33 또는 L12 개선된 리더가 EFS 또는 huPGK 프로모터 카세트에 사용되었을 때와 유사하게 수행하였다. 중요하게도, 새로운 변이체에 대한 'ON' 수준(TRAP이 없는 경우)은 중첩되지 않는 tbs/Kozak 변이체와 유사했으며, 이는 새로운 변이체 내의 Kozak 서열이 효율적인 번역을 지시하는 데 효과적임을 나타낸다.
데이터는 모든 tbs-Kozak 변이체가 유사한 수준의 'ON' 전이유전자 발현이 가능함을 나타내며, 이는 Kozak 서열이 번역 개시의 효율적인 수준을 지시한다는 것을 보여준다. 변이체 1은 원래 리포터 구성과 비교할 때 TRAP에 의해 제대로 억제되지 않았다(TRAP의 존재 하에 GFP 발현 수준이 10배 더 높음). 그러나, 놀랍게도 변이체 0, 2 및 3은 원래 구성에 비해 더 낮은 수준으로 억제되었다.
Figure pct00022
표 II: 최적의 3'tbs - Kozak 접합 서열
[패널 I] 상류 tbs 서열의 3' 말단과 중첩되도록 설계된 변이체 Kozak 서열. 확장된 Kozak 서열은 주요 전이유전자 ATG 개시 코돈이 tbs의 3' 말단 KAGNN 반복부의 9개 뉴클레오티드 하류에 배치되도록, 즉 중첩이 없도록 배치하였다. 주요 전이유전자 ATG 개시 코돈을 상류 tbs에 더 가깝게 위치시키기 위해, 3' 말단 tbs 반복부의 컨센서스 KAGNN 반복부가 유지되는 동시에 효율적인 확장된 Kozak 컨센서스 서열(본원에서 GNNRVVATG로 정의됨)이 유지되도록 4개의 변이체를 설계하였다. KAGNN 반복부 서열은 대괄호 안에 있고, Kozak 서열은 굵은 대문자로 표시하였다.
실시예 4: 바이시스트론 카세트에서 전이유전자의 더 큰 배수 억제를 가능하게 하는 IRES와 tbs 사이의 개선된 스페이서 서열의 확인.
WO2015/092440에 보고된 원래의 TRIP 시스템에서 IRES와 ORF 사이에 tbs를 삽입함으로써 TRAP-tbs 패러다임이 IRES 의존성 전이유전자의 억제에 적용될 수 있음이 처음으로 입증되었다; 이 구성에서 26개 뉴클레오티드 스페이서가 IRES의 3' 말단과 tbs 사이에 포함되었다.
본 발명의 작업에서는, 더 나은 수준의 억제를 허용하도록 스페이서 서열이 최적화될 수 있다는 가설을 세웠고, 따라서 많은 IRES-스페이서-tbs-GFP 변이체를 작제하였다 - 표 III-패널 I 및 도 7A 참조. 이러한 모든 작제물은 상류 발현 카세트를 포함하는 동일한 5'UTR-루시퍼라제 서열을 또한 함유하였으며, 이는 실험에서 형질감염 효율을 모니터링하는 데 사용되었다. 스페이서 변이체는 원래의 26개 뉴클레오티드 스페이서 또는 이 스페이서의 변이체의 절단으로 구성되었으며, 길이가 15개 또는 10개 또는 5개 뉴클레오티드로 절단되었다. 스페이서가 포함되지 않은 최종 변이체를 만들었다. 원래의 26개 뉴클레오티드 스페이서를 포함하는 리포터와 함께 이러한 변이체를 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시키고, GFP 발현을 형질감염 후 2일에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(%GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 7B). 루시퍼라제 활성을 또한 측정하여 형질감염 효율을 평가하였다.
데이터는 길이가 15, 10 및 5개 뉴클레오티드인 원래 스페이서의 스페이서 절단 변이체가 'ON' 수준(TRAP가 없는 경우)에 영향을 미치지 않으면서 원래 스페이서와 비교하여 더 낮은 억제 수준을 제공했음을 보여준다. 변이체 스페이서를 기반으로 하는 10개 뉴클레오티드 스페이서의 경우에도 마찬가지였다. 따라서, 개선된 스페이서 서열이 확인되었다.
최고의 스페이서 중 하나(Original, 15nt로 절단됨)에 대한 추가의 검증은 tbs를 하류 ATG 코돈에 더 가깝게 위치시키는(9개에서 3개 뉴클레오티드로 이동) 맥락에서 그리고 tbs 서열의 11개 또는 8개 반복부의 맥락에서 수행하였다. 이들 추가의 변이체 4개 모두는 원래 스페이서 함유 구성과 비교하여 TRAP에 의한 개선된 억제 프로파일을 제공하였고(도 7C), 이는 다른 스페이서가 기능적이지만 서로 다른 tbs 컨텍스트에서 활용될 수 있음을 보여준다.
Figure pct00023
표 III: IRES- 스페이서 - Kozak 서열
[패널 I] 연구에서 사용된 IRES와 tbs 서열 사이에 사용된 변이체 스페이서. WO2015092440에 요약된 '원래' 스페이서 서열은 길이가 26개 뉴클레오티드이다. 이 스페이서 서열의 변이체를 만들었다(Variant [26nt]). 이 두 스페이서의 절단을 만들었으며, 또한 스페이서가 없는 변이체도 만들었다. Original-[Trunc-15nt] 스페이서는 우수한 'ON' 수준을 유지하면서(즉, TRAP 부재에서) 최고의 억제 수준을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 그런 다음 Original-[Trunc-15nt] 스페이서를 11xKAGNN 반복부 또는 8xtbsKAGNN 반복부 tbs 서열과 함께 사용하고, tbs의 3' 말단에서부터 하류 전이유전자 ATG 개시 코돈까지의 거리가 9nt에서 3nt로 감소된 변이체와 함께 사용하였다. 이탤릭체 서열은 EMCV IRES 요소의 3' 말단을 나타내고, 변이체 스페이서 서열은 굵게 표시하였고, tbs 컨센서스는 일반 텍스트로 표시하였고, 하류 전이유전자 확장 Kozak 서열은 밑줄로 표시하였다.
실시예 5: 개선된 중첩되는 tbs- Kozak 변이체를 전장의 인트론 함유 EF1a 프로모터에 통합.
이전 실시예는 중첩되지 않는 tbs/Kozak 변이체와 비교하여 중첩되는 tbs-Kozak 변이체가 억제를 개선했음을 나타내었으며, 이는 EFS 프로모터(내포된 인트론을 제거함으로써 절단된 EF1a 프로모터)의 맥락에서 입증되었다. tbs-Kozak 변이체가 전장 EF1a 프로모터(즉, 인트론의 스플라이싱-아웃 후) 내에서 유사하게 '수행하였는'지 평가하기 위해, 3개의 tbs-Kozak 변이체(0, 2 및 3)를 EF1a 프로모터를 포함하는 GFP 리포터 카세트에 클로닝하였다(도 10A). 스플라이싱 후, 5'UTR은 엑손1(즉, L33 개선된 리더), 엑손2의 첫 번째 뉴클레오티드를 포함하는 짧은 12 nt 서열, 그 다음 tbs-Kozak 변이체 서열(서열번호 60)을 포함한다. 이들 GFP 리포터 플라스미드를 tbs를 함유하지 않는 리포터와 함께 현탁액, 무혈청 HEK293T 세포 +/- TRAP-발현 플라스미드에 개별적으로 공동-형질감염시켰고, GFP 발현을 형질감염 2일 후에 유세포 분석에 의해 측정하였다. GFP 발현 점수(%GFP 양성 세포 × MFI)를 유세포 분석 데이터로부터 생성하고 플롯팅하였다(도 10B). 또한, 이러한 tbs-함유 GFP 발현 카세트를 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 게놈 플라스미드(여기서 MSD 및 crSD는 불활성화됨, 아래 참조)에 클로닝하고, 현탁액, 무혈청 HEK293T 세포에서 유사한 실험을 수행하여, GFP 발현 점수를 수득하였다(도 10C). 데이터는 실제로 중첩되는 tbs-Kozak 변이체가 사용된 중첩되지 않는 tbs/Kozak 변이체와 비교하여 개선된 전이유전자 억제를 나타낼 수 있었음을 보여준다.
실시예 6 - MSD - 2KO 렌티바이러스 벡터는 비정상적인 스플라이싱의 제거로 인해 생산 동안 더 적은 전이유전자 단백질을 생산한다
렌티바이러스 벡터 생산 동안 비정상적인 스플라이싱을 제거하는 추가의 이점은 전이유전자 단백질 생산을 유도하는 전이유전자 암호화 mRNA의 양을 줄이는 것이다.
이 작업을 진행하는 동안, 우리는 SL2의 스플라이싱 영역(패키징 신호의 일부)에서부터 내부 스플라이스 수용체 부위까지의 스플라이싱-아웃으로 인해 벡터 게놈 카세트를 구동하는 '외부' (CMV) 프로모터로부터 전이유전자 암호화 mRNA가 효과적으로 생산된다는 것을 예기치 않게 발견하였다(도 11A). 이것이 발생하는 정도는 cppt와 전이유전자 ORF 사이의 내부 서열(즉, 프로모터-5'UTR 서열)에 따라 다르다. 전이유전자 카세트에서 EF1a 프로모터(매우 강력한 스플라이스 수용체 포함)를 사용하면 외부 프로모터에서 비롯된 전체 전사체의 95% 이상에서 MSD로부터의 비정상적인 스플라이싱이 발생한다(도 12). 표준 또는 MSD-2KO 렌티바이러스 벡터 생산 배양에서 총 GFP 발현을 비교함으로써(도 11B), 우리는 생산 중에 발현된 전이유전자 단백질의 최대 80%가 비정상적인 스플라이스 생성물에서 유래한다는 것을 보여주었다. 우리는 MSD-2KO 유전자형을 TRiP 시스템과 결합하면 생산되는 전이유전자 단백질의 감소를 증가시킨다는 것을 발견하였다.
도 11C는 MSD-2KO 렌티바이러스 벡터 게놈 패키징 영역의 'MSD2KO' 변이체의 SL2 루프에 대한 유전자 변형을 표시하며, 이는 MSD와 하류에 위치한 잠복 스플라이스 공여자 모두를 돌연변이시킨다(MSD2KO 변이체는 도 11B에 나타난 데이터를 생성하는 데 사용되었다). 우리는 또한 3개의 다른 스플라이스 공여자 영역 돌연변이를 만들었다: [1] MSD 및 잠복 공여자 서열 내에 두 가지 특정 변화를 또한 도입한 'MSD2KOv2', [2] 전체 SL2 루프를 인공 스템 루프로 대체하는 'MSD2KOm5' 및 [3] 완전한 SL2 결실로서, 이에 의해 전체 스플라이스 공여자 영역(스플라이싱 영역이라고도 함)을 제거함. 이들은 독립적으로 비정상적인 스플라이싱 활성을 제거하는 것으로 나타났다.
실시예 7: tbs의 3' 말단 KAGNN 반복에 의한 코어 Kozak 서열의 점점 더 많은 폐색은 TRAP에 의한 점진적으로 더 큰 전이유전자 억제를 초래한다.
실시예 3에서, 제한된 수의 중첩되는 tbs-Kozak 변이체를 생성하고 인트론을 함유하지 않은 프로모터 EFS 및 huPGK의 맥락에서 테스트하였다. 그런 다음 이러한 변이체를 실시예 5에서 인트론을 함유하는 전체 EF1a 프로모터에서 테스트했는데, 이는 이 억제하기 어려운 프로모터가 중첩되는 tbs-Kozak 변이체를 사용하여 억제될 수 있음을 보여준다.
tbs의 3' 말단 KAGNN 반복부 내에 코어 Kozak 서열을 '숨김'으로써 개선된 TRAP 억제의 원칙을 추가로 예시하기 위해, 새로운 변이체 패널을 설계하였다(표 IV 참조). 이들은 하기 세 개의 '중첩 그룹'으로 암호화되는 모든 가능한 변이체를 기초로 하였다; KAGatg(KAGNN 컨센서스가 코어 Kozak의 ATG와 가능한 한 많이 중첩되는 경우, 즉 코어 Kozak의 ATG의 처음 두 뉴클레오티드가 겹침), KAGNatg(KAGNN 컨센서스가 코어 Kozak의 ATG의 첫 번째 뉴클레오티드와 겹치는 경우) 및 KAGNNatg(KAGNN 컨센서스가 코어 Kozak의 ATG와 겹치지 않는 경우). (실시예 3 및 5의 초기 변이체 tbs-kzkV0, tbs-kzkV1 및 tbs-kzkV2는 이러한 정의된 그룹에 속한다). 'GT' 디뉴클레오티드를 생성한 이 그룹 내의 모든 변이체는 생성/평가되지 않았는데 그 이유는 이들이 잠복 스플라이스 공여자 부위를 생성할 수 있는 바람직하지 않은 가능성 때문이다.
표 IV: 추가의 예시를 위해 생성된 중첩되는 tbs- Kozak 변이체
KAGatg, KAGNatg 또는 KAGNNatg의 컨센서스와 관련된 '중첩 그룹'을 나타내는 가능한 모든 변이체를 생성하였으며, 단, 원치 않는 (잠복) 스플라이스 공여자 부위를 생성할 수 있는 'GT' 디뉴클레오티드에 이르게 하는 것은 제외하였다. 처음 10개 KAGNN 반복부는 명확성을 위해 여기에서 컨센서스로 표시하였지만 주로 서열 번호 8의 처음 48개 뉴클레오티드였다. 3' 말단 tbs KAGNN은 각 변이체에 암호화된 대로 표시하였다(이탤릭체 및 대괄호); 코어 Kozak 컨센서스는 굵게 표시하였으며 더 광범위하고 확장된 Kozak 컨센서스의 일부로 제시된 모든 뉴클레오티드는 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00024
일반적으로, 대부분의 변이체는 RVVATG의 선호되는 코어 Kozak 컨센서스를 따랐으며, 동시에 표시된 KAGNN tbs 컨센서스를 포함하는 것으로 제한하였다. 이들 변이체를 pEF1a-GFP 리포터 플라스미드에 클로닝하였고, 따라서 5'UTR은 (인트론의 스플라이싱 후) L33 리더(엑손 1)와 엑손 2의 짧은 12nt 서열을 포함하였으며, 이는 중첩되는 tbs-Kozak 변이체가 사용되지 않는 한 TRAP에 의해 덜 억제되는 것으로 실시예 5에서 이전에 밝혀졌다. 현탁액(무혈청) HEK293T 세포를 전형적으로 렌티바이러스 벡터(LV) 형질감염/생산을 반영하는 조건(예: 나트륨 부티레이트 유도 포함) 하에서 TRAP-발현 플라스미드가 있거나 없이 이러한 변이체로 개별적으로 형질감염시켰고, 전형적인 LV 수확 시간(형질감염 후 2일)에 유세포 분석을 수행하였다. +/- TRAP 조건에 대해 전역 GFP 발현 점수를 생성한 다음(%GFP × MFI; ArbU) 배수 억제 값을 생성하고 도 13A에 플롯팅하였다. 결과는 코어 Kozak 컨센서스 서열이 3' 말단 KAGNN tbs 반복부와 더 많이 중첩될수록, TRAP 억제 수준이 더 우수함을 입증한다. 각 중첩 그룹의 배수 차이(fold difference)에 대한 통계 분석(T-테스트)은 더 많은 코어 Kozak이 3' 말단 KAGNN tbs 반복부와 중첩됨에 따라 억제의 유의한 증가를 보여주며, 여기서 최고의 억제 점수는 개시 코돈의 3분의 2가 KAGNN 반복부의 일부를 형성하는 KAGatg 그룹에서 나온다. 모든 중첩 변이체는 중첩되지 않는 tbs 변이체와 비교하여 TRAP에 의해 통계적으로 더 큰 전이유전자 억제를 생성하였다.
데이터를 도 13B에 추가로 계층화하였으며, 여기서 억제되지 않은 'ON' 전이유전자 수준을 최고에서 최저로 표시하였다. KAGatg 중첩 그룹의 두 변이체는 강조표시하였는데 TRAP 억제 측면에서 이 두 가지 가장 성능이 우수한 변이체 중에서 GAGatg 변이체(tbskzkV0.G)가 가장 높은 'ON' 수준을 제공했음을 보여주며, 이는 아마도 그것이 RVVATG의 코어 Kozak 컨센서스를 따르는 반면 TAGatg(tbskzkV0.T)는 그렇지 않기 때문일 것이다.
이 모든 데이터는 중첩되는 tbs-Kozak 변이체가 중첩되지 않는 tbs 변이에 비해 TRAP 억제를 중재하는 데 더 효과적이며, 바람직하게는 벡터 형질도입된 표적 세포에서 우수한 'ON' 전이유전자 발현을 보장하기 위해 tbs-Kozak 중첩이 RVVATG의 코어 Kozak 컨센서스를 따른다는 일반 원칙을 뒷받침한다. 따라서, 이들 신규한 tbs-Kozak 변이체의 사용은 바이러스 벡터 생산 동안 보다 효율적인 전이유전자 억제를 가능하게 할 것이며, 상기 전이유전자 단백질 활성이 바이러스 벡터 역가 및/또는 활성에 유해한 경우 잠재적으로 바이러스 벡터 역가의 증가를 초래할 것이다.
실시예 8: 인트론을 포함하는 공통 프로모터의 TRAP 매개 억제를 개선하기 위한 최적의 중첩되는 tbs-Kozak 변이체의 추가적 사용.
실시예 5에서, 중첩되는 tbs-Kozak 변이체의 사용은 인트론을 함유하는 전장 EF1a 프로모터를 사용할 때 TRAP 매개 억제를 개선하는 것으로 나타났다. 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터 게놈에 널리 사용되는 유사한 프로모터 - 예를 들어 CAG 프로모터 - 의 경우 내장된 엑손/인트론 서열의 존재는 TRAP 매개 억제의 정도가 '천연' 엑손 서열 내의 서열에 의해 영향을 받을 수 있음을 의미한다. TRAP 매개 억제를 개선하는 관점에서, 엑손 서열을 변경하는 것이 분명하거나 실현 가능하지 않을 수 있으며, 특히 이것이 스플라이싱 향상(예: 스플라이스 공여자 부위에 가까운 스플라이스 인핸서 요소)과 관련된 경우 그러하다. 널리 사용되는 CAG 프로모터는 CMV 인핸서 요소, 코어 닭 β-액틴 유전자 프로모터-엑손1-인트론 서열, 및 토끼 β-글로빈 유전자로부터의 스플라이스 수용체-엑손 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 곳에서 놀랍게도 EF1a 프로모터로부터의 엑손 1(L33)이 모든 유형의 tbs 변이체의 상류에서 사용되어 TRAP 매개 억제를 개선할 수 있다는 것이 발견되었으며, 이는 안정한 TRAP-tbs 복합체 형성을 지원하기 위한 우수한 서열 컨텍스트를 제공하는 것으로 추정되며, 효율적인 번역 억제를 가능하게 한다. 중첩되는 tbs-Kozak 변이체는 EF1a(인트론 함유) 및 인트론이 없는 여러 다른 프로모터 모두에서 TRAP 매개 억제를 돕는 것으로 나타났다.
이 실시예에서(도 14A 참조), [a] CAG 프로모터의 '천연' 5'UTR 영역 내에 tbskzkV0.G 변이체(다른 실시예에서 변이체 '0'으로도 지칭됨)를 배치하고(서열번호 117), [b] 전체 '천연' 인트론 함유 5'UTR 영역을 tbskzkV0.G 변이체를 포함하는 EF1a 5'UTR-인트론 영역으로 교체함으로써(서열번호 118), 두 구성 모두를 CAG 프로모터로부터 TRAP 매개 억제를 개선하는 데 적용하였다. 상응하는 스플라이싱된 서열을 각각 서열번호 119 및 서열번호 120으로 나타내었다. 또한, 바이러스 벡터 게놈에서 전형적으로 인트론 없이 사용되는 프로모터 - 이 경우 CMV - 에 이종 인트론을 포함하는 인공 5'UTR이 추가될 수 있다는 것을 예시로 보여주었으며, 이의 발현은 TRAP에 의해 효율적으로 억제되는 것으로 이전에 나타났다. 구체적으로, tbskzkV0.G 변이체를 함유하는 EF1a 5'UTR-인트론 영역(서열번호 118)이 있는 5'UTR을 CMV 프로모터 컨텍스트에서 사용하였다.
이러한 리포터 작제물(GFP 암호화)을 바이러스 벡터 생산 시나리오를 모델링하는 현탁액(무혈청) HEK293T 세포에서 'ON' 발현 수준과 TRAP 매개 억제 모두에 대해 평가하였다. 세포를 GFP 리포터 플라스미드 +/- pTRAP로 형질감염시키고, 형질감염 후 나트륨 부티레이트로 유도한 배양물(전형적인 바이러스 벡터 생산에 따라) 및 형질감염 후 ~2일(즉, 전형적인 바이러스 벡터 수확 지점)에서 GFP 발현에 대해 세포를 분석하였다. GFP 발현 점수(% GFP 양성 × MFI; ArbU)를 생성하고 플롯팅하였으며(도 14B), TRAP-억제 점수를 표시하였다. 이들 데이터는 전형적인 바이러스 벡터 생산 세포에서 TRAP 매개 발현이 tbskzkV0.G 변이체를 사용하는 CAG 프로모터로부터 3배에서 30배까지 개선될 수 있음을 나타낸다. 더욱이, 데이터는 서로 다른 프로모터로부터의 '천연' 5'UTR 영역 서열이 tbsKzkV0.G 변이체를 함유하는 인트론 함유 EF1a 5'UTR로 대체될 수 있고, 양자 모두 실질적으로 개선된 TRAP 매개 억제(30-40배 내지 >100배) 및 TRAP의 부재 시 높은 유전자 발현의 유지(즉, 바이러스 벡터 형질도입 표적 세포에서의 발현을 모델링)에 이르게 함을 보여준다. 따라서, 새로운 EF1a-5'UTR-인트론-tbskzkV0.G 서열은 표적 세포에서 인트론에 의해 부여되는 알려진 이점(즉, 유전자 발현 증가)을 이종 프로모터에 제공하는 데 유용할 수 있으며, 동시에 바이러스 벡터 생산 동안 전이유전자 단백질의 효율적인 억제를 가능하게 하며, 상기 전이유전자 단백질 활성이 바이러스 벡터 역가에 유해한 경우 잠재적으로 바이러스 벡터 역가의 증가를 초래할 수 있다. 이것은 EF1a-5'UTR-인트론 서열을 다른 중첩되는 tbs-Kozak 서열과 함께 사용하는 경우에도 적용된다.
상기 명세서에 언급된 모든 간행물은 참고로 본 명세서에 포함된다. 본 발명의 기술된 측면의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 비록 본 발명이 특정의 바람직한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명이 그러한 특정의 구현예에 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 생화학 및 생명공학 또는 관련 분야의 숙련자에게 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 모드의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford BioMedica (UK) Limited <120> PRODUCTION SYSTEM <130> P118208PCT <150> GB 1916452.4 <151> 2019-11-12 <150> GB 2001998.0 <151> 2020-02-13 <160> 198 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 75 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1 Met Asn Gln Lys His Ser Ser Asp Phe Val Val Ile Lys Ala Val Glu 1 5 10 15 Asp Gly Val Asn Val Ile Gly Leu Thr Arg Gly Thr Asp Thr Lys Phe 20 25 30 His His Ser Glu Lys Leu Asp Lys Gly Glu Val Ile Ile Ala Gln Phe 35 40 45 Thr Glu His Thr Ser Ala Ile Lys Val Arg Gly Glu Ala Leu Ile Gln 50 55 60 Thr Ala Tyr Gly Glu Met Lys Ser Glu Lys Lys 65 70 75 <210> 2 <211> 86 <212> PRT <213> Aminomonas paucivorans <400> 2 Met Lys Glu Gly Glu Glu Ala Lys Thr Ser Val Leu Ser Asp Tyr Val 1 5 10 15 Val Val Lys Ala Leu Glu Asn Gly Val Thr Val Ile Gly Leu Thr Arg 20 25 30 Gly Gln Glu Thr Lys Phe Ala His Thr Glu Lys Leu Asp Asp Gly Glu 35 40 45 Val Trp Ile Ala Gln Phe Thr Glu His Thr Ser Ala Ile Lys Val Arg 50 55 60 Gly Ala Ser Glu Ile His Thr Lys His Gly Met Leu Phe Ser Gly Arg 65 70 75 80 Gly Arg Asn Glu Lys Gly 85 <210> 3 <211> 81 <212> PRT <213> Desulfotomaculum hydrothermale <400> 3 Met Asn Pro Met Thr Asp Arg Ser Asp Ile Thr Gly Asp Tyr Val Val 1 5 10 15 Val Lys Ala Leu Glu Asn Gly Val Thr Ile Ile Gly Leu Thr Arg Gly 20 25 30 Gly Val Thr Lys Phe His His Thr Glu Lys Leu Asp Lys Gly Glu Ile 35 40 45 Met Ile Ala Gln Phe Thr Glu His Thr Ser Ala Ile Lys Ile Arg Gly 50 55 60 Arg Ala Glu Leu Leu Thr Lys His Gly Lys Ile Arg Thr Glu Val Asp 65 70 75 80 Ser <210> 4 <211> 74 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 4 Met Tyr Thr Asn Ser Asp Phe Val Val Ile Lys Ala Leu Glu Asp Gly 1 5 10 15 Val Asn Val Ile Gly Leu Thr Arg Gly Ala Asp Thr Arg Phe His His 20 25 30 Ser Glu Lys Leu Asp Lys Gly Glu Val Leu Ile Ala Gln Phe Thr Glu 35 40 45 His Thr Ser Ala Ile Lys Val Arg Gly Lys Ala Tyr Ile Gln Thr Arg 50 55 60 His Gly Val Ile Glu Ser Glu Gly Lys Lys 65 70 <210> 5 <211> 74 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 5 Met Tyr Thr Asn Ser Asp Phe Val Val Ile Lys Ala Leu Glu Asp Gly 1 5 10 15 Val Asn Val Ile Gly Leu Thr Arg Gly Ala Asp Thr Arg Phe His His 20 25 30 Ser Glu Lys Leu Asp Lys Gly Glu Val Leu Ile Ala Gln Phe Thr Glu 35 40 45 His Thr Ser Ala Ile Lys Val Arg Gly Lys Ala Tyr Ile Gln Thr Arg 50 55 60 His Gly Val Ile Glu Asn Glu Gly Lys Lys 65 70 <210> 6 <211> 76 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 6 Met Asn Val Gly Asp Asn Ser Asn Phe Phe Val Ile Lys Ala Lys Glu 1 5 10 15 Asn Gly Val Asn Val Phe Gly Met Thr Arg Gly Thr Asp Thr Arg Phe 20 25 30 His His Ser Glu Lys Leu Asp Lys Gly Glu Val Met Ile Ala Gln Phe 35 40 45 Thr Glu His Thr Ser Ala Val Lys Ile Arg Gly Lys Ala Ile Ile Gln 50 55 60 Thr Ser Tyr Gly Thr Leu Asp Thr Glu Lys Asp Glu 65 70 75 <210> 7 <211> 80 <212> PRT <213> Carboxydothermus hydrogenoformans <400> 7 Met Val Cys Asp Asn Phe Ala Phe Ser Ser Ala Ile Asn Ala Glu Tyr 1 5 10 15 Ile Val Val Lys Ala Leu Glu Asn Gly Val Thr Ile Met Gly Leu Thr 20 25 30 Arg Gly Lys Asp Thr Lys Phe His His Thr Glu Lys Leu Asp Lys Gly 35 40 45 Glu Val Met Val Ala Gln Phe Thr Glu His Thr Ser Ala Ile Lys Ile 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Glu Ile Tyr Thr Lys His Gly Val Ile Lys Asn Glu 65 70 75 80 <210> 8 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 8 gaguuuagcg gaguggagaa gagcggagcc gagccuagca gagacgagug gagcu 55 <210> 9 <211> 55 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 9 gaguuuagcg gaguggagaa gagcggagcc gagccuagca gagacgagaa gagcu 55 <210> 10 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 10 uaguuuaguu uaguuuaguu uaguuuaguu 30 <210> 11 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 11 uaguuuaguu gaguuuaguu gaguuuaguu 30 <210> 12 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 12 gaguuugagu ugaguugagu uugaguugag uu 32 <210> 13 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 13 uaguuugagu uuaguugagu uuuaguugag uu 32 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 14 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagtg gagct 55 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 15 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagaa 50 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 16 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagac 45 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 17 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca 40 <210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 18 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcc 35 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 19 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc 30 <210> 20 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 20 gagtttagcg gagtggagaa agagacggag ccgagaccta gcagagacga gaagagct 58 <210> 21 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 21 gagtttagcg gagtggagaa gagacggagc cgagcctagc agagacgaga agagct 56 <210> 22 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 22 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagaa gagct 55 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 23 gagtttagcg gagtggagaa agagcggagc cgagcctagc a 41 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAP binding site variant <400> 24 gagtttagcg gagtggagaa agagcggagc cgagcc 36 <210> 25 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L33 Improved leader sequence <400> 25 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca cag 33 <210> 26 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L12 Improved leader sequence <400> 26 ctttttcgca ac 12 <210> 27 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extended Kozak consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, or t <400> 27 gnnrvvatgg 10 <210> 28 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core Kozak consensus sequence <400> 28 rvvatg 6 <210> 29 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 29 gagatg 6 <210> 30 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 30 kagvatg 7 <210> 31 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 31 kagvvatg 8 <210> 32 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 32 kagrvvatg 9 <210> 33 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 33 kagnrvvatg 10 <210> 34 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal 3' tbs-Kozak junction variant <400> 34 kagccgagat g 11 <210> 35 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal 3' tbs-Kozak junction variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 35 kagnggagcc atg 13 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal 3' tbs-Kozak junction variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 36 kagnngagac catg 14 <210> 37 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 37 kaggcgagca tg 12 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 38 atagcagaga cggct 15 <210> 39 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 39 atagcagaga 10 <210> 40 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 40 atagc 5 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 41 atatcagaga cggctagcgt atacca 26 <210> 42 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 42 atatcagaga cggct 15 <210> 43 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 43 agagacggct 10 <210> 44 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer variant <400> 44 tacca 5 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 45 gagctctaga vvatg 15 <210> 46 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 46 gagctcgtcg acvatg 16 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 47 gagctcgaat tcgaavvatg 20 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 48 gagctctaga cgtcgacvat g 21 <210> 49 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 49 gagctctaga attcgaavva tg 22 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 50 gagctctaga tatcgatrvv atg 23 <210> 51 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 51 kagactagta cttaagcttr vvatg 25 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 52 gagctctaga ccatg 15 <210> 53 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 53 gagctcgtcg accatg 16 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 54 gagctcgaat tcgaaccatg 20 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 55 gagctctaga cgtcgaccat g 21 <210> 56 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 56 gagctctaga attcgaacca tg 22 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 57 gagctctaga tatcgatacc atg 23 <210> 58 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-MCS-Kozak variant <400> 58 kagactagta cttaagctta ccatg 25 <210> 59 <211> 32 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 59 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata cc 32 <210> 60 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal (overlapping) tbs-Kozak <400> 60 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagcc gagatg 56 <210> 61 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimal (overlapping) tbs-MCS-Kozak <400> 61 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagaa gagctctaga 60 ccatg 65 <210> 62 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 1 containing L33 Improved leader, optimal (overlapping) tbs ([KAGNN]8)-Kozak junction <400> 62 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggagttta gcggagtgga gaagagcgga 60 gccgagccga gatg 74 <210> 63 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 2 containing L33 Improved leader, optimal (overlapping) tbs ([KAGNN]11)-Kozak junction <400> 63 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggagttta gcggagtgga gaagagcgga 60 gccgagccta gcagagacga gccgagatg 89 <210> 64 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 3 containing L12 Improved leader, optimal (overlapping) tbs ([KAGNN]11)-Kozak junction <400> 64 ctttttcgca acgagtttag cggagtggag aagagcggag ccgagcctag cagagacgag 60 ccgagatg 68 <210> 65 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 4 for intron-containing 5'UTRs, resulting in a spliced leader comprising L33, optimal (overlapping) tbs ([KAGNN]11)-Kozak junction <400> 65 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtgtcgt gaaaagagtt tagcggagtg 60 gagaagagcg gagccgagcc tagcagagac gagccgagat g 101 <210> 66 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 5 containing improved spacer, optimal (overlapping) tbs ([KAGNN]8)-Kozak junction <400> 66 atagcagaga cggctgagtt tagcggagtg gagaagagcg gagccgagcc gagatg 56 <210> 67 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 6 containing L33 Improved leader tbs ([KAGNN]11)-MCS-Kozak <400> 67 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggagttta gcggagtgga gaagagcgga 60 gccgagccta gcagagacga gaagagctct agaccatg 98 <210> 68 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> illustrative nucleic acid sequence 7 containing improved spacer, tbs ([KAGNN]11)-MCS-Kozak <400> 68 atagcagaga cggctgagtt tagcggagtg gagaagagcg gagccgagcc tagcagagac 60 gagaagagct ctagaccatg 80 <210> 69 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 69 gagaatg 7 <210> 70 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 70 gagcatg 7 <210> 71 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 71 gaggatg 7 <210> 72 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 72 tagaatg 7 <210> 73 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 73 tagcatg 7 <210> 74 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 74 taggatg 7 <210> 75 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 75 gagaaatg 8 <210> 76 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 76 gagacatg 8 <210> 77 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 77 gagagatg 8 <210> 78 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 78 gagcaatg 8 <210> 79 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 79 gagccatg 8 <210> 80 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 80 gagcgatg 8 <210> 81 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 81 gaggaatg 8 <210> 82 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 82 gaggcatg 8 <210> 83 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 83 gagggatg 8 <210> 84 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 84 tagaaatg 8 <210> 85 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 85 tagacatg 8 <210> 86 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 86 tagagatg 8 <210> 87 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 87 tagcaatg 8 <210> 88 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 88 tagccatg 8 <210> 89 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 89 tagcgatg 8 <210> 90 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 90 taggaatg 8 <210> 91 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 91 taggcatg 8 <210> 92 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 92 tagggatg 8 <210> 93 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L33 improved leader derived from a splicing event <400> 93 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtgtcgt gaaaa 45 <210> 94 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> splice donor region variant <400> 94 ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat 30 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> splice donor region variant <400> 95 ggggcggcga ctgcagacaa cgccaaaaat 30 <210> 96 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> major splice donor consensus sequence variant <400> 96 tggtragt 8 <210> 97 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> major splice donor consensus sequence variant <400> 97 ctggt 5 <210> 98 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor region variant (MSD-2KO) <400> 98 cagaca 6 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor region variant (MSD-2KO) <400> 99 ggcgactgca gacaacgcc 19 <210> 100 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor region variant (MSD-2KOv2) <400> 100 gtggagact 9 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor region variant (MSD-2KOv2) <400> 101 ggcgagtgga gactacgcc 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> splice donor region SL2 <400> 102 ggcgactggt gagtacgcc 19 <210> 103 <211> 5 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cryptic splice donor consensus sequence variant <400> 103 tgagt 5 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor (MSD) region, MSD-2KOv2 <400> 104 ggggcggcga gtggagacta cgccaaaaat 30 <210> 105 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor (MSD) region, MSD-2KOm5 <400> 105 ggggaaggca acagataaat atgccttaaa at 32 <210> 106 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> core sequence <400> 106 gtgagta 7 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor <400> 107 aaggcaacag ataaatatgc ctt 23 <210> 108 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 108 tagatg 6 <210> 109 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 109 gagatatg 8 <210> 110 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 110 gagctatg 8 <210> 111 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 111 tagatatg 8 <210> 112 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 112 tagctatg 8 <210> 113 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 113 kagnng 6 <210> 114 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak junction variant <400> 114 kagatg 6 <210> 115 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 115 kagnntg 7 <210> 116 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' tbs-Kozak consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 116 kagnatg 7 <210> 117 <211> 1082 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken beta-Actin / Rabbit beta-globin chimeric 5'UTR-intron with tbs-kzkV0.G variant <400> 117 cggcgggcgg gaacgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg 60 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctccc 120 tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180 aagccttaaa gggctccggg agggcctttg tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240 cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggcccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 300 tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcgtgtgcg cgaggggagc gcgggccggg 360 ggcggtgccc cgcggtgcgg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 420 gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctggca 480 cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtgcggggcg 540 tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600 ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg gagcgccggc 660 ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 720 cagggacttc ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780 cctctagcgg gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 840 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg gctgccgcag 900 ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 960 ggcggcttta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg 1020 ggcaaagagt ttagcggagt ggagaagagc ggagccgagc ctagcagaga cgagccgaga 1080 tg 1082 <210> 118 <211> 1040 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a 5'UTR-intron with tbskzkV0.G variant <400> 118 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 60 cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctgcag 120 tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gtggccttgc 180 gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgtggcct ggcctgggcg ctggggccgc 240 cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc 300 atttaaaatt tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat 360 gcgggccaag atcagcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc 420 cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc 480 ggacgggggt agtctcaagc tgcccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt 540 atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga 600 tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc acaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag 660 cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca 720 tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc cagcttttgg 780 agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag 840 tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc 900 ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt 960 cttccatttc aggtgtcgtg aaaagagttt agcggagtgg agaagagcgg agccgagcct 1020 agcagagacg agccgagatg 1040 <210> 119 <211> 161 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced sequence corresponding to SEQ ID NO: 117 <400> 119 cggcgggcgg gaacgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg 60 ccccggctct gactgaccgc gttactccca cagctcctgg gcaaagagtt tagcggagtg 120 gagaagagcg gagccgagcc tagcagagac gagccgagat g 161 <210> 120 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spliced sequence corresponding to SEQ ID NO: 118 <400> 120 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtgtcgt gaaaagagtt tagcggagtg 60 gagaagagcg gagccgagcc tagcagagac gagccgagat g 101 <210> 121 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken beta-Actin / Rabbit beta-globin chimeric 5'UTR-intron <400> 121 cggcgggcgg gaacgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg 60 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctccc 120 tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180 aagccttaaa gggctccggg agggcctttg tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240 cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggcccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 300 tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcgtgtgcg cgaggggagc gcgggccggg 360 ggcggtgccc cgcggtgcgg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 420 gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctggca 480 cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtgcggggcg 540 tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600 ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg gagcgccggc 660 ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 720 cagggacttc ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780 cctctagcgg gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 840 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg gctgccgcag 900 ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 960 ggcggcttta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg 1020 ggcaaa 1026 <210> 122 <211> 984 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a 5'UTR-intron <400> 122 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 60 cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctgcag 120 tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gtggccttgc 180 gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgtggcct ggcctgggcg ctggggccgc 240 cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc 300 atttaaaatt tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat 360 gcgggccaag atcagcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc 420 cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc 480 ggacgggggt agtctcaagc tgcccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt 540 atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga 600 tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc acaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag 660 cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca 720 tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc cagcttttgg 780 agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag 840 tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc 900 ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt 960 cttccatttc aggtgtcgtg aaaa 984 <210> 123 <211> 1030 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chicken beta-Actin / Rabbit beta-globin chimeric 5'UTR-intron-tbs consensus <220> <221> misc_feature <222> (1027)..(1030) <223> kagn(2-3) may be repeated 10-11 times <220> <221> misc_feature <222> (1030)..(1030) <223> n may be repeated 2-3 times <400> 123 cggcgggcgg gaacgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg 60 ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctccc 120 tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180 aagccttaaa gggctccggg agggcctttg tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240 cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggcccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 300 tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcgtgtgcg cgaggggagc gcgggccggg 360 ggcggtgccc cgcggtgcgg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt 420 gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctggca 480 cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtgcggggcg 540 tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600 ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg gagcgccggc 660 ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 720 cagggacttc ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc 780 cctctagcgg gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg 840 ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg gctgccgcag 900 ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc 960 ggcggcttta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg 1020 ggcaaakagn 1030 <210> 124 <211> 988 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a 5'UTR-intron-tbs consensus <220> <221> misc_feature <222> (985)..(988) <223> kagn(2-3) may be repeated 10-11 times <220> <221> misc_feature <222> (988)..(988) <223> n may be repeated 2-3 times <400> 124 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtaagtg ccgtgtgtgg ttcccgcggg 60 cctggcctct ttacgggtta tggcccttgc gtgccttgaa ttacttccac ctggctgcag 120 tacgtgattc ttgatcccga gcttcgggtt ggaagtgggt gggagagttc gtggccttgc 180 gcttaaggag ccccttcgcc tcgtgcttga gttgtggcct ggcctgggcg ctggggccgc 240 cgcgtgcgaa tctggtggca ccttcgcgcc tgtctcgctg ctttcgataa gtctctagcc 300 atttaaaatt tttgatgacc tgctgcgacg ctttttttct ggcaagatag tcttgtaaat 360 gcgggccaag atcagcacac tggtatttcg gtttttgggg ccgcgggcgg cgacggggcc 420 cgtgcgtccc agcgcacatg ttcggcgagg cggggcctgc gagcgcggcc accgagaatc 480 ggacgggggt agtctcaagc tgcccggcct gctctggtgc ctggcctcgc gccgccgtgt 540 atcgccccgc cctgggcggc aaggctggcc cggtcggcac cagttgcgtg agcggaaaga 600 tggccgcttc ccggccctgc tgcagggagc acaaaatgga ggacgcggcg ctcgggagag 660 cgggcgggtg agtcacccac acaaaggaaa agggcctttc cgtcctcagc cgtcgcttca 720 tgtgactcca cggagtaccg ggcgccgtcc aggcacctcg attagttctc cagcttttgg 780 agtacgtcgt ctttaggttg gggggagggg ttttatgcga tggagtttcc ccacactgag 840 tgggtggaga ctgaagttag gccagcttgg cacttgatgt aattctcctt ggaatttgcc 900 ctttttgagt ttggatcttg gttcattctc aagcctcaga cagtggttca aagttttttt 960 cttccatttc aggtgtcgtg aaaakagn 988 <210> 125 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, t or u <400> 125 rnnatg 6 <210> 126 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> original tbs-Kozak region sequence <400> 126 acagccacca tg 12 <210> 127 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpaI variant tbs-Kozak region sequence <400> 127 gagttaacgc caccatg 17 <210> 128 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full Kozak consensus sequence for DNA <400> 128 gccgccrcca tgg 13 <210> 129 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> full Kozak consensus sequence for RNA <400> 129 gccgccrcca ugg 13 <210> 130 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> extended Kozak consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, or u <400> 130 gnnrvvaugg 10 <210> 131 <211> 153 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> main U1 snRNA sequence [clover leaf] (nt 410-562) of the U1_256 sequence <400> 131 gcaggggaga taccatgatc acgaaggtgg ttttcccagg gcgaggctta tccattgcac 60 tccggatgtg ctgacccctg cgatttcccc aaatgtggga aactcgactg cataatttgt 120 ggtagtgggg gactgcgttc gcgctttccc ctg 153 <210> 132 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (CMV) <400> 132 gtcagatccg ctagcgctac cggactcaga tctc 34 <210> 133 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (RSV) <400> 133 gccatttgac cattcaccac attggtgtgc acctccaagg ccaagatctt tgtcgatcct 60 accatccact cgacacaccc gccagcggcc gc 92 <210> 134 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (EF1a) <400> 134 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca caggtgtcgt gaaaactacc cctaaaagcc 60 aaaagatctt tgtcgatcct accatccact c 91 <210> 135 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (UBC) <400> 135 agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc 60 gtcacttgga cgcagggttc gggcctaggg taggctctcc tgaatcgaca ggcgccggac 120 ctctggtgag gggagggata agtgaggcgt cagtttcttt ggtcggtttt atgtacctat 180 cttcttaagt agctgaagct ccggttttga actatgcgct cggggttggc gagtgtgttt 240 tgtgaagttt tttaggcacc ttttgaaatg taatcatttg ggtcaatatg taattttcag 300 tgttagactt gtaaattgtc cgctaaattc tggccgtttt tggctttttt gttagacaac 360 agatcttgat cctaccatcc actcgacaca cccgccagcg gccgc 405 <210> 136 <211> 104 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (SV40) <400> 136 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcagatc 60 tttgtcgatc ctaccatcca ctcgacacac ccgccagcgg ccgc 104 <210> 137 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (huPGK) <400> 137 gttccgcatt ctggcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct cgttgaccga 60 atcaccgacc tctctcccca gctgtatttc caaaagatct ttgtcgatcc taccatccac 120 tcgacacacc cgccagcggc cgc 143 <210> 138 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (hsvTK) <400> 138 acaccgagcg accctgcagc gacccgctta agatctttgt cgatcctacc atccactcga 60 cacacccgcc agcggccgc 79 <210> 139 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (Improved leader L33) <400> 139 ctttttcgca acgggtttgc cgccagaaca cag 33 <210> 140 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UTR-leader sequence (Improved leader L12) <400> 140 ctttttcgca ac 12 <210> 141 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tbs sequence <400> 141 gagtttagcg gagtggagaa gagcggagcc gagcctagca gagacgagtg gagct 55 <210> 142 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tbs consensus sequence <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> n is a, c, g, or t <400> 142 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnn 55 <210> 143 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> multiple cloning site (MCS) sequence variant, No MCS <400> 143 acagccacca tg 12 <210> 144 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS2.1 <400> 144 gagctctaga ccatg 15 <210> 145 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS3.1 <400> 145 gagctcgtcg accatg 16 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS3.2 <400> 146 gagctcgaat tcgaaccatg 20 <210> 147 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS4.1 <400> 147 gagctctaga cgtcgaccat g 21 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS4.2 <400> 148 gagctctaga attcgaacca tg 22 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS4.3 <400> 149 gagctctaga tatcgatacc atg 23 <210> 150 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCS sequence variant, MCS4.4 <400> 150 kagactagta cttaagctta ccatg 25 <210> 151 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'tbs-Kozak junction sequence, original <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 151 kagnnacagc caccatg 17 <210> 152 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'tbs-Kozak junction sequence, variant '0' <400> 152 kagccgagat g 11 <210> 153 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'tbs-Kozak junction sequence, variant '1' <400> 153 kaggcgagca tg 12 <210> 154 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'tbs-Kozak junction sequence, variant '2' <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 154 kagnggagcc atg 13 <210> 155 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'tbs-Kozak junction sequence, variant '3' <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 155 kagnngagac catg 14 <210> 156 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [26nt] <220> <221> misc_feature <222> (59)..(63) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (67)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(83) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(88) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (92)..(93) <223> n is a, c, g, or t <400> 156 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagcaga gacggctagc gttaacctka 60 gnnkagnnka gnnkagnnka gnnkagnnka gnnaacgcca ccatg 105 <210> 157 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [Trunc-15nt] <220> <221> misc_feature <222> (48)..(52) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(82) <223> n is a, c, g, or t <400> 157 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagcaga gacggctkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnnkag nnaacgccac catg 94 <210> 158 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [Trunc-10nt] <220> <221> misc_feature <222> (43)..(47) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <400> 158 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagcaga gakagnnkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnnaac gccaccatg 89 <210> 159 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [Trunc-5nt] <220> <221> misc_feature <222> (38)..(42) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <400> 159 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagckag nnkagnnkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnaacgccac catg 84 <210> 160 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, No Spacer [0nt] <220> <221> misc_feature <222> (33)..(37) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <400> 160 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata cckagnnkag nnkagnnkag nnkagnnkag 60 nnkagnnaac gccaccatg 79 <210> 161 <211> 105 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Variant [26nt] <220> <221> misc_feature <222> (59)..(63) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (67)..(68) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (72)..(73) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (77)..(78) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(83) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (87)..(88) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (92)..(93) <223> n is a, c, g, or t <400> 161 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatatcaga gacggctagc gtataccaka 60 gnnkagnnka gnnkagnnka gnnkagnnka gnnaacgcca ccatg 105 <210> 162 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Variant [Trunc-15nt] <220> <221> misc_feature <222> (48)..(52) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(82) <223> n is a, c, g, or t <400> 162 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatatcaga gacggctkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnnkag nnaacgccac catg 94 <210> 163 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Variant [Trunc-10nt] <220> <221> misc_feature <222> (43)..(47) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <400> 163 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccagagacgg ctkagnnkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnnaac gccaccatg 89 <210> 164 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Variant [Trunc-5nt] <220> <221> misc_feature <222> (38)..(42) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <400> 164 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata cctaccakag nnkagnnkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnaacgccac catg 84 <210> 165 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [Trunc-15nt]-3ntKozak <220> <221> misc_feature <222> (48)..(52) <223> kagnn may be repeated 6-10 times <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <400> 165 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagcaga gacggctkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnngag accatg 86 <210> 166 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IRES-spacer-Kozak variant sequence, Original [Trunc-15nt]-9ntKozak <220> <221> misc_feature <222> (48)..(52) <223> kagnn may be repeated 7-11 times <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (71)..(72) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (81)..(82) <223> n is a, c, g, or t <400> 166 cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata ccatagcaga gacggctkag nnkagnnkag 60 nnkagnnkag nnkagnnkag nnaacgccac catg 94 <210> 167 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> n is a, c, g, or t <400> 167 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnacagc 60 caccatg 67 <210> 168 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 168 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagatg 56 <210> 169 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 169 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagatg 56 <210> 170 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 170 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagcatg 57 <210> 171 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 171 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagaatg 57 <210> 172 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 172 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gaggatg 57 <210> 173 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 173 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagaatg 57 <210> 174 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 174 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagcatg 57 <210> 175 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 175 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn taggatg 57 <210> 176 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 176 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagccatg 58 <210> 177 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 177 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagaaatg 58 <210> 178 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 178 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagagatg 58 <210> 179 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 179 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagacatg 58 <210> 180 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 180 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagatatg 58 <210> 181 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 181 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagcaatg 58 <210> 182 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 182 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagcgatg 58 <210> 183 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 183 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagctatg 58 <210> 184 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 184 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gaggaatg 58 <210> 185 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 185 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gagggatg 58 <210> 186 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 186 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn gaggcatg 58 <210> 187 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 187 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagaaatg 58 <210> 188 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 188 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagagatg 58 <210> 189 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 189 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagacatg 58 <210> 190 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 190 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagatatg 58 <210> 191 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 191 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagcaatg 58 <210> 192 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 192 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagcgatg 58 <210> 193 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 193 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagccatg 58 <210> 194 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 194 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagctatg 58 <210> 195 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 195 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn taggaatg 58 <210> 196 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 196 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn tagggatg 58 <210> 197 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> overlapping tbs 3'KAGNN-Kozak variant <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (19)..(20) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (24)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (34)..(35) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (39)..(40) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n is a, c, g, or t <400> 197 kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn kagnnkagnn taggcatg 58 <210> 198 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mutated splice donor (MSD) region, deltaSL2 <400> 198 ggggcgcaaa aat 13

Claims (92)

  1. 관심 뉴클레오티드(nucleotide of interest) 및 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(tryptophan RNA-binding attenuation protein, TRAP) 결합 부위를 포함하는 핵산 서열; 여기서
    (i) 상기 TRAP 결합 부위는 상기 관심 뉴클레오티드의 시작 코돈 ATG와 중첩되고; 및/또는
    (ii) 상기 핵산 서열은 Kozak 서열을 또한 포함하며, 여기서 상기 TRAP 결합 부위는 Kozak 서열과 중첩된다.
  2. 관심 뉴클레오티드 및 TRAP 결합 부위를 포함하는 핵산 서열; 여기서
    (i) TRAP 결합 부위는 상기 관심 뉴클레오티드의 시작 코돈 ATG의 일부를 포함하거나, 여기서 ATG 시작 코돈은 TRAP 결합 부위의 일부를 포함하고; 및/또는
    (ii) 상기 핵산 서열은 Kozak 서열을 또한 포함하며, 여기서 상기 Kozak 서열은 TRAP 결합 부위의 일부를 포함한다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 뉴클레오티드가 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 서열.
  4. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질과 상호작용할 수 있는 것인 핵산 서열.
  5. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 관심 뉴클레오티드가 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질이 결여된 표적 세포에서 번역되는 것인 핵산 서열.
  6. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2-3의 다중 반복부(repeat)를 포함하는 것인 핵산 서열.
  7. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2의 다중 반복부를 포함하는 것인 핵산 서열.
  8. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2의 적어도 6개의 반복부를 포함하는 것인 핵산 서열.
  9. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2-3의 적어도 8개의 반복부를 포함하는 것인 핵산 서열.
  10. 제9항에 있어서, KAGNNN 반복부의 수가 1개 이하인 핵산 서열.
  11. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2의 적어도 8-11개의 반복부를 포함하는 것인 핵산 서열.
  12. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열 KAGN2-3의 11개의 반복부를 포함하고, 여기서 KAGNNN 반복부의 수가 3개 이하인 핵산 서열.
  13. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, Kozak 서열 및/또는 시작 코돈이 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단과 중첩되는 것인 핵산 서열.
  14. 제13항에 있어서, Kozak 서열 및/또는 시작 코돈이 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부와 중첩되는 것인 핵산 서열.
  15. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Kozak 서열이 서열 RNNATG(서열번호 125) 또는 RVVATG(서열번호 28)를 포함하는 것인 핵산 서열.
  16. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중첩되는 Kozak 서열 및/또는 시작 코돈 및 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 서열번호 29-33 중 어느 하나를 포함하는 것인 핵산 서열.
  17. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 34-37, 69-92 또는 108-112 중 어느 하나, 바람직하게는 서열번호 114를 포함하는 것인 핵산 서열.
  18. 제17항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 34 또는 서열번호 35 중 하나를 포함하는 것인 핵산 서열.
  19. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 시작 사이의 거리가 1 내지 33개 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열.
  20. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 전사 시작 부위/프로모터의 말단에서 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 시작 사이의 거리가 1 내지 12개 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열.
  21. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부가 II형 제한 효소 부위, 바람직하게는 SapI 제한 효소 부위가 결여된 것인 핵산 서열.
  22. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 상류에 5' 리더 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  23. 제22항에 있어서, 상기 리더 서열이 비-코딩 EF1α 엑손 1 영역으로부터 유래된 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  24. 제23항에 있어서, 상기 리더 서열이 서열번호 25 또는 서열번호 26에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  25. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 서열이 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)를 포함하는 것인 핵산 서열.
  26. 제25항에 있어서, 상기 서열이 내부 리보솜 진입 부위(IRES)와 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부 사이에 스페이서(spacer) 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  27. 제26항에 있어서, 상기 스페이서가 0 내지 30개 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열.
  28. 제27항에 있어서, 상기 스페이서가 15개 뉴클레오티드 길이인 핵산 서열.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 및 관심 뉴클레오티드의 하류 개시 코돈으로부터 3 또는 9개 뉴클레오티드인 핵산 서열.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 서열번호 38-44 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하고, 바람직하게는 스페이서가 서열번호 39에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  31. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 관심 뉴클레오티드가 치료 효과를 발생시키는 것인 핵산 서열.
  32. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 RRE 서열 또는 그의 기능적 대체물을 추가로 포함하는 것인 핵산 서열.
  33. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 벡터 전이유전자 발현 카세트인 핵산 서열.
  34. 선행하는 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부가 시작 코돈 ATG의 적어도 첫 번째 뉴클레오티드와 중첩되는 것인 핵산 서열.
  35. 제34항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부가 시작 코돈 ATG의 처음 두 개의 뉴클레오티드와 중첩되는 것인 핵산 서열.
  36. 제34항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 3' 말단 KAGNN 반복부가 코어 Kozak 서열 내에서 시작 코돈 ATG의 첫 번째 뉴클레오티드와 중첩되는 것인 핵산 서열.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 서열번호 114 또는 서열번호 116에 정의된 바와 같은 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  38. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 바이러스 벡터가 하나 이상의 관심 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 관심 뉴클레오티드가 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 작동가능하게 연결된 것인 바이러스 벡터.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 백시니아(vaccinia) 바이러스 또는 배큘로바이러스(baculovirus)로부터 유래된 것인 바이러스 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래되고, 바람직하게는 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된 것인 바이러스 벡터.
  42. 바이러스 벡터의 생산에 필요한 구성요소를 암호화하는 핵산 서열 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 여기서 바이러스 벡터의 RNA 게놈이 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래되고, 바람직하게는 바이러스 벡터가 레트로바이러스 벡터이고 바이러스 벡터 생산 시스템이 Gag 및 Pol 단백질, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, 및 Env 단백질, 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 시스템이 rev 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래되고, 바람직하게는 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래된 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  46. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는, 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물.
  47. 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물.
  48. 제46항 또는 제47항의 DNA 작제물, Gag 및 Pol 단백질을 암호화하는 DNA 작제물, 및 Env 단백질, 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 포함하는 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 작제물 세트로서, 바람직하게는 DNA 작제물 세트가 rev 서열 또는 그의 기능적 대체물을 암호화하는 DNA 작제물을 추가로 포함하는 것인 DNA 작제물 세트.
  49. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열, 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 DNA 작제물을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포.
  50. 제49항에 있어서, 세포가 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 암호화하는 벡터로 일시적으로 형질감염된 것인 바이러스 벡터 생산 세포.
  51. 제49항에 있어서, 세포가 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질을 안정적으로 발현하는 것인 바이러스 벡터 생산 세포.
  52. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열, 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항의 DNA 작제물을 바이러스 벡터 생산 세포 내로 도입하는 단계 및 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건 하에서 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법.
  53. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해, 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하여 또는 제52항의 방법에 의해 생산된 바이러스 벡터.
  54. 제53항에 있어서, 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래된 것인 바이러스 벡터.
  56. 제55항에 있어서, 렌티바이러스로부터 유래된 것인 바이러스 벡터.
  57. 제56항에 있어서, HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래된 것인 바이러스 벡터.
  58. 제38항 내지 제41항 또는 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포.
  59. 의약에 사용하기 위한 제38항 내지 제41항 또는 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 제58항의 세포.
  60. 관심 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하기 위한 약제의 제조를 위한 제38항 내지 제41항 또는 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 제58항의 세포의 용도.
  61. 제38항 내지 제41항 또는 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 제58항의 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
  62. 제38항 내지 제41항 또는 제53항 내지 제57항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 제58항의 세포를 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 핵산 결합 부위에 작동가능하게 연결된 경우 관심 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 부위 및/또는 핵산 결합 단백질을 확인하는 방법으로서, 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 핵산 결합 부위 및 핵산 결합 단백질 둘 다를 포함하는 세포에서 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 리포터 유전자가 형광 단백질을 암호화하는 것인 방법.
  65. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제92항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 핵산 서열, 및 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질(TRAP)을 암호화하는 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 세포에서 관심 뉴클레오티드(NOI)의 번역을 억제하는 방법으로서, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하여 NOI의 번역을 억제하는 것인 방법.
  66. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템 및 트립토판-RNA 결합 감쇠 단백질(TRAP)을 암호화하는 핵산 서열을 진핵생물 벡터 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 진핵생물 벡터 생산 세포에서 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 방법으로서, 여기서 TRAP는 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부에 결합하고 NOI의 번역을 억제함으로써, TRAP 결합 부위가 없는 바이러스 벡터에 비해 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 것인 방법.
  67. 관심 뉴클레오티드, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)에 대한 결합 부위, 다중 클로닝 부위 및 Kozak 서열을 포함하는 핵산 서열로서, 여기서 상기 다중 클로닝 부위가 TRAP 결합 부위의 3' KAGN2 -3 반복부의 하류 및 Kozak 서열의 상류에 위치하거나 이와 중첩되는 것인, 핵산 서열.
  68. 제67항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 45-58 중 어느 하나를 포함하는 것인 핵산 서열.
  69. 제68항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 52-58 중 어느 하나를 포함하는 것인 핵산 서열.
  70. 제69항에 있어서, 상기 핵산 서열이 서열번호 52, 서열번호 55 또는 서열번호 58 중 어느 하나를 포함하는 것인 핵산 서열.
  71. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터-5' UTR 영역을 추가로 포함하는 핵산 서열.
  72. 제71항에 있어서, TRAP 결합 부위 또는 그의 일부 및 Kozak 서열 또는 TRAP 결합 부위, 다중 클로닝 부위 및 Kozak 서열이 프로모터-5' UTR 영역의 5' UTR 내에 위치하는 것인 핵산 서열.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 프로모터-5' UTR 영역이 인트론을 추가로 포함하고, 바람직하게는 인트론이 TRAP 결합 부위 또는 그의 일부의 상류에 있는 것인 핵산 서열.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터-5' UTR 영역이 5' UTR 내에 이종 인트론을 포함하는 조작된 프로모터인 핵산 서열.
  75. 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 핵산 서열로서, 여기서 바이러스 벡터의 RNA 게놈이 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 서열.
  76. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 바이러스 벡터의 RNA 게놈 내에 포함되는 것인 핵산 서열.
  77. 제1항 내지 제37항 또는 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열이 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 것인 핵산 서열.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항의 핵산 서열 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈 내의 주요 스플라이스 공여자 부위(major splice donor site)가 불활성화된 것인 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  79. 제78항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈에서 주요 스플라이스 공여자 부위 및 주요 스플라이스 공여자 부위의 3'의 잠복(cryptic) 스플라이스 공여자 부위가 불활성화되고, 바람직하게는 여기서 잠복 스플라이스 공여자 부위는 주요 스플라이스 공여자 부위의 3'의 첫 번째 잠복 스플라이스 공여자 부위인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  80. 제75항에 있어서, 상기 잠복 스플라이스 공여자 부위가 주요 스플라이스 공여자 부위의 6개 뉴클레오티드 내에 있는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위가 돌연변이되거나 결실된 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 스플라이스 부위의 불활성화 전에 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 94, 96, 97, 102, 103 및/또는 106 중 어느 하나에 기재된 서열에 대해 돌연변이 또는 결실이 있는 서열을 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 13 및 14에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 주요 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 전의 주요 스플라이스 공여자 부위의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 97에 기재된 서열을 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  86. 제79항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 전 잠복 스플라이스 공여자 부위의 뉴클레오티드 서열이 서열번호 103에 기재된 서열을 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  87. 제79항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 불활성화되지 않았다면 서열번호 94의 뉴클레오티드 17 및 18에 상응하는 뉴클레오티드 사이에 절단 부위를 가지는 불활성화된 잠복 스플라이스 공여자 부위를 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  88. 제78항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 95, 98, 99, 100, 101, 104, 105 및/또는 107 중 어느 하나에 기재된 서열을 포함하는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  89. 제78항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 102에 기재된 서열을 포함하지 않는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  90. 제78항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈의 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱 활성이 억제되거나 제거되는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  91. 제78항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터의 RNA 게놈의 주요 스플라이스 공여자 부위 및 잠복 스플라이스 공여자 부위로부터의 스플라이싱 활성이 형질감염된 세포 또는 형질도입된 세포에서 억제되거나 제거되는 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
  92. 제67항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래된 것인, 핵산 서열 또는 바이러스 벡터 생산 시스템.
KR1020227019258A 2019-11-12 2020-11-11 생산 시스템 KR20220097492A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1916452.4A GB201916452D0 (en) 2019-11-12 2019-11-12 Production system
GB1916452.4 2019-11-12
GB2001998.0 2020-02-13
GBGB2001998.0A GB202001998D0 (en) 2020-02-13 2020-02-13 Production system
PCT/GB2020/052873 WO2021094752A1 (en) 2019-11-12 2020-11-11 Production system

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220097492A true KR20220097492A (ko) 2022-07-07

Family

ID=73498074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227019258A KR20220097492A (ko) 2019-11-12 2020-11-11 생산 시스템

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230002777A1 (ko)
EP (1) EP4058067A1 (ko)
JP (1) JP2023504593A (ko)
KR (1) KR20220097492A (ko)
CN (1) CN114667161A (ko)
WO (1) WO2021094752A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB202114528D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
GB202114530D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
GB202114532D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral Vectors
GB202114529D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
GB202114534D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Novel viral regulatory elements
GB202211935D0 (en) 2022-08-16 2022-09-28 Oxford Biomedica Ltd envelope proteins

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5512421A (en) 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
EP0783575B1 (en) 1994-09-19 1999-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Anti-sickling beta-globin protein, compositions and methods for treating sickle cell disease
GB9510272D0 (en) 1995-05-22 1995-07-19 Isis Innovation Retroviral vectors
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
KR20000029858A (ko) 1996-08-07 2000-05-25 마르크 젠너 엠엠피와티엔에프억제활성을갖는히드록삼산및카르복실산유도체
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
ES2153654T3 (es) 1996-10-17 2001-03-01 Oxford Biomedica Ltd Vectores retrovirales.
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
AU742650B2 (en) 1997-10-02 2002-01-10 Altor Bioscience Corporation Soluble single-chain T-cell receptor proteins
CN1322137C (zh) 1997-12-22 2007-06-20 牛津生物医学（英国）有限公司 基于马传染性贫血病毒(eiav)的逆转录病毒载体
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
GB9904905D0 (en) 1999-03-03 1999-04-28 Oxford Biomedica Ltd Cells
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
ES2239246T3 (es) 2001-08-31 2005-09-16 Avidex Limited Receptor soluble de celulas t.
DK2348119T3 (en) 2002-02-01 2017-08-21 Oxford Biomedica (Uk) Ltd Polycistronic lentiviral vector
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
GB0526210D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Vectors
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
US9169491B2 (en) 2008-06-18 2015-10-27 Oxford Biomedica (Uk) Limited Virus purification
JP2015529466A (ja) 2012-09-14 2015-10-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 鎌状赤血球症の幹細胞遺伝子治療のためのレンチウイルスベクター
GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2014-02-05 Oxford Biomedica Ltd Production system
EP3696272A1 (en) 2017-12-22 2020-08-19 Oxford BioMedica (UK) Limited Retroviral vector

Also Published As

Publication number Publication date
US20230002777A1 (en) 2023-01-05
JP2023504593A (ja) 2023-02-06
WO2021094752A1 (en) 2021-05-20
EP4058067A1 (en) 2022-09-21
CN114667161A (zh) 2022-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7340471B6 (ja) ウイルスベクター産生系
US20230002777A1 (en) Production System
US20240052366A1 (en) Production of Lentiviral Vectors
US20230118587A1 (en) Lentiviral Vectors
US20220348958A1 (en) Enhancing Production of Lentiviral Vectors
US20230183742A1 (en) Viral Vector Production
WO2023062365A2 (en) Lentiviral vectors
WO2023062359A2 (en) Novel viral regulatory elements
WO2024038266A1 (en) Envelope proteins
WO2023062366A1 (en) Retroviral vectors
WO2023062367A1 (en) Lentiviral vectors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination