KR102354365B1 - 바이러스 벡터 생산 시스템 - Google Patents

바이러스 벡터 생산 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR102354365B1
KR102354365B1 KR1020167019013A KR20167019013A KR102354365B1 KR 102354365 B1 KR102354365 B1 KR 102354365B1 KR 1020167019013 A KR1020167019013 A KR 1020167019013A KR 20167019013 A KR20167019013 A KR 20167019013A KR 102354365 B1 KR102354365 B1 KR 102354365B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
viral vector
vector
rna
trap
protein
Prior art date
Application number
KR1020167019013A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160122125A (ko
Inventor
다니엘 팔리
키리아코스 미트로파노스
Original Assignee
옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드 filed Critical 옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
Publication of KR20160122125A publication Critical patent/KR20160122125A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102354365B1 publication Critical patent/KR102354365B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10351—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2740/15052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
    • C12N2840/102—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation inhibiting translation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/55—Vectors comprising a special translation-regulating system from bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

본 발명은 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열에 관한 것으로, 상기 결합 부위는 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있다.

Description

바이러스 벡터 생산 시스템{VIRAL VECTOR PRODUCTION SYSTEM}
본 발명은 바이러스 벡터들의 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 바이러스 벡터 생산 세포에서, 바이러스 벡터에 의해 인코딩되는 관심의 뉴클레오티드의 번역의 변형에 관한 것이다.
유전자 치료는 대체적으로 질병을 치료하기 위한 유전자 물질의 사용을 포함한다. 유전자 치료는 그 유전자들의 기능적 복제본으로 결함이 있는 유전자들(예를 들어, 돌연변이들을 갖는 유전자들)을 갖는 세포 보완, 적절하지 않게 작용하는 유전자들의 불활성화, 및 새로운 치료 유전자들의 도입을 포함한다.
핵산의 전달을 가능하게 하기 위해 벡터들을 사용하여 치료 유전자 물질이 호스트의 표적 세포 내로 혼입될 수 있다. 이러한 벡터들은 일반적으로 바이러스 및 비-바이러스 카테고리로 분류될 수 있다.
바이러스들은 이들의 복제 사이클의 일부로서 호스트의 표적 세포내로 이들의 유전자 물질을 자연스럽게 도입한다. 조작된 바이러스 벡터들은 표적 세포에 관심의 뉴클레오티드(nucleotide of interest; NOI)를 전달할 수 있도록 하기 위해 이러한 능력을 활용한다. 현재까지, 많은 바이러스들이 유전자 치료를 위한 벡터로서 조작되었다. 이들은 레트로바이러스, 아데노바이러스(AdV), 아데노-관련 바이러스(AAV), 단순 포진 바이러스(HSV) 및 우두 바이러스(vaccinia virus)를 포함한다.
관심의 뉴클레오티드를 전달하기 위한 변형 이외에, 바이러스 벡터들은 복제에 결함이 있도록 전형적으로 더 조작된다. 이와 같이, 재조합 벡터들은 표적 세포를 직접 감염시킬 수 있지만, 감염성 비리온들의 추가 세대들을 생성할 수는 없다. 다른 유형의 바이러스 벡터들은 암 세포 내에서만 조건부로 복제 가능할 수 있고, 독성 형질전환유전자(transgene) 또는 프로효소(pro-enzyme)를 추가적으로 인코딩할 수 있다.
레트로바이러스 벡터들은 다양한 유전적 질환들에 대한 치료법으로서 개발되었고, 현재 임상 시험들에서 가능성 증가를 보여주고 있다(예를 들어, Galy, A. and A. J. Thrasher (2010) Curr Opin Allergy Clin Immunol ll(6): 545-550; Porter, D. L, B. L. Levine, M. Kalos, A. Bagg and C. H. June (2011) N Engl J Med 365(8): 725-733; Campochiaro, P. A. (2012) Gene Ther 19(2): 121-126; Cartier, N., S. Hacein-Bey-Abina, C. C. Bartholomae, P. Bougneres, M. Schmidt, C. V. Kalle, A. Fischer, M. Cavazzana-Calvo and P. Aubourg (2012) Methods Enzymol 507: 187-198; Sadelain, M., I. Riviere, X. Wang, F. Boulad, S. Prockop, P. Giardina, A. Maggio, R. Galanello, F. Locatelli and E. Yannaki (2010) Ann N Y Acad Sci 1202: 52-58; DiGiusto, D. L, A. Krishnan, L. Li, H. Li, S. Li, A. Rao, S. Mi, P. Yam, S. Stinson, M. Kalos, J. Alvarnas, S. F. Lacey, J. K. Yee, M. Li, L. Couture, D. Hsu, S. J. Forman, J. J. Rossi and J. A. Zaia (2010) Sci Transl Med 2(36): 36ra43 and Segura MM, M. M., Gaillet B, Gamier A. (2013) Expert opinion in biological therapy).
이러한 벡터들의 중요한 예들은 (MMLV를 기반으로 하는) 감마-레트로바이러스 벡터 시스템, (HIV-1을 기반으로 하는) 영장류 렌티바이러스 벡터 시스템 및 (EIAV를 기반으로 하는) 비-영장류 렌티바이러스 벡터 시스템을 포함한다.
역유전학은 큰 이종 서열들(약 10kb)을 인코딩하는 벡터들이 적절한 DNA 서열들을 갖는 포유동물 세포들의 형질감염에 의해 생산될 수 있도록 이들 바이러스 기반 벡터가 심하게 조작되는 것을 허용했다(Bannert, K. (2010) Caister Academic Press: 347-370에서 검토됨).
전형적으로, 연구 단계에서의 레트로바이러스 벡터들의 조작 및 사용은 예를 들어, GFP 또는 lacZ를 인코딩하는 리포터 유전자 벡터들의 생산을 포함한다. 이러한 임상적으로 무관한 벡터들의 역가는 보통 1X106 내지 1X107 TU/mL(형질도입 유닛/가공하지 않은 집균 물질의 mL) 정도이다. 이러한 물질의 추가 농도 및 정제는 1X1010 TU/mL를 초과하는 원료를 작업하여 달성할 수 있다. 그러나, 치료 관련 NOI들을 인코딩하는 벡터들의 생산은 자주 이들 리포터 벡터와 비교하여 실질적으로 감소된 역가를 야기한다.
잠재적으로 이러한 효과에 책임이 있는 몇 가지 인자들이 있다:
1. 치료 게놈의 크기. 매우 큰 게놈들은 레트로바이러스들에 의해 패키징될 수 있지만, 역전사 및/또는 통합 단계는 크기가 증가함에 따라 덜 효율적이 될 것이라 생각된다.
2. 벡터 게놈 RNA의 안정성. 이것은 NOI에서 예상치 못한 불안정 요소들의 존재에 의해 감소할 수 있다.
3. 벡터 게놈 RNA 내에서의 차선의 뉴클레오티드 사용. 야생형 바이러스 게놈들은 자주 특정 뉴클레오티드 편향을 갖는다(예를 들어, HIV-1은 AT가 풍부하다). 벡터 게놈들은 AT가 덜 풍부해지는 경향이 있고, 이는 패키징 및/또는 후-성숙 단계에 영향을 미칠 수 있다.
4. 바이러스 벡터 생산 세포들에서 NOI의 발현. (과-)발현된 단백질은 벡터 비리온 어셈블리 및/또는 감염성에 간접 또는 직접적인 영향을 미칠 수 있다.
우리는 바이러스 벡터 생산 세포들 내에서 NOI에 의해 인코딩된 단백질의 발현이 치료 벡터 역가들에 부정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 실험적으로 보여주었다(도 3i 및 도 3ii 참조).
NOI에 의해 인코딩된 단백질(관심의 단백질, POI)의 벡터 비리온으로의 혼입은 벡터 입자들의 다운스트림 처리에 또한 영향을 미칠 수 있다; 예를 들어, 경막 POI를 인코딩하는 NOI는 잠재적으로 비리온들의 물리적 특성을 바꾸는 바이러스 벡터 비리온에서의 경막 단백질의 높은 표면 발현으로 이어질 수 있다. 또한, 이러한 혼입은 전달 부위에서 환자의 면역 시스템에 POI를 제공할 수 있고, 이는 체내에서 진행되는 치료 유전자의 형질도입 및/또는 장기 발현에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 또한, NOI는 생산, 정제, 회수 및 면역원성에 영향을 미칠 수 있는 원하지 않는 이차 단백질 또는 대사산물들의 생산을 초래할 수 있고, 따라서 이를 최소화하는 것이 바람직하다.
표적 세포들에서는 NOI의 효과적인 발현을 유지하면서 바이러스 벡터 생산 세포들에서는 NOI의 발현을 억제하는 능력이 명백히 필요하다. 어떠한 메커니즘이 사용되더라도, 바이러스 벡터 입자들의 어셈블리의 '천연' 경로 및 결과로 초래된(resulting) 기능은 방해하지 않아야 한다. 비리온들로 패키징될 바이러스 벡터 게놈 분자는 NOI 발현 카세트를 반드시 인코딩해야 하기 때문에 이는 간단하지 않다. 다시 말해서, 벡터 게놈 분자 및 NOI 발현 카세트들은 작동 가능하도록 연결되기 때문에, NOI 발현 카세트의 변형은 세포에서 벡터 게놈 분자를 생산하는 능력에 불리한 결과들을 가져올 수 있다. 예를 들어, 물리적 전사 블록(예를 들어, TetR 억제 시스템)이 NOI 발현 카세트를 억제하기 위해 사용되는 경우, 벡터 게놈 분자의 생산도 입체 장애(steric hindrance)를 통해 또한 억제될 가능성이 크다. 또한, 제어 메커니즘 변형들 역시 비리온 성숙 및 방출 후 벡터 게놈 분자의 기능에(즉, 표적 세포의 형질도입(transduction)을 유도하는 단계와 관련하여) 부정적인 영향을 미치지 않아야 한다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터 게놈 RNA 분자는 역 전사 및 통합 프로세스들이 가능해야 한다 - NOI 발현 카세트에 대한 모든 변형은 형질도입 프로세스에서 이들 단계를 방해하지 않아야 한다.
바이러스 벡터 생산 세포들 내에서 NOI 발현의 억제는 추가적인 장점들을 제공할 수 있다. NOI 발현이 벡터 생산 세포들의 생존력의 감소로 이어지면, 그 억제는 많은 세포 수를 필요로 하는 큰 규모의 제조에 유익할 수 있다. 세포 사멸에 따른 세포 찌꺼기의 감소는 가공하지 않은 벡터 집균 물질 내의 불순물들을 또한 감소시킬 것이다. 벡터 플랫폼(즉, 동일한 벡터 시스템 내에 인코딩된 상이한 치료 유전자들) 의 처리, 정제 및 농도는 표준화될 수 있다; 바이러스 벡터 생산 세포들 내에서 발현된 유일한 이종 유전자들이 벡터 생산에 필요한 것들이면, 다운스트림 처리는 치료 벡터들의 전체 플랫폼에 대해 더 쉽게 최적화될 수 있고, 이는 벡터 제제들의 매우 유사한 물리적 사양들을 야기한다. 생체 내에서(in vivo) 수득되는 벡터들에 대한 면역 반응의 가변성 및 수득되는 벡터들의 독성은 최소화될 수 있고, 이는 표적 세포들에서 더 지속적인 치료 NOI 발현으로 이어질 수 있다.
생산 세포들에서 NOI의 발현을 제한하는 조직-특이적 프로모터(promoter)는 이러한 문제에 대한 가능한 해결책이나, 이들 프로모터의 유출(leakiness)이 형질전환유전자(transgene) 단백질의 이상(adverse) 수준으로 이어질 수 있다. 그러나, 표적 세포들에서의 NOI의 더 크고 더 강력한 발현은 구성적 프로모터들을 사용하여 달성될 수 있다. 실제로, 이러한 강력한 발현은 생체 내 효능에 필요할 수 있다. 또한, 전-임상 및 임상 개발 동안 동물 모델을 통한 치료적 벡터 생성물에 이어서 인간에게 적용하는 경우 조직-특이적 프로모터들은 덜 예측가능할 수 있다.
전술한 바와 같이, 바이러스 벡터 생산 세포에서 바이러스 벡터 발현 카세트에 의해 인코딩된 관심의 단백질(POI)의 발현은 바이러스 벡터 치료제들의 생성에 대해 많은 문제점을 제공할 수 있다. 특히, 이러한 발현은 바이러스 벡터의 역가 감소, 및 NOI에 의해 인코딩된 단백질의 바이러스 벡터 입자로의 바람직하지 못한 혼입 또는 연합(association)으로 이어질 수 있다.
우리는, NOI의 번역을 억제함으로써 NOI에 의해 인코딩된 단백질의 발현을 억제 또는 방지하는 이종(heterologous) 번역 제어 시스템을 진핵 세포 배양에서 사용함으로써 이러한 문제를 극복할 수 있음을 보여주었다. 우리는 이러한 시스템의 사용이 패키징할 수 있는 벡터 게놈 분자들의 생산 및 벡터 비리온들의 활성을 방해하지 않고, 표적 세포에서 NOI의 장기 발현을 방해하지 않는다는 놀라운 사실을 알아냈다.
일 양태에서, 본 발명은 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열로서, 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 상기 결합 부위가 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산 서열을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP), 예를 들어 박테리아 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 바이러스 벡터의 생산에 필요한 성분들을 인코딩하는 한 세트의 핵산 서열들을 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 상기 벡터 게놈 서열은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터 생산 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 구조체(construct)에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 RNA-결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 DNA 구조체들의 일부 또는 전체 및 Gag/Pol 단백질 및 Env 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체들, 또는 이들의 기능적 대체물들을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 한 세트(set)의 DNA 구조체에 관한 것이다. Rev를 발현시키는 DNA 구조체는 바이러스 벡터 생산 시스템에서도 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 DNA 구조체들의 일부 또는 전체를 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 DNA 구조체들의 일부 또는 전체를 바이러스 벡터 생산 세포에 도입하는 단계 및 바이러스 벡터들의 생산에 적합한 조건 하에서 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터들을 생산하기 위한 프로세스에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 프로세스에 의해 또는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하여 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해 생산된 바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 의약에 사용하기 위한 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포의 의약에의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 관심의 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하는 약제의 제조를 위한 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 또는 세포들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 핵산 결합 부위에 작동 가능하도록 연결될 때 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 부위 및/또는 핵산 결합 단백질들을 식별하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 리포터 유전자에 작동 가능하도록 연결된 상기 핵산 결합 부위와 상기 핵산 결합 단백질 양자 모두를 포함하는 세포에서 상기 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함한다.
발명의 요약
치료적 레트로바이러스 벡터들을 고 역가 또는 중간 역가로 생산함에 있어서 중요한 한계는 특히 형질전환유전자가 강력한 구성적 프로모터에 의해 구동되는 경우 생산 세포들에서 형질전환유전자/NOI에 의해 인코딩된 단백질의 이상(adverse) 발현일 수 있다. 특정 형질전환유전자 단백질들은 활동적인 감염성 벡터 입자들을 생산하는 세포의 능력에 직접 및 간접적으로 여러가지 영향을 미칠 수 있다. 세포 대사, 바이러스 벡터 입자 어셈블리 및/또는 입자 활성은 형질전환유전자 생성물의 특정(알려지거나 알려지지 않은) 작용에 의해 영향을 받을 수 있다. 생산 세포들에서의 형질전환유전자 발현을 침묵시키는 조직-특이적 프로모터들이 이러한 문제에 대한 해결책으로 사용되었지만, 이러한 접근방법에 의한 심각한 단점은 자주 조직-특이적 프로모터들로부터의 유전자 발현이 구조적 프로모터들로부터의 유전자 발현만큼 강력하지 않고, 벡터 개발 시 사용되는 상이한 동물 모델들에서 덜 예측 가능하거나 더 많은 변수가 존재할 수 있다는 것이다.
우리는 RNA-결합 단백질(예를 들어, 박테리아 trp 오페론 조절 단백질, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)), 및 RNA-결합 단백질이 결합하는 RNA 표적들의 새로운 용도가 RNA 또는 DNA 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 형질전환유전자 번역을 억제하거나 방지할 것이라는 놀라운 사실을 발견하였다. TRAP의 경우, 이러한 형질전환유전자 번역의 감소 또는 방지는 특정 NOI들을 인코딩하는 벡터들에 대한 벡터 역가를 100배 정도 개선할 수 있다. 이러한 시스템은 벡터 생산 세포 시스템에서의 형질전환유전자 억제 시스템(Transgene Repression In vector Production cell system) 또는 TRIP 시스템이라 칭한다.
우리는 NOI mRNA의 번역을 억제함으로써 진핵 세포 생산 시스템들에서 RNA (레트로바이러스) 벡터 역가를 증가시키기 위해 박테리아 번역 억제 시스템의 사용을 처음으로 입증한다. NOI 번역 개시 코돈의 업스트림에의 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP 결합 서열, tbs)에 대한 결합 부위의 배치는 벡터 RNA의 생산 또는 안정성에 어떠한 해로운 영향도 미치지 않으면서 내부 발현 카세트로부터 유래된 mRNA의 번역의 특이적 억제를 허용한다. 또한, 우리는 레트로바이러스 벡터들의 생산 및 기능이 벡터 게놈에서 tbs의 존재에 의해 최소한의 영향을 받는 것으로 나타났다는 것을 보여주었다. 이것은 역전사효소(RT)가 tbs로부터 TRAP를 대체할 수 있거나, TRAP가 비리온 내에 패키징된 긴 벡터 게놈 RNA의 맥락에서 tbs에 효율적으로 결합되지 않는다는 것을 의미한다. 또한, 우리는 AAV와 같은, DNA 바이러스 벡터들의 NOI 발현 카세트 내에 배치된 tbs의 유사한 구성이 활성 바이러스 벡터 비리온들의 생산을 유지하면서 TRAP에 의한 NOI 번역 억제를 허용한다는 것을 보여주었다.
NOI의 번역 개시 코돈과 tbs 사이의 뉴클레오티드의 개수는 바람직하게 mRNA 번역의 억제 정도에 영향을 미치지 않고 0개 내지 12개의 뉴클레오티드까지 달라질 수 있다. 어떠한 이론에도 얽매이지 않으면서, tbs-결합 TRAP는 개시 코돈에 도달될 수 있기 전에 리보솜 복합체를 스캐닝하는 40S를 물리적으로 차단함으로써 번역 개시를 억제할 수 있고, 그 결과 더 안정적이고 더 높은 친화성 번역 기계가 달리 형성된다.
또한, 우리는 멀티시스트론 mRNA에서 NOI의 번역을 억제하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)의 다운스트림에 tbs가 배치될 수 있음을 발견하였다. 정말로, 이것은 tbs 결합 TRAP가 40S 리보솜의 통로를 차단할 수도 있다는 추가 증거를 제공한다; IRES 요소들은 전체 번역 복합체가 형성되기 이전에 CAP 독립 방식으로 mRNA에 40S 리보솜 서브유닛을 격리시키기 위해 작용한다(IRES 번역 개시에 대한 검토를 위해 Thompson, S. (2012) Trends in Microbiology 20(11): 558-566 참조). NOI의 개시 코돈과 IRES 사이에 배치된 tbs 서열은 비-억제 번역 수준에 약간 영향을 미쳤지만, TRAP에 의해 기능적으로 작용할 수 있는 능력을 유지했다. 이러한 발견은 TRIP 시스템이 바이러스 벡터 게놈들로부터 발현된 하나의 mRNA로부터 복수의 개방 판독 프레임을 억제하는 것이 가능하다는 것을 입증한다. 이것은 복수의 치료 유전자를 인코딩하는 벡터들을 생산하는 경우, 특히 모든 형질전환유전자 생성물들이 어느 정도까지 벡터 역가에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 경우에 TRIP 시스템의 유용한 특징이 될 것이다.
tbs 서열의 또 다른 특성은, 일 실시형태에서는 강력한 형질전환유전자 억제를 또한 획득하기 위해 7번 반복이 사용될 수 있고, 다른 실시형태에서는 벡터 역가들을 구출할 수 있는 수준까지 형질전환유전자의 충분한 억제를 허용하기 위해 6번 반복이 사용될 수 있지만, RNA-결합 단백질로서의 TRAP의 경우, 바람직하게 TRIP 시스템은 적어도 8번의 RAGNN 반복을 포함하는 tbs 서열과 함께 가장 효과적으로 작동한다는 것을 보여주었다. RAGNN 공통 서열은 TRAP 매개 억제를 유지하기 위해 달라질 수 있지만, 바람직하게 선택된 정확한 서열은 비-억제 상태에서 높은 수준의 번역을 보장하기 위해 최적화될 수 있다. 예를 들어, tbs 서열은 TRAP의 부재 하에서(즉, 표적 세포들에서) mRNA의 번역 효율을 방해할 수 있는 스플라이싱 부위, 불안정한 서열 또는 줄기 루프들를 제거함으로써 최적화될 수 있다. 주어진 tbs의 RAGNN 반복들의 구성을 고려하면, RAG 반복들 사이의 N 개의 "간격" 뉴클레오티드의 개수는 바람직하게 2개이다. 그러나, 적어도 두 번의 RAG 반복 사이에 두 개 이상의 N 스페이서를 포함하는 tbs가 용인될 수 있다(3개의 N을 포함하는 반복들의 50% 정도는 체내 결합 연구들에 의해 판단되는 바와 같이 기능적 tbs를 야기할 수 있다; Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 정말로, 우리는 11x RAGNN tbs 서열이 최대 3번까지 RAGNNN 반복으로의 교체가 용인될 수 있고, TRAP 결합과 협력하여 일부 잠재적으로 유용한 번역 차단 활성을 여전히 유지할 수 있다는 것을 보여주었다.
박테리아 유전자 서열은 포유동물 세포들에서의 발현에 대해 비-최적화될 가능성이 있기 때문에, RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 개방 판독 프레임은 포유동물(예를 들어, 호모 사피엔스) 세포들에서의 발현에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 서열은 잠재적인 불안정한 서열 및 스플라이싱 부위들을 제거함으로써 또한 최적화될 수 있다. TRAP 단백질에서 C-말단 발현된 HIS-태그의 사용은 번역 억제 측면에서 혜택을 제공하는 것으로 보이고, 선택적으로 사용될 수 있다. 개선된 기능적 혜택을 배제할 수 없지만, 이러한 C 말단 HIS-태그는 진핵 세포들 내에서의 TRAP의 안정성 또는 가용성을 개선할 수 있다. 그럼에도 불구하고, HIS-태그 및 태그되지 않은 TRAP 모두는 형질전환유전자 발현의 강력한 억제를 허용했다. RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 전사 유닛 내의 특정 cis-작용 서열들이 또한 최적화될 수 있다; 예를 들어, EF1a 프로모터 구동 구조체들은 일시적 형질감염의 맥락에서 CMV 프로모터 구동 구조체들과 비교하여 RAP 플라스미드의 낮은 투입로 더 잘 억제할 수 있다.
TRIP 시스템 내에서의 RNA 결합 부위(예를 들어, TRAP)의 강력한 발현은 형질전환유전자 번역의 억제를 극대화하기 위해 바람직하다. 높은 수준의 RNA-결합 단백질 플라스미드를 포함하는 요건은 일시적 벡터 생산 시스템에서 다른 벡터 생산 구조체들의 형질감염에 부정적인 영향을 미칠 수 있을 것으로 예상되었다. 이것은 게놈 구조체의 양/비율이 전형적으로 추가적인 플라스미드들의 부재 하에서 최적화되기 때문이다; 많은 양의 RNA-결합 단백질 인코딩 플라스미드를 공-형질감염시키는 요건은 이들 최적의 비율들에 부정적인 영향을 미칠 수 있고, 이는 벡터 역가의 감소로 이어질 수 있다. 그러나, 1 대 10 정도의 낮은 TRAP 대 레트로바이러스 벡터 게놈 플라스미드의 비율은, 일시적 형질감염 프로토콜을 사용할 때, 거의 최대 수준의 형질전환유전자를 억제할 수 있는 것으로 나타났다. 또한, 1 대 5 정도의 높은 TRAP 대 레트로바이러스 벡터 게놈 플라스미드의 비율이 사용될 때, 거의 최대의 역가에서 비-문제적 NOI를 발현시키는 벡터가 생산되었다. 따라서, 레트로바이러스 벡터 생산 구조체들의 일시적 형질감염 시 이들의 상대적으로 낮은 투입에서의 TRAP 발현 플라스미드의 추가가 이러한 구조체들의 이전에 최적화된 비율에 부정적인 영향을 미칠 가능성은 없다. AAV와 같은 DNA 바이러스 벡터 성분 플라스미드에 대한 TRAP 발현 플라스미드의 비율들이 또한 최적화되었다.
이러한 중요한 발견들은 일시적 형질감염 벡터 생산 프로토콜 동안 TRIP 시스템이 사용될 수 있음을 입증한다. 또한, TRIP 시스템은 안정적인 생산 시스템들에 사용될 수 있고, 따라서 바이러스 벡터 제조에 광범위하게 적용될 수 있다.
도 1. 전형적인 레트로바이러스 벡터 성분들을 표시하는 개략도. 현재 사용되는 치료 레트로바이러스 벡터 시스템들은 그들이 유래된 야생형 바이러스 게놈들로부터 많이 조작되었다. 감마-레트로바이러스 벡터들은 전형적으로 벡터 게놈, Gag/Pol 및 외피 발현 구조체들을 필요로 하는 3- 또는 4-성분 시스템들을 사용하여 생산되고, HIV 기반 렌티바이러스 벡터들의 경우에는 액세서리 유전자 Rev가 또한 필요하다. 개방 판독 프레임(ORF)이 RRE를 대신하면 EIAV 기반 렌티바이러스 벡터들은 Rev를 필요로 하지 않는다. 벡터 게놈들은 전형적으로 패키징 신호(ψ), NOI, (선택적으로) 전사후 요소(PRE), 3'ppu 및 자기-불활성(SIN) LTR을 필요로 한다. 역 전사 프로세스뿐만 아니라, 벡터 게놈 RNA 및 형질전환유전자 mRNA 모두의 올바른 폴리아데닐화에는 R-U5 영역들이 필요하다. 보통, 게놈 카세트 내에 인코딩된 '외부' 및 '내부' 프로모터(Pro)들 모두는 다른 벡터 시스템 성분들을 구동시키는 프로모터만큼 강한 진핵 또는 바이러스 프로모터들이다.
도 2. 벡터들을 생산하는 생산 세포들의 능력에 대한 NOI 형질전환유전자 생성물의 부정적인 영향의 정도를 결정하기 위한 벡터 게놈 플라스미드 혼합 실험을 설명하는 개략도. 벡터 게놈 혼합 실험에서, 벡터 입자들은 세포의 벡터 생산성에 미치는 형질전환유전자 생성물의 영향을 테스트하기 위해 두 가지 유형의 벡터 게놈 플라스미드 즉, NOI 형질전환유전자를 인코딩하는 벡터 및 하나의 리포터 유전자 벡터 게놈 플라스미드 및 벡터 패키징 성분들에 의한 세포들의 공-형질감염에 의해 생산된다. lacZ 또는 GFP 리포터 단백질의 발현은 벡터 역가에 영향을 미치지 않기 때문에, 이들은 대조 벡터로서 사용된다. 세포의 벡터 생산성에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 NOI 형질전환유전자를 인코딩하는 제 2 벡터 게놈 플라스미드의 도입은 lacZ 벡터 생산에 대해 방관자 효과를 가질 것이다. NOI 형질전환유전자의 발현은, 강력한 구성적 프로모터에 의해 전형적으로 구동되는, 내부 발현 카세트로부터 주로 발생할 것이다. 비리온 당 두 개의 벡터 게놈 RNA 분자들의 복제본을 패키징하는 가능한 결과 및 단지 하나의 벡터 RNA만이 역 전사되고 표적 세포들에 통합된다는 사실로 인해, lacZ 벡터와 제 2 게놈 혼공통 희석 효과가 존재할 것이다; 이러한 희석 효과는 비례적으로 더 많은 제 2 게놈 플라스미드가 lacZ 벡터 게놈 플라스미드와 혼합될 때 더 분명해진다. 따라서, 제 2 벡터 게놈 플라스미드가 GFP의 것인을 특징으로 하는 '희석' 대조가 필요하다; GFP는 벡터 역가에 어떠한 부정적인 영향도 미치지 않는 것으로 또한 알려져 있다. 따라서, 벡터 생산성에 미치는 주어진 NOI 형질전환유전자 생성물의 영향은 LacZ:GFP 벡터 게놈 혼합 대조와 바교하여 측정될 수 있다. 혼합 실험으로부터 생산된 벡터들은 전형적으로 lacZ-벡터에 대한 판독 예를 들어, 벡터 형질도입된 세포들의 X-gal 염색에 의해 적정된다.
도 3ⅰ. 생산 시의 벡터 게놈 혼합은 벡터 역가에 대한 형질전환유전자 단백질 발현의 영향을 입증한다.
A. lacZ 인코딩 벡터 게놈 성분은 일시적 벡터 생산 시 다른 벡터 게놈과 1:1 또는 1:5의 비율로 혼합되었고, 벡터 역가에 대한 영향은 표적 세포들에 대한 X-gal 분석에 의해 분석되었다. GFP 발현은 백터 역가들에 영향을 미치지 않고, 따라서 상이한 비율에서의 역가 감소의 수준은 lacZ 게놈을 희석시키는 기준치 효과를 나타낸다. 따라서, lacZ 역가에 대한 다른 벡터 형질전환유전자들의 영향은 lacZ:GFP 혼합들과 비교하여 측정될 수 있다.
B. 본 실험은 RetinoStat®, StarGen™, UshStat® 및 ReQuinate® 게놈들로부터의 형질전환유전자 단백질의 효과가 7배 내지 100배까지 벡터 역가에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 외부 및 내부 프로모터 요소들은 양쪽 CMV이다.
도 3ⅱ. 생산 시의 혼합하는 COX-2 및/또는 FPR 게놈들 및 lacZ 게놈은 벡터 역가에 대한 형질전환유전자 단백질 발현의 영향을 입증한다. 일시적 형질감염 벡터 생산 시 lacZ 인코딩 벡터 게놈 성분이 GFP 또는 치료 벡터 게놈과 1:1 또는 1:5 비율로 혼합되고, 표적 세포들에 대한 X-gal 분석에 의해 lacZ벡터 역가에 대한 영향이 분석된다. GFP 발현은 벡터 역가에 영향을 미치지 않고, 따라서 lacZ 역가는 lacZ 게놈을 희석시키는 기준치 효과를 나타낸다. 따라서, lacZ 역가에 대한 다른 벡터 형질전환유전자들의 영향은 1:1 및 1:5 비율에서 lacZ/GFP 혼합들과 비교하여 측정될 수 있다. 테스트된 치료 벡터들은 IRES 요소를 숨겨주는 바이시스트론 벡터 또는 단일 형질전환유전자 벡터들이었다; lacZ 역가에 대한 COX-2 및 FPR의 영향은 추가일 수 있다.
도 4. 레트로바이러스 벡터 생산 세포들에서의 형질전환유전자 발현의 억제에서 TRIP 시스템의 일 예. tbs가 벡터 게놈 발현 카세트의 형질전환유전자의 5'UTR에 삽입되는 경우 TRAP 또는 코돈 최적화된 TRAP(coTRAP)를 발현시키는 레트로바이러스 벡터 생산 세포. TRAP는 tbs에 결합하여 형질전환유전자 단백질 번역을 차단한다. 벡터 RNA 분자들은 또한 TRAP를 결합할 수 있지만, 놀랍게도 이것은 벡터 비리온의 1회 라이프 사이클을 방해하지 않는다 즉, 역 전사 및 통합 단계가 벡터 입자에 의해 정상적으로 수행된다.
도 5. GFP 플라스미드 형질감염된 세포 개체군들의 유동 세포 분석에서 MFI 또는 GFP 양성 세포수의 단독 사용의 한계. 이들 개략도는 실질적으로 상이한 GFP 발현 수준들을 갖는 개체군들을 비교하는 실험들의 잠재적인 결과들을 보여준다. A/B 실험에서, 양쪽 GFP 양성 개체군들은 동일한 MFI를 가지며, C/D 실험에서, GFP 양성 개체군들은 유사한 세포수를 포함하지만, 10배의 상이한 MFI를 갖는다. 시나리오 A는 실제로 pEF1a-coTRAP[H6]를 사용할 때 입증되었다; pCMV-tbsGFP 및 pEF1a-coTRAP[H6]로 공-형질감염될 때 매우 높게 발현하는 GFP 양성 HEK293T 세포들의 매우 작은 수(<1%)가 지속적으로 관찰되었고, 이는 EF1a 프로모터가 이러한 작은 아개체군에서는 활성화될 수 없다는 것을 시사한다. 따라서, 개체군에서의 발현의 척도로서 MFI만을 사용할 때 이것은 GFP 억제 분석을 왜곡시킨다. 따라서, 발현 스코어(% GFP 양성 x MFI)가 게이트 개체군 내에서의 GFP 단백질 발현의 글로벌 수준을 더 효과적으로 설명한다.
도 6. TRAP/tbs 구성의 평가를 위한 형광 리포터 유전자 구조체. 간단한 평가를 위해 pCMV-tbsGFP가 pONY8.4RC-GFP로부터 처음으로 만들어졌다. 이후에, 벡터 활성에 대한 TRAP/tbs 구성의 효과를 평가하기 위해 비-SIN EIAV 벡터 게놈 pONY8.4RC-tbsGFP가 만들어졌다. 평가를 위해 처음으로 사용된 tbs 서열 [RAGNN]11은 번역 개시 코돈 앞에 41nt 근위 및 9nt 말단 서열을 측부에 두었다.
도 7. 안정적인 HEK293T -TRAP[H6] 세포주들을 만들기 위한 및 일시적 형질감염 평가 연구들에서 사용되는 TRAP-발현 플라스미드. 초기 실험들은 바실러스 서브틸리스 +/- C 말단 HIS6 -태그의 코돈/서열 최적화된 TRAP의 발현을 구동시키기 위해 pCI-Neo 골격을 이용했다. 이어서, pEF1a-coTRAP[H6]를 얻기 위해 CMV 프로모터를 대신하여 EF1a 프로모터 서열이 사용되었다. 3'UTR이 상이한 CMV 프로모터 구동 구조체들과 대조적으로, 양쪽 EF1a 프로모터 구동 구조체의 3'UTR이 동일하도록 pEF1a-coTRAP[H6]에서 H6 서열의 올리고-어댑터를 교체하는 것에 의해 pEF1a-coTRAP 플라스미드가 만들어졌다. pEF1a-coTRAP-iBsr은 합성에 의해 완전히 다시 유도되었고, 블라스티시딘 내성 마커 및 TRAP[H6]를 인코딩하는 멀티시스트론 mRNA를 발현시킨다; Bsr 번역을 구동하기 위해 EMCV IRES가 사용되었다.
도 8. HEK293T 세포들에서의 형질전환유전자 발현의 TRAP 매개 억제의 첫 번째 일시적 형질감염 평가 연구로부터 사진 선택. pCMV-tbsGFP의 tbs-포함 5'UTR 로부터 명확하게 발현을 억제하는 pCI-coTRAP[H6]의 능력을 보여주는 사진 증거.
도 9. HEK293T 세포들에서의 형질전환유전자 발현의 TRAP 매개 억제의 첫 번째 일시적 형질감염 평가 연구로부터의 유동 세포 분석 데이터의 요약.
A. 별도의 축에 표시된 메디아 형광 강도(ArbU) 및 % 양성 GFP 개체군의 막대그래프. TRAP 및 TRAP[H6]는 모두 pCMV-GFP로부터의 GFP 발현에 어떠한 영향도 미치지 않았다. TRAP[H6]는 투여 의존 방식으로 및 1:1의 비율에서 pCMV-tbsGFP로부터의 GFP 발현을 크게 감소시켰다. TRAP는 pCMV-tbsGFP의 발현을 덜 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
B. TRAP 매개 억제의 크기를 더 잘 평가하기 위해 각각의 공-형질감염된 세포 배양에 대해 발현 스코어들이 유도되었다. MFI를 곱한 % 양성 세포는 배양 당 생산된 GFP의 총량의 근사값을 제공한다. 발현 스코어들에 의해 판단되는 바와 같이 TRAP[H6]에 의한 가장 높은 수준의 GFP 억제는 본 실험에서 ~25배이었다.
C. 1:1 비율에서 pCI-coTRAP 또는 pCI-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염된 리포터 플라스미드들의 대표적인 유동 세포 분석 도트 플롯.
D. 비-TRAP 발현 플라스미드 (스터퍼)와 비교한 EF1a 프로모터 또는 CMV 프로모터 구동 TRAP[H6] 플라스미드 및 GFP 리포터 플라스미드들에 의해 공-형질감염된 HEK293T 세포들의 GFP 메디아 형광 강도. pCI-coTRAP[H6]에 의해서는 불가능했던 GFP:RAP 플라스미드의 1:0.1 몰비에서 pEF1a-coTRAP[H6]를 사용하여 pCMV-tbsGFP로부터의 거의 최대의 GFP 억제가 가능하였다.
도 10. 태그되지 않은 TRAP 및 HIS 6- 태그 TRAP의 기능 비교.
A. 별도의 축에 표시된 메디아 형광 강도(ArbU) 및 % 양성 GFP 개체군의 막대그래프. HIS6 -태그 또는 태그되지 않은 TRAP 발현 또는 스터퍼 플라스미드가 표시된 비율(괄호)들에서 GFP 리포터 플라스미드들 중 어느 하나에 의해 세 차례 공-형질감염되었다. 형질감염된 세포들은 유동 세포 분석법으로 분석되었다.
B. 발현 스코어(MFI x %GFP)는 개체군에서 GFP의 TRAP 매개 억제 효과의 전반적인 평가를 제공한다. HIS6 C-말단 태그는 pCMV-tbsGFP에 의한 GFP 발현을 억제하는 TRAP의 능력을 최소 2배 증가시킨다.
도 11. 형질전환유전자 발현을 억제시키는 상이한 TRAP 동족체들의 능력 및 HEK293T-TRAP 세포주들의 평가.
A. Desulfotomaculum hydrothermale 및 Aminomonas paucivorans로부터의 TRAP ORF들이 코돈/서열 최적화되고, pEF1a-플라스미드 골격에 복제되었다. TRAP 발현 또는 스터퍼 플라스미드는 표시된 비율(괄호)들에서 GFP 리포터 플라스미드들 중 어느 하나에 의해 세 차례 공-형질감염되었다. 형질감염된 세포들은 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. 평균 발현 스코어들이 각각의 형질감염 조건에 대해 생성되었다.
B. 4 개의 HEK293T-TRAP[H6] 세포주들이 일시적 형질감염에 의해 pCMV-tbsGFP로부터의 형질전환유전자 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 세 차례 비교되었다. pCMV-GFP 또는 pCMV-tbsGFP는 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 세포들은 유동 세포 분석법에 의해 분석되었고, 평균 발현 스코어들이 각각의 조건에 대해 생성되었다. pCMV-GFP/스터퍼의 발현 스코어들을 다른 조건들의 발현 스코어들로 나눔으로써 평균 배수 억제가 생성되었다.
도 12. 레트로바이러스 벡터 생산에서 TRAP-tbs 시스템의 평가로부터의 유동 세포 분석 데이터의 요약
A. 별도의 축에 표시된 메디아 형광 강도(ArbU) 및 % 양성 GFP 개체군의 막대그래프. 표시도 비율들에서 단일 GFP 리포터 플라스미드 또는 비-SIN EIAV 벡터 게놈 플라스미드(도 6 참조)들에 의해 TRAP[H6] 발현 플라스미드가 HEK293T 세포들에 공-형질감염되었다. 벡터 생산은 비- SIN EIAV 벡터 게놈 플라스미드들에 의한 Gag/Pol 및 VSVG 발현 플라스미드들의 추가적인 공-형질감염에 의해 달성되었다. 벡터의 생산 시 GFP 억제는 단일 GFP 리포터 맥락과 매우 유사하였고, TRAP 및 tbs 서열 모두의 존재에 의존하였다.
B. 발현 스코어(MFI x %GFP)들은 개체군에서의 GFP의 TRAP 매개 억제 효과의 전반적인 평가를 제공한다.
C. D17 세포들에 대한 벡터 역가. pONY8.4RC-(tbs)GFP 벡터 형질감염으로부터 생성된 벡터 상청액들이 4일 후 수행된 유동 세포 분석 및 D17 세포들을 형질도입하기 위해 사용되었다. TRAP/tbs 구성은 놀랍게도 벡터 입자들의 1회 라이프 사이클이 벡터 RNA 게놈에 대한 추정상의 TRAP/tbs 상호작용에 의해 영향받지 않는다는 것을 나타내는 벡터 역가들에 최소한의 영향을 미쳤다.
도 13. TRAP/tbs 구성에서 tbs와 형질전환유전자 AUG 코돈 사이의 짧은 간격 요건들을 테스트하는 단계로부터의 유동 세포 분석 데이터의 요약.
A. pONY8.4RC-tbsGFP 기반 벡터 게놈 내에서 테스트된 간격 변이체들을 보여주는 개략도. 'Null' 변이체는 전체 길이 벡터 게놈 RNA로부터 유래된 즉, '외부' CMV 프로모터로부터 유래된 모든 GFP 발현을 제어하기 위해 종결 코돈으로 변경된 AUG를 가졌다(도 6 참조). 5' 줄기 루프(SL) 서열은 바실러스 서브틸리스의 trp 오페론 리더 서열로부터 유래되었다. 밑줄친 뉴클레오티드는 코작 서열을 나타낸다. 이들 스페이서 변이체 벡터 리포터 플라스미드들은 세 차례 표시된 몰비(괄호)에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 HEK293T 세포들로 공-형질감염되었다.
B. 각각의 조건에 대한 글로벌 GFP 발현이 평균 발현 스코어들을 생성함으로써 평가되었다. GFP 억제의 효율은 기본적으로 간격 변이체 +11 내지 +1에 대해 동일했다. '0' 변이체는 TRAP[H6]의 부재 하에서 GFP 발현에 대해 약간의 결함이 있는 것으로 나타났다. 예상치 않게, 5'SL 변이체는 TRAP 매개 억제에 전혀 응답하지 않았으며, 이는 5'SL이 본 시스템에서 TRAP-tbs 상호작용을 교란시킨다는 것을 제안한다.
도 14ⅰ. TRAP/tbs 구성이 기능하기 위해 필요한 TRAP 결합 서열에서의 RAGNN 반복의 최소 횟수 정의.
A. 평가를 위해 pCMV-tbsGFP에 복제된 tbs 변이체 서열. 연구에서 평가된 초기 tbs 서열은 TG 스페이서를 AA로 변경하는 제 10 및 제 11 RAGNN 반복 사이에서 서열 최적화되었다. 따라서, 변이체 tbsx11M 및 tbsx10M은 잠재적인 잠재 SD 부위가 제거되도록 설계되었다. RAGNN 반복들은 GFP 리포터의 좋은 번역 맥락을 유지하는 동안, tbsx11M 변이체의 3' 말단부터 연속적으로 (단지 11회 내지 4회 반복) 삭제되었다. 반복 변이체 tbs-GFP 리포터 플라스미드들은 10:1의 비율의 GFP:TRAP 플라스미드에서 세 차례 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 HEK293T 세포들로 공-형질감염되었다. 세포들은 유동 세포 분석법으로 분석되었다.
B. 별도의 축 상에 나타낸 메디아 형광 강도(ArbU) 및 % 양성 GFP 개체군의 히스토그램.
C. 각각의 조건에 대한 평균 발현 스코어들을 계산하였고, 형질감염된 개체군들 내에서의 글로벌 GFP 발현의 기준으로 사용하였다.
D. 스터퍼 플라스미드에 의해 형질감염된 각각의 tbs 변이체에 대한 발현 스코어들을 pEF1a-coTRAP[H6] 형질감염의 발현 스코어로 나눔으로써 배수 억제 인자들이 생성되었다. 최대 억제는 8번의 RAGNN 반복으로 가능하고, 7번의 RAGNN 반복 tbs는 거의 최대 억제를 허용했다. 6번의 RAGNN 반복 tbs는 형질전환유전자 억제의 중간 수준을 허용한 반면에, 5번 및 4번의 RAGNN 반복 tbs서열들은 최소한으로 기능적이었다.
도 14ⅱ. 11회 RAGNN 반복 tbs의 배경에 하나 이상의 RAGNNN 반복을 갖는 tbs 서열들의 기능성 평가.
A. 본 실험에서 N2x11로 언급된 tbsx11M tbs 서열은 점진적으로 더 많은 RAGNNN 반복들로 tbs의 중심으로부터 RAGNN 반복을 교체하는 변형에 대한 기초로서 사용되었다. 따라서, 변형들은 점진적으로 1회, 3회, 5회, 7회 또는 10회 RAGNNN 반복을 포함했다(3'말단 ct 뉴클레오티드는 스페이서로서 카우트되지 않기 때문에, N3x11은 10개의 NNN 간격 뉴클레이티드를 포함한다). 이들 tbs 변이체는 기존 tbs를 대신하는, 치료 벡터 게놈 플라스미드 pONYK-tbsCOX2(도 18i 참조)로 복제되었다.
B. 벡터 게놈:TRAP 플라스미드의 5:1 비율에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해, 및 EIAV 벡터 패키징 성분들에 의한 공-형질감염에 의해 벡터를 만들기 위해 이들 tbs 변이체 포함 벡터 게놈 플라스미드들이 사용되었다. 생산 종료 세포들로부터의 세포 용해물들에 대해 COX-2에 대한 면역 블로팅이 수행되었다.
도 14ⅲ. 11회 RAGNN 반복 tbs의 배경에 하나 이상의 RAGNNN 반복을 갖는 tbs 서열들의 기능성 평가: 형질감염 8시간 후 벡터 생산 세포들에서의 COX2 단백질 수준. 이전에, 생산 종료 세포들에서의 COX2 수준이 (형질감염 48시간 후에) 분석되었다(도 14ⅱB 참조). TRAP-tbs 매개 억제가 벡터 생산 시 서로 다른 지를 테스트하기 위해, 생산 세포들이 면역 블롯에 의해 COX2 수준에 대한 형질감염 8시간 후에 분석되었다. N3N2 tbs 변이체들을 인코딩하는 상이한 구조체들로부터 COX2의 발현 패턴은 형질감염 48시간 후에 관찰된 것과 형질감염 8시간 후의 것이 동일하였다. 이것은 주어진 tbs 서열에 대한 TRAP의 억제 정도가 벡터 생산 시 눈에 띠게 바뀌지 않는다는 것을 나타낸다.
도 14ⅳ. 11회 RAGNN 반복 tbs의 배경에 하나 이상의 RAGNNN 반복을 갖는 tbs 서열들의 기능성 평가: 벡터 역가. 도 14ⅱ 및 도 14ⅲ과 관련된 실험들에서 EIAV-tbsCOX2 생산 세포들로부터 생성된 가공하지 않은 벡터 상청액들은 벡터 활성에 미치는 생산 시 COX2 발현의 영향을 결정하기 위해 DNA 통합 분석에 의해 적정되었다. 데이터는 EIAV-COX2 벡터 역가를 실질적으로 향상시키기 위해서 단지 생산 시 COX2의 적당한 억제(도 14ⅱ 및 도 14ⅲ의 N3N2x11[3] 참조)가 필요하다는 것을 나타낸다.
도 14ⅴ. x7 RAGNN 반복 및 x8 RAGNN 반복 tbs의 배경에 하나 이상의 RAGNNN 반복을 갖는 tbs 서열들의 기능성 평가.
A. 이전 데이터는 최대 또는 거의 최대 수준의 형질전환유전자 억제가 8번 또는 7번의 RAGNN 반복을 포함하는 tbs를 사용하여 발생할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 더 짧은 tbs 서열들의 기능에 대한 영향을 평가하기 위해 단일 RAGNNN 반복이 8xRAGNN 및 7xRAGNN tbs에 삽입되었다. 이들은 x11, x7, x6 및 x5 반복을 포함하는 RAGNN 포함 tbs와 함께 비교되었다. 이들 tbs 변이체는 기존 tbs를 대신하는 치료 벡터 게놈 플라스미드 pONYK-tbsCOX2(도 18i 참조)로 복제되었다.
B. 벡터 게놈:TRAP 플라스미드의 5:1 비율에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 및 EIAV 벡터 패키징 성분들에 의한 공-형질감염에 의해 벡터를 만들기 위해 이들 tbs 변이체 포함 벡터 게놈 플라스미드들이 사용되었다. 벡터 생산 시 초기 시간(즉, 형질감염 후 약 8시간)에서 세포 용해물들에 대해 COX-2에 대한 면역블로팅이 수행되었다. 데이터는 RAGNNN 반복이 7xRAGNN을 포함하는 x8 반복 tbs 내에서 "허용"될 수 있다는 것을 보여준다.
도 15. 유전자 발현의 IRES 의존 TRAP/tbs 조절을 테스트하기 위한 IRES-tbs GFP 리포터 플라스미드들의 구성.
A. 말단 시스트론(GFP)으로부터의 발현이 TRAP에 의한 억제 정도를 보고하도록, IRES-tbs GFP 리포터 구조체들이 만들어졌다. pCMV-Vi-tbsx11G에서 tbs와 IRES 요소 간의 거리는 (간격 뉴클레오티드들을 인코딩하는) 44nt이었고, 이 거리는 pCMV-Vi-tbsx4G에서 4nt까지 감소되었다. pCMV-ViGFP는 'tbs가 없는' 대조로서 복제되었다.
B. GFP-reporter:TRAP 플라스미드의 10:1 비율에서 세 차례 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 IRES-tbs GFP 리포터 플라스미드들이 HEK293T 세포들에 공-형질감염되었다. 단일 ORF GFP 리포터 플라스미드들이 TRAP 매개 억제에 대한 대조로서 함께 포함되었다. 세포들은 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. 각각의 조건에 대한 평균 발현 스코어들이 계산되었고, 형질감염된 개체군들 내 글로벌 GFP 발현의 기준으로 사용되었다. TRAP는 5'CAP 매개 발현과 유사한 크기에서 IRES로부터 유도된 GFP 발현을 억제할 수 있었다.
도 16. TRIP 시스템을 사용한 WPRE를 포함하는 EIAV SIN 벡터의 생산. 벡터 게놈 플라스미드 pONY8.9RC-tbsGFP(+WPRE)는 TRAP/tbs 구성에 대한 WPRE의 영향에 대해 테스트되었다. 세포들은 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. pEF1a-coTRAP[H6] 또는 스터퍼 플라스미드와 함께 벡터 게놈 pONY8.4RC-tbsGFP 또는 pONY8.9RC-tbsGFP(+WPRE)에 의해 공-형질감염된 세포 개체군들에 대해 발현 스코어들이 생성되었다. 스코어들은 전체 개체군에서의 GFP 발현의 기준을 제공하기 위해 % GFP와 메디아 형광 강도의 곱으로부터 유도되었다.
도 17ⅰ. tbs를 포함하도록 변형된 ReQuinate ® 를 기반으로 하여 치료 벡터 게놈들의 개략도. 혈우병 A의 치료를 위한 벡터 ReQuinate®는 인간 제 8인자(Factor Ⅷ) 유전자를 인코딩한다. 제 8인자는 벡터 활성을 극적으로 감소시키는 벡터 비리온 입자로의 VSV-G 혼입을 방해하는 것으로 알려져 있다. tbs 또는 스크램블링된 tbs가 각각 ReQuinate-tbs 및 ReQuinate-con 벡터를 생성하기 위해 벡터 게놈으로 복제되었다.
도 17ⅱ. TRIP 시스템을 사용한 향상된 ReQuinate ® 역가. HEK293T 세포들에서 TRIP 시스템을 사용하여 표준 벡터 프로토콜 하에서 ReQuinate® 기반 벡터들이 생산되었다: 벡터 게놈 플라스미드들은 EIAV 벡터 패키징 성분들과 함께, 5:1의 비율에서 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 벡터 상청액은 하베스트되었고, 원심분리에 의해 ~70배 농축되었을 뿐만 아니라 통합 분석에 의해 적정되었고, 뒤이어 PERT 분석 및 VSV-G 및 p26(EIAV 캡시드)에 대한 면역 블롯을 수행하였다.
A. ReQuinate®-tbs 벡터 역가들은 DNA 통합 분석에 의해 판단된 바와 같이 ReQuinate®보다 30배 강화되었고, 이것은 벡터 생산 시 TRAP의 존재에 의존하였다. 벡터들의 감염 비율에 대한 입자 또한 향상되었다(데이터는 도시되지 않음).
B. 농축된 벡터 샘플 내 VSV-G의 면역 블롯. 벡터 역가들은 벡터 비리온들 내로의 VSV-G 혼입 정도와 상관 관계가 있다; 인간 제 8인자는 레트로바이러스 벡터 비리온들로 혼입된 VSV-G의 양을 극적으로 억제하는 것으로 알려져 있다.
C. 벡터 코어(p26 - 캡시드)들의 면역 블롯은 웰 당 동일한 수의 벡터 비리온이 로딩되었음을 입증한다.
도 18ⅰ. COX2 또는 FPR을 인코딩하는 벡터 게놈들의 개략도. tbsx11M 변이체가 단일 유전자 발현 벡터들에 복제되었다. ReQuinate® 연구에서 사용된 대조 스크램블링된 tbs 포함 5'UTR과 대조하여, 5'UTR 서열 +/- tbsx11M은 전혀 다르다는 것을 유의해야 한다.
도 18ⅱ. TRIP 시스템을 사용한 향상된 단일 유전자 COX2 벡터 역가. HEK293T 세포들에서 TRIP 시스템을 사용하여 단일 유전자 COX-2 기반 벡터들이 생산되었다: 벡터 게놈 플라스미드들은 EIAV 벡터 패키징 성분들과 함께, 5:1의 비율에서 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 벡터 상청액은 하베스트되었고, 가공하지 않은 하베스트 상청액들의 동일한 부피를 사용하여 통합 분석에 의해 적정되었고, 생산 종 세포 용해물들은 면역 블롯에서 항-COX-2 항체들에 의해 프로브되었다. 통합 분석 종료 세포들(즉, COX-2 벡터 제제들로 형질도입된 것들)도 면역 블롯에 의해 COX-2 발현에 대해 분석되었다.
A. COX2 벡터 역가들은 DNA 통합 분석에 의해 판단된 바와 같이 100배 강화되었고, 이것은 벡터 생산 시 TRAP 및 tbs의 존재에 의존하였다.
B. 생산 종료 세포들 내 COX-2의 면역 블롯은 벡터 역가가 COX-2 수준들과 반비례 관계가 있음을 나타낸다.
C. 하베스트 상청액의 부피 당 활성 벡터 입자들의 증가는 표적 세포들에서의 COX-2의 형질도입 및 발현을 야기했다.
도 18ⅲ. TRIP 시스템을 사용한 향상된 단일 유전자 FPR 벡터 역가. HEK293T 세포들에서 TRIP 시스템을 사용하여 단일 유전자 FPR 기반 벡터들이 생산되었다: 벡터 게놈 플라스미드들은 EIAV 벡터 패키징 성분들과 함께, 5:1의 비율에서 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 벡터 상청액은 하베스트되었고, 가공하지 않은 하베스트 상청액들의 동일한 부피를 사용하여 통합 분석되었다. FPR 벡터 역가들은 DNA 통합 분석에 의해 판단되는 바와 같이 24배 강화되었고, 이것은 벡터 생산 시 TRAP 및 tbs의 존재에 의존하였다.
도 19i. COX-2 또는 FPR ORF 모두를 인코딩하는 벡터 게놈들의 개략도. 표시된 바와 같이 tbsx11M 변이체가 멀티시스트론 벡터 게놈 플라스미드들로 복제되었다. COX-2 및 FPR은 상류 또는 하류 위치에 배치되었고, tbsx11M 서열은 양쪽 위치에 삽입되거나 어느 위치에도 삽입되지 않았다.
도 19ⅱ. TRIP 시스템을 사용한 향상된 멀티시스트론 COX2 / FPR 벡터 역가. 도 19i의 멀티시스트론 벡터들은 HEK293T 세포들에서 TRIP 시스템을 사용하여 생산되었다: 벡터 게놈 플라스미드들은 EIAV 벡터 패키징 성분들과 함께, 5:1의 비율에서 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 벡터 상청액들이 하베스트되었고, 가공하지 않은 하베스트 상청액들의 동일한 부피를 사용하여 통합 분석법에 의해 적정되었고, 생산 종료 세포 용해물들은 면역 블롯에 대한 항-COX-2 항체들에 의해 프로브되었다. COX-2/FPR 멀티시스트론 벡터 역가들은 ~100배 강화되었고, FPR/COX-2 멀티시스트론 벡터 역가들은 DNA 통합 분석법에 의해 판단된 바와 같이 ~50배 강화되었고, 이것은 벡터 생산 시 TRAP 및 tbs 존재에 의존하였다. 생산 종료 세포들 내에서의 COX-2의 면역 블롯은 벡터 역가가 COX-2 수준들과 반비례 관계에 있고, TRAP/tbs 구성이 동일한 mRNA 전사체에서 복수의 부위에서 형질전환유전자를 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 20ⅰ. TRIP 시스템에서 사용하기 위해 변형된 OXB -102 벡터 게놈들의 개 략도. 표시된 바와 같이 tbsx11M 변이체가 멀티시스트론 벡터 게놈 플라스미드들로 복제되었다. 단지 상류 TH-CH1 융합 유전자만이 tbsx11M 서열을 포함하도록 변형되었다.
도 20ⅱ. TRIP 시스템에서 벡터 생산 시 '비- 문제적 ' 형질전환유전자들의 억제. 도 20i에서의 벡터는 HEK293T 세포들에서 TRIP 시스템을 사용하여 생산되었다: 벡터 게놈 플라스미드들은 EIAV 벡터 패키징 성분들과 함께 5:1의 비율에서 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 공-형질감염되었다. 벡터 상청액이 하베스트되었고, 항-TH 항체를 사용하는 면역형광 분석법에 의해 적정되었고(A), 생산 종료 세포 용해물들은 면역 블롯에 대해 항-TH 및 항-CH1 항체에 의해 프로브되었다(B). TRAP/tbs 시스템에 의한 생산 세포들에서의 형질전환유전자들의 억제는 명백했지만, 표적 세포들에서의 형질전환유전자 발현에 영향을 미치지 않았으며, 이는 어떠한 검출가능한 TRAP 관련 활성도 표적 세포들로 전달되지 않았고, 형질전환유전자 카세트의 5'UTR 내에서 인코딩된 tbs는 TRIP 생산 세포들의 것 이외의 세포들에서 융합 형질전환유전자의 강력한 발현을 허용했다.
도 21ⅰ. HEK293T 세포들에서의 TRAP 억제 기능성에 대해 테스트된 상이한 박테리아 종들로부터의 트립토판 RNA-결합 동족체들의 목록. 연구에서 테스트된 TRAP 동족체들의 이름, 혈통 및 NCBI 참조 번호. (도 11A에 대한 추가 정보).
도 21ⅱ. ×11회- 및 ×12회- RAGNN 반복을 함유하는 tbs- GFP 리포터 카세트들에서의 억제 기능에 대한 상이한 TRAP 동족체 및 S72N 변이체의 테스트. 6개의 His-태그 TRAP 동족체가 pEF1a 발현 플라스미드에 복제되었고, 1: 5(pTRAP:pReporter)의 비율에서. pCMV-tbsxl 1-GFP 또는 pCMV-tbsx12-GFP 리포터 플라스미드에 의해 HEK293T 세포들로 공-형질감염되었다. 'TRAP이 없는' 대조의 경우, TRAP 변이체들과 비교하기 위gks GFP 발현의 "on" 수준들을 생성하기 위해 사용되었다. 세포들은 형질감염 2일 후 유동 세포 측정법에 의해 분석되었고, GFP 발현 스코어들이 [A]에서 생성되었다(MFI x %GFP). [B]는 각각의 tbs-GFP 리포터에 대한 "No TRAP"에 대한 배수 억제로서 이들 데이터를 표시한다. (도 11A에 대한 추가 정보).
도 21ⅲ. 새로운 억제 시스템에서의 상이한 TRAP 동족체들의 기능성 요약. HEK293T 세포들에서 x11- RAGNN 반복 또는 x12-RAGNN 반복 tbs-GFP 리포터 카세트들을 사용한 상이한 동족체 및 S72N 변이체의 배수 억제의 요약. 동족체들은 B. Subtilis TRAP(100%, 정렬들이 His-태그 포함)과 비교하여 다양한 아미노 서열 변화(56% 내지78%)를 나타낸다. (도 11A에 관한 추가 정보).
도 22i. 안정적인 세포주들을 분리하기 위해 사용된 TRAP 발현 카세트. IRES-Bsr 서열이 TRAP[H6]와 폴리아데닐화 신호 사이에 삽입되도록 pEF1a-coTRAP[H6]가 변형되었다. 플라스미드 선형화 시 DNA 서열로부터 박테리아 서열들이 제거되었고, B. Subtilis TRAP를 인코딩하는 이러한 카세트는 낮은 통로 HEK293T 세포들에 안정적으로 형질감염되었다(도 11B에 관한 추가 정보).
도 22ⅱ. GFP 리포터 플라스미드들의 형질감염 에 의한 HEK293T .TRIP 세포 클론들의 스크리닝.
A. 두 개의 서브클론 세포들의 플레이트가 pCMV-GFP 또는 pCMV-tbsxl 1GFP에 의해 세 차례 형질감염되었고, 2일 후 세포들에 대해 FACS을 수행하였다. 각각의 서브클론에 대해 pCMV-GFP(즉, tbs 없음)에 대한 발현 스코어들을 pCMV-tbsx11GFP에 대한 발현 스코어들로 나누어 발현 스코어(MFI x %GFP)들을 계산하였다("배수 억제" 표시 막대, 오른쪽 축). (도 11B에 대한 추가 정보).
B. 클론 세포 용해물들에서 TRAP의 면역 블롯. 항- HIS6 항체에 의해 검출된 단분자 TRAP인 TRAP[H6]를 발현시키는 11개의 서브클론에 대한 결과들을 표시. HEK293T 세포들이 pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 일시적으로 형질감염되었고, 면역 블롯에 대한 양성 대조로서 용해물이 사용되었다. (도 11B에 대한 추가 정보).
도 22ⅲ. TRAP를 안정적으로 발현시키는 생산 세포들을 사용한 향상된 EIAV 벡터 역가 ; 생산 시 EIAV -[tbs] GFP 및 EIAV -[tbs] huF Ⅷ 벡터 게놈들의 50:50 혼합을 사용한 사례 연구.
A. 혼합된 벡터 게놈들에 의해 형질감염된 벡터 생산 세포들에 대한 GFP 발현 스코어. 50:50 비율에서 벡터 게놈 플라스미드 EIAV-[tbs]GFP 및 EIAV-[tbs]huFⅧ와 함께 EIAV벡터 패키징 성분 pGagPol, pVSVG에 의해 세포들이 형질감염되었다. 따라서, 생산 세포들에서 huFⅧ의 발현은 혼합된 벡터 입자들의 역가에 부정적인 영향을 미칠 것이다(EIAV-[tbs]huFⅧ는 ReQuinate-tbs와 동일하다, 도 17i 참조). 게놈들은 표준이거나 또는 형질전환유전자의 업스트림에 tbs을 포함하였다. 표시되는 경우 pEF1a-coTRAP[H6] (+TRAP TXN) 또는 pBluescript (-)가 또한 추가되었다. 생산 세포들은 HEK293T 세포들 또는 안정적인 TRAP 세포주 2F, 10H, 7E 및 3D였다. GFP 발현 스코어들은 생산 종료 세포들에 대해 계산되었다(MFI x %GFP).
B. HEK293T 세포들에서 혼합된 EIAV-[tbs]GFP/huFⅧ 가공하지 않은 벡터 하베스트의 벡터 적정. [A]에서 벡터 생산 세포들로부터 가공하지 않은 벡터 상청액들이 HEK293T 세포들에서 적정되었고 역가가 FACS에 의해 측정되었다. huFactorⅧ의 발현은 EIAV 벡터 비리온 활성에 대한 영향으로 알려져 있다(도 17ii 참조); 따라서, 형질전환유전자 발현이 ([A]에서 GFP에 의해 측정된) 생산 세포들에서 억제되는 경우에만, 벡터 역가들이 ([B]에서 GFP에 의해 측정된) 향상될 수 있다.
도 22iv . 안정적인 또는 일시적 TRIP 시스템에서 생산된 혼합된 EIAV -[tbs]GFP|EIAV-[tbs]huFⅧ 벡터 입자들로의 향상된 VSVG 혼입. EIAV-[tbs]GFP | EIAV-[tbs]huFVIII 벡터 게놈 혼합 실험에서 생산 세포들로부터의 벡터 상청액들이 원심분리에 의해 농축되었고, 항-VSVG 항체를 사용하는 면역 블롯에 의해 분석되었다. 농축된 제조물의 동등한 부피가 웰 당 로딩되었다.
도 22v. HEK293T .TRIP 안정적인 세포주를 사용한 치료 형질전환유전자 인코딩 렌티바이러스 벡터의 향상된 생산. HEK293T 세포들에서 일시적으로 형질감염된 TRAP 및 표준(TRAP 없음)과 함께, 세포 Factory™ 규모에서 (B. subtilis TRAP[H6])를 안정적으로 발현시키는) HEK293T.TRIP[3D] 세포주가 EIAV-tbsCOX2를 생산하기 위해 사용되었다. 벡터들은 DNA 통합 분석법에 의해 적정되었고, TU/mL이 (100%로 설정된) EIAV-GFP 벡터 역가들과 비교되었다. EIAV-COX2의 경우, HEK293T.TRIP[3D] 세포들의 사용은 HEK293T 세포들에서 일시적으로 형질감염된 TRAP와 비교하여 벡터 역가의 추가 복구를 가능하게 한다.
도 23i. 다양한 길이의 tbs 서열에서 RAGNN 반복의 "R" 및 " NN " 위치에서 뉴클레오티드 선택의 중요성 테스트. 위치 R에서 G의 맥락에서, NN 서열이 GG, AA, TT[UU] 또는 CC인 11x RAGNN 반복의 테스트는 NN 위치에서의 피리딘들에 대한 선호도를 나타냈다. 기능성의 전반적인 순서는 T[U]>C>G>A이었다. 제 1 (R) 위치에서 가장 기능적인 뉴클레오티드를 테스트하기 위해, 각각의 뉴클레오티드 G, A, T[U] 또는 C가 x11, x8 또는 x6 반복을 포함하는 tbs' 내의 xAGAA 반복에 삽입되었다.
도 23ⅱ. RAGTT 반복의 "R" 위치에서의 G|T 선호도 테스트 및 NN 스페이서 내에서 T와 쌍을 이루는 뉴클레오티드 테스트. 크게 억제하는 tbs (HxGAGTT)의 맥락 내에서, TAGTT 반복은 이러한 x11 tbs 서열로 점진적으로 교환되었다. (GAGTT 반복을 대신하는) TAGTT 반복의 증가는 tbs의 억제 기능을 적당히 감소시켰다. 적어도 하나의 N=T인 GAGNN 반복의 테스트는 첫 번째 N(RAGNN의 위치 4)이 바람직하게 T[U] 또는 피리미딘인 경우 최대 억제가 달성된다는 것을 보여주었다. 이것은 RAGNN의 중요한 특징들이 R 위치에서 G>T이고 첫 번째 N 스페이서(위치 4)에서 피리미딘임을 보여주었다. (이러한 RAGNN 서열의 텐덤 반복은 형질전환유전자의 발현을 약화시킬 가능성이 있는 형질전환유전자 ORF의 업스트림에 복수의 ATG 코돈을 야기시기 때문에, GAGAT는 테스트되지 않았다).
도 24i. TRAP에 의한 억제 활성을 테스트하기 위한 GFP형질전환유전자의 5'UTR 내에서의 tbs의 위치 및 복제 횟수 변화. CAP 부위에 대해 상이한 위치들 즉, Ont[1], 34nt[2], 54nt[3], 74nt[4], 또는 114nt[5]에서 tbsx11M 서열이 pCMV-GFP로 복제되었다; 구조체[2] (유효성, 표준 tbsx11M 리포터)를 포함하는 34nt 리더 상에 추가된 추가적 서열들은 CMVp 5'UTR로부터 유래되었다. tbs 및 AUG 사이의 서열은 구조체[6]에서 43nt까지 또한 증가되었다. 마지막으로, tbs의 두 개의 복제본은 그들 사이의 34nt 스페이서[7]와 함께 5'UTR에 배치되었다.
도 24ⅱ. TRAP에 의한 억제 활성의 효과에 대한 GFP 형질전환유전자의 5'UTR 내에서의 tbs의 가변적인 포지셔닝 테스트. 도 24i에서의 7개의 tbs 변이체 GFP 리포터 구조체들은 3가지 조건 즉, TRAP(HEK293T) 없이, 일시적으로 공-형질감염된 TRAP (HEK293T + TRAP) 및 최대의 TRAP 억제 조건(HEK293T.TRIP[Endogenous TRAP] + co-transfected TRAP)하에서 TRAP에 의해 억제되는 이들의 능력을 테스트하였다. 형질감염 2일 후 GFP 발현을 측정하기 위해 유동 세포 분석법으로 배양물을 분석하였고, GFP 발현 스코어(MFI x %GFP)들을 생성하였다.
도 25i. HIV 기반 GFP 벡터 생산에 대한 TRIP 시스템의 적용. [A] tbs(x11M 변이체)가 GFP를 인코딩하는 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 골격에 삽입되었고, HEK293T 세포 +/- pEF1a-coTRAP[H6]에서 가공하지 않은 벡터 제제들을 만들기 위해 사용되었다. [B] GFP 발현 스코어(MFI x % GFP; "발현 스코어"-표시 막대)를 생성하기 위해 생산 종료 세포들을 FACS로 분석하였다. 가공하지 않은 벡터 상청액들을 HEK293T 세포들에 대한 DNA 통합 분석으로 적정하였다("역가" 표시 막대). GFP 발현은 TRAP의 존재 하에서 HIV-tbsGFP 벡터를 배출하는 생산 세포들에서 >100배 벡터에 의해 억제되었지만, (GFP 단백질이 벡터 생산에 해롭지 않기 때문에) 벡터 역가들은 영향받지 않았다. CMV - CMV 프로모터, Ψ - 패키징 신호, RRE - rev 반응 요소, wPRE - 우드척(woodchuck) HBV 전사 후 요소, ppu - 폴리푸린 관, SIN - 자기 불활성 U3/LTR.
도 25ⅱ. HIV 기반 치료 벡터 생산에 대한 TRIP 시스템의 적용. [A] tbs(x11M 변이체)가 5T4-CAR 를 인코딩하는 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 골격에 삽입되었고, HEK293T 세포 +/- pEF1a-coTRAP[H6]에서 가공하지 않은 벡터 제제들을 만들기 위해 사용되었다. [B] 가공하지 않은 벡터 상청액들은 HEK293T 세포에 대한 DA 통합 분석(HIV-5T4.CAR; 우측 2개 막대) 또는 FACS(HIV-GFP; 좌측 2개 막대)에 의해 적정되었다. TRIP 시스템은 TRAP 동시 발현이 없는 생산과 비교하여 HIV-5T4.CAR 벡터 역가들의 10배 향상을 가능하게 했다. CMV - CMV 프로모터; Ψ - 패키징 신호; RRE - rev 억제 요소, wPRE - 우드척 HBV 전사 후 요소, ppu = 폴리푸린 관, SIN - 자기 불활성 U3/LTR.
도 26. 표준 또는 TRAP-tbs 구성 성분들에 의해 형질감염된 HEK293T 세포들 내에서의 형질전환유전자 mRNA 수준 분석. HEK293T 세포들이 pCMV-GFP 또는 pCMV-tbsGFP +/- pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 형질감염되었고, 48 시간 후에 세포들을 GFP 단백질([A]; FACS) 및 세포질에서의 GFP mRNA 수준([B] GFP 특이적 프라이머/FAM 프로브 세트를 사용하여 추출되어 DNAse 처리된 세포질 RNA의 qRT-PCR)에 대해 분석하였다. 이들 데이터는 GFP 단백질의 >100배 억제가 TRAP-tbs 구성을 사용할 때 세포들에서 발생하는 동안, GFP mRNA 수준들은 눈에 띠게 영향받지 않는다는 것을 입증한다. [B] Ct는 신호가 처음 검출된 PCR 사이클을 반영하고, Ct가 낮을수록 표적이 더 풍부하다. 따라서, 존재비는 매 사이클에 대해 ~1.5배까지 증가하고, 40은 검출할 수 없는 신호이다. -RT 조건은 최소한의 플라스미드 DNA 오염을 의미한다.
도 27i. 구조적 또는 조직-특이적 프로모터에 의해 구동된 TRAP-tbs 조절, 바이시스트론 형질전환유전자 카세트를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터들. 개똥벌레 발광효소(제 1 위치) 및 GFP(제 2 위치)를 인코딩하는 바이시스트론 형질전환유전자 카세트가 구조적 CMV 프로모터에 의해 전사되고, TRAP-tbs에 의해 번역 수준에서 차등 조절되는 4개의 구조체가 생성되었다. tbs 서열들은 양쪽 형질전환유전자 ORF의 상류 또는 단지 제 1 또는 제 2 형질전환유전자에만 삽입되거나, 전혀 삽입되지 않았다. 또한, 조직-특이적 프로모터 즉, 간 특이적인 mAlbAT 프로모터 또는 광수용체 세포들에 대해 제한되는 VMD2 프로모터들이 사용되는 두 개의 구조체가 만들어졌다. 전체 길이 벡터 RNA 전사체로부터 어떠한 낮은 수준의 발현도 측정될 수 없도록, 내부 프로모터가 존재하지 않는 대조 구조체가 만들어졌다.
도 27ⅱ. HEK293T 생산 세포들에서 구조적 또는 조직-특이적 프로모터들에 의해 구동된 TRAP-tbs 조절, 바이시스트론 형질전환유전자 카세트를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터들로부터의 형질전환유전자 발현의 평가. HEK293T 세포들이 HIV-1 바이시스트론 벡터 게놈(도 27i), pGagPol, pRev 및 pVSVG 에 의해, 및 pEF1a-coTRAP[H6] (+TRAP) 또는 pBluescript(대조)에 의해 공-형질감염되었다; 게놈 대 TRAP 플라스미드 비는 5 대 1이었다. pGL3-대조(레닐라 발광효소 발현 플라스미드)는 전체 DNA 질량의 1:40 비율에서 모든 형질감염 혼합에 존재하였다. 두 개의 96-웰 플레이트에서 세 차례 형질감염이 수행되었다. 하나의 96-웰 플레이트는 GFP 발현 스코어(MFI x %GFP)를 생성하기 위해 형질감염 2일 후 유동 세포 분석법에 의한 생산 종료 세포 분석을 위해 사용되었다. 제 2 플레이트는 이중 발광효소 분석(프로메가)을 위해 형질감염 2일 후 세포 용해물들을 생성하기 위해 사용되었다.
도 27ⅲ. 멀티시스트론 형질전환유전자를 인코딩하는 레트로바이러스( 렌티바이러스 ) 벡터들의 생산에 적용될 때 TRIP 시스템의 발현 능력을 요약하는 개략도. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 두 개의 개방 판독 프레임(ORF)로부터의 형질전환유전자 발현을 억제하기 위해 TRIP 시스템을 이용하는 렌티바이러스 벡터 생산 세포의 일 예. 벡터 게놈 발현 카세트는 벡터 게놈 RNA의 풍부한 양들을 생성하기 위해 강한 프로모터[Ext Pro]에 의해 구동된다. 내부 프로모터[Int Pro]는 형질전환유전자 인코딩/발현 mRNA의 풍부한 수준으로 이어지는 강한/구조적 프로모터이거나, 최소의 형질전환유전자 인코딩/발현 mRNA 수준으로 이어지는/형질전환유전자 인코딩/발현 mRNA가 없는 수준으로 이어지는 누출되거나 누출될 수 없는 조직-특이적 프로모터일 수 있다. TRAP 결합 서열[tbs]은 하나 또는 양쪽 ORF 위치의 상류에 삽입될 수 있다; 따라서, 생산 세포 내에서 TRAP의 발현은 풍부하거나 낮은 수준의 형질전환유전자 mRNA로부터의 단백질 생산을 억제할 것이다. 또한, 벡터 게놈 RNA는 Cap에 무관한 방식(IRES으로부터; 전형적으로 높은 수준까지 중간에서) 또는 Cap에 의존하는 방식(전형적으로 낮은 수준)으로 형질전환유전자 단백질을 발현시킬 수 있다. 따라서, 내부 프로모터가 활성이든 활성이 아니든, 형질전환유전자 발현은 벡터 생산 시 가능할 수 있고, 따라서 TRIP 시스템은 조직-특이적 프로모터들을 사용하는 것과 비교하여 이러한 발현을 더 잘 억제할 수 있다. Ext Pro - 외부 프로모터; Ψ - 패키징 신호; RRE - rev 반응 요소; cppt/CTS - 중앙 폴리푸린 관/중앙 종결 서열; Int Pro - 내부 프로모터; tbs - TRAP 결합 서열; ORF - 개방 판독 프레임; IRES - 내부 리보솜 진입 부위; WPRE - 우드척 간염(Hepatitis) 전사 후 조절 요소; ppu - 폴리푸린 관; Δ - 부분적으로 삭제된 U3. (벡터 패키징 및 TRAP 발현 카세트들은 개략도에 표시되지 않지만, 본 실시예의 TRIP 시스템 벡터 생산 세포 내에 존재하는 것으로 가정한다는 것을 유의해야 한다).
도 28ⅰ. TRIPAAV 시스템의 개발. AAV 기반 벡터들의 생산에 대한 TRAP-tbs 구성의 적용. 표준 AAV 벡터 시스템은 아데노바이러스 E1 발현 세포(예를 들어, HEK293-기반 세포)들에서의 벡터 생산을 위해 세 가지 DNA 성분 즉, (자기 보완[sc] AAV 벡터 게놈을 생성하기 위해 선택적으로 하나의 trs[-trs]에서 삭제된) 게놈, RepCap 및 헬퍼 함수들(이러한 비-제한 예에서, 헬퍼 함수들은 아데노바이러스 E2A, E4orf6 및 VA에 의해 제공된다)을 이용한다. TRIPAAV 시스템은 TRAP-tbs 구성을 이용한다: AAV 벡터 게놈은 tbs가 형질전환유전자 카세트의 5'UTR에 삽입되도록 변형되고, 벡터 생산 시, TRAP 발현 카세트는 TRAP 발현 플라스미드의 공-형질감염에 의해 및/또는 TRAP를 안정적으로 발현시키는 세포주의 사용에 의해 동시 형질도입된다; TRAP는 선택적으로 His6 -태그일 수 있다. ITR - 역 말단 반복; Pro - 진핵 프로모터 요소; tbs - TRAP 결합 서열; pA - 폴리아데닐화 신호; [ITN] - 선택적 인트론. 개략도는 크기가 조정되지 않음.
도 28ⅱ. TRIPAAV 시스템을 사용하는 HEK293T 세포들에서의 scAAV 벡터 형질전환유전자 발현의 억제. 혈청형 2 scAAV-GFP 벡터 게놈(+/- tbs)들을 인코딩하는 플라스미드들이 TRAP-tbs 매개 형질전환유전자 억제에 대한 이들의 영향을 측정하기 위해 다양한 성분들과 함께 HEK293T 세포들로 공-형질감염되었다. pEF1a-coTRAP[H6]의 투입이 언급한 바와 같이 달라지는 것을 제외하고, pscAAV-[tbs]GFP | pRepCap2 | pHelper | pEF1a-coTRAP[H6] 또는 pBlueScript(-)의 질량비는 10㎝ TC 플레이트 당 2 | 2 | 2 | 2 ㎍이었다. 억제 수준을 비교하기 위해 동일 조건들로 (측부 AAV2 ITR이 부족한) pCMV-tbsGFP 대조 플라스미드가 행해졌다. 아마, 더 안정적인 mRNA 전사로 인해, pscAAV2-[tbs]GFP 플라스미드들로부터의 GFP 발현은 pCMV-tbsGFP보다 컸다(3'UTR 서열 및 polyA 신호는 구조체들 사이에서 상이했다). TRAP는 pRepCap2 및 pHelper의 존재 하에서 즉 scAAV 벡터 생산 시 300배 이상까지 pscAAV2-tbsGFP로부터의 GFP 발현을 억제할 수 있었다. pscAAV2-tbsGFP에 대한 pEF1a-coTRAP[H6]의 동일 질량비는 사용된 형질감염 조건 하에서 최대 억제를 허용했다; 10배로 투입되는 pEF1a-coTRAP[H6] 질량의 감소가 1 Log의 크기에서 측정가능한 GFP 억제에 대해 또한 허용되었다. pscAAV-GFP에 대해 어떠한 억제도 관찰되지 않았다.
도 28ⅲ. 표준 및 TRIPAAV 시스템을 사용하는 scAAV -[tbs] GFP 벡터 생산의 비교. scAAV-(CMV)-GFP 또는 scAAV-(CMV)-tbsGFP 벡터가 HEK293T 세포들에서 동일한 질량의 게놈 pRepCap2, pHelper 및 pEF1a-coTRAP[H6] 또는 pBluescript의 일시적 공-형질감염에 의해 생산되었다. 대략적으로 형질감염 53시간 후에, 세포들이 하베스트되었고, AAV 비리온들을 방출하기 위해 동결 건조 사이클을 실시하였다. Virabind™ kit를 사용하여 AAV 비리온들을 정제하여 각각의 10㎝ 플레이트로부터 100㎕의 PBS를 포함하는 벡터를 얻었다. 벡터 제제들은 HEK293T 세포("HEK293T"-표시 막대) 또는 HEPG2 세포 ("HEPG2"-표시 막대)들에서 유동 세포 분석법으로 적정하였다. 각각의 벡터 생산 세포들에 대한 GFP 발현 스코어들이 함께 나타내어진다(("GFP 발현 스코어"-표시 막대). 데이터는 AAV 벡터 생산 세포들에서의 GFP 발현이 >300배까지 억제되는 동안, TRIPAAV 시스템의 TRAP-tbs 구성은 AAV 벡터 생산의 기본 생물학에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주고, 이는 문제적/세포 독성의 형질전환유전자들이 AAV 벡터 생산 시 중단될 수 있음을 의미한다.
도 28ⅳ. 바르나아제를 사용한 문제적 /세포 독성의 형질전환유전자들을 인코딩하는 AAV 벡터들의 생산 모델링 .
A. 벡터 게놈 scAAV2-CMV-tbs 바르나제(Barnase)는 ORF가 인간 세포들에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 박테리아 RNAse 바르나아제를 인코딩한다. 형질전환유전자 카세트의 5'UTR에 tbs가 삽입되었다. 추가적으로, 대장균에서 CMV 프로모터의 누출 발현으로 인해, 박테리아에서의 플라스미드 전개를 돕기 위해 바르스타(바르나아제의 천연 억제제)에 대한 박테리아 발현 카세트가 플라스미드 골격에 존재한다. 바르스타 ORF는 대장균에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
B. GFP 발현에서 바르나아제에 미치는 효과를 모니터링하기 위한 게놈 혼합 형질감염에서 pscAAV-CMV-GFP 플라스미드가 사용되었다.
도 28ⅴ. pscAAV-CMV-tbs바르나제 및 pscAAV-CMV-GFP 벡터 게놈 플라스미드의 50:50 혼합, 플러스 pRepCap2 및 pHelper에 의한 HEK293T 또는 HEK293T.TRiP[3D] 세포들의 형질감염에 의해 게놈 혼합이 수행되었다. 게놈 플라스미드들은 각각 1㎍/10㎝ 플레이트에 존재하거나[i], 단지 pscAAV-CMV-GFP가 추가적인 TRAP 발현 플라스미드 없이, 2㎍/10㎝ 플레이트에 존재하였다. 형질감염 24시간 후에 이들 배양물에서의 GFP 발현 사진을 촬영하였다.
도 29ⅰ. TRIP아데노 시스템의 개발. 아데노바이러스 기반 벡터들의 생산에 대한 TRAP-tbs 구성의 적용. 표준 아데노바이러스 벡터들은 (E1/E3 영역에서 삭제된) 제 1 생성, (E1/E2/E3/E4에서 삭제된) 제 2 생성, 및 헬퍼-의존성의 "제거된" 벡터들로 분류된다. 또한, E1-활성 온콜리틱 벡터들은 E3 영역 내에 인코딩된 독성의 형질전환유전자들을 포함할 수 있다; 예를 들어, 독성 유전자의 발현은 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 또는 이종 프로모터, 및 아데노바이러스 인코딩된 또는 이종 폴리아데닐화 신호에 의해 좌우될 수 있다. 이러한 유형의 벡터 게놈들의 TRIP아데노 시스템 버전들은 형질전환유전자 인코딩 전사체의 5'UTR 내에 tbs를 숨긴다. 벡터 생산 시, TRAP 발현 카세트는 TRAP 발현 플라스미드의 공-형질감염에 의해 및/또는 TRAP를 안정적으로 발현시키는 세포주의 사용에 의해 동시 형질도입된다; TRAP는 선택적으로 His6 -태그일 수 있다. ITR - 역 말단 반복; Ψ - 패키징 신호; Pro - 진핵 프로모터 요소; tbs - TRAP 결합 서열; pA - 폴리아데닐화 신호; [ITN] - 선택적 인트론. 개략도는 크기가 조정되지 않음.
도 29ⅱ. TRAP-tbs 구성을 사용한 HEK293T 세포들에서 1 세대 아데노바이러스 벡터 게놈 성분들로부터의 GFP 형질전환유전자의 억제. pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP) 또는 pBluescript(-)와 함께 (아데노바이러스 벡터 게놈의 좌측을 포함하는) pAd-CMV-GFP 또는pAd-CMV-tbsGFP 셔틀 플라스미드에 의해 HEK293T 세포들이 형질감염되었고[A], 48시간 후에 유동 세포 측정법을 수행하였다[B]. 또한, 병렬 형질감염들은 (벡터 게놈의 재조합이 HEK293T 세포들에서 발생하는) RAPAd®kit를 사용하여 1 세대 아데노바이러스 벡터 생산을 자극하는 RAPAd®-골격(아데노바이러스 벡터 게놈의 우측을 포함, pacAd5 9.2-100)을 포함했다. GFP 발현 스코어(MFI x % GFP)들은 각각의 조건 하에서 생성되었다. tbs가 셔틀 플라스미드 내에 존재하고, TRAP가 발현되는 경우에만 100배 이상의 GFP의 발현이 관찰되었다. ITR - 역 말단 반복; CMV - CMV 프로모터; Ψ - 패키징 신호; tbs - TRAP 결합 서열; pA - 폴리아데닐화 신호. 개략도는 크기가 조정되지 않음.
도 29ⅲ. HEK293T .TRIP 세포들에서 (E1/ E3삭제된 ) 아데노 - tbsGFP 벡터 증폭 시의 GFP 형질전환유전자의 억제. pRAPAd 골격 및 pEF1a-coTRAP[H6](도 29ⅱ 참조)에 의한 pAd-CMV-GFP 또는 pAd-CMV-tbsGFP 셔틀의 공-형질감염에 의해 생성된 아데노- CMV-GFP 및 아데노- CMV-tbsGFP 벡터의 균체들이 0.01의 MOI에서 (TRAP[H6]를 안정적으로 발현시키는) HEK293T 세포 또는 HEK293T.TRIP[3D] 세포들을 형질도입하는 데 사용되었다. [A] 복제 배양들이 벡터 증폭 시 GFP 발현을 평가하기 위해 형질도입 후 상이한 시점들에서 유동 세포 분석법에 의해 분석되었다. GFP 발현 스코어(MFI x % GFP)들이 각각의 조건에 대해 생성되었다. [B] 벡터 입자들을 방출하기 위해 코스 종료 복제 배양이 동결 해동되었다; 세포 단편이 원심분리에 의해 제거되었고, 가공하지 않은 상청액들이 HeLa 세포들에서 적정되었다.
이제, 비-제한적인 실시예들을 통해 본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 실시형태들을 설명할 것이다.
본 발명의 실시는, 별도의 표시가 없으면, 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 종래 기술들을 사용할 것이다. 이러한 기술들은 문헌에서 설명된다. 예를 들어, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press를 참조한다. 이러한 일반적인 교재들 각각은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
일 양태에서, 본 발명은 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 제공하고, 상기 결합 부위는 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
용어 "RNA-결합 단백질"은 핵산 서열에 결합할 수 있는 단백질로서 이해되어야 한다. 본 발명의 맥락에서, 이의 결합 부위 서열에 대한 RNA-결합 단백질의 결합은 결합 부위가 바이러스 벡터 생산 세포에서 작동 가능하도록 연결되는 관심의 뉴클레오티드의 번역을 억제하거나 방지하는 효과가 있다.
바람직한 실시형태에서, RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP), 예를 들어 박테리아 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질이다.
다른 실시형태에서, RNA-결합 단백질은 박테리아 보존 탄소 저장 조절 시스템 단백질 A(CsrA)이다.
다른 실시형태에서, RNA-결합 단백질은 단순 포진 바이러스-1 RNA-결합 단백질 US11이다.
트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)
트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)은 바실러스 서브틸리스에서 광범위하게 특징지어지는 박테리아 단백질이다. TRAP는 전사 감쇠 또는 번역 제어 메커니즘에 참여하여 trpEDCFBA 오페론으로부터 지시된 트립토판 생합성을 조절한다(Gollnick, B., Antson, and Yanofsky (2005) Annual Review of Genetics 39: 47-68에서 검토됨).
그의 자연스러운 맥락에서, TRAP는 세 가지의 별개의 메커니즘에 의해 트립토판 생합성 및 운반을 조절한다:
1. trpEDCFBA 오페론의 전사 감쇠 (Shimotsu H, K. M., Yanofsky C, Henner DJ. (1986) Journal of Bacteriology 166: 461-171).
2. trpE 및 trpD 샤인-달가르노 차단 헤어핀의 형성 촉진 (Yakhnin H, B. J., Yakhnin AV, Babitzke P. (2001) Journal of Bacteriology 183(20): 5918-5926).
3. trpG 및 yhaG 리보솜 결합 부위들에 대한 리보솜 액세스 차단 (Yang M, d. S. A., van Loon A PGM, Gollnick P. (1995) Journal of Bacteriology 177: 4272-4278).
바실러스 서브틸리스에서, TRAP는 단일 유전자(mtrB)에 의해 인코딩되고, 기능성 단백질은 환상면체 링으로 배열된 11개의 동일한 서브유닛들로 구성되어 있다(Antson AA, D. E., Dodson G, Greaves RB, Chen X, Gollnick P. (1999) Nature 401 (6750): 235-242). 그것은 이웃하는 서브유닛들 사이의 포켓들에서 최대 11개의 트립토판 분자들을 결합시킴으로써 RNA와 상호작용하기 위해 활성화된다. 표적 RNA는 이러한 사차 링 구조의 외측에 감겨있다(Babitzke P, S. J., Shire SJ, Yanofsky C. (1994) Journal of Biological Chemistry 269: 16597-16604).
이론에 구애받지 않고, 트립토판 합성을 감지 및 제어하는 천연 메커니즘에서, TRAP는 새롭게 합성된 RNA 리더에서 결합 부위에 결합함으로써 전사 종결의 수준에서 작용하는 것으로 이해된다. 이것은 다운스트림 rho-독립 종결자가 활성화되도록 중복 항-종결자 서열을 불안정하게 만들고, 이는 단지 짧은 RNA의 생산으로 이어진다. 트립토판이 박테리아 내에서 제한되는 경우, TRAP 링은 더 이상 이의 RNA 결합 부위에 결합할 수 없다. 따라서, 항-종결자가 활성화되고, 트립토판 합성 유전자 오페론으로 전사가 계속된다. 또한, TRAP는 번역 수준에서 작용할 수 있다: RNA 전사체의 5'-UTR에서 이의 결합 부위에 대한 TRAP의 트립토판 의존 결합은 항-샤인 달가르노 서열을 해방시키고, 이것은 번역의 리보솜 개시가 억제되도록 샤인-달가르노 서열과 안정적인 줄기를 형성한다. 결과적으로, 다른 맥락들에서, TRAP가 이의 핵산 결합 부위에 결합될 때, 그것은 개시 코돈에 도달할 수 있기 이전에 40S 스캐닝 리보솜 복합체를 물리적으로 차단함으로써 번역 개시를 억제할 수 있고, 따라서, 더 안정적이고 더 높은 친화성 번역 기계가 달리 형성된다.
본 발명의 일 실시형태에서, TRAP는 바실러스 서브틸리스로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MNQKHSSDFWIKAVEDGVNVIGLTRGTDTKFHHSEKLDKGEVIIAQFTEHTSAIKVRGEALIQTAYGEMKSEKK (서열번호 1)
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 서열번호 1은 6개의 히스티딘 아미노산으로 C-말단 태그된다(HISx6 태그).
대안적인 실시형태에서, TRAP는 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans)로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MKEGEEAKTSVLSDYVWKALENGVTVIGLTRGQETKFAHTEKLDDGEVWIAQFTEHTSAIKVRGASEIHTKHGMLFSGRGRNEKG (서열번호 2)
대안적인 실시형태에서, TRAP는 디설포토마큘럼 하이드로써멀(Desulfotomaculum hydrothermale)로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MNPMTDRSDITGDYVVVKALENGVTIIGLTRGGVTKFHHTEKLDKGEIMIAQFTEHTSAlKlRGRAELLTKHGKI RTEVDS (서열번호 3)
대안적인 실시형태에서, TRAP는 B. 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus)로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIESEGKK (서열번호 4)
대안적인 실시형태에서, TRAP는 B. 스테아로써모필러스 S72N(B. stearothermophilus S72N)으로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIENEGKK (서열번호 5)
대안적인 실시형태에서, TRAP는 B. 할로두란스(B. halodurans)로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MNVGDNSNFFVIKAKENGVNVFGMTRGTDTRFHHSEKLDKGEVMIAQFTEHTSAVKIRGKAIIQTSYGTLDTEKDE (서열번호 6)
대안적인 실시형태에서, TRAP는 카르복시도서무스 하이드로게노포르만스(Carboxydothermus hydrogenoformans)로부터 유래된다. 예를 들어, TRAP는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
MVCDNFAFSSAINAEYIWKALENGVTIMGLTRGKDTKFHHTEKLDKGEVMVAQFTEHTSAIKIRGKAEIYTKHGVIKNE (서열번호 7)
일 실시형태에서, TRAP는 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질 유전자 과(family) mtrB(예를 들어, NCBI 보존 도메인 데이터베이스#CI03437을 갖는 TrpBP 상과)에 의해 인코딩된다.
바람직한 실시형태들에서, TRAP는 6개의 히스티딘 아미노산으로 C 말단 태그된다(HISx6 태그).
바람직한 실시형태에서, TRAP는 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 대해 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바이러스 벡터 생산 세포에서 작동 가능하도록 연결된 NOI의 발현이 변형되도록, 예를 들어 억제되거나 방지되도록, RNA 결합 부위와 상호작용할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, TRAP는 서열번호 1 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 대해 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 100% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 바이러스 벡터 생산 세포에서 작동 가능하도록 연결된 NOI의 발현이 변형되도록, 예를 들어 억제되거나 방지되도록, RNA 결합 부위와 상호작용할 수 있다.
다른 실시형태에서, RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)은 바이러스 벡터 생산 세포에서 작동 가능하도록 연결된 NOI의 발현이 변형되도록, 예를 들어 억제되거나 방지되도록, RNA 결합 부위와 상호작용할 수 있는 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다. 예를 들어, TRAP는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위해 TRAP와 같은 RNA-결합 단백질들의 모든 변이체, 단편 또는 동족체들은 (마커 유전자일 수 있는) NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 본 발명의 결합 부위에 결합하는 능력을 유지할 것이다.
핵산 결합 부위
용어 "결합 부위"는 특정 단백질과 상호 작용할 수 있는 핵산 서열로서 이해되어야 한다. 본 발명의 핵산 결합 부위는 본 발명의 RNA-결합 단백질 예를 들어, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)과 상호 작용할 수 있는 핵산 서열일 수 있다.
TRAP의 경우, TRAP에 결합할 수 있는 공통 핵산 결합 부위 서열은 복수 회(예를 들어, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회 또는 그 이상) 반복되는 [RAGNN]이다; 이러한 서열은 천연 trp 오페론에서 발견된다. 기본 맥락에서, 가끔 AAGNN이 용인되고, 가끔 추가 "간격(spacing)" N의 뉴클레오티드들이 기능적 서열을 야기시킨다. 체외 실험들은 적어도 6번 이상의 공통 반복이 TRAP-RNA 결합에 필요하다는 것을 입증했다(Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 따라서, 바람직하게 일 실시형태에서, tbs내에 존재하는 6개 이상의 연속 [RAGN≥2] 서열들이 존재하고, 여기서 R은 DNA에서 T 또는 G 및 RNA에서 U 또는 G일 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, TRAP 결합 부위는 서열 RAGN≥2(예를 들어, RAGN2-3)를 포함한다. 따라서, 의심의 소지를 없애기 위해, 이러한 핵산 결합 부위는 예를 들어, 서열 UAGNN, GAGNN, TAGNN, UAGNNN, GAGNNN, 또는 TAGNNN 중 어느 하나를 포함한다.
"N"은 서열의 해당 위치에서의 임의의 뉴클레오티드를 지정하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 이것은 G, A, T, C 또는 U일 수 있다. 이러한 뉴클레오티드의 개수는 바람직하게 2개이지만, 최대 3개 예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개이고, 11x 반복 tbs의 RAG 반복은 3개의 간격 뉴클레오티드들에 의해 분리될 수 있고, 번역 억제로 이어지는 약간의 TRAP 결합 활성을 여전히 유지한다. 바람직하게, 번역 억제로 이어지는 최대한의 TRAP 결합 활성을 유지하기 위해서 1개 이하의 N3 스페이서가 11x 반복 tbs 에서 사용될 것이다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN≥2의 복수 반복(예를 들어, RAGN2 -3의 복수 반복)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 서열 RAGN2의 복수 반복을 포함한다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN≥2의 적어도 6회 반복(예를 들어, RAGN2-3의 적어도 6회 반복)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN2의 적어도 6회 반복을 포함한다. 예를 들어, 핵산 결합 부위는 RAGN2의 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회 또는 그 이상의 반복을 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN≥2의 적어도 8회 반복(예를 들어, RAGN2-3의 적어도 8회 반복)을 포함한다.
바람직하게, 핵산 결합 부위에 존재하는 RAGNNN의 반복 횟수는 1회 이하이다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN≥2의 11회 반복(예를 들어, RAGN2 -3의 11회 반복)을 포함한다. 바람직하게, 핵산 결합 부위에 존재하는 RAGNNN의 반복 횟수는 3회 이하이다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN≥2의 12회 반복(예를 들어, RAGN2 -3의 12회 반복)을 포함한다.
다른 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 RAGN2의 8회 내지 11회 반복(예를 들어, RAGN2의 8회, 9회, 10회 또는 11회 반복)을 포함한다.
예를 들어, TRAP 결합 부위는 다음의 서열들 중 하나를 포함할 수 있다:
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGUGGAGCU (서열번호 8); 또는
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGAAGAGCU (서열번호 9)
"RAGN≥2의 반복"에 따르면, 일반적인 RAGN≥2 (예를 들어, RAGN2 -3) 모티프가 반복되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 모티프의 기준을 만족시키는 상이한 RAGN≥2서열들은 핵산 결합 부위를 만들기 위해 결합될 수 있다. 이러한 가능성은 정의에 포함되지만, 결과로 초래된 핵산 결합 부위가 이러한 모티프의 요건들을 만족시키는 단지 하나의 서열의 반복으로 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, "RAGN≥2의 6회 반복"은 다음의 서열들을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다:
UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU (서열번호 10);
UAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU (서열번호 11);
GAGUUU-GAGUU-GAGUU-GAGUUU-GAGUU-GAGUU (서열번호 12)
및:
UAGUUU-GAGUU-UAGUU-GAGUUU-UAGUU-GAGUU (서열번호 13)
(대시들은 단지 명확성을 위해 반복들 사이에 포함된다).
RAGNNN의 1회 반복 및 RAGNN의 7회 반복을 포함하는 8회 반복의 tbs는 TRAP 매개 억제 활성을 유지한다. 1회 이상의 RAGNNN 반복을 포함하는 8회 미만의 tbs 서열(예를 들어, 7회 또는 6회의 tbs 서열)들은 더 낮은 TRAP 매개 억제 활성을 가질 수 있다. 따라서, 8회 미만의 반복이 존재하는 경우, tbs는 단지 RAGNN 반복만을 포함하는 것이 바람직하다.
RAGNN 반복 공통에서 사용하기 위한 바람직한 뉴클레오티드들은
- NN 스페이서 위치들 중 적어도 하나에서의 피리미딘;
- NN 스페이서 위치들 중 첫 번째 위치에서의 피리미딘;
- NN 스페이서의 양쪽 위치에서의 피리미딘;
- R 위치에서의 G이다.
NN 스페이서 위치들이 AA인 경우 G가 R 위치에서 사용되는 것이 또한 바람직하다(즉, TAGAA는 공통 서열에서의 반복으로 사용되지 않는 것이 바람직하다).
"상호 작용할 수 있는"에 따르면, 핵산 결합 부위는 세포 예를 들어, 진핵 바이러스 벡터 생산 세포에서 맞닥뜨리는 조건 하에서 단백질 예를 들어, TRAP에 결합할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. TRAP와 같은 RNA-결합 단백질과의 이러한 상호 작용은 핵산 결합 부위가 작동 가능하도록 연결되는 NOI의 번역의 억제 또는 방지를 야기시킨다.
"작동 가능하도록 연결된"에 따르면, 설명한 성분들이 그들이 의도한 방식으로 기능하도록 허용하는 관계에 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, NOI에 작동 가능하도록 연결된 본 발명의 RNA 결합 부위는 TRAP와 같은 RNA-결합 단백질이 RNA 결합 부위에 결합할 때 NOI의 번역이 변형되는 방식으로 배치된다.
주어진 개방 판독 프레임(ORF)의 NOI 번역 개시 코돈의 업스트림에의 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP 결합 서열; tbs)과 상호 작용할 수 있는 핵산 결합 부위의 배치는 해당 ORF로부터 유래된 mRNA의 특정 번역 억제를 허용한다. TRAP 결합 부위 및 번역 개시 코돈을 분리하는 뉴클레오티드의 개수는 억제의 정도에 영향을 미치지 않고 예를 들어, 0개 내지 12개의 뉴클레오티드까지 달라질 수 있다. 또 다른 예로서, 0개 내지 43개의 뉴클레오티드가 TRAP 결합 부위 및 번역 개시 코돈을 분리하기 위해 사용될 수 있다.
NOI 번역의 억제 또는 방지는 동등한 시점에서 본 발명의 핵산 결합 부위의 부재 하에서 발현된 양과 비교하여 바이러스 벡터 생산 시 번역되는 NOI의 생성물(예를 들어, 단백질)의 양의 변화로 이해되어야 한다. 이러한 번역의 변화는 NOI에 의해 인코딩된 단백질의 발현의 결과적인 억제 또는 방지를 야기시킨다.
본 발명의 일 실시형태에서, 핵산 결합 부위는 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)과 같은 RNA-결합 단백질과 상호 작용할 수 있다.
벡터 생산 시 어느 주어진 시간에서 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에서 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0.5% 또는 0.1 %까지 감소될 수 있다.
벡터 생산 시 어느 주어진 시간에서 NOI의 번역은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에서 번역된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0.5% 또는 0.1 % 미만까지 감소될 수 있다.
NOI 번역의 방지는 실질적으로 0까지 번역량을 감소시키는 것으로 이해되어야 한다.
벡터 생산 시 어느 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에서 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0.5% 또는 0.1 %까지 감소될 수 있다.
벡터 생산 시 어느 주어진 시간에 NOI로부터 단백질의 발현은 벡터 생산의 동일한 시점에서 본 발명의 핵산 서열의 부재 하에서 발현된 양의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0.5% 또는 0.1 % 미만까지 감소될 수 있다.
NOI로부터 단백질의 발현을 방지하는 것은 발현되는 단백질의 양을 실질적으로 0까지 감소시키는 것으로 이해되어야 한다.
NOI 번역의 분석 및/또는 정량화를 위한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있다.
용해된 세포들로터의 단백질 생성물은 쿠마시 또는 은 염색에 의한 시각화를 이용한 SDS-PAGE 분석과 같은 방법들을 사용하여 분석될 수 있다. 대안적으로, 단백질 생성물은 단백질 생성물을 결합하는 항체 프로브들을 사용한 웨스턴 블로팅 또는 효소-연결 면역흡착 측정법(ELISA)을 사용하여 분석될 수 있다. 온전한 세포들에서의 단백질 생성물은 면역 형광법에 의해 분석될 수 있다.
관심의 뉴클레오티드
본 발명의 일 실시형태에서, 관심의 뉴클레오티드는 RNA-결합 단백질, 예를 들어 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)이 결여된 표적 세포에서 번역된다.
"표적 세포"는 NOI를 발현시키는 것이 바람직한 세포로서 이해되어야 한다. NOI는 본 발명의 바이러스 벡터를 사용하여 표적 세포내로 도입될 수 있다. 표적 세포로의 전달은 체내(in vivo), 체외(ex vivo), 또는 시험관 내에서(in vitro) 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 관심의 뉴클레오티드는 치료 효과가 생기게 한다.
NOI는 치료적 또는 진단적 적용을 가질 수 있다. 적합한 NOI들은 효소들을 인코딩하는 서열들에 국한되지 않고, 보조 인자(co-factor), 사이토킨, 케모킨, 호르몬, 항체, 항산화 분자, 조작된 면역글로불린-유사 분자, 단일 사슬 항체, 융합 단백질, 면역 동시 자극 분자, 면역능력조절 분자, 키메라 항원 수용체 표적 단백질의 트랜스도메인 음성 돌연변이체, 독소, 조건부 독소, 항원, 종양 억제 단백질, 성장 인자, 막 단백질, 수용체, 혈관활성 단백질 및 펩티드, 항 바이러스 단백질 및 리보자임, 및 (관련 리포터 작용기를 갖는 유도체와 같은) 이들의 유도체가 포함된다. 또한, NOI는 micro-RNA를 인코딩할 수 있다. 이론에 구애받지 않고, micro-RNA의 처리는 TRAP에 의해 억제될 것으로 생각된다.
일 실시형태에서, NOI는 신경퇴행성 질환의 치료에 유용할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 파킨슨 병의 치료에 유용할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 도파민 합성에 관여하는 효소 또는 효소들을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 효소는 다음의 티로신수산화효소, GTP-시클로히드로라아제 I 및/또는 방향족 아미노산 도파 디카르복실라아제 중 하나 이상일 수 있다. 세 가지 유전자 모두의 서열들을 이용할 수 있다(각각, GenBank® Accession Nos. X05290, U 19523 및 M76180).
다른 실시형태에서, NOI는 소포 모노아민 운반체 2(VMAT2)를 인코딩할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 바이러스 게놈은 방향족 아미노산 도파 디카르복실라아제를 인코딩하는 NOI 및 VMAT2를 인코딩하는 NOI를 포함할 수 있다. 이러한 게놈은 특히 L-DOPA의 지엽적인 투여와 함께 파킨슨 병 치료에 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 치료 단백질 또는 치료 단백질들의 조합을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 신경 아교 세포 유래 신경 성장 인자(GDNF), 뇌 유래 신경 성장 인자(BDNF), 섬모 신경 성장 인자(CNTF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 인터류킨-1 베타(IL-1β), 종양 괴사 인자 알파(TNF-a), 인슐린 성장 인자-2, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C/VEGF-2, VEGF-D, VEGF-E, PDGF-A, PDGF-B, PDFG-A 및 PDFG-B의 헤테로다이머 및 호모다이머로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질 또는 단백질들을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 혈소판 인자 4, 색소 상피 유래 인자(PEDF), 레스틴, 인터페론-a, 인터페론 유도 단백질, gro-베타 및 튜브다운-1, 인터류킨(IL)-1, IL-12, 레티논산, 이들의 항-VEGF 항체 또는 단편/변이체들, 트롬보스폰딘, 미국특허 제5,952,199호 및 미국특허 제6,100,071호에 개시된 것과 같은 VEGF 수용체 단백질들, 및 항-VEGF 수용체 항체들로 이루어진 그룹에서 선택된 항-혈관형성 단백질 또는 항-혈관형성 단백질들을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절자(CFTR)를 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 안구 세포에서 정상적으로 발현된 단백질을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 광수용체 세포 및/또는 망막 색소 상피 세포에서 정상적으로 발현된 단백질을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태에서, NOI는 RPE65, 아릴히드로카본 상호 작용 수용체 단백질류1(AIPL1), CRB1, 레시틴 레티날 아세틸트란스페라아제(LRAT), 광수용체 특이적 호메오 박스(CRX), 레티날 구아닐산 고리화효소(GUCY2D), RPGR 상호작용 단백질 1(RPGRIP1), LCA2, LCA3, LCA5, 디스트로핀, PRPH2, CNTF, ABCR/ABCA4, EMP1, TIMP3, MERTK, ELOVL4, MY07A, USH2A, VMD2, RLBP1, COX-2, FPR, 하루모닌, Rab 에스코트 단백질 1, CNGB2, CNGA3, CEP 290, RPGR, RS1, RP1, PRELP, 글루타티온 경로 효소들 및 옵티신을 포함하는 그룹에서 선택된 단백질을 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태들에서, NOI는 인간 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ를 인코딩할 수 있다.
다른 실시형태들에서, NOI는 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, NOI는 SGSH, SUMF1, GAA, 일반 감마 체인(CD132), 아데노신 탈아미노효소, WAS 단백질, 글로빈, 알파 갈락토시다아제 A, δ-아미노레불린산(ALA) 합성효소, δ-아미노레불린산 디히드라타아제(ALAD), 히드록시메틸빌란(HMB) 합성효소, 우로포르피리노겐(URO) 합성효소, 우로포르피리노겐(URO) 디카르복실라아제, 코프로포르피리노겐(COPRO) 산화효소, 프로토포르피리노겐(PROTO) 산화효소, 페로케라타아제, α-L-이두로니다아제, 이두론산 설파타아제, 헤파란 설파미다아제, N-아세틸글루코사미니다아제, 헤파란-a-글루코사미니드 N-아세틸트란스페라아제, 3 N-아세틸글루코사민 6-설파타아제, 갈락토스-6-황산 설파타아제, β-갈락토시다아제, N-아세틸갈락토사민-4-설파타아제, β-글루쿠로니다아제 및 히알루로니다아제를 인코딩할 수 있다.
NOI 이외에, 벡터는 siRNA, shRNA, 또는 조절된 shRNA를 또한 포함하거나 인코딩할 수 있다. (Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37: 1281-1288).
적응증
본 발명에 따른, 레트로바이러스 및 AAV 벡터를 포함하는, 벡터들은 국제특허 제1998/05635호, 국제특허 제1998/07859호, 국제특허 제1998/09985호에 열거된 질환들의 치료에 유용한 하나 이상의 NOI(들)을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 관심의 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이러한 질병들의 예가 아래에 주어진다.
- 사이토긴 및 세포 증식 및 분화 활성; (예를 들어, 인간 면역 결핍 바이러스 감염, 림프구 성장의 조절을 포함하는 면역 결핍 치료를 위한, 암 및 많은 자가 면역 질환을 치료하기 위한, 및 이식 거부을 방지하거나 종양 면역을 유도하기 위한) 면역 억제 또는 면역자극 활성; 조혈의 조절(예를 들어, 골수성 또는 림프 질환의 치료); (예를 들어, 상처 치유, 화상, 궤양 및 치주 질환 및 신경 퇴화 치료를 위한) 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 신경 조직의 성장 촉진; 난포 자극 호르몬의 억제 또는 활성화 (불임의 조절); (예를 들어, 부상 또는 감염 부위에 특정 세포 유형들을 집결시키기 위한) 화학주성/화학운동성 활성; (예를 들어, 혈우병 및 뇌졸증 치료를 위한) 지혈 및 혈전 용해 활성; (예를 들어, 패혈성 쇼크 또는 크론 병 치료를 위한) 소염 활성; 식세포 억제 및/또는 T 세포 억제 활성 및 따라서 소염 활성; 자가 면역 활성 (즉, 염증과 관련되지 않은 반응을 포함한 세포 및/또는 체액성 면역 반응에 대한 억제 효과들); T 세포들에서의 상위 조절 fas 수용체 발현뿐만 아니라, 세포외 기질 성분 및 피브로넥틴에 부착하기 위한 T 세포 및 대식 세포들의 능력 억제에 반응하는 질환들.
- 암, 백혈병, 양성 및 악성 종양 성장, 침입 및 확산, 혈관형성, 전이, 복수, 및 악성 늑막 유출을 포함하는 악성 질환들
- 류마티스성 관절염을 포함하는 관절염, 과민증, 알러지 반응, 천식, 전신 홍반성 루푸스, 콜라겐 질환 및 기타 질환들을 포함하는 자가 면역 질환들
- 동맥 경화증, 동맥 경화성 심장 질환, 재관류 손상, 심장 마비, 심근 경색, 혈관 염증 질환, 호흡 곤란 증후군, 심혈관 영향, 말초 혈관 질환, 편두통 및 아스피린 의존성 항-혈전증, 뇌졸증, 대뇌 허혈, 허혈성 심장 질환 또는 다른 질환들을 포함하는 혈관 질환들
- 위궤양, 궤양성 대장염, 크론병 및 기타 질환들을 포함하는 위장 관 질환들
- 간 섬유증, 간 경화 또는 기타 질환들을 포함하는 간 질환들
- 갑상선염이나 다른 선 질병, 사구테신염 또는 다른 질환들을 포함하는 신장 및 비뇨기 질환들
- 귓병이나 다른 이비인후과 질환을 포함하는 귀, 코 및 목 질환, 피부염 또는 다른 피부 질환.
- 치주 질환, 치주염, 치은염 또는 다른 치과/구강 질환을 포함하는 치과 및 구강 질환들
- 고환염이나 부고환고환염, 불임, 고환 외상 또는 다른 고환 질환을 포함하는 고환 질환
- 태반 기능 장애, 태반 부전, 습관성 유산, 경련, 전자간증, 자궁 내막증 및 다른 부인과 질환을 포함하는 부인과 질환들
- 후방 포도막염, 중간 포도막염, 전방 포도막염, 결막염, 맥락망막염, 우베오렌티니티스, 시신경염, 개방각 녹내장 및 청소년 선천성 녹내장을 포함하는 녹내장, 망막염 또는 낭포 황반 부종, 교감 안염, 공막염, 색소성 망막염 등의 안구내 염증, 베스트 질환을 포함하는 청소년 황반 변성 및 연령 관련 황반 변성(AMD)을 포함하는 황반 변성, 베스트 노른자모양 황반 변성, 스타가르트병, 어셔 증후군, 도이네의 벌집 망막 이영양증, 소르비의 황반 이영양증, 청소년 망막분리, 콘 로드 이영양증, 각막 이상증, 후치스씨 근육이영양증, 레버 선천성 흑내장, 레버 유전 시신경 병증(LHON), 아디 증후군, 오구치 질환, 퇴행성 퐁뒤 질환, 눈의 외상, 감염에 의해 야기된 눈의 염증, 증식성 유리체 망막 병증, 급성 허혈성 시신경 병증, 녹내장 여과 수술에 따른 과도한 흉터, 안구 이식에 대한 반응, 각막 이식편 거부 반응 등의 안과 질환, 및 당뇨병 황반 부종, 망막 정맥 폐색, RLBP1 관련 망막 이영양증, 맥락막 결여 및 색맹과 같은 다른 안과 질환.
- 파킨슨병, 파킨슨병의 치료로부터의 합병증 및/또는 부작용, AIDS 관련 치매 복합 HIV 관련 뇌증, 데빅병, 시드남 무도병, 알츠하이머병 및 다른 퇴행성 질환을 포함하는 신경 및 신경 퇴행성 질환, CNS의 질환 또는 장애, 뇌졸중, 폴리오 후 증후군, 정신 질환, 골수염, 뇌염, 아급성 경화성 범뇌염, 뇌척수염, 급성 신경병증, 아급성 신경증, 만성 신경증, 폼페병, 기엥 바레 증후군, 시드남 무도병, 증증 근무력증, 가뇌 종양, 다운 증후군, 헌팅턴 무도병, CNS 압축 또는 CNS 외상 또는 CNS의 감염, 근육 위축 및 이영양증, 중추 및 말초 신경계의 질환, 질병 또는 장애, 근 위축성 측삭 경화증, 척추 근육 위축, 척수 및 견열 손상을 포함하는 운동 신경 질환
- 낭포성 섬유증, 산필리포 증후군 A, ADA-SCID, X 염색체 관련 SCID, 포르피린증, 혈우병 A, 혈우병 B, 외상 후 염증, 출혈, 응집 및 급성 위상 반응을 포함하는 점액 다당류증, 악액질, 거식증, 급성 감염, 패혈성 쇼크, 감염성 질환, 수술의 합병증 또는 부작용, 골수 이식 또는 다른 이식 합병증 및/또는 부작용, 각막, 골수, 기관, 렌즈, 심박 조율기, 천연 또는 인공 피부 조직과 같은 천연 또는 인공 세포, 조직 및 기관들의 이식의 경우에 이식 거부 반응의 예방 및/또는 치료를 위한, 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 억압 또는 억제하기 위한 예를 들어, 바이러스 캐리어 감염 또는 AIDS로 인한 유전자 치료의 합병증 및 부작용 등의 기타 질환 및 질병.
siRNA, micro-RNA 및 shRNA
특정한 다른 실시형태들에서, NOI는 micro-RNA를 포함한다. micro-RNA들은 유기체들에서 자연적으로 생산된 작은(small) RNA들의 매우 큰 그룹으로서, 이들의 적어도 일부는 표적 유전자들의 발현을 조절한다. micro-RNA 과의 창립 맴버들은 let-7 및 lin-4이다. let-7 유전자는 유충(worm) 성장 시 내생 단백질 코딩 유전자들의 발현을 조절하는 작고 고도로 보존된 RNA 종들을 인코딩한다. 활성 RNA 종들은 ~70 nt 전구체로서 처음에 전사되고, 이는 전사 후 처리되어 성숙한 ~21 nt 형태가 된다. let-7 및 lin-4 양자 모두는 헤어핀 RNA 전구체들로서 전사되고 이는 다이서(Dicer) 효소에 의해 이들의 성숙한 형태로 처리된다.
NOI 이외에, 벡터는 siRNA, shRNA, 또는 조절된 shRNA를 또한 포함하거나 인코딩할 수 있다 (Dickins et al. (2005) Nature Genetics 37: 1289-1295, Silva et al. (2005) Nature Genetics 37: 1281-1288).
이중-가닥 RNA(dsRNA)에 의해 매개된 전사 후 유전자 침묵(PTGS)은 외래 유전자들의 발현을 제어하기 위한 보존된 세포 방어 메커니즘이다. 트랜스포슨 또는 바이러스들과 같은 요소들의 랜덤 통합은 동종의 단일 가닥 mRNA 또는 바이러스 게놈 RNA의 서열 특이적 분해를 활성화시키는 dsRNA의 발현을 야기시키는 것으로 생각된다. 침묵 효과는 RNA 간섭(RNAi)으로 알려져 있다(Ralph et al. (2005) Nature Medicine 11:429-433). RNAi의 메커니즘은 약 21개 내지 25개의 뉴클레오티드(nt) RNA의 듀플렉스로 긴 dsRNA들을 처리하는 단계를 포함한다. 이들 생성물은 mRNA 분해의 서열 특이적 매개체들인 작은 간섭 또는 침묵 RNA(siRNA)라 불린다. 분화된 포유 동물 세포들에서, dsRNA >30 bp는 비특이적 mRNA 분해 및 단백질 합성의 정지로 이어지는 인터페론 반응을 활성화하는 것으로 확인되었다(Stark et al., Annu Rev Biochem 67:227-64 (1998)). 그러나, 이러한 반응은 유전자 기능이 배양된 포유 동물 세포들에서 분석되는 것을 허용하는 21개의 nt siRNA 듀플렉스를 사용함으로써 바이패스될 수 있다(Elbashir et al., EMBO J. Dec 3;20(23):6877-88 (2001), Hutvagner et al., Science.Aug 3, 293(5531):834-8. Eupub Jul 12 (2001)).
벡터
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다.
벡터는 하나의 환경에서 다른 환경으로의 개체 전달을 허용하거나 용이하도록 하는 도구이다. 본 발명에 따라서, 및 예들 들어, 재조합 핵산 기술들에서 사용되는 일부 벡터들은 핵산의 세그먼트(예를 들어, 이종 cDNA 세그먼트와 같은 이종 DNA 세그먼트)와 같은 개체들이 표적 세포로 전달되도록 허용한다. 벡터는 핵산의 세그먼트에 의해 인코딩된 단백질의 발현 또는 DNA또는 RNA의 세그먼트를 포함하는 벡터의 복제를 용이하게 하거나, 셀 내에 이종 핵산(DAN 또는 RNA)을 유지하는 목적들에 도움이 될 수 있다.
본 발명의 벡터들은 예를 들어, 복제의 기원, 선택적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터, 및 선택적으로 프로모터의 조절자와 함께 제공되는 바이러스 벡터들일 수 있다. 벡터들은 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자들(예를 들어, 네오마이신 내성 유전자) 및/또는 추적가능한 마커 유전자들(예를 들어, GFP 인코딩 유전자)을 포함할 수 있다. 벡터들은 예를 들어, 표적 세포를 감염시키기 위해 및/또는 형질도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터는 체외에서 양립가능한 표적 세포에서 NOI를 복제하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 체외에서 양립가능한 표적 세포에 본 발명의 벡터를 도입하고, NOI의 발현을 야기시키는 조건 하에서 표적 세포를 성장시킴으로써 체외에서 단백질들을 만드는 방법을 제공한다. 단백질은 당업계에 잘 알려진 방법들에 의해 표적 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 표적 세포들은 포유 동물 세포주 및 다른 진핵 세포주를 포함한다.
벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 발현 벡터들은 전사될 수 있는 서열들을 포함하는 핵산의 영역들을 포함한다. 따라서, mRNA, tRNA 및 rRNA을 인코딩하는 서열들이 이러한 정의 내에 포함된다. 바람직하게, 발현 벡터는 표적 세포에 의해 코딩 서열의 발현을 제공할 수 있는 제어 서열에 작동 가능하도록 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
바이러스 벡터
본 발명의 일 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 벡터, 벡터 비리온 또는 벡터 입자로도 불릴 수 있다.
다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 우두 바이러스(vaccinia virus) 또는 바큐로바이러스(baculovirus)로부터 유래된다.
본 발명의 억제 시스템은 모든 바이러스 벡터 시스템에 도움이 될 것으로 예상된다. 시스템은 예를 들어, 관심의 뉴클레오티드가 비리온 어샘블리 동안 또는 바이러스 벡터 생산 세포에 부작용을 야기하는 경우 특정 용도를 찾을 것이다.
다른 실시형태에서, 레트로바이러스는 포말(foamy) 바이러스로부터 유래된다.
다른 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다.
다른 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된다.
벡터 역가
당업자는 바이러스 벡터들의 역가를 결정하는 많은 상이한 방법들이 존재함을 이해할 것이다. 역가는 자주 형질도입 유닛/mL(TU/mL)로 설명된다. 역가는 감염성 입자의 개수를 증가시킴으로써 및 벡터 제제의 특정 활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 모든 적합한 레트로바이러스로부터 유래되거나 유래될 가능성이 있다. 다수의 상이한 레트로바이러스가 확인되었다. 예로는 쥐 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T 세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Mo MLV), FBR 쥐 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 쥐 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손 쥐 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수세포증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적아세포증 바이러스(AEV)가 포함된다. 레트로바이러스들의 상세 목록은 Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763에서 찾을 수 있다.
레트로바이러스들은 크게 두 개의 카테고리 즉, "단순형" 및 "복잡형"으로 나뉠 수 있다. 레트로바이러스들은 7개의 그룹으로 더 나뉠 수 있다. 이들 그룹 중 5개 그룹은 발암 가능성이 있는 레트로바이러스들을 나타낸다. 나머지 두 개의 그룹은 렌티바이러스 및 스푸마바이러스이다. 이들 레트로바이러스들의 검토는 Coffin et al (1997)에서 제공된다.
레트로바이러스 게놈 및 렌티바이러스 게놈의 기본 구조는 게놈들이 패키징될 수 있도록 하는 패키징 신호, 프라이머 결합 부위, 표적 세포 게놈으로의 통합을 가능하게 하는 통합 부위들 및 패키징 구성성분들을 인코딩하는 gag/pol 및 env 유전자에 배치되는 5' LTR 및 3' LTR과 같은 많은 공통적인 특징들을 공유한다 - 이들은 바이러스 입자들의 어셈블리에 필요한 폴리펩티드이다. 렌티바이러스들은 감염된 표적 세포의 핵에서 세포질로의 통합된 프로바이러스의 RNA 전사체를 효율적으로 내보낼 수 있는, HIV에서의 rev 유전자 및 RRV 서열과 같은, 추가 특징들을 갖는다.
프로바이러스에서, 이들 유전자는 긴 말단 반복(LTR)으로 불리는 영역들에 의해 양단의 측면에 배치된다. LTR들은 프로바이러스 통합 및 전사에 대한 책임이 있다. 또한, LTR들은 인핸서-프로모터 서열들로서의 역할을 하고, 바이러스 유전자들의 발현을 제어할 수 있다.
LTR들 자체는 U3, R 및 U5라 불리는 세 가지 요소로 분할될 수 있는 동일한 서열들이다. U3는 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양단에서 반복되는 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. 세 가지 요소들의 크기는 상이한 레트로바이러스들 사이에서 상당히 달라질 수 있다.
본 발명의 전형적인 레트로바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역들의 적어도 일부가 바이러스로부터 제거될 수 있다; 예를 들어, gag/pol 및 env가 없거나 기능하지 않을 수 있다. 이것은 바이러스 벡터가 복제 결함이 되도록 만든다.
바이러스 게놈의 일부는 표적 비분할 세포를 형질도입할 수 있고 및/또는 호스트 게놈으로 이의 게놈을 통합할 수 있는 본 발명의 후보 핵산 결합 서열들을 포함하는 벡터를 생성하기 위해 벡터 게놈에서 리포터 유전자 및 조절 제어 영역에 작동 가능하도록 연결된 본 발명의 후보 핵산 결합 서열들을 인코딩하는 라이브러리에 의해 또한 교체될 수 있다.
렌티바이러스들은 레트로바이러스들의 더 큰 그룹의 일부이다. 렌티바이러스들의 상세 목록은 Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763)에서 찾을 수 있다. 간단하게, 렌티바이러스들은 영장류 및 비영장류 그룹으로 나뉠 수 있다. 영장류 렌티바이러스들의 예로는 인간 면역 결핍 바이러스(HIV), 인간 자가 면역 결핍 증후군의 원인 인자(AIDS), 및 유인원 면역 결핍 바이러스(SIV)가 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 비영장류 렌티바이러스 그룹은 관련된 염소의 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역 결핍 바이러스뿐만 아니라 프로토타입 "느린 바이러스" 비스나/매디 바이러스(VMV)를 포함한다.
렌터바이러스과는 렌티바이러스들이 분할 및 비분할 세포들 모두를 감염시킬 수 있는 능력을 갖는다는 점에서 레트로바이러스들과는 상이하다(Lewis et al (1992) EMBO J 1 1 (8): 3053-3058 and Lewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516). 반면에, MLV와 같은 다른 레트로바이러스들은 예를 들어, 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 만드는 것들과 같은 비분할 또는 느리게 분할하는 세포들을 감염시킬 수 없다.
본원에서 사용된 바와 같은 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래할 수 있는 적어도 하나의 성분 일부를 포함하는 벡터이다. 바람직하게, 해당 성분 일부는 벡터가 세포들을 감염시키고, 유전자를 발현시키고, 또는 복제되는 생물학적 메커니즘들에 관여한다.
렌티바이러스 벡터는 영장류 렌티바이러스 (예를 들어, HIV-1) 또는 비-영장류 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
비-영장류 렌티바이러스의 예들은 자연 발생적으로는 영장류를 감염시키지 않는 렌티바이러스과의 구성원일 수 있고, 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV), 소 면역 결핍 바이러스(BIV), 염소 관절염 뇌염 바이러스(CAEV), 매디 비스나 바이러스(MW) 또는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)를 포함할 수 있다.
일반적인 관점에서, 전형적인 레트로바이러스 벡터 생산 시스템은 필수적인 바이러스 패키징 기능들로부터의 바이러스 게놈의 분리를 포함한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이들 성분들은 (대안적으로, 플라스미드, 발현 플라스미드, DNA 구조체 또는 발현 구조체들로 알려진) 별도의 DNA 발현 카세트들의 생산 세포들에 제공된다.
벡터 게놈은 NOI를 포함한다. 벡터 게놈들은 전형적으로 패키징 신호(ψ), NOI를 숨기고 있는 내부 발현 카세트, (선택적으로) 전사 후 요소(RRE), 3'-ppu 및 자기 불활성(SIN) LTR을 필요로 한다. R-U5 영역들은 역 전사의 프로세스뿐만 아니라 벡터 게놈 RNA 및 NOI mRNA 모두의 올바른 폴리아데닐화에 필요하다. 벡터 게놈은 국제특허 제2003/064665호에 기술된 바와 같이 선택적으로 개방 판독 프레임을 포함할 수 있다.
패키징 기능들은 gag/pol 및 env 유전자를 포함한다. 이들은 생산 세포에 의한 벡터 입자들의 생산에 필요하다. 이들 기능들을 게놈에 트란스로(in trans) 제공하는 것은 복제 결함 바이러스의 생산을 용이하게 한다.
감마 레트로바이러스 벡터들에 대한 생산 시스템들은 전형적으로 게놈, gag/pol 및 env 발현 구조체들을 필요로 하는 3 성분 시스템들이다. HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터들에 대한 생산 시스템들은 추가적으로 rev 반응 요소를 포함하는 벡터 게놈을 위해 및 트란스에서(in trans) 제공되는 액세서리 유전자 rev를 필요로 한다. 개방 판독 프레임(ORF)이 존재하면, EIAV 기반 렌티바이러스 벡터들은 rev를 필요로 하지 않는다(국제특허 제2003/064665호 참조).
보통, 벡터 게놈 카세트 내에 인코딩된 (벡터 게놈 카세트를 구동시키는) "외부" 프로모터 및 (NOI 카세트를 구동시키는) "내부" 프로모터 모두는 다른 벡터 시스템 성분들을 구동시키는 프로모터들과 같이, 강한 진핵 또는 바이러스 프로모터들이다. 이러한 프로모터들의 예로는 CMV, EF1a, PGK, CAG, TK, SV40 및 유비퀴틴 프로모터가 포함된다. DNA 라이브러리들에 의해 생성된 것(예를 들어, JeT 프로모터)들과 같은 강한 '합성' 프로모터들이 전사를 구동시키기 위해 또한 사용될 수 있다. 대안적으로, 로돕신(Rho), 로돕신 키나아제(Rhok), 유전자를 포함하는 원뿔형 막대 호메오박스(CRX), 신경 망막 특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 노른자모양 황반 이영양증 2(VMD2), 티로신 수산화효소와 같은 조직-특이적 프로모터들, 신경세포-특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터, 성상세포-특이적 아교 섬유 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 인간 α1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN-1 프로모터, WASP 프로모터, SV40/hA1b 프로모터, SV40/CD43, SV40/CD45, NSE/RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터가 전사를 구동하기 위해 사용될 수 있다.
레트로바이러스 벡터들의 생산은 안정적인 생산자 세포주(PCL)들의 사용 또는 이들 DNA 성분들을 이용한 생산 세포들의 일시적 형질감염을 포함하고, 성분들은 생산 세포 게놈 내에 통합된다(예를 들어, Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous and P. A. Radcliffe (2009) Gene Ther. 16(6): 805-814 Epub 2009 Mar 2005). 대안적인 방법은 (패키징 성분들이 안정적으로 통합되는) 안정적인 패키징 세포를 사용하고 나서 필요에 따라 벡터 게놈 플라스미드에서 일시적으로 형질감염시키는 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터를 생성하기 위해, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP 단백질)을 발현시킬 수 있어야 한다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 안정적으로 발현시킬 것이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 일시적으로 발현시킬 것이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질 (예를 들어, TRAP) 구조체를 안정적으로 발현시킬 것이고, 또한 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 일시적으로 발현시킨다.
레트로바이러스 벡터들을 생산하기 위한 TRIP 시스템이 주로 기술되었지만, 유사한 전략들이 다른 바이러스 벡터들에 적용될 수 있다는 것을 유의해야 한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 바이러스 벡터는 EIAV로부터 유래된다. EIAV는 렌티바이러스들의 가장 단순한 게놈 구조를 가지며, 특히 본 발명에서의 사용에 바람직하다. gag/pol 및 env 유전자 이외에, EIAV는 세 개의 다른 유전자 즉, tat, rev, 및 S2를 인코딩한다. tat는 바이러스 LTR의 전사 활성제로서 작용하고(Derse and Newbold (1993) Virology 194(2): 530-536 and Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642), rei는 rev 반응 요소(RRE)들을 통해 바이러스 유전자들의 발현을 조절하고 조정한다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-311 1). 이들 두 종류의 단백질의 작용 메커니즘은 영장류 바이러스들에서의 유사한 메커니즘들과 대체로 유사할 것이라 생각된다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). S2의 기능은 알려져 있지 않다. 또한, 막횡단 단백질의 시작에서 env 코딩 서열에 접합된 tat의 첫 번째 엑손에 의해 인코딩되는 EIAV 단백질 Ttm이 확인되었다. 본 발명의 대안적 실시형태에서, 바이러스 벡터는 HIV로부터 유래된다: HIV는 S2를 인코딩하지 않지만 EIAV와 달리 vif, vpr, vpu 및 nef를 인코딩한다는 점에서 EIAV와는 상이하다.
용어 "제조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터(RRV)"는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자 내로, 패키징 성분들의 존재 하에서, RNA 게놈의 패키징을 허용하기에 충분한 레트로바이러스 유전 정보를 갖는 벡터를 의미한다. 표적 세포의 감염은 표적 세포 게놈으로의 역전사 및 통합을 포함할 수 있다. RRV는 표적 세포에 벡터에 의해 전달될 비-바이러스 코딩 서열들을 운반한다. RRV는 표적 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자들을 생산하는 독립적인 복제를 할 수 없다. 보통, RRV는 복제에 필수적인 기능적 gag/pol 및/또는 env 유전자, 및/또는 다른 유전자들이 부족하다.
바람직하게, 본 발명의 RRV 벡터는 최소한의 바이러스 게놈을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "최소한의 바이러스 게놈"은 표적 세포에 관심의 뉴클레오티드를 감염, 형질도입 및 전달하기 위해 필요한 기능성을 제공하기 위해 필수적인 요소들을 유지하면서 비필수적인 요소들을 제거하도록 바이러스 벡터가 조작되었음을 의미한다. 이러한 전략의 추가적인 상세 설명은 국제특허 제1998/17815호 및 국제특허 제99/32646호에서 찾을 수 있다. 최소한의 EIAV 벡터는 tat, rev 및 S2 유전자가 부족하고, 생산 시스템에서의 트란스에서(in trans) 이들 유전자들의 어떤 것도 제공되지 않는다. 최소한의 HIV 벡터는 vif, vpr, vpu, tat 및 nef가 부족하다.
그러나, 생산 세포 내에서 벡터 게놈을 생산하기 위해 사용되는 발현 플라스미드는 생산 세포/패키징 세포에서 게놈의 전사를 지시하기 위한 레트로바이러스 게놈에 작동 가능하도록 연결된 전사 조절 제어 서열들을 포함할 것이다. 이들 조절 서열은 전사된 레트로바이러스 서열 즉, 5'U3 영역과 관련된 천연 서열들일 수 있고, 또는 그들은 후술되는 바와 같이 다른 바이러스 프로모터 예를 들어, CMV 프로모터와 같은 이종 프로모터일 수 있다. 일부 렌티바이러스 벡터 게놈들은 효율적인 바이러스 생산을 위해 추가적인 서열들을 필요로 한다. 예를 들어, 특히 HIV의 경우, RRE 서열들이 포함될 수 있다. 그러나, RRE에 대한 요건(및 트란스에서 제공되는 rev에 대한 의존성)은 코돈 최적화에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이러한 전략의 보다 상세한 설명은 국제특허 제2001/79518호에서 찾을 수 있다. rev/RRE 시스템과 동일한 기능을 수행하는 대안적인 서열들이 또한 알려져 있다. 예를 들어, rev/RRE의 기능적 유사체는 메이슨 화이저 원숭이 바이러스에서 발견된다. 이것은 구성적 전송 요소(CTE)로서 알려져 있고, 감염된 세포의 인자와 상호 작용하는 것으로 생각되는 게놈의 RRE형 서열을 포함한다. 세포 인자는 rev 유사체로 간주될 수 있다. 따라서, CTE는 rev/RRE 시스템에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 알려져 있거나 사용할 수 있게 되는 다른 기능적 등가물들이 본 발명에 관련될 수 있다. 예를 들어, HTLV-I의 Rex 단백질은 HIV-1의 Rev 단백질을 기능적으로 대신할 수 있다고 또한 알려져 있다. Rev 및 RRE는 본 발명의 방법들에서 사용하기 위한 벡터에서 존재하지 않거나 기능하지 않을 수 있다; 대안적인 rev 및 RRE에서, 또는 기능적으로 등가인 시스템에서 존재할 수 있다.
SIN 벡터들
본 발명의 방법들에서 사용하기 위한 벡터들은 바람직하게 바이러스 인핸서 및 프로모터 서열들이 삭제된 자기 불활성(SIN) 구성에서 사용된다. SIN 벡터들이 생성될 수 있고, 야생형 벡터들의 효율과 유사한 효능으로 체내, 체외 또는 시험관 내에서 비분할 표적 세포들을 형질도입할 수 있다. SIN 프로바이러스에서의 긴 말단 반복(LTR)의 전사 불활성화는 복제 가능 바이러스에 의한 동원을 방지해야 한다. 이것은 LTR의 모든 cis 작용 효과를 제거함으로써 내부 프로모터들로부터 유전자들의 조절된 발현을 또한 가능하게 해야 한다.
예로서, 3' LTR의 U3 영역에서 전사 인핸서들(transcriptional enhancer) 또는 인핸서들 및 프로모터를 결실시켜 자기-불활성 레트로바이러스 벡터 시스템들을 작제하였다. 1회의 벡터 역전사 및 통합 이후, 이들 변화는 전사적으로 비활성인 프로바이러스를 생산하는 5' 및 3' LTR 모두에 복제된다. 그러나, 이러한 벡터들에서 LTR들의 임의의 내부 프로모터(들)은 여전히 전사적으로 활성일 것이다. 이러한 전략은 내부적으로 배치된 유전자들로부터의 전사에 대한 바이러스 LTR들에서의 인핸서들 및 프로모터들의 영향을 제거하기 위해 사용되었다. 이러한 영향들은 증가된 전사 또는 전사의 억제를 포함한다. 이러한 전략은 3'LTR에서 유전적 DNA로의 다운스트림 전사를 제거하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이것은 모든 내생 종양유전자의 우발적 활성화를 방지하는 것이 중요한 인간 유전자 치료에서 특히 관심이 있다. Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261 : 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11 : 179-90. SIN 렌티바이러스 벡터들은 미국특허 제6,924,123호 및 미국특허 제7,056,699호에 설명되어 있다.
비-복제형 렌티바이러스 벡터들
복제 결함 렌티바이러스 벡터의 게놈에서, gag/pol 및/또는 env의 서열은 돌연변이되거나, 부재이거나 및/또는 기능하지 않을 수 있다.
본 발명의 전형적인 렌티바이러스 벡터에서, 바이러스 복제에 필수적인 단백질들에 대한 하나 이상의 코딩 영역들의 적어도 일부는 벡터로부터 제거될 수 있다. 이것은 바이러스 벡터가 복제 결함이 되도록 한다. 바이러스 게놈의 일부는 비분할 표적 세포를 형질 도입하거나 이의 게놈을 표적 세포 게놈에 통합할 수 있는 NOI를 포함하는 벡터를 생성하기 위해 관심의 뉴클레오티드(NOI)에 의해 또한 교체될 수 있다.
일 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터들은 국제특허 제2006/010834호 및 국제특허 제2007/071994호에 기술된 바와 같이 비 통합 벡터들이다.
또 다른 실시형태에서, 벡터들은 바이러스 RNA가 부족하거나 전혀 없는 서열을 전달하는 능력을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, Gag 또는 GagPol 상의 동족 결합 도메인 및 전달될 RNA에 배치된 이종 결합 도메인(gag에 대해 이종)은 전달될 RNA의 패키징을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이들 벡터들는 국제특허 제2007/072056호에 기술되어 있다.
아데노바이러스 벡터들
본 발명의 다른 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 아데노바이러스는 RNA 중간체를 통해 복제하지 않는 이중 가닥의 선형 DNA 바이러스이다. 이들의 유전자 서열을 기반으로 하여 6개의 서브그룹으로 나뉜 아데노바이러스의 50개 이상의 상이한 인간 혈청형이 존재한다.
아데노바이러스들은 인간 및 비인간 기원의 다양한 세포 유형들의 체내, 체외 및 시험관 내 형질도입이 가능한 이중 가닥의 DNA 비-외피 바이러스들이다. 이들 세포는 호흡 기도 상피 세포, 간세포, 근육 세포, 심장 근육 세포, 활막, 일차 유방 상피 세포, 및 신경세포와 같은 후-유사분열로 말기 분화된 세포들을 포함한다.
또한, 아데노바이러스 벡터들은 비분할 세포들을 형질도입할 수 있다. 이것은 폐 상피에서 영향받은 세포들이 느린 회전율을 갖는, 낭포성 섬유증과 같은, 질환들에 대해 매우 중요하다. 사실, 몇 가지 실험이 성인 낭포성 섬유증으로 시달리고 있는 환자들의 폐로의 낭포성 섬유증 운반체(CFTR)의 아데노바이러스 매개 전달을 이용하여 진행 중이다.
아데노바이러스들은 이종 유전자들의 발현을 위한 및 유전자 치료를 위한 벡터들로서 사용되어왔다. 큰(36 kb) 게놈은 최대 8 kb의 외래 삽입 DNA를 수용할 수 있고, 최대 1012의 형질도입 유닛/ml의 매우 높은 역가를 생산하기 위해 보완 세포주들에서 효율적으로 복제할 수 있다. 따라서, 아데노바이러스는 일차 비복제 세포들에서의 유전자들의 발현을 연구하기 위한 최상의 시스템들 중 하연령이다.
아데노바이러스 게놈으로부터 바이러스 또는 외래 유전자들의 발현은 복제 세포를 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터들은 수용체 매개 세포내섭취에 의해 세포에 들어간다. 일단, 세포 안의, 아데노바이러스 벡터들은 거의 호스트 염색체에 통합되지 않는다. 대신에, 그들은 호스트 핵에서 선형 게놈으로서 (호스트 게놈과 독립적으로) 에피솜으로 기능한다.
아데노-관련 바이러스 벡터들
아데노-관련 바이러스(AAV)는 높은 통합 빈도을 갖고 비분할 세포들을 감염시킬 수 있기 때문에, 본 발명에서 사용하기 위한 매력적인 벡터 시스템이다. 이것은 아데노-관련 바이러스가 포유 동물 세포들로의 유전자 전달에 유용하도록 만든다. AAV는 감염에 대한 광범위한 호스트 범위를 갖는다. rAAV 벡터들의 생성 및 사용에 관한 상세한 설명은 각각 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,139,941호 및 미국 특허 제4,797,368호에서 기술된다.
재조합 AAV 벡터들은 인간의 질병들에 관여하는 유전자 및 마커 유전자들의 시험관 내, 체외 및 체내 형질 도입에 성공적으로 사용되었다.
큰 페이로드(최대 8 내지 9kb)를 효율적으로 통합할 수 있는 특정 AAV 벡터들이 개발되었다. 하나의 이러한 벡터는 AAV5 캡시드 및 AAV2 ITR을 갖는다(Allocca M, et al J. Clin Invest (2008) 118: 1955-1964).
단순 포진 바이러스 벡터들
단순 포진 바이러스(HSV)는 신경세포를 자연적으로 감염시키는 외피가 있는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 그것은 그것을 벡터 시스템으로서 매력적이도록 만드는, 외래 DNA의 큰 섹션들을 수용할 수 있고, 신경세포에 대한 유전자 전달을 위한 벡터로서 사용되었다(Manservigiet et al Open Virol J. (2010) 4:123-156).
치료 절차들에서 HSV의 사용은 그들이 용균 회로를 확립할 수 없도록 감쇠될 수 있는 균주들을 필요로 한다. 특히, HSV 벡터들이 인간의 유전자 치료에 사용되면, 폴리뉴클레오티드가 필수 유전자에 바람직하게 삽입되어야 한다. 이것은 바이러스 벡터가 야생형 바이러스를 맞닥뜨리는 경우, 야생형 바이러스로의 이종 유전자의 전달이 재조합에 의해 발생할 수 있기 때문이다. 그러나, 폴리뉴클레오티드가 필수 유전자에 삽입되는 한, 이러한 재조합 전달은 또한 수용체 바이러스에서 필수 유전자를 삭제하고, 복제 능력이 있는 야생형 바이러스 개체군으로의 이종 유전자의 "탈출"을 방지할 것이다.
우두 바이러스 벡터들
본 발명의 벡터는 MVA 또는 NYVAC과 같은 우두 바이러스 벡터일 수 있다. 우두 벡터들에 대한 대안으로는 인간 세포들에서의 재조합 단백질들을 감염시킬 수 있고 발현시킬 수는 있지만 복제할 수는 없는 그것으로부터 유래된 균주들 및 ALVAC로 알려진 계두(fowlpox) 또는 카나리아 두창(canarypox)과 같은 조류폭스(avipox) 벡터들을 포함한다.
바큐로바이러스 벡터들
본 발명의 벡터는 또한 바큐로바이러스 벡터일 수 있다. 포유 동물 세포 내의 인코딩된 NOI들의 발현을 가능하게 하는 바큐로바이러스의 변형 당업계에 잘 알려져 있다. 이것은 예를 들어, NOI의 업스트림에서의 포유 동물 프로모터들의 사용을 통해 달성될 수 있다.
복수의 NOI를 인코딩하는 벡터들
일 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 NOI를 포함하고, 하나 이상의 NOI는 본 발명의 핵산 결합 부위에 작동 가능하도록 연결된다.
내부 리보솜 진입 부위(IRES)
전술한 바와 같이, 본 발명의 벡터들은 하나 이상의 NOI를 포함할 수 있다. 이들 NOI가 발현되도록 하기 위해, 각각의 NOI에 대해 하나씩, 벡터 게놈 내에 두 개 이상의 전사 유닛이 존재할 수 있다. 그러나, 레트로바이러스 벡터들은 그들이 유전적으로 간단하게 유지되는 경우 가장 높은 역가 및 가장 강력한 유전자 발현 특성을 달성하고(WO 96/37623; Bowtell et al., 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll et al., 1994 Blood 84, 1812; Emerman and Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al., 1991 Mol. Cell. Biol. 11 , 5848; Hantzopoulos et al., 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al., 1991 J.Biol.Chem 266, 8416; Hatzoglou et al., 1988 J.Biol.Chem 263, 17798; Li et al., 1992 Hum.Gen.Ther. 3, 381; McLachlin et al., 1993 Virol. 195, 1; Overell et al., 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al., 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al., 1994 Gene Ther 1 , 307; Xu et al., 1989 Virol. 171, 331 ; Yee et al., 1987 PNAS 84, 5197), 따라서 폴리시스트론 메시지에서 제 2 (및 후속) 코딩 서열(들)의 전사를 개시하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다(Adam et al 1991 J.Virol. 65, 4985)는 것은 문헌으로부터 명백하다.
IRES 요소들의 레트로바이러스 벡터들 내로의 삽입은 레트로바이러스 복제 주기와 호환되고, 단일 프로모터로부터 복수의 코딩 부위들의 발현을 허용한다(Adam et al (as above); Koo et al (1992) Virology 186:669-675; Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148). IRES 요소들은 그들이 바이러스 단백질들의 캡-독립 전사를 촉진하는 피코르나바이러스들의 비-번역 5' 말단들에서 처음 발견되었다(Jang et al (1990) Enzyme 44: 292-309). RNA에서 개방 판독 프레임들 사이에 배치되는 경우, IRES 요소들은 번역의 다운스트림 개시로 이어지는 IRES 요소에서의 리보솜 진입을 촉진함으로써 다운스트림 개방 판독 프레임의 효율적인 번역을 허용한다.
IRES에 대한 검토는 Mountford and Smith (TIG May 1995 vol 1 1 , No 5: 179-184)에 의해 제공된다. 다수의 상이한 IRES 서열들이 공지되어 있으며, 이에는 뇌심근염 바이러스(EMCV)(Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991); BiP 단백질[Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; 초파리의 안테나페디아 유전자(엑손 d 및 e)[Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)]로부터의 IRES 서열뿐만 아니라, 폴리오 바이러스(PV)에서의 IRES 서열[Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); see also Mountford and Smith, TIG 11 , 179-184 (1985)]도 포함된다.
PV, EMCV 및 돼지 수포성 질환 바이러스로부터의 IRES 요소들이 레트로바이러스 벡터들에서 이전에 사용되었다(Coffin et al, as above).
용어 "IRES"는 IRES의 기능을 개선하거나 IRES로서 작동하는 임의의 서열 또는 서열들의 조합을 포함한다.
IRES(들)은 (EMCV IRES, PV IRES, 또는 FMDV 2A류의 서열들과 같은) 바이러스 기원 또는 (FGF2 IRES, NRF IRES, Notch 2 IRES 또는 EIF4 IRES와 같은) 세포 기원일 수 있다.
IRES가 각각의 폴리뉴클레오티드의 번역을 개시할 수 있도록 하기 위해서, 그것은 벡터 게놈에서 폴리뉴클레오티드들 앞 또는 사이에 배치되어야 한다.
프로모터
NOI의 발현은 프로모터/인핸서 및 다른 발현 조절 신호들을 포함하는 제어 서열들을 사용하여 제어될 수 있다. 원핵 프로모터 및 진핵 세포들에서 기능적인 프로모터들이 사용될 수 있다. 조직-특이적 또는 자극 특이적 프로모터들이 사용될 수 있다. 두 개 이상의 상이한 프로모터들로부터의 서열 요소들을 포함하는 단계에서 키메라 프로모터들이 또한 사용될 수 있다.
적합한 프로모팅 서열들은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로 바이러스(CMV), 레트로바이러스 및 유인원바이러스40(SV40)과 같은 바이러스들의 게놈으로부터, 또는 액틴 프로모터, EF1a, CAG, TK, SV40, 우비퀴틴, PGK 또는 리보솜 단백질 프로모터와 같은 이종 포유동물 프로모터들로부터 유래된 것들을 포함하는 강력한 프로모터들이다. 대안적으로, 로돕신(Rho), 로돕신 키나아제(RhoK), 원뿔형 막대 호메오박스 포함 유전자(CRX), 신경 망막 특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황상 황반 이상증 2(VMD2), 티로신 히드록실라아제, 신경세포 특이적 에놀라아제(NSE) 프로모터, 성상세포 특이적 아교 섬유성 산성 단백질(GFAP) 프로모터, 인간 a1-항트립신(hAAT) 프로모터, 포스포에놀피루브산 카르복시키나아제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN-1 프로모터, WASP 프로모터, SV40/hA1b 프로모터, SV40/CD43, SV40/CD45, NSE/RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타아제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터와 같은 조직-특이적 프로모터들이 전사를 구동하기 위해 사용될 수 있다.
유전자의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 더 증가될 수 있다. 인핸서들은 상대적으로 방향 및 위치에 의존하지 않지만, CMV 초기 프로모터 인핸서 및 복제 기원의 후반 측(bp 100 내지 270)에서의 SV40 인핸서와 같이, 진핵 세포 바이러스로부터 인핸서가 사용될 수 있다. 인핸서는 프로모터로 대한 위치 5' 또는 3'에서 벡터에 접합될 수 있지만, 프로모터로부터 부위 5'에 바람직하게 배치된다.
프로모터는 적합한 표적 세포에서의 발현을 보장하거나 또는 증가시키는 특징들을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특징들은 보존 부위 예를 들어, 프리브노(Pribnow) 박스 또는 TATA 박스일 수 있다. 프로모터는 뉴클레오티드 서열의 발현 정도에 영향을 미치는(유지, 증강 또는 감소시키는 것과 같이) 다른 서열들을 포함할 수 있다. 적합한 다른 서열들은 Sh1 인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열들로는, 온도, 화학 물질, 빛 또는 스트레스 유도 요소들과 같은 유도 요소들을 포함한다. 또한, 전사 또는 번역을 증가시키기 위한 적합한 요소들이 존재할 수 있다.
형질전환유전자를 구동시키는, 조직-특이 프로모터를 포함하는, 구성적인 및/또는 강력한 프로모터가 바람직한 경우에, 그리고 특히, 생산 세포들에서의 형질전환유전자 단백질의 발현이 벡터 역가의 감소로 이어지고, 및/또는 형질전환유전자 유래 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체 내에서 면역 반응을 일으키는 경우에, RNA-결합 단백질과 결합 부위(예를 들어, TRAP-tbs) 상호 작용은 레트로바이러스 벡터들의 생산을 위한 형질전환유전자 단백질 억제 시스템에 대한 기초를 형성함에 있어서 유용할 수 있다. 도 4는 이것이 바람직한 형태로 적용될 수 있는 방법의 일 예를 표시한다.
패키징 서열
본 발명의 맥락 내에서 사용되는, "패키징 서열" 또는 "psi"로서 상호 교환적으로 언급되는 용어 "패키징 신호"는 바이러스 입자 형성 시 레트로바이러스 RNA 가닥들의 이입에 필요한 비-코딩의 cis-작용 서열과 관련하여 사용된다. HIV-1에서, 이러한 서열은 적어도 gag 시작 코돈으로 주요 접합 공여부(SD)의 업스트림으로부터 확장하는 loci에 매핑되었다. EIAV에서, 패키징 신호는 Gag의 5' 코딩 영역에 R 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "확장된 패키징 신호" 또는 "확장된 패키징 서열"은 gag 유전자로의 추가 확장으로 psi 서열 주변 서열들의 사용을 나타낸다. 이들 추가 패키징 서열들의 포함은 바이러스 임자들로의 벡터 RNA의 삽입의 효율을 증가시킬 수 있다.
게놈 mRNA의 5' 말단(R-U5)에서의 하나의 영역 및 gag의 근위 311 nt 내에 매핑된 다른 영역을 포함하는 고양이 면역 결핍 바이러스(FIV) RNA 이입 결정기들이 이산 및 비연속으로 도시되었다(Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995).
바이러스 벡터 생산 시스템 및 세포들
본 발명의 다른 양태는 벡터 게놈 서열이 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 벡터의 생산에 필요한 성분들을 인코딩하는 한 세트의 핵산 서열들을 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 생산 시스템" 또는 "벡터 생산 시스템" 또는 "생산 시스템"은 바이러스 벡터 생산을 위해 필요한 성분들을 포함하는 시스템으로 이해되어야 한다.
따라서, 벡터 생산 시스템은 바이러스 벡터 입자들을 생성하기 위해 필요한 성분들을 인코딩하는 한 세트의 핵산 서열들을 포함한다. 하나의 이러한 핵산 서열은 RNA-결합 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, RNA-결합 단백질은 박테리아 TRAP이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터 생산 시스템은 본 발명의 결합 부위를 포함하는 벡터 게놈 서열, 및 Gag 및 Gag/Pol 단백질, 및 Env 단백질을 인코딩하는 핵산 서열들, 또는 이들의 기능적 대체물들을 더 포함한다. 생산 시스템은 Rev 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템의 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래된다.
다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 구조체들에 관한 것이다. 이러한 DNA 구조체(예를 들어, 플라스미드)들은 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터 게놈 구조체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 RNA-결합 단백질, 예를 들어 TRAP를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 DNA 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 DNA 구조체들 및 Gag 및 Gag/Pol 단백질 및 Env 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체들, 또는 이들의 기능적 대체물들을 포함하는, 포함하는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에서 사용하기 위한 한 세트의 DNA 구조체들에 관한 것이다.
본 발명의 실시형태에서, 한 세트의 DNA 구조체들은 RNA-결합 단백질, 예를 들어 TRAP를 인코딩하는 DNA 구조체를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 한 세트의 DNA 구조체들은 Rev 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체 또는 이의 기능적 대체물을 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 DNA 구조체들의 일부 또는 전체를 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 생산 세포"는 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포로 이해되어야 한다. 바이러스 벡터 생산 세포들은 "생산자 세포들" 또는 "패키징 세포들"일 수 있다. 바이러스 벡터 시스템의 하나 이상의 DNA 구조체들은 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 에피솜으로 유지되거나 안정적으로 통합될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 시스템의 모든 DNA 성분들은 바이러스 벡터 생산 세포에 일시적으로 형질감염될 수 있다. 또 다른 대안에서, 성분들의 일부를 안정적으로 발현시키는 생산 세포는 남아있는 성분들에 의해 일시적으로 형질감염될 수 있다.
RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)을 인코딩하는 DNA 발현 카세트는 바이러스 벡터 생산 세포 내에 에피솜으로 유지되거나 안정적으로 통합될 수 있다. 대안적으로, RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)을 인코딩하는 DNA 발현 카세트는 바이러스 벡터 생산 세포에 일시적으로 형질감염될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 안정적으로 발현시킬 것이다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 일시적으로 발현시킬 것이다.
필요한 억제 수준은 NOI에 따라 달라질 수 있기 때문에, 생산 세포에서 필요한 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)의 수준도 NOI에 의존할 수 있다. 따라서, 일부 환경들에서, 안정적이고 일시적 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 발현의 조합이 바람직할 수 있다. 안정적인 발현은 생산 세포에서 RNA-결합 단백질 발현의 연속적인 수준을 제공할 수 있는 반면에, 일시적 발현은 더 짧은 기간, 증가된 수준의 RNA-결합 단백질 발현을 제공할 수 있다. 예를 들어, 더 문제가 많은/독성의 형질전환유전자들의 억제는 벡터 생산 시 (예를 들어, 안정적인 발현에 의해 제공되는) 기존의 및 높은 수준의 RNA-결합 단백질 모두로부터 혜택을 누릴 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 실시형태에서, 생산 세포들은 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 안정적으로 발현시키고, 또한 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 구조체를 일시적으로 발현시킬 것이다. 일시적 발현은 안정적인 발현에 의해 제공된 것보다 단기적으로 더 높은 수준의 RNA-결합 단백질 발현을 제공할 수 있다.
"안정적인 발현"에 따르면, 실질적으로 안정적인 발현을 제공하는 구조체로부터의 RNA-결합 단백질의 발현은 장기간에 걸쳐 달라지지 않는다는 것으로 이해해야 한다.
"일시적 발현"에 따르면, 일시적 발현을 제공하는 구조체로부터의 RNA-결합 단백질의 발현은 장기간에 걸쳐 안정적이지 않다는 것으로 이해해야 한다. 바람직하게, 일시적 발현을 위해 제공하는 RNA-결합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 생산 세포 게놈에 통합되지 않고, 생산 세포에 에피솜으로 유지되지 않는다.
본원에서 사용되는 용어 "패키징 세포"는 감염성 벡터 입자들의 생산에 필요한 요소들을 포함하지만, 벡터 게놈은 결여하는 세포를 의미한다. 전형적으로, 이러한 패키징 세포들은 (gag, gag/pol 및 env와 같은) 바이러스 구조 단백질을 발현시킬 수 있는 하나 이상의 발현 카세트들을 포함한다.
생산자 세포/패키징 세포들은 모든 적합한 세포 유형일 수 있다. 생산자 세포들은 일반적으로 포유 동물 세포이지만, 예를 들어, 곤충 세포들일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "생산자/생산 세포" 또는 "벡터 생산/생산 세포"는 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)의 발현, 및 레트로바이러스 벡터 입자들의 생산에 필요한 요소 모두를 포함하는 세포를 의미한다.
생산자 세포는 안정적인 생산자 세포주이거나 일시적으로 유래될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 외피 및 뉴클레오캡시드, RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP) 및, 존재한다면, rev 뉴클레오티드 서열들은 생산자 및/도는 패키징 세포에 모두 안정적으로 통합된다. 그러나, 이들 서열 중 하나 이상은 에피솜 형태로 또한 존재할 수 있고, 유전자 발현은 에피솜으로부터 발생할 수 있고, 또는 셍산 세포로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
벡터 생산 세포들은 조직 배양 세포주와 같이 시험관 내에서 배양된 세포들일 수 있다. 적합한 세포주들은 쥐의 섬유아세포 유래 세포주 또는 인간 세포주들과 같은 포유 동물 세포들을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 바람직하게, 벡터 생산 세포들은 인간 세포주로부터 유래된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 벡터들은 NOI, gag-pol 성분들, 외피 및 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)에 작동 가능하도록 연결된 본 발명의 결합 부위를 포함하는 벡터 게놈을 발현시키는 4개의 전사 유닛들을 이들의 생산 시스템으로서 사용한다. 외피 발현 카세트는 VSV-G와 같은 다수의 이종 외피들 중 하나를 포함할 수 있다. 선택적으로, rev 성분이 또한 포함될 수 있다.
바이러스 벡터 생산 방법(process)
본 발명의 다른 양태는 바이러스 벡터 생산 세포에 본 발명의 핵산 서열, 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 DNA 구조체들의 일부 또는 전체를 도입하는 단계 및 바이러스 벡터들의 생산에 적합한 조건 하에서 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는 바이러스 벡터들을 생산하는 방법(process)에 관한 것이다.
적합한 "생산 세포들"은 적절한 조건 하에서 배양될 때 바이러스 벡터들 또는 바이러스 벡터 입자들을 생산할 수 있는 생산 세포들이다. 그들은 일반적으로 포유 동물 또는 인간 세포들 예를 들어, HEK293T, HEK293, CAP, CAP-T 또는 CHO 세포들이지만, 예를 들어 SF9 세포들과 같은 곤충 세포들일 수 있다.
생산 세포들은 또한 조류 세포 예를 들어, EB66®(시그마) 세포들일 수 있다. 조류 세포들은 인간 및 가축병 바이러스 기반 백신들 예를 들어, 인플루엔자 및 뉴캐슬 질환 바이러스 백신들의 생산에 특히 유용할 수 있다.
생산 세포들에 핵산을 도입하기 위한 방법들은 당업계에 잘 알려져 있고, 이전에 설명하였다.
일 실시형태에서, 생산 세포는 RNA-결합 단백질(예를 들어, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, TRAP)을 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해, 본 발명의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하여, 또는 본 발명의 프로세스에 의해 생산되는 바이러스 벡터에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 바이러스 벡터 입자는 핵산 결합 부위를 포함한다. 바이러스 벡터 입자는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래될 수 있다. 레트로바이러스 벡터 입자는 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다. 렌티바이러스 벡터 입자는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래될 수 있다.
렌티바이러스 벡터들을 생성하기 위한 방법들 및 특히 렌티바이러스 벡터들의 처리 단계는 국제특허 제2009/153563호에서 설명된다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된 세포"는 바이러스 벡터 입자에 의해 운반된 핵산이 전달된 세포 특히 표적 세포로서 이해되어야 한다.
위형화 ( Pseudotyping )
하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터가 위형화되었다. 이와 관련하여, 위형화는 하나 이상의 장점들을 부여할 수 있다. 예를 들어, HIV 기반 벡터들의 env 유전자 생성물은 이들 벡터가 CD4라 불리는 단백질을 발현시키는 세포들만 감염시키도록 제한한다. 이들 벡터에서 env 유전자가 다른 외피가 있는 바이러스들로부터의 env 서열들로 치환되었다면, 그들은 더 넓은 감염 스펙트럼을 가질 수 있다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242). 예로서, 작업자들은 VSV로부터의 당단백질로 HIV 기반 벡터를 위형화했다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242).
다른 대안에서, env 단백질은 돌연 변이 또는 조작된 env 단백질과 같이 변형된 env 단백질일 수 있다. 변형들은 타겟 능력을 도입하기 위해 또는 독성을 감소시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 만들어지거나 선택될 수 있다(Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64; Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286; and Fielding et al (1998) Blood 91 (5): 1802-1809 and references cited therein).
벡터는 선택의 어느 한 분자로 위형화될 수 있다.
VSV-G
수포성 구내염 바이러스(VSV)의 외피 당단백질(G)인 라브도바이러스는 특정 외피가 있는 바이러스 및 바이러스 벡터 비리온들을 위형화할 수 있는 것으로 밝혀진 외피 단백질이다.
모든 레트로바이러스 외피 단백질들의 부재 하에서 MoMLV 기반 레트로바이러스 벡터들을 위형화하는 이의 능력은 Emi et al. (1991) Journal of Virology0 65: 1202-1207)에 의해 처음 밝혀졌다. 국제특허 제1994/294440호는 레트로바이러스 벡터들이 VSV-G로 성공적으로 위형화될 수 있음을 보여준다. 이들 위형화된 VSV-G 벡터는 다양한 포유 동물 세포를 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. 보다 최근에, Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361은 비-감염성 레트로바이러스 입자들이 VSV-G의 추가에 의해 감염될 수 있다는 것을 보여준다.
Burns et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7)은 VSV-G로 레트로바이러스 MLV를 성공적으로 위형화하였고, 이것은 이의 천연 형태에서의 MLV와 비교하여 변경된 호스트 범위를 갖는 벡터를 야기했다. VSV-G 위형화된 벡터들은 포유 동물 세포들뿐만 아니라 물고기, 파충류 및 곤충으로부터 유래된 세포주들을 감염시키는 것으로 나타났다(Burns et al. (1993) ibid). 또한, 그들은 다양한 세포주에 대한 전통적인 암포트로픽 외피들보다 더 효율적인 것으로 나타났다(Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :9564-9568, Emi et al. (1991) Journal of Virology 65: 1202-1207). VSV-G 단백질은 이의 세포질 꼬리가 레트로바이러스 코어들과 상호 작용할 수 있기 때문에 특정 레트로바이러스들을 위형화하기 위해 사용될 수 있다.
VSV-G 단백질과 같은 비-레트로바이러스 위형화 외피의 제공은 벡터 입자들이 감염성의 손실 없이 높은 역가로 농축될 수 있다는 장점을 제공한다(Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5). 레트로바이러스 외피 단백질들은, 아마도 그들이 두 개의 비공유적으로 연결된 서브유닛들로 구성되어 있기 때문에, 분명히 초원심분리 시 공유하는 힘들을 견딜 수 없다. 서브유닛들 간의 상호 작용은 원리분리에 의해 방해받을 수 있다. VSV 당단백질이 단일 유닛으로 구성된다는 것과 비교하여, VSV-G 단백질 위형화는 따라서 잠재적인 장점들을 제공할 수 있다.
국제특허 제2000/52188호는 막 관련 바이러스 외피 단백질로서 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G)를 갖는, 안정적인 생산자 세포주들로부터의, 위형화된 레트로바이러스 벡터들의 생성을 설명하고, VSV-G 단백질에 대한 유전자 서열을 제공한다.
로스 리버 (Ross River) 바이러스
로스 리버 바이러스 외피는 비영장류 렌티바이러스 벡터(FIV)를 위형화하기 위해 사용되었고, 다음의 전신 투여는 대부분 간을 형질도입했다(Kang et al (2002) J Virol 76(18):9378-9388). 효율은 VSV-G 위형화된 벡터로 획득되는 것보다 20배 크다고 보고되었고, 간독성을 연상시키는 간 효소들의 혈청 농도에 의해 측정된 것보다 세포독성을 덜 야기했다.
바큐로바이러스 GP64
바큐로바이러스 GP64 단백질은 임상적 및 상업적 어플리케이션들에 필요한 높은 역가의 바이러스의 대량 생산들에 사용되는 바이러스 벡터들을 위한 VSV-G에 대한 대안이 되는 것으로 나타났다(Kumar M. Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77). VSV-G 위형화된 벡터들과 비교하여, GP64 위형화된 벡터들은 유사한 넓은 굴성 및 유사한 천연 역가들을 갖는다. GP64 발현은 세포들을 죽이지 않기 때문에, GP64를 구조적으로 발현시키는 293T 기반 세포주들이 생성될 수 있다.
대안적인 외피
EIAV를 위형화하기 위해 사용될 때 합리적인 역가를 제공하는 다른 외피들은 모콜라, 광견병 및 LCMV(림프구성 맥락 수막염 바이러스)를 포함한다. 4070A로 위형화된 렌티바이러스의 마우스로의 정맥 주입은 간에서 최대한의 유전자 발현으로 이어진다.
폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드들은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 그들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 많은 상이한 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 퇴화의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다는 것를 당업자는 이해할 것이다. 또한, 당업자들은 일상적인 기술들을 사용하여, 본 발명의 폴리펩티드들이 발현되어야 하는 모든 특정 호스트 유기체의 코돈 사용을 반영하기 위해 본 발명의 폴리뉴클레오티드들에 의해 인코딩된 폴리펩티드 서열에 영향을 미치지 않는 뉴클레오티드 대체물을 만들 수 있다는 것을 이해해야 한다.
폴리뉴클레오티드들은 당업계에서 이용 가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
DNA 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드들은 재조합에 의해, 합성에 의해, 또는 당업자가 이용 가능한 모든 수단에 의해 생산될 수 있다. 또한, 그들은 표준 기술들에 의해 복제될 수 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드들은 일반적으로 재조합 수단을 사용하여 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 복제 기술들을 사용하여 생산될 것이다. 이것은 복제하고자 하는 표적 서열을 측면 배치하는 (예를 들어, 약 15 내지 40개의 뉴클레오티드의) 한쌍의 프라이머를 만드는 단계, 동물 또는 인간 세포로부터 획득한 mRNA 또는 cDNA에 프라이머들을 접촉시키는 단계, 원하는 영역의 증폭을 초래하는 조건 하에서 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 단계, (예를 들어, 아가로오스 겔과의 반응 혼합물을 정제하여) 증폭된 단편들을 분리하는 단계, 및 증폭된 DNA를 회수하는 단계를 포함할 것이다. 프라이머들은 증폭된 DNA가 적합한 벡터 내로 복제될 수 있도록 적합한 제한 효소 인식 부위들을 포함하도록 설계될 수 있다.
단백질
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 각각의 구성 폴리펩티드들이 공유 또는 비공유 수단에 의해 연결되는 다중 폴리펩티드 복합체들뿐만 아니라 단일 사슬 폴리펩티드 분자들을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 모노머들이 아미노산들이고 펩티드 또는 이황화 결합을 통해 함께 연결된 고분자를 의미한다.
변이체 , 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본원에서 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드 이외에, 본 발명은 이들의 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 사용을 또한 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 어느 주어진 서열의 변이체는 (아미노산 잔기이든 핵산 잔기이든) 잔기들의 특정 서열이 문제의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 내생 기능들 중 적어도 하나를 보유하는 방식으로 변형되었다. 변이체 서열은 자연적으로 발생하는 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 추가, 삭제, 치환, 수정, 교체 및/또는 변형에 의해 획득될 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유도체"는 결과로서 생기는 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내생 기능들 중 적어도 하나를 보유하는 서열로부터의 또는 서열에 대한 하나 (또는 그 이상)의 아미노산 잔기들의 치환, 변형, 수정, 교체, 삭제 및/또는 추가를 포함한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 본원에서 사용되는 용어 "유사체"는 모든 모방체 즉, 모방되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내생 기능들 중 적어도 하나를 소유하는 화합물을 포함한다.
전형적으로, 아미노산 치환체들은 수정된 서열이 필요한 활성 또는 능력을 유지한다면 예를 들어, 1개, 2개 또는 3개 내지 10개 또는 20개의 치환체까지 제조될 수 있다. 아미노산 치환체들은 비-자연적으로 발생하는 유사체들의 사용을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 단백질들은 침묵(silent) 변화를 초래하는 아미노산 잔기들의 삭제, 삽입 또는 치환을 가질 수 있고, 기능적으로 동일한 단백질을 초래할 수 있다. 계획적인 아미노산 치환체들은 내생 기능이 유지되는 한 잔기들의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성에서의 유사성에 기초하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산들은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산들은 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산들은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
보존적 치환체들은 예를 들어, 아래의 표에 따라 제조될 수 있다. 제 2 열의 동일한 블럭 및 바람직하게 제 3 열의 동일한 라인의 아미노산들은 서로 치환될 수 있다:
Figure 112016068192074-pct00001
용어 "동족체"는 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과 특정 상동성을 갖는 개체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
본 맥락에서, 상동 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일, 바람직하게 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하도록 취해진다. 전형적으로, 동족체들은 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능들을 갖는 아미노산 잔기들) 측면에서 고려될 수도 있지만, 본 발명의 맥락에서는 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 맥락에서, 상동 서열은 대상 서열과 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일, 바람직하게 적어도 95% 또는 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 취해진다. 상동성은 유사성 측면에서 고려될 수도 있지만, 본 발명의 맥락에서는 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 육안으로, 또는 더 일반적으로, 쉽게 이용할 수 있는 서열 비교 프로그램들의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 시판되는 컴퓨터 프로그램들은 두 개 이상의 서열 간의 상동성 또는 동일성 퍼센트를 계산할 수 있다.
상동성 퍼센트는 연속적인 서열들을 통해 계산될 수 있다 즉, 하나의 서열이 다른 서열로 정렬되고, 한 번에 하나의 잔기씩, 하나의 서열의 각각의 아미노산이 다른 서열의 대응하는 아미노산과 직접 비교된다. 이것은 "갭이 없는" 정렬이라 불린다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬들은 상대적으로 짧은 잔기 수에 대해서만 수행된다.
이것은 매우 단순하고 일관된 방법이지만, 예를 들어, 다른 동일한 서열들의 쌍에서는, 뉴클레오티드 서열에서의 하나의 삽입 또는 삭제가 다음의 코돈들이 정렬되지 못하도록 함으로써, 글로벌 정렬이 수행될 때 잠재적으로 상동성 퍼센트를 크게 감소시킬 수 있다는 것을 고려하지 못하게 된다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법들은 전체 상동성 스코어를 지나치게 불리하게 만들지 않으면서 가능한 삽입 및 삭제들을 고려하는 최적의 정렬들을 생산하도록 설계된다. 이것은 로컬 상동성을 극대화하기 위해 시도하는 서열 정렬에 "갭들"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 더 복잡한 방법들은 동일한 개수의 동일한 아미노산의 경우, 두 개의 비교되는 서열들 간의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭들을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 서열 정렬보다 높은 스코어를 달성하도록 정렬에서 발생하는 각각의 갭에 "갭 패널티"를 할당한다. 전형적으로, 갭의 존재에 대한 상대적으로 높은 비용 및 갭의 각각의 후속 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부과하는 "아핀 갭 비용"이 사용된다. 이것은 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어 시스템이다. 높은 갭 패널티는 물론 더 적은 갭을 갖는 최적화된 정렬들을 생산할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램들은 갭 패널티가 수정되는 것을 허용한다. 그러나, 서열 비교를 위해 이러한 소프트웨어를 사용할 때는 디폴트 값들을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG 위스콘신 최적합 패키지를 사용할 때, 아미노산 서열들에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해서는 -12이고 각각의 확장에 대해서는 -4이다.
따라서, 최대 상동성 퍼센트 계산은 갭 패널티를 고려한 최적의 정렬의 생산을 우선 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기에 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 최적합 패키지(University of Wsconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387)이다. 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예로는 BLAST 패키지(Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18 참조), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 비교 도구들의 GENEWORKS 제품군이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. BLAST 및 FASTA 모두는 오프라인 및 온라인 검색을 사용할 수 있다(Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60 참조). 그러나, 일부 어플리케이션의 경우, GCG 최적합 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 단백질 및 뉴클레오티드 서열들을 비교하기 위해 BLAST 2 서열이라 불리는 다른 도구를 또한 사용할 수 있다(FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1): 187-8 참조).
최종 상동성 퍼센트는 동일성 측면에서 측정될 수 있지만, 정렬 프로세스 자체는 전형적으로 양단간의 쌍 비교를 기반으로 하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 하여 각각의 쌍 비교에 스코어를 할당하는 스케일된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 일 예는 프로그램의 BLAST 제품군의 디폴트 매트릭스인 BLOSUM62 매트릭스이다. 일반적으로, GCG 위스콘신 프로그램들은 일반적으로 공공 디폴트 값 또는 제공된 경우 사용자 정의 심볼 비교표(추가 상세 설명은 사용자 메뉴얼 참조)를 사용한다. 일부 어플리케이션의 경우, GCG 패키지에 대해서는 공공 디폴트 값을, 또는 다른 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 사용하는 것이 바람직하다.
일단 소프트웨어가 최적의 할당을 생산하면, 상동성 퍼센트, 바람직하게 서열 동일성 퍼센트를 계산하는 것이 가능하다. 전형적으로, 소프트웨어는 서열 비교의 일부로서 이것을 수행하고 수치 결과들을 생성한다.
"단편들"도 변이체이고, 전형적으로, 상기 용어는 기능적으로 또는 예를 들어, 분석에서 관심있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 나타낸다. 따라서, "단편"은 전체 길이의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 나타낸다.
이러한 변이체들은 부위 특이적 돌연변이 유도와 같은 표준 재조합 DNA 기술들을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어지는 경우, 삽입 부위의 양측에 자연적으로 발생하는 서열에 대응하는 5' 및 3' 측부 영역(flanking region)과 함께 삽입을 인코딩하는 합성 DNA가 제조될 수 있다. 측부 영역들은 서열이 적절한 효소(들)로 절단되고, 합성 DNA가 절단 내에 결찰될 수 있도록 자연적으로 발생하는 서열의 부위들에 대응하는 편리한 제한 부위들을 포함할 것이다. 이후, 인코딩된 단백질을 만들기 위해 본 발명에 따라 DNA가 발현된다. 이들 방법은 단지 DNA 서열들의 조작을 위해 당업계 알려진 많은 표준 기술들의 실례이고, 다른 알려진 기술들이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 RNA-결합 단백질의 모든 변이체, 단편 또는 동족체들은 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 본 발명의 동족 결합 부위를 결합하는 능력을 유지할 것이다.
본 발명의 결합 부위의 모든 변이체, 단편 또는 동족체들은 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 동족 RNA-결합 단백질을 결합하는 능력을 유지할 것이다.
코돈 최적화
(벡터 생산 시스템의 NOI 및/또는 성분들을 포함하여) 본 발명에서 사용된 폴리뉴클레오티드들은 코돈 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 국제특허 제1999/41397호 및 국제특허 제2001/79518호에서 이전에 설명되었다. 상이한 세포는 이들의 특정 코돈 사용빈도가 상이하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 존재비의 편향에 대응한다. 서열에서 코돈을 변경하여 해당 tRNA의 상대적 존재비와 일치하도록 코돈들을 조정함으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 같은 이유에서, 해당 tRNA들이 특정 세포 유형에서 드문 것으로 알려져 있는 코돈들을 의도적으로 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가적인 어느 정도의 번역 제어가 가능하다.
HIV 및 다른 렌티바이러스들을 포함하는 많은 바이러스들은 다수의 희귀한 코돈들을 사용하고, 일반적으로 사용되는 포유 동물 코돈들에 대응하는 코돈을 변경함으로써, 포유 동물 생산자 세포들에서의 관심의 유전자 예를 들어, NOI 또는 패키징 성분들의 발현 증가를 달성할 수 있다. 다양한 다른 유기체들뿐만 아니라 포유 동물 세포들에 대한 코돈 사용빈도 표는 당업계에 알려져 있다.
바이러스 벡터 성분들의 코돈 최적화는 많은 다른 장점들을 갖는다. 이들의 서열 변경에 의해서, 생산자 세포/패키징 세포들에서 바이러스 입자들의 어셈블리에 필요한 바이러스 입자들의 패키징 성분들을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열들은 그들로부터 제거된 RNA 불안정 서열(INS)들을 갖는다. 동시에, 서열들에 의해 인코딩된 바이러스 성분들이 동일하게 유지되거나, 적어도 패키징 성분들의 기능이 이 손상되지 않을 만큼 충분히 유사하게 유지되도록, 패키징 성분들에 대한 아미노산 서열 코딩 서열이 유지된다. 렌티바이러스 벡터들에서, 코돈 최적화는 Rev에 의존하지 않는 최적화된 서열들을 렌더링하는, 엑스포트에 대한 Rev/RRE 요건을 또한 극복한다. 또한, 코돈 최적화는 벡터 시스템 내의 상이한 구조체들 간의(예를 들어, gag-pol 및 eni/ 개방 판독 프레임들의 중첩 영역들 사이에서) 상동 재조합을 감소시킨다. 따라서, 코돈 최적화의 전체적인 효과는 바이러스 역가의 주목할만한 증가 및 개선된 안전성이다.
일 실시형태에서, INS에 관한 코돈들만 코돈 최적화된다. 그러나, 훨씬 더 바람직하고 실질적인 실시형태에서, 서열들은 일부 예외 예를 들어, gag-pol의 프레임시프트 부위를 포괄하는 서열(아래 참조)을 제외하고, 서열 전부가 코돈 최적화된다.
gag-pol 유전자는 gag-pol 단백질들을 인코딩하는 두 개의 중첩된 판독 프레임을 포함한다. 양쪽 단백질의 발현은 번역 시 프레임시프트에 의존한다. 이러한 프레임시프트는 번역 시 리보솜 "미끄러짐(slippage)"의 결과로서 발생한다. 이러한 미끄러짐은 리보솜-스톨링 RNA 이차 구조들에 의해 적어도 부분적으로 야기될 것으로 생각된다. 이러한 이차 구조들은 gag-pol 유전자에서 프레임시프트 부위의 다운스트림에 존재한다. HIV의 경우, 중첩 영역은 (뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A인) gag 시작의 다운스트림 뉴클레오티드 1222로부터 gag의 끝(nt 1503)까지 연장된다. 결과적으로, 두 개의 판독 프레임의 중첩 영역 및 프레임시프트 부위를 가로지르는 281 bp 단편은 바람직하게 코돈 최적화되지 않는다. 이러한 단편을 유지하는 것은 Gag-Pol 단백질들의 더욱 효율적인 발현을 가능하게 할 것이다.
EIAV의 경우, nt 1262가 되도록 중첩의 시작이 취해졌다(여기서, 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A이다). 중첩의 끝은 1461 bp에 있다. 프레임시프트 부위 및 gag-pol 중첩이 보존된다는 것을 보장하기 위해, 야생형 서열이 nt 1156에서 nt 1465까지 유지되었다.
예를 들어, 편리한 제한 부위들을 수용하기 위해 최적의 코돈 사용빈도로부터의 파생물들이 만들어질 수 있고, 보존적 아미노산 변화가 Gag-Pol 단백질에 도입될 수 있다.
일 실시형태에서, 코돈 최적화는 약간 발현된 포유 동물 유전자들을 기반으로 한다. 제 3 및 때때로는 제 2 및 제 3 염기가 변경될 수 있다.
유전 코드의 퇴보하는 특성으로 인해, 많은 gag-pol 서열들이 숙련된 작업자에 의해 달성될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 코돈 최적화된 gag-pol 서열을 생성하기 위한 시작 지점으로 사용될 수 있는 설명된 많은 레트로바이러스 변이체들이 존재한다. 렌티바이러스 게놈들은 상당히 가변적일 수 있다. 예를 들어, 여전히 기능적인 HIV-1의 많은 유사 종들이 존재한다. 이것은 또한 EIAV의 경우이다. 이들 변이체는 형질도입 프로세스의 특정 부분들을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. HIV-1 변이체들의 예는 http://hiv-web.lanl.gov에서 로스 알라모스 국가 안보부(LLC)에 의해 운영되는 HIV 데이터베이스들에서 발견될 수 있다. EIAV 클론들의 세부 사항은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 있는 국립생명공학정보센터(NCBI) 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
코돈 최적화된 gag-pol 서열들에 대한 전략은 모든 레트로바이러스와 관련하여 사용될 수 있다. 이것은 EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMR, SIV, HIV-1 및 HIV-2를 포함하여 모든 렌티바이러스에 적용된다. 또한, 이러한 방법은 HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV 및 인간 내생 레트로바이러스(HERV), MLV 및 다른 레트로바이러스들로부터 유전자들의 발현을 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
코돈 최적화는 gag-pol 발현을 Rev-비의존적인 것으로 만들 수 있다. 그런데, 렌티바이러스 벡터에서 anti-rev 또는 RRC 인자의 사용을 가능하도록 하기 위해서는, 바이러스 벡터 생성 시스템을 완전히 Rev/RRE-비의존적인 것으로 만들어야 할 필요가 있다. 따라서, 게놈이 또한 수정될 필요가 있다. 이것은 벡터 게놈 성분들을 최적화함으로써 달성된다. 유리하게, 이들 수정은 생산자 및 형질도입된 세포모두에서 모든 추가 단백질들이 없는 안전 시스템의 생산으로 또한 이어진다.
용도
본 발명의 다른 양태는 의약에의 사용을 위한 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직의 의약으로의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 관심의 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하는 약제의 제조를 위한 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 생산 세포, 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포의 이러한 용도들은 전술한 바와 같이 치료 또는 진단 목적을 위한 것일 수 있다.
치료 벡터
레트로바이러스 치료 벡터
일 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 파킨슨병을 치료하기 위해 도파민 합성 경로의 세 가지 효소를 인코딩하는 세 가지 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자들은 (TH의 피드백 조절에 관여하는 N-말단의 160개 아미노산이 부족한) 인간 티로신 수산화효소(TH*) 유전자, 인간 방향족 L-아미노산 디카르복실라아제(AADC), 및 인간 GTP-시클로히드로라아제 1(CH1) 유전자의 절단된 형태를 포함할 수 있다. 세 가지 효소는 세 개의 별도의 개방 판독 프레임에서 레트로바이러스 벡터에 의해 인코딩될 수 있다. 대안적으로, 레트로바이러스 벡터는 제 2 개방 판독 프레임에서 AADC 효소 및 제 1 개방 판독 프레임에서 TH 및 CH1 효소의 융합을 인코딩할 수 있다. 유전자들의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 발현 카세트는 하나 이상의 IRES 요소를 포함할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 뇌의 선상체 내로 직접 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피(RRE) 세포들을 지원하고, 광수용체들에 교정 MY07A 유전자를 도입하기 위해 설계된 유전자 치료 생성물로서 사용될 수 있기 때문에, 어셔 1B 증후군과 관련된 시력 저하를 감쇠 또는 반전시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 MY07A 단백질(길이가 100mb 이상인 큰 유전자)을 코딩하는 MY07A cDNA이다. 큰 MY07A 유전자의 발현은 CMV 프로모터, CMV/MY07A 키메라 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접적인 망막밑으로 직접 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 광수용체에 교정 ATP 결합 카세트 유전자인 ABCA4(ABCR로도 알려짐)를 도입함으로써, 스타르가르트병으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 ABCA4 단백질을 코딩하는 ABCA4 cDNA이다. ABCA4 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나아제와 같은 광수용체-특이적 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형(wet-form) 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형(dry-form) 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관형성 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현시킨다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성 환자들의 눈에서 부종의 비정상적인 혈관 성장의 재발을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관생성 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현시킨다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 이식하기 이전에 기증자의 각막으로의 항-혈관형성 유전자(들)의 전달에 의한 신혈관 형성의 결과로서 각막 이식 거부를 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G, 에볼라 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 각막 이식에 대한 체외 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자들과 같은 항-혈관형성 유전자(들)을 발현시킬 것이다. 레트로바이러스 벡터는 체외 각막 이식 조직에 적용될 수 있고, 형질도입된 기증자의 조직은 또한 이식하기 이전에 보관될 수 있다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터와 같은 구성적인 프로모터에 의해 구동될 수 있지만, 대안적인 프로모터가 사용될 수 있다는 것도 가능하다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 fms류의 티로신 키나아제의 가용성 형태를 인코딩하는 유전자(가용성 Flt-1)를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 가용성 Flt-1 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 색소 상피 유래 인자 단백질(PEDF)을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. PEDF 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 항-VEGF 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제자, VEGF 특이적 앱타머, 또는 VEGF 수용체의 가용성 형태를, 국한되지는 않지만, 포함하는 VEGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드 및/또는 항-PDGF 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)의 억제자, PDGF 특이적 앱타머, 또는 PDGF 수용체의 가용성 형태를, 국한되지는 않지만, 포함하는 PDGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 PDGF의 억제제 및 VEGF 의 억제제를 발현시킨다. 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 교정 노른자모양 황반 이영양증 2(VMD2) 및 VMD2의 질환 관련 형태에 대해 특이적인 miRNA를 인코딩하는 카세트, 또는 RDS 유전자를 인코딩하는 교정 페리페린 2 및 RDS의 질환 관련 형태에 대해 특이적인 miRNA를 인코딩하는 카세트를 도입함으로써, 베스트 질환 또는 베스트 노른자모양 황반 변성(BVMD)으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자들의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 교정 레틴알데히드 결합 단백질 1 유전자(RLBP1)를 도입함으로써, RLBP1 관련 망막 이영양증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 RLBP1 단백질을 코딩하는 RLBP1 cDNA이다. RLBP1 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 녹내장을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 백터는 안압을 감소시키기 위해 작용하는 COX-2 및/또는 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR)를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 전안방에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 COX-2 및 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR) 유전자를 발현시킨다. 유전자(들)의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 각막횡단 주사로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 어셔 증후군 1c로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 하르모닌 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 하르모닌 단백질을 코딩하는 하르모닌 cDNA이다. 하르모민 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 맥락막 결여로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 Rab 에스코트 단백질1(REP1) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 REP1 단백질을 코딩하는 REP1 cDNA이다. REP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 색맹으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 시클릭 뉴클레오티드 게이트 채널 베타 2(CNGB2) 및/또는 시클릭 뉴클레오티드 게이트 채널 알파 3(CNGA3) 유전자(들)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자(들)은 CNGB2 및/또는 CNGA3 단백질을 코딩하는 CNGB2 및/또는 CNGA3 유전자(들)이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후에 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 레버 선천성 흑내장(LCA)으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 CEP290 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 290 kDa의 중심체 단백질을 코딩하는 CEP290 유전자이다. CEP290 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 x 염색체 연관 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 색소성 망막염 GTP가수분해효소 조절(RPGR) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 RPGR 단백질을 코딩하는 RPGR cDNA이다. RPGR 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 x 염색체 연관 망막분리증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 RS1(retinoschisin 1) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 RS1 단백질을 코딩하는 RS1 cDNA이다. RS1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 색소성 망막염 1(RP1) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 RP1 단백질을 코딩하는 RP1 cDNA이다. RP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나아제와 같은 광수용체-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 레버 선천성 흑내장(LCA) 유형2로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 RPE65 단백질을 코딩하는 RPE65 cDNA이다. RPE65 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE 특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD). 건성형 AMD, 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 인간 프롤린/아르기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복 단백질(PRELP) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자는 PRELP 단백질을 코딩하는 PRELP cDNA이다. PRELP 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 마이오실린의 발현을 녹다운시킴으로써 청소년 개방각 녹내장으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 합성 마이오실린-특이적 miRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 합성 마이오실린-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 유전자 증가 및/또는 녹-다운에 의해 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 글루타티온 생합성 경로, 글루타민산 시스테인 리가아제(GCL) 및/또는 글루타티온 합성효소(GSS)로부터의 속도 제한 효소(들), 및/또는 합성 감마 글루타밀전달효소(GGT) 특이적 miRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. GCL 및/또는 GSS 유전자(들) 및/또는 합성 GGT-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 멀티시스트론 구성에서 유전자(들) 및/또는 합성 miRNA를 발현시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 전안방에 직접 전달하는 것에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 전측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병과 같은 신경퇴행성 질환 및 루게릭병(ALS)과 같은 운동 신경 질환들을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 아이소폼, 또는 신경보호 효과를 갖는 유전자들과 같은 VEGF-B, VEGF-C, 또는 VEGF-D일 수 있는 VEGF 단백질을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 광견병 G 또는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 척추강내 또는 심실내 주사를 통해 뇌척수액에 직접 주사하거나 대근군에 직접 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 낭포성 섬유증을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절제(CFTR)를 인코딩하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 Flu-HA, 센다이 바이러스 외피 F 또는 HN, 에볼라, 바큐로바이러스 GP64, 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 폐로의 기관지 폐포 세척요법을 통한 직접 전달에 의해 또는 분무기의 사용에 의해 비강내로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 산필리포 증후군 A로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 뇌에 교정 N-설포글루코사민 설포히드롤라아제(SGSH) 및/또는 설파타아제 변경 인자 1(SUMF1) 유전자(들)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 운반된 유전자(들)은 SGSH 단백질을 코딩하는 SGSH cDNA 및/또는 SUMF1 단백질을 코딩하는 SUMF1 유전자이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 실시형태에서, 레트로바이러스 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 SGSH 및 SUMF1 유전자를 발현시킬 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 직접적인 대뇌내 주사에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 폼페병으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 대근군 및/또는 폐에 교정 산성-알파 글리코시다아제(GAA) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 레트로바이러스 벡터는 GAA 단백질을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 레트로바이러스 벡터는 Flu-HA, 센다이 바이러스 외피 F 또는 HN, 에볼라, 바큐로바이러스GP64, 광견병 G, VSV-G, 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 i) 대근군에 직접 주사하여, 및/또는 ⅱ) 분무기를 사용하여 비강내로, 또는 폐로의 기관지 폐포 세척요법을 통한 직접 전달에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 CD19-특이적 키메라 항원 수용체(CAR19)를 인코딩하는 핵산 서열로 자가 또는 동종 T 세포를 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 T 세포는 CD19를 발현시키는 암 및 백혈병을 치료하기 위해 대상에 주입된다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 핵산 서열을 인코딩하는 CAR의 발현은 EF1α, CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 5T4-특이적 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열로 자가 또는 동종 T 세포들을 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 T 세포들은 5T4를 발현시키는 암 및 백혈병을 치료하기 위해 대상에 주입된다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 5T4 CAR 인코딩 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
당업자들에게 알려진 바와 같이, 다양한 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드에 대해 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)들이 생산될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 모든 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드에 대해 특이적인 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열로 자가 또는 동종 T 세포들을 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, CAR이 결합하는 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드를 발현시키는 암 및 백혈병을 치료하기 위해 이들 형질도입된 T 세포들이 대상에 주입된다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. CAR 인코딩 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 상기 CAR들의 표적이 될 수 있는 적합한 암 또는 백혈병 관련 폴리펩티드들은 다음의 메소텔린, 엽산 수용체α, 면역글로불린의 카파 경쇄, CD30, 암배아 항원(CEA), CD138, 강글리오시드 G2(GD2), CD33, CD22, EGFR Ⅷ과 같은 표피 성장 인자 수용체(EGFR), IL-13Rα2, CD20, Her2와 같은 ErbB, 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 루이스 Y 항원 및 섬유아세포 활성화 단백질(FAB)이 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 병에 걸린 세포, 백혈병 세포 또는 암 세포에 발현된 펩티드-MHC에 대해 특이적인 T 세포 수용체(TCR)를 인코딩하는 핵산 서열로 자가 또는 동족 T 세포를 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, TCR이 결합하는 펩티드-MHC의 발현과 관련되는 질병, 암 또는 백혈병을 치료하기 위해 이들 형질도입된 T 세포가 대상에 주입된다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. TCR 인코딩 핵산 서열의 발현은 EF1α, CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 벡터들에 의해 인코딩되는 TCR은 단일 사슬 TCR(scTCR) 또는 이량체 TCR(dTCR)일 수 있다. 당업자들에게 알려진 바와 같이, 적합한 dTCR들은 국제특허 제2003/020763호에 기술된 것들을 포함하고, 적합한 scTCR들은 국제특허 제1999/018129에 기술된 것들을 포함한다. 본 실시형태의 특정 양태들에서, TCR로 형질감염된 T 세포들은 AIDs, 백혈병, 및 림프종 및 육종을 포함하는 암들을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 x 염색체 연관 중증 복합형 면역부전증(SCID)을 치료하기 위해 일반 감마 사슬(CD132)을 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포들을 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 골수 줄기 세포들은 질병을 치료하기 위해 대상에 주입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 ADA 중증 복합형 면역 부전증(SCID)을 치료하기 위해 아데노신 디아미나아제를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포들을 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 골수 줄기 세포들은 질병을 치료하기 위해 대상에 주입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 위스콧 알드리치 증후군(WAS)을 치료하기 위해 WAS 단백질을 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 골수 줄기 세포들은 질병을 치료하기 위해 대상에 주입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 겸상적혈구병 또는 지중해 빈혈을 치료하기 위해 야생형 β-글로빈, 야생형 태아 글로빈, 및 돌연변이된 "항-겸상적혈구" 글로빈을 포함하는 여러가지 글로빈들 중 하나를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 당업자들에게 알려진 바와 같이, 항-겸삼적혈구 글로빈의 예들은 국제특허 제2014/043131호 및 국제특허 제1996/009385호에서 기술된 것들을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 골수 줄기 세포를 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 골수 줄기 세포들은 질병을 치료하기 위해 대상에 주입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 혈우병 A를 치료하기 위해 간, 근육 또는 지방 세포에 교정 유전자인 제 8 인자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자는 제 8 인자이다. 제 8 인자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 혈우병 B를 치료하기 위해 간, 근육 또는 지방 세포에 교정 유전자인 제 9 인자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자는 제 9 인자이다. 제 9 인자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 파브리병을 치료하기 위해 알파 갈락토시다아제A(α-GAL A)를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자는 α-GAL A 단백질을 코딩하는 GLA cDNA이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 조혈 CD34+ 줄기 세포들을 형질도입하기 위해 체외에서 사용될 수 있다. 이후, 이들 형질도입된 조혈 CD34+ 줄기 세포들은 질병을 치료하기 위해 대상에 주입될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 포르피린증의 형태를 치료하기 위해 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자는 아래 표에서 선택된 치료될 포르피린증의 유형과 관련된 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure 112016068192074-pct00002
다른 실시형태에서, 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 점액다당류증의 형태를 치료하기 위해 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 VSV-G 또는 대안적인 바이러스 외피 단백질로 위형화될 수 있는 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래된 비-복제, 자기-불활성의 최소 렌티바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 벡터에 의해 전달된 유전자는 아래 표에서 선택된 치료될 점액다당류증의 유형과 관련된 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure 112016068192074-pct00003
레트로바이러스 치료 벡터들의 생산
본 발명의 레트로바이러스 벡터들은 다음의4 가지 플라스미드에 의한 HEK293T 세포들의 일시적 형질감염에 의해 생산될 수 있다.
(1) RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위 및 필요한 형질전환유전자(들)을 인코딩하는 재조합 레트로바이러스 벡터 게놈 플라스미드
(2) 합성 레트로바이러스 gag/pol 발현 플라스미드
(3) 예를 들어, VSV-G를 발현시킬 수 있는 외피(env) 발현 플라스미드
(4) RNA-결합 단백질 발현 플라스미드
대안적으로, HIV와 같은 본 발명의 레트로바이러스 벡터들은 다음의 5 가지 플라스미드에 의한 HEK293T 세포들의 일시적 형질감염에 의해 생산될 수 있다.
(1) 필요한 형질전환유전자(들), RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위, 및 RRE 서열을 인코딩하는 재조합 HIV 벡터 게놈 플라스미드
(2) 합성 gag/pol 발현 플라스미드
(3) 예를 들어, VSV-G를 발현시킬 수 있는 외피(env) 발현 플라스미드
(4) RNA-결합 단백질 발현 플라스미드
(5) REV 발현 플라스미드
대안적으로, 일시적 형질감염 시스템은 본 발명의 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP)을 안정적으로 발현시키는 세포주를 이용할 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터들은 (1) gag/pol, (2) env, 및 (3) RNA-결합 단백질 및 HIV 벡터들의 경우에는 Rev를 안정적으로 발현시키는 패키징 세포들을 사용함으로써 생산될 수 있고, HIV 벡터들의 경우에는 RRE 서열을 포함하고, RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위 및 필요한 형질변환유전자(들)을 인코딩하는 재조합 레트로바이러스 벡터 게놈을 인코딩하는 플라스미드가 일시적 형질감염에 의해 이러한 세포들에 도입된다.
대안적으로, 본 발명의 레트로바이러스 벡터들은 (1) gag/pol, (2) env, (3) RNA-결합 단백질, (4) RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위 및 필요한 형질전환유전자(들)을 인코딩하는 재조합 EIAV 벡터 게놈을 안정적으로 발현시키는 생산자 세포들에서 생산될 수 있다.
대안적으로, 본 발명의 HIV 벡터들은 (1) gag/pol, (2) env, (3) RNA-결합 단백질, (4) 필요한 형질전환유전자(들), RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위, 및 RRE 서열을 인코딩하는 재조합 HIV 벡터 게놈, 및 (5) REV를 안정적으로 발현시키는 생산자 세포들에서 생산될 수 있다.
AAV 치료 벡터
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV는 파킨슨병을 치료하기 위해 도파민 합성 경로의 세 가지 효소를 인코딩하는 세 가지 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자들은 (TH의 피드백 조절에 관여하는 N 말단의 160개 아미노산이 부족한) 인간 티로신 수산화효소(TH*) 유전자, 인간 방향족 L-아미노산 디카르복실라아제(AADC), 및 인간 GTP-시클로히드로라아제1(CH1) 유전자의 절단된 형태를 포함할 수 있다. 세 가지 효소들은 세 개의 별도의 개방 판독 프레임에서 AAV 벡터에 의해 인코딩될 수 있다. 대안적으로, AAV 벡터는 제 2 개방 판독 프레임에서 AADC 효소 및 제 1 개방 판독 프레임에서 TH 및 CH1 효소의 융합을 인코딩할 수 있다. 유전자들의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 발현 카세트는 하나 이상의 IRES 요소를 포함할 수 있다. AAV 벡터는 뇌의 선상체에 직접 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 망막 색소 상피(RPE) 세포들을 지원하고 광수용체들에 교정 MY07A 유전자를 도입함으로써 어셔 1B 증후군과 관련되는 시력 저하를 약화시키거나 역전시키기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 MY07A 단백질(100mb 이상의 길이를 갖는 큰 유전자)을 코딩하는 MY07A cDNA이다. 큰 MY07A 유전자의 발현은 CMV 프로모터, CMV/MY07A 키메라 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 광수용체에 교정 ATP 결합 카세트 유전자 (ABCR로도 알려진) ABCA4를 도입함으로써 스타르가르트병으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 ABCA4 단백질을 코딩하는 ABCA4 cDNA이다. ABCA4 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나아제와 같은 광수용체-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD). 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관형성 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 사용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현시킨다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 이식하기 이전에 기증자의 각막으로의 항-혈관혈성 유전자(들)의 전달에 의한 신혈관형성의 결과로서 각막 이식 거부를 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 각막 이식에 대한 체외 전달을 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자들과 같은 항-혈관형성 유전자(들)을 발현시킬 것이다. AAV 벡터는 체외에서 각막 이식 조직에 적용될 수 있고, 형질도입된 기증자 조직은 또한 이식하기 전에 보관될 수 있다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터와 같은 구성적 프로모터에 의해 구동될 수 있지만, 또한 대안적인 프로모터가 사용될 수 있는 것도 가능하다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 fms-류 티로신 키나아제의 가용성 형태를 인코딩하는 유전자(가용성 Flt-1)를 전달한다. 가용성 Flt-1 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 색소 상피 유래 인자 단백질(PEDF)을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. PEDF 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장 및/또는 혈관 누출의 재발을 방지하기 위해 및/또는 건성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 비정상적인 혈관 성장을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 항-VEGF 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 억제자, VEGF 특이적 앱타머, 또는 VEGF 수용체의 가용성 형태를, 국한되지는 않지만, 포함하는 VEGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드 및/또는 항-PDGF 항체 또는 이의 결합 단편과 같은 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)의 억제자, PDGF 특이적 앱타머, 또는 PDGF 수용체의 가용성 형태를, 국한되지는 않지만, 포함하는 PDGF 차단 펩티드 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 PDGF의 억제제 및 VEGF 의 억제제를 발현시킨다. 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 교정 유전자 노른자모양 황반 이영양증 2(VMD2) 및 VMD2의 질환 관련 형태에 대해 특이적인 miRNA를 인코딩하는 카세트, 또는 RDS 유전자를 인코딩하는 교정 페리페린 2 및 RDS의 질환 관련 형태에 대해 특이적인 miRNA를 인코딩하는 카세트를 도입함으로써, 베스트 질환 또는 베스트 노른자모양 황반 변성(BVMD)으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. 유전자들의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 교정 레틴알데히드 결합 단백질 1 유전자 RLBP1을 도입함으로써, RLBP1 관련 망막 이영양증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 RLBP1 단백질을 코딩하는 RLBP1 cDNA이다. RLBP1 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 녹내장을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 COX-2 및/또는 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR)를 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 전안방에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 COX-2 및 프로스타글란딘 F2α 수용체(FPR) 유전자를 발현시킨다. 유전자(들)의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 각막횡단 주사로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 어셔 증후군 1c로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 하르모닌 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 하르모닌 단백질을 코딩하는 하르모민 cDNA이다. 하르모닌 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 맥락막 결여로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 Rab 에스코트 단백질 1(REP1)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 REP1 단백질을 코딩하는 REP1 cDNA이다. REP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 색맹으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 시클릭 뉴클레오티드 게이트 채널 베타 2(CNGB2) 및/또는 시클릭 뉴클레오티드 게이트 채널 알파 3(CNGA3) 유전자(들)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자(들)은 CNGB2 및/또는 CNGA3 단백질을 코딩하는 CNGB2 및/또는 CNGA3 유전자(들)이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 레버 선천성 흑내장(LCA)으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 CEP290 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 290 kDa의 중심체 단백질을 코딩하는 CEP290 유전자이다. CEP290 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 x 염색체 연관 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 색소성 망막염 GTP가수분해효소 조절(RPGR) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 RPGR 단백질을 코딩하는 RPGR cDNA이다. RPGR 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 x 염색체 연관 망막분리증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 RS1(retinoschisin 1) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 RS1 단백질을 코딩하는 RS1 cDNA이다. RS1 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 교정 색소성 망막염 1(RP1) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 RP1 단백질을 코딩하는 RP1 cDNA이다. RP1 유전자의 발현은 CMV 프로모터, 로돕신 키나아제와 같은 광수용체-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 레버 선천성 흑내장(LCA) 유형 2로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 망막 색소 상피-특이적 65 kDa 단백질(RPE65) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 RPE65 단백질을 코딩하는 RPE65 cDNA이다. RPE65 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD), 건성형 AMD, 당뇨병 황반 부종 또는 망막 정맥 폐쇄증으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 교정 인간 프롤린/아르기닌-풍부 말단 류신-풍부 반복 단백질(PRELP) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 PRELP 단백질을 코딩하는 PRELP cDNA이다. PRELP 유전자의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 마이오실린의 발현을 녹다운시킴으로써 청소년 개방각 녹내장으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 합성 마이오실린-특이적 miRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 합성 마이오실린-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 유전자 보강 및/또는 녹다운에 의해 색소성 망막염으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 눈에 글루타티온 생합성 경로로부터의 속도 제한 효소(들), 글루타민산 시스테인 리가아제(GCL) 및/또는 글루타티온 합성효소(GSS), 및/또는 합성 감마 글루타밀전달효소(GGT) 특이 miRNA를 인코딩하는 핵산 서열을 도입하기 위해 사용될 수 있다. GCL 및/또는 GSS 유전자(들) 및/또는 합성 GGT-특이적 miRNA의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 멀티시스트론 구성에서 유전자(들) 및/또는 합성 miRNA를 발현시킬 수 있다. AAV 벡터는 전안방으로의 직접 전달에 의해 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 전측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병과 같은 신경퇴행성 질환 및 루게릭병(ALS)과 같은 운동 신경 질환들을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 아이소폼, 또는 신경보호 효과를 갖는 유전자들과 같은 VEGF-B, VEGF-C, 또는 VEGF-D일 수 있는 VEGF 단백질을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 심실내 및 척수강내 주사를 통해 뇌척수액에 직접 주사하거나 대근군에 직접 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 낭포성 섬유증을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절제(CFTR)를 인코딩하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 폐로의 기관지 폐포 세척요법을 통한 직접 전달에 의해 또는 분무기의 사용에 의해 비강내로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 산필리포 증후군 A로 이어지는 병리생리학을 약화사키거나 역전시키기 위해 뇌에 교정 N-설포글루코사민 설포하이드롤라아제(SGSH) 및/또는 설파타아제 변경 인자 1(SUMF1) 유전자(들)을 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자(들)은 SGSH 단백질을 코딩하는 SGSH cDNA 및/또는 SUMF1 단백질을 코딩하는 SUMF1 유전자이다. 유전자(들)의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 SGSH 및 SUMF1 유전자를 발현시킬 수 있다. AAV 벡터는 직접적인 대뇌내 주사로 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 폼페병으로 이어지는 병리생리학을 약화시키거나 역전시키기 위해 대근군 및/또는 폐에 교정 산성-알파 글리코시다아제(GAA) 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 GAA 단백질을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 (ⅰ) 대근군으로의 직접 주사 및/또는 (ⅱ) 분무기를 사용하여 비강내에, 또는 폐에 기관지 폐포 세척을 통해 직접 전달함으로써 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 혈우병 A를 치료하기 위해 간, 근육 또는 지방 세포에 교정 유전자 제 8 인자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 제 8 인자이다. 제 8 인자 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 혈우병 B를 치료하기 위해 간, 근육 또는 지방 세포에 교정 유전자 제 9 인자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 제 9 인자이다. 제 9 인자 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 포르피린증의 형태를 치료하기 위해 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 아래 표에서 선택된 치료될 포르피린증의 유형과 관련된 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure 112016068192074-pct00004
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 점액다당류증의 형태를 치료하기 위해 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자를 도입하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터에 의해 전달된 유전자는 아래 표에서 선택된 치료될 점액다당류증의 유형과 관련된 결핍된 효소를 인코딩하는 유전자이다. 유전자의 발현은 CMV 프로모터 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다.
Figure 112016068192074-pct00005
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 습성형 연령 관련 황반 변성(AMD) 환자들의 눈에서 부종의 비정상적인 혈관 성장의 재발을 방지하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 안지오스타틴 및/또는 엔도스타틴과 같은 항-혈관형성 단백질 또는 단백질들을 인코딩하는 유전자 또는 유전자들을 전달한다. 일 실시형태에서, AAV 벡터는 망막 색소 상피 세포들에 전달하기 위해 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 이용하는 바이시스트론 구성에서 인간 엔도스타틴 및 안지오스타틴 유전자를 발현시킨다. 항-혈관형성 유전자(들)의 발현은 CMV, (더 최근에는 베스트로핀 프로모터로 알려진) 노른자모양 황반 이영양증2(VMD2) 프로모터와 같은 RPE-특이적 프로모터, 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 눈의 유리체 절제 후 직접 망막밑으로 주사하여 투여될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 AAV 벡터는 전측두엽 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병과 같은 신경퇴행성 질환 및 루게릭병(ALS)과 같은 운동 신경 질환들을 치료하기 위해 설계된 유전자 치료제로서 사용될 수 있다. 이러한 AAV 벡터는 VEGF145, VEGF165, 또는 VEGF189와 같은 VEGF-A 아이소폼, 또는 신경보호 효과를 갖는 유전자들과 같은 VEGF-B, VEGF-C, 또는 VEGF-D일 수 있는 VEGF 단백질을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 유전자의 발현은 CMV 또는 대안적인 프로모터에 의해 구동될 수 있다. AAV 벡터는 심실내 및 척수강내 주사를 통해 척수를 씻는 뇌척수액에 직접 주사하여 투여될 수 있다.
치료 방법
본 발명의 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 본 발명의 바이러스 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서, 예방에 대한 언급들은 일반적으로 예방을 위한 치료와 더 관련되지만, 치료를 위해 본원에 기재된 모든 언급은 치유력이 있는, 일시적 처방 및 예방을 위한 치료를 포함한다는 것을 인식해야 한다. 또한, 치료는 질병 진행을 방지하거나 둔화시키는 것을 포함한다. 포유 동물의 치료는 특히 바림직하다. 인간 및 가축 치료는 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
일 실시형태에서, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자들은 백신으로서의 사용을 위한 것일 수 있다. 백신들은 예를 들어, 인간 또는 가축 바이러스 기반 백신(예를 들어, 인플루엔자 및 뉴캐슬 질환 바이러스 백신)일 수 있다.
본 발명은, 형질전환유전자를 내포하고 있는 항체반응을 일으키는(competent) 변형된 바이러스를 기반으로 하는 백신인 경우, 특히 유용할 수 있다.
전술한 바와 같이, 조류 생산 세포들은 백신으로 사용하기 위한 바이러스 벡터 및 바이러스 벡터 입자들의 생산에 사용될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 다른 양태는 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 유전자 치료에 의해 개인을 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하며, 이때 상기 조성물은 치료적 유효량의 벡터를 포함한다. 약학적 조성물은 사람 또는 동물에 사용할 수 있다.
조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 포함할 수 있다. 약학적 담체, 부형제, 또는 희석제의 선택은 표준 약학적 실시 및 투여의 의도된 경로와 관련하여 이루어질 수 있다. 약학적 조성물들은 담체, 부형제 또는 희석제 이외에 모든 적합한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 도포제(들), 가용화제(들) 및 (예를 들어, 지질 전달 시스템과 같이) 표적 부위로의 벡터 진입에 도움이 되거나 벡터 진입을 증가시킬 수 있는 다른 운반체들을 포함할 수 있다.
적절한 경우, 조성물은 좌약 또는 질 좌약의 형태로; 원칙적으로 로션, 용액, 크림, 연고 또는 상처 소독용 살포제의 형태로; 피부 패치의 사용에 의해; 전분 또는 락토오스와 같은 첨가제들을 포함하는 정제의 형태, 또는 단독 또는 부형제와의 혼화제 캡슐 또는 소란(밑씨, ovule), 또는 향미제 또는 착색제를 포함하는 엘릭시르제, 용액 또는 현탁액의 형태로 경구적으로 하나 이상의 흡입제에 의해 투여될 수 있고, 또는 그들은 비경구적으로 예를 들어, 내부 해면성으로, 정맥 주사로, 근육 내로, 두개 내로, 안구 내로 또는 피하로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우, 조성물들은 다른 물질 예를 들어, 혈액과 등장인 용액을 만들기에 충분한 염 또는 단당류를 포함할 수 있는 멸균 수용액의 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 구강 또는 설하 투여의 경우, 조성물들은 종래의 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 캔디의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 벡터는 표적 세포 또는 조직을 이를 필요로 하는 환자에게 전달하기 전에 체외에서 표적 세포 또는 표적 조직을 형질도입하기 위해 또한 사용될 수 있다. 이러한 세포의 일 예는 자가 T 세포들일 수 있고, 이러한 조직의 일 예는 기증자의 각막일 수 있다.
스크리닝 방법
본 발명의 다른 양태는 핵산 결합 부위에 작동 가능하도록 연결될 때 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 부위 및/또는 동족 핵산 결합 단백질들을 식별하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 리포터 유전자에 작동 가능하도록 연결된 핵산 결합 부위와 핵산 결합 단백질 모두를 포함하는 세포에서 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 본 발명에서 유용한 새로운 RNA-결합 단백질 및 이들의 해당 결합 부위들의 식별을 허용할 수 있다. 또한, 상기 방법은 알려진 RNA-결합 단백질 또는 결합 부위들의 변이체의 식별을 허용할 수 있다.
일시예예서, 상기 방법은 TRAP와 상호작용하는 결합 부위들의 식별을 허용한다.
다른 실시형태에서, 상기 방법은 TRAP에 결합할 수 있는 결합 부위와 상호작용하는 핵산 결합 단백질들의 식별을 허용한다.
일 실시형태에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, 리포터 유전자는 양성 세포 성장 선택 마커, 예를 들어, 제오신TM에 대한 세포 저항을 가능하게 하는 sh ble 유전자 생성물을 인코딩한다.
다른 실시형태에서, 리포터 유전자는 음성 세포 성장 선택 마커, 예를 들어, 간사이클로비르(Ganciclovir)의 존재 하에서 세포 사멸을 야기하는 HSV 티미딘 키나아제 유전자 생성물을 인코딩한다.
향상된 기능에 대한 TRAP 결합 부위(tbs)를 스크리닝하는 일 예는 다음과 같다:
o RAGNN 및 RAGNNN의 8회 반복 전부 또는 서열 RAGNN의 8회 반복을 포함하는 퇴화 DNA 라이브러리 합성.
o GFP와 같은 리포터 유전자 카세트의 5'UTR 내(바람직하게, ORF의 12개 뉴클레오티드 내)에서 라이브러리 복제. 라이브러리 연결 리포터 유전자는 생산된 레트로바이러스 벡터 라이브러리 및 레트로바이러스 벡터 게놈에 선택적으로 복제될 수 있다.
o 세포주에 라이브러리 연결 리포터 유전자 카세트를 안정적으로 도입(이것은 레크로바이러스 벡터 전달 또는 형질감염에 의해 달성될 수 있다) 및 단일 클론들을 분리.
o 대조 DNA(pBlueScript) 또는 TRAP 발현 플라스미드 DNA를 사용하여 병렬 형질감염에 의해 클론들을 스크리닝. 두 개의 시나리오에서의 리포터 유전자 발현을 측정하여, 높은, 비-억제 리포터 유전자 수준(대조) 및 낮은, 억제 리포터 유전자 수준(TRAP)으로 클론들을 식별.
o 후보 클론들로부터의 표적 세포 게놈 DNA로부터의 tbs 서열의 서열화 및 PCR 증폭에 의해 서열들을 식별
실시예
프로토콜 설명, 데이터 분석 및 보고
(tbs) GFP 리포터 및 TRAP-발현 플라스미드들의 일시적 공-형질감염
리포펙타민 2000CD를 사용하여 TRAP 발현 플라스미드들과 함께 pCMV-GFP 또는 pCMV-tbsGFP (또는 이들의 변이체)에 의한 HEK293T 세포들의 일시적 동시-형질감염에 의해 TRAP-tbs 구성의 테스트가 수행되었다. (형질감염을 하기 24시간 전에 3.5x106개의 세포를 미리 접종한) 10cm 플레이트 당 6.1㎍의 전체 DNA에 대해 DNA 양을 표준화하기 위해 스터퍼 DNA(pBlueScript)를 사용하였다. 멀티웰 플레이트를 사용하는 경우, 이들 변수는 조직 배양 용기 면적에 따라 스케일다운되었다. 형질감염은 세 차례 수행하였다. TRAP 발현 플라스미드에 대한 GFP-리포터 플라스미드의 몰비가 각 실험에서 표시된다. 배지는 형질감염 후 18시간 이내에 교체하였고, 형질감염 48시간 후에 살이있는 세포들에 대해 GFP 분석을 수행하였다.
전형적인 레트로(렌티)바이러스 벡터 생산 프로토콜
3 개의 벡터 성분을 사용한 HEK283T 세포들의 일시적 형질감염에 의한 벡터 생산은 리포펙타민 2000CD를 사용하여 발생했다; pDNA들의 비율은 10㎝ 플레이트(형질감염 24시간 전에 3.5x106개의 세포를 미리 접종한 플레이트) 당 4㎍의 벡터 게놈, 2㎍의 GagPol, 0.1㎍의 VSVG 플라스미드이었다 - 이들 변수는 용기 면적에 따라 조정하였다. TRAP 플라스미드 또는 스터퍼 플라스미드(pBluescript)의 공-형질감염을 벡터 게놈을 사용하여 명시된 몰비(molar ratio)로 발생시켰다. 예를 들어 TRAP 플라스미드에 대한 벡터 게놈 플라스미드의 10 대 1 몰비의 경우, 질량비는 0.28㎍의 TRAP 플라스미드에 대해 4㎍의 벡터 게놈이었다. 새로운 배지로 교체하기 전에 6시간 동안 10mM의 최종 농도에서 형질감염 2일 후에 소디움 부티레이트를 추가하였고; 20시간 내지 24시간 후에 벡터 함유 하베스트 상청액을 채취했다. GFP 인코딩 벡터들의 생산을 위해, 형질감염 48시간 후에 살아있는 세포들에 대해 GFP 분석을 수행하였다. 면역 블로팅법을 위한 벡터 생산 종료 세포 샘플들은 전형적으로 분별 버퍼(130mM NaCI, 20mM Tris-HCI[pH7.4], 2mM EDTA, 0.2% IEGPAL)를 사용하여 만들어졌고, 세포핵들은 원심분리에 의해 제거되었다. 벡터 하베스트 상청액들은 벡터 적정 분석 이전에 0.45㎛의 여과지로 여과하여 -80℃에 보관하였다. GFP 인코딩 벡터들은 표적 세포들의 형질도입에 의해 적정되었고, 3일 후에 유동 세포 분석법에 의한 분석되었다(아래 참조). 형질감염 10일 후 숙주 세포 DNA의 qPCR(DNA 통합 분석; 아래 참조) 또는 형질감염 3일 후 형질전환유전자 생성물에 대한 면역형광검사법으로 치료 벡터들을 적정하였다.
형질감염된 세포 개체군 내의 글로벌 GFP 단백질의 평가
GFP 양성 세포들의 분석은 주로, 메디아 형광 강도에 의해 측정되는, 세포 당 GFP 발현 정도뿐만 아니라 개체군에서의 GFP 양성 세포 퍼센트의 정밀한 정량화를 허용하는 유동 세포 분석법으로 수행하였다. 형질감염된 개체군에서의 글로벌 GFP 발현 정도의 보고는 GFP 양성 세포수 퍼센트와 메디아 형광 강도(MFI, 임의의 단위)를 곱하여 얻은 '발현 스코어'에 의해 수행됨을 유의해야 한다. 우리는 이러한 척도가 형질감염된 세포 개체군 내에서의 GFP 단백질 발현의 전체 수준을 더욱 잘 표현한다고 믿는다 - 기본적으로, 형질감염된 개체군 내에서의 GFP 발현 수준의 정규 분포를 가정하기 때문에 '곡선 아래 면적'을 근사치로 계산한다. 퍼센트-양성 또는 MFI만을 기반으로 하는 GFP 발현의 보고는 분석되는 개체군의 이들의 '설명'에 한정되기 때문에 이것이 수행되었다(설명을 위해 도 5 참조). 따라서, '배수 억제'는 GFP 번역에 대한 TRAP의 영향의 척도이고, '스터퍼' 대조군들의 발현 스코어를 관련 TRAP 발현 플라스미드 테스트 샘플의 발현 스코어로 나눔으로써 계산되었다.
SDS-PAGE 및 면역 블로팅
표준 SDS-PAGE 및 면역 블로팅 프로토콜은 주골 벡터 하베스트 후, 벡터 생산 종료 세포들에 대해서 수행하였다. 벡터 입자들의 면역 블로팅 분석을 위해, 2mL이하의 여과된 벡터 상청액을 4℃에서 1시간 내지 2시간 동안 소형원심분리기에서 21,000rpm으로 원심분리한 후, '펠릿'을 20-30㎕의 PBS에 재현탁시켰다. 원심분리된 벡터 제제들은 SDS-PAGE 겔의 웰 당 로딩된 벡터의 7x104개의 PERT 예측 TU 및 PERT 분석(아래)으로 정량화되었다. 대략적으로, 1x106개의 벡터 생산 종료 세포를 200㎕의 분별 버퍼에 용해하였고, 원심분리로 세포핵을 제거하였다. 단백질 샘플들은 BioRad 분석에 의해 정량화되었고, 전형적으로 5㎍의 단백질이 미리 형성된 12개 내지 15개 웰의 4% 내지 20% 아크릴아미드 겔에 로딩되었다. 단백질들은 얼음 위에서 3시간 동안 45V에서 니트로셀룰로오스 상으로 전달되었다. 블롯은 4℃에서 밤새 5% 밀크 PBS/tween-20에서 차단되었다. 블롯들은 차단 버퍼에서 전형적으로 1:100 희석에서 일차 항체 및 HRP 이차 항체들로 프로브하였다. 면역 블롯들은 ECL 검출 후 X레이 필름 노출에 의해 분석되었다.
레트로바이러스 벡터 적정
o 통합 분석
하베스트하여 여과한 벡터 상청액을 배지에 1:5로 희석한 후 0.5mL의 부피를 사용하여 8㎍/mL의 폴리브렌의 존재 하에서 12-웰 규모로 1x105개의 HEK293T 세포를 형질도입하였다. 배양물들을 10일 동안 계대(2-3일 마다 1:5 분할)한 후, 1x106개의 세포 펠릿으로부터 숙주 DNA를 추출하였다. 다음의 인자들 즉, 형질도입 부피, 벡터 희석, 세포 당 검출된 ψ 복제, 및 특성화된 '단일 복제 ψ' 세포주 대조군의 세포 당 검출된 ψ 복제를 사용하여 계산한 벡터 역가(TU/mL) 및 EIAV 패키징 신호(ψ)로 설정된 FAM 프라이머/프로브를 사용하여 정량적 PCR를 수행하였다.
o GFP-리포터 분석
하베스트하여 여과한 GFP 인코딩 벡터 상청액을 배지에 1:10에서 1:160범위 내에서 희석한 후 0.25mL의 부피를 사용하여 8㎍/mL의 폴리브렌의 존재 하에서 12-웰 규모로 5x104개의 HEK293T 세포 또는 3.74x104개의 D17 세포를 형질도입하였다. 제조업자가 제안한 설정 하에서 FACS Verse 또는 FACS 칼리버를 사용하여 형질감염 3일 후에 유동 세포 분석법으로 배양물들을 분석하였다; 10,000개의 이벤트를 캡처하였고, SSC/FSC 2D 플롯 및/또는 ToPro3 염색을 기반으로 하는 DEAD/LIVE 혼합 대조군을 사용하여 죽은 세포들을 게이트-아웃하였다.
o 면역형광(IF) 분석(생물학적 적정)
하베스트하여 여과한 OXB-102 인코딩 벡터 상청액을 배지에 1:2에서 1:8의 범위 내에서 희석한 후 0.5mL의 부피를 사용하여 8㎍/mL의 폴리브렌의 존재 하에서 12-웰 규모로 1x105개의 HEK293T 세포를 형질도입하였다. 배양물들을 3일 동안 배양한 후 고정 및 투과된 세포들에 대해 IF 분석을 실시하였다. 티로신 수산화효소(TH)에 대한 일차 항체 및 Alexa-488 이차 항체 모두는 투과성 버퍼에서 1:500의 희석으로 사용되었다.
o LacZ-리포터 분석
LacZ 벡터 혼합 실험들을 위해, 하베스트하여 여과한 벡터 상청액을 10-5 배까지 10배씩 순차적으로 희석한 후 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5배 희석된 벡터들의 0.5 ㎖ 부피를 사용하여, 형질도입 24 시간 전에 7.5x104개의 세포를 미리 접종한 12-웰 플레이트에서 D17 세포들을 형질도입하였다. 역가(LFU TU/mL)를 생성하기 위해 형질도입 3일 후에 고정 및 X-Gal 추가 후 블루 콜로니 계수에 의해 배양물들을 분석하였다.
o PERT 분석
PERT 분석은 다른 곳에서 설명하였다(Arnold BA, et al., 1998, Biotechniques 25:98-106). PERT 예측 역가(PERT-TU/mL)는 PERT 분석에서 qRT-PCR 표준 곡선으로 사용된 GFP 인코딩 EIAV 벡터 제제의 생물학적 역가와 관련된 RT 활성을 기반으로 하는 임의의 물리적 입자 역가이다.
벡터 게놈 혼합 실험들에 의한 생산 세포들에서의 형질전환유전자 생성물의 발현에 의한 레트로/렌티바이러스 벡터 생산에 미치는 영향 평가
세포로부터의 레트로바이러스 벡터 생산에 대한 NOI 형질전환유전자 생성물의 부정적인 영향 정도를 평가하기 위해, 간단한 벡터 게놈 혼합 실험이 도 2에서 설명한 바와 같이 수행될 수 있다. 전술한 '레트로(렌티)바이러스 벡터 생산 프로토콜'은 도 1에서 설명한 벡터 패키징 성분들과 함께, NOI를 발현시키는 벡터 게놈 플라스미드 및 리포터 유전자 벡터 게놈 플라스미드(예를 들어, lacZ 또는 GFP 형질전환유전자)의 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. HEK293T와 같은 벡터 생산 세포 내에서의 리포터 단백질 lacZ 또는 GFP의 발현은 일반적으로, 생산된 벡터 입자들의 역가 또는 특이적 활성에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 받아들여지기 때문에, 이들 리포터를 인코딩하는 벡터들은 높은 역가에서 만들어질 수 있다. 따라서, 벡터 역가에 영향을 미치는 형질전환유전자를 인코딩하는 벡터 게놈의 플라스미드와 이러한 리포터 유전자를 갖는 벡터 게놈을 인코딩하는 플라스미드의 혼합은 표적 세포들에서 판독되는, 리포터 유전자 활성을 사용한 벡터의 적정에 의해 영향 정도의 측정을 가능하게 한다. 이것은 모든 벡터 입자들은 비리온 어셈블리에 대해 동일한 세포 기계/경로를 이용하여, 동일한 세포에서 만들어지기 때문에, '문제적' 형질전환유전자 단백질의 영향으로부터 리포터 유전자 벡터 역가에 미치는 '방관자' 효과가 존재하기 때문일 것이다. 형질감염에서 사용된 리포터 벡터 게놈 플라스미드 대 NOI 벡터 게놈 플라스미드의 비율은 전형적으로 1:1 과 1:5 사이이다. 레트로바이러스 벡터 입자들은 비리온 당 두 개의 게놈 RNA 복제본을 패키징하기 때문에, 두 개의 비-문제적 단백질(예를 들어, LacZ 및 GFP)이 생산 세포 내에서 두 개의 상이한 벡터 게놈 플라스미드로부터 발현되는 경우에도 리포터-특이적 벡터 역가에 대해 '희석' 효과가 존재할 것이라는 것을 유의해야 한다. 예를 들어, 1:1 비율의 LacZ 및 GFP 벡터 게놈 플라스미드를 사용하는 경우, 확률의 법칙은 비리온의 25%는 두 개의 lacZ 벡터 RNA 복제본을 포함하고, 25%는 두 개의 GEP 벡터 RNA 복제본을 포함하고, 비리온의 나머지 50%는 각각의 벡터 RNA 중 하나를 포함할 것을 지시한다. 후자의 시나리오에서, 두 개의 게놈 RNA 분자들 중 단지 하나만이 DNA로 역 전사될 것이고, 따라서 상기 리포터의 발현을 야기시키는, 표적 세포들로 통합되고 있는 양족 리포터 벡터 게놈의 50:50 기회가 존재한다. 종합하면, 이것은 벡터 게놈들의 두 개의 플라스미드가 1:1 비율로 혼합되는 경우, 특이적 리포터 벡터 역가는 생산 단일 벡터 게놈 제제들과 비교하여 2배까지 감소될 것이라는 것을 의미한다. 더 큰 혼합 비율(예를 들어, 1:5)을 사용하면 희석 효과는 더 커질 것이다. 이러한 이유로, 평가 하에서 NOI 형질전환유전자를 발현시키는 벡터 게놈 플라스미드와 리포터 벡터 게놈 플라스미드의 모든 혼합과 함께, 두 개의 리포터 벡터 게놈 플라스미드의 혼합이 희석 효과에 대한 "혼합" 대조군으로 사용될수 있다.
예로서, 도 3ⅰ 및 도 3ⅱ는 표적 세포들에서 X-gal 염색을 기반으로 하여 판독된 벡터 역가에 의한, lacZ 리포터 벡터 게놈 플라스미드를 사용하여 다양한 벡터 게놈 플라스미드 혼합 실험들로부터의 데이터를 표시한다. COX-2 및/또는 FPR을 발현시키는 벡터들뿐만 아니라, RetinoStat®, StarGen™, UshStat® 및 ReQuinate®의 것들을 포함하여 테스트된 벡터 게놈 플라스미드들의 대부분은 사용된 테스트 벡터 플라스미드에 대한 lacZ 벡터 플라스미드의 비율에 따라, 7배 내지 100배까지 벡터 역가에 영향을 미친다. 이들 데이터는 벡터 생산 세포들 내에서의 형질전환유전자 단백질 발현이 리포터 유전자 벡터들과 비교하여 임상적으로 관련있는 벡터들에서 관찰된 낮은 벡터 역가들에 대해 크게 기여한다는 것을 명확하게 보여준다.
레트로바이러스 벡터 생산에 관한 본 발명의 설명; 벡터 생산 세포에서의 번역 억제[TRIP] 시스템
도 4는 레트로/렌티바이러스 벡터 생산에 적용된 벡터 생산 세포에서의 번역 억제[TRIP] 시스템의 간략화된 개략도를 표시한다. 다른 바이러스 벡터 시스템(예를 들어, 아데노바이러스 및 AAV 벡터 기반 벡터)들에서 형질전환유전자 번역을 억제하는데 필요한 성분들을 설명하는 TRIP 시스템들을 바이러스-특이적 패키징 성분들을 포함하기 위해 설명할 수 있다. 모든 이러한 TRIP 시스템들은 필요한 벡터 성분들 이외에 다음의 두 가지 성분 즉, TRAP의 존재 하에서 POI 생산이 억제되도록 NOI 형질전환유전자의 5'UTR 내에 삽입된 TRAP 결합 부위(tbs) 및 TRAP 발현 카세트를 포함해야 한다. 벡터 게놈 분자 내의 복수의 NOI ORF는 TRAP에 의해 조절될 수 있다 즉, 벡터 게놈은 (예를 들어, IRES 요소를 포함하는) 멀티시스트론일 수 있고, 하나 이상의 ORF가 (예를 들어, IRES와 다운스트림 ORF 사이에) 이의 번역 개시 코돈의 업스트림에 삽입된 TRAP 결합 부위를 가질 수 있다.
주요 실험들에 대한 설명
GFP 플라스미드 및 GFP 발현 렌티바이러스 벡터 게놈 플라스미드의 사용에 의한 TRAP/tbs 구성의 초기 테스트
실시예 1. TRAP 발현 플라스미드에 의한 일시적 공-형질감염에서의 GFP 발현 조절 테스트
GFP 리포터 구조체 pCMV-tbsGFP가 도 6에 기술된 바와 같이 구성되었다. TRAP 결합 서열(tbs)은 5'UTR이 41nt 리더, 55nt tbs, 및 GFP ATG 코돈의 업스트림에 즉시 코작 공통 서열을 인코딩하는 9nt 영역을 (5'부터 3'까지) 인코딩하도록 구조체에 삽입되었다. 이들 GFP 리포터 구조체는 두 개의 CMV 프로모터 사이의 영역 삭제에 의해 실험적 EIAV 벡터 게놈 pONY8.4RC-GFP로부터 유래되었다.
보다 상세히 설명하면, 형광 유전자 발현 리포터들의 세부 사항에 관해서, 유전자 조절의 상대적으로 빠른 평가가 유동 세포 분석법에 의해 수행될 수 있도록 GFP 리포터 유전자가 초기 평가 실험들을 위해 선택되었다. GFP는 벡터 생산에 해롭거나 독성이 있는 것으로 알려져 있지는 않지만, TRAP/tbs에 의해 유전자 발현 조절에 대한 정밀한 모델로서 사용되었다. 또한, 기존의 벡터 게놈 pONY8.4RC-GFP는 조작을 위해 사용할 수 있었다; 이러한 벡터는 도 6에 도시된 바와 같이 내부 형질전환유전자 카세트의 업스트림에서 DsRED 발현 ORF 및 3'LTR 내의 야생형 EIAV U3를 이용한다. 따라서, 이러한 벡터 게놈 플라스미드는 벡터 생산 세포들 내에서 GFP 및 DsRed-express 발현 모두를 할 수 있다.
모든 이들 리포터 구조체는 강한 CMV 프로모터로부터 번역으로부터 유래된 mRNA의 폴리아데닐화를 허용한 야생형 EIAV LTR을 포함했다. 따라서, HEK293T 세포들에서의 pCMV-tbsGFP 및 대조 플라스미드 pCMV-GFP 모두로부터의 GFP 발현은 강력했다(도 8 및 도 9 참조).
TRAP 발현 구조체들은 인간 세포들에서의 높은 발현을 위해 바실러스 서브틸리스로부터 코돈/서열 최적화된 TRAP ORF를 사용하여 생성되었다. 구체적으로, 도 7은 일시적 형질감염 실험들에서 처음으로 평가된 TRAP 발현 플라스미드들의 유형을 표시한다. TRAP 단백질은 박테리아 기원이기 때문에, 공개적으로 사용가능한 뉴클레오티드 서열은 mtrB/TrpBP '전사 감쇠 단백질 유전자 과' 오페론 내에서 인코딩된 박테리아 서열이다. 그러나, 포유 동물 세포들에서의 발현을 잠재적으로 증가시키기 위해, 및 스플라이스-공여/수용 부위들과 같은 모든 차선의 서열들을 제거하기 위해, TRAP 뉴클레오티드 서열은 호모사피엔스에서의 발현을 위해 코돈/서열 최적화되었다. pCI-coTRAP를 얻기 위해 pCI-NEO로의 복제를 위해 합성 서열이 설계되었다. Sapl 부위들은 소화 및 재순환이 TRAP 단백질의 C-말단에 대한 HIS6 -태그의 융합을 허용하도록 배치되었다. 이것은 궁극적으로 pCI-coTRAP[H6]를 생성했다. 비-코돈 최적화된 TRAP 발현 플라스미드들을 사용한 이전의 보고들은 TRAP 기능에 대한 손해없이 C 말단 HIS6 -태그 TRAP를 또한 사용했다. 현재 구매 가능한 TRAP 항체가 없기 때문에, 실험 시 TRAP의 발현 정도를 결정하기 위해 HIS6 -태그 TRAP가 사용되었다.
제1 세트의 실험은 태그되지 않은 TRAP 및 C 말단 HIS6 -태그 TRAP 모두를 사용했다. TRAP+/-His6 -태그 플라스미드 및 tbs-GFP 리포터 구조체들을 사용한 공-형질감염 실험은 TRAP의 두 가지 버전이 HEK293T 세포들에서 pCMV-tbsGFP로부터 GFP 발현을 억제할 수 있음을 입증했다(도 8 및 도 9). TRAP 플라스미드 및 리포터가 1:1 비율에서 공-형질감염된 경우, TRAP 및 TRAP[H6]는 각각 3배 및 27배 GFP 발현을 억제했다(도 9B). TRAP 플라스미드들이 이러한 투여량의 10th에서 즉, 10:1(리포터:TRAP)의 분자비에서 공-형질감염되는 경우에도 약간의 최소 억제가 관찰되었다. TRAP 의 두 가지 버전 모두 pCMV-GFP의 GFP 발현에 영향을 미치지 않았고, 이는 tbs가 TRAP 매개 억제에 필수적임을 입증한다.
실시예 2. TRAP 발현 플라스미드 발현의 최적화
pCI-Neo 기반 플라스미드들로부터의 발현은 다른 CMV 유래 DNA 카세트들의 대상이 되거나 카세트들과 직접 경쟁할 수 있다. 이러한 이유로, 1/10th 투여량에서 pCMV-tbsGFP로 공-형질감염된 pCI-coTRAP[H6]가, pCI-Neo가 또한 로딩된 DNA를 표준화하기 위해 스터퍼 DNA로서도 사용되었기 때문에, 이러한 경쟁 유형의 대상이 되었을 수도 있다고 가정하였다(이러한 실험 이후, pBlueScript가 모든 다른 실험들에 대한 표준 스터퍼 DNA로서 사용되었다). 따라서, EF1a 유래 구조체 pEF1a-coTRAP[H6]는 전술한 바와 같이 만들어졌고, 상이한 비율들에서 pCMV-tbsGFP에 의한 공-형질감염에서 테스트되었다. 도 9D는 GFP 리포터 구조체들과 함께 pCI-coTRAP[H6] 또는 pEF1a-coTRAP[H6]로 공-형질감염된 세포에서의 GFP의 억제를 요약한다. 이들 데이터는 pEF1a-coTRAP[H6]가 1/10th 투여량에서 tbs-GFP 리포터 DNA로 공-형질감염될 수 있고, pCI-coTRAP[H6]와 대조하여, 1:1 비율에서 관찰된 GFP 억제 수준을 유지할 수 있다는 것을 입증한다(본 사례에서는, MFI 데이터가 비교되었다). 따라서, EF1a 프로모터는 TRAP 발현을 구동하는 단계에서 더 바람직할 수 있다.
pCI-coTRAP 및 pCI-coTRAP[H6]를 복제하는 방법으로 인해, 이들 구조체의 3'UTR들은 동일하지 않았고(도 7), 따라서 두 개의 구조체 사이에서 관찰된 기능성의 차이(도 9)에 대한 잠재적 원인은 아미노산 차이때문이라기 보다는 TRAP mRNA/단백질 수준에 의한 것일 수 있다. TRAP에서 C 말단 HIS6 태그가 기능성에 중요한 지 여부를 평가하기 위해, pEF1a-coTRAP[H6]로부터 서열을 제거함으로써 pEF1a-coTRAP가 구성되었다(도 7); 이들 구조체는 HIS6 -태그 서열을 제외하고 동일하다. pEF1a-coTRAP[H6] 및 pEF1a-coTRAP가 상이한 비율들에서 tbs-GFP 리포터 플라스미드들에 의한 HEK293T 세포들의 공-형질감염에 의해 직접 비교되었다(도 10).
이들 데이터는 HIS6 -태그 및 태그되지 않은 TRAP 단백질 모두는 tbs-함유 GFP 리포터 플라스미드와 1:1 또는 1:0.1의 몰비로 공급될 때 거의 검출할 수 없는 수준까지 GFP 발현을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 태그되지 않은 TRAP 버전은 모든 발현의 측정에서 TRAP[H6]보다 억제에서 2배 덜 효과적이었다. 따라서, HIS6 태그는 태그되지 않은 TRAP를 통해 최소한의 장점들을 제공할 수 있다; 이것은 향상된 단백질 안정성, 및/또는 가용성/폴딩 및/또는 기능성(예를 들어, RNA 결합)때문일 수 있다.
실시예 3. 상이한 TRAP 동족체의 평가
바실러스 서브틸리스의 TRAP 이외에, 두 개의 다른 TRAP 동족체가 pCMV-tbsGFP 및 TRAP 발현 플라스미드로 공-형질감염된 세포들로부터의 GFP 발현의 억제를 매개하는 것으로 나타났다(도 11A). 디설포토마쿨럼 히드로써멀(Desulfotomaculum hydrothermale) 및 아미노모나스 파우시보란스(Aminomonas paucivorans)로부터의 TRAP 유전자들이 코돈/서열 최적화되고 pEF1a 기반 발현 플라스미드로 복제되었다; 이들 변이체 모두 C 말단 HIS6 태그를 포함했다. 이들 TRAP 변이체는 각각 바실러스 서브틸리스 TRAP의 것과 75% 및 55% 아미노산 상동성을 공유했다. 세 가지 변이체는 모두 2 Log의 크기에서 HEK293T 세포들에서의 GFP 발현을 억제할 수 있었고, 이는 단지 55% 서열 상동성을 갖는 TRAP 동족체들이 TRIP 시스템에서 기능할 수 있다는 것을 입증한다. 세 가지 동족체는 모두 RNA 및 트립토판 결합 부위에 관여하는 서열에서 보존되었다(데이터는 도시되지 않음).
실시예 3b. 상이한 TRAP 동족체 및 변이체들의 평가
바실러스 서브틸리스 이외에 박테리아 균주로부터의 TRAP의 동족체들이 억제 시스템에서 기능할 수 있는 지를 테스트하기 위해, 바실러스 서브틸리스 TRAP에 대한 서열 동일성을 달리한 5 종류의 TRAP 변이체를 NCBI 데이터베이스에서 식별하였다(도 21ⅰ). 변이체들은 박테리아 계통을 넘어서 다양한 상이한 TRAP 변이체들을 대표한다. 이들 TRAP 변이체에 대한 유전자 서열은 인간 세포들에서의 높은 발현을 위해 코돈 최적화되었고, (TRAP 매개 억제를 향상시키기 위해 이전에 도시된 바실러스 서브틸리스 TRAP[H6]와 유사한, 도 10) C 말단 HIS6를 포함했고, pEF1a 프로모터 플라스미드에 복제되었다(도 7). 바실러스 할로두란스(B. Halodurans) TRAP 변이체는, 잠재적으로 tbs 내에서의 12회의 RAGNN 반복이 TRAP에 의해 결합될 수 있음을 표시하는 천연 12-mer를 형성한다(Bayfield, O.W. et ai (2012) PLoS ONE 7: e44309. doi: 10.1371/joumal.pone.0044309). 또한, 천연 11-mer TRAP 변이체들의 인공 12-mer 버전들은 단백질의 C 종점에서의 수정을 통해 조작될 수 있는 것으로 나타났다. 이들 변이체의 11-mer 또는 12-mer가 세포 환경에서 형성되는 지 여부는 알려져 있지 않지만, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus Stearothermophilus) TRAP의 S72N 수정은 X선 결정학으로 판단된 바와 같이 12-mer 단백질을 야기시키는 것으로 나타났다(Bayfield, 0,W, et ai (2012) PLoS ONE 7; e44309. doi: 10.1371/journal.pone.0044309). Bacillus Stearothermophilus TRAP-S72N 변이체가 또한 구성되었고, TRAP 억제 시스템에서의 잠재적 기능에 대해 다른 TRAP 동족체들과 함께 테스트되었다. 11x RAGNN 또는 12x RAGNN 반복 tbs 을 포함하는 두 개의 GFP 리포터 플라스미드가 사용되었다; 12-mer TRAP들은 pCMV-tbsxl1GFP 리포터에서의 11-mer들보다 큰 정도까지 pCMV-tbsx12GFP 리포터로부터의 형질전환유전자 발현을 억제할 수 있다고 가정하였다.
상이한 TRAP 동족체 및 B. Stearothermophilus TRAP-S72N 변이체의 비교에 의한 데이터가 도 21ⅱA 및 도 21ⅱB에 표시된다. 동족체 및 B. Stearothermophilus TRAP-S72N 변이체는 모두 적어도 10배 GFP를 억제할 수 있다. 이들 TRAP 동족체 간의 상대적으로 낮은 아미노산 서열 상동성(B. Subtilis TRAP와 비교하여 56% 내지 78%; 도 21ⅲ 참조)이 주어지면, 이것은 다양한 박테리아 종들로부터의 TRAP 단백질들은 포유 동물 세포들에서 tbs RNA 서열들과 상호작용하기 위해 필요한 유사한 사차 구조를 형성한다는 것을 제안한다. 모든 동족체들은 RNA 및 L-트립토판 결합과의 접촉을 위해 중요한 것으로 알려진 아미노산 잔기들을 포함했다; 그러나, B.Subtilis TRAP T30V(Yakhnin et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 4519-4524)와 같이 (L-트립토판의 부재에서도) tbs-RNA를 구조적으로 결합하는, L-트립토판 결합 돌연변이들은 TRAP 매개 억제 구성에서도 또한 기능할 것으로 기대된다.
실시예 4. 안정적인 HEK293T -TRAP 세포주에서의 형질전환유전자 억제의 평가
안정한 TRAP 발현 세포주의 맥락에서 형질전환유전자 발현의 TRAP 매개 억제를 평가하기 위해, 구조체 pEF1a-coTRAP[H6]-iBsr이 만들어졌고 블라스티시딘 선택에 의해 HEK293T 세포들을 안정적으로 형질감염하기 위해 사용되었다(도 11B). 100개 이하의 안정적인 클론들로부터, 4개의 서브클로닝된 HEK293T-TRAP[H6] 세포주 2F, 10H, 7E 및 3D를 분리하였고, 형질감염된 pCMV-tbsGFP로부터의 GFP 발현을 억제하는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. TRAP[H6]의 내생 수준이 일시적으로 형질감염된 TRAP 발현 플라스미드에 의해 관찰된 것과 동일한 수준의 GFP 억제를 달성할 수 있는 지 여부를 평가하기 위해 배양물들을 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]로 공-형질감염하였다. 이들 데이터는 안정적인 TRAP 발현 세포주들이 TRAP 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293T 세포와 비교하여 내생 TRAP로부터 (2 Log의 크기에서) 유사한 수준으로 형질전환유전자를 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 그러나, 추가적인 TRAP 발현 플라스미드가 (4 Log의 크기에서) 일시적으로 형질감염되는 경우, HEK293T-TRAP[H6] 클론들에서 훨씬 높은 수준의 형질전환유전자 억제가 관찰되었다. 이러한 효과의 원인은 HEK293T-TRAP[H6] 클론 세포들에 들어있는 기존 TRAP 풀로 인한 것일 가능성이 있다. 추가로 설명하기 위해, 일시적으로 형질감염된 시나리오에서, pCMV-tbsGFP 유래 mRNA의 TRAP 매개 억제가 발생할 수 있기 전에 작지만 측정가능한 양의 GFP 발현을 야기하는 불충분한 TRAP[H6] 단백질이 축적되는, pCMV-tbsGFP 및 pEF1a-coTRAP[H6]의 공-형질감염 이후의 이른 시점이 존재할 것이다. TRAP[H6]의 기존 풀은 de novo tbsGFP mRNA에 즉시 작용할 수 있기 때문에, 이러한 적은 양의 GFP 발현은 HEK293T-TRAP[H6] 세포에서 관찰되지 않는다. 추가적인 TRAP 발현 플라스미드와 협력하여, 이러한 효과는 안정적인 TRAP 세포주들에서의 GFP 발현에서 훨씬 큰 '배수 억제'를 허용한다. 이것은 안정적인 세포주들에서 TRAP[H6] 발현의 최대량은 HEK293T 세포들의 일시적 형질감염에서 관찰된 것보다 높지 않음을 제안한다(이것은 TRAP[H6]에 대한 면역 블롯에 의해 확인되었다, 데이터는 도시되지 않음). 그러나, 2 Log 이상까지 형질전환유전자 발현을 억제하는 안정적인 TRAP[H6] 세포주들의 능력은 벡터 역가를 향상시키기에 충분할 가능성이 있다.
실시예 4b. TRAP[H6]를 안정적으로 발현시키는 HEK293T 세포주들의 개발 및 벡터들의 생산에서의 이들의 사용
본 예는 실시예 4에서 제시된 것을 기반으로 하고, 안정적인 TRAP[H6] 세포주들이 개발된 방법에 대한 더 많은 정보를 제공한다. HEK293T 세포들은 EF1a-coTRAP[H6]-iBsr 발현 카세트로 안정적으로 형질감염되었고(도 22i), 블라스티시딘 선택에 의해 클론들을 분리하였다. 이들 안정적으로 발현시키는 TRAP[H6] (B.Subtilis) 클론들은 두 배로 서브클로닝되었고, 그후 pCMV-GFP(억제 없음) 또는 pCMV-tbsGFP에 의한 형질감염에 의한 억제 기능성에 대해 스크리닝되었다. 세포 개체군들에서의 전체 GFP 발현은 발현 스코어를 셍성함으로써 평가되었다(도 22ⅱA; MFIx %GFP). 4 개의 클론(2F, 10H, 7E, and 3D)은 억제 조건들에서(즉, TRAP의 존재 하에서) 낮고, 절대적인 GFP 발현 스코어들뿐만 아니라 최대 2-Log 억제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 안정적인 클론들 내에서의 GFP 형질전환유전자의 억제 수준은 세포들 내에서 검출된 TRAP[H6]의 수준과 상당히 연관성이 있다(도 22ⅱB). 이들 데이터는 TRAP 발현이 HEK293T 세포들에 대해 독성이 없고, (TRAP를 안정적으로 발현시키는, 'HEK293T.TRAP'로도 알려진) 'HEK293T.TRIP' 세포들은 TRAP 플라스미드의 일시적 형질감염에서 이전에 관찰된 것과 유사한 방식으로 형질전환유전자 발현을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.
우리는 다른 예에서, TRIP 시스템이 표준 벡터 생산 시스템을 통해 huFactor Ⅷ를 발현시키는 EIAV 벡터 ReQuinate의 벡터 역가를 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다. HuFactor Ⅷ는 EIAV 벡터 비리온으로의 VSVG 통합을 방해한다. 안정적인 TRIP 시스템(즉, 통합된 TRAP 카세트)은 일시적 TRIP 시스템(즉, 벡터 성분들에 의한 'pTRAP' 플라스미드의 공-형질감염)과 비교하여 형질전환유전자 억제 타이밍에서의 향상을 제공할 수 있다는 이론이 제시된다. 이것은 안정적인 세포들에서 TRAP 단백질의 기존 풀들이 형질전환유전자를 억제하기 위해 즉시 이용가능한 반면에, 일시적 시스템에서, 'pTRAP'는 충분한 수준의 TRAP 단백질이 형질전환유전자 mRNA를 억제하기 위해 존재할 때까지 발현될 필요가 있고; 따라서, 이러한 이른 시간에, 형질전환유전자의 약간의 '누출' 발현이 발생할 수 있고, 아마도 활성 벡터 생산에 대한 부정적인 영향을 가질 수 있기 때문이다. 이를 테스트하기 위해, 벡터 혼합 실험이 수행되었고, EIAV-[tbs]GFP 및 (ReQuinate-tbs로도 알려진) EIAV-[tbs]FⅧ 게놈은 벡터 성분 +/- pEF1a-coTRAP[H6]에 의한 세포들의 형질감염 시 50:50으로 혼합되었다.
따라서, 일반적인 EIAV 벡터 비리온 활성에 대한 huFⅧ 발현의 모든 부정적인 영향은 EIAV-GFP 벡터 역가에 대해 측정 가능하다. HEK293T 세포 및 안정적인 HEK293T.TRIP 세포주 2F, 10H, 7E 및 3D를 테스트하였다. 생산 종료 세포들은 유동 세포 분석법으로 GFP 발현으로부터 분석되었고(도 22ⅲA), 생산된 가공하지 않은 벡터는 새로운 HEK293T 세포들에서 적정되었고, 유동 세포 분석법에 의해 또한 분석되었다(도 22ⅲB).
도 22ⅲA의 데이터는 TRAP를 발현시키는 안정적인 세포들이 일시적 TRIP 시스템과 비교하여 더 많이 형질전환유전자를 억제할 수 있음을 입증한다; GFP 발현은 (도 22ⅲA, EIAV-GFP 및 EIAV-tbsGFP 게놈과 비교하여) HEK293T.TRIP-10H에서 1000배까지 감소되었다. 생산 세포들에서의 GFP (및 확장하여, huFⅧ)의 억제 정도는 생산된 벡터들의 역가와 연관성이 있다(도 22ⅲB 참조). 대체로, 안정적인 HEK293T.TRIP 세포주들은 일시적 TRIP 시스템보다 3배 이하로 더 큰 역가를 생산했다. 안정적인 HEK293T.TRIP 세포주((+ TRAP TXN)에서의 추가적인 TRAP 발현은 형질전환유전자 발현의 추가 억제를 허용했지만, 이것은 이러한 특정 형질전환유전자 인코딩 벡터의 역가에서의 추가 향상을 번역하지 않았다. 따라서, 최대의 TRAP 단백질 그 자체가 아닌, TRAP의 기존 풀이 본 예시의 일시적 시스템(즉, huFⅧ를 발현시키는 벡터들)에 대한 벡터 역가 향상에 책임이 있을 가능성이 있다. 더 많은 문제적/독성 형질전환유전자들의 억제는 벡터 생산 시 기존 및 높은 수준의 TRAP 모두로부터 혜택을 누릴 가능성이 있다.
EIAV-[tbs]GFP|EIAV-[tbs]huFⅧ 생산 세포들로부터 하베스트된 벡터 입자 함유 상청액들을 면역 블로팅법으로 VSVG 함량에 대해 분석하였다(도 22ⅳ). 이들 데이터는 tbs가 벡터 게놈에 대해 사용되고 TRAP가 (트랜스 - HEK293T + pEF1a-coTRAP[H6]에서 또는 안정적인 TRAP 발현에 의해) 벡터 생산 시 공급되는 경우에만 VSVG가 벡터 입자들에 통합될 수 있음을 보여준다.
실시예 5. GFP 인코딩 렌티바이러스 벡터들의 생산에 대한 TRIP 시스템 테스트
실험의 목적은 벡터 게놈 내에서 tbs의 존재의 잠재적 영향을 평가하는 것이었다. 확장하기 위해, TRAP는 (형질전환유전자 mRNA에서뿐만 아니라) 벡터 게놈 RNA 분자 내의 tbs에 결합할 수 있고, 따라서 새로이 벡터 비리온들로 패키징되기 때문에, 역 전사 프로세스는 상당히 부정적인 영향을 미칠 것으로 예상된다. TRAP-tbs 상호작용은 특히 높은 친화성(nM 범위)이 있고, 역 전사효소가 RT 단계 시 이러한 상호작용을 방해할 수 있었는지 여부는 알려지지 않았다. 생산 세포들에서의 벡터 형질전환유전자의 억제에 TRAP/tbs 구성을 적용하기 위해, EIAV 벡터 게놈 pONY8.4RC-tbsGFP가 pCMV-tbsGFP로부터 구성되었다(도 6 참조). 벡터는 성분들(GagPol and VSVG)을 패키징하는 게놈 pONY8.4RC-tbsGFP 또는 pONY8.4RC-GFP를 사용하여 HEK293T 세포들에서 생산되고, pCI-coTRAP[H6]와 함께 또는 pCI-coTRAP[H6] 없이 공-형질감염되었다(이 실험은 pEF1a-coTRAP[H6]의 구성 전에 수행되었다). 생산 종료 세포들은 유동 세포 분석법에 의해 GFP 발현에 대해 분석되었고(도 12A 및 도 12B), 벡터 상청액들은 D17 세포들을 형질도입하기 위해 사용되었다(도 12C).
TRAP/tbs 구성은 tbs 없는 벡터 게놈(도 12A)과 대조적으로, pCMV-tbsGFP와 유사한 수준까지 tbs 함유 벡터 게놈의 내부 형질전환유전자 카세트로부터의 GFP를 억제할 수 있었다. DsRed-X 발현은 TRAP에 의해 영향받지 않았고, 이는 전체 길이 벡터 게놈 DNA가 만들어졌고 번역 가능했음을 나타낸다(데이터 도시되지 않음). TRAP에 의한 벡터 게놈 플라스미드로부터의 GFP의 배수 억제는 50배 내지 100배였다(도 12B). 배수 억제가 pCMV-tbsGFP에 대해 관찰된 것보다 낮지만, 이것은 아마도 벡터 게놈 RNA를 구동하는 외부 CMVp와의 경쟁의 결과인, 벡터 게놈으로부터 관찰된 GFP의 더 낮은 억제되지 않는 수준 때문일 것 같다. 이들 데이터는 또한 CMV 프로모터의 알려진 활성제인 벡터 생산 시의 소디움 부티레이트의 추가는 TRIP 시스템에 영향을 미칠 것 같지 않다는 것을 나타낸다(소디움 부티레이트는 본 실험에서 pCMV-tbsGFP 형질감염에도 추가되었다).
도 12C는 tbs-함유 GFP 벡터들이 표준 GFP 벡터들과 매우 유사한 역가에서 생산될 수 있음을 입증한다; TRAP 단백질의 존재 하에서 생산된 pONY8.4RC-tbsGFP는 TRAP 단백질의 부재 하에서 생산된 pONY8.4RC-GFP의 1.8x106 TU/ml과 비교하여 1.4x106 TU/ml를 제공했다. 이들 데이터는 TRIP 시스템을 형질전환유전자가 번역적으로 침묵하는 레트로바이러스 벡터를 생성하는 단계에서 사용할 수 있다는 것을 처음으로 입증한다.
TRAP 매개 억제를 위한 서열 요건들의 기본 특성
실시예 6. tbs와 번역 개시 코돈 사이의 짧은 간격 요건 테스트
TRAP 결합 부위(tbs)에서 중요한 서열들을 특성화하는 첫 실험에서는 tbs 와 AUG 번역 개시 코돈 간의 짧은 간격 거리가 번역 억제에 대해 중요한지 여부를 알아보았다. pCMV-tbsGFP 및 pONY8.4RC-tbsGFP 내에서 tbs의 구성은 tbs가 9개의 뉴클레오티드에 의해 GFP AUG 번역 개시 코돈으로부터 분리되도록 한다. Tet-ON/OFF과 같은, 다른 인공적 유전자 조절 시스템들에서, 간격 변수들이 기능성에 기여하는 것으로 나타났다. 단거리 간격의 중요성을 평가하기 위해, 1개 내지 9개의 이들 스페이서 뉴클레오티드가 점진적으로 삭제되는 일련의 변이체들이 구성되었다. 또한, 간격은 두 개의 다른 변이체에서 10개 및 11개의 뉴클레오티드까지 증가하였다. 마지막으로, 표준 tbs-9nt-AUG 구성은, TRAP-tbs 결합이 체내에서의 전사 감쇠 메커니즘에 중요한 것으로 밝혀진, 바실러스 서브틸리스 trpEDCFBA 오페론으로부터 취해진 5' 근위 줄기 루프(SL) 서열이 추가되었다(McGraw AP, M. A., Major F, Bevilacqua PC, Babitzke P. (2009) RNA 15(1): 55-66). TRAP 매개 억제가 향상될 수 있는 지를 테스트하기 위해 SL 돌연변이가 포함되었다. 이들 변이체는 벡터 게놈 pONY8.4RC-tbsGFP으로 복제되었고, 번역 억제에서의 미묘한 차이가 더 쉽게 정량화될 수 있도록 하기 위해 pEF1a-coTRAP[H6](1:0.05의 비율)의 한정 수량으로 공-형질감염되었다.
본 실험의 결과들은 도 13B에 도시된다. 스페이서 삭제 변이체 또는 증가된 스페이서 변이체들 모두 9nt 스페이서와 비교하여 어떤 변경된 TRAP 매개 억제를 보여주었다. 'O' 변이체는 다른 변이체 +11 내지 +1과 비교하여 GFP 발현에서 대략적으로 2배의 감소를 보여주었지만, 이것은 TRAP의 존재 또는 부재 하에서 발생했고, 이는 이러한 변이체 mRNA로부터 번역될 GFP의 일반적인 능력이 (아마도, 최적의 코작 공통 서열의 삭제로 인해서) 덜 효율적임을 나타낸다. 흥미롭게, 천연 trp 오페론으로부터 5' 줄기 루프의 존재는 TRAP와 협력하여 번역을 억제하는 tbs의 기능성을 완전히 제거했다. 이러한 예상치 않은 결과는 체내에서 기능성을 허용하는 SL-tbs 구성의 다른 특징들이 무엇이든, 그들아 이러한 인위적 구성으로부터 부족하거나 올바른 서열 간격/맥락에서 존재하지 않거나, 바실러스 서브틸리스에서 SL-tbs에 결합하는 TRAP가 SL에 독립적인 후자, 번역 감쇠와 비교하여 전사 감쇠에서 상이한 메커니즘을 따른다는 것을 제안한다. 모든 이들 데이터는 이러한 인위적 시스템에서 tbs에 결합하는 TRAP에 의해 지시된 번역 억제가 tbs와 번역 개시 코돈 사이의 짧은 거리에 의해 변경되지 않는다고 제안한다.
실시예 6b. TRAP 매개 억제에 대한 형질전환유전자 카세트의 5'UTR 내 tbs 위치의 영향 테스트
TRAP 매개 억제 활성에 관해서 형질전환유전자의 5'UTR 내의 tbs 위치의 중요성을 더욱 특성화하기 위해, Cap 부위 및 AUG 개시 코돈으로부터 tbs의 상대적 거리를 달리한 일련의 pCMV-tbsGFP의 5'UTR 변이체들이 구성되었다(도 24i). 또한, 두 개의 tbs 서열 사이의 34nt 개입 서열로 5'UTR 내에 두 개의 tbs 복제본이 삽입된 다른 구조체가 만들어졌다. 이것은 TRAP-tbs 매개 억제가 단일 복제tbs 구성을 통해 향상될 수 있는 지를 테스트하기 위해 구성되었다.
도 24i의 7개의 tbs 변이체 GFP 리포터 구조체는 세 가지 조건 하에서 즉, TRAP(HEK293T)가 없는 조건, pEF1a-coTRAP[H6](HEK293T + TRAP)로 일시적으로 공-형질감염된 조건, 및 최대의 TRAP 억제 조건 하의 조건(HEK293T.TRIP[내생 TRAP] + 공-형질감염된 TRAP) 하에서, TRAP에 의해 그들이 능력이 억제되는 지 테스트되었다. 모든 5'UTR tbs 변이체는 10 내지 100배까지 TRAP[H6]에 의해 억제될 수 있었다. 0까지 업스트림 UTR 길이를 감소시키는 것은(즉, UTR의 전체가 단지 하나의 tbs로만 구성됨) TRAP 매개 억제에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았고; GFP의 억제되지 않은 수준들은 다른 구조체들보다 낮았지만, 구조체 #[1]은 TRAP에 의해 GFP를 2-Log 이하까지 억제할 수 있었다.
9nt에서 43nt까지 tbs와 AUG 개시 코돈 사이의 간격을 증가시키는 것은 tbs를 통한 10배의 TRAP 매개 억제를 또한 허용했다. 이중 tbs 인코딩 5'UTR 변이체(도 24ⅱ, 구조체#[7])은 하나의 tbs를 포함하는 변이체들과 비교하여 TRAP 매개 억제를 향상시키지 못했다.
이들 데이터는 [1] 하나의 tbs가 어느 정도의 형질전환유전자의 TRAP 매개 억제를 허용하는 5'UTR 내의 임의의 위치에 삽입될 수 있고, [2] 최대의 TRAP 매개 억제를 용이하게 하기 위해 AUG 개시 코돈에 가깝게 tbs를 삽입하는 것이 바람직하고, [3] tbs의 상류에서의 5'UTR 서열 길이는 억제의 크기에 영향을 주지 않고 0까지 감소될 수 있음을 보여준다.
실시예 7. 번역의 TRAP 매개 억제에 필요한 tbs 내의 [ RAGNN ] 반복의 최소 횟수 확인
다음 실험은 TRAP 매개 억제를 허용하기 위해 필요한 [RAGNN]의 최소 반복 횟수를 확인하기 위해 수행되었다. 문헌에서의 하나의 보고는 5회 정도의 반복이 TRAP 결합을 허용하기에 충분하다는 것을 보여주기 위해 시험관 내 결합을 사용했다(Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 1회 내지 7회 반복이 점진적으로 삭제된 일련의 tbs 삭제 변이체들이 생성되었다(도 14iA). 최적의 코작 서열이 모든 변이체들에서 유지되었다. 또한, TG>AA 변화가 10번째 및 11번째 반복 사이의 tbs에서 이루어졌다; 이것은 이러한 영역이 비-표준 스플라이스 공여 부위를 포함할 수 있다고 제안한 다른 연구(이것은 나중에 올바르지 않은 것으로 판명됨) 이후에 이루어졌다 - 데이터는 도시되지 않음. 변이체 tbs GFP 리포터 구조체들은 pEF1a-coTRAP[H6](전자는 후자보다 10:1 몰 초과) 또는 pBlueScript 로 HEK293T 세포들에 공-형질감염되었고, GFP 발현은 유동 세포 분석법에 의해 측정되었다(도 14iB). tbsx11M 변이체가 GFP 발현의 1000배 억제를 허용했기 때문에, tbs에 대한 TG>AA 수정은 TRAP 매개 억제에서 검출가능한 효과가 없었다. 또한, 변이체 tbsxIOM, tbsx9 및 tbsx8도 GFP 발현에서 1000배의 억제를 허용하였고, tbsx7은 500배의 억제를 허용했다(도 14iC 및 도 14iD). 이러한 변이체가 30배까지 GFP 발현을 억제할 수 있기 때문에, tbsx6를 제공하는 추가 RAGNN 반복의 삭제는 기능에서의 추가 감소를 야기시켰다. 변이체 tbsx5 및 tbsx4는 tbs 서열이 없는 것과 비교하여 무시할 수 있는 정도의 억제를 보여주었다. 이들 데이터는 TRAP/tbs 구성에 의한 대부분의 강력한 억제 수준은 적어도 7x (바람직하게 적어도 8회) RAGNN 반복을 필요로 하고, 6회 반복은 형질전환유전자 발현에서 일부 유용한 녹다운을 허용할 수 있다는 것을 명확하게 입증한다.
실시예 8. tbs 내에서 용인된 [ RAGNN ] 반복 횟수의 확인
전반적인 공통은 RAG 반복 사이에 N2스페이서를 포함하는 tbs에 결합하는 TRAP가 최적이지만, 시험관 내 tbs-TRAP 결합 연구들은 tbs의 RAG 반복 사이에 세 개의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 스페이서들이 용인될 수 있다고 또한 제안했다(Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 이것은 체내에서의 TRAP/tbs 상호작용이 다른 단백질 상호작용 및/또는 선택적 압력들이 진행중일 수 있는 특정 세포 조건 하에서 진화되었기 때문일 가능성이 있지만, 정말로, 체내에서 발견된 천연 tbs 서열들은 가끔 두 개의 뉴클레오티드보다 긴 스페이서들을 갖는다. 천연 TRAP/tbs 상호작용이 생물학적 기능을 준수하기 위해 최대 효율에 있을 필요는 없다는 것이 가능하다. 그러나, 인위적 TRIP 시스템에서, TRAP/tbs 상호작용이 최대로 효과적인 것은 바람직하다. RAGNNN 반복으로 연속 교체하는 것이 11x RAGNN tbs 서열의 기능성에 대해 얼마나 내성이 있는지 테스트하기 위해, 일련의 변이체 tbs 서열들이 설계되었고(도 14ⅱA), COX2 형질전환유전자를 발현시키는 EIAV 벡터 게놈에 복제되었다(도 18i 참조). 이들은 도 14iA에서 먼저 테스트된 tbsx11M 서열을 기반으로 하였다. RAGNNN 반복으로 중앙 위치 바깥쪽으로부터 tbsx11M 내에서 RAGNN 반복을 교체하여 1x, 3x, 5x 7x 및 마지막으로 11x RAGNNN 반복을 갖는 tbs 서열들을 얻었다(대부분의 3' 말단 반복 스페이서는 스페이서로서 카운트하지 않기 때문에, N3x11M tbs 서열의 경우, 단지 10개의 NNN 스페이서들만이 효과적으로 존재한다는 것을 유의해야 한다). 이들 벡터 게놈 플라스미드는 EIAV 벡터 패키징 성분들 +/ pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 HEK293T 세포들로 일시적으로 공-형질감염되었고, 벡터 상청액들은 하베스트되었다(이들 COC2 벡터들의 벡터 역가는 후술된다). (억제되지 않은) 스터퍼 플라스미드와 비교하여 세포에서의 형질전환유전자 억제를 측정하기 위해 생산 종료 세포 용해물들이 COX2에 대한 면역 블롯에 의해 분석되었다(도 14ⅱB).
데이터는 11x 반복 tbs 내에서 최대 3회의 RAGNNN 반복이 벡터 생산 세포들 내에서의 형질전환유전자 발현의 약간의 검출가능한 억제를 허용하다는 것을 나타낸다; 이것은 TRIP 시스템 없이 벡터 역가에 대한 형질전환유전자 단백질의 영향 정도에 의존하는, 일부 사례에서 벡터 역가를 향상시키기에 충분할 수 있다. tbs 내에서의 단일 RAGNNN 반복은 N2x11 반복 tbs만큼 기능적인 것으로 보인다.
실시예 8b. tbs 내에서 용인된 [ RAGNNN ] 반복 횟수의 확인
TRAP 매개 억제를 허용하는 공통 반복 RAGN2 -3에서 RAG 반복 사이에 스페이서를 포함하는 N의 개수에 대한 추가 연구가 수행되었다. 도 14iB는 대략적으로 형질감염 2일 후, 생산 종료 세포들에서의 COX2 발현 분석을 보여준다. N3N2 tbs 변이체들의 맥락에서 형질전환유전자(COX2) 발현이 (나중의 시간들과 비교하여) 형질감염 후 이른 시간에서 차이가 있는 지를 테스트하기 위해, 형질감염 8시간 후에 생산 세포 용해물들을 COX2에 대한 면역 블로팅법으로 분석하였다(도 14ⅲ). 이들 데이터는 COX2 발현의 유사한 패턴이 벡터 생산 시 이른 시간 및 나중 시간 모두에서 N3N2 tbs 변이체들로부터 발생한다는 것을 보여준다 즉, 주어진 tbs 변이체에 대한 TRAP-tbs 매개 억제의 크기는 벡터 생산의 코스 동안 유사한 것으로 나타난다.
벡터 역가에 대한 N3N2 tbs 변이체 포함 벡터 게놈들의 상이한 수준의 COX2 억제의 영향을 측정하기 위해, 가공하지 않은 상청액 하베스트가 DNA 통합 분석법의 대상이 되었다. 도 14ⅳ는 이들 데이터를 표시하고, 벡터 역가가 생산 세포들에서 명확한 COX2 억제가 있었던 N3N2 tbs 변이체들 즉, 'N3N2x11 [3]', 'N3N2x11 [1]' 및 'N2x11 [0]'에 대해 증가되었음을 보여준다. 이것은 RAGNN으로 구성된 x11 tbs내에서 최대 3개의 반복이 RAGNNN 반복으로 교체될 수 있고, 향상된 벡터 역가들을 야기시키는 약간의 TRAP 매개 억제 활성을 유지한다는 것을 확인시켜준다. 그러나, RAGNN x8 내지 RAGNN x11 tbs 구성은 벡터 생산 증가 이외의 이유 즉, 그렇지 않다면 벡터 생산 시 형질전환유전자에 대한 면역 반응으로 이어질 수 있는 벡터 생성물과 관련된 형질전환유전자의 대규모 감소때문에 선호도를 유지한다는 것을 유의해야 한다.
이전에, RAGNN x7 및 RAGNN x8 tbs 변이체들은 거의 최대의 TRAP 매개 억제 활성을 유지하는 것으로 나타났다(도 14i). 이들 더욱 짧은 tbs 변이체들 내의 RAGNNN에 의한 단일 RAGNN 반복 교체의 영향을 테스트하기 위해, N3N2 tbs 변이체 등의 제 2 시리즈가 구성되었고, COX2 벡터 게놈에 삽입되었다(도 14vA). 이들 벡터 게놈 플라스미드는 EIAV 벡터 패키징 성분들 +/ pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 HEK293T 세포들에 일시적으로 공-형질감염되었고, 형질감염 8시간 후에 세포 용해물들은 (억제되지 않은) 스터퍼 플라스미드와 비교하여 세포에서의 형질전환유전자 억제를 측정하기 위해 COX2에 대한 면역 블롯에 의해 분석되었다(도 14vB). 이들 데이터는 하나의 RAGNNN 반복 및 7개의 RAGNN 반복을 포함하는 8회 반복 tbs가 TRAP 매개 억제 활성을 유지한다는 것을 보여준다. 하나 이상의 RAGNNN회 반복을 포함하는 8회 미만 반복의 tbs 서열들은 더욱 낮은 TRAP 매개 억제 활성을 가질 수 있다.
실시예 8c. RAGNN 반복 공통의 5개 위치에서의 바람직한 뉴클레오티드의 특성
tbs의 RAGNN 공통 반복을 더욱 특성화하기 위해, 모든 GAGxx 반복들로 구성된 x11 반복 tbs의 맥락에서 각각의 뉴클레오티드(G|A|T[U]|C)로 NN 스페이서를 테스트하였다. 이들 tbs 변이체는 x11M tbs를 대신하는 pCMV-[tbs]GFP로 복제되었고, HEK293T 세포 +/- pEF1a-coTRAP[H6]의 일시적 공-형질감염에 의해 테스트하였다. 48시간 후, 세포들을 유동 세포 분석법으로 분석하였고, GFP 발현 스코어를 계산하였다(도 23i). 이것은 NN 위치에서 피리미딘에 대한 선호도를 밝혔다. 기능성의 전반적인 순서는 T[U]>C>G/A이었다. 제1의 (R) 위치에서 가장 기능적인 뉴클레오티드를 테스트하기 위해, 각각의 뉴클레오티드 G, A, T[U] 또는 C가 x11, x8 또는 x6 반복을 포함하는 tbs' 내의 xAGAA 반복에 삽입되었다. 이것은 가장 약한 스페이서 반복(NN=AA)의 맥락에서, G가 제 1 위치에서 가장 기능적임을 밝혔다. [TAGAA]x11의 제 1 위치에서 T[U]는 단지 최소한 기능적이었고, A 및 C는 이들 xAGAA 반복들 중 어느 하나에서 기능적이지 않았다. 따라서, 탠덤 xAGAA 반복을 포함하는 tbs'의 맥락에서, x는 G이고, T는 아니어야 한다.
다음으로, RAGNN 반복 공통의 첫 번째에서 G 또는 T의 상대적 선호도를 테스트하였다. 매우 기능적인 tbs (11xGAGTT)의 맥락 내에서, GAGTT 반복은 TAGTT 반복으로 점진적으로 교체되었다. (GAGTT 반복을 대신하는) TAGTT 반복의 증가는 tbs의 억제 기능을 단지 적당히 감소시켰다. 도 23i의 결과를 감안하면, 이것은 RAGNN반복 공통에서, 가변의 뉴클레오티드의, 기능성에 대한 가장 중요한 위치들은 R로 이어지는 NN 스페이서들임을 제안한다. 데이터는 NN 위치들에서 피리미딘들이 가장 바람직하다는 것을 나타냈다.
RAGNN 반복 공통의 이러한 특징을 더 특성화하기 위해, GAGxx의 맥락에서, 적어도 하나의 N=T인 tbs 변이체들의 다른 시리즈가 구성되었다(도 23ⅱ). 이것은 제 1 N(RAGNN의 위치 4)이 바람직하게 피리미딘이고, 훨씬 더 바람직하게 T[U]일 때 최대 억제가 달성된다는 것을 보여주었다. 이러한 RAGNN 서열의 탠덤 반복은, 다운스트림 형질전환유전자의 발현을 약화시킬 가능성이 있는, 형질전환유전자 ORE의 업스트림에 복수의 ATG 코돈을 야기하기 때문에 GAGAT는 테스트하지 않았음을 유의해야 한다.
약간의 차이가 관찰되었지만, 이러한 결과들의 대부분은 시험관 내 또는 체내[박테리아]에서 테스트된 TRAP-tbs 상호작용에 대해 게시된 보고서들과 일치한다(Babitzke P, Y. J., Campanelli D. (1996) Journal of Bacteriology 178(17): 5159-5163). 예를 들어, 본 연구에서, RAGCC 반복은 TRAP 억제의 매우 효과적인 매개자가 될 수 있음을 증명하였고, 다른 연구들은 이러한 스페이서가 이차 구조로 인해 활성을 감소시켰다고 제안했다(Xirasagar et al., J. Biol. Chem., Vol 273(42):27146-27153, Oct 1998). 이것은 RAGNN 반복을 포함하는 특이적 tbs 서열은 TRAP의 존재 하에서 특이적 tbs에 의해 가능한 억제의 크기에 대해 테스트하기 위해, 벡터 생산을 위해 의도된 세포들(전형적으로, 그러나 국한되지는 않는, HEK293 기반 세포들)에서의 TRAP-tbs 억제 시스템 내에서 경험적으로 테스트할 필요가 있음을 나타낸다. 전체적으로, 본 연구의 데이터는 RAGNN 반복 공통의 바람직한 뉴클레오티드가
o NN 스페이서 위치들 중 적어도 하나에서의 피리미딘
o NN 스페이서 위치들 중 첫 번째에서의 피리미딘
o 양쪽 NN 스페이서 위치들에서의 피리미딘
o 바람직하게 R 위치에서 G라는 것을 밝혔다.
실시예 9. 번역이 IRES에 의존하는 형질전환유전자 카세트에서의 TRAP/tbs 구성 테스트
멀티 시스트론 벡터들은 하나 이상의 유전자를 환자들의 표적 세포에 전달하는 과정에서 유용한 도구이다. 따라서, IRES 요소들에 의존하는 것들을 포함하여, TRIP 시스템을 사용하여 벡터 게놈 내에서 복수의 형질전환유전자들을 억제할 수 있는 것이 유리할 것이다. TRIP 시스템이 말단의 ORF가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의존하는 형질전환유전자 발현 카세트에 적용될 수 있는 지를 테스트하기 위해, 도 15A에 기술한 바이시스트론 벡터들을 구성하였다. 간단히, pCMV-Vi-tbsx11GFP 내에서 인코딩된 바이시스트론 유전자 카세트 VEGF-IRES-tbsGFP가 생기게 하는 pCMV-tbsGFP에 EMCV IRES 요소 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 인코딩하는 서열을 삽입하였다. 단지 4개의 [RAGNN] 반복을 포함하거나 반복을 포함하지 않는 두 개의 추가적인 대조 구조체를 제조하였다; 이들은 TRAP에 의해 억제될 수 있을 것으로 예상되지 않았다. 구조체들은 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]로 HEK293T 세포에서 공-형질감염되었고, GFP 발현을 유동 세포 측정법으로 평가했다. 이들 데이터는 도 15B에 표시된다. 바이시스트론 카세트의 말단 위치로부터의 GFP 발현의 수준은, 바이시스트론 유전자 구성에 대해 이례적이지 않은, 단일 시스트론 구조체의 것보다 대략적으로 7배 낮았다. pCMV-Vi-tbsx11GFP 형질감염된 세포들에서의 GFP 발현의 수준은 2배 더 낮았고, 이는 서열의 배치가 IRES 의존 번역 효율에서 작은 감소를 가짐을 나타낸다. pCMV-Vitbsx11G + pEF1a-coTRAP[H6] 형질감염된 세포들에서의 GFP 발현의 수준은 스터퍼 플라스미드에 의한 것보다 17배 낮았고, 이는 TRAP/tbs 구성이 내부 리보솜 진입의 맥락에서 기능할 수 있다는 것을 입증한다. 또한, 대조 및 4x 반복 구조체들은 TRAP에 크게 반응하지 않기 때문에, 이러한 기능성은 TRAP 단백질의 존재뿐만 아니라 tbs의 존재에 의존한다. 이들 데이터는 IRES 의존 번역의 제어에 의한 유전자 발현을 조절하는 과정에서 TRAP/tbs의 새로운 용도를 처음으로 입증한다. (또한, 도 19i 및 도 19ⅱ의 데이터는 멀티시스트론 mRNA 내의 복수의 ORF가 TRIP 시스템을 사용하여 동시에 억제될 수 있음을 입증한다).
TRAP/tbs 구성에 의한 WPRE 포함 SIN 벡터로부터 생산 세포들에서의 GFP 형질전환유전자의 억제
실시예 10. TRIP 시스템을 사용한 WPRE를 포함하는 SIN- 렌티바이러스 벡터들의 생산
우드척 전사 후 요소(WPRE)를 또한 포함하는 SIN 벡터의 생산에 TRIP 시스템이 적용되었다. TRAP/tbs 구성을 사용하는 형질전환유전자 번역 억제를 예시하기 위해 사용된 초기 벡터 게놈(pONY8.4RC-tbsGFP)은 SIN 벡터가 아니었고, 전사 후 조절 요소(PRE)를 포함하지 않았다 - 현대의 레트로바이러스 벡터 및 다른 바이러스 벡터 시스템들의 전형의 특징. WPRE는 폴리아데닐화 부위들에서의 read-through를 감소시킴으로써 기능하는 것으로 나타났다(Higashimoto T, U. F., Perumbeti A, Jiang G, Zarzuela A, Chang LJ, Kohn DB, Malik P. (2007) Gene Therapy 14(17): 1298-1304). 그러나, 초기 리포트들은 WPRE가 다른 방법들로 RNA 수준에서 작용할 수 있다고 제안했다. TRAP/tbs 구성이 WPRE를 포함하는 SIN 벡터 게놈으로부터의 형질전환유전자 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있는 지를 테스트하기 위해, 벡터 게놈 pONY8.9RCTG(+WPRE)를 구성하였고, HEK293T 세포들에서 GFP 발현을 억제하는 과정에서 테스트하였다. 도 16은 SIN 벡터 게놈에 WPRE의 포함은 TRIP 시스템에 부정적인 영향을 미치지 않음을 입증했다: pONY8.4RC-tbsGFP 및 pONY8.9RCTG(+WPRE)GFP로부터의 GFP 억제는 동등하였다.
치료 형질전환유전자들을 발현시키는 벡터들의 생산 역가를 증가시키기 위한 TRIP 시스템의 사용
실시예 11. TRIP 시스템을 사용한 huFactor Ⅷ 발현 벡터의 생산
형질전환유전자 huFactor Ⅷ는 벡터 비리온에 대한 VSVG 외피 혼입을 심각하게 저해하는 것으로 나타났기 때문에, 혈우병 A의 치료를 위해 개발된 ReQuinate®는 HEK293T 세포에서 생산하기 어렵다. HEK293T 세포에서 활성화되어 있지 않는 조직-특이적 프로모터가 huFactor Ⅷ 발현을 구동하기 위해 사용되지 않는다면, ReQuinate® 벡터 역가는 낮다(실험 데이터를 혼합하기 위해 도 3i 참조) (Radcliffe PA, S. C, Wilkes FJ, Custard EJ, Beard GL, Kingsman SM, Mitrophanous KA (2008) Gene Therapy 15(4): 289-297). 벡터 역가가 HEK293T 생산 세포들에서 huFactor Ⅷ 발현을 억제함으로써 향상될 수 있는 지를 테스트하기 위해 ReQuinate®에 TRIP 시스템을 적용하였다. 원래의 ReQuinate® 게놈 내의 5'UTR이 (도 6에 도시된) tbs-GFP 리포터 벡터들로부터 동일한 5'UTR로 교체된, 벡터 게놈 ReQuniate-tbs 및 ReQuniate-con이 구성되었다(도 17i). ReQuinate-con 벡터 게놈은 tbs가 스크램블링된 것을 제외하고 ReQuinate-tbs와 동일한 5'UTR을 포함했다; 이것은 tbs-음성 mRNA로부터의 huFactor Ⅷ의 번역이 tbs-포함 mRNA와 비교하여 뉴클레오티드 함량 및 서열 길이의 관점에서 유사한 5'UTR의 맥락에 있도록 수행되었다. 이들 벡터는 pEF1a-coTRAP[H6] 보다 5배의 몰 초과에서 벡터 게놈 플라스미드 DNA를 사용하여 HEK293T 세포들에서 만들어졌다. 여과된 벡터 상청액들이 역가를 결정하는 DNA 통합 분석의 대상이 되었다. 또한, 벡터 상청액들을 100배 이하로 농축하여 입자수를 정량화하기 위해 PERT 분석을 하였고, 동일한 수의 벡터 입자를 면역 블로팅법으로 VSVG 함량에 대해 분석하였다. 이들 분석으로부터의 데이터는 도 17ⅱ에 표시된다. ReQuinate® 및 TRAP[H6]의 존재 하에서 생산된 ReQuinate-tbs와 비교하여, TRIP 시스템은 30배까지 huFactor Ⅷ 발현 벡터 게놈의 DNA 통합 역가를 향상시켰다. 벡터 입자들로의 VSVG 혼입 정도는 TRAP/tbs 구성을 사용하여 엄청나게 증가되었고, 이것은 벡터 역가와 밀접하게 관련이 있었다. 흥미롭게, ReQuniate-con으로 만들어진 벡터 입자들로의 VSVG 혼입 또한 약간 증가되었고, 벡터 역가에서의 작은 수반되는 증가가 +/-pEF1a-coTRAP[H6]에서 관찰되었다; 이것은 이러한 구조체로부터 huFactor Ⅷ의 차선의 발현때문일 수 있다.
실시예 12. TRIP 시스템을 사용한 COX2 및/또는 FRP 발현 벡터의 생산
녹내장을 치료하기 위한 레트로바이러스 벡터들의 개발과 관련하여, PTGFR 유전자에 의해 인코딩되는 프로스타글란딘 F2α에 대한 수용체인 프로스타글란딘 F 수용체(FPR), 및 프로스타글란딘 생합성에서의 속도 제한 효소인 시클로옥시게나아제-2(COX-2)를 포함하여 다수의 형질전환유전자가 안압을 감소시키기 위해 평가되고 있다. (바이시스트론 유전자 벡터에 의해 또는 별도의 단일 유전자 벡터들에 의해) 이들 유전자 모두를 동시에 전달하는 것이 녹내장 환자들에게 도움이 될 것이라 희망한다. 그러나, 이들 형질전환유전자를 인코딩하는 벡터들의 역가가 마커 유전자 벡터 역가들에 비해 크게 감소하는 것이 발견되었다. 벡터 생산 시 lacZ 벡터와 이들 벡터 게놈의 혼합이 lacZ 벡터 역가를 감소시키기 때문에 이러한 효과의 적어도 일부는 형질전환유전자 생성물들로 인한 것으로 입증되었다(도 3ⅱ 참조).
TRIP 시스템이 녹내장 벡터 역가를 증가시킬 수 있는 지를 테스트하기 위해, 도 18ⅰ에 도시된 단일 형질전환유전자 벡터 게놈들에 tbsx11m 변이체 서열(도 14ⅰA)을 복제하였다. 1:0.2의 몰비의 벡터 게놈:TRAP 플라스미드에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]를 또한 공-형질감염하는 동안, 바이러스 벡터 제제들이 HEK293T들에서 생산되었다. 벡터 제제들은 표준 DAN 통합 분석에 의해 적정하였고(도 18ⅱA), 세포 용해물들은 표적 세포들에서의 tbs 함유 전사 유닛로부터 COX-2의 발현을 평가하기 위해 COX-2 벡터 생산 세포 및 COX-2 벡터 형질도입 세포 양쪽으로부터 채취했다. 이들 분석으로부터의 데이터는 각각 도 18ⅱB 및 도 18ⅱC에 도시하였다. tbs-COX-2 벡터의 역가들은 변형되지 않은 COX-2 벡터의 역가보다 100배 높았고(도 18ⅱA), 생산 세포들 내에서 COX-2의 수준은 역가와 반비례 관계를 보였다(도 18ⅱB). COX-2 발현은 TRIP 시스템을 사용하여 생산된 벡터에 의해 형질도입된 표적 세포들 내에서만 확실하게 검출될 수 있었고, 이는 tbs 서열이 표적 세포들에서의 형질전환유전자의 발현에 영향을 미치지 않았음을 입증한다(도 18ⅱC). TRIP 시스템을 사용하여 생산된 FPR 벡터의 역가는 표준 벡터들과 바교하여 24배까지 증가하였고(도 18ⅲ), 다시, 이것은 시스템에서 TRAP 및 tbs에 의존했다.
COX-2 및 FPR 양쪽 모두를 발현시키는 멀티시스트론 벡터를 테스트하기 위해, 도 19ⅰ에 도시된 벡터 게놈 플라스미드들에 tbsx11M 서열을 복제하였다; +/- tbs 어느 위치에서든 COX-2 및 FTR을 인코딩하는 바이시스트론 벡터 게놈 플라스미드들이 생성되었다. 1:0.2 몰비의 벡터 게놈:TRAP 플라스미드에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]를 또한 공-형질감염하는 동안, 표준 조건 하에서 바이러스 벡터 제제들이 HEK293T들에서 생산되었다. 벡터 제제들은 표준 DNA 통합 분석으로 적정하였고, 세포 용매물들은 벡터 생산 세포들로부터 채취했다(도 19ⅱ). 구매 가능한 FPR에 대한 항체가 없기 때문에 COX-2에 대한 항체만을 사용하여 세포 용매물들의 면역 블로팅을 수행하였다. 이들 데이터는 멀티시스트론 mRNA가 TRIP 시스템을 사용하여 하나 이상의 ORP 위치에서 동시에 억제될 수 있음을 보여준다. 이러한 억제의 결과는 벡터 역가에서의 100배 증가를 허용했다(pKCMV-COX2-i-FPR [+스터퍼]를pKCMV-tbsCOX2-i-tbsFPR[+pEF1a-coTRAP[H6]]와 비교).
실시예 13. TRIP 시스템을 사용한 OXB -102 벡터들의 생산
OXB-102는 도파민 생합성에 관여하는 3가지 단백질 즉, 티로신 수산화효소, GTP 시클로히드롤라아제, 및 (국제특허 제WO 2013/061076호에 기술된) 방향족 L 아미노산 탈탄산효소를 발현시키고, 파킨슨병 치료를 위해 개발되고 있는 EIAV 벡터이다. 전술한 바와 같이, 이들 효소는 벡터 역가들에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있고, 환자에게 더 적은 면역성의 벡터 제제를 전달할뿐만 아니라 벡터 처리/농축의 관점에서 벡터 생산 세포들 내에서의 형질전환유전자 발현을 억제하는 데 유익할 수 있다. 따라서, 도 20ⅰ에 도시된 바와 같이 멀티시스트론 OXB-102 벡터 게놈 플라스미드의 5' 근위 ORF에 tbsx11M 서열을 복제하였다. 결과의 벡터에서, 융합 유전자 티로신 가수분해효소:GTP 시클로히드롤라아제 1(TH-CH1)의 번역은 벡터 생산 세포들에서 단지 TRAP에 의해 억제될 것으로 예상된다. 1:0.2 몰비의 벡터 게놈:TRAP 플라스미드에서 스터퍼 플라스미드 또는 pEF1a-coTRAP[H6]를 또한 공-형질감염하는 동안, 바이러스 벡터 제제들이 HEK293T에서 생산되었다. 벡터 제제들은 표준 DAN 통합 분석으로 적정하였고, 세포 용해물들은 벡터 생산 세포들로부터 채취하였다. 도 20ⅱA 및 도 20ⅱB는 TH 및 CH1 모두에 대한 항체들을 사용하는 면역 블로팅법에 의한 판단으로 TH-CH1 융합 단백질이 벡터 생산 세포들에서 억제되지만(도 20ⅱB), 항-TH 항체들을 사용하는 면역 염색법에 의한 판단으로 형질도입된 세포들에서 쉽게 검출된다는 것을 확실히 보여준다.
실시예 14. TRIP 시스템을 사용한 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터들의 생산
우리는 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터들을 생산하는 과정에서의 TRIP 시스템의 유용성을 입증하기 위해 노력했다. CMV 프로모터의 제어 하에서 GFP를 인코딩하는 표준 HIV-1 벡터 게놈에 tbsx11M 서열을 복제하였다(도 25ⅰA). GFP 인코딩 벡터들을 (형질감염 24시간 전에 플레이트 당 3.5x106개의 세포가 접종된) 10㎝ 플레이트 당 25㎕ 리포펙타민 2000CD를 사용하여, 다음의 질량비 즉, 4.5㎍ 벡터 게놈, 1.5㎍ gagpol, 1.1㎍ rev, 0.56㎍의 pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP) 또는 0.56㎍의 pBlueScript(-)와 0.7㎍ vsvg에서 패키징 성분 플라스미드에 의한 HEK293T 세포들의 일시적 공-형질감염으로 생산하였다. 배양물들을 밤새 배양한 후, 소디움 부티레이트를 5시간 동안 10mM의 최종 농도까지 첨가하였다. 이후, 가공하지 않은 벡터 상청액들을 하베스트하고, 여과(0.2㎛)하여 -80℃에 보관할 때, 배지를 교체하였고 형질감염 2일 후까지 배양물들을 배양했다. 생산 종료 세포들을 유동 세포 분석법으로 분석하였고, GFP 발현 스코어를 계산했다. HEK293T 세포들의 형질도입에 의해 벡터 상청액들을 적정한 후 유동 세포 측정법으로 분석하였다. 도 25ⅱB는 생산된 벡터 역가 및 생산 종료 세포에 대한 GFP 발현 스코어(MFI x %GFP) 모두를 표시한다. TRAP가 동시 도입된 경우, 및 HIV-1 벡터 게놈이 기술된 바와 같은 tbs 서열을 포함한 경우에만 GFP 발현은 2-Log까지 억제되었다. 그러나, 벡터 역가들은 이들 변형에 의해 영향받지 않았다. 이들 데이터는 원칙적으로, 모든 형질전환유전자가 TRIP렌티 시스템을 사용하는 HIV-1 기반 벡터 생산 세포들에서 억제될 수 있음을 입증한다.
치료 유전자를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터의 역가가 TRIP렌티 시스템을 사용하여 향상될 수 있는 지를 평가하기 위해, 5T4-CAR을 인코딩하는 HIV-1 벡터 게놈의 형질전환유전자 카세트의 5'UTR에 tbsx11M tbs가 삽입되었다(도 25ⅱA); 이러한 치료 벡터는 그들이 항원 5T4를 발현시키는 종양 세포들을 표적으로 삼아 죽일 수 있는 T 세포들을 유전 변형시키기 위한 것이다. 결과 벡터 HIV-tbs-h5T4.CAR은 (GFP 벡터에 대해) 전술한 동일한 조건 즉, 벡터 성분 +/- pEF1a-coTRAP[H6]에 의한 HEK293T 세포들의 공-형질감염 하에서 생산되었다. 벡터 상청액들을 HEK293T 세포들에서의 DAN 통합 분석으로 적정하였다. 도 25ⅱB는 본 실험의 결과를 도시한다; HIV-tbs-h5T4.CAR의 역가는 대조(pBlueScript)와 비교하여 TRAP[H6]가 생산 세포들에서 동시 발현될 때 30배 더 컸다. 이들 데이터는 생산 세포들 내에서의 5T4.CAR 발현이 활성 벡터 생산에 해롭고, TRIP 시스템이 형질전환유전자 발현의 억제를 통해 이러한 문제를 극복한다는 것을 입증한다.
실시예 15. TRAP-tbs 구성은 세포질에서의 형질전환유전자 mRNA 수준에 영향을 미치지 않는다
TRAP-tbs 구성은 매우 강력하게 형질전환유전자를 억제시킬 수 있고, 번역 수준에서 단독으로 작용할 것으로 생각된다. 형질전환유전자 발현에서의 억제에 또한 기여할 수 있는, tbs-인코딩 mRNA의 정상 상태 풀이 TRAP의 존재 하에서 영향을 받는 지 여부(예를 들어, 가능한 불안정화 효과)를 테스트하기 위해, 형질전환유전자 세포질 RNA의 상대적 수준들이 pCMV-[tbs]GFP +/- pEF1a-coTRAP[H6]에 의해 트랜트펙션된 HEK293T 세포들에서 측정되었다. 세포들이 형질감염되었고, GFP 발현이 형질감염 2일 후에 유동 세포 측정법에 의해 측정되었다(도 26A). 복제 배양물들을 분별하여, 세포핵을 제거하고, QIAGEN RNAeasy 키트를 사용하여 전체 세포질 RNA를 정제하였다. GFP 표적 서열로 설정된 FAM 프로브/프라이머를 사용하여 qRT-PCR이 수행되기 전에 RNA를 DNAse 처리하였다(도 26B). 이전 데이터와 마찬가지로, TRAP-tbs 구성은 2-Log까지 HEK293T 세포들에서의 GFP 발현을 억제할 수 있었다. 그러나, 세포질 내에서의 GFP mRNA의 검출 수준은 모든 조건들에서 2배 이하까지 달라졌다((모든 Ct 값들이 1.5 사이클보다 적게 달라졌다). 이들 데이터는 TRAP 매개 형질전환유전자 억제의 가장 가능성있는 메커니즘은 번역에서 임을 확인시켜준다.
실시예 16. 구성적 프로모터와 조직-특이적 프로모터를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터들로부터의 벡터 생산 세포들에서 TRAP/tbs 매개 바이시스트론 형질전환유 전자 억제 비교
전사 수준에서의 형질전환유전자 억제와 비교하여 (번역 수준에서의) TRAP 매개 억제를 테스트하기 위해, 형질전환유전자 전사가 구성적 CMV 프로모터, 또는 조직 특이 프로모터들(VMD2; 광수용체 세포 발현 (Esumi, N. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279: 19064-73), mA1bAT; 간의 간세포 발현 (Kramer, M.G. et al. (2003) Mol. Ther. 7: 375-385))에 의해 구동되는 HIV-1 기반 벡터 게놈들이 구성되었다. 형질전환유전자 카세트는 두 개의 ORF 사이에 삽입된 EMCV IRES 요소와, 제 1 ORF에서 개똥벌레 (Photinus pyralis) 발광 효소 및 제 2 ORF에서 GFP를 인코딩하는 바이시스트론이었다. 단일 tbs (x11M) 서열들이 양쪽 리포터 유전자의 업스트림에 삽입되었다. 프로모터가 없거나 tbs 서열이 없는 대조들, 및 단지 제 1 또는 제 2 ORF가 TRAP-tbs에 의해 조절되는 대안적인 CMV 프로모터 구조체들이 만들어졌다(도 27ⅰ).
HEK293T 세포들에서 벡터 입자들을 만들기 위해 7개의 벡터 게놈이 사용되었다. pEF1a-coTRAP[H6] 또는 pBluescript (대조) 및 벡터 게놈 플라스미드 플러스 패키징 성분들에 의해 세포들이 공-형질감염되었다. 또한, 형질감염 효율 대조를 제공하기 위해 (전체 DNA에 대해 1:40 비율)로 pGL3-대조(SV40 프로모터 구동 Renilla reniformis, 발광효소)가 첨가되었다. 플라스미드들의 비율은 게놈(4.5)|GagPol(1.5)|Rev(1.1)|VSVG(0.7)|TRAP/청스크립트(0.56)|pGL3 대조(0.23)이었다. 각각의 조건을 갖는, 2개의 플레이트의 96-웰 규모에서 형질감염들이 세 차례 발생했다. 형질감염 1일 후, 새로운 배지로 배지를 교체하기 전에, 5 내지 6시간 동안 10mM 소디움 부티레이트에 의해 배양물들이 유도되었다(전형적인 벡터 생산 방법). 생산 종료 세포들은 제 1 위치에서의 발현을 측정하는 Dual luciferase® 리포터 분석 프로토콜(Promega)에 따라 수동적인 용해 버퍼에 용해되거나, 제 2 위치에서 발현을 측정하는 GFP 발현 스코어(MFI x % GFP)를 생성하기 위해 유동 세포 측정법에 의해 분석되었다. 용해물들은 제조자의 방법을 사용하여 상기 프로토콜에 따라 Dynex MLX 플레이트 리더를 사용하여 개똥벌레 발광효소 발현에 대해 분석되었다.
벡터 생산 세포들에서의 바이시스트론 카세트들에 대한 발현 데이터는 도 27ⅱ에 제시된다. 예상대로, tbs'의 부재로 인해, TRAP가 공급된 경우 pHIV-CMV-Luc-iGFP로부터 GFP 또는 발광효소의 억제는 관찰되지 않았다. 발광효소 발현의 억제가 pHIV-CMV-tbsLuc-itbsGFP 및 pHIV-CMV-tbsLuc-iGFP에서는 관찰되었지만, pHIV-CMV-Luc-itbsGFP에서는 관찰되지 않았다. GFP 발현의 복제가 pHIV-CMV-tbsLuc-itbsGFP 및 pHIV-CMV-Luc-itbsGFP에서는 관찰되었지만, pHIV-CMV-tbsLuc-iGFP에서는 관찰되지 않았다.
흥미롭게, 프로모터가 없는 벡터 게놈 pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP가 CMVp 변이체들보다 100배 낮은 수준에서 발광효소를 발현시키는 동안, 이러한 발현 수준은 TRAP에 의해 억제될 수 있었다. (TRAP의 부재 하에서) 발광효소의 이러한 낮은 수준의 발현은 CAP 의존 방식 즉, 전체 길이 벡터 RNA의 5' 말단으로부터 스케닝하는 리보솜에서 전체 길이 벡터 게놈 RNA로부터 유래되었다. 따라서, TRAP는 전체 길이 벡터 게놈 RNA의 tbs에 결합할 수 있고, 내부 전사물뿐만 아니라 이러한 더 긴 RNA로부터의 형질전환유전자 발현을 차단할 수 있다. 이것은 아마도 단지 GFP 번역을 구동하는 IRES 요소로 인해, 높은 수준의 GFP가 pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP에 의해 발현되었다는 사실에 의해 또한 입증되었다. TRAP는 pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP에 의해 유래된 전체 길이 벡터 게놈 RNA로부터 GFP의 이러한 발현을 억제할 수 있었다. 이것은 발광효소 발현이 (CMVp 구조체들과 비교하여) 낮음에도 불구하고, 조직-특이적 구조체 pHIV-VMD2-tbsLuc-itbsGFP 및 pHIV-mAlb-hAAT-tbsLuc-itbsGFP가 (TRAP의 부재 하에서) pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP와 비교하여 유사한 GFP의 수준들을 생산한다는 사실에 의해 지지되고, 이는 GFP 발현의 대부분이 내부 프로모터 구동 카세트로부터 오지 않았다는 것을 입증한다. (전체 길이 벡터 게놈 RNA로부터의) 이러한 수준의 GFP 발현은 TRAP에 의해 또한 효율적으로 억제될 수 있었다. 마지막으로, pHIV-VMD2-tbsLuc-itbsGFP 및 pHIV-mAlb-hAAT-tbsLuc-itbsGFP로부터의 발광효소 발현의 수준들은 pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP의 것보다 2배 이하이었고, 이는 이들 조직-특이적 프로모터들이 HEK293T 세포들에서 약간 누출된다는 것을 나타낸다. 심지어 이러한 낮은 수준의 발광효소 발현도 TRAP에 의해 억제되었다.
이들 관찰들은 도 27ⅱ에 제공된 개략도에 요약된다. 이들 데이터는 TRIP 시스템이 멀티시스트론 형질전환유전자들을 동시에 억제할 수 있고, 조직-특이적 프로모터들을 사용하는 이상의 장점들을 갖는다는 것을 보여준다. 레트로바이러스 벡터 생산을 위해, 많은 양의 전체 길이의 벡터 게놈 RNA가 세포 내에서 전사되어야 하지만, 여기에서 우리는, 특히 IRES 요소가 사용되는 경우, 형질전환유전자 단백질의 번역이 이러한 전체 길이 분자로부터 가능하다는 것을 입증한다. TRIP 시스템은 번역 수준에서 발현을 매개하기 때문에, 내부적으로 유래된 형질전환유전자 카세트 mRNA뿐만 아니라, 전체 길이 벡터 게놈 RNA로부터의 형질전환유전자 발현을 억제할 수 있다.
실시예 17. DNA 기반 바이러스 벡터의 생산에서의 TRAP/tbs 매개 형질전환유전자 억제의 유용성 입증; 사례 연구 1 - AAV 기반 벡터들
다음의 연구는 레트로/렌티바이러스와 같이 RNA 기반 바이러스 벡터 시스템들에 대해 기술된 것과 유사한 방식으로 TRAP-tbs 구성을 사용하는 TRiPAAV 벡터 생산 시스템을 기술한다. 도 28ⅰ는 다음의 발현 카세트들 즉, [1] 형질전환유전자의 5'UTR 내 (및/또는 (IRES와 다운스트림 형질전환유전자 사이)에 tbs가 삽입되도록 변형된 AAV 벡터 게놈, [2] repcap 발현 플라스미드, [3] 헬퍼 함수들(예를 들어, 아데노바이러스 E2A, E4orf6, VA 유전자), 및 [4] TRAP 발현 카세트 (일시적으로 형질감염되거나 안정적인 TRAP 세포주)를 포함하는 생산 세포(예를 들어, 아데노바이러스 E1 발현 세포; HEK293 기반 세포, PER.C6 기반 세포)들을 포함하는 TRiPAAV 시스템의 비제한적 예를 표시한다.
형질전환유전자 발현이 AAV 벡터 생산 세포들에서 억제될 수 있는 지를 테스트하기 위해, HEK293T 세포들에서의 자기 보완 (sc)AAV-(CMV)-tbsGFP 벡터(혈청형 2)의 생산에 TRiPAAV 시스템이 적용되었다. 우선, TRAP 매개 억제에 대한 repcap 및 아데노바이러스 헵퍼 함수들의 동시 발현의 영향을 테스트하였고, pCMV-tbsGFP 리포터 플라스미드와 비교하였다(도 28ⅱ). pEF1a-coTRAP[H6], pRepCap2 및 pHelper의 상이한 조합들에서(pEF1a-coTRAP[H6]에 대해 달리 명시되지 않는 한 10㎝ 플레이트 당 2㎍의 동일한 질량비에서 모두, 도 28ⅱ 참조), pscAAV-GFP 또는 pscAAV-tbsGFP 또는 pCMV-tbsGFP에 의해 HEK293T 세포들이 세 차례 형질감염되었다. 예상대로, TRAP의 발현은 tbs가 부족한 pscAAV-GFP에 의한 GFP 발현에 영향을 미치지 않았다. pscAAV-tbsGFP로부터의 GFP 발현은 TRAP (1:1 비율에서의 TRAP 및 scAAV 벡터 게놈 플라스미드)의 존재 하에서 거의 3-Log까지 억제되었다. pHelper 또는 pRepCap2의 동시 발현은 이러한 수준의 TRAP 매개 억제에 영향을 미치지 않았다. pscAAV-tbsGFP, pRepCap2, pHelper 및 pEF1a-coTRAP[H6]가 모두 함께 형질감염된 경우 (즉, scAAV-tbsGFP 벡터 입자들이 생산되는 조건 하에서), TRAP에 의한 GFP 억제의 수준은 300배 이상이었다. scAAV-tbsGFP 생산의 조건 하에서 pEF1a-coTRAP[H6] (1:1[2㎍] 내지 10:1[0.2㎍]의 게놈과의 비율)의 10배 적정은 3-Log 억제가 TRAP 플라스미드의 더 큰 투입으로 가능할 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는 AAV 벡터 게놈 내에서의 전이 유전자 카세트의 발현이 TRiPAAV 시스템을 사용하여 적어도 300배까지 억제될 수 있고, 패키징/헬퍼 함수들 자체는 TRAP 매개 억제를 억제하지 않는다는 것을 입증한다.
기능적 AAV 벡터 입자들이 TRiPAAV 시스템을 사용하여 생산될 수 있다는 것을 입증하기 위해, scAAV2-[tbs]GFP 벡터 입자들이 pscAAV2-GFP 게놈(+/- tbs), pRepCap2, pHelper, 및 pEF1a-coTRAP[H6] (TRAP) 또는 pBluescript (-) (모든 DNA의 2㎍)에 의해 세포들을 형질감염시킴으로써 10㎝ 플레이트 규모에서 생산되었다. ~53시간 후에, 세포들을 동결 해동하였고, Virabind™ 키트를 사용하여 벡터 입자들을 정제하였고, 100 μL의 PBS 최종 부피까지 농축하였고, 이후 HEK293T 및 HEPG2 세포의 형질도입으로 적정하였다(도 28ⅲ). 이들 데이터는, AAV-GFP 벡터들이 표준 방법 하에서와 같이 TRiPAAV 시스템 하에서 동등한 역가로 생산될 수 있다는 것을 보여주고, 이는 tbs 변형 및 TRAP의 동시 발현이 AAV 벡터 생물학을 본질적으로 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 연구는 TRiPAAV 시스템을 사용하는 AAV 벡터 생산 세포들에서의 형질전환유전자 발현의 강력한 억제가 가능하고, 형질전환유전자 생성물의 활성이 AAV 벡터 입자 역가 또는 효능에 해로운 경우, 이러한 활성이 크게 감소될 것이라는 것을 보여준다.
TRiPAAV 벡터 시스템이 생산 세포들에서 AAV 벡터 게놈에 의해 인코딩된 높은 독성/문제적 형질전환유전자를 억제할 수 있다는 것을 입증하기 위해, scAAV2-tbsBarnase가 구성되었다(도 28ⅳA). 바르나제(Barnase)는 발현되는 경우 진핵 세포에 독성이 있는 강력한 박테리아 RABse이고, 침묵하지 않는다면 AAV 벡터 생산을 손상시키는 것으로 나타났다(Chen H., Mol Ther Nuc Acids., 1, e57; doi: 10.1038/mtna.2012.48, Nov 2012). HEK293T 및 HEK293T.TRiP[3D] 세포 배양물들은 단지 pscAAV-(CMV)-GFP만이 형질감염되거나, GFP 발현에 대한 바르나제의 효과를 관찰하기 위해 동일한 질량의 pscAAV2-GFP (도 28ivB) 및 pscAAV2-tbs 바르나제 게놈 플라스미드가 혼합되는 것을 제외하고, (pEF1a-coTRAP[H6] 없이), pRepCap2 및 pHelper 패키징 성분들에 의해 형질감염되었다. 도 28ⅴ:ⅰ 및 도 28v:ⅱ에 도시된 이들 배양물의 사진들은 형질감염 24시간 후에 촬영되었다. pscAAV-(CMV)-GFP 하나만으로 형질감염된 HEK293T 및 HEK293T.TRiP[3D] 배양물은 높은 수준의 GFP 발현을 생산했다(도 28ⅴ:ⅱ). 그러나, pscAAV-(CMV)-GFP 게놈 및 pscAAV-(CMV)-tbs바르나제에 의해 공-형질감염된 HEK293T 배양물들은 무시할 수 있는 수준의 GFP를 발현시켰고(도 28ⅴ:ⅰ), 이는, 아마도 형질전환유전자 mRNA 및 리보솜 RNa의 분해로 인해 바르나제 발현이 감소된 단백질 발현의 글로벌 효과를 야기시켰다는 것을 입증한다. 한편, 동일한 DNA 혼합에 의해 형질감염된 HEK293T.TRiP 배양물들은 약간의 실질적인 GFP 발현을 허용했고, 이는 이들 세포에서의 TRAP[H6]의 내생적 수준이 바르나제 발현을 억제했음을 나타낸다. 훨씬 더 높은 수준의 내생적 TRAP를 갖는 안정적인 세포주들을 분리함으로써 바르나제 억제를 개선할 수 있을 것으로 예상된다. 바이러스 벡터 생산 시 발현된 독성의 형질전환유전자 단백질로서의 바르나제의 모델링은 최악의 시나리오를 나타내고, (바이러스 벡터 성분들을 포함하여) 새로운 단백질 합성이 효과적으로 중단된다. 관찰된 HEK293T.TRiP 세포들에서의 GFP 발현의 적당한 복구가 제공되면, 이것은 AAV 벡터 성분 단백질들의 발현이 또한 발생되고, 바르나제 인코딩 AAV 벡터 입자들의 생산이 안정적인 TRAP 세포주들에서 가능하다는 것을 제안한다.
실시예 18. DNA 기반 바이러스 벡터 생산에서의 TRAP/tbs 매개 형질전환유전자 억제의 유용성 입증; 사례 연구 2 - 아데노바이러스 기반 벡터들
다음의 연구는 레트로/렌티바이러스와 같은 RNA 기반 바이러스 벡터 시스템, 및 DNA 기반 AAV 벡터(실시예 17)에 대해 기술한 것과 유사한 방식으로 TRAP-tbs 구성을 사용하는 TRIPAdeno 벡터 생산 시스템을 기술한다. 도 29ⅰ는 다음의 발현 카세트 즉, [1] tbs가 형질전환유전자의 5'UTR 내에 (및/또는 IRES와 다운스트림 형질전환유전자 사이에) 삽입되도록 수정된 아데노바이러스 기반 벡터 게놈, 및 [2] TRAP 발현 카세프(일시적으로 형질감염되거나 안정적인 TRAP 세포주)를 포함하는 생산 세포들(예를 들어, 아데노바이러스 E1 발현 세포; HEK293 기반 세포, PER.C6 기반 세포들)을 포함하는 TRIPAdeno 시스템의 비-제한적인 실시예를 표시한다. 선택적으로, E1이 삭제된 헬퍼 바이러스가 헬퍼 의존성 벡터 생산을 위해 동시 도입될 수 있다.
형질전환유전자 발현이 포유 동물 세포들에서의 벡터 DNA 재조합 시 TRIP아데노 시스템에서 억제될 수 있기 때문에 전체 길이 아데노-tbs형질전환유전자 벡터 게놈들을 생성할 수 있다는 것을 증명하기 위해, pAdeno-CMV-GFP 및 pAdeno-tbsGFP 셔틀 플라스미드(RAPAd® kit, Cell BioLabs)들이 구성되었다(도 29ⅱA). 이들은 형질전환유전자 카세트를 인코딩하는 (E1이 삭제된) 아데노바이러스 게놈의 좌변을 포함했다. 이들 셔틀 플라스미드는 우측 ITR에 대한 (E3 삭제된) Ad5 게놈의 나머지, 및 셔틀들에서 Ad5 서열들과의 중첩 상동성을 포함하는, pacAd5 9.2-100 (RAPAd® kit, Cell BioLabs)에 의해 병령 형질감염으로, 및 pEF1a-coTRAP[H6] (TRAP) 또는 pBlueScript (-)에 의해 HEK293T 세포들에 공-형질감염되었다(도 29ⅱB). TRAP 플라스미드에 대한 셔틀 플라스미드의 질량비는 5:1이었다. 복제 배양물들은 48시간 동안 배양되고 나서 유동 세포 분석법에 의해 GFP 발현에 대해 분석되거나(GFP 발현 스코어가 생성되었다; MFI x %GFP), 세포 변성 효과가 관찰될 때까지(~14일) 배양되었다. 가공하지 않은 아데노-CMV-GFP 및 아데노 CMV-tbsGFP 벡터 군체들은 세포들을 동결 해동하고, 세포 잔해를 제거하여 만들어졌고, 이후 HeLa 세포들에 대해 적정하였다.
도 29ⅱB의 데이터는 형질감염 48시간 후에 배양 내에서의 글로벌 GFP 발현을 표시하고, tbs가 TRAP의 존재 하에서 및 형질전환유전자 5'UTR 내에 존재하는 경우 형질전환유전자 발현이 2-Log까지 Ad 셔틀 플라스미드로부터 억제될 수 있다는 것을 보여준다. pacAd5 9.2-100에 의한 공-형질감염은 억제 수준에 영향을 미치지 않았기 때문에, 포유 동물 세포에서의 벡터 DNA 재조합 시 형질전환유전자 발현을 억제할 가능성이 있다는 것을 입증한다. 독성의 형질전환유전자 발현의 벡터 재조합들을 복구하는 능력을 무효화시킬 수 있기 때문에, 이것은 포유 동물 세포들에서의 아데노바이러스 벡터 생성에서 큰 발전을 의미한다.
TRIP아데노 시스템이 Ad 벡터 확장 시 형질전환유전자 발현을 억제할 수 있는 지를 테스트하기 위해, (TRAP[H6]를 안정적으로 발현시키는) HEK293T.TRIP[3D] 세포 또는 HEK293T 세포들이 0.01의 MOI에서 아데노-CMV-GFP 및 아데노-CMV-tbsGFP로 형질도입되었다. 접종 후 상이한 시점에서 벡터 확장 시 GFP 발현 및 생성된 GFP 발현 스코어(MFI x %GFP)들에 대해 복제 배양물들을 분석하였다. 본 실험의 결과들은 도 29ⅲ에 표시되고, HEK293T.TRIP[3D] 세포주에서만 아데노-CMV-tbsGFP 확장 시 GFP 발현이 400배 이상까지 억제됨을 보여준다. 아데노-CMV-GFP 확장 시 GFP 발현은 예상대로 세포주들의 어느 하나와 유사했다(즉, 억제되지 않았다).
TRAP의 존재 하에서 생산된 아데노-CMV-GFP 및 아데노-CMV-tbsGFP의 벡터 군체들은 접종 48시간 후에 세포들로부터 하베스트되었다; 잔해를 제거하고, HeLa 세포들에 대해 적정하였다(도 29ⅲB). HEK293T 또는 HEK293T.TRIP[3D] 세포에서 생산된 벡터의 역가는 동일했고, 이는 TRAP의 동시 발현 및 tbs 변형이 아데노바이러스 벡터 생물학을 본질적으로 방해하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 연구는 TRIP아데노 시스템을 사용하는 아데노바이러스 벡터 생산 세포에서 형질전환유전자 발현의 강력한 억제가 가능하고, 형질변환유전자 생성물의 활성이 아데노바이러스 벡터 입자 역가 또는 효능에 해로운 경우, 이 활성은 크게 감소될 것이라는 것을 보여준다.
상기 명세서에서 언급된 모든 출판물들은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 기술된 양태들의 다양한 수정 및 변경들은 본 발명의 범위 및 사상에서 벗어나지 않고 당업자들에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정한 바람직한 실시형태들과 관련하여 기술하였지만, 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시형태들에 한정되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 사실, 생화학 및 생명공학 또는 관련 분야의 당업자들에게 명백한 본 발명을 실시하기 위한 기술된 모드들의 다양한 수정들은 다음의 청구범위들의 범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (76)

  1. 관심의 뉴클레오티드(NOI)에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터로서, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있으며,
    RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인 바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 관심의 뉴클레오티드가 RNA-결합 단백질이 결여된 표적 세포에서 번역되는 것인 바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2-3의 다중 반복을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2의 다중 반복을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  5. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2의 적어도 6회 반복을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2-3의 적어도 8회 반복을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  7. 제6항에 있어서, RAGNNN 반복의 횟수가 1 이하인 것인 바이러스 벡터.
  8. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2의 8 내지 11회 반복을 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  9. 제1항에 있어서, TRAP 결합 부위가 서열 RAGN2-3의 11회 반복을 포함하고, RAGNNN 반복의 횟수는 3 이하인 것인 바이러스 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 관심의 뉴클레오티드가 치료 효과를 일으키는 것인 바이러스 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 핵산 서열이 RRE 서열을 더 포함하는 것인 바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 단순 포진 바이러스(herpes simplex virus), 우두 바이러스(vaccinia virus) 또는 바큐로바이러스(baculovirus)로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래된 레트로바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  15. 바이러스 벡터의 생산에 필요한 성분들을 인코딩하는 핵산 서열의 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서,
    벡터 게놈은, 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있으며, RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인, 바이러스 벡터 생산 시스템.
  16. 제15항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이고, 바이러스 벡터 생산 시스템이 Gag 및 Pol 단백질, RNA-결합 단백질, 및 Env 단백질을 인코딩하는 핵산 서열들을 더 포함하는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 시스템이 rev를 인코딩하는 핵산 서열 을 더 포함하는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  19. 제16항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  20. 제19항에 있어서, 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터 생산 시스템.
  21. 핵산 서열을 포함하는, 제15항의 바이러스 벡터 생산 시스템에 사용하기 위한 DNA 구조체(construct)로서,
    상기 핵산 서열은 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있으며, RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인, DNA 구조체.
  22. 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제15항의 바이러스 벡터 생산 시스템에 사용하기 위한 DNA 구조체.
  23. 제21항의 DNA 구조체, Gag 및 Pol 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체, 및 Env 단백질을 인코딩하는 DNA 구조체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템에 사용하기 위한 DNA 구조체 세트로서,
    상기 바이러스 벡터 생산 시스템은 바이러스 벡터의 생산에 필요한 성분들을 인코딩하는 핵산 서열의 세트를 포함하고, 벡터 게놈은, 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것인, DNA 구조체 세트.
  24. 제23항에 있어서, RNA-결합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템에 사용하기 위한 DNA 구조체를 더 포함하는 DNA 구조체 세트로서,
    상기 바이러스 벡터 생산 시스템은 바이러스 벡터의 생산에 필요한 성분들을 인코딩하는 핵산 서열의 세트를 포함하고, 벡터 게놈은, 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것인, DNA 구조체 세트.
  25. 제23항에 있어서, rev 서열을 인코딩하는 DNA 구조체를 더 포함하는 것인 DNA 구조체 세트.
  26. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 서열, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 DNA 구조체 또는 DNA 구조체 세트를 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포.
  27. 제26항에 있어서, 세포가,
    관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위와,
    상호작용할 수 있는 RNA-결합 단백질을 인코딩하는 벡터로 일시적으로 형질감염(transfection)되며,
    RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인는 것인, 바이러스 벡터 생산 세포.
  28. 제26항에 있어서, 세포가,
    관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위와,
    상호작용할 수 있는 RNA-결합 단백질을 안정적으로 발현하며,
    RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인, 바이러스 벡터 생산 세포.
  29. 제26항에 있어서, 세포가,
    관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위와,
    상호작용할 수 있는 RNA-결합 단백질을 안정적으로 발현하고, 그리고 별개의 구조체로부터 RNA-결합 단백질을 일시적으로 발현하며,
    RNA-결합 단백질은 트립토판 RNA-결합 감쇠(attenuation) 단백질(TRAP)인 것인, 바이러스 벡터 생산 세포.
  30. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 서열, 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템, 또는 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항의 DNA 구조체 또는 DNA 구조체 세트를 바이러스 벡터 생산 세포 내로 도입하는 단계, 및 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건하에서 생산 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 바이러스 벡터를 생산하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 세포가,
    관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되고 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 결합 부위와,
    상호작용할 수 있는 RNA-결합 단백질을 포함하며, 그리고
    RNA-결합 단백질이 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)인 것인 방법.
  32. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 생산 시스템에 의해 생산되는 바이러스 벡터.
  33. 제26항의 바이러스 벡터 생산 세포를 사용하여 생산되는 바이러스 벡터.
  34. 제30항의 방법에 의해 생산되는 바이러스 벡터.
  35. 제32항에 있어서, 바이러스 벡터가,
    관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것인 바이러스 벡터.
  36. 제32항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래된 레트로바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  38. 제37항에 있어서, 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  39. 제33항에 있어서, 바이러스 벡터가, 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것인 바이러스 벡터.
  40. 제33항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래된 레트로바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  42. 제41항에 있어서, 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  43. 제34항에 있어서, 바이러스 벡터가, 관심의 뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 결합 부위를 포함하는 핵산을 포함하고, 상기 결합 부위는 상기 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 RNA-결합 단백질과 상호작용할 수 있는 것인 바이러스 벡터.
  44. 제35항에 있어서, 바이러스 벡터가 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스로부터 유래되는 것인 바이러스 벡터.
  45. 제44항에 있어서, 바이러스 벡터가 렌티바이러스로부터 유래된 레트로바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 바이러스 벡터가 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(visna lentivirus)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터인 것인 바이러스 벡터.
  47. 제1항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 생체 외(ex vivo) 세포.
  48. 제32항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 생체 외(ex vivo) 세포.
  49. 제33항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 생체 외(ex vivo) 세포.
  50. 제34항의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 생체 외(ex vivo) 세포.
  51. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 바이러스 벡터.
  52. 제32항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 바이러스 벡터.
  53. 제33항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 바이러스 벡터.
  54. 제34항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 바이러스 벡터.
  55. 제47항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 생체 외(ex vivo) 세포.
  56. 제48항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 생체 외(ex vivo) 세포.
  57. 제49항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 생체 외(ex vivo) 세포.
  58. 제50항에 있어서, 의약에 사용하기 위한 생체 외(ex vivo) 세포.
  59. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 제47항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  60. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제48항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  61. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제49항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  62. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제50항의 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  63. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제32항의 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  64. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제33항의 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  65. 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 제34항의 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물.
  66. 핵산 결합 부위에 작동 가능하도록 연결될 때 관심의 뉴클레오티드의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되도록 상호작용할 수 있는 핵산 결합 단백질 및/또는 핵산 결합 부위을 식별하는 방법으로서, 리포터 유전자에 작동 가능하도록 연결된 상기 핵산 결합 부위와 상기 핵산 결합 단백질 양자 모두를 포함하는 세포에서 상기 리포터 유전자의 발현을 분석하는 단계를 포함하며, 핵산 결합 단백질이 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)이고, 핵산 결합 부위가 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질(TRAP)에 결합할 수 있는 것인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 리포터 유전자가 형광 단백질을 인코딩하는 것인, 방법.
  68. 바이러스 벡터 생산 세포에서 관심의 뉴클레오티드(NOI)의 번역을 억제하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 정의된 핵산 서열 및 RNA-결합 단백질(RBP)을 인코딩하는 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, RBP는 RBP 결합 부위에 결합하고 이에 의해 NOI의 번역을 억제하는 것인, 방법.
  69. 진핵 세포 백터 생산 세포에서 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 벡터 생산 시스템 및 RNA-결합 단백질(RBP)을 인코딩하는 핵산 서열을 진핵세포 벡터 생산 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, RBP는 RBP 결합 부위에 결합하고, NOI의 번역을 억제하며, 이에 의해 RBP 결합 부위를 가지지 않는 바이러스 벡터에 비해 바이러스 벡터 역가를 증가시키는 방법.
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
KR1020167019013A 2013-12-20 2014-12-19 바이러스 벡터 생산 시스템 KR102354365B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1322798.8 2013-12-20
GBGB1322798.8A GB201322798D0 (en) 2013-12-20 2013-12-20 Production system
PCT/GB2014/053813 WO2015092440A1 (en) 2013-12-20 2014-12-19 Viral vector production system

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160122125A KR20160122125A (ko) 2016-10-21
KR102354365B1 true KR102354365B1 (ko) 2022-01-20

Family

ID=50071322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167019013A KR102354365B1 (ko) 2013-12-20 2014-12-19 바이러스 벡터 생산 시스템

Country Status (10)

Country Link
US (2) US10544429B2 (ko)
EP (2) EP3650548B1 (ko)
JP (3) JP6655014B2 (ko)
KR (1) KR102354365B1 (ko)
CN (1) CN106029891B (ko)
DK (1) DK3083969T3 (ko)
ES (2) ES2911805T3 (ko)
GB (1) GB201322798D0 (ko)
PL (1) PL3083969T3 (ko)
WO (1) WO2015092440A1 (ko)

Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
AU2015346162B2 (en) 2014-11-14 2022-02-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
CN112375760A (zh) 2014-11-14 2021-02-19 沃雅戈治疗公司 调节性多核苷酸
WO2016094783A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
WO2016149254A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 Chimera Bioengineering, Inc. Smart car devices, de car polypeptides, side cars and uses thereof
US11052111B2 (en) 2015-12-08 2021-07-06 Chimera Bioengineering, Inc. Smart CAR devices and DE CAR polypeptides for treating disease and methods for enhancing immune responses
WO2017106202A2 (en) * 2015-12-14 2017-06-22 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for ocular disorders
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF DISEASES
US10222369B2 (en) 2016-05-17 2019-03-05 Chimera Bioengineering, Inc. Methods for making novel antigen binding domains
RU2764587C2 (ru) 2016-05-18 2022-01-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для лечения хореи гентингтона
SG11201809699XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Voyager Therapeutics Inc Modulatory polynucleotides
US11298041B2 (en) 2016-08-30 2022-04-12 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
WO2018045177A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Chimera Bioengineering, Inc. Gold optimized car t-cells
CN109863243B (zh) * 2016-09-30 2023-07-28 埃斯蒂文制药股份有限公司 用于治疗粘多糖症的腺相关病毒载体
CA3039673A1 (en) 2016-10-20 2018-04-26 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for the treatment of fabry disease
US11783918B2 (en) 2016-11-30 2023-10-10 Microsoft Technology Licensing, Llc DNA random access storage system via ligation
US10793897B2 (en) * 2017-02-08 2020-10-06 Microsoft Technology Licensing, Llc Primer and payload design for retrieval of stored polynucleotides
CA3056542A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Oxford Biomedica (Uk) Limited Method
GB201706121D0 (en) * 2017-04-18 2017-05-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Stable cell lines for retroviral production
JP2020518258A (ja) 2017-05-05 2020-06-25 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）治療組成物および方法
SG11201909868YA (en) 2017-05-05 2019-11-28 Voyager Therapeutics Inc Compositions and methods of treating huntington's disease
CA3099990A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 University Of Massachusetts Viral vector production
EP3638316A4 (en) 2017-06-14 2021-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN111132626B (zh) 2017-07-17 2024-01-30 沃雅戈治疗公司 轨迹阵列引导系统
JP2020530993A (ja) * 2017-08-02 2020-11-05 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体または改変ｔｃｒを発現し、選択的に発現されるヌクレオチド配列を含む細胞
EP3694988A4 (en) 2017-10-10 2021-07-14 NantBio, Inc. MODIFIED EC7 CELLS WITH LOW TOXICITY TO VIRAL PRODUCTION LOADS
JP2021502060A (ja) 2017-10-16 2021-01-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドＶｏｙａｇｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 筋萎縮性側索硬化症（ａｌｓ）の治療
WO2019079242A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Voyager Therapeutics, Inc. TREATMENT OF AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS (ALS)
EP3633040B1 (en) 2017-12-22 2023-06-07 Oxford BioMedica (UK) Limited Retroviral vector
US11110125B2 (en) 2018-02-13 2021-09-07 Chimera Bioengineering, Inc. Coordinating gene expression using RNA destabilizing elements
CN113056561A (zh) * 2018-04-05 2021-06-29 牛津大学科技创新有限公司 用于治疗黄斑营养不良的组合物和方法
GB201807945D0 (en) * 2018-05-16 2018-06-27 Ospedale San Raffaele Srl Vector production
US20220348958A1 (en) * 2019-07-23 2022-11-03 Oxford Biomedica (Uk) Limited Enhancing Production of Lentiviral Vectors
CN114786686A (zh) 2019-08-18 2022-07-22 嵌合体生物工程公司 Gold控制的转基因的联合疗法
KR20210026024A (ko) 2019-08-29 2021-03-10 변정원 학습에 대한 보상을 제공하여 동기부여를 높이는 학습 보조 어플리케이션
JP2023504593A (ja) 2019-11-12 2023-02-06 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド 産生系
WO2021160993A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Oxford Biomedica (Uk) Limited Production of lentiviral vectors
WO2021183674A1 (en) * 2020-03-11 2021-09-16 Remotor Therapeutics, Inc. Methods and materials for disseminating a protein throughout the central nervous system
JP2023516493A (ja) 2020-03-13 2023-04-19 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド レンチウイルスベクター
GB202007199D0 (en) 2020-05-15 2020-07-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vector production
CN113699112A (zh) * 2020-05-20 2021-11-26 苏州方德门达新药开发有限公司 表达重组hsv-1 us11蛋白的工程细胞及其在提高慢病毒包装效率中的应用
GB202017725D0 (en) 2020-11-10 2020-12-23 Oxford Biomedica Ltd Method
CN112430582B (zh) * 2020-12-04 2022-05-03 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种慢病毒稳定包装细胞系及其制备方法
CN112501210B (zh) * 2020-12-07 2022-08-05 和元生物技术（上海）股份有限公司 外源基因可控表达的慢病毒包装方法
GB202114534D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Novel viral regulatory elements
GB202114530D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
GB202114532D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral Vectors
GB202114529D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
GB202114528D0 (en) 2021-10-12 2021-11-24 Oxford Biomedica Ltd Lentiviral vectors
CN114181972A (zh) * 2021-11-23 2022-03-15 上海本导基因技术有限公司 适用于难治性血管新生性眼疾病基因治疗的慢病毒载体
CN114107231B (zh) * 2021-12-13 2023-08-18 重庆大学 实现全脑突触后神经元胞体标记的重组腺相关病毒及其应用
CN114639442B (zh) * 2022-03-30 2024-01-30 中国农业科学院农业基因组研究所 一种基于单核苷酸多态性预测开放阅读框的方法及系统
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
CN115161345A (zh) * 2022-06-14 2022-10-11 同宜医药（苏州）有限公司 高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途
GB202211935D0 (en) 2022-08-16 2022-09-28 Oxford Biomedica Ltd envelope proteins
CN116621947B (zh) * 2023-07-18 2023-11-07 北京智源人工智能研究院 一种基于索烃骨架的拓扑蛋白质、制备方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010135716A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Research Foundation Of State University Of New York Trans-acting rna switches

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US5512421A (en) 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
EP0783575B1 (en) 1994-09-19 1999-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Anti-sickling beta-globin protein, compositions and methods for treating sickle cell disease
GB9510272D0 (en) 1995-05-22 1995-07-19 Isis Innovation Retroviral vectors
US5723315A (en) 1996-08-23 1998-03-03 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
DE69729007T2 (de) 1996-08-07 2005-04-07 Darwin Discovery Ltd., Slough Hydroxamsäure- und carbonsäure-derivate mit mmp und tnf hemmender wirkung
US6126939A (en) 1996-09-03 2000-10-03 Yeda Research And Development Co. Ltd. Anti-inflammatory dipeptide and pharmaceutical composition thereof
IL129017A0 (en) 1996-10-17 2000-02-17 Oxford Biomedica Ltd Retroviral vectors
US6924123B2 (en) 1996-10-29 2005-08-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Lentiviral LTR-deleted vector
KR100712256B1 (ko) 1997-10-02 2007-04-27 알토 바이오사이언스 코포레이션 가용성 단일쇄 ｔ-세포 수용체 단백질
JP4578678B2 (ja) 1997-12-22 2010-11-10 オックスフォード バイオメディカ（ユーケー）リミテッド ウマ伝染性貧血ウイルス（ｅｉａｖ）系
GB9803351D0 (en) 1998-02-17 1998-04-15 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
AU4924199A (en) * 1998-07-30 2000-02-21 Advec, Inc. Repressor proteins producing cell lines for the propagation of vectors
GB9904905D0 (en) 1999-03-03 1999-04-28 Oxford Biomedica Ltd Cells
GB0009760D0 (en) 2000-04-19 2000-06-07 Oxford Biomedica Ltd Method
PT1421115E (pt) 2001-08-31 2005-07-29 Avidex Ltd Receptor de celulas t soluvel
EP1504108B1 (en) 2002-02-01 2013-04-17 Oxford Biomedica (UK) Limited Lentiviral vector
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
GB0526211D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Viral vectors
GB0526210D0 (en) 2005-12-22 2006-02-01 Oxford Biomedica Ltd Vectors
PL2307551T3 (pl) 2008-06-18 2017-07-31 Oxford Biomedica (Uk) Limited Oczyszczanie wektorów retrowirusowych
GB201118636D0 (en) 2011-10-28 2011-12-07 Oxford Biomedica Ltd Nucleotide sequence
WO2014043131A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The Regents Of The University Of California Lentiviral vector for stem cell gene therapy of sickle cell disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010135716A1 (en) 2009-05-22 2010-11-25 The Research Foundation Of State University Of New York Trans-acting rna switches

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 19, pp5528-5540. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015092440A1 (en) 2015-06-25
EP3083969B1 (en) 2019-08-07
PL3083969T3 (pl) 2020-03-31
US20200102578A1 (en) 2020-04-02
JP2022091989A (ja) 2022-06-21
ES2748377T3 (es) 2020-03-16
JP7340471B2 (ja) 2023-09-07
GB201322798D0 (en) 2014-02-05
CN106029891B (zh) 2021-09-07
EP3650548A1 (en) 2020-05-13
EP3650548B1 (en) 2022-03-09
ES2911805T3 (es) 2022-05-20
US20160333373A1 (en) 2016-11-17
JP6655014B2 (ja) 2020-02-26
EP3083969A1 (en) 2016-10-26
KR20160122125A (ko) 2016-10-21
JP7340471B6 (ja) 2024-02-26
US10544429B2 (en) 2020-01-28
JP2017500870A (ja) 2017-01-12
DK3083969T3 (da) 2019-10-14
JP2020096609A (ja) 2020-06-25
CN106029891A (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7340471B6 (ja) ウイルスベクター産生系
ES2951857T3 (es) Vector retroviral
US20230118587A1 (en) Lentiviral Vectors
US20240052366A1 (en) Production of Lentiviral Vectors
US20230002777A1 (en) Production System
US20220348958A1 (en) Enhancing Production of Lentiviral Vectors
US20230183742A1 (en) Viral Vector Production
WO2023062359A2 (en) Novel viral regulatory elements
WO2023062365A2 (en) Lentiviral vectors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant