ES2951857T3

ES2951857T3 - Vector retroviral

Info

Publication number: ES2951857T3
Application number: ES19211962T
Authority: ES
Inventors: Hannah Stewart; Helen Maunder; Kyriacos Mitrophanous; Daniel Farley
Original assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Current assignee: Oxford Biomedica UK Ltd
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2023-10-25
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: US20230183745A1; EP3502260A1; US20190211358A1; FI3633040T3; EP3696272A1; EP3633040B1; EP3633040A1

Abstract

Una célula para producir vectores retrovirales que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican: i) gag-pol; ii) entorno; iii) el genoma de ARN del vector retroviral; y iv) opcionalmente rev, o un sustituto funcional del mismo, en el que al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético; y en el que al menos dos secuencias de ácido nucleico están en orientaciones inversas y/o alternas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Vector retroviral

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a la producción de vectores retrovirales. En particular, se refiere a constructos modulares que comprenden componentes génicos retrovirales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La terapia génica implica de manera amplia el uso de material genético para tratar una enfermedad. Incluye la complementación de células con genes defectuosos (por ejemplo, las que albergan mutaciones) con copias funcionales de esos genes, la inactivación de genes que funcionan de manera inapropiada y la introducción de nuevos genes terapéuticos.

Puede incorporarse material genético terapéutico en las células diana de un huésped usando vectores para permitir la transferencia de ácidos nucleicos. Tales vectores pueden dividirse generalmente en categorías viral y no viral.

Los virus introducen de manera natural su material genético en células diana de un huésped como parte de su ciclo de replicación. Los vectores virales modificados por ingeniería aprovechan esta capacidad para permitir el suministro de un nucleótido de interés (NOI) en una célula diana. Hasta ahora, se han modificado varios virus por ingeniería como vectores para terapia génica. Estos incluyen retrovirus, adenovirus (AdV), virus adenoasociados (VAA), virus del herpes simple (VHS) y virus vaccinia.

Además de la modificación para portar un nucleótido de interés, normalmente los vectores virales se modifican adicionalmente por ingeniería para ser defectuosos para la replicación. Como tales, los vectores recombinantes pueden infectar directamente una célula diana, pero no pueden producir generaciones adicionales de viriones infecciosos. Otros tipos de vectores virales pueden ser condicionalmente competentes para la replicación únicamente dentro de células cancerosas y adicionalmente pueden codificar para una proenzima o transgén tóxico.

Se han desarrollado vectores retrovirales como terapias para diversos trastornos genéticos y ahora están mostrando ser cada vez más prometedores en ensayos clínicos. Actualmente hay más de 459 ensayos clínicos con seres humanos que implican terapia génica retroviral registrados en la base de datos del Journal of Gene Medicine; 158 ensayos clínicos de terapia génica están usando vectores lentivirales (http://www.abedia.com/wiley/vectores.php, actualizado en abril de 2017). Strimvelis recibió autorización de comercialización de la Comisión Europea el 26 de mayo de 2016; Strimvelis es un producto para el tratamiento de ADA-SCID basado en células CD34+ de paciente transducidas ex vivo con vectores retrovirales que expresan el gen de ADA. Kymriah (USAN: tisagenlecleucel) recibió la aprobación de la FDA el 30 de agosto de 2017; Kymriah es un producto para el tratamiento de pacientes hasta 25 años de edad con ALL que no responde al tratamiento. Los artículos sobre terapia génica retroviral incluyen Wang X, Naranjo A, Brown CE, Bautista C, Wong CW, Chang WC, Aguilar B, Ostberg JR, Riddell SR, Forman SJ, Jensen MC (2012) J Immunother. 35(9):689-701, Hu Y, Wu Z, Luo Y, Shi J, Yu J, Pu C, Liang Z, Wei G, Cui Q, Sun J, Jiang J, Xie J, Tan Y, Ni W, Tu J, Wang J, Jin A, Zhang H, Cai Z, Xiao L, Huang H. (2017) Clin Cancer Res. 23(13):3297-3306, Galy, A. y A. J. Thrasher (2010) Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6): 545-550; Porter, D. L., B. L. Levine, M. Kalos, A. Bagg y C. H. June (2011) N Engl J Med 365(8): 725 733; Campochiaro, P. A. (2012) Gene Ther 19(2): 121-126; Cartier, N., S. Hacein-Bey-Abina, C. C. Bartholomae, P. Bougneres, M. Schmidt, C. V. Kalle, A. Fischer, M. Cavazzana-Calvo y P. Aubourg (2012) Methods Enzymol 507: 187 198; Sadelain, M., I. Riviere, X. Wang, F. Boulad, S. Prockop, P. Giardina, A. Maggio, R. Galanello, F. Locatelli y E. Yannaki (2010) Ann N YAcad Sci 1202: 52-58; DiGiusto, D. L., A. Krishnan, L. Li, H. Li, S. Li, A. Rao, S. Mi, P. Yam, S. Stinson, M. Kalos, J. Alvarnas, S. F. Lacey, J. K. Yee, M. Li, L. Couture, D. Hsu, S. J. Forman, J. J. Rossi y J. A. Zaia (2010) Sci TranslMed 2(36): 36ra43 y Segura MM, M. M., Gaillet B, Garnier A. (2013) Expert opinion in biological therapy).

Los ejemplos importantes de tales vectores incluyen el sistema de vector de gamma-retrovirus (basado en VLMM), el sistema de vector de lentivirus de primate (basado en VIH-1) y el sistema de vector de lentivirus no de primate (basado en VAIE).

La genética inversa ha permitido modificar en gran medida por ingeniería estos vectores basados en virus de tal manera que pueden producirse vectores que codifican para grandes secuencias heterólogas (aproximadamente 10 kb) mediante transfección de células de mamífero con secuencias de ADN apropiadas (revisado en Bannert, K. (2010) Caister Academic Press: 347-370).

La modificación por ingeniería y el uso de vectores retrovirales en la fase de investigación implica normalmente la producción de vectores de genes indicadores que codifican, por ejemplo, para GFP o lacZ. Los títulos de estos vectores clínicamente irrelevantes se encuentran habitualmente en la región de 1*106 a 1*107 unidades de transducción por ml (UT/ml) de material recogido en bruto.

Un método común para producir vectores virales se conoce como transfección transitoria. Es decir, se introducen genes virales necesarios para la producción de vectores virales en una célula huésped (por ejemplo, HEK-293) mediante plásmidos por transfección. Además, resulta habitual que cada componente requerido para la producción de vectores se codifique en plásmidos independientes. Esto es, al menos parcialmente, por motivos de seguridad, ya que entonces se requeriría que se produjeran varios acontecimientos de recombinación para formarse una partícula de virus competente para la replicación a través del procedimiento de producción.

Sin embargo, un procedimiento transitorio de este tipo tiene inconvenientes inherentes. El coste de los agentes de transfección y los plásmidos son altos y, junto con la naturaleza de trabajo intensivo de la técnica de transfección, esto hace que la transfección transitoria sea un procedimiento caro y técnicamente complejo para la producción de vectores clínicos/comerciales.

Por tanto, existe un deseo en la técnica de proporcionar métodos alternativos de producción de vectores virales que ayuden a abordar las cuestiones conocidas asociadas con el procedimiento de transfección transitoria.

En los últimos años ha habido un intento de generar líneas de células de empaquetamiento estables, en el que se introducen genes de empaquetamiento virales en células huésped eucariotas junto con marcadores de selección de tal manera que estos genes pueden integrarse de manera estable en la célula. De manera similar, también existen líneas de células productoras estables en las que el genoma retroviral también está integrado de manera estable. Ambas permiten evitar una porción significativa del procedimiento de transfección transitoria.

Sin embargo, las líneas de células de empaquetamiento y productoras son difíciles de generar en parte debido al requisito general de introducir de manera secuencial componentes genéticos virales en la célula huésped. La dificultad de predecir el sitio de integración también puede conducir a niveles de expresión impredecibles así como inestabilidad genética.

Otra manera recientemente desarrollada de producir líneas de células de empaquetamiento y productoras se describe en los documentos WO 2017/089307 y WO 2017/089308. Implica el uso de vectores de ácido nucleico que comprenden un origen de replicación no de mamífero tal como cromosomas artificiales bacterianos, que comprenden los genes retrovirales esenciales para la producción de vectores retrovirales. Los cromosomas artificiales bacterianos o "BAC" se refieren a un constructo de ADN derivado de plásmidos bacterianos que puede contener un gran inserto de ADN exógeno. Habitualmente pueden contener un inserto de ADN máximo de aproximadamente 350 kb. Se desarrollaron BAC a partir del plásmido de fertilidad funcional bacteriano bien caracterizado (plásmido F) que contiene genes de reparto que fomentan la distribución uniforme de plásmidos después de la división de células bacterianas. Esto permite replicar de manera estable los BAC y segregarlos junto con genomas bacterianos endógenos. El BAC contiene habitualmente al menos una copia de un origen de replicación (tal como el oriSox o Ngene), el gen repE (para la replicación de plásmidos y regulación de número de copias) y genes de reparto lo que garantiza un mantenimiento estable del BAC en células bacterianas. De manera natural, los BAC son circulares y están superenrollados, lo que hace que sean más fáciles de recuperar que los cromosomas artificiales lineales.

El docum ento WO 2012/028680 A1 da a conocer una línea de células de empaquetamiento semiestable y un método para producir vectores lentivirales usando dicha línea celular. Los métodos y las líneas de células de empaquetamiento se generan usando un sistema híbrido de baculo-VAA para la expresión estable de proteínas lentivirales estructurales y reguladoras, comprendiendo tal sistema una estructura principal de baculovirus que contiene un casete de integración flanqueado por ITR de VAA en combinación con un plásmido que codifica para proteína rep.

El docum ento WO 2006/089001 A2 da a conocer vectores lentivirales para terapia génica, tratamiento del cáncer, producción de proteínas recombinantes y otros propósitos terapéuticos. Los vectores lentivirales, por ejemplo, comprenden secuencias auxiliares en orientaciones opuestas y/o secuencias de LTR mínimamente funcionales, que pueden usarse para preparar vectores de transducción de alta eficiencia.

Por tanto, existe un deseo de mejorar tanto la producción de vectores transitorios así como el procedimiento para generar líneas de células de empaquetamiento y productoras estables.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han encontrado que, sorprendentemente, constructos modulares que comprenden al menos dos de los componentes de ácido nucleico necesarios para la producción de vectores virales pueden ser eficaces en la generación de células de producción de vectores. En particular, se ha mostrado que esto es cierto para el uso de constructos de plásmidos bacterianos. Los constructos modulares de la presente invención pueden usarse para la generación de células de producción de vectores tanto transitorias como estables.

Anteriormente, se pensaba que esto sería ineficaz debido a que los constructos modulares, tales como los de la presente invención, son demasiado grandes como para contenerse por plásmidos bacterianos que tenían que usarse para la producción retroviral, ya que los plásmidos sobredimensionados pueden conducir tanto a inestabilidad genética como a escasa expresión. Adicionalmente, el tamaño d t t t dí l l fi i i d l t d l l sistemas de producción de vectores transitorios y estables, y la integración en células de producción de vectores estables usando métodos de transfección típicos. También podía cuestionarse la seguridad y eficacia del uso de tales plásmidos para la generación de células de producción de vectores, ya que puede conducir a una probabilidad aumentada de la formación de partículas virales competentes para la replicación.

Sin embargo, los presentes inventores han mostrado que pueden usarse constructos modulares que comprenden al menos dos de los componentes de ácido nucleico necesarios para la producción de vectores virales para proporcionar niveles de producción de vectores comparables a aquellos con un procedimiento transitorio de múltiples plásmidos tradicional, pero permitiendo una reducción significativa, por ejemplo, en el uso de agentes de transfección. Los inventores han mostrado que la producción de vectores no parece verse significativamente afectada por el uso de orientaciones alternantes de los genes retrovirales en los constructos modulares. Además, los genes retrovirales en los constructos modulares pueden disponerse en cualquier orden. Tales constructos modulares también pueden usarse para evaluar la estequiometría óptima de los diversos componentes de vectores retrovirales para proporcionar la célula de producción de vector más ventajosa.

Dado que los constructos modulares de la presente invención contienen dos o más de los componentes retrovirales en un constructo, se ha considerado el perfil de seguridad de estos constructos modulares y se han diseñado por ingeniería características de seguridad adicionales directamente en la invención. Estas características incluyen el uso de elementos de aislamiento para múltiples marcos de lectura abiertos de componentes de vectores retrovirales y la orientación y disposición específicas de los genes retrovirales en los constructos modulares. Los inventores creen que, usando estas características, se evitará la translectura directa para generar partículas virales competentes para la replicación. Los inventores han mostrado que el uso de estas características no tiene un impacto significativo sobre la generación de vector viral en sistemas de producción de vectores ni transitorios ni estables.

Los inventores han mostrado que el uso de tales constructos modulares puede permitir un procedimiento más eficiente para la generación de líneas de células de empaquetamiento (PaCL) y productoras (PCL) estables. El uso de constructos modulares mejora este procedimiento ya que hay múltiples componentes retrovirales presentes en el mismo constructo. Se requiere transfectar de manera estable menos constructos en la línea de células huésped y, por tanto, se necesita que se produzcan menos acontecimientos de integración para generar una PaCL/PCL estable. Esto reduce significativamente el tiempo y los costes de producción y también ofrece la ventaja de reducir el número de marcadores seleccionables, y por tanto de etapas de selección, requeridos para la generación de líneas celulares estables. Con respecto a esto último, esto resulta particularmente relevante ya que solo hay un número limitado de marcadores seleccionables disponibles.

El hecho de que al menos algunos (si no todos) de los componentes necesarios para la producción de vectores se integrarán en el mismo sitio dentro del genoma de célula de producción puede significar además que un procedimiento de este tipo también puede superar problemas tales como el silenciamiento génico, que puede producirse cuando se integran genes de vectores retrovirales de manera aleatoria y en diferentes ubicaciones dentro del genoma de célula de producción.

Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona un plásmido bacteriano que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev en orientaciones inversas, en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev están cada una asociada con:

1. i) al menos un elemento de regulación de la transcripción seleccionado del grupo de represores de tetraciclina (TetR) de reguladores de la transcripción o de los reguladores de la transcripción del sistema de conmutación inducible por cumato; o

2.

3. ii) al menos un elemento de represión de la traducción, en el que el elemento de represión de la traducción es una proteína de unión a ARN activada por triptófano (TRAP).

4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula para producir vectores retrovirales que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para:

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env; y

4.

5. iii) rev,

6.

en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env están ubicadas en el mismo locus genético; en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env están en orientaciones inversas; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev están cada una asociada con al menos un elemento de regulación de la transcripción seleccionado del grupo de represores de tetraciclina (TetR) de reguladores de la transcripción o de los reguladores de la transcripción del sistema de conmutación inducible por cumato.

En el presente documento se describe una célula para producir vectores retrovirales que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para:

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) opcionalmente rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

en la que al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético; en la que las al menos dos secuencias de ácido nucleico están en orientaciones inversas y/o alternantes; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y/o env están asociadas con al menos un elemento regulador.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

en la que al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env están en orientaciones inversas y/o alternantes.

En el presente documento se describe una célula de producción transitoria para producir vectores retrovirales que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para:

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

en la que al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y rev están en orientaciones inversas y/o alternantes.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) opcionalmente rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

en la que las secuencias de ácido nucleico están ubicadas en, al menos, dos loci diferentes dentro de la célula, en la que, además, al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético en el genoma de la célula; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y/o env están asociadas con al menos un elemento regulador.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

en la que las secuencias de ácido nucleico están ubicadas en, al menos, dos loci diferentes dentro de la célula, en la que, además, al menos dos secuencias de ácido nucleico están ubicadas en el mismo locus genético; y en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env están en orientaciones inversas y/o alternantes.

En el presente documento se describe un constructo modular que comprende al menos dos secuencias de ácido nucleico seleccionadas de secuencias de ácido nucleico que codifican para:

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) el genoma de ARN del vector retroviral; y/o

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo;

8.

en el que las al menos dos secuencias de ácido nucleico están en orientaciones inversas y/o alternantes; y en el que:

1. a) cuando el constructo modular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para gag-pol, dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para gag-pol está asociada con al menos un elemento regulador; o 2.

3. b) cuando el constructo modular comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para env, dicha secuencia de ácido nucleico que codifica para env está asociada con al menos un elemento regulador; o 4.

5. c) cuando el constructo modular comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y env, dichas secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y env están asociadas con al menos un elemento regulador.

6.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) el genoma de ARN del vector retroviral; y/o

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo;

8.

en el que el constructo modular no contiene una secuencia derivada de un PAC, BAC, YAC, cósmido o fósmido; y en el que:

6.

En el presente documento se describe un constructo modular que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev, o un sustituto funcional de los mismos, en orientaciones inversas y/o alternantes, y opcionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y/o el genoma de ARN del vector retroviral.

En el presente documento se describe un constructo modular que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev, o un sustituto funcional de los mismos, en orientaciones inversas y/o alternantes, y opcionalmente secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol y/o el genoma de ARN del vector retroviral, en el que el constructo modular no contiene una secuencia derivada de un PAC, BAC, YAC, cósmido o fósmido.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula para producir vectores retrovirales que comprenden al menos un plásmido bacteriano de la invenció

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para generar una célula de producción para producir vectores retrovirales, que comprende las etapas de:

1. a) introducir al menos un plásmido bacteriano de la invención en una célula de mamífero; y

2.

3. b) opcionalmente seleccionar una célula de mamífero que tiene las al menos dos secuencias de ácido nucleico integradas dentro de su genoma.

4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para generar una célula estable para producir vectores retrovirales, que comprende las etapas de:

2.

3. b) seleccionar una célula de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env integradas dentro de su genoma.

4.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula estable para producir vectores retrovirales producida mediante un método de la invención.

En el presente documento se describe un método para generar una célula de producción transitoria para producir vectores retrovirales, que comprende introducir al menos un constructo modular de la invención en una célula de mamífero.

En el presente documento se describe una célula de producción transitoria para producir vectores retrovirales producida mediante un método de la invención.

En el presente documento se describe un método para producir un vector retroviral defectuoso para la replicación, que comprende las etapas de:

1. a) introducir un constructo modular de la invención en una célula de mamífero;

2.

3. b) seleccionar una célula de mamífero que tiene las al menos dos secuencias de ácido nucleico integradas dentro de su genoma

4.

5. c) opcionalmente introducir un vector de ácido nucleico que es diferente del constructo modular en la célula de mamífero seleccionada;

6.

7. d) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación; y

8.

opcionalmente e) aislar el vector retroviral defectuoso para la replicación.

2.

3. b) opcionalmente introducir un vector de ácido nucleico que es diferente del constructo modular en la célula de mamífero; y

4.

5. c) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación;

6.

y opcionalmente d) aislar el vector retroviral defectuoso para la replicación.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para producir un vector retroviral defectuoso para la replicación, que comprende las etapas de:

1. a) introducir un plásmido bacteriano según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en una célula de mamífero; 2.

3. b) seleccionar una célula de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env integradas dentro de su genoma; y

4.

5. c) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para producir un vector retroviral defectuoso para la replicación, que comprende las etapas de:

1. a) introducir un plásmido bacteriano según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en una célula de mamífero; y 2.

3. b) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación.

4.

En el presente documento se describe un vector retroviral defectuoso para la replicación producido mediante cualquier método de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: (A) Un esquema que presenta componentes de vectores retrovirales típicos. Los sistemas de vectores retrovirales terapéuticos actualmente usados se han modificado altamente por ingeniería a partir de los genomas de virus de tipo natural de los que se derivaron. Los vectores gamma-retrovirales se producen normalmente usando sistemas de 3 o 4 componentes que requieren genoma de vector, Gag/Pol y constructos de expresión de la envuelta y, para varios sistemas de vectores lentivirales, también se requiere el gen accesorio Rev. Los vectores lentivirales basados en VAIE no requieren Rev si un marco de lectura abierto (ORF) sustituye a RRE. Los genomas de vectores requieren normalmente una señal de empaquetamiento (y ), un nucleótido de interés (NOI), (opcionalmente) un elemento postranscripcional (PRE), la 3'ppu y una LTR autoinactivante (SIN). Las regiones de R-U5 se requieren para una correcta poliadenilación tanto de ARN de genoma de vector como de ARNm de transgén, así como el proceso de transcripción inversa. Habitualmente, los promotores tanto "externo" como "interno" (Pro) codificados dentro del casete de genoma son fuertes promotores eucariotas o de virus, al igual que los que impulsan los demás componentes de sistema de vector.

Figura 2: Un esquema del constructo modular transitorio completo de OXB (pOXB_Transient_Modular); HS1, HS4 y HS5 son secuencias de aislamiento bien conocidas.

Figura 3: Título predicho mediante FACS y PERT biológico de vector de LV-GFP producido a partir de células HEK₂93T que se habían transfectado transitoriamente con el constructo modular transitorio (pOXB_Transient_Modular) con respecto a vector de LV-GFP producido usando el procedimiento de cotransfección de cuatro plásmidos transitoria convencional (todos los constructos de o Xb por separado). Se evaluó la producción de vectores mediante ensayo de título de FACS de GFP y análisis de título predicho de PERT (mostrado como títulos promedio a partir de la recogida 2).

Figura 4: Expresión de proteína VEV-G y GFP en porcentaje a partir de células HEK₂93T transfectadas de manera transitoria con el constructo modular transitorio con respecto al procedimiento de transfección transitoria convencional. Se cuantificaron imágenes de inmunotransferencia de tipo Western mediante densitometría y se estableció la expresión de proteína VEV-G y GFP a partir del control de transfección transitoria convencional al 100%. La expresión de VEV-G y GFP a partir de células tras la producción HEK₂93T transfectadas de manera transitoria con el constructo modular transitorio se expresa como porcentaje con respecto a la expresión de VEV-G y GFP a partir de células HEK₂93T transfectadas de manera transitoria con los plásmidos de LV de control convencionales.

Tabla 1. Se sometieron a prueba diferentes combinaciones de constructos modulares de LV para determinar su capacidad para generar LV-GFP tras la co-transfección transitoria de células HEK₂93T.TetR14 (que expresan de manera constitutiva la proteína TetR). Aquí se muestra el esquema de cada uno de los constructos modulares que se sometieron a prueba y el título de FACS de GFP promedio (UT/ml) del vector resultante tras la cotransfección transitoria de células HEK₂93T con cada uno de los constructos modulares más plásmidos de componentes individuales restantes para completar el sistema de producción de vector.

Tabla 2. Se generaron combinaciones estables de células de empaquetamiento mediante transfección estable usando diferentes combinaciones de constructos de LV individuales o modulares seguido por un periodo de selección con antibiótico. Se sometieron a prueba células de empaquetamiento estables resultantes para determinar su capacidad para generar LV-GFP tras la transfección transitoria de genoma de GFP de VIH-1 (y Rev para PAC006) e inducción por doxiciclina de la línea celular. Aquí se muestra el esquema de cada uno de los constructos modulares y plásmidos individuales que se usaron para generar combinaciones de células de empaquetamiento estables. También se muestran los títulos de FACS de GFP resultantes (UT/ml) del vector de GFP de LV que se produjo a partir de cada combinación de células de empaquetamiento tras la transfección transitoria de genoma de GFP de VIH-1 (y Rev de VIH-1 para PAC006) e inducción por doxiciclina.

Figura 5: Producción de LV a partir de los 5 mejores clones de empaquetamiento estables generados usando o bien plásmidos individuales (PAC001) o bien una combinación de constructos modulares y plásmidos individuales (PAC004: véase la tabla 2).

Tabla 3. Se generaron combinaciones estables de células productoras mediante transfección estable usando diferentes combinaciones de plásmidos individuales o constructos de LV modulares seguido por un periodo de selección con antibiótico. Se sometieron a prueba las líneas de células productoras resultantes para determinar su capacidad para generar LV-GFP tras la inducción por doxiciclina de la línea celular. Aquí se muestra el esquema de cada uno de los plásmidos modulares que se evaluaron y el título de FACS de GFP promedio (UT/ml) del vector resultante tras la inducción por doxiciclina.

Figura 6: Título de FACS de GFP (UT/ml) a partir de células HEK₂93T transfectadas de manera estable con los constructos modulares en forma lineal o superenrollada. Producción de vector de LV-GFP a partir de líneas de células productoras estables que se generaron mediante transfección estable usando constructos modulares de VEV-G-Rev (MO₃y MO12; véase la tabla 3) y constructos de genoma y GagPol individuales. Las combinaciones de plásmidos evaluadas estaban o bien superenrolladas o bien linealizadas. Se produjo vector y se cuantificó mediante ensayo de título de FACS de GFP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención empleará técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología e inmunología, que están dentro de las capacidades de un experto habitual en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, NY; B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak y James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; y, D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado con el que los entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. A menos que se especifique lo contrario, "rev" y "gag-pol" se refieren a las proteínas y/o genes de vectores lentivirales.

Vectores

La presente invención se refiere a vectores retrovirales.

Un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. Según la presente invención, y a modo de ejemplo, algunos vectores usados en técnicas de ácido nucleico recombinante permiten transferir entidades, tales como un segmento de ácido nucleico (por ejemplo, un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo), al interior de, y expresarse en, una célula diana. El vector puede facilitar la integración del ácido nucleico/nucleótido de interés (NOI) para mantener el NOI y su expresión dentro de la célula diana. Alternativamente, el vector puede facilitar la replicación del vector a través de la expresión del NOI en un sistema transitorio.

Los vectores de la invención son vectores virales, en particular vectores retrovirales, con un promotor para la expresión de dicho NOI y opcionalmente un regulador del NOI. Los vectores pueden contener uno o más genes de marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a la neomicina) y/o gen(es) de marcadores rastreables (por ejemplo, un gen que codifica para proteína verde fluorescente (GFP)). Pueden usarse vectores, por ejemplo, para infectar y/o transducir una célula diana.

El vector retroviral puede usarse para replicar el NOI en una célula diana compatible in vitro. Por tanto, la invención proporciona un método de producción de proteínas in vitro introduciendo un vector de la invención en una célula diana compatible in vitro y haciendo crecer la célula diana en condiciones que dan como resultado la expresión del NOI. Puede recuperarse proteína y NOI a partir de la célula diana mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las células diana adecuadas incluyen líneas de células de mamífero y otras líneas de células eucariotas.

El vector puede ser un vector de expresión. Los vectores de expresión tal como se describe en el presente documento comprenden regiones de ácido nucleico que contienen secuencias que pueden transcribirse. Por tanto, dentro de esta definición se incluyen secuencias que codifican para ARNm, ARNt y ARNr.

En algunos aspectos los vectores pueden tener "elementos de aislamiento", secuencias genéticas que bloquean la interacción entre promotores y potenciadores, y actúan como barrera que reduce la translectura a partir del gen adyacente.

En una realización el elemento de aislamiento está presente entre una o más de las secuencias de ácido nucleico retrovirales para prevenir la interferencia del promotor y la translectura a partir de genes adyacentes. Si los elementos de aislamiento están presentes en el constructo modular entre una o más de las secuencias de ácido nucleico retrovirales, entonces cada uno de estos genes aislados puede disponerse como unidades de expresión individuales.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) opcionalmente rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) opcionalmente rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

1. i) gag-pol;

2.

3. ii) env;

4.

5. iii) opcionalmente el genoma de ARN del vector retroviral; y

6.

7. iv) rev o un sustituto funcional del mismo,

8.

En otra realización, el retrovirus se deriva a partir de un espumavirus.

En otra realización, el vector retroviral se deriva a partir de un lentivirus.

En otra realización, el vector lentiviral se deriva a partir de VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VIB, VAIE, VAEC o lentivirus Visna.

Vectores retrovirales y lentivirales

El vector retroviral de la presente divulgación puede derivarse, o puede ser derivable, a partir de cualquier retrovirus adecuado. Se ha identificado un gran número de retrovirus diferentes. Los ejemplos incluyen: virus de la leucemia murino (VLM), virus de la leucemia de células T humano (VLTH), virus de tumor de mama de ratón (VTMR), virus del sarcoma de Rous (VSR), virus del sarcoma de Fujinami (VSFu), virus de la leucemia murino de Moloney (VLMMo), virus de osteosarcoma murino de FBR (VSM de FBR), virus de sarcoma murino de Moloney (VSM-Mo), virus de la leucemia murino de Abelson (VLM-A), virus de mielocitomastosis aviar 29 (MC₂9) y virus de eritroblastosis aviar (VEA). Puede encontrarse una lista detallada de retrovirus en Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, págs. 758-763.

Los retrovirus pueden dividirse de manera amplia en dos categorías, en concreto "simples" y "complejos". Los retrovirus pueden incluso dividirse adicionalmente en siete grupos. Cinco de estos grupos representan retrovirus con potencial oncogénico. Los dos grupos restantes son los lentivirus y los espumavirus. En Coffin et al (1997), anteriormente citado, se presenta una revisión de estos retrovirus.

La estructura básica de genomas retrovirales y lentivirales comparten muchas características comunes, tales como una LTR en 5' y una LTR en 3', entre o dentro de las cuales está ubicada una señal de empaquetamiento para permitir empaquetar el genoma, un sitio de unión a cebador, sitios de integración para permitir la integración en un genoma de célula diana y genes de gag/pol y env que codifican para los componentes de empaquetamiento, se trata de polipéptidos requeridos para el ensamblaje de partículas virales. Los lentivirus tienen características adicionales, tales como el gen de rev y secuencias de RRE en VIH, que permiten la exportación eficiente de transcritos de ARN del provirus integrado desde el núcleo hasta el citoplasma de una célula diana infectada.

En el provirus, estos genes están flanqueados en ambos extremos por regiones denominadas repeticiones terminales largas (LTR). Las LTR son responsables de la integración proviral y de la transcripción. Las LTR también sirven como secuencias de potenciador-promotor y pueden controlar la expresión de los genes virales.

Las propias LTR son secuencias idénticas que pueden dividirse en tres elementos, que se denominan U3, R y U5. U3 se deriva a partir de la secuencia única para el extremo 3' del ARN. R se deriva a partir de una secuencia repetida en ambos extremos del ARN y U5 se deriva a partir de la secuencia única para el extremo 5' del ARN. Los tamaños de los tres elementos pueden variar considerablemente entre diferentes retrovirus.

En un vector retroviral típico de la presente divulgación, al menos parte de una o más regiones que codifican para proteína esenciales para la replicación pueden retirarse del virus; por ejemplo, gag/pol y env pueden estar ausentes o no ser funcionales. Esto hace que el vector viral sea defectuoso para la replicación.

Los lentivirus forman parte de un grupo más grande de retrovirus. Puede encontrarse una lista detallada en Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus, págs. 758-763). En resumen, los lentivirus pueden dividirse en grupos de primates y no de primates. Los ejemplos de lentivirus de primates incluyen, pero no se limitan a: virus de inmunodeficiencia humano (VIH), el agente causante del síndrome de inmunodeficiencia adquirida humano (SIDA), y el virus de inmunodeficiencia del simio (VIS). El grupo de lentivirus no de primates incluye el prototipo de "virus lento" virus de Visna/Maedi (VVM), así como el virus de artritis-encefalitis caprino (VAEC), virus de anemia infecciosa equino (VAIE), virus de inmunodeficiencia felino (VIF), virus de Maedi-Visna (VMV) y virus de inmunodeficiencia bovino (VIB) relacionados.

La familia de lentivirus difiere de los retrovirus en que los lentivirus tienen la capacidad de infectar tanto a células que se dividen como que no se dividen (Lewis et al (1992) Em BO J 11 (8):3053-3058 y Lewis y Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516). En cambio, otros retrovirus, tales como VLM, no pueden infectar a células que no se dividen o que se dividen lentamente tales como las que constituyen, por ejemplo, tejido muscular, cerebral, pulmonar y hepático.

Un vector lentiviral, tal como se usa en el presente documento, es un vector que comprende al menos una parte componente derivable a partir de un lentivirus. Preferiblemente, esa parte componente participa en los mecanismos biológicos mediante los cuales el vector infecta o transduce células diana y expresa NOI.

El vector lentiviral puede derivarse o bien a partir de un lentivirus de primate (por ejemplo, VIH-1) o bien a partir de un lentivirus no de primate (por ejemplo, VAIE).

En términos generales, un sistema de producción de vector retroviral típico implica la separación del genoma viral a partir de las funciones de empaquetamiento virales esenciales. Tal como se ilustra en la figura 1, estos componentes se proporcionan normalmente a las células de producción en casetes de expresión de ADN independientes (alternativamente conocidos como plásmidos, plásmidos de expresión, constructos de ADN o constructos de expresión).

El genoma de vector comprende el NOI. Los genomas de vectores requieren normalmente una señal de empaquetamiento (Y), el casete de expresión interno que alberga el NOI, (opcionalmente) un elemento postranscripcional (Pr E), la 3'-ppu y una LTR autoinactivante (SIN). Las regiones de R-U5 se requieren para una correcta poliadenilación tanto del ARN de genoma de vector como de ARNm de NOI, así como el proceso de transcripción inversa. El genoma de vector puede incluir opcionalmente un marco de lectura abierto, tal como se describe en el documento WO 2003/064665, que permite la producción de vector en ausencia de rev.

Las funciones de empaquetamiento incluyen los genes gag/pol y env. Estos se requieren para la producción de partículas de vector por la célula de producción. Proporcionar estas funciones en trans con respecto al genoma facilita la producción de vectores virales defectuosos para la replicación.

Los sistemas de producción para vectores gamma-retrovirales son normalmente sistemas de 3 componentes que requieren constructos de expresión de genoma, gag/pol y env. Los sistemas de producción para vectores lentivirales basados en VIH-1 pueden requerir adicionalmente proporcionar el gen accesorio rev y que el genoma de vector incluya el elemento sensible a rev (RRE). Los vectores lentivirales basados en VAIE no requieren que rev se proporcione en trans si está presente un marco de lectura abierto (ORF) dentro del genoma (véase el documento WO 2003/064665).

Habitualmente, tanto el promotor "externo" (que impulsa el casete de genoma de vector) como el promotor "interno" (que impulsa el casete de n O i) codificados dentro del casete de genoma de vector son fuertes promotores eucariotas o de virus, al igual que los que impulsan los demás componentes de sistema de vector. Los ejemplos de tales promotores incluyen promotores de CMV, EF1a, PGK, CAG, TK, VS40 y ubiquitina. También pueden usarse promotores "sintéticos" fuertes, tales como los generados mediante bibliotecas de ^aDⁿ(por ejemplo, el promotor JeT), para impulsar la transcripción. Alternativamente, para impulsar la transcripción pueden usarse promotores específicos de tejido tales como rodopsina (Rho), rodopsina cinasa (RhoK), gen que contiene homeosecuencia de conos y bastones (CRX), proteína de cremallera de leucinas específica de retina neural (NRL), distrofia macular viteliforme 2 (VMD2), tirosina hidroxilasa, promotor de enolasa específica neuronal (NSE), promotor de proteína ácida fibrilar específica de astrocitos (GFAP), promotor de a1-antitripsina humana (hAAT), fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK), promotor de proteína de unión a ácidos grasos hepática, promotor de Flt-1, promotor de INF-p, promotor de Mb, promotor de SP-B, promotor de SYN1, promotor de WASP, promotor de VS40 / hAlb, VS40 / CD43, VS40 / CD45, promotor de NSE / RU5', promotor de ICAM-2, promotor de GPllb, promotor de GFAP, promotor de fibronectina, promotor de endoglina, promotor de elastasa-1, promotor de desmina, promotor de CD68, promotor de CD14 y promotor de B29.

La producción de vectores retrovirales implica o bien la co-transfección transitoria de las células de producción con estos componentes de ADN o bien el uso de líneas de células de producción estables en las que todos los componentes están integrados de manera estable dentro del genoma de célula de producción (por ejemplo, Stewart HJ, Fong-Wong L, Strickland I, Chipchase D, Kelleher M, Stevenson L, Thoree V, McCarthy J, Ralph GS, Mitrophanous KA y Radcliffe PA. (2011). Hum Gene Ther. Mar; 22 (3):357-69). Un enfoque alternativo es usar una célula de empaquetamiento estable (en la que están integrados de manera estable los componentes de empaquetamiento) y después transfectar de manera transitoria en el genoma de vector plásmido según se requiera (por ejemplo, Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous y P. A. Radcliffe (2009). Gene Ther. Jun; 16 (6):805-14). También es viable que puedan generarse líneas de células de empaquetamiento alternativas, no completas (tan solo uno o dos componentes de empaquetamiento están integrados de manera estable en las líneas celulares) y para generar el vector se transfectan de manera transitoria los componentes que faltan. La célula de producción también puede expresar proteínas reguladoras tales como un miembro del grupo de reguladores de la transcripción de proteína represora de tet (TetR) (por ejemplo, T-Rex, Tet-On y Tet-Off), un miembro del grupo de reguladores de la transcripción del sistema de conmutación inducible por cumato (por ejemplo, proteína represora de cumato (CymR)), o una proteína de unión a ARN (por ejemplo, TRAP -proteína de unión a ARN activada por triptófano).

En una realización de la presente invención, el vector viral se deriva a partir de VAIE. VAIE tiene la estructura genómica más sencilla de los lentivirus y se prefiere particularmente para su uso en la presente invención. Además de los genes gag/pol y env, VAIE codifica para otros tres genes: tat, rev, y S2. Tat actúa como activador de la transcripción de la LTR viral (Derse y Newbold (1993) Virology 194(2):530-536 y Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642) y rev regula y coordina la expresión de genes virales mediante elementos de respuesta a rev (RRE) (Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). Se piensa que los mecanis

mecanismos análogos en los virus de primates (Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). Se desconoce la función de S2. Además, se ha identificado una proteína de VAIE, Ttm, que se codifica por el primer exón de tat empalmado en la secuencia codificante de env al inicio de la proteína transmembrana. En una realización alternativa de la presente invención, el vector viral se deriva a partir de VIH: VIH difiere de VAIE en que no codifica para S2 pero, a diferencia de VAIE, sí que codifica para vif, vpr, vpu y nef.

El término "vector retroviral o lentiviral recombinante" (RRV) se refiere a un vector con suficiente información genética retroviral como para permitir el empaquetamiento de un genoma de ARN, en presencia de componentes de empaquetamiento, en una partícula viral que puede transducir una célula diana. La transducción de la célula diana puede incluir transcripción inversa e integración en el genoma de célula diana. El RRV porta secuencias codificantes no virales que tienen que suministrarse por el vector a la célula diana. Un RRV no puede realizar replicación independiente para producir partículas retrovirales infecciosas dentro de la célula diana. Habitualmente, el RRV carece de un gen gag/pol y/o env funcional y/o de otros genes esenciales para la replicación.

Preferiblemente, el vector RRV de la presente invención tiene un genoma viral mínimo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "genoma viral mínimo" significa que el vector viral se ha manipulado para retirar los elementos no esenciales al tiempo que se conservan los elementos esenciales para proporcionar la funcionalidad requerida para infectar, transducir y suministrar un NOI a una célula diana. Pueden encontrarse detalles adicionales de esta estrategia en los documentos WO 1998/17815 y WO 99/32646. Un vector de VAIE mínimo carece de los genes tat, rev y S2 y no se proporciona ninguno de estos genes en trans en el sistema de producción. Un vector de VIH mínimo carece de vif, vpr, vpu, tat y nef (figura 1).

El plásmido de expresión usado para producir el genoma de vector dentro de una célula de producción puede incluir secuencias de control reguladoras de la transcripción operativamente unidas al genoma retroviral para dirigir la transcripción del genoma en una célula de producción/célula de empaquetamiento. Estas secuencias reguladoras pueden ser las secuencias naturales asociadas con la secuencia retroviral transcrita, es decir la región 5' U3, o pueden ser un promotor heterólogo tal como otro promotor viral, por ejemplo el promotor de CMV, tal como se comenta a continuación. Algunos genomas de vector lentiviral requieren secuencias adicionales para una producción eficiente de virus. Por ejemplo, particularmente en el caso de VIH, pueden incluirse secuencias de RRE. Sin embargo, el requisito de RRE (y la dependencia de rev que se proporciona en trans) puede reducirse o eliminarse mediante optimización de codones. Pueden encontrarse detalles adicionales de esta estrategia en el documento WO 2001/79518.

También se conocen secuencias alternativas que realizan la misma función que el sistema de rev/RRE. Por ejemplo, un análogo funcional del sistema de rev/RRE se encuentra en el virus del mono de Mason Pfizer. Esto se conoce como el elemento de transporte constitutivo (CTE) y comprende una secuencia de tipo RRE en el genoma que se cree que interacciona con un factor en la célula infectada. El factor celular puede considerarse como un análogo de rev. Por tanto, puede usarse CTE como alternativa al sistema de rev/RRE. Cualquier otro equivalente funcional de la proteína Rev que se conozca o llegue a estar disponible puede resultar relevante para la invención. Por ejemplo, también se sabe que la proteína Rex de VLTH-I puede sustituir funcionalmente a la proteína Rev de VIH-1. Rev y ^rR^epueden estar ausentes o no ser funcionales en el vector para su uso en los métodos de la presente invención; en la alternativa rev y RRE, o un sistema funcionalmente equivalente, pueden estar presentes.

Tal como se usa en el presente documento, el término "sustituto funcional" significa una proteína o secuencia que tiene una secuencia alternativa que realiza la misma función que otra proteína o secuencia. El término "sustituto funcional" se usa de manera intercambiable con "equivalente funcional" y "análogo funcional" en el presente documento con el mismo significado.

Vectores SIN

Los vectores retrovirales de la divulgación pueden usarse en una configuración autoinactivante (SIN) en la que se han delecionado las secuencias de potenciador y promotor virales. Pueden generarse vectores SIN y transducir células diana que no se dividen in vivo, ex vivo o in vitro con una eficacia similar a la de vectores no SIN. La inactivación de la transcripción de la repetición terminal larga (LTR) en el provirus SIN debe prevenir la movilización por virus competentes para la replicación. Esto también debe permitir la expresión regulada de genes a partir de promotores internos eliminando cualquier efectos de acción en cis de la LTR.

A modo de ejemplo, se han construido sistemas de vectores retrovirales autoinactivantes delecionando los potenciadores de la transcripción o los potenciadores y el promotor en la región U3 de la LTR en 3'. Después de una ronda de transcripción inversa e integración de vector, estos cambios se copian en las LTR tanto en 5' como en 3' produciendo un provirus transcripcionalmente inactivo. Sin embargo, cualquier promotor interno en las LTR en tales vectores todavía será transcripcionalmente activo. Esta estrategia se ha empleado para eliminar efectos de los potenciadores y promotores en las LTR virales sobre la transcripción a partir de genes colocados de manera interna. Tales efectos incluyen un aumento de la transcripción o supresión de la transcripción. Esta estrategia también puede usarse para eliminar la transcripción posterior a partir de la LTR en 3' en el ADN genómico. Esto supone una preocupación particular en la terapia génica en seres humanos, en la que es importante preven

PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90. Se describen vectores lentivirales SIN en los documentos US 6.924.123 y US 7.056.699.

Vectores lentivirales defectuosos para la replicación

En el genoma de un vector lentiviral defectuoso para la replicación las secuencias de gag/poly/o env pueden estar mutadas y/o no ser funcionales.

En un vector lentiviral típico de la presente divulgación, puede eliminarse del vector al menos parte de una o más regiones codificantes para proteínas esenciales para la replicación de virus. Esto hace que el vector viral sea defectuoso para la replicación. También pueden sustituirse porciones del genoma viral por un NOI con el fin de generar un vector que comprende un NOI que puede transducir una célula diana que no se divide y/o integrar su genoma en el genoma de célula diana.

En una realización, los vectores lentivirales son vectores no integrantes tal como se describe en los documentos WO 2006/010834 y WO 2007/071994.

En una realización adicional, los vectores tienen la capacidad de suministrar una secuencia que está libre o carece de ARN viral. En una realización adicional, puede usarse un dominio de unión heterólogo (heterólogo con respecto a gag) ubicado en el ARN que va a suministrarse y un dominio de unión relacionado en Gag o GagPol para garantizar el empaquetamiento del ARN que va a suministrarse. Ambos de estos vectores se describen en el documento WO 2007/072056.

NOI y polinucleótidos

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Un experto en la técnica entenderá que numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar para el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que los expertos, usando técnicas de rutina, pueden realizar sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que van a expresarse los polipéptidos de la invención.

Los polinucleótidos pueden modificarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo con el fin de potenciar la actividad in vivo o vida útil de los polinucleótidos de la invención.

Los polinucleótidos tales como polinucleótidos de ADN pueden producirse de manera recombinante, sintética o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la técnica. También pueden clonarse mediante técnicas convencionales.

Generalmente se producirán polinucleótidos más largos usando medios recombinantes, por ejemplo usando técnicas de clonación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Esto implicará preparar un par de cebadores (por ejemplo, de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean la secuencia diana que se desea clonar, poner los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenido a partir de una célula de animal o humana, realizar PCR en condiciones que provocan la amplificación de la región deseada, aislar el fragmento amplificado (por ejemplo, purificando la mezcla de reacción con un gel de agarosa) y recuperar el ADN amplificado. Los cebadores pueden diseñarse para contener sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados de modo que el ADN amplificado puede clonarse en un vector adecuado.

Proteínas

Tal como se usa en el presente documento, el término "proteína" incluye moléculas de polipéptido de cadena sencilla así como complejos de múltiples polipéptidos en los que polipéptidos constituyentes individuales están unidos mediante medios covalentes o no covalentes. Tal como se usan en el presente documento, los términos "polipéptido" y "péptido" se refieren a un polímero en el que los monómeros son aminoácidos y están unidos entre sí a través de enlaces peptídicos o disulfuro.

Variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos

Además de las proteínas y nucleótidos específicos mencionados en el presente documento, la presente invención también abarca el uso de variantes, derivados, análogos, homólogos y fragmentos de los mismos.

En el contexto de la presente invención, una variante de cualquier secuencia dada es una secuencia en la que la secuencia específica de residuos (ya sean residuos de aminoácido o de ácido nucleico) se ha modificado de tal manera que el polipéptido o polinucleótido en cuestión conserva al menos una de sus funciones endógenas. Una secuencia variante puede obtenerse mediante adición, deleción, sustitución, modificación, remplazo y/o variación de al menos un residuo presente en la proteína que se produce de man

El término "derivado" tal como se usa en el presente documento, en relación con proteínas o polipéptidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, remplazo, deleción y/o adición de uno (o más) residuos de aminoácido a partir de, o a, la secuencia siempre que la proteína o polipéptido resultante conserve al menos una de sus funciones endógenas.

El término "análogo" tal como se usa en el presente documento, en relación con polipéptidos o polinucleótidos, incluye cualquier compuesto mimético, es decir, un compuesto químico que presenta al menos una de las funciones endógenas de los polipéptidos o polinucleótidos que imita.

Normalmente, pueden realizarse sustituciones de aminoácidos, por ejemplo desde 1, 2 o 3 hasta 10 o 20 sustituciones siempre que la secuencia modificada conserve la actividad o capacidad requerida. Las sustituciones de aminoácidos pueden incluir el uso de análogos que no se producen de manera natural.

Las proteínas usadas en la presente invención también pueden tener deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácido que producen un cambio silencioso y dan como resultado una proteína funcionalmente equivalente. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la función endógena. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen índices de hidrofilia similares incluyen asparagina, glutamina, serina, treonina y tirosina.

Pueden realizarse sustituciones conservativas, por ejemplo según la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

El término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con la secuencia de aminoácidos de tipo natural y la secuencia de nucleótidos de tipo natural. El término "homología" puede equipararse a "identidad".

En el presente contexto, se interpreta que una secuencia homóloga incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser idéntica en al menos el 50%, 55%, 65%, 75%, 85% o 90%, preferiblemente idéntica en al menos el 95%, 97 o 99% a la secuencia objeto. Normalmente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc., que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque también puede considerarse la homología en cuanto a similitud (es decir, residuos de aminoácido que tienen propiedades químicas/funciones similares), en el contexto de la presente invención es preferible expresar la homología en cuanto a identidad de secuencia.

En el presente contexto, se interpreta que una secuencia homóloga incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser idéntica en al menos el 50%, 55%, 65%, 75%, 85% o 90%, preferiblemente idéntica en al menos el 95%, 97% o 99% a la secuencia objeto. Aunque también puede considerarse la homología en cuanto a similitud, en el contexto de la presente invención es preferible expresar la homología en cuanto a identidad de secuencia.

Pueden llevarse comparaciones de homología a simple vista o, más habitualmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas informáticos comercialmente disponibles pueden calcular el porcentaje de homología o identidad entre dos o más secuencias.

El porcentaje de homología puede calcularse a lo largo de secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con la otra secuencia y se compara directamente cada aminoácido en una secuencia con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo cada vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos". Normalmente, tales alineaciones sin huecos solo se realizan a lo largo de un número relativamente corto de residuos.

Aunque es un método muy sencillo y sistemático, no logra tener en cuenta que, por ejemplo, en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o deleción en la secuencia de nucleótidos puede provocar que los codones siguientes queden desalineados, dando por tanto posiblemente una gran reducción en el porcentaje de homología cando se realiza una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias están diseñados para producir alineaciones óptimas que tienen en

puntuación de homología global. Esto se logra insertando "huecos" en la alineación de secuencias para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones de hueco" a cada hueco que se produce en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de secuencias con los menos huecos posibles, lo que refleja una relación superior entre las dos secuencias comparadas, logrará una puntuación superior a aquella con muchos huecos. Normalmente se usan "costes de huecos afines" que aplican un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización más pequeña por cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos más habitualmente usado. Evidentemente, las altas penalizaciones de hueco producirán alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones de hueco. Sin embargo, se prefiere usar los valores por defecto cuando se usan tales software para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se usa el paquete de GCG Wisconsin Bestfit, la penalización de hueco por defecto para secuencias de aminoácidos es de -12 por un hueco y -4 por cada extensión.

Por tanto, el cálculo del porcentaje de homología máximo requiere en primer lugar la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones de huecos. Un programa informático adecuado para llevar a cabo una alineación de este tipo es el paquete de GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387). Los ejemplos de otros software que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete BLAS^t(véase Ausubel et al. (1999) citado anteriormente, Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) y la serie G^eNEWORKS de herramientas de comparación. Tanto B^lA^sT como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al. (1999) citado anteriormente, páginas 7-58 a 7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa de GCG Bestfit. También está disponible otra herramienta, denominada BLAST 2 Sequences, para comparar secuencias de proteínas y de nucleótidos (véase FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1):187-8).

Aunque el porcentaje de homología final puede medirse en cuanto a identidad, normalmente el propio procedimiento de alineación no se basa en una comparación de parejas de todo o nada. En vez de eso, generalmente se usa una matriz de puntuación de similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por parejas basándose en similitud química o distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de este tipo habitualmente usada es la matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para la serie de programas BLAST. Los programas de GCG Wisconsin usan generalmente o bien los valores públicos por defecto o bien una tabla de comparación de símbolos personalizada si se suministra (véase el manual de usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete de GCG o, en el caso de otro software, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Una vez que el software ha producido una alineación óptima, es posible calcular el porcentaje de homología, preferiblemente el porcentaje de identidad de secuencia. Habitualmente el software hace esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Los "fragmentos" también son variantes y el término se refiere normalmente a una región seleccionada del polipéptido o polinucleótido que es de interés o bien funcionalmente o bien, por ejemplo, en un ensayo. Por tanto, "fragmento" se refiere a una secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico que es una porción de un polipéptido o polinucleótido de longitud completa.

Tales variantes pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante convencionales tales como mutagénesis dirigida al sitio. Cuando tienen que realizarse inserciones, puede producirse ADN sintético que codifica para la inserción junto con las regiones flanqueantes en 5' y 3' correspondientes a la secuencia que se produce de manera natural a cada lado del sitio de inserción. Las regiones flanqueantes contendrán sitios de restricción convenientes correspondientes a sitios en la secuencia que se produce de manera natural de modo que puede cortarse la secuencia con la(s) enzima(s) apropiada(s) y ligarse el ADN sintético en la rotura. Después se expresa el ADN según la invención para producir la proteína codificada. Estos métodos solo son ilustrativos de las numerosas técnicas convencionales conocidas en la técnica para la manipulación de secuencias de ADN y también pueden usarse otras técnicas conocidas.

Todas las variantes, fragmentos u homólogos de la proteína reguladora adecuados para su uso en las células y/o constructos modulares de la invención conservarán la capacidad de unirse al sitio de unión relacionado del NOI de tal manera que se reprime o se previene la traducción del NOI en una célula de producción de vector viral.

Todas las variantes, fragmentos u homólogos del sitio de unión conservarán la capacidad de unirse a la proteína de unión a ARN relacionada, de tal manera que se reprime o se previene la traducción del NOI en una célula de producción de vector viral.

Optim/zación de codones

Los polinucleótidos usados en la presente invención (incluyendo el NOI y/o componentes del sistema de producción de vector) pueden someterse a optimización de codones. La optimización de codones se ha descrito anteriormente en los documentos WO 1999/41397 y WO 2001/79518. Células diferentes difieren en cuanto a su uso de codones particulares. Este sesgo de codones corresponde a un se

Alterando los codones en la secuencia de modo que se personalicen para corresponder con la abundancia relativa de ARNt correspondientes, es posible aumentar la expresión. Del mismo modo, es posible reducir la expresión eligiendo deliberadamente codones para los que se sabe que los ARNt correspondientes son poco frecuentes en el tipo de célula particular. Por tanto, se dispone de un grado adicional de control de la traducción.

Muchos virus, incluyendo retrovirus, usan un gran número de codones poco frecuentes y, cambiando los mismos para corresponder a codones de mamífero habitualmente usados, pueden lograrse aumentos en la expresión de un gen de interés, por ejemplo un NOI o componentes de empaquetamiento en células de producción de mamífero. En la técnica se conocen tablas de uso de codones para células de mamífero, así como para una variedad de otros organismos.

La optimización de codones de componentes de vectores virales tiene varias otras ventajas. Gracias a alteraciones en sus secuencias, se eliminan secuencias de inestabilidad de ARN (INS) de las secuencias de nucleótidos que codifican para los componentes de empaquetamiento de las partículas virales requeridos para el ensamblaje de partículas virales en las células productoras/células de empaquetamiento. Al mismo tiempo, la secuencia codificante de secuencia de aminoácidos para los componentes de empaquetamiento se conserva de modo que los componentes virales codificados por las secuencias siguen siendo los mismos, o al menos suficientemente similares de modo que la función de los componentes de empaquetamiento no se ve comprometida. En vectores lentivirales, la optimización de codones también supera el requisito de Rev/RRE para la exportación, haciendo que las secuencias optimizadas sean independientes de Rev. La optimización de codones también reduce la recombinación homóloga entre diferentes constructos dentro del sistema de vector (por ejemplo, entre las regiones de solapamiento en los marcos de lectura abiertos de gag-pol y env). Por tanto, el efecto global de la optimización de codones es un aumento notable en el título viral y una seguridad mejorada.

En una realización, solo se someten a optimización de codones los codones relacionados con INS. Sin embargo, en una realización mucho más preferida y práctica, las secuencias se someten a optimización de codones en su totalidad, con algunas excepciones, por ejemplo la secuencia que abarca el sitio de desplazamiento de marco de gag-pol (véase a continuación).

El gen gag-pol de vectores lentivirales comprende dos marcos de lectura solapantes que codifican para las proteínas gagpol. La expresión de ambas proteínas depende de un desplazamiento de marco durante la traducción. Este desplazamiento de marco se produce como resultado de "deslizamiento" de ribosoma durante la traducción. Se piensa que este deslizamiento está provocado, al menos en parte, por estructuras secundarias de ARN de estancamiento de ribosoma. Tales estructuras secundarias existen en el sentido de 3' del sitio de desplazamiento de marco en el gen gagpol. Para VIH, la región de solapamiento se extiende desde el nucleótido 1222 en el sentido de 3' del comienzo de gag (en el que el nucleótido 1 es la A del ATG de gag) hasta el final de gag (nt 1503). Por consiguiente, preferiblemente un fragmento de 281 pb que abarca el sitio de desplazamiento de marco y la región solapante de los dos marcos de lectura no se somete a optimización de codones. Conservar este fragmento permitirá una expresión más eficiente de las proteínas Gag-Pol. Para ^vA ⁱE, se ha interpretado que el comienzo del solapamiento es nt 1262 (en el que el nucleótido 1 es la A del ATG de gag) y el final del solapamiento es nt 1461. Con el fin de garantizar que se conserva el sitio de desplazamiento de marco y el solapamiento de gag-pol, se ha conservado la secuencia de tipo natural desde nt 1156 hasta 1465.

Pueden realizarse derivaciones a partir del uso de codones óptimo, por ejemplo, con el fin de albergar sitios de restricción convenientes, y pueden introducirse cambios de aminoácidos conservativos en las proteínas Gag-Pol.

En una realización, la optimización de codones se basa en genes de mamífero ligeramente expresados. La tercera, y algunas veces la segunda y la tercera, bases pueden cambiarse.

Debido a la naturaleza degenerada del código genético, se apreciará que un experto puede lograr numerosas secuencias de gag-pol. También se describen muchas variantes retrovirales que pueden usarse como punto de partida para generar una secuencia de gag-pol sometida a optimización de codones. Los genomas lentivirales pueden ser bastante variables. Por ejemplo, hay muchas casi especies de VIH-1 que todavía son funcionales. Este también es el caso para VAIE. Estas variantes pueden usarse para potenciar partes particulares del procedimiento de transducción. Pueden encontrarse ejemplos de variantes de VIH-1 en las bases de datos de VIH gestionadas por Los Alamos National Security, LLC en http://hiv-web.lanl.gov. Pueden encontrarse detalles de clones de VAIE en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) que se encuentra en http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

La estrategia para secuencias de gag-pol sometidas a optimización de codones puede usarse en relación con cualquier retrovirus. Esto se aplicará a todos los lentivirus, incluyendo VAIE, VIF, VIB, V^aE^c, VMR, VIS, VIH-1 y VIH-2. Además, este método puede usarse para aumentar la expresión de genes a partir de VLTH-1, VLTH-2, HFV, HSRV y retrovirus endógenos humanos (HERV), VLM y otros retrovirus.

La optimización de codones puede hacer que la expresión de gag-pol se independiente de Rev. Sin embargo, con el fin de permitir el uso de factores anti-rev o r Re en el vector lentiviral, sería necesario hacer que el sistema de generación de vector viral fuera totalmente independiente de Rev/RRE. Por tanto, también se necesita modificar el genoma. Esto se logra optimizando componentes de genoma de vector. Ventajosamente, estas modificaciones también conducen a la producción de un sistema más seguro carente de todas las proteínas adicionales tanto en la célula productora como en la transducida.

Elementos de vectores retrovirales comunes

Promotores y potenciadores

La expresión de un NOI y polinucleótido puede controlarse usando secuencias de control, por ejemplo elementos de regulación de la transcripción o elementos de represión de la traducción, que incluyen promotores, potenciadores y otras señales de regulación de la expresión (por ejemplo, sistema de represor de tet (TetR)) o el sistema de represión de transgén en célula de producción de vector (TRIP) u otros reguladores de NOl descritos en el presente documento.

Pueden usarse promotores procariotas y promotores funcionales en células eucariotas. Pueden usarse promotores específicos de tejido o específicos de estímulos. También pueden usarse promotores quiméricos que comprenden elementos de secuencia de dos o más promotores diferentes.

Las secuencias promotoras adecuadas son promotores fuertes que incluyen los derivados de los genomas de virus, tales como poliomavirus, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV), retrovirus y virus del simio 40 (VS40), o de promotores de mamífero heterólogos, tales como el promotor de actina, EF1a, CAG, TK, VS40, ubiquitina, PGK o promotor de proteína ribosómica. Alternativamente, para impulsar la transcripción pueden usarse promotores específicos de tejido tales como rodopsina (Rho), rodopsina cinasa (RhoK), gen que contiene homeosecuencia de conos y bastones (CRX), proteína de cremallera de leucinas específica de retina neural (NRL), distrofia macular viteliforme 2 (VMD2), tirosina hidroxilasa, promotor de enolasa específica neuronal (NSE), promotor de proteína ácida fibrilar específica de astrocitos (GFAP), promotor de al-antitripsina humana (hAAT), fosfoenolpiruvato carboxicinasa (PEPCK), promotor de proteína de unión a ácidos grasos hepática, promotor de Flt-1, promotor de INF-p, promotor de Mb, promotor de SP-B, promotor de SYN1, promotor de WASP, promotor de VS40 / hAlb, VS40 / CD43, VS40 / CD45, promotor de NSE / RU5', promotor de IC^aM-2, promotor de Gμllb, promotor de GFAP, promotor de fibronectina, promotor de endoglina, promotor de elastasa-1, promotor de desmina, promotor de CD68, promotor de CD14 y promotor de B29.

La transcripción de un NOI puede aumentarse adicionalmente insertando una secuencia de potenciador en el vector. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y de la posición; sin embargo, puede emplearse un potenciador de un virus de célula eucariota, tal como el potenciador de VS40 y el potenciador del promotor temprano de CMV. El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición en 5' o 3' con respecto al promotor, pero está preferiblemente ubicado en un sitio en 5' con respecto al promotor.

El promotor puede incluir adicionalmente características para garantizar o aumentar la expresión en una célula diana adecuada. Por ejemplo, las características pueden ser regiones conservadas, por ejemplo una caja de Pribnow o una caja TATA. El promotor puede contener otras secuencias para afectar (tal como mantener, potenciar o reducir) los niveles de expresión de una secuencia de nucleótidos. Otras secuencias adecuadas incluyen el intrón de Sh1 o un intrón de ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles, tales como elementos inducibles por temperatura, agentes químicos, luz o estrés. Además, pueden estar presentes elementos adecuados para potenciar la transcripción o traducción.

Reguladores de NOl

Un factor que complica la generación de líneas de células de empaquetamiento/productoras de retrovirus y la producción de vectores retrovirales es que la expresión constitutiva de ciertos componentes de vectores retrovirales y NOl es citotóxica, conduciendo a la muerte de células que expresan estos componentes y, por tanto, la incapacidad de producir el vector. Por tanto, debe regularse la expresión de estos componentes (por ejemplo, gag-pol y proteínas de la envuelta tales como VEV-G). La expresión de otros componentes de vector no citotóxicos también puede regularse para minimizar la carga metabólica sobre la célula. Los constructos modulares y/o células de la invención pueden comprender componentes de vector citotóxicos y/o no citotóxicos asociados con al menos un elemento regulador. Tal como se usa en el presente documento, el término "elemento regulador" se refiere a cualquier elemento que puede afectar, o bien aumentando o bien reduciendo, la expresión de un gen o proteína asociado. Un elemento regulador incluye un sistema de conmutación génico, elemento de regulación de la transcripción y elemento de represión de la traducción.

Se han adaptado varios sistemas reguladores procariotas para generar conmutadores génicos en células de mamífero. Se han controlado muchas líneas de células de empaquetamiento y productoras de retrovirus usando sistemas de conmutación génica (por ejemplo, sistemas de conmutación inducibles por tetraciclina y cumato) permitiendo por tanto activar la expresión de uno o más de los componentes de vectores retrovirales en el momento de la producción de vector. Los sistemas de conmutación génica incluyen los del grupo de reguladores de la transcripción de proteína (TetR) (por ejemplo, T-Rex, Tet-On, y Tet-Off), los del grupo de reguladores de la transcripción del sistema de conmutación inducible por cumato (por ejemplo, proteína CymR) y los que implican una proteína de unión a ARN (por ejemplo, TRAP).

Un sistema inducible por tetraciclina de este tipo es el sistema de represor de tetraciclina (TetR) basado en el sistema T-REx™. A modo de ejemplo, en un sistema de este tipo, operadores de tetraciclina (TetO₂) están colocados en una posición de tal manera que el primer nucleótido está a 10 pb desde el extremo 3' del último nucleótido del elemento de TATATAA del promotor temprano inmediato principal de c

represor (Yao F, Svensjo T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. 1998. Hum Gene Ther, 9: 1939-1950). En un sistema de este tipo la expresión del NOI puede controlarse mediante un promotor de CMV en el que se han insertado en tándem dos copias de la secuencia de TetO₂. Los homodímeros de TetR, en ausencia de un agente de inducción (tetraciclina o su análogo doxiciclina [dox]), se unen a las secuencias de TetO₂y bloquean físicamente la transcripción a partir del promotor de CMV en el sentido de 5'. Cuando está presente, el agente de inducción se une a los homodímeros de TetR, provocando cambios alostéricos de tal manera que ya no pueden unirse a las secuencias de TetO₂, dando como resultado la expresión génica. El gen de TetR usado en los ejemplos dados a conocer en el presente documento se ha sometido a optimización de codones ya que se encontró que esto mejoraba la eficiencia de traducción dando como resultado un control más estrecho de la expresión génica controlada por TetO₂.

El sistema de TRiP se describe en el documento WO 2015/092440 y proporciona otra manera de reprimir la expresión del NOI en las células de producción durante la producción de vector. La interacción TRAP-secuencia de unión (por ejemplo, TRAP-tbs) forma la base para un sistema de represión de proteína transgénica para la producción de vectores retrovirales, cuando es deseable un promotor constitutivo y/o fuerte, incluyendo un promotor específico de tejido, que impulsa el transgén, y particularmente cuando la expresión de la proteína transgénica en células de producción conduce a la reducción de títulos de vector y/o provoca una respuesta inmunitaria in vivo debido al suministro por el vector viral de proteína derivada de transgén (Maunder et al, Nat Commun. (2017), 27 de marzo; 8).

En resumen, la interacción de TRAP-tbs forma un bloque de traducción, que representa la traducción de la proteína transgénica (Maunder et al, Nat Commun. (2017), 27 de marzo; 8). El bloque de traducción solo es eficaz en células de producción y, como tal, no obstaculiza los sistemas de vectores basados en ADN o ARN. El sistema de TRiP puede reprimir la traducción cuando la proteína transgénica se expresa a partir de un promotor constitutivo y/o fuerte, incluyendo un promotor específico de tejido a partir de ARNm de un único o de múltiples cistrones. Se ha demostrado que la expresión no regulada de proteína transgénica puede reducir los títulos de vector y afectar a la calidad de producto de vector. La represión de proteína transgénica para sistemas de producción de vector de PaCL/PCL tanto transitorios como estables resulta beneficiosa para células de producción para prevenir una reducción de los títulos de vector: cuando cuestiones de toxicidad o carga molecular pueden conducir a estrés celular; cuando la proteína transgénica provoca una respuesta inmunitaria in vivo debido al suministro por el vector viral de proteína derivada de transgén; cuando el uso de transgenes de edición génica puede dar como resultado efectos intencionados/no intencionados; cuando la proteína transgénica puede afectar al vector y/o exclusión de glicoproteína de la envuelta.

Envuelta y pseudotipado

En un aspecto preferido, se ha pseudotipado el vector retroviral de la presente divulgación. Con respecto a esto, el pseudotipado puede conferir una o más ventajas. Por ejemplo, el producto génico de env de los vectores basados en VIH restringirá estos vectores a infectar únicamente células que expresan una proteína denominada CD4. Pero si el gen env en estos vectores se ha sustituido por secuencias de env de otros virus con envuelta, entonces pueden tener un espectro infeccioso más amplio (Verma y Somia (1997) Nature 389(6648):239-242). A modo de ejemplo, algunos trabajadores han pseudotipado un vector basado en VIH con la glicoproteína de V^eV (Verma y Somia (1997) Nature 389(6648):239-242).

En otra alternativa, la proteína Env puede ser una proteína Env modificada tal como una proteína Env mutante o modificada por ingeniería. Pueden realizarse o seleccionarse modificaciones para introducir capacidad de direccionamiento o para reducir la toxicidad o con otro fin (Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64; Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286; y Fielding et al (1998) Blood 91(5):1802-1809 y referencias citadas en los mismos).

Puede pseudotiparse el vector con cualquier molécula de elección.

Tal como se usa en el presente documento, "env" significará una envuelta lentiviral endógena o una envuelta heteróloga, tal como se describe en el presente documento.

VEV-G

La glicoproteína de la envuelta (G) del virus de la estomatitis vesicular (VEV), un rabdovirus, es una proteína de la envuelta que se ha mostrado que puede pseudotipar determinados virus con envuelta y viriones de vectores virales.

Su capacidad para pseudotipar vectores retrovirales basados en VLMMo en ausencia de cualquier proteína de la envuelta retroviral se mostró por primera vez por Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207). El docum ento WO 1994/294440 enseña que pueden pseudotiparse satisfactoriamente vectores retrovirales con VEV-G. Estos vectores de VEV-G pseudotipados pueden usarse para transducir una amplia gama de células de mamífero. Más recientemente, Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361 enseñan que puede hacerse que partículas retrovirales no infecciosas se vuelvan infecciosas mediante la adición de VEV-G.

Burns et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7) pseudotiparon satisfactoriamente el retrovirus VLM con VEV-G y esto dio como resultado un vector que tiene una gama de huéspedes alterada en comparación con VLM en su forma nativa. Se ha mostrado que los vectores pseudotipados con VEV-G infectan no solo células de mamífero, sino también líneas celulares derivadas de peces, reptiles e insectos (Burns et al. (1993) citado anteriormente). También se ha mostrado que son más eficientes que las envueltas anfotrópicas tradicionales para una variedad de líneas celulares (Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568, Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207). Puede usarse proteína VEV-G para pseudotipar ciertos retrovirus porque su cola citoplasmática puede interaccionar con los núcleos retrovirales.

Proporcionar una envuelta de pseudotipado no retroviral tal como proteína VEV-G da la ventaja de que pueden concentrarse partículas de vector hasta un alto título sin pérdida de infectividad (Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5). Aparentemente, las proteínas de la envuelta de retrovirus no pueden resistir las fuerzas de cizalladura durante la ultracentrifugación, probablemente porque consisten en dos subunidades unidas mediante enlaces no covalentes. La interacción entre las subunidades puede perturbarse por la centrifugación. En comparación, la glicoproteína de VEV está compuesta por una única unidad. Por tanto, el pseudotipado con proteína VEV-G puede ofrecer posibles ventajas tanto para una infección/transducción de células diana eficiente como durante procedimientos de fabricación.

El docum ento WO 2000/52188 describe la generación de vectores retrovirales pseudotipados, a partir de líneas de células productoras estables, que tienen proteína G de virus de la estomatitis vesicular (VEV-G) como proteína de la envuelta viral asociada a membrana, y proporciona una secuencia génica para la proteína VEV-G.

Virus del río Ross

Se ha usado la envuelta de virus del río Ross para pseudotipar un vector lentiviral no de primate (VIF) y, tras la administración sistémica, se transdujo predominantemente en el hígado (Kang et al (2002) J Virol 76(18):9378-9388). Se notificó que la eficiencia era 20 veces mayor que la obtenida con vector pseudotipado con VEV-G y provocó menos citotoxicidad tal como se mide mediante niveles en suero de enzimas hepáticas que sugieren hepatotoxicidad.

GP64 de baculovirus

Se ha mostrado que la proteína GP64 de baculovirus es una alternativa a VEV-G para vectores virales usados en la producción a gran escala de virus de alto título requeridos para aplicaciones clínicas y comerciales (Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J (2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77). En comparación con vectores pseudotipados con VEV-G, los vectores pseudotipados con GP64 tienen un amplio tropismo similar y títulos nativos similares. Dado que la expresión de GP64 no destruye a las células, pueden generarse líneas celulares basadas en HEK₂93T que expresan GP64 de manera constitutiva.

Envueltas alternativas

Otras envueltas que proporcionan un título razonable cuando se usan para pseudotipar VAIE incluyen Mokola, Rabia, Ébola y VCML (virus de la coriomeningitis linfocítica). La infusión intravenosa en ratones de lentivirus pseudotipados con 4070A condujo a una expresión génica máxima en el hígado.

Secuencia de empaquetamiento

Tal como se usa en el contexto de la presente invención, el término "señal de empaquetamiento", que se denomina de manera intercambiable "secuencia de empaquetamiento" o "psi", se usa haciendo referencia a la secuencia no codificante que actúa en cis requerida para la encapsidación de cadenas de ARN retroviral durante la formación de partículas virales. En VIH-1, se ha mapeado esta secuencia a loci que se extienden desde el sentido de 5' del sitio donador de corte y empalme principal (SD) hasta al menos el codón de iniciación de gag. En VAIE, la señal de empaquetamiento comprende la región R en la región codificante en 5' de Gag.

Tal como se usa en el presente documento, el término "señal de empaquetamiento extendida" o "secuencia de empaquetamiento extendida" se refiere al uso de secuencias alrededor de la secuencia psi con extensión adicional al gen gag. La inclusión de estas secuencias de empaquetamiento adicionales puede aumentar la eficiencia de la inserción de ARN de vector en partículas virales.

Se ha mostrado que determinantes de encapsidación de ARN de virus de inmunodeficiencia felino (VIF) son discretos y no continuos, comprendiendo una región en el extremo 5' del ARNm genómico (R-U5) y otra región que se mapea dentro de los 311 nt proximales de gag (Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995).

Sitio de entrada al ribosoma interno (IRES)

La inserción de elementos de IRES permite la expresión de múltiples regiones codificantes a partir de un único promotor (Adam et al (como anteriormente); Koo et al (1992) Virology 186:669-675; Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148). Los elementos de IRES se encontraron por primera vez en los extremos 5' no traducidos de picornavirus en los que fomentan la traducción independiente de la caperuza de proteínas virales (Jang et al (1990) Enzyme 44: 292-309) Cuando están ubicados entre marcos de lectura abiertos en un ARN, los elementos de IRES permiten una traducción eficiente del marco de lectura abierto en el sentido de 3' fomentando la entrada del ribosoma en el elemento de IRES seguido por el inicio de la traducción en el sentido de 3'.

Se presenta una revisión sobre IRES por Mountford y Smith (TIG, mayo de 1995, vol. 11, n.° 5:179-184). Se conocen varias secuencias de IRES diferentes incluyendo aquellas a partir de virus de encefalomiocarditis (VEMC) (Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991); proteína BiP [Macejak y Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; el gen de Antennapedia de Drosophila (exones d y e) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)] así como aquellos en el poliovirus (PV) [Pelletier y Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); véase también Mountford y Smith, TIG 11, 179-184 (1985)].

Anteriormente se han usado elementos de IRES a partir de PV, VEMC y virus de la enfermedad vesicular porcina en vectores retrovirales (Coffin et al, véase anteriormente).

El término "IRES" incluye cualquier secuencia o combinación de secuencias que funcione como, o mejore la función de, un IRES. El/los IRES puede(n) ser de origen viral (tales como IRES de VEMC, IRES de PV o secuencias de tipo FMDV 2A) o de origen celular (tales como IRES de FGF2, IRES de NRF, IRES de Notch 2 o IRES de EIF4).

Con el fin de que el IRES pueda iniciar la traducción de cada polinucleótido debe estar ubicado entre o antes de los polinucleótidos en el constructo modular.

Los constructos modulares usados para el desarrollo de líneas celulares estables requieren la adición de marcadores seleccionables para la selección de células en las que se ha producido una integración estable. Estos marcadores seleccionables pueden expresarse como una única unidad de transcripción dentro del constructo modular o puede se preferible usar elementos de IRES para iniciar la traducción del marcador seleccionable en un mensaje policistrónico (Adam et al 1991 J.Virol. 65, 4985). En esta invención, se diseñaron varios de los constructos modulares de tal manera que el marcador seleccionable estaba colocado en el sentido de 3' de uno de los componentes de vectores retrovirales usando un elemento de IRES.

Orientación genética y elementos de aislamiento

Se sabe que los ácidos nucleicos son direccionales y, en última instancia, esto afecta a mecanismos tales como transcripción y replicación en la célula. Por tanto, los genes pueden tener orientaciones relativas unos con respecto a otros cuando forman parte del mismo constructo de ácido nucleico.

En determinadas realizaciones de la presente invención, las al menos dos secuencias de ácido nucleico presentes en el mismo locus en la célula o constructo pueden estar en orientaciones inversas y/o alternantes. Dicho de otro modo, en determinadas realizaciones de la invención, en este locus particular, el par de genes secuenciales no tendrán la misma orientación.

Los inventores han mostrado que tener orientaciones alternantes beneficia a la producción de vector retroviral cuando los ácidos nucleicos requeridos para la producción de vector se basan en el mismo locus genético dentro de la célula huésped. Esto puede ayudar a prevenir la translectura tanto transcripcional como traduccional cuando se expresa la región dentro de la misma ubicación física de la célula huésped.

A su vez, esto también puede mejorar la seguridad de los constructos resultantes para prevenir la generación de vectores retrovirales competentes para la replicación.

Los inventores también han encontrado que, cuando las secuencias de ácido nucleico están en orientaciones inversas y/o alternantes, el uso de elementos de aislamiento puede prevenir la expresión o el silenciamiento inapropiados de un NOI a partir de su entorno genético.

El término "elemento de aislamiento" se refiere a una clase de elementos de secuencia de ADN que, cuando se unen a proteínas de unión a elementos de aislamiento presentan una capacidad para proteger a genes frente a señales reguladoras circundantes. Hay dos tipos de elementos de aislamiento: una función de bloqueo de potenciador y una función de barrera de cromatina. Cuando un elemento de aislamiento está situado entre un promotor y un potenciador, la función de bloqueo de potenciador del elemento de aislamiento protege al promotor frente a la influencia de potenciación de la transcripción del potenciador (Geyer y Corces 1992; Kellum y Schedl 1992). Los elementos de aislamiento de barrera de cromatina funcionan previniendo el avance de cromatina condensada cercana que conduciría a que una región de cromatina transcripcionalmente activa se convierta en una región de cromatina transcripcionalmente inactiva y dando como resultado el silenciamiento de la expresión génica. Los elementos de aislamiento que inhiben la dispersión de heterocromatina y, por tanto, el silenciamiento génico, reclutan enzimas que participan en modificaciones de histona para prevenir este proceso (Yang J, Corces VG. Chromatin Insulators: A Role in Nuclear Organization and Gene Expression. Advances in cancer research. 2011;110:43-76. doi: 10.1016/B978-0-12-386469-7.00003-7; Huang, Li et al. 2007; Dhillon, Raab et al. 2009). Un elemento de aislamiento puede tener una o ambas de estas funciones y el elemento de aislamiento de p-globina de pollo (cHS4) es un ejemplo de

vertebrado más extensamente estudiado, es altamente rico en G+C y tiene funciones tanto de bloqueo de potenciador como de barrera heterocromática (Chung J H, Whitely M, Felsenfeld G. Cell. 1993;74:505-514). Otros elementos de aislamiento de este tipo con funciones de bloqueo de potenciador no están limitados a, pero incluyen, los siguientes: elemento de aislamiento de p-globina humano 5 (HS5), elemento de aislamiento de p-globina humano 1 (HS1), y elemento de aislamiento de p-globina de pollo (cHS3) (Farrell CM1, West AG, Felsenfeld G., Mol Cell Biol., junio de 2002; 22(11):3820-31; J Ellis et al. EM^bO J.,1 de febrero de 1996; 15(3): 562-568). Además de reducir las interacciones distales no deseadas, los elementos de aislamiento también ayudan a prevenir la interferencia del promotor (es decir, cuando el promotor de una unidad de transcripción afecta a la expresión de una unidad de transcripción adyacente) entre secuencias de ácido nucleico retrovirales adyacentes. Si los elementos de aislamiento se usan entre cada una de las secuencias de ácido nucleico de vector retroviral, entonces la reducción de translectura directa ayudará a prevenir la formación de partículas de vector retroviral competentes para la replicación.

En una realización, el elemento de aislamiento está presente entre cada una de las secuencias de ácido nucleico retrovirales. En una realización, el uso de elementos de aislamiento evita que interacciones de promotor-potenciador a partir de un casete de expresión de NOI interaccionen con otro casete de expresión de NOI en un constructo modular.

En una realización preferida, un elemento de aislamiento está presente entre el genoma de vector y las secuencias de gagpol. Por tanto, esto limita la probabilidad de la producción de un vector retroviral competente para la replicación y transcritos de ARN de "tipo natural", mejorando el perfil de seguridad del constructo. El uso de elementos de aislamiento para mejorar la expresión de vectores de múltiples genes integrados de manera estable se menciona en Moriarity et al (Modular assembly of transposon integratable multigene vectors using RecWay assembly, Nucleic Acids Res., abril de 2013; 41(8):e92).

Título de vector

El experto entenderá que hay varios métodos diferentes de determinación del título de vectores retrovirales. El título se describe con frecuencia como unidades de transducción/ml (UT/ml). El título puede aumentarse aumentando el número de partículas de vector y aumentando la actividad específica de una preparación de vector.

Constructos modulares

La presente divulgación también se refiere a constructos de ácido nucleico modulares (constructos modulares). Un constructo modular es un constructo de expresión de ADN que comprende dos o más ácidos nucleicos usados en la producción de vectores retrovirales. Un constructo modular puede ser un plásmido de ADN que comprende dos o más ácidos nucleicos usados en la producción de vectores retrovirales. Los ácidos nucleicos pueden codificar, por ejemplo, para gag-pol, rev, env, genoma de vector. Además, puede necesitarse adicionalmente que los constructos modulares diseñados para la generación de líneas de células de empaquetamiento y productoras codifiquen para proteínas reguladoras de la transcripción (por ejemplo, TetR, CymR) y/o proteínas de represión de la traducción (por ejemplo, TRAP) y marcadores seleccionables (por ejemplo, Zeocin™, genes de resistencia a higromicina, blasticidina, puromicina, neomicina).

El constructo de expresión de ADN puede ser un plásmido de ADN (superenrollado, mellado o linealizado), ADN de minicírculo (lineal o superenrollado), ADN de plásmido que contiene únicamente las regiones de interés mediante eliminación de la estructura principal de plásmido mediante digestión con enzimas de restricción y purificación, ADN generado usando una plataforma de amplificación de ADN enzimática, por ejemplo ADN de hueso de perro (dbDNA™) en el que el ADN final usado está en una forma ligada cerrada o en el que se ha preparado (por ejemplo, digestión con enzimas de restricción) para tener extremos cortados abiertos.

Tal como se describe en el presente documento, los métodos actuales para la producción de vector retroviral usan constructos genéticos en los que se introducen genes esenciales para la producción retroviral en una célula huésped en plásmidos independientes mediante métodos de transfección transitoria. Esto puede crear variación entre lotes y aumenta adicionalmente el coste debido a los plásmidos y agentes de transfección caros. Usando los constructos modulares de la presente divulgación, se reduce el número de plásmidos que se necesitan en el procedimiento de transfección, reduciendo por tanto la carga sobre el trabajo y el coste de material.

El uso de tales constructos modulares también puede ayudar en la producción de líneas de células de empaquetamiento y productoras eficientes. En particular, introducir dos o más genes de vectores retrovirales en un constructo modular reducirá posteriormente el número de transfecciones/transducciones estables, integraciones y etapas de selección requeridas con el fin de crear la célula de empaquetamiento/productora final.

En particular, ha resultado sorprendente encontrar que los plásmidos bacterianos pueden realizar esta función, ya que generalmente se cree que los grandes genes implicados no permitirían incorporar de manera estable múltiples genes en un plásmido bacteriano.

Según la presente invención, las líneas celulares estables (de empaquetamiento o productoras) para producir los vectores retrovirales comprenden al menos dos de los g

indica combinaciones de ejemplo de ácidos nucleicos que pueden estar ubicados en el mismo locus en células de producción de vectores estables de la presente invención y que se expresan a partir de un único constructo modular. También se menciona el orden de cada ácido nucleico componente. El asterisco (*) indica combinaciones que serán adecuadas para la producción de vectores retrovirales basados en VAIE, ya que Rev no es un componente esencial para tales vectores. El doble asterisco (**) indica combinaciones que están asociadas con un elemento regulador o están en orientaciones inversas y/o alternantes en el vector.

En una realización de la presente invención, la célula o vector de la presente invención no contiene una secuencia de origen de replicación derivada de un PAC, BAC, YAC, cósmido o fósmido. PAC, BAC, YAC, cósmido y fósmidos son vectores de ácido nucleico artificialmente generados diseñados para contener grandes cantidades de ADN. Por tanto, sus secuencias principales se conocen bien y están definidas en la técnica.

Células y sistemas de producción de vectores retrovirales

En el presente documento se describe un sistema de producción de vector retroviral que comprende un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican para los componentes requeridos para la producción del vector retroviral.

El "sistema de producción de vector viral" o "sistema de producción de vector" o "sistema de producción" debe entenderse como un sistema que comprende los componentes necesarios para la producción de vector retroviral.

Por consiguiente, el sistema de producción de vector comprende un conjunto de secuencias de ácido nucleico que codifican para los componentes necesarios para generar partículas de vector retroviral.

En el presente documento se describe el sistema de producción de vector viral que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas Gag y Gag/Pol, y proteína Env del mismo y la secuencia de genoma de vector. El sistema de producción puede comprender opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína Rev o un sustituto funcional de la misma.

En una realización, el vector retroviral se deriva a partir de un lentivirus. En otra realización, el vector retroviral se deriva a partir de VIH-1, VIH-2, VIS, VIF, VIB, VAIE, VAEC o lentivirus Visna. En el presente documento se describe un conjunto de constructos de ADN para su uso en el sistema de producción de vector retroviral de la invención que comprende los constructos modulares de la invención. En el presente documento se describe el conjunto de constructos de ADN que comprende adicionalmente un constructo de ADN que codifica para proteína Rev o un sustituto funcional de la misma.

En el presente documento se describe una célula de producción de vector retroviral que comprende la secuencia de ácido nucleico, el sistema de producción de vector viral, o algunos o la totalidad de los constructos modulares de la invención.

Una "célula de producción de vector viral", "célula de producción de vector" o "célula de producción" debe entenderse como una célula que puede producir un vector retroviral o partícula de vector retroviral. Las células de producción de vectores retrovirales pueden ser "células produ

del sistema de vector viral pueden o bien integrarse de manera estable o bien mantenerse de manera episomal dentro de la célula de producción de vector viral. Alternativamente, todos los componentes de ADN del sistema de vector viral pueden transfectarse de manera transitoria en la célula de producción de vector viral. En aún otra alternativa, una célula de producción que expresa de manera estable algunos de los componentes puede transfectarse de manera transitoria con los componentes restantes requeridos para la producción de vector.

Tal como se usa en el presente documento, el término "célula de empaquetamiento" se refiere a una célula que contiene los elementos necesarios para la producción de partículas de vector retroviral pero que carece del genoma de vector. Opcionalmente, tales células de empaquetamiento contienen uno o más casetes de expresión que pueden expresar proteínas estructurales virales (tales como gag, gag/poly env).

Las células productoras/células de empaquetamiento pueden ser de cualquier tipo de célula adecuado. Las células productoras son generalmente células de mamífero, pero pueden ser, por ejemplo, células de insecto.

Tal como se usa en el presente documento, el término "célula productora/de producción" o "célula productora/de producción de vector" se refiere a una célula que contiene todos los elementos necesarios para la producción de partículas de vector retroviral. La célula productora puede ser o bien una línea de células productoras estable o bien derivarse de manera transitoria o puede ser una célula de empaquetamiento estable en la que el genoma retroviral se expresa de manera transitoria.

Las células de producción de vectores pueden ser células cultivadas in vitro tales como una línea celular de cultivo tisular. Las líneas celulares adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblastos murinos o líneas celulares humanas. Preferiblemente, las células de producción de vectores se derivan de una línea celular humana.

Células y métodos de producción

Otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para producir vectores retrovirales que comprende introducir las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento en una célula (por ejemplo, una célula huésped) y cultivar la célula en condiciones adecuadas para la producción de los vectores retrovirales.

En el presente documento se describe un método para generar una célula de producción para producir vectores retrovirales, que comprende las etapas de:

2.

3. y

4.

5. b) opcionalmente seleccionar una célula de mamífero que tiene las al menos dos secuencias de ácido nucleico integradas dentro de su genoma.

6.

En el presente documento se describe un método para generar una célula estable para producir vectores retrovirales, que comprende las etapas de:

2.

3. y

4.

5. b) seleccionar una célula de mamífero que tiene las al menos dos secuencias de ácido nucleico integradas dentro de su genoma.

6.

2.

4.

6.

7. d) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación;

8.

9. y opcionalmente

10.

11. e) aislar el vector retroviral defectuoso para la replicación.

12.

2.

4.

6.

y opcionalmente d) aislar el vector retroviral defectuoso para la replicación.

Las células de producción adecuadas son aquellas células que pueden producir vectores virales o partículas de vector viral cuando se cultivan en condiciones apropiadas. Generalmente son células de mamífero o humanas, por ejemplo células HEK₂93T, HEK₂93, CAP, CAP-T o CHO, pero pueden ser, por ejemplo, células de insecto tales como células SF9.

En la célula se conocen bien métodos para introducir ácidos nucleicos en células de producción y se han descrito anteriormente.

Las células estables pueden ser células de empaquetamiento o productoras. Para generar células productoras a partir de células de empaquetamiento, pude introducirse el constructo de ADN de genoma de vector de manera estable o transitoria. Pueden generarse células de empaquetamiento/productoras mediante transducción de una línea celular adecuada con un vector retroviral que expresa uno de los componentes de la célula de empaquetamiento/productora, es decir un genoma, los componentes de gag-pol y una envuelta tal como se describe en el documento WO 2004/022761.

Alternativamente, el ácido nucleico puede transfectarse en células y después la integración en el genoma de célula de producción se produce de manera poco frecuente y aleatoria. Los métodos de transfección pueden realizarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de transfección puede realizarse usando fosfato de calcio o formulaciones comercialmente disponibles tales como Lipofectamine™ 2000CD (Invitrogen, CA), FuGENE® HD o polietilenimina (PEI). Alternativamente, pueden introducirse constructos modulares de la invención en la célula de producción mediante electroporación. El experto conocerá métodos para fomentar la integración de los ácidos nucleicos en células de producción. Por ejemplo, la linealización de un constructo de ácido nucleico puede ayudar si de manera natural es circular. Metodologías de integración menos aleatorias pueden implicar que el constructo de ácido nucleico comprenda zonas de homología compartida con los cromosomas endógenos de la célula huésped de mamífero para guiar la integración a un sitio seleccionado dentro del genoma endógeno. Además, si están presentes sitios de recombinación en el constructo, entonces pueden usarse para una recombinación dirigida. Por ejemplo, el constructo de ácido nucleico puede contener un sitio de loxP que permite la integración dirigida cuando se combina con recombinasa Cre (es decir, usando el sistema de Crellox derivado de bacteriófago P1). Alternativa o adicionalmente, el sitio de recombinación es un sitio de att (por ejemplo, de fago A), en el que el sitio de att permite la integración dirigida al sitio en presencia de una integrasa lambda. Esto permitirá dirigir los genes retrovirales a un locus dentro del genoma de célula huésped lo cual permite una expresión alta y/o estable.

En la técnica se conocen bien otros métodos de integración dirigida. Por ejemplo, pueden usarse métodos de inducir la escisión dirigida de ADN genómi

métodos implican con frecuencia el uso de métodos o sistemas para inducir una rotura de doble cadena (DSB), por ejemplo una mella en el genoma endógeno, para inducir una reparación de la rotura mediante mecanismos fisiológicos tales como unión de extremos no homólogos (NHEJ). Puede producirse escisión mediante el uso de nucleasas específicas tales como nucleasas de dedos de cinc (ZFN) modificadas por ingeniería, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), usando sistemas de CRISPR/Cas9 con un ARNcr/ARNtracr modificado por ingeniería ("ARN de guía único") para guiar la escisión específica y/o usando nucleasas basadas en el sistema de Argonaute (por ejemplo, de T. thermophilus).

Pueden generarse líneas de células de empaquetamiento/productoras mediante integración de ácidos nucleicos usando métodos simplemente de transducción retroviral o simplemente de transfección de ácido nucleico, o puede usarse una combinación de ambos.

Se describen métodos para generar vectores retrovirales a partir de células de producción y, en particular el procesamiento de vectores retrovirales, en el documento WO 2009/153563.

En una realización, la célula de producción puede comprender la proteína de unión a ARN (por ejemplo, proteína de atenuación de la unión a ARN de triptófano, TRAP) y/o la proteína represora de Tet (TetR) o proteínas reguladoras alternativas (por ejemplo, CymR).

La producción de vector retroviral a partir de células de producción puede realizarse mediante métodos de transfección, a partir de la producción de líneas celulares estables que pueden incluir etapas de inducción (por ejemplo, inducción por doxiciclina) o mediante una combinación de ambos. Los métodos de transfección pueden realizarse usando métodos bien conocidos en la técnica, y anteriormente se han descrito ejemplos.

Se cultivan células de producción, líneas de células o bien de empaquetamiento o bien productoras o aquellas transfectadas de manera transitoria con los componentes que codifican para vector retroviral para aumentar los números de células y virus y/o los títulos de virus. El cultivo de una célula se realiza para permitirle metabolizar y/o crecer y/o dividirse y/o producir vectores virales de interés según la invención. Esto puede lograrse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, e incluye, pero no se limita a, proporcionar nutrientes para la célula, por ejemplo en los medios de cultivo apropiados. Los métodos pueden comprender el crecimiento adherido a superficies, crecimiento en suspensión o combinaciones de los mismos. El cultivo puede realizarse, por ejemplo, en matraces de cultivo tisular, placas de múltiples pocillos de cultivo tisular, placas de cultivo, frascos rotativos, bolsas Wave o en biorreactores, usando sistemas discontinuos, semicontinuos, continuos y similares. Con el fin de lograr la producción de vector viral a gran escala mediante cultivo celular, en la técnica se prefiere tener células que puedan crecer en suspensión. Se conocen condiciones adecuadas para cultivar células (véase, por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editores (1973), y R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, cuarta edición (Wiley- Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

Preferiblemente, inicialmente se "acumulan" células en matraces de cultivo tisular o biorreactores y posteriormente se hacen crecer en recipientes de cultivo de múltiples capas o grandes biorreactores (más de 50 l) para generar las células de producción de vector de la presente invención.

Preferiblemente, se hacen crecer células en modo adherente para generar las células de producción de vector de la presente invención.

Preferiblemente, se hacen crecer células en un modo en suspensión para generar las células de producción de vector de la presente invención.

Uso

En el presente documento se describe el uso del vector retroviral de la divulgación, una célula de producción de la divulgación o una célula o tejido transducido con el vector retroviral de la divulgación, para la preparación de un medicamento para suministrar un nucleótido de interés a un sitio diana que necesita el mismo. Tales usos del vector retroviral o la célula transducida de la divulgación pueden ser con fines terapéuticos o de diagnóstico, tal como se describió anteriormente.

En el presente documento se describe una célula transducida mediante el vector retroviral de la divulgación.

Una "célula transducida mediante una partícula de vector viral" debe entenderse como una célula, en particular una célula diana, en la que se ha transferido el ácido nucleico portado por la partícula de vector viral.

Composiciones farmacéuticas

En el presente documento se describe una composición farmacéutica que comprende el vector retroviral de la divulgación o una célula o tejido transducido con el vector viral de la divulgación, en combinación con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe una composición farmacéutica para tratar a un individuo mediante terapia génica, en la que la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un vector retroviral. La composición farmacéutica puede ser para uso en seres humanos o animales.

La composición puede comprender un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico puede realizarse teniendo en cuenta la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convenciona

además del portador, excipiente o diluyente, cualquier aglutinante, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuados y otros agentes portadores que pueden ayudar o aumentar la entrada de vector en el sitio diana (tales como, por ejemplo, un sistema de suministro de lípidos).

Cuando sea apropiado, la composición puede administrarse mediante uno cualquiera o más de inhalación; en forma de un supositorio u óvulo vaginal; por vía tópica en forma de una loción, disolución, crema, pomada o polvo para espolvorear; mediante el uso de un parche cutáneo; por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos o bien solos o bien en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes aromatizantes o colorantes; o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo por vía intracavernosa, intravenosa, intramuscular, intracraneal, intraocular, intraperitoneal o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos como para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar que pueden formularse de una manera convencional.

El vector retroviral de la divulgación también puede usarse para transducir células diana o tejido diana ex vivo antes de la transferencia de dicha célula o tejido diana al interior de un paciente que lo necesita. Un ejemplo de tal célula puede ser células T autólogas y un ejemplo de tal tejido puede ser una córnea de donante.

Ahora se describirán diversas características y realizaciones preferidas de la presente invención a modo de ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS

La célula HEK₂93T.TetR14, usada en los estudios descritos en los siguientes ejemplos, expresa de manera constitutiva la proteína represora de tetraciclina (TetR). Dado que se ha implicado la expresión de gagpol de VIH-1 y VEV-G como que son tóxicas para las células, los constructos de expresión para estas proteínas incluyen el promotor de hCMV en el que se han insertado en tándem dos copias de la secuencia de TetO₂. TetR se une a las secuencias de TetO₂y evita que se produzca la transcripción en las células HEK₂93T.TetR14. Cuando se requiere la expresión de los genes, pueden inducirse mediante la adición de doxiciclina o tetraciclina a las células. Estos agentes de inducción se unen a los homodímeros de TetR, lo que provoca cambios alostéricos de tal manera que ya no pueden unirse a las secuencias de TetO₂y la expresión génica puede avanzar sin impedimentos.

Ejemplo 1 - Evaluación de un plásmido modular transitorio completo

Se generó un vector de VIH-1-GFP en células HEK₂93T.TetR14 (que expresan de manera constitutiva la proteína TetR) usando los constructos de ADN modulares completos (pOXB_Transient_Modular) que se muestran en la figura 2, o mediante el procedimiento de co-transfección transitoria convencional usando un plásmido de genoma de GFP de VIH-1 y tres plásmidos de componentes de empaquetamiento inducibles (figura 1). El procedimiento de co-transfección transitoria convencional generó vector con un título de FACS de GFP promedio de 8,7E+05 UT/ml. Cuando usó el plásmido modular transitorio completo, se generó vector con un título promedio de 3,5E+05 UT/ml, lo cual es tan solo 2,5 menor que el procedimiento de co-transfección transitoria convencional (figura 3). Estos resultados sugieren que los títulos de vector producidos usando el sistema de transfección transitoria de múltiples componentes o el plásmido modular transitorio son sorprendentemente similares.

El análisis de PERT de vector generado a partir de la recogida 2 se normalizó con respecto al título convencional de referencia conocido generando de ese modo un título predicho de PERT (UT/ml). Los títulos predichos de PERT a partir de vector generado usando el constructo de ADN modular completo (pOXB_Transient_Modular) demostraron títulos predichos de PERT comparables a los obtenidos a partir de vector generado usando el procedimiento de transfección transitoria convencional (solo 1,1 veces menor) (figura 3). Además de estos experimentos, el análisis de proteínas mediante inmunotransferencia de tipo Western de las células tras la producción a partir de ambos sistemas reveló resultados compatibles con respecto a los obtenidos mediante análisis tanto de FACS de GFP como de PERT observándose un nivel similar de expresión de proteína GFP y un aumento del 36% en los niveles de expresión de proteína VEV-G (figura 4).

Tomados en conjunto, estos resultados indicaron sorprendentemente que el constructo pOXB_Transient_Modular funciona a una capacidad similar a cuando se transfectan conjuntamente los 4 plásmidos de componentes de vectores individuales. Como tal, puede usarse el constructo modular completo para optimizar el procedimiento de transfección transitoria, reduciendo los costes de producción de plásmidos y posiblemente reduciendo los requisitos de reactivo de transfección del sistema.

Ejemplo 2 - Evaluación de producción de vector lentiviral usando constructos modulares en un procedimiento de transfección transitoria

Se evaluaron los constructos modulares mostrados en la tabla 1 mediante el sistema de co-transfección transitoria usando el constructo modular que estaba evaluándose

sistema de vector. Todos los constructos modulares sometidos a prueba en este experimento generaron vector con títulos de FACS de GFP por encima de 4E+04 UT/ml, confirmando que todas las combinaciones modulares que se habían evaluado podían producir vector lentiviral usando un procedimiento de transfección transitoria. El procedimiento de generación de vector de GFP mediante co-transfección transitoria de células HEK₂93T con una combinación de constructos modulares y plásmidos de componentes individuales no se optimizó y se basó en el procedimiento de cotransfección transitoria óptimo cuando se usaron cuatro plásmidos individuales. Por tanto, es probable que, con una optimización adicional, puedan mejorarse los rendimientos de vector lentiviral. Los parámetros que pueden optimizarse incluyen: densidades de siembra, cantidades de transfección de constructo modular, cantidades de reactivos de transfección, tiempos de recogida y tiempos de inducción. Solo se analizó el vector de la recogida 2 en este experimento. Los resultados se resumen en la tabla 1.

Tabla 1: Constructos de LV modulares evaluados usando el procedimiento de transfección transitoria de LV

Ejemplo 3 - Constructos de vector lentiviral modulares evaluados usando el procedimiento de línea celular estable para generar combinaciones de líneas de células de empaquetamiento

Se generaron combinaciones estables de líneas de células de empaquetamiento mediante transfección estable usando diferentes combinaciones de plásmidos de com i di id l d l i i l d l id por un periodo de selección con antibiótico. La selección con antibiótico garantizó la selección únicamente de aquellas células en las que los componentes de empaquetamiento de vector lentiviral se habían integrado en los genomas de células huésped. Tras un periodo de cultivo celular, que garantizó que todos los ADN de plásmido no integrados se habían diluido fuera de los cultivos celulares, se sometieron a prueba las combinaciones resultantes de células de empaquetamiento para determinar su capacidad para generar vectores lentivirales que contenían GFP tras la transfección transitoria de genoma de GFP de VIH-1 (y Rev para PAC006) y la inducción por doxiciclina. La tabla 2 detalla las combinaciones de constructo modular y de plásmido individual que se usaron en la generación de cada una de las combinaciones de líneas de células de empaquetamiento. Además, la tabla 2 detalla los títulos de FACS de GFP resultantes (UT/ml) del vector de GFP que se produjo a partir de cada combinación de células de empaquetamiento tras la transfección transitoria de genoma de GFP de VIH-1 (y Rev de VIH-1 para PAC006) e inducción por doxiciclina. Sorprendentemente, los resultados indican que todas las combinaciones de células de empaquetamiento generaron vector de GFP. Además, los títulos de vector lentiviral de todas las combinaciones de células de empaquetamiento (excepto PAC002) demostraron títulos que eran comparables (dentro de 2 veces) al vector producido a partir de una combinación de líneas de células de empaquetamiento generada cuando se habían integrado de manera estable componentes de empaquetamiento independientes individuales (PAC001).

Además de la generación de combinaciones de células, se aislaron varios clones a partir de las estrategias de líneas de células de empaquetamiento PAC001 (componentes de plásmidos individuales) y PAC004 (constructos modulares y componentes de plásmidos individuales). Se evaluaron los cinco mejores clones de cada estrategia para determinar su capacidad para producir vector de GFP tras la transfección transitoria de genoma de VIH-GFP y la inducción con doxiciclina (figura 5). Los resultados indican que la estrategia que usó una combinación de constructos modulares y plásmidos de componentes individuales (PAC004, véase la tabla 2) condujo a la generación de clones de empaquetamiento que, en promedio, proporcionaron un vector de GFP con título superior al logrado a partir de clones de empaquetamiento aislados a partir de una combinación de células que se habían generado usando los plásmidos de vector lentiviral de empaquetamiento individuales convencionales (PAC001, véase la tabla 2).

Tabla 2: Constructos de LV modulares evaluados usando el procedimiento de línea celular estable de LV para generar combinaciones de líneas de células de empaquetamiento

Ejemplo 4 - Constructos de vector lentiviral modulares evaluados usando el procedimiento de línea celular estable de vector lentiviral para generar líneas de células productoras

Se generaron combinaciones estables de líneas de células productoras mediante transfección estable usando diferentes combinaciones de plásmidos de componentes individuales o constructos de vector lentiviral modulares seguido por un periodo de selección con antibiótico. Tras un periodo de cultivo celular, que garantizó que todos los ADN de plásmido no integrados se habían diluido fuera de los cultivos celulares, se sometieron a prueba las combinaciones resultantes de células productoras para determinar su capacidad para generar vector de GFP tras la inducción por doxiciclina. La tabla 3 detalla las combinaciones de constructo modular y de plásmido individual que se usaron en la generación de cada una de las combinaciones de líneas de células productoras. Además, la tabla 3 detalla los títulos de FACS de GFP resultantes (UT/ml) del vector de GFP que se produjo a partir de cada combinación de células productoras tras la inducción por doxiciclina. Los resultados demostraron que todas las combinaciones de células productoras generaron vector de GFP con títulos que eran comparables (dentro de 2 veces) al vector producido a partir de una combinación de líneas de células productoras generada cuando se habían integrado de manera estable componentes de empaquetamiento independientes individuales (constructos de componentes individuales, véase la tabla 3).

Tabla 3: onstructos de LV modulares evaluados usando el procedimiento de lnea celular estable de LV para generar líneas de células productoras

Ejemplo 5 - Procedimiento de línea de células productoras estables retrovirales evaluado usando constructos linealizados frente a superenrollados

Para investigar si la generación de líneas celulares estables se beneficiaría de usar constructos de ADN lineales o constructos de ADN superenrollados, se generaron combinaciones estables de líneas de células productoras mediante transfección estable usando constructos modulares de VEV-G-Rev (MO₃y MO12; véase la tabla 3) y plásmidos de genoma y GagPol individuales, en formatos o bien linealizado o bien superenrollado. Se evaluó la producción de vector mediante ensayo de título de FACS de GFP a escala de 6 pocillos (figura 6). Los resultados indican que la linealización de los constructos modulares antes de la transfección estable dio como resultado una combinación de líneas de células productoras que podían producir vectores lentivirales de título superior a cuando se introdujo el constructo modular en la célula en la forma superenrollada (más de 2 veces).

Materiales y métodos

Plásmidos

Plásmidos usados para la transfección transitoria

El plásmido de genoma de VIH-1 mínimo (pRKHVCG) es un vector SIN que contiene el gen de GFP bajo el control de un promotor de CMV humano interno. Los plásmidos de envuelta de VEV-G se basan en el plásmido de VEV-G (pHG) que se ha descrito anteriormente (Farley DC et al. (2007). J Gene Med; 9: 345-356). Los plásmidos de GagPol de V iH-1 contienen Gag/Pol de VIH-1 sometido a optimización de codones y se basan en el plásmido (pSYNGP) que se ha descrito anteriormente (Kotsopoulou E et al. (2000) Journal Of Virology; 74: 4539-4852 y documento WO 2001/079518) y también se usaron plásmidos de Rev de VIH-1 que se basaron en pCMV-Rev (Kotsopoulou E et al. (2000) Journal Of Virology; 74: 4539-4852).

Plásmidos modulares

Los constructos modulares y plásmidos individuales sometidos a prueba en los ejemplos en el presente documento se construyeron basándose en los plásmidos detallados anteriormente, pero incluyen adicionalmente los elementos de TetO₂inducibles y marcadores seleccionables para el desarrollo de líneas celulares estables. La única excepción a esto fue el constructo transitorio modular completo (pOXB_Transient_Modular) en el que ni se incluyó ningún elemento de TetO₂o marcador seleccionable. La siguiente tabla indica los constructos modulares que se sometieron a prueba en los ejemplos en el presente documento.

Tabla 4: Constructos modulares y plásmidos individuales usados en los ejemplos en el presente documento

Líneas celulares

Las células HEK₂93T usadas para la transfección transitoria y generación de líneas de células de empaquetamiento y productoras se obtuvieron de M. Calos (Stanford University). Se mantuvieron células HEK₂93T en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma, Poole, R.U., cat. D5671) que contenía el 10% (v/v) de suero bovino fetal (FCS) y complementado con L-glutamina 2 mM (Sigma, cat. G7513) y el 1% de aminoácidos no esenciales (Sigma, M7145). Líneas celulares estables

Línea de células HEK293-TetR

Se generaron células HEK₂93T que expresaban de manera estable la proteína represora de tetraciclina (coTetR) sometida a optimización de codones transfectando una placa de 10 cm que contenía 3E+06 células HEK₂93T con ADN de plásmido pPuro-coTetR linealizado usando Lipofectamine

medios con medios condicionados que contenían puromicina (0,6 |jg/ml) 48 h tras la transfección para seleccionar transfectantes. Dos semanas tras la selección se aislaron clones individuales a partir de la población mixta mediante dilución limitante en medios condicionados.

Líneas de células de empaquetamiento de vector retroviral

Se generaron combinaciones de líneas de células de empaquetamiento de vector lentiviral (basadas en VIH-1) transfectando una placa de 10 cm que contenía 3,5E+06 células HEK₂93T-TetR con plásmidos individuales linealizados y/o constructos modulares que codificaban para componentes de empaquetamiento inducibles (GagPol inducible de VIH-1, Rev inducible de VIH-1 y envuelta inducible (VEV-G)) usando Lipofectamine™ 2000 CD. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se sustituyeron los medios por medios condicionados que contenían el/los antibiótico(s) relevante(s) (por ejemplo, Zeocin™, blasticidina) para la selección de células que contenían las secuencias de ácido nucleico integradas requeridas. Cuando las combinaciones de líneas de células de empaquetamiento se habían recuperado de la selección, se cultivaron durante 2 semanas antes de examinarse para seleccionar productividad de LV.

Cuando se requerían líneas celulares clonales individuales, entonces se aislaron clones mediante clonación mediante dilución limitante y se examinaron para seleccionar producción de LV antes de expandirse y examinarse para seleccionar producción de LV a mayor escala.

Líneas de células productoras de vector retroviral

Se generaron combinaciones de líneas de células productoras de vector lentiviral (GFP de VIH-1) transfectando 4,0E+06 células HEK₂93T-TetR con plásmidos individuales linealizados o superenrollados y/o constructos modulares que codificaban para los componentes de LV productores (genoma de GFP de VIH-1, GagPol inducible de VIH-1, Rev inducible de VIH-1 y envuelta inducible (VEV-G)) usando Lipofectamine™ 2000 CD. Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se sustituyeron los medios por medios condicionados que contenían el/los antibiótico(s) relevante(s) (por ejemplo, Zeocin™, higromicina, blasticidina) para la selección de células que contenían las secuencias de ácido nucleico integradas requeridas. Cuando las combinaciones de líneas de células productoras se habían recuperado de la selección, se cultivaron durante 2 semanas antes de examinarse para seleccionar productividad de LV.

Producción de vector retroviral mediante co-transfección transitoria de plásmido de células HEK293T

Se transfectó ADN de vector en células HEK₂93T o células HEK₂93T.TetR en placas de 10 cm que se habían sembrado previamente con 3,5*106 células aproximadamente 18 horas antes de la transfección. Se transfectaron ADN de plásmido en las células usando Lipofectamine 2000CD. Se añadió butirato de sodio aproximadamente 6 horas tras la transfección a una concentración final de 10 mM. Se tomó el sobrenadante de recogida que contenía vector 1 (H1) 16-18 horas después seguido por una segunda recogida (H₂) 24 horas después. También se produjo producción de vector en placas de múltiples pocillos a menor escala (por ejemplo, placas de 6 pocillos) y, en este caso, se redujo la escala del protocolo de producción de vector de 10 cm según razones de área de superficie. Se filtraron sobrenadantes de recogida de vector a través de filtros de 0,45 jm y se almacenaron a -80°C antes de ensayos de titulación de vector. Se titularon vectores que codificaban para GFP mediante transducción de células diana y análisis 3 días después mediante ensayo de FACS de GFP.

Además del procedimiento convencional expuesto anteriormente, también se generó LV usando el sistema inducible por tetraciclina. En este caso, se siguieron los mismos procedimientos que los expuestos anteriormente, excepto porque se transfectaron células HEK₂93T-TetR de manera transitoria con genoma y ADN de plásmido de empaquetamiento inducibles. Cada uno de los plásmidos de empaquetamiento (GagPol, VEV-G, Rev) se impulsa por promotores de CMV en los que se han insertado dos copias de las secuencias de operador de tetraciclina (TetO₂). Tras la transfección de los ADN de plásmido, la proteína represora de tetraciclina (TetR), que se expresa de manera constitutiva por las células HEK₂93T-TetR, se une a las secuencias de TetO₂en los plásmidos de empaquetamiento y bloquea físicamente la transcripción a partir del promotor de CMV en el sentido de 5'. Por tanto, no puede producirse la producción de LV hasta que se ha activado la expresión de los componentes de empaquetamiento. Esto implica la adición de un agente de inducción (tetraciclina o su análogo doxiciclina [dox]) ya que se une a los homodímeros de TetR, provocando cambios alostéricos de tal manera que ya no puede unirse a las secuencias de TetO₂, y se activa la expresión génica de los componentes de empaquetamiento. Por tanto, además de los procedimientos anteriores, se realizó adicionalmente una etapa de inducción en la que se añadió doxiciclina tras la transfección a una concentración final de 1 jg/ml.

Producción de vector retroviral a partir de líneas de células de empaquetamiento

Se realizó la producción de vector a partir de células de empaquetamiento (combinaciones de células y clones) tal como se describió anteriormente pero solo se transfectó plásmido de genoma. Cuando se requirió la inducción con doxiciclina, se añadió tras la transfección a una concentración final de 1 jg/ml.

Producción de vector retroviral a p a rtir de líneas de células p roductoras

Se sembraron placas de seis pocilios con combinaciones de líneas de células productoras a una densidad de 2E+06 células por pocillo, por triplicado. Aproximadamente 24 horas después, se indujeron las combinaciones de células productoras con doxiciclina (concentración final de 1 |jg/ml) y butirato de sodio (concentración final de 10 mM). Se tomó el sobrenadante de recogida que contenía vector 1 (H1) 16-18 horas después seguido por una segunda recogida (H₂) 24 horas después. Se cuantificó el vector de la recogida 2 mediante ensayo de FACS de GFP.

S DS-PA G E e inm unotransferencia

Se llevaron a cabo protocolos convencionales de SDS-PAGE e inmunotransferencia principalmente en células al final de la producción de vector, tras la recogida de vector. Se sometieron aproximadamente 1E+06 células al final de la producción de vector a lisis en 200 j l de tampón de fraccionamiento (Tris.Cl 0,1 M, pH 7,3, Nonidet P40 al 0,2% [v/v]) y se retiraron los núcleos mediante centrifugación, se ajustaron los volúmenes de lisis si se recogieron números de células inferiores. Se cuantificaron muestras de proteína mediante ensayo de BioRad y normalmente se cargaron 10 jg de proteína en geles de acrilamida al 4-20%, en 12-15 pocillos, previamente formados. Se transfirieron proteínas a membrana de nitrocelulosa usando el sistema de transferencia de Bio-Rad Trans-Blot Turbo según las instrucciones del fabricante. Se bloquearon las transferencias en tampón de bloqueo (PBS con leche al 5%/tween-20) durante la noche a 4°C. Se analizaron las transferencias con sonda con anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios con HRP normalmente a una dilución de 1:1000 en tampón de bloqueo. Se analizaron inmunotransferencias mediante detección por ECL seguido por obtención de imágenes y análisis usando un dispositivo ChemiDoc de BioRad.

Ensayos de cuantificación de vector retroviral

• Ensayo de FAC S de GFP

Se usó un ensayo de FACS de GFP para determinar el título de integración de vector midiendo el porcentaje de células transducidas que expresaban GFP mediante citometría de flujo. Se sembraron células HEK₂93T en placas de 96 pocillos a una densidad de 7,5E+03 células/pocillo. Veinticuatro horas después, sobrenadantes de vector que codificaba para GFP recogidos y filtrados se diluyeron en el intervalo de 1:10 a 1:100 en medios antes de 50 j l o se usó cada dilución para transducir las células HEK₂93T en presencia de polibreno 8 jg/ml. Si se realizan transducciones a mayor escala, entonces se ajusta el ensayo a escala de manera correspondiente. Se analizaron cultivos para detectar niveles de expresión de GFP 3 días tras la transducción usando un dispositivo FACS Verse. Se calcularon los títulos de vector según el porcentaje de células positivas para GFP y se notificó el título de vector como unidades de transducción por mililitro (UT/ml).

• Ensayo de transcriptasa inversa potenciada p o r producto.

El ensayo de transcriptasa inversa potenciada por producto (PERT) mide la cantidad de actividad de RT dentro de preparaciones de vector, lo cual es una medida indirecta de la funcionalidad del constructo de GagPol. La RT asociada con partículas de vector se liberó mediante tratamiento con un detergente leve (tampón de alteración de partículas) y se usó para sintetizar ADNc usando ARN de bacteriófago MS2 como molde. La cantidad de ADNc resultante es proporcional a la cantidad de RT liberada a partir de las partículas y se cuantificó usando una máquina de ciclador térmico de PCR en tiempo real. El número de moléculas de ADNc generadas mediante la actividad de Rt representa el número relativo de partículas de vector presentes. Se incluyó un patrón de referencia de vector de VIH de título conocido en cada ensayo de PERT y la comparación de los resultados a partir de las muestras de vector de prueba desconocidas con el patrón de vector permitió realizar la estimación del número de partículas real y se notificó como título predicho de PERT en UT por ml (UT/ml).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Plásmido bacteriano que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev en orientaciones inversas, en el que las secuencias de ácido nucleico que codifican para env y rev están cada una asociada con:

i) al menos un elemento de regulación de la transcripción seleccionado del grupo de represores de tetraciclina (TetR) de reguladores de la transcripción o de los reguladores de la transcripción del sistema de conmutación inducible por cumato; o

ii) al menos un elemento de represión de la traducción, en el que el elemento de represión de la traducción es una proteína de unión a ARN activada por triptófano (TRAP).

2. Plásmido bacteriano según la reivindicación 1, en el que el plásmido bacteriano comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para una cualquiera de las siguientes combinaciones:

i) env y rev; o

ii) gag-pol, rev y env.

3. Plásmido bacteriano según la reivindicación 1, en el que el plásmido bacteriano comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para una cualquiera de las siguientes combinaciones:

i) el genoma de ARN del vector retroviral, rev y env; o

ii) gag-pol, rev, el genoma de ARN del vector retroviral y env.

4. Plásmido bacteriano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el plásmido bacteriano comprende secuencias de ácido nucleico que codifican para gag-pol, rev, el genoma de ARN del vector retroviral y env.

5. Célula para producir vectores retrovirales que comprenden al menos un plásmido bacteriano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Célula para producir vectores retrovirales que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican para:

i) gag-pol;

ii) env; y

iii) rev,

7. Célula según la reivindicación 6, en la que las secuencias de ácido nucleico ubicadas en el mismo locus genético son una cualquiera de las siguientes combinaciones:

) env y rev;

i) el genoma de ARN del vector retroviral, rev y env;

iii) gag-pol, rev y env; o

v) gag-pol, rev, el genoma de ARN del vector retroviral y env.

8. Célula según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en la que la célula es una célula de empaquetamiento o una célula productora.

9. Método para generar una célula de producción para producir vectores retrovirales, que comprende la etapa de introducir al menos un plásmido bacteriano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una célula de mamífero.

10. Método según la reivindicación 9, en el que el método comprende además la etapa de seleccionar una célula de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env integradas dentro de su genoma.

11. Célula estable para producir vectores retrovirales producida mediante el método según la reivindicación 10.

12. Método para producir un vector retroviral defectuoso para la replicación, que comprende las etapas de:

a) introducir un plásmido bacteriano según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en una célula de mamífero;

b) seleccionar una célula de mamífero que tiene las secuencias de ácido nucleico que codifican para rev y env integradas dentro de su genoma; y

c) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación.

13. Método para producir un vector retroviral defectuoso para la replicación, que comprende las etapas de:

a) introducir un plásmido bacteriano según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 en una célula de mamífero; y b) cultivar adicionalmente la célula de mamífero en condiciones en las que se produce el vector retroviral defectuoso para la replicación.

14. Método según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, que comprende además la etapa de aislar el vector retroviral defectuoso para la replicación.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12 a 14, en el que el plásmido bacteriano se introduce en la célula mediante transfección o en el que el plásmido bacteriano se introduce en la célula mediante electroporación.