JP2023516493A - レンチウイルスベクター - Google Patents

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Abstract

本発明は、ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。【選択図】図１

Description

本発明はレンチウイルスベクターおよびその製造に関する。より詳細には、本発明は、ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、修飾されたウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムに関する。本発明はまた、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列を欠く、または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片を欠くレンチウイルスベクターゲノムを提供する。そのようなレンチウイルスベクターゲノムを含む方法および使用も本発明に含まれる。
過去数十年にわたるワクチンおよびヒト遺伝子治療に向けたウイルスベクターの開発および製造は科学文献および特許に十分に記載されている。治療効果を得るために導入遺伝子（トランスジーン）を送達するための操作されたウイルスの使用は広範囲にわたる。γ－レトロウイルスおよびレンチウイルスのようなＲＮＡウイルス（Ｍｕｈｌｅｂａｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら，２０１０，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１３：３４７－３７０；Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍ．Ｎ．，Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｋ．Ａ． ＆ Ａｎａｋｏｋ，Ｏ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：３６３－３７４）、ならびにアデノウイルス（Ｃａｐａｓｓｏ，Ｃ．ら，２０１４，Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：８３２－８５５）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：４４５－４５１）のようなＤＮＡウイルスに基づく現代の遺伝子治療ベクターは益々多数のヒト疾患適応における有望さを示している。これらには、血液学的病態に対する患者細胞のエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）修飾（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．＆ Ｋａｋａｒｌａ，Ｓ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０：１４５－１５０；Ｔｏｕｚｏｔ，Ｆ．ら，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１４：７８９－７９８）、ならびに眼科疾患（Ｂａｌａｇｇａｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ａｌｉ，Ｒ．Ｒ．，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９：１４５－１５３）、心血管疾患（Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｇ．ら，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：９１４－９２７）、神経変性疾患（Ｃｏｕｎｅ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．＆ Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，４：ａ００９４３１）および腫瘍治療（Ｐａｚａｒｅｎｔｚｏｓ，Ｅ．＆ Ｍａｚａｒａｋｉｓ，Ｎ．Ｄ．，２０１４，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．，８１８：２５５－２８０）のインビボ治療が含まれる。
臨床試験におけるこれらのアプローチの成功が規制当局の承認および商業化に向けて継続しており、例えばワクチン接種および遺伝子治療の状況における、患者へのウイルスベクターの投与に関わる安全性の観点が、特に重要となっている。
改善された安全性プロファイルを有するウイルスベクターが当技術分野において依然として必要とされている。
更に、治療効果のために使用される導入遺伝子のサイズが増加しつつある。したがって、ウイルスベクターの収容能力、すなわち、ウイルスベクターが運搬しうる導入遺伝子（またはペイロード）のサイズを増加させることが、当技術分野において依然として必要とされている。
Ｍｕｈｌｅｂａｃｈ，Ｍ．Ｄ．ら，２０１０，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，１３：３４７－３７０ Ａｎｔｏｎｉｏｕ，Ｍ．Ｎ．，Ｓｋｉｐｐｅｒ，Ｋ．Ａ． ＆ Ａｎａｋｏｋ，Ｏ．，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：３６３－３７４ Ｃａｐａｓｓｏ，Ｃ．ら，２０１４，Ｖｉｒｕｓｅｓ，６：８３２－８５５ Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ａ．＆ Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｄ．Ｖ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１５：４４５－４５１ Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．＆ Ｋａｋａｒｌａ，Ｓ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．，２０：１４５－１５０ Ｔｏｕｚｏｔ，Ｆ．ら，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１４：７８９－７９８ Ｂａｌａｇｇａｎ，Ｋ．Ｓ．＆ Ａｌｉ，Ｒ．Ｒ．，２０１２，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９：１４５－１５３ Ｋａｔｚ，Ｍ．Ｇ．ら，２０１３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２４：９１４－９２７ Ｃｏｕｎｅ，Ｐ．Ｇ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．Ｌ．＆ Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．，２０１２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｍｅｄ．，４：ａ００９４３１ Ｐａｚａｒｅｎｔｚｏｓ，Ｅ．＆ Ｍａｚａｒａｋｉｓ，Ｎ．Ｄ．，２０１４，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．，８１８：２５５－２８０
発明の概括
１つの態様においては、本発明は、レンチウイルスベクターゲノム内に存在するウイルス性シス作用配列［例えば、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）］内の内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の破壊に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つの内部ＯＲＦを破壊するためのウイルス性シス作用配列における修飾（例えば、少なくとも１つの内部ＯＲＦの開始を示すＡＴＧ配列を突然変異させることによるもの）が、修飾されたウイルス性シス作用配列がその機能を保持するように、例えば修飾されたＲＲＥがＲｅｖ結合能を保持するように、許容されることを見出した。
したがって、１つの態様においては、本発明は、ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列（ＡＴＧ配列は翻訳開始コドンとして機能しうる）を突然変異させることにより破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は、
ａ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および／または
ｂ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＲＲＥである。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＷＰＲＥである。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾された（以下、「修飾」と略称されうる）ＲＲＥおよび本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥを含む。
もう１つの態様においては、本発明は、ＲＲＥ内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、修飾Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列（ＡＴＧ配列は翻訳開始コドンとして機能しうる）を突然変異させることにより破壊されうる。
もう１つの態様においては、本発明は、ＷＰＲＥ内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、修飾ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。
もう１つの態様においては、本発明は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の欠失に基づく。本発明者らは、驚くべきことに、レンチウイルスベクターゲノムのバックボーンからのＧａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の欠失がレンチウイルスベクター産生中のベクター力価に有意な影響を及ぼさないことを見出した。
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列を欠く、または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片を欠くレンチウイルスベクターゲノムを提供する。レンチウイルスベクターゲノムは、例えば、Ｇａｇ－ｐ１７またはその断片を発現しないことが可能である。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されている少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含む。少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＲＲＥでありうる。少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＷＰＲＥでありうる。幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは修飾ＲＲＥおよび修飾ＷＰＲＥを含み、ここで、ＲＲＥ内の少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されており、ＷＰＲＥ内の少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されている。少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、修飾ＲＲＥは８個未満のＡＴＧ配列を含む。
もう１つの態様においては、本発明は、修飾ＲＲＥが８個未満のＡＴＧ配列を含む、修飾Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
幾つかの実施形態においては、ＲＲＥは完全長ＲＲＥである。幾つかの実施形態においては、ＲＲＥは最小ＲＲＥである。
幾つかの実施形態においては、ＲＲＥは、
ａ）配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む。
幾つかの実施形態においては、修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、ここで、群（ａ）～（ｈ）：
ａ）配列番号２の２７～２９位に対応するＡＴＧ、
ｂ）配列番号２の１９２～１９４位に対応するＡＴＧ、
ｃ）配列番号２の２０７～２０９位に対応するＡＴＧ、
ｄ）配列番号２の４３６～４３８位に対応するＡＴＧ、
ｅ）配列番号２の４８９～４９１位に対応するＡＴＧ、
ｆ）配列番号２の５７１～５７３位に対応するＡＴＧ、
ｇ）配列番号２の５９９～６０１位に対応するＡＴＧ、
ｈ）配列番号２の６６３～６６５位に対応するＡＴＧ
から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している。
幾つかの実施形態においては、修飾ＲＲＥは７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含む。
幾つかの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは７個未満のＡＴＧ配列を含む。幾つかの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは６個未満のＡＴＧ配列を含む。
もう１つの態様においては、本発明は、修飾されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供し、ここで、修飾ＷＰＲＥは７個未満のＡＴＧ配列を含む。
もう１つの態様においては、本発明は、修飾されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供し、ここで、修飾ＷＰＲＥは６個未満のＡＴＧ配列を含む。
幾つかの実施形態においては、ＷＰＲＥは、
ａ）配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号１２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
を含む。
幾つかの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれらに対して少なくとも８０％の同一性（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）を有する配列を含むことが可能であり、ここで、群（ａ）～（ｇ）：
ａ）配列番号１１の５３～５５位に対応するＡＴＧ、
ｂ）配列番号１１の７２～７４位に対応するＡＴＧ、
ｃ）配列番号１１の９１～９３位に対応するＡＴＧ、
ｄ）配列番号１１の１０４位～１０６位に対応するＡＴＧ、
ｅ）配列番号１１の１２１位～１２３位に対応するＡＴＧ、
ｆ）配列番号１１の１７０～１７２位に対応するＡＴＧ、および／または
ｇ）配列番号１１の４１１位～４１３位に対応するＡＴＧ
から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している。
幾つかの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含む。幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を含み、ここで、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されている。ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態においては、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は３個未満のＡＴＧ配列（例えば、２個未満または１個未満の内部ＡＴＧ配列）を含む。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠いている。レンチウイルスベクターゲノムは、例えば、Ｇａｇ－ｐ１７またはその断片を発現しないことが可能である。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノム内の主要（ｍａｊｏｒ）スプライスドナー部位が不活性化されている。主要スプライスドナー部位の３’側の潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライスドナー部位も不活性化されていてもよい。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、治療効果をもたらしうる、関心のあるヌクレオチドを更に含む。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムはトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位を更に含む。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムである。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクターを提供する。レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来しうる。
幾つかの実施形態においては、本発明のレンチウイルスベクターは導入遺伝子発現カセットである。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供する。
幾つかの実施形態においては、本発明のレンチウイルスベクターゲノムは、ベクター製造のためのＵ３またはｔａｔ非依存系におけるレンチウイルスベクターにおける使用に適切でありうる。本明細書に記載されているとおり、第３世代レンチウイルスベクターはＵ３／ｔａｔ非依存的であり、本発明によるレンチウイルスベクターゲノムは第３世代レンチウイルスベクターのコンテキストにおいて使用されうる。１つの実施形態においては、ｔａｔはレンチウイルスベクター製造系において提供されず、例えば、ｔａｔはトランスで提供されない。１つの態様においては、本明細書に記載されている細胞またはベクターまたはベクター製造系はｔａｔタンパク質を含まない。１つの実施形態においては、ＨＩＶ－１ Ｕ３はレンチウイルスベクター製造系に存在せず、例えば、ＨＩＶ－１ Ｕ３は、ベクターゲノム発現カセットの転写を駆動するためにシスで提供されない。
幾つかの実施形態においては、本発明のレンチウイルスベクターゲノムは、
ａ）ｔａｔ非依存的レンチウイルスベクターにおいて使用される；
ｂ）ｔａｔの非存在下で製造される；
ｃ）ｔａｔに非依存的に転写されている；
ｄ）Ｕ３非依存的レンチウイルスベクターにおいて使用される；
ｅ）Ｕ３プロモーターに非依存的に転写されている；または
ｆ）異種プロモーターにより転写されている。
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されているヌクレオチド配列の転写はＵ３の存在に依存的でない。ヌクレオチド配列はＵ３非依存的転写事象に由来しうる。ヌクレオチド配列は異種プロモーターに由来しうる。本明細書に記載されているヌクレオチド配列は天然Ｕ３プロモーターを含まないことが可能である。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、ヌクレオチド配列のセットを含むウイルスベクター製造系を提供し、ここで、該ヌクレオチド配列は、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分と、本発明のレンチウイルスベクターゲノムとをコードする。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノム、本発明のヌクレオチド配列、本発明の発現カセットまたは本発明のウイルスベクター製造系を含む細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、
ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに本発明のヌクレオチド配列もしくは本発明の発現カセット、または
ｂ）本発明のウイルスベクター製造系、ならびに
ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／もしくは、所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
を含むレンチウイルスベクターを製造するための細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、
（ｉ）ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに本発明のヌクレオチド配列もしくは本発明の発現カセット、または
ｂ）本発明のウイルスベクター製造系、ならびに
ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／もしくは、所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
を細胞内に導入する工程、
（ｉｉ）所望により、ベクター成分とレンチウイルスベクターゲノムとをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程、ならびに
（ｉｉｉ）レンチウイルスベクターの産生に適した条件下で細胞を培養する工程
を含む、レンチウイルスベクターの製造方法を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の方法により製造されるレンチウイルスベクターを提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノム、本発明のヌクレオチド配列、本発明の発現カセット、本発明のウイルスベクター製造系または本発明の細胞の、レンチウイルスベクターの製造のための使用を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥを含むヌクレオチド配列を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノムまたは本発明のレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターを、または本明細書に記載されているウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、レンチウイルスベクターの治療的有効量を含む、遺伝子治療により個体を治療するための医薬組成物を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、治療に使用するための、本発明のレンチウイルスベクター、または本発明のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織を提供する。
もう１つの態様においては、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達するための医薬の製造のための、本発明のレンチウイルスベクター、本発明の生産細胞、または本発明のレンチウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織の使用を提供する。
レンチウイルスベクターゲノム内のＲＲＥ－ｃｐｐｔ領域のＯＲＦの除去を示す概要図。上パネルは第３世代レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成を示す（ＲＮＡは５’Ｒ領域からコードされる）。略語説明：ＲＵ５（ＬＴＲ領域）、Ψ（コアパッケージングシグナル）、ＭＳＤ（主要スプライスドナー）、ｇａｇ（より広いパッケージングシグナルの一部としてｇａｇ ＯＲＦからの保持配列）、ＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）、ｓａ７（ＨＩＶ－１スプライスアクセプター７）、ｃｐｐｔ（中央ポリプリントラクト）、Ｐｒｏ（プロモーター）、ＮＯＩ（関心のあるヌクレオチド、例えば導入遺伝子ＯＲＦ）、ＰＲＥ（転写後調節エレメント）、ｐｐｔ（ポリプリントラクト）。この下に拡大されているのは、種々のフレームにおいてＲＲＥ－ｃｐｐｔ配列内に保持されている全サブＯＲＦの拡大図である。ｃｐｐｔはＡＴＧコドンおよびサブＯＲＦ（Ｐｏｌ遺伝子からのもの）をも含有する。全てのＡＴＧ配列およびそれぞれの修飾が示されている。標準的な現代的レンチウイルスベクターゲノムにおいては、ＲＲＥ（約８００ｎｔ）は本質的に野生型ＨＩＶ－１ゲノムの３’末端から再配置されており、この場合、その天然コンテキストにおいては、それはエンベロープＯＲＦと重複している。本発明以前には、残存エンベロープ部分的ＯＲＦを除去する試みは報告されておらず、これは、おそらく、ベクターゲノムＲＮＡから翻訳されうるであろう（「ＳＴＤ－ＲＲＥｃｐｐｔ」は、標準的なレンチウイルスベクターゲノム内で見出される典型的な配列である）。変異体「ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］」および「ＲＲＥ［８－ＡＴＧＫＯ］」は共に突然変異を含有し、その結果、ｃｐｐｔ領域を含む７残基を超える全サブＯＲＦが除去されているが、ＲＲＥ［８－ＡＴＧＫＯ］は、７残基の２つのサブＯＲＦを除去する突然変異をも含有する。新規変異体「ｍｉｎ－ＲＲＥ［２－ＡＴＧＫＯ］」（ｃｐｐｔサブＯＲＦ除去をも含む）は僅か２３４ｎｔのＲＲＥのトランケート化形態であり、サブＯＲＦも除去されている。 ７個を超える残基の全サブＯＲＦを欠くように修飾されたＲＲＥ変異体は完全に機能的である。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを一過性トランスフェクションにより無血清懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生させ、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した。変異体ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］を含有するベクターおよびＲＲＥを完全に欠く（しかしｃｐｐｔを保持する）ベクターと共に、標準ベクター（ＳＴＤＲＲＥｃｐｐｔ）を産生させた。データは、ＲＲＥおよびｃｐｐｔにおけるサブＯＲＦを欠く変異体が、ＡＴＧコドンを除去する一連の挿入ヌクレオチドの存在にもかかわらず、完全に機能的であったことを示している。 ７個を超える残基の全サブＯＲＦを欠くように修飾されたＲＲＥ変異体は修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡの存在下で完全に機能的である。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを一過性トランスフェクションにより無血清懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生させ、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した。変異体ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］を含有するベクターと共に、標準ベクター（ＳＴＤＲＲＥｃｐｐｔ）を産生させ、ベクターゲノムＲＮＡを標的化する修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡを、所望により、コトランスフェクトした（－／＋２５６Ｕ１）。ベクターゲノムＲＮＡを標的化する修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＲＮＡを安定化することにより、力価上昇をもたらすことが示されている。データは、ＲＲＥおよびｃｐｐｔにおけるサブＯＲＦを欠く新規変異体が完全に機能的であり、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる力価増強に依然として応答したことを示しており、このことは、標準ＲＲＥエレメントと新規ＲＲＥエレメントとの間で同様のレベルのｖＲＮＡが生成されたことを示している。 レンチウイルスベクターゲノム内のパッケージング配列のｇａｇ領域におけるＯＲＦの除去を示す概要図。上パネルは第３世代レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成を示す（ＲＮＡは５’Ｒ領域からコードされる）。略語説明：ＲＵ５（ＬＴＲ領域）、Ψ（コアパッケージングシグナル）、ＭＳＤ（主要スプライスドナー）、ｇａｇ（より広いパッケージングシグナルの一部としてのｇａｇ ＯＲＦからの保持配列）、ＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）、ｓａ７（ＨＩＶ－１スプライスアクセプター７）、ｃｐｐｔ（中央ポリプリントラクト）、Ｐｒｏ（プロモーター）、ＮＯＩ（関心のあるヌクレオチド、例えば導入遺伝子ＯＲＦ）、ＰＲＥ（転写後調節エレメント）、ｐｐｔ（ポリプリントラクト）。標準的な現代的レンチウイルスベクターゲノムにおいては、（典型的には）最初のＧａｇ ＡＴＧの約４５ｎｔ下流にフレームシフト突然変異（＋ＣＧ）を導入することによって潜在的Ｇａｇ発現を抑制する努力がなされており、その結果、２１残基の短いＯＲＦが得られており、そのうちの最初の１５個はＧａｇに由来する。この下に拡大されているのは、ｐ１７不安定性エレメント（ｐ１７－ＩＮＳ）、および種々のフレームにおいてｇａｇ内に保持されている全サブＯＲＦの拡大図である。全てのＡＴＧ配列およびそれらのそれぞれの修飾が示されている。標準的な現代的レンチウイルスベクターゲノムは、ｐ１７－ＩＮＳを保持する「ＳＴＤ－Ｇａｇ」構成を含有する。新規変異体「ΔＧａｇ［３－ＡＴＧＫＯ］」および「ΔＧａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳ」への修飾が示されている。ΔＧａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳ配列は、ＡＴＧ３を含むｐ１７－ＩＮＳ配列の全体を欠いており、したがって、約２５０ｎｔの追加的な導入遺伝子容量を提供することに注目すべきである。 サブＯＲＦを欠き、ｐ１７－ＩＮＳにおいて欠失しているＧａｇ配列は、レンチウイルスベクターのパッケージング領域のＧａｇ配列を機能的に置換しうる。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを一過性トランスフェクションにより無血清懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生させ、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した。ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］および「ΔＧａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳ」新規変異体配列を含有するベクターと共に、標準ベクター（ＳＴＤ－Ｇａｇ＋ＳＴＤＲＲＥｃｐｐｔ）を産生させ、ベクターゲノムＲＮＡを標的化する修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡを、所望により、コトランスフェクト（－／＋２５６Ｕ１）した。ベクターゲノムＲＮＡを標的化する修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＲＮＡを安定化することにより力価上昇をもたらすことが示されている。また、これらの比較を、天然主要スプライスドナー（ｗｔＭＳＤ）またはＭＳＤ突然変異体（２ＫＯ－ｍ５）を含有する標準レンチウイルスベクターにおいて行った。ＭＳＤはベクターゲノム内に「異常」スプライス産物を生成して、完全長のパッケージ可能なｖＲＮＡの減少をもたらすことが示されており、修飾Ｕ１ ｓＲＮＡの提供はＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターの力価を回復させうる。データは、ｐ１７－ＩＮＳにおける欠失およびｇａｇにおけるサブＯＲＦを欠く変異体が、ベクター機能／力価を保持しながら、ＲＲＥ変異体（７残基を超えるサブＯＲＦをも欠失している）と組合されうることを示している。ＭＳＤ突然変異変異体（２ＫＯ－ｍ５）も、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる力価増強に対する応答性を維持していた。このことは、標準Ｇａｇ－ＲＲＥｃｐｐｔエレメントと新規Ｇａｇ－ＲＲＥｃｐｐｔエレメントと間で同様のレベルのｖＲＮＡが生成されたことを示している。 レンチウイルスベクターゲノム内のｗＰＲＥにおけるＯＲＦの除去を示す概要図。上パネルは第３世代レンチウイルスベクター発現カセットの典型的な構成を示す（ＲＮＡは５’Ｒ領域からコードされる）。略語説明：ＲＵ５（ＬＴＲ領域）、Ψ（コアパッケージングシグナル）、ＭＳＤ（主要スプライスドナー）、ｇａｇ（より広いパッケージングシグナルの一部としてのｇａｇ ＯＲＦからの保持配列）、ＲＲＥ（ｒｅｖ応答エレメント）、ｓａ７（ＨＩＶ－１スプライスアクセプター７）、ｃｐｐｔ（中央ポリプリントラクト）、Ｐｒｏ（プロモーター）、ＮＯＩ（関心のあるヌクレオチド、例えば導入遺伝子ＯＲＦ）、ＰＲＥ（転写後調節エレメント）、ｐｐｔ（ポリプリントラクト）。標準的な現代的レンチウイルスベクターゲノムにおいては、ｗＰＲＥ Ｘ－タンパク質は典型的に除去されている。しかし、その他のサブＯＲＦを除去する試みは行われておらず、そのうちで最も重要なのは、ＷＨＶ Ｐｏｌ（ＲＮアーゼＨ ドメイン）に由来する約１６０残基のＯＲＦである。この下に拡大されているのは、「標準」において保持されている全サブＯＲＦの拡大図であり、ここで、Ｘ－タンパク質は除去されており（ｗＰＲＥ［Ｘ－ＫＯ］）、変異体「ｗＰＲＥΔＯＲＦ」においては、更に、残りの６個のＡＴＧコドンの全てが除去されている。 全サブＯＲＦを欠くように修飾されたｗＰＲＥ変異体は完全に機能的である。ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターを一過性トランスフェクションにより無血清懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生させ、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した。変異体ｗＰＲＥΔＯＲＦを含むベクターおよびｗＰＲＥを完全に欠くベクターと共に、標準ベクター（ｗＰＲＥ［Ｘ－ＫＯ］）を産生させた。データは、ｗＰＲＥにおけるサブＯＲＦを欠く変異体が、ＡＴＧコドンを除去する一連の挿入ヌクレオチドの存在にもかかわらず、驚くべきことに、完全に機能的であったことを示している。 Ｕ１ ｓｎＲＮＡ分子の概要図、および標的化配列をどのようにして修飾するかの一例。内因性非コード（ノンコーディング）ＲＮＡであるＵ１ ｓｎＲＮＡは、イントロンスプライシングの初期段階で、５’－（ＡＣ）ＵＵＡＣＣＵＧ－３’（灰色で強調表示されている）天然スプライスドナー標的化配列を介してコンセンサススプライスドナー部位（５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）に結合する。ステムループＩは、ポリＡ抑制に重要であることが示されているＵ１Ａ－７０Ｋタンパク質に結合する。ステムループＩＩはＵ１Ａタンパク質に結合し、５’－ＡＵＵＵＧＵＧＧ－３’配列はＳｍタンパク質に結合し、これは、ステムループＩＶと共に、Ｕ１ ｓｎＲＮＡプロセシングに重要である。本開示において、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナー標的化配列の部位において、ベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するように修飾されうる。この図では、示されている例は、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡを標準的ＨＩＶ－１レンチウイルスベクターゲノム（パッケージングシグナルの場合にはＳＬ１ループ内に位置する）の１５ヌクレオチド（ベクターゲノム分子２５６Ｕ１の最初のヌクレオチドに基づけば２５６～２７０）に向けている。
発明の詳細な説明
ウイルス性シス作用配列
本発明は、ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列（ＡＴＧ配列は翻訳開始コドンとして機能しうる）を突然変異させることにより破壊されうる。
形質導入された（例えば、患者の）細胞に送達されたベクターバックボーンに存在するＯＲＦは、例えば、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じた場合、転写される可能性があり（レンチウイルスベクターは活性転写部位を標的化する）、患者細胞におけるベクターバックボーンに位置する遺伝物質の潜在的な異常転写を招きうる。リードスルー転写後のベクターバックボーンに位置する遺伝物質のこの潜在的な異常転写は生産細胞におけるレンチウイルスベクター産生中にも生じうる。
レンチウイルスベクターゲノム内に存在する少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は複数の内部ＯＲＦを含有しうる。これらの内部ＯＲＦはウイルス性シス作用配列の内部ＡＴＧ配列とＡＴＧ配列の直ぐ３’側の終止コドンとの間に見出されうる。
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つの内部ＯＲＦを破壊するためのウイルス性シス作用配列における修飾（例えば、少なくとも１つの内部ＯＲＦの開始を示すＡＴＧ配列を突然変異させることによるもの）が許容されることを見出した。したがって、本明細書に記載されている修飾ウイルス性シス作用配列はその機能を保持している。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは少なくとも２個（適切には、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個）の修飾ウイルス性シス作用配列を含む。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列における少なくとも２個（適切には、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列における少なくとも３個の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列における１つ（適切には２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。したがって、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じる場合、内部ＯＲＦの異常転写が予防されるように、形質導入細胞に送達されるベクターバックボーンにおける修飾ウイルス性シス作用配列に存在する少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。ＡＴＧ配列の「突然変異」は１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換を含みうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、
ａ）ＡＴＴＧ配列、
ｂ）ＡＣＧ配列、
ｃ）Ａ－Ｇ配列、
ｄ）ＡＡＧ配列、
ｅ）ＴＴＧ配列、および／または
ｆ）ＡＴＴ配列
からなる群から選択される配列に突然変異されうる。
少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、ＡＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、ＡＣＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、Ａ－Ｇ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、ＡＡＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、ＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ウイルス性シス作用配列において、ＡＴＴ配列に突然変異されうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つの修飾ウイルス性シス作用エレメントはＡＴＧ配列を欠いてもよい。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムにおけるウイルス性シス作用配列内の全てのＡＴＧ配列が突然変異している。
レンチウイルスベクターは、典型的には、複数のウイルス性シス作用配列を含む。ウイルス性シス作用配列の例には、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）およびウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が含まれる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は少なくとも１つのレンチウイルス性シス作用配列でありうる。レンチウイルス性シス作用配列の例には、ＲＲＥおよびｃｐｐｔが含まれる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は少なくとも１つの非レンチウイルス性シス作用配列でありうる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は少なくとも１つのレンチウイルス性シス作用配列および少なくとも１つの非レンチウイルス性シス作用配列でありうる。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列は、
ａ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および／または
ｂ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＲＲＥである。
幾つかの実施形態においては、少なくとも１つのウイルス性シス作用配列はＷＰＲＥである。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは少なくとも２個（適切には、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個）の修飾ウイルス性シス作用配列を含む。
幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥおよび本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥを含む。
レンチウイルスベクターゲノムは、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を更に含むことが可能であり、ここで、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されている。内部ＯＲＦが発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。したがって、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じる場合、内部ＯＲＦの異常転写が予防されるように、形質導入細胞に送達されるベクターバックボーンにおけるｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列に存在する少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。ＡＴＧ配列の「突然変異」は１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換を含みうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、
ａ）ＡＴＴＧ配列、
ｂ）ＡＣＧ配列、
ｃ）Ａ－Ｇ配列、
ｄ）ＡＡＧ配列、
ｅ）ＴＴＧ配列、および／または
ｆ）ＡＴＴ配列
からなる群から選択される配列に突然変異されうる。
少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、ＡＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、ＡＣＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、Ａ－Ｇ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、ＡＡＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、ＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列において、ＡＴＴ配列に突然変異されうる。
ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、ｇａｇの一部をコードするトランケート化（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ヌクレオチド配列でありうる。ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、ｇａｇの一部をコードする最小トランケート化ヌクレオチド配列でありうる。ｇａｇの一部は連続的配列でありうる。ｇａｇの一部をコードするトランケート化ヌクレオチド配列または最小トランケート化ヌクレオチド配列は少なくとも１つのフレームシフト突然変異をも含有しうる。
ｇａｇの一部をコードし４５～４６位にフレームシフト突然変異を含有するトランケート化ヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000002
ｇａｇの一部をコードし４５～４６位にフレームシフト突然変異を含有する最小トランケート化ヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000003
ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、例えば、
ａ）配列番号６に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列、または
ｂ）配列番号７に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列
を含みうる。
ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ｇａｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、例えば、
ａ）配列番号６に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列、または
ｂ）配列番号７に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列
を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号６に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号７に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号６もしくは配列番号７に示されている配列、またはそれに対して８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、（ａ）～（ｃ）：
ａ）配列番号６の１～３位に対応するＡＴＧ、
ｂ）配列番号６の４７～４９位に対応するＡＴＧ、および／または
ｃ）配列番号６の１０７～１０９位に対応するＡＴＧ
から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号６もしくは配列番号７に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号６の１～３位に対応するＡＴＧが突然変異している。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号６もしくは配列番号７に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号６の４７～４９位に対応するＡＴＧが突然変異している。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号６もしくは配列番号７に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号６の１０７～１０９位に対応するＡＴＧが突然変異している。
ｇａｇの一部をコードしフレームシフト突然変異を含有する修飾トランケート化ヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000004
ｇａｇの一部をコードしフレームシフト突然変異を含有する修飾最小トランケート化ヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000005
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号８に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。該配列は３個未満（適切には２個未満または１個未満）のＡＴＧ配列を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は、配列番号９に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。該配列は２個未満（適切には１個未満）のＡＴＧ配列を含みうる。
ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は３個未満のＡＴＧ配列を含みうる。適切には、ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列は２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含みうる。ｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列はＡＴＧ配列を欠いていてもよい。
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムは、Ｇａｇ－ｐ１７またはその断片をコードするヌクレオチド配列を欠いていてもよい。レンチウイルスベクターゲノムは、例えば、Ｇａｇ－ｐ１７またはその断片を発現しないことが可能である。１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号１０に示されている配列を欠いていてもよい。
レンチウイルスベクターゲノムはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムでありうる。
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターは導入遺伝子発現カセットでありうる。
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
１つの実施形態においては、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムはベクターゲノムのバックボーンにおけるＡＴＧ配列を欠いている。１つの実施形態においては、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムは、ＮＯＩ（導入遺伝子）におけるものを除き、ＡＴＧ配列を欠いている。
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、ウイルス性シス作用配列内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されている、少なくとも１つの修飾ウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、ウイルス性シス作用配列内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がサイレンシングされている、少なくとも１つの修飾ウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
修飾Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）
本発明は、ＲＲＥ内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、修飾Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
形質導入された（例えば、患者の）細胞に送達されたベクターバックボーンに存在するＯＲＦは、例えば、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じた場合、転写される可能性があり（レンチウイルスベクターは活性転写部位を標的化する）、患者細胞におけるベクターバックボーンに位置する遺伝物質の潜在的な異常転写を招きうる。リードスルー転写後のベクターバックボーンに位置する遺伝物質のこの潜在的な異常転写は生産細胞におけるレンチウイルスベクター産生中にも生じうる。
ＲＲＥは、レンチウイルスベクター間および種々の野生型ＨＩＶ－１分離体間で十分に保存されている必須のウイルスＲＮＡエレメントである。レンチウイルスベクターゲノム内に存在するＲＲＥは複数の内部ＯＲＦを含有しうる。これらの内部ＯＲＦはＲＲＥの内部ＡＴＧ配列とＡＴＧ配列の直ぐ３’側の終止コドンとの間に見出されうる。
レンチウイルスベクターゲノム内に存在するＲＲＥは、典型的には、ＲＮＡの５’領域（５’ＵＴＲ）に向かって、高度に構造化されたＲＮＡを含有するパッケージング領域内に埋め込まれている。５’ＵＴＲ構造は、小さなリンカーにより連結された一連のステムループ構造からなる。これらのステムループはＲＲＥを含む。したがって、ＲＲＥ自体は、Ｒｅｖが結合する、相補的な塩基対を含む複雑な二次構造を有する。
本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つの内部ＯＲＦを破壊するためのＲＲＥにおける修飾（例えば、少なくとも１つの内部ＯＲＦの開始を示すＡＴＧ配列を突然変異させることによるもの）が許容されることを見出した。したがって、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥはＲｅｖ結合能を保持している。
幾つかの実施形態においては、ＲＲＥにおける少なくとも２個（適切には、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、ＲＲＥにおける少なくとも３個の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、ＲＲＥにおける１つ（適切には、２、３、４、５、６、７または８個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。したがって、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じる場合、内部ＯＲＦの異常転写が予防されるように、形質導入細胞に送達されるベクターバックボーンにおける修飾ＲＲＥに存在する少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。ＡＴＧ配列の「突然変異」は１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換を含みうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、
ａ）ＡＴＴＧ配列、
ｂ）ＡＣＧ配列、
ｃ）Ａ－Ｇ配列、
ｄ）ＡＡＧ配列、
ｅ）ＴＴＧ配列、および／または
ｆ）ＡＴＴ配列
からなる群から選択される配列に突然変異されうる。
少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、ＡＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、ＡＣＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、Ａ－Ｇ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、ＡＡＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、ＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＲＲＥにおいて、ＡＴＴ配列に突然変異されうる。
修飾ＲＲＥは８個未満のＡＴＧ配列を含みうる。
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、修飾ＲＲＥが８個未満のＡＴＧ配列を含む、修飾Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
適切には、修飾ＲＲＥは７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含みうる。修飾ＲＲＥはＡＴＧ配列を欠いていてもよい。
ＲＲＥは最小機能的ＲＲＥでありうる。最小機能的ＲＲＥの一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000006
「最小機能的ＲＲＥ」または「最小ＲＲＥ」は、完全長ＲＲＥの機能を保持するトランケート化ＲＲＥ配列を意味する。したがって、最小機能的ＲＲＥはＲｅｖ結合能を保持する。
ＲＲＥは完全長ＲＲＥでありうる。完全長ＲＲＥの一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000007
ＲＲＥは、
ａ）配列番号１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列
を含みうる。
ＲＲＥは、配列番号１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ＲＲＥは、配列番号２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＲＲＥは、
ａ）配列番号１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列
を含みうる。
修飾ＲＲＥは、配列番号１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＲＲＥは、配列番号２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、群（ａ）～（ｈ）：
ａ）配列番号２の２７～２９位に対応するＡＴＧ、
ｂ）配列番号２の１９２～１９４位に対応するＡＴＧ、
ｃ）配列番号２の２０７～２０９位に対応するＡＴＧ、
ｄ）配列番号２の４３６～４３８位に対応するＡＴＧ、
ｅ）配列番号２の４８９～４９１位に対応するＡＴＧ、
ｆ）配列番号２の５７１～５７３位に対応するＡＴＧ、
ｇ）配列番号２の５９９～６０１位に対応するＡＴＧ、および／または
ｈ）配列番号２の６６３～６６５位に対応するＡＴＧ
から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の２７～２９位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の１９２～１９４位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の２０７～２０９位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の４３６～４３８位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の４８９～４９１位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の５７１～５７３位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の５９９～６０１位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥは、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号２の６６３～６６５位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＲＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000008
修飾ＲＲＥ配列のもう１つの例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000009
ＡＴＧ配列を欠く修飾ＲＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000010
修飾ＲＲＥは、配列番号３もしくは配列番号４もしくは配列番号５に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。該配列は８個未満（適切には、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満）のＡＴＧ配列を含みうる。
ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）
１つの態様においては、本発明は、ＷＰＲＥ内の少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、修飾ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
ＷＰＲＥは、レンチウイルスベクターを含む多数の異なるベクター型からの発現を増強しうる（米国特許第６，１３６，５９７号；第６，２８７，８１４号；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２８８６－９２）。理論によって束縛されるものではないが、この増強は、転写後レベルでのＲＮＡプロセシングの改善によるものと考えられており、核転写産物のレベルの上昇をもたらす。ｍＲＮＡ安定性における２倍の増強もこの増強に寄与する（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．ら，同誌）。ｗＰＲＥを含有する転写産物からのタンパク質発現の増強レベルは、ｗＰＲＥを含有しないものと比較して約２～５倍であると報告されており、転写レベルの増加とよく相関している。これは多数の異なる導入遺伝子で実証されている（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，Ｒ．ら，同誌）。
ＷＰＲＥは、発現レベルを増強するその機能に重要な３個のシス作用配列を含有する。また、それは、ＷＨＶ Ｘタンパク質ＯＲＦ（完全長ＯＲＦは４２５ｂｐである）の５’末端を含む約１８０ｂｐの断片を、その付随プロモーターと共に含有する。完全長Ｘタンパク質は腫瘍形成に関連づけられている（Ｆｌａｊｏｌｅｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６１７５－６１８０）。Ｘプロモーターから開始される転写産物からの翻訳は、Ｘタンパク質のＮＨ２末端の６０アミノ酸に相当するタンパク質の形成をもたらす。このトランケート化Ｘタンパク質は、特にトランケート化Ｘタンパク質配列が特定の遺伝子座において宿主細胞ゲノムに組み込まれている場合に、腫瘍形成を促進しうる（Ｂａｌｓａｎｏ，Ｃ．ら，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７６：９８５－９２；Ｆｌａｊｏｌｅｔ，Ｍ．ら，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６１７５－８０；Ｚｈｅｎｇ，Ｙ．Ｗ．ら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２５９３－８；Ｒｕｎｋｅｌ，Ｌ．ら，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９７：５２９－３６）。したがって、トランケート化Ｘタンパク質の発現は、目的の細胞に送達された場合、腫瘍形成を促進して、野生型ＷＰＲＥ配列の安全な使用を妨げうる。
ＵＳ ２００５／０００２９０７は、Ｘタンパク質ＯＲＦに対応するＷＰＲＥの領域の突然変異がＸタンパク質の腫瘍形成活性を除去し、それにより、ＷＰＲＥがレトロウイルス発現ベクターおよびレンチウイルス発現ベクターにおいて安全に使用されて、関心のある異種遺伝子またはヌクレオチドの発現レベルを増強することを可能にすることを開示している。
本明細書中で用いる、ＷＰＲＥの「Ｘ領域」は、翻訳開始コドンを含む、Ｘタンパク質ＯＲＦの少なくとも最初の６０アミノ酸、およびその付随プロモーターを含むと定義される。「機能的」Ｘタンパク質は、本明細書においては、目的の細胞で発現された場合に、腫瘍形成または形質転換表現型を促進しうるトランケート化Ｘタンパク質として定義される。本出願の文脈における「非機能的」Ｘタンパク質は、目的の細胞において腫瘍形成を促進し得ないＸタンパク質として定義される。
本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥは、レンチウイルスベクターからの発現を増強する能力を保持している。
幾つかの実施形態においては、ＷＰＲＥ内の少なくとも２個（適切には、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個または少なくとも７個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、ＷＰＲＥ内の少なくとも３個の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、ＷＰＲＥ内の１個（適切には、２個、３個、４個、５個、６個または７個）の内部ＯＲＦが破壊されうる。
幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦが翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が発現されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。幾つかの実施形態においては、内部ＯＲＦからタンパク質が翻訳されないように、少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。したがって、上流細胞プロモーターからのリードスルー転写が生じる場合、内部ＯＲＦの異常転写が予防されるように、形質導入細胞に送達されるベクターバックボーンにおける修飾ＷＰＲＥに存在する少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つの内部ＯＲＦは、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されうる。ＡＴＧ配列の「突然変異」は１以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換を含みうる。
１つの実施形態においては、少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、
ａ）ＡＴＴＧ配列、
ｂ）ＡＣＧ配列、
ｃ）Ａ－Ｇ配列、
ｄ）ＡＡＧ配列、
ｅ）ＴＴＧ配列、および／または
ｆ）ＡＴＴ配列
からなる群から選択される配列に突然変異されうる。
少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、ＡＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、ＡＣＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、Ａ－Ｇ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、ＡＡＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、ＴＴＧ配列に突然変異されうる。少なくとも１つのＡＴＧ配列は、修飾ＷＰＲＥにおいて、ＡＴＴ配列に突然変異されうる。
修飾ＷＰＲＥは７個未満のＡＴＧ配列を含みうる。修飾ＷＰＲＥは６個未満のＡＴＧ配列を含みうる。
したがって、もう１つの態様においては、本発明は、修飾ＷＰＲＥが７個未満のＡＴＧ配列を含む、修飾ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、修飾ＷＰＲＥが６個未満のＡＴＧ配列を含む修飾ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムを提供する。。
適切には、修飾ＷＰＲＥは７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含みうる。修飾ＷＰＲＥはＡＴＧ配列を欠いていてもよい。
幾つかの実施形態においては、ＷＰＲＥのＸ領域内の少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異しており、それにより、機能的Ｘタンパク質の発現が妨げられる。好ましい実施形態においては、突然変異はＸ領域の翻訳開始コドン内に存在する。少なくとも１つのＡＴＧ配列の突然変異の結果として、Ｘタンパク質は発現されない可能性がある。
幾つかの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥはＷＰＲＥのＸ領域内のＡＴＧ配列における突然変異を含まない。
ＷＰＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000011
破壊されたＸタンパク質ＯＲＦを含有するＷＰＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000012
ＷＰＲＥは、
ａ）配列番号１１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号１２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列
を含みうる。
ＷＰＲＥは、配列番号１１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
ＷＰＲＥは、配列番号１２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１２に対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、群（ａ）～（ｇ）：
ａ）配列番号１１の５３～５５位に対応するＡＴＧ、
ｂ）配列番号１１の７２～７４位に対応するＡＴＧ、
ｃ）配列番号１１の９１～９３位に対応するＡＴＧ、
ｄ）配列番号１１の１０４位～１０６位に対応するＡＴＧ、
ｅ）配列番号１１の１２１位～１２３位に対応するＡＴＧ、
ｆ）配列番号１１の１７０～１７２位に対応するＡＴＧ、および／または
ｇ）配列番号１１の４１１位～４１３位に対応するＡＴＧ
から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の５３～５５位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の７２～７４位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の９１～９３位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の１０４～１０６位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の１２１～１２３位に対応するＡＴＧが突然変異している。
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の１７０～１７２位に対応するＡＴＧが突然変異している。
および／または、修飾ＷＰＲＥは、配列番号１１もしくは配列番号１２に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含むことが可能であり、ここで、配列番号１１の４１１～４１３位に対応するＡＴＧが突然変異している。
ＷＲＰＥは、典型的には、保持されたＰｏｌ ＯＲＦを含有する。保持されたＰｏｌ ＯＲＦ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000013
１つの実施形態においては、ＷＰＲＥにおける保持されたＰｏｌ ＯＲＦ配列内の少なくとも１つ（適切には、少なくとも２個または少なくとも３個）のＡＴＧ配列が突然変異している。１つの実施形態においては、ＷＰＲＥにおける保持されたＰｏｌ ＯＲＦ配列内の全てのＡＴＧ配列が突然変異している。
１つの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥにおける保持されたＰｏｌ ＯＲＦ配列内に３個未満（適切には、２個未満または１個未満）のＡＴＧ配列を含む。１つの実施形態においては、修飾ＷＰＲＥは、ＷＰＲＥにおける保持されたＰｏｌ ＯＲＦ配列内のＡＴＧ配列を欠いている。
保持されたＰｏｌ ＯＲＦ内の全てのＡＴＧコドンが突然変異している修飾ＷＰＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000014
ＡＴＧ配列を欠く修飾ＷＰＲＥ配列の一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000015
修飾ＷＰＲＥは、配列番号１４もしくは配列番号１５に示されている配列、またはそれに対して少なくとも８０％（適切には、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）の同一性を有する配列を含みうる。該配列は６個未満（適切には、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満）のＡＴＧ配列を含みうる。
ウイルスＧａｇ－ｐ１７タンパク質
本発明は、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
ウイルスタンパク質Ｇａｇ－ｐ１７はレンチウイルスベクター粒子のカプシドを包囲しており、そしてエンベロープタンパク質によって包囲されている。ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列は、歴史的には、治療用レンチウイルスベクターの製造用のレンチウイルスベクターゲノム内に含まれていた。レンチウイルスベクターゲノム内に存在するＧａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、ＲＮＡの５’領域（５’ＵＴＲ）に向かう高度に構造化されたＲＮＡを含有するパッケージング領域内に埋め込まれている。Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、本明細書においてｐ１７－ＩＮＳと称されるＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）を含む。
本発明者らは、驚くべきことに、レンチウイルスベクターゲノムのバックボーンからのｐ１７－ＩＮＳの欠失が、レンチウイルスベクター産生中のベクター力価に有意な影響を及ぼさないことを見出した。
Ｇａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を欠くレンチウイルスベクターゲノムは、Ｇａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターゲノムと比較して小さなサイズを有する。したがって、Ｇａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を欠くレンチウイルスベクターゲノムを使用すると、形質導入細胞に送達されるウイルスベクターバックボーン内に含有されるウイルスＤＮＡの量が減少する。更に、Ｇａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を欠くレンチウイルスベクターゲノムは、Ｇａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を含有するレンチウイルスベクターゲノムを使用して送達されうる導入遺伝子より大きなサイズの導入遺伝子を送達するために使用されうる。したがって、ベクターバックボーン内でＧａｇ－ｐ１７またはｐ１７－ＩＮＳをコードするヌクレオチド配列を欠失させることが望ましい幾つかの理由が存在する。
本発明は、ｐ１７－ＩＮＳまたはその断片をコードするヌクレオチド配列を欠くレンチウイルスベクターゲノムを提供する。
ｐ１７－ＩＮＳの一例は以下のとおりである。
Figure 2023516493000016
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムは、配列番号１０に示されている配列を欠いていてもよい。
１つの実施形態においては、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードする完全長ヌクレオチド配列の一部である。１つの実施形態においては、該断片は少なくとも約１０個のヌクレオチド（適切には、少なくとも約２０個、少なくとも約３０個、少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、少なくとも約３５０個のヌクレオチド）を含む、またはそれらからなる。
１つの実施形態においては、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードする完全長ヌクレオチド配列の１％～９９％の長さを有しうる。適切には、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードする天然ヌクレオチド配列のようなＧａｇ－ｐ１７をコードする完全長ヌクレオチド配列の少なくとも約１０％（適切には、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の長さを有しうる。該断片は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードする天然ヌクレオチド配列のようなＧａｇ－ｐ１７をコードする完全長ヌクレオチド配列の連続領域でありうる。
１つの実施形態においては、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、ｐ１７－ＩＮＳをコードする完全長ヌクレオチド配列の１％～９９％の長さを有しうる。適切には、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、ｐ１７－ＩＮＳをコードする天然ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１０）のようなｐ１７－ＩＮＳをコードする完全長ヌクレオチド配列の少なくとも約１０％（適切には、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％）の長さを有しうる。該断片は、ｐ１７－ＩＮＳをコードする天然ヌクレオチド配列（例えば、配列番号１０）のようなｐ１７－ＩＮＳをコードする完全長ヌクレオチド配列の連続領域でありうる。
１つの実施形態においては、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片は、Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列に位置するＩＮＳを含む、またはそれからなる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている少なくとも１つの修飾ウイルス性シス作用配列を含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥを含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥを含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥおよび本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥを含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されているｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥおよび本明細書に記載されているｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥおよび本明細書に記載されているｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を含みうる。
１つの実施形態においては、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片のいずれかを欠くレンチウイルスベクターゲノムは、本明細書に記載されている修飾ＲＲＥ、本明細書に記載されている修飾ＷＰＲＥおよび本明細書に記載されているｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列を含みうる。
レンチウイルスベクターゲノムはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムでありうる。
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムをコードするヌクレオチド配列を提供する。
ベクター／発現カセット
ベクターは、１つの環境から別の環境への実体（エンティティ）の転移を可能または容易にする手段である。本発明によれば、例えば、組換え核酸技術において使用される幾つかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ＤＮＡセグメント、例えば、異種ｃＤＮＡセグメント）のような実体が標的細胞内に導入され、該細胞により発現されることを可能にする。ベクターは、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列の組込みを促進して、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列、および標的細胞におけるその発現を維持しうる。
ベクターは発現カセット（発現構築物とも称される）であることが可能であり、またはそれを含みうる。本明細書に記載されている発現カセットは、転写されうる配列を含有する核酸の領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡをコードする配列はこの定義に含まれる。
ベクターは１以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）および／または追跡可能なマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子）を含有しうる。ベクターは、例えば、標的細胞に感染させるため、および／または標的細胞に形質導入するために使用されうる。ベクターは、例えば条件付き複製性腫瘍溶解性ベクターのように、問題の宿主細胞内でベクターが複製することを可能にするヌクレオチド配列を更に含みうる。
「カセット」なる語は、「コンジュゲート」、「構築物」および「ハイブリッド」のような語と同義であり、プロモーターに直接的または間接的に結合したポリヌクレオチド配列を含む。本発明における使用のための発現カセットは、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列の発現のためのプロモーターを含み、そして所望により、ウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列の調節因子を含みうる。好ましくは、カセットは、プロモーターに機能的に連結された少なくともポリヌクレオチド配列を含む。
発現カセット、例えばプラスミド、コスミド、ウイルスまたはファージベクターの選択は、しばしば、それが導入される宿主細胞に左右される。発現カセットはＤＮＡプラスミド（スーパーコイル、ニックまたは線状）、ミニサークルＤＮＡ（線状またはスーパーコイル）、制限酵素消化および精製によるプラスミドバックボーンの除去により目的領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えばドギーボーン（ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡ［この場合、使用される最終的なＤＮＡは、閉じた連結形態であり、またはそれは、オープンカットエンドを有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）］でありうる。
もう１つの態様においては、本発明は、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクターを提供する。レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクターはレンチウイルスベクター粒子の形態でありうる。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含む発現カセットを提供する。
レンチウイルスベクター製造系および細胞
レンチウイルスベクター製造系は、レンチウイルスベクターの製造（産生）に必要な成分をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。したがって、ベクター製造系は、レンチウイルスベクター粒子の生成に必要なウイルスベクター成分をコードするヌクレオチド配列のセットを含む。
「ウイルスベクター製造系」または「ベクター製造系」または「製造系」は、レンチウイルスベクターの製造に必要な成分を含む系として理解されるべきである。
１つの実施形態においては、ウイルスベクター製造系は、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノム、ＧａｇおよびＧａｇ／Ｐｏｌタンパク質、ならびにＥｎｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。該製造系は、所望により、Ｒｅｖタンパク質またはその機能的代替物をコードするヌクレオチド配列を含みうる。
１つの実施形態においては、ウイルスベクター製造系はモジュラー核酸構築物（モジュラー構築物）を含む。モジュラー構築物は、レンチウイルスベクターの製造において使用される２以上の核酸を含むＤＮＡ発現構築物である。モジュラー構築物は、レンチウイルスベクターの製造において使用される２以上の核酸を含むＤＮＡプラスミドでありうる。プラスミドは細菌プラスミドでありうる。核酸は、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、ベクターゲノムをコードしうる。また、パッケージング細胞株およびプロデューサー細胞株の作製のために設計されたモジュラー構築物は更に、転写調節タンパク質（例えば、ＴｅｔＲ、ＣｙｍＲ）および／または翻訳抑制タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）および選択可能なマーカー［例えば、Ｚｅｏｃｉｎ（商標）、ハイグロマイシン、ブラストサイジン、ピューロマイシン、ネオマイシン耐性遺伝子］をコードする必要がありうる。本発明における使用のための適切なモジュラー構築物はＥＰ３５０２２６０（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
本発明による使用のためのモジュラー構築物は１つの構築物上にレトロウイルス成分の２以上をコードする核酸配列を含有するため、これらのモジュラー構築物の安全性プロファイルは考慮されており、追加的な安全上の特徴が構築物内に直接的に組み込まれている。これらの特徴には、レトロウイルスベクター成分の複数のオープンリーディングフレームのためのインスレーターの使用ならびに／またはモジュラー構築物におけるレトロウイルス遺伝子の特定の配向および配置が含まれる。これらの特徴を用いることにより、複製可能ウイルス粒子を生成する直接的なリードスルーが予防されると考えられている。
ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、モジュラー構築物において、逆および／または交互の転写配向でありうる。したがって、ウイルスベクター成分をコードする核酸配列は、同じ５’から３’への配向では提供されず、その結果、ウイルスベクター成分は、同じｍＲＮＡ分子からは生成され得ない。逆配向は、異なるベクター成分のための少なくとも２つのコード配列が「頭から頭へ」および「尾から尾へ」の転写配向で提供されることを意味しうる。これは、モジュラー構築物の、１つの鎖上に、１つのベクター成分（例えば、ｅｎｖ）のコード配列を提供すること、および反対側の鎖上に、別のベクター成分（例えば、ｒｅｖ）のコード配列を提供することにより達成されうる。好ましくは、３以上のベクター成分のコード配列がモジュラー構築物に存在する場合、コード配列の少なくとも２つは逆転写配向で存在する。したがって、３以上のベクター成分のコード配列がモジュラー構築物に存在する場合、各成分は、それが隣接している他のベクター成分の隣接コード配列の全てに対して反対の５’から３’への配向で存在するように配向されうる。すなわち、各コード配列に関して交互の５’から３’への（または転写的な）配向が用いられうる。
本発明による使用のためのモジュラー構築物は、以下のベクター成分のうちの２以上をコードする核酸配列を含みうる：本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、ｅｎｖ。モジュラー構築物は、ベクター成分の任意の組合せをコードする核酸配列を含みうる。１つの実施形態においては、モジュラー構築物は、以下のものをコードする核酸配列を含みうる：
ｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｒｅｖ、またはそれらの機能的代替物、
ｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｇａｇ－ｐｏｌ、
ｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノムおよびｅｎｖ、
ｉｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｒｅｖ、またはそれらの機能的代替物、
ｖ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ、
ｖｉ）ｅｎｖおよびｒｅｖ、またはそれらの機能的代替物、
ｖｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖまたはそれらの機能的代替物、およびｇａｇ－ｐｏｌ、
ｖｉｉｉ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｒｅｖ、またはそれらの機能的代替物、およびｅｎｖ、
ｉｘ）レトロウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖ、あるいは
ｘ）ｇａｇ－ｐｏｌ、ｒｅｖ、またはそれらの機能的代替物、およびｅｎｖ
（ここで、核酸配列は逆および／または交互の配向である）。
１つの実施形態においては、レトロウイルスベクターを製造するための細胞は、前記のｉ）～ｘ）の組合せのいずれかをコードする核酸配列を含むことが可能であり、ここで、核酸配列は、同じ遺伝子座に位置し、逆および／または交互の配向である。同じ遺伝子座は、細胞内の単一の染色体外遺伝子座、例えば単一のプラスミド、または細胞のゲノム内の単一の遺伝子座（すなわち、単一の挿入部位）を意味しうる。細胞は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターを製造するための安定または一過性細胞でありうる。１つの態様においては、細胞はｔａｔを含まない。
ＤＮＡ発現構築物はＤＮＡプラスミド（スーパーコイル、ニックまたは線状）、ミニサークルＤＮＡ（線状またはスーパーコイル）、制限酵素消化および精製によるプラスミドバックボーンの除去により目的領域のみを含有するプラスミドＤＮＡ、酵素ＤＮＡ増幅プラットフォーム、例えばドギーボーン（ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ）ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ（商標））を使用して生成されたＤＮＡ［この場合、使用される最終的なＤＮＡは、閉じた連結形態であり、またはそれは、オープンカットエンドを有するように調製されている（例えば、制限酵素消化）］でありうる。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノム、本発明のヌクレオチド配列、本発明の発現カセットまたは本発明のウイルスベクター製造系を含む細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、
ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに本発明のヌクレオチド配列もしくは本発明の発現カセット、または
ｂ）本発明のウイルスベクター製造系、ならびに
ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／または所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
を含む、レンチウイルスベクターを製造するための細胞を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、
（ｉ）ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに本発明のヌクレオチド配列もしくは本発明の発現カセット、または
ｂ）本発明のウイルスベクター製造系、ならびに
ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／または所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
を細胞内に導入する工程、
（ｉｉ）所望により、ベクター成分とレンチウイルスベクターゲノムとをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程、ならびに
（ｉｉｉ）レンチウイルスベクターの産生に適した条件下で細胞を培養する工程
を含む、レンチウイルスベクターの製造方法を提供する。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の方法により製造されるレンチウイルスベクターを提供する。レンチウイルスベクターは、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムを含む。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明のレンチウイルスベクターゲノム、本発明のヌクレオチド配列、本発明の発現カセット、本発明のウイルスベクター製造系または本発明の細胞の、レンチウイルスベクターの製造のための使用を提供する。
「ウイルスベクター生産細胞」、「ベクター生産細胞」または「生産細胞」は、レンチウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター粒子を産生しうる細胞として理解されるべきである。レンチウイルスベクター生産細胞は「プロデューサー細胞」または「パッケージング細胞」でありうる。ウイルスベクター系の、１以上のＤＮＡ構築物は、ウイルスベクター生産細胞内に安定に組み込まれうる、または該生産細胞内でエピソーム的に維持されうる。あるいは、ウイルスベクター系のＤＮＡ成分の全てがウイルスベクター生産細胞内に一過性にトランスフェクトされうる。更に別の代替的実施形態においては、該成分の幾つかを安定に発現する生産細胞が、ベクター産生に必要な残りの成分で一過性にトランスフェクトされうる。
本明細書中で用いる「パッケージング細胞」なる語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要なエレメントを含有するがベクターゲノムを欠く細胞を意味する。所望により、そのようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現しうる１以上の発現カセットを含有する。
プロデューサー細胞／パッケージング細胞は任意の適切な細胞型でありうる。プロデューサー細胞は一般には哺乳類細胞であるが、例えば昆虫細胞でありうる。
本明細書中で用いる「プロデューサー／生産細胞」または「ベクター産生／プロデューサー細胞」なる語は、レンチウイルスベクター粒子の産生に必要なエレメントの全てを含有する細胞を意味する。プロデューサー細胞は、安定なプロデューサー細胞株であること又は一過性に誘導されたものであることが可能であり、あるいは、レトロウイルスゲノムが一過性に発現される安定なパッケージング細胞であることが可能である。
本発明の方法においては、ベクター成分は、ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである場合、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよび／またはレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを包含しうる。ベクター成分をコードするヌクレオチド配列は同時にまたは任意の順序で連続的に細胞内に導入されうる。
ベクター生産細胞は、例えば組織培養細胞株のようなインビトロで培養される細胞でありうる。本発明の方法および使用の幾つかの実施形態においては、レンチウイルスベクターを製造するための適切な生産細胞または細胞は、適切な条件下で培養された場合にウイルスベクターまたはウイルスベクター粒子を産生しうる細胞である。したがって、細胞は、典型的には、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノム、ｇａｇ、ｅｎｖおよびｒｅｖを包含しうるベクター成分をコードするヌクレオチド配列を含む。適切な細胞株には、哺乳類細胞、例えばマウス線維芽細胞由来の細胞株またはヒト細胞株が含まれるが、これらに限定されるものではない。それらは、一般には、ヒト細胞を含む哺乳類細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３、ＣＡＰ、ＣＡＰ－ＴまたはＣＨＯ細胞であるが、例えば、ＳＦ９細胞のような昆虫細胞であることも可能である。好ましくは、ベクター生産細胞はヒト細胞株に由来する。したがって、そのような適切な生産細胞は、本発明の方法または使用のいずれかにおいて使用されうる。
ヌクレオチド配列を細胞内に導入するための方法は当技術分野で周知であり、既に記載されている。したがって、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖおよびレンチウイルスベクターのＲＮＡゲノムを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列を、分子生物学および細胞生物学における通常の技術を用いて細胞内に導入することは、当業者の能力の範囲内である。
安定な生産細胞はパッケージングまたはプロデューサー細胞でありうる。パッケージング細胞からプロデューサー細胞を作製するために、ベクターゲノムＤＮＡ構築物を安定または一過性に導入することが可能である。パッケージング／プロデューサー細胞は、ＷＯ ２００４／０２２７６１に記載されているとおり、ベクターの成分の１つ、すなわち、ゲノム、ｇａｇ－ｐｏｌ成分およびエンベロープを発現するレトロウイルスベクターで適切な細胞株を形質導入することにより作製されうる。
あるいは、ヌクレオチド配列を細胞内にトランスフェクトすることが可能であり、ついで、生産細胞ゲノム内への組込みが稀にランダムに生じる。トランスフェクション法は、当技術分野で周知の方法を用いて行われうる。例えば、安定なトランスフェクション法は、コンカテマー化を助けるように操作された構築物を使用することが可能である。もう１つの例においては、トランスフェクション法は、リン酸カルシウム、または商業的に入手可能な製剤、例えばＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して行われうる。あるいは、ヌクレオチド配列はエレクトロポレーションにより生産細胞内に導入されうる。当業者は、生産細胞内へのヌクレオチド配列の組込みを促進するための方法を認識するであろう。例えば、核酸構築物の線状化は、それが天然で環状である場合に有用でありうる。それほどランダムでない組込み法は、内因性ゲノム内の選択された部位への組込みを導くために、哺乳類宿主細胞の内因性染色体と共有される相同性の領域を含む核酸構築物を含みうる。更に、組換え部位が構築物上に存在する場合、これらは標的化組換えに使用されうる。例えば、核酸構築物は、Ｃｒｅリコンビナーゼと組合された場合に標的化組込みを可能にするｌｏｘＰ部位（すなわち、Ｐ１バクテリオファージに由来するＣｒｅ／ｌｏｘ系を使用）を含有しうる。代替的または追加的に、組換え部位は、ａｔｔ部位（例えば、λファージ由来）であり、この場合、ａｔｔ部位はラムダインテグラーゼの存在下で部位特異的組込みを可能にする。これは、レンチウイルス遺伝子が宿主細胞ゲノム内の遺伝子座に標的化されることを可能にし、これは、高いおよび／または安定な発現を可能にする。
標的化組込みの他の方法は当技術分野で周知である。例えば、選択された染色体遺伝子座における標的化組換えを促進するために、ゲノムＤＮＡの標的化切断を誘導する方法が用いられうる。これらの方法は、しばしば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のような生理学的メカニズムによる切断の修復を誘導するための内因性ゲノムにおけるニックのような二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する方法または系の使用を含む。切断は、特異的ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用、特異的切断を導くための、操作されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ ＲＮＡ（「単一ガイドＲＮＡ」）の存在下のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用、および／またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ（例えば、ティー・サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来）の使用により生じうる。
パッケージング／プロデューサー細胞株は、レンチウイルス形質導入のみ又は核酸トランスフェクションのみ又はそれらの両方の組合せの方法を用いるヌクレオチド配列の組込みにより作製されうる。
生産細胞からレトロウイルスベクターを作製するための方法、特に、レトロウイルスベクターのプロセシングはＷＯ２００９／１５３５６３に記載されている。
１つの実施形態においては、生産細胞はＲＮＡ結合タンパク質（例えば、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質；ＴＲＡＰ）および／またはＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質または代替的調節タンパク質（例えば、ＣｙｍＲ）を含みうる。
生産細胞からのレンチウイルスベクターの製造は、トランスフェクション法、誘導工程（例えば、ドキシサイクリン誘導）を含みうる安定細胞株からの製造、または両方の組合せによるものでありうる。トランスフェクション法は、当技術分野で周知の方法を用いて実施可能であり、具体例は既に記載されている。
生産細胞（パッケージングもしくはプロデューサー細胞株のいずれか、または成分をコードするレンチウイルスベクターで一過性にトランスフェクトされたももの）を培養して、細胞およびウイルスの数ならびに／またはウイルス力価を増加させる。細胞の培養は、それが代謝し、および／または増殖し、および／または分裂し、および／または本発明による目的のウイルスベクターを産生することを可能にするように行う。これは当業者に周知の方法により達成可能であり、例えば適切な培地における細胞に栄養素を供与することを含むが、これに限定されるものではない。該方法は、表面に接着する成長、懸濁液中での成長またはそれらの組合せを含みうる。培養は、例えば、組織培養フラスコ、組織培養マルチウェルプレート、皿、ローラーボトル、ウェーブバッグまたはバイオリアクターにおいて、バッチ、流加、連続系などを使用して行われうる。細胞培養によるウイルスベクターの大規模な製造を達成するためには、細胞が懸濁状態で増殖しうることが当技術分野において好ましい。細胞を培養するための適切な条件は公知である（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＫｒｕｓｅおよびＰａｔｅｒｓｏｎ編（１９７３），ならびにＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ ０－４７１－３４８８９－９）を参照されたい）。
好ましくは、細胞を、まず、組織培養フラスコまたはバイオリアクターにおいて「増量（バルクアップ）」し、ついで、多層培養容器または大型バイオリアクター（５０Ｌを超えるもの）において増殖させて、本発明における使用のためのベクター生産細胞を得る。
好ましくは、細胞を懸濁様態で増殖させて、本発明における使用のためのベクター生産細胞を得る。
レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、より大きなレトロウイルスの群の一部である。レンチウイルスの詳細な一覧はＣｏｆｆｉｎら（１９９７）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：ＪＭ Ｃｏｆｆｉｎ，ＳＭ Ｈｕｇｈｅｓ，ＨＥ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３に見出されうる。簡潔に説明すると、レンチウイルスは霊長類群および非霊長類群に分類されうる。霊長類レンチウイルスの例には、ヒト自己免疫不全症候群（エイズ）の原因因子であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。非霊長類レンチウイルス群には、原型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディビスナウイルス（ＭＶＶ）およびウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）が含まれる。１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターはＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する。
レンチウイルスファミリーは、レンチウイルスが分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力を有する点で、レトロウイルスとは異なる（Ｌｅｗｉｓら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（８）：３０５３－３０５８ならびにＬｅｗｉｓおよびＥｍｅｒｍａｎ（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（１）：５１０－５１６）。これとは対照的に、ＭＬＶのような他のレトロウイルスは、非分裂細胞または遅く分裂する細胞（例えば、筋肉、脳、肺および肝組織を構成する細胞）には感染できない。
本明細書中で用いるレンチウイルスベクターは、レンチウイルスから誘導可能な少なくとも１つの成分部分を含むベクターである。好ましくは、その成分部分は、該ベクターが標的細胞に感染または形質導入し、ＮＯＩを発現する生物学的メカニズムに関与する。
レンチウイルスベクターは、インビトロで適合性標的細胞においてＮＯＩを複製するために使用されうる。したがって、本明細書には、インビトロで適合性標的細胞内に本発明のベクターを導入し、ＮＯＩの発現をもたらす条件下、該標的細胞を増殖させることによる、インビトロでのタンパク質の製造方法が記載されている。タンパク質およびＮＯＩは、当技術分野で周知の方法により標的細胞から回収されうる。適切な標的細胞には、哺乳類細胞株および他の真核細胞株が含まれる。
幾つかの態様においては、ベクターは「インスレーター」（プロモーターとエンハンサーとの間の相互作用を遮断し、隣接遺伝子からのリードスルーを低減するバリヤとして機能する遺伝的配列）を有しうる。
１つの実施形態においては、インスレーターは１以上のレンチウイルス核酸配列の間に存在して、プロモーター干渉および隣接遺伝子からのリードスルーを予防する。インスレーターが１以上のレンチウイルス核酸配列の間にベクター内に存在する場合、これらの絶縁された遺伝子のそれぞれは個々の発現単位として配置されうる。
レトロウイルスおよびレンチウイルスゲノムの基本構造は多数の共通の特徴を有し、それらとしては、例えば、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ（それらの間または内部に、ゲノムがパッケージングされることを可能にするパッケージングシグナルが位置する）、プライマー結合部位、標的細胞ゲノム内への組込みを可能にする組込み部位、ならびにウイルス粒子の構築に必要なポリペプチドであるパッケージング成分をコードするｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子が挙げられる。レンチウイルスは追加的な特徴、例えば、ＨＩＶにおけるｒｅｖ遺伝子およびＲＲＥ配列を有し、これらは、感染標的細胞の核から細胞質への、組込まれたプロウイルスのＲＮＡ転写産物の効率的な輸出を可能にする。
プロウイルスにおいては、これらの遺伝子は両端で、長末端反復（ＬＴＲ）と称される領域に隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組込みおよび転写をもたらす。ＬＴＲはエンハンサー－プロモーター配列としても働き、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。
ＬＴＲはそれら自体が同一の配列であり、Ｕ３、ＲおよびＵ５と称される３つのエレメントに分類されうる。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に特有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両端において反復する配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に特有の配列に由来する。それらの３つのエレメントのサイズはレトロウイルスよって大きく変動しうる。
本明細書に記載されている典型的なレトロウイルスベクターにおいては、複製に必須の１以上のタンパク質コード領域の少なくとも一部が該ウイルスから除去されうる。例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖは存在しないこと又は機能的でないことが可能である。これは該ウイルスベクターを複製欠損型にする。
レンチウイルスベクターは霊長類レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１）または非霊長類レンチウイルス（例えば、ＥＩＡＶ）に由来しうる。
一般的には、典型的なレトロウイルスベクター製造系は必須ウイルスパッケージング機能からのウイルスゲノムの分離を含む。これらのウイルスベクター成分は、通常、別々のＤＮＡ発現カセット（あるいは、プラスミド、発現プラスミド、ＤＮＡ構築物または発現構築物として公知である）上で生産細胞に付与される。
ベクターゲノムはＮＯＩを含む。ベクターゲノムは、典型的には、パッケージングシグナル（ψ）、ＮＯＩを含有する内部発現カセット、（所望により）転写後エレメント（ＰＲＥ）、典型的には中央ポリプリントラクト（ｃｐｐｔ）、３’－ｐｐｕおよび自己不活性化（ＳＩＮ）ＬＴＲを要する。ベクターゲノムＲＮＡおよびＮＯＩ ｍＲＮＡの両方の適切なポリアデニル化ならびに逆転写のプロセスのために、Ｒ－Ｕ５領域が必要である。ベクターゲノムは、所望により、ＷＯ ２００３／０６４６６５に記載されているオープンリーディングフレームを含むことが可能であり、これは、ｒｅｖの非存在下でのベクター製造を可能にする。
パッケージング機能はｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。これらは生産細胞によるベクター粒子の産生のために必要である。ゲノムへのトランスでのこれらの機能の付与は複製欠損型ウイルスの産生を促進する。
ガンマ－レトロウイルスベクターの製造系は、典型的には、ゲノム、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ発現構築物を要する３成分系である。ＨＩＶ－１に基づくレンチウイルスベクターの製造系は更に、アクセサリー遺伝子ｒｅｖが付与されること、およびベクターゲノムがｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むことを要する。ＥＩＡＶに基づくレンチウイルスベクターは、ゲノム内にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する場合には、ｒｅｖがトランスで付与されることを要さない（ＷＯ ２００３／０６４６６５を参照されたい）。
通常、ベクターゲノムカセット内でコードされる「外部」プロモーター（これはベクターゲノムカセットを駆動する）および「内部」プロモーター（これはＮＯＩカセットを駆動する）の両方は、その他のベクター系成分を駆動するものと同様に、強力な真核またはウイルスプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０およびユビキチンプロモーターが含まれる。強力な「合成」プロモーター、例えば、ＤＮＡライブラリーにより作製されるプロモーター（例えば、ＪｅＴプロモーター）も、転写を駆動するために使用されうる。あるいは、転写を駆動するために、例えば以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
レトロウイルスベクターの製造は、これらのＤＮＡ成分での生産細胞の一過性コトランスフェクションまたは安定な生産細胞系の使用（ここで、該成分の全ては生産細胞ゲノム内に安定に組込まれる）を含む（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ＨＪ，Ｆｏｎｇ－Ｗｏｎｇ Ｌ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ Ｉ，Ｃｈｉｐｃｈａｓｅ Ｄ，Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｍ，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ Ｌ，Ｔｈｏｒｅｅ Ｖ，ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｊ，Ｒａｌｐｈ ＧＳ，Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ ＫＡおよびＲａｄｃｌｉｆｆｅ ＰＡ．（２０１１）．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍａｒ；２２（３）：３５７－６９）。もう１つのアプローチは、安定なパッケージング細胞（該細胞内にパッケージング成分が安定に組込まれている）を使用すること、および次いで必要に応じて、ベクターゲノムプラスミドにおける一過性トランスフェクションを行うことである（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｈ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｌｅｒｏｕｘ－Ｃａｒｌｕｃｃｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｉｏｎ，Ｋ．Ａ．ＭｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓおよびＰ．Ａ．Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ（２００９）．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｊｕｎ；１６（６）：８０５－１４）。完全ではない代替的なパッケージング細胞株を作製し（１つまたは２つのパッケージング成分のみが細胞株内に安定に組込まれている）、そしてベクターを作製するために、欠損成分を一過性にトランスフェクトすることも可能である。生産細胞はまた、調節タンパク質、例えば、転写調節因子のｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）タンパク質グループのメンバー（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－ＯｎおよびＴｅｔ－Ｏｆｆ）、転写調節因子のクマート誘導性スイッチ系グループのメンバー（例えば、クマートリプレッサー（ＣｙｍＲ）タンパク質）、またはＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ－トリプトファン活性化ＲＮＡ結合タンパク質）を発現しうる。
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＥＩＡＶに由来する。ＥＩＡＶはレンチウイルスの最も単純なゲノム構造を有し、本発明における使用に特に好ましい。ＥＩＡＶは、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子に加えて、３つの他の遺伝子、すなわち、ｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２をコードしている。ＴａｔはウイルスＬＴＲの転写活性化因子として作用し（ＤｅｒｓｅおよびＮｅｗｂｏｌｄ（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４（２）：５３０－５３６ならびにＭａｕｒｙら（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００（２）：６３２－６４２）、ｒｅｖはｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を介してウイルス遺伝子の発現を調節し、統合する（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。これらの２つのタンパク質の作用メカニズムは霊長類ウイルスにおける同様のメカニズムに広く類似していると考えられている（Ｍａｒｔａｒａｎｏら（１９９４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８（５）：３１０２－３１１１）。Ｓ２の機能は未知である。また、ＥＩＡＶタンパク質Ｔｔｍが特定されており、これは、膜貫通タンパク質の開始部位におけるｅｎｖコード配列へとスプライシングされるｔａｔの第１エキソンによりコードされている。本発明のもう１つの実施形態においては、ウイルスベクターはＨＩＶに由来する。ＨＩＶがＥＩＡＶと異なるのは、それがＳ２をコードしていないが、ＥＩＡＶとは違って、それがｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕおよびｎｅｆをコードしている点である。
「組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター」（ＲＲＶ）なる語は、標的細胞に形質導入しうるウイルス粒子内へのＲＮＡゲノムのパッケージングをパッケージング成分の存在下で可能にするのに十分なレトロウイルス遺伝情報を有するベクターを意味する。標的細胞の形質導入は逆転写および標的細胞ゲノム内への組込みを含みうる。ＲＲＶは、該ベクターにより標的細胞へと運搬される非ウイルスコード配列を保持する。ＲＲＶは、標的細胞内で感染性レトロウイルス粒子を産生する自律的（非依存的）複製の能力を有さない。通常、ＲＲＶは機能的ｇａｇ／ｐｏｌおよび／もしくはｅｎｖ遺伝子、ならびに／または複製に必須の他の遺伝子を欠く。
好ましくは、本発明のＲＲＶベクターは最小ウイルスゲノムを有する。
本明細書中で用いる「最小ウイルスゲノム」なる語は、標的細胞へのＮＯＩの感染、形質導入および運搬のための必要な機能性を付与するのに必須のエレメントを保有させながら非必須エレメントを除去するためにウイルスベクターが操作されていることを意味する。この方法の更なる詳細はＷＯ １９９８／１７８１５およびＷＯ ９９／３２６４６に見出されうる。最小ＥＩＡＶベクターはｔａｔ、ｒｅｖおよびＳ２遺伝子を欠き、これらの遺伝子のいずれもが製造系においてトランスで付与されない。最小ＨＩＶベクターはｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｔａｔおよびｎｅｆを欠く。
生産細胞内でベクターゲノムを産生させるために使用される発現プラスミドは、生産細胞／パッケージング細胞におけるゲノムの転写を指令するための、レトロウイルスゲノムに機能的に連結された転写調節制御配列を含みうる。全ての第３世代レンチウイルスベクターは５’Ｕ３エンハンサー－プロモーター領域における欠失を有し、ベクターゲノムＲＮＡの転写は異種プロモーター、例えば別のウイルスプロモーター、例えばＣＭＶプロモーター（後記）により駆動されうる。この特徴はｔａｔに非依存的なベクター製造を可能にする。幾つかのレンチウイルスベクターゲノムは効率的なウイルス産生のための追加的配列を要する。例えば、特にＨＩＶの場合には、ＲＲＥ配列が含まれうる。しかし、（別個の）ＧａｇＰｏｌカセットにおけるＲＲＥの必要性（およびトランスで付与されるｒｅｖに対する依存性）はＧａｇＰｏｌ ＯＲＦのコドン最適化によって低減または排除されうる。この方法の更なる詳細はＷＯ ２００１／７９５１８に見出されうる。
ｒｅｖ／ＲＲＥ系と同じ機能を果たす代替的配列も公知である。例えば、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の機能的類似体がメイソン・ファイザー（Ｍａｓｏｎ Ｐｆｉｚｅｒ）サルウイルスにおいて見出される。これは構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）として公知であり、感染細胞内の因子と相互作用すると考えられているゲノム内のＲＲＥ型配列を含む。該細胞因子はｒｅｖ類似体とみなされうる。したがって、ｒｅｖ／ＲＲＥ系の代替物としてＣＴＥが使用されうる。公知の又は利用可能となるＲｅｖタンパク質の任意の他の機能的等価体が本発明において適切でありうる。例えば、ＨＴＬＶ－１のＲｅｘタンパク質はＨＩＶ－１のＲｅｖタンパク質に機能的に取って代わりうることも公知である。ＲｅｖおよびＲＲＥは、本発明の方法における使用のためのベクターにおいて存在しないか又は非機能的であることが可能であり、あるいは、ｒｅｖおよびＲＲＥ、または機能的に等価な系が存在することが可能である。
本明細書中で用いる「機能的代替物」なる語は、別のタンパク質または配列と同じ機能を果たす代替的配列を有するタンパク質または配列を意味する。「機能的代替物」なる語は、本明細書における「機能的等価体」および「機能的類似体」と同じ意味で交換的に用いられる。
ＳＩＮベクター
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターは、ウイルスエンハンサーおよびプロモーター配列が欠失している自己不活性化（ＳＩＮ）配置で使用されうる。ＳＩＮベクターは製造可能であり、非ＳＩＮベクターの場合に類似した有効性でインビボ、エクスビボまたはインビトロで非分裂標的細胞に形質導入しうる。ＳＩＮプロウイルスにおける長末端反復（ＬＴＲ）の転写不活性化はｖＲＮＡの動員を妨げるはずであり、複製可能ウイルスの形成の可能性を更に低減する特徴である。これは、ＬＴＲのシス作用性効果を排除することにより内部プロモーターからの遺伝子の発現の調節をも可能にするはずである。
例えば、自己不活性化レトロウイルスベクター系は、転写エンハンサーまたはエンハンサーおよびプロモーター（３’ＬＴＲのＵ３領域内のもの）を欠失させることにより構築されている。ベクターの逆転写および組込みのラウンドの後、これらの変化は５’および３’ＬＴＲの両方にコピーされて、転写的に不活性なプロウイルスを与える。しかし、そのようなベクターにおけるＬＴＲに対して内部のいずれかのプロモーターは転写的に尚も活性であろう。この戦略は、内部に位置する遺伝子からの転写に対するウイルスＬＴＲにおけるエンハンサーおよびプロモーターの効果を排除するために用いられている。そのような効果には、転写の増強または転写の抑制が含まれる。この戦略は、ゲノムＤＮＡ内への３’ＬＴＲからの下流転写を排除するためにも用いられうる。これは、いずれかの内因性癌遺伝子の偶発的活性化を予防することが重要なヒト遺伝子治療において特に関心が持たれる。Ｙｕら（１９８６）ＰＮＡＳ ８３：３１９４－９８；Ｍａｒｔｙら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ ７２：８８５－７；Ｎａｖｉａｕｘら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１－５；Ｉｗａｋｕｍａら（１９９９）Ｖｉｒｏｌ．２６１：１２０－３２；Ｄｅｇｌｏｎら（２０００）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７９－９０。ＳＩＮレンチウイルスベクターはＵＳ ６，９２４，１２３およびＵＳ ７，０５６，６９９に記載されている。
複製欠損型レンチウイルスベクター
複製欠損型レンチウイルスベクターのゲノムにおいては、ｇａｇ／ｐｏｌおよび／またはｅｎｖの配列が突然変異していること、および／または機能的でないことが可能である。
本明細書に記載されている典型的なレンチウイルスベクターにおいては、ウイルス複製に必須のタンパク質に関する１以上のコード領域の少なくとも一部が該ベクターから除去されうる。これはウイルスベクターを複製欠損型にする。また、ウイルスゲノムの部分をＮＯＩにより置換して、非分裂標的細胞に形質導入しうる及び／又はそのゲノムを標的細胞ゲノム内に組込みうるＮＯＩを含むベクターを作製することが可能である。
１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターは、ＷＯ ２００６／０１０８３４およびＷＯ ２００７／０７１９９４に記載されている非組込み性ベクターである。
もう１つの実施形態においては、該ベクターは、ウイルスＲＮＡを欠損している又は欠いている配列を運搬する能力を有する。もう１つの実施形態においては、運搬されるべきＲＮＡ上に位置する異種結合ドメイン（ｇａｇにとって異種）およびＧａｇまたはＧａｇＰｏｌ上の同族（コグネイト）結合ドメインが、運搬されるべきＲＮＡのパッケージングを確保するために使用されうる。これらのベクターは共にＷＯ ２００７／０７２０５６に記載されている。
ＮＯＩおよびポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含みうる。それらは一本鎖または二本鎖でありうる。遺伝暗号の縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドが同一ポリペプチドをコードしうる、と当業者により理解されるであろう。また、本発明のポリペプチドが発現されることになるいずれかの特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映させるために、通常の技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を当業者が行いうる、と理解されるべきである。
該ポリヌクレオチドは、当技術分野で利用可能ないずれかの方法により修飾されうる。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増加させるために行われうる。
ＤＮＡポリヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは組換え法、合成法または当業者に利用可能な任意の手段により製造されうる。それらはまた、標準的な技術によってクローニングされうる。
より長いポリヌクレオチドは、一般に、組換え手段を用いて、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて製造される。これは、クローニングしたい標的配列に隣接するプライマー（例えば、約１５～３０ヌクレオチドのもの）のペアを作製すること、動物またはヒト細胞から得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡと該プライマーを接触させること、所望の領域の増幅を引き起こす条件下でＰＣＲを行うこと、増幅された断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲルで精製することにより）単離すること、および増幅されたＤＮＡを回収することを含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡが適切なベクター内にクローニングされうるように適切な制限酵素認識部位を含有するように設計されうる。
一般的なレトロウイルスベクターエレメント
プロモーターおよびエンハンサー
ＮＯＩおよびポリヌクレオチドの発現は、制御配列、例えば転写調節エレメントまたは翻訳抑制エレメント［これらには、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節シグナル（例えば、ｔｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）系）またはベクター生産細胞系内導入遺伝子抑制（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）（ＴＲｉＰ）または本明細書に記載されているＮＯＩの他の調節因子が含まれる］を使用して制御されうる。
原核生物プロモーターおよび真核細胞において機能するプロモーターが使用されうる。組織特異的または刺激特異的プロモーターが使用されうる。２以上の異なるプロモーターからの配列エレメントを含むキメラプロモーターも使用されうる。
適切なプロモーター配列は強力プロモーターであり、それらには、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノムに由来するもの、あるいは、異種哺乳類プロモーター、例えばアクチンプロモーター、ＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＴＫ、ＳＶ４０、ユビキチン、ＰＧＫまたはリボソームタンパク質プロモーターが含まれる。あるいは、転写を駆動するために、例えば以下のような組織特異的プロモーターが使用されうる：ロドプシン（Ｒｈｏ）、ロドプシンキナーゼ（ＲｈｏＫ）、錐体－桿体ホメオボックス含有遺伝子（ＣＲＸ）、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質（ＮＲＬ）、卵黄様黄斑ジストロフィー２（ＶＭＤ２）、チロシンヒドロキシラーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、アストロサイト特異的グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、肝臓脂肪酸結合タンパク質プロモーター、Ｆｌｔ－１プロモーター、ＩＮＦ－βプロモーター、Ｍｂプロモーター、ＳＰ－Ｂプロモーター、ＳＹＮ１プロモーター、ＷＡＳＰプロモーター、ＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター、ＳＶ４０／ＣＤ４３、ＳＶ４０／ＣＤ４５、ＮＳＥ／ＲＵ５’プロモーター、ＩＣＡＭ－２プロモーター、ＧＰＩＩｂプロモーター、ＧＦＡＰプロモーター、フィブロネクチンプロモーター、エンドグリンプロモーター、エラスターゼ－１プロモーター、デスミンプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、ＣＤ１４プロモーターおよびＢ２９プロモーター。
ＮＯＩの転写は、エンハンサー配列をベクター内に挿入することにより、更に増強されうる。エンハンサーは比較的、配向および位置に非依存的であるが、真核細胞ウイルス由来のエンハンサー、例えばＳＶ４０エンハンサーおよびＣＭＶ初期プロモーターエンハンサーが使用されうる。エンハンサーはプロモーターに対して５’または３’側の位置においてベクター内にスプライシングされうるが、好ましくは、プロモーターから５’側の部位に位置する。
プロモーターは、適切な標的細胞における発現を確保または増強するための特徴を更に含みうる。例えば、該特徴は保存領域、例えばプリブナウボックス（Ｐｒｉｂｎｏｗ Ｂｏｘ）またはＴＡＴＡボックスでありうる。プロモーターは、ヌクレオチド配列の発現のレベルに影響を及ぼす（例えば、該レベルを維持、増強または低減する）他の配列を含有しうる。適切な他の配列には、Ｓｈ１－イントロンまたはＡＤＨイントロンが含まれる。他の配列には、誘導可能エレメント、例えば、温度、化学物質、光またはストレスにより誘導可能なエレメントが含まれる。また、転写または翻訳を増強するための適切なエレメントが存在しうる。
ＮＯＩの調節因子
レトロウイルスパッケージング／プロデューサー細胞株の作製およびレトロウイルスベクター製造における複雑化要因は、特定のレトロウイルスベクター成分およびＮＯＩの構成的発現が細胞毒性であり、該毒性が、これらの成分を発現する細胞の死を招き、したがってベクターの製造を不可能にすることである。したがって、これらの成分（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌ、およびエンベロープタンパク質、例えばＶＳＶ－Ｇ）の発現が調節されうる。細胞への代謝負荷を最小限に抑えるために、他の非細胞毒性ベクター成分、例えばｒｅｖの発現も調節されうる。したがって、本明細書に記載されているモジュラー構築物および／または細胞は、少なくとも１つの調節エレメントに関連する細胞毒性および／または非細胞毒性ベクター成分を含みうる。本明細書中で用いる「調節エレメント」なる語は、関連する遺伝子またはタンパク質の発現に影響を及ぼしうる（該発現を増強または低減しうる）任意のエレメントを意味する。調節エレメントには、遺伝子スイッチ系、転写調節エレメントおよび翻訳抑制エレメントが含まれる。
哺乳類細胞において遺伝子スイッチを生成させるために、多数の原核生物調節系が採用されている。多数のレトロウイルスパッケージングおよびプロデューサー細胞株は、遺伝子スイッチ系（例えば、テトラサイクリンおよびクマート誘導性スイッチ系）を使用して制御されており、したがって、ベクター産生時にレトロウイルスベクター成分の１以上の発現のスイッチが入れられることを可能にする。遺伝子スイッチ系には、転写調節因子の（ＴｅｔＲ）タンパク質グループ（例えば、Ｔ－Ｒｅｘ、Ｔｅｔ－ＯｎおよびＴｅｔ－Ｏｆｆ）のもの、転写調節因子のクマート誘導性スイッチ系グループ（例えば、ＣｙｍＲタンパク質）のもの、およびＲＮＡ結合タンパク質（例えば、ＴＲＡＰ）が関わるものが含まれる。
そのような１つのテトラサイクリン誘導性系として、Ｔ－ＲＥｘ（商標）系に基づくテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）系が挙げられる。例えば、そのような系においては、最初のヌクレオチドがヒトサイトメガロウイルス主要前初期プロモーター（ｈＣＭＶｐ）のＴＡＴＡＴＡＡエレメントの最後のヌクレオチドの３’末端から１０ｂｐの位置となるように、テトラサイクリンオペレーター（ＴｅｔＯ２）が配置され、その場合、ＴｅｔＲが単独でリプレッサーとして機能しうる（Ｙａｏ Ｆ，Ｓｖｅｎｓｊｏ Ｔ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｔ，Ｌｕ Ｍ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｃ，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ Ｅ．Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ，ｔｅｔＲ，ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｔｅｔＲ－ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．１９９８．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ；９：１９３９－１９５０）。そのような系においては、ＮＯＩの発現は、ＴｅｔＯ２配列の２つのコピーがタンデムに挿入されているＣＭＶプロモーターにより制御されうる。ＴｅｔＲホモ二量体は、誘導物質（テトラサイクリンまたはその類似体ドキシサイクリン［ｄｏｘ］）の非存在下、ＴｅｔＯ２配列に結合し、上流ＣＭＶプロモーターからの転写を物理的に遮断する。誘導物質は、存在する場合には、ＴｅｔＲホモ二量体に結合して、アロステリック変化を引き起こし、その結果、それはＴｅｔＯ２配列にもはや結合できなくて、遺伝子発現が生じる。ＴｅｔＲ遺伝子はコドン最適化されうる。なぜなら、これは翻訳効率を改善して、ＴｅｔＯ２制御遺伝子発現の、より厳密な制御をもたらすからである。
ＴＲｉＰ系はＷＯ ２０１５／０９２４４０に記載されており、ベクター産生中に生産細胞におけるＮＯＩの発現を抑制する別の方法を提供する。導入遺伝子を駆動する構成的および／または強力なプロモーター（組織特異的プロモーターを含む）が望ましい場合、特に、生産細胞における導入遺伝子タンパク質の発現がベクター力価の低下をもたらし、および／または導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター運搬によりインビボで免疫応答を誘導する場合、ＴＲＡＰ結合配列（例えば、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ）相互作用はレトロウイルスベクターの製造のための導入遺伝子タンパク質抑制系の基礎を形成する（Ｍａｕｎｄｅｒら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。
簡潔に説明すると、ＴＲＡＰ－ｔｂｓ相互作用は翻訳遮断をもたらして、導入遺伝子タンパク質の翻訳を抑制する（Ｍａｕｎｄｅｒら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．（２０１７）Ｍａｒ ２７；８）。翻訳遮断は生産細胞においてのみ有効であり、それ自体は、ＤＮＡまたはＲＮＡに基づくベクター系を妨げない。導入遺伝子タンパク質が構成的および／または強力なプロモーター（単一または多シストロン性ｍＲＮＡからの組織特異的プロモーターを含む）から発現される場合、ＴＲｉＰ系は翻訳を抑制しうる。導入遺伝子タンパク質の非調節発現はベクター力価を低下させ、ベクター産物の品質に影響を及ぼしうることが実証されている。毒性または分子負荷の問題が細胞ストレスにつながりうる場合、導入遺伝子由来タンパク質のウイルスベクター運搬により導入遺伝子タンパク質がインビボで免疫応答を誘導する場合、遺伝子編集導入遺伝子の使用がオン／オフ・ターゲットの影響をもたらしうる場合、導入遺伝子タンパク質がベクターおよび／またはエンベロープ糖タンパク質除去に影響を及ぼしうる場合、一過性および安定ＰａＣＬ／ＰＣＬベクター製造系の両方における導入遺伝子タンパク質の抑制は、ベクター力価の低下を防ぐために生産細胞にとって有益である。
エンベロープおよびシュードタイピング
１つの好ましい態様においては、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターはシュードタイピング（偽型化）されている。これに関して、シュードタイピングは１以上の利点をもたらしうる。例えば、ＨＩＶに基づくベクターのｅｎｖ遺伝子産物は、これらのベクターを、ＣＤ４と称されるタンパク質を発現する細胞のみに感染することに制限するであろう。しかし、これらのベクター内のｅｎｖ遺伝子が他のエンベロープウイルスからのｅｎｖ配列で置換されている場合、それらはより広い感染スペクトルを有しうる（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。例えば、研究者は、ＨＩＶに基づくベクターをＶＳＶ由来の糖タンパク質でシュードタイピングしている（ＶｅｒｍａおよびＳｏｍｉａ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９（６６４８）：２３９－２４２）。
もう１つの代替形態においては、Ｅｎｖタンパク質は修飾Ｅｎｖタンパク質、例えば突然変異体または操作されたＥｎｖタンパク質でありうる。修飾は、標的化能を導入するために、または毒性を低減するために、または別の目的のために行われ、または選択されうる（Ｖａｌｓｅｓｉａ－Ｗｉｔｔｍａｎら １９９６ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７０：２０５６－６４；Ｎｉｌｓｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３（４）：２８０－２８６；およびＦｉｅｌｄｉｎｇら（１９９８）Ｂｌｏｏｄ ９１（５）：１８０２－１８０９およびそれらにおいて引用されている参考文献）。
ベクターは、選ばれた任意の分子でシュードタイピングされうる。
本明細書中で用いる「ｅｎｖ」は、本明細書に記載されている内因性レンチウイルスエンベロープまたは異種エンベロープを意味するものとする。
ＶＳＶ－Ｇ
ラブドウイルスである水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のエンベロープ糖タンパク質（Ｇ）は、あるエンベロープウイルスおよびウイルスベクタービリオンをシュードタイピングしうることが示されたエンベロープタンパク質である。
レトロウイルスエンベロープタンパク質の非存在下、ＭｏＭＬＶに基づくレトロウイルスベクターをそれがシュードタイピングしうることはＥｍｉら（（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）により最初に示された。ＷＯ １９９４／２９４４４０は、レトロウイルスベクターがＶＳＶ－Ｇで成功裏にシュードタイピング（シュードタイプ化）されうることを教示している。これらのシュードタイプ化ＶＳＶ－Ｇベクターは、広範な哺乳類細胞に形質導入するために使用されうる。その後、Ａｂｅら（１９９８）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（８）６３５６－６３６１は、非感染性レトロウイルス粒子がＶＳＶ－Ｇの付加により感染性にされうることを教示している。
Ｂｕｒｎｓら（（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：８０３３－７）はレトロウイルスＭＬＶをＶＳＶ－Ｇで成功裏にシュードタイピングし、これは、天然形態のＭＬＶと比較して変化した宿主域を有するベクターを与えた。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターは、哺乳類細胞だけでなく、魚類、爬虫類および昆虫に由来する細胞株にも感染することが示されている（Ｂｕｒｎｓら（１９９３）前掲）。それらは、種々の細胞株に関して、通常のアンホトロピックエンベロープより効率的であることも示されている（Ｙｅｅら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９５６４－９５６８，Ｅｍｉら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：１２０２－１２０７）。ＶＳＶ－Ｇタンパク質は、あるレトロウイルスをシュードタイピングするために使用されうる。なぜなら、その細胞質尾部はレトロウイルスのコアと相互作用しうるからである。
ＶＳＶ－Ｇタンパク質のような非レトロウイルスシュードタイピングエンベロープの提供は、感染性の低下を伴うことなくベクター粒子が高い力価まで濃縮されうるという利点をもたらす（Ａｋｋｉｎａら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２５８１－５）。レトロウイルスエンベロープタンパク質は超遠心分離中のセン断力に耐えることができないようである。なぜなら、おそらく、それらは、非共有結合により結合した２つのサブユニットからなるからであろう。それらのサブユニット間の相互作用は遠心分離により破壊されうる。一方、ＶＳＶ糖タンパク質は単一の単位から構成されている。したがって、ＶＳＶ－Ｇタンパク質シュードタイピングは、製造プロセス中に、効率的な標的細胞感染／形質導入の両方に、潜在的な利点をもたらしうる。
ＷＯ ２０００／５２１８８は、膜結合ウイルスエンベロープタンパク質として水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）を有する、安定なプロデューサー細胞株からのシュードタイプ化レトロウイルスベクターの作製を記載しており、ＶＳＶ－Ｇタンパク質の遺伝子配列を記載している。
ロスリバーウイルス
非霊長類レンチウイルスベクター（ＦＩＶ）をシュードタイピングするために、ロスリバーウイルスエンベロープが使用されており、全身投与後、主に肝臓に形質導入された（Ｋａｎｇら，２００２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７６：９３７８－９３８８）。効率は、ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターで得られたものより２０倍大きいと報告された。そして、それは、肝毒性を示唆する肝酵素の血清レベルによる測定でのそれほど大きな細胞毒性を引き起こさなかった。
バキュロウイルスＧＰ６４
バキュロウイルスＧＰ６４タンパク質は、臨床的および商業的用途に必要な高力価ウイルスの大規模製造において使用されるウイルスベクターのためのＶＳＶ－Ｇの代替物となることが示されている（Ｋｕｍａｒ Ｍ，Ｂｒａｄｏｗ ＢＰ，Ｚｉｍｍｅｒｂｅｒｇ Ｊ（２００３）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１４（１）：６７－７７）。ＶＳＶ－Ｇシュードタイプ化ベクターと比較して、ＧＰ６４シュードタイプ化ベクターは、類似した広い指向性および類似した天然力価を有する。ＧＰ６４の発現は細胞を殺さないため、ＧＰ６４を構成的に発現するＨＥＫ２９３Ｔに基づく細胞株が作製されうる。
代替的エンベロープ
ＥＩＡＶをシュードタイピングするために使用された場合に合理的な力価を与える他のエンベロープには、モコラ（Ｍｏｋｏｌａ）、狂犬病、エボラおよびＬＣＭＶ（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）が含まれる。４０７０Ａでシュードタイピングされたレンチウイルスの、マウスへの静脈内注入は、肝臓において最大の遺伝子発現をもたらした。
パッケージング配列
本発明の文脈において用いる「パッケージングシグナル」なる語は互換的に「パッケージング配列」または「ｐｓｉ」とも称され、ウイルス粒子形成中にレトロウイルスＲＮＡ鎖のカプシド形成に要求される非コード化シス作用配列に関して用いられる。ＨＩＶ－１においては、この配列は、主要スプライスドナー部位（ＳＤ）の上流から少なくともｇａｇ開始コドン（ヌクレオチド６８８までのｇａｇの５’配列の一部または全部が含まれうる）まで伸長する遺伝子座に位置づけられている。ＥＩＡＶにおいては、パッケージングシグナルはＧａｇの５’コード領域内へのＲ領域を含む。
本明細書中で用いる「拡張パッケージングシグナル」または「拡張パッケージング配列」なる語は、ｇａｇ遺伝子内へと更に拡張された、ｐｓｉ配列の周囲の配列の使用に関するものである。これらの追加的パッケージング配列の含有はウイルス粒子内へのベクターＲＮＡの挿入の効率を増加させうる。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ＲＮＡカプシド形成決定因子は離散的および不連続的であり、ゲノムｍＲＮＡの５’末端の１つの領域（Ｒ－Ｕ５）、およびｇａｇの近位３１１ ｎｔ内に位置づけられるもう１つの領域を含むことが示されている（Ｋａｙｅら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ｏｃｔ；６９（１０）：６５８８－９２（１９９５））。
配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳエレメントの挿入は単一プロモーターからの複数のコード領域の発現を可能にする（Ａｄａｍら（前記）；Ｋｏｏら（１９９２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８６：６６９－６７５；Ｃｈｅｎら １９９３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６７：２１４２－２１４８）。ＩＲＥＳエレメントは、それがウイルスタンパク質のキャップ（ｃａｐ）非依存的翻訳を促進する、ピコルナウイルスの非翻訳５’末端において、最初に見出された（Ｊａｎｇら（１９９０）Ｅｎｚｙｍｅ ４４：２９２－３０９）。ＩＲＥＳエレメントは、ＲＮＡにおけるオープンリーディングフレーム間に位置する場合、ＩＲＥＳエレメントにおけるリボソームの進入およびそれに続く下流の翻訳開始を促進することにより、下流オープンリーディングフレームの効率的翻訳を可能にする。
ＩＲＥＳの概説はＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ（ＴＩＧ Ｍａｙ １９９５ ｖｏｌ １１，Ｎｏ ５：１７９－１８４）に示されている。多数の異なるＩＲＥＳ配列が公知であり、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｇｈａｔｔａｓ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：５８４８－５８５９（１９９１））；ＢｉＰタンパク質［ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９１（１９９１）］；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディア遺伝子（エキソンｄおよびｅ）［Ｏｈら，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，６：１６４３－１６５３（１９９２）］からのもの、ならびにポリオウイルス（ＰＶ）におけるもの［ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０－３２５（１９８８）；また、ＭｏｕｎｔｆｏｒｄおよびＳｍｉｔｈ，ＴＩＧ １１，１７９－１８４（１９８５）も参照されたい］を包含する。
ＰＶ、ＥＭＣＶおよびブタ水疱病ウイルス由来のＩＲＥＳエレメントはレトロウイルスベクターにおいて既に使用されている（Ｃｏｆｆｉｎら，前記）。
「ＩＲＥＳ」なる語は、ＩＲＥＳとして働く又はＩＲＥＳの機能を改善する任意の配列または配列の組合せを含む。ＩＲＥＳはウイルス由来（例えば、ＥＭＣＶ ＩＲＥＳ、ＰＶ ＩＲＥＳまたはＦＭＤＶ ２Ａ様配列）または細胞由来（例えば、ＦＧＦ２ ＩＲＥＳ、ＮＲＦ ＩＲＥＳ、Ｎｏｔｃｈ ２ ＩＲＥＳまたはＥＩＦ４ ＩＲＥＳ）でありうる。
ＩＲＥＳが各ポリヌクレオチドの翻訳を開始しうるためには、それはモジュラー構築物における該ポリヌクレオチドの間または前に位置するべきである。
安定な細胞株の開発に利用されるヌクレオチド配列は、安定な組込みが生じた細胞の選択のための選択可能なマーカーの付加を要する。これらの選択可能なマーカーはヌクレオチド配列内の単一転写単位として発現可能であり、あるいは、ポリシストロン性メッセージにおける選択可能なマーカーの翻訳を開始させるためにＩＲＥＳエレメントを使用することが好ましいかもしれない（Ａｄａｍら １９９１ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，４９８５）。
遺伝的配向およびインスレーター
核酸は方向性（配向性）を有し、これは細胞内の転写および複製のようなメカニズムに究極的な影響を及ぼすことが周知である。したがって、遺伝子は、同じ核酸構築物の一部である場合、互いに対する相対的配向を有しうる。
本発明の特定の実施形態においては、細胞または構築物中の同じ遺伝子座に存在する少なくとも２つの核酸配列は逆配向および／または交互配向で存在しうる。換言すれば、本発明の特定の実施形態においては、この特定の遺伝子座において、連続する遺伝子のペアは同一配向を有さない。これは、該領域が宿主細胞の同じ物理的位置において発現される場合、転写および翻訳の両方のリードスルーを防ぐのに役立ちうる。
ベクター製造に必要な核酸が細胞内の同じ遺伝子座を拠点としている場合、交互配向を有することはレトロウイルスベクター製造に利益をもたらす。また、これが今度は、複製可能レトロウイルスベクターの生成の予防において、生じる構築物の安全性を改善しうる。
核酸配列が逆配向および／または交互配向で存在する場合、インスレーターの使用は、ＮＯＩのその遺伝的環境からの不適切な発現またはサイレンシングを予防しうる。
「インスレーター」なる語は、インスレーター結合タンパク質に結合した際に周囲の調節因子シグナルから遺伝子を保護する能力を有するＤＮＡ配列エレメントのクラスを意味する。エンハンサー遮断機能およびクロマチンバリア機能の２つのタイプのインスレーターが存在する。インスレーターがプロモーターとエンハンサーとの間に位置する場合、インスレーターのエンハンサー遮断機能はエンハンサーの転写増強の影響からプロモーターを保護する（ＧｅｙｅｒおよびＣｏｒｃｅｓ １９９２；ＫｅｌｌｕｍおよびＳｃｈｅｄｌ １９９２）。クロマチンバリアインスレーターは、近傍の凝縮クロマチンの進行を防ぐことにより機能し、それは、転写的に活性なクロマチン領域を転写的に不活性なクロマチン領域へと変換して遺伝子発現のサイレンシングをもたらすものである。ヘテロクロマチンの拡散を抑制して遺伝子サイレンシングを抑制するインスレーターは、ヒストン修飾に関与する酵素をリクルートして、このプロセスを妨げる（Ｙａｎｇ Ｊ，Ｃｏｒｃｅｓ ＶＧ．２０１１；１１０：４３－７６；Ｈｕａｎｇ，Ｌｉら ２００７；Ｄｈｉｌｌｏｎ，Ｒａａｂら ２００９）。インスレーターはこれらの機能の一方または両方を有しうる。ニワトリβ－グロビンインスレーター（ｃＨＳ４）はそのような一例である。このインスレーターは、最も広く研究されている脊椎動物インスレーターであり、Ｇ＋Ｃに非常に富み、エンハンサー遮断機能とヘテロクロマチンバリア機能との両方を有する（Ｃｈｕｎｇ Ｊ Ｈ，Ｗｈｉｔｅｌｙ Ｍ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．Ｃｅｌｌ．１９９３；７４：５０５－５１４）。エンハンサー遮断機能を有する他のそのようなインスレーターには、以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：ヒトβ－グロビンインスレーター５（ＨＳ５）、ヒトβ－グロビンインスレーター１（ＨＳ１）およびニワトリβ－グロビンインスレーター（ｃＨＳ３）（Ｆａｒｒｅｌｌ ＣＭ１，Ｗｅｓｔ ＡＧ，Ｆｅｌｓｅｎｆｅｌｄ Ｇ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｊｕｎ；２２（１１）：３８２０－３１；Ｊ Ｅｌｌｉｓら ＥＭＢＯ Ｊ．１９９６ Ｆｅｂ １；１５（３）：５６２－５６８）。望ましくない遠位相互作用を低減することに加えて、インスレーターは、隣接レトロウイルス核酸配列間のプロモーター干渉（すなわち、１つの転写単位からのプロモーターが隣接転写単位の発現を損なう場合）を防ぐのにも役立ちうる。レトロウイルスベクター核酸配列のそれぞれの間でインスレーターが使用される場合、直接的なリードスルーの低減は、複製可能レトロウイルスベクター粒子の形成を防ぐのに役立つであろう。
インスレーターはレトロウイルス核酸配列のそれぞれの間に存在しうる。１つの実施形態においては、インスレーターの使用はプロモーター－エンハンサー相互作用を妨げて、ベクター成分をコードするヌクレオチド配列において、あるＮＯＩ発現カセットが別のＮＯＩ発現カセットと相互作用することを妨げる。
ベクターゲノム配列とｇａｇ－ｐｏｌ配列との間にインスレーターが存在することが可能である。したがって、これは複製可能レトロウイルスベクターおよび「野生型」様ＲＮＡ転写産物の産生の可能性を低下させて、構築物の安全性プロファイルを改善する。安定に組込まれた多重遺伝子ベクターの発現を改善するためのインスレーターエレメントの使用はＭｏｒｉａｒｉｔｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３ Ａｐｒ；４１（８）：ｅ９２において引用されている。
ベクター力価
レンチウイルスベクターの力価を決定する多数の異なる方法が存在する、と当業者は理解するであろう。力価は、しばしば、形質導入単位／ｍＬ（ＴＵ／ｍＬ）として示される。力価は、ベクター粒子の数を増加させることにより、およびベクター調製物の特異的活性を増加させることにより増加されうる。
治療用途
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターまたは本明細書に記載されているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織は医学において使用されうる。
また、本明細書に記載されているレンチウイルスベクター、本発明の生産細胞または本明細書に記載されているレンチウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織は、関心のあるヌクレオチドをそれを要する標的部位に送達するために、医薬の製造に使用されうる。本発明のレンチウイルスベクターまたは形質導入細胞のそのような使用は、既に記載されているとおり、治療または診断の目的のためのものでありうる。
したがって、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞を提供する。
「ウイルスベクター粒子により形質導入された細胞」または「レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞」は、ウイルスベクター粒子により運搬される核酸が導入された細胞、特に標的細胞として理解されるべきである。
本発明の１つの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠く標的細胞において翻訳される。
「標的細胞」は、ＮＯＩを発現させることが望ましい細胞として理解されるべきである。ＮＯＩは、本発明のウイルスベクターを使用して標的細胞内に導入されうる。標的細胞への送達（運搬）はインビボ、エクスビボまたはインビトロで行われうる。
好ましい実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは治療効果をもたらす。
ＮＯＩは治療または診断用途を有しうる。適切なＮＯＩには、酵素、補因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、融合タンパク質、免疫共刺激分子、免疫調節分子、キメラ抗原受容体、標的タンパク質のトランスドメイン陰性突然変異体、毒素、条件的毒素、抗原、転写因子、構造タンパク質、レポータータンパク質、細胞内局在化シグナル、腫瘍抑制タンパク質、増殖因子、膜タンパク質、受容体、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルスタンパク質およびリボザイム、ならびにそれらの誘導体（例えば、関連レポーター基を有する誘導体）をコードする配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。ＮＯＩはマイクロＲＮＡをもコードしうる。理論により束縛されることを望むものではないが、マイクロＲＮＡのプロセシングはＴＲＡＰにより抑制されると考えられている。
１つの実施形態においては、ＮＯＩは神経変性障害の治療において有用でありうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩはパーキンソン病の治療において有用でありうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ドーパミン合成に関与する１以上の酵素をコードしうる。例えば、該酵素は以下のものの１以上でありうる：チロシンヒドロキシラーゼ、ＧＴＰ－シクロヒドロラーゼＩおよび／または芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼ。３つ全ての遺伝子の配列が入手可能である（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｘ０５２９０、Ｕ１９５２３およびＭ７６１８０）。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは小胞モノアミン輸送体２（ＶＭＡＴ２）をコードしうる。もう１つの実施形態においては、ウイルスゲノムは、芳香族アミノ酸ドーパデカルボキシラーゼをコードするＮＯＩおよびＶＭＡＴ２をコードするＮＯＩを含みうる。そのようなゲノムはパーキンソン病の治療において、特にＬ－ＤＯＰＡの末梢投与と共に使用されうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは治療用タンパク質または治療用タンパク質の組合せをコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ－１β）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、インスリン増殖因子－２、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ／ＶＥＧＦ－２、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＦＧ－ＡおよびＰＤＦＧ－Ｂのヘテロ二量体およびホモ二量体からなる群から選択される１以上のタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、アンジオスタチン、エンドスタチン、血小板因子４、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、胎盤増殖因子、レスチン（ｒｅｓｔｉｎ）、インターフェロン－α、インターフェロン誘導性タンパク質、ｇｒｏ－ベータおよびチューブダウン（ｔｕｂｅｄｏｗｎ）－１、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－１２、レチノイン酸、抗ＶＥＧＦ抗体またはそれらのフラグメント（断片）／変異体、例えばアフリベルセプト、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦ受容体タンパク質、例えばＵＳ ５，９５２，１９９およびＵＳ ６，１００，０７１に記載されているもの、ならびに抗ＶＥＧＦ受容体抗体からなる群から選択される１以上の抗血管新生タンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ＮＦ－ｋＢインヒビター、ＩＬ１ベータインヒビター、ＴＧＦベータインヒビター、ＩＬ－６インヒビター、ＩＬ－２３インヒビター、ＩＬ－１８インヒビター、腫瘍壊死因子アルファおよび腫瘍壊死因子ベータ、リンホトキシンアルファおよびリンホトキシンベータ、ＬＩＧＨＴインヒビター、アルファシヌクレインインヒビター、タウインヒビター、ベータアミロイドインヒビター、ＩＬ－１７インヒビターからなる群から選択される抗炎症タンパク質、抗体、またはタンパク質もしくは抗体のフラグメント／変異体をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は眼細胞において発現されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、通常は光受容細胞および／または網膜色素上皮細胞において発現されるタンパク質をコードしうる。
もう１つの実施形態においては、ＮＯＩは、ＲＰＥ６５、アリール炭化水素相互作用性受容体タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、ＣＲＢ１、レシチンレチナールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、光受容体特異的ホメオボックス（ＣＲＸ）、レチナールグアニル酸シクラーゼ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、ＲＰＧＲ相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰ１）、ＬＣＡ２、ＬＣＡ３、ＬＣＡ５、ジストロフィン、ＰＲＰＨ２、ＣＮＴＦ、ＡＢＣＲ／ＡＢＣＡ４、ＥＭＰ１、ＴＩＭＰ３、ＭＥＲＴＫ、ＥＬＯＶＬ４、ＭＹＯ７Ａ、ＵＳＨ２Ａ、ＶＭＤ２、ＲＬＢＰ１、ＣＯＸ－２、ＦＰＲ、ハルモニン（ｈａｒｍｏｎｉｎ）、Ｒａｂエスコート（ｅｓｃｏｒｔ）タンパク質１、ＣＮＧＢ２、ＣＮＧＡ３、ＣＥＰ ２９０、ＲＰＧＲ、ＲＳ１、ＲＰ１、ＰＲＥＬＰ、グルタチオン経路酵素およびオプチシン（ｏｐｔｉｃｉｎ）を含む群から選択されるタンパク質をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩはヒト凝固因子ＶＩＩＩまたはＩＸをコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩは、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、カルバモイル－リン酸シンターゼアンモニア、オルニチントランスカルバミラーゼ、グルコシルセラミダーゼベータ、アルファガラクトシダーゼＡ、グルコシルセラミダーゼベータ、シスチノシン、グルコサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチル－アルファ－グルコサミニダーゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ガラクトサミン－６スルファターゼ、アリールスルファターゼＡ、チトクロームＢ－２４５ベータ、ＡＢＣＤ１、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸シンターゼ、アルギニノコハク酸リサーゼ、アルギナーゼ１、アラニングリコキシラートアミノトランスフェラーゼ、ＡＴＰ結合性カセット、サブファミリーＢメンバーを含む群から選択される、代謝に関与する１以上のタンパク質をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードしうる。１つの実施形態においては、ＣＡＲは抗５Ｔ４ ＣＡＲである。他の実施形態においては、ＮＯＩはＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ４７、ＣＤ１３８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ルイスＹ抗原（ＬｅＹ）、チロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）、ムチン１，細胞表面結合（Ｍｕｃ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、内皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、インスリン、タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体タイプ（ｎｏｎ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｐｅ）２２、インターロイキン２受容体アルファ、ヘリカーゼＣドメイン１で誘導されるインターフェロン、ヒト上皮増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、メシオテリン、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）をコードしうる。
他の実施形態においては、ＮＯＩは、ＵＬＢＰ１、２および３、Ｈ６０、Ｒａｅ－１ａ、ｂ、ｇ、ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢを含む群から選択されるＮＫＧ２Ｄリガンドに対するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードしうる。
更なる実施形態においては、ＮＯＩは、ＳＧＳＨ、ＳＵＭＦ１、ＧＡＡ、コモンガンマ鎖（ＣＤ１３２）、アデノシンデアミナーゼ、ＷＡＳタンパク質、グロビン、アルファガラクトシダーゼＡ、δ－アミノレブリン酸（ＡＬＡ）シンターゼ、δ－アミノレブリン酸デヒドラターゼ（ＡＬＡＤ）、ヒドロキシメチルビラン（ＨＭＢ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）シンターゼ、ウロポルフィリノーゲン（ＵＲＯ）デカルボキシラーゼ、コプロポルフィリノーゲン（ＣＯＰＲＯ）オキシダーゼ、プロトポルフィリノーゲン（ＰＲＯＴＯ）オキシダーゼ、フェロケラターゼ、α－Ｌ－イデュロニダーゼ、イドロナートスルファターゼ、ヘパランスルファミダーゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ヘパラン－α－グルコサミニド、Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ、３ Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ、ガラクトース－６－スルファートスルファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ、β－グルクロニダーゼおよびヒアルロニダーゼをコードしうる。
ＮＯＩに加えて、該ベクターはまた、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを含む又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
適応症
本発明の、レトロウイルスおよびＡＡＶベクターを含むベクターは、ＷＯ １９９８／０５６３５、ＷＯ １９９８／０７８５９、ＷＯ １９９８／０９９８５に挙げられている障害の治療において有用な１以上のＮＯＩを運搬するために使用されうる。関心のあるヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。そのような疾患の例を以下に記載する。
以下のものに応答する障害：サイトカインおよび細胞増殖／分化活性；免疫抑制物質または免疫刺激物質の活性（例えば、ヒト免疫不全ウイルスの感染を含む免疫不全の治療、リンパ球増殖の調節、癌および多数の自己免疫疾患の治療、ならびに移植片拒絶の予防または腫瘍免疫の誘導のためのもの）；造血の調節（例えば、骨髄またはリンパ系疾患の治療）；骨、軟骨、腱、靭帯および神経組織の成長の促進（例えば、創傷治癒、火傷、潰瘍および歯周病および神経変性の治療のためのもの）；卵胞刺激ホルモンの阻害または活性化（繁殖性の調節）；走化性／ケモキネシス活性（例えば、損傷または感染部位に特定の細胞型を動員するためのもの）；止血および血栓溶解活性（例えば、血友病および卒中の治療のためのもの）；抗炎症活性（例えば、敗血症性ショックまたはクローン病の治療のためのもの）；マクロファージ阻害および／またはＴ細胞阻害活性、したがって、抗炎症活性；抗免疫活性（すなわち、炎症に関連しない応答を含む、細胞性および／または体液性免疫応答に対する阻害効果）；マクロファージおよびＴ細胞が細胞外マトリックス成分およびフィブロネクチンに接着する能力の阻害、ならびにＴ細胞におけるアップレギュレーションされたｆａｓ受容体発現。
悪性障害、例えば、癌、白血病、良性および悪性腫瘍の増殖、浸潤および拡大、血管新生、転移、腹水および悪性胸水貯留。
自己免疫疾患、例えば、関節炎、例えば関節リウマチ、過敏症、アレルギー反応、喘息、全身性エリテマトーデス、膠原病および他の疾患。
血管疾患、例えば、動脈硬化、アテローム性動脈硬化性心疾患、再灌流障害、心停止、心筋梗塞、血管炎症性障害、呼吸窮迫症候群、心血管作用、末梢血管疾患、片頭痛およびアスピリン依存性抗血栓症、卒中、脳虚血、虚血性心疾患または他の疾患。
消化管の疾患、例えば、消化性潰瘍、潰瘍性大腸炎、クローン病および他の疾患。
肝疾患、例えば、肝線維症、肝硬変。
遺伝性代謝障害、例えば、フェニルケトン尿症ＰＫＵ、ウィルソン病、有機酸血症、尿素回路障害、胆汁うっ滞および他の疾患。
腎臓および泌尿器疾患、例えば、甲状腺炎または他の腺疾患、糸球体腎炎または他の疾患。
耳、鼻および咽喉の障害、例えば、耳炎または他の耳鼻咽喉科疾患、皮膚炎または他の皮膚疾患。
歯科および口腔障害、例えば、歯周病、歯周炎、歯肉炎または他の歯科／口腔疾患。
精巣疾患、例えば、精巣炎または精巣上体－精巣炎、不妊症、精巣外傷または他の精巣疾患。
婦人科疾患、例えば、胎盤機能不全、胎盤不全、習慣性流産、子癇、子癇前症、子宮内膜症および他の婦人科疾患。
眼科的障害、例えば、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、例えばＬＣＡ１０、後部ブドウ膜炎、中間部ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、結膜炎、脈絡網膜炎、ブドウ膜網膜炎、視神経炎、緑内障、例えば開放角緑内障および若年性先天性緑内障、眼内炎症、例えば網膜炎または嚢胞性黄斑浮腫、交感性眼炎、強膜炎、色素性網膜炎、黄斑変性、例えば加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）および若年性黄斑変性、例えばベスト病、ベスト卵黄様黄斑変性、シュタルガルト病、アッシャー症候群、ドイン蜂巣状網膜ジストロフィー、ソルビー黄斑ジストロフィー、若年性網膜分離症、錐体桿体ジストロフィー、角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、アディ症候群、小口病、変性眼底疾患、眼外傷、感染により引き起こされる眼炎症、増殖性硝子体網膜症、急性虚血性視神経症、過剰瘢痕、例えば緑内障濾過手術後のもの、眼インプラントに対する反応、角膜移植移植片拒絶、および他の眼科疾患、例えば糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、ＲＬＢＰ１関連網膜ジストロフィー、脈絡膜欠如および色覚異常。
神経障害および神経変性障害、例えば、パーキンソン病、パーキンソン病の治療による合併症および／または副作用、エイズ関連認知症症候群、ＨＩＶ関連脳症、デビック病、シデナム舞踏病、アルツハイマー病および他の変性疾患、ＣＮＳの病態または障害、脳卒中、ポリオ後症候群、精神障害、脊髄炎、脳炎、亜急性硬化性全脳炎、脳脊髄炎、急性神経障害、亜急性神経障害、慢性神経障害、ファブリー病、ゴーチャー病、シスチン症、ポンペ病、異染性白質ジストロフィー、ウィスコット－アルドリッチ症候群、副腎白質ジストロフィー、ベータサラセミア、鎌状赤血球症、ギランバレー症候群、シデナム舞踏病、重力筋無力症、偽性脳腫瘍、ダウン症候群、ハンチントン病、ＣＮＳ圧迫またはＣＮＳ外傷またはＣＮＳの感染症、筋萎縮および筋ジストロフィー、中枢神経系および末梢神経系の疾患、病態または障害、運動ニューロン疾患、例えば筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、脊髄および剥離損傷。
他の疾患および病態、例えば嚢胞性線維症、ムコ多糖症、例えばサンフィリポ症候群Ａ、サンフィリポ症候群Ｂ、サンフィリポ症候群Ｃ、サンフィリポ症候群Ｄ、ハンター症候群、ハーラー－シャイエ症候群、モルキオ症候群、ＡＤＡ－ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖ＳＣＩＤ、Ｘ連鎖慢性肉芽腫性疾患、ポルフィリン症、血友病Ａ、血友病Ｂ、外傷後炎症、出血、凝固および急性期反応、悪液質、食欲不振、急性感染症、敗血症性ショック、感染症、糖尿病、手術の合併症または副作用、骨髄移植または他の移植の合併症および／または副作用、遺伝子治療の合併症および副作用、例えばウイルス性担体の感染またはエイズによるもの、天然または人工の細胞、組織および器官、例えば角膜、骨髄、臓器、レンズ、ペースメーカー、天然または人工皮膚組織の移植の場合の移植片拒絶の予防および／または治療のための体液性および／または細胞性免疫応答を抑制または阻害するためのもの。
ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
特定の他の実施形態においては、ＮＯＩはマイクロＲＮＡを含む。マイクロＲＮＡは、生物において天然で産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、それらの少なくとも一部は標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡファミリーの当初のメンバーはｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４である。ｌｅｔ－７遺伝子は、蠕虫の発生中に内因性タンパク質コード化遺伝子の発現を調節する小さな高度に保存されたＲＮＡ種をコードしている。該活性ＲＮＡ種は最初は約７０ｎｔの前駆体として転写され、これは約２１ｎｔの成熟形態へと転写後プロセシングされる。ｌｅｔ－７およびｌｉｎ－４は共にヘアピンＲＮＡ前駆体として転写され、これらはダイサー酵素によりそれらの成熟形態へとプロセシングされる。
該ベクターは、ＮＯＩに加えて、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたは調節ｓｈＲＮＡを含み又はコードしうる（Ｄｉｃｋｉｎｓら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８９－１２９５，Ｓｉｌｖａら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３７：１２８１－１２８８）。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により引き起こされる転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は、外来遺伝子の発現を制御するための保存された細胞防御メカニズムである。ウイルスまたはトランスポゾンのようなエレメントのランダムな組込みは、相同一本鎖ｍＲＮＡまたはウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられている。該サイレンシング作用はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として公知である（Ｒａｌｐｈら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１：４２９－４３３）。ＲＮＡｉのメカニズムは約２１～２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡの二本鎖への長いｄｓＲＮＡのプロセシングを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡ分解の配列特異的メディエーターである低分子干渉またはサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と称される。分化哺乳類細胞においては、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡはインターフェロン応答を活性化して、タンパク質合成の阻止および非特異的ｍＲＮＡ分解を招くことが判明している（Ｓｔａｒｋら，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６７：２２７－６４（１９９８））。しかし、この応答は、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することにより迂回可能であり（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，ＥＭＢＯ Ｊ．Ｄｅｃ ３；２０（２３）：６８７７－８８（２００１），Ｈｕｔｖａｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ａｕｇ ３，２９３（５５３１）：８３４－８．Ｅｕｐｕｂ Ｊｕｌ １２（２００１））、これは、培養哺乳類細胞内で遺伝子機能が分析されることを可能にする。
医薬組成物
本発明は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に、本明細書に記載されているレンチウイルスベクターを含む、または本明細書に記載されているウイルスベクターで形質導入された細胞もしくは組織を含む医薬組成物を提供する。
本発明は、遺伝子治療により個体を治療するための医薬組成物を提供し、ここで、該組成物はレンチウイルスベクターの治療的有効量を含む。該医薬組成物はヒトまたは動物における使用のためのものでありうる。
該組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤またはアジュバント（補助剤）を含みうる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣例に基づいて行われうる。該医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤を含むことが可能であり、あるいはそれらに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤、可溶化剤、および標的部位内へのベクターの進入を補助または増進しうる他の担体物質（例えば、リピッド（脂質）デリバリーシステム）を含みうる。
適切な場合には、該組成物は以下のいずれかの１以上により投与されうる：吸入；坐剤またはペッサリーの形態；ローション剤、溶液（水剤）、クリーム剤、軟膏剤または散布剤の形態で局所的に；皮膚パッチの使用により；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトースを含有する錠剤の形態で、あるいは単独での又は賦形剤と混合されたカプセル剤または胚珠状物（ｏｖｕｌｅ）において、あるいは香味または着色剤を含有するエリキシル剤、溶液（水剤）または懸濁剤の形態で経口的に。あるいは、それらは、非経口的に、例えば海綿体内、静脈内、筋肉内、頭蓋内、眼内、腹腔内または皮下に注射されうる。非経口投与の場合、該組成物は、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類のような他の物質を含有しうる無菌水溶液の形態で最良に使用されうる。頬側または舌下投与の場合には、該組成物は、通常の方法で製剤化されうる錠剤またはトローチ剤（ロゼンジ）の形態で投与されうる。
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターは、エクスビボで、標的細胞または標的組織に形質導入した後、該標的細胞または組織を、それを要する患者に導入するためにも使用されうる。そのような細胞の一例は自己Ｔ細胞でありうる。そのような組織の一例はドナー角膜でありうる。
変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片
本明細書に記載されている特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はそれらの変異体、誘導体、類似体、ホモログおよび断片の使用をも含む。
本発明の場合には、いずれかの与えられた配列の変異体は、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその内因性機能の少なくとも１つを保有するように残基（アミノ酸残基も核酸残基も含む）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、天然に存在するタンパク質に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、置換および／または変異により得られうる。
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関して本明細書中で用いる「誘導体」なる語は、配列からの又は配列に対する、１つ（または１以上）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失および／または付加を含む。ただし、生じるタンパク質またはポリペプチドはその内因性機能の少なくとも１つを保有する必要がある。
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して本明細書に記載されている「類似体」なる語は、任意の模倣体、すなわち、それが模倣しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化合物を含む。
典型的には、アミノ酸置換は、例えば、１、２または３個から１０または２０個までの置換として行われうる。ただし、修飾された配列は、要求される活性または能力を保有する必要がある。アミノ酸置換は、天然に存在しない類似体の使用を含みうる。
本発明において使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし機能的に同等なタンパク質を与える、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換をも有しうる。内因性機能が保有される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換が行われうる。例えば、負荷電アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含み、正荷電アミノ酸はリジンおよびアルギニンを含み、類似した親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸はアスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニンおよびチロシンを含む。
保存的置換が、例えば以下の表に従い行われうる。第２列における同じ分類におけるアミノ酸、および好ましくは、第３列における同じ行におけるアミノ酸が互いに置換されうる。
Figure 2023516493000017
「ホモログ」なる語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列に対して或る相同性（ホモロジー）を有する実体を意味する。「相同性」なる語は「同一性」と同等でありうる。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一でありうるアミノ酸配列を含むとみなされる。典型的には、ホモログは対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含む。相同性は類似性（すなわち、類似した化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮されうるが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
この文脈においては、相同配列は、対象配列に対して少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％または９０％同一でありうる、好ましくは少なくとも９５％または９７％、９８％または９９％同一でありうるヌクレオチド配列を含むとみなされる。相同性は類似性に関しても考慮されうるが、本発明の文脈においては、配列同一性に関して相同性を表すことが好ましい。
相同性比較は、目により、またはより通常には、容易に利用可能な配列比較プログラムの補助により行われうる。これらの商業的に入手可能なコンピュータプログラムは２以上の配列の間の相同性または同一性の割合（％）を計算しうる。
相同性の割合（％）は連続的アミノ酸にわたって計算されうる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアライメント（整列）し、一方の配列における各アミノ酸を他方の配列における対応アミノ酸と、同時に１残基ごとに、直接的に比較する。これは「非ギャップ化（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アライメントと称される。典型的には、そのような非ギャップ化アライメントは比較的短い残基数のみにわたって行われる。
これは非常に簡便で一貫した方法であるが、それは例えば以下のような場合を考慮していない。すなわち、ヌクレオチド配列において１つの挿入または欠失が存在する場合、それが存在しなければ同一であるペアの配列において、該挿入または欠失は、後続コドンの、アライメントからの脱落を引き起こして、グローバルアライメントが行われた場合に相同性（％）における大きな減少を潜在的に引き起こしうる。したがって、ほとんどの配列比較法は、全体的な相同性スコアを不当に不利にすることなく、考えられうる挿入および欠失を考慮した最適アライメントを与えるように設計される。これは、局所的相同性（ローカルホモロジー）を最大にすることを試みるために配列アライメント内に「ギャップ」を挿入することにより達成される。
しかし、より複雑なこれらの方法は、アライメントにおいて生じる各ギャップに「ギャップ・ペナルティ」を割り当てるものであり、この場合、同一アミノ酸の数が同じとなる場合、可能な限り少ないギャップを有する配列アライメント（これは、それらの２つの比較配列間の、より高い関連性を反映する）が、多数のギャップを有するものより高いスコアを得る。「アフィン・ギャップ・コスト（ａｆｆｉｎｅ ｇａｐ ｃｏｓｔ）」は典型的に用いられ、これは、ギャップの存在に関しては比較的高いコストを課し、ギャップにおける各後続残基に関しては、より小さいペナルティを課すものである。これは、最もよく用いられるギャップ・スコア化（スコアリング）系である。高いギャップ・ペナルティは、もちろん、より少数のギャップを有する最適化アライメントを与えるであろう。ほとんどのアライメントプログラムは、ギャップペナルティが改変されることを可能にする。しかし、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列に関するデフォルト・ギャップ・ペナルティはギャップに関しては－１２であり、各伸長に関しては－４である。
したがって、最大相同性（％）の計算は、まず、ギャップ・ペナルティを考慮した最適アライメントの生成を要する。そのようなアライメントを行うための適切なコンピュータプログラムとしては、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）が挙げられる。配列比較を行いうる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９） 前掲－Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３－４１０）およびＧＥＮＥＷＯＲＫＳ比較ツールスイートが含まれるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡは共に、オフラインおよびオンライン検索のために利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）前掲，ｐ．７－５８～７－６０を参照されたい）。しかし、幾つかのアプリケーションに関しては、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称されるもう１つのツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列の比較のために利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７４（２）：２４７－５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ（１９９９）１７７（１）：１８７－８を参照されたい）。
最終的な相同性（％）は同一性に関して測定されうるが、アライメントプロセス自体は、典型的には、オール・オア・ナッシング（全か無か）のペア比較に基づくものではない。実際には、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てるスケール化（ｓｃａｌｅｄ）類似性スコアマトリックスが一般に使用される。一般に使用されるそのようなマトリックス（行列）の一例は、ＢＬＡＳＴプログラムスイートのデフォルトマトリックスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、公的デフォルト値またはカスタム記号比較表（提供されている場合）を使用する（更なる詳細は使用マニュアルを参照されたい）。幾つかのアプリケーションに関しては、ＧＣＧパッケージには公的デフォルト値を、あるいは他のソフトウェアの場合にはデフォルトマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。
ソフトウェアが最適アライメントを一旦生成したら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を計算することが可能である。ソフトウェアは、通常、配列比較の一部としてこれを行い、数的結果を与える。
「断片」も変異体であり、この語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいて関心が持たれるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの、選択された領域を意味する。したがって、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列を意味する。
そのような変異体は、標準的な組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的突然変異誘発を用いて製造されうる。挿入を行いたい場合には、挿入部位の両側の天然に存在する配列に対応する５’および３’隣接領域と共に該挿入をコードする合成ＤＮＡが作製されうる。該隣接領域は、天然に存在する配列内の部位に対応する簡便な制限部位を含有し、その結果、該配列は適切な酵素で切断され、該合成ＤＮＡは該切断物内に連結されうる。ついで該ＤＮＡは本発明に従い発現されてコード化タンパク質を与える。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当技術分野で公知の多数の標準的な技術の単なる例示であるに過ぎず、他の公知技術も使用されうる。
コドン最適化
本発明において使用されるポリヌクレオチド（ＮＯＩおよび／またはベクター製造系の成分を含む）はコドン最適化されうる。コドン最適化はＷＯ １９９９／４１３９７およびＷＯ ２００１／７９５１８に既に記載されている。個々のコドンの、細胞の使用頻度は、細胞によって異なる。このコドン偏向は細胞型における個々のｔＲＮＡの相対存在量における偏向に対応する。配列内のコドンを、対応ｔＲＮＡの相対存在量に合致するようにそれが調整されるように変化させることにより、発現を増強することが可能である。同様に、対応ｔＲＮＡが個々の細胞型において稀有であることが知られているコドンを意図的に選択することにより、発現を低減することが可能である。このように、更なる翻訳制御度が利用可能である。
レトロウイルスを含む多数のウイルスは多数の稀有コドンを利用しており、一般的に利用される哺乳類コドンに一致するようにこれらを変化させることにより、関心のある遺伝子、例えばＮＯＩまたはパッケージング成分の、哺乳類生産細胞内の発現の増強が達成されうる。コドン使用頻度表は哺乳類細胞および種々の他の生物に関して当技術分野で公知である。
ウイルスベクター成分のコドン最適化は多数の他の利点を有する。それらの配列の改変により、プロデューサー細胞／パッケージング細胞におけるウイルス粒子の構築に要求されるウイルス粒子のパッケージング成分をコードするヌクレオチド配列において、それらからＲＮＡ不安定性配列（ＩＮＳ）が除去される。同時に、パッケージング成分のアミノ酸配列コード化配列は保有されており、その結果、該配列によってコードされるウイルス成分は同じままであり、またはパッケージング成分の機能が損なわれない程度に少なくとも十分に類似したままである。また、レンチウイルスベクターにおいて、コドン最適化は輸出のためのＲｅｖ／ＲＲＥの必要性を回避して、最適化配列をＲｅｖ非依存的にする。コドン最適化はベクター系内の種々の構築物間（例えば、ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレームにおける重複領域間）の相同組換えをも低減する。したがって、コドン最適化の全体的な効果はウイルス力価の顕著な増加および安全性の改善である。
１つの実施形態においては、ＩＮＳに関連したコドンのみがコドン最適化される。しかし、遥かに好ましく実用的な実施形態においては、幾つかの例外、例えば、ｇａｇ－ｐｏｌのフレームシフト部位を含む配列を除き（後記を参照されたい）、該配列はそれらの全体においてコドン最適化される。
レンチウイルスベクターのｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子は、ｇａｇ－ｐｏｌタンパク質をコードする２つの重複したリーディングフレームを含む。両方のタンパク質の発現は翻訳中のフレームシフトに依存している。このフレームシフトは翻訳中のリボソーム「スリッページ」の結果として生じる。このスリッページは少なくとも部分的にはリボソーム停止（ｓｔａｌｌｉｎｇ）ＲＮＡ二次構造により引き起こされると考えられている。そのような二次構造はｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子におけるフレームシフト部位の下流に存在する。ＨＩＶの場合、重複領域はｇａｇの開始位置の下流のヌクレオチド１２２２（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）からｇａｇの終結位置（ｎｔ１５０３）まで伸長している。したがって、フレームシフト部位およびそれらの２つのリーディングフレームの重複領域にわたる２８１ｂｐの断片は、好ましくは、コドン最適化されない。この断片の保有は、Ｇａｇ－Ｐｏｌタンパク質の、より効率的な発現を可能にするであろう。ＥＩＡＶの場合には、重複の開始位置はｎｔ１２６２（ここで、ヌクレオチド１はｇａｇ ＡＴＧのＡである）に位置し、該重複の終結位置は１４６１ｂｐに位置するとみなされている。該フレームシフト部位およびｇａｇ－ｐｏｌ重複が維持されることを保証するために、野生型配列はｎｔ１１５６から１４６５まで保持されている。
最適コドン使用頻度からの誘導体化が、例えば、簡便な制限部位を収容するために実施可能であり、保存的アミノ酸変化がＧａｇ－Ｐｏｌタンパク質内に導入されうる。
１つの実施形態においては、コドン最適化は、軽度に発現される哺乳類遺伝子に基づく。第３の塩基、そして時には第２および第３の塩基が改変されうる。
遺伝暗号の縮重性ゆえに、多数のｇａｇ－ｐｏｌ配列が当業者により得られうると理解されるであろう。また、コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列を作製するための出発点として使用されうる多数のレトロウイルス変異体が記載されている。レンチウイルスゲノムは非常に可変性でありうる。例えば、尚も機能的であるＨＩＶ－１の多数の擬似種が存在する。これはＥＩＡＶにも当てはまる。これらの変異体は、形質導入プロセスの特定の部分を増強するために使用されうる。ＨＩＶ－１変異体の例は、ｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ－ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖにおけるＬｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＬＬＣにより運営されているＨＩＶ Ｄａｔａｂａｓｅｓにおいて見出されうる。ＥＩＡＶクローンの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）データベースにおいて見出されうる。
コドン最適化ｇａｇ－ｐｏｌ配列に関する戦略は任意のレトロウイルスに関して用いられうる。これは、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＣＡＥＶ、ＶＭＲ、ＳＩＶ、ＨＩＶ－１およびＨＩＶ－２を含む全てのレンチウイルスに適用されるであろう。また、この方法は、ＨＴＬＶ－１、ＨＴＬＶ－２、ＨＦＶ、ＨＳＲＶおよびヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）、ＭＬＶおよび他のレトロウイルスからの遺伝子の発現を増強するために使用されうるであろう。
コドン最適化はｇａｇ－ｐｏｌ発現をＲｅｖ非依存的にしうる。しかし、レンチウイルスベクターにおける抗ｒｅｖまたはＲＲＥ因子の使用を可能にするためには、ウイルスベクター産生系を完全にＲｅｖ／ＲＲＥ非依存的にすることが必要であろう。したがって、ゲノムが修飾されることも必要である。これは、ベクターゲノム成分を最適化することにより達成される。好都合なことに、これらの修飾はまた、プロデューサー細胞および形質導入細胞の両方において全ての追加的タンパク質が存在しない、より安全な系の産生をもたらす。
ヌクレオチドの番号付け
本発明においては、本発明で使用される修飾ＲＲＥにおける及びｇａｇをコードする修飾ヌクレオチド配列におけるヌクレオチド位置の特定の番号付けが用いられうる。サンプルのＲＲＥのヌクレオチド配列を、配列番号２において定められているＲＲＥとアライメント（整列）させることにより、本開示の配列番号２に示されているヌクレオチド配列のヌクレオチド位置または番号付けに対応する、該サンプルＲＲＥにおけるヌクレオチド位置に、番号を割り当てることが可能である。同様に、ｇａｇをコードするサンプルヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を、配列番号６において定められているｇａｇをコードするヌクレオチド配列とアライメントさせることにより、本開示の配列番号６に示されているヌクレオチド配列のヌクレオチド位置または番号付けに対応する、ｇａｇをコードする該サンプルヌクレオチド配列におけるヌクレオチド位置に、番号を割り当てることが可能である。同様に、サンプルＷＰＲＥのヌクレオチド配列を、配列番号１１において定められているＷＰＲＥとアラインメントさせることにより、本開示の配列番号１１に示されているヌクレオチド配列のヌクレオチド位置または番号付けに対応する、該サンプルＷＰＲＥにおけるヌクレオチド位置に、番号を割り当てることが可能である。
本出願において用いられるヌクレオチドの番号付けを示す別の方法は、配列番号２、配列番号６または配列番号１１に示されているヌクレオチド配列における特定の位置に「対応する」ものによりヌクレオチド位置が特定されるというものである。これは、配列番号２、配列番号６または配列番号１１に示されているヌクレオチド配列を本発明の配列が含まなければならないことを意味すると解釈されるべきではない。ＲＲＥおよびｇａｇをコードするヌクレオチド配列はレンチウイルスベクターによって異なる、と当業者は容易に理解するであろう。配列番号２、配列番号６または配列番号１１に示されているヌクレオチド配列に対する言及は、いずれかの特定のＲＲＥまたはｇａｇをコードするヌクレオチド配列内の特定のヌクレオチド位置の特定を可能にするためにのみ用いられる。そのようなヌクレオチド位置は、配列アライメントプログラムを使用して常套的に特定可能であり、その使用は当技術分野で周知である。
ＲＮＡスプライシング
本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位は不活性化されうる。本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位の３’側の潜在的（ｃｒｙｐｔｉｃ）スプライスドナー部位は不活性化されうる。本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位および主要スプライスドナー部位の３’側の潜在的スプライスドナー部位は不活性化されうる。
ＲＮＡスプライシングは、５つの小さな核内低分子リボ核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）から構成されるスプライセオソームと称される大きなＲＮＡ－タンパク質複合体により触媒される。イントロンとエクソンとの境界はプレｍＲＮＡ内の特定のヌクレオチド配列により示され、これは、スプライシングが生じる位置を示す。そのような境界は「スプライス部位」と称される。「スプライス部位」なる語は、切断されおよび／または別のスプライス部位に連結されるのに適していると、真核細胞のスプライシング機構により認識されうるポリヌクレオチドを意味する。
スプライス部位は、プレｍＲＮＡ転写産物に存在するイントロンの切除を可能にする。典型的には、５’スプライス境界は「スプライスドナー部位」または「５’スプライス部位」と称され、３’スプライス境界は「スプライスアクセプター部位」または「３’スプライス部位」と称される。スプライス部位には、例えば、天然に存在するスプライス部位、操作されたスプライス部位または合成スプライス部位、カノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）またはコンセンサススプライス部位および／または非カノニカルスプライス部位、例えば潜在的スプライス部位が含まれる。
「カノニカルスプライス部位」または「コンセンサススプライス部位」なる語は交換的に用いられることが可能であり、種間で保存されているスプライス部位を意味しうる。
真核生物のＲＮＡスプライシングにおいて使用される５’ドナースプライス部位および３’アクセプタースプライス部位のコンセンサス配列は当技術分野で周知である。これらのコンセンサス配列は、イントロンの各末端におけるほぼ不変のジヌクレオチド、すなわち、イントロンの５’末端におけるＧＴ、およびイントロンの３’末端におけるＡＧを含む。
カノニカルスプライスドナー部位コンセンサス配列は（ＤＮＡの場合には）ＡＧ／ＧＴＲＡＧＴ（ここで、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す）でありうる。これは、本明細書に記載されているより一般的なスプライスドナーコンセンサス配列ＭＡＧＧＵＲＲに適合している。スプライスドナー配列がこのコンセンサスから逸脱しうることは当技術分野で周知であり、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造のような他の制約がその同じ配列に影響を及ぼしているウイルスゲノムにおいて、特にそうである。非カノニカルスプライス部位も当技術分野で周知であるが、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列と比較して稀にしか存在しない。
「主要スプライスドナー部位」は、ウイルスベクターヌクレオチド配列の５’領域に典型的に位置する天然ウイルスＲＮＡパッケージング配列内でコードされ組み込まれている、ウイルスベクターゲノムにおける第１の（優勢な）スプライスドナー部位を意味する。
１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムは活性主要スプライスドナー部位を含有しない。すなわち、スプライシングは該レンチウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位からは生じず、主要スプライスドナー部位からのスプライシング活性は除去されている。
主要スプライスドナー部位はレンチウイルスゲノムの５’パッケージング領域に位置する。
ＨＩＶ－１ウイルスの場合、主要スプライスドナーコンセンサス配列は（ＤＮＡの場合には）ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（ここで、Ａはアデノシンであり、Ｔはチミンであり、Ｇはグアニンであり、Ｃはシトシンであり、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位を示す）である。
本発明の１つの態様においては、主要スプライスドナー部位は以下のコンセンサス配列：
ＴＧ／ＧＴＲＡＧＴ（配列番号１６）
（ここで、Ｒはプリンであり、「／」は切断部位である）を有しうる。
１つの態様においては、Ｒはグアニン（Ｇ）でありうる。
本発明の１つの態様においては、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー領域は以下のコア配列：
／ＧＴＧＡ／ＧＴＡ（配列番号１７）
（ここで、「／」は主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー部位における切断部位である）を有しうる。
本発明の１つの態様においては、ＭＳＤ突然変異ベクターゲノムは主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー「領域」（配列番号１７）に少なくとも２つの突然変異を有することが可能であり、ここで、第１および第２の「ＧＴ」ヌクレオチドは、それぞれ、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナーヌクレオチドの直に３’側に位置する。
本発明の１つの態様においては、主要スプライスドナーコンセンサス配列はＣＴＧＧＴ（配列番号１８）である。主要スプライスドナー部位は配列ＣＴＧＧＴを含有しうる。
１つの態様においては、スプライス部位の不活性化の前のレンチウイルスベクターゲノムは、配列番号１６、１７、１８および／または１９のいずれかに記載されている配列を含む。
１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムは不活性化主要スプライスドナー部位を含み、該部位は、不活性化されていない場合には、配列番号１６のヌクレオチド２および３に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有するものである。
本明細書に記載されている本発明においては、レンチウイルスベクターゲノムは不活性潜在的スプライスドナー部位をも含有する。１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムは、主要スプライスドナー部位に隣接する（該部位の３’側の）活性潜在的スプライスドナー部位を含有しない。すなわち、該隣接潜在的スプライスドナー部位からはスプライシングが生じず、潜在的スプライスドナー部位からのスプライシングは除去されている。
「潜在的スプライスドナー部位」なる語は、隣接配列コンテキスト（例えば、近傍の「好ましい」スプライスドナーの存在）ゆえに通常はスプライスドナー部位として機能しない又はスプライスドナー部位としてそれほど効率的に利用されないが、隣接配列の突然変異（例えば、近傍の「好ましい」スプライスドナーの突然変異）によってより効率的に機能するスプライスドナー部位になるように活性化されうる核酸配列を意味する。
１つの態様においては、潜在的スプライスドナー部位は主要スプライスドナーの３’側の最初の潜在的スプライスドナー部位である。
１つの態様においては、潜在的スプライスドナー部位は主要スプライスドナー部位の３’側の主要スプライスドナー部位の６ヌクレオチド以内に存在する。好ましくは、潜在的スプライスドナー部位は主要スプライスドナー切断部位の４または５ヌクレオチド以内、好ましくは４ヌクレオチド以内に存在する。
本発明の１つの態様においては、潜在的スプライスドナー部位はコンセンサス配列ＴＧＡＧＴ（配列番号１９）を有する。
１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムは不活性化潜在的スプライスドナー部位を含み、該部位は、不活性化されていない場合には、配列番号１６のヌクレオチド６および７に対応するヌクレオチドの間に切断部位を有するものである。
本発明の１つの態様においては、主要スプライスドナー部位および／または隣接潜在的スプライスドナー部位は「ＧＴ」モチーフを含む。本発明の１つの態様においては、主要スプライスドナー部位と隣接潜在的スプライスドナー部位との両方が、突然変異した「ＧＴ」モチーフを含む。突然変異したＧＴモチーフは、主要スプライスドナー部位と隣接潜在的スプライスドナー部位との両方からのスプライス活性を不活性化しうる。
主要スプライスドナー部位および隣接潜在的スプライスドナー部位を不活性化するために、種々の異なるタイプの突然変異がレンチウイルスベクターゲノム内に導入されうる。
１つの態様においては、突然変異は、スプライス領域におけるスプライシング活性を除去または抑制する機能的突然変異である。本明細書に記載されているレンチウイルスベクターゲノムは配列番号１６、１７、１８および／または１９におけるヌクレオチドのいずれかにおいて突然変異または欠失を含有しうる。適切な突然変異は当業者に公知であり、本明細書に記載されている。
例えば、点突然変異が核酸配列内に導入されうる。本明細書中で用いる「点突然変異」なる語は単一ヌクレオチドに対する任意の変化を意味する。点突然変異には、例えば欠失、トランジションおよびトランスバージョンが含まれ、これらは、タンパク質コード配列内に存在する場合、ナンセンス突然変異、ミスセンス突然変異またはサイレント突然変異として分類されうる。「ナンセンス」突然変異は終止コドンを生成する。「ミスセンス」突然変異は、異なるアミノ酸をコードするコドンを生成する。「サイレント」突然変異は、タンパク質の機能を改変しない同じアミノ酸または異なるアミノ酸のいずれかをコードするコドンを生成する。潜在的スプライスドナー部位を含むレンチウイルスベクターゲノム内に１以上の点突然変異が導入されうる。例えば、主要スプライス部位および／または潜在的スプライス部位を含むレンチウイルスベクターゲノムは、２以上の点突然変異をそれに導入することにより突然変異に付されうる。
スプライスドナー領域からのスプライシングの減弱を達成するために、主要スプライスドナーおよび潜在的スプライスドナー部位を含む核酸配列内の幾つかの位置に少なくとも２つの点突然変異が導入されうる。１つの態様においては、突然変異はスプライスドナー切断部位における４ヌクレオチド内に存在することが可能であり、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列において、これはＡ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４であり、ここで、「／」は切断部位である。スプライスドナー切断部位がこのコンセンサスから逸脱しうることは当技術分野で周知であり、例えばｖＲＮＡパッケージング領域内の二次構造のような他の制約がその同じ配列に影響を及ぼしているウイルスゲノムにおいて、特にそうである。Ｇ３Ｔ４ジヌクレオチドは一般に、カノニカルスプライスドナーコンセンサス配列内で最も可変性の低い配列であることが周知であり、Ｇ３および／またはＴ４への突然変異が、最大の減弱効果を達成する可能性が最も高いであろう。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位の場合、これはＴ１Ｇ２／Ｇ３Ｔ４（ここで、「／」は切断部位である）でありうる。例えば、ＨＩＶ－１ウイルスベクターゲノムの潜在的スプライスドナー部位の場合、これはＧ１Ａ２／Ｇ３Ｔ４（ここで、「／」は切断部位である）でありうる。また、スプライスドナー部位の隣に点突然変異が導入されうる。例えば、スプライスドナー部位の上流または下流に点突然変異が導入されうる。主要スプライスドナー部位および／または潜在的スプライスドナー部位を含むレンチウイルスベクターゲノムが、複数の点突然変異をそれに導入することにより突然変異に付される実施形態においては、点突然変異は潜在的スプライスドナー部位の上流および／または下流に導入されうる。
１つの実施形態においては、主要スプライスドナー部位および／または潜在的スプライスドナー部位が欠失している。
スプライス部位突然変異体の構築
本発明のスプライス部位突然変異体は、種々の技術を用いて構築されうる。例えば、突然変異は、天然配列の断片への連結を可能にする制限部位に隣接した突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入されうる。連結後、得られた再構築された配列は、所望のヌクレオチド挿入、置換または欠失を有する誘導体を含む。
ＤＮＡ配列の改変を可能にする他の公知技術には、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ ａｓｓｅｍｂｌｙ）、ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅ）クローニング、インフュージョン（Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ）のような組換えアプローチが含まれる。
あるいは、必要な置換、欠失または挿入による改変配列を得るために、オリゴヌクレオチドに対する部位特異的（またはセグメント特異的）突然変異誘発法が用いられうる。スプライス部位突然変異体の欠失またはトランケート化誘導体は、所望の欠失に隣接する簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することによっても構築されうる。
制限処理の後、オーバーハングが埋められ、ＤＮＡが再連結されうる。
前記の改変を施す例示的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に開示されている。
スプライス部位突然変異体はまた、ＰＣＲ突然変異誘発、化学的突然変異誘発、強制的なヌクレオチドの誤取り込み（例えば、ＬｉａｏおよびＷｉｓｅ，１９９０）による化学的突然変異誘発（ＤｒｉｎｋｗａｔｅｒおよびＫｌｉｎｅｄｉｎｓｔ，１９８６）の技術を用いることにより、またはランダム突然変異誘発オリゴヌクレオチドの使用（Ｈｏｒｗｉｔｚら，１９８９）により構築されうる。
ベクター力価を改善するための修飾Ｕ１との組合せ
内因性配列（スプライスドナー部位）をもはや標的化せずに今やｖＲＮＡ分子内の配列を標的化するように修飾されたＵ１ ｓｎＲＮＡに基づく非コードＲＮＡを共発現させることにより、レンチウイルスベクターの産出（ｏｕｔｐｕｔ）力価を増加させることが可能である。産生中にベクターゲノムＲＮＡの５’パッケージング領域に結合するように仕向けられた修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡを共発現させることにより、ＭＳＤ突然変異第３世代（すなわち、Ｕ３／ｔａｔ非依存的）ＬＶを高力価で産生させることが可能である。
力価の低下につながる主要スプライスドナー領域内の広範囲の突然変異型（点突然変異、領域欠失および配列置換）を含有するベクターゲノムが修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡと組合せて使用されうる。このアプローチは、ベクター産生中に修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをその他のベクター成分と共発現させることを含みうる。修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、コンセンサススプライスドナー部位への結合が、ベクターゲノムｖＲＮＡ内の標的配列に相補的な異種配列でそれを置換することにより排除されるように設計される。
本明細書に記載されている本発明の１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムは修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡと組合せて使用されうる。
スプライシングに必要な、プレｍＲＮＡ内のエレメントには、５’スプライスドナーシグナル、分岐点を包囲する配列および３’スプライスアクセプターシグナルが含まれる。これらの３つのエレメントと相互作用するのはスプライセオソームであり、これは、Ｕ１ ｓｎＲＮＡを含む５つの核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）と関連核タンパク質（ｓｎＲＮＰ）とにより形成される。Ｕ１ ｓｎＲＮＡはポリメラーゼＩＩプロモーターにより発現され、ほとんどの真核細胞に存在する（Ｌｕｎｄら，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：２０１３－２０２１）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、その５’末端に、エクソン－イントロン接合部における５’スプライスドナー部位に対して広く相補的な短い配列を含有する。Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、５’スプライスドナー部位との塩基対形成により、スプライス部位選択およびスプライセオソーム構築に関与する。
ヒトＵ１ ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）は１６４ ｎｔの長さを有し、４つのステムループからなる明らかな構造を有する（図８を参照されたい）。内因性非コードＲＮＡであるＵ１ ｓｎＲＮＡは、イントロンスプライシングの初期段階で、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を介してコンセンサス５’スプライスドナー部位（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’；ここで、ＭはＡまたはＣであり、ＲはＡまたはＧである）に結合する。本発明による使用のための、本明細書に定義されている修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナー標的化／アニーリング配列の部位において、ベクターゲノムｖＲＮＡ分子内の標的配列に相補的な異種配列を導入するように修飾されている（図８を参照されたい）。
本明細書中で用いる「修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再指向化Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再標的化Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」、「再利用Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」および「突然変異Ｕ１ ｓｎＲＮＡ」なる語は、Ｕ１ ｓｎＲＮＡが、標的遺伝子のスプライシングプロセスを開始させるためにそれが使用するコンセンサス５’スプライスドナー部位配列（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように修飾されているＵ１ ｓｎＲＮＡを意味する。したがって、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、スプライスドナー部位配列（例えば、５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’）にもはや相補的でないように修飾されているＵ１ ｓｎＲＮＡである。その代わりに、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ｖＲＮＡのスプライシングに無関係な配列である、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内のユニークＲＮＡ配列（標的部位）を有するヌクレオチド配列を標的化するように又は該ヌクレオチド配列に相補的となるように設計されている。
本明細書中で用いる「天然スプライスドナーアニーリング配列」および「天然スプライスドナー標的化配列」なる語は、イントロンのコンセンサス５’スプライスドナー部位に広く相補的である内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における短い配列を意味する。天然スプライスドナーアニーリング配列は５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’でありうる。
本明細書中で用いる「コンセンサス５’スプライスドナー部位」なる語は、例えば配列５’－ＭＡＧＧＵＲＲ－３’を有する、スプライス部位選択において使用されるイントロンの５’末端におけるコンセンサスＲＮＡ配列を意味する。
本明細書中で用いる「ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列」、「標的配列」および「標的部位」なる語は、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡに結合／アニーリングする標的部位として予め選択された、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域内の特定のＲＮＡ配列を有する部位を意味する。
本明細書中で用いる「ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」および「ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域」なる語は５’Ｕ５ドメインの開始部からｇａｇ遺伝子由来配列の末端までのＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノムの５’末端における領域を意味する。したがって、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域は５’Ｕ５ドメイン、ＰＢＳエレメント、ステムループ（ＳＬ）１エレメント、ＳＬ２エレメント、ＳＬ３ψエレメント、ＳＬ４エレメントおよびｇａｇ遺伝子由来配列を含む。レンチウイルスベクター産生中に完全ｇａｇ遺伝子がトランスで提供される場合、「レンチウイルスベクターゲノム分子のパッケージング領域」なる語は、５’Ｕ５ドメインの開始部からＳＬ３ ψエレメントにおける「コア」パッケージングシグナルまでのＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム分子の５’末端における領域、およびＡＴＧコドン（ＳＬ４内に存在する）から、ベクターゲノム上に存在する残りのｇａｇヌクレオチド配列の末端までの天然ｇａｇヌクレオチド配列を意味しうる、と当業者に理解される。
本明細書中で用いる「ｇａｇ遺伝子由来配列」なる語は、該ベクターゲノム内に存在（例えば、残存）しうる、ＡＴＧコドンからヌクレオチド６８８まで（Ｋｈａｒｙｔｏｎｃｈｙｋ，Ｓ．ら，２０１８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４３０：２０６６－７９）に由来するｇａｇ遺伝子の任意の天然配列を意味する。
本明細書中で用いる「天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入する」および「Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における天然スプライスドナーアニーリング配列内に異種配列を導入する」なる語は、天然スプライスドナーアニーリング配列を、全体的または部分的に、該異種配列で置換すること、あるいは、該異種配列と同じ配列を有するように、天然スプライスドナーアニーリング配列を修飾することを含む。
本明細書中で用いる「レンチウイルスベクター力価を増強する」なる語は、「レンチウイルスベクター力価を増加させる」および「レンチウイルスベクター力価を改善する」を含む。
したがって、１つの態様においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に結合するように修飾されている。
幾つかの実施形態においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を導入するように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において修飾されている。
幾つかの実施形態においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列を天然スプライスドナーアニーリング配列内に導入するように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において修飾されている。
修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、天然スプライスドナーアニーリング配列を含む配列を、該ヌクレオチド配列に相補的な異種配列で置換するように、内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡと比較して５’末端において修飾されうる。
修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡ変異体でありうる。本発明に従い修飾されるＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体は、天然に存在するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体、Ｕ１－７０Ｋタンパク質結合を除去するステムループＩ領域内の突然変異を含有するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体、またはＵ１Ａタンパク質の結合を除去するステムループＩＩ領域内の突然変異を含有するＵ１ ｓｎＲＮＡ変異体でありうる。
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されている修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載されているＵ１＿２５６配列の主要Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）に対して少なくとも７０％の同一性（適切には、少なくとも７５％、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。Ｕ１＿２５６配列（配列番号１５）の主要Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）は以下のとおりである。
Figure 2023516493000018
幾つかの実施形態においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、本明細書に記載されているＵ１＿２５６配列の主要Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）を含む。Ｕ１＿２５６配列（配列番号２０）の主要Ｕ１ ｓｎＲＮＡ配列［クローバーリーフ］（ｎｔ ４１０～５６２）は以下のとおりである。
Figure 2023516493000019
幾つかの実施形態においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、表１に示されている標的アニーリング配列を含む。
Figure 2023516493000020
幾つかの実施形態においては、天然スプライスドナーアニーリング配列は、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的である異種配列により、全体的または部分的に置換されうる。適切には、天然スプライスドナーアニーリング配列の１～１１個（適切には、２～１１個、３～１１個、５～１１個、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個）の核酸が、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列により置換される。好ましい実施形態においては、天然スプライスドナーアニーリング配列の全体が、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列により置換される。すなわち、天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）が、本明細書に記載されているとおりに、異種配列により、完全に置換される。
幾つかの実施形態においては、ＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム配列のパッケージング領域内のヌクレオチド配列に相補的な異種配列は、該ヌクレオチド配列に相補的な少なくとも７個、少なくとも９個または少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。適切には、本発明における使用のための異種配列は７～２５（適切には、７～２０、７～１５、９～１５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５）個のヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されている修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは、（ａ）修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡに結合するＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノムのパッケージング領域における標的部位（事前選択ヌクレオチド部位）を選択すること、および（ｂ）Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内に、工程（ａ）で選択された事前選択ヌクレオチド部位に相補的な異種配列を導入することにより、設計されうる。
内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば、５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）内に又はその代わりに、標的部位に相補的な異種配列を、分子生物学における通常の技術を用いて導入することは、当業者の能力の範囲内である。内因性Ｕ１ ｓｎＲＮＡの５’末端における天然スプライスドナーアニーリング配列（例えば５’－ＡＣＵＵＡＣＣＵＧ－３’）を、標的部位に相補的な異種配列と同じ配列を有するように、分子生物学における通常の技術を用いて修飾することは、当業者の能力の範囲内である。例えば、適切な方法は、特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発、およびそれに続く、本明細書に記載されている修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡを与える突然変異に関する選択を含む。
本明細書に記載されている修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは当技術分野で一般に公知の方法に従い製造されうる。例えば、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡは化学合成または組換えＤＮＡ／ＲＮＡ技術により製造されうる。
１つの態様においては、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド配列上、例えば異なるプラスミド上に存在しうる。
ＴＲＩＰ系
ＷＯ２０１５／０９２４４０（これを参照により本明細書に組み込みいれる）は、ウイルスベクター産生中にＮＯＩの翻訳を抑制する（導入遺伝子発現を抑制する）ことにより、ＮＯＩによりコードされるタンパク質の発現を抑制または予防するための、真核細胞培養における異種翻訳制御系の使用を開示している。この系はベクター生産細胞内トランスジーン抑制系（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｉｎ ｖｅｃｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｓｙｓｔｅｍ）またはＴＲＩＰ系と称される。１つの形態においては、ＴＲＩＰ系は細菌ｔｒｐオペロン調節タンパク質、トリプトファンＲＮＡ結合減弱タンパク質（ＴＲＡＰ）およびＴＲＡＰ結合部位／配列（ｔｂｓ）を利用して、導入遺伝子抑制をもたらす。この系の使用はパッケージング可能なベクターゲノム分子の産生もベクタービリオンの活性も妨げず、標的細胞におけるＮＯＩの長期発現を妨げない。
１つの態様においては、レンチウイルスベクターゲノムはｔｂｓを含む。
本発明の幾つかの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドはｔｂｓに機能的に連結されている。幾つかの実施形態においては、関心のあるヌクレオチドは、ＴＲＡＰを欠く標的細胞で翻訳される。
ｔｂｓは、関心のあるヌクレオチドの翻訳がウイルスベクター生産細胞において抑制または予防されるように、ＴＲＡＰと相互作用しうる。
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）
トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）は、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において詳細に特徴づけられている細菌タンパク質である。それは、転写減衰または翻訳制御メカニズムのいずれかに関与することにより、ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンから指令されるトリプトファン生合成を調節する（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｂ．，ＡｎｔｓｏｎおよびＹａｎｏｆｓｋｙ（２００５）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９：４７－６８に概説されている）。
ＴＲＡＰは、その天然コンテキストにおいて、以下の３つの異なるメカニズムによりトリプトファンの生合成および輸送を調節する。
１．ｔｒｐＥＤＣＦＢＡオペロンの転写の減衰（Ｓｈｉｍｏｔｓｕ Ｈ，Ｋ．Ｍ．，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ，Ｈｅｎｎｅｒ ＤＪ．（１９８６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６６：４６１－４７１）。
２．ｔｒｐＥおよびｔｒｐＤシャイン－ダルガルノ遮断性ヘアピンの形成の促進（Ｙａｋｈｎｉｎ Ｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｙａｋｈｎｉｎ ＡＶ，Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ．（２００１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １８３（２０）：５９１８－５９２６）。
３．ｔｒｐＧおよびｙｈａＧリボソーム結合部位へのリボソームの接近の遮断（Ｙａｎｇ Ｍ，ｄ．Ｓ．Ａ．，ｖａｎ Ｌｏｏｎ ＡＰＧＭ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４２７２－４２７８）。
バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）においては、ＴＲＡＰは単一遺伝子（ｍｔｒＢ）によりコードされ、機能的タンパク質は、トロイド環として配置された１１個の同一サブユニットから構成される（Ａｎｔｓｏｎ ＡＡ，Ｄ．Ｅ．，Ｄｏｄｓｏｎ Ｇ，Ｇｒｅａｖｅｓ ＲＢ，Ｃｈｅｎ Ｘ，Ｇｏｌｌｎｉｃｋ Ｐ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４０１（６７５０）：２３５－２４２）。それは、隣接サブユニット間のポケット内の１１個までのトリプトファン分子に結合することにより、ＲＮＡと相互作用するように活性化される。標的ＲＮＡはこの四元（ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ）環構造の外側を包囲する（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｓ．Ｊ．，Ｓｈｉｒｅ ＳＪ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ Ｃ．（１９９４）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：１６５９７－１６６０４）。
ＴＲＡＰオープンリーディングフレームは哺乳類（例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））細胞における発現に関してコドン最適化されうる。なぜなら、細菌遺伝子配列は哺乳類細胞における発現に非最適である可能性があるからである。該配列は、潜在的な不安定配列およびスプライシング部位を除去することによっても最適化されうる。ＴＲＡＰタンパク質上のＣ末端で発現されるＨＩＳ－タグの使用は翻訳抑制に関する利点をもたらすようであり、所望により使用されうる。このＣ末端ＨＩＳ－タグは真核細胞におけるＴＲＡＰの溶解性または安定性を改善しうるが、改善される機能的利点は排除され得ない。それでも、ＨＩＳタグ付きＴＲＡＰおよびタグ無しＴＲＡＰの両方が導入遺伝子発現の頑強な抑制を可能にした。ＴＲＡＰ転写単位内の或るシス作用性配列も最適化されうる。例えば、ＥＦ１ａプロモーター駆動性構築物は、一過性トランスフェクションの状況において、低い投入量のＴＲＡＰプラスミドで、ＣＭＶプロモーター駆動性構築物より良好な抑制を可能にする。
１つの実施形態においては、ＴＲＡＰは細菌に由来する。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはバシラス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ）、例えばバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する。
１つの実施形態においては、ＴＲＡＰは、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、デスルホトマクルム・ヒドロサーマレ（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｅ）、ビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ビー・ステアロサーモフィラス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓ７２Ｎ、ビー・ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）およびカルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）からなる群に由来する。
１つの実施形態においては、ＴＲＡＰはトリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質遺伝子ファミリーｍｔｒＢ（ＴｒｐＢＰスーパーファミリー、例えば、ＮＣＢＩ保存ドメインデータベース＃ｃｌ０３４３７）によりコードされる。
好ましい実施形態においては、ＴＲＡＰは６個のヒスチジンアミノ酸（ＨＩＳ×６タグ）でＣ末端においてタグ化されている。
ＴＲＡＰ結合部位
「結合部位」なる語は、あるタンパク質と相互作用しうる核酸配列として理解されるべきである。
ＴＲＡＰに結合しうるコンセンサスＴＲＡＰ結合部位配列は、複数回（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２回以上）反復する［ＫＡＧＮＮ］であり、そのような配列は天然ｔｒｐオペロンにおいて見出される。天然の状況においては、時にはＡＡＧＮＮが許容され、時には追加的な「スペーシング」Ｎヌクレオチドが機能的配列を与える。インビトロ実験は、少なくとも６個またはそれ以上のコンセンサス反復がＴＲＡＰ－ＲＮＡ結合に要求されることを示している（Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。したがって、好ましくは、１つの実施形態においては、ｔｂｓ内に６個以上の連続的［ＫＡＧＮ ＞２］配列が存在し、ここで、ＫはＤＮＡにおけるＴまたはＧおよびＲＮＡにおけるＵまたはＧでありうる。
ＲＮＡ結合タンパク質としてのＴＲＡＰの場合、好ましくは、ＴＲＩＰ系は、少なくとも８個のＫＡＧＮＮ反復を含有するｔｂｓ配列で最大限度に働く。尤も、頑強な導入遺伝子抑制を尚も得るために７個の反復が使用可能であり、ベクター力価をレスキューしうるレベルまでの導入遺伝子の十分な抑制を可能にするために６個の反復が使用可能である。ＴＲＡＰ媒介性抑制を維持するためにＫＡＧＮＮコンセンサス配列は改変されうるが、好ましくは、選択された厳密な配列は、非抑制状態の高レベルの翻訳を確保するために最適化されうる。例えば、ｔｂｓ配列は、スプライシング部位、不安定な配列またはステム－ループ［これは、ＴＲＡＰの非存在下（すなわち、標的細胞内）でｍＲＮＡの翻訳効率を阻害しうる］を除去することにより最適化されうる。与えられたｔｂｓのＫＡＧＮＮ反復の配置に関しては、ＫＡＧ反復間のＮ「スペーシング」ヌクレオチドの数は好ましくは２である。しかし、少なくとも２個のＫＡＧ反復間に２個を超えるＮスペーサーを含有するｔｂｓも許容される（インビトロ結合研究による判定によれば、３個のＮを含有する反復の５０％もが機能的ｔｂｓを与えうる；Ｂａｂｉｔｚｋｅ Ｐ，Ｙ．Ｊ．，Ｃａｍｐａｎｅｌｌｉ Ｄ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１７）：５１５９－５１６３）。実際、１１×ＫＡＧＮＮ ｔｂｓ配列がＫＡＧＮＮＮ反復での３個までの置換を許容し、ＴＲＡＰ結合と協同して幾らかの潜在的に有用な翻訳遮断活性を尚も保有しうることが示されている。
本発明の１つの実施形態においては、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部は配列ＫＡＧＮ ＞２（例えば、ＫＡＧＮ２－３）を含む。したがって、疑義を回避するために示すと、このｔｂｓまたはその一部は、例えば、以下の反復配列のいずれかを含む：ＵＡＧＮＮ、ＧＡＧＮＮ、ＴＡＧＮＮ、ＵＡＧＮＮＮ、ＧＡＧＮＮＮまたはＴＡＧＮＮＮ。
「Ｎ」は、配列内のその位置におけるいずれかのヌクレオチドを特定するものとして理解されるべきである。例えば、これはＧ、Ａ、Ｔ、ＣまたはＵでありうる。そのようなヌクレオチドの数は好ましくは２であるが、１１×反復ｔｂｓまたはその一部のＫＡＧ反復の、３個まで、例えば１個、２個または３個が、３個のスペーシングヌクレオチドにより分離されていることが可能であり、翻訳抑制を招く幾らかのＴＲＡＰ結合活性を尚も保有しうる。好ましくは、翻訳抑制を招く最大ＴＲＡＰ結合活性を保有させるために、１１×反復ｔｂｓまたはその一部において、１個以下のＮ３スペーサーが使用される。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部はＫＡＧＮ ＞２の複数反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の複数反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は配列ＫＡＧＮ２の複数反復を含む。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ ＞２の、少なくとも６個の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の、少なくとも６個の反復）を含む。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ２の、少なくとも６個の反復を含む。例えば、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ２の、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれ以上の反復を含みうる。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ ＞２の、少なくとも８個の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の、少なくとも８個の反復）を含む。
好ましくは、ｔｂｓまたはその一部に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は１以下である。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ ＞２の、１１個の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の、１１個の反復）を含む。好ましくは、このｔｂｓまたはその一部に存在するＫＡＧＮＮＮ反復の数は３以下である。
もう１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ ＞２の、１２個の反復（例えば、ＫＡＧＮ２－３の、１２個の反復）を含む。
好ましい実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部は、ＫＡＧＮ２の、８～１１個の反復（例えば、ＫＡＧＮ２の、８、９、１０または１１個の反復）を含む。
「ＫＡＧＮ ＞２の反復」は、一般的なＫＡＧＮ ＞２（例えばＫＡＧＮ２－３）モチーフが反復していることであると理解されるべきである。このモチーフの基準を満足する種々のＫＡＧＮ ＞２配列が、ｔｂｓまたはその一部を構成するために加わりうる。生じるｔｂｓまたはその一部は、このモチーフの要件を満足するただ１個の配列の反復に限定されるとは意図されないが、この可能性も該定義に含まれる。
１個のＫＡＧＮＮＮ反復と７個のＫＡＧＮＮ反復とを含有する８反復のｔｂｓまたはその一部はＴＲＡＰ媒介性抑制活性を保有する。１以上のＫＡＧＮＮＮ反復を含有する８個未満の反復のｔｂｓ配列またはその一部（例えば、７または６反復のｔｂｓ配列またはその一部）はより低いＴＲＡＰ媒介性抑制活性を有しうる。したがって、８個未満の反復が存在する場合、ｔｂｓまたはその一部はＫＡＧＮＮ反復のみを含むことが好ましい。
ＫＡＧＮＮ反復コンセンサスにおける使用のための好ましいヌクレオチドは以下のとおりである：
・ＮＮスペーサー位置の少なくとも１つにおけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の最初の位置におけるピリミジン；
・ＮＮスペーサー位置の両方におけるピリミジン；
・Ｒ位におけるＧ。
ＮＮスペーサー位置がＡＡである場合、Ｋ位にＧが使用されることも好ましい（すなわち、コンセンサス配列における反復としてＴＡＧＡＡは使用されないことが好ましい）。
「相互作用しうる」は、細胞、例えばウイルスベクター産生真核細胞において遭遇する条件下、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓまたはその一部）がタンパク質、例えばＴＲＡＰに結合しうることとして理解されるべきである。ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＴＲＡＰとのそのような相互作用は、核酸結合部位（例えば、ｔｂｓまたはその一部）が機能的に連結されているＮＯＩの翻訳の抑制または予防をもたらす。
「機能的に連結」は、記載されている成分が、それらの意図される様態でそれらが機能することを可能にする関係で存在することとして理解されるべきである。したがって、ＮＯＩに機能的に連結されている本発明における使用のためのｔｂｓまたはその一部は、ＴＲＡＰがｔｂｓまたはその一部に結合した場合にＮＯＩの翻訳が修飾されるように位置する。
与えられたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のＮＯＩ翻訳開始コドンの上流のＴＲＡＰと相互作用しうるｔｂｓまたはその一部の配置は、そのＯＲＦに由来するｍＲＮＡの特異的翻訳抑制を可能にする。ｔｂｓまたはその一部と翻訳開始コドンとを分離しているヌクレオチドの数は、抑制の度合に影響を及ぼすことなく、様々となることが可能であり、例えば０～３４ヌクレオチドでありうる。もう１つの例として、ＴＲＡＰ結合部位またはその一部と翻訳開始コドンとを分離するために０～１３ヌクレオチドが使用されうる。
ｔｂｓまたはその一部は、マルチシストロンｍＲＮＡにおけるＮＯＩの翻訳を抑制するために、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の下流に配置されうる。１つの実施形態においては、レンチウイルスベクターゲノムはＩＲＥＳとｔｂｓまたはその一部との間にスペーサー配列を含む。ＩＲＥＳは、本明細書において「配列内リボソーム進入部位」なる小見出しの箇所に記載されているＩＲＥＳでありうる。スペーサー配列は０～３０ヌクレオチド長、好ましくは１５ヌクレオチド長でありうる。
１つの実施形態においては、ＩＲＥＳとｔｂｓまたはその部分との間のスペーサー配列はｔｂｓまたはその部分の３’末端およびＮＯＩの下流開始コドンからの３または９ヌクレオチドである。
１つの実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部はＩＩ型制限酵素部位を欠いている。好ましい実施形態においては、ｔｂｓまたはその一部はＳａｐＩ制限酵素部位を欠いている。
本発明の実施は、特に示されていない限り、当業者の能力の範囲内の化学、分子生物学、微生物学および免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は文献に説明されている。例えば、以下のものを参照されたい：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋｓ １－３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら．（１９９５および定期的な補遺）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３および１６，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂ．Ｒｏｅ，Ｊ．ＣｒａｂｔｒｅｅおよびＡ．Ｋａｈｎ（１９９６）ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ（１９９０）Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ。これらの一般的テキストのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする。
本開示は、本明細書に開示されている例示的な方法および材料により限定されるものではなく、本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料が本開示の実施形態の実施または試験に使用されうる。数値範囲は、範囲を定める数値を含む。特に示されていない限り、全ての核酸配列は、それぞれ、左から右に、５’から３’への方向で示されており、アミノ酸配列は、それぞれ、左から右に、アミノからカルボキシへの方向で示されている。
値の範囲が示されている場合、文脈に明らかに矛盾しない限り、その範囲の上限と下限との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値も具体的に開示されていると理解される。示されている範囲内の任意の示されている値または介在値と、その示されている範囲内の任意の他の示されている値または介在値との間のそれぞれのより小さな範囲は本開示に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、該範囲に含まれること又は該範囲から除外されることが可能であり、示されている範囲内に任意の具体的に除外される限界がある場合には、より小さな範囲内に一方もしくは両方の限界が含まれる又は両方の限界が含まれない場合の各範囲もこの開示に含まれる。示されている範囲が該限界の一方または両方を含む場合には、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる単数形は、文脈に明らかに矛盾しない限り、複数対象物を含むことに注意する必要がある。
本明細書中で用いる「含む」、「含み」および「含まれる」なる語は、「包含する」、「包含し」または「含有する」、「含有し」と同義であり、包括的またはオープンエンド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）であり、追加的な非列挙メンバー、要素または方法工程を除外しない。「含む」、「含み」および「含まれる」なる語は「からなる」なる語も含む。
本明細書に記載されている刊行物は、専ら、本出願の出願日の前のそれらの開示のために提供されているに過ぎない。本明細書におけるいかなるものも、そのような刊行物が、本明細書に添付されている特許請求の範囲の先行技術を構成することを認めるものと解釈されるべきではない。
次に、実施例により本発明を更に詳細に説明することとする。これらの実施例は、本発明を実施する際に当業者を助けるのに役立つことを意図しており、本発明の範囲を限定することを何ら意図してない。
実施例
方法
接着細胞培養、トランスフェクションおよびレンチウイルスベクター製造
ＨＥＫ２９３Ｔ．１－６５ｓ懸濁細胞を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＋ ０．１％ ＣＬＣ（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、５％ ＣＯ２で、振とうインキュベーター（１９０ＲＰＭに設定された２５ｍｍの軌道）内で増殖させた。ベクター製造のために、懸濁液中の１－６５ｓ細胞を、遠心分離によりペレット化することにより接着様態に移し、１０％ 熱不活性化（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）および１％ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｓｉｇｍａ）で補足された適切な体積のダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁させた。接着様態でのＨＩＶ－１ベクターの標準的なスケールの製造は以下の条件下の１０ｃｍディッシュにおけるものであった（他の形態での実施の場合には、全ての条件は面積によってスケーリングされた）。完全培地内に再懸濁した１－６５ｓ細胞を１０ｍＬの完全培地内で３．５×１０５細胞／ｍｌで播種し、２４時間後、１０ｃｍプレート当たりに以下の質量比のプラスミドを使用して、細胞をトランスフェクトした：４．５μｇ ゲノム、１．４μｇ Ｇａｇ－Ｐｏｌ、１．１μｇ Ｒｅｖ、０．７μｇ ＶＳＶ－Ｇおよび０．０１～２μｇの修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡプラスミド。
トランスフェクションは、製造業者のプロトコル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ中でＤＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（リポフェクタミン）２０００ＣＤと混合することにより行った。約１８時間後に酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）を１０ｍＭの最終濃度まで約５～６時間にわたって加えた後、トランスフェクション培地を１０ｍＬの新鮮無血清培地で置換した。典型的には、２０～２４時間後にベクター上清を回収し、ついで濾過（０．２２μｍ）し、－２０／－８０℃で凍結した。
レンチウイルスベクター力価測定アッセイ
ＧＦＰマーカー含有カセットによるレンチウイルスベクターの力価測定のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート内で１．２×１０４細胞／ウェルで播種した。ＧＦＰをコードするウイルスベクターを使用して、８ｍｇ／ｍｌ ポリブレンを含有する完全培地内で細胞を形質導入した。形質導入細胞を５％ ＣＯ２中、３７℃で２日間インキュベートした。ついで、Ａｔｔｕｎｅ－ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してフローサイトメトリー用に培養物を調製した。ＧＦＰ発現率を測定し、形質導入時の１．８×１０４細胞の予想細胞数（典型的な増殖速度に基づく）、ベクターサンプルの希釈係数、陽性ＧＦＰ集団の割合および形質導入時の総体積を用いて、ベクター力価を計算した。
実施例１：サブＯＲＦが除去された機能的Ｒｅｖ応答エレメントの開発
標準的なレンチウイルスベクター内に保持された（そして「再配置」された）中心的なウイルス性シス作用エレメントはＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）である。このＲＮＡエレメントはレンチウイルスエンベロープＯＲＦの一部と完全に重複しており、ｒｅｖタンパク質が結合する複雑なＲＮＡ構造を形成する。そうすることで、ｒｅｖタンパク質はベクターゲノムＲＮＡ分子を核から「引き出し」、それをパッケージングに利用可能にしうる。したがって、これはベクターゲノムＲＮＡの重要な特徴であり、ベクター力価はその非存在下で実質的に低下する。しかし、ＲＲＥはエンベロープＯＲＦの一部でもあるため、その中のＡＴＧコドンの存在は、上流細胞プロモーターによる指令のとおりに細胞（例えば、患者細胞）内でベクターバックボーン配列が転写されれば、ＲＲＥコード化エンベロープサブＯＲＦ（および他のリーディングフレームにおける他のサブＯＲＦ）が翻訳される潜在的なリスクが存在することを意味する。
図１は、ＲＲＥをその典型的な位置に含有する典型的な標準的な第３世代レンチウイルスベクター、ならびに全ての潜在的ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびそれらの関連サブＯＲＦ（本明細書では内部ＯＲＦとも称される）を示す。単一ヌクレオチド挿入により６個または８個全てのＡＴＧコドンが突然変異している変異体ＲＲＥを作製して、７個を超える残基の全サブＯＲＦを破壊した。また、これらをｃｐｐｔ配列で試験し、該配列においては、Ｐｏｌ遺伝子に由来する上流ＡＴＧコドンも突然変異しており、関連サブＯＲＦが破壊されている。変異体ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］を、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター内にクローニングし、無血清懸濁ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生させ、形質導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した（図２）。この変異体を標準的ＲＲＥ含有ベクターゲノムおよびＲＲＥ欠失形態と比較した。該変異体は、ＡＴＧコドンを除去する一連の挿入ヌクレオチドの存在にもかかわらず、（標準ベクターと比較して同等の力価により実証されるとおり）完全に活性であることが判明した。また、同じＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］変異体を、ベクターゲノムＲＮＡを標的化する修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡ（これはレンチウイルスベクターの力価を増加させることが実証されており、これは、おそらく、産生中のｖＲＮＡの安定化によるものであろう）と組合せて試験した。これは標準的ＲＲＥ含有ベクターと同様に挙動した（図３）。
実施例２：除去されたサブＯＲＦおよび／またはｐ１７－ＩＮＳ欠失を含有する、レンチウイルスパッケージング配列内の機能的Ｇａｇ配列の開発
レンチウイルスベクターゲノムＲＮＡ内に保持されたＧａｇ配列は（非コア）パッケージング配列の一部を形成する。典型的には、現代的レンチウイルスベクターはこのＧａｇ配列内に突然変異を含んでいて、ベクターのバックボーン配列が上流細胞プロモーターにより転写された場合（これは安全性のリスクに相当する）、（適切な粒子構築を潜在的に阻害する）ベクター産生中と患者細胞内との両方におけるＧａｇ配列の翻訳の可能性を低減する。典型的には、第１のＡＴＧ Ｇａｇコドンから約４５ｎｔ下流にフレームシフト突然変異が挿入されるが、これは、Ｇａｇの約１５残基をコードするサブＯＲＦと、フレームシフトに由来する幾つかの他の融合残基とを保持させる。また、Ｇａｇ配列は、典型的に、ｒｅｖ－ＲＲＥ活性の保持に重要であると報告されているｐ１７－ＩＮＳ配列を保有する。
図４は、Ｇａｇ配列をその典型的な位置に含有する典型的な標準的第３世代レンチウイルスベクター、ならびに全ての潜在的ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびそれらの関連サブＯＲＦを示す。サブＯＲＦを除去するようにＡＴＧコドン内に突然変異を含有するＧａｇ配列を開発した。また、変異体「Δｇａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳ」を作製した。これにおいては、ｐ１７－ＩＮＳ配列全体が欠失していて、非常に最小化されたＧａｇ配列が得られた。Δｇａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳ変異体配列を新規ＲＲＥ変異体「ＲＲＥ［６－ＡＴＧＫＯ］」と組合せ、両方を、無傷主要スプライスドナー（ＭＳＤ）を含有するＧＦＰ発現レンチウイルスベクターゲノム内にクローニングした。また、この変異体を、「２ＫＯ－ｍ５」と称されるＭＳＤ突然変異レンチウイルスベクターゲノム内にもクローニングした。ＭＳＤ突然変異ベクターは、標準体とは異なり、ベクター産生中に異常スプライス化ＲＮＡを生成しないが、その力価は低下する。ベクターゲノムＲＮＡに標的化された再指向化Ｕ１ ｓｎＲＮＡの発現はこの欠損を完全にレスキューしうることが示されている。本発明者らは、ＭＳＤ含有ベクターゲノムとＭＳＤ突然変異ベクターゲノムとの両方の状況において該組合せＧａｇ－ＲＲＥ変異体を試験し、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡによるそれらの潜在的レスキューを試験したいと考えた。無血清懸濁液ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、パッケージング成分および＋／－ 修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡと共に、この新規変異体または標準ベクターゲノム構築物でトランスフェクトし、得られたベクター上清を導入細胞のフローサイトメトリーにより力価測定した（図５）。結果は、最小Ｇａｇ配列変異体Δｇａｇ［２－ＡＴＧＫＯ］ΔＩＮＳが、標準ベクターに匹敵するベクター力価を生成可能であり、新規ＲＲＥ変異体と組合せて使用されたことを示している。該組合せ変異体は修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡに対しても完全に応答性であった。なぜなら、ＭＳＤ突然変異形態の力価は、ＭＳＤ突然変異ベクターゲノムにおいて、標準的Ｇａｇ－ＲＲＥ配列と比較して同等にレスキューされたからである。したがって、７残基を超えるペプチド／タンパク質をコードする全サブＯＲＦ（ウイルスタンパク質の部分をコードするサブＯＲＦを含む）を除去するだけでなく、ｐ１７－ＩＮＳ配列の欠失によって約２５０ｎｔの追加的なベクター容量を生成させることが可能であった。
実施例３：全てのサブＯＲＦが完全に除去された機能的ｗＰＲＥの開発
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）は、機能に必須である機能的に保存された二次構造を示すシス作用ＲＮＡ配列である。このエレメントは、ウイルスタンパク質に無関係に、ＷＨＶの未スプライス化ＲＮＡの細胞質内蓄積を促進する。更に、異種ｍＲＮＡ内へのｗＰＲＥの挿入は遺伝子発現レベルを著しく改善することが実証されている。これらの特性は、ほとんどの標準的レンチウイルスベクタープラットフォーム（第３世代）の３’ＵＴＲ内にｗＰＲＥを含有させることにつながっている。レンチウイルスベクターに含まれるｗＰＲＥエレメント配列は、典型的には、ヌクレオチド１０９３～１６８５（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４５１４のヌクレオチド番号付け体系）からなる。この配列は、ＰＲＥ活性に必要な三成分エレメント、ならびにＷＨＶ Ｘタンパク質のプロモーターおよび最初の６０アミノ酸を保持している。標準的レンチウイルスベクターにおいては、ベクターの安全性プロファイルを改善するために、Ｘタンパク質の開始コドンが、ＡＴＧからＴＧへの欠失により開始コドンを突然変異させることにより除去されている。しかし、追加的なＡＴＧ配列が、少なくとも３つのＯＲＦをコードするｗＰＲＥ内に無傷で残されていた。これは、ＲＮアーゼＨドメインに対応するＷＨＶ Ｐｏｌタンパク質に由来する１６０残基のＯＲＦを含んでいた。
この実施例においては、ＡＴＴＧへの突然変異により、全ての更なるＡＴＧをｗＰＲＥから除去した（図６）。これを行ったのは、ｗＰＲＥ内でコードされる潜在的ＯＲＦを更に除去して、レンチウイルスベクタープラットフォームの安全性プロファイルを改善するためであった。この研究の前には、ｗＰＲＥ機能およびベクター力価に対するこれらの突然変異の影響は不明であった。ｗＰＲＥ ＲＮＡは高度に構造化されており、少なくとも１つのステムループが転写後調節エレメントとしてのその機能に重要であることが知られている。しかし、ｗＰＲＥの完全な活性はエレメント全体を要するようであり、このことは、複数の因子結合部位および／またはより高次の構造が未だ明らかでないことを示唆している。したがって、ヌクレオチド配列の破壊はＲＮＡの二次構造を破壊する可能性があり、したがって、ｗＰＲＥの機能に悪影響を与えうる。これを評価するために、Ｘタンパク質ＯＲＦが除去されている標準的なｗＰＲＥエレメント（ｗＰＲＥ［Ｘ－ＫＯ］）を含有する、または全ての追加的なＡＴＧがＡＴＴＧに突然変異しているｗＰＲＥ［Ｘ－ＫＯ］（ｗＰＲＥΔＯＲＦ）を含有する、またはｗＰＲＥを含有しない第３世代レンチウイルスベクターを製造した（図７）。これらのベクターを、ＲＲＥエレメントへの結合によって未スプライス化ＨＩＶ－１ ＲＮＡの細胞質内蓄積を促進するＨＩＶ－１ Ｒｅｖタンパク質の存在下および非存在下の両方で製造した。Ｒｅｖの非存在下では、全てのベクターの力価は低く、このことは、ｗＰＲＥの状態に無関係に、ベクターゲノムＲＮＡのＲｅｖ－ＲＲＥ媒介性輸出が必要であることを示している。Ｒｅｖの存在下では、ｗＰＲＥを含有しないベクターの力価は、標準的なＸ－ＫＯ ｗＰＲＥを含有するものよりも５倍以上低かった。これはレンチウイルスベクタープラットフォームにおけるｗＰＲＥの機能的重要性を示している。Ｘ－ＫＯ ｗＰＲＥ（ｗＰＲＥΔＯＲＦ）における全ての追加的ＡＴＧが除去されたレンチウイルスベクターは、標準的なｗＰＲＥ Ｘ－ＫＯベクターと同様の力価を示した。これは、ｗＰＲＥ内の全てのＡＴＧ配列の突然変異が、レンチウイルスベクター力価を改善するその機能に影響を及ぼさないことを示している。

Claims (32)

  1. 少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含むレンチウイルスベクターゲノムであって、
    当該ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、レンチウイルスベクターゲノム。
  2. 前記少なくとも１つのウイルス性シス作用配列が、ａ）Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および／または、ｂ）ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  3. 修飾されたＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムであって、
    当該ＲＲＥにおける少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、レンチウイルスベクターゲノム。
  4. 修飾されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムであって、
    当該ＷＰＲＥにおける少なくとも１つの内部オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が破壊されている、レンチウイルスベクターゲノム。
  5. （ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列を欠くか、または
    （ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片を欠く、
    レンチウイルスベクターゲノム。
  6. Ｇａｇ－ｐ１７またはその断片を発現しない、請求項５記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  7. 前記レンチウイルスベクターゲノムが少なくとも１つの修飾されたウイルス性シス作用配列を含み、
    ウイルス性シス作用配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されており、
    所望により、前記ウイルス性シス作用配列がＲＲＥおよび／またはＷＰＲＥである、請求項５または請求項６記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  8. 前記少なくとも１つの内部ＯＲＦが、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されている、請求項１～４または７のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  9. （ａ）前記修飾されたＲＲＥが８個未満のＡＴＧ配列を含み、および／または、（ｂ）前記修飾されたＷＰＲＥが７個未満のＡＴＧ配列を含む、請求項２、３、４、７または８のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  10. 修飾されたＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムであって、
    当該修飾されたＲＲＥが８個未満のＡＴＧ配列を含む、レンチウイルスベクターゲノム。
  11. 修飾されたウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むレンチウイルスベクターゲノムであって、
    当該修飾されたＷＰＲＥが７個未満のＡＴＧ配列を含む、レンチウイルスベクターゲノム。
  12. 前記ＲＲＥが、完全長ＲＲＥまたは最小ＲＲＥである、請求項２、３または７～１０のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  13. （ｉ）前記ＲＲＥが、
    ａ）配列番号１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、および／もしくは
    ｂ）配列番号２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
    を含む、ならびに／または
    （ｉｉ）前記ＷＰＲＥが、
    ａ）配列番号１１に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列、および／もしくは
    ｂ）配列番号１２に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列
    を含む、請求項２、３、４または７～１２のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  14. 前記修飾されたＲＲＥが、配列番号１もしくは配列番号２に示されている配列またはそれに対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含み、群（ａ）～（ｈ）：
    ａ）配列番号２の２７～２９位に対応するＡＴＧ、
    ｂ）配列番号２の１９２～１９４位に対応するＡＴＧ、
    ｃ）配列番号２の２０７～２０９位に対応するＡＴＧ、
    ｄ）配列番号２の４３６～４３８位に対応するＡＴＧ、
    ｅ）配列番号２の４８９～４９１位に対応するＡＴＧ、
    ｆ）配列番号２の５７１～５７３位に対応するＡＴＧ、
    ｇ）配列番号２の５９９～６０１位に対応するＡＴＧ、
    ｈ）配列番号２の６６３～６６５位に対応するＡＴＧ
    から選択される少なくとも１つのＡＴＧ配列が突然変異している、請求項２、３または７～１３のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  15. 前記修飾されたＲＲＥが、７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満または１個未満のＡＴＧ配列を含む、請求項２、３または７～１４のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  16. 前記レンチウイルスベクターゲノムが、ｇａｇをコードする修飾されたヌクレオチド配列を含み、
    ｇａｇをコードする前記修飾されたヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが破壊されており、
    所望により、ｇａｇをコードする前記修飾されたヌクレオチド配列における少なくとも１つの内部ＯＲＦが、少なくとも１つのＡＴＧ配列を突然変異させることにより破壊されている、前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  17. ｇａｇをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６または配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１６記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  18. ｇａｇをコードする前記修飾されたヌクレオチド配列が３個未満のＡＴＧ配列を含む、請求項１７記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  19. 前記レンチウイルスベクターゲノムが、（ｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列を欠いているか、または（ｉｉ）Ｇａｇ－ｐ１７をコードするヌクレオチド配列の断片を欠いており、
    所望により、当該レンチウイルスベクターゲノムがＧａｇ－ｐ１７またはその断片を発現しない、請求項２、３、４または７～１８のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  20. 前記レンチウイルスベクターゲノムにおける主要スプライスドナー部位が不活性化されており、
    所望により、更に、当該主要スプライスドナー部位の３’側の潜在的スプライスドナー部位が不活性化されている、前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  21. 前記レンチウイルスベクターゲノムが、関心のあるヌクレオチドを更に含み、
    所望により、当該関心のあるヌクレオチドが治療効果をもたらす、前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  22. 前記レンチウイルスベクターゲノムが、トリプトファンＲＮＡ結合減衰タンパク質（ＴＲＡＰ）結合部位を更に含む、前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  23. 前記レンチウイルスベクターが、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム。
  24. 前記請求項のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクターであって、
    所望により、当該レンチウイルスベクターがＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶまたはビスナレンチウイルスに由来する、前記レンチウイルスベクター。
  25. 請求項１～２３のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノムをコードするヌクレオチド配列。
  26. 請求項２５記載のヌクレオチド配列を含む発現カセット。
  27. ヌクレオチド配列のセットを含むウイルスベクター製造系であって、
    当該ヌクレオチド配列が、ｇａｇ－ｐｏｌ、ｅｎｖ、所望によりｒｅｖを包含するベクター成分と、請求項１～２３のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノムとをコードする、ウイルスベクター製造系。
  28. 請求項１～２３のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム、請求項２５記載のヌクレオチド配列、請求項２６記載の発現カセットまたは請求項２７記載のウイルスベクター製造系を含む、細胞。
  29. ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに、請求項２５記載のヌクレオチド配列もしくは請求項２６記載の発現カセット、または
    ｂ）請求項２７記載のウイルスベクター製造系、ならびに
    ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／もしくは、所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
    を含む、レンチウイルスベクターを製造するための細胞。
  30. レンチウイルスベクターの製造方法であって、
    （ｉ）ａ）ｇａｇ－ｐｏｌおよびｅｎｖを包含する、そして所望によりｒｅｖを包含するベクター成分をコードするヌクレオチド配列、ならびに、請求項２５記載のヌクレオチド配列もしくは請求項２６記載の発現カセット、または
    ｂ）請求項２７記載のウイルスベクター製造系、ならびに
    ｃ）所望により、修飾Ｕ１ ｓｎＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、および／もしくは、所望により、ＴＲＡＰをコードするヌクレオチド配列
    を細胞内に導入する工程、
    （ｉｉ）所望により、ベクター成分とレンチウイルスベクターゲノムとをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を選択する工程、ならびに
    （ｉｉｉ）前記レンチウイルスベクターの産生に適した条件下で前記細胞を培養する工程
    を含む、製造方法。
  31. 請求項３０記載の製造方法により製造されるレンチウイルスベクター。
  32. 請求項１～２３のいずれか１項記載のレンチウイルスベクターゲノム、請求項２５記載のヌクレオチド配列、請求項２６記載の発現カセット、請求項２７記載のウイルスベクター製造系または請求項２８もしくは請求項２９記載の細胞の、レンチウイルスベクターを製造するための使用。
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