JP7340471B6 - ウイルスベクター産生系 - Google Patents

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Description

本発明はウイルスベクターの製造に関する。より詳細には、本発明は、ウイルスベクタ
ー産生細胞における、ウイルスベクターによりコードされる関心のあるヌクレオチドの翻
訳の修飾に関する。
遺伝子治療は、疾患を治療するために遺伝物質を使用することを広く含む。それは、欠
損遺伝子（例えば、突然変異を含有するもの）を有する細胞における、それらの遺伝子の
機能的コピーでの補充、不適切に機能する遺伝子の不活性化、および新たな治療用遺伝子
の導入を含む。
治療用遺伝物質は、核酸の導入を可能にするベクターを使用して、宿主の標的細胞内に
取り込まれうる。そのようなベクターは一般にウイルスおよび非ウイルスの範疇に分類さ
れうる。
ウイルスは、その複製周期の一部として、その遺伝物質を宿主の標的細胞内に自然に導
入する。操作されたウイルスベクターは、関心のあるヌクレオチド（ＮＯＩ）を標的細胞
へ送達することを可能にするために、この能力を利用する。現在のところ、多数のウイル
スが遺伝子治療用のベクターとして操作されている。これらには、レトロウイルス、アデ
ノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ
）およびワクシニアウイルスが含まれる。
関心のあるヌクレオチドを保持させるための修飾に加えて、ウイルスベクターは、典型
的には、複製欠損型となるように更に操作される。したがって、組換えベクターは標的細
胞に直接感染しうるが、感染性ビリオンの後代を産生し得ない。他のタイプのウイルスベ
クターは癌細胞内のみで条件的に複製可能であり、更に毒性トランスジーン（毒性導入遺
伝子）またはプロ酵素をコードしうる。
レトロウイルスベクターは種々の遺伝障害に対する療法として開発されており、臨床試
験における益々増大する有望さを現在示している（例えば、Ｇａｌｙ，Ａ．およびＡ．Ｊ
．Ｔｈｒａｓｈｅｒ（２０１０）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ １１（６）：５４５－５５０；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｂ．Ｌ．Ｌｅｖｉ
ｎｅ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ａ．ＢａｇｇおよびＣ．Ｈ．Ｊｕｎｅ（２０１１）Ｎ Ｅｎｇｌ
Ｊ Ｍｅｄ ３６５（８）：７２５－７３３；Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ，Ｐ．Ａ．（２
０１２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １９（２）：１２１－１２６；Ｃａｒｔｉｅｒ，Ｎ．，Ｓ
．Ｈａｃｅｉｎ－Ｂｅｙ－Ａｂｉｎａ，Ｃ．Ｃ．Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａｅ，Ｐ．Ｂｏｕｇ
ｎｅｒｅｓ，Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｃ．Ｖ．Ｋａｌｌｅ，Ａ．Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｃａ
ｖａｚｚａｎａ－ＣａｌｖｏおよびＰ．Ａｕｂｏｕｒｇ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ ５０７：１８７－１９８；Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｉ．Ｒｉｖｉｅｒｅ
，Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｆ．Ｂｏｕｌａｄ，Ｓ．Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｐ．Ｇｉａｒｄｉｎａ，Ａ．
Ｍａｇｇｉｏ，Ｒ．Ｇａｌａｎｅｌｌｏ，Ｆ．ＬｏｃａｔｅｌｌｉおよびＥ．Ｙａｎｎａ
ｋｉ（２０１０）Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １２０２：５２－５８；ＤｉＧｉ
ｕｓｔｏ，Ｄ．Ｌ．，Ａ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｌ．Ｌｉ，Ｈ．Ｌｉ，Ｓ．Ｌｉ，Ａ．Ｒａ
ｏ，Ｓ．Ｍｉ，Ｐ．Ｙａｍ，Ｓ．Ｓｔｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ｋａｌｏｓ，Ｊ．Ａｌｖａｒｎａ
ｓ，Ｓ．Ｆ．Ｌａｃｅｙ，Ｊ．Ｋ．Ｙｅｅ，Ｍ．Ｌｉ，Ｌ．Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｄ．Ｈｓｕ
，Ｓ．Ｊ．Ｆｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ．ＲｏｓｓｉおよびＪ．Ａ．Ｚａｉａ（２０１０）Ｓｃ
ｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２（３６）：３６ｒａ４３ならびにＳｅｇｕｒａ ＭＭ，Ｍ
．Ｍ．，Ｇａｉｌｌｅｔ Ｂ，Ｇａｒｎｉｅｒ Ａ．（２０１３）Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉ
ｎｉｏｎ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ）。
そのようなベクターの重要な例には、ガンマ－レトロウイルスベクター系（ＭＭＬＶに
基づくもの）、霊長類レンチウイルスベクター系（ＨＩＶ－１に基づくもの）および非霊
長類レンチウイルスベクター系（ＥＩＡＶに基づくもの）が含まれる。
逆遺伝学は、ウイルスに基づくこれらのベクターが高度に操作されることを可能にして
おり、その結果、適当なＤＮＡ配列での哺乳類細胞のトランスフェクションにより、大き
な異種配列（約１０ｋｂ）をコードするベクターの製造が可能となっている（Ｂａｎｎｅ
ｒｔ，Ｋ．（２０１０）Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：３４７－３７
０に概説されている）。
研究段階でのレトロウイルスベクターの操作および使用は、典型的には、例えばＧＦＰ
またはｌａｃＺをコードするレポーター－遺伝子ベクターの製造を含む。これらの臨床的
に無関係なベクターの力価は、通常、粗回収物１ｍＬ当たり１×１０６～１×１０７ 導
入単位（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ ｕｎｉｔ）（ＴＵ／ｍＬ）の範囲である。更に、この
物質の濃縮および精製は１×１０１０ ＴＵ／ｍＬを超える実施用ストックを与えうる。
しかし、治療的に重要なＮＯＩをコードするベクターの製造は、これらのレポーターベク
ターと比較して実質的に低い力価を与えることが多い。
この結果を潜在的にもたらす幾つかの要因が存在する。
１．治療用ゲノムのサイズ。非常に大きなゲノムがレトロウイルスによりパッケージン
グされうるが、逆転写および／または組込み段階はサイズの増加と共に低効率になると考
えられる。
２．ベクターゲノムＲＮＡの安定性。これはＮＯＩにおける予測されない不安定性要素
の存在により低減されうる。
３．ベクターゲノムＲＮＡ内の最適ではないヌクレオチド使用。野生型ウイルスゲノム
は、しばしば、あるヌクレオチド偏向を有する（例えば、ＨＩＶはＡＴに富む）。ベクタ
ーゲノムはそれほどＡＴには富まない傾向にあり、このことはパッケージングおよび／ま
たは成熟後段階に影響を及ぼしうる。
４．ウイルス産生細胞におけるＮＯＩの発現。（過剰）発現タンパク質はベクタービリ
オン構築および／または感染性に間接的または直接的な影響を及ぼしうる。
本発明者らは、ウイルスベクター産生細胞内のＮＯＩによりコードされるタンパク質の
発現が治療用ベクター力価に悪影響を及ぼしうることを実験的に示した（図３ｉおよび３
ｉｉを参照されたい）。
ＮＯＩによりコードされるタンパク質（関心のあるタンパク質；ＰＯＩ）の、ベクター
ビリオン内への取り込みもベクター粒子の下流プロセシングに影響を及ぼしうる。例えば
、膜貫通ＰＯＩをコードするＮＯＩはウイルスベクタービリオン内の膜貫通タンパク質の
高い表面発現を招いて、ビリオンの物理的特性を潜在的に改変しうる。更に、この取り込
みは送達部位における患者の免疫系にＰＯＩを提示する可能性があり、これはインビボの
治療用遺伝子の導入および／または長期発現に負の影響を及ぼしうる。ＮＯＩは、産生、
精製、回収および免疫原性に影響を及ぼしうる望ましくない二次タンパク質または代謝産
物の産生をも誘導する可能性があり、したがって、これを最小にすることが望ましい。
標的細胞におけるＮＯＩの有効な発現を維持する一方でウイルスベクター産生細胞にお
けるＮＯＩの発現を抑制可能にすることが明らかに必要とされている。どのようなメカニ
ズムが用いられるにせよ、ウイルスベクター粒子の構築およびそれによる機能性の「天然
」経路が妨げられる必要がある。これは容易なことではない。なぜなら、ビリオン内にパ
ッケージングされるウイルスベクターゲノム分子はＮＯＩ発現カセットを必然的にコード
する必要があるからである。換言すれば、ベクターゲノム分子およびＮＯＩ発現カセット
は機能的に連結されているため、ＮＯＩ発現カセットの修飾は、細胞内でベクターゲノム
分子を産生する能力に悪影響を及ぼしうる。ＮＯＩ発現カセットを抑制するために物理的
転写遮断（例えば、ＴｅｔＲレプレッサー系）を用いた場合には、立体障害によりベクタ
ーゲノム分子の産生も抑制される可能性がある。また、制御メカニズムの修飾もビリオン
成熟および放出後のベクターゲノム分子の機能性（すなわち、標的細胞の導入の指令に関
するもの）に悪影響を及ぼすものであってはならない。例えば、レトロウイルスベクター
ゲノムＲＮＡ分子は逆転写および組込みの過程を可能にするものでなければならず、ＮＯ
Ｉ発現カセットに対するいずれの修飾も導入過程におけるこれらの段階を妨げるものであ
ってはならない。
ウイルスベクター産生細胞内のＮＯＩ発現の抑制は更なる利点を示しうる。ＮＯＩ発現
がベクター産生細胞の生存性の低減を招く場合、その抑制は、大きな細胞数を要する大規
模製造に有益となりうる。細胞死による細胞残渣の減少は粗ベクター回収物における不純
度をも低減するであろう。ベクタープラットフォーム（すなわち、同じベクター系内でコ
ードされる種々の治療用遺伝子）のプロセシング（加工）、精製および濃縮は標準化可能
であろう。すなわち、ウイルスベクター産生細胞内で発現される唯一の異種遺伝子が、ベ
クター産生に要求されるものであれば、下流プロセシングは、治療用ベクターのプラット
フォーム全体のために、より容易に最適化されて、ベクター調製物の非常に類似した物理
的仕様をもたらしうるであろう。インビボでの産生ベクターに対する免疫応答の変動性お
よび該ベクターの毒性は最小化可能であり、このことは、標的細胞における、より持続的
な治療用ＮＯＩ発現をもたらしうる。
この問題に対して可能な解決策の一つは、産生細胞内でのＮＯＩの発現を限定する組織
特異的プロモーターである。尤も、これらのプロモーターの漏出性（ｌｅａｋｉｎｅｓｓ
）はトランスジーンタンパク質の不利なレベルを招きうるであろう。しかし、構成的プロ
モーターを使用して、標的細胞におけるＮＯＩの、より大きな及びより頑強な発現が達成
されうる。実際、インビボにおける有効性のためには、そのような頑強な発現がに要求さ
れうる。また、組織特異的プロモーターは、前臨床および臨床開発中に動物モデルからヒ
トへと治療用ベクター産物を追跡する場合、それほど予測可能ではないかもしれない。
発明の陳述
前記のとおり、ウイルスベクター産生細胞におけるウイルスベクター発現カセットによ
りコードされる関心のあるタンパク質（ＰＯＩ）の発現はウイルスベクター治療用物質の
製造に幾つかの問題をもたらしうる。特に、そのような発現はウイルスベクターの力価の
低減、ならびにウイルスベクター粒子内へのＮＯＩコード化タンパク質の望ましくない取
り込み又は該タンパク質との結合を招きうる。
本発明者らは、真核細胞培養内で異種翻訳制御系を使用することで、ＮＯＩの翻訳を抑
制し従ってＮＯＩによってコードされるタンパク質の発現を抑制または予防（阻止）する
ことにより、この問題が克服されうることを、本発明において示した。本発明者らは、驚
くべきことに、この系の使用が、パッケージング可能なベクターゲノム分子の産生もベク
ター粒子の活性も妨げず、標的細胞におけるＮＯＩの長期発現を妨げないことを、本発明
において見出した。
１つの態様においては、本発明は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合
部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細
胞において抑制または予防（阻止）されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相
互作用しうる、核酸配列を提供する。
好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質はトリプトファンＲＮＡ結合減衰
タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば細菌トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質である。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。
本発明のもう１つの態様は、ウイルスベクターの産生に要求される成分をコードする核
酸配列のセットを含むウイルスベクター産生系に関するものであり、ここで、ベクターゲ
ノム配列は本発明の核酸配列を含む。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含む本発明のウイルスベクター産生系
における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含
む本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＤＮＡ構築物の一部または全部ならびにＧａｇ／
Ｐｏｌタンパク質およびＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードするＤＮ
Ａ構築物を含む本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセ
ットに関する。Ｒｅｖを発現するＤＮＡ構築物も該ウイルスベクター産生系において使用
されうる。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ
構築物の全部もしくは一部を含むウイルスベクター産生細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ
構築物の一部もしくは全部をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの
産生に適した条件下で、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法
に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクター産生系により、本発明のウイル
スベクター産生細胞を使用して、または本発明の製造方法により製造されるウイルスベク
ターに関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターが導入された細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、医薬品における使用のための、本発明の核酸配列、ウイル
スベクターまたは導入細胞に関する。
本発明のもう１つの態様は、医薬品における、本発明の核酸配列、ウイルスベクターま
たは導入細胞の使用に関する。
本発明のもう１つの態様は、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達す
るための医薬の製造のための、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは細胞の使用に
関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞を、
それを要する対象に投与することを含む治療方法に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクターまたは導入細胞を、
医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物に関する。
本発明のもう１つの態様は、核酸結合部位に機能的に連結されている場合に関心のある
ヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように相
互作用しうる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を特定する方法に関するも
のであり、ここで、該方法は、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位およ
び核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析すること
を含む。
発明の概括
治療用レトロウイルスベクターを高い又は更には中等度の力価で製造する際の重大な制
約は、特にトランスジーン（導入遺伝子）が強力な構成的プロモーターにより駆動される
場合の、産生細胞におけるトランスジーン／ＮＯＩによりコードされるタンパク質の不利
な発現でありうる。あるトランスジーンタンパク質は、直接的および間接的の両方で、活
性感染性ベクター粒子を産生する細胞の能力に様々な影響を及ぼしうる。細胞代謝、ウイ
ルスベクター粒子構築および／または粒子活性はトランスジーン産物の個々の（既知また
は未知の）作用により影響されうる。産生細胞におけるトランスジーン発現をサイレンシ
ングするための組織特異的プロモーターがこの問題の解決策として使用されているが、こ
のアプローチの重大な欠点は、しばしば、組織特異的プロモーターからの遺伝子発現が構
成的プロモーターからのものほどは頑強ではなく、ベクター開発中に利用される種々の動
物モデルにおいて、より低い予測可能性またはより高い変動性を示しうることである。
本発明者らは、驚くべきことに、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、細菌ｔｒｐオペロン
調節タンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質、ＴＲＡＰ）およびそれが結
合するＲＮＡ標的の新規使用がＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクター産生細胞におけるト
ランスジーン翻訳を抑制または予防することを、本発明において見出した。ＴＲＡＰの場
合、トランスジーン翻訳のこの低減または予防は、あるＮＯＩをコードするベクターに関
するベクター力価の、１００倍もの改善をもたらしうる。この系はベクター産生細胞内ト
ランスジーン抑制系（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）またはＴＲＩＰ系と称される。
本発明者らは、ＮＯＩ ｍＲＮＡの翻訳を抑制することにより真核細胞産生系における
ＲＮＡ（レトロウイルス）ベクター力価を増加させるための、細菌翻訳抑制系の使用を初
めて実証するものである。ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合部位（例えば、ＴＲＡＰ結
合配列、ｔｂｓ）をＮＯＩ翻訳開始コドンの上流に配置することは、ベクターＲＮＡの産
生または安定性に有害な影響を全く及ぼすことなく、内部発現カセットから誘導されるｍ
ＲＮＡの翻訳の特異的抑制を可能にする。本発明者らはまた、レトロウイルスベクターの
産生および機能がベクターゲノム内のｔｂｓの存在によって最低限度で影響されるらしい
ことを示している。これは、逆転写酵素（ＲＴ）がｔｂｓからＴＲＡＰを追い出しうるこ
と、またはビリオン内にパッケージングされる長いベクターゲノムＲＮＡのコンテキスト
（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてはＴＲＡＰがｔｂｓに効率的に結合しないことのいずれかを
示唆している。本発明者らはまた、ＡＡＶのようなＤＮＡウイルスベクターのＮＯＩ発現
カセット内に配置されるｔｂｓの類似配置が、活性ウイルスベクタービリオンの産生を維
持する一方で、ＴＲＡＰによるＮＯＩ翻訳抑制を可能にすることを示している。
ＮＯＩの翻訳開始コドンとｔｂｓとの間のヌクレオチドの数は、好ましくは、ｍＲＮＡ
翻訳の抑制の度合に影響を及ぼすことなく、０～１２ヌクレオチドで変動可能である。い
ずれの理論によっても束縛されるものではないが、ｔｂｓ結合ＴＲＡＰは、４０Ｓスキャ
ニングリボソーム複合体を、それが開始コドンに到達する前に物理的に遮断することによ
り（これが生じないならば、より安定でより高いアフィニティの翻訳装置が形成するであ
ろう）、翻訳開始を抑制しうる。
また、本発明者らは、マルチシストロンｍＲＮＡにおけるＮＯＩの翻訳を抑制するため
に配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の下流にｔｂｓが配置されうることを見出して
いる。実際、これは、ｔｂｓ結合ＴＲＡＰが４０Ｓリボソームの通過を遮断しうること、
すなわち、完全翻訳複合体が形成される前に、ＩＲＥＳ要素が、４０Ｓリボソームサブユ
ニットをｍＲＮＡへとＣＡＰ非依存的に隔離するように機能することの更なる証拠となる
（ＩＲＥＳ翻訳開始に関する総説は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｓ．（２０１２）Ｔｒｅｎｄｓ
ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０（１１）：５５８－５６６を参照されたい）。
ＮＯＩの開始コドンとＩＲＥＳとの間に配置されたｔｂｓ配列は非抑制翻訳レベルに若干
の影響を及ぼしたが、ＴＲＡＰによって機能的に作用される能力を維持した。この知見は
、ウイルスベクターゲノムから発現される単一ｍＲＮＡからの複数のオープンリーディン
グフレームをＴＲＩＰ系が抑制することが可能であることを示している。これは、複数の
治療用遺伝子をコードするベクターを製造する場合、特に、トランスジーン産物の全てが
ベクター力価に或る程度の負の影響を及ぼしうる場合、ＴＲＩＰ系の有用な特徴であろう
。
ｔｂｓ配列の更なる特徴づけは、ＲＮＡ結合タンパク質としてのＴＲＡＰに関して、好
ましくは、少なくとも８個のＲＡＧＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列でＴＲＩＰ系が最大限
度に働くことを明らかにした。尤も、１つの実施形態においては、頑強なトランスジーン
抑制を尚も得るために７個の反復（リピート）が使用可能であり、もう１つの実施形態に
おいては、ベクター力価をレスキューしうるレベルまでのトランスジーンの十分な抑制を
可能にするために６個の反復が使用可能である。ＴＲＡＰ媒介性抑制を維持するためにＲ
ＡＧＮＮコンセンサス配列は改変されうるが、好ましくは、選択された厳密な配列は、非
抑制状態の高レベルの翻訳を確保するために最適化されうる。例えば、ｔｂｓ配列は、ス
プライシング部位、不安定な配列またはステム－ループ［これは、ＴＲＡＰの非存在下（
すなわち、標的細胞内）でｍＲＮＡの翻訳効率を阻害しうる］を除去することにより最適
化されうる。与えられたｔｂｓのＲＡＧＮＮ反復の配置に関しては、ＲＡＧ反復間のＮ「
スペーシング」ヌクレオチドの数は好ましくは２である。しかし、少なくとも２個のＲＡ
Ｇ反復間に２個を超えるＮスペーサーを含有するｔｂｓも許容される（インビトロ結合研
究による判定によれば、３個のＮを含有する反復の５０％もが機能的ｔｂｓを与えうる；
Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。実際
、本発明者らは、１１×ＲＡＧＮＮ ｔｂｓ配列がＲＡＧＮＮＮ反復での３個までの置換
を許容し、ＴＲＡＰ結合と協同して何らかの潜在的に有用な翻訳遮断活性を尚も保有しう
ることを示している。
ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）オープンリーディングフレームは哺乳類（
例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））細胞における発現に関してコ
ドンが最適化されうる。なぜなら、細菌遺伝子配列は哺乳類細胞における発現に非最適で
ある可能性があるからである。該配列は、潜在的な不安定配列およびスプライシング部位
を除去することによっても最適化されうる。ＴＲＡＰタンパク質上のＣ末端で発現される
ＨＩＳ－タグの使用は翻訳抑制に関する利点をもたらすようであり、所望により使用され
うる。このＣ末端ＨＩＳ－タグは真核細胞におけるＴＲＡＰの溶解性または安定性を改善
しうるが、改善される機能的利点は排除され得ない。それでも、ＨＩＳタグ付きＴＲＡＰ
およびタグ無しＴＲＡＰの両方がトランスジーン発現の頑強な抑制を可能にした。ＲＮＡ
結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）転写単位内の或るシス作用性配列も最適化されうる
。例えば、ＥＦ１ａプロモーター駆動性構築物は、一過性トランスフェクションの状況に
おいて、低い投入量のＴＲＡＰプラスミドで、ＣＭＶプロモーター駆動性構築物より良好
な抑制を可能にする。
トランスジーン翻訳の抑制を最大にするためには、ＴＲＩＰ系内のＲＮＡ結合タンパク
質（例えば、ＴＲＡＰ）の頑強な発現が望ましい。高レベルのＲＮＡ結合タンパク質プラ
スミドを含むための要件は一過性ベクター産生系内の他のベクター産生構築物のトランス
フェクションに悪影響を及ぼしうると予想されていた。これは、ゲノム構築物の量／比が
典型的には追加的プラスミドの非存在下で最適化されるからであり、大量のＲＮＡ結合タ
ンパク質コード化プラスミドをコトランスフェクトするための要件はこれらの最適比に悪
影響を及ぼして、ベクター力価の低減を招きうるであろう。しかし、一過性トランスフェ
クションプロトコルを用いた場合、僅か１対１０のＴＲＡＰ対レトロウイルスベクターゲ
ノムプラスミドの比が、最高に近いレベルのトランスジーン抑制を可能にすることが示さ
れた。更に、１対５ものＴＲＡＰ対レトロウイルスベクターゲノムプラスミドの比を用い
た場合、問題の無いＮＯＩを発現するベクターが、最高に近い力価で産生された。したが
って、レトロウイルスベクター産生構築物の一過性トランスフェクション中のこれらの比
較的低い投入量でのＴＲＡＰ発現プラスミドの添加は、そのような構築物の予め最適化さ
れた比に悪影響を及ぼす可能性が低い。ＴＲＡＰ発現プラスミド対ＤＮＡウイルスベクタ
ー成分プラスミド（例えばＡＡＶ）の比も最適化されている。
これらの重要な知見は、一過性トランスフェクションベクター産生プロトコル中にＴＲ
ＩＰ系が使用されうることを示している。ＴＲＩＰ系は安定産生系にも使用可能であり、
したがってウイルスベクター製造に広範に適用可能である。
発明の詳細な説明
次に、非限定的な例により、本発明の種々の好ましい特徴および実施形態を記載する。
本発明の実施は、特に示されていない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学
、微生物学および免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている
。例えば、以下のものを参照されたい：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ
およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １－
３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ａ
ｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５および定期的な補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３および１６，Ｊ
ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．Ｃｒａ
ｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ（１９９０
）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒ
ａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（
編）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅ
ｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐ
ｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。これらの一般的テキストのそれぞれを参照
により本明細書に組み入れることとする。
１つの態様においては、本発明は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合
部位を含む核酸配列を提供し、ここで、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクタ
ー産生細胞において抑制または予防されるように、該結合部位はＲＮＡ結合タンパク質と
相互作用しうる。
「ＲＮＡ結合タンパク質」なる語は、核酸配列に結合しうるタンパク質として理解され
るべきである。本発明の文脈においては、ＲＮＡ結合タンパク質のその結合部位配列への
結合は、該結合部位が機能的に連結されている関心のあるヌクレオチドの翻訳をウイルス
ベクター産生細胞において抑制または予防する効果をもたらす。
好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質はトリプトファンＲＮＡ結合減衰
タンパク質（ＴＲＡＰ）、例えば細菌トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質である。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は細菌保存炭素固定調節系タン
パク質Ａ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ
ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ）（ＣｓｒＡ）である。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は単純ヘルペスウイルス１ＲＮ
Ａ結合タンパク質ＵＳ１１である。
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、バシラス・サチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において詳細に特徴づけられている細菌タンパク質で
ある。それは、転写減衰または翻訳制御メカニズムのいずれかに関与することにより、ｔ
ｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから指令されるトリプトファン生合成を調節する（Ｇｏｌｌｎ
ｉｃｋ，Ｂ．，ＡｎｔｓｏｎおよびＹａｎｏｆｓｋｙ（２００５）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖ
ｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：４７－６８に概説されている）。
ＴＲＡＰは、その天然コンテキストにおいて、以下の３つの異なるメカニズムによりト
リプトファンの生合成および輸送を調節する。
１．ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンの転写の減衰（Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ，Ｋ．Ｍ．，
Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ，Ｈｅｎｎｅｒ ＤＪ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６６：４６１－４７１）。
２．ｔｒｐＥおよびｔｒｐＤシャイン－ダルガルノ遮断性ヘアピンの形成の促進（Ｙ
ａｋｈｎｉｎ Ｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｙａｋｈｎｉｎ ＡＶ，Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００
１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（２０）：５９１８－５
９２６）。
３．ｔｒｐＧおよびｙｈａＧリボソーム結合部位へのリボソームの接近の遮断（Ｙａ
ｎｇ Ｍ，ｄ．Ｓ．Ａ．，ｖａｎ Ｌｏｏｎ ＡＰＧＭ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９
９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４２７２－４２７８
）。
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においては、ＴＲＡＰは
単一遺伝子（ｍｔｒＢ）によりコードされ、機能的タンパク質は、トロイド環として配置
された１１個の同一サブユニットから構成される（Ａｎｔｓｏｎ ＡＡ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏ
ｄｓｏｎ Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ ＲＢ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９
９）Ｎａｔｕｒｅ ４０１（６７５０）：２３５－２４２）。それは、隣接サブユニット
間のポケット内の１１個までのトリプトファン分子に結合することにより、ＲＮＡと相互
作用するように活性化される。標的ＲＮＡはこの四元（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）環構造の
外側を包囲する（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｉｒｅ ＳＪ，Ｙａｎｏｆｓｋ
ｙ Ｃ．（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ２６９：１６５９７－１６６０４）。
理論により束縛されることを望むものではないが、トリプトファン合成のセンシングお
よび制御の天然メカニズムにおいては、ＴＲＡＰは、新たに合成されたＲＮＡリーダー内
の結合部位に結合することにより、転写終結のレベルで作用すると理解される。これは、
重複する抗ターミネーター配列を不安定化させて、下流ｒｈｏ非依存的ターミネーターを
活性にして、短いＲＮＡのみの産生をもたらす。トリプトファンが細菌内で限定的である
場合、ＴＲＡＰ環は、もはや、そのＲＮＡ結合部位に結合できない。したがって、抗ター
ミネーターが活性化され、トリプトファン合成遺伝子オペロンへと転写が継続する。ＴＲ
ＡＰは転写レベルでも作用可能であり、ＲＮＡ転写産物の５’－ＵＴＲ内のＴＲＡＰの結
合部位へのＴＲＡＰのトリプトファン依存的結合は抗シャイン－ダルガルノ配列を遊離さ
せ、これは、翻訳のリボソームイニシエーションが抑制されるように、シャイン－ダルガ
ルノ配列と共に安定なステムを形成しうる。最後に、他の状況においては、ＴＲＡＰがそ
の核酸結合部位に結合すると、それは、４０Ｓスキャニングリボソーム複合体を、それが
開始コドンに到達する前に物理的に遮断することにより（これが生じないならば、より安
定でより高いアフィニティの翻訳装置が形成するであろう）、翻訳開始を抑制しうる。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＮＱＫＨＳＳＤＦＶＶ
ＩＫＡＶＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＴＤＴＫＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＩＩＡＱＦＴＥＨ
ＴＳＡＩＫＶＲＧＥＡＬＩＱＴＡＹＧＥＭＫＳＥＫＫ（配列番号１）を含みうる。
本発明の好ましい実施形態においては、配列番号１は、Ｃ末端において、６個のヒスチ
ジンアミノ酸でタグ化されている（ＨＩＳ×６ タグ）。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎ
ｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＫＥ
ＧＥＥＡＫＴＳＶＬＳＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＶＩＧＬＴＲＧＱＥＴＫＦＡＨＴＥＫ
ＬＤＤＧＥＶＷＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＡＳＥＩＨＴＫＨＧＭＬＦＳＧＲＧＲＮ
ＥＫＧ（配列番号２）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはデスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄ
ｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）に由来する。例えば、
ＴＲＡＰは配列：ＭＮＰＭＴＤＲＳＤＩＴＧＤＹＶＶＶＫＡＬＥＮＧＶＴＩＩＧＬＴＲＧ
ＧＶＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＩＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲＧＲＡＥＬＬＴＫＨ
ＧＫＩＲＴＥＶＤＳ（配列番号３）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＹＴＮＳ
ＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＬＩＡＱ
ＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＳＥＧＫＫ（配列番号４）を含みう
る。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔ
ｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓ７２Ｎに由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：Ｍ
ＹＴＮＳＤＦＶＶＩＫＡＬＥＤＧＶＮＶＩＧＬＴＲＧＡＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶ
ＬＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＶＲＧＫＡＹＩＱＴＲＨＧＶＩＥＮＥＧＫＫ（配列番号５）
を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはビー・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕ
ｒａｎｓ）に由来する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＮＶＧＤＮＳＮＦＦＶＩＫＡＫＥＮ
ＧＶＮＶＦＧＭＴＲＧＴＤＴＲＦＨＨＳＥＫＬＤＫＧＥＶＭＩＡＱＦＴＥＨＴＳＡＶＫＩ
ＲＧＫＡＩＩＱＴＳＹＧＴＬＤＴＥＫＤＥ（配列番号６）を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはカルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマ
ンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）に由来
する。例えば、ＴＲＡＰは配列：ＭＶＣＤＮＦＡＦＳＳＡＩＮＡＥＹＩＶＶＫＡＬＥＮＧ
ＶＴＩＭＧＬＴＲＧＫＤＴＫＦＨＨＴＥＫＬＤＫＧＥＶＭＶＡＱＦＴＥＨＴＳＡＩＫＩＲ
ＧＫＡＥＩＹＴＫＨＧＶＩＫＮＥ（配列番号７）を含みうる。
１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質遺伝
子ファミリーｍｔｒＢ（ＴｒｐＢＰスーパーファミリー、例えば、ＮＣＢＩ保存ドメイン
データベース＃ｃｌ０３４３７）によりコードされる。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは６個のヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳ×６タグ
）でＣ末端においてタグ化されている。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは、配列番号１～７のいずれかに対して５０％
、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有するア
ミノ酸配列を含み、機能的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞におい
て修飾、例えば抑制または予防されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうる。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは、配列番号１～７のいずれかに対して少なく
とも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５
％、９７％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、機能的に連結
されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において修飾、例えば抑制または予防さ
れるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうる。
もう１つの実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）は、機能
的に連結されたＮＯＩの発現がウイルスベクター産生細胞において修飾、例えば抑制また
は予防されるようにＲＮＡ結合部位と相互作用しうるタンパク質をコードするヌクレオチ
ド配列を含むポリヌクレオチドによりコードされうる。例えば、ＴＲＡＰは、配列番号１
～７のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによりコードさ
れうる。
本発明における使用のためのＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰの全変異体、断片
またはホモログは、ＮＯＩ（これはマーカー遺伝子でありうる）の翻訳がウイルスベクタ
ー産生細胞において抑制または予防されるように本発明の結合部位に結合する能力を保有
する。
核酸結合部位
「結合部位」なる語は、あるタンパク質と相互作用しうる核酸配列として理解されるべ
きである。本発明の核酸結合部位は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質、例えばトリプトフ
ァンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）と相互作用しうるものでありうる。
ＴＲＡＰの場合、ＴＲＡＰに結合しうるコンセンサス核酸結合部位配列は、複数回（例
えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回以上）反復する［ＲＡＧＮＮ］であり、その
ような配列は天然ｔｒｐオペロンにおいて見出される。天然の状況においては、時にはＡ
ＡＧＮＮが許容され、時には追加的な「スペーシング」Ｎヌクレオチドが機能的配列を与
える。インビトロ実験は、少なくとも６個またはそれ以上のコンセンサス反復がＴＲＡＰ
－ＲＮＡ結合に要求されることを示している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍ
ｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
１７８（１７）：５１５９－５１６３）。したがって、好ましくは、１つの実施形態にお
いては、ｔｂｓ内に６個以上の連続的［ＲＡＧＮ ＞２ ］配列が存在し、ここで、ＲはＤＮ
ＡにおけるＴまたはＧおよびＲＮＡにおけるＵまたはＧでありうる。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰ結合部位は配列ＲＡＧＮ ＞２ （例えば、
ＲＡＧＮ２－３）を含む。したがって、疑義を回避するために示すと、この核酸結合部位
は、例えば、配列ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮま
たはＴＡＧＮＮＮのいずれかを含む。
「Ｎ」は、配列内のその位置におけるいずれかのヌクレオチドを特定するものとして理
解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵでありうるであろう。その
ようなヌクレオチドの数は好ましくは２であるが、１１×反復ｔｂｓの、３個までの、例
えば１個、２個または３個のＲＡＧ反復が３個のスペーシングヌクレオチドにより分離さ
れていることが可能であり、翻訳抑制を招く何らかのＴＲＡＰ結合活性を尚も保有しうる
。好ましくは、翻訳抑制を招く最大ＴＲＡＰ結合活性を保有させるために、１１×反復ｔ
ｂｓにおいて、１個以下のＮ３スペーサーが使用される。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位はＲＡＧＮ ＞２ の複数反復（例えば、Ｒ
ＡＧＮ２－３の複数反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は配列ＲＡＧＮ２の複数反復を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２ の、少なくとも６個の
反復（例えば、ＲＡＧＮ２－３の、少なくとも６個の反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、少なくとも６個の反
復を含む。例えば、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、６、７、８、９、１０、１１、１２
個またはそれ以上の反復を含みうる。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２ の、少なくとも８個の
反復（例えば、ＲＡＧＮ２－３の、少なくとも８個の反復）を含む。
好ましくは、核酸結合部位に存在するＲＡＧＮＮＮ反復の数は１以下である。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２ の、１１個の反復（例
えば、ＲＡＧＮ２－３の、１１個の反復）を含む。好ましくは、この核酸結合部位に存在
するＲＡＧＮＮＮ反復の数は３以下である。
もう１つの実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ ＞２ の、１２個の反復（例
えば、ＲＡＧＮ２－３の、１２個の反復）を含む。
好ましい実施形態においては、核酸結合部位は、ＲＡＧＮ２の、８～１１個の反復（例
えば、ＲＡＧＮ２の、８、９、１０または１１個の反復）を含む。
例えば、ＴＲＡＰ結合部位は以下の配列のいずれかを含みうる：
ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡ
ＧＡＧＡＣＧＡＧＵＧＧＡＧＣＵ（配列番号８）；または
ＧＡＧＵＵＵＡＧＣＧＧＡＧＵＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＣＣＵＡＧＣＡ
ＧＡＧＡＣＧＡＧＡＡＧＡＧＣＵ（配列番号９）。
「ＲＡＧＮ ＞２ の反復」は、一般的なＲＡＧＮ ＞２ （例えばＲＡＧＮ２－３）モチーフ
が反復していることであると理解されるべきである。このモチーフの基準を満足する種々
のＲＡＧＮ ＞２ 配列が、核酸結合部位を構成するために加わりうる。生じる核酸結合部位
は、このモチーフの要件を満足するただ１個の配列の反復に限定されるとは意図されない
が、この可能性も該定義に含まれる。例えば、「ＲＡＧＮ ＞２ の、６個の反復」は以下の
配列を含むが、それらに限定されるものではない：
ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ（配列番号
１０）；
ＵＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ（配列番号
１１）；
ＧＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ（配列
番号１２）；および
ＵＡＧＵＵＵ－ＧＡＧＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵＵ－ＵＡＧＵＵ－ＧＡＧＵＵ（配列
番号１３）（ここにおけるダッシュ記号は、明確化のために、該反復間に含まれているに
過ぎない）。
１個のＲＡＧＮＮＮ反復と７個のＲＡＧＮＮ反復とを含有する８反復ｔｂｓはＴＲＡＰ
媒介性抑制活性を保有する。１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有する８個未満の反復のｔｂ
ｓ配列（例えば、７または６反復ｔｂｓ配列）はより低いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を有し
うる。したがって、８個未満の反復が存在する場合、ｔｂｓはＲＡＧＮＮ反復のみを含む
を含むことが好ましい。
ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスにおける使用のための好ましいヌクレオチドは以下のとお
りである：
・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の最初の位置におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・Ｒ位におけるＧ。
ＮＮスペーサー位置がＡＡである場合、Ｒ位にＧが使用されることも好ましい（すなわ
ち、コンセンサス配列における反復としてＴＡＧＡＡは使用されないことが好ましい）。
「相互作用しうる」は、細胞、例えばウイルスベクター産生真核細胞において生じる条
件下、核酸結合部位がタンパク質、例えばＴＲＡＰに結合しうることとして理解されるべ
きである。ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰとのそのような相互作用は、核酸結合
部位が機能的に連結されているＮＯＩの翻訳の抑制または予防をもたらす。
「機能的に連結」は、記載されている成分が、それらの意図される様態でそれらが機能
することを可能にする関係で存在することとして理解されるべきである。したがって、Ｎ
ＯＩに機能的に連結されている本発明のＲＮＡ結合部位は、ＲＮＡ結合タンパク質、例え
ばＴＲＡＰがＲＮＡ結合部位に結合した場合にＮＯＩの翻訳が修飾されるように位置する
。
与えられたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＯＩ翻訳開始コドンの上流の
ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ結合配列；ｔｂｓ）と相互作用しうる核酸結合
部位の配置は、そのＯＲＦに由来するｍＲＮＡの特異的翻訳抑制を可能にする。翻訳開始
コドンおよびＴＲＡＰ結合部位を分離しているヌクレオチドの数は、抑制の度合に影響を
及ぼすことなく、様々となることが可能であり、例えば０～１２ヌクレオチドでありうる
。もう１つの例として、翻訳開始コドンおよびＴＲＡＰ結合部位を分離するために０～４
３ヌクレオチドが使用されうる。
ＮＯＩの翻訳の抑制または予防は、同等の時点で本発明の核酸結合部位の非存在下で発
現される量と比較した場合の、ウイルスベクター産生中に翻訳されるＮＯＩの産物（例え
ば、タンパク質）の量の変化として理解されるべきである。翻訳のそのような変化は、Ｎ
ＯＩによりコードされるタンパク質の発現の、結果として生じる抑制または予防をもたら
す。
本発明の１つの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクタ
ー産生細胞において抑制または予防されるように、核酸結合部位はＲＮＡ結合タンパク質
、例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）と相互作用しうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター産生におけ
る同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６
０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．
５％または０．１％に低減されうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩの翻訳は、ベクター産生におけ
る同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で翻訳される量の９０％、８０％、７０％、６
０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．
５％または０．１％未満に低減されうる。
ＮＯＩの翻訳の予防（阻止）は、翻訳の量を実質的にゼロに低減することとして理解さ
れるべきである。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベ
クター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で発現される量の９０％、８
０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、
２％、１％、０．５％または０．１％に低減されうる。
ベクター産生中のいずれかの与えられた時点でのＮＯＩからのタンパク質の発現は、ベ
クター産生における同じ時点で本発明の核酸配列の非存在下で発現される量の９０％、８
０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、
２％、１％、０．５％または０．１％未満に低減されうる。
ＮＯＩからのタンパク質の発現の予防（阻止）は、発現されるタンパク質の量を実質的
にゼロに低減することとして理解されるべきである。
ＮＯＩの翻訳の分析および／または定量のための方法は当技術分野でよく知られている
。
細胞溶解細胞からのタンパク質産物は、クーマシーまたは銀染色による可視化を伴うＳ
ＤＳ－ＰＡＧＥ分析のような方法を用いて分析されうる。あるいは、タンパク質産物は、
タンパク質産物に結合する抗体プローブを使用するウエスタンブロット法または酵素結合
イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析されうる。無傷細胞におけるタン
パク質産物は免疫蛍光による分析されうる。
関心のあるヌクレオチド
本発明の１つの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク
質、例えばトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）を欠く標的細胞におい
て翻訳される。
「標的細胞」は、それにおいてＮＯＩを発現させることが望ましい細胞として理解され
るべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを使用して標的細胞内に導入されう
る。標的細胞への送達はインビボ、エクスビボまたはインビトロで行われうる。
好ましい実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは治療効果をもたらす。
ＮＯＩは治療または診断用途を有しうる。適当なＮＯＩには、酵素、補因子、サイトカ
イン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一
本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タ
ンパク質のトランスドメイン陰性突然変異体、毒素、条件的毒素、抗原、腫瘍抑制タンパ
ク質、増殖因子、膜タンパク質、受容体、血管作動性タンパク質およびペプチド、抗ウイ
ルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、関連レポーター基
を有する誘導体）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。Ｎ
ＯＩはマイクロＲＮＡをもコードしうる。理論により束縛されることを望むものではない
が、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰにより抑制されると考えられている。
１つの実施形態においては、ＮＯＩは神経変性障害の治療において有用でありうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩはパーキンソン病の治療において有用でありう
る。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する酵素をコードし
うる。例えば、該酵素は以下のものの１以上でありうる：チロシンヒドロキシラーゼ、Ｇ
ＴＰ－シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。
３つ全ての遺伝子の配列が入手可能である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション
番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０）。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコ
ードしうる。もう１つの実施形態においては、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパ
デカルボキシラーゼをコードするＮＯＩおよびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含みうる
。そのようなゲノムはパーキンソン病の治療において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と共
に使用されうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは治療用タンパク質または治療用タンパク質の
組合せをコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）
、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフ
ィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因
子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－
α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ
－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－Ａおよび
ＰＤＦＧ－Ｂのヘテロおよびホモ二量体からなる群から選択されるタンパク質をコードし
うる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小
板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、インターフェロ
ン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ－ベータおよびチューブダウン（ｔ
ｕｂｅｄｏｗｎ）－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗
ＶＥＧＦ抗体またはそれらのフラグメント（断片）／変異体、トロンボスポンジン、ＶＥ
ＧＦ受容体タンパク質、例えばＵＳ ５，９５２，１９９およびＵＳ ６，１００，０７
１に記載されているもの、ならびに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される抗血
管新生タンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子
（ＣＦＴＲ）をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は眼細胞において発現されるタンパク
質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は光受容細胞および／または網膜色素
上皮細胞において発現されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用性
受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチン網膜アセチルトランスフェラ
ーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、網膜グアニル酸シクラー
ゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、Ｌ
ＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、Ｅ
ＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、
ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ハルモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）、Ｒａｂエスコート
（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ ２９０、ＲＰＧＲ、
ＲＳ１、ＲＰ１．ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素およびオプチシン（ｏｐｔｉｃｉｎ
）を含む群から選択されるタンパク質をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩはヒト第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子をコードしう
る。
他の実施形態においては、ＮＯＩはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（
ＴＣＲ）をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、共通ガンマ鎖（
ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、アルファガラク
トシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒ
ドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィ
リノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラー
ゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン
（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イズロニダーゼ、イズロン酸
スルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラ
ン－α－グルコサミニド Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、３ Ｎ－アセチルグルコサ
ミン ６スルファターゼ、ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ、β－ガラクトシダー
ゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒ
アルロニダーゼをコードしうる。
ＮＯＩに加えて、該ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを
含む又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ ３７：１２８１－１２８８）。
適応症
本発明の、レトロウイルスおよびＡＡＶベクターを含むベクターは、ＷＯ １９９８／
０５６３５、ＷＯ １９９８／０７８５９、ＷＯ １９９８／０９９８５に挙げられてい
る障害の治療において有用な１以上のＮＯＩを送達するために使用されうる。関心のある
ヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。そのような疾患の例を以下に記載する。
サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制または免疫刺激活性（例えば、ヒト
免疫不全ウイルス感染を含む免疫不全の治療、リンパ球増殖の調節、癌および多数の自己
免疫疾患の治療、ならびに移植拒絶反応の予防または腫瘍免疫の誘導のためのもの）；造
血の調節（例えば、骨髄またはリンパ系疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組
織の成長の促進（例えば、創傷治癒、熱傷、潰瘍および歯周病および神経変性の治療のた
めのもの）；卵胞刺激ホルモンの抑制または活性化（生殖能力の調節）；走化性／ケモキ
ネシス活性（例えば、特定の細胞型を損傷または感染部位に動員するためのもの）；止血
および血栓溶解活性（例えば、血友病および脳卒中の治療のためのもの）；抗炎症活性（
例えば、敗血症性ショックまたはクローン病の治療のためのもの）；マクロファージ抑制
および／またはＴ細胞抑制活性、したがって抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に
関連しない応答を含む、細胞性および／または体液性免疫応答に対する抑制効果）；細胞
外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着するマクロファージおよびＴ細胞の能
力の抑制、ならびにＴ細胞におけるアップレギュレーションｆａｓ受容体発現に応答する
障害。
悪性障害、例えば癌、白血病、良性および悪性腫瘍の増殖、浸潤および広がり、血管新
生、転移、腹水および悪性胸水。
自己免疫疾患、例えば関節炎、例えば関節リウマチ、過敏症、アレルギー反応、喘息、
全身性エリテマトーデス、コラーゲン疾患および他の疾患。
血管疾患、例えば動脈硬化症、アテローム硬化性心疾患、再灌流障害、心停止、心筋梗
塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛およびアスピ
リン依存性抗血栓症、脳卒中、脳虚血、虚血性心疾患または他の疾患。
胃腸管の疾患、例えば消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病および他の疾患。
肝疾患、例えば肝線維症、肝硬変または他の疾患。
腎および泌尿器疾患、例えば甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の疾患。
耳、鼻および咽喉障害、例えば中耳炎または他の耳鼻咽喉疾患、皮膚炎または他の皮膚
疾患。
歯科および口腔障害、例えば歯周病、歯周炎、歯肉炎または他の歯科／口腔疾患。
精巣疾患、例えば精巣炎または精巣上体－精巣炎、不妊症、睾丸外傷または他の精巣疾
患。
婦人科疾患、例えば胎盤機能不全、胎盤不全、習慣流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症
およびその他の婦人科疾患。
眼科学的障害、例えば後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、
脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、緑内障、例えば開放隅角緑内障および若年性先
天性緑内障、眼内炎症、例えば網膜炎または嚢胞様黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、網膜
色素変性症、黄斑変性、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および若年性黄斑変性、例えば
ベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性、スタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網
膜ジストロフィー、ソービー黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、錐体桿体ジストロ
フィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバ
ー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディー症候群、小口病、変性眼底疾患、眼外傷、感染
によって引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過剰瘢痕化
、例えば緑内障濾過手術後のもの、眼用インプラントに対する反応、角膜移植片拒絶反応
、ならびに他の眼疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞、ＲＬＢＰ１関連網膜ジ
ストロフィー、脈絡膜欠如および色盲。
神経学的および神経変性障害、例えばパーキンソン病、パーキンソン病の治療からの合
併症および／または副作用、エイズ関連認知症症候群ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデ
ナム舞踏病、アルツハイマー病および他のＣＮＳ変性疾患、病態または障害、脳卒中、ポ
リオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性汎脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害
、亜急性神経障害、慢性神経障害、ポンペ病、ギラン・バレー症候群、シドナム舞踏病、
重症筋無力症、擬似腫瘍大脳、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ
外傷またはＣＮＳ感染、筋委縮およびジストロフィー、中枢および末梢神経系の疾患、病
態または障害、運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋委縮症、脊髄
および剥離損傷。
他の疾患および病態、例えば嚢胞性線維症、ムコ多糖症、例えばサンフィリポ症候群Ａ
、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎
症、出血、凝血および急性期応答、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、
感染性疾患、手術の合併症または副作用、骨髄移植または他の移植合併症および／または
副作用、遺伝子治療の合併症および副作用、例えばウイルスキャリアまたはエイズの感染
によるもの、体液性および／または細胞性免疫応答を抑制または阻害するためのものによ
って生じるもの、天然または人工細胞、組織および器官、例えば角膜、骨髄、臓器、臓器
、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織の移植の場合の移植拒絶の予防およ
び／または治療のためのものによって生じるもの。
ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
ある他の実施形態においては、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは生物
において天然で産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、それらの少なくとも一
部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの当初のメンバーはｌｅｔ
－７およびｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、蠕虫の発生中に内因性タンパク質コ
ード化遺伝子の発現を調節する小さな高度に保存されたＲＮＡ種をコードしている。該活
性ＲＮＡ種は最初は～７０ｎｔの前駆体として転写され、これは～２１ｎｔの成熟形態へ
と転写後プロセシングされる。ｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４は共にヘアピンＲＮＡ前駆体
として転写され、これらはダイサー酵素によりそれらの成熟形態へとプロセシングされる
。
該ベクターは、ＮＯＩに加えて、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを含み
又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３
７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
３７：１２８１－１２８８）。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により引き起こされる転写後遺伝子スプライシング（ＰＴ
ＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御メカニズムである。ウ
イルスまたはトランスポゾンのような要素のランダムな組込みは、相同一本鎖ｍＲＮＡま
たはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こす
と考えられている（Ｒａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：
４２９－４３３）。ＲＮＡｉのメカニズムは約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ
の二本鎖への長いｄｓＲＮＡのプロセシングを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配
列特異的メディエーターである低分子干渉またはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と
称される。分化哺乳類細胞においては、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡはインターフェロン
応答を活性化して、タンパク質合成の阻止および非特異的ｍＲＮＡ分解を招くことが判明
している（Ｓｔａｒｋら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：２２７－６４（１
９９８））。しかし、この応答は、培養哺乳類細胞内で遺伝子機能が分析されることを可
能にする２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することにより迂回されうる（Ｅｌｂａｓｈ
ｉｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ ３；２０（２３）：６８７７－８８（２００１），Ｈｕ
ｔｖａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ ３，２９３（５５３１）：８３４－８．Ｅ
ｕｐｕｂ Ｊｕｌ １２（２００１））。
ベクター
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列を含むウイルスベクターに関する。
ベクターは、１つの環境からもう１つの環境への実体の導入を可能にし又は促進する手
段である。例示すれば、本発明においては、組換え核酸技術において使用される幾つかの
ベクターは、核酸のセグメント（例えば異種ＤＮＡセグメント、例えば異種ｃＤＮＡセグ
メント）のような実体が標的細胞内に導入されることを可能にする。ベクターは、異種核
酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞内に維持する目的、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡのセ
グメントを含むベクターの複製または核酸のセグメントによりコードされるタンパク質の
発現を促進する目的を達成しうる。
本発明のベクターは、例えば、複製起点、所望により、該ポリヌクレオチドの発現のた
めのプロモーター、および所望により、該プロモーターの調節因子を備えたウイルスベク
ターでありうる。ベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシ
ン耐性遺伝子）および／または追跡可能なマーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰをコードする
遺伝子）を含有しうる。ベクターは、例えば、標的細胞に感染させ、および／または導入
するために使用されうる。
本発明のベクターは、インビトロで和合性標的細胞においてＮＯＩを複製するために使
用されうる。したがって、本発明は、インビトロで和合性標的細胞内に本発明のベクター
を導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下、該標的細胞を増殖させることによる、インビ
トロでのタンパク質の製造方法を提供する。タンパク質は、当技術分野でよく知られた方
法により標的細胞から回収されうる。適当な標的細胞には、哺乳類細胞系および他の真核
細胞系が含まれる。
ベクターは発現ベクターでありうる。本明細書に記載されている発現ベクターは、転写
されうる配列を含有する核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲ
ＮＡをコードする配列がこの定義に含まれる。好ましくは、発現ベクターは、標的細胞に
よるコード配列の発現をもたらしうる制御配列に機能的に連結された本発明のポリヌクレ
オチドを含む。
ウイルスベクター
本発明の１つの実施形態においては、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベ
クターはベクター、ベクタービリオンまたはベクター粒子とも称されうる。
もう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレトロウイルス、アデノウイルス
、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイ
ルスに由来する。
本発明の抑制系は任意のウイルスベクター系に有益であると予想される。該系は、関心
のあるヌクレオチドが例えばウイルスベクター産生細胞に又はビリオン構築中に有害な影
響をもたらす場合に特に有用であろう。
もう１つの実施形態においては、レトロウイルスは泡沫状ウイルスに由来する。
もう１つの実施形態においては、レトロウイルスベクターはレンチウイルスに由来する
。
もう１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、
ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
ベクター力価
ウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法が存在する、と当業者は理解する
であろう。力価は、しばしば、導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として記載される。力価は
、感染粒子の数を増加させることにより、およびベクター調製物の特異的活性を増加させ
ることにより増加しうる。
レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター
本発明のレトロウイルスベクターは任意の適当なレトロウイルスから誘導（由来）され
うる又は誘導可能でありうる。多数の異なるレトロウイルスが特定されている。具体例に
は以下のものが含まれる：マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス
（ＨＴＬＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、
藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ ＭＬＶ）、ＦＢ
Ｒマウス骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏ－ＭＳ
Ｖ）、アベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス－２９
（ＭＣ２９）およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）。レトロウイルスの詳細な一覧はＣ
ｏｆｆｉｎら（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ
Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３において見出されうる。
レトロウイルスは大雑把には２つの範疇、すなわち、「単純」および「複合」に分類さ
れうる。レトロウイルスは更に７つの群に分類されうる。これらの群のうちの５つは、発
癌能を有するレトロウイルスに相当する。残りの２つの群はレンチウイルスおよびスプー
マウイルスである。これらのレトロウイルスの概説はＣｏｆｆｉｎら（１９９７），前掲
に記載されている。
レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本構造は多数の共通の特徴を有し、そ
れらには、例えば、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ（それらの間または内部に、ゲノムがパ
ッケージングされることを可能にするパッケージングシグナルが位置する）、プライマー
結合部位、標的細胞ゲノム内への組込みを可能にする組込み部位、ならびにウイルス粒子
の構築に必要なポリペプチドであるパッケージング成分をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよ
びｅｎｖ遺伝子が挙げられる。レンチウイルスは追加的な特徴、例えば、ＨＩＶにおける
ｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列を有し、これらは、感染標的細胞の核から細胞質への、組
込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物の効率的な輸出を可能にする。
プロウイルスにおいては、これらの遺伝子は両端で、長末端反復（ＬＴＲ）と称される
領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込みおよび転写をもたらす。ＬＴＲはエ
ンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。
ＬＴＲはそれら自体が同一の配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つの要素に
分類されうる。Ｕ３はＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端に
おいて反復する配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。それ
らの３つの要素のサイズはレトロウイルスよって大きく変動しうる。
本発明の典型的なレトロウイルスベクターにおいては、複製に必須の領域をコードする
１以上のタンパク質の少なくとも一部が該ウイルスから除去されうる。、例えば、ｇａｇ
／ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないこと又は機能的でないことが可能である。これは該ウ
イルスベクターを複製欠損型にする。
また、標的の非分裂細胞に導入可能であり、および／またはウイルスゲノムを宿主ゲノ
ム内に組込むことが可能な本発明の候補核酸結合配列を含むベクターを作製するために、
ウイルスゲノムの部分は、ベクターゲノム内のレポーター遺伝子および調節制御領域に機
能的に連結された本発明の候補核酸結合配列をコードするライブラリーにより置換されう
る。
レンチウイルスはレトロウイルスの、より大きな群の一部である。レンチウイルスの詳
細な一覧はＣｏｆｆｉｎら（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆ
ｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３に見出されうる
。簡潔に説明すると、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類されうる。霊長
類レンチウイルスの例には、ヒト自己免疫不全症候群（エイズ）の原因因子であるヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これ
らに限定されるものではない。非霊長類レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」
ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ
）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）およびウシ
免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。
レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感
染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢ
Ｏ Ｊ １１（８）：３０５３－３０５８ならびにＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１
９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。これとは対照的に、ＭＬＶの
ような他のレトロウイルスは非分裂細胞または遅く分裂する細胞（例えば、筋肉、脳、肺
および肝組織を構成する細胞）には感染できない。
本明細書中で用いるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスから誘導可能な少なく
とも１つの成分部分を含むベクターである。好ましくは、その成分部分は、該ベクターが
細胞に感染し、遺伝子を発現し、または複製される生物学的メカニズムに関与する。
レンチウイルスベクターは霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）または非霊長
類レンチウイルスに由来しうる。
非霊長類レンチウイルスの例は、霊長類に天然で感染しないレンチウイルス科の任意の
メンバーであることが可能であり、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイ
ルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶ
Ｖ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を包含しうる。
一般的には、典型的なレトロウイルスベクター産生系は必須ウイルスパッケージング機
能からのウイルスゲノムの分離を含む。図１に示されているとおり、これらの成分は、別
々のＤＮＡ発現カセット（あるいは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物または
発現構築物として知られている）上で産生細胞に付与される。
ベクターゲノムはＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグ
ナル（ψ）、ＮＯＩを保持する内部発現カセット、（所望により）転写後要素（ＰＲＥ）
、３’－ｐｐｕおよび自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを要する。ベクターゲノムＲＮＡお
よびＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化ならびに逆転写の過程のために、Ｒ
－Ｕ５領域が必要である。ベクターゲノムは、所望により、ＷＯ ２００３／０６４６６
５に記載されているオープンリーディングフレームを含みうる。
パッケージング機能はｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。これらは産生細胞に
よるベクター粒子の産生のために必要である。ゲノムへのトランスでのこれらの機能の付
与は複製欠損型ウイルスの産生を促進する。
ガンマ－レトロウイルスベクターの産生系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌお
よびｅｎｖ発現構築物を要する３成分系である。ＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベク
ターの産生系は更に、ベクターゲノムがｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を含むための、トラン
スで付与されるアクセサリー遺伝子ｒｅｖを要する。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベ
クターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合には、ｒｅｖを要さ
ない（ＷＯ ２００３／０６４６６５を参照されたい）。
通常、ベクターゲノムカセット内でコードされる「外部」プロモーター（これはベクタ
ーゲノムカセットを駆動する）および「内部」プロモーター（これはＮＯＩカセットを駆
動する）の両方は、その他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核または
ウイルスプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、Ｐ
ＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０およびユビキチンプロモーターが含まれる。強力な「合成
」プロモーター、例えば、ＤＮＡライブラリーにより作製されたプロモーター（例えば、
ＪｅＴプロモーター）が、転写を駆動するために使用されうる。あるいは、転写を駆動す
るためには、例えば以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（
Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（Ｃ
ＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフ
ィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ
）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモ
ーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌ
ｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモータ
ー、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、
ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－
２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプ
ロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロ
モーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
レトロウイルスベクターの産生（製造）はこれらのＤＮＡ成分での産生細胞の一過性ト
ランスフェクションまたは安定なプロデューサー細胞系（ＰＣＬ）の使用を含み、ここで
、該成分は産生細胞ゲノム内に組込まれる（Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒ
ｏｕｘ－Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓおよ
びＰ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６（６）：８０５－
８１４ Ｅｐｕｂ ２００９ Ｍａｒ ２００５）。もう１つのアプローチは、安定なパ
ッケージング細胞（該細胞内にパッケージング成分が安定に組込まれている）を使用する
こと、および次いで必要に応じて、ベクターゲノムプラスミドにおける一過性トランスフ
ェクションを行うことである。本発明のウイルスベクターを作製するためには、産生細胞
は、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰタンパク質）を発現する能力を有する必要
がある。したがって、本発明の１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパ
ク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現する。本発明のもう１つの実施形態におい
ては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現する
。本発明のもう１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、
ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現し、そしてまた、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡ
Ｐ）構築物を一過性に発現する。
ＴＲＩＰ系は主にレトロウイルスベクターの製造に関して記載されているが、他のウイ
ルスベクターにも類似戦略が適用されうることに留意すべきである。
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡ
Ｖはレンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明における使用に特に好ましい
。ＥＩＡＶは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、３つの他の遺伝子、すなわ
ち、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードしている。ＴａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化
因子として作用し（ＤｅｒｓｅおよびＮｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １
９４（２）：５３０－５３６ ならびにＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２
００（２）：６３２－６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）を介してウイルス遺
伝子の発現を調節し、統合する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６
８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用メカニズムは霊長類
ウイルスにおける同様のメカニズムに大雑把には類似していると考えられている（Ｍａｒ
ｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２
の機能は未知である。また、ＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが特定されており、これは、膜貫
通タンパク質の開始部位におけるｅｎｖコード配列へとスプライシングされるｔａｔの第
１エキソンによりコードされている。本発明のもう１つの実施形態においては、ウイルス
ベクターはＨＩＶに由来する。ＨＩＶがＥＩＡＶと異なるのは、それがＳ２をコードして
いないが、ＥＩＡＶとは違って、それがｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをコードし
ている点である。
「組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）なる語は、標的細
胞に感染しうるウイルス粒子内へのＲＮＡゲノムのパッケージングをパッケージング成分
の存在下で可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを意味する。
標的細胞への感染は逆転写および標的細胞ゲノム内への組込みを含みうる。ＲＲＶは、該
ベクターにより標的細胞へと送達されるべき非ウイルスコード配列を保持する。ＲＲＶは
、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生する非依存的複製の能力を有さない。通
常、ＲＲＶは機能的ｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子、ならびに／または複
製に必須の他の遺伝子を欠く。
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書中で用いる「最小ウイルスゲノム」なる語は、標的細胞への関心のあるヌクレ
オチド配列の感染、導入および送達のための必要な機能性を付与するのに必須の要素を保
有させながら非必須要素を除去するためにウイルスベクターが操作されていることを意味
する。この方法の更なる詳細はＷＯ １９９８／１７８１５およびＷＯ ９９／３２６４
６に見出されうる。最小ＥＩＡＶベクターはｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２を欠き、これらの
遺伝子のいずれもが産生系においてトランスで付与されない。最小ＨＩＶベクターはｖｉ
ｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆを欠く。
しかし、産生細胞内でベクターゲノムを産生させるために使用される発現プラスミドは
、産生細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指令するための、レトロウイル
スゲノムに機能的に連結された転写調節制御配列を含む。これらの調節配列は、転写され
るレトロウイルス配列に関連した天然配列、すなわち、５’Ｕ３領域であることが可能で
あり、あるいはそれらは異種プロモーター、例えば別のウイルスプロモーター、例えばＣ
ＭＶプロモーター（後記）であることが可能である。幾つかのレンチウイルスベクターゲ
ノムは効率的なウイルス産生のための追加的配列を要する。例えば、特にＨＩＶの場合に
は、ＲＲＥ配列が含まれうる。しかし、ＲＲＥの必要性（およびトランスで付与されるｒ
ｅｖに対する依存性）はコドン最適化によって低減または排除されうる。この方法の更な
る詳細はＷＯ ２００１／７９５１８において見出されうる。ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機
能を果たす代替的配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体がメイソ
ン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスにおいて見出される。これは
構成的輸送要素（ＣＴＥ）として公知であり、感染細胞内の因子と相互作用すると考えら
れているゲノム内のＲＲＥ型配列を含む。該細胞因子はｒｅｖ類似体とみなされうる。し
たがって、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替物としてＣＴＥが使用されうる。公知の又は利用可能
となる任意の他の機能的等価体が本発明に関連がありうる。例えば、ＨＴＬＶ－１のＲｅ
ｘタンパク質はＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質に機能的に取って代わりうることが公知で
ある。ＲｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法において使用されるベクターにおいて存在し
ないか又は非機能的であることが可能であり、二者択一で、ｒｅｖおよびＲＲＥ、または
機能的に等価な系が存在することが可能である。
ＳＩＮベクター
本発明の方法において使用されるベクターは、好ましくは、ウイルスエンハンサーおよ
びプロモーター配列が欠失した自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用される。ＳＩＮベクタ
ーは製造可能であり、野生型ベクターの場合に類似した有効性でインビボ、エクスビボま
たはインビトロで非分裂標的細胞に導入されうる。ＳＩＮプロウイルスにおける長末端反
復（ＬＴＲ）の転写不活性化は複製可能ウイルスによる動員を妨げるはずである。これは
、ＬＴＲのシス作用性効果を排除することにより内部プロモーターからの遺伝子の調節発
現をも可能にするはずである。
例えば、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、転写エンハンサーまたはエンハン
サーおよびプロモーター（３’ＬＴＲのＵ３領域内のもの）を欠失させることにより構築
されている。ベクターの逆転写および組込みのラウンドの後、これらの変化が５’および
３’ＬＴＲの両方にコピーされて、転写的に不活性なプロウイルスを与える。しかし、そ
のようなベクターにおけるＬＴＲに対して内部のいずれかのプロモーターは転写的に尚も
活性であろう。この戦略は、内部に位置する遺伝子からの転写の際のウイルスＬＴＲにお
けるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために用いられている。そのよう
な効果には、転写の増強または転写の抑制が含まれる。この戦略は、ゲノムＤＮＡ内への
３’ＬＴＲから下流転写を排除するためにも用いられうる。これは、いずれかの内因性癌
遺伝子の偶発的活性化を予防することが重要なヒト遺伝子治療において特に関心が持たれ
る。Ｙｕら（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４－９８；Ｍａｒｔｙら（１９９０）Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５－７；Ｎａｖｉａｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
７０：５７０１－５；Ｉｗａｋｕｍａら（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０－３２
；Ｄｅｇｌｏｎら（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９－
９０。ＳＩＮレンチウイルスベクターはＵＳ ６，９２４，１２３およびＵＳ ７，０５
６，６９９に記載されている。
非複製型レンチウイルスベクター
複製欠損型レンチウイルスベクターのゲノムにおいては、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／また
はｅｎｖの配列が突然変異している、存在しない、および／または機能的でないことが可
能である。
本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいては、ウイルス複製に必須のタンパク
質に関する１以上のコード領域の少なくとも一部が該ベクターから除去されうる。これは
ウイルスベクターを複製欠損型にする。非分裂標的細胞に導入可能であり、および／また
はウイルスゲノムを標的細胞ゲノム内に組込むことが可能なＮＯＩを含むベクターを作製
するために、ウイルスゲノムの部分も、関心のあるヌクレオチド（ＮＯＩ）により置換さ
れうる。
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターは、ＷＯ ２００６／０１０８３
４およびＷＯ ２００７／０７１９９４に記載されている非組込み性ベクターである。
もう１つの実施形態においては、該ベクターは、ウイルスＲＮＡを欠損している又は欠
いている配列を送達する能力を有する。もう１つの実施形態においては、送達されるべき
ＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇにとって異種）およびＧａｇまたはＧａｇ
Ｐｏｌ上の同族（コグネイト）結合ドメインが、送達されるべきＲＮＡのパッケージング
を確保するために使用されうる。これらのベクターは共にＷＯ ２００７／０７２０５６
に記載されている。
アデノウイルスベクター
本発明のもう１つの実施形態においては、ベクターはアデノウイルスベクターでありう
る。アデノウイルスは、ＲＮＡ中間体を介しては複製されない二本鎖線状ＤＮＡウイルス
である。遺伝子配列に基づいて６個の亜群に分類されるアデノウイルスの５０以上の異な
るヒト血清型が存在する。
アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡ非エンベロープウイルスであり、これは、ヒトおよび非
ヒト由来の広範な細胞型にインビボ、エクスビボおよびインビトロで導入されうる。これ
らの細胞には、呼吸気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、初代乳腺上皮
細胞および有糸分裂後終末分化細胞、例えばニューロンが含まれる。
アデノウイルスベクターは非分裂細胞にも導入可能である。これは、肺上皮内の罹患細
胞が遅い代謝回転速度を有する嚢胞性線維症のような疾患の場合に非常に重要である。実
際、罹患成人嚢胞性線維症患者の肺内への嚢胞性線維症トランスポーター（ＣＦＴＲ）の
アデノウイルス媒介性導入を利用する幾つかの治験が進行中である。
アデノウイルスは遺伝子治療用および異種遺伝子発現用のベクターとして使用されてい
る。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは８ｋｂまでの外来インサートＤＮＡを収容可能であり、
相補細胞系において効率的に複製されて、１０１２導入単位／ｍｌまでの非常に高い力価
を示しうる。したがって、アデノウイルスは、初代非複製細胞における遺伝子の発現を研
究するための最良の系の１つである。
アデノウイルスゲノムからのウイルス遺伝子または外来遺伝子の発現は複製細胞を要さ
ない。アデノウイルスベクターは受容体媒介性エンドサイトーシスにより細胞に侵入する
。細胞内に一旦入れば、アデノウイルスベクターは宿主染色体内にはめったに組込まれな
い。それよりむしろ、それらは宿主核内で線状ゲノムとしてエピソーム的に（宿主ゲノム
から独立して）機能する。
アデノ随伴ウイルスベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明において使用される魅力的なベクター系であ
る。なぜなら、それは高い組込み頻度を有し、それは非分裂細胞に感染可能だからである
。このため、それは哺乳類細胞内への遺伝子の送達に有用となる。ＡＡＶは広範な感染宿
主域を有する。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は米国特許第５，１３９
，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号（それぞれを参照により本明細書に組
み入れることとする）に記載されている。
組換えＡＡＶベクターはマーカー遺伝子およびヒト疾患に関与する遺伝子のインビトロ
、エクスビボおよびインビボ導入のために成功裏に使用されている。
大きなペイロード（ｐａｙｌｏａｄ；負荷）（８～９ｋｂまで）を効率的に組込みうる
或るＡＡＶベクターが開発されている。１つのそのようなベクターはＡＡＶ５カプシドお
よびＡＡＶ２ ＩＴＲを有する（Ａｌｌｏｃｃａ Ｍら，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ（
２００８）１１８：１９５５－１９６４）。
単純ヘルペスウイルスベクター
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、ニューロンに自然感染するエンベロープ二本鎖Ｄ
ＮＡウイルスである。それは外来ＤＮＡの大きな断片を収容可能であり、このため、それ
はベクター系として魅力的なものとなり、ニューロンへの遺伝子送達用のベクターとして
使用されている（Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉｅｔら Ｏｐｅｎ Ｖｉｒｏｌ Ｊ．（２０１０
）４：１２３－１５６）。
治療方法におけるＨＳＶの使用は、株を、それが溶解サイクルを確立し得ないように弱
毒化することを要する。特に、ＨＳＶベクターをヒトにおける遺伝子治療に使用する場合
には、ポリヌクレオチドは、好ましくは、必須遺伝子内に挿入されるべきである。これは
、ウイルスベクターが野生型ウイルスと遭遇すると、野生型ウイルスへの異種遺伝子の導
入が組換えにより生じうるからである。しかし、ポリヌクレオチドが必須遺伝子内に挿入
される限り、この組換え導入は受容ウイルスにおける必須遺伝子を欠失させ、複製可能野
生型ウイルス集団内への異種遺伝子の「脱出」を防ぐであろう。
ワクシニアウイルスベクター
本発明のベクターはワクシニアウイルスベクター、例えばＭＶＡまたはＮＹＶＡＣであ
りうる。ワクシニアベクターの代替物には、鶏痘またはカナリア痘（ＡＬＶＡＣとして公
知である）のようなアビポックスベクター、およびそれらに由来する株であって、ヒト細
胞に感染し、ヒト細胞において組換えタンパク質を発現するが、複製不能であるものが含
まれる。
バキュロウイルスベクター
また、本発明のベクターはバキュロウイルスベクターでありうる。哺乳類細胞における
コード化ＮＯＩの発現を可能にするバキュロウイルスの修飾は当技術分野でよく知られて
いる。これは、例えば、ＮＯＩの上流の哺乳類プロモーターの使用により達成されうる。
複数のＮＯＩをコードするベクター
１つの実施形態においては、ベクターは２以上のＮＯＩを含み、ここで、１以上のＮＯ
Ｉは本発明の核酸結合部位に機能的に連結されている。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
前記のとおり、本発明のベクターは２以上のＮＯＩを含みうる。これらのＮＯＩが発現
されるためには、ベクターゲノム内に２以上の転写単位（各ＮＯＩにつき１個）が存在し
うる。しかし、レトロウイルスベクターは、それが遺伝的に単純な状態で維持されている
場合、最高の力価および最強の遺伝子発現特性を与えることが、文献から明らかであり（
ＷＯ ９６／３７６２３；Ｂｏｗｔｅｌｌら，１９８８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，２４６
４；Ｃｏｒｒｅｌｌら，１９９４ Ｂｌｏｏｄ ８４，１８１２；Ｅｍｅｒｍａｎおよび
Ｔｅｍｉｎ １９８４ Ｃｅｌｌ ３９，４５９；Ｇｈａｔｔａｓら，１９９１ Ｍｏｌ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１，５８４８；Ｈａｎｔｚｏｐｏｕｌｏｓら，１９８９ ＰＮ
ＡＳ ８６，３５１９；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕら，１９９１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２
６６，８４１６；Ｈａｔｚｏｇｌｏｕら，１９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３，
１７７９８；Ｌｉら，１９９２ Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．３，３８１；ＭｃＬａｃｈ
ｌｉｎら，１９９３ Ｖｉｒｏｌ．１９５，１；Ｏｖｅｒｅｌｌら，１９８８ Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．８，１８０３；Ｓｃｈａｒｆｍａｎら，１９９１ ＰＮＡＳ ８８
，４６２６；Ｖｉｌｅら，１９９４ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １，３０７；Ｘｕら，１９８
９ Ｖｉｒｏｌ．１７１，３３１；Ｙｅｅら，１９８７ ＰＮＡＳ ８４，５１９７）、
したがって、ポリシストロンメッセージにおける第２（および後続）のコード配列の翻訳
を開始するために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用することが好ましい（Ａ
ｄａｍら １９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。
レトロウイルスベクター内へのＩＲＥＳ要素の挿入はレトロウイルス複製サイクルに適
合し、単一プロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍら（前記
）；Ｋｏｏら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎら １
９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳ要素は、それがウイル
スタンパク質のキャップ（ｃａｐ）非依存的翻訳を促進する、ピコルナウイルスの非翻訳
５’末端において、最初に見出された（Ｊａｎｇら（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２
９２－３０９）。ＩＲＥＳ要素は、ＲＮＡにおけるオープンリーディングフレーム間に位
置する場合、ＩＲＥＳ要素におけるリボソームの進入およびそれに続く下流の翻訳開始を
促進することにより、下流オープンリーディングフレームの効率的発現を可能にする。
ＩＲＥＳの概説はＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５
ｖｏｌ １１，Ｎｏ ５：１７９－１８４）に示されている。多数の異なるＩＲＥＳ配列
が公知であり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８－５８５９（１９９１））；ＢｉＰタンパク質［
ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；ショ
ウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ
）［Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３－１６５３（１９
９２）］からのもの、ならびにポリオウイルス（ＰＶ）におけるもの［Ｐｅｌｌｅｔｉｅ
ｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０－３２５（１９８８）；ま
た、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９－１８４（１９８５）
も参照されたい］を包含する。
ＰＶ、ＥＭＣＶおよびブタ水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳ要素はレトロウイルスベクタ
ーにおいて既に使用されている（Ｃｏｆｆｉｎら，前記）。
「ＩＲＥＳ」なる語は、ＩＲＥＳとして働く又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列
または配列の組合せを含む。
ＩＲＥＳはウイルス由来（例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤ
Ｖ ２Ａ様配列）または細胞由来（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎ
ｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）でありうる。
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始しうるためには、それはベクターゲノムに
おいて該ポリヌクレオチドの間または前に位置するべきである。
プロモーター
ＮＯＩの発現は、プロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む制御
配列を使用して制御されうる。原核プロモーターおよび真核細胞において機能的なプロモ
ーターが使用されうる。組織特異的または刺激特異的プロモーターが使用されうる。２以
上の異なるプロモーターからの配列要素を含むキメラプロモーターも使用されうる。
適当なプロモーター配列は強力プロモーターであり、それらには、ウイルス、例えばポ
リオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫
ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス４
０（ＳＶ４０）のゲノムに由来するもの、あるいは、異種哺乳類プロモーター、例えばア
クチンプロモーター、ＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫまたはリ
ボソームタンパク質プロモーターが含まれる。あるいは、転写を駆動するために、例えば
以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシ
ンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特
異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）
、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ア
ストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－
アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナ
ーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター
、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモ
ーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３
、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、Ｇ
ＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンド
グリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８
プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
遺伝子の転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することにより、更に増強され
うる。エンハンサーは比較的、配向および位置に非依存的であるが、真核細胞ウイルス由
来のエンハンサー、例えば、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ １００～
２７０）、およびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーを使用することが可能である。エ
ンハンサーはプロモーターに対して５’または３’側の位置においてベクター内にスプラ
イシングされうるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置する。
プロモーターは、適当な標的細胞における発現を確保または増強するための特徴を更に
含みうる。例えば、該特徴は保存領域、例えばプリブナウボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ Ｂ
ｏｘ）またはＴＡＴＡボックスでありうる。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現の
レベルに影響を及ぼす（例えば、該レベルを維持、増強または低減する）他の配列を含有
しうる。適当な他の配列には、Ｓｈ１－イントロンまたはＡＤＨイントロンが含まれる。
他の配列には、誘導可能要素、例えば、温度、化学物質、光またはストレスにより誘導可
能な要素が含まれる。また、転写または翻訳を増強するための適当な要素が存在しうる。
トランスジーンを駆動する組織特異的プロモーターを含む構成的および／または強力プ
ロモーターが望ましい場合、そして特に、産生細胞におけるトランスジーンタンパク質の
発現がベクター力価の減少を招く、および／またはトランスジーン由来タンパク質のウイ
ルスベクター送達ゆえにインビボで免疫応答を惹起する場合に、ＲＮＡ結合タンパク質－
結合部位（例えば、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用は、レトロウイルスベクターの産生のた
めのトランスジーンタンパク質抑制系の基礎を形成するのに有用でありうる。図４は、こ
れがその好ましい形態においてどのように適用されうるかの一例を示す。
パッケージング配列
本発明の文脈において用いる「パッケージングシグナル」なる語は互換的に「パッケー
ジング配列」または「ｐｓｉ」とも称され、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ
鎖のカプシド形成に要求される非コード化シス作用性配列に関して用いられる。ＨＩＶ－
１においては、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇ
ａｇ開始コドンまで伸長する遺伝子座に位置づけられている。ＥＩＡＶにおいては、パッ
ケージングシグナルはＧａｇの５’コード領域内へのＲ領域を含む。
本明細書中で用いる「拡張パッケージングシグナル」または「拡張パッケージング配列
」なる語は、ｇａｇ遺伝子内へと更に拡張された、ｐｓｉ配列の周囲の配列の使用に関す
るものである。これらの追加的パッケージング配列の含有はウイルス粒子内へのベクター
ＲＮＡの挿入の効率を増加させうる。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡカプシド形成決定因子は離散的および不連続的
であり、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の１つの領域（Ｒ－Ｕ５）、およびｇａｇの近位３１
１ｎｔ内に位置づけられるもう１つの領域を含む（Ｋａｙｅら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ
；６９（１０）：６５８８－９２（１９９５））。
ウイルスベクター産生系および細胞
本発明のもう１つの態様は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸配
列のセットを含むウイルスベクター産生系に関するものであり、ここで、該ベクターゲノ
ム配列は本発明の核酸配列を含む。
「ウイルスベクター産生系」または「ベクター産生系」または「産生系」は、ウイルス
ベクター産生のための必要な成分を含む系として理解されるべきである。
したがって、該ベクター産生系は、ウイルスベクター粒子の産生に必要な成分をコード
する核酸配列のセットを含む。１つのそのような核酸配列は、ＲＮＡ結合タンパク質をコ
ードする遺伝子を含みうる。好ましい実施形態においては、ＲＮＡ結合タンパク質は細菌
ＴＲＡＰである。
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターであ
り、ウイルスベクター産生系は更に、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質ならびにＥ
ｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードする核酸配列と、本発明の結合部位
を含むベクターゲノム配列とを含む。該産生系は、所望により、Ｒｅｖタンパク質をコー
ドする核酸配列を含みうる。
本発明のウイルスベクター産生系のもう１つの実施形態においては、ウイルスベクター
はレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する。
もう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはレンチウイルスに由来する。もう
１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩ
Ｖ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
本発明のもう１つの態様は本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮ
Ａ構築物に関する。そのようなＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）は、本発明の核酸配
列を含むベクターゲノム構築物を含みうる。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰをコード
する核酸配列を含む、本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築
物に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のＤＮＡ構築物と、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタ
ンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードするＤＮＡ構築
物とを含む、本発明のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセッ
トに関する。
本発明の１つの実施形態においては、ＤＮＡ構築物のセットは更に、ＲＮＡ結合タンパ
ク質、例えばＴＲＡＰをコードするＤＮＡ構築物を含む。
本発明の１つの実施形態においては、ＤＮＡ構築物のセットは更に、Ｒｅｖタンパク質
またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む。
本発明の１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ構築
物の一部もしくは全部を含むウイルスベクター産生細胞に関する。
「ウイルスベクター産生細胞」は、ウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産
生しうる細胞として理解されるべきである。ウイルスベクター産生細胞は「プロデューサ
ー細胞」または「パッケージング細胞」でありうる。ウイルスベクター系の、１以上のＤ
ＮＡ構築物は、ウイルスベクター産生細胞内に安定に組込まれ、またはエピソーム的に維
持されうる。あるいは、ウイルスベクター系のＤＮＡ成分の全てはウイルスベクター産生
細胞内に一過性にトランスフェクトされうる。更にもう１つの代替形態においては、該成
分の幾つかを安定に発現する産生細胞が、残りの成分で一過性にトランスフェクトされう
る。
ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）をコードするＤＮＡ発現カセットはウイル
スベクター産生細胞内に安定に組込まれ、またはエピソーム的に維持されうる。あるいは
、ＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）をコードするＤＮＡ発現カセットはウイル
スベクター産生細胞内に一過性にトランスフェクトされうる。
したがって、本発明の１つの実施形態においては、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質
（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現する。本発明のもう１つの実施形態においては
、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現するで
あろう。
要求される抑制のレベルはＮＯＩによって様々でありうる。したがって、該産生細胞に
おいて要求されるＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）のレベルもＮＯＩに左右さ
れうる。したがって、幾つかの場合には、安定な及び一過性のＲＮＡ結合タンパク質（例
えば、ＴＲＡＰ）発現の組合せが望まれうる。安定発現は産生細胞における継続したレベ
ルのＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらし、一方、一過性発現は、より短い期間の、増加
したレベルのＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらしうる。例えば、より問題のある／毒性
のトランスジーンの抑制は、ベクター産生中の既存（例えば、安定発現によりもたらされ
る）および高レベルの両方のＲＮＡ結合タンパク質から利益を得ることが可能である。
したがって、本発明のもう１つの実施形態においては、該産生細胞はＲＮＡ結合タンパ
ク質（例えば、ＴＲＡＰ）構築物を安定に発現し、そしてまた、ＲＮＡ結合タンパク質（
例えば、ＴＲＡＰ）構築物を一過性に発現する。一過性発現は、安定発現によってもたら
されるものより高いレベルの短期間のＲＮＡ結合タンパク質発現をもたらしうる。
「安定発現」は、安定発現をもたらす構築物からのＲＮＡ結合タンパク質の発現が長期
間にわたって実質的に変動しないこととして理解されるべきである。
「一過性発現」は、一過性発現をもたらす構築物からのＲＮＡ結合タンパク質の発現が
長期間にわたって安定でないこととして理解されるべきである。好ましくは、一過性発現
をもたらすＲＮＡ結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは産生細胞ゲノム内に組
込まれず、産生細胞内にエピソーム的に維持されない。
本明細書中で用いる「パッケージング細胞」は、感染性ベクター粒子の産生に必要な要
素を含有するがベクターゲノムを欠く細胞を意味する。典型的には、そのようなパッケー
ジング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ
）を発現しうる１以上の発現カセットを含有する。
プロデューサー細胞／パッケージング細胞は任意の適当な細胞型のものでありうる。プ
ロデューサー細胞は一般に哺乳類細胞であるが、例えば昆虫細胞でありうる。
本明細書中で用いる「プロデューサー／産生細胞」または「ベクター産生細胞」は、レ
トロウイルスベクター粒子の産生およびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）の発
現に必要な要素の全てを含有する細胞を意味する。
産生細胞は安定プロデューサー細胞系であることが可能であり、または一過性に誘導さ
れることが可能である。
本発明の１つの実施形態においては、エンベロープおよびヌクレオカプシド、ＲＮＡ結
合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）、および存在する場合のｒｅｖヌクレオチド配列は全
て、プロデューサーおよび／またはパッケージング細胞内に安定に組込まれる。しかし、
これらの配列のいずれかの１以上はエピソーム形態で存在することも可能であり、遺伝子
発現はエピソームから生じることが可能であり、あるいは産生細胞内に一過性にトランス
フェクトされることが可能であろう。
ベクター産生細胞は、インビトロで培養された細胞、例えば組織培養細胞系でありうる
。適当な細胞系には、哺乳類細胞、例えばマウス線維芽細胞由来の細胞系またはヒト細胞
系が含まれるが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ベクター産生細胞はヒ
ト細胞系に由来する。
１つの実施形態においては、本発明のベクターは、ＮＯＩに機能的に連結された本発明
の結合部位、ｇａｇ－ｐｏｌ成分、エンベロープおよびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、
ＴＲＡＰ）を含むベクターゲノムを発現する４つの転写単位を、その産生系として使用す
る。エンベロープ発現カセットはＶＳＶ－Ｇのような幾つかの異種エンベロープの１つを
含みうる。所望により、ｒｅｖ成分も含まれうる。
ウイルスベクターの製造方法
本発明のもう１つの態様は、本発明の核酸配列、ウイルスベクター産生系またはＤＮＡ
構築物の一部もしくは全部をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの
産生に適した条件下、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法に
関する。
適当な「産生細胞」は、適当な条件下で培養された場合にウイルスベクターまたはウイ
ルスベクター粒子を産生しうる細胞である。それらは一般に哺乳類またはヒト細胞、例え
ばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－ＴまたはＣＨＯ細胞であるが、例え
ば昆虫細胞、例えばＳＦ９細胞でありうる。
産生細胞はまた、鳥類細胞、例えばＥＢ６６（登録商標）（Ｓｉｇｍａ）細胞でありう
る。鳥類細胞は、ウイルスに基づくヒト用および獣医学用ワクチン、例えばインフルエン
ザおよびニューカッスル病ウイルスワクチンに特に有用でありうる。
産生細胞内に核酸を導入する方法は当技術分野でよく知られており、既に記載されてい
る。
１つの実施形態においては、産生細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、トリプトファ
ンＲＮＡ結合減衰タンパク質；ＴＲＡＰ）を含む。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクター産生系により、本発明のウイル
スベクター産生細胞を使用して、または本発明の製造方法により製造されるウイルスベク
ターに関する。
１つの実施形態においては、ウイルスベクター粒子は核酸結合部位を含む。ウイルスベ
クター粒子はレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来しうる。
レトロウイルスベクター粒子はレンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクター粒
子はＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビス
ナレンチウイルスに由来しうる。
レンチウイルスベクターの製造方法および特にレンチウイルスベクターのプロセシング
はＷＯ ２００９／１５３５６３に記載されている。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターが導入された細胞に関する。
「ウイルスベクター粒子が導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子によって運ばれ
る核酸が導入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。
シュードタイピング
１つの好ましい態様においては、本発明のウイルスベクターはシュードタイピング（偽
型化）されている。これに関して、シュードタイピングは１以上の利点をもたらしうる。
例えば、ＨＩＶに基づくベクターのｅｎｖ遺伝子産物はこれらのベクターを、ＣＤ４と称
されるタンパク質を発現する細胞のみに感染することに制限するであろう。しかし、これ
らのベクター内のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルスからのｅｎｖ配列で置換され
ている場合、それらはより広い感染スペクトルを有しうる（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ
（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例えば、研究者は
、ＨＩＶに基づくベクターをＶＳＶ由来の糖タンパク質でシュードタイピングしている（
ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－
２４２）。
もう１つの代替形態においては、Ｅｎｖタンパク質は修飾Ｅｎｖタンパク質、例えば突
然変異体または操作されたＥｎｖタンパク質でありうる。修飾は、標的化能を導入するた
めに、または毒性を低減するために、または別の目的のために行われ、または選択されう
る（Ｖａｌｓｅｓｉａ－Ｗｉｔｔｍａｎら １９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５６
－６４；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０－２８６；
およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２－１８０９お
よびそれらにおいて引用されている参考文献）。
ベクターは、選ばれた任意の分子でシュードタイピングされうる。
ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（
Ｇ）は、あるエンベロープウイルスおよびウイルスベクタービリオンをシュードタイピン
グしうることが示されたエンベロープタンパク質である。
レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下、ＭｏＭＬＶに基づくレトロウイル
スベクターをそれがシュードタイピングしうることはＥｍｉら（（１９９１）Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）により最初に示された。Ｗ
Ｏ １９９４／２９４４４０は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで成功裏にシュー
ドタイピング（シュードタイプ化）されうることを教示している。これらのシュードタイ
プ化ＶＳＶ－Ｇベクターは、広範な哺乳類細胞に導入するために使用されうる。その後、
Ａｂｅら（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（８）６３５６－６３６１は、非感染性レト
ロウイルス粒子がＶＳＶ－Ｇの付加により感染性にされうることを教示している。
Ｂｕｒｎｓら（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：
８０３３－７）はレトロウイルスＭＬＶをＶＳＶ－Ｇで成功裏にシュードタイピングし、
これは、天然形態のＭＬＶと比較して変化した宿主域を有するベクターを与えた。ＶＳＶ
－Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳類細胞だけでなく、魚類、爬虫類および昆虫に由
来する細胞系にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）前掲）。それ
らは、種々の細胞系に関して、通常のアンホトロピックエンベロープより効率的であるこ
とも示されている（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ９１：９５６４－９５６８，Ｅｍｉら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、あるレトロウイルス
をシュードタイピングするために使用されうる。なぜなら、その細胞質尾部はレトロウイ
ルスのコアと相互作用しうるからである。
ＶＳＶ－Ｇタンパク質のような非レトロウイルスシュードタイピングエンベロープの提
供は、感染性の低下を伴うことなくベクター粒子が高い力価まで濃縮されうるという利点
をもたらす（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－５）。レト
ロウイルスエンベロープタンパク質は超遠心分離中のセン断力に耐えることができないよ
うである。なぜなら、おそらく、それらは、非共有結合により結合した２つのサブユニッ
トからなるからであろう。そららのサブユニット間の相互作用は遠心分離により破壊され
うる。一方、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位から構成されている。したがって、ＶＳＶ
－Ｇタンパク質シュードタイピングは潜在的な利点をもたらしうる。
ＷＯ ２０００／５２１８８は、膜関連ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性
口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定なプロデューサー細胞系から
のシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク
質の遺伝子配列を提供している。
ロスリバーウイルス
非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイピングするために、ロスリ
バーウイルスエンベロープが使用されており、全身投与後、主に肝臓に導入された（Ｋａ
ｎｇら（２００２）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６（１８）：９３７８－９３８８）。効率は、Ｖ
ＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものより２０倍大きいと報告された。そし
て、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによる測定では、それはそれほど大きな細胞毒
性を引き起こさなかった。
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床的および商業的用途に必要な高力価ウイ
ルスの大規模製造において使用されるウイルスベクターのためのＶＳＶ－Ｇの代替物とな
ることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ
Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇシ
ュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似した広
い指向性および類似した天然力価を有する。ＧＰ６４の発現は細胞を殺さないため、ＧＰ
６４を構成的に発現する２９３Ｔに基づく細胞系が作製されうる。
代替エンベロープ
ＥＩＡＶをシュードタイピングするために使用された場合に合理的な力価を与える他の
エンベロープには、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）、狂犬病、エボラおよびＬＣＭＶ（リンパ球
性脈絡髄膜炎ウイルス）が含まれる。４０７０Ａでシュードタイピングされたレンチウイ
ルスの、マウスへの静脈内注入は、肝臓において最大の遺伝子発現をもたらした。
ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは一本鎖または二
本鎖でありうる。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一ポ
リペプチドをコードしうる、と当業者により理解されるであろう。また、本発明のポリペ
プチドが発現されることになるいずれかの特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させる
ために、通常の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチ
ド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を当業者が行いうる、と理解されるべきであ
る。
該ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能ないずれかの方法により修飾されうる。
そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増加させるた
めに行われうる。
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは組換え法、合成法または当業者に
利用可能ないずれかの手段により製造されうる。それらはまた、標準的な技術によってク
ローニングされうる。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えば、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて製造される。これは、クローニングしたい標
的配列に隣接するプライマー（例えば、約１５～３０ヌクレオチドのもの）のペアを作製
し、動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと該プライマーを接触させ
、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された断片
を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することにより）単離し、増幅されたＤ
ＮＡを回収することを含む。該プライマーは、増幅されたＤＮＡが適当なベクター内にク
ローニングされうるように適当な制限酵素認識部位を含有するように設計されうる。
タンパク質
本明細書中で用いる「タンパク質」なる語は一本鎖ポリペプチド分子および複数のポリ
ペプチドの複合体（この場合、個々の構成ポリペプチドは共有的手段または非共有的手段
により連結されている）を含む。本明細書中で用いる「ポリペプチド」および「ペプチド
」なる語は、単量体がアミノ酸でありペプチド結合またはジスルフィド結合により互いに
連結された重合体を意味する。
変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片
本明細書に記載されている特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はそ
れらの変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片の使用をも含む。
本発明の場合には、いずれかの与えられた配列の変異体は、問題のポリペプチドまたは
ポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保有するように残基（アミノ酸残
基も核酸残基も含む）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然に
存在するタンパク質において存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、
置換および／または変異により得られうる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して本明細書中で用いる「誘導体」なる語
は、生じるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを保有する
限り、配列からの又は配列に対する、１つ（以上）のアミノ酸残基の、いずれかの置換、
変異、修飾、置き換え、欠失および／または付加を含む。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書に記載されている「類似体」な
る語は、いずれかの模倣体、すなわち、それが模倣しているポリペプチドまたはポリヌク
レオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化合物を含む。
典型的には、アミノ酸置換は、要求される活性または能力を修飾配列が保有する限り、
例えば、１、２または３個から１０または２０個までの置換として行われうる。アミノ酸
置換は、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
本発明において使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし機能的に同等な
タンパク質を与えるアミノ酸残基の欠失、挿入または置換をも有しうる。内因性機能が保
有される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性にお
ける類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換が行われうる。例えば、負荷電アミノ酸は
アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正荷電アミノ酸はリジンおよびアルギニンを
含み、類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸はアスパラギン、グ
ルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む。
保存的置換が、例えば以下の表に従い行われうる。第２列における同じ分類におけるア
ミノ酸、および好ましくは、第３列における同じ行におけるアミノ酸が互いに置換されう
る。
Figure 0007340471000001
「ホモログ」なる語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列に対して或
る相同性（ホモロジー）を有する実体を意味する。「相同性」なる語は「同一性」と同等
でありうる。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５
％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９
７％または９９％同一でありうるアミノ酸配列を含むとみなされる。典型的には、ホモロ
グは対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。類似性（すなわち、類似した化学的特
性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても相同性が考慮されうるが、本発明の文脈にお
いては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５
％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９
７％または９９％同一でありうるヌクレオチド配列を含むとみなされる。類似性に関して
も相同性が考慮されうるが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性を表す
ことが好ましい。
相同性比較は、目により、またはより通常には、容易に利用可能な配列比較プログラム
の補助により行われうる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは２以上
の配列の間の相同性または同一性の割合（％）を計算しうる。
相同性の割合（％）は連続的アミノ酸にわたって計算されうる。すなわち、一方の配列
を他方の配列とアライメント（整列）し、一方の配列における各アミノ酸を他方の配列に
おける対応アミノ酸と、１残基ごとに同時に、直接的に比較する。これは「非ギャップ化
（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アライメントと称される。典型的には、そのような非ギャップ化
アライメントは比較的短い残基数のみにわたって行われる。
これは非常に簡単で一貫した方法であるが、それは例えば以下のような場合を考慮して
いない。すなわち、ヌクレオチド配列において１つの挿入または欠失が存在する場合、そ
れが存在しなければ同一ペアである配列において、該挿入または欠失は、後続コドンの、
アライメントからの脱落を引き起こして、グローバルアライメントが行われた場合に相同
性（％）における大きな減少を潜在的に引き起こしうる。したがって、ほとんどの配列比
較法は、全体的な相同性スコアを過度に不利にすることなく、考えられうる挿入および欠
失を考慮した最適アライメントを与えるように設計される。これは、局所的相同性（ロー
カルホモロジー）を最大にすることを試みるために配列アライメント内に「ギャップ」を
挿入することにより達成される。
しかし、より複雑なこれらの方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャ
ップ・ペナルティ」を割り当てるものであり、この場合、同一アミノ酸の数が同じとなる
場合、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメント（これは、それらの２つの比
較配列間の、より高い関連性を反映する）が、多数のギャップを有するものより高いスコ
アを得る。「アフィン・ギャップ・コスト（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）」は典型
的に用いられ、これは、ギャップの存在に関しては比較的高いコストを課し、ギャップに
おける各後続残基に関しては、より小さいペナルティを課すものである。これは、最もよ
く用いられるギャップ・スコア化（スコアリング）法である。高いギャップ・ペナルティ
は、もちろん、より少数のギャップを有する最適化アライメントを与えるであろう。ほと
んどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが修飾されることを可能にする。
しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合、デフォルト値を使用するこ
とが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用
する場合、アミノ酸配列に関するデフォルト・ギャップ・ペナルティはギャップに関して
は－１２であり、各伸長に関しては－４である。
したがって、最大相同性（％）の計算は、まず、ギャップ・ペナルティを考慮した最適
アライメントの生成を要する。そのようなアライメントを行うための適当なコンピュータ
プログラムとしては、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９
８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）が挙げられる。
配列比較を行いうる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ
ら（１９９９） 前掲－Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら（
１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツー
ルスイートが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴ
Ａは共に、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら
（１９９９）前掲，ｐ．７－５８～７－６０を参照されたい）。しかし、幾つかのアプリ
ケーションに関しては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。
ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称されるもう１つのツールも、タンパク質および
ヌクレオチド配列の比較のために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅ
ｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔ
ｔ（１９９９）１７７（１）：１８７－８を参照されたい）。
最終的な相同性（％）は同一性に関して測定されうるが、アライメントプロセス自体は
、典型的には、オール・オア・ナッシング（全か無か）のペア比較に基づくものではない
。実際には、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当
てるスケール化（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に
使用されるそのようなマトリックス（行列）の一例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートの
デフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公的デフォルト値またはカスタム記号比較表（提供さ
れている場合）を使用する（更なる詳細は使用マニュアルを参照されたい）。幾つかのア
プリケーションに関しては、ＧＣＧパッケージには公的デフォルト値を、あるいは他のソ
フトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用すること
が好ましい。
該ソフトウェアが最適アライメントを一旦生成したら、相同性（％）、好ましくは配列
同一性（％）を計算することが可能である。該ソフトウェアは、典型的には、配列比較の
一部としてこれを行い、数的結果を与える。
「断片」も変異体であり、この語は、典型的には、機能的に又はアッセイにおいて関心
が持たれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を意味する。したがっ
て、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸また
は核酸配列を意味する。
そのような変異体は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用
いて製造されうる。挿入を行いたい場合には、該挿入の両側の天然に存在する配列に対応
する５’および３’隣接（フランキング）領域と共に該挿入をコードする合成ＤＮＡが作
製されうる。該隣接領域は、天然に存在する配列内の部位に対応する簡便な制限部位を含
有しており、その結果、該配列は適当な酵素で切断され、該合成ＤＮＡは該切断物内に連
結されうる。ついで該ＤＮＡは本発明に従い発現されてコード化タンパク質を与える。こ
れらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の単な
る例示に過ぎず、他の公知技術も使用されうる。
本発明のＲＮＡ結合タンパク質の全ての変異体、断片またはホモログは、ＮＯＩの翻訳
がウイルスベクター産生細胞において抑制または予防されるように本発明の同族（コグネ
イト）結合部位に結合する能力を保有する。
本発明の結合部位の全ての変異体断片またはホモログは、ＮＯＩの翻訳がウイルスベク
ター産生細胞において抑制または予防されるように同族ＲＮＡ結合タンパク質に結合を能
力を保有する。
コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ＮＯＩおよび／またはベクター産生系の
成分を含む）はコドンが最適化されうる。コドン最適化はＷＯ １９９９／４１３９７お
よびＷＯ ２００１／７９５１８に既に記載されている。細胞が異なれば、個々のコドン
の該細胞の使用頻度も異なる。このコドン偏向は細胞型における個々のｔＲＮＡの相対存
在量における偏向に対応する。配列内のコドンを、対応ｔＲＮＡの相対存在量に合致する
ようにそれが調整されるように変化させることにより、発現を増強することが可能である
。同様に、対応ｔＲＮＡが個々の細胞型において稀有であることが知られているコドンを
意図的に選択することにより発現を低減することが可能である。このように、翻訳制御度
の付加が利用可能である。
ＨＩＶおよび他のレンチウイルスを含む多数のウイルスは多数の稀有コドンを利用して
おり、一般的に利用される哺乳類コドンに一致するようにこれらを変化させることにより
、関心のある遺伝子、例えばＮＯＩまたはパッケージング成分の、哺乳類プロデューサー
細胞内の発現の増強が達成されうる。コドン使用頻度表は哺乳類細胞および種々の他の生
物に関して当技術分野で公知である。
ウイルスベクター成分のコドン最適化は多数の他の利点を有する。それらの配列の改変
により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の構築に要求さ
れるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列において、それら
からＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）が除去される。同時に、パッケージング成分のアミノ
酸配列コード化配列は保有されており、その結果、該配列によってコードされるウイルス
成分は同じままであり、またはパッケージング成分の機能が損なわれない程度に少なくと
も十分に類似したままである。レンチウイルスベクターにおいては、コドン最適化は輸出
のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を克服して、最適化配列をＲｅｖ非依存的にする。コド
ン最適化はベクター系内の種々の構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖオープ
ンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えをも低減する。したがって、
コドン最適化の全体的な効果はウイルス力価の顕著な増加および安全性の改善である。
１つの実施形態においては、ＩＮＳに関連したコドンのみがコドン最適化される。しか
し、遥かに好ましく実用的な実施形態においては、幾つかの例外、例えば、ｇａｇ－ｐｏ
ｌのフレームシフト部位を含む配列を除き（後記を参照されたい）、該配列はそれらの全
体においてコドン最適化される。
ｇｇａ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複したリー
ディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は翻訳中のフレームシフトに依存して
いる。このフレームシフトは翻訳中のリボソーム「スリッページ」の結果として生じる。
このスリッページは少なくとも部分的にはリボソーム停止（ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡ二
次構造により引き起こされると考えられている。そのような二次構造はｇａｇ－ｐｏｌ遺
伝子におけるフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域はｇａｇの
開始位置の下流のヌクレオチド１２２２（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡ
である）からｇａｇの終結位置（ｎｔ１５０３）まで伸長している。したがって、フレー
ムシフト部位およびそれらの２つのリーディングフレームの重複領域にわたる２８１ｂｐ
の断片は、好ましくは、コドン最適化されない。この断片の保有は、Ｇａｇ－Ｐｏｌタン
パク質の、より効率的な発現を可能にするであろう。
ＥＩＡＶの場合には、重複の開始位置はｎｔ１２６２（ここで、ヌクレオチド１はｇａ
ｇ ＡＴＧのＡである）に位置するとみなされている。該重複の終結位置は１４６１ｂｐ
に位置する。該フレームシフト部位およびｇａｇ－ｐｏｌ重複が維持されることを保証す
るために、野生型配列はｎｔ１１５６から１４６５まで保持されている。
最適コドン使用頻度からの誘導体化が、例えば、簡便な制限部位を収容するために実施
可能であり、保存的アミノ酸変化がＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質内に導入されうる。
１つの実施形態においては、コドン最適化は、軽度に発現される哺乳類遺伝子に基づく
。第３の塩基、そして時には第２および第３の塩基が改変されうる。
遺伝暗号の縮重性ゆえに、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者により得られうると理解
されるであろう。また、コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列を作製するための出発点として
使用されうる多数のレトロウイルス変異体が記載されている。レンチウイルスゲノムは非
常に可変性でありうる。例えば、尚も機能的であるＨＩＶ－１の多数の擬似種が存在する
。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、導入プロセスの特定の部分を増強
するために使用されうる。ＨＩＶ－１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌ
ａｎｌ．ｇｏｖにおけるＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，
ＬＬＣにより運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅｓにおいて見出されうる。ＥＩＡ
Ｖクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけ
るＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースにおいて見出されうる。
コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列に関する戦略は任意のレトロウイルスに関して用いら
れうる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１お
よびＨＩＶ－２を含む全てのレンチウイルスに適用されるであろう。また、この方法は、
ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥ
ＲＶ）、ＭＬＶおよび他のレトロウイルスからの遺伝子の発現を増強するために使用され
うるであろう。
コドン最適化はｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存的にしうる。しかし、レンチウイル
スベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベ
クター産生系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存的にすることが必要であろう。したがって、
ゲノムが修飾されることも必要である。これは、ベクターゲノム成分を最適化することに
より達成される。好都合なことに、これらの修飾はまた、プロデューサー細胞および導入
細胞の両方において全ての追加的タンパク質が存在しない、より安全な系の産生をもたら
す。
用途
本発明のもう１つの態様は、医薬品における使用のための、本発明のウイルスベクター
または本発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織に関する。
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターまたは本発明のウイルスベクタ
ーが導入された細胞もしくは組織の、医薬品における使用に関する。
本発明のもう１つの態様は、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達す
るための医薬の製造のための、本発明のウイルスベクター、本発明の産生細胞、または本
発明のウイルスベクターが導入された細胞もしくは組織の使用に関する。
本発明のウイルスベクターまたは導入細胞のそのような使用は、既に記載されていると
おり、治療目的または診断目的のためのものでありうる。
治療用ベクター
レトロウイルス治療用ベクター
１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、パーキンソン病を治
療するために、ドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するた
めに使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエン
ベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）また
はウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイ
ルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はヒトチロシンヒ
ドロキシラーゼ（ＴＨ＊）遺伝子のトランケート化形態（これは、ＴＨのフィードバック
調節に関与するＮ末端の１６０アミノ酸を欠いている）、ヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカル
ボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）およびヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を
含みうる。それらの３つの酵素は３つの別々のオープンリーディングフレームにおいてレ
トロウイルスベクターによりコードされうる。あるいは、該レトロウイルスベクターは第
１オープンリーディングフレームにおけるＴＨおよびＣＨ１酵素ならびに第２オープンリ
ーディングフレームにおけるＡＡＤＣ酵素の融合体をコードしうる。該遺伝子の発現はＣ
ＭＶプロモーターにより駆動可能であり、発現カセットは１以上のＩＲＥＳ要素を含みう
る。該レトロウイルスベクターは直接注射により脳の線条体内に投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、光受容体および
支持網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正用ＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッ
シャー（Ｕｓｈｅｒ）１Ｂ症候群に関連した視力の悪化を軽減または逆転させるために設
計された遺伝子治療製品として使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇ
または代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自
己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれ
る遺伝子はＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡであり、これはＭＹＯ７Ａタンパク質（長さが１００ｍ
ｂを超える大きな遺伝子）をコードしている。この大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現はＣＭ
Ｖプロモーター、ＣＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替的プロモーターによ
り駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下
注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用ＡＴＰ結
合カセット遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても公知である）を光受容体に導入し、それ
により、シュタルガルト病を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。
該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質
でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウ
イルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである
。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＡＢＣＡ４ ｃＤＮＡであり、これ
はＡＢＣＡ４タンパク質をコードしている。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現はＣＭＶプロモータ
ー、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーター
により駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網
膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者
の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならび
に／または乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異
常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレト
ロウイルスベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／または
エンドスタチンをコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－
Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫
不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性
自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロ
ウイルスベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（Ｉ
ＲＥＳ）を利用してビシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）配置でヒトエンドスタチン
およびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ
特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最
近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代
替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術
の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における浮腫における異常な血管増殖
の再発を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイ
ルスベクターは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンド
スタチンをコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまた
は代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不
活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイル
スベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ
）を利用してビシストロン配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発
現する。該抗血管新生遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様
黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏ
ｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能で
ある。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投
与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、移植前のドナー
角膜への抗血管新生遺伝子の送達により、血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防
するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。該レトロウイルスベクターは
、ＶＳＶ－Ｇ、エボラまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピン
グされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）
に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態に
おいては、該レトロウイルスベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内
リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置で抗血管新生遺伝子、例え
ばヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該レトロウイルスベク
ターは角膜移植組織にエクスビボで適用可能であり、導入ドナー組織は移植前に貯蔵され
ることも可能である。該抗血管新生遺伝子の発現は構成的プロモーター、例えばＣＭＶプ
ロモーターにより駆動可能であるが、代替的プロモーターを使用することも可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者
の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならび
に／または乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異
常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療として使用されうる。このレトロウ
イルスベクターは、ｆｍｓ様チロシンキナーゼの可溶性形態（可溶性Ｆｌｔ－１）をコー
ドする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイル
スエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レン
チウイルスベクターである。可溶性Ｆｌｔ－１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロ
モーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベスト
ロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモ
ーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接
的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者
の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならび
に／または乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異
常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレト
ロウイルスベクターは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする遺伝子を
送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープ
タンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝
染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベク
ターである。ＰＥＤＦ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様
黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏ
ｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能で
ある。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投
与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者
の眼における異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならび
に／または乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異
常な血管増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレト
ロウイルスベクターは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＶＥＧ
Ｆ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＶＥＧＦ特異的アプタマーまたはＶＥＧＦ遮断
性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＶＥＧＦ受容体の可溶
性形態、および／または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＰＤ
ＧＦ抗体もしくはその結合性フラグメント、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたはＰＤＧＦ遮
断性ペプチドもしくはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＰＤＧＦ受容体の可
溶性形態をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまた
は代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不
活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レトロウイル
スベクターは、網膜色素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ
）を利用してビシストロン配置でＶＥＧＦのインヒビターおよびＰＤＧＦのインヒビター
を発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジ
ストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉ
ｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。
該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与され
うる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用遺伝子卵
黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に特異的なマイク
ロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、または矯正用ペリフェリン２コード化Ｒ
ＤＳ遺伝子およびＲＤＳの疾患関連形態に特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを、
網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭ
Ｄ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該レトロウイルスベク
ターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピング
されうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に
由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣ
ＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロ
モーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知であ
る）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の
硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、矯正用レチンア
ルデヒド結合タンパク質１遺伝子ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、
ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィーを招く病態生理を軽減または逆転させるために使用さ
れうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタ
ンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染
性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクタ
ーである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡであ
り、これはＲＬＢＰ１タンパク質をコードしている。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現はＣＭＶ、
ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモータ
ー（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）ま
たは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体
切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、緑内障を治療す
るために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは
、眼圧を低下させるように作用するＣＯＸ－２および／またはプロスタグランジンＦ２α
受容体（ＦＰＲ）をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ
－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製
性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。１つの実施形態においては、該レト
ロウイルスベクターは、眼の前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ
）を利用してビシストロン配置でＣＯＸ－２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（Ｆ
ＰＲ）遺伝子を発現する。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモータ
ーにより駆動されうる。該レトロウイルスベクターは経角膜注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、アッシャー（Ｕ
ｓｈｅｒ）１ｃを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ホルモニン（ｈｏｒ
ｍｏｎｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳ
Ｖ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複
製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより
運ばれる遺伝子はホルモニンｃＤＮＡであり、これはホルモニンタンパク質をコードして
いる。ホルモニン遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆
動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射
により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、コロイデレミア
を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）
タンパク質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベク
ターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピング
されうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に
由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベ
クターにより運ばれる遺伝子はＲＥＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＥＰ１タンパク質を
コードしている。ＲＥＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーター
により駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網
膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、色盲を招く病態
生理を軽減または逆転させるために矯正用環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（Ｃ
ＮＧＢ２）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺
伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇま
たは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己
不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる
遺伝子はＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３遺伝子であり、これらはＣＮＧＢ２および
／またはＣＮＧＡ３タンパク質をコードしている。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター
または代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子
体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、レーバー先天黒
内障（ＬＣＡ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ＣＥＰ２９０遺伝子
を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは
代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活
性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝
子はＣＥＰ２９０遺伝子であり、これは２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードしてい
る。ＣＥＰ２９０遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆
動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射
により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖網膜色素
変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節
因子（ＲＰＧＲ）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクタ
ーは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングさ
れうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由
来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベク
ターにより運ばれる遺伝子はＲＰＧＲ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＧＲタンパク質をコ
ードしている。ＲＰＧＲ遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターによ
り駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下
注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖網膜分離
症を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝
子を眼内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまた
は代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウ
イルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不
活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺
伝子はＲＳ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＳ１タンパク質をコードしている。ＲＳ１遺伝
子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロ
ウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、網膜色素変性を
招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性１（ＲＰ１）遺伝子を眼
内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替
的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化
最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は
ＲＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＰ１タンパク質をコードしている。ＲＰ１遺伝子の発
現はＣＭＶプロモータ、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは
代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除
術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、レーバー先天黒
内障（ＬＣＡ）２型を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素上皮特
異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入するために使用されうる。該レト
ロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュ
ードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス
（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レ
トロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰＥ６５ ｃＤＮＡであり、これはＲＰ
Ｅ６５タンパク質をコードしている。ＲＰＥ６５遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プ
ロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベス
トロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロ
モーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直
接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、湿潤型（ｗｅｔ
－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）ＡＭＤ、糖尿病性
黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ヒト
プロリン／アルギニンリッチ末端ロイシンリッチ反復タンパク質（ＰＲＥＬＰ；ｐｒｏｌ
ｉｎｅ／ａｒｇｉｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｅｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａ
ｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクター
は、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされ
うるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来
する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクタ
ーにより運ばれる遺伝子はＰＲＥＬＰ ｃＤＮＡであり、これはＰＲＥＬＰタンパク質を
コードしている。ＰＲＥＬＰ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば
卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓ
ｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動
可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射に
より投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ミオシリンの発
現をノックダウンすることにより若年性開放隅角緑内障を招く病態生理を軽減または逆転
させるために、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入する
ために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエ
ンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ま
たはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウ
イルスベクターである。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまた
は代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウイルスベクターは眼の硝子体切
除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、遺伝子増強およ
び／またはノックダウンにより網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるため
に、グルタチオン生合成経路からの律速性酵素、グルタミン酸－システインリガーゼ（Ｇ
ＣＬ）および／またはグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）、および／または合成ガンマ
－グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼
内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替
的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうる、例えばヒト免疫不全
ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己
不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＧＣＬおよび／またはＧＳＳ遺伝子および
／または合成ＧＧＴ特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモータ
ーにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該レトロウイルスベクターは、１
以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン配置で該遺伝
子および／または該合成ｍｉＲＮＡを発現しうる。該レトロウイルスベクターは眼の前房
への直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、神経変性障害、
例えば前頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および
運動ニューロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された
遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベクターは、ＶＥＧＦ－Ａアイ
ソフォーム、例えばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、
あるいはＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣまたはＶＥＧＦ－ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質
をコードする遺伝子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該レトロウイル
スベクターは、狂犬病（Ｒａｂｉｅｓ）ＧまたはＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベ
ロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または
ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイル
スベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能で
ある。該レトロウイルスベクターは大筋肉群内への直接注射により、または髄腔内もしく
は脳室内注射による脳脊髄液内への直接注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、嚢胞性線維症を
治療するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このレトロウイルスベク
ターは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を
送達する。該レトロウイルスベクターは、Ｆｌｕ－ＨＡ、センダイウイルスエンベロープ
ＦもしくはＨＮ，エボラ、バキュロウイルスＧＰ６４または代替的ウイルスエンベロープ
タンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝
染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベク
ターである。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
該レトロウイルスベクターは噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗
浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、サンフィリポ症
候群Ａを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｎ－スルホグルコサミンスル
ホヒドロラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺
伝子を脳内に導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇま
たは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうる、例えばヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複
製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより
運ばれる遺伝子は、ＳＧＳＨタンパク質をコードするＳＧＳＨ ｃＤＮＡ、および／また
はＳＵＭＦ１タンパク質をコードするＳＵＭＦ１遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶ
プロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態において
は、該レトロウイルスベクターは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビ
シストロン配置でＳＧＳＨおよびＳＵＭＦ－１遺伝子を発現しうる。該レトロウイルスベ
クターは直接脳内注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ポンペ病を招く
病態生理を軽減または逆転させるために矯正用酸－アルファグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺
伝子を大筋肉群および／または肺内に導入するために使用されうる。このレトロウイルス
ベクターは、ＧＡＡタンパク質をコードする遺伝子を送達する。該レトロウイルスベクタ
ーは、Ｆｌｕ－ＨＡ、センダイウイルスエンベロープＦもしくはＨＮ，エボラ、バキュロ
ウイルスＧＰ６４、狂犬病Ｇ、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質
でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウ
イルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである
。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該レトロウ
イルスベクターは、（ｉ）大筋肉群内への直接注射により、および／または（ｉｉ）噴霧
器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与され
うる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ＣＤ１９特異的
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ１９）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導
入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、ＣＤ１９を発
現する癌および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクター
は、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされ
うるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来
する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＣＡＲをコードする核酸
配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、５Ｔ４特異的キ
メラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入する
ためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、５Ｔ４を発現する癌
および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは、ＶＳ
Ｖ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト
免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複
製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。５Ｔ４ ＣＡＲをコードする核酸
配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
当業者に公知のとおり、ある範囲の癌または白血病関連ポリペプチドに特異的であるキ
メラ抗原受容体（ＣＡＲ）が製造されうる。本発明のレトロウイルスベクターは、いずれ
かの癌または白血病関連ポリペプチドに特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードす
る核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる。つ
いで、これらの導入Ｔ細胞は、ＣＡＲが結合する癌または白血病関連ポリペプチドを発現
する癌および白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクターは
、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされう
るヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来す
る非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該ＣＡＲをコードする核酸
配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＣＡ
Ｒにより標的化されうる適当な癌または白血病関連ポリペプチドには、メソセリン、葉酸
受容体α、免疫グロブリンのカッパ軽鎖、ＣＤ３０、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１３
８、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ
Ｒ）、例えばＥＧＦＲ ＶＩＩＩ、ＩＬ－１３Ｒα２、ＣＤ２０、ＥｒｂＢ、例えばＨｅ
ｒ２、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原および線維芽細胞活性化タンパク
質（ＦＡＢ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、罹患白血病また
は癌細胞上で発現されるペプチド－ＭＨＣに特異的であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコー
ドする核酸配列を自己または同種異系Ｔ細胞に導入するためにエクスビボで使用されうる
。ついで、これらの導入Ｔ細胞は、ＴＣＲが結合するペプチド－ＭＨＣの発現に関連した
疾患、癌または白血病を治療するために対象内に注入される。該レトロウイルスベクター
は、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされ
うるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来
する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。ＴＣＲをコードする核酸
配列の発現はＥＦ１α、ＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明
のベクターによりコードされるＴＣＲは一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）または二量体ＴＣＲ
（ｄＴＣＲ）でありうる。当業者に公知のとおり、適当なｄＴＣＲには、ＷＯ ２００３
／０２０７６３に記載されているものが含まれ、適当なｓｃＴＣＲには、ＷＯ １９９９
／０１８１２９に記載されているものが含まれる。この実施形態の特定の態様においては
、ＴＣＲでトランスフェクトされたＴ細胞は、骨髄腫および肉腫を含む、エイズ、白血病
および癌を治療するために使用されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、Ｘ連鎖重症複合
免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するために、共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２）をコードする遺伝
子を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替
的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるウマ伝染性貧血ウイル
ス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。該
遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本
発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されう
る。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ＡＤＡ重症複合
免疫不全（ＳＣＩＤ）を治療するために、アデノシンデアミナーゼをコードする遺伝子を
導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウ
イルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小
レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロ
モーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導入
するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を治
療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ウィスコット・
アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）を治療するために、ＷＡＳタンパク質をコードする遺伝子
を導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的
ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（
ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最
小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プ
ロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞に導
入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾患を
治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、鎌状赤血球症ま
たはサラセミアを治療するために、野生型β－グロビン、野生型胎児グロビンおよび突然
変異「抗鎌状」グロビンを含む幾つかのグロブリンの１つをコードする遺伝子を導入する
ために使用されうる。当業者に公知のとおり、抗鎌状グロビンの例には、ＷＯ ２０１４
／０４３１３１およびＷＯ １９９６／００９３８５に記載されているものが含まれるが
、これらに限定されるものではない。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代
替的ウイルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性
化最小レンチウイルスベクターである。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替
的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレトロウイルスベクターは、骨髄幹細胞
に導入するためにエクスビボで使用されうる。ついで、これらの導入骨髄幹細胞は、該疾
患を治療するために対象に注入されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、血友病Ａを治療
するために、矯正用遺伝子第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために
使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロ
ープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウ
マ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルス
ベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子であ
る。第ＶＩＩＩ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより
駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、血友病Ｂを治療
するために、矯正用遺伝子第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用
されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープ
タンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝
染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベク
ターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第Ｉ
Ｘ因子遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能であ
る。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ファブリー病を
治療するために、アルファガラクトシダーゼＡ（α－ＧＡＬ Ａ）をコードする遺伝子を
導入するために使用されうる。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウ
イルスエンベロープタンパク質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（Ｈ
ＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小
レンチウイルスベクターである。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子はＧＬ
Ａ ｃＤＮＡであり、これはα－ＧＡＬ Ａタンパク質をコードしている。該遺伝子の発
現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。本発明のレト
ロウイルスベクターは、造血ＣＤ３４＋幹細胞に導入するためにエクスビボで使用されう
る。ついで、これらの導入造血ＣＤ３４＋幹細胞は、該疾患を治療するために対象に注入
されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ポルフィリン症
の一形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる
。該レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク
質でシュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血
ウイルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターであ
る。該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療さ
れるポルフィリン症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の
発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 0007340471000002
もう１つの実施形態においては、本発明のレトロウイルスベクターは、ムコ多糖症の一
形態を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該
レトロウイルスベクターは、ＶＳＶ－Ｇまたは代替的ウイルスエンベロープタンパク質で
シュードタイピングされうるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはウマ伝染性貧血ウイ
ルス（ＥＩＡＶ）に由来する非複製性自己不活性化最小レンチウイルスベクターである。
該レトロウイルスベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療される
ムコ多糖症のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣ
ＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 0007340471000003
Figure 0007340471000004
レトロウイルス治療用ベクターの製造
本発明のレトロウイルスベクターは以下の４つのプラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の
一過性トランスフェクションにより製造されうる：
（１）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位および必要なトランスジーンをコ
ードする組換えレトロウイルスベクターゲノムプラスミド、
（２）合成レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ－Ｇを発現しうるエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド。
あるいは、ＨＩＶのような本発明のレトロウイルスベクターは以下の５つのプラスミド
でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより製造されうる：
（１）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位、必要なトランスジーンおよびＲ
ＲＥをコードする組換えＨＩＶベクターゲノムプラスミド、
（２）合成レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、
（３）例えばＶＳＶ－Ｇを発現しうるエンベロープ（ｅｎｖ）発現プラスミド、
（４）ＲＮＡ結合タンパク質発現プラスミド、
（５）ＲＥＶ発現プラスミド。
あるいは、一過性トランスフェクション系は、本発明のＲＮＡ結合タンパク質（例えば
、ＴＲＡＰ）を安定に発現する細胞系を利用しうる。
あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ
および（３）ＲＮＡ結合タンパク質、そしてＨＩＶベクターの場合にはＲｅｖを安定に発
現するパッケージング細胞を使用することにより製造可能であり、ここで、ＲＮＡ結合タ
ンパク質と相互作用しうる結合部位および必要なトランスジーンをコードし、そしてＨＩ
Ｖベクターの場合にはＲＲＥ配列を含む組換えレトロウイルスベクターゲノムをコードす
るプラスミドは、一過性トランスフェクションによりそのような細胞に導入される。
あるいは、本発明のレトロウイルスベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ
、（３）ＲＮＡ結合タンパク質、（４）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位
および必要なトランスジーンをコードする組換えＥＩＡＶベクターゲノムを安定に発現す
るプロデューサー細胞において製造されうる。
あるいは、本発明のＨＩＶベクターは、（１）ｇａｇ／ｐｏｌ、（２）ｅｎｖ、（３）
ＲＮＡ結合タンパク質、（４）ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる結合部位、必要な
トランスジーンおよびＲＲＥ配列をコードする組換えＨＩＶベクターゲノム、ならびに（
５）ＲＥＶを安定に発現するプロデューサー細胞において製造されうる。
ＡＡＶ治療用ベクター
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、パーキンソン病を治療す
るために、ドーパミン合成経路の３つの酵素をコードする３つの遺伝子を導入するために
使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はヒトチロシンヒドロキシラーゼ
（ＴＨ＊）遺伝子のトランケート化形態（これは、ＴＨのフィードバック調節に関与する
Ｎ末端の１６０アミノ酸を欠いている）、ヒト芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（
ＡＡＤＣ）およびヒトＧＴＰ－シクロヒドロラーゼ１（ＣＨ１）遺伝子を含みうる。それ
らの３つの酵素は３つの別々のオープンリーディングフレームにおいてＡＡＶベクターに
よりコードされうる。あるいは、該ＡＡＶベクターは第１オープンリーディングフレーム
におけるＴＨおよびＣＨ１酵素ならびに第２オープンリーディングフレームにおけるＡＡ
ＤＣ酵素の融合体をコードしうる。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターにより駆動可能
であり、発現カセットは１以上のＩＲＥＳ要素を含みうる。該ＡＡＶベクターは直接注射
により脳の線条体内に投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、光受容体および支持網膜
色素上皮（ＲＰＥ）細胞に矯正用ＭＹＯ７Ａ遺伝子を導入し、それにより、アッシャー（
Ｕｓｈｅｒ）１Ｂ症候群に関連した視力の悪化を軽減または逆転させるために設計された
遺伝子治療製品として使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＭＹＯ７
Ａ ｃＤＮＡであり、これはＭＹＯ７Ａタンパク質（長さが１００ｍｂを超える大きな遺
伝子）をコードしている。この大きなＭＹＯ７Ａ遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、Ｃ
ＭＶ／ＭＹＯ７Ａキメラプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用ＡＴＰ結合カセッ
ト遺伝子ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲとしても公知である）を光受容体に導入し、それにより、
シュタルガルト病を招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該ＡＡＶ
ベクターにより運ばれる遺伝子はＡＢＣＡ４ ｃＤＮＡであり、これはＡＢＣＡ４タンパ
ク質をコードしている。ＡＢＣＡ４遺伝子の発現はＣＭＶプロモーター、光受容体特異的
プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーターにより駆動可能であ
る。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる
。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒ
ｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼にお
ける異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／また
は乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管
増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクタ
ーは、抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンを
コードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色
素上皮細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシスト
ロン配置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生
遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２
（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモータ
ーとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクタ
ーは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、移植前のドナー角膜への
抗血管新生遺伝子の送達により、血管新生の結果としての角膜移植片拒絶を予防するため
に設計された遺伝子治療製品として使用されうる。１つの実施形態においては、該ＡＡＶ
ベクターは、角膜移植片へのエクスビボ送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥ
Ｓ）を利用してビシストロン配置で抗血管新生遺伝子、例えばヒトエンドスタチンおよび
アンジオスタチン遺伝子を発現する。該ＡＡＶベクターは角膜移植組織にエクスビボで適
用可能であり、導入ドナー組織は移植前に貯蔵されることも可能である。該抗血管新生遺
伝子の発現は構成的プロモーター、例えばＣＭＶプロモーターにより駆動可能であるが、
代替的プロモーターを使用することも可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒ
ｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼にお
ける異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／また
は乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管
増殖を予防するために設計された遺伝子治療として使用されうる。このＡＡＶベクターは
、ｆｍｓ様チロシンキナーゼの可溶性形態（可溶性Ｆｌｔ－１）をコードする遺伝子を送
達する。可溶性Ｆｌｔ－１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵
黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔ
ｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可
能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与さ
れうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒ
ｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼にお
ける異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／また
は乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管
増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクタ
ーは、色素上皮由来因子タンパク質（ＰＥＤＦ）をコードする遺伝子を送達する。ＰＥＤ
Ｆ遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー
２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモー
ターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベク
ターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒ
ｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫もしくは網膜静脈閉塞の患者の眼にお
ける異常な血管増殖および／もしくは血管漏出の再発を予防するために、ならびに／また
は乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における異常な血管
増殖を予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクタ
ーは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＶＥＧＦ抗体もしくはそ
の結合性フラグメント、ＶＥＧＦ特異的アプタマーまたはＶＥＧＦ遮断性ペプチドもしく
はポリペプチド、限定的なものではないが例えばＶＥＧＦ受容体の可溶性形態、および／
または血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のインヒビター、例えば抗ＰＤＧＦ抗体もしくは
その結合性フラグメント、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたはＰＤＧＦ遮断性ペプチドもし
くはポリペプチド、限定的なものではないが例えばＰＤＧＦ受容体の可溶性形態をコード
する遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮
細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配
置でＶＥＧＦのインヒビターおよびＰＤＧＦのインヒビターを発現する。該遺伝子の発現
はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）
プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知
である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子
体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用遺伝子卵黄様黄斑
ジストロフィー２（ＶＭＤ２）およびＶＭＤ２の疾患関連形態に特異的なマイクロＲＮＡ
（ｍｉＲＮＡ）をコードするカセット、または矯正用ペリフェリン２コード化ＲＤＳ遺伝
子およびＲＤＳの疾患関連形態に特異的なｍｉＲＮＡをコードするカセットを、網膜色素
上皮細胞に導入し、それにより、ベスト病またはベスト卵黄様黄斑変性（ＢＶＭＤ）を招
く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。該遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰ
Ｅ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（
最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または
代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に
直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、矯正用レチンアルデヒド
結合タンパク質１遺伝子ＲＬＢＰ１を網膜色素上皮細胞に導入し、それにより、ＲＬＢＰ
１関連網膜ジストロフィーを招く病態生理を軽減または逆転させるために使用されうる。
該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＬＢＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＬＢＰ
１タンパク質をコードしている。ＲＬＢＰ１遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモ
ーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロ
フィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモー
ターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下
注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、緑内障を治療するために
設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、眼圧を低下させ
るように作用するＣＯＸ－２および／またはプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）
をコードする遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、眼の
前房への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配
置でＣＯＸ－２およびプロスタグランジンＦ２α受容体（ＦＰＲ）遺伝子を発現する。該
遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動されうる。該ＡＡＶベクター
は経角膜注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ
）１ｃを招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ホルモニン（ｈｏｒｍｏｎｉ
ｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はホ
ルモニンｃＤＮＡであり、これはホルモニンタンパク質をコードしている。ホルモニン遺
伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該Ａ
ＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、コロイデレミアを招く病
態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク
質１（ＲＥＰ１）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれ
る遺伝子はＲＥＰ１ ｃＤＮＡであり、これはＲＥＰ１タンパク質をコードしている。Ｒ
ＥＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能であ
る。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる
。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、色盲を招く病態生理を軽
減または逆転させるために矯正用環状ヌクレオチド感受性チャネルベータ２（ＣＮＧＢ２
）および／または環状ヌクレオチド感受性チャネルアルファ３（ＣＮＧＡ３）遺伝子を眼
内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＣＮＧＢ２
および／またはＣＮＧＡ３遺伝子であり、これらはＣＮＧＢ２および／またはＣＮＧＡ３
タンパク質をコードしている。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモ
ーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜
下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、レーバー先天黒内障（Ｌ
ＣＡ）を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ＣＥＰ２９０遺伝子を眼内に
導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＣＥＰ２９０遺
伝子であり、これは２９０ｋＤａの中心体タンパク質をコードしている。ＣＥＰ２９０遺
伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該Ａ
ＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、Ｘ連鎖網膜色素変性を招
く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節因子（Ｒ
ＰＧＲ）遺伝子を眼内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる
遺伝子はＲＰＧＲ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＧＲタンパク質をコードしている。ＲＰ
ＧＲ遺伝子の発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、Ｘ連鎖網膜分離症を招く
病態生理を軽減または逆転させるために矯正用レチノスキシン１（ＲＳ１）遺伝子を眼内
に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＳ１ ｃＤ
ＮＡであり、これはＲＳ１タンパク質をコードしている。ＲＳ１遺伝子の発現はＣＭＶプ
ロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子
体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、網膜色素変性を招く病態
生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素変性１（ＲＰ１）遺伝子を眼内に導入
するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＲＰ１ ｃＤＮＡで
あり、これはＲＰ１タンパク質をコードしている。ＲＰ１遺伝子の発現はＣＭＶプロモー
タ、光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシンキナーゼまたは代替的プロモーター
により駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射
により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、レーバー先天黒内障（Ｌ
ＣＡ）２型を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用網膜色素上皮特異的６５
ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクタ
ーにより運ばれる遺伝子はＲＰＥ６５ ｃＤＮＡであり、これはＲＰＥ６５タンパク質を
コードしている。ＲＰＥ６５遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば
卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓ
ｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動
可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与
されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒｍ）加齢
性黄斑変性（ＡＭＤ）、乾燥型（ｄｒｙ－ｆｏｒｍ）ＡＭＤ、糖尿病性黄斑浮腫もしくは
網膜静脈閉塞を招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用ヒトプロリン／アルギ
ニンリッチ末端ロイシンリッチ反復タンパク質（ＰＲＥＬＰ；ｐｒｏｌｉｎｅ／ａｒｇｉ
ｎｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｅｎｄ ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ）遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子はＰ
ＲＥＬＰ ｃＤＮＡであり、これはＰＲＥＬＰタンパク質をコードしている。ＰＲＥＬＰ
遺伝子の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２
（ＶＭＤ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモータ
ーとして公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクタ
ーは眼の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ミオシリンの発現をノッ
クダウンすることにより若年性開放隅角緑内障を招く病態生理を軽減または逆転させるた
めに、合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入するために使
用されうる。合成ミオシリン特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プ
ロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼の硝子体切除術の後に直接的な
網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、遺伝子増強および／また
はノックダウンにより網膜色素変性を招く病態生理を軽減または逆転させるために、グル
タチオン生合成経路からの律速性酵素、グルタミン酸－システインリガーゼ（ＧＣＬ）お
よび／またはグルタチオンシンテターゼ（ＧＳＳ）、および／または合成ガンマ－グルタ
ミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）特異的ｍｉＲＮＡをコードする核酸配列を眼内に導入
するために使用されうる。ＧＣＬおよび／またはＧＳＳ遺伝子および／または合成ＧＧＴ
特異的ｍｉＲＮＡの発現はＣＭＶプロモータまたは代替的プロモーターにより駆動可能で
ある。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、１以上の配列内リボソーム進入
部位（ＩＲＥＳ）を利用してマルチシストロン配置で該遺伝子および／または該合成ｍｉ
ＲＮＡを発現しうる。該ＡＡＶベクターは眼の前房への直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、神経変性障害、例えば前
頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動ニュ
ーロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された遺伝子治
療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム、例え
ばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、あるいはＶＥＧＦ
－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣまたはＶＥＧＦ－ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝
子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代
替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは大筋肉群内への直接注射に
より、または髄腔内もしくは脳室内注射による脳脊髄液内への直接注射により投与されう
る。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症を治療する
ために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、嚢胞性線
維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子を送達する。該遺伝
子の発現はＣＭＶまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは
噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞洗浄による直接送達により投与
されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、サンフィリポ症候群Ａを
招く病態生理を軽減または逆転させるために矯正用Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロ
ラーゼ（ＳＧＳＨ）および／またはスルファターゼ修飾因子１（ＳＵＭＦ１）遺伝子を脳
内に導入するために使用されうる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は、ＳＧＳＨ
タンパク質をコードするＳＧＳＨ ｃＤＮＡ、および／またはＳＵＭＦ１タンパク質をコ
ードするＳＵＭＦ１遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プ
ロモーターにより駆動可能である。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、配
列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配置でＳＧＳＨおよびＳＵ
ＭＦ－１遺伝子を発現しうる。該ＡＡＶベクターは直接脳内注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ポンペ病を招く病態生理
を軽減または逆転させるために矯正用酸－アルファグリコシダーゼ（ＧＡＡ）遺伝子を大
筋肉群および／または肺内に導入するために使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＧＡ
Ａタンパク質をコードする遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代替的プロ
モーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは、（ｉ）大筋肉群内への直接注射に
より、および／または（ｉｉ）噴霧器の使用により鼻腔内に、または肺内への気管支肺胞
洗浄による直接送達により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ａを治療するため
に、矯正用遺伝子第ＶＩＩＩ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用され
うる。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は第ＶＩＩＩ因子である。第ＶＩＩＩ因子
遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、血友病Ｂを治療するため
に、矯正用遺伝子第ＩＸ因子を肝臓、筋肉または脂肪細胞に導入するために使用されうる
。該ＡＡＶベクターにより運ばれる遺伝子は第ＩＸ因子である。第ＩＸ因子遺伝子の発現
はＣＭＶプロモーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ポルフィリン症の一形態
を治療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡ
Ｖベクターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるポルフィリン症
のタイプに関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモ
ーターまたは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 0007340471000005
Figure 0007340471000006
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、ムコ多糖症の一形態を治
療するために、欠損酵素をコードする遺伝子を導入するために使用されうる。該ＡＡＶベ
クターにより運ばれる遺伝子は、以下の表から選択される治療されるムコ多糖症のタイプ
に関連した欠損酵素をコードする遺伝子である。該遺伝子の発現はＣＭＶプロモーターま
たは代替的プロモーターにより駆動可能である。
Figure 0007340471000007
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、湿潤型（ｗｅｔ－ｆｏｒ
ｍ）加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）の患者の眼における浮腫における異常な血管増殖の再発を
予防するために設計された遺伝子治療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、
抗血管新生タンパク質、例えばアンジオスタチンおよび／またはエンドスタチンをコード
する遺伝子を送達する。１つの実施形態においては、該ＡＡＶベクターは、網膜色素上皮
細胞への送達のために配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を利用してビシストロン配
置でヒトエンドスタチンおよびアンジオスタチン遺伝子を発現する。該抗血管新生遺伝子
の発現はＣＭＶ、ＲＰＥ特異的プロモーター、例えば卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭ
Ｄ２）プロモーター（最近はベストロフィン（ｂｅｓｔｒｏｐｈｉｎ）プロモーターとし
て公知である）または代替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは眼
の硝子体切除術の後に直接的な網膜下注射により投与されうる。
もう１つの実施形態においては、本発明のＡＡＶベクターは、神経変性障害、例えば前
頭側頭葉認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動ニュ
ーロン障害、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するために設計された遺伝子治
療製品として使用されうる。このＡＡＶベクターは、ＶＥＧＦ－Ａアイソフォーム、例え
ばＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５またはＶＥＧＦ１８９でありうる、あるいはＶＥＧＦ
－Ｂ、ＶＥＧＦ－ＣまたはＶＥＧＦ－ＤでありうるＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝
子であって、神経保護作用を有する遺伝子を送達する。該遺伝子の発現はＣＭＶまたは代
替的プロモーターにより駆動可能である。該ＡＡＶベクターは、髄腔内もしくは脳室内注
射による、脊髄を浸す脳脊髄液内への直接注射により投与されうる。
治療方法
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターを、または本発明のウイルスベ
クターが導入された細胞を、それを要する対象に投与することを含む治療方法に関する。
本明細書における治療に対する全ての言及は、治癒的、対症療法的および予防的治療を
含むと理解されるべきである。尤も、本発明の文脈においては、予防（阻止）に対する言
及は、より一般的には、予防的治療に関連したものである。治療は、予防または疾患進行
の減速（遅延）をも含む。哺乳動物の治療が特に好ましい。ヒトに対する治療および獣医
学的治療は共に本発明の範囲内である。
１つの実施形態においては、本発明のウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子は
ワクチンとしての使用のためのものでありうる。該ワクチンは、例えば、ヒト用または獣
医学用の、ウイルスに基づくワクチン（例えば、インフルエンザおよびニューカッスル病
ウイルスワクチン）でありうる。
ワクチンが、トランスジーンを保持する修飾されたコンピテント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ
）ウイルスである場合に、本発明は特に有用でありうる。
前記のとおり、ワクチンとしての使用のためのウイルスベクターおよびウイルスベクタ
ー粒子の製造においては、トリ産生細胞が使用されうる。
医薬組成物
本発明のもう１つの態様は、本発明のウイルスベクターを、または本発明のウイルスベ
クターが導入された細胞もしくは組織を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と
共に含む医薬組成物に関する。
本発明は、遺伝子治療により個体を治療するための医薬組成物を提供し、ここで、該組
成物はベクターの治療的有効量を含む。
該組成物は、医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバント（補助剤）を
含みうる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な
医薬慣例に基づいて行われうる。該医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤を、あるい
はそれらに加えて、いずれかの適当な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶
化剤、および標的部位内へのベクターの進入を補助または増進しうる他の担体物質（例え
ば、リピッド（脂質）デリバリーシステム）を含みうる。
適当な場合には、該組成物は以下のいずれかの１以上により投与されうる：吸入；坐剤
またはペッサリーの形態；ローション剤、溶液（水剤）、クリーム剤、軟膏剤または散布
剤の形態で局所的に；皮膚パッチの使用により；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトー
スを含有する錠剤の形態で、あるいは単独での又は賦形剤と混合されたカプセル剤または
胚珠状物（ｏｖｕｌｅ）において、あるいは香味または着色剤を含有するエリキシル剤、
溶液（水剤）または懸濁剤の形態で経口的に。あるいは、それらは、非経口的に、例えば
海綿体内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内または皮下に注射されうる。非経口投与の場合
、該組成物は、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類を
含有しうる無菌水溶液の形態で最良に使用されうる。頬側または舌下投与の場合には、該
組成物は、通常の方法で製剤化されうる錠剤またはトローチ剤（ロゼンジ）の形態で投与
されうる。
本発明のベクターは、エクスビボで、標的細胞または標的組織に導入した後、該標的細
胞または組織を、それを要する患者に導入するためにも使用されうる。そのような細胞の
一例は自己Ｔ細胞でありうる。そのような組織の一例はドナー角膜でありうる。
スクリーニング方法
本発明のもう１つの態様は、核酸結合部位および／または同族（コグネイト）核酸結合
タンパク質を特定する方法に関するものであり、それらは、核酸結合部位に機能的に連結
されている場合の関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑
制または予防されるように相互作用することが可能であり、ここで、該方法は、レポータ
ー遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位と核酸結合タンパク質との両方を含む細胞に
おいて、該レポーター遺伝子の発現を分析することを含む。
該方法は、本発明において有用な新規ＲＮＡ結合タンパク質およびそれらの対応結合部
位の特定を可能にしうる。該方法は、既知ＲＮＡ結合タンパク質または結合部位の変異体
の特定をも可能にしうる。
１つの実施形態においては、該方法は、ＴＲＡＰと相互作用する結合部位の特定を可能
にする。
もう１つの実施形態においては、該方法は、ＴＲＡＰに結合しうる結合部位と相互作用
する核酸結合タンパク質の特定を可能にする。
１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質をコードしている。
もう１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は、陽性細胞増殖選択マーカー、例
えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）（ゼオシン）に対する細胞の耐性を可能にするｓｈ ｂｌｅ
遺伝子産物をコードしている。
もう１つの実施形態においては、レポーター遺伝子は、陰性細胞増殖選択マーカー、例
えば、ガンシクロビル（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）の存在下で細胞死を引き起こすＨＳＶ
チミジンキナーゼ遺伝子産物をコードしている。
機能性の改善のためのＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）のスクリーニングの一例は以下のと
おりでありうる。
・配列ＲＡＧＮＮの、８個の反復、またはＲＡＧＮＮおよびＲＡＧＮＮＮの、合計８
個の反復を含む縮重ＤＮＡライブラリーを合成する。
・該ライブラリーをＧＦＰのようなレポーター遺伝子カセットの５’ＵＴＲ内（好ま
しくは、ＯＲＦの１２ヌクレオチド以内）にクローニングする。該ライブラリー連結レポ
ーター遺伝子は、所望により、レトロウイルスベクターゲノム内にクローニングされ、レ
トロウイルスベクターライブラリーが作製されうる。
・ライブラリー連結レポーター遺伝子カセットを細胞系内に安定に導入し（これはト
ランスフェクションまたはレトロウイルスベクター送達により達成されうる）、単一クロ
ーンを単離する。
・対照ＤＮＡ（例えば、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）またはＴＲＡＰ発現プラスミドＤ
ＮＡを使用する並行トランスフェクションによりクローンをスクリーニングする。両方の
シナリオにおいてレポーター遺伝子発現を測定し、高い非抑制レポーター遺伝子レベル（
対照）および低い抑制レポーター遺伝子レベル（ＴＲＡＰ）を示すクローンを特定する。
・候補クローンからの標的細胞ゲノムＤＮＡからのｔｂｓ配列のＰＣＲ増幅および配
列決定により配列を特定する。
典型的なレトロウイルスベクター成分を示す図。現在使用されている治療用レトロウイルスベクター系は、それが由来する野生型ウイルスゲノムから高度に操作されている。ガンマ－レトロウイルスベクターは、典型的には、ベクターゲノム、Ｇａｇ／Ｐｏｌおよびエンベロープ発現構築物を要する３または４成分系を使用して製造され、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターの場合には、アクセサリー遺伝子Ｒｅｖも必要である。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がＲＲＥに取って代わっている場合にはＲｅｖを要さない。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、ＮＯＩ、（所望により使用されうる）転写後要素（ＰＲＥ）、３’ｐｐｕおよび自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを要する。ベクターゲノムＲＮＡおよびトランスジーンｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化ならびに逆転写の過程のためにＲ－Ｕ５領域が必要である。通常、ゲノムカセット内でコードされる「外部」および「内部」の両方のプロモーター（Ｐｒｏ）は、その他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核生物またはウイルスプロモーターである。 ベクターを産生する産生細胞の能力に対するＮＯＩトランスジーン産物の負の影響の規模を決定するためのベクターゲノムプラスミド混合実験を記載する図。ベクターゲノム混合実験において、ベクターパッケージング成分および２つのタイプのベクターゲノムプラスミド（１つのレポーター遺伝子ベクターゲノムプラスミド、および細胞のベクター産生性に対するトランスジーン産物の影響を試験するためのＮＯＩトランスジーンをコードするベクター）での細胞のコトランスフェクションによりベクター粒子を産生させる。ｌａｃＺまたはＧＦＰレポータータンパク質の発現はベクター力価に影響を及ぼさないため、これらは対照ベクターとして使用される。該細胞のベクター産生性に負の影響を及ぼしうるＮＯＩトランスジーンをコードする第２のベクターゲノムプラスミドの導入はｌａｃＺ－ベクター産生にバイスタンダー効果を及ぼすであろう。ＮＯＩトランスジーンの発現は主に内部発現カセットから生じ、これは、典型的には、強力な構成的プロモーターにより駆動される。ビリオン当たり２コピーのベクターゲノムＲＮＡ分子をパッケージングする結果が考えられうること、そしてただ１つのベクターＲＮＡが逆転写され、標的細胞内に組込まれることから、ｌａｃＺ－ベクターと第２のゲノムを混合する希釈効果が存在するであろう。この希釈効果は、比例的に更に多量の第２のゲノムプラスミドがｌａｃＺ－ベクターゲノムプラスミドと混合された場合、より明らかとなる。したがって、第２のベクターゲノムプラスミドがＧＦＰのものである「希釈」対照が要求され、ＧＦＰはベクター力価に負の影響を及ぼさないことも公知である。したがって、ベクター産生性に対する与えられたＮＯＩトランスジーン産物の影響は、ＬａｃＺ：ＧＦＰベクターゲノム混合対照に対して測定されうる。混合実験から産生されたベクターは、典型的には、ｌａｃＺ－ベクターの測定（例えば、ベクター－導入細胞のＸ－ｇａｌ染色）により力価測定される。 図３ｉ．産生中のベクターゲノム混合はベクター力価に対するトランスジーンタンパク質発現の影響を示す。Ａ．ｌａｃＺコード化ベクターゲノム成分を、一過性ベクター産生中に、もう１つのベクターゲノムと１：１または１：５の比で混合し、標的細胞上のＸ－ｇａｌアッセイによりベクター力価に対する影響をアッセイした。ＧＦＰ発現はベクター力価に影響を及ぼさず、したがって、種々の比における力価低減のレベルはｌａｃＺゲノムの希釈のベースライン効果を示す。したがって、ｌａｃＺ力価に対する他のベクタートランスジーンの影響がｌａｃＺ：ＧＦＰ混合物に対して測定されうる。Ｂ．この実験は、ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、ＳｔａｒＧｅｎ（商標）、ＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）およびＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）ゲノムからのトランスジーンタンパク質の効果がベクター力価に７～１００倍影響を及ぼすことを示している。外部および内部プロモーター要素は共にＣＭＶである。図３ｉｉ．産生中のＣＯＸ２および／またはＦＰＲゲノムならびにｌａｃＺゲノム混合はベクター力価に対するトランスジーンタンパク質発現の影響を示す。ｌａｃＺコード化ベクターゲノム成分を、一過性トランスフェクションベクター産生中に、ＧＦＰまたは治療用ベクターゲノムと１：１または１：５の比で混合し、標的細胞上のＸ－ｇａｌアッセイによりｌａｃＺベクター力価に対する影響をアッセイする。ＧＦＰ発現はベクター力価に影響を及ぼさず、したがって、ｌａｃＺの力価はｌａｃＺゲノムの希釈のベースライン効果を示す。したがって、ｌａｃＺ力価に対する他のベクタートランスジーンの影響が１：１および１：５の比のｌａｃＺ／ＧＦＰ混合物に対して測定されうる。試験された治療用ベクターは単一トランスジーンベクターまたはビシストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクター（ＩＲＥＳ要素を保持するもの）のいずれかであった。ｌａｃＺ力価に対するＣＯＸ－２およびＦＰＲの影響は相加的でありうる。 レトロウイルスベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の抑制におけるＴＲＩＰ系の一例。ＴＲＡＰまたはコドン最適化ＴＲＡＰ（ｃｏＴＲＡＰ）（ここで、ベクターゲノム発現カセットのトランスジーンの５’ＵＴＲ内にｔｂｓが挿入されている）を発現するレトロウイルスベクター産生細胞。ＴＲＡＰはｔｂｓに結合し、トランスジーンタンパク質の翻訳を遮断する。ベクターＲＮＡ分子もＴＲＡＰに結合しうるが、驚くべきことに、これはベクタービリオンの単一ラウンドのライフサイクルを妨げない。すなわち、逆転写および組込み工程はベクター粒子により正常に行われる。 ＧＦＰ－プラスミドトランスフェクト化細胞集団のフローサイトメトリー分析においてＧＦＰ陽性細胞またはＭＦＩのいずれかの数のみを用いた場合の制約。これらの図は、実質的に異なるＧＦＰ発現レベルを有する集団を比較する実験における潜在的結果を示す。実験Ａ／Ｂにおいては、どちらのＧＦＰ陽性集団も同じＭＦＩを有し、実験Ｃ／Ｄにおいては、ＧＦＰ陽性集団は類似した数の細胞を含有するが、１０倍異なるＭＦＩを示す。シナリオＡは、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を使用した場合に実際に実証されており、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰおよびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］でコトランスフェクトされた場合、非常に少数（＜１％）の非常に高発現性のＧＦＰ陽性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が一貫して観察されている。このことは、ＥＦ１ａプロモーターがこの小さな亜集団において活性でない可能性があることを示唆している。したがって、これは、集団における発現の尺度としてＭＦＩのみを使用した場合にＧＦＰ－抑制分析を歪曲する。したがって、発現スコア（％ ＧＦＰ陽性×ＭＦＩ）がゲート化（ｇａｔｅｄ）集団内のＧＦＰタンパク質発現の全体的なレベルをより有効に示す。 ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の評価のための蛍光レポーター遺伝子構築物。まず、簡単な評価のために、ｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ＧＦＰからｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰを作製した。この後、ベクター活性に対するＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の効果を評価するために、非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰを作製した。評価のために初めに使用されたｔｂｓ配列［ＲＡＧＮＮ］１１は翻訳開始コドンの前の４１ｎｔの近位および９ｎｔの遠位配列に隣接していた。 一過性トランスフェクション評価研究において及び安定なＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系を作製するために使用されたＴＲＡＰ発現プラスミド。初期実験は、Ｃ末端ＨＩＳ６－タグの存在下／非存在下のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のコドン／配列最適化ＴＲＡＰの発現を駆動するためにｐＣＩ－Ｎｅｏバックボーンを使用した。ついでＣＭＶプロモーターを置換するためにＥＦ１ａプロモーター配列を使用して、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を得た。ＣＭＶプロモーター駆動性構築物（この場合には３’ＵＴＲが異なる）とは対照的に、両方のＥＦ１ａプロモーター駆動性構築物の３’ＵＴＲが同一となるように、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］におけるＨ６配列のオリゴ－アダプター置換により、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰプラスミドを作製した。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ－ｉＢｓｒは合成により完全に再誘導された。これは、ＴＲＡＰ［Ｈ６］およびブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）耐性マーカーをコードするマルチシストロン（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ｍＲＮＡを発現する。Ｂｓｒの翻訳を駆動するためにＥＭＣＶ ＩＲＥＳを使用した。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制の第１の一過性トランスフェクション評価研究からの選ばれた写真。ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰのｔｂｓ含有５’ＵＴＲからの発現をｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］が特異的に抑制しうることを示す写真による証拠。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制の第１の一過性トランスフェクション評価研究からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＴＲＡＰもＴＲＡＰ［Ｈ６］もｐＣＭＶ－ＧＦＰからのＧＦＰ発現に全く影響を及ぼさなかった。ＴＲＡＰ［Ｈ６］は、１：１の比で、および用量依存的に、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を有意に低減した。ＴＲＡＰは、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからの発現を抑制する能力が、より低いようであった。Ｂ．ＴＲＡＰ媒介性抑制の規模をより良好に評価するために、各コトランスフェクト化細胞培養に関して発現スコアを導いた。陽性細胞の百分率（％）にＭＦＩを掛け算すると、培養当たりに産生されたＧＦＰの総量の近似値が得られる。発現スコアにより判定された場合のＴＲＡＰ［Ｈ６］によるＧＦＰ抑制の最大レベルはこの実験においては２５倍までであった。Ｃ．ｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰまたはｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］で１：１の比でコトランスフェクトされたレポータープラスミドの代表的なフローサイトメトリードットプロット。Ｄ．ＴＲＡＰ発現プラスミドの非存在下のもの（スタッファー）と比較された、ＧＦＰ－レポータープラスミドおよびＥＦ１ａプロモーターまたはＣＭＶプロモーター駆動性ＴＲＡＰ［Ｈ６］プラスミドでのコトランスフェクト化ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＧＦＰ蛍光強度の中央値。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］をＧＦＰ：ＴＲＡＰの１：０．１のモル比で使用した場合に、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからの最大に近いＧＦＰ抑制が可能であったが、これはｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］では可能でなかった。 ＨＩＳ６タグ付きＴＲＡＰおよびタグ無しＴＲＡＰの機能比較。Ａ．別々の軸上でプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＨＩＳ６タグ付き若しくはタグ無しＴＲＡＰ発現またはスタッファープラスミドをＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと、示されている比（括弧内）で、三重重複でコトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）は集団におけるＧＦＰのＴＲＡＰ媒介性抑制の効果の全体的な評価を示す。ＨＩＳ６ Ｃ末端タグは、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰによるＧＦＰ発現を抑制するＴＲＡＰの能力における少なくとも２倍の増加をもたらす。 トランスジーン発現を抑制する種々のＴＲＡＰホモログの能力およびＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ細胞系の評価。Ａ．デスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）およびアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）からのＴＲＡＰ ＯＲＦをコドン／配列最適化し、ｐＥＦ１ａ－プラスミドバックボーン内にクローニングした。ＴＲＡＰ発現またはスタッファープラスミドをＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと共に、示されている比（括弧内）で、三重重複でコトランスフェクトした。トランスフェクト化細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各トランスフェクション条件ごとに平均発現スコアを得た。Ｂ．４個のＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系を、三重重複の一過性トランスフェクションによるｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからのトランスジーン発現を抑制するそれらの能力に関して比較した。ｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共にコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析し、各条件ごとに平均発現スコアを得た。ｐＣＭＶ－ＧＦＰ／スタッファーの発現スコアをその他の条件の発現スコアで割り算することにより、平均抑制倍率を得た。 レトロウイルスベクター産生におけるＴＲＡＰ－ｔｂｓ系の評価からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。ＴＲＡＰ［Ｈ］発現プラスミドを単一ＧＦＰレポータープラスミドまたは非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミド（図６を参照されたい）のいずれかと共に、示されている比で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。非ＳＩＮ ＥＩＡＶベクターゲノムプラスミドとのＧａｇ／ＰｏｌおよびＶＳＶＧ発現プラスミドの追加的なコトランスフェクションによりベクター産生が達成された。ベクターの産生中のＧＦＰ抑制は単一ＧＦＰレポーターの状況に非常に類似しており、ＴＲＡＰおよびｔｂｓ配列の両方の存在に左右された。Ｂ．発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）は集団におけるＧＦＰのＴＲＡＰ媒介性抑制の効果の全体的な評価を示す。Ｃ．Ｄ１７細胞に対するベクター力価。ｐＯＮＹ８．４ＲＣ－（ｔｂｓ）ＧＦＰベクタートランスフェクションから得られたベクター上清を使用してＤ１７細胞に導入し、４日後にフローサイトメトリーを行った。驚くべきことに、ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置はベクター力価に最小の影響を及ぼした。このことは、ベクター粒子の単一ラウンドのライフサイクルがベクターＲＮＡゲノム上の推定ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用によっては影響されなかったことを示している。 ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置におけるトランスジーンＡＵＧコドンとｔｂｓとの間の短いスペーシングの要件の試験からのフローサイトメトリーデータの概要。Ａ．ｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰに基づくベクターゲノムにおいて試験されたスペーシング変異体を示す図。完全長ベクターゲノムＲＮＡから誘導されうる、すなわち、「外部」ＣＭＶプロモーター（図６を参照されたい）から駆動されうるいずれかのＧＦＰ発現に関する制御のために、「ヌル」変異体においてはＡＵＧが終止コドンに改変された。５’ステム－ループ（ＳＬ）配列をバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）におけるｔｒｐオペロンリーダー配列から誘導した。下線付きヌクレオチドはコザック配列を示す。これらのスペーサー変異体ベクターレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に、示されているモル比（括弧内）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に三重重複でコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．各条件ごとの全体的なＧＦＰ発現を、平均発現スコアを得ることにより評価した。ＧＦＰ抑制の効率はスペーシング変異体＋１１～＋１に関して実質的に同じであった。「０」変異体はＴＲＡＰ［Ｈ６］の非存在下のＧＦＰ発現に関して若干欠損しているようであった。意外にも、５’ＳＬ変異体はＴＲＡＰ媒介性抑制に対して完全に不応答性であった。このことは、５’ＳＬがこの系におけるＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用を阻止することを示唆している。 図１４ｉ．ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置が機能するのに必要なＴＲＡＰ結合配列におけるＲＡＧＮＮ反復の最小数を定める。Ａ．評価のためにｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ内にクローニングされたｔｂｓ変異体配列。該研究において評価された初期ｔｂｓ配列は、ＴＧスペーサーをＡＡへと変化するように第１０および第１１ ＲＡＧＮＮ反復間で最適化された配列であった。したがって、変異体ｔｂｓ×１１Ｍおよびｔｂｓ×１０Ｍは、潜在的な隠れたＳＤ部位が除去されるように設計された。ＧＦＰレポーターの良好な翻訳コンテキストを維持しながら、ＲＡＧＮＮ反復をｔｂｓ×１１Ｍ変異体の３’末端から順次欠失させた（１１～４反復のみ）。反復－変異体ｔｂｓ－ＧＦＰレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に、１０：１ ＧＦＰ：ＴＲＡＰプラスミドの比で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に三重重複でコトランスフェクトした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。Ｂ．別々の軸上にプロットされた陽性ＧＦＰ集団の百分率（％）および蛍光強度（ＡｒｂＵ）の中央値のヒストグラム。Ｃ．各条件ごとの平均発現スコアを計算し、トランスフェクト化集団内の全体的なＧＦＰ発現の尺度として使用した。Ｄ．スタッファープラスミドでトランスフェクトされた各ｔｂｓ変異体に関する発現スコアをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］トランスフェクションのもので割り算することにより、抑制倍率を得た。８ ＲＡＧＮＮ反復で最大抑制が可能であり、７ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓは最大に近い抑制を可能にした。６ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓは中等度レベルのトランスジーン抑制を可能にし、一方、５および４ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓ配列は最低限度の機能性を示した。図１４ｉｉ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価。Ａ．この実験においてＮ２×１１と称されるｔｂｓ×１１Ｍ配列を、より多数のＲＡＧＮＮＮ反復がｔｂｓの中心部から漸進的にＲＡＧＮＮ反復に取って代わる修飾のための基本体として使用した。したがって、該変異体は漸進的に１、３、５、７または１０個のＲＡＧＮＮＮ反復を含有していた（３’末端ｃｔヌクレオチドはスペーサーとはみなされないため、Ｎ３×１１は１０個のＮＮＮスペーシングヌクレオチドを含有する）。これらのｔｂｓ変異体を治療用ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹＫ－ｔｂｓＣＯＸ２（図１８ｉを参照されたい）内にクローニングして、既存ｔｂｓを置換する。Ｂ．これらのｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムプラスミドを使用して、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分との及びスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］との５：１のベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミド比でのコトランスフェクションにより、ベクターを作製した。ＣＯＸ－２に対する免疫ブロット法を産生終了細胞からの細胞ライセート上で行った。図１４ｉｉｉ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価：トランスフェクションの８時間後のベクター産生細胞におけるＣＯＸタンパク質レベル。予め、産生終了細胞（トランスフェクション後４８時間まで）におけるＣＯＸ２レベルを分析した（図１４ｉｉＢを参照されたい）。ＴＲＡＰ－ｔｂｓ媒介性抑制がベクター産生中に一時的に異なるかどうかを試験するために、トランスフェクションの８時間後、免疫ブロットによりＣＯＸ２レベルに関して産生細胞を分析した。Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体をコードする種々の構築物からのＣＯＸ２の発現のパターンは、トランスフェクションの８時間後には、トランスフェクションの４８時間までに観察されたもの（図１４ｉｉＢを参照されたい）と同じであった。これは、与えられたｔｂｓ配列上のＴＲＡＰの抑制の度合がベクター産生中に明白には変化しないことを示している。図１４ｉｖ．１１ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価：ベクター力価。図１４ｉｉおよび図１４ｉｉｉに関連した実験においてＥＩＡＶ－ｔｂｓＣＯＸ２産生細胞から得られた粗ベクター上清をＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定して、ベクター活性に対する産生中のＣＯＸ２抑制の影響を判定した。該データは、産生中のＣＯＸ２の僅かな抑制のみ（図１４ｉｉＢおよび図１４ｉｉｉにおけるＮ３Ｎ２×１１［３］を参照されたい）が、ＥＩＡＶ－ＣＯＸ２ベクター力価を実質的に増強するために要求されることを示している。図１４ｖ．×７および×８ ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓのバックグラウンドにおいて１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列の機能性の評価。Ａ．これまでのデータは、８または７個のＲＡＧＮＮ反復を含むｔｂｓを使用して、最大レベルまたは最大に近いレベルのトランスジーン抑制が生じうることを示している。単一ＲＡＧＮＮＮ反復を８×ＲＡＧＮＮおよび７×ＲＡＧＮＮ ｔｂｓ内に挿入して、より短いこれらのｔｂｓ配列の機能に対する影響を評価した。これらを、×１１、×７、×６および×５反復を含むＲＡＧＮＮ含有ｔｂｓと共に比較した。これらのｔｂｓ変異体を治療用ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹＫ－ｔｂｓＣＯＸ２（図１８ｉを参照されたい）内にクローニングして、既存のｔｂｓを置換した。Ｂ．これらのｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムプラスミドを使用して、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分との及びスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］との５：１のベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミド比でのコトランスフェクションにより、ベクターを作製した。ＣＯＸ－２に対する免疫ブロット法をベクター産生中の早い時点（すなわち、トランスフェクションの８時間まで）の細胞ライセート上で行った。該データは、ＲＡＧＮＮＮ反復が、７×ＲＡＧＮＮを含む×８反復ｔｂｓ以内で「許容」されうることを示している。 遺伝子発現のＩＲＥＳ依存的ＴＲＡＰ／ｔｂｓ調節を試験するためのＩＲＥＳ－ｔｂｓ ＧＦＰレポータープラスミドの構築。Ａ．遠位シストロン（ＧＦＰ）からの発現がＴＲＡＰによる抑制の度合を示すように、ＩＲＥＳ－ｔｂｓ ＧＦＰレポーター構築物を作製した。ｐＣＭＶ－Ｖｉ－ｔｂｓｘ１１ＧにおけるｔｂｓとＩＲＥＳ要素との間の距離は４４ｎｔ（スペーシングヌクレオチドをコードする）であり、一方、ｐＣＭＶ－Ｖｉ－ｔｂｓｘ４Ｇにおいてはこの距離を４ｎｔへと低減した。ｐＣＭＶ－ＶｉＧＦＰを「無ｔｂｓ」対照としてクローニングした。Ｂ．ＩＲＥＳ－ｔｂｓ ＧＦＰレポータープラスミドをスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共に１０：１のＧＦＰ－レポーター：ＴＲＡＰプラスミド比でＨＥＫ２９３Ｔ内に三重重複でコトランスフェクトした。単一ＯＲＦ ＧＦＰレポータープラスミドをＴＲＡＰ媒介性抑制に関する対照として同時に含めた。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。各条件ごとの平均発現スコアを計算し、トランスフェクト化集団における全体的なＧＦＰ発現の尺度として使用した。ＴＲＡＰは、ＩＲＥＳから導かれるＧＦＰ発現を、５’ＣＡＰ媒介性発現と類似した規模で抑制することが可能であった。 ＴＲＩＰ系を使用する、ＷＰＲＥを含有するＥＩＡＶ ＳＩＮ－ベクターの製造。ベクターゲノムプラスミドｐＯＮＹ８．９ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰ（＋ＷＰＲＥ）をＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置に対するＷＰＲＥのいずれかの影響に関して試験した。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドと共にベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰまたはｐＯＮＹ８．９ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰ（＋ＷＰＲＥ）でコトランスフェクトされた細胞集団に関する発現スコアを得た。％ ＧＦＰおよび蛍光強度値中央値の掛け算からスコアを導出して、全集団におけるＧＦＰ発現の尺度を得た。 図１７ｉ．ｔｂｓを含有するように修飾されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）に基づく治療用ベクターゲノムの図。血友病Ａの治療用ベクターであるＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）はヒト第ＶＩＩＩ因子遺伝子をコードしている。第ＶＩＩＩ因子はベクタービリオン粒子内へのＶＳＶ－Ｇの取り込みを妨げてベクター活性を劇的に低減することが公知である。ｔｂｓまたはスクランブル化（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）ｔｂｓを該ベクターゲノム内にクローニングして、それぞれＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｔｂｓおよびＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｃｏｎベクターを得た。図１７ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用するＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）力価の改善。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＲＩＰ系を使用して、標準的なベクタープロトコルに従い、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）に基づくベクターを製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比でＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を集め、組込みアッセイにより力価測定し、遠心分離により～７０倍濃縮し、ついでＰＥＲＴアッセイを行い、ついでＶＳＶ－Ｇおよびｐ２６（ＥＩＡＶカプシド）に対する免疫ブロットを行った。Ａ．ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）－ｔｂｓベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定でＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）と比較して３０倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰの存在に左右された。ベクターの粒子対感染性の比も改善された（非表示データ）。Ｂ．濃縮ベクターサンプルにおけるＶＳＶ－Ｇの免疫ブロット。ベクター力価はベクタービリオン内へのＶＳＶ－Ｇの取り込みの度合と相関した。ｈ第ＶＩＩＩ因子は、レトロウイルスベクタービリオン内に取り込まれるＶＳＶ－Ｇの量を劇的に抑制することが公知である。Ｃ．ベクターコア（ｐ２６－カプシド）の免疫ブロットは、ウェル当たりに等しい数のベクタービリオンがローディングされたことを示している。 図１８ｉ．ＣＯＸ２またはＦＰＲのいずれかをコードするベクターゲノムの図。ｔｂｓ×１１Ｍ変異体を単一遺伝子発現ベクター内にクローニングした。５’ＵＴＲ配列＋／－ｔｂｓ×１１Ｍは、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）研究において使用された対照スクランブル化ｔｂｓ含有５’ＵＴＲとは完全に異なる。図１８ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善された単一遺伝子ＣＯＸ２ベクター力価。単一遺伝子ＣＯＸ－２に基づくベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定し、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＣＯＸ－２抗体によりプローブした。組込み終了アッセイ細胞（すなわち、ＣＯＸ－２ベクター調製物が導入されたもの）も免疫ブロットによりＣＯＸ－２発現に関して分析した。Ａ．ＣＯＸ２ベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で１００倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。Ｂ．産生終了細胞内のＣＯＸ－２の免疫ブロットは、ベクター力価がＣＯＸ－２レベルと逆相関したことを示している。Ｃ．回収上清の体積当たりの活性ベクター粒子の増加は標的細胞内のＣＯＸ－２の導入および発現の増加をもたらした。図１８ｉｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善された単一遺伝子ＦＰＲベクター力価。単一遺伝子ＦＰＲに基づくベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定した。ＦＰＲベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で２４倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。 図１９ｉ．ＣＯＸ－２またはＦＰＲ ＯＲＦをコードするベクターゲノムの図。示されているとおり、マルチシストロンベクターゲノムプラスミド内にｔｂｓ×１１Ｍ変異体をクローニングした。ＣＯＸ－２およびＦＰＲを上流または下流のいずれかの位置に配置し、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を両方の位置に挿入するか、いずれの位置にも挿入しなかった。図１９ｉｉ．ＴＲＩＰ系を使用して改善されたマルチシストロンＣＯＸ２／ＦＰＲベクター力価。図１９ｉにおけるマルチシストロンベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、等しい体積の粗回収上清を使用する組込みアッセイにより力価測定し、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＣＯＸ－２抗体によりプローブした。ＣＯＸ－２／ＦＰＲマルチシストロンベクター力価は～１００倍増加し、ＦＰＲ／ＣＯＸ－２マルチシストロンベクター力価はＤＮＡ組込みアッセイによる判定で～５０倍増加し、これはベクター産生中のＴＲＡＰおよびｔｂｓの存在に左右された。産生終了細胞におけるＣＯＸ－２の免疫ブロットが示すところによると、ベクター力価はＣＯＸ－２レベルと逆相関し、ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置は同じｍＲＮＡ転写産物上の複数部位におけるトランスジーン抑制が可能であった。 図２０ｉ．ＴＲＩＰ系における使用のために修飾されたＯＸＢ－１０２ベクターゲノムの図。示されているとおり、マルチシストロンベクターゲノムプラスミド内にｔｂｓ×１１Ｍ変異体をクローニングした。上流ＴＨ－ＣＨ１融合遺伝子のみを、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を含むように修飾した。図２０ｉｉ．ＴＲＩＰ系におけるベクター産生中の「問題の無い」トランスジーンの抑制。図２０ｉにおけるベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内でＴＲＩＰ系を使用して製造した。ベクターゲノムプラスミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と５：１の比で、ＥＩＡＶベクターパッケージング成分と共にコトランスフェクトした。ベクター上清を回収し、抗ＴＨ抗体を使用する免疫蛍光アッセイにより力価測定し（Ａ）、産生終了細胞ライセートを免疫ブロット上で抗ＴＨおよび抗ＣＨ１抗体によりプローブした（Ｂ）。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ系による産生細胞におけるトランスジーンの抑制は明らかであったが、標的細胞におけるトランスジーン発現には影響を及ぼさなかった。このことは、検出可能なＴＲＡＰ関連活性が標的細胞に導入されなかったこと、およびトランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内でコードされるｔｂｓがＴＲＩＰ産生細胞のもの以外の細胞における融合トランスジーンの頑強な発現を可能にしたことを示している。 図２１ｉ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＲＡＰ抑制機能性に関して試験された種々の細菌種からのトリプトファンＲＮＡ結合ホモログの一覧。該研究において試験されたＴＲＡＰホモログの名称、系統およびＮＣＢＩ参照番号（図１１Ａに関連した追加的情報）。図２１ｉｉ．×１１－および×１２ＲＡＧＮＮ反復含有ｔｂｓ－ＧＦＰレポーターカセット上の抑制機能に関する種々のＴＲＡＰホモログおよびＳ７２Ｎ変異体の試験。６Ｈｉｓタグ付きＴＲＡＰホモログをｐＥＦ１ａ発現プラスミド内にクローニングし、ｐＣＭＶ－ｔｂｓｘ１１－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓｘ１２－ＧＦＰレポータープラスミドのいずれかと共に、１：５（ｐＴＲＡＰ：ｐＲｅｐｏｒｔｅｒ）の比でＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。「ＴＲＡＰ無し」対照には、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔを使用して、ＴＲＡＰ変異体を比較するためにＧＦＰ発現の「オン（ｏｎ）」レベルを得た。トランスフェクションの２日後に細胞をフローサイトメトリーにより分析し、［Ａ］（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）においてＧＦＰ発現スコアを得た。［Ｂ］は、各ｔｂｓ－ＧＦＰレポーターごとの「ＴＲＡＰ無し」対照に対する抑制倍率として、これらのデータを示す。（図１１Ａに関する追加的情報）。図２１ｉｉｉ．新規抑制系における種々のＴＲＡＰホモログの機能性の概要。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において×１１－または×１２－ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓ－ＧＦＰレポーターカセットを使用した場合の種々のホモログおよびＳ７２Ｎ変異体の抑制倍率の概要。該ホモログは、バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰと比較して多様なアミノ配列変異（５６～７８％）を表す（１００％；アライメントはＨｉｓ－タグを含む）。（図１１Ａに関連した追加的情報）。 図２２ｉ．安定細胞系を単離するために使用されたＴＲＡＰ発現カセット。ＩＲＥＳ－Ｂｓｒ配列がＴＲＡＰ［Ｈ６］とポリアデニル化シグナルとの間に挿入されるようにｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を修飾した。プラスミドの線状化中に細菌配列を該ＤＮＡ配列から除去し、バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰをコードするこのカセットを低継代ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に安定にトランスフェクトした。（図１１Ａに関連した追加的情報）。図２２ｉｉ．ＧＦＰレポータープラスミドのトランスフェクションによるＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞クローンのスクリーニング。Ａ．サブクローン細胞の二重重複プレートをｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓｘ１１ＧＦＰのいずれかで三重重複でトランスフェクトし、２日後、細胞上でＦＡＣＳを行った。各サブクローンに関する発現スコアを計算し（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）、各サブクローンごとにｐＣＭＶ－ＧＦＰ（すなわち、ｔｂｓ無し）に関する発現スコアをｐＣＭＶ－ｔｂｓ×１１ＧＦＰに関する発現スコアで割り算することにより、抑制倍率を計算した（「抑制倍率」と表示されている棒グラフ、右側の軸）。（図１１Ｂに関連した追加的情報）。Ｂ．クローン細胞ライセートにおけるＴＲＡＰの免疫ブロット。ＴＲＡＰ［Ｈ６］を発現する１１個のサブクローンに関する結果が示されており、抗ＨＩＳ６抗体により単量体ＴＲＡＰが検出された。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］で一過性にトランスフェクトし、ライセートを免疫ブロットのための陽性対照として使用した。（図１１Ｂに関連した追加的情報）。図２２ｉｉｉ．ＴＲＡＰを安定に発現する産生細胞を使用して改善されたＥＩＡＶベクター力価；ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクターゲノムの５０：５０の混合物を産生中に使用する事例研究。Ａ．混合ベクターゲノムでトランスフェクトされたベクター産生細胞に関するＧＦＰ発現スコア。５０：５０の比のベクターゲノムプラスミドＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩと共にＥＩＡＶ－ベクターパッケージング成分ｐＧａｇＰｏｌ、ｐＶＳＶＧで細胞をトランスフェクトした。したがって、産生細胞におけるｈｕＦＶＩＩＩの発現は混合ベクター粒子の力価に負の影響を及ぼすであろう（ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩはＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｔｂｓと同じである；図１７ｉを参照されたい）。ゲノムは標準体であるか、またはトランスジーンの上流にｔｂｓを含有していた。示されている場合には、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ ＴＸＮ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（－）も加えた。産生細胞はＨＥＫ２９３Ｔ細胞または安定ＴＲＡＰ細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄであった。産生終了細胞に関してＧＦＰ発現スコアを計算した（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）。Ｂ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に関する混合ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ／ｈｕＦＶＩＩＩ粗ベクター回収物のベクター力価。［Ａ］におけるベクター産生細胞からの粗ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で滴定し、ＦＡＣＳにより力価を測定した。ｈｕ第ＶＩＩＩ因子の発現はＥＩＡＶベクタービリオン活性に影響を及ぼすことが知られており（図１７ｉｉを参照されたい）、したがって、トランスジーン発現が産生細胞において（［Ａ］におけるＧＦＰによる測定で）抑制される場合にのみ、（［Ｂ］におけるＧＦＰによる測定で）ベクター力価は改善されうる。図２２ｉｖ．安定または一過性ＴＲＩＰ系において産生された混合ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクター粒子内へのＶＳＶＧの取り込みの改善。ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩベクターゲノム混合実験における産生細胞からのベクター上清を遠心分離により濃縮し、抗ＶＳＶＧ抗体を使用する免疫ブロットにより分析した。ウェルごとに等しい体積の濃縮調製物をローディングした。図２２ｖ．ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ安定細胞系を使用して改善された、治療用トランスジーンコード化レンチウイルスベクターの産生。Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）のスケールでＥＩＡＶ－ｔｂｓＣＯＸ２を製造するために、標準物（ＴＲＡＰ無し）および一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にけるもの）と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞系（バシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）を使用した。ベクターをＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、ＴＵ／ｍＬをＥＩＡＶ－ＧＦＰベクター力価（１００％と設定）と比較した。ＥＩＡＶ－ＣＯＸ２ベクターに関しては、ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞の使用は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰと比較して、ベクター力価の更なる回収を可能にする。 図２３ｉ．種々の長さのｔｂｓ配列におけるＲＡＧＮＮ反復の「Ｒ」および「ＮＮ」位におけるヌクレオチドの選択の重要性の試験。Ｒ位がＧである場合にＮＮ配列がＧＧ、ＡＡ、ＴＴ［ＵＵ］またはＣＣである１１×ＲＡＧＮＮ反復の試験は、ＮＮ位にはピリミジンが好ましいことを示した。機能性の一般的順位はＴ［Ｕ］＞Ｃ＞Ｇ＞Ａであった。最初の（Ｒ）における最も機能的なヌクレオチドを試験するために、×１１、×８または×６反復を含むｔｂｓ内のｘＡＧＡＡ反復内に各ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ［Ｕ］またはＣを挿入した。図２３ｉｉ．ＲＡＧＴＴ反復の「Ｒ」位におけるＧ｜Ｔ優先性の試験、およびＮＮスペーサー内のＴとのヌクレオチドペア形成の試験。高抑制性ｔｂｓ（１１×ＧＡＧＴＴ）の場合において、ＴＡＧＴＴ反復をこの×１１ ｔｂｓ配列と漸進的に交換した。ＴＡＧＴＴ反復の増加（ＧＡＧＴＴ反復の置換）は該ｔｂｓの抑制機能を多少は低減した。少なくとも１つがＮ＝ＴであるＧＡＧＮＮ反復の試験は、最初のＮ（ＲＡＧＮＮの４位）が好ましくはＴ［Ｕ］またはピリミジンである場合に最大抑制が達成されることを示した。これは、ＲＡＧＮＮの重要な特徴が最初のＮスペーサーにおけるピリミジンおよびＲ位におけるＧ＞Ｔであることを示した。（ＧＡＧＡＴは試験されなかった。なぜなら、このＲＡＧＮＮ配列の縦列反復はトランスジーンＯＲＦの上流に複数のＡＴＧコドンを与え、これがトランスジーンの発現を減衰させる可能性があるからである）。 図２４ｉ．ＴＲＡＰによる抑制活性を試験するために、ＧＦＰトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの位置およびコピー数を変化させた。ＣＡＰ部位に対して種々の位置においてｐＣＭＶ－ＧＦＰ内にｔｂｓ×１１Ｍ配列をクローニングした：０ｎｔ［１］、３４ｎｔ［２］、５４ｎｔ［３］ ７４ｎｔ［４］または１１４ｎｔ［５］。構築物［２］を構成する３４ｎｔのリーダー上に付加された付加的配列（有効な標準的なｔｂｓ×１１Ｍレポーター）をＣＭＶｐ ５’ＵＴＲから誘導した。また、構築物［６］においては、ｔｂｓとＡＵＧとの間の配列が４３ｎｔへと増加された。最後に、ｔｂｓの２コピーが５’ＵＴＲ内に配置され、それらの間に３４ｎｔスペーサーが存在する［７］。図２４ｉｉ．ＴＲＡＰによる抑制活性の効果に関する、ＧＦＰトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの種々の配置の試験。図２４ｉにおける７個のｔｂｓ変異体ＧＦＰレポーター構築物を、以下の３つの条件下でＴＲＡＰにより抑制されるそれらの能力に関して試験した：ＴＲＡＰ無し（ＨＥＫ２９３Ｔ）、一過性コトランスフェクト化ＴＲＡＰ（ＨＥＫ２９３Ｔ＋ＴＲＡＰ）および最大ＴＲＡＰ抑制条件（ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［内因性ＴＲＡＰ］＋コトランスフェクト化ＴＲＡＰ）。トランスフェクションの２日後、ＧＦＰ発現を測定するために、培養をフローサイトメトリーにより分析し、ＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。 図２５ｉ．ＨＩＶに基づくＧＦＰベクターの製造へのＴＲＩＰ系の適用。［Ａ］ＧＦＰをコードするＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクターバックボーン内にｔｂｓ（×１１Ｍ変異体）を挿入し、それを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］における粗ベクター調製物を得た。［Ｂ］産生終了細胞をＦＡＣＳにより分析してＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ；「発現スコア」と表示された棒グラフ）を得た。粗ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＮＡ組換えアッセイにより力価測定した（「力価」と表示された棒グラフ）。ＧＦＰ発現は、ＴＲＡＰの存在下、ＨＩＶ－ｔｂｓＧＦＰベクターを放出する産生細胞において＞１００倍抑制されたが、ベクター力価は影響されなかった（なぜなら、ＧＦＰタンパク質はベクター産生に有害ではないからである）。ＣＭＶ－ＣＭＶプロモーター、ψ－パッケージングシグナル、ＲＲＥ－ｒｅｖ応答要素、ｗＰＲＥ－ウッドチャックＨＢＶ転写後要素、ｐｐｕ－ポリプリントラクト、ＳＩＮ－自己不活性化Ｕ３／ＬＴＲ。図２５ｉｉ．ＨＩＶに基づく治療用ベクター製造へのＴＲＩＰ系の適用。［Ａ］５Ｔ４－ＣＡＲをコードするＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクターバックボーン内にｔｂｓ（×１１Ｍ変異体）を挿入し、それを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞 ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］における粗ベクター調製物を得た。［Ｂ］ＦＡＣＳ（ＨＩＶ－ＧＦＰ；左側の２本の棒グラフ）またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞上のＤＮＡ組込みアッセイ（ＨＩＶ－５Ｔ４．ＣＡＲ；右側の２本の棒グラフ）により粗ベクター上清を力価測定した。ＴＲＩＰ系は、ＴＲＡＰ共発現の非存在下の産生と比較して、ＨＩＶ－５Ｔ４．ＣＡＲベクター力価の１０倍の改善を可能にした。ＣＭＶ－ＣＭＶプロモーター、ψ－パッケージングシグナル、ＲＲＥ－ｒｅｖ応答要素、ｗＰＲＥ－ウッドチャックＨＢＶ転写後要素、ｐｐｕ－ポリプリントラクト、ＳＩＮ－自己不活性化Ｕ３／ＬＴＲ。 標準的またはＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置成分でトランスフェクト化されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスジーンｍＲＮＡレベルの分析。ｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクト化し、４８時間後、ＧＦＰタンパク質（［Ａ］；ＦＡＣＳ）および細胞質内のＧＦＰ ｍＲＮＡレベル（［Ｂ］；ＧＦＰ特異的プライマー／ＦＡＭ－プローブセットを使用する、抽出されＤＮアーゼ処理された細胞質ＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ）に関して細胞を分析した。ＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置を使用した場合には、細胞においてＧＦＰタンパク質の＞１００倍の抑制が生じるが、ＧＦＰ ｍＲＮＡレベルは明白には影響されないことを、これらのデータは示している。［Ｂ］Ｃｔは、シグナルが初めて検出されたＰＣＲサイクルを反映しており、Ｃｔが低くなればなるほど、標的は豊富になる。したがって、存在量は各サイクルごとに～１．５倍増加し、４０は検出不能シグナルである。－ＲＴ条件は最小プラスミドＤＮＡ汚染を示す。 図２７ｉ．ＴＲＡＰ－ｔｂｓコードするＨＩＶ－１に基づくベクターは、構成的または組織特異的プロモーターにより駆動されるビシストロントランスジーンカセットを調節した。ホタルルシフェラーゼ（１位）およびＧＦＰ（２位）をコードするビシストロントランスジーンカセットが構成的ＣＭＶプロモーターにより転写され、ＴＲＡＰ－ｔｂｓにより翻訳レベルで示差的に調節される、４個の構築物を作製した。両方のトランスジーンＯＲＦまたは第１もしくは第２トランスジーンのみの上流にｔｂｓ配列を挿入し、あるいはいずれのｔｂｓ配列も存在させなかった。また、組織特異的プロモーター（光受容体細胞に限局されたＶＭＤ２プロモーター、または肝臓特異的であるｍＡｌｂＡＴプロモーター）が利用される２個の構築物を作製した。完全長ベクターＲＮＡ転写産物からの低レベル発現が測定されうるように内部プロモーターが存在しない対照構築物を作製した。図２７ｉｉ．ＴＲＡＰ－ｔｂｓをコードするＨＩＶ－１に基づくベクターからのトランスジーン発現の評価は、ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞において構成的または組織特異的プロモーターにより駆動されるビシストロントランスジーンカセットを調節した。ＨＩＶ－１ビシストロンベクターゲノム（図２７ｉ）、ｐＧａｇＰｏｌ、ｐＲｅｖおよびｐＶＳＶＧで、ならびにｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（対照）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクトした。ゲノム対ＴＲＡＰプラスミド比は５対１であった。ｐＧＬ３－対照（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現プラスミド）は全てのトランスフェクション混合物において全ＤＮＡ塊に対して１：４０の比で存在した。二重重複９６ウェルプレート上でトランスフェクションを三重重複で行った。１個の９６ウェルプレートを、トランスフェクションの２日後、フローサイトメトリーによる産生終了細胞の分析のために使用して、ＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。第２のプレートを使用して、トランスフェクションの２日後、二重ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のための細胞ライセートを得た。図２７ｉｉｉ．マルチシストロントランスジーンをコードするレトロウイルス（レンチウイルス）ベクターの製造に適用された場合のＴＲＩＰ系の抑制能を要約する図。配列内リボソーム進入部位［ＩＲＥＳ］を使用する２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からのトランスジーン発現を抑制するためにＴＲＩＰ系を使用するレンチウイルスベクター産生細胞の一例。該ベクターゲノム発現カセットは強力なプロモーター［Ｅｘｔ Ｐｒｏ］により駆動されて、豊富な量のベクターゲノムＲＮＡを生成する。内部プロモーター［Ｉｎｔ Ｐｒｏ］は、豊富なレベルのトランスジーンコード化／発現ｍＲＮＡを与える強力／構成的プロモーター、または最小／トランスジーン非コード化／発現ｍＲＮＡレベルを与える漏出性であってもなくてもよい組織特異的プロモーターでありうる。ＴＲＡＰ結合配列［ｔｂｓ］は一方または両方のＯＲＦ位置の上流に挿入されうる。したがって、産生細胞内のＴＲＡＰの発現は豊富な又は低レベルのトランスジーンｍＲＮＡからのタンパク質産生を抑制するであろう。また、該ベクターゲノムＲＮＡはトランスジーンタンパク質を（典型的には低レベルで）Ｃａｐ依存的に又は（ＩＲＥＳから；典型的には中等度レベルないし高レベルで）Ｃａｐ非依存的に発現しうる。したがって、内部プロモーターが活性であるか否かに無関係に、トランスジーン発現はベクター産生中に可能でありうる。したがって、ＴＲＩＰ系は、組織特異的プロモーターを使用した場合より良好に、この発現を抑制しうる。Ｅｘｔ Ｐｒｏ－外部プロモーター；ψ－パッケージングシグナル；ＲＲＥ－ｒｅｖ応答要素；ｃｐｐｔ／ＣＴＳ－中央ポリプリントラクト／中央ターミネーター配列；Ｉｎｔ Ｐｒｏ－内部プロモーター；ｔｂｓ－ＴＲＡＰ結合配列；ＯＲＦ－オープンリーディングフレーム；ＩＲＥＳ－配列内リボソーム進入部位；ＷＰＲＥ－ウッドチャック肝炎転写後調節要素；ｐｐｕ－ポリプリントラクト；Δ；部分欠失Ｕ３（ベクターパッケージングおよびＴＲＡＰ発現カセットは図に示されていないが、この例のＴＲＩＰ系ベクター産生細胞内に存在するとみなされることに注意されたい）。 図２８ｉ．ＴＲＩＰＡＡＶ系の開発。ＡＡＶに基づくベクターの製造のためのＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置の適用。標準的なＡＡＶベクター系はアデノウイルスＥ１発現細胞（例えば、ＨＥＫ２９３に基づく細胞）におけるベクターの産生のために以下の３個のＤＮＡ成分を利用する：ゲノム（所望により、自己相補性［ｓｃ］ＡＡＶベクターゲノムを得るために１つのｔｒｓが欠失しうる［Δｔｒｓ］）、ＲｅｐＣａｐおよびヘルパー機能（この非限定的な例においては、ヘルパー機能はアデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６およびＶＡにより付与される）。ＴＲＩＰＡＡＶ系はＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置を利用する。ＡＡＶベクターゲノムを修飾して、トランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内にｔｂｓを挿入し、ＴＲＡＰ発現プラスミドのコトランスフェクションおよび／またはＴＲＡＰを安定に発現する細胞系の使用によりベクター産生中にＴＲＡＰ発現カセットを共導入する。ＴＲＡＰは、所望により、Ｈｉｓ６タグ化されうる。ＩＴＲ－逆末端反復；Ｐｒｏ－真核プロモーター要素；ｔｂｓ－ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ－ポリアデニル化シグナル；［ＩＴＮ］－随意的イントロン。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２８ｉｉ．ＴＲＩＰＡＡＶ系を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｓｃＡＡＶベクタートランスジーン発現の抑制。血清型２ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰゲノムをコードするプラスミド（＋／－ ｔｂｓ）を、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ媒介性トランスジーン抑制に対するそれらの影響を測定するための種々の成分と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトした。ｐｓｃＡＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ｐＲｅｐＣａｐ２｜ｐＨｅｌｐｅｒ｜ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔの（－）質量比は、示されているとおりにｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の投入量を変化させる場合以外は、１０ｃｍ ＴＣプレート当たり２｜２｜２｜２μｇであった。ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ対照プラスミド（隣接ＡＡＶ２ ＩＴＲを欠く）を同じ条件に付して抑制レベルを比較した。ｐｓｃＡＡＶ２－［ｔｂｓ］ＧＦＰプラスミドからのＧＦＰ発現はｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰより大きかったが、これは恐らく、より安定なｍＲＮＡ転写産物（３’ＵＴＲ配列およびポリＡシグナルは構築物間で異なっていた）によるものであろう。ＴＲＡＰは、ｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒの存在下（すなわち、ｓｃＡＡＶベクター産生中）、ｐｓｃＡＡＶ２－ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を３００倍以上抑制することが可能であった。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］対ｐｓｃＡＡＶ２－ｔｂｓＧＦＰの等しい質量比は、用いたトランスフェクション条件下、最大抑制を可能にした。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の質量投入を１０倍減少させても、１－Ｌｏｇのオーダーの測定可能なＧＦＰ抑制が尚も可能であった。ｐｓｃＡＡＶ－ＧＦＰでは抑制は観察されなかった。図２８ｉｉｉ．標準的およびＴＲＩＰＡＡＶ系を使用するｓｃＡＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰベクター産生の比較。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における等しい質量のゲノム、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの一過性コトランスフェクションにより、ｓｃＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ｔｂｓＧＦＰベクターを製造した。トランスフェクションの約５３時間後、細胞を回収し、凍結－解凍サイクルに付してＡＡＶビリオンを放出させた。Ｖｉｒａｂｉｎｄ（商標）キットを使用してＡＡＶビリオンを精製して、それぞれの１０ｃｍプレートからのベクターを含有する１００μＬのＰＢＳを得た。フローサイトメトリーによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞（「ＨＥＫ２９３Ｔ」と表示されている棒グラフ）またはＨＥＰＧ２細胞（「ＨＥＰＧ２」と表示されている棒グラフ）上でベクター調製物を力価測定した。それぞれのベクター産生細胞に関するＧＦＰ発現スコアが共にプロットされている（「ＧＦＰ発現スコア」と表示されている棒グラフ）。ＡＡＶベクター産生細胞におけるＧＦＰ発現は＞３００倍抑制され、ＴＲＩＰＡＡＶ系のＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置はＡＡＶベクター産生の基本的な生物学には影響を及ぼさないことを、データは示しており、このことは、問題のある／細胞毒性トランスジーンがＡＡＶベクター産生中に阻止されうることを示唆している。図２８ｉｖ．バルナーゼを使用する、問題のある／細胞毒性トランスジーンをコードするＡＡＶベクターのモデル化。Ａ．ベクターゲノムｓｃＡＡＶ２－ＣＭＶ－ｔｂｓＢａｒｎａｓｅは、細菌ＲＮアーゼであるバルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ）をコードしており、そのＯＲＦはヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。トランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内にｔｂｓを挿入した。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＭＶプロモーターの漏出性（ｌｅａｋｙ）発現ゆえに、細菌におけるプラスミド増殖を補助するために、バルスター（Ｂａｒｓｔａｒ）（バルナーゼの天然インヒビター）のための細菌発現カセットがプラスミドバックボーン内に存在する。バルスターＯＲＦは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のためにコドン最適化される。Ｂ．ＧＦＰ発現に対するバルナーゼの効果をモニターするために、ゲノム混合トランスフェクションにおいてｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰプラスミドを使用した。図２８ｖ．ｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ｔｂｓＢａｒｎａｓｅおよびｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターゲノムプラスミドの５０：５０の混合物ならびにｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒでのＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ［３Ｄ］細胞のトランスフェクションによりゲノム混合を行った。ゲノムプラスミドはそれぞれ、１μｇ／１０ｃｍ プレートで存在するか［ｉ］、あるいはｐｓｃＡＡＶ－ＣＭＶ－ＧＦＰのみが２μｇ／１０ｃｍ プレートで存在し［ｉｉ］、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドは存在しなかった。トランスフェクションの２４時間後、これらの培養におけるＧＦＰ発現の写真を撮影した。 図２９ｉ．ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系の開発。アデノウイルスに基づくベクターの製造へのＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置の適用。標準的アデノウイルスベクターは第１世代（Ｅ１／Ｅ３領域において欠失している）、第２世代（Ｅ１／Ｅ２／Ｅ３／Ｅ４において欠失している）およびヘルパー依存的「中身抜き（ｇｕｔｔｅｄ）」ベクターに分類される。また、Ｅ１活性腫瘍溶解性ベクターは、Ｅ３領域内にコードされる毒性トランスジーンを含有しうる。例えば、毒性遺伝子の発現はアデノウイルス主要後期プロモーターまたは異種プロモーターおよびアデノウイルスコード化または異種ポリアデニル化シグナルによって支配されうる。これらのタイプのベクターゲノムＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系形態はトランスジーンコード化転写産物の５’ＵＴＲ内にｔｂｓを保持する。ベクター産生中に、ＴＲＡＰ発現プラスミドのコトランスフェクションおよび／またはＴＲＡＰを安定に発現する細胞系の使用により、ＴＲＡＰ発現カセットを共導入する。ＴＲＡＰは、所望により、Ｈｉｓ６でタグ化されうる。ＩＴＲ－逆末端反復；ψ－パッケージングシグナル；Ｐｒｏ－真核プロモーター要素；ｔｂｓ－ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ－ポリアデニル化シグナル；［ＩＴＮ］－随意的イントロン。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２９ｉｉ．ＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞における第１世代アデノウイルスベクターゲノム成分からのＧＦＰトランスジーンの抑制。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（－）と共に、ｐＡｄ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡｄ－ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰシャトルプラスミド（アデノウイルスベクターゲノムの左側を含有する）でＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし［Ａ］、４８時間後、フローサイトメトリーを行った［Ｂ］。また、並行トランスフェクションはＲＡＰＡｄ（登録商標）－バックボーン（ｐａｃＡｄ５ ９．２－１００；アデノウイルスベクターゲノムの右側を含有する）を含んでいて、ＲＡＰＡｄ（登録商標）キットを使用する第１世代アデノウイルスベクターの産生を模擬した（ここで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、該ベクターゲノムの組換えが生じる）。各条件下でＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。ｔｂｓが該シャトルプラスミド内に存在した場合およびＴＲＡＰが発現された場合にのみ、ＧＦＰの１００倍以上の抑制が観察された。ＩＴＲ－逆末端反復；ＣＭＶ－ＣＭＶプロモーター；ψ－パッケージングシグナル；ｔｂｓ－ＴＲＡＰ結合配列；ｐＡ－ポリアデニル化シグナル。この図は正確な縮尺で示されているわけではない。図２９ｉｉｉ．ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞におけるＡｄｅｎｏ（アデノ）－ｔｂｓＧＦＰ（Ｅ１／Ｅ３欠失）ベクター増幅中のＧＦＰトランスジーンの抑制。ｐＲＡＰＡｄ（登録商標）－バックボーンおよびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の存在下のｐＡｄ－ＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＡｄ－ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰシャトルのコトランスフェクションにより作製されたＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰベクターのストック（図２９ｉｉを参照されたい）を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞（ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）のいずれかに０．０１のＭＯＩで導入した。［Ａ］ベクター増幅中のＧＦＰ発現を評価するために、導入後の種々の時点で同型培養をフローサイトメトリーにより分析した。各条件ごとにＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得た。［Ｂ］時間経過終了同型培養を凍結－解凍してベクター粒子を放出させ、細胞残渣を遠心分離により除去し、粗上清をＨｅＬａ細胞上で力価測定した。
(請求項１)
関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用しうる、核酸配列。
(請求項２)
ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項１記載の核酸配列。
(請求項３)
ＲＮＡ結合タンパク質を欠く標的細胞において、関心のあるヌクレオチドが翻訳される、請求項１または２記載の核酸配列。
(請求項４)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の複数の反復を含む、請求項1～３のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項５)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の複数の反復を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項６)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、少なくとも６個の反復を含む、請求項１～５のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項７)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の、少なくとも８個の反復を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項８)
ＲＡＧＮＮＮの反復の数が１以下である、請求項７記載の核酸配列。
(請求項９)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、８～１１個の反復を含む、請求項１～８のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項１０)
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の、１１個の反復を含み、ここで、ＲＡＧＮＮＮの反復の数が３以下である、請求項１～９のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項１１)
関心のあるヌクレオチドが治療効果をもたらす、請求項１～１０のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項１２)
核酸配列がＲＲＥ配列またはその機能的代替物を更に含む、請求項１～１１のいずれか１項記載の核酸配列。
(請求項１３)
請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列を含むウイルスベクター。
(請求項１４)
２以上の、関心のあるヌクレオチドを含み、少なくとも１つの、関心のあるヌクレオチドが、請求項１～１２のいずれか１項に定められている結合部位に機能的に連結されている、請求項１３記載のウイルスベクター。
(請求項１５)
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスに由来する、請求項１３または１４記載のウイルスベクター。
(請求項１６)
レンチウイルスに由来する、請求項１５記載のレトロウイルスベクター。
(請求項１７)
ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項１６記載のレンチウイルスベクター。
(請求項１８)
ウイルスベクターの産生に要求される成分をコードする核酸配列のセットを含むウイルスベクター産生系であって、ベクターゲノムが請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列を含む、ウイルスベクター産生系。
(請求項１９)
ウイルスベクターがレトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項１８記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２０)
ウイルスベクターがレトロウイルスベクターであり、ウイルスベクター産生系が、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質ならびにＥｎｖタンパク質またはそれらの機能的代替物をコードする核酸配列を更に含む、請求項１９記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２１)
ウイルスベクター産生系が、ｒｅｖまたはその機能的代替物をコードする核酸配列を更に含む、請求項２０記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２２)
ウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、請求項１９～２１のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２３)
ウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項２２記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２４)
ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項１８～２３のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系。
(請求項２５)
請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
(請求項２６)
請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
(請求項２７)
該構築物が、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を含む、請求項２６記載のＤＮＡ構築物。
(請求項２８)
請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットであって、請求項２５記載のＤＮＡ構築物、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物ならびにＥｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む、ＤＮＡ構築物のセット。
(請求項２９)
請求項２６または２７記載のＤＮＡ構築物を更に含む、請求項２８記載のＤＮＡ構築物のセット。
(請求項３０)
ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を更に含む、請求項２８または２９記載のＤＮＡ構築物のセット。
(請求項３１)
請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列、請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系または請求項２５～３０のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含むウイルスベクター産生細胞。
(請求項３２)
請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１～１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質をコードするベクターで一過性にトランスフェクトされている、前記細胞。
(請求項３３)
請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１～１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を安定に発現する、前記細胞。
(請求項３４)
請求項３１記載のウイルスベクター産生細胞であって、該細胞が、請求項１～１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を安定に発現し、別の構築物から該ＲＮＡ結合タンパク質を一過性に発現する、前記細胞。
(請求項３５)
ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項３１～３４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生細胞。
(請求項３６)
請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列、請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系または請求項２５～３０のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物をウイルスベクター産生細胞内に導入し、ウイルスベクターの産生に適した条件下で、該産生細胞を培養することを含む、ウイルスベクターの製造方法。
(請求項３７)
該ウイルスベクター産生細胞が、請求項１～１２のいずれか１項に定められている結合部位と相互作用しうるＲＮＡ結合タンパク質を含む、請求項３６記載の製造方法。
(請求項３８)
ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項３７記載の製造方法。
(請求項３９)
請求項１８～２４のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系により製造されるウイルスベクターであって、請求項３１～３５のいずれか１項記載のウイルスベクター産生細胞を使用して、または請求項３６～３８のいずれか１項記載の製造方法により製造される該ウイルスベクター。
(請求項４０)
請求項１～１２のいずれか１項記載の核酸配列を含む、請求項３９記載のウイルスベクター。
(請求項４１)
レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスに由来する、請求項３９または４０記載のウイルスベクター。
(請求項４２)
レンチウイルスに由来する、請求項４１記載のレトロウイルスベクター。
(請求項４３)
ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、請求項４２記載のレンチウイルスベクター。
(請求項４４)
請求項１３～１７または３９～４３のいずれか１項記載のウイルスベクターが導入された細胞。
(請求項４５)
医薬品における使用のための、請求項１３～１７もしくは３９～４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞。
(請求項４６)
関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位へ送達するための医薬の製造のための、請求項１３～１７もしくは３９～４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞の使用。
(請求項４７)
請求項１３～１７もしくは３９～４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞を、それを要する対象に投与することを含む治療方法。
(請求項４８)
請求項１３～１７もしくは３９～４３のいずれか１項記載のウイルスベクターまたは請求項４４記載の細胞を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
(請求項４９)
核酸結合部位に機能的に連結されている場合に、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように相互作用しうる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を特定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む方法。
(請求項５０)
前記核酸結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、請求項４９記載の核酸結合部位を特定する方法。
(請求項５１)
核酸結合部位がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に結合しうる、請求項４９記載の核酸結合タンパク質を特定する方法。
(請求項５２)
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項４９～５１のいずれか１項記の方法。
実施例
プロトコル、データ分析および報告の説明
（ｔｂｓ）ＧＦＰレポーターおよびＴＲＡＰ発現プラスミドの一過性コトランスフェク
ション
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタミン）２０００ＣＤを使用して、ＴＲＡＰ
発現プラスミドを伴うｐＣＭＶ－ＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ（またはそれらの
変異体）でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性コトランスフェクションにより、ＴＲＡＰ－ｔ
ｂｓ配置の試験を行った。ＤＮＡの量を１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４
時間前に３．５×１０６個の細胞が予め播かれたもの）当たり６．１μｇの全ＤＮＡに正
規化するために、スタッファーＤＮＡ（ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）を使用した。マルチウ
ェルプレートを使用する場合には、これらのパラメータを組織培養容器面積に応じて縮小
した。トランスフェクションを三重重複で行った。ＧＦＰ－レポータープラスミド対ＴＲ
ＡＰ発現プラスミドのモル比が各実験において示されている。トランスフェクションの～
１８時間後に培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に生細胞に関してＧＦＰ
分析を行った。
典型的なレトロ（レンチ）ウイルスベクター産生プロトコル
３つのベクター成分を使用するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによ
るベクター産生を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ＣＤを使用して行った。ｐＤ
ＮＡの比は１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４時間前に３．５×１０６個の
細胞が予め播かれたプレート）当たり４μｇのベクターゲノム、２μｇのＧａｇＰｏｌ、
０．１μｇのＶＳＶＧプラスミドであった。これらのパラメータを容器面積に応じて比例
的に増減した。ＴＲＡＰプラスミドまたはスタッファープラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ）のトランスフェクションを、示されているモル比のベクターゲノムで行った。例え
ば、ベクターゲノムプラスミド対ＴＲＡＰプラスミドのモル比が１０対１の場合、質量比
は４μｇ ベクターゲノム対０．２８μｇ ＴＲＡＰプラスミドであった。トランスフェ
クションの２日後、新鮮培地の交換の前に６時間にわたって、１０ｍＭの最終濃度の酪酸
ナトリウムを加えた。２０～２４時間後、ベクター含有回収上清を採取した。ＧＦＰコー
ド化ベクターの産生の場合、トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰ分析を生細胞に
関して行った。免疫ブロット法のためのベクター産生終了細胞サンプルを、典型的には、
分画バッファー（１３０ｍＭ ＮａＣｌ，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．４］，
２ｍＭ ＥＤＴＡ，０．２％ ＩＥＧＰＡＬ）を使用して調製し、遠心分離により核を取
り出した。ベクター回収上清を０．４５μｍフィルターで濾過し、ベクター力価測定アッ
セイの前に－８０℃で保存した。標的細胞の導入および分析（３日後のフローサイトメト
リーによるもの（後記を参照されたい））により、ＧＦＰコード化ベクターを力価測定し
た。導入の１０日後に宿主細胞ＤＮＡのｑＰＣＲにより（ＤＮＡ組込みアッセイ；後記を
参照されたい）、または導入の３日後にトランスジーン産物に対する免疫蛍光により、治
療用ベクターを力価測定した。
トランスフェクト化細胞集団内の全体的なＧＦＰタンパク質の評価
ＧＦＰ陽性細胞の分析を主としてフローサイトメトリーにより行った。これは、該集団
におけるＧＦＰ陽性細胞の比率および細胞当たりのＧＦＰ発現の度合（蛍光強度の中央値
により測定される）の両方の高感度定量を可能にした。ＧＦＰ陽性細胞数の百分率に蛍光
強度の中央値（ＭＦＩ；任意単位）を掛け算して「発現スコア」を得ることにより、トラ
ンスフェクト化集団における全体的なＧＦＰ発現の規模の報告を行ったことに注目すべき
である。この尺度は、トランスフェクト化細胞集団内の全体的なＧＦＰタンパク質発現レ
ベルの、より良好な表現である、と本発明者らは考えている。それはトランスフェクト化
集団内のＧＦＰ発現レベルの正規分布を本質的に前提としており、したがって「曲線下面
積」を近似している。これを行ったのは、陽性比率またはＭＦＩのいずれかのみに基づく
ＧＦＰ発現の報告が、分析されている集団のそれらの「記述」において制限されたからで
ある（説明は図５を参照されたい）。したがって、「抑制倍率」がＧＦＰ翻訳に対するＴ
ＲＡＰの影響の尺度であり、「スタッファー」対照の発現スコアを関連ＴＲＡＰ－発現プ
ラスミド試験サンプルの発現スコアにより割り算することにより計算された。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法
標準的なＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび免疫ブロット法を、主として、ベクター回収後のベク
ター産生終了細胞に関して行った。ベクター粒子の免疫ブロット分析では、～２ｍＬの濾
過ベクター上清を微量遠心管内で２１，０００ｒｐｍで４℃で１～２時間、遠心分離した
後、「ペレット」を２０～３０μＬのＰＢＳに再懸濁させた。これらの濃縮ベクター調製
物をＰＥＲＴアッセイ（後記）により定量し、７×１０４ ＰＥＲＴ予測ＴＵのベクター
をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルのウェルごとにローディングした。約１×１０６個のベクター産
生終了細胞を２００μｌの分画バッファー中で細胞溶解し、遠心分離により核を取り出し
た。タンパク質サンプルをＢｉｏＲａｄアッセイにより定量し、典型的には５μｇのタン
パク質を、予め形成された１２～１５ウェルの４～２０％ アクリルアミドゲル上にロー
ディングした。タンパク質を氷上で３時間にわたって４５Ｖでニトロセルロース上にトラ
ンスファーした。ブロットを５％ 乳ＰＢＳ／ｔｗｅｅｎ―２０中で４℃で一晩ブロッキ
ングした。一次抗体およびＨＲＰ二次抗体（ブロッキングバッファー中で典型的には１：
１００希釈）でブロットをプローブした。免疫ブロットをＥＣＬ検出およびそれに続くＸ
線フィルム露出により分析した。
レトロウイルスベクター力価測定
・組込みアッセイ
回収された濾過ベクター上清を培地中で１：５希釈した後、０．５ｍＬの体積を用いて
、８μｇ／ｍＬ ポリブレンの存在下、１２ウェルスケールで１×１０５個のＨＥＫ２９
３Ｔ細胞に導入した。培養を１０日間継代（２～３日ごとに１：５分割）した後、１×１
０６ 細胞ペレットから宿主ＤＮＡを抽出した。ＥＩＡＶパッケージングシグナル（ψ）
に対して設定されたＦＡＭプライマー／プローブを使用して定量ＰＣＲを行い、以下の因
子を用いてベクター力価（ＴＵ／ｍＬ）を計算した：導入体積、ベクター希釈度、細胞当
たりに検出されたψコピー数、および特徴づけられた「単一コピーψ」細胞系対照の細胞
当たりに検出されたψコピー数。
・ＧＦＰ－レポーターアッセイ
回収された濾過ＧＦＰコード化ベクター上清を培地内で１：１０～１：１６０の範囲で
希釈した後、０．２５ｍＬの体積を用いて、２４ウェルスケールで、８μｇ／ｍＬ ポリ
ブレンの存在下、５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞または３．７４×１０４個のＤ１７
細胞に導入した。導入の３日後、ＦＡＣＳ ＶｅｒｓｅまたはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ
を製造業者により推奨された設定で用いて、培養をフローサイトメトリーにより分析した
。１０，０００個の事象を捕捉し、ＳＳＣ／ＦＳＣ ２Ｄプロットおよび／またはＴｏＰ
ｒｏ３染色に基づいてＤＥＡＤ／ＬＩＶＥ混合対照を使用して死細胞をアウトゲート（ｏ
ｕｔ－ｇａｔｅ）した。
・免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ（生物学的力価測定）
回収された濾過ＯＸＢ－１０２コード化ベクター上清を培地内で１：２～１：８で希釈
した後、０．５ｍＬの体積を用いて、１２ウェルスケールで、８μｇ／ｍＬ ポリブレン
の存在下、１×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。培養を３日間インキュベート
した後、固定され透過処理された細胞上のＩＦに付した。チロシンヒドロキシラーゼ（Ｔ
Ｈ）に対する一次抗体およびＡｌｅｘａ－４８８二次抗体を共に、透過処理バッファー中
で１：５００希釈で使用した。
・ＬａｃＺ－レポーターアッセイ
ＬａｃＺ－ベクター混合実験のために、回収された濾過ベクター上清を１０－５の係数
まで１０倍系列希釈した後、１０－２、１０－３、１０－４および１０－５希釈ベクター
の０．５ｍＬの体積を用いて、導入の２４時間前に７．５×１０４個の細胞が予め播かれ
た１２ウェルプレート上のＤ１７細胞に導入した。導入の３日後に、固定およびＸ－ｇａ
ｌ添加ならびにそれに続く青色コロニー計数により培養を分析して、力価（ＬＦＵ ＴＵ
／ｍＬ）を得た。
・ＰＥＲＴアッセイ
ＰＥＲＴアッセイは他の文献に記載されている（Ａｒｎｏｌｄ ＢＡら，１９９８，Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５：９８－１０６）。ＰＥＲＴ予測力価（ＰＥＲＴ－ＴＵ
／ｍＬ）は、ＰＥＲＴアッセイにおいてｑＲＴ－ＰＣＲ標準曲線として使用されたＧＦＰ
コード化ＥＩＡＶベクター調製物の生物学的力価に関連したＲＴ活性に基づく任意物理的
粒子力価である。
ベクターゲノム混合実験による産生細胞におけるトランスジーン産物の発現によるレト
ロ／レンチウイルスベクター産生に対する影響の評価
細胞からのレトロウイルスベクター産生に対するＮＯＩトランスジーン産物の負の影響
の度合を評価するために、図２に概説されているとおり、単純なベクターゲノム混合実験
を行った。前記の「レトロ（レンチ）ウイルスベクター産生プロトコル」は、図１に記載
されているベクターパッケージング成分と共に、レポーター遺伝子ベクターゲノムプラス
ミド（例えば、ｌａｃＺまたはＧＦＰトランスジーン）と、ＮＯＩを発現するベクターゲ
ノムプラスミドとの混合物を使用して行われうる。ベクター産生細胞、例えばＨＥＫ２９
３Ｔにおけるレポータータンパク質ｌａｃＺまたはＧＦＰの発現は、産生されるベクター
粒子の力価または特異的活性に悪影響を及ぼさないことが、一般に受け入れられている。
したがって、これらのレポーターをコードするベクターは高い力価で製造されうる。した
がって、そのようなレポーター遺伝子を有するベクターゲノムをコードするプラスミドと
、ベクター力価に影響を及ぼすトランスジーンをコードするベクターゲノムのプラスミド
とを混合することは、標的細胞における読取り（ｒｅａｄ－ｏｕｔ）としてレポーター遺
伝子活性を用いたベクターの力価測定によるその影響の或る程度の測定を可能にする。こ
れは、「問題のある」トランスジーンタンパク質の影響からのレポーター遺伝子ベクター
力価に対する「バイスタンダー」効果が存在するからである。なぜなら、全てのベクター
粒子は同じ細胞において生じ、ビリオン構築のために同じ細胞装置／経路を利用するから
である。トランスフェクション時に用いられるレポーター対ＮＯＩベクターゲノムプラス
ミドの比は典型的には１：１～１：５である。レトロウイルスベクター粒子はビリオン当
たり２コピーのゲノムＲＮＡをパッケージングするため、問題の無い２つのタンパク質（
例えば、ＬａｃＺおよびＧＦＰ）が産生細胞において２つの異なるベクターゲノムプラス
ミドから発現された場合であっても、レポーター特異的ベクター力価に対する「希釈」効
果が存在することに注目されたい。例えば、ｌａｃＺおよびＧＦＰベクターゲノムプラス
ミドの１：１の比を用いる場合、確率の法則により、ビリオンの２５％は２コピーのｌａ
ｃＺベクターＲＮＡを含有することになり、２５％は２コピーのＧＦＰベクターＲＮＡを
含有することになり、残りの５０％のビリオンは各ベクターＲＮＡの１つを含有すること
になる。後者のシナリオにおいては、それらの２つのゲノムＲＮＡ分子の１つだけがＤＮ
Ａへと逆転写されることになり、したがって、５０：５０の確率で、いずれかのレポータ
ーベクターゲノムが標的細胞内に組込まれて、該レポーターの発現をもたらす。総合する
と、これは、ベクターゲノムの、２つのプラスミドが、１：１の比で混合され、特異的レ
ポーターベクター力価が、単一ベクターゲノム調製物の産生と比べて２倍減少することを
意味している。より大きな混合比（例えば、１：５）を用いた場合には、希釈効果はより
大きくなる。この理由により、２つのレポーターベクターゲノムプラスミドの混合は、評
価中のＮＯＩトランスジーンを発現するベクターゲノムプラスミドとのレポーターベクタ
ーゲノムプラスミドのいずれかの混合と共に、希釈効果に関する「混合」対照として用い
られる。
例えば、図３ｉおよび３ｉｉは、標的細胞におけるＸ－ｇａｌ染色に基づくベクター力
価読取りによる、ｌａｃＺレポーターベクターゲノムプラスミドを使用した種々のベクタ
ーゲノムプラスミド混合実験からのデータを示す。ＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、
ＳｔａｒＧｅｎ（商標）、ＵｓｈＳｔａｔ（登録商標）およびＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録
商標）のもの並びにＣＯＸ－２および／またはＦＰＲを発現するベクターを含む、試験さ
れたベクターゲノムプラスミドの大多数は、使用される試験ベクタープラスミドに対する
ｌａｃＺベクタープラスミドの比に応じて、７～１００倍、ベクター力価に影響を及ぼす
。これらのデータは、ベクター産生細胞におけるトランスジーンタンパク質発現が、レポ
ーター遺伝子ベクターと比べて臨床的に関連のあるベクターで観察される低いベクター力
価に有意に寄与することを明らかに示している。
レトロウイルスベクター産生に関する本発明の説明：ベクター産生細胞内翻訳抑制（Ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｃｅｌｌ）［ＴＲＩＰ］系
図４は、レトロ／レンチウイルスベクター産生に適用された場合のベクター産生細胞内
翻訳抑制［ＴＲＩＰ］系の簡略図を示す。他のウイルスベクター系（例えば、アデノウイ
ルスおよびＡＡＶベクターに基づくベクター）におけるトランスジーン翻訳を抑制するの
に必要な成分を示すＴＲＩＰ系は、ウイルス特異的パッケージング成分を含むように示さ
れうる。全てのそのようなＴＲＩＰ系は、必要なベクター成分に加えて、以下の２つの成
分を含有しなければならない：ＴＲＡＰの存在下でＰＯＩの産生が抑制されるようにＮＯ
Ｉトランスジーンの５’ＵＴＲ内に挿入されるＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）およびＴＲＡ
Ｐ発現カセット。ベクターゲノム分子内の複数のＮＯＩ ＯＲＦはＴＲＡＰにより調節さ
れうる。すなわち、ベクターゲノムはマルチシストロンである（例えば、ＩＲＥＳを含有
する）ことが可能であり、２以上のＯＲＦが、その翻訳開始コドンの上流（例えば、ＩＲ
ＥＳと下流ＯＲＦとの間）に挿入されたＴＲＡＰ結合部位を有しうる。
中心的な実験の説明
ＧＦＰプラスミドおよびＧＦＰ発現レンチウイルスベクターゲノムプラスミドの使用に
よるＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置の初期試験
実施例１．ＴＲＡＰ発現プラスミドでの一過性コトランスフェクションにおけるＧＦＰ
発現調節の試験
図６に記載されているとおり、ＧＦＰレポーター構築物ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰを構築
した。５’ＵＴＲが（５’から３’へと）４１ｎｔのリーダー、５５ｎｔのｔｂｓおよび
ＧＦＰ ＡＴＧコドンの直上流にコザックコンセンサス配列をコードする９ｎｔの領域を
コードするように、ＴＲＡＰ結合配列（ｔｂｓ）を該構築物内に挿入した。これらのＧＦ
Ｐレポーター構築物は２つのＣＭＶプロモーター間の領域の欠失により実験用ＥＩＡＶベ
クターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ＧＦＰから誘導された（図６を参照されたい）。
蛍光遺伝子発現レポーターの詳細に関して、より詳細には、ＧＦＰレポーター遺伝子は
、遺伝子調節の比較的早い評価がフローサイトメトリーにより実施可能となるように、初
期評価実験のために選択された。ＧＦＰがベクター産生に毒性または有害であることは知
られていないが、ＴＲＡＰ／ｔｂｓによる遺伝子発現調節に関する高感度モデルとして使
用された。更に、既存ベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ＧＦＰが操作のために利用可
能であった。図６に示されているとおり、このベクターは３’ＬＴＲ内の野生型ＥＩＡＶ
Ｕ３、および内部トランスジーンカセットの上流のＤｓＲＥＤ－ｅｘｐｒｅｓｓ ＯＲ
Ｆを利用する。したがって、このベクターゲノムプラスミドはベクター産生細胞における
ＧＦＰおよびＤｓＲｅｄ－ｅｘｐｒｅｓｓの両方の発現が可能である。
全てのこれらのレポーター構築物は、強力なＣＭＶプロモーターからの転写から誘導さ
れるｍＲＮＡのポリアデニル化を可能にする野生型ＥＩＡＶ ＬＴＲを含有していた。し
たがって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰおよび対照プラスミドｐ
ＣＭＶ－ＧＦＰの両方からのＧＦＰの発現は頑強であった（図８および９を参照されたい
）。
該ＴＲＡＰ発現構築物は、ヒト細胞における高発現のためのバシラス・サチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのコドン／配列最適化ＴＲＡＰ ＯＲＦを使用し
て作製した。より詳細には、図７は、一過性トランスフェクション実験において初期に評
価されたＴＲＡＰ発現プラスミドのタイプを示す。ＴＲＡＰタンパク質は細菌由来である
ため、公に入手可能なヌクレオチド配列は、ｍｔｒＢ／ＴｒｐＢＰ「転写減衰タンパク質
遺伝子ファミリー」オペロン内でコードされる細菌配列のものである。しかし、哺乳類細
胞における発現を潜在的に増強するために、そしてスプライス－ドナー／アクセプター部
位のようないずれかの準最適配列を排除するために、ＴＲＡＰヌクレオチド配列をホモサ
ピエンス（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）における発現に関してコドン／配列最適化した。
該合成配列は、ｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰを得るためのｐＣＩ－ＮＥＯ内へのクローニングの
ために設計された。ＳａｐＩ部位は、消化および再環化がＴＲＡＰタンパク質のＣ末端へ
のＨＩＳ６－タグの融合を可能にするように、配置された。これはｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ
［Ｈ６］を最終的に与えた。非コドン最適化ＴＲＡＰ発現プラスミドを使用した過去の報
告も、ＴＲＡＰ機能への悪影響を伴うことなくＣ末端ＨＩＳ６－タグ付きＴＲＡＰを使用
している。商業的に入手可能なＴＲＡＰ抗体は現在存在しないため、ＨＩＳ６－タグ付き
ＴＲＡＰを使用して実験中のＴＲＡＰの発現のレベルを決定した。
実験の第１セットはタグ無しＴＲＡＰおよびＣ末端ＨＩＳ６－タグ付きＴＲＡＰの両方
を使用した。ＴＲＡＰ ＋／－ ＨＩＳ６－タグプラスミドおよびｔｂｓ－ＧＦＰレポー
ター構築物でのコトランスフェクション実験は、両形態のＴＲＡＰがＨＥＫ２９３Ｔ細胞
におけるｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を抑制しうることを示した（図８およ
び９）。ＴＲＡＰプラスミドおよびレポーターが１：１の比でコトランスフェクトされた
場合、ＴＲＡＰおよびＴＲＡＰ［Ｈ６］はＧＦＰ発現をそれぞれ３倍および２７倍抑制し
た（図９Ｂ）。この用量の１０分の１（すなわち、１０：１の分子比（レポーター：ＴＲ
ＡＰ））でＴＲＡＰプラスミドをコトランスフェクトした場合でさえも、幾らかの最小抑
制が観察された。ＴＲＡＰのいずれの形態もｐＣＭＶ－ＧＦＰのＧＦＰ発現に影響を及ぼ
さなかったが、このことは、ｔｂｓがＴＲＡＰ媒介性抑制に必須であったことを示してい
る。
実施例２．ＴＲＡＰ発現プラスミド発現の最適化
ｐＣＩ－Ｎｅｏに基づくプラスミドからの発現は他のＣＭＶ駆動性ＤＮＡカセットの影
響下にあるか、またはそれと競合しうる。この理由により、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰで１
／１０の用量でコトランスフェクトされたｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］はこのタイプの
競合の影響下にあった可能性があると仮定した。なぜなら、ＤＮＡ負荷を正規化するため
のスタッファーＤＮＡとしてｐＣＩ－Ｎｅｏをも使用したからである（この実験後、全て
の他の実験のための標準的なスタッファーＤＮＡとしてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを使用し
た）。したがって、ＥＦ１ａ駆動性構築物ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を前記のと
おりに作製し、種々の比のｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰとのコトランスフェクションにおいて
試験した。図９Ｄは、ＧＦＰレポーター構築物と共にｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］また
はｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかでコトランスフェクトされた細胞におけ
るＧＦＰの抑制を要約している。これらのデータは、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］
が１／１０の用量のｔｂｓ－ＧＦＰレポーターＤＮＡと共にコトランスフェクト可能であ
り、ｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］とは対照的に、１：１の比で観察されたＧＦＰ抑制レ
ベルを維持しうることを示している（この場合には、ＭＦＩデータを比較した）。したが
って、ＥＦ１ａ－プロモーターは、ＴＲＡＰ発現の駆動において、より好ましい可能性が
ある。
ｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰおよびｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］をクローニングする方法に
より、これらの構築物の３’ＵＴＲは同一ではなかった（図７）。したがって、それらの
２つの構築物の間の機能性における観察された相違（図９）に関する考えられうる理由は
、いずれかのアミノ酸相違によるものではなくＴＲＡＰ ｍＲＮＡ／タンパク質レベルに
よるものであった可能性がある。ＴＲＡＰ上のＣ末端ＨＩＳ６タグが機能性に重要である
かどうかを評価するために、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］から該配列を除去するこ
とによりｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰを構築した（図７）。これらの構築物はＨＩＳ６タグ
配列以外は同一である。ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］およびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲ
ＡＰを、種々の比のｔｂｓ－ＧＦＰレポータープラスミドとのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコト
ランスフェクションにより、直接的に比較した（図１０）。
これらのデータは、ＨＩＳ６タグ付きおよびタグ無しの両方のＴＲＡＰタンパク質が、
ｔｂｓ含有ＧＦＰレポータープラスミドと共に１：１または１：０．１のモル比で供給さ
れた場合に、ほとんど検出不能なレベルまでＧＦＰ発現を抑制しうることを示している。
該タグ無しＴＲＡＰ形態は、発現の全測定において、ＴＲＡＰ［Ｈ６］より２倍低い、抑
制における有効性を示した。したがって、ＨＩＳ６タグはタグ無しＴＲＡＰと比較して何
らかの最低限の利点をもたらしうる。これは、タンパク質の安定性および／または溶解度
／フォールディングおよび／または機能性（例えば、ＲＮＡ結合）の増強によるものかも
しれない。
実施例３．種々のＴＲＡＰホモログの評価
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＴＲＡＰに加えて、２
つの他のＴＲＡＰホモログが、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰおよびＴＲＡＰ発現プラスミドで
コトランスフェクトされた細胞からのＧＦＰ発現の抑制を媒介することが示された（図１
１Ａ）。デスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈ
ｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）およびアミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａ
ｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）からのＴＲＡＰ遺伝子をコドン／配列最適化し、ｐＥＦ１
ａに基づく発現プラスミド内にクローニングした。これらの変異体は共にＣ末端ＨＩＳ６
タグを含んでいた。これらのＴＲＡＰ変異体はバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰのものに対してそれぞれ７５％および５５％のアミノ酸相同
性を有していた。３つ全ての変異体は２ ＬｏｇのオーダーでＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけ
るＧＦＰ発現抑制が可能であった。このことは、わずか５５％の配列相同性を有するＴＲ
ＡＰホモログがＴＲＩＰ系において機能しうることを示している。３つ全てのホモログは
、ＲＮＡおよびトリプトファン結合部位に関与する配列において保存されていた（非表示
データ）。
実施例３ｂ．種々のＴＲＡＰホモログおよび変異体の評価
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のほかの細菌株からのＴ
ＲＡＰのホモログが該抑制系において機能しうるかどうかを試験するために、バシラス・
サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰに対して種々の配列同一性を
有する５つのＴＲＡＰ変異体をＮＣＢＩデータベースから特定した（図２１ｉ）。それら
の変異体は細菌系統にわたる広範な異なるＴＲＡＰ変異体を代表するものであった。これ
らのＴＲＡＰ変異体の遺伝子配列をヒト細胞における高発現のためにコドン最適化し、Ｃ
末端ＨＩＳ６を含有させ（ＴＲＡＰ媒介性抑制を増強することが既に示されているバシラ
ス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ［Ｈ６］に類似している
；図１０）、ｐＥＦ１ａ－プロモータープラスミド内にクローニングした（図７）。ビー
・ハロジュランス（Ｂ．Ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）ＴＲＡＰ変異体は天然１２マーを形成し
（Ｂａｙｆｉｅｌｄ，Ｏ．Ｗ．ら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４４３０９．ｄ
ｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４４３０９）、このことは、潜
在的にｔｂｓ内の１２個のＲＡＧＮＮ反復がこのＴＲＡＰに結合しうることを示している
。天然１１マーＴＲＡＰ形態の人工１２マー形態が該タンパク質のＣ末端における修飾に
より操作されうることも示されている。バシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰのＳ７２Ｎ修飾はＸ線結晶学
による判定で１２マータンパク質を与えることが示されている（Ｂａｙｆｉｅｌｄ，Ｏ．
Ｗ．ら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ７：ｅ４４３０９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊ
ｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４４３０９）。尤も、これらの変異体の１１マーまたは１
２マーが細胞環境において形成されるかどうかは知られていない。バシラス・ステアロサ
ーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ－
Ｓ７２Ｎ変異体も構築し、その他のＴＲＡＰホモログと共に、ＴＲＡＰ－抑制系における
潜在的機能に関して試験した。１１×ＲＡＧＮＮまたは１２×ＲＡＧＮＮ反復ｔｂｓを含
有する２つのＧＦＰレポータープラスミドを使用した。１２マーＴＲＡＰはｐＣＭＶ－ｔ
ｂｓｘ１２ＧＦＰレポーターからのトランスジーン発現を、ｐＣＭＶ－ｔｂｓｘ１１ＧＦ
Ｐレポーター上の１１マーより大きな度合で抑制しうると仮定した。
種々のＴＲＡＰホモログおよびバシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ－Ｓ７２Ｎ変異体の比較からのデータを図２１ｉｉ
Ａ～Ｂに示す。該ホモログおよびバシラス・ステアロサーモフィルス（Ｂ．Ｓｔｅａｒｏ
ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＴＲＡＰ－Ｓ７２Ｎ変異体の全てはＧＦＰの少なくとも１０
倍の抑制が可能であった。これらのＴＲＡＰホモログ間の比較的低いアミノ酸配列相同性
（バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）との比較で５６～７８％；図２１ｉｉｉ
を参照されたい）を考慮すると、これは、多様な細菌種からのＴＲＡＰタンパク質が、哺
乳類細胞におけるｔｂｓ ＲＮＡ配列との相互作用に要求される類似した四次構造を形成
することを示唆している。全てのホモログが、ＲＮＡとの接触およびＬ－トリプトファン
結合に重要であることが知られているアミノ酸残基を含有していた。しかし、Ｌ－トリプ
トファン結合突然変異体は、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＴＲＡＰ Ｔ
３０Ｖのように（Ｌ－トリプトファンの非存在下でさえも）ｔｂｓ－ＲＮＡに構成的に結
合し（Ｙａｋｈｎｉｎら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：４５１９－４５
２４）、同様にＴＲＡＰ媒介性抑制配置において機能すると予想される。
実施例４．安定ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ細胞系におけるトランスジーン抑制の評価
安定ＴＲＡＰ発現細胞系の場合のトランスジーン発現のＴＲＡＰ媒介性抑制を評価する
ために、構築物ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］－ｉＢｓｒを作製し、これを使用して
、ブラスチシジン選択によりＨＥＫ２９３Ｔ細胞に安定にトランスフェクトした（図１１
Ｂ）。～１００個の安定クローンから、４個のサブクローニングされたＨＥＫ２９３Ｔ－
ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄを単離し、トランスフェクト化ｐ
ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現を抑制するそれらの能力に関して試験した。ＴＲ
ＡＰ［Ｈ６］の内因性レベルが、一過性トランスフェクト化ＴＲＡＰ発現プラスミドで観
察されたものと同じレベルのＧＦＰ抑制を達成しうるかどうかを評価するために、培養を
スタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］プラスミドのいずれか
でコトランスフェクトした。安定ＴＲＡＰ発現細胞系は、ＴＲＡＰ発現プラスミドで一過
性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と比較して、内因性ＴＲＡＰからの類似
レベルのトランスジーン抑制（２Ｌｏｇのオーダー）が可能であることを、これらのデー
タは示している。しかし、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドが一過性にトランスフェクト
された場合に、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ［Ｈ６］クローンにおいて、より一層大きなレ
ベルのトランスジーン抑制が観察された（４Ｌｏｇのオーダー）。この理由は、おそらく
、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ［Ｈ６］クローン細胞における既存のＴＲＡＰプールによる
ものであろう。更に詳細に説明すると、一過性トランスフェクト化シナリオにおいては、
ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰおよびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のコトランスフェクシ
ョンの後の早い時点で、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ由来ｍＲＮＡのＴＲＡＰ媒介性抑制が生
じうる前に不十分なＴＲＡＰ［Ｈ６］タンパク質が蓄積して、少量であるが測定可能な量
のＧＦＰ発現をもたらすであろう。この少量のＧＦＰ発現はＨＥＫ２９３Ｔ－ＴＲＡＰ［
Ｈ６］細胞においては観察されない。なぜなら、ＴＲＡＰ［Ｈ６］の既存プールはデノボ
（ｄｅ ｎｏｖｏ）ｔｂｓＧＦＰ ｍＲＮＡに対して直接作用しうるからである。この効
果は、追加的なＴＲＡＰ発現プラスミドと協同して、安定ＴＲＡＰ細胞系におけるＧＦＰ
発現における遥かに大きな「抑制倍率」を可能にする。これは、安定細胞系におけるＴＲ
ＡＰ［Ｈ６］発現の最大量が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにおい
て観察されるものほどは高くないことを示唆している（これはＴＲＡＰ［Ｈ６］に対する
免疫ブロットにより確認されている；非表示データ）。しかし、トランスジーン発現を２
Ｌｏｇ以上抑制する安定ＴＲＡＰ［Ｈ６］細胞系の能力は、ベクター力価を改善するのに
十分である可能性がある。
実施例４ｂ．ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞系の開発およびベ
クターの産生におけるそれらの使用
この実施例は、実施例４に示されているものに基づくものであり、安定ＴＲＡＰ［Ｈ６
］細胞系をどのようにして開発したかに関する更なる情報を提供する。ＨＥＫ２９３Ｔ細
胞をＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］－ｉＢｓｒ発現カセット（図２２ｉ）で安定にトラ
ンスフェクトし、ブラスチシジン選択によりクローンを単離した。これらの安定発現ＴＲ
ＡＰ［Ｈ６］（バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））クローンを２回サブクロ
ーニングし、ついでｐＣＭＶ－ＧＦＰ（無抑制）またはｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰでのトラ
ンスフェクションにより抑制機能に関してスクリーニングした。発現スコア（図２２ｉｉ
Ａ；ＭＦＩ×％ＧＦＰ）を得ることにより、細胞集団における全ＧＦＰ発現を推定した。
４つのクローン（２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅおよび３Ｄ）が２－Ｌｏｇまでの抑制活性および低
い絶対的ＧＦＰ発現スコアを抑制条件下（すなわち、ＴＲＡＰの存在下）で有すると確認
された。安定クローンにおけるＧＦＰトランスジーンの抑制レベルは、細胞において検出
されたＴＲＡＰ［Ｈ６］のレベルと合理的に良く相関した（図２２ｉｉＢ）。これらのデ
ータは、ＴＲＡＰ発現がＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対して毒性ではないこと、および「ＨＥＫ
２９３Ｔ．ＴＲＩＰ」細胞（ＴＲＡＰを安定に発現するもの；「ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＡ
Ｐ」としても公知である）が、ＴＲＡＰプラスミドの一過性トランスフェクションにおい
て既に観察されているものと同様にトランスジーン発現を抑制しうることを示している。
本発明者らは、もう１つの例において、ＴＲＩＰがＲｅＱｕｉｎａｔｅ（ｈｕ第ＶＩＩ
Ｉ因子を発現するＥＩＡＶベクター）のベクター力価を標準的なベクター産生系と比較し
て改善しうることを示す（図１７）。ｈｕ第ＶＩＩＩ因子はＥＩＡＶベクタービリオン内
へのＶＳＶＧの取り込みを妨げる。安定ＴＲＩＰ系（すなわち、組込みＴＲＡＰカセット
）は、一過性ＴＲＩＰ系（すなわち、ベクター成分との「ｐＴＲＡＰ」プラスミドのコト
ランスフェクション）と比較して、トランスジーン抑制のタイミングにおける改善をもた
らしうると理論化される。これは、安定細胞におけるＴＲＡＰタンパク質の既存プールは
、トランスジーンを抑制するために直ちに利用可能となり、一方、一過性系においては、
トランスジーンｍＲＮＡを抑制するために十分なレベルのＴＲＡＰタンパク質が存在する
まで「ｐＴＲＡＰ」が発現されることが必要だからである。したがって、この早い時点で
、トランスジーンの幾らかの「漏出（ｌｅａｋｙ）」発現が生じて、おそらく、活性なベ
クター産生に負の影響を及ぼしうる。これを試験するために、ベクター混合実験を行った
。この実験においては、ベクター成分 ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］での
細胞のトランスフェクション中に、ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰおよびＥＩＡＶ－［ｔｂ
ｓ］ＦＶＩＩＩ（ＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｔｂｓとしても公知である）ゲノムを５０：５０
で混合した。したがって、全般的なＥＩＡＶベクタービリオン活性に対するｈｕＦＶＩＩ
Ｉ発現のいずれかの負の影響がＥＩＡＶ－ＧＦＰベクター力価に関して測定可能であろう
。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞ならびに安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系２Ｆ、１０Ｈ、７Ｅ
および３Ｄを試験した。産生終了細胞をフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現から分析
し（図２２ｉｉｉＡ）、産生した粗ベクターを新鮮なＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で力価測定し
、同様にフローサイトメトリーにより分析した（図２２ｉｉｉＢ）。
図２２ｉｉｉＡにおけるデータは、ＴＲＡＰを発現する安定細胞が一過性ＴＲＩＰ系の
場合より大きなトランスジーン抑制を可能にすることを示している。ＨＥＫ２９３Ｔ．Ｔ
ＲＩＰ－１０Ｈにおいては、ＧＦＰ発現は１０００倍低減した（図２２ｉｉｉＡ；ＥＩＡ
Ｖ－ＧＦＰおよびＥＩＡＶ－ｔｂｓＧＦＰゲノムの比較）。産生細胞におけるＧＦＰ（そ
してその延長線上で考えて、ｈｕＦＶＩＩＩ）抑制の度合は、産生したベクターの力価と
相関した（図２２ｉｉｉＢ）。総合すると、安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系は一過
性ＴＲＩＰ系より～３倍大きな力価を示した。安定ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ細胞系（＋
ＴＲＡＰ ＴＸＮ）における追加的ＴＲＡＰ発現はトランスジーン発現の更なる抑制を
可能にしたが、これはこの特異的トランスジーンコード化ベクターの力価における更なる
改善には転換しなかった。したがって、ＴＲＡＰ（最大ＴＲＡＰタンパク質自体ではない
）の既存プールが本実施例における一過性系（すなわち、ｈｕＦＶＩＩＩを発現するベク
ター）と比べた場合のベクター力価における改善の原因となっている可能性がある。より
問題のある／毒性のトランスジーンは、ベクター産生中に、既存および高レベルの両方の
ＴＲＡＰから利益を受けることが可能である。
ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ｜ＥＩＡＶ－［ｔｂｓ］ｈｕＦＶＩＩＩ産生細胞から回収
されたベクター粒子含有上清を免疫ブロット法によりＶＳＶＧ含量に関して分析した（図
２２ｉｖ）。これらのデータは、ｔｂｓが該ベクターゲノム上で利用され、ベクター産生
中にＴＲＡＰが（トランス － ＨＥＫ２９３Ｔ ＋ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６
］で、または安定ＴＲＡＰ発現により）供給された場合にのみ、ＶＳＶＧがベクター粒子
内に取り込まれうることを示している。
実施例５．ＧＦＰコード化レンチウイルスベクターの産生に関するＴＲＩＰ系の試験
この実験の目的は、ベクターゲノム内のｔｂｓの存在の潜在的影響を評価することであ
った。更に拡張すると、ＴＲＡＰはベクターゲノムＲＮＡ分子内（およびトランスジーン
ｍＲＮＡ上）のｔｂｓに結合可能であり、したがって、デノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）ベクタ
ービリオン内にパッケージングされうるため、逆転写の過程が悪影響を受けると合理的に
予想された。ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は特に高いアフィニティ（ｎＭの範囲）で生じ、
ＲＴ段階中に逆転写酵素がこの相互作用を破壊しうるかどうかは知られていなかった。産
生細胞におけるベクタートランスジーンの抑制にＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を適用するために
、ＥＩＡＶベクターゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰをｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ
から構築した。（図６を参照されたい）。ゲノムｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰまた
はｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ＧＦＰ、パッケージング成分（ＧａｇＰｏｌおよびＶＳＶＧ）を
使用して、ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生させ、ｐＣＩ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ
６］の存在下または非存在下でコトランスフェクトした（この実験はｐＥＦ１ａ－ｃｏＴ
ＲＡＰ［Ｈ６］の構築の前に行った）。産生終了細胞をＧＦＰ発現に関してフローサイト
メトリーにより分析し（図１２ＡおよびＢ）、ベクター上清を使用してＤ１７細胞に導入
した（図１２Ｃ）。
ｔｂｓの非存在下のベクターゲノムとは対照的に、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置は、ｔｂｓ
含有ベクターゲノムの内部トランスジーンカセットからのＧＦＰを、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧ
ＦＰに類似したレベルまで抑制することが可能であった（図１２Ａ）。ＤｓＲｅｄ－Ｘの
発現はＴＲＡＰによっては影響されなかったが、このことは、完全長ベクターゲノムＲＮ
Ａが産生され、翻訳可能であったことを示している（非表示データ）。ＴＲＡＰによるベ
クターゲノムプラスミドからのＧＦＰの抑制倍率は５０～１００倍であった（図１２Ｂ）
。該抑制倍率は、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰで観察されたものより低かったが、これは、該
ベクターゲノムから観察されたＧＦＰの、より低い非抑制レベルによるものであった可能
性があり、これは、おそらく、外部ＣＭＶｐ駆動性ベクターゲノムＲＮＡとの競合の結果
であったでろう。これらのデータはまた、ベクター産生中の酪酸ナトリウム（ＣＭＶプロ
モーターの公知活性化因子）の添加がＴＲＩＰ系に影響を及ぼさないようであったことを
示している（この実験においては、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰトランスフェクションにも酪
酸ナトリウムを加えた）。
図１２Ｃは、ｔｂｓ含有ＧＦＰベクターが標準的なＧＦＰベクターに非常に類似した力
価で産生されうることを示している。すなわち、ＴＲＡＰタンパク質の存在下で産生され
たｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰは１．４×１０６ ＴＵ／ｍｌを示し、一方、ＴＲ
ＡＰタンパク質の非存在下で産生されたｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ＧＦＰは１．８×１０６
ＴＵ／ｍｌを示した。これらのデータは、トランスジーンが翻訳的にサイレンシングされ
たレトロウイルスベクターの製造においてＴＲＩＰ系が使用されうることを初めて示すも
のである。
ＴＲＡＰ媒介性抑制のためのｔｂｓ配列要件の基本的特徴づけ
実施例６．ｔｂｓと翻訳開始コドンとの間の短い間隔要件の試験
ＴＲＡＰ結合部位（ｔｂｓ）において重要な配列の特徴づけにおける最初の実験は、ｔ
ｂｓとＡＵＧ翻訳開始コドンとの間の短い間隔（スペーシング）距離が翻訳抑制に重要で
あるかどうかという疑問を検討した。ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰおよびｐＯＮＹ８．４ＲＣ
－ｔｂｓＧＦＰ内のｔｂｓの配置においては、ｔｂｓはＧＦＰ ＡＵＧ翻訳開始コドンか
ら９ヌクレオチド離れている。Ｔｅｔ－ＯＮ／ＯＦＦのような他の人工遺伝子調節系にお
いては、間隔パラメータは機能性に寄与することが示されている。短距離の間隔の重要性
を評価するために、これらのスペーサーヌクレオチドの１～９個が漸進的に欠失した一連
の変異体を構築した。また、２つの他の変異体においては、間隔を１０および１１ヌクレ
オチドまで増加させた。最後に、インビボの転写減衰メカニズムのためのＴＲＡＰ－ｔｂ
ｓ結合に重要であることが示されているバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ）ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから得られた５’近位ステムループ（ＳＬ）配
列（ＭｃＧｒａｗ ＡＰ，Ｍ．Ａ．，Ｍａｊｏｒ Ｆ，Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａ ＰＣ，Ｂ
ａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００９）ＲＮＡ １５（１）：５５－６６）に、標準的なｔｂ
ｓ－９ｎｔ－ＡＵＧ配置を付加した。該ＳＬ突然変異体を含めたのは、ＴＲＡＰ媒介性抑
制が増強されうるかどうかを試験するためであった。これらの変異体をベクターゲノムｐ
ＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰ内にクローニングし、翻訳抑制における微妙な相違がよ
り容易に定量されうるように、限られた量のｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（１：０
．０５の比）でコトランスフェクトした。
この実験の結果を図１３Ｂに示す。スペーサー欠失変異体またはスペーサー増加変異体
はいずれも、９ｎｔスペーサーと比べて変化したＴＲＡＰ媒介性抑制を全く示さなかった
。「０」変異体は、その他の変異体＋１１～＋１と比べてＧＦＰ発現における約２倍の低
減を示したが、これはＴＲＡＰの存在下または非存在下で生じた。このことは、この変異
体ｍＲＮＡから翻訳されうるＧＦＰの全般的能力がそれほど効率的でなかったことを示し
ている（おそらく、最適コザックコンセンサス配列の欠失によるものであろう）。興味深
いことに、天然ｔｒｐオペロンからの５’ステムループの存在は、ＴＲＡＰと協同して翻
訳を抑制するｔｂｓの機能性を完全に除去した。この予想外の結果が示唆するところによ
ると、インビボでの機能性を可能にするＳＬ－ｔｂｓ配置のその他の特徴がどのようなも
のであっても、それらは、この人工配置から欠けているか、または適切な配列間隔／コン
テキストでは存在せず、あるいはバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）におけるＳＬ－ｔｂｓへのＴＲＡＰ結合は、転写減衰においては、翻訳減衰とは異
なるメカニズムに従っており、後者はＳＬに非依存的である。全てのこれらのデータは、
この人工系におけるｔｂｓへのＴＲＡＰ結合により導かれる翻訳抑制がｔｂｓと翻訳開始
コドンとの間の短い距離によっては改変されないことを示唆している。
実施例６ｂ．ＴＲＡＰ媒介性抑制に対するトランスジーンカセットの５’ＵＴＲ内のｔ
ｂｓの位置の影響の試験
ＴＲＡＰ媒介性抑制活性に関するトランスジーンの５’ＵＴＲ内のｔｂｓの位置の重要
性を更に特徴づけるために、ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰの一連の５’ＵＴＲ変異体を構築し
た。この場合、Ｃａｐ部位およびＡＵＧ開始コドンからのｔｂｓの相対距離を変化させた
（図２４ｉ）。また、ｔｂｓの２コピーがそれらの２つのｔｂｓ配列の間の３４ｎｔの介
在配列と共に５’ＵＴＲ内に挿入されたもう１つの構築物を作製した。これを構築したの
は、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ媒介性抑制が単一コピーのｔｂｓ配置と比べて増強されうるかどう
かを試験するためであった。
図２４ｉにおける７個のｔｂｓ変異体ＧＦＰレポーター構築物を、以下の３つの条件下
、ＴＲＡＰにより抑制されるそれらの能力に関して試験した：ＴＲＡＰ無し（ＨＥＫ２９
３Ｔ）、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＨＥＫ２９３Ｔ ＋ ＴＲＡＰ）での一過
性コトランスフェクション、および最大ＴＲＡＰ抑制条件（ＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［
内因性ＴＲＡＰ］ ＋ コトランスフェクト化ＴＲＡＰ）。該５’ＵＴＲ ｔｂｓ変異体
の全てはＴＲＡＰ［Ｈ６］によって１０～１００倍抑制可能であった。上流ＵＴＲの長さ
をゼロまで減少させる（すなわち、該ＵＴＲ全体が単一ｔｂｓのみから構成された）こと
はＴＲＡＰ媒介性抑制に影響を及ぼさないようであった。構築物＃［１］はＴＲＡＰによ
る～２－ＬｏｇのＧＦＰ抑制が可能であった。尤も、ＧＦＰの非抑制レベルはその他の構
築物より低かった。
ｔｂｓとＡＵＧ開始コドンとの間の間隔を９から４３ｎｔへと増加させることは、ｔｂ
ｓによる１０倍のＴＲＡＰ媒介性抑制を尚も可能にした。二重ｔｂｓコード化５’ＵＴＲ
変異体（図２４ｉｉ、構築物＃［７］）は、単一ｔｂｓ含有変異体と比較して、ＴＲＡＰ
媒介性抑制を改善しなかった。
これらのデータは、［１］単一ｔｂｓが５’ＵＴＲ内のいずれかの部位に挿入されて、
トランスジーンの或る程度のＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にしうること、［２］最大ＴＲＡ
Ｐ媒介性抑制を促進するために、ｔｂｓをＡＵＧ開始コドンの近くに挿入することが好ま
しいこと、および［３］ｔｂｓの上流の５’ＵＴＲ配列の長さが、抑制の大きさに影響を
及ぼすことなく、ゼロまで低減されうることを示している。
実施例７．翻訳のＴＲＡＰ媒介性抑制に必要なｔｂｓ内の［ＲＡＧＮＮ］反復の最小数
の特定
ＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にするのに必要な［ＲＡＧＮＮ］反復の最小数を特定するた
めに、次の実験を行った。文献における１つの報告は、ＴＲＡＰ結合を可能にするには僅
か５個の反復で十分でありうることを示すためにインビトロ結合を用いた（Ｂａｂｉｔｚ
ｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。１～７個の反復が
漸進的に欠失した一連のｔｂｓ欠失変異体を作製した（図１４ｉＡ）。全ての変異体にお
いて、最適コザック配列は維持された。また、ｔｂｓにおいて、第１０反復と第１１反復
との間でＴＧ＞ＡＡの変化を施した。これを行ったのは、この領域が非正準（ｎｏｎ－ｃ
ａｎｏｎｉｃａｌ）スプライスドナー部位を含有しうること（これは後に間違いであるこ
とが判明した）（非表示データ）を他の研究が示唆した後であった。該変異体ｔｂｓ Ｇ
ＦＰレポーター構築物をｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（前者は後者に対して１０：
１のモル過剰であった）またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコ
トランスフェクトし、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより測定した（図１４ｉＢ）
。ｔｂｓ×１１Ｍ変異体はＧＦＰ発現の１０００倍の抑制を可能にしたことから、ｔｂｓ
に対するＴＧ＞ＡＡの修飾はＴＲＡＰ媒介性抑制における検出可能な効果を及ぼさなかっ
た。変異体ｔｂｓ×１０Ｍ、ｔｂｓ×９およびｔｂｓ×８もＧＦＰ発現における１０００
倍の抑制を可能にし、一方、ｔｂｓ×７は５００倍の抑制を可能にした（図１４ｉＣおよ
びＤ）。ｔｂｓ×６を与えるもう１つのＲＡＧＮＮ反復の欠失は、この変異体がＧＦＰ発
現を３０倍抑制することが可能であったため、機能性における更なる低減をもたらした。
変異体ｔｂｓ×５およびｔｂｓ×４は無ｔｂｓ配列と比べて無視しうるほどの抑制を示し
た。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置による最も高いレベルの抑制は少なくとも７個（好ましくは少
なくとも８個）のＲＡＧＮＮ反復を要し、一方、６個の反復はトランスジーン発現におけ
る幾らかの有用なノックダウンを可能にしうることを、これらのデータは明らかに示して
いる。
実施例８．ｔｂｓ内で許容される［ＲＡＧＮＮＮ］反復の数の特定
一般的な一致した見解によると、ＲＡＧ反復間にＮ２スペーサーを含有するｔｂｓへの
ＴＲＡＰ結合が最適であるが、インビトロのｔｂｓ－ＴＲＡＰ結合研究は、ｔｂｓのＲＡ
Ｇ反復間の３ヌクレオチドのヌクレオチドスペーサーも許容されうることを示唆している
（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。実
際、インビボで見出される天然ｔｂｓ配列は、２ヌクレオチドより長いスペーサーを有す
ることがたまにある。尤も、これは、インビボでのＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用が、他のタ
ンパク質相互作用および／または選択圧が働きうる特異的細胞条件下で進化してきたこと
による可能性がある。生物学的機能性に合致するためには、天然ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作
用は最大効率であることを要しない可能性がある。しかし、人工ＴＲＩＰ系においては、
ＴＲＡＰ／ｔｂｓ相互作用は最大限度に効率的であることが望ましい。１１×ＲＡＧＮＮ
ｔｂｓ配列の機能性がＲＡＧＮＮＮ反復での系列的置換に対してどの程度許容性である
のかを試験するために、一連の変異体ｔｂｓ配列を設計し（図１４ｉｉＡ）、ＣＯＸ２ト
ランスジーンを発現するＥＩＡＶベクターゲノム内にクローニングした（図１８ｉを参照
されたい）。これらは、図１４ｉＡにおいて最初に試験されたｔｂｓ×１１Ｍ配列に基づ
くものであった。ＲＡＧＮＮＮ反復が中心位置から外側へとｔｂｓ×１１Ｍ内のＲＡＧＮ
Ｎ反復に取って代わって、１×、３×、５×、７×、そして最終的に１１×ＲＡＧＮＮＮ
反復を含有するｔｂｓ配列を与えた（Ｎ３×１１Ｍ ｔｂｓ配列に関しては、最も３’側
の遠位反復スペーサーはスペーサーとみなされないため、１０個のＮＮＮスペーサーのみ
が有効に存在することに注意されたい）。これらのベクターゲノムプラスミドをＥＩＡＶ
ベクターパッケージング成分 ＋／ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］と共にＨＥＫ２
９３Ｔ細胞内に一過性にコトランスフェクトし、ベクター上清を回収した（これらのＣＯ
Ｘ２ベクターのベクター力価は後記に示されている）。産生終了細胞ライセートをＣＯＸ
２に対する免疫ブロットにより分析して、スタッファープラスミド（非抑制）と比較した
場合の該細胞におけるトランスジーン抑制を測定した（図１４ｉｉＢ）。
１１×反復ｔｂｓ内の３個までのＲＡＧＮＮＮ反復はベクター産生細胞におけるトラン
スジーン発現の幾らかの検出可能な抑制を可能にすることを該データは示している。これ
は、ＴＲＩＰ系の非存在下のベクター力価に対するトランスジーンタンパク質の影響の大
きさによっては、幾つかの場合には、ベクター力価を改善するのに十分であるかもしれな
い。ｔｂｓ内の単一ＲＡＧＮＮＮ反復はＮ２×１１反復ｔｂｓと同程度に機能的であるよ
うである。
実施例８ｂ．ｔｂｓ内に許容される［ＲＡＧＮＮＮ］反復の数の特定
ＴＲＡＰ媒介性抑制を可能にするコンセンサス反復ＲＡＧＮ２－３におけるＲＡＧ反復
間のスペーサーを含むＮの数に関して、更なる研究を行った。図１４ｉＢはトランスフェ
クションの約２日後の産生終了細胞におけるＣＯＸ２発現分析を示す。Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ
変異体のコンテキストにおけるトランスジーン（ＣＯＸ２）発現がトランスフェクション
後の早い時点で（後の時点と比較して）異なっていたかどうかを試験するために、トラン
スフェクションの８時間後の産生細胞ライセートをＣＯＸ２に対する免疫ブロット法によ
り分析した（図１４ｉｉｉ）。ベクター産生中の早い時点および遅い時点の両方において
ＣＯＸ２発現の類似パターンがＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体から生じることを、これらのデー
タは示している。すなわち、与えられたｔｂｓ変異体に関するＴＲＡＰ－ｔｂｓ媒介性抑
制はベクター産生の経過中に類似しているようである。
Ｎ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体含有ベクターゲノムの、異なるレベルのＣＯＸ２抑制の、ベク
ター力価に対する影響を測定するために、粗上清回収物をＤＮＡ組込みアッセイに付した
。図１４ｉｖはこれらのデータを示し、明らかなＣＯＸ２抑制が産生細胞において認めら
れたＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体、すなわち、「Ｎ３Ｎ２×１１［３］」、「Ｎ３Ｎ２×１１
［１］」および「Ｎ２×１１［０］」に関しては、ベクター力価が増加したことを示して
いる。これは、ＲＡＧＮＮから構成される×１１ ｔｂｓ内の３個までの反復がＲＡＧＮ
ＮＮ反復で置換可能であり、ベクター力価の改善をもたらす幾らかのＴＲＡＰ媒介性抑制
活性を維持しうることを証明している。しかし、ベクター産生の増加以外の理由（すなわ
ち、ベクター投与中にトランスジーンに対する免疫応答を招きうるベクター産物に関連し
たトランスジーンタンパク質の著しい減少）により、ＲＡＧＮＮ ×８～１１ ｔｂｓ配
置が尚も優先されることに注目すべきである。
ＲＡＧＮＮ×７～８ ｔｂｓ変異体は最大に近いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有するこ
とが既に示された（図１４ｉ）。より短いこれらのｔｂｓ変異体内のＲＡＧＮＮＮによる
単一ＲＡＧＮＮ反復置換の影響を試験するために、第２の一連のＮ３Ｎ２ ｔｂｓ変異体
を構築し、ＣＯＸ２ベクターゲノム内に挿入した（図１４ｖＡ）。これらのベクターゲノ
ムプラスミドをＥＩＡＶベクターパッケージング成分 ＋／ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ
［Ｈ６］と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に一過性にコトランスフェクトし、トランスフェク
ションの８時間後、細胞ライセートをＣＯＸ２に対する免疫ブロットにより分析して、ス
タッファープラスミド（非抑制）と比較した場合の該細胞におけるトランスジーン抑制を
測定した（図１４ｖＢ）。これらのデータは、１個のＲＡＧＮＮＮ反復および７個のＲＡ
ＧＮＮ反復を含有する８反復ｔｂｓがＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有することを示してい
る。１以上のＲＡＧＮＮＮ反復を含有する８個未満の反復ｔｂｓの配列はより低いＴＲＡ
Ｐ媒介性抑制活性を有しうる。
実施例８ｃ．ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの５つの位置における好ましいヌクレオチド
の特徴づけ
ｔｂｓのＲＡＧＮＮコンセンサス反復を更に特徴づけるために、全てのＧＡＧｘｘ反復
から構成される×１１反復ｔｂｓのコンテキストにおける各ヌクレオチド（Ｇ｜Ａ｜Ｔ［
Ｕ］｜Ｃ）を用いて、ＮＮスペーサーを試験した。これらのｔｂｓ変異体をｐＣＭＶ－［
ｔｂｓ］ＧＦＰ内にクローニングして×１１Ｍ ｔｂｓに取って代え、ＨＥＫ２９３Ｔ細
胞 ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］の一過性コトランスフェクションにより
試験した。４８時間後、細胞をフローサイトメトリーにより分析し、ＧＦＰ発現スコアを
計算した（図２３ｉ）。これはＮＮ位におけるピリミジンの優先性を示した。機能性の一
般的順位はＴ［Ｕ］＞Ｃ＞Ｇ／Ａであった。最初の（Ｒ）位における最も機能的なヌクレ
オチドを試験するために、各ヌクレオチドＧ、Ａ、Ｔ［Ｕ］またはＣを、×１１、×８ま
たは×６反復を含むｔｂｓ内のｘＡＧＡＡ反復内に挿入した。これは、最弱のスペーサー
反復（ＮＮ＝ＡＡ）のコンテキストにおいては、Ｇが最初の位置において最も機能的であ
ることを示した。［ＴＡＧＡＡ］×１１の最初の位置におけるＴ［Ｕ］は最低限度に機能
的であるに過ぎず、これらのｘＡＧＡＡ反復のいずれにおいてもＡおよびＣは機能的でな
かった。したがって、縦列ｘＡＧＡＡ反復含有ｔｂｓのコンテキストにおいては、ｘはＴ
ではなく、Ｇでなければならない。
次に、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの第１位におけるＧまたはＴの相対的優先性を試験
した。高度に機能的なｔｂｓ（１１×ＧＡＧＴＴ）のコンテキストにおいて、ＧＡＧＴＴ
反復をＴＡＧＴＴ反復で漸進的に置換した。ＴＡＧＴＴ反復を増加させる（ＧＡＧＴＴ反
復を置換する）ことはｔｂｓの抑制機能を僅かに低減したに過ぎなかった。図２３ｉの結
果を考慮すると、これは、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスにおいては、可変性ヌクレオチド
のうち、機能性のために最も重要な位置がＮＮスペーサーであり、それに次いでＲである
ことを示唆している。該データは、ＮＮ位におけるピリミジンが最も好ましいことを示し
た。
ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスのこの特徴を更に特徴づけるために、もう１つの一連のｔ
ｂｓ変異体を構築した。この場合、ＧＡＧｘｘのコンテキストにおける少なくとも１つは
Ｎ＝Ｔであった（図２３ｉｉ）。これは、最初のＮ（ＲＡＧＮＮの第４位）が好ましくは
ピリミジンであり、より一層好ましくはＴ［Ｕ］である場合に最大抑制が達成されること
を示した。このＲＡＧＮＮ配列の縦列反復はトランスジーンＯＲＦの上流に複数のＡＴＧ
コドンを与え、これは下流トランスジーンの発現を低減する可能性があるため、ＧＡＧＡ
Ｔは試験しなかったことに注意されたい。
これらの知見の多くは、インビトロまたはインビボで試験されたＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互
作用に関する公開されている報告に合致している［細菌］（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．
Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。尤も、幾つかの相違が見られる。
例えば、本研究においては、ＲＡＧＣＣ反復はＴＲＡＰ抑制の非常に有効なメディエータ
ーであることが判明したが、他の研究は、このスペーサーが二次構造ゆえに活性を低減す
ることを示唆している（Ｘｉｒａｓａｇａｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ ２
７３（４２）：２７１４６－２７１５３，Ｏｃｔ １９９８）。このことは、ＴＲＡＰの
存在下で特異的ｔｂｓにより可能となる抑制の大きさを試験するためには、ＲＡＧＮＮ反
復を含む特異的ｔｂｓ配列が、ベクター産生のために意図される細胞（限定的なものでは
ないが、典型的にはＨＥＫ２９３に基づく細胞）において、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ抑制系内で
実験的に試験される必要があることを示している。総合すると、本研究におけるデータは
、ＲＡＧＮＮ反復コンセンサスの好ましいヌクレオチドが以下のとおりであることを示し
ている：
・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の最初の位置におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・好ましくはＲ位におけるＧ。
実施例９．翻訳がＩＲＥＳに依存的であるトランスジーンカセットにおけるＴＲＡＰ／
ｔｂｓ配置の試験
マルチシストロンベクターは、患者における標的細胞へ２以上の遺伝子を送達する際の
有用な手段である。したがって、ＴＲＩＰ系（ＩＲＥＳに依存的なものを含む）を使用し
てベクターゲノム内の複数のトランスジーンを抑制することができれば好都合であろう。
遠位ＯＲＦが配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に依存的であるトランスジーン発現
カセットにＴＲＩＰ系が適用されうるかどうかを試験するために、図１５Ａに記載されて
いるビシストロンベクターを構築した。簡潔に説明すると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ
）およびＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素をコードする配列をｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰ内に挿入し
て、ｐＣＭＶ－Ｖｉ－ｔｂｓｘ１１ＧＦＰ内にコードされるビシストロン遺伝子カセット
ＶＥＧＦ－ＩＲＥＳ－ｔｂｓＧＦＰを得た。４個のみの［ＲＡＧＮＮ］反復を含有する又
は反復を含有しない２つの更なる対照構築物を作製した。これらはＴＲＡＰにより抑制可
能であるとは予想されなかった。該構築物をスタッファープラスミドまたはｐＥＦ１ａ－
ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］のいずれかと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェクトし、
ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーにより評価した。これらのデータを図１５Ｂに示す。
ビシストロンカセットにおける遠位からのＧＦＰ発現のレベルは単一シストロン構築物の
ものより約７倍低かったが、これはビシストロン遺伝子配置には非典型的である。ｐＣＭ
Ｖ－Ｖｉ－ｔｂｓｘ１１ＧＦＰトランスフェクト化細胞におけるＧＦＰ発現のレベルは更
に２倍低かったが、このことは、該ｔｂｓ配列の配置がＩＲＥＳ依存的翻訳効率を若干低
減したことを示している。ｐＣＭＶ－Ｖｉｔｂｓｘ１１Ｇ ＋ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡ
Ｐ［Ｈ６］でトランスフェクトされた細胞におけるＧＦＰ発現のレベルはスタッファープ
ラスミドの場合より１７倍低かったが、このことは、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置が配列内リ
ボソーム進入のコンテキストにおいて機能しうることを示している。更に、この機能性は
ｔｂｓの存在およびＴＲＡＰタンパク質の存在に依存的であった。なぜなら、該対照およ
び４×反復構築物はＴＲＡＰに対して有意には応答しなかったからである。これらのデー
タは、ＩＲＥＳ依存的翻訳の制御による遺伝子発現の調節におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓの新
規使用を初めて示すものである（図１９ｉおよび１９ｉｉにおけるデータは、ＴＲＩＰ系
を使用してマルチシストロンｍＲＮＡ内の複数のＯＲＦが同時に抑制されうることを更に
実証している）。
ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置によるＷＰＲＥ含有ＳＩＮベクターからの産生細胞におけるＧＦ
Ｐトランスジーンの抑制
実施例１０．ＴＲＩＰ系を使用するＷＰＲＥを含有するＳＩＮ－レンチウイルスベクタ
ーの製造
ウッドチャック転写後要素（ＷＰＲＥ）をも含有するＳＩＮ－ベクターの製造（産生）
にＴＲＩＰ系を適用した。ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を使用するトランスジーン翻訳抑制を例
示するために使用した初期ベクターゲノム（ｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰ）はＳＩ
Ｎベクターではなく、転写後調節要素（ＰＲＥ）（現在のレトロウイルスベクターおよび
他のウイルスベクター系に典型的な特徴である）を含有しなかった。ＷＰＲＥは、ポリア
デニル化部位におけるリードスルーを低減することにより機能することが示されている（
Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ，Ｕ．Ｆ．，Ｐｅｒｕｍｂｅｔｉ Ａ，Ｊｉａｎｇ Ｇ，Ｚ
ａｒｚｕｅｌａ Ａ，Ｃｈａｎｇ ＬＪ，Ｋｏｈｎ ＤＢ，Ｍａｌｉｋ Ｐ．（２００７
）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １４（１７）：１２９８－１３０４）。しかし、初期報告
は、ＷＰＲＥが他の様態でＲＮＡレベルで作用しうることを示唆した。ＷＰＲＥを含有す
るＳＩＮ－ベクターゲノムからのトランスジーン発現を抑制するためにＴＲＡＰ／ｔｂｓ
配置が使用されうるかどうかを試験するために、ベクターゲノムｐＯＮＹ８．９ＲＣＴＧ
（＋ＷＰＲＥ）を構築し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現において試験した。図
１６は、ＳＩＮ－ベクターゲノム上のＷＰＲＥの含有がＴＲＩＰ系に悪影響を及ぼさない
ことを示した。ｐＯＮＹ８．４ＲＣ－ｔｂｓＧＦＰおよびｐＯＮＹ８．９ＲＣＴＧ（＋Ｗ
ＰＲＥ）からのＧＦＰ抑制は同等であった。
治療用トランスジーンを発現するベクターの産生力価を増加させるためのＴＲＩＰ系の
使用
実施例１１．ＴＲＩＰ系を使用するｈｕ第ＶＩＩＩ因子発現ベクターの製造
血友病Ａの治療のために開発されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）はＨＥＫ２９３Ｔ
細胞において製造することが困難である。なぜなら、トランスジーンｈｕ第ＶＩＩＩ因子
はベクタービリオン内へのＶＳＶＧエンベロープの取り込みを著しく抑制することが示さ
れているからである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において活性でない組織特異的プロモーターが
ｈｕ第ＶＩＩＩ因子の発現の駆動のために使用されない限り、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録
商標）のベクター力価は低い（混合実験データに関しては、図３ｉを参照されたい）（Ｒ
ａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ，Ｓ．Ｃ．，Ｗｉｌｋｅｓ ＦＪ，Ｃｕｓｔａｒｄ ＥＪ，Ｂｅ
ａｒｄ ＧＬ，Ｋｉｎｇｓｍａｎ ＳＭ，Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ＫＡ（２００８）
Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（４）：２８９－２９７）。ＨＥＫ２９３Ｔ産生細胞に
おけるｈｕ第ＶＩＩＩ因子発現を抑制することによりベクター力価が増加しうるかどうか
を試験するために、ＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）にＴＲＩＰ系を適用した。ベクター
ゲノムＲｅＱｕｎｉａｔｅ－ｔｂｓおよびＲｅＱｕｎｉａｔｅ－ｃｏｎを構築した（図１
７ｉ）。この場合、元のＲｅＱｕｉｎａｔｅ（登録商標）ゲノム内の５’ＵＴＲをｔｂｓ
－ＧＦＰレポーターベクター（図６に示されている）からの同じ５’ＵＴＲで置換した。
ＲｅＱｕｎｉａｔｅ－ｃｏｎベクターゲノムは、ｔｂｓがスクランブル化（ｓｃｒａｍｂ
ｌｅｄ）されている以外はＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｔｂｓと同じ５’ＵＴＲを含有していた
。ｔｂｓ陰性ｍＲＮＡからのｈｕ第ＶＩＩＩ因子の翻訳が、ｔｂｓ含有ｍＲＮＡと比較し
て配列の長さおよびヌクレオチド含量の点で類似した５’ＵＴＲのコンテキストとなるよ
うに、これを行った。ベクターゲノムプラスミドＤＮＡをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ
６］に対して５倍モル過剰で使用して、これらのベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞において
作製した。濾過されたベクター上清をＤＮＡ組込みアッセイに付して、力価を決定した。
また、ベクター上清を～１００倍濃縮し、ＰＥＲＴアッセイに付して粒子数を定量し、免
疫ブロット法により同数のベクター粒子をＶＳＶＧ含量に関して分析した。これらの分析
からのデータを図１７ｉｉに示す。ＴＲＩＰ系は、ＴＲＡＰ［Ｈ６］およびＲｅＱｕｉｎ
ａｔｅ（登録商標）の存在下で産生されたＲｅＱｕｉｎａｔｅ－ｔｂｓと比較して、ｈｕ
第ＶＩＩＩ因子発現ベクターゲノムのＤＮＡ組込み力価を３０倍改善した。ベクター粒子
内へのＶＳＶＧの取り込みの度合は、該ＴＲＡＰ／ｔｂｓ配置を使用して著しく増加し、
これはベクター力価と密接に相関した。興味深いことに、ＲｅＱｕｎｉａｔｅ－ｃｏｎで
作製されたベクター粒子内へのＶＳＶＧの取り込みは若干増加し、＋／－ ｐＥＦ１ａ－
ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］において、ベクター力価における僅かな付随的増加が観察された。
これは、この構築物からのｈｕ第ＶＩＩＩ因子の準最適発現によるものであった可能性が
ある。
実施例１２．ＴＲＩＰ系を使用するＣＯＸ２および／またはＦＲＰ発現ベクターの製造
緑内障を治療するためのレトロウイルスベクターの開発に関連して、幾つかのトランス
ジーンが、眼圧を低減するために評価されている。それらには、ＰＴＧＦＲ遺伝子により
コードされるプロスタグランジンＦ２αの受容体であるプロスタグランジンＦ受容体（Ｆ
ＰＲ）、およびプロスタグランジン生合成における律速酵素であるシクロオキシゲナーゼ
－２（ＣＯＸ－２）が含まれる。これらの遺伝子の両方の同時送達（別々の単一遺伝子ベ
クターによるもの、またはビシストロン遺伝子ベクターによるもの）は緑内障患者に有益
であると期待される。しかし、これらのトランスジーンをコードするベクターの力価はマ
ーカー遺伝子ベクター力価と比べて著しく低いことが判明している。この影響の少なくと
も一部はトランスジーン産物によるものであることが示されている。なぜなら、ベクター
産生中のｌａｃＺ－ベクターゲノムとのこれらのベクターゲノムの混合はｌａｃＺ－ベク
ター力価の減少を引き起こすからである（図３ｉｉを参照されたい）。
ＴＲＩＰ系が緑内障ベクター力価を増加させうるかどうかを試験するために、ｔｂｓ×
１１ｍ変異体配列（図１４ｉＡを参照されたい）を、図１８ｉに示されている単一トラン
スジーンベクターゲノム内にクローニングした。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３
Ｔにおいて作製し、同時にまた、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファー
プラスミドをベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフ
ェクトした。ベクター調製物を標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し（図１８
ｉｉＡ）、細胞ライセートをＣＯＸ－２ベクター産生細胞およびＣＯＸ－２ベクター導入
細胞の両方から採取して、標的細胞におけるｔｂｓ含有転写単位からのＣＯＸ－２の発現
を評価した。これらの分析からのデータをそれぞれ図１８ｉｉＢおよび１８ｉｉＣに示す
。ｔｂｓ－ＣＯＸ－２ベクターの力価は未修飾ＣＯＸ－２ベクターのものより１００倍高
く（図１８ｉｉＡ）、産生細胞におけるＣＯＸ－２のレベルは力価と逆相関した（図１８
ｉｉＢ）。ＣＯＸ－２発現は、ＴＲＩＰ系を使用して産生されたベクターが導入された標
的細胞内のみで頑強に検出可能であったが、このことは、ｔｂｓ配列が標的細胞における
トランスジーンの発現に影響を及ぼさなかったことを示している（図１８ｉｉＣ）。ＴＲ
ＩＰ系を使用して産生されたＦＰＲ－ベクターの力価は標準的ベクターと比べて２４倍増
加した（図１８ｉｉｉ）。この場合も、これは該系におけるＴＲＡＰおよびｔｂｓの両方
に依存的であった。
ＣＯＸ－２およびＦＰＲの両方を発現するマルチシストロンベクターを試験するために
、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、図１９ｉに示されているベクターゲノムプラスミド内クローニ
ングした。ＣＯＸ－２およびＦＲＰを＋／－ ｔｂｓ位でコードするビシストロンベクタ
ーゲノムプラスミドを作製した。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３Ｔにおいて標準
条件下で産生させ、同時にまた、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファー
プラスミドをベクターゲノム：ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフ
ェクトした。ベクター調製物を標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、細胞ラ
イセートをベクター産生細胞から採取した（図１９ｉｉ）。ＦＰＲに対する商業的に入手
可能な抗体が存在しないため、ＣＯＸ－２に対する抗体のみを使用して、細胞ライセート
の免疫ブロット法を行った。これらのデータは、ＴＲＩＰ系を使用してマルチシストロン
ｍＲＮＡが２以上のＯＲＦ位置において同時に抑制されうることを示している。この抑制
の結果はベクター力価における１００倍の増加を可能にした（ｐＫＣＭＶ－ＣＯＸ２－ｉ
－ＦＰＲ［＋スタッファー］とｐＫＣＭＶ－ｔｂｓＣＯＸ２－ｉ－ｔｂｓＦＰＲ［＋ｐＥ
Ｆ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］］との比較）。
実施例１３．ＴＲＩＰ系を使用するＯＸＢ－１０２ベクターの製造
ＯＸＢ－１０２は、パーキンソン病の治療のために開発されているＥＩＡＶベクターで
あり、それは、ドーパミン生合成に関与する３つのタンパク質、すなわち、チロシンヒド
ロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼおよび芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラー
ゼを発現する（ＷＯ ２０１３／０６１０７６に記載されている）。既に記載されている
とおり、これらの酵素はベクター力価に悪影響を及ぼさないことが公知であるが、ベクタ
ーの処理／濃度の観点、およびより低い免疫原性のベクター調製物を患者に投与するとい
う観点からは、ベクター産生細胞におけるトランスジーン発現を抑制することが有益であ
りうる。したがって、ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、図２０ｉに示されているマルチシストロン
ＯＸＢ－１０２ベクターゲノムプラスミドの５’近位ＯＲＦ内にクローニングした。得ら
れたベクターにおける融合遺伝子チロシンヒドロキシラーゼ：ＧＴＰ－シクロヒドロラー
ゼ１（ＴＨ－ＣＨ１）の翻訳はベクター産生細胞のみにおいてＴＲＡＰにより抑制される
と予測された。ウイルスベクター調製物をＨＥＫ２９３Ｔにおいて産生させ、同時にまた
、ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］またはスタッファープラスミドをベクターゲノム：
ＴＲＡＰプラスミドの１：０．２のモル比でコトランスフェクトした。ベクター調製物を
標準的なＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定し、細胞ライセートをベクター産生細胞か
ら採取した。図２０ｉｉＡおよび２０ｉｉＢは、ＴＨおよびＣＨ１の両方に対する抗体を
使用する免疫ブロットによる判断で、ＴＨ－ＣＨ１融合タンパク質がベクター産生細胞に
おいて抑制されるが（図２０ｉｉＢ）、抗ＴＨ抗体を使用する免疫染色による判断で、導
入細胞において容易に検出されることを実際に示している。
実施例１４．ＴＲＩＰ系を使用するＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクターの製造
本発明者らは、ＨＩＶに基づくレンチウイルスベクターの製造（産生）におけるＴＲＩ
Ｐ系の有用性を実証しようと努力した。ｔｂｓ×１１Ｍ配列を、ＣＭＶプロモーターの制
御下でＧＦＰをコードする標準的なＨＩＶ－１ベクターゲノム内にクローニングした（図
２５ｉＡ）。１０ｃｍプレート（トランスフェクションの２４時間前に３．５×１０６
細胞／プレートで播かれたもの）当たり２５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ）２０００ＣＤを使用して、４．５μｇのベクターゲノム、１．５μｇのｇａ
ｇｐｏｌ、１．１μｇのｒｅｖ、０．７μｇのｖｓｖｇ、および０．５６μｇのｐＥＦ１
ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（＋ＴＲＡＰ）または０．５６μｇのｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ
（－）の質量比のパッケージング成分プラスミドでのＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性コトラ
ンスフェクションにより、ＧＦＰコード化ベクターを産生させた。培養を一晩インキュベ
ートした後、酪酸ナトリウムを１０ｍＭの最終濃度まで５時間加えた。ついで培地を交換
し、培養をトランスフェクションの２日後までインキュベートし、その時点で粗ベクター
上清を回収し、濾過（０．２μｍ）し、－８０℃で保存した。産生終了細胞をフローサイ
トメトリーに分析し、ＧＦＰ発現スコアを計算した。ベクター上清をＨＥＫ２９３Ｔ細胞
のトランスダクションにより力価測定し、ついでフローサイトメトリーによる分析を行っ
た。図２５ｉｉＢは産生終了細胞のＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ）および得られ
たベクター力価の両方を示す。記載されているｔｂｓ配列をＨＩＶ－１ベクターゲノムが
含有する場合およびＴＲＡＰが共導入された場合にのみ、ＧＦＰ発現は２－Ｌｏｇ抑制さ
れた。しかし、ベクター力価はこれらの修飾によっては影響されなかった。これらのデー
タは、原則として、ＴＲＩＰＬｅｎｔｉ（レンチ）系を使用して、いずれかのトランスジ
ーンが、ＨＩＶ－１に基づくベクター産生細胞において抑制されうることを示している。
治療用遺伝子をコードするＨＩＶ－１に基づくベクターの力価が、ＴＲＩＰＬｅｎｔｉ
系を使用して改善されうるかどうかを評価するために、ｔｂｓ×１１Ｍ ｔｂｓを、５Ｔ
４－ＣＡＲをコードするＨＩＶ－１ベクターゲノムのトランスジーンカセット（図２５ｉ
ｉＡ）の５’ＵＴＲ内に挿入した。この治療用ベクターはＴ細胞の遺伝的修飾のためのも
のであり、抗原５Ｔ４を発現する腫瘍細胞を該Ｔ細胞が標的とし殺すことを可能にする。
得られたベクターＨＩＶ－ｔｂｓ－ｈ５Ｔ４．ＣＡＲを、（ＧＦＰベクターに関する）前
記と同じ条件下で、すなわち、ベクター成分 ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６
］でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞のコトランスフェクションにより産生させた。ベクター上清を
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＮＡ組込みアッセイにより力価測定した。図２５ｉｉＢは
この実験の結果を示す。ＴＲＡＰ［Ｈ６］を産生細胞内で共発現させた場合、対照（ｐＢ
ｌｕｅＳｃｒｉｐｔ）と比較して、ＨＩＶ－ｔｂｓ－ｈ５Ｔ４．ＣＡＲの力価は３０倍大
きかった。これらのデータは、産生細胞における５Ｔ４．ＣＡＲの発現が活性なベクター
の産生に有害であること、および、ＴＲＩＰ系がトランスジーン発現の抑制によりこの問
題を克服することを示している。
実施例１５．ＴＲＩＰ－ｔｂｓ配置は細胞質におけるトランスジーンｍＲＮＡレベルに
影響を及ぼさない
ＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置は極めて強力なトランスジーン抑制を可能し、専ら翻訳レベルで
作用すると考えられている。ｔｂｓをコードするｍＲＮＡの定常状態プールがＴＲＡＰの
存在下で影響されるかどうか（例えば、考えられうる不安定化効果）（これは、トランス
ジーン発現の抑制にも寄与しうるであろう）を試験するために、トランスジーン細胞質Ｒ
ＮＡの相対レベルを、ｐＣＭＶ－［ｔｂｓ］ＧＦＰ ＋／－ ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ
［Ｈ６］でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において測定した。細胞をトラン
スフェクトし、トランスフェクションの２日後にＧＦＰ発現をフローサイトメトリーによ
り測定した（図２６Ａ）、同型培養を分画し、核を除去し、全細胞質ＲＮＡを、ＱＩＡＧ
ＥＮ ＲＮＡｅａｓｙキットを使用して精製した。ＲＮＡをＤＮＡアーゼ処理した後、Ｇ
ＦＰ標的配列に対するＦＡＭ－プローブ／プライマーセットを使用してｑＲＴ－ＰＣＲを
行った（図２６Ｂ）。これまでのデータと合致して、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置はＨＥＫ２９
３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現を２－Ｌｏｇ抑制することが可能であった。しかし、細胞質
内のＧＦＰ ｍＲＮＡの検出レベルは全ての条件にわたって僅か～２倍変動したに過ぎな
かった（全てのＣｔ値は１．５サイクル未満で変動した）。これらのデータは、ＴＲＡＰ
媒介性トランスジーン抑制の最も考えられうるメカニズムが翻訳におけるものであること
を証明している。
実施例１６．構成的プロモーターをコードするＨＩＶ－１に基づくベクターからのベク
ター産生細胞におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性ビシストロントランスジーン抑制と、組織
特異的プロモーターをコードするＨＩＶ－１に基づくベクターからの該抑制との比較
転写レベルにおけるトランスジーン抑制と比較してＴＲＡＰ媒介性抑制（翻訳レベルの
もの）を試験するために、組織特異的プロモーター（ＶＭＤ２；光受容体細胞発現（Ｅｓ
ｕｍｉ，Ｎ．ら（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１９０６４－７３），ｍ
ＡｌｂＡＴ；肝細胞発現（Ｋｒａｍｅｒ，Ｍ．Ｇ．ら（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．７
：３７５－３８５））または構成的ＣＭＶプロモーターによりトランスジーン転写が駆動
されるＨＩＶ－１に基づくベクターゲノムを構築した。該トランスジーンカセットはビシ
ストロンであり、第１ ＯＲＦにおいてはホタル（ホチヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕ
ｓ ｐｙｒａｌｉｓ））ルシフェラーゼを、そして第２ ＯＲＦにおいてはＧＦＰをコー
ドしており、それらの２つのＯＲＦの間にＥＭＣＶ ＩＲＥＳ要素が挿入されている。単
一ｔｂｓ（×１１Ｍ）配列を両方のレポーター遺伝子の上流に挿入した。第１または第２
ＯＲＦのみがＴＲＡＰ－ｔｂｓにより調節される代替的ＣＭＶプロモーター構築物、お
よびいずれのｔｂｓ配列をも含有しない又はプロモーターを含有しない対照を作製した（
図２７ｉ）。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてベクター粒子を作製するために７個のベクターゲノムを使
用した。ベクターゲノムプラスミド ＋ パッケージング成分およびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴ
ＲＡＰ［Ｈ６］またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（対照）のいずれかで細胞をコトランスフ
ェクトした。また、ｐＧＬ３－対照（ＳＶ４０プロモーター駆動性レニラ・レニフォルミ
ス（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ルシフェラーゼ）を加えて（全ＤＮＡに
対して１：４０の比）、トランスフェクション効率対照を得た。プラスミドの比は以下の
とおりであった：ゲノム（４．５）｜ＧａｇＰｏｌ（１．５）｜Ｒｅｖ（１．１）｜ＶＳ
ＶＧ（０．７）｜ＴＲＡＰ／Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（０．５６）｜ｐＧＬ３対照（０．２
３）。トランスフェクションは９６ウェルの規模で二重重複プレートにおいて行い、各条
件を三重重複で行った。トランスフェクションの１日後、培養を１０ｍＭ 酪酸ナトリウ
ムで５～６時間誘導した（典型的なベクター産生法）後、培地を新鮮培地と交換した。産
生終了細胞をフローサイトメトリーにより分析してＧＦＰ発現スコア（ＭＦＩ×％ＧＦＰ
）を得て、第２位における発現を測定し、あるいは産生終了細胞をＤｕａｌ ｌｕｃｉｆ
ｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い受動細
胞溶解（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ）バッファー中で細胞溶解して、第１位における発
現を測定した。Ｄｙｎｅｘ ＭＬＸプレートリーダーを、製造業者の方法を用いて前記プ
ロトコルに従い使用して、ホタルルシフェラーゼ発現に関してライセートを分析した。
ベクター産生細胞におけるビシストロンカセットに関する発現データを図２７ｉｉに示
す。予想どおり、ＴＲＡＰが供給された場合のｐＨＩＶ－ＣＭＶ－Ｌｕｃ－ｉＧＦＰから
は、ｔｂｓの非存在ゆえに、ルシフェラーゼまたはＧＦＰのいずれの抑制も観察されなか
った。ｐＨＩＶ－ＣＭＶ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰおよびｐＨＩＶ－ＣＭＶ－ｔｂ
ｓＬｕｃ－ｉＧＦＰからはルシフェラーゼ発現の抑制が観察されたが、ｐＨＩＶ－ＣＭＶ
－Ｌｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰからは観察されなかった。
興味深いことに、プロモーター非含有ゲノムｐＨＩＶ－Ｎｕｌｌ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔ
ｂｓＧＦＰはＣＭＶｐ変異体より１００倍低いレベルでルシフェラーゼを発現したが、こ
の発現レベルはＴＲＡＰにより抑制可能であった。より低いレベルの（ＴＲＡＰの非存在
下の）このルシフェラーゼ発現は完全長ベクターゲノムＲＮＡからＣＡＰ依存的に（すな
わち、完全長ベクターＲＮＡの５’末端からのリボソームスキャニングにより）誘導され
る可能性がある。したがって、ＴＲＡＰは完全長ベクターゲノムＲＮＡ上のｔｂｓに結合
し、より長いこのＲＮＡおよび内部転写産物からのトランスジーン発現を阻止しうる。こ
れは、高レベルのＧＦＰがｐＨＩＶ－Ｎｕｌｌ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰにより発
現された事実によって更に実証される。これは、おそらく、ＩＲＥＳ要素がＧＦＰ翻訳の
みを駆動することによるものであろう。ＴＲＡＰは、ｐＨＩＶ－Ｎｕｌｌ－ｔｂｓＬｕｃ
－ｉｔｂｓＧＦＰに由来する完全長ベクターゲノムＲＮＡからのＧＦＰのこの発現を抑制
することが可能であった。これは、ルシフェラーゼ発現が（ＣＭＶｐ構築物と比べて）低
いにもかかわらず、組織特異的構築物ｐＨＩＶ－ＶＭＤ２－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦ
ＰおよびｐＨＩＶ－ｍＡｌｂ－ｈＡＡＴ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰが、（ＴＲＡＰ
の非存在下）ｐＨＩＶ－Ｎｕｌｌ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰと比べて類似レベルの
ＧＦＰを産生したことにより裏付けられ、このことは、ＧＦＰ発現の大部分が内部プロモ
ーター駆動性カセットに由来していなかったことを示している。このレベルの（完全長ベ
クターゲノムＲＮＡからの）ＧＦＰ発現はＴＲＡＰによって効率的に抑制可能であった。
最後に、ｐＨＩＶ－ＶＭＤ２－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰおよびｐＨＩＶ－ｍＡｌｂ
－ｈＡＡＴ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰからのルシフェラーゼ発現のレベルはｐＨＩ
Ｖ－Ｎｕｌｌ－ｔｂｓＬｕｃ－ｉｔｂｓＧＦＰの場合より～２倍高かった。このことは、
これらの組織特異的プロモーターがＨＥＫ２９３Ｔにおいて若干漏出性であることを示し
ている。この低レベルのルシフェラーゼ発現でさえもＴＲＡＰによって抑制された。
これらの観察を、図２７ｉｉｉに示す図に要約する。これらのデータは、ＴＲＩＰ系が
マルチシストロントランスジーンを同時に抑制することが可能であり、組織特異的プロモ
ーターの使用と比較した場合の利点を有することを示している。レトロウイルスベクター
産生の場合、大量の完全長ベクターゲノムＲＮＡが細胞内で転写される必要があるが、こ
こで、本発明者らは、特にＩＲＥＳ要素が使用された場合、トランスジーンタンパク質の
翻訳がこの完全長分子から可能であることを示している。ＴＲＩＰ系は翻訳レベルで抑制
を媒介するため、それは完全長ベクターゲノムＲＮＡおよび内部由来トランスジーンカセ
ットｍＲＮＡからのトランスジーン発現を抑制しうる。
実施例１７．ＤＮＡに基づくウイルスベクターの産生におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性
トランスジーン抑制の有用性の実証；事例研究１－ＡＡＶに基づくベクター
以下の研究はＴＲｉＰＡＶＶベクター産生系を示し、これは、レトロ／レンチウイルス
のようなＲＮＡに基づくウイルスベクター系に関して記載されているのと同様にしてＴＲ
ＡＰ－ｔｂｓ配置を使用する。図２８ｉはＴＲｉＰＡＶＶ系の非限定的な一例を示し、こ
れは、以下の発現カセットを含有する産生細胞（例えば、アデノウイルスＥ１発現細胞；
ＨＥＫ２９３に基づく細胞、ＰＥＲ．Ｃ６に基づく細胞）を含む：［１］トランスジーン
の５’ＵＴＲ内（および／またはＩＲＥＳと下流トランスジーンとの間）にｔｂｓが挿入
されるように修飾されたＡＡＶベクターゲノム、［２］ｒｅｃａｐ発現プラスミド、［３
］ヘルパー機能（例えば、アデノウイルスＥ２Ａ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＶＡ遺伝子）、および
［４］ＴＲＡＰ発現カセット（一過性にトランスフェクトされた又は安定なＴＲＡＰ細胞
系）。
トランスジーン発現がＡＡＶベクター産生細胞において抑制されうるかどうかを試験す
るために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ｔｂｓ
ＧＦＰベクター（血清型２）の産生にＴＲｉＰＡＡＶ系を適用した。まず、ＴＲＡＰ媒介
性抑制に対するｒｅｃａｐおよびアデノウイルスヘルパー機能の共発現の影響を試験し、
ｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰレポータープラスミドと比較した（図２８ｉｉ）。ｐＥＦ１ａ－
ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］、ｐＲｅｐＣａｐ２ およびｐＨｅｌｐｅｒ（ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴ
ＲＡＰ［Ｈ６］に関して特記されているもの以外は全て、２μｇ／１０ｃｍプレートの等
しい質量比におけるもの；図２８ｉｉを参照されたい）の種々の組合せにおけるｐｓｃＡ
ＡＶ－ＧＦＰまたはｐｓｃＡＡＶ－ｔｂｓＧＦＰまたはｐＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰのいずれ
かでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を三重重複でトランスフェクトした。予想どおり、ＴＲＡＰの発
現は、ｔｂｓを欠くｐｓｃＡＡＶ－ＧＦＰによるＧＦＰ発現には影響を及ぼさなかった。
ｐｓｃＡＡＶ－ｔｂｓＧＦＰからのＧＦＰ発現はＴＲＡＰの存在下（１：１の比のＴＲＡ
ＰおよびｓｃＡＡＶベクターゲノムプラスミド）で約３－Ｌｏｇ抑制された。ｐＨｅｌｐ
ｅｒまたはｐＲｅｐＣａｐ２の共発現はＴＲＡＰ媒介性抑制のこのレベルに影響を及ぼさ
なかった。ｐｓｃＡＡＶ－ｔｂｓＧＦＰ、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅｌｐｅｒおよびｐＥ
Ｆ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を全て一緒に（すなわち、ｓｃＡＡＶ－ｔｂｓＧＦＰベク
ター粒子が産生される条件下で）トランスフェクトした場合、ＴＲＡＰによるＧＦＰ抑制
のレベルは３００倍を超えた。ｓｃＡＡＶ－ｔｂｓＧＦＰ産生の条件下のｐＥＦ１ａ－ｃ
ｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ゲノムとの比は１：１［２μｇ］～１０：１［０．２μｇ］）の、
１０倍の力価は、より大量のＴＲＡＰプラスミドの投入で、３－Ｌｏｇの抑制が可能であ
りうることを示している。ＴＲｉＰＡＡＶ系を使用してＡＡＶベクターゲノム内のトラン
スジーンカセットの発現が少なくとも３００倍抑制されうること、およびパッケージング
／ヘルパー機能自体はＴＲＡＰ媒介性抑制を抑制しないことを、これらのデータは示して
いる。
ＴＲｉＰＡＡＶ系を使用して機能的ＡＡＶベクター粒子が産生されうることを実証する
ために、ｐｓｃＡＡＶ２－ＧＦＰゲノム（＋／－ ｔｂｓ）、ｐＲｅｐＣａｐ２、ｐＨｅ
ｌｐｅｒおよびｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ（－）（２μｇの全ＤＮＡ）で細胞をトランスフェクトすることにより、ｓｃＡＡ
Ｖ２－［ｔｂｓ］ＧＦＰベクター粒子を１０ｃｍプレートの規模で産生させた。～５３時
間後、細胞を凍結－解凍し、ベクター粒子を、Ｖｉｒａｂｉｎｄ（商標）キットを使用し
て精製し、１００μＬ ＰＢＳの最終体積まで濃縮し、ついでＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥ
ＰＧ２細胞のトランスダクションにより力価測定した（図２８ｉｉｉ）。これらのデータ
は、ＡＡＶ－ＧＦＰベクターがＴＲｉＰＡＡＶ系において、標準的な方法の場合と同等の
力価まで産生されうることを示しており、このことは、ｔｂｓ修飾およびＴＲＡＰの共発
現がＡＡＶベクターの生物学を本質的に妨げないことを示している。したがって、ＴＲｉ
ＰＡＡＶ系を使用してＡＡＶベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の強力な抑制
が可能であること、およびトランスジーン産物の活性がＡＡＶベクター粒子の力価または
効力に有害である場合、この活性は著しく低減することを、この研究は示している。
ＴＲｉＰＡＡＶベクター系が、ＡＡＶベクターゲノムによりコードされる非常に毒性／
問題のあるトランスジーンを産生細胞において抑制しうることを実証するために、ｓｃＡ
ＡＶ２－ｔｂｓＢａｍａｓｅを構築した（図２８ｉｖＡ）。バルナーゼ（Ｂａｒｎａｓｅ
）は、発現されると真核細胞に対して毒性である強力な細菌ＲＮアーゼであり、サイレン
シングされない限りＡＡＶベクターの産生を妨げることが示されている（Ｃｈｅｎ Ｈ．
，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ．，１，ｅ５７；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍ
ｔｎａ．２０１２．４８，Ｎｏｖ ２０１２）。ＨＥＫ２９３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ．
ＴＲｉＰ［３Ｄ］細胞系をｐＲｅｐＣａｐ２およびｐＨｅｌｐｅｒパッケージング成分（
ｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］を伴わない）でトランスフェクトした。ただし、ＧＦ
Ｐ発現に対するバルナーゼの効果を観察するために、等しい質量のｐｓｃＡＡＶ２－ＧＦ
Ｐ（図２８ｉｖＢ）およびｐｓｃＡＡＶ２－ｔｂｓＢａｒｎａｓｅゲノムプラスミドを混
合し、あるいはｐｓｃＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ＧＦＰのみをトランスフェクトした。トラン
スフェクションの２４時間後、これらの培養の写真を撮影し、これらを図２８ｖ：ｉ～ｉ
ｉに示す。ｐｓｃＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ＧＦＰのみでトランスフェクトされたＨＥＫ２９
３ＴおよびＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ［３Ｄ］培養は高レベルのＧＦＰ発現を示した（図
２８ｖ：ｉｉ）。しかし、ｐｓｃＡＡＶ－（ＣＭＶ）－ＧＦＰゲノムおよびｐｓｃＡＡＶ
－（ＣＭＶ）－ｔｂｓＢａｒｎａｓｅでコトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ培養は
無視しうるレベルのＧＦＰを発現したが（図２８ｖ：ｉ）、このことは、おそらくトラン
スジーンｍＲＮＡおよびリボソームＲＮＡの分解ゆえに、バルナーゼ発現がタンパク質発
現の低減の全体的な影響をもたらしていたことを示している。これとは対照的に、同じＤ
ＮＡ混合物でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲｉＰ培養は相当なＧＦＰ発現
を可能にしたが、このことは、これらの細胞におけるＴＲＡＰ［Ｈ６］の内因性レベルが
バルナーゼ発現を抑制していたことを示している。より一層大きなレベルの内因性ＴＲＡ
Ｐを含有する安定細胞系を単離することによりバルナーゼ抑制を改善することが可能であ
りうる。ウイルスベクター産生中に発現される毒性トランスジーンタンパク質としてのバ
ルナーゼのモデル化は最悪の場合のシナリオに相当し、この場合、デノボ（ｄｅ ｎｏｖ
ｏ）タンパク質合成（ウイルスベクター成分を含む）が有効に阻止される。ＨＥＫ２９３
Ｔ．ＴＲｉＰ細胞におけるＧＦＰ発現の中等度の回復が観察されたことを考慮すると、こ
れは、ＡＡＶベクター成分タンパク質の発現も生じたこと、およびバルナーゼをコードす
るＡＡＶベクター粒子の産生が安定なＴＲＡＰ細胞系において可能であることを示唆して
いる。
実施例１８．ＤＮＡに基づくウイルスベクターの産生におけるＴＲＡＰ／ｔｂｓ媒介性
トランスジーン抑制の有用性の実証；事例研究２－アデノウイルスに基づくベクター
以下の研究はＴＲＩＰＡｄｅｎｏベクター産生系を示し、これは、レトロ／レンチウイ
ルスのようなＲＮＡに基づくウイルスベクター系に関して及びＤＮＡに基づくＡＡＶベク
ター（実施例１７）に関して記載されているのと同様にしてＴＲＡＰ－ｔｂｓ配置を使用
する。図２９ｉはＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系の非限定的な一例を示し、これは、以下の発現カ
セットを含有する産生細胞（例えば、アデノウイルスＥ１発現細胞；ＨＥＫ２９３に基づ
く細胞、ＰＥＲ．Ｃ６に基づく細胞）を含む：［１］トランスジーンの５’ＵＴＲ内（お
よび／またはＩＲＥＳと下流トランスジーンとの間）にｔｂｓが挿入されるように修飾さ
れたアデノウイルスに基づくベクターゲノム、および［２］ＴＲＡＰ発現カセット（一過
性にトランスフェクトされた又は安定なＴＲＡＰ細胞系）。所望により、Ｅ１欠失ヘルパ
ーウイルスがヘルパー依存的ベクター産生のために共導入されうる。
哺乳類細胞においてベクターＤＮＡ組換え中にＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系においてトランス
ジーン発現が抑制されて、完全長Ａｄｅｎｏ－ｔｂｓＴｒａｎｓｇｅｎｅベクターゲノム
が得られうることを実証するために、ｐＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびｐＡｄｅｎｏ
－ｔｂｓＧＦＰシャトルプラスミド（ＲＡＰＡｄ（登録商標）キット，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
Ｌａｂｓ）を構築した（図２９ｉｉＡ）。これらは、該トランスジーンカセットをコード
するアデノウイルスゲノム（Ｅ１欠失体）の左側を含有していた。これらのシャトルプラ
スミドをｐＥＦ１ａ－ｃｏＴＲＡＰ［Ｈ６］（ＴＲＡＰ）またはｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ
（－）と共に、そして並行トランスフェクションにおいてｐａｃＡｄ５ ９．２－１００
（ＲＡＰＡｄ（登録商標）キット，Ｃｅｌｌ ＢｉｏＬａｂｓ）（これは、該シャトルに
おけるＡｄ５配列に対する重複相同性、およびＡｄ５ゲノム（Ｅ３欠失体）から右側ＩＴ
Ｒまでの残部を含む）（図２９ｉｉＢ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にコトランスフェク
トした。シャトルプラスミド対ＴＲＡＰプラスミドの質量比は５：１であった。同型培養
を４８時間インキュベートし、ついでフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現に関して分
析し（ＧＦＰ発現スコアを得た；ＭＦＩ×％ＧＦＰ）、あるいは細胞変性効果が観察され
るまで（～１４日）、インキュベートした。細胞を凍結－解凍し、細胞残渣を除去するこ
とにより、粗Ａｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰベク
ターストックを調製し、ついでＨｅＬａ細胞上での力価測定を行った。
図２９ｉｉＢにおけるデータはトランスフェクションの４８時間後の培養における全体
的なＧＦＰ発現を示し、トランスジーン５’ＵＴＲ内にｔｂｓが存在する場合かつＴＲＡ
Ｐの存在下でのみ、Ａｄシャトルプラスミドからのトランスジーン発現が２－Ｌｏｇ抑制
されうることを示している。ｐａｃＡｄ５ ９．２－１００でのコトランスフェクション
は抑制レベルに影響を及ぼさなかったが、このことは、哺乳類細胞においてベクターＤＮ
Ａ組換え中にトランスジーン発現を抑制することが可能であることを示している。これは
哺乳類細胞におけるアデノウイルスベクターの製造における大きな進歩に相当する。なぜ
なら、毒性トランスジーン発現はベクター組換え体の回収の可能性をなくしうるからであ
る。
ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系がＡｄベクター増幅中にトランスジーン発現を抑制しうるかどう
かを試験するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞
（ＴＲＡＰ［Ｈ６］を安定に発現する）にＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ
－ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰを０．０１のＭＯＩで導入した。同型培養をベクター増幅中のＧ
ＦＰ発現に関して接種後の種々の時点で分析し、ＧＦＰ発現スコアを得た（ＭＦＩ×％Ｇ
ＦＰ）。この実験の結果は図２９ｉｉｉに示されており、ＧＦＰ発現が、ＨＥＫ２９３Ｔ
．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞系においてのみ、Ａｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ｔｂｓＧＦＰの増幅中に
＞４００倍抑制されることを示している（図２９ｉｉｉＡ）。予想どおり、それらの細胞
系のいずれにおいてもＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰの増幅中のＧＦＰ発現は類似していた
（すなわち、抑制されなかった）。
ＴＲＡＰの存在下で産生されたＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ－ＧＦＰおよびＡｄｅｎｏ－ＣＭＶ
－ｔｂｓＧＦＰのベクターストックを、接種の４８時間後に細胞から回収し、残渣を除去
し、ＨｅＬａ細胞上で力価測定を行った（図２９ｉｉｉＢ）。ＨＥＫ２９３ＴまたはＨＥ
Ｋ２９３Ｔ．ＴＲＩＰ［３Ｄ］細胞において産生されたベクターの力価は同等であったが
、このことは、ｔｂｓ修飾およびＴＲＡＰの発現がアデノウイルスベクターの生物学を本
質的に妨げないことを示している。したがって、ＴＲＩＰＡｄｅｎｏ系を使用してアデノ
ウイルスベクター産生細胞におけるトランスジーン発現の強力な抑制が可能であること、
およびトランスジーン産物の活性がアデノウイルスベクター粒子の力価または効力に有害
である場合、この活性は著しく低減することを、この研究は示している。
前記の本明細書に挙げられている全ての刊行物を参照により本明細書に組み入れることとする。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明の記載されている態様の種々の修飾および変更が当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求している本発明はそのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないと理解されるべきである。実際、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野における当業者に明らかである、本発明を実施するための記載されている態様の種々の修飾が、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
一態様において、本発明は以下を提供する。
[項目１]
関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含む核酸配列であって、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、前記ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、核酸配列。
[項目２]
ＲＮＡ結合タンパク質を欠く標的細胞において、関心のあるヌクレオチドが翻訳される、項目１記載の核酸配列。
[項目３]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２－３ の複数の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項1～２のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目４]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２ の複数の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、項目１～３のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目５]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２ の、少なくとも６個の反復を含む、項目１～４のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目６]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２－３ の、少なくとも８個の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、項目１～３のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目７]
ＲＡＧＮＮＮの反復の数が１以下である、項目６記載の核酸配列。
[項目８]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２ の、８～１１個の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、項目１～７のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目９]
ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ ２－３ の、１１個の反復を含み、ここで、ＲＡＧＮＮＮの反復の数が３以下であり、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、項目１～８のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目１０]
関心のあるヌクレオチドが治療効果をもたらす、項目１～９のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目１１]
核酸配列がＲＲＥ配列またはその機能的代替物を更に含む、項目１～１０のいずれか１項記載の核酸配列。
[項目１２]
項目１～１１のいずれか１項記載の核酸配列を含むウイルスベクター。
[項目１３]
２以上の、関心のあるヌクレオチドを含み、少なくとも１つの、関心のあるヌクレオチドが、項目１～１１のいずれか１項に定められている結合部位に機能的に連結されている、項目１２記載のウイルスベクター。
[項目１４]
項目１２～１３のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、項目１～１１のいずれか１項記載の核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
[項目１５]
項目１２～１３のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のための、ＲＮＡ結合タンパク質をコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物。
[項目１６]
該構築物が、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸配列を含む、項目１５記載のＤＮＡ構築物。
[項目１７]
項目１２～１３のいずれか１項記載のウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットであって、項目１４記載のＤＮＡ構築物、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物ならびにＥｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含む、ＤＮＡ構築物のセット。
[項目１８]
項目１５または１６記載のＤＮＡ構築物を更に含む、項目１７記載のＤＮＡ構築物のセット。
[項目１９]
ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を更に含む、項目１７または１８記載のＤＮＡ構築物のセット。
[項目２０]
項目１～１１のいずれか１項記載の核酸配列を、医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
[項目２１]
核酸結合部位に機能的に連結されている場合に、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように相互作用しうる核酸結合部位および／または核酸結合タンパク質を特定する方法であって、レポーター遺伝子に機能的に連結された核酸結合部位および核酸結合タンパク質の両方を含む細胞におけるレポーター遺伝子の発現を分析することを含む方法。
[項目２２]
前記核酸結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、項目２１記載の核酸結合部位を特定する方法。
[項目２３]
核酸結合部位がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）に結合しうる、項目２１記載の核酸結合タンパク質を特定する方法。
[項目２４]
レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、項目２１～２３のいずれか１項記載の方法。

Claims (16)

  1. ウイルスベクター産生系において使用するための核酸であって、
    該ウイルスベクター産生系は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸のセットを含み、
    該ベクターのゲノムが前記核酸を含み、
    前記核酸は、関心のあるヌクレオチドに機能的に連結された結合部位を含み、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター産生細胞において抑制されるように該結合部位がＲＮＡ結合タンパク質と相互作用することができ、前記ＲＮＡ結合タンパク質がトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）である、核酸。
  2. ＲＮＡ結合タンパク質を欠く標的細胞において、関心のあるヌクレオチドが翻訳される、請求項１記載の核酸。
  3. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の複数の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項1～２のいずれか１項記載の核酸。
  4. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の複数の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項１～３のいずれか１項記載の核酸。
  5. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、少なくとも６個の反復を含む、請求項１～４のいずれか１項記載の核酸。
  6. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の、少なくとも８個の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項１～３のいずれか１項記載の核酸。
  7. ＲＡＧＮＮＮの反復の数が１以下である、請求項６記載の核酸。
  8. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２の、８～１１個の反復を含み、ここで、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項１～７のいずれか１項記載の核酸。
  9. ＴＲＡＰ結合部位が配列ＲＡＧＮ２－３の、１１個の反復を含み、ここで、ＲＡＧＮＮＮの反復の数が３以下であり、ＲはＴ、ＵまたはＧであり、ＮはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵである、請求項１～８のいずれか１項記載の核酸。
  10. 関心のあるヌクレオチドが治療効果をもたらす、請求項１～９のいずれか１項記載の核酸。
  11. 核酸配列がＲＲＥ配列またはその機能的代替物を更に含む、請求項１～１０のいずれか１項記載の核酸。
  12. ウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物であって、
    該ウイルスベクター産生系は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸配列のセットを含み、
    該ベクターのゲノムが前記ＤＮＡ構築物を含み、
    前記ＤＮＡ構築物が請求項１～１１のいずれか１項記載の核酸を含むＤＮＡ構築物。
  13. ウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物であって、
    該ウイルスベクター産生系は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸配列のセットを含み、
    該ベクターのゲノムが請求項１～１１のいずれか１項記載の核酸を含み、
    トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）をコードする核酸を含む、ＤＮＡ構築物。
  14. ウイルスベクター産生系における使用のためのＤＮＡ構築物のセットであって、請求項１２記載のＤＮＡ構築物、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質をコードするＤＮＡ構築物ならびにＥｎｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を含み、
    該ウイルスベクター産生系は、ウイルスベクターの産生に必要な成分をコードする核酸のセットを含み、
    該ベクターのゲノムが請求項１２に記載のＤＮＡ構築物を含む、ＤＮＡ構築物のセット。
  15. 請求項１３記載のＤＮＡ構築物を更に含む、請求項１４記載のＤＮＡ構築物のセット。
  16. ｒｅｖ配列またはその機能的代替物をコードするＤＮＡ構築物を更に含む、請求項１４または１５記載のＤＮＡ構築物のセット。
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