KR20200131309A - 바이러스 벡터 생산 시스템 - Google Patents

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KR20200131309A
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다니엘 팔리
키리아코스 미트로파노스
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옥스포드 바이오메디카(유케이) 리미티드
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Abstract

바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 뉴클레아제를 분비하는 바이러스 벡터 생산 시스템 및 이의 방법이 본원에 개시된다. 이러한 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다. 또 다른 이러한 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제는 발현되고 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.

Description

바이러스 벡터 생산 시스템
발명의 분야
본 발명은 바이러스 벡터의 생산에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 벡터 제조 공정 동안 뉴클레아제를 발현하고 세포 배양 배지 내로 분비하도록 조작된 바이러스 벡터 세포 생산 시스템에 관한 것이다.
발명의 배경
전술된 바와 같이, 본 발명은 생산 세포, 이의 제조 및 이의 용도에 관한 것이다. 생산 세포는 또한 종종 숙주 세포 또는 숙주 생산 세포로서 언급된다. 생산 세포는 특히 유전자 요법에 유용하다.
유전자 요법은 광범위하게 질병을 치료하기 위해 유전자 물질의 사용을 포함한다. 이는 결함 유전자(예를 들어, 돌연변이가 있는 유전자)를 갖는 세포에 해당 유전자의 기능적 복사체로의 보충, 부적절하게 기능하는 유전자의 비활성화 및 새로운 치료 유전자의 도입을 포함한다.
치료학적 유전자 물질은 핵산의 전달을 가능하게 하는 벡터를 사용하여 숙주의 표적 세포 내로 혼입될 수 있다. 이러한 벡터는 일반적으로 바이러스 및 비-바이러스 범주로 나눠질 수 있다.
바이러스는 이들의 복제 주기의 일부로서 숙주의 표적 세포 내로 이들의 유전자 물질을 자연스럽게 도입한다. 조작된 바이러스 벡터는 이러한 능력을 이용하여 관심 뉴클레오티드(NOI)를 표적 세포에 전달할 수 있다. 현재까지 많은 바이러스가 유전자 요법을 위한 벡터로서 조작되었다. 이들은 레트로바이러스, 아데노바이러스(Adv), 아데노-관련 바이러스(AAV), 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 백시니아 바이러스를 포함한다.
관심 뉴클레오티드를 운반하기 위한 변형 이외에, 바이러스 벡터는 전형적으로 복제 결함되도록 추가로 조작된다. 이와 같이, 재조합 벡터는 표적 세포를 직접 감염시킬 수 있으나, 감염성 비리온의 추가 발생을 생성시킬 수 없다. 다른 유형의 바이러스 벡터는 암 세포 내에서만 조건부로 복제 적격일 수 있으며, 추가로 독성 전이유전자 또는 프로-효소를 인코딩할 수 있다.
치료학적 유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 사용은 잘 알려져 있으며, 적응증에 걸쳐 광범위하다. 특히, 유전자 요법의 발전 및 제품은 이제 글로벌 의료 시장에서 중요한 부분을 차지하고 있다. RNA 바이러스 예컨대, γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 및 DNA 바이러스 예컨대, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AAV)에 기반한 현대 유전자 치료 벡터는 점점 더 많은 인간 질환 적응증에 대한 가능성을 보여주었다. 이들은 혈액학적 상태에 대한 환자 세포의 생체외 변형, 및 안과, 심혈관, 신경퇴행성 질환 및 종양 요법 또는 면역요법의 생체내 치료를 포함한다. 다른 바이러스 벡터 예컨대, 폭스바이러스(Poxviruses) 및 아비안(Avian) 바이러스 기반의 바이러스는 인간 및 동물 백신화에 널리 사용된다.
다양한 유전자 장애에 대한 치료법으로서 개발된 레트로바이러스 벡터는 임상 시험에서 계속해서 증가하는 가능성을 보여주며, 현재 일부는 승인된 치료 제품의 기초를 형성한다. 현재, Journal of Gene Medicine 데이터베이스에 등록된 레트로바이러스 유전자 요법을 포함하는 459건 초과의 인간 임상 실험이 있으며; 158건의 유전자 요법 임상 실험은 렌티바이러스 벡터를 사용하고 있다(http://www.abedia.com/wiley/vectors.php, 2017년 4월 업데이트됨). 스트림벨리스(Strimvelis)는 2016년 5월 26일에 유럽 위원회로부터 판매 승인을 받았으며; 스트림벨리스는 ADA 유전자를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 생체 외에서 형질도입된 환자 CD34+ 세포를 기반으로 하는 ADA-SCID 치료용 제품이다. 킴리아(Kymriah)(USAN:티사젠렐류셀)는 2017년 8월 30일 FDA로부터 승인을 받았다; 킴리아는 불응성 ALL을 가진 25세 이하 환자를 치료하기 위한 제품이다. 레트로바이러스 유전자 요법에 대한 논문은 하기를 포함한다: [Wang X, Naranjo A, Brown CE, Bautista C, Wong CW, Chang WC, Aguilar B, Ostberg JR, Riddell SR, Forman SJ, Jensen MC (2012) J Immunother. 35(9):689-701, Hu Y, Wu Z, Luo Y, Shi J, Yu J, Pu C, Liang Z, Wei G, Cui Q, Sun J, Jiang J, Xie J, Tan Y, Ni W, Tu J, Wang J, Jin A, Zhang H, Cai Z, Xiao L, Huang H. (2017) Clin Cancer Res. 23(13):3297-3306, Galy, A. and A. J. Thrasher (2010) Curr Opin Allergy Clin Immunol 11(6): 545-550; Porter, D. L., B. L. Levine, M. Kalos, A. Bagg and C. H. June (2011) N Engl J Med 365(8): 725-733; Campochiaro, P. A. (2012) Gene Ther 19(2): 121-126; Cartier, N., S. Hacein-Bey-Abina, C. C. Bartholomae, P. Bougneres, M. Schmidt, C. V. Kalle, A. Fischer, M. Cavazzana-Calvo and P. Aubourg (2012) Methods Enzymol 507: 187-198; Sadelain, M., I. Riviere, X. Wang, F. Boulad, S. Prockop, P. Giardina, A. Maggio, R. Galanello, F. Locatelli and E. Yannaki (2010) Ann N Y Acad Sci 1202: 52-58; DiGiusto, D. L., A. Krishnan, L. Li, H. Li, S. Li, A. Rao, S. Mi, P. Yam, S. Stinson, M. Kalos, J. Alvarnas, S. F. Lacey, J. K. Yee, M. Li, L. Couture, D. Hsu, S. J. Forman, J. J. Rossi and J. A. Zaia (2010) Sci Transl Med 2(36): 36ra43 and Segura MM, M. M., Gaillet B, Garnier A. (2013) Expert opinion in biological therapy].
이러한 벡터의 중요한 예는 감마-레트로바이러스 벡터 시스템(MMLV 기반), 영장류 렌티바이러스 벡터 시스템(HIV-1 기반) 및 비-영장류 렌티바이러스 벡터 시스템(EIAV 기반)을 포함한다.
큰 이종 서열(약 10kb)을 인코딩하는 벡터가 적절한 DNA 서열로의 포유동물 세포의 형질감염에 의해 생성될 수 있도록 역유전학으로 하여금 이러한 바이러스-기반 벡터를 강력하게 조작할 수 있다(문헌 [Bannert, K.(2010) Caister Academic Press: 347-370]에서 검토됨).
연구 단계에서 레트로바이러스 벡터의 조작 및 사용은 예를 들어 GFP 또는 lacZ를 인코딩하는 리포터-유전자 벡터의 생성을 전형적으로 포함한다. 이러한 임상적으로 무관한 벡터의 역가는 일반적으로 미정제 수확 물질의 1 x 106 내지 1 x 107의 mL 당 형질도입 유닛(TU/mL)의 영역에 있다.
인간 유전자 요법 및 백신화를 위한 바이러스 벡터의 제조는 지난 수십년에 걸쳐 과학 저널에 잘 기록되어 있다. 잘 알려진 바이러스 벡터 제조 방법은 벡터 DNA 구성요소로의 일차 세포 또는 포유동물/곤충 세포주의 형질감염, 예를 들어 일시적 형질감염, 이후 제한된 인큐베이션 기간 및 이어서, 배양 배지 및/또는 세포로부터 미정제 벡터(crude vector)의 수확을 포함한다. 일시적 형질감염에는 바이러스 벡터의 생산에 필요한 바이러스 유전자가 형질감염에 의해 플라스미드를 통해 생산 세포(예를 들어, HEK-293)내에 도입되어야 한다. 종종, 벡터 생산에 필요한 각 구성요소는 부분적으로 안전상의 이유로 별도의 플라스미드에 의해 인코딩되는데, 이는 생산 과정 동안 복제 적격 바이러스 입자가 형성되게 하기 위해 많은 재조합 이벤트가 발생해야 하기 때문이다.
형질감염, 인큐베이션 및 수확 후, 바이러스 벡터 비리온은 이어서 하기 단계 중 일부 또는 모두의 일반화된 과정을 이용하여 미정제 물질로부터 정제되고 농축된다: 1) 정화, 2) 원치 않은 핵산 또는 오염 핵산의 분해 (예를 들어, Benzonase® 처리), 3) 칼럼 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환), 4) 완충액 교환/농축(예를 들어, 한외여과) 및 추가 핵산 제거(예를 들어, 제2 Benzonase® 처리), 5) 연마(예를 들어, 크기 배제) 및 6) 멸균 여과.
수십년의 개선에도 불구하고, 일시적 형질감염은 고유의 단점을 갖는다. 형질감염제/플라스미드 및/또는 처리제의 비용은 높고, 형질감염 기술의 노동-집약적 특성과 결합되어, 임상/상업적 벡터 생산에 있어서 일시적 형질감염을 고가의 기술적으로 복잡한 과정이 되게 한다.
따라서, 당업계에는 일시적 형질감염 과정과 관련하여 알려진 문제를 해결하는데 도움이 되는 바이러스 벡터를 생산하는 대안적 방법을 제공하고자 하는 요구가 있다.
최근 몇 년 동안 바이러스 패키징 유전자가 세포 내로 안정적으로 통합될 수 있도록 선택 마커와 함께 진핵 숙주 세포 내로 도입되는 안정적인 패키징 세포주를 생성하려는 시도가 있었다. 유사하게는, 레트로바이러스 게놈이 또한 안정적으로 통합되는 안정적인 생산자 세포주가 또한 존재한다. 이들 둘 모두는 일시적 형질감염 과정의 상당 부분을 우회할 수 있게 해준다.
그 전체가 본원에 참조로 통합되며, 바이러스 벡터 생산에 필요한 핵산 구성요소 중 적어도 2개를 포함하는 모듈식 작제물을 사용하는 바이러스 벡터 생산 시스템 및 방법을 기술하는 레트로바이러스 벡터라는 제목의 공동-계류중인 출원 번호 EP 17210359.0을 또한 참조한다. 이러한 모듈식 작제물은 전통적인 다중-플라스미드 일시적 공정을 사용하는 것과 유사한 벡터 생산 수준을 제공하나, 예를 들어, 형질감염제의 용도를 현저히 축소시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 벡터 제조 부문에서 일시적인 벡터 생산 공정과 안정적인 패키징 및 생산자 세포주를 생성하는 공정을 둘 모두 개선하고자 하는 요구가 있다.
최종 약품에서 생산 세포 또는 바이러스 벡터 구성요소로부터 유래된 핵산의 제거는 안전성의 중요한 측면이며, 개선하기에 적합한 바이러스 벡터 제조 영역이다. HEK293T 세포(아데노바이러스 E1 및 SV40 T 항원 유전자를 또한 함유)와 같은 형질전환된 진핵 세포주가 생산에 사용되는 경우, 이러한 세포는 일반적으로 (원)-발암 특성을 가진 유전자를 보유한다. 바이러스 벡터 제조 동안 불가피한 세포 사멸 및 생산 세포 DNA의 방출은 미정제 수확 물질 내의 이러한 (부분적이고 오염된) 서열의 존재로 이어진다. 따라서, 벡터 전달 동안 불필요하고 잠재적으로 유해한 기능성 유전자 서열이 환자 세포 내로 통합될 가능성을 방지하기 위해 일반적인 DNA 오염(예를 들어, 더 긴 오염 dsDNA가 최종 생성물 내에서 짧은 형태로 분해됨)을 최소화시키는 것이 바람직하다. 또한, 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 대량의 플라스미드 DNA(pDNA)로 생산 세포를 일시적으로 형질감염시키는 전형적인 바이러스 벡터 생산 방법은 대부분의 오염 DNA가 벡터 구성요소 기원이라는 것을 야기할 것이다. 따라서, 오염된 잔여 pDNA를 제거하는 것이 또한 바람직하며, 그렇지 않으면 이는 환자 세포에 의해 취해지고 발현될 수 있다.
실험실 규모에서부터 산업 규모에 이르기까지, 바이러스 벡터 제조업체는 미정제 벡터 물질을 처리하고 업스트림 및 다운스트림 정제 과정 동안 오염 핵산을 제거하기 위해 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(예를 들어, Benzonase®)로부터 유래된 것과 같은 재조합 뉴클레아제 또는 기타 상업적 가수분해 뉴클레아제의 사용에 의지하였다. 업스트림 처리 동안 뉴클레아제 처리를 위해, 단백질 형태의 재조합 뉴클레아제는 전형적으로 수확 물질에 첨가된 후 37º 이하에서 제한된 기간 동안 인큐베이션된다. 그러나, 이는 잠재적으로 피할수 있는 추가적인 처리 단계를 나타내며, 증가된 온도 및 증가된 인큐베이션 시간으로 인해 벡터 안정성이 손실될 수 있는 단계이다. 수확 후의 독립 단계로서의 이를 피하기 위해, 재조합 뉴클레아제가 종종 벡터 생산의 후반 단계에서 생산 세포 배양물에 첨가된다. 그러나, 뉴클레아제 반감기가 비교적 짧거나 활성이 필요한 양의 잔여 핵산을 분해하기에 불충분한 경우, 대량의 뉴클레아제가 이러한 배양 후반 단계 동안 한번에 또는 지속적으로 첨가되어야 할 수 있다. 불행히도, 이러한 공정 단계에서 상업적으로 이용가능한 재조합 뉴클레아제의 사용은 특히 규모가 수백 또는 수천 리터로 증가함에 따라 종종 실질적으로 부담스럽고 비용이 많이 들게 된다.
따라서, 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는 중요 단계(들)를 간소화하고 보다 효율적으로 만들기 위한 것으로서 바이러스 벡터 생산 및 제조 공정을 개선하려는 요구가 있다.
발명의 개요
본원에 개시된 발명은 바이러스 벡터 생산 동안 바이러스 벡터 생산 세포에서 가수분해 뉴클레아제(들)의 발현 및 분비를 사용하는 매우 효과적이고 간소화된 바이러스 벡터 생산 시스템 및 제조 방법을 기술한다. 따라서, 뉴클레아제의 분비는 바이러스 벡터 생산 동안 원치 않는 또는 오염된(잔여) 핵산을 분해한다. 이러한 벡터 생산 시스템 및 공정에서, 뉴클레오티드 발현 카세트에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 바이러스 벡터 구성요소 발현 카세트(들)와 일시적으로 공동-형질감염되거나 생산 세포 게놈 또는 뉴클레아제 헬퍼 세포 게놈 내에 안정하게 통합되거나, 뉴클레아제 헬퍼 세포가 뉴클레아제 발현 카세트를 사용한 일시적 형질감염에 의해 생성될 수 있다.
바이러스 벡터 생산 공정의 복잡성으로 인해, 바이러스 벡터 생산 시스템과 관련하여 및/또는 바이러스 벡터 생산 공정 동안 유전자 발현 카세트로부터의 뉴클레아제의 발현 및 분비는 최신 기술로서, 박테리아 세포에서 뉴클레아제의 발현/공동-발현만을 입증하며, 바이러스 벡터 맥락에서 부담스러운 업스트림 및/또는 다운스트림 시점에서 바이러스 벡터의 재조합 단백질-기반 효소 처리로서 시중에서 입수가능한 뉴클레아제 첨가를 이용하는 것을 사용하는 최신 기술에 위배된다. 따라서, 본원에 개시된 본 발명 이전에는, 바이러스 벡터 생산 시스템에서 바이러스 벡터 구성요소(들) 발현 카세트(들)와 함께 핵산 발현 카세트에 의해 인코딩된 뉴클레아제의 발현 및 분비는 필수 벡터 구성요소 DNA의 분해를 발생시켜 벡터 구성요소의 감소된 발현, 생산된 바이러스 벡터의 낮은 역가 및/또는 바이러스 벡터 생산 세포에 대한 독성으로 이어지는 것으로 간주되었다.
그러나, 바이러스 벡터 생산 제조를 개선하기 위한 노력의 일환으로, 본 발명자들은 본원에 개시된 발명을 제공한다: 치료학적 바이러스 벡터의 생산 동안 바이러스 벡터 생산 세포(생산자 및/또는 뉴클레아제 헬퍼 세포)에서 뉴클레아제의 발현 및 분비를 이용하는 바이러스 벡터 생산 시스템 및 바이러스 벡터 생산 방법. 본 발명은 현재 상업적 뉴클레아제 기술과 비교하여 더욱 효과적인 (및 비용-효율적인) 바이러스 벡터 생산 시스템/방법을 제공한다. 게다가, 본 발명은 바이러스 역가에 영향을 주지 않고/거나 바이러스 벡터 생산 세포에 독성을 부여하지 않으면서 바이러스 벡터 생산 동안 원치않는 또는 오염 잔여 핵산의 분해를 위한 뉴클레아제의 분비를 조작함으로써 통상적인 벡터 제조 기술과 비교하여 간소화된 방식으로 바이러스 벡터의 제조를 제공한다. 본 발명자들은 렌티바이러스 벡터 생산에 있어서, 생산의 상류 단계에서 분비된 뉴클레아제의 적용은 미정제 수확 물질 내에서 잔여 DNA의 이러한 효율적인 분해로 이어지며, 다운스트림 공정 동안 추가의 뉴클레아제 처리가 불필요하게 됨을 보여준다. 중요하게는, 정제된/농축된 렌티바이러스 벡터 물질 내의 잔여 DNA의 수준은 시중의 표준 뉴클레아제와 비교하여 분비된 뉴클레아제를 사용하는 경우 크게 감소할 수 있으며, 이는 조절인자가 생성물 품질/안전성에서 끊임없이 증가하는 개선을 필요로 하기 때문에 유전자 요법에서 매우 중요하다.
따라서, 본원에서는 뉴클레아제를 분비하도록 조작된 바이러스 벡터 생산 시스템이 개시된다.
일 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제가 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제가 발현되고 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
또한, 본원에 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 바이러스 벡터 생산 동안 뉴클레아제를 발현하고 분비하는 것을 포함하는 방법이 기재된다. 특히, 바이러스 벡터를 생산하는 이러한 방법은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열로 바이러스 생산 세포를 형질감염(때때로 접촉)시키는 것을 포함하며, 여기에서 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
추가로, 본원에는 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 공동-배양 방법이 기재된다. 추가의 구현예에서, 헬퍼 세포로부터의 액체 피드(feed)는 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포와 접촉된다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 본원에는 바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법이 기재되며, 개선된 방법은 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포 내에 도입시키는 것을 포함하며, 핵산 서열은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하며, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
또한, 본원에는 바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법이 기재되며, 개선된 방법은 바이러스 벡터 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포와 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 공동-배양물에서 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레아제는 헬퍼 세포에서 발현되고 세포-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
본원에 개시된 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 6.5 pH 내지 7.2 pH의 pH 범위에서 유지된다.
본원에 개시된 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 당-비-특이적 뉴클레아제이다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 1 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 10 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 50 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 100 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 10 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 50 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 100 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 1000 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 1500 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
본원에 개시된 본 발명의 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 주요 바이러스 벡터 생산 용기를 접종시키기 전에 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 달성되는 뉴클레아제 활성은 mL 당 적어도 약 2000 Benzonase® 유닛 당량이며, 바람직하게는 상기 뉴클레아제 활성은 검정법 1로서 본원에 제공된 DNAse AlertTM 검정에 의해 결정가능하다.
바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 SmNucA, VsEndA, VcEndA 및 BacNucB로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가의 구현예에서, 뉴클레아제는 SEQ ID NO: 1의 비브리오 콜레라 엔도뉴클레아제 I 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체이다.
더욱 추가의 구현예에서, 뉴클레아제 변이체는 SEQ ID NO: 5-11 중 임의의 것의 VcEndA 변이체이다.
추가의 구현예에서, 뉴클레아제는 염-활성 뉴클레아제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 염-활성 뉴클레아제는 SEQ ID NO: 2의 비브리오 살모니시다 엔도뉴클레아제 I 또는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체이다.
추가의 구현예에서, 뉴클레아제는 SEQ ID NO: 3의 세라티아 마르세센스 뉴클레아제 A 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
추가 구현예에서, 뉴클레아제는 SEQ ID NO: 4의 바실러스 BacNucB 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 N-말단 분비 신호를 포함한다.
본원에 개시된 본 발명의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 잠재적인 스플라이스 부위 및/또는 불안정한 요소를 제거하기 위해 서열-최적화된다.
또 다른 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 생산 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된다.
추가 구현예에서, 생산 시스템 및/또는 방법은 하나 이상의 추가 뉴클레아제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 생산 시스템 및/또는 방법은 2개 이상의 뉴클레아제 또는 뉴클레아제 도메인의 융합 단백질을 포함한다.
더욱 추가의 구현예에서, 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 5 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 10 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 15 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 20 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 25 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 30 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 35 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 40 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 45 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 50 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
시스템 또는 방법의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 60리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 70 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 80 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 90 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 100 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 200 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 적어도 약 500 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 최대 또는 적어도 약 1000 리터(L) 부피의 배지를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포는 부착 세포이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포는 현탁 세포로 존재한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포는 현탁액 중 부착 세포이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 혈청을 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 세포 배양물은 무혈청이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 숙주 세포는 인간 숙주 세포이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 인간 숙주 세포는 HEK293 세포 또는 이의 유도체이다. HEK293 유도체의 예는 HEK293S, HEK293SG, HEK293SGGD, HEK293FTM 및 HEK293T를 포함한다. 이러한 유도체는 또한 HEK293의 변이체로 언급될 수 있다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 한 구현예에서, HEK293 세포는 HEK293T 세포이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 구성요소는 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 구성요소는 레트로바이러스 벡터 구성요소이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 구성요소는 렌티바이러스 벡터 구성요소이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 구성요소는 i) gag-pol; ii) env; iii) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈; 및 iv) 선택적으로 rev, 또는 이의 기능적 치환물을 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열 중 적어도 2개는 동일한 유전자좌에 위치한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열 중 적어도 2개는 역 및/또는 교차 방향으로 존재한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, gag-pol 및/또는 env를 인코딩하는 핵산 서열 중 적어도 2개는 적어도 하나의 조절인자 요소와 관련된다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, env는 VSV-G env이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스 벡터이다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 일시적 형질감염 후에 세포로부터 발현되고 분비된다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 세포의 안정한 통합 후에 세포로부터 발현되고 분비된다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제의 발현은 유도성 또는 조건부이고, 여기서 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 유도성 또는 조건부 프로모터 또는 조절 요소를 포함한다.
본 발명의 시스템 또는 방법 또는 다른 양태의 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 세포외 뉴클레아제이다.
추가적인 구현예에서, 본원에 기재된 발명은 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 일시적 또는 안정적 생산 세포를 제공하며, 여기서 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 DNA를 분해한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 일시적 또는 안정적 생산 세포를 제공하며, 여기서 뉴클레아제 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하며, 뉴클레아제 융합 단백질은 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하며, 생산 세포는 진핵 생산 세포이다.
또 다른 구현예에서, 본원에 개시된 발명은 뉴클레아제를 발현하고 분비하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치, 예컨대 생물반응기를 제공한다.
또한, 본원에는 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해할 수 있는 분비된 뉴클레아제의 변이체로서, SEQ ID NO: 5-11 중 임의의 아미노산 서열을 포함하는 뉴클레아제 변이체가 기재된다. 특히, 변이체는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, 또는 SEQ ID NO: 11을 포함한다.
또한, 본원에서 진핵 세포의 분비 경로를 통해 발현되는 증가된 세포-보유 및/또는 세포-회합을 갖는 변형된 뉴클레아제로서, 이의 C-말단에서 보유 신호를 포함하는 변형된 뉴클레아제가 기재된다.
또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 소포체(ER) 및/또는 골지 구획에 국소화되어 상응하는 비변형된 뉴클레아제의 세포 보유와 비교하여 증가된 세포 보유를 발생시킨다. 또 다른 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 ER 보유-결함 보완 그룹의 ER 수용체에 결합된다.
또 다른 구현예에서, 보유 신호는 컨센서스의 [KRHQSA]-[DENQ]-E-L 또는 KKXX의 C-말단에 위치하며, 추가의 구현예에서, 보유 신호는 이의 컨센서스 KDEL의 C-말단에 위치한다.
다른 구현예에서, 진핵 세포는 변형된 뉴클레아제를 발현하며, 바이러스 벡터 생산 시스템은 변형된 뉴클레아제를 발현하는 세포를 포함한다.
도 1A-1B는 바이러스 벡터 생산 시스템의 생산 동안 진핵 세포로부터의 뉴클레아제의 분비를 보여주는 본원에 개시된 본 발명의 두 개념을 예시한다. 이러한 개념에서, 분비된 뉴클레아제를 발현하는 세포는 뉴클레아제 발현 카세트로 일시적으로 형질감염될 수 있거나 세포의 게놈 내로 안정하게 통합될 수 있으며 선택적으로 유도될 수 있다. 어느 한 개념에서, 바이러스 벡터 생산 모드는 부착 세포 배양물 또는 현탁 세포 배양물일 수 있다. 도 1a는 분비되는 뉴클레아제를 발현할 수 있는 뉴클레아제 헬퍼 세포가 첨가된 바이러스 벡터 생산 세포의 배양물을 보여준다. 도 1B는 생산 세포가 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하지 않고 분비된 뉴클레아제 자체를 발현할 수 있는 바이러스 벡터 생산 시스템을 보여준다.
도 2는 본원에 개시된 본 발명에 사용하기 위한 생산 세포에서 유전자 조작을 위한 뉴클레아제의 변형을 위한 작업 흐름 단계적 접근법을 예시한다.
도 3a-3d는 본원에 개시된 본 발명에 사용하기 위한 개략적인 뉴클레아제 발현 카세트를 예시한다. 도 3a는 SmNucA에 대한 비제한적인 예시적 발현 카세트를 보여준다. 도 3b는 VsEndA 및 VcEndA에 대한 비제한적인 예시적인 발현 카세트를 보여준다. 도 3c는 BacNucB에 대한 비제한적인 예시적 발현 카세트를 보여준다. 도 3d는 안정한 세포 발달을 위한 조절된 분비 뉴클레아제 카세트에 대한 비제한적인 예시적인 발현 카세트를 보여준다.
도 4a-4c는 HEK293T 세포로부터의 뉴클레아제의 형질감염 후 발현 및 분비가 배양 배지에서 감소된 DNA와 상관관계가 있음을 보여준다. 도 4A는 항-히스티딘 태깅된 smNucAH6에 대해 면역블롯된 형질감염 세포 용해물을 보여준다. 도 4b는 항-히스티딘 태깅된 SmNucAH6을 사용하여 형질감염된 세포 배양 배지 프로빙의 면역-도트 블롯을 보여준다. 도 4c는 배지 내의 잔여 DNA 분석을 보여준다.
도 5는 발현 카세트 대 Benzonase® & 비처리된 벡터 수확물로부터 분비된 태깅 및 비태깅 뉴클레아제(SmNucA)를 비교하여 부착 또는 현탁 HEK293T 세포 배양물에서 일시적인 렌티바이러스 벡터 생산을 보여준다.
도 6은 천연 신호 펩티드가 있거나 없는 SmNucA 발현 카세트를 사용하는 부착 HEK293T에서 일시적인 렌티바이러스 벡터 생산을 보여 주며, 여기서 예시적인 진핵 ER 신호 펩티드는 천연 신호를 대체한다.
도 7은 벡터 성분으로의 일시적인 형질감염 동안 부착 HEK293T 세포 배양물에서 렌티 바이러스 벡터의 생성 동안 발현 카세트(총 투입 pDNA의 1%)를 통한 분비된 뉴클레아제(예를 들어, VsEndA 및 SmNucA)의 비제한적인 예를 보여준다.
도 8은 뉴클레아제 플라스미드로의 일시적인 형질감염 동안, 벡터 구성요소의 dox 도입에 의한 부착 HEK293T 생산자 세포주에서 렌티바이러스 벡터의 생성 동안 발현 카세트(총 투입 pDNA의 1%)를 통한 분비된 뉴클레아제(예를 들어, VsEndA 및 SmNucA)의 비제한적인 예를 보여준다.
도 9a-9b는 현탁 배양에서 벡터 생산 동안 분비된 뉴클레아제를 보여준다. 도 9a는 벡터 구성요소의 일시적인 형질감염 동안 현탁액 중 HEK293T 세포 배양물에서 렌티바이러스 벡터의 생성 동안 발현 카세트(총 투입 pDNA의 5%)를 통한 분비된 뉴클레아제(예를 들어, VsEndA 및 SmNucA)의 비제한적인 예를 보여준다. 도 9B는 분비된 뉴클레아제 단백질을 검출하기 위해 항-히스티딘 태그 항체를 사용한 SDS-PAGE 및 면역블롯팅에 의한 농축된 벡터 상청액을 보여준다.
도 10a-d는 본원에 개시된 본 발명에 사용하기 위한 BacNucB에 대한 비제한적인 예시적 변형 및 인실리코 분석을 보여준다. 도 10a는 BacNucB 및 트랜스멤브레인 예측 분석의 일차 서열을 보여준다. 도 10b는 BacNucB의 분비 펩티드 신호의 분석을 보여준다. 도 10c는 알파-나선, 베타-가닥 및 코일의 BacNucB 영역, 및 4개의 상이한 변이체로 조작된 신규한 NxS/T 세쿠온(sequon)의 위치 분석을 보여준다. 도 10d는 4개의 NxS/T 세쿠온 변이 위치를 갖는 BacNucB의 1차 서열 분석과 N-글리칸 부위로서의 이들의 예상된 사용을 보여준다.
도 11a-11b는 조작된 BacNucB에 의한 렌티바이러스 벡터 생산 세포 배양물에서 잔여 플라스미드 DNA의 제거의 향상을 보여준다. 도 11a는 높은 벡터 역가를 유지하면서 pDNA를 감소시키기 위해 일시적 형질감염을 통한 렌티바이러스 벡터 생산 동안 무혈청 현탁 HEK293T 세포에서 BacNucB 변이체 발현 플라스미드(5% 총 pDNA)의 사용을 보여준다. 도 11b는 분비된 뉴클레아제 단백질을 검출하기 위해 항-히스티딘 태그 항체를 사용한 면역블롯팅 및 SDS-PAGE에 의한 농축된 벡터 상청액을 보여준다.
도 12a-12c는 변이된 NxS/T 세쿠온을 함유하는 조작된 변이체 'VcEndA-1glc'의 사용에 의한 렌티바이러스 벡터 생산 세포 배양물에서 잔여 플라스미드 DNA의 제거 향상을 보여준다. 도 12a는 높은 벡터 역가를 유지하면서 일시적 형질감염을 통한 렌티바이러스 벡터 생산 동안 무혈청 현탁 HEK293T 세포에서 VcEndA 변이체 발현 플라스미드(5% 총 pDNA)를 보여준다. 도 12b는 아가로스-전기영동을 통해 벡터 상청액으로부터의 잔여 DNA의 정도를 보여준다. 도 12c는 분비된 뉴클레아제 단백질을 검출하기 위해 항-히스티딘 태그 항체를 사용한 면역블 롯팅 및 SDS-PAGE에 의한 농축된 벡터 상청액 또는 생산-후 세포 용해물을 보여준다.
도 13은 발현 카세트로부터 분비된 VsEndA를 사용하여 0.5 L 규모의 렌티바이러스 벡터 생산 생물반응기로부터 잔여(플라스미드) DNA의 분해를 보여준다.
도 14a-14b: 도 14a는 발현 카세트로부터의 VsEndA를 사용한 5 L 규모의 렌티바이러스 벡터 생산 생물반응기로부터의 잔여 DNA의 분해 및 후속 다운스트림 프로세싱을 통한 총 KanR/TU를 보여준다. 도 14b는 겔 전기영동(DNA에 있어서 에티듐 브로마이드 염색)에 의해 분석되는 바와 같이 일부 공정 단계(A)에서 농축된 샘플의 분석을 보여준다.
도 15a-15b는 공동-형질감염 동안 tetR-조절된 VsEndA 발현 카세트를 사용하는 렌티바이러스 벡터 생산 세포 배양물에서 잔여 DNA의 분해를 보여준다. 도 15a는 벡터 생산 역가가 높게 유지됨을 보여준다. 도 15b는 아가로스-전기영동을 통해 벡터 상청액으로부터의 잔여 DNA의 정도를 보여준다.
도 16a-16b는 tetR-조절된 VsEndA 또는 SmNucA를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 함께 공동-배양된 렌티바이러스 벡터 생산 세포 배양물에서 잔여 DNA의 분해를 보여준다. 도 16a는 벡터 생산 역가가 높게 유지됨을 보여준다. 도 16b는 아가로스-전기영동을 통해 벡터 상청액으로부터의 잔여 DNA의 정도를 보여준다.
도 17a-17b는 VcEndA의 NxS/T N-글리칸 세쿠온 돌연변이체를 요약한다. 도 17a는 VsEndA 및 VcEndA의 단백질 정렬을 나타내는데, 진핵 세포에서 발현될 경우 N-글리코실화의 잠재적인 부위인 VcEndA 내의 NxS/T 세쿠온을 강조하였다. VcEndA의 첫 번째 N-글리칸 세쿠온(102NCT 위치)만 VsEndA와 공유되므로, VcEndA의 세쿠온 2, 3및 4와 관련된 VsEndA 내의 등가 위치에 있는 아미노산 서열은 이러한 세쿠온의 돌연변이에 대한 유용한 가이드를 제공한다. 따라서, 119NLT>NLV 및/또는 130NRS>DRS 및/또는 133NFS>NFR을 포함하는 변형의 조합을 포함하는 VcEndA의 변이체가 생성되었으며(도 17b에 표시됨; [작제물 9, 19-25]), SEQ ID NO: 1, 5-11을 발생시킨다.
도 18a-18b는 무혈청의 현탁 모드 LV 생산 배양물에서 생산-후 세포 용해물 및 배양 배지에서 SmNucAH6 및 VsEndAH6 대비 VcEndAH6 변이체의 발현을 보여준다. 도 18a는 튜불린(로딩 대조군) 및 항-His6(뉴클레아제)에 대해 프로빙된 LV 생산-후 세포 용해물의 면역블롯을 나타낸다. 도 18b는 VSVG(분비 제어) 및 항-His6(뉴클레아제)에 대해 프로빙된 농축된 미정제 벡터 수확물의 면역블롯을 나타낸다. 뉴클레아제의 분자량은 N-글리칸 상태에 의해 조절된다(일반적으로 단일 글리칸은 ~2.5kDa를 추가함); 변형되지 않은 뉴클레아제 크기는 다음과 같다: VcEndAH6 - 27.6kDa; VsEndAH6 - 27.9kDa; SmNucAH6 - 29.7kDa. 분비된 뉴클레아제 플라스미드는 형질감염시 0.5% 또는 5% 총 플라스미드 DNA에 첨가되었다. VcEndAH6 변이체는 도 17 및 SEQ ID NO: 1, 5-11에 기재되어 있다.
도 19a-19b는 도 17 및 18에 설명된 분비된 뉴클레아제의 존재하에 생성된 LV-CMV-GFP 벡터 역가는 물론 미정제 벡터 수확물에서 잔여 DNA에 대해 발생된 영향을 보여준다. LV 수확시, 생산 세포는 원심분리에 의해 제거되고, 상청액은 HEK293T 세포의 형질도입 후 흐름세포측정에 의해 적정 전에 여과되었다(0.22 μm); LV 역가는 그에 따라 계산하였다(도 19a). 또한, 상청액은 3K 컷-오프 Amicon-15 장치를 사용하여 원심분리에 의해 농축하고, 이 물질의 50%는 잔여 DNA 전기영동을 위해 2% 아가로스 겔에 로딩하였다(도 19b; 에티듐 브로마이드 염색된 겔). 데이터는 LV 역가가 분비된 뉴클레아제에 의해 최소한으로 영향을 받고, VcEndA N-글리칸 세쿠온의 조작은 뉴클레아제의 개선된 분비 및 향상된 잔여 DNA 제거를 발생시킴을 보여준다.
도 20a-20b는 산성 또는 알칼리성 배양 조건 하에 무혈청 현탁 배양물에서의 LV의 생산에서 VcEndAH6-1glc, VsEndAH6 및 SmNucAH6의 평가 동안 확인된 pH 설정점(도 20a) 및 세포 생존율(도 20b)을 나타낸다.
도 21a-21b는 산 또는 알칼리 배양 조건하에 무혈청의 현탁 모드 LV 생산 배양물에서 생산-후 세포 용해물 및 배양 배지에서 VcEndAH6-1glc, SmNucAH6 및 VsEndAH6의 발현을 보여준다. 도 21a는 튜불린(로딩 대조군) 및 항-His6(뉴클레아제)에 대해 프로빙된 LV 생산-후 세포 용해물의 면역블롯을 나타낸다. 도 21b는 VSVG(분비 대조군) 및 항-His6(뉴클레아제)에 대해 프로빙된 농축된 미정제 벡터 수확물의 면역블롯을 나타낸다. 뉴클레아제의 분자량은 N-글리칸 상태에 의해 조절된다(일반적으로 단일 글리칸은 ~2.5kDa를 추가함); 변형되지않은 뉴클레아제 크기는 다음과 같다: VcEndAH6 - 27.6kDa; VsEndAH6 - 27.9kDa; SmNucAH6 - 29.7kDa. 분비된 뉴클레아제 플라스미드는 형질감염시 5% 총 플라스미드 DNA로 첨가되었다.
도 22a-22b는 분비된 뉴클레아제 VcEndAH6-1glc, SmNucAH6 및 VsEndAH6의 존재하에 생성된 LV-CMV-GFP 벡터 역가뿐만 아니라 미정제 벡터 수확물에서 잔여 DNA에 대해 발생된 영향을 나타낸다. LV 수확시, 생산 세포는 원심분리에 의해 제거되고, 상청액은 HEK293T 세포의 형질도입 후 흐름세포측정에 의해 적정 전에 여과되었다(0.22 μm); LV 역가는 그에 따라 계산하였다(도 22a). 또한, 상청액은 3K 컷-오프 Amicon-15 장치를 사용하여 원심분리에 의해 농축하고, 이 물질의 50%는 잔여 DNA 전기영동을 위해 2% 아가로스 겔에 로딩하였다(도 22b; 에티듐 브로마이드 염색된 겔). 데이터는 VcEndAH6-1glc 변이체가 높은 역가 LV 생산을 유지하면서, VsEndAH6과 비교하여 산성 하에 잔여 DNA의 개선된 제거를 나타냄을 보여준다.
도 23a-23b는 산성 또는 알칼리성 배양 조건 하에 무혈청 현탁 배양물에서의 LV의 생산에서 VcEndAH6-124glc, VcEndAH6-1glc 및 VsEndAH6의 평가 동안 확인된 pH 설정점(도 23a) 및 세포 생존율(도 23b)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 데이터는 LV 생산의 후반 단계에서 세포 생존력에 대한 VcEndAH6-기반 뉴클레아제 발현의 잠재적 이점을 나타낸다(도 20에서도 관찰됨).
도 24a-24b는 분비된 뉴클레아제 VcEndAH6-124glc, VcEndAH6-1glc 및 VsEndAH6의 존재하에 생성된 LV-CMV-GFP 벡터 역가뿐만 아니라 미정제 벡터 수확물에서 잔여 DNA에 대해 발생된 영향을 나타낸다. LV 수확시, 생산 세포는 원심분리에 의해 제거되고, 상청액은 HEK293T 세포의 형질도입 후 흐름세포측정에 의해 적정하기 전에 여과되었다(0.22 μm); LV 역가는 그에 따라 계산하였다(도 24a). 또한, 상청액은 3K 컷-오프 Amicon-15 장치를 사용하여 원심분리에 의해 농축하고, 이 물질의 50%는 잔여 DNA 전기영동을 위해 2% 아가로스 겔에 로딩하였다(도 24b; 에티듐 브로마이드 염색된 겔). 데이터는 VcEndAH6-124glc 및 VcEndAH6-1glc 변이체가 높은 역가 LV 생산을 유지하면서, VsEndAH6와 비교하여 산성 하에 잔여 DNA의 개선된 제거를 나타냄을 보여준다.
도 25는 AAV 및 AdV와 같은 세포-관련 바이러스 벡터의 생산에 사용하기 위해 세포 내에서 더 많은 뉴클레아제를 유지하기 위해 뉴클레아제가 어떻게 변형될 수 있는지를 보여주는 개략도를 나타낸다. 본 발명의 구현예에 있어서, 뉴클레아제의 일부, 바람직하게는 모두는 신호 펩티다제(SPase)에 의해 절단되어 ER 루멘으로의 방출을 허용하는 단백질의 N-말단에서 인코딩된 기능적 ER 신호 펩티드(SP)를 사용하여 분비 경로로 표적화되어야 한다. 그러나, 선택적으로 뉴클레아제의 C-말단에 서열 'KDEL'(N에서 C로 판독)과 같은 ER-보유 신호를 첨부함으로써, 변형된 뉴클레아제는 'ER 보유-결함[ERD] 상보성 군' 단백질 수용체 중 하나에 의해 결합될 것이며, 이는 벡터 생산 세포 내에서 더 많은 뉴클레아제의 보유를 허용할 것이다. AAV 및 AdV와 같은 세포-관련 바이러스 벡터의 생산에 있어서, 이는 세포 용해 전에 배양 배지로부터 생산 세포를 분리(즉, 여과, 침전 또는 원심분리)하게 하는 반면, 뉴클레아제가 세포와 남아있을 수 있게 하며 생산 세포 DNA를 분해하기 위해 세포 용해 지점에 존재할 수 있게 한다.
도 26a-26b는 현탁액의 무혈청 HEK293T 세포에서 scAAV2-GFP 벡터의 생산 동안 분비되고 ER-보유된 뉴클레아제의 사용으로부터의 데이터를 나타낸다. 복제 scAAV2 벡터 생산 배양은 세포를 게놈, Repcap2 및 헬퍼 플라스미드, 및 5%(총 투입 pDNA)의 표시된 뉴클레아제 플라스미드 또는 뉴클레아제 비함유물(pBlueScript; AAV-NEG)로 형질감염시킴으로써 설정하였다. 뉴클레아제 vcEndAH6 [wt] 및 vcEndAH6-1glc는 선택적으로 C-말단 ER-보유 신호(KDEL; 도 25참조)로 조작되었고, smNucAH6과 비교하였다. 형질감염-후 2일째에 세포를 원심분리에 의해 수확하고 용해 처리하였다. 용해물에 염화마그네슘을 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하였다; 동시에 양성 대조군에 있어서, SAN을 AAV-NEG 용해물에 첨가하고, 인큐베이션하였다. 파편은 원심분리에 의해 펠렛화시키고, 상청액을 여과시키고, HEK293T 세포에 대한 벡터 역가에 대해 직접 분석하거나[도 26a] 아가로스 겔 상에 로딩하여 잔여 DNA 분해를 평가하였다[도 26b]. 이론에 얽매이지 않으면서, 'AAV-NEG' 샘플 레인 내의 잔여 DNA 수준은 많은 방출된 DNA가 샘플 여과 동안 손실되었기 때문에 처리되지 않은 세포 용해물 내에 실제로 존재하는 것보다 더 낮을 수 있으며, 이는 점도로 인해 수행되기 어렵게 하였다. 따라서, vcEndAH6 [wt] 변이체는 다른 뉴클레아제 변이체와 비교하여 잔여 DNA에 미치는 영향이 더 낮은 것으로 보이는 반면, 실제로는 상당한 활성을 가지는 것으로 보인다.
도 27은 도 26b에 제시된 잔여 DNA 아가로스 겔 이미지의 밀도계 분석을 나타낸다. ImageLab을 사용하여 겔 이미지를 여러 채널로 분할하여 각 샘플 레인이 2-3개의 채널로 오버레이되도록 하였다. 언급된 샘플 레인에 대한 대표적인 채널이 제시되며, 이는 빈 레인(배경)과 비교하여 상대적인 밴드 강도(임의 단위)를 나타낸다. 생성된 밴드 '프로파일'은 겔 웰 내부 및 샘플 레인 내부의 잔여 DNA를 보여준다. 도 26b에서 겔의 이미지로부터 볼 수 있듯이, 짧은 DNAse 내성 형태를 볼 수 있으며, 상관 피크가 레인 프로파일 내에서 관찰될 수 있다. VcEndAH6-1glc-KDEL 변이체는 다른 변이체 및 SAN에 비해 잔여 DNA의 더 큰 제거율을 달성할 수 있다.
도 28a-28b는 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물 내에서 최대에 근접한 수준의 뉴클레아제 발현을 달성하는 조건을 확인하기 위한 형질감염 최적화 실험의 결과를 나타낸다. 무혈청의 현탁 HEK293T 세포의 형질감염은 리포펙타민 2000CD(각 조건에서 플라스미드 DNA의 질량 당 동일한 비율)와 뉴클레아제 인코딩 플라스미드를 최종 형질감염된 세포 배양물 mL 당 100, 300, 500, 700 또는 900 ng로 혼합하여 매개되었다. 강한 CMV 또는 더 약한 SV40 프로모터에 의해 구동되는 VcEndAH6-1glc 또는 SmNucAH6 발현 플라스미드가 사용되었다. 비교로서, 복제 배양물은 또한 바이러스 벡터 생산(즉, 동일한 세포에서 제조된 뉴클레아제 및 벡터)을 위해 세포를 공동-형질감염시킬 경우 형질감염 혼합물의 유형을 모방하기 위해 5% 총 플라스미드 투입물과 95% pBluescript 투입물의 각각의 뉴클레아제 플라스미드로 공동-형질감염시켰다; 이는 효과적으로 mL 당 62 ng의 뉴클레아제 플라스미드였다. 복제 형질감염은 바이러스 벡터 생산 배양물 내의 조건을 모방하기 위해 형질감염 후 ~20 시간에 소듐 부티레이트(10 mM 최종 농도)에 의해 유도하였다. 형질감염 후 2일째에 헬퍼 세포 배양물 상청액을 여과하고(0.2 μm), 3K 컷-오프 스핀 칼럼으로 농축하고, 세포 용해물을 뉴클레아제(항-HisTag) 및 GAPDH(세포 용해물 단독)에 대한 면역블롯팅 전에 생성하였다. [A] 모든 조건에 대해 플롯된 정규화된 면역블롯 밴드 강도. [B] 헬퍼 세포 배양물 내 분비된 뉴클레아제 단백질의 면역블롯.
도 29a-29c는 주요 벡터 생산 배양과 병행하여 일시적 형질감염에 의해 생성된 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하여 40 mL 쉐이크 플라스크 규모에서 무혈청 현탁 HEK293T 배양물에서 렌티바이러스 벡터(LV-CMV-GFP) 생산 결과를 보여준다. 뉴클레아제 헬퍼 세포는 750 ng(최종 배양물의 mL 당)의 pSV40-VcEndAH6-1glc 또는 pSV40-SmNucAH6으로 HEK293T 세포를 형질감염시킴으로써 생성시키고, 동시에 이전 실시예에 사용된 조건 하에서 벡터 구성요소로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 약 20시간째에, 배양물을 계수하고, 주요 벡터 생산 용기에서 총 세포의 요망되는 목표 백분율 비율을 달성하기 위해 헬퍼 세포를 주요 벡터 생산 용기에 첨가하였다. 본 실시예에서, 헬퍼 세포 비율은 1% 내지 10% 총 세포의 범위이다. 소듐 부티레이트를 동시에 최종 농도 10 mM가 되도록 첨가하였다. 형질감염 후 2일째에, 벡터 상청액을 수확하고, 정화하고(0.2 μm), 추가 분석으로 처리하였다. [A] 벡터 상청액은 부착 HEK293T 세포의 형질도입에 이어 형질도입 2일 후 FACS에 의해 적정하였다. [B] 헬퍼 세포 및 벡터 상청액을 3K 컷-오프 스핀 칼럼으로 농축하고, 뉴클레아제 발현(항-HisTag) 또는 아가로스 겔(에티듐 브로마이드; 벡터 상청액 단독)에서 잔여 DNA 분석에 대해 분석하였다 [C].
도 30a-30b는 잔여 DNA를 제거하기 위해 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용할 경우 무혈청 현탁 HEK293T 세포에서 렌티바이러스 벡터(LV-CMV-GFP)의 생산의 분석을 나타낸다. 주요 벡터 생산 배양과 병행하여, 무혈청 현탁액 HEK293T 세포를 배양 배지 mL 당 750 ng의 pCMV-VcEndAH6-1glc로 형질감염시켰다. 소듐 부티레이트 유도 시점에서, 뉴클레아제 헬퍼 세포를 지시된 비율(전체 세포 백분율)로 주요 벡터 생산 용기에 접종하였다. 부착 HEK293T 세포에 대한 적정을 위한 벡터 상청액을 취한 다음 FACS로 처리하고[A], 또한, 아가로스 겔 분석(에티듐 브로마이드)을 위해 3K 컷-오프 스핀 칼럼으로 농축하였을 때[B], 표준 벡터 생산은 형질감염 후 2일까지 계속되었다.
도 31a-31b는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 첨가할 때, 렌티바이러스 벡터 생산 배양 배지 내에서 특정 뉴클레아제 활성과 획득가능한 뉴클레아제 분비 수준 사이의 상관관계를 나타내며; 벡터 제조 생산물은 도 30에 도시된 것과 동일하다. 배양 상청액은 Benzonase®를 표준 곡선으로 사용하여 DNAse Alert 검정에 의해 뉴클레아제 활성에 대해 분석하였다[A]. 실험에서 농축된 배양 상청액은 뉴클레아제에 대한 면역블롯팅(항-HisTag)에 의해 분석하였다[B].
도 32a-32b는 공동-형질감염에서 VcEndAH6-1glc를 사용하여 5 L 생물반응기 규모에서 무혈청 현탁 HEK293T 배양물에서 렌티바이러스 벡터(LV-CMV-GFP) 생산 결과를 제시하다. PSV40-VcEndAH6-1glc는 5% 총 투입의 LV 구성요소 플라스미드와 혼합한 반면, '표준' 대조군 생물반응기는 총 투입량 5%의 pBlueScript로 형질감염시켰다. 벡터의 생산은 실시예 21에 설명된 바와 같이 진행하였으며, 형질감염-후 6.7의 pH를 유지하였다[A]. 약 2.5 L의 정화된 수확 물질이 각각의 명시된 단계에서 샘플링하면서 다운스트림 공정을 통해 취하였다: 인-바이오(MgCl2 +/- Benzonase®로 1시간 인큐베이션 전), CLH(정화된 수확물; MgCl2 +/-Benzonase®로 처리 후), IEX 용출물(IEX 칼럼에서 용출된 물질 [0.6 M NaCl로 희석됨], 전 HFF(Benzonase® 첨가 전 중공 섬유 카트리지를 사용하여 정용/한외-여과에 의한 완충액 교환된 IEX 용출물), 후 HFF(Benzonase® 처리 후, 완충액 교환). 에티듐 브로마이드를 함유하는 2% 아가 겔에 로딩하기 전에 샘플을 3K 컷-오프 스핀 칼럼에 의해 농축하였다[B].
도 33은 pSV40-VcEndAH6-1glc, pSV40-VcEndAH6-1glc-KDEL로 형질감된 무혈청 현탁 HEK293T 세포 또는 형질감염되지 않은 세포의 세포 용해물로 로딩된 염색된 SDS-PAGE 겔을 나타낸다. VcEndAH6-1glc-KDEL은 VcEndAH6-1glc과 비교하여 세포 추출물 내에서 풍부하였다.
발명의 상세한 설명
본원에 개시된 본 발명의 실행은 달리 지시되지 않는 한, 당업자의 능력 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌 [J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, NY; B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg (1992) Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press] 참조. 이들 일반 텍스트 각각은 본원에 참조로 포함된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, "rev" 및 "gag-pol"은 렌티바이러스 벡터의 단백질 및/또는 유전자를 의미하다.
뉴클레아제-분비 바이러스 벡터 생산 시스템
본원에 기재된 발명은 적어도 하나의 뉴클레아제를 발현 및 분비하여 바이러스 벡터 생산 동안 원치 않는/오염 즉, 잔여 핵산을 분해하고, 바이러스 벡터를 생산하는데 필요한 구성요소를 인코딩하는 일련의 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제-분비 바이러스 벡터 생산 시스템이다.
따라서, 본원에 개시된 발명은 바이러스 벡터 또는 바이러스-기반 백신의 생산 동안 바이러스 벡터 생산 세포에 의해 뉴클레아제를 발현 및 분비하는 개선된 벡터 생산 시스템을 제공한다. 그 결과, 그렇지 않으면 미정제 수확 물질과 회합되는 원치않는(오염) 잔여 핵산(예를 들어, pDNA)은 생산된 바이러스 벡터 품질 및 양에 때때로 어느 정도까지 손상을 줄 수 있는 부담스러운 상업적 뉴클레아제 효소 처리의 업스트림 및/또는 다운스트림 단계로 전형적으로 필요한 것보다 간소화된 방식으로 생산 공정 동안 분해된다. 문헌 [Merten, O-W., Schweizer, M., Chahal, P., & Kamen, A.A. Manufacturing of viral vectors for gene therapy: part I. Upstream processing. Pharmaceutical Bioprocessing 2, 183-203 (2014); Merten, O-W., Schweizer, M., Chahal, P., & Kamen, A.A. Manufacturing of viral vectors: part II. Downstream processing and safety aspects Pharmaceutical Bioprocessing 2, 237-251 (2014); Gousseinov, E., Kools, W., and Pattnaik, P. Nucleic Acid Impurity Reduction in Viral Vaccine Manufacturing. BioProcess International 12, 59-68 (2014)]에서 널리 공지된 업스트림 및 다운스트림 처리 단계를 참조한다. 동일한 이유로, 본원에 개시된 발명은 또한 개선된 엑소좀 및 게시클(gesicle) 생산 시스템을 제공하는데 유용하다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열(들)은 뉴클레오티드 발현 카세트(들) 또는 플라스미드 형태로 존재할 수 있다. 이러한 발현 카세트(들)는 바이러스 벡터 구성요소 발현 카세트(들)와 공동-형질감염되고/되거나 바이러스 벡터 생산 세포 DNA(또는 세포 게놈) 내에 안정적으로 통합된다.
일 구현예에서, 본원에 개시된 본 발명의 핵산 서열(들)은 하나 이상의 뉴클레아제를 인코딩하는 발현 작제물이다. 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제는 바이러스 벡터 생산 동안 2개의 뉴클레아제(또는 뉴클레아제 도메인)가 분비되게하는 방식으로 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 추가 구현예에서, 뉴클레아제 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 도메인 및 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하고, 이에 의해 바이러스 벡터 생산 동안 분비된 엔도뉴클레아제는 원형 플라스미드 DNA를 분해하는 반면, 분비된 엑소뉴클레아제는 히스톤 단백질 주위로 감겨진 DNA를 더욱 효율적으로 분해하기 위해 5' 및/또는 3' 말단에서 선형 DNA를 표적으로 하고 분해하며, 이는 그렇지 않으면 엔도뉴클레아제에 접근할 수 없다.
뉴클레아제 발현 카세트는 뉴클레아제의 발현을 구동시키는 프로모터 서열 및/또는 조절 요소(들)를 포함한다. 이러한 프로모터는 뉴클레아제의 구성적, 유도성 및/또는 조건부 발현을 유도할 수 있다. 또한, 뉴클레아제는 뉴클레아제를 세포 배양물 내에 분비하기 위한 천연 및/또는 비-천연 N-말단 분비 신호를 포함한다.
본원에 개시된 본 발명의 대안적 구현예에서, 뉴클레아제 발현 카세트는 바이러스 벡터 생산 세포와 함께 (또는 공동-배양에) 사용되는 뉴클레아제 헬퍼 세포 내에서 일시적으로 형질감염되거나 안정하게 통합하는데 사용된다. 그 후, 이러한 뉴클레아제 헬퍼 세포는 바이러스 벡터 제조 동안 바이러스 벡터 생산 세포와 첨가되며, 바이러스 벡터 생산 끝까지 공동-배양된다.
업스트림 바이러스 벡터 생산 공정 동안 뉴클레아제를 분비하기 위해 본원에 개시된 본 발명의 배양된 세포를 사용하는 접근법은 1) 바이러스 벡터 비리온이 생성되는 즉시 배양 배지 내에서 원치않은 또는 오염(잔여) 핵산의 즉각적 분해, 2) 추가의 부담스러운 조작 없이 바이러스 생산 전반에 걸쳐 뉴클레아제의 영구 분비, 3) 상업적 뉴클레아제(예를 들어, Benzonase®)로의 바이러스 벡터 미정제 수확 물질의 처리 단계 제거, 4) 정제된 벡터 생성물 내부에서 잔여 DNA의 실질적인 감소 및 5) 다운스트림 바이러스 벡터 정제/처리 동안 재조합 뉴클레아제 첨가와 관련된 비용 감소의 이점을 갖는다.
본원에 개시된 본 발명은 부착 및/또는 현탁 무혈청 세포 배양물에서 분비된 뉴클레아제를 발현하는 바이러스 벡터 생산 시스템(일시적 및 안정한 벡터 생산 측면 둘 모두에서)을 제공한다. 놀랍게도, 바이러스 벡터 생산 동안 바이러스 벡터 비리온의 어셈블리와 관련된 복잡한 생물학을 고려하여, 본원에서 본 발명자는 바이러스 벡터 생산 동안 세포 배양물에서 뉴클레아제의 발현 및 분비가 여전히 높은 생산 역가를 유지하면서 업스트림 및 다운스트림 바이러스 벡터 제작에서 수 많은 문제를 극복함을 보여준다. 본 발명자는 또한 실험실 규모 또는 소규모 바이러스 벡터 생산에서부터 생물반응기에서의 바이러스 벡터 생산까지 확장성을 입증한다.
본원에 개시된 발명은 분비된 뉴클레아제가 시중에서 입수가능한 뉴클레아제, 예컨대 Benzonase® 및 SAN (염-활성 뉴클레아제)에 비해 개선된 성능으로 미정제 벡터 수확물 내 잔여 DNA를 분해한다는 증거를 제공한다. 본원에 개시된 발명은 광범위하게 분기하는 뉴클레아제(예를 들어, 그람-음성 및 양성 박테리아로부터 유래됨)가 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 DNA를 분해함을 보여준다. 본원에서 뉴클레아제-첨부된 C-말단 히스티딘 태그가 뉴클레아제 분비 기능에 영향을 미치지 않는 것으로 본원에 나타나기 때문에, 항-히스티딘-태그 기반 ELISA를 사용하여 최종 바이러스 벡터 제형에서 잔여 뉴클레아제를 측정하였다.
중요하게는, 본원에 개시된 발명은 뉴클레아제 분비 시점이 공동-형질감염된 바이러스 벡터 구성요소 발현 카세트로부터의 유전자 발현에 일시적으로 연결된다는 증거를 제공한다. 이러한 방식으로, 뉴클레아제 발현은 잔여 플라스미드 DNA 분해가 요구되는 가장 빠른 시점에서 시작된다. 더욱이, 또 다른 구현예에서, 뉴클레아제의 유도성 발현은 본원에 개시된 바이러스 벡터 생산 시스템에서 뉴클레아제 발현의 시간적 제어를 허용한다.
본 발명의 일 양태에서, 바이러스 벡터 생산 세포주는, 바이러스 벡터 생산 동안 유도인자의 첨가시 세포 배양 배지 내로의 뉴클레아제의 안정한 분비를 허용하는 테트라사이클린-기반 접근법을 기반으로 하는 것과 같은 유도성 뉴클레아제 발현 카세트 및 바이러스 벡터 발현 카세트(들)로 형질감염된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 뉴클레아제 카세트는 바이러스 벡터 구성요소를 안정하게 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포 내로 도입된다. 이러한 방식으로, 뉴클레아제의 안정적인 분비는 선택된 조절 요소에 따라 세포 배양 배지 내로의 항시적 분비 또는 유도성 분비일 수 있다. 또한, 벡터 구성요소의 일부가 조절되는 양태에서, 뉴클레아제 카세트는 바이러스 벡터 구성요소와 동일한 또는 별개의 조절 요소의 조정하에 있으며, 후자는 뉴클레아제 및 벡터 구성요소의 일시적 조정을 분리한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 뉴클레아제 카세트는 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 생산 시스템에서 뉴클레아제를 발현하고 분비한다.
지연된 환경에서 뉴클레아제 발현의 조절과 관련된 대안적인 양태에서, HIV-1 rev 또는 유사한 레트로바이러스 RNA-이출(export) 단백질은 뉴클레아제 발현을 조절하기 위해 전사 조절 조정 구성요소(들)의 사용에 추가하여 또는 이 대신에 뉴클레아제 분비의 조정에 사용된다. 이러한 방식으로, 뉴클레아제-인코딩 mRNA는 HIV-1 rev-반응성 요소(RRE, HIV-1 rev에 의해 결합됨) 또는 유사한 레트로바이러스 RNA-이출 단백질-반응성 요소를 포함한다. 뉴클레아제 ORF 및 RRE는 발현 카세트 내의 동일한 인트론 내에 위치하며, 따라서, HIV-1 rev(또는 유사한 레트로바이러스 RNA-이출 단백질)의 부재하에 세포질 내의 뉴클레아제-인코딩 mRNA의 양이 rev의 존재하의 뉴클레아제의 양과 비교하여 감소된다. HIV-1 rev 또는 유사한 레트로바이러스 RNA-이출 단백질은 뉴클레아제의 발현을 증가시키기 위해 벡터의 생산 동안 요구되는 시점에서 공동-발현된다.
본원에 개시된 것은 뉴클레아제 헬퍼 세포가 바이러스 벡터 생산 세포와 공동-배양하기 위해 바이러스 벡터 생산 업스트림 공정 중에 도입될 수 있다는 증거이다. 이와 관련하여, 뉴클레아제가 동시에 공급된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 뉴클레아제-헬퍼 세포 또는 헬퍼 세포는 바이러스 벡터 생산 배양과 동시에 배양될 수 있으며, 그 후 분비된 뉴클레아제를 포함하는 배지가 바이러스 벡터 생산 세포 배양물에 공급된다.
또 다른 양태에서, 뉴클레아제 헬퍼 세포 또는 헬퍼 세포는 엑소좀 생산 배양과 동시에 배양될 수 있으며, 그 후 분비된 뉴클레아제를 포함하는 배지가 엑소좀 생산 세포 배양물에 공급된다.
또 다른 양태에서, 뉴클레아제 헬퍼 세포 또는 헬퍼 세포는 게시클 생산 배양과 동시에 배양될 수 있으며, 그 후 분비된 뉴클레아제를 포함하는 배지가 엑소좀 게시클 세포 배양물에 공급된다.
본원에 개시된 본 발명의 또 다른 양태에서, 뉴클레아제 카세트는 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 AAV 또는 아데노바이러스 벡터 생산 시스템에서 뉴클레아제를 발현하고 분비한다.
일반적으로, AAV-기반 벡터는 포유동물 세포주(예를 들어, HEK293-기반)에서 또는 바쿨로바이러스/Sf9 곤충 세포 시스템의 사용을 통해 생산된다. AAV 벡터는 전형적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)로부터 헬퍼 기능과 함께 DNA를 인코딩하는 벡터 구성요소의 일시적인 형질감염에 의해 또는 AAV 벡터 구성요소를 안정적으로 발현하는 세포주의 사용에 의해 생산될 수 있다. 아데노바이러스 벡터는 일반적으로 아데노바이러스 E1 기능을 안정적으로 발현하는 포유동물 세포주에서 전형적으로 생성된다(예를 들어, HEK293-기반). 아데노바이러스 벡터는 또한, 일반적으로 생산 세포주를 사용하여 일련의 '감염' 라운드를 통해 헬퍼-기능 의존적 복제를 통해 '증폭'된다. 본원에 개시된 발명에 있어서, AAV 벡터 및 아데노바이러스 벡터 생산의 공통적인 특징은 세포-관련된 벡터 비리온을 더욱 효율적으로 방출하기 위한 세포 용해 단계이다. 동결-해동과 같은 일부 방법은 수확 배지 내에서 세포 용해를 허용하는 반면, 더 큰 규모에서 동결-해동 또는 기계적 또는 화학적 처리에 의한 세포 용해 전에 (예를 들어, 원심분리 또는 여과에 의해) 생산 세포를 농축시키는 것이 바람직할 수 있다. 세포 용해 단계에서, 미정제 벡터는 전형적으로 생산 세포 DNA로 실질적으로 오염되며, 일반적으로 재조합 뉴클레아제 단백질의 시중의 공급원(예컨대, Benzonase® 또는 SAN-HQ)은 DNA의 양을 최소화하기 위해 세포 용해 직전 및/또는 후에 사용되며; 이는 점도를 감소시키며 후속 다운스트림 처리를 용이하게 한다.
따라서, 본원에 개시된 발명은 비제한적으로, AAV 및 아데노바이러스 벡터 생산 시스템 및 제조 공정에서 시중의 뉴클레아제 대신에 분비된 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 이러한 시스템 및 공정의 맥락에서, 분비된 뉴클레아제는 배지(세포 용해가 배양 배지 내에서 발생하는 경우) 및/또는 벡터 생산 세포 내에서 '정상 상태' 단백질 풀로서 존재하는데, 왜냐하면 뉴클레아제는 성숙한 뉴클레아제로서 ER-Golgi 네트워크 내로 지속적으로 발현되고 분비되기 때문이다. 생산 세포 내에 존재하는 뉴클레아제는 세포가 배양 배지로부터 멀리 농축되어 있으나, 세포 용해시 방출되는 경우 존재하며, 따라서 오염 (또는 잔여) DNA에 접근한다. 대안적으로, 분비된 뉴클레아제는 물론 '유리' 벡터 비리온을 포함하는 정화된 배양 상청액은 추가 다운스트림 처리 전에 DNA 분해를 유발하기 위해 벌크 세포 용해물에 '다시 추가'될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 세포 용해가 요구되는 이러한 AAV- 또는 아데노바이러스-기반 벡터 생산(또는 실제로 벡터 비리온이 주로 세포 회합된채 남아 있는 임의의 바이러스 벡터 플랫폼)에서 뉴클레아제 분비는 유도성의 안정한 뉴클레아제 발현 카세트를 함유하는 진핵 세포를 활용할 수 있다. 또 다른 양태에서, 뉴클레아제 분비는 형질감염된 세포(예를 들어, RapAd® 시스템) 내에서 재조합을 수행할 경우 AAV 벡터 생산 또는 아데노바이러스 벡터 마스터 시드 스톡의 생산을 위한 뉴클레아제 플라스미드의 (다른 벡터 성분과 함께) 일시적 형질감염을 통해 달성될 수 있다.
뉴클레아제
뉴클레아제 구조 및 기능은 본 분야에 널리 공지되어 있다(Yang, Q. Rev. Biophys. 2011 Feb; 44(1)L1-93). 뉴클레아제는 핵산 - DNA 및 RNA를 가수분해하는 편재 부류의 효소이다. 이들 효소는 폴리뉴클레오티드의 백본 내의 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 매개하여 절단을 일으킨다. 많은 뉴클레아제는 이들의 최대 활성을 위해 금속 이온을 필요로 한다. 뉴클레아제는 이들의 모드 오프 공격에 의해 지배되는 2개의 광범위한 군으로 분류될 수 있다: [1] 엔도뉴클레아제 및 [2] 엑소뉴클레아제.
엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내의 포스포디에스테르 결합을 공격한다(내부/'엔도'); 일부 엔도뉴클레아제는 비-특이적이며, 이는 이들이 임의의 뉴클레오티드 사이를 절단하는 반면, 다른 것은 특이적-디뉴클레오티드에서 선호 부위를 가질 수 있음을 의미한다.
엑소뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬의 5' 또는 3' 말단에 존재하는 핵산의 말단에서 분해된다. 일부 뉴클레아제, 예를 들어 뉴클레아제 Bal-31은 엔도- 및 엑손-뉴클레아제 특성 둘 모두를 가질 수 있으며, 이는 표적의 특성(즉, 표적이 dsDNA 또는 ssDNA인지)에 따라 폴리뉴클레오티드 내에서 및 말단으로부터 DNA를 분해할 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드가 자유 5' 또는 3' 말단을 보유할 필요가 없음을 고려할 때, 엔도뉴클레아제는 원형 형태의 DNA(예컨대, 플라스미드 DNA)를 분해할 수 있다. 이와 같이, 본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 '당-비-특이적' 뉴클레아제로부터의 뉴클레아제인데, 이들 효소는 서열-독립적 방식으로 ssDNA, dsDNA, ssRNA 및/또는 dsRNA를 비-특이적으로 분해할 수 있기 때문이다. 이 군은 '세라티아' 패밀리의 뉴클레아제를 포함하며, 이는 박테리아 뉴클레아제(NucA) 및 효모에서 Nuc1p로서 또한 알려진 진핵생물 미토콘드리아 엔도뉴클레아제 G(Endo G)를 포함한다. 세리아티아 뉴클레아제는 구조적으로 매우 유사하다; 촉매적 ββα 모티프는 구조적 서브메인을 형성하고 6-가닥 역평행 β-시트의 한 면에 대해 패키징된다. '당-비-특이적' 뉴클레아제는 또한 박테리아 세포질주변 엔도뉴클레아제 I 패밀리의 뉴클레아제, 예를 들어 VsEndA를 포함한다.
진핵 또는 원핵 세포로부터 분비된 뉴클레아제는 고전적 분비 경로의 모든 분비된 단백질의 유사한 특징에 의해 지배되는 유사한 분비 경로를 공유한다. 리보솜으로부터 출현하는 성숙-전 뉴클레아제 단백질의 N-말단에 위치한 상대적으로 짧은 펩티드(전형적으로 30개 잔기 미만)는 세포질/사이토졸로부터 진핵생물 또는 원핵생물 각각의 소포체(ER) 또는 원형질막으로의 세포 기계적 및 물리적 재배치에 의해 인식되며, 여기에서 번역은 분리된 세포 구획으로 막을 통해 계속된다. 단백질 번역 후, 분비 펩티드가 절단되며, 여기에서 단백질 폴딩이 완료되며, 성숙한 뉴클레아제는 ER(진핵생물) 또는 주변세포(원핵생물) 내에 함유된다. 그 후, 뉴클레아제는 전형적으로 세포외 공간 내로 방출될 것이다.
본원에 개시된 방법은 비제한적으로, 바이러스 벡터 생산에서 분비될 수 있는 야생형 및 변형된 또는 변이된(즉, 변이체) 뉴클레아제의 사용을 포함한다. 이러한 뉴클레아제는 박테리아 또는 천연 분비 펩티드를 대체하기 위한 진핵생물 분비 신호를 선택적으로 포함할 수 있다. 예시적인 분비 신호 펩티드는 비제한적으로, 하기 표에 나열된 것들을 포함한다:
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본원에 개시된 본 발명에 사용하기 위한 뉴클레아제는 신규한 N-글리칸 세쿠온 부위의 발생 또는 기능-파괴 N-글리칸 세쿠온에 관한 변형 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 고전적 분비 경로를 통해 진핵 세포로부터 효율적으로 분비될 수 있는 뉴클레아제 활성을 가진 단백질의 분비는 오픈-리딩 프레임(ORF)의 시작부에서 인코딩된 기능성 분비 신호-펩티드의 존재를 필요로 하며, 종종 분비된 단백질은 적어도 하나의 아스파라긴-연결된(N-연결된) 글리칸을 포함할 것이며 따라서 분비가 더욱 효율적이게 된다. 글리코실화는 진핵 세포에서 발견된 분비 경로를 통해 이출되는 동안 NxS 또는 NxT 세쿠온(여기에서 x는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음)의 아스파라긴 잔기에서 발생하며, 박테리아 분비된 뉴클레아제는 이러한 방식으로 글리코실화되지 않는다. 그러나, NxS/T 모티프는 또한 종종 박테리아 뉴클레아제에서 발생하기 때문에, 원칙적으로 이들 부위는 박테리아 뉴클레아제가 본원에 개시된 본 발명에 따라 진핵 세포로부터 발현되는 경우 이용될 수 있다. N-글리칸 부위 예측 프로그램(예컨대, NetNGlyc)은 어떤 NxS/T 부위가 가장 많이 활용될 수 있을 것인지를 확인하는데 도움이 될 수 있다. 추가로, DNAse 활성 부위에 대한 N-글리칸의 근접성 및 DNA 활성에 대한 임의의 영향에 대한 결정이 이루어질 수 있다. 실제로, 발명자들은 뉴클레아제가 본원에 개시된 바와 같이 생산 세포 당 및/또는 바이러스 벡터 생산 시스템의 맥락에서 분비를 개선하도록 NxS/T 세쿠온을 조절하거나 변형시키기 위해 변이될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 ER 보유 신호와 같은 보유 신호로의 뉴클레아제의 C-말단 부가의 변형을 포함할 수 있으며, 이는 ER 및/또는 골지 구획에 뉴클레아제를 국소화시킴으로써 세포-보유 또는 세포-회합을 개선시킨다. 이러한 방식으로, 뉴클레아제는 ER 보유-결함 상보 그룹의 ER 수용체에 결합한다. 이러한 변형은 벡터 생산 동안, 특히 AAV 벡터 생산 동안 세포 용해물로부터 잔여 DNA 제거를 개선한다. 보유 신호는 비제한적으로, 컨센서스 [KRHQSA]-[DENQ]-E-L 또는 KKXX의 보유 신호, 및/또는 컨센서스 KDEL의 보유 신호를 포함한다. KDEL 모티프를 갖는 C-말단 보유 신호는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Raykhel et al., J. Cell. Biol., 2007 Dec 7, 179(6): 1193-1204).
세포-보유/회합을 달성하기 위한 본 발명의 뉴클레아제에 대한 대안적 변형은 비제한적으로, 뉴클레아제의 C-말단에서 GPI 앵커 또는 트랜스멤브레인 도메인의 사용을 포함한다. 이와 같이, 대안적인 구현예에서, 변형된 뉴클레아제는 이의 C-말단에서 GPI 앵커 및/또는 트랜스멤브레인 도메인을 포함한다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 바이러스 벡터 생산 시스템의 기능성을 위한 최적의 pH 또는 pH 범위를 갖는 뉴클레아제이다. 본 발명의 분비된 뉴클레아제는 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 최적인 pH 또는 pH 범위에서 기능한다. 본원에 개시된 본 발명의 분비된 뉴클레아제의 최적 pH는 비제한적으로, 약 pH6, 약 pH6.5, 약 pH6.6, 약 pH6.8, 약 pH7, 약 pH7.2, 약 pH7.5이다. 본 발명의 분비된 뉴클레아제의 최적 pH 범위는 비제한적으로, 약 pH6 - 약 pH7, 약 pH6 - 약 pH6.5, 약 pH6 - 약 pH7.2, 약 pH6.5 - 약 pH7.2, 약 pH6.5 - 약 pH7.5, 약 pH6.5 - 약 pH7, 약 pH6.5 - 약 pH6.8, 약 pH6.6 - 약 pH7.2, 약 pH6.6 - 약 pH7.5, 약 pH6.6 - 약 pH7.2, 약 pH6.6 - 약 pH7, 약 pH6.6 - 약 pH6.8, 약 pH6.8 - 약 pH7, 약 pH6.8 - 약 pH7.2, 약 pH7 - 약 pH7.2, 약 pH7 - 약 pH7.5, 약 pH7.2 - 약 pH7.5이다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로 바이러스 벡터 생산 시스템에서 분비될 수 있는 가수분해 뉴클레아제, 예컨대 비제한적으로 세포외 뉴클레아제 또는 세포외 뉴클레아제로서 기능하도록 변형된 뉴클레아제이다.
생산 시스템으로부터 오염(또는 잔여) 핵산(DNA 및 RNA 둘 모두)을 가능한 한 많이 제거해야할 경우 제조 맥락에서 상업적 뉴클레아제(단백질-형태)의 광범위한 사용이 발생한다. 생산이 세포내에서 발생하는 경우 또는 세포가 생산 동안 용해되는 경우 핵산을 제거하기 위한 요건이 특히 중요함이 널리 알려져 있다. 그 결과, 다량의 오염 핵산이 방출되며, 이는 여과 및/또는 크로마토그래피와 같은 추가의 정제 공정을 예를 들어, 샘플의 증가된 점도로 인해 더욱 어렵게 한다.
이와 같이, 본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 오염 (또는 원치않은) 잔여 핵산(바람직하게는, DNA 그러나, 또한 RNAse 활성을 가질 수 있음)을 절단(즉, 분해)하면서 바이러스 벡터 생산 시스템에 있어서 뉴클레아제 기능성 및 안정성을 나타내는 뉴클레아제이다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 바이러스 벡터 생산 시스템에서 잔여 핵산을 분해할 수 있는 원핵생물 뉴클레아제, 진핵생물 뉴클레아제 및/또는 이의 기능성 변이체 또는 유도체이다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 바이러스 벡터 생산 시스템에서 dsDNA, ssDNA, dsRNA 및/또는 ssRNA를 분해할 수 있는 당-비-특이적 뉴클레아제 및/또는 이의 기능성 변이체, 도메인 또는 유도체이다.
본원의 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 비브리오 살모니시다(Vibrio salmonicida), 세라티아 마르세센스 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 이의 변이체 및 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 유기체로부터 유래된 뉴클레아제이다.
본원의 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 임의의 공지된 뉴클레아제 또는 공지된 유기체로부터 유래된 뉴클레아제이다. (상기 Wang 참조) 예를 들어, 비제한적으로, 본 발명의 뉴클레아제는 비브리오 콜레라, 비브리오 살모니시다, 세라티아 마르세센스 및 바실러스 리체니포르미스로부터 유래된 뉴클레아제이다. 추가로, 비제한적으로, 본 발명의 뉴클레아제는 하기 범주의 임의의 알려진 뉴클레아제이다:
포식성 박테리아 뉴클레아제, 예를 들어 브델로비브리오 박테리오보러스(Bdellovibrio bacteriovorus) Bd1244, Bd1934
식물 뉴클레아제, 예를 들어 호르데움 불가레 L(Hordeum vulgare L) 마이크로스포어 뉴클레아제(Barley)
Snase 패밀리 뉴클레아제, 예를 들어 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) NucA
장 뉴클레아제, 예를 들어, 췌장 DNAse I
낮은 pH 활성, 예를 들어 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) Rv0888(낮은 pH 뉴클레아제)
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, smNucA (NCBI 참조 서열: WP_047571650.1), VsEndA (GenBank: CAQ78235.1), VcEndA (NCBI 참조 서열: WP_000972597.1), BacNucB (NCBI 참조 서열: WP_003182220.1), 이의 변이체, 및 이의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로, 비브리오 콜레라로부터의 엔도뉴클레아제 I의 변형된 변이체(VcEndA로서 본원에서 언급됨)이다. 야생형 VcEndA에 대한 참조 서열 [예측 진핵생물 신호 펩티드는 굵은체, NxS/T 세쿠온은 밑줄]은 하기 SEQ ID NO: 1로서 본원에 제공된다:
Figure pct00002
비제한적으로, 언급된 돌연변이를 갖는 VcEndA의 변이체는 하기와 같다:
Figure pct00003
Figure pct00004
VcEndA는 비브리오나세에 패밀리에서 구부러신 간상 그람-네거티브 박테리아 종이다. 이러한 벡티라아 뉴클레아제는 진핵생물 분비 신호 펩티드로서 기능하는 박테리아 분비 신호를 포함한다. 이러한 뉴클레아제의 최적의 염 농도는 150 - 200 mM이며, 이는 광범위한 pH에 걸쳐 활성이며, 이는 바이러스 벡터 생산 세포 배지 내로의 분비를 위한 이상적인 세포외 뉴클레아제 후보가 되게 한다. 비변형된 VcEndA는 벡터 생산 세포로부터 발현되는 경우 검출가능한 분비 및 DNAse 활성을 갖는 반면, N119, N130, N133(성숙전 천연 VcEndA에 대한 잔기 번호)에서 출발하는 NxS/T 모티프의 제거는 본원에 개시된 발명에서 VcEndA의 개선된 분비 및 DNA의 제거를 가능하게 한다.
본원에서 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로 '염-활성' 뉴클레아제이며, 이는 전형적으로 호염성 미생물 유기체로부터 유래된다. 다른 뉴클레아제와 달리, 염-활성 뉴클레아제는 초-생리학적 염 농도(예를 들어, > 0.15 M [NaCl])의 활성을 유지한다. 이와 같이, 수확 후 정화된 벡터 물질 및 염-활성 뉴클레아제는 초-생리학적 염 농축물과 인큐베이션되어 수확 물질 내에서 단백질에 결합된 핵산의 해리를 잠재적으로 지원할 수 있으며, 이는 뉴클레아제 절단에 더욱 접근할 수 있게 한다.
본원에 개시된 본 발명의 염-활성 뉴클레아제는 비제한적으로 비브리오 살모니시다로부터의 '엔도누클레아제 I'이다(본원에서는 'VsEndA'로서 언급됨). 문헌 [Altermark B1, Niiranen L, Willassen NP, Smal
Figure pct00005
s AO, Moe E. Comparative studies of endonuclease I from cold-adapted Vibrio salmonicida and mesophilic Vibrio cholerae. FEBS J. 274(1):252-63 (2007)] 참조. 야생형 VsEndA에 대한 참조 서열 [예측 진핵생물 신호 펩티드는 굵은체, NxS/T 세쿠온은 밑줄]은 하기 SEQ ID NO: 2로서 본원에 제공된다:
엔도뉴클레아제 I [V.살모니시다]( 'VsEndA')
Figure pct00006
VsEndA는 비브리오나세에 패밀리에서 구부러신 간상 그람-네거티브 박테리아 종이다. 이러한 박테리아 뉴클레아제는 진핵 분비 신호 펩티드로서 기능하는 박테리아 분비 신호를 포함한다.
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로 세라티아 마르세센스로부터의 '누클레아제 A'(이하 'SmNucA')이며, 이는 엔테로박테리아세애 패밀리에서 간상 그람-네거티브 박테리아의 종이다. 야생형 SmNucA에 대한 참조 서열 [예측 진핵생물 신호 펩티드는 굵은체, NxS/T 세쿠온은 밑줄]은 하기 SEQ ID NO: 3으로서 본원에 제공된다:
뉴클레아제 A[S.마르세센스]('SmNucA')
Figure pct00007
본원에 개시된 본 발명의 뉴클레아제는 비제한적으로 바실러스 리체니포르미스로부터의 '누클레아제 B'(이하 'BacNucB')이며, 이는 엔테로박테리아세애 패밀리에서 간상 그람-파지티브 박테리아의 종이다. 야생형 BacNucB에 대한 참조 서열 (예측 진핵생물 신호 펩티드는 굵은체)은 하기 SEQ ID NO: 4로서 본원에 제공된다:
엔도뉴클레아제 B[바실러스 sp. E.g. B.리체니포르미스]('BacNucB')
Figure pct00008
벡터
본원에 개시된 발명은 바이러스 벡터 및 이의 제조 및/또는 생산에 관한 것이다.
벡터는 한 환경에서 다른 환경으로 실체의 전이를 허용하거나 조장하는 도구이다. 본 발명에 따르면, 예로서, 재조합 핵산 기술에 사용되는 일부 벡터는 핵산의 세그먼트(예를 들어, 이종성 DNA 세그먼트 예컨대, 이종성 cDNA 세그먼트)와 같은 실체가 표적 세포 내로 전이되어 이에 의해 발현되게 한다. 벡터는 관심 핵산/뉴클레오티드의 통합을 조장하여 표적 세포 내에서의 NOI 및 이의 발현을 유지시킬 수 있다. 대안적으로, 벡터는 일시적 시스템에서 NOI의 발현을 통해 벡터의 복제를 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 벡터는 상기 NOI의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로, NOI의 조절인자를 지닌 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터이다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자(예를 들어, 네오마이신 내성 유전자) 및/또는 추적 가능한 마커 유전자(들)(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP)을 인코딩하는 유전자)를 포함할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 표적 세포를 감염 및/또는 형질도입시키는데 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 시험관내에서 양립가능한 표적 세포에서 NOI를 발현시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 시험관내의 양립성 표적 세포 내로 도입시키고, NOI의 발현을 발생시키는 조건 하에서 표적 세포를 성장시킴으로써 시험관내에서 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 단백질 및 NOI는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 표적 세포로부터 회수될 수 있다. 적합한 표적 세포는 포유동물 세포주는 및 기타 진핵 세포주를 포함한다.
벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본원에 기술된 발현 벡터는 전사될 수 있는 서열을 함유하는 핵산 영역을 포함한다. 따라서, mRNA, tRNA 및 rRNA를 인코딩하는 서열은 이 정의 내에 포함된다.
일부 양태에서, 벡터는 "격리인자"를 가질 수 있다 - 프로모터와 인핸서 사이의 상호작용을 차단하며, 인접 유전자로부터 판독을 감소시키는 배리어로서 작용하는 유전자 서열.
일 구현예에서, 격리인자는 하나 이상의 레트로바이러스 핵산 서열 사이에 존재하여 인접 유전자로부터의 판독 및 프로모터 간섭을 방지한다. 격리인자가 하나 이상의 레트로바이러스 핵산 서열 사이의 모듈 작제물에 존재하는 경우, 이들 격리된 유전자 각각은 개별 발현 단위로 배열될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 하기를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 생성하기 위한 세포를 제공한다:
i) gag-pol;
ii) env;
iii) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈; 및
iv) 선택적으로, rev 또는 이의 기능적 치환물.
또 다른 양태에서, 본 발명의 벡터는 동일한 유전자좌에 위치하는 적어도 2개의 핵산 서열을 포함하며; 이러한 적어도 2개의 핵산 서열은 역 및/또는 교차 방향으로 위치하며, gag-pol 및/또는 env를 인코딩하는 핵산 서열은 적어도 하나의 조절 요소와 연관된다.
또 다른 구현예에서, 레트로바이러스는 거품형 바이러스로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다.
또 다른 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(Visna lentivirus)로부터 유래된다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터
본원에 개시된 발명의 레트로바이러스 벡터는 임의의 적합한 레트로바이러스로부터 유래될 수 있거나 유래가능할 수 있다. 수 많은 다양한 레트로바이러스가 확인되었다. 예를 하기를 포함한다: 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV), 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV), 라우스 육종 바이러스(RSV), 후지나미 육종 바이러스(FuSV), 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Mo MLV), FBR 뮤린 골육종 바이러스(FBR MSV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨손 뮤린 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수구종증 바이러스-29(MC29) 및 조류 적혈아구증 바이러스(AEV). 레트로바이러스의 자세한 목록은 문헌 [Coffin et al. (1997) "Retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 찾아볼 수 있다.
레트로바이러스는 크게 두 가지 범주 즉, "단순" 및 "복합"으로 나눌 수 있다. 레트로바이러스는 심지어 7개의 군으로 더 나눌 수 있다. 이 군 중 5개는 발암 가능성이 있는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두 군은 렌티바이러스와 스푸마바이러스이다. 이러한 레트로바이러스에 대한 개관은 문헌 [상기 Coffin et al(1997) ibid]에 제시되어 있다.
레트로바이러스 및 렌티바이러스 게놈의 기본 구조는 많은 공통 특징부, 예컨대 5' LTR 및 3' LTR(이들 사이에 또는 이들 내부에는 패키징 신호가 위치하여 게놈이 패키징될 수 있게 함), 프라이머 결합 부위, 표적 세포 게놈 내로의 통합을 가능하게 하는 통합 부위 및 패키징 구성요소(바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 폴리펩티드)를 인코딩하는 gag/pol 및 env 게놈을 공유한다. 렌티바이러스는 추가적인 특징부, 예컨대 HIV에서 rev 유전자 및 RRE 서열을 가지며, 이는 통합된 프로바이러스의 RNA 전사체가 핵으로부터 감염된 표적 세포의 세포질로 효과적으로 이출 가능하게 한다.
프로바이러스에서, 이들 유전자는 긴 말단 반복부(LTR)로 불리는 영역에 의해 양쪽 끝에서 측면 배치된다. LTR은 프로바이러스 통합 및 전사를 담당한다. LTR은 또한 인핸서-프로모터 서열로서 작용하며, 바이러스 유전자의 발현을 조정할 수 있다.
LTR 자체는 U3, R 및 U5로 불리는 3개의 요소로 나눠질 수 있는 동일한 서열이다. U3은 RNA의 3' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. R은 RNA의 양쪽 끝에서 반복되는 서열로부터 유래되고, U5는 RNA의 5' 말단에 고유한 서열로부터 유래된다. 이러한 3개 요소의 크기는 다양한 레트로바이러스에 따라 상당히 다를 수 있다.
본 발명의 전형적인 레트로바이러스 벡터에서, 복제에 필수적인 하나 이상의 단백질 코딩 영역의 적어도 일부는 바이러스로부터 제거될 수 있으며; 예를 들어, gag/pol 및 env가 없거나 기능하지 않을 수 있다. 이는 바이러스 벡터를 복제-결함성이 되게 한다.
렌티바이러스는 더 큰 군의 레트로바이러스의 일부이다. 렌티바이러스의 자세한 목록은 문헌 [Coffin et al (1997) "Retroviruses" Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 찾아볼 수 있다. 간단히 말해서, 렌티바이러스는 영장류와 비-영장류 군으로 나눌 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예는 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 인간 자가-면역결핍 증후군(AIDS)의 원인 인자 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV). 비-영장류 렌티바이러스 군은 프로토타입 "느린 바이러스" 비스나/메디 바이러스(VMV)는 물론, 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 메디 비스나 바이러스(MVV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)를 포함한다.
렌티바이러스 패밀리는 렌티바이러스가 분열 및 비-분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스와 상이하다(Lewis et al (1992) EMBO J 11(8):3053-3058 and Lewis and Emerman (1994) J Virol 68 (1):510-516). 대조적으로, MLV와 같은 다른 레트로바이러스는 예를 들어, 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 세포와 같이 분열하지 않거나 천천히 분열하는 세포를 감염시킬 수 없다.
본원에 사용된 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래할 수 있는 적어도 하나의 구성요소 부분을 포함하는 벡터이다. 바람직하게는, 그러한 구성요소 부분은 벡터가 표적 세포를 감염 또는 형질도입하고 NOI를 발현하는 생물학적 메커니즘에 관여한다.
렌티바이러스 벡터는 영장류 렌티바이러스(예를 들어, HIV-1) 또는 비-영장류 렌티바이러스(예를 들어, EIAV)로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 전형적인 레트로바이러스 벡터 생산 시스템은 필수 바이러스 패키징 기능에서 바이러스 게놈을 분리하는 것을 포함하다. 이러한 벡터 구성요소는 일반적으로 별도의 DNA 발현 카세트(대안적으로, 플라스미드, 발현 플라스미드, DNA 작제물 또는 발현 작제물로 공지됨)로 생산 세포에 제공된다.
벡터 게놈은 NOI를 포함한다. 벡터 게놈은 일반적으로 패키징 신호(ψ), NOI를 지니는 내부 발현 카세트, (선택적으로) 전사-후 요소(PRE), 3'-ppu 및 자가-비활성화(SIN) LTR을 필요로 한다. R-U5 영역은 벡터 게놈 RNA 및 NOI mRNA 둘 모두의 정확한 폴리아데닐화는 물론 역전사 공정에 필요하다. 벡터 게놈은 WO 2003/064665에 기술된 바와 같이 오픈 리딩 프레임을 선택적으로 포함할 수 있으며, 이는 rev의 부재하에 벡터 생산을 허용한다.
패키징 기능은 gag/pol 및 env 유전자를 포함한다. 이들은 생산 세포에 의한 벡터 입자의 생산에 필요하다. 게놈에 트랜스로 이들 기능을 제공하는 것은 복제-결함 바이러스 벡터의 생산을 조장한다.
감마-레트로바이러스 벡터에 대한 생산 시스템은 전형적으로, 게놈, gag/pol 및 env 발현 작제물을 필요로 하는 3-구성요소 시스템이다. HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터를 위한 생산 시스템은 추가로 액세서리 유전자 rev가 제공되고 벡터 게놈에 rev-반응성 요소(RRE)를 포함시켜야 할 수 있다. EIAV-기반 렌티바이러스 벡터에는 오픈-리딩 프레임(ORF)이 게놈 내에 존재하는 경우 rev를 트랜스로 제공할 필요는 없다(WO 2003/064665 참조).
일반적으로, 벡터 게놈 카세트 내에서 인코딩된 "외부" 프로모터(벡터 게놈 카세트를 구동) 및 "내부" 프로모터(NOI 카세트를 구동) 둘 모두는 다른 벡터 시스템 구성요소를 구동하는 것과 마찬가지로 강력한 진핵생물 또는 바이러스 프로모터이다. 이러한 프로모터의 예는 CMV, EF1α, PGK, CAG, TK, SV40 및 유비퀴틴 프로모터를 포함한다. DNA 라이브러리(예를 들어, JeT 프로모터)에 의해 생성된 것과 같은 강력한 '합성' 프로모터는 또한 전사를 유도하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나제 (RhoK), cone-rod 홈박스 함유 유전자(CRX), 신경 레티나-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황형 황반부 이영양증 2(VMD2), 티로신 하이드록실라제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 별아교세포-특이적 신경교원섬유 산 단백(GFAP) 프로모터, 인간 α1-안티트립신(hAAT) 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40/hAlb 프로모터, SV40/CD43, SV40/CD45, NSE/RU5′ 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터가 전사를 구동하는데 사용될 수 있다.
레트로바이러스 벡터의 생산은 이들 DNA 구성요소로의 생산 세포의 일시적 공동-형질감염 또는 안정한 생산 세포주의 사용을 포함하며, 여기에서 모든 구성요소는 생산 세포 게놈 내에 안정적으로 통합된다(예를 들어, [Stewart HJ, Fong-Wong L, Strickland I, Chipchase D, Kelleher M, Stevenson L, Thoree V, McCarthy J, Ralph GS, Mitrophanous KA and Radcliffe PA. (2011). Hum Gene Ther. Mar; 22 (3):357-69]). 대안적 접근법은 안정한 패키징 세포(이 안으로 패키징 구성요소가 안정하게 통합됨)를 사용하고, 그 후 필요에 따라 벡터 게놈 플라스미드에서 일시적으로 형질감염시키는 것이다(예를 들어, Stewart, H. J., M. A. Leroux-Carlucci, C. J. Sion, K. A. Mitrophanous and P. A. Radcliffe (2009). Gene Ther. Jun; 16 (6):805-14). 대안적인 완전하지 않은 패키징 세포주를 생성시킬 수 있으며(단지 1 또는 2개의 패키징 구성요소가 세포주 내로 안정적으로 통합됨), 벡터를 생성하기 위해 누락 구성요소가 일시적으로 형질감염되는 것이 또한 실현가능하다. 생산 세포는 또한 조절 단백질, 예컨대 전사 조절인자의 tet 리프레서(TetR) 단백질 군의 구성원(예를 들어, T-Rex, Tet-On 및 Tet-Off), 전사 조절인자의 큐메이트 유도성 스위치 시스템 군의 구성원(예를 들어, 큐메이트 리프레서(CymR) 단백질), 또는 생산 동안 전이유전자 발현을 억압하기 위해 공급된 RNA-결합 단백질(예를 들어, TRAP - 트립토판-활성화된 RNA-결합 단백질)을 발견할 수 있다.
본원에 개시된 발명의 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 EIAV로부터 유래된다. EIAV는 렌티바이러스의 가장 단순한 게놈 구조를 갖는다. gag/pol 및 env 유전자 외에도 EIAV는 3개의 다른 유전자를 인코딩한다: tat, rev 및 S2. Tat는 바이러스 LTR의 전사 활성인자로서 작용하며(Derse and Newbold (1993) Virology 194(2):530-536 and Maury et al (1994) Virology 200(2):632-642), rev는 rev-반응 요소(RRE)를 통한 바이러스 유전자의 발현을 조절하고 조정하다(Martarano et al.(1994) J Virol 68(5):3102-3111). 이들 두 단백질의 작용 기전은 영장류 바이러스의 유사 메카니즘과 대체로 유사한 것으로 여겨진다(Martarano et al. (1994) J Virol 68(5):3102-3111). S2의 기능은 SERINC3/5에 길항하는 것이다(Chande et al., PNAS, 2016 Nov 15; 113(46):13197-13202). 또한, 트랜스멤브레인 단백질의 시작에서 env 코딩 서열에 스플라이싱된 tat의 첫 번째 엑손에 의해 인코딩되는 EIAV 단백질인 Ttm이 확인되었다. 본원에 개시된 본 발명의 대안적 구현예에서, 바이러스 벡터는 HIV로부터 유래된다: HIV는, S2를 인코딩하지 않는다는 점에서 EIAV와 상이하나, EIAV와 달리 이는 vif, vpr, vpu 및 nef를 인코딩한다.
용어 "재조합 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터"(RRV)는 패키징 구성요소의 존재하에 표적 세포를 형질도입할 수 있는 바이러스 입자 내로 RNA 게놈을 패키징할 수 있도록 충분한 레트로바이러스 유전자 정보를 갖는 벡터를 나타낸다. 표적 세포의 형질도입은 역전사 및 표적 세포 게놈 내로의 통합을 포함할 수 있다. RRV는 벡터에 의해 표적 세포에 전달시키고자 하는 비-바이러스 코딩 서열을 운반한다. RRV는 표적 세포 내에서 감염성 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 독립적인 복제를 할 수 없다. 일반적으로, RRV에는 기능적인 gag/pol 및/또는 env 유전자, 및/또는 복제에 필수적인 기타 유전자가 결여되어 있다.
바람직하게는, 본원에 개시된 본 발명의 RRV 벡터는 최소 바이러스 게놈을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "최소 바이러스 게놈"은 바이러스 벡터가 비-필수 요소는 제거된 반면 NOI를 표적 세포에의 감염, 형질 도입 및 전달에 필요한 기능성을 제공하는데 필수적인 요소를 보유하도록 조작되었음을 의미한다. 이 전략에 대한 추가의 자세한 내용은 WO 1998/17815 및 WO 99/32646에서 찾아볼 수 있다. 최소 EIAV 벡터에는 tat, rev 및 S2 유전자가 결여되어 있으며, 이들 유전자는 생산 시스템에 트랜스로 제공되지도 않는다. 최소 HIV 벡터에는 vif, vpr, vpu, tat 및 nef가 결여되어 있다.
생산 세포 내에서 벡터 게놈을 생산하는데 사용되는 발현 플라스미드는 생산 세포/패키징 세포에서 게놈의 전사를 유도하기 위해 레트로바이러스 게놈에 작동가능하게 연결된 전사 조절 제어 서열을 포함할 수 있다. 이들 조절 서열은 전사된 레트로바이러스 서열, 즉 5' U3 영역과 관련된 천연 서열일 수 있거나, 이들은 아래에서 논의되는 바와 같이 이종 프로모터, 예컨대 또 다른 바이러스 프로모터, 예를 들어 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 렌티바이러스 벡터 게놈은 효율적인 바이러스 생산을 위해 추가 서열을 필요로 한다. 예를 들어, 특히 HIV의 경우, RRE 서열이 포함될 수 있다. 그러나, RRE에 대한 요구 사항 (및 트랜스로 제공되는 rev에 대한 의존성)은 코돈 최적화에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이 전략에 대한 추가의 자세한 내용은 WO 2001/79518에서 찾아볼 수 있다.
rev/RRE 시스템과 동일한 기능을 수행하는 대안적 서열 또한 공지되어 있다. 예를 들어, rev/RRE 시스템의 기능적 유사체는 Mason Pfizer 원숭이 바이러스에서 발견된다. 이는 항시적 수송 요소(CTE)로 알려져 있으며, 감염된 세포에서 인자와 상호작용하는 것으로 여겨지는 게놈에서 RRE-유형 서열을 포함한다. 세포 인자는 rev 유사체로서 생각될 수 있다. 따라서, CTE는 rev/RRE 시스템의 대안으로 사용될 수 있다. 공지되거나 이용가능하게 되는 Rev 단백질의 임의의 다른 기능적 등가물은 본 발명과 관련될 수 있다. 예를 들어, HTLV-I의 Rex 단백질은 HIV-1의 Rev 단백질을 기능적으로 대체할 수 있음이 또한 알려져 있다. Rev 및 RRE는 본원에 개시된 본 발명의 방법에 사용하기 위한 벡터에 부재하거나 비-기능적일 수 있으며; 대안적 rev 및 RRE, 또는 기능적으로 동등한 시스템에서 본원의 벡터 시스템에 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "기능적 치환물"은 대체 서열을 갖는 단백질 또는 서열로서, 또 다른 단백질 또는 서열과 동일한 기능을 수행하는 단백질 또는 서열을 의미한다. 용어 "기능적 치환물"은 동일한 의미로 본원에서 "기능적 등가물" 및 "기능적 유사체"와 상호교환적으로 사용된다.
SIN 벡터
본 발명의 레트로바이러스 벡터는 바이러스 인핸서 및 프로모터 서열이 결실된 자가-불활성화(SIN) 형태로 사용될 수 있다. SIN 벡터는 생성될 수 있으며, 비-SIN 벡터의 효능과 유사한 효능으로 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 비-분할 표적 세포를 형질도입할 수 있다. SIN 프로바이러스에서 긴 말단 반복(LTR)의 전사 비활성화는 복제-적격 바이러스에 의한 동원을 방지해야 한다. 이는 또한, LTR의 임의의 시스-작용 효과를 제거함으로써 내부 프로모터로부터 유전자의 조절된 발현을 가능하게 해야 한다.
예를 들어, 자가-불활성화 레트로바이러스 벡터 시스템은 전사 인핸서 또는 3' LTR의 U3 영역에서 인핸서와 프로모터를 결실시킴으로써 작제되었다. 한 라운드의 벡터 역전사 및 통합 후, 이러한 변화는 전사적으로 비활성인 프로바이러스를 생성하는 5' 및 3' LTR 둘 모두에 복사된다. 그러나, 이러한 벡터에서 LTR에 대한 내부의 모든 프로모터(들)는 여전히 전사적으로 활성일 것이다. 이러한 전략은 내부에 배치된 유전자로부터의 전사에 대한 바이러스 LTR의 인핸서 및 프로모터의 효과를 제거하기 위해 사용되었다. 이러한 효과는 전사 증가 또는 전사 억제를 포함한다. 이러한 전략은 또한, 3' LTR로부터 게놈 DNA의 다운스트림 전사를 제거하는데 사용될 수 있다. 이는 임의의 내인성 종양유전자의 후천성 활성화를 방지하는 것이 매우 바람직하며, 어떤 경우에는 매우 중요한 인간 유전자 요법에서 특히 중요하다. [Yu et al., (1986) PNAS 83: 3194-98; Marty et al., (1990) Biochimie 72: 885-7; Naviaux et al., (1996) J. Virol. 70: 5701-5; Iwakuma et al., (1999) Virol. 261: 120-32; Deglon et al., (2000) Human Gene Therapy 11: 179-90]. SIN 렌티바이러스 벡터는 US 6,924,123 및 US 7,056,699에 설명되어 있다.
복제-결함 렌티바이러스 벡터
복제-결함 렌티바이러스 벡터의 게놈에서, gag/pol 및/또는 env의 서열은 돌연변이되고/거나 기능하지 않을 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 전형적인 렌티바이러스 벡터에서, 바이러스 복제에 필수적인 단백질에 대한 하나 이상의 코딩 영역의 적어도 일부가 벡터로부터 제거될 수 있다. 이는 바이러스 벡터를 복제-결함이 되게 한다. 바이러스 게놈의 일부는 또한, 비-분할 표적 세포를 형질도입하고/거나 이의 게놈을 표적 세포 게놈 내에 통합시킬 수 있는 NOI를 포함하는 벡터를 생성하기 위해 NOI에 의해 대체될 수 있다.
일 구현예에서, 렌티바이러스 벡터는 WO 2006/010834 및 WO 2007/071994에 기술된 바와 같이 비-통합 벡터이다.
추가의 구현예에서, 벡터는 바이러스 RNA에 없거나 결여된 서열을 전달하는 능력을 갖는다. 추가의 구현예에서, 전달하고자 하는 RNA에 위치한 이종성 결합 도메인(gag에 이종성) 및 Gag 또는 GagPol 상의 동족 결합 도메인은 전달하고자 하는 RNA의 패키징을 보장하기 위해 사용될 수 있다. 이들 벡터 둘 모두는 WO 2007/072056에 기술되어 있다.
아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 벡터
유전자 요법을 위한 재조합 아데노-관련 바이러스(AAV) 및 아데노바이러스 기반 바이러스 벡터의 사용은 광범위하며, 이의 제조는 잘 문서화되어 있다. 일반적으로, AAV-기반 벡터는 포유동물 세포주(예를 들어, HEK293-기반)에서 또는 바쿨로바이러스/Sf9 곤충 세포 시스템의 사용을 통해 생산된다. AAV 벡터는 전형적으로 아데노바이러스 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)로부터 헬퍼 기능과 함께 DNA를 인코딩하는 벡터 구성요소의 일시적인 형질감염에 의해 또는 AAV 벡터 구성요소를 안정적으로 발현하는 세포주의 사용에 의해 생산될 수 있다.
AAV 벡터는 비제한적으로, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 및 AAV-8을 포함하는 아데노-관련 바이러스 혈청형으로부터 유래된 벡터인 것으로 일반적으로 이해된다. AAV 벡터는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 AAV 야생형 유전자 중 하나 이상, 바람직하게는 rep 및/또는 cap 유전자를 가질 수 있으며, 기능적 측면인접 ITR 서열은 보유할 수 있다. 기능적 ITR 서열은 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징에 필요하다. 따라서, AAV 벡터는 바이러스의 복제 및 패키징(예를 들어, 기능적 ITR)에 대해 시스로 필요한 적어도 이들 서열을 포함하는 것으로 본원에서 정의된다. ITR은 야생형 뉴클레오티드 서열일 필요는 없으며, 서열이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 예를 들어 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 'AAV 벡터'는 또한 표적 세포의 핵에 벡터 핵산을 전달하기 위한 효율적인 비히클을 제공하는 이의 단백질 쉘 또는 캡시드를 지칭한다. AAV 생산 시스템은 AAV 유전자 생성물을 제공도록 발현될 수 있으며, 이는 이어서 생산적 AAV 복제를 위해 트랜스로 기능하는 AAV-유래된 코딩 서열을 전형적으로 나타내는 헬퍼 기능을 필요로 한다. 따라서, AAV 헬퍼 기능은 주요 AAV 오픈 리딩 프레임(ORF), rep 및 cap 둘 모두를 포함한다. Rep 발현 생성물은 특히 하기를 포함하는 많은 기능을 갖는 것으로 나타났다: DNA 복제의 AAV 기원의 인식, 결합 및 니킹; DNA 헬리카제 활성; 및 AAV (또는 다른 이종성) 프로모터로부터의 전사 조절. Cap 발현 생성물은 필요한 패키징 기능을 제공한다. AAV 헬퍼 기능은 AAV 벡터에서 누락되는 트랜스의 AAV 기능을 보완하기 위해 본원에 사용된다. AAV 헬퍼 작제물은 관심 뉴클레오티드 서열의 전달을 위한 형질도입 벡터를 생성하는데 사용하고자 하는 AAV 벡터로부터 결실된 AAV 기능을 제공하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 일반적으로 나타내는 것으로 이해된다. AAV 헬퍼 작제물은 AAV 복제에 필요한 누락 AAV 기능을 보완하기 위해 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 일시적 발현을 제공하는데 일반적으로 사용된다; 그러나, 헬퍼 작제물은 AAV ITR이 결여되어 있으며, 이들 자체를 복제하거나 패키징할 수 없다. AAV 헬퍼 작제물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태로 존재할 수 있다. 많은 AAV 헬퍼 작제물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 모두를 인코딩하는 일반적으로 사용된 플라스미드 pAAV/Ad 및 plM29+45가 설명되어 있다. 예를 들어, 본원에 참조로 통합된 문헌 [Samulski et al. (1989) J. Virol. 63:3822-3828; and McCarty et al. (1991) J. Virol. 65:2936-2945] 참조. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 인코딩하는 많은 다른 벡터가 설명되었다. 예를 들어, 본원에 참조로 통합된 미국 특허 번호 5,139,941 및 6,376,237 참조. 또한, 용어 "액세서리 기능"은 AAV가 이의 복제에 의존하는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 세포 기능을 지칭한다는 것은 일반적인 지식이다. 따라서, 이 용어는 AAV 유전자 전사의 활성화, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, Cap 발현 생성물의 합성 및 AAV 캡시드 어셈블리와 관련된 이들 모이어티를 포함하는, AAV 복제에 필요한 단백질 및 RNA를 포획한다. 바이러스-기반 보조 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(헤르페스 심플렉스 바이러스 타입-1 제외) 및 우두 바이러스로부터 유래될 수 있다.
본원에 참조로 통합된 하기 간행물은 아데노-관련 바이러스 벡터의 생산과 관련된 아데노-관련 바이러스 생물학 및/또는 기술의 다양한 양태를 기술한다. [Aponte-Ubillus, et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Appl Microbiol Biotechnol. 2018; 102(3): 1045-1054; Wang Q, et al. A Robust System for Production of Superabundant VP1 Recombinant AAV Vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Dec 15; 7: 146-156; Adamson-Small L, et al. A scalable method for the production of high-titer and high-quality adeno-associated type 9 vectors using the HSV platform. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016; 3: 16031; Cl
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아데노바이러스 벡터는 일반적으로 아데노바이러스 E1 기능을 안정적으로 발현하는 포유동물 세포주에서 전형적으로 생산된다(예를 들어, HEK293-기반). 아데노바이러스 벡터는 또한, 일반적으로 생산 세포주를 사용하여 일련의 '감염' 라운드를 통해 헬퍼-기능 의존적 복제를 통해 '증폭'된다. 아데노바이러스 벡터 및 이의 생산 시스템은 아데노바이러스 게놈의 일부 또는 전부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 아데노바이러스는 비제한적으로 Ad2, Ad5, Ad12 및 Ad40으로부터 유래된 아데노바이러스라는 것은 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터는 일반적으로 또 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태(예컨대, 헤르페스 심플렉스, 및 AAV)로 패키징된 아데노바이러스 DNA 또는 아데노바이러스 코트로 캡슐화된 DNA 형태로 존재한다.
본원에 참조로 통합된 하기 간행물은 아데노바이러스 벡터의 생산과 관련된 아데노바이러스 생물학 및/또는 기술의 다양한 양태를 기술한다. [Graham and Van de Eb (1973) Virology 52:456-467; Takiff et al. (1981) Lancet ii:832-834; Berkner and Sharp (1983) Nucleic Acid Research 6003-6020; Graham (1984) EMBO J 3:2917-2922; Bett et al. (1993) J. Virology 67:5911-5921; and Bett et al. (1994) Proc. Natl. Acad Sci. USA 91:8802-8806]. 아데노바이러스는 복제-결함 유전자 전이 벡터를 생성하기 위해 유전적으로 변형되었다. 이러한 벡터에서, 초기 아데노바이러스 유전자 생성물 E1A 및 E1B는 프랭크 그라햄(Frank Graham)에 의해 개발된 패키징 세포주 293에 의해 결실되고 트랜스로 제공된다(Graham et al. (1987) J. Gen. Birol. 36:59-72 and Graham (1977) J. Genetic Virology 68:937-940). 형질도입될 유전자는 바이러스 게놈의 결실된 E1A 및 E1B 영역에서 아데노바이러스 내로 일반적으로 삽입된다. (Bett et al. (1994), supra.) 아데노바이러스 벡터 및 이의 생산은 하기 문헌에 의해 기술되었다[Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1:2-256; Rosenfeld (1991) Science 252:431-434; Wang et al. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309:61-66; Jaffe et al. (1992) Nat Gent. 1:372-378; Quantin et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld et al. (1992) Cell 68:143-155; Stratford-Perricaudet et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:626-630; Le Gal La Salle et al. (1993) Science 259:988-990; Mastrangeli et al. (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234; Ragot et al. (1993) Nature 361:647-650; Hayaski et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:23872-23875; Lee CS, et al. Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine. Genes Dis. 2017 Jun;4(2):43-63; Kallel H, Kamen AA. Large-Scale Adenovirus and Poxvirus-Vectored Vaccine Manufacturing to Enable Clinical Trials. Biotechnol. J. 10(5) 2015: 741-747; Miravet S, et al. Construction, production, and purification of recombinant adenovirus vectors. Methods Mol Biol. 2014;1089:159-73; Silva AC, etal. Scalable production of adenovirus vectors. Methods Mol Biol. 2014;1089:175-96; Kreppel F. Production of high-capacity adenovirus vectors. Methods Mol Biol. 2014;1089:211-29; Xie L, et al. Large-Scale Propagation of a Replication-Defective Adenovirus Vector in Stirred-Tank Bioreactor PER.C6TM Cell Culture Under Sparging Conditions. Biotechnol. Bioeng. 83(1) 2003: 45-52; Garnier A, et al. Scale-Up of the Adenovirus Expression System for the Production of Recombinant Protein in Human 293S Cells. Cell Culture Engineering IV. Buckland BC, Ed. Springer Science and Business Media: Rotterdam, The Netherlands, 1994; 145-155].
NOI 및 폴리뉴클레오티드
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 이들은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 다수의 상이한 폴리뉴클레오티드가 유전자 코드의 퇴화의 결과로서 동일한 폴리펩티드를 인코딩할 수 있음은 당업자에게 이해될 것이다. 또한, 당업자는 관례적 기술을 이용하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 수행하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영할 수 있음이 이해되어야 한다.
폴리뉴클레오티드는 당업계에서 이용가능한 임의의 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 생체내 활성 또는 수명을 향상시키기 위해 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드, 예컨대 DNA 폴리뉴클레오티드는 재조합적으로, 합성적으로 또는 당업자에게 이용가능한 임의의 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 또한 표준 기술에 의해 클로닝될 수 있다.
더 긴 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 재조합 수단, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR) 클로닝 기술을 사용하여 생성될 것이다. 이는 클로닝하고자 하는 표적 서열에 측면인접한 한 쌍의 프라이머(예를 들어, 약 15 내지 30개 뉴클레오티드)를 만들고, 프라이머를 동물 또는 인간 세포에서 얻은 mRNA 또는 cDNA와 접촉시키고, 요망되는 영역의 증폭을 일으키는 조건 하에서 PCR을 수행하고, 증폭된 단편을 (예를 들어, 반응 혼합물을 아가로스 겔로 정제함으로써) 분리하고, 증폭된 DNA를 회수하는 것을 포함할 것이다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있도록 적합한 제한 효소 인식 부위를 함유하도록 설계될 수 있다.
단백질
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단백질"은 단일-사슬 폴리펩티드 분자는 물론 다중 폴리펩티드 복합물을 포함하며, 여기에서 개별 구성 폴리펩티드는 공유 또는 비-공유 수단에 의해 연결된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 단량체가 아미노산이고 펩티드 또는 이황화 결합을 통해 함께 결합되는 중합체를 지칭한다.
변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편
본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드 이외에, 본원에 개시된 본 발명은 또한 이의 변이체, 유도체, 유사체, 동족체 및 단편의 사용을 포함한다.
본원의 본 발명에 있어서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 잔기(아미노산 잔기이든 또는 핵산 잔기이든)의 특정 서열이 해당 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 보유하는 방식으로 변형된 서열이다. 변이체 서열은 자연 발생 단백질에 존재하는 적어도 하나의 잔기의 첨가, 결실, 치환, 변형, 대체 및/또는 변이에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유도체"는 생성된 단백질 또는 폴리펩티드가 이의 내인성 기능 중 적어도 하나를 보유하는 한 이 서열로부터 또는 이 서열에 대한 하나의 (또는 그 이상의) 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 대체, 결실 및/또는 첨가를 포함한다.
폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 본원에 사용된 용어 "유사체"는 임의의 모방체, 즉 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 내인성 기능 중 적어도 하나를 보유하는 화학적 화합물을 포함한다.
전형적으로, 아미노산 치환은 예를 들어 1, 2 또는 3 내지 10 또는 20개의 치환으로 이루어질 수 있으며, 단, 변형된 서열은 필요한 활성 또는 능력을 유지한다. 아미노산 치환은 비-자연 발생 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 본 발명에서 사용되는 단백질은 또한 침묵 변화를 생성하고 기능적으로 동등한 단백질을 생성하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는한 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성의 유사성에 기초하여 이루어 질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하며; 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 비하전된 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함한다.
예를 들어, 아래 표에 따라 보전적 치환이 이루어질 수 있다. 두 번째 열의 동일한 블록, 및 바람직하게는 세 번째 열의 동일한 줄에 있는 아미노산이 서로 치환될 수 있다:
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용어 "상동성"은 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열과의 특정 상동성을 갖는 실체를 의미한다. 용어 "상동성"은 "동일성"과 동일시될 수 있다.
본 맥락에서, 상동 서열은 해당 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 전형적으로, 상동체는 해당 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 포함할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 특성/기능을 갖는 아미노산 잔기)의 관점에서도 고려될 수 있지만, 본원에 개시된 본 발명의 맥락에서는 서열 동일성 관점으로 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
본 맥락에서, 상동 서열은 해당 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 65%, 75%, 85% 또는 90% 동일할 수 있는, 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 동일할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것으로 간주된다. 상동성은 유사성 측면에서도 고려될 수 있지만, 본원에 개시된 본 발명의 맥락에서 서열 동일성 측면에서 상동성을 표현하는 것이 바람직하다.
상동성 비교는 육안으로 또는 보다 일반적으로 용이하게 이용가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이러한 시중에서 입수가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열간의 상동성 또는 동일성 백분율을 계산할 수 있다.
상동성 백분율은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있으며, 즉, 한 서열이 다른 서열과 정렬되고 한 서열의 각 아미노산이 다른 서열의 상응하는 아미노산과 한 번에 하나의 잔기 씩 직접 비교된다. 이는 “갭이 없는(ungapped)” 정렬로 불린다. 전형적으로, 이러한 갭이 없는 정렬은 상대적으로 적은 수의 잔기에 대해서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어 다른 동일한 서열 쌍에서, 뉴클레오티드 서열에서의 한 번의 삽입 또는 결실은 다음 코돈이 정렬되지 못하게 할 수 있다는 점을 고려하지 않았으며, 따라서 포괄 정렬이 수행될 때 상동성 퍼센트가 잠재적으로 크게 감소하게 된다. 결과적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 스코어에 과도하게 불이익을 주지 않으면서 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적의 정렬을 생성하도록 설계된다. 이는 국소 상동성을 최대화시키기 위해 서열 정렬에서 "갭"을 삽입함으로써 달성된다.
그러나, 이러한 보다 복잡한 방법은 정렬에서 발생하는 각 갭에 "갭 페널티"를 할당하여, 동일한 수의 동일한 아미노산에 있어서 비교된 두 서열 간의 더 높은 관련성을 반영하는 가능한 한 적은 갭을 갖는 서열 정렬이 많은 갭을 갖는 것보다 더 높은 스코어를 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 비교적 높은 코스트를 부과하고 갭의 각 후속 잔기에 대해 더 작은 페널티를 부과하는 "아핀 갭 코스트(affine gap cost)"가 일반적으로 사용된다. 이것이 가장 일반적으로 사용되는 갭 스코어링 시스템이다. 높은 갭 페널티는 물론 더 적은 갭으로 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램에서는 갭 페널티를 수정할 수 있다. 그러나, 이러한 소프트웨어를 서열 비교에 사용할 경우 기본 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG Wisconsin Bestfit 패키지를 사용할 경우, 아미노산 서열에 대한 기본 갭 패널티는 갭에 있어서 -12이며, 각 확장의 경우 -4이다.
따라서, 최대 상동성 백분율의 계산은 먼저 갭 페널티를 고려하여 최적의 정렬을 생성해야 한다. 이러한 정렬을 수행하는데 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 비제한적으로 BLAST 패키지(문헌 [Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18] 참조), FASTA(Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS 슈트의 비교 도구를 포함한다. BLAST와 FASTA 둘 모두는 오프라인 및 온라인 검색에 사용할 수 있다(문헌 [Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 응용에 있어서, GCG Bestfit 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 Sequence로 불리는 또 다른 도구는 또한 단백질과 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 사용될 수 있다(문헌 [FEMS Microbiol Lett (1999) 174(2):247-50; FEMS Microbiol Lett (1999) 177(1):187-8] 참조).
최종 상동성 백분율은 동일성 측면에서 측정될 수 있지만, 정렬 공정 자체는 일반적으로 올-오어-낫씽 페어 비교(all-or-nothing pair comparison)를 기반으로 하지 않는다. 대신에, 화학적 유사성 또는 진화적 거리를 기반으로 하는 각 쌍별 비교에 스코어를 할당하는 척도화된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용된다. 일반적으로 사용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - BLAST 슈트 프로그램에 대한 기본 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 제공되는 경우 공개 기본값 또는 사용자 정의 기호 비교 표를 사용한다(자세한 내용은 사용자 설명서 참조). 일부 응용에 있어서, GCG 패키지에 대한 공개 기본값을 사용하거나, 다른 소프트웨어의 경우, 기본 매트릭스, 예컨대 BLOSUM62를 사용하는 것이 바람직하다.
일단 소프트웨어가 최적의 정렬을 생성하면, 상동성 백분율, 바람직하게는 서열 동일성 백분율을 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 일반적으로 서열 비교의 일부로서 이를 수행하고, 수치 결과를 생성한다.
"단편"은 또한 변이체이며, 용어는 전형적으로 기능적으로 또는 예를 들어, 검정에서 관심이 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 선택된 영역을 지칭한다. 따라서, "단편"은 전장 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 일부인 아미노산 또는 핵산 서열을 지칭한다.
이러한 변이체는 부위-특이적 돌연변이유발과 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 삽입이 이루어질 경우, 삽입 부위의 어느 한쪽의 자연-발생 서열에 상응하는 5' 및 3' 측면인접 영역과 함께 삽입부를 인코딩하는 합성 DNA가 만들어질 수 있다. 측면인접 영역은 자연 발생 서열의 부위에 상응하는 편리한 제한 부위를 포함하여 서열이 적절한 효소(들)로 절단되고, 합성 DNA가 절단부에 결찰되게 할 수 있다. 그 후, DNA는 본 발명에 따라 발현되어 인코딩된 단백질을 만든다. 이러한 방법은 DNA 서열의 조작을 위해 당업계에 공지된 수많은 표준 기술을 예시할 뿐이며, 다른 공지된 기술이 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 세포 및/또는 모듈 작제물에서 사용하기에 적합한 조절 단백질의 모든 변이체, 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 NOI의 동족 결합 부위에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
결합 부위의 모든 변이체 단편 또는 상동체는 NOI의 번역이 바이러스 벡터 생산 세포에서 억제되거나 방지되도록 동족 RNA-결합 단백질에 결합하는 능력을 보유할 것이다.
코돈 최적화
본원에 개시된 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드(NOI 및/또는 벡터 생산 시스템의 구성요소 포함)는 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 이전에 WO 1999/41397 및 WO 2001/79518에 기술되었다. 상이한 세포는 이들의 특정 코돈의 사용에 있어서 상이하다. 이러한 코돈 편향은 세포 유형에서 특정 tRNA의 상대적 풍부함의 편향에 해당한다. 서열의 코돈을 변경하여 상응하는 tRNA의 상대적 풍부도와 일치하도록 맞춤화함으로써, 발현을 증가시키는 것이 가능하다. 마찬가지로, 특정 세포 유형에서 해당 tRNA가 드문 것으로 알려진 코돈을 의도적으로 선택함으로써 발현을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 추가 수준의 번역 제어가 이용가능하다.
레트로바이러스를 포함하는 많은 바이러스는 많은 희귀 코돈을 사용하며, 공통으로 사용되는 포유동물 코돈에 상응하도록 이들을 변경하여 관심 유전자의 발현을 증가시키며, 예를 들어 포유동물 생산 세포에서 NOI 패키징 구성요소를 달성할 수 있다. 포유동물 세포뿐만 아니라 다양한 다른 유기체에 대한 코돈 사용 표는 당업계에 알려져 있다.
바이러스 벡터 구성요소의 코돈 최적화는 여러가지 다른 이점을 갖는다. 이들의 서열 변경에 의해, 생산자 세포/패키징 세포에서 바이러스 입자의 어셈블리에 필요한 바이러스 입자의 패키징 구성요소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 이들로부터 RNA 불안정성 서열(INS)이 제거되었다. 동시에, 패키징 구성요소에 대한 아미노산 서열 코딩 서열은 서열에 의해 인코딩된 바이러스 구성요소가 동일하게 유지되거나 패키징 성분의 기능이 손상되지 않도록 적어도 충분히 유사하게 유지된다. 렌티바이러스 벡터에서, 코돈 최적화는 또한 이출을 위한 Rev/RRE 요건을 극복하여 최적화된 서열이 Rev-독립적이 되게 한다. 코돈 최적화는 또한, 벡터 시스템 내에 상이한 작제물 간에 상동성 재조합을 감소시킨다(예를 들어, gag-pol 및 env 오픈 리딩 프레임에서 중첩 영역 사이). 따라서, 코돈 최적화의 전반적인 효과는 바이러스 역가의 현저한 증가 및 향상된 안전성이다.
일 구현예에서, INS와 관련된 코돈만이 코돈 최적화된다. 그러나, 훨씬 더 바람직하고 실제적인 구현예에서, 서열은 gag-pol의 프레임시프트 부위를 포함하는 서열과 같은 일부를 제외하고는 이들 전체에서 최적화된 코돈이다(하기 참조).
렌티바이러스 벡터의 gag-pol 유전자는 gag-pol 단백질을 인코딩하는 2개의 중첩 리딩 프레임을 포함한다. 두 단백질 모두의 발현은 번역 동안 프레인쉬프트에 의존적이다. 이러한 프레임시프트는 번역 동안 리보솜 "어긋남(slippage)"의 결과로서 발생한다. 이러한 어긋남은 리보솜-중단(stalling) RNA 이차 구조에 의해 적어도 부분적으로 초래되는 것으로 생각된다. 이러한 2차 구조는 gag-pol 유전자에서 프레임쉬프트 부위의 하류에 존재한다. HIV에 있어서, 중첩 영역은 gag의 시작부(여기에서 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A임)의 다운스트림 뉴클레오티드 1222번으로부터 gag 말단(nt 1503)까지 확장된다. 결과적으로, 2개의 리딩 프레임의 중첩 영역 및 프레임쉬프트 부위에 걸친 281 bp 단편은 바람직하게는, 코돈 최적화되지 않는다. 이러한 단편을 유지하면 Gag-Pol 단백질을 더욱 효율적으로 발현시킬 것이다. EIAV에 있어서, 중첩부의 시작은 nt 1262(여기에서 뉴클레오티드 1은 gag ATG의 A임)가 되고, 중첩부의 말단은 nt 1461이 된다. 프레임쉬프트 부위 및 gag-pol 중첩이 보존되게 하기 위해, 야생형 서열은 nt 1156에서 1465까지 유지되었다.
예를 들어, 편리한 제한 부위를 수용하기 위해 최적의 코돈 사용으로부터 유도될 수 있으며, 보존적 아미노산 변경이 Gag-Pol 단백질에 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 코돈 최적화는 약하게 발현되는 포유동물 유전자를 기반으로 한다. 세번째 및 때때로 두번째 및 세번째 염기가 변경될 수 있다.
유전자 코드의 퇴행성 특성으로 인해, 수많은 gag-pol 서열이 숙련된 작업자에 의해 달성될 수 있음이 이해될 것이다. 또한, 코돈-최적화된 gag-pol 서열을 생성하기 위한 시작점으로서 사용될 수 있는 많은 레트로바이러스 변이체가 기술되어 잇다. 렌티바이러스 게놈은 매우 다양할 수 있다. 예를 들어, 여전히 기능을 하는 HIV-1의 많은 준-종이 존재한다. 이는 EIAV의 경우도 마찬가지이다. 이러한 변이체는 형질도입 과정의 특정 부분을 향상시키는데 사용될 수 있다. HIV-1 변종의 예는 Los Alamos National Security, LLC(http://hiv-web.lanl.gov.)에 의해 작동되는 HIV 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다. EIAV 클론에 대한 자세한 내용은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov에 있는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 데이터베이스에서 찾아볼 수 있다.
코돈-최적화된 gag-pol 서열에 대한 전략은 임의의 레트로바이러스와 관련하여 사용될 수 있다. 이는 EIAV, FIV, BIV, CAEV, VMV SIV, HIV-1 및 HIV-2를 포함하는 모든 렌티바이러스에 적용될 것이다. 또한, 이 방법은 HTLV-1, HTLV-2, HFV, HSRV 및 인간 내인성 레트로바이러스(HERV), MLV 및 기타 레트로바이러스로부터의 유전자의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다.
코돈 최적화는 gag-pol 발현이 Rev-독립성을 띠게할 수 있다. 그러나, 렌티바이러스 벡터에서 항-rev 또는 RRE 인자의 사용을 가능하게 하기 위해, 바이러스 벡터 생산 시스템이 전체 Rev/RRE-독립성을 띠게 하는 것이 필요할 것이다. 따라서, 게놈 또한 변형되어야 한다. 이는 벡터 게놈 구성요소를 최적화시킴으로써 달성된다. 유리하게는, 이들 변형은 또한 생산자 및 형질도입된 세포 둘 모두에서 모든 추가적인 단백질의 부재하에 더 안전한 시스템의 생산으로 이어진다.
공통 벡터 요소
프로모터 및 인핸서
NOI 및 폴리뉴클레오타이드의 발현은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 신호(예를 들어, tet 리프레서(TetR) 시스템) 또는 벡터 생산 세포 시스템에서 전이유전자 억제(TRIP) 또는 본원에 기술된 NOI의 다른 조절인자를 포함하는 예를 들어, 전사 조절 요소 또는 번역 억제 요소와 같은 조정 서열를 사용하여 조정될 수 있다.
원핵생물 프로모터 및 진핵생물 세포에서 기능적 프로모터가 사용될 수 있다. 조직-특이적 또는 자극-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 2개 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 요소를 포함하는 키메라 프로모터가 또한 사용될 수 있다.
적합한 촉진 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 소유두종 바이러스, 조류육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스(CMV), 레트로바이러스 및 원숭이 바이러스 40(SV40)와 같은 바이러스의 게놈, 또는 이종성 포유동물 프로모터, 예컨대 액틴 프로모터, EF1α, CAG, TK, SV40, 유비퀴틴, PGK 또는 리보솜 단백질 프로모터로부터 유래된 프로모터를 포함하는 강한 프로모터이다. 대안적으로, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 로돕신(Rho), 로돕신 키나제 (RhoK), 원추-간상 호메오박스 함유 유전자(CRX), 감각신경망막-특이적 류신 지퍼 단백질(NRL), 난황형 황반부 이영양증 2(VMD2), 티로신 하이드록실라제, 뉴런-특이적 뉴런-특이적 에놀라제(NSE) 프로모터, 별아교세포-특이적 신경교원섬유 산 단백(GFAP) 프로모터, 인간 α1-안티트립신(hAAT) 프로모터, 포스포엔올피루베이트 카르복시키나제(PEPCK), 간 지방산 결합 단백질 프로모터, Flt-1 프로모터, INF-β 프로모터, Mb 프로모터, SP-B 프로모터, SYN1 프로모터, WASP 프로모터, SV40/hAlb 프로모터, SV40/CD43, SV40/CD45, NSE/RU5' 프로모터, ICAM-2 프로모터, GPIIb 프로모터, GFAP 프로모터, 피브로넥틴 프로모터, 엔도글린 프로모터, 엘라스타제-1 프로모터, 데스민 프로모터, CD68 프로모터, CD14 프로모터 및 B29 프로모터가 전사를 구동하는데 사용될 수 있다.
인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 NOI의 전사가 추가로 증가될 수 있다. 인핸서는 상대적으로 방향- 및 위치-독립적이다; 그러나, 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서, 예컨대 SV40 인핸서 및 CMV 초기 프로모터 인핸서를 사용할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
프로모터는 적합한 표적 세포에서의 발현을 보장하거나 증가시키는 특징부를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특징부는 보존 영역, 예를 들어 Pribnow Box 또는 TATA 박스일 수 있다. 프로모터는 뉴클레오티드 서열의 발현 수준에 영향을 끼치는 (예컨대, 유지하거나, 향상시키거나 감소시키는) 다른 서열을 함유할 수 있다. 적합한 다른 서열은 Sh1-인트론 또는 ADH 인트론을 포함한다. 다른 서열은 온도, 화학물질, 광 또는 스트레스 유도성 요소와 같은 유도성 요소를 포함한다. 또한, 전사 또는 번역을 향상시키는데 적합한 요소는 여기에 통합될 수 있다.
NOI의 조절인자
레트로바이러스 패키징/생산자 세포주 및 레트로바이러스 벡터 생산의 발생에서 복잡한 요인은 특정 레트로바이러스 벡터 구성요소 및 NOI의 항시적 발현이 세포독성이며, 이들 구성요소를 발현하는 세포의 치사로 이어지며, 따라서 벡터를 생성할 수 없다는 것이다. 따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 이들 구성요소(예를 들어, gag-pol 및 외피 단백질, 예컨대 VSV-G)의 발현이 조절되어야 한다. 다른 비-세포독성 벡터 구성요소의 발현은 또한 세포에 대한 대사 부담을 최소화하기 위해 조절될 수 있다. 본 발명의 모듈형 작제물 및/또는 세포는 적어도 하나의 조절 요소와 회합된 세포독성 및/또는 비-세포독성 벡터 구성요소를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소"는 관련 유전자 또는 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있는, 즉 증가시키거나 감소시킬 수 있는 임의의 요소를 지칭한다. 조절 요소는 유전자 스위치 시스템, 전사 조절 요소 및 번역 억제 요소를 포함한다.
많은 원핵생물 조절인자 시스템이 포유동물 세포에서 유전자 스위치를 생성하기 위해 채택되었다. 많은 레트로바이러스 패키징 및 생산자 세포주는 유전자 스위치 시스템(예를 들어, 테트라사이클린 및 큐메이트 유도성 스위치 시스템)을 사용하여 조정되었으며, 따라서 하나 이상의 레트로바이러스 벡터 구성요소의 발현이 벡터 생산시 스위치 온되게 할 수 있다. 유전자 스위치 시스템은 전사 조절인자(예를 들어, T-Rex, Tet-On 및 Tet-Off)의 (TetR) 단백질 그룹의 유전자 스위치 시스템 및 전사 조절인자(예를 들어, CymR 단백질)의 큐메이트 유도성 스위치 시스템 그룹의 유전자 스위치 시스템을 포함한다.
이러한 한 테트라사이클린-유도성 시스템은 T-REx™ 시스템에 기반한 테트라사이클린 리프레서(TetR) 시스템이다. 예를 들어, 이러한 시스템에서 테트라사이클린 작동인자(TetO2)는 첫 번째 뉴클레오티드가 인간 사이토메갈로바이러스 주요 즉시형 초기 프로모터(hCMVp)의 TATATAA 요소의 마지막 뉴클레오티드의 3' 말단으로부터 10bp인 위치에 배치되며, 그 후 TetR 단독은 리프레서로서 작용할 수 있다(Yao F, Svensjo T, Winkler T, Lu M, Eriksson C, Eriksson E. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. 1998. Hum Gene Ther; 9: 1939-1950). 이러한 시스템에서, NOI의 발현은 TetO2 서열의 2개 복사체가 나란히 삽입된 CMV 프로모터에 의해 조정될 수 있다. 유도제(테트라사이클린 또는 이의 유사체 독시사이클린 [dox])의 부재하에 TetR 호모다이머는 TetO2 서열에 결합하며, 업스트림 CMV 프로모터로부터의 전사를 물리적으로 차단한다. 존재하는 경우, 유도제는 TetR 호모다이머에 결합하여, 더 이상 TetO2 서열에 결합할 수 없도록 다른자리입체성 변화를 일으켜 유전자 발현을 발생시킨다. 본원에 개시된 실시예에 사용된 TetR 유전자는 코돈 최적화되었는데, 이는 번역 효율을 개선하여 TetO2 제어된 유전자 발현의 보다 엄격한 제어를 초래하는 것으로 밝혀졌기 때문이다.
TRiP 시스템은 WO 2015/092440에 설명되어 있으며 벡터 생산 동안 생산 세포에서 NOI의 발현을 억제하는 또 다른 방법을 제공한다. 전이유전자를 구동하는, 조직-특이적 프로모터를 포함하는 구성적 및/또는 강력한 프로모터가 바람직하고, 특히 생산 세포에서 전이유전자 단백질의 발현이 벡터 역가의 감소를 유도하고/거나 전이유전자-유래된 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인한 생체내 면역 반응을 유발할 때, TRAP-결합 서열(예를 들어, TRAP-tbs) 상호작용은 레트로바이러스 벡터의 생산을 위한 전이유전자 단백질 억제 시스템에 대한 기초를 형성한다(Maunder et al, Nat Commun.(2017) Mar 27; 8).
간단히 말해서, TRAP-tbs 상호작용은 번역 블록을 형성하여 이식유전자 단백질의 번역을 억제한다(Maunder et al, Nat Commun.(2017) Mar 27; 8). 번역 블록은 생산 세포에서만 효과적이며, DNA- 또는 RNA-기반 벡터 시스템을 방해하지 않는다. TRiP 시스템은 단일- 또는 다중-시스트로닉 mRNA의 조직 특이적 프로모터를 포함하는 구성적 및/또는 강력한 프로모터로부터 전이유전자 단백질이 발현되는 경우 번역을 억제할 수 있다. 전이유전자 단백질의 비조절된 발현이 벡터 역가를 감소시키고 벡터 생성물 품질에 영향을 미칠 수 있음이 입증되었다. 일시적이고 안정적인 PaCL/PCL 벡터 생산 시스템에 대한 전이유전자 단백질의 억제는 생산 세포가 벡터 역가의 감소를 방지하는데 유용하며: 여기에서, 독성 또는 분자 부담 문제는 세포 스트레스로 이어질 수 있으며; 전이유전자 단백질은 전이유전자-유래된 단백질의 바이러스 벡터 전달로 인해 생체내 면역 반응을 유발시키며; 유전자-편집 전이유전자의 사용은 온/오프 표적 효과를 발생시킬 수 있으며; 전이유전자는 벡터 및/또는 외피 당단백질 배제에 영향을 미칠 수 있다.
외피 및 슈도타이핑
한 바람직한 양태에서, 본원에 개시된 본 발명의 레트로바이러스 벡터는 슈도타이핑되었다. 이와 관련하여, 슈도타이핑은 하나 이상의 이점을 제공할 수 있다. 예를 들어, HIV 기반 벡터의 env 유전자 생성물은 이러한 벡터가 CD4로 불리는 단백질을 발현하는 세포만 감염하도록 제한할 것이다. 그러나, 이러한 벡터의 env 유전자가 다른 외피 바이러스로부터의 env 서열로 치환되는 경우, 이들은 더 넓은 감염 스펙트럼을 가질 수 있다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242). 예를 들어, 작업자는 VSV의 당단백질을 사용하여 HIV 기반 벡터를 슈도타이핑하였다(Verma and Somia (1997) Nature 389(6648):239-242).
또 다른 대안에서, Env 단백질은 돌연변이체 또는 조작된 Env 단백질과 같은 변형된 Env 단백질일 수 있다. 표적화 능력을 도입하거나 독성을 감소시키기 위해 또는 또 다른 목적을 위해 변형이 이루어지거나 선택될 수 있다(Valsesia-Wittman et al 1996 J Virol 70: 2056-64; Nilson et al (1996) Gene Ther 3(4):280-286; and Fielding et al (1998) Blood 91(5):1802-1809 및 본원에 언급된 참고문헌).
벡터는 임의의 선택 분자로 슈도타이핑될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "env"는 본원에 기재된 바와 같이 내인성 렌티바이러스 외피 또는 이종성 외피를 의미할 것이다.
VSV-G
랍도바이러스인 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 외피 당단백질(G)은 특정 외피 바이러스 및 바이러스 벡터 비리온을 슈도타이핑할 수 있는 것으로 밝혀진 외피 단백질이다.
임의의 레트로바이러스 외피 단백질의 부재하에 MoMLV-기반 레트로바이러스 벡터를 슈도타이핑할 수 있는 이의 능력은 문헌 [Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207]에 의해 처음으로 밝혀졌다. WO 1994/294440은 레트로바이러스 벡터가 VSV-G로 성공적으로 슈도타이핑될 수 있음을 교시한다. 이러한 슈도타이핑된 VSV-G 벡터는 광범위한 포유동물 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 더욱 최근에는 문헌 [Abe et al. (1998) J Virol 72(8) 6356-6361]은 비감염성 레트로바이러스 입자가 VSV-G의 첨가에 의해 감염될 수 있음을 교시한다.
문헌 [Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-7]은 레트로바이러스 MLV를 VSV-G로 성공적으로 슈도타이핑하였으며, 이는 자연 형태의 MLV와 비교하여 변형된 숙주 범위를 갖는 벡터를 발생시킨다. VSV-G 슈도타이핑된 벡터는 포유동물 세포뿐만 아니라 어류, 파충류 및 곤충으로부터 유래된 세포주도 감염시키는 것으로 나타났다(Burns et al.(1993) ibid). 이들은 또한 다양한 세포주에 대해 기존의 양쪽성 외피보다 더 효율적인 것으로 나타났다(Yee et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9564-9568, Emi et al. (1991) Journal of Virology 65:1202-1207). VSV-G 단백질은 세포질 꼬리가 레트로바이러스 코어와 상호작용할 수 있기 때문에 특정 레트로바이러스를 슈도타이핑하는데 사용될 수 있다.
VSV-G 단백질과 같은 비-레트로바이러스 슈도타이핑 외피의 제공은 벡터 입자가 감염성 손실 없이 높은 역가로 농축될 수 있다는 이점을 제공한다(Akkina et al. (1996) J. Virol. 70:2581-5). 레트로바이러스 외피 단백질은 아마도 두 개의 비공유적으로 연결된 서브유닛으로 구성되기 때문에 초원심분리 동안 전단력을 견딜 수 없는 것으로 보인다. 서브유닛간의 상호작용은 원심분리에 의해 파괴될 수 있다. 이에 비해, VSV 당단백질은 단일 유닛으로 구성된다. 따라서, VSV-G 단백질 슈도타이핑은 효율적인 표적 세포 감염/형질도입에 대해 제조 공정 동안 잠재적인 이점을 제공할 수 있다.
WO 2000/52188은 막-관련 바이러스 외피 단백질로 소포성 구내염 바이러스-G 단백질(VSV-G)을 갖는 안정한 생산자 세포주로부터의 슈도타이핑된 레트로바이러스 벡터의 생성을 설명하고, VSV-G 단백질에 대한 유전자 서열을 제공한다.
로스 리버 바이러스
로스 리버 바이러스 외피는 비-영장류 렌티바이러스 벡터(FIV)를 슈도타이핑하는데 사용되었으며, 전신 투여 후 주로 간에 형질도입되었다(Kang et al (2002) J Virol 76(18):9378-9388). 효율성은 VSV-G 슈도타이핑된 벡터로 얻은 것보다 20배 더 큰 것으로 보고되었으며, 간독성을 암시하는 간 효소의 혈청 수준으로 측정할 경우 세포 독성이 더 적었다.
바쿨로바이러스 GP64
바쿨로바이러스 GP64 단백질은 임상 및 상업적 적용에 필요한 고역가 바이러스의 대규모 생산에 사용되는 바이러스 벡터에 대한 VSV-G의 대안인 것으로 나타났다(Kumar M, Bradow BP, Zimmerberg J(2003) Hum Gene Ther. 14(1):67-77). VSV-G-슈도타이핑된 벡터와 비교할 경우, GP64-슈도타이핑된 벡터는 유사한 넓은 향성 및 유사한 천연 역가를 갖는다. GP64 발현은 세포를 치사시키지 않기 때문에, GP64를 항시적으로 발현하는 HEK293T-기반 세포주가 생성될 수 있다.
대안적 외피
EIAV를 슈도타이핑하는데 사용되는 경우 합리적인 역가를 제공하는 다른 외피로는 Mokola, Rabies, Ebola 및 LCMV(림프구성 맥락수막염 바이러스)를 포함한다. 마우스내로의 4070A로 슈도타이핑된 렌티바이러스의 정맥내 주입은 간에서 최대 유전자 발현으로 이어진다.
패키징 서열
본 발명의 맥락 내에서 사용되는 바와 같이, "패키징 서열" 또는 "psi"로서 상호교환적으로 지칭되는 용어 "패키징 신호"는 바이러스 입자 형성 동안 레트로바이러스 RNA 가닥의 캡슐화에 필요한 비-코딩 시스-작용 서열과 관련하여 사용된다. HIV-1에서, 이 서열은 주요 스플라이스 도너 부위(SD)의 업스트립으로부터 적어도 gag 시작 코돈으로 확장되는 유전자좌에 맵핑되었다. EIAV에서 패키징 신호는 Gag의 5' 코딩 영역으로의 R 영역을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "확장된 패키징 신호" 또는 "확장된 패키징 서열"은 gag 유전자 내로 추가 연장된 psi 서열 주변의 서열을 사용하는 것을 지칭한다. 이러한 추가적인 패키징 서열의 포함은 바이러스 입자 내로의 벡터 RNA 삽입의 효율을 증가시킬 수 있다.
고양이 면역결핍 바이러스(FIV) RNA 캡슐화 결정인자는 게놈 mRNA(R-U5)의 5' 말단에 있는 한 영역 및 gag의 근위 311 nt 내에 맵핑된 또 다른 영역을 포함하는 것으로서 불연속적이고 비연속적인 것으로 나타났다 (Kaye et al., J Virol. Oct;69(10):6588-92 (1995).
내부 리보솜 진입 부위(IRES)
IRES 요소의 삽입은 단일 프로모터로부터의 다중 코딩 영역의 발현을 허용한다(Adam et al (as above); Koo et al (1992) Virology 186:669-675; Chen et al 1993 J. Virol 67:2142-2148). IRES 요소는 피코르나바이러스의 비-번역된 5' 말단에서 처음 발견되었으며, 여기서 이들은 바이러스 단백질의 cap-독립적 번역을 촉진하다(Jang et al(1990) Enzyme 44:292-309). RNA의 오픈 리딩 프레임 사이에 위치하는 경우, IRES 요소는 IRES 요소에서 리보솜의 진입에 이어 번역의 다운 스트림 개시를 촉진함으로써 다운스트림 오픈 리딩 프레임의 효율적인 번역을 허용한다.
IRES에 대한 리뷰는 마운트포드(Mountford)와 스미스(Smith)에 의해 제시된다(TIG May 1995 vol 11, No 5:179-184). 뇌심근염바이러스(EMCV) (Ghattas, I.R., et al., Mol. Cell. Biol., 11:5848-5859 (1991)); BiP 단백질 [Macejak and Sarnow, Nature 353:91 (1991)]; 초파리의 안테나페디아 유전자(엑손 d 및 e) [Oh, et al., Genes & Development, 6:1643-1653 (1992)]로부터의 IRES 서열은 물론 폴리오 바이러스(PV) [Pelletier and Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988); 또한, 문헌 (Mountford and Smith, TIG 11, 179-184 (1985)) 참조]에서의 IRES 서열을 포함하는 많은 다양한 IRES 서열이 공지되어 있다.
PV, EMCV 및 돼지 수포병 바이러스의 IRES 요소는 종래에 레트로바이러스 벡터에 사용되었다(Coffin et al, 위와 같음).
용어 "IRES"는 IRES의 기능을 향상시키거나 IRES 작용하는 임의의 서열 또는 서열 조합을 포함한다. IRES(들)는 바이러스 기원(예를 들어, EMCV IRES, PV IRES 또는 FMDV 2A-유사 서열) 또는 세포 기원(예를 들어, FGF2 IRES, NRF IRES, Notch 2 IRES 또는 EIF4 IRES)일 수 있다.
IRES가 각 폴리뉴클레오티드의 번역을 개시할 수 있게 하기 위해, 이는 모듈형 작제물에서 폴리뉴클레오티드 사이 또는 전에 위치해야 하다.
안정한 세포주의 개발에 활용되는 기재된 벡터 작제물은 안정한 통합이 발생한 세포의 선별을 위해 선택 마커의 첨가를 필요로 한다. 이러한 선택 마커는 모듈형 작제물 내에서 단일 전사 유닛으로서 발현될 수 있거나 IRES 요소를 사용하여 폴리시스트론 메시지에서 선택 마커의 번역을 개시하는 것이 바람직할 수 있다(Adam et al 1991 J.Virol. 65, 4985). 이와 같이, 선택 마커가 IRES 요소를 사용하는 레트로바이러스 벡터 구성요소 중 하나의 다운스트림에 배치되도록 많은 모듈식 작제물이 설계되었다.
유전자 방향 및 격리인자
핵산은 방향성이 있으며 이는 궁극적으로 세포의 전사 및 복제와 같은 메카니즘에 영향을 미친다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 유전자는 동일한 핵산의 일부가 작제될 때 서로에 대해 상대적인 방향을 가질 수 있다.
이와 같이 세포 또는 작제물 내 동일한 유전자좌에 존재하는 적어도 2개의 핵산 서열은 역방향 및/또는 교차 방향으로 존재할 수 있다. 즉, 이러한 특정 유전자좌에서, 연속 유전자 쌍은 동일한 방향을 갖지 않을 것이다. 벡터 생산에 필요한 핵산이 생산 세포 내의 동일한 유전자좌를 기반으로 하는 경우 교차 방향은 레트로바이러스 벡터 생산에 도움이 된다. 이는 영역이 생산 세포의 동일한 물리적 위치 내에서 발현되는 경우 전사 및 번역 초과 둘 모두를 방지하는데 도움이 될 수 있다. 이는 결국 또한 복제-적격 레트로바이러스 벡터의 생성을 방지하는데 있어서 생성된 작제물의 안전성을 향상시킬 수 있다. 핵산 서열이 역방향 및/또는 교차 방향인 경우, 격리인자의 사용은 이의 유전자 환경에서 NOI의 부적절한 발현 또는 침묵을 방지할 수 있다.
용어 "격리인자"는 격리인자-결합 단백질에 결합될 때 주위 조절인자 신호로부터 유전자를 보호하는 능력을 갖는 DNA 서열 요소의 부류를 지칭한다. 두 가지 유형의 격리인자가 있다: 인핸서 차단 기능 및 크로마틴 장벽 기능. 격리인자가 프로모터와 인핸서 사이에 위치하는 경우, 격리인자의 인핸서-차단 기능은 인핸서의 전사-향상 영향으로부터 프로모터를 보호한다(Geyer and Corces 1992; Kellum and Schedl 1992). 크로마틴 장벽 격리인자는 전사적으로 활성인 크로마틴 영역이 전사적으로 비활성인 크로마틴 영역으로 바뀌게 하여 유전자 발현의 침묵을 발생시키는 근처의 응축된 크로마틴의 진행을 방지함으로써 기능한다. 헤테로크로마틴의 확산을 억제하여 유전자 침묵시키는 격리인자는 히스톤 변형과 관련된 효소를 모집하여 이러한 과정을 방지한다(Yang J, Corces VG. Chromatin Insulators: A Role in Nuclear Organization and Gene Expression. Advances in cancer research. 2011;110:43-76. doi:10.1016/B978-0-12-386469-7.00003-7; Huang, Li et al. 2007; Dhillon, Raab et al. 2009). 격리인자는 이들 기능 중 하나 또는 둘 모두를 가질 수 있으며, 닭 β-글로빈 격리인자(cHS4)는 그러한 한 예이다. 이 격리인자가 가장 광범위하게 연구된 척추동물 격리인자이며, G+C가 매우 풍부하며, 인핸서-차단 및 헤테로크로마틴 장벽 기능 둘 모두를 갖는다(Chung J H, Whitely M, Felsenfeld G. Cell. 1993;74:505-514). 인핸서 차단 기능을 갖는 다른 이러한 격리인자는 비제한적으로 하기를 포함한다: 인간 β-글로빈 격리인자 5(HS5), 인간 β-글로빈 격리인자 1(HS1), 및 닭 β-글로빈 격리인자(cHS3) (Farrell CM1, West AG, Felsenfeld G., Mol Cell Biol. 2002 Jun;22(11):3820-31; J Ellis et al. EMBO J. 1996 Feb 1; 15(3): 562-568). 원치 않는 원위 상호작용을 감소시키는 것 이외에, 격리인자는 또한 인접한 레트로바이러스 핵산 서열 사이의 프로모터 간섭(즉, 하나의 전사 유닛으로부터의 프로모터가 인접한 전사 유닛의 발현을 손상시킴)을 방지하는데 도움이 된다. 격리인자가 각각의 레트로바이러스 벡터 핵산 서열 사이에 사용되는 경우, 직접적인 번역 초과의 감소는 복제-적격 레트로바이러스 벡터 입자의 형성을 방지하는데 도움이 될 것이다. 격리인자는 각각의 레트로바이러스 핵산 서열 사이에 존재할 수 있으며, 격리인자의 사용은 모듈식 작제물에서 또 다른 NOI 발현 카세트와 상호작용하는 하나의 NOI 발현 카세트로부터 프로모터-인핸서 상호작용을 방지할 수 있다. 격리인자는 벡터 게놈과 gag-pol 서열 사이에 존재할 수 있다. 따라서, 이는 복제-적격 레트로바이러스 벡터 및 '야생형' 유사 RNA 전사체의 생산 가능성을 제한하여 작제물의 안전성 프로파일을 개선한다. 안정적으로 통합된 다중유전자 벡터의 발현을 개선하기 위한 격리인자 요소의 사용은 문헌 [Moriarity et al (Modular assembly of transposon integratable multigene vectors using RecWay assembly, Nucleic Acids Res. 2013 Apr;41(8):e92)]에 언급된다.
벡터 역가
당업자는 바이러스 벡터의 역가를 결정하는 많은 다양한 방법이 있음을 이해할 것이다. 역가는 종종 변환 유닛/mL (TU/mL)로서 기술된다. 역가는 벡터 입자의 수를 증가시킴으로써 및 벡터 제조물의 특정 활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다.
모듈형 작제물
본원에 개시된 뉴클레아제-분비 바이러스 생산 시스템 및 방법은 그 전체가 본원에 참조로 통합된 레트로바이러스 벡터라는 명칭으로 공동-계류중인 출원 번호 EP 17210359.0에 기재된 모듈형 핵산 작제물(모듈형 작제물)을 포함할 수 있다. 모듈형 작제물은 레트로바이러스 벡터의 생산에 사용된 2개 이상의 핵산을 포함하는 DNA 발현 작제물이다. 모듈형 작제물은 레트로바이러스 벡터의 생산에 사용된 2개 이상의 핵산을 포함하는 DNA 플라스미드일 수 있다. 핵산은 예를 들어, gag-pol, rev, env, 벡터 게놈을 인코딩할 수 있다. 또한, 패키징 및 생산자 세포주의 생성을 위해 설계된 모듈형 작제물은 전사 조절 단백질(예를 들어, TetR, CymR) 및/또는 번역 억제 단백질(예를 들어, TRAP) 및 선택 마커(예를 들어, Zeocin ™, 하이그로마이신, 블라스티시딘, 푸로마이신, 네오마이신 내성 유전자)를 인코딩하는 것을 추가로 필요로 할 수 있다.
DNA 발현 작제물은 DNA 플라스미드(슈퍼코일드되거나, 니킹되거나 선형화됨), 미니서클 DNA(선형 또는 슈퍼코일드됨), 제한 효소 분해 및 정제에 의한 플라스미드 백본의 제거에 의해 관심 영역만 함유하는 플라스미드 DNA, 효소 DNA 증폭 플랫폼을 사용하여 생성된 DNA, 예를 들어 도기본(doggybone) DNA(dbDNA™)일 수 있으며, 여기에서 사용된 최종 DNA는 폐쇄된 결찰 형태로 존재하거나 개방된 절단 말단을 갖도록 제조되었다(예를 들어, 제한 효소 분해).
본원에 기술된 바와 같이, 레트로바이러스 벡터 생산을 위한 현재 방법은 레트로바이러스 생산에 필수적인 유전자가 일시적 형질감염 방법에 의해 별도의 플라스미드 상에서 생산 세포 내로 도입되는 유전자 작제물을 이용한다. 이는 배치간 변형을 생성할 수 있으며, 고가의 형질감염제 및 플라스미드로 인해 비용이 추가로 증가한다. 이러한 모듈형 작제물을 사용함으로써, 형질감염 공정에 필요한 플라스미드의 수가 감소되며, 따라서 노동력과 재료 비용에 대한 부담이 줄어든다.
이러한 모듈형 작제물의 사용은 또한, 효율적인 패키징 및 생산자 세포주의 생산에 도움이 될 수 있다. 특히, 2개 이상의 레트로바이러스 벡터 게놈을 하나의 모듈형 작제물에 도입하면 최종 패키징/생산자 세포를 생성하기 위해 필요한 안정한 형질감염/형질도입, 통합 및 선택 단계의 수를 후속하여 감소시킬 것이다.
특히, 박테리아 플라스미드가 이러한 기능을 수행할 수 있음을 발견함이 놀라웠는데, 일반적으로 관련된 큰 유전자는 다중 유전자가 박테리아 플라스미드 내로 안정적으로 혼입되는 것을 허용하지 않을 것으로 간주되기 때문이다.
본 발명의 양태에 따르면, 레트로바이러스 벡터를 생산하기 위한 안정한 세포주(패키징 또는 생산자)는 동일한 유전자좌에 위치한 레트로바이러스 유전자 중 적어도 2개를 포함한다. 하기 표는 본원에 개시된 본 발명의 안정한 벡터 생산 세포의 동일한 유전자좌에 위치할 수 있으며, 단일 모듈형 작제물로부터 발현되는 핵산의 예시적인 조합을 열거한다. 각 구성요소 핵산의 순서도 또한 언급된 바와 같다. 별표(*)는 EIAV-기반 레트로바이러스 벡터의 생산에 적합한 조합을 표시하는데, Rev는 이러한 벡터의 필수 구성요소가 아니다. 이중 별표(**)는 조절 요소와 회합되거나 벡터에서 역방향 및/또는 교차 방향으로 있는 조합물을 표시한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
이러한 모듈형 작제물을 사용하는 경우, 본 발명의 세포 또는 벡터는 PAC, BAC, YAC, 코스미드 또는 포스미드로부터 유래된 복제 서열 기점을 함유하지 않는다. PAC, BAC, YAC, 코스미드 및 포스미드는 대량의 DNA를 보유하도록 설계된 인공적으로 생성된 핵산 벡터이다. 따라서, 이들의 코어 서열은 널리 공지되어 있으며, 당업계에 정의되어 있다.
바이러스 벡터 생산 시스템 및 세포
일반적으로 말해서, "바이러스 벡터 생산 시스템" 또는 "벡터 생산 시스템" 또는 "생산 시스템"은 바이러스 벡터 생산에 필요한 구성요소를 포함하는 시스템으로서 이해되어야 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 Gag 및 Gag/Pol 단백질, 및 이의 Env 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 및 벡터 게놈 서열을 포함하는 레트로바이러스 벡터 생산 시스템이다. 생산 시스템은 Rev 단백질을 인코딩하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 치환물을 선택적으로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, 레트로바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, BIV, EIAV, CAEV 또는 비스나 렌티바이러스(Visna lentivirus)로부터 유래된다. 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 모듈형 작제물을 포함하는 본 발명의 레트로바이러스 벡터 생산 시스템에 사용하기 위한 일련의 DNA 작제물에 관한 것이다. 본 발명의 일 구현예에서, 이러한 일련의 DNA 작제물은 Rev 단백질 또는 이의 기능적 치환물을 인코딩하는 DNA 작제물을 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열, 예컨대 발현 카세트 및/또는 일부 또는 모든 모듈형 작제물을 포함하는 레트로바이러스 벡터 생산 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터 생산 시스템은 AAV 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 아데노바이러스 벡터 생산 시스템이다.
"바이러스 벡터 생산 세포", "벡터 생산 세포" 또는 "생산 세포"는 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포로서 이해되어야 한다. 레트로바이러스 벡터 생산 세포는 "생산자 세포" 또는 "패키징 세포"일 수 있다. 바이러스 벡터 시스템의 하나 이상의 DNA 작제물은 바이러스 벡터 생산 세포 내에서 안정적으로 통합되거나 에피솜으로 유지될 수 있다. 대안적으로, 바이러스 벡터 시스템의 모든 DNA 구성요소는 바이러스 벡터 생산 세포내로 일시적으로 형질감염될 수 있다. 또 다른 대안에서, 구성요소 중 일부를 안정적으로 발현하는 생산 세포는 벡터 생산에 필요한 나머지 구성요소로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "패키징 세포"는 레트로바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 요소를 함유하지만 벡터 게놈은 결여된 세포를 지칭한다. 선택적으로, 이러한 패키징 세포는 바이러스 구조 단백질(예를 들어, gag, gag/pol 및 env)을 발현할 수 있는 하나 이상의 발현 카세트를 함유한다.
생산자 세포/패키징 세포는 임의의 적합한 세포 유형일 수 있다. 생산자 세포는 일반적으로 포유동물 세포이지만, 예를 들어 곤충 세포일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생산자/생산 세포" 또는 "벡터 생산/생산 세포"는 레트로바이러스 벡터 입자의 생산에 필요한 모든 요소를 함유하는 세포를 지칭한다. 생산자 세포는 안정한 생산자 세포주일 수 있거나 일시적으로 유도될 수 있거나 레트로바이러스 게놈이 일시적으로 발현되는 안정한 패키징 세포일 수 있다.
벡터 생산 세포는 조직 배양 세포주와 같이 시험관내에서 배양된 세포일 수 있다. 적합한 세포주는 비제한적으로, 뮤린 섬유아세포 유래된 세포주 또는 인간 세포주와 같은 포유동물 세포를 포함한다. 바람직하게는, 벡터 생산 세포는 인간 세포주로부터 유래된다.
세포 및 생산 방법
본 발명은 본원에 기재된 핵산 서열을 세포(예를 들어, 생산 세포)에 도입시키고, 바이러스 벡터의 생산에 적합한 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본원에 개시된 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 의해 생산된 복제 결함 레트로바이러스 벡터를 제공한다.
적합한 생산 세포는 적절한 조건 하에서 배양될 때 바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터 입자를 생산할 수 있는 세포이다. 이들은 일반적으로 포유동물 또는 인간 세포와 같은 진핵생물 세포, 예를 들어 HEK293T, HEK293, CAP, CAP-T, CHO 세포 또는 PER.C6 세포이지만, 예를 들어 SF9 세포와 같은 곤충 세포일 수 있다.
핵산을 생산 세포 내에 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 이전에 설명되었다.
안정한 세포는 패키징 또는 생산자 세포일 수 있다. 패키징 세포로부터 생산자 세포를 생성하기 위해 벡터 게놈 DNA 작제물이 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다.
패키징/생산자 세포는 WO 2004/022761에 기재된 바와 같이 패키징/생산자 세포의 구성요소 중 하나, 즉 게놈, gag-pol 구성요소 및 외피를 발현하는 레트로바이러스 벡터로 적합한 세포주를 형질도입함으로써 생성될 수 있다.
대안적으로, 핵산은 세포 내로 형질감염될 수 있고, 그 후 생산 세포 게놈내로의 통합은 드물게 무작위로 발생한다. 형질감염 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, LipofectamineTM 2000CD(Invitrogen, CA), FuGENE® HD 또는 폴리에틸렌이민(PEI)과 같은 시중에서 입수가능한 제형 또는 인산칼슘을 사용하여 형질감염 공정이 수행될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 모듈형 작제물은 전기천공을 통해 생산 세포 내에 도입될 수 있다. 당업자는 핵산의 생산 세포 내로의 통합을 장려하는 방법을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 핵산 작제물이 자연적으로 원형인 경우, 핵산 작제물 선형화가 도움이 될 수 있다. 덜 무작위적인 통합 방법은 내인성 게놈 내의 선택된 부위에의 통합을 안내하기 위해 포유동물 숙주 세포의 내인성 크로모좀과 공유된 상동성 영역을 포함하는 핵산 작제물을 포함할 수 있다. 더욱이, 재조합 부위가 작제물에 존재하는 경우, 이들은 표적화된 재조합에 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 작제물은 Cre 재조합효소와 조합되는 경우 (즉, P1 박테리오파지로부터 유래된 Cre/lox 시스템을 사용하여) 표적화된 통합을 허용하는 loxP 부위를 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 재조합 부위는 (예를 들어, λ 파지로부터의) att 부위이고, 여기서 att 부위는 람다 인테그라제의 존재하에 부위-특이적 통합을 허용한다. 이는 레트로바이러스 유전자가 높고/거나 안정한 발현을 허용하는 숙주 세포 게놈 내의 유전자좌를 표적으로 하게 한다.
표적화된 통합의 다른 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 게놈 DNA의 표적 절단을 유도하는 방법은 선택된 염색체 유전자좌에서 표적화된 재조합을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 종종 비-상동 말단 결합(NHEJ)과 같은 생리학적 메카니즘에 의해 파괴의 복구를 유도하기 위한 내인성 게놈의 닉(nick)과 같은 이중 가닥 파괴(DSB)를 유도하는 방법 또는 시스템의 사용을 포함한다. 절단은 아르고너트 시스템(예를 들어, T. 써모필러스(T. thermophilus)로부터)에 기초한 뉴클레아제를 사용하고/거나 특이적 절단을 안내하도록 조작된 crRNA/tracr RNA('단일 안내 RNA')를 갖는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, 조작된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN), 전사-활성인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN)와 같은 부위-특이적 뉴클레아제의 사용을 통해 발생할 수 있다. 이러한 유전자-편집-유형 뉴클레아제는, 이들이 뉴클레아제를 표적으로 하는 부위-특이적 효소이며 본원에 개시된 본 발명의 비-특이적 뉴클레아제로서 분비되지 않기 때문에, 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 비-특이적으로 분해하는 목적으로 벡터 생산 세포에 사용하기에 적합하지 않다.
패키징/생산자 세포주는 레트로바이러스 형질도입 또는 핵산 형질감염 방법, 또는 이의 조합을 사용하여 핵산의 통합에 의해 생성될 수 있다. 생산 세포로부터 레트로바이러스 벡터를 생성하는 방법 및 특히, 레트로바이러스 벡터의 공정은 WO 2009/153563에 기술되어 있다.
생산 세포는 선택적으로 RNA-결합 단백질(예를 들어, 트립토판 RNA-결합 감쇠 단백질, TRAP) 및/또는 Tet 리프레서(TetR) 단백질 또는 대안적 조절 단백질(예를 들어, CymR)을 포함할 수 있다.
생산 세포로부터 레트로바이러스 벡터의 생산은 형질감염 방법을 통해, 유도 단계(예를 들어, 독시사이클린 유도)를 포함할 수 있는 안정한 세포주로부터의 생산으로부터, 또는 이 둘의 조합을 통해 이루어질 수 있다. 형질감염 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 예는 이전에 설명되었다.
생산 세포인 패키징 또는 생산자 세포주 또는 구성요소를 인코딩하는 레트로바이러스 벡터로 일시적으로 형질감염된 세포는 세포 및 바이러스 수 및/또는 바이러스 역가를 증가하도록 배양된다. 세포 배양은 본 발명에 따른 관심 바이러스 벡터를 대사 및/또는 성장 및/또는 분열 및/또는 생산할 수 있도록 수행된다. 이는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 달성될 수 있으며, 예를 들어, 적절한 배양 배지에서 세포에 영양분을 제공하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 방법은 표면에 부착되는 성장, 현탁액에서의 성장, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 배양은 예를 들어, 조직 배양 플라스크, 조직 배양 다중-웰 플레이트, 디쉬, 롤러 보틀, 웨이브 백 또는 생물반응기에서 회분식, 유가식, 연속 시스템, 기타 등등을 이용하여 수행될 수 있다. 세포 배양을 통해 바이러스 벡터의 대규모 생산을 달성하기 위해서 현탁액 중 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 당업계에서 바람직하다. 세포 배양에 적합한 조건은 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), and R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley- Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9] 참조).
일 구현예에서, 세포는 초기에 조직 배양 플라스크 또는 생물반응기에서 "벌크 업"되고, 후속하여 다중-층 배양 용기 또는 대형 생물반응기(50L 초과)에서 성장하여 본원에 개시된 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성한다.
또 다른 구현예에서, 세포는 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성하기 위해 부착 모드로 성장한다.
또 다른 추가의 구현예에서, 세포는 본 발명의 벡터 생산 세포를 생성하기 위해 현탁액 모드로 성장한다.
용도
본 발명의 또 다른 양태는 의약에서 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 생산 세포, 또는 약제 제조를 위해 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입되어 관심 뉴클레오티드를 이를 필요로 하는 표적 부위에 전달하는 세포 또는 조직의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 벡터 또는 형질도입된 세포의 이러한 용도는 이전에 기술된 바와 같이 치료 또는 진단 목적을 위한 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포에 관한 것이다.
"바이러스 벡터 입자에 의해 형질도입된 세포"는 바이러스 벡터 입자에 의해 운반된 핵산이 전달되는 세포, 특히 표적 세포로서 이해되어야 한다.
약학적 조성물
본 발명의 또 다른 양태는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합된, 본 발명의 바이러스 벡터 또는 본 발명의 바이러스 벡터로 형질도입된 세포 또는 조직을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 개시된 본 발명은 또한 유전자 요법에 의해 개체를 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 치료학적 유효량의 바이러스 벡터를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 인간 또는 동물용일 수 있다.
조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 애주번트를 포함할 수 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 관행과 관련하여 이루어질 수 있다. 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제 이외에, 표적 부위로의 벡터 진입을 돕거나 증가시킬 수 있는 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 가용화제(들) 및 기타 운반체(예컨대, 지질 전달 시스템)일 수 있거나 이를 포함할 수 있다.
적절한 경우, 조성물은 흡입; 좌약 또는 페서리 형태로; 전형적으로, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 산포제 형태로; 피부 패치의 사용에 의해; 전분 또는 락토스와 같은 부형제를 함유하는 정제 형태로 경구적으로 또는 단독의 또는 부형제와 혼합된 캡슐 또는 소란(ovule)으로, 또는 향미제 또는 착색제를 함유하는 엘릭시르, 용액 또는 현탁액의 형태 중 임의의 하나 이상에 의해 투여될 수 있거나; 이들은 비경구적으로, 예를 들어 해면페내, 정맥내, 근육내, 두개내, 안구내, 복강내 또는 피하 주사될 수 있다. 비경구 투여를 위해, 조성물은 다른 물질, 예를 들어 용액을 혈액과 등장성이 되게 하는데 충분한 염 또는 단당류를 함유할 수 있는 멸균 수용액 형태로 가장 잘 사용될 수 있다. 협측 또는 설하 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 또한 표적 세포 또는 표적 조직을 이를 필요로하는 환자에게 전달하기 전에 생체외에서 상기 표적 세포 또는 조직을 형질도입시키는데 사용될 수 있다. 이러한 표적 세포의 예는 자가 T 세포일 수 있으며, 이러한 조직의 예는 도너 각막일 수 있다.
본 발명은 게시클 또는 엑소좀의 생산에 유용하다. 이와 관련하여, 게시클은 소포를 생성하는, (HEK293-유래된) 세포주에서 VSV-G 외피를 과발현함으로써 전형적으로 만들어진다. 엑소좀은 세포로부터 내인성으로 유도/발현될 수 있다. 게시클 또는 엑소좀 둘 모두는 RNA 및 단백질, 예컨대 CRISPR-cas9 또는 다른 유전자 편집 구성요소로 로딩될 수 있다.
넘버링된 단락
바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 뉴클레아제를 분비하는 바이러스 벡터 생산 시스템 및 이의 방법이 본원에 개시된다. 이러한 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다. 또 다른 이러한 바이러스 벡터 생산 시스템은 1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하며, 여기에서 뉴클레아제는 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양에서 발현되고 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해한다.
본 발명의 양태는 하기 넘버링된 단락 1-26에 의해 설명될 것이다 - 넘버링된 단락 세트 1로 제시됨.
넘버링된 단락 세트 1:
1. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
2. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제는 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 발현되고 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
3. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열로 바이러스 벡터 생산 세포를 형질감염(때때로 접촉으로서 언급됨)시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
4. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 헬퍼 세포에서 발현되고 생산 세포와 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
5. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포로부터의 액체 피드(feed)와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물이 적어도 약 5 리터 부피의 배지를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
7. 1 내지 6 단락 중의 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 적어도 약 50 리터 부피의 배지를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
8. 1 내지 7 단락 중의 어느 하나에 있어서, 생산 세포가 HEK293 세포 또는 이의 유도체인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
9. 8 단락에 있어서, HEK293 생산 세포가 HEK293T 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
10. 1 내지 9 단락 중의 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
11. 1 내지 10 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 레트로바이러스 벡터 구성요소인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
12. 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제는 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하고, 생산 세포가 진핵생물 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
13. 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하며, 뉴클레아제 융합 단백질은 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하며, 생산 세포는 진핵생물 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
14. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템을 포함하는 세포 배양 장치로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 세포 배양 장치.
15. 진핵 세포의 분비 경로를 통해 발현되는 증가된 세포-보유 및/또는 세포-결합을 갖는 변형된 뉴클레아제로서, 변형된 뉴클레아제가 이의 C-말단에서 보유 신호를 포함하는, 변형된 뉴클레아제.
16. 1 내지 15 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 1 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
17. 1 내지 16 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
18. 1 내지 17 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
19. 16 내지 18 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 활성이 바이러스 벡터 생산 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
20. 16 내지 18 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 활성이 뉴클레아제 헬퍼 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
21. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
22. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
23. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 2000 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
24. 1 내지 23 단락 중의 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 발현 카세트가 강한 프로모터, 바람직하게는 CMV 프로모터를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
25. 1 내지 24 단락 중 어느 하나에 있어서, 소듐 부티레이트 보충시 또는 보충 후에 주요 바이러스 벡터 생산 용기에 첨가되는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
26. 1 내지 25 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 용기 내의 뉴클레아제 발현이 추가의 뉴클레아제 처리 요구 없이 다운스트림 프로세싱의 사용을 가능하게 하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
본 발명의 이러한 및 다른 양태는 하기 넘버링된 단락 1-82에 의해 설명될 것이다 - 넘버링된 단락 세트 2로 제시됨.
넘버링된 단락 세트 2:
1. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
2. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제는 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 발현되고 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
3. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열로 바이러스 벡터 생산 세포를 형질감염(때때로 접촉으로서 언급됨)시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
4. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 헬퍼 세포에서 발현되고 생산 세포와 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
5. 1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포로부터의 액체 피드와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제는 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
6. 바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법으로서, 개선은 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포 내에 도입시키는 것을 포함하며, 핵산 서열은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하고 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
7. 바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법으로서, 개선은 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 공동-배양물에서 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
8. 1 내지 7 단락 중의 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 6.5 내지 7.2의 pH 범위에서 유지되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
9. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 세포외 뉴클레아제가 smNucA, VsEndA, VcEndA 및 BacNucB로 구성된 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
10. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 세포외 뉴클레아제인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
11. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 당-비-특이적 뉴클레아제인 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
12. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 3에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체의 세르라티아 마르세센스 뉴클레아제 A를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
13. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체의 비브리오 콜레라 엔도뉴클레아제 I를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
14. 13 단락에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 5의 VcEndA-12glc, SEQ ID NO: 6의 VcEndA-123glc, SEQ ID NO: 7의 VcEndA-124glc, SEQ ID NO: 8의 VcEndA-134glc, SEQ ID NO: 9의 VcEndA-13glc, SEQ ID NO: 10의 VcEndA-14glc 및 SEQ ID NO: 11의 VcEndA-1glc로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레아제 변이체인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
15. 13 단락에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 11의 뉴클레아제 변이체 VcEndA-1glc인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
16. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 염-활성 뉴클레아제를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
17. 16 단락에 있어서, 염-활성 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 2의 비브리오 살모니시다 엔도뉴클레아제 I 또는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
18. 1 내지 7 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 4의 BacNucB 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
19. 1 내지 18 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제가 천연 또는 비-천연 N-말단 분비 신호를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
20. 1 내지 18 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 잠재적인 스플라이스 부위 및/또는 불안정한 요소를 제거하도록 서열-최적화되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
21. 1 내지 18 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 생산 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
22. 1 내지 21 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산 시스템 및/또는 방법이 하나 이상의 추가적인 뉴클레아제를 추가로 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
23. 22 단락에 있어서, 뉴클레아제가 하나 이상의 추가적인 뉴클레아제 중 적어도 하나에 융합되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
24. 1 내지 23 단락 중의 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 적어도 약 5 리터 부피의 배지를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
25. 1 내지 24 단락 중 어느 하나에 있어서, 세포가 현탁 또는 부착 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
26. 1 내지 25 단락 중 어느 하나에 있어서, 세포 배양물이 무혈청 배양물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
27. 1 내지 26 단락 중 어느 하나에 있어서, 생산 세포가 진핵 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
28. 27 단락에 있어서, 생산 세포가 포유동물 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
29. 28 단락에 있어서, 생산 세포가 인간 생산 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
30. 1 내지 29 단락 중의 어느 하나에 있어서, 생산 세포가 HEK293 세포 또는 이의 유도체인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
31. 30 단락에 있어서, HEK293 생산 세포가 HEK293T 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
32. 1 내지 31 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
33. 1 내지 32 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 레트로바이러스 벡터 구성요소인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
34. 33 단락에 있어서, 레트로바이러스 벡터 구성요소가 렌티바이러스 벡터 구성요소인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
35. 34 단락에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 i) gag-pol; ii) env; iii) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈; 및 iv) 선택적 rev, 또는 이의 기능적 치환물을 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
36. 35 단락에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 동일한 유전자좌에 위치한 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 모듈형 작제물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
37. 35 단락에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 역방향 및/또는 교차 방향으로 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 모듈형 작제물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
38. 35 단락에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 gag-pol 및/또는 env를 인코딩하는 모듈형 작제물이며, 모듈형 작제물은 적어도 하나의 조절인자 요소와 회합되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
39. 35 내지 38 단락 중 어느 하나에 있어서, env가 VSV-G env인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
40. 1 내지 39 단락 중 어느 하나에 있어서, 일시적 뉴클레아제가 발현되고 형질감염 후 세포로부터 분비되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
41. 1 내지 39 단락 중 어느 하나에 있어서, 세포의 안정한 통합 후 뉴클레아제가 발현되고 세포로부터 분비되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
42. 41 단락에 있어서, 뉴클레아제의 발현이 유도성 또는 조건부이며, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 유도성 또는 조건부 프로모터 또는 조절 요소를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
43. 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제는 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하고, 생산 세포는 진핵 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
44. 43 단락에 있어서, 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인, 세포.
45. 44 단락에 있어서, 엑소뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 세포.
46. 45 단락에 있어서, 엔도뉴클레아제가 엑소뉴클레아제에 융합되는, 세포.
47. 43 단락에 있어서, 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인, 세포.
48. 48 단락에 있어서, 엑소뉴클레아제가 엔도뉴클레아제에 융합되는, 세포.
49. 43 단락에 있어서, 세포가 일시적인 생산 세포인, 세포.
50. 43 단락에 있어서, 세포가 안정한 생산 세포인, 세포.
51. 50 단락에 있어서, 뉴클레아제 발현 및 분비가 안정한 생산 세포에서의 유도성 발현 및 분비인, 세포.
52. 1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하며, 뉴클레아제 융합 단백질은 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하며, 생산 세포는 진핵 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
53. 52 단락에 있어서, 엔도뉴클레아제가 VcEndA 또는 이의 변이체인, 세포.
54. 52 단락에 있어서, 엔도뉴클레아제가 SEQ ID NO: 11의 VcEndA-1glc인 세포.
55. 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템을 포함하는 세포 배양 장치로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 세포 배양 장치.
56. 46 단락에 있어서, 교반-탱크 생물반응기 또는 웨이브-백 또는 iCELLis® 생물반응기인, 세포 배양 장치.
57. 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해할 수 있는 분비된 뉴클레아제의 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는, 변이체.
58. 진핵 세포의 분비 경로를 통해 발현되는 증가된 세포-보유 및/또는 세포-회합을 갖는 변형된 뉴클레아제로서, 변형된 뉴클레아제가 이의 C-말단에서 보유 신호를 포함하는, 변형된 뉴클레아제.
59. 58 단락에 있어서, 변형된 뉴클레아제가 소포체(ER) 및/또는 골지 구획에 국소화되어 상응하는 비변형된 뉴클레아제의 세포 보유와 비교하여 증가된 세포 보유를 발생시키는, 변형된 뉴클레아제.
60. 58 단락에 있어서, 변형된 뉴클레아제가 ER 보유-결함 보완 그룹의 ER 수용체 결합되는, 변형된 뉴클레아제.
61. 58 단락에 있어서, 보유 신호가 콘센서스 [KRHQSA]-[DENQ]-E-L 또는 KKXX의 C-말단에 위치하는, 변형된 뉴클레아제.
62. 58 단락에 있어서, 보유 신호가 콘센서스 KDEL의 C-말단에 위치하는, 변형된 뉴클레아제.
63. 58 단락의 변형된 뉴클레아제를 발현하는 진핵 세포.
64. 63 단락의 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템.
65. 1 내지 42 단락 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터를 생성하기 위한, 생산 세포.
66. 43 단락 또는 이의 임의의 종속 단락에 있어서, 1 내지 42 단락 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는, 생산 세포.
67. 52 단락 또는 이의 임의의 종속 단락에 있어서, 1 내지 42 단락 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는 생산 세포.
68. 1 내지 42 단락 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
69. 43 단락 또는 이의 임의의 종속 단락에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
70. 52 단락 또는 이의 임의의 종속 단락에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
71. 1 내지 42 단락 중 어느 하나에 있어서, 57 내지 62 단락 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 뉴클레아제를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
72. 1 내지 71 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성은 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 1 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
73. 1 내지 72 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성은 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
74. 1 내지 73 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성은 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
75. 72 내지 74 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 활성이 바이러스 벡터 생산 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
76. 72 내지 74 단락 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 활성이 바이러스 뉴클레아제 헬퍼 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
77. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
78. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
79. 헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 2000 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
80. 1 내지 79 단락 중의 어느 하나에 있어서, 뉴클레아제 발현 카세트가 강한 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
81. 1 내지 80 단락 중 어느 하나에 있어서, 소듐 부티레이트 보충시 또는 보충 후에 주요 바이러스 벡터 생산 용기에 첨가되는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
82. 1 내지 81 단락 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 벡터 생산 용기 내의 뉴클레아제 발현이 추가의 뉴클레아제 처리 요구 없이 다운스트림 프로세싱의 사용을 가능하게 하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
이제 본 발명의 다양한 바람직한 특징 및 구체예가 비제한적인 예로서 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 바이러스 벡터 생산 세포 배양 동안 잔여 DNA의 감소를 위해 광범위하게 분기된 뉴클레아제를 인코딩하는 발현 작제물
도 3에 따라 세라티아 마르세센스 엔도뉴클레아제 A(SmNucA), VsEndA 및 BacNucB에 대한 발현 플라스미드를 작제하였다. 모든 작제물은 SV40 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하였다. ORF는 코돈-최적화시켰으며(호모 사피엔스), 이들의 C-말단에 6x히스티딘(H6) 태깅시켰다. SmNucA 발현 플라스미드는 자체 박테리아 분비 서열을 갖는 야생형 smNucA를 인코딩하거나, 인간 알부민 또는 VSV-G의 서열로 대체된 박테리아 분비 서열을 갖거나, 언급된 위치에서 NxS/T 세쿠온 돌연변이를 추가로 포함하였다. VsEndA 또는 VcEndA 발현 플라스미드는 자체 박테리아 분비 서열을 갖는 야생형 뉴클레아제를 인코딩하거나, 인간 알부민의 서열로 대체된 박테리아 분비 서열을 갖거나, T121V, N130D, S135R에서 NxS/T 세쿠온 돌연변이를 추가로 포함하였다. BacNucB 발현 플라스미드는 자체 박테리아 분비 서열을 갖는 야생형 BacNucB를 인코딩하거나 언급된 위치에서 y>N 돌연변이를 추가로 포함하여 NxS/T 세쿠온을 발생시켰다.
실시예 2: 배양 배지에서 감소된 잔여 DNA와 상관관계가 있는 HEK293T 세포로부터 뉴클레아제의 발현 및 분비의 입증
HEK293T 세포는 단백질 검출을 허용하기 위해 C-말단 His-태그와 융합된 SmNucA를 인코딩하는 pSV40-smNucAH6 및 스터퍼 DNA(pBluescript)의 상이한 비율을 사용하여 고정된 양의 플라스미드 DNA(총 μg)로 형질감염시켰다. 세포 용해물 및 배양 배지는 His-태그에 대한 면역블롯팅(내인성 His-태깅된 단백질 'TRAPH6'이 로딩 대조군으로 사용됨)에 의해 분석하였으며, 이는 SmNucAH6가 용량 의존 방식으로 배양물에서 발현되고 분비됨을 입증하였다. 정화된 배양 상청액은 PicoGreen 검정에 의해 잔여 DNA에 대해 분석하였으며, 이는 DNA 검출의 감소가 배지 중 SmNucAH6의 존재에서만 발생하였음을 입증하였다. 결과는 도 4에 도시된다.
실시예 3: 렌티바이러스 벡터 생성물의 생산 동안의 C-말단 히스티딘 태깅 및 비태깅 분비된 뉴클레아제
HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터는 총 pDNA의 10% 투입량으로 부착 또는 현탁 HEK293T 세포 내로의 분비된 뉴클레아제 플라스미드의 일시적 공동-형질감염에 의해 생성하였다. 렌티바이러스 벡터 수확물은 정화 전 1시간 동안 Benzonase®로 처리하거나 '비처리된' 상태로 두었다. 분비된 뉴클레아제 배양물은 Benzonase®로 처리하지 않았다. 여과된 배양 배지를 PicoGreen 검정으로 분석하였다. 분비된 뉴클레아제는 배양 배지에서 Benzonase®과 동등하거나 이보다 우수한 DNA 감소를 생성하였다. 결과는 도 5에 도시된다.
실시예 4: 진핵생물 ER 신호 펩티드는 smNucA의 박테리아 분비 펩티드를 대체할 수 있다
HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터(HIV-CMV-GFP)를 총 pDNA의 1% 투입량으로 부착 HEK293T 세포 내로 분비된 뉴클레아제 플라스미드의 일시적 공동-형질감염에 의해 생성시켰다. SmNucA ORF는 이의 천연 박테리아 분비 신호(천연) 또는 인간 알부민 ER 신호 펩티드(Hu 알부민 ER-SP) 또는 VSV-G ER 신호 펩티드(VSV-G ER-SP)를 포함하였다. 렌티바이러스 벡터 수확물 중 어느 것도 Benzonase®로 처리하지 않았다. 여과된 배양 배지를 PicoGreen 검정에 의해 분석하고(검은색 막대), 렌티바이러스 벡터를 HEK293T 세포의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정하였다. 결과는 도 6에 도시된다.
실시예 5: 벡터 구성요소의 일시적 형질감염 동안 부착 HEK293T 세포 배양물에서 렌티바이러스 벡터의 생성 동안 분비된 분기성 뉴클레아제
HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터(HIV-CMV-GFP)를 총 pDNA의 1% 투입량으로 부착 HEK293T 세포 내로 SmNucAH6 또는 VsEndAH6 뉴클레아제 플라스미드의 일시적 공동-형질감염에 의해 생성시켰다. 렌티바이러스 벡터 수확물은 벡터 수확 전 1시간 동안 Benzonase®로 처리하거나 '비처리된' 상태로 두었다. 분비된 뉴클레아제 배양물은 Benzonase®로 처리하지 않았다. 여과된 배양 배지를 PicoGreen 검정에 의해 분석하고(검은색 막대), LV를 HEK293T의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정하였다. 결과는 도 7에 도시된다.
실시예 6: 부착성의 안정한 생산자 세포주 배양물에서 렌티바이러스 벡터의 생성 동안 분비된 분기성 뉴클레아제
HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터(HIV-CMV-GFP)는 총 pDNA의 1% 투입량으로 SmNucAH6 또는 VsEndAH6 뉴클레아제 플라스미드로의 생산자 세포주의 일시적 형질감염에 의해 생성하였다(pBluescript는 표준 스터퍼로 추가됨). 형질감염 후 약 18시간째에, 독시사이클린(최종 농도 1000ng/ml)을 첨가하여 배양물을 유도하였으며, 이는 CMV-tetO 프로모터(항시적으로 발현된 GFP 게놈)에 의해 구동되는 패키징 구성요소의 발현을 발생시켰다. 여과된 배양 배지를 PicoGreen 검정에 의해 분석하고(검은색 막대), LV를 HEK293T의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정하였다. 결과는 도 8에 도시된다.
실시예 7: 현탁 세포 배양물에서 렌티바이러스 벡터의 생성 동안 분비된 분기성 뉴클레아제
HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터(HIV-CMV-GFP)를 현탁액 중 HEK293T 세포에서 생성시켰다. 세포는 총 pDNA의 5% 투입량으로 SmNucAH6 또는 VsEndAH6 뉴클레아제 플라스미드로 일시적으로 공동-형질감염시켰다. 렌티바이러스 벡터 수확물은 벡터 수확 전 1시간 동안 Benzonase®로 처리하거나 '비처리된' 상태로 두었다. 분비된 뉴클레아제 배양물은 Benzonase®로 처리하지 않았다. 여과된 배양 배지를 PicoGreen 검정에 의해 분석하고(검은색 막대), 정제된 총 DNA를 18S DNA에 대한 qPCR에 의해 생산 세포 DNA에 대해 분석하였다(밝은 회색 막대). 렌티바이러스 벡터 상청액은 HEK293T의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정되었다(짙은 회색 막대). 농축된 벡터 상청액을 SDS-PAGE로 처리하고 항-His Tag 항체를 사용하여 면역블롯팅하여 분비된 뉴클레아제 단백질을 검출하였다. 결과는 도 9에 도시된다.
실시예 8: BacNucB 및 BacNucB 변이체를 사용하여 렌티바이러스 벡터 생산 현탁액의 무혈청 세포 배양물에서 잔여 플라스미드 DNA 제거
바실러스 종 BacNucB 단백질(SEQ ID No: 4)은 어떠한 NxS/T 세쿠온을 포함하지 않으며, 따라서 진핵 세포에서 분비 경로를 표적으로 할 경우 N-글리코실화될 수 없다. 따라서, N-글리코실화의 결여가 분비 수준을 방해할 수 있기 때문에 BacNucB가 벡터 생산 배양물로부터 잔여 DNA 제거에서 효과적으로 사용될 수 있는지의 여부는 알려져 있지 않다. 도 2에 요약된 작업 흐름도는 BacNucB의 일차 서열(SEQ ID NO: 4)에 적용되었다. 서열을 분석하고, TMHMM (CBS)을 사용하여 신호 펩티드(이는 TM으로 예측됨)의 C-말단 측에 TM(트랜스멤브레인) 도메인이 존재하지 않음을 결정하였다. SignalP(CBS)에 의한 BacNucB의 분석은 박테리아 분비 펩티드가 ER 신호 펩티드로서 기능할 것으로 예측되며, 이의 절단은 완전한 성숙 뉴클레아제를 생성할 것으로 예측됨을 확인시켜준다. YAPIN (Centre for integrative Bioinformatics VU (IBIVU))에 의한 추가 분석은 NxS/T 모티프가 더 작은 폴드를 방해하지 않으면서 BacNucB 단백질 서열로 도입될 수 있는 영역을 정확히 가리키는 알파-헬릭스, 베타-가닥 및 코일의 영역을 예측하였다. 이와 같이, BacNucB의 하기 4가지 변이체를 확인하였다: P43N(세쿠온=NAS)는 변이체 'N1'이며, G61N(세쿠온=NHS)은 'N2'이며, V65N(세쿠온=NCT)은 변이체 'N3'이고, D133N(세쿠온=NGT)은 변이체 'N4'이다. 43, 61, 65, 및 133에서 'N' 돌연변이를 갖는 BacNucB의 일차 서열은 분석을 위해 NetNGlyc(CBS)에 제출되었다. 모두 4개의 NxS/t 세쿠온은 임계치(0.5)를 넘는 스코어를 가졌으며, N65 및 N133 변이체가 기능 향상 가능성이 가장 높았다. 결과는 도 10에 도시된다.
상기 분석에 기초하여, BacNucB의 4개 변이체(N1, N2, N3 및 N4)를, 천연 단백질 서열 내의 4개 YxS/T 부위에서 Y 잔기를 N으로 변이시켜 일차 아미노산 서열 내에 NxS/T 세쿠온을 삽입함으로써 생성하였다. 이는 잠재적인 N-글리코실화가 단백질 폴딩에 영향을 미치지 않을 가능성을 최대화하기 위해 2차 폴드에 참여하지 않을 것으로 예측되는 위치에서 수행하였다.
모든 BacNucB 발현 플라스미드는 검출 용이성을 위해 이들의 C-말단에 His-태깅시켰다. 현탁액의 무혈청 HEK293T 세포를 총 pDNA의 5% 투입량으로 뉴클레아제 플라스미드 및 HIV-CMV-GFP 벡터 구성요소로 형질감염시켰다. 벡터 수확물로부터 정제된 총 DNA를 KanR 서열에 대한 qPCR에 의해 잔여 플라스미드에 대해 분석하였다(검은색 막대). 렌티바이러스 벡터 상청액은 HEK293T의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정하였다(회색 막대). 농축된 벡터 상청액을 SDS-PAGE로 처리하고 항-HisTag 항체를 사용하여 면역블롯팅하여 분비된 뉴클레아제 단백질을 검출하였다. 데이터는 잔여 플라스미드 DNA가 BacNucBH6에 의해 단지 완만하게 제거되지만 N-글리칸 변이체 중 두 개는 잔여 플라스미드 DNA의 향상된 제거를 보여주었음을 입증한다. VsEndAH6을 인코딩하는 발현 플라스미드는 잔여 DNA 제거 측면에서 BacNucB를 인코딩하는 모든 발현 플라스미드보다 우수하였음을 주지한다.
실시예 9: VcEndA 변이체를 사용하여 무혈청 현탁 세포 배양물에서 렌티바이러스 벡터 생산에서 잔여 플라스미드 DNA의 제거
VcEndA 및 VsEndA는 이들의 아미노산 서열에서 68% 동일성을 공유한다(분비된 형태). VcEndA는 150 내지 200 mM 염(즉, 전형적인 진핵 세포 배양물 중 염 농도에 가까움) 사이에서 최적의 활성을 갖는 것으로 나타났으며, VsEndA보다 pH6.5 및 pH7에서 더 활동적이다. VcEndA 분석(도 2에 도시된 워크플로에 따라)은 이의 4개의 NxS/T 세쿠온 중 3개가 VsEndA에 존재하지 않음을 보여준다. ‘1glc’ VcEndA 변이체는 모두 3개의 위치에서 이들 세쿠온을 제거함으로써 생성되었다(도 3에 도시됨). 인간 알부민 ER 신호 펩티드뿐만 아니라 선택적인 C-말단 His-태그를 갖는 추가적인 VcEndA 변이체를 생성시켰다. (키: wt = VcEndA, 1 = VcEndA-1glc, 2 = AlbVcEndA, 3 = AlbVcEndA-1glyc; 4, 5, 6, 7 = 각각 wt, 1, 2, 3의 His-태깅된 버전. HIV-CMV-GFP 벡터는 5% 총 투입량 pDNA에서 뉴클레아제 플라스미드로 공동-형질감염된 무-혈청 현탁 배양물에서 제조하였다. 렌티바이러스 벡터 상청액은 HEK 293T 세포의 형질도입에 이어 흐름세포측정에 의해 적정하였다(막대). 농축된 벡터 상청액(VcEndA 변이체 4-7)을 항-HisTag 항체를 사용하여 SDS-PAGE/면역블롯팅으로 처리하여 분비된 뉴클레아제 단백질은 물론 VSV-G(렌티리바이러스 벡터 비리온)를 검출하였다. 생산 후 세포 용해물은 또한 뉴클레아제 발현에 대해 프로빙하였다. 벡터 상청액으로부터의 잔여 DNA를 아가로스-전기영동에 의해 시각화하였다. VcEndA(wt)는 배양 배지로 제대로 분비되지 않지만 '1glc' 변이체는 효율적으로 분비되어 잔여 DNA를 효율적으로 제거한다. 결과는 도 12에 도시된다.
실시예 10: 0.5 L 규모의 렌티바이러스 벡터 생산 생물반응기로부터 잔여 DNA의 분해
무-혈청 적합화된 현탁 HEK293T 세포를 6개의 0.5 리터(L) 생물반응기에 시딩하고, 삼중 생물반응기를 5% 총 플라스미드 투입량으로 pSV40-VsEndAH6 또는 pBluescript(STD로 언급됨 - 도 13에서 Benzonase®)와 함께 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 구성요소(GFP 발현 게놈)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 20시간째에 소듐 부티레이트(NaBut)를 10 mM의 최종 농도로 모든 생물반응기에 첨가하였다. NaBut 도입 후 4시간째에 샘플을 취하였다(생물반응기 [NaBut 후 4hr]). 벡터 수확 1시간 전에, pBluescript-공동-형질감염된 생물반응기를 5 U/ml 최종 농도로 Benzonase®로 접종하였다. PSV40-VsEndAH6-공동-형질감염된 생물 반응기는 처리하지 않은 채로 두었다. 삼중 생물반응기로부터의 벌크 수확물을 풀링하여 ~1 L의 수확물을 생성시켰으며, 이는 0.45 μm 여과처리하고, 분석을 위해 샘플을 채취하였다(CL 수확). 이러한 풀링은, 일반적인 대규모 다운스트림 공정을 반영하는 장비/유량의 사용을 허용하는 규모로 다운스트림 프로세스를 수행할 수 있도록 수행하였다. 물질을 이온-교환(IEX) 크로마토그래피로 처리하고, 샘플(IEX 통과액, IEX 세척, IEX 용출물, 및 2M 염으로의 IEX 칼럼 세척)을 수집한 후 중공 섬유 카트리지를 사용하는 정용/한외-여과를 이용하여 추가로 처리하였다. 첫 번째 단계는 완충액 교환(HFF-Benzonase® 전)을 허용하였으며, 그 후 두 번째 뉴클레아제 단계로서 400 U/ml Benzonase®를 '표준 Benzonase®' 처리된 벡터와 VsEndAH6 처리된 벡터 둘 모두에 첨가하였다. 마지막으로, 완충액 교환을 발생시켜 Benzonase®(HFF-Benzonase® 후)를 제거하였다. 샘플을 적정하여 렌티바이러스 벡터 역가(GFP/FACS; TU/ml)를 생성하고 잔여 DNA를 정제하고 KanR 서열에 대한 qPCR에 의해 플라스미드 복사체 수 분석을 실시하였다. 각 단계에서의 총 부피를 고려함으로써 각 단계에 대해 총 TU 및 총 kanR 복세체를 생성시켰다. 결과는 도 13에 도시된다. 데이터는 분비된 VsEndAAH6이 형질감염 후 24시간 만큼 초기에 생물반응기에서 KanR 검출을 10배만큼 감소시키는 반면, 렌티바이러스 벡터 역가는 생물반응기에서 다운스트림 처리 동안 영향을 받지 않은 상태로 남아있음을 보여준다. Benzonase®-처리된 수확물은 VsEndAH6과 비교하여 KanR 검출을 비록 약간 높은 수준이기는 하지만 유사한 수준으로 감소시키는 것으로 보였지만, 다운 스트림 공정을 통한 KanR 검출은 VsEndAH6 물질에서 더 낮았다. 이는 두 접근법을 비교하여 유사한 수의 KanR 복사체가 CL 수확물에서 검출된 반면, 두 조건 간의 정량적 차이가 존재하였음을 시사하며, 즉 VsEndAH6 물질 중의 잔여 DNA는 크기가 더 작고(이의 증거에 있어서 도 14 참조), 다운스트림 공정 동안 제거하기 용이할 것으로 보인다.
실시예 11: 5 L 규모의 렌티바이러스 벡터 생산 생물반응기로부터 잔여 DNA의 분해
GFP를 발현하는 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터는 0.5 L 생물반응기(실시예 10)에 대해 설명된 것과 유사한 방식으로 그러나, 5 L 규모의 단일 생물반응기에서 생성하였다. SAN-HQ는 또한 Benzonase® 및 분비된 뉴클레아제 접근법(5%의 총 플라스미드 투입량으로 공동-형질감염된 pSV40-VsEndAH6)과 병행하여 테스트하였다. 도 14a는 각 공정 단계에서 총 렌티바이러스 벡터 TU 및 검출가능한 플라스미드(KanR)를 보여주고, 도 14b는 업스트림 & 다운스트림 공정 단계에서 농축된 샘플을 겔 전기영동(DNA에 대한 에티듐 브로마이드 염색)으로 분석하였음을 보여준다. 도 13에 도시된 바와 같이, 발현 플라스미드-발현된 분비된 뉴클레아제는 시중의 뉴클레아제(예컨대, Benzonase®)와 비교하여 플라스미드 DNA에서 유사한 또는 우수한 감소를 달성하였으며, 추가로 총 DNA(생성 세포 DNA를 포함할 것임)는 더 작은 단편으로 분해되며, 이는 HFF 카트리지 상에서의 최종 뉴클레아제 단계에 의해 더욱 효율적으로 제거되는 것으로 보인다.
실시예 12: tetR-조절된 뉴클레아제 발현 플라스미드를 사용하여 렌티바이러스 벡터 생산 배양물 내에서 잔여 DNA의 분해
GFP를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터를, 무혈청의 현탁액-적합화된 HEK293T.tetR 세포를 총 플라스미드 DNA의 1% 또는 5% 투입량으로 pCMV-TO-VsEndAH6 및 벡터 구성요소로 일시적 형질감염시켜 생성시켰다(도 15). 뉴클레아제 플라스미드가 제공되지 않은 배양물을 pBluescript로 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 약 20시간째에, 모든 배양물을 소듐 부티레이트 및 1000 ng/mL 독시사이클린으로 유도하였으며(레인 1, 3-6; 존재하는 경우 VsEndAH6 발현을 유도), 단 5% pCMV-TO-VsEndAH6으로 형질감염된 복제 배양물 세트에는 단지 소듐 부티레이트라만 제공하였다(dox 비함유; 레인 2). 대조군 배양물은 처리하지 않은 채 두거나(Nuc 비함유) 수확 1시간 전 5 U/mL 최종 농도의 SAN 또는 Benzonase®로 처리하였다. 수확 1시간 전에 모든 배양물에 2 mM MgCl2를 최종 농도로 제공하였다. 모든 조건은 삼중으로 수행하였다. 수확시, 생산 세포는 원심분리에 의해 제거하고, 상청액은 HEK293T 세포의 형질도입 후 흐름세포측정에 의해 적정하기 전에 여과하였다(0.22 μm). 각 삼중 배양물의 상청액을 풀링시키고, 3K 컷-오프 Amicon-15 장치를 사용하여 원심분리에 의해 ~2 mL를 0.12 mL로 농축하고, 이 물질의 50%를 잔여 DNA 전기영동을 위해 2% 아가로스 겔에 로딩하였다(에티듐 브로마이드). 데이터는 tetR-조절된 뉴클레아제 발현이 뉴클레아제 발현의 일시적 조정을 허용하기 위해 사용될 수 있으며; 형질감염 후 20시간째에 독시사이클린 첨가는 시중의 뉴클레아제와 비교하여 잔여 DNA의 향상된 제거에 의해 나타낸 바와 같이 충분히 활성 수준의 분비된 뉴클레아제를 유도함을 보여준다. 분비된 뉴클레아제의 존재하에 생성된 렌티바이러스 벡터의 역가는 모두 1x106 TU/mL 초과였으며, 이는 벡터의 출력에 최소한의 영향을 미침을 입증한다.
실시예 13: 분비되는 뉴클레아제를 발현하는 헬퍼 세포와 공동-배양함으로써 렌티바이러스 벡터 생산 배양물 내에서 잔여 DNA의 분해.
GFP를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터는 벡터 구성요소와 무혈청의 현탁액-적합화된 HEK293T-1.65S 세포의 일시적 형질감염에 의해 생성시켰다. 병행하여 동일한 규모로, 무혈청의 현탁액-적합화된 HEK293T.tetR 세포를 tetR-조절된 뉴클레아제 플라스미드 pCMV-TO-VsEndAH6 또는 pCMV-TO-smNucAH6로 형질감염시켰다. 형질감염 후 약 20시간째에, 배양물을 소듐 부티레이트 및 1000 ng/mL dox와 함께 10%의 헬퍼 세포 배양물로 접종시켜 헬퍼 세포로부터 뉴클레아제 발현을 유도하였다. 대조군 배양물은 처리되지 않은 채 두거나(Nuc 비함유) 수확 1시간 전 5 U/mL 최종 농도로 SAN 또는 Benzonase®로 처리하였다. 모든 배양물에 수확 1시간 전에 2 mM MgCl2을 최종 농도로 제공하였다. 모든 조건은 삼중으로 수행하였다. 수확시, 생산 세포는 원심분리에 의해 제거되고, 상청액은 HEK293T 세포의 형질도입에 이어서 흐름세포측정에 의한 적정 전에 여과하였다(0.22 μm). 각 삼중 배양물의 상청액을 풀링시키고, 3K 컷-오프 Amicon-15 장치를 사용하여 원심분리에 의해 ~2 mL를 0.12 mL로 농축하고, 이 물질의 50%를 잔여 DNA 전기영동을 위해 2% 아가로스 겔에 로딩하였다(에티듐 브로마이드). 결과는 도 16에 도시된다. 데이터는 뉴클레아제를 발현하는 헬퍼 세포가 벡터 생산 세포와 공동-배양되어 시중의 뉴클레아제와 비교하여 잔여 DNA의 향상된 제거로 나타내는 바와 같이 충분히 활성인 수준의 분비된 뉴클레아제를 허용할 수 있음을 보여준다. 분비된 뉴클레아제의 존재하에 생성된 렌티바이러스 벡터의 역가는 모두 1x106 TU/mL 초과이며, 이는 벡터의 출력에 미치는 영향이 없음을 입증한다.
실시예 14: 동결-해동 단계를 필요로 하는 벡터 생산 동안 잔여 핵산의 분해를 위한 분비되는 뉴클레아제를 발현하는 AAV-기반 및 아데노바이러스-기반 벡터 생산 시스템
A. 일시적 형질감에 의해 AAV 벡터의 생산에서 분비된 뉴클레아제 사용의 작업 흐름:
1. 배양 용기 내에의 생산 세포(예를 들어, HEK293)의 시딩(부착 또는 현탁)
2. 뉴클레아제 플라스미드와 벡터 구성요소의 일시적 공동-형질감염:
i. 총 pDNA의 하위분획으로서 공동형질감염된 pNuclease와 벡터 구성요소 pAAV 게놈:pRepCap:pHelper(예를 들어, 1:1:1 비율)의 다중-플라스미드 형질감염
ii. 리포펙타민 또는 PEI와 같은 시약을 통한 형질감염
3. 수일(예를 들어, 2 내지 4일) 동안 형질감염된 세포 배양물의 인큐베이션
4. 세포 용해:
i. 배양 배지 중 생산 세포의 직접 동결-해동, 또는
ii. 생산 세포의 농축화 후 화학적 용해 또는 물리적 용해, 예를 들어 미세유동화/동결-해동
iii. 분비된 뉴클레아제가 오염 DNA를 분해하게 하는 제한된 인큐베이션 기간
5. 벌크 물질의 여과 및 선택적 동결
6. 다운스트림 정화/농축, 예를 들어 크로마토그래피(이온-교환), 정용/한외-여과 및/또는 크기 배제.
B. 아데노바이러스 E1-발현 세포에서의 증폭에 의한 아데노바이러스 벡터 생산에서 분비된 뉴클레아제 사용의 작업 흐름:
1. 배양 용기 내에의 생산 세포(예를 들어, HEK293)의 시딩(부착 또는 현탁)
2. MOI=1에서 아데노바이러스 벡터 시드 스톡의 접종
3. 24-72시간 동안 또는 ~50% 가시적인 세포병리 효과(cpe)까지 배양물 인큐베이션
4. 세포 용해:
i. 배양 배지 중 생산 세포의 직접 동결-해동, 또는
ii. 생산 세포의 농축화 후 화학적 용해 또는 물리적 용해, 예를 들어 미세유동화/동결-해동
iii. 분비된 뉴클레아제가 오염 DNA 분해하게 하는 제한된 인큐베이션 기간
5. 벌크 물질의 여과 및 선택적 동결
6. 선택적으로, 단계 1-5의 연속적인 확장
7. 다운스트림 정화/농축, 예를 들어 크로마토그래피(이온-교환), 정용/한외-여과 및/또는 크기 배제.
실시예 15: 렌티바이러스 벡터 생산 무혈청의 현탁 배양에서 잔여 DAN를 분해하기 위해 NxS/T 세쿠온 절제 돌연변이를 포함하는 VcEndA 변이체의 생성 및 평가.
GFP를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터를 LV 구성요소 pDNA로 공동-형질감염된 다양한 분비되는 뉴클레아제 인코딩 플라스미드(0.5% 또는 5% 총 투입 pDNA)를 갖는 무혈청의 현탁-적합화된 HEK293T-1.65S 세포로부터 생성하였다. 시험한 분비된 뉴클레아제를 면역블롯팅에 의한 검출 용이성을 위해 C-말단에 모두 His-태깅하였다. 도 17b에 나타낸 모든 세쿠온-변이된 변이체를 야생형 VcEndA ('1234-glc'), SmNucA 및 VsEndA와 함께 테스트하였다.
생산 종료 세포 용해물 및 농축된 상청액을 His6-Tag(뉴클레아제), 튜불린(세포 대조군) 또는 VSVG(분비 대조군, 즉 LV 비리온 상의 VSVG)에 대한 항-혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 처리하였다 - 도 18a & b 참조. 이들 면역블롯은 분비된 뉴클레아제(모두 이들의 글리코실화된 형태)가 세포에서 발현되고 LV 생산 동안 어느 정도 분비되었음을 입증하였다. 야생형 VcEndAH6-1234glc 뉴클레아제(및 VcEndAH6-123glc 변이체)는 제대로 분비되지 않았으며, 이는 NxS/T 세쿠온 절제 접근법이 신규하고 개선된 분비 뉴클레아제 변이체를 생성하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 요약하면, 1glc 및 12glc 변이체는 주로 단일 글리코실화된 반면, 다른 형태의 VcEndAH6 모두는 이중 글리코실화되었다. 추론을 통해, 존재하는 경우, VcEndAH6 (wt) 및 VcEndAH6-134glc을 제외하고 102NCT (#1), 130NRS (#3) 및 133NFS (#4)에서 세쿠온이 사용되며, 여기에서 주로 이들 세쿠온 중 단지 2개가 실제로 사용되는 것으로 결론내릴 수 있다. LV 역가는 모두 1x107 TU/mL을 초과하였으며, 이는 높은 역가 벡터가 분비된 뉴클레아제의 존재하에 생성될 수 있음을 입증한다(도 19a).
배양 상청액을 또한 프로세싱 처리하여 농축된 샘플을 발생시키고, 이를 겔 전기영동을 통한 시각화에 의해 잔여 DNA 함량에 대해 분석하였다(도 19b). 이러한 분석은 잔여 DNA 분해 및 개선된 분비와의 일반적인 상관관계를 보여주었다. 그러나, 130NRS 세쿠온(#3)이 VcEndAH6 내에 존재하는 경우, 뉴클레아제가 효율적으로 분비되는 경우에도 DNA 분해는 훨씬 덜 효율적이며; 이는 VcEndA 내의 NRS 세쿠온은 우선적으로 N-글리코실화에 사용되나, 이러한 변형은 뉴클레아제 활성의 감쇠를 발생시킴을 나타낸다.
실시예 16: 다양한 설정된 pH 조건에서 분비된 뉴클레아제를 사용하여 렌티바이러스 벡터 생산 무혈청 현탁 배양물 내 잔여 DNA의 분해.
GFP를 인코딩하는 HIV-1 기반 벡터는 LV 구성요소 pDNA로 공동-형질감염된 플라스미드(5% 총 투입 pDNA)를 인코딩하는 다양한 분비된 뉴클레아제로 무혈청의 현탁-적합화된 HEK293T-1.65S 세포로부터 생성시켰으며, 배양물은 형질감염 후 두 개의 상이한 pH 수준으로 설정하였다; pH7.2(약 알칼리성) 및 pH6.6(약 산성) - 도 20-22 참조. AMBR-15 시스템을 사용하여 이중의 12 mL 배양물을 설정하고, pH 수준(도 20a) 및 세포 생존율(도 20b)을 생산 실행 동안 매일 측정하였다. 형질감염일(2일)에, pH 설정점은 pDNA/리포펙타민 형질감염 혼합물을 첨가한 후 6.6 ±0.15 또는 7.2 ±0.15였으며, 이들 pH 설정점은 4일에 LV 수확때까지 유지하였다. 사용된 분비된 뉴클레아제 플라스미드는 pSV40-VcEndAH6-1glc (SEQ ID NO: 11, C-말단 His6 Tag을 지님), pSV40-VsEndAH6 (SEQ ID NO: 2, C-말단 His6 Tag을 지님), 및 pSV40-SmNucAH6 (SEQ ID NO: 3, C-말단 His6 Tag을 지님)였다. 나머지 12개 형질감염/배양물에 5% pBluescript를 첨가하고, 임의의 분비된 뉴클레아제는 공급하지 않았다. 이러한 나머지 12개 배양물은 LV 수확 1시간 전에 Benzonase® (4개 배양물) 또는 SAN (4개 배양물)로 처리하거나 비처리하고(4개 배양물); pSecNuc 형질감염된 배양물(각각의 경우 4개)에 따라 이들은 pH6.6 및 pH7.2 설정점 시험 조건으로 쌍을 이루었다.
생산 종료 세포 용해물 및 농축된 상청액을 His6-Tag(뉴클레아제), 튜불린(세포 대조군) 또는 VSVG(분비 대조군, 즉 LV 비리온 상의 VSVG)에 대한 항-혈청을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 처리하였다 - 도 21a & b 참조. 이들 면역블롯은 분비된 뉴클레아제(모두 이들의 글리코실화된 형태)가 세포에서 발현되고 LV 생산 동안 효율적으로 분비되었음을 입증하였다.
LV-CMV-GFP 상청액은 HEK293T 세포에서 적정하였으며, 이는 모든 조건이 1x106 TU/mL 초과의 LV 생산을 가능하게 하였으며, 두 pH 설정점에서 생산 역가의 일반적인 유사성을 가짐을 나타낸다(도 22a). 배양 상청액을 또한 프로세싱 처리하여 농축된 샘플을 발생시키고, 이를 겔 전기영동을 통한 시각화에 의해 잔여 DNA 함량에 대해 분석하였다(도 22b). 분비된 뉴클레아제 또는 Benzonase®/SAN으로 처리된 모든 배양물은 비처리된 것에 비해 더 적은 양의 잔여 DNA를 나타내었으며, 다만 분비된 뉴클레아제가 일반적으로 시중의 뉴클레아제를 능가하였다. VsEndAH6은 pH6.6과 비교하여 pH7.2에서 더욱 우수한 잔여 DNA 제거 특성을 나타내었다. 그러나, VcEndAH6-1glc 및 SmNucAH6 둘 모두는 pH 설정점 둘 모두에서 잔여 DNA를 제거하는데 효율적인 것으로 나타났다; VcEndAH6-1glc는 이를 달성하면서 LV 역가에 최소한의 영향을 제공하는 것으로 보임이 주지된다.
실시예 17: 상이하게 설정된 pH 조건에서 렌티바이러스 벡터 생산의 무혈청 현탁 배양물 내에서 잔여 DNA의 분해: VcEndA의 2개의 상이한 N-글리칸-변이체의 활성 비교.
실시예 15는 야생형 VcEndA와 비교하여 분비 및 잔여 DNA 제거가 개선된 3개의 VcEndA 변이체를 확인하였으며, LV 역가에 최소한의 영향을 끼치거나 끼치지 않았다. 이들은 VcEndAH6-1glc, -14glc and -124glc이었다. 실시예 16은 알칼리성 또는 산성 배양 조건 하에 교반 탱크 미니-생물반응기에서 VsEndAH6 및 SmNucAH6과 함께 VsEndAH6-1glc 변이체를 테스트하였으며, 이는 VsEndAH6이 산성 pH에서 VcEndAH6-1glc보다 덜 효율적으로 작동함을 입증하였다. VcEndAH6-1glc가 VsEndA를 기반으로 하는 변경된 잔기를 가진 변이된 NxS/T 세쿠온을 보유하고 있기 때문에, 다른 NxS/T 세쿠온이 '복원'되는 경우 산성 조건에서 VcEndAH6-1glc의 향상된 활성이 추가로 개선될 수 있는지의 여부는 불분명하였다. 실시예 16에 요약된 것과 유사한 실험을 수행하였으며(pH6.6 또는 7.2에서 교반 탱크 미니-생물반응기[AMBR-15]에서 LV-CMV-GFP 벡터 및 분비된 뉴클레아제의 생성), VcEndAH6-124glc, VcEndAH6-1glc 및 VsEndAH6을 시중의 뉴클레아제와 비교하였다(도 23 및 24). pH에 대한 설정점 및 세포 생존율을 기록하고(도 24a 및 24b), LV를 적정하여 이들 뉴클레아제가 생산 역가에 영향을 미치지 않았음을 입증하였다(도 24a). 배양 상청액을 또한 프로세싱 처리하여 농축된 샘플을 발생시키고, 이를 겔 전기영동을 통한 시각화에 의해 잔여 DNA 함량에 대해 분석하였다(도 24b). 이러한 분석은 VcEndAH6-1glc 및 VcEndAH6-124glc에 의한 매우 유사한 수준의 잔여 DNA 제거를 나타내었으며, 두 변이체 모두 VsEndAH6을 능가할뿐만 아니라 산성 조건에서 향상된 활성을 나타내었다. 이러한 데이터는 VcEndAH6-1glc 변이체가 일차 서열에 도입된 변형에도 불구하고 산성 pH에서 활성의 완전한 특성을 가지고 있음을 입증하며, 이는 아마도 변경된 잔기가 VsEndA로부터 VcEndA를 구별하는 뉴클레아제 활성에 기여하지 않음을 나타낸다.
실시예 18: AAV-기반 벡터의 생산 동안 잔여 DNA를 분해하기 위한 분비되고 세포-보유된 뉴클레아제의 사용.
벡터 비리온이 생산 세포 - 예컨대, AAV 및 AdV - 와 회합된채 보유되게 하는 바이러스 벡터의 생산을 위해, 생산 세포는 세포-붕괴제, 예컨대 세제를 첨가함으로써 생물반응기 내에서 원위치에서 직접적으로 용해될 수 있는 것으로 예상된다. 이 경우, 배양 배지 내에서 분비된 뉴클레아제는 오염 DNA를 분해하도록 존재할 것이다. 그러나, 생산 세포가 (예를 들어, 침전 또는 원심분리 또는 배지 변경에 의해) 배양 배지로부터 분리되는 경우, 공동-발현된 뉴클레아제는 세포 용해 후 존재하고 활성화되기 위해 세포와 회합된 상태로 유지되는 것이 바람직하다. 본 실시예는 공지된 ER-보유 신호 'KDEL'을 갖는 뉴클레아제의 C-말단 부속기가 scAAV2-GFP 생산 동안 세포 용해물로부터 잔여 DNA 제거를 어떻게 개선하는 지를 보여준다. 도 25는 (비제한적인 용어로) ER-보유 신호가 ER 루멘 내로 분비된 뉴클레아제에 부속될 수 있어 'ER 보유-결함[ERD] 보완 기' 단백질 수용체에의 결합을 발생시켜 ER 루멘으로 계속해서 다시 순환될 수 있는 방법을 보여준다. 이러한 접근법을 테스트하기 위해, VcEndAH6 [wt](HEK293T 기반 세포에서 제대로 분비되지 않은 것으로 보임; 도 18ab 참조) 및 VcEndAH6-1glc는 C-말단 'KDEL' 서열을 포함하도록 조작되었다. 도 26은 AAV2 벡터 구성요소 플라스미드(게놈:RepCap2:헬퍼 비율은 1:1:1임)와 함께 지시된 뉴클레아제 발현 플라스미드(총 투입량의 5%)로의 무혈청 현탁 HEK293T 세포의 공동-형질감염에 의한 scAAV2-GFP 벡터 생산 결과를 나타낸다. SmNucAH6 뉴클레아제 또한 테스트하였다. 뉴클레아제 발현 플라스미드가 포함되지 않은 2개의 대조군을 포함시켰다(즉, 5% pBluescript: 'AAV-NEG'). 2일 후, 세포를 펠렛화시키고, 상청액으로부터 분리하고, 세제-기반 세포용해 완충액의 존재하에 3회 동결-해동 사건을 수행하였다. 염화마그네슘을 모든 조건(2 mM 최종)에 첨가하고, SAN을 대조군 중 하나에 추가하여 시중의 뉴클레아제(효과적으로 75U/0.5 mL 세포 펠렛)와의 비교를 허용하였다. 잔해물을 저속 원심분리에 의해 제거하고, 생성된 용해물을 여과한 후, 미정제 벡터-함유 상청액을 HEK293T 세포에 대해 적정하였으며(도 26a), 잔여 DNA를 아가로스 겔 전기영동(이티듐 브로마이드)에 의해 분석하였다(도 26b). 이 실시예는 SmNucAH6이 이 수준의 플라스미드 투입에서 역가를 3-4배 감소시켰음에도 불구하고, 높은 역가 scAAV2-GFP가 공동-발현된 뉴클레아제의 존재하에 생성될 수 있음을 입증한다. 테스트된 다른 뉴클레아제는 5% 투입 수준에서 벡터 생산에 영향을 미치지 않았다. 잔여 DNA 제거 분석은 실제로 KDEL 서열없이 VcEndAH6-1glc 및 smNucAH6을 사용하여 매우 우수한 수준의 DNA 분해를 달성할 수 있었음을 나타내었다. 세포 용해물과 회합된 이러한 두 분비된 뉴클레아제의 수준(도 18b 참조)은 효율적인 DNA 제거를 허용하기에 충분한 것으로 보이며, 세포로부터 분비되는 '과정 중에(on their way)' 완전히 활성인 단백질이 존재하였음을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, VcEndAH6 [wt] 및 VcEndAH6-1glc에 대한 KDEL 부속물은 비-KDEL 변이체와 비교하여 개선된 DNA 제거를 허용하는 것으로 나타났다. 렌티바이러스 벡터 생산으로 관찰된 바와 같이, VcEndAH6-1glc는 VcEndAH6 [wt] 버전보다 훨씬 더 효율적이었고, VcEndAH6-1glc-KDEL 변이체는 도 26b의 겔 이미지의 밀도계 프로파일을 비교할 때 배경 수준에 가깝게 잔여 DNA 수준을 감소시킬 수 있었다(도 27). VcEndAH6-1glc-KDEL 변이체는 겔 분석에서 일반적으로 관찰되는 작은 '내성' 형태의 DNA를 제거하는데 있어서 SAN뿐만 아니라 테스트된 다른 분비된 뉴클레아제를 능가하였다. 실시예는 세포-회합 방식으로 잔여 DAN를 제거하는데 있어서 분비된 뉴클레아제의 유용성을 입증하며, 이는 ER-보유 신호의 사용에 의해 개선될 수 있음을 입증한다.
실시예 19: 일시적 형질감염에 의해 뉴클레아제 헬퍼 세포를 생성하기 위한 형질감염 파라미터의 최적화
바람직한 구현예에서 분비된 뉴클레아제 기술을 적용하는 주요 방법 중 하나가 별도로 생성된 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하고, 일단 바이러스 벡터 입자가 생성되면 주요 바이러스 벡터 생산 배양에 적용될 것이다. 한 접근법은 GMP 제조 캠페인 동안 동시에 세포를 일시적으로 형질감염시키는 것이다 - 이상적으로는 바이러스 벡터 인코딩 플라스미드에 의한 일시적 형질감염에 사용될 동일한 기본 세포주이다. 생각할 수 있듯이, 일시적으로 형질감염된 뉴클레아제 헬퍼 세포의 GMP 뱅크가 생성될 수 있으며(동결 전에 특성규명되고 검증됨), 그런 다음 소생되어 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에 적용될 수 있다. 안정적이고 tet-조절된 뉴클레아제 헬퍼 세포에 비해 일시적으로 형질감염된 뉴클레아제 헬퍼 세포의 사용에 대해 인식되고 이점은 테트라사이클린 또는 독시사이클린과 같은 화학적 유도인자가 필요 없다는 점이다. 그러나, 헬퍼 세포 접근법이 적용되며(일시적 또는 안정적), 바람직한 구현예에서, 중요한 파라미터는 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에서 바람직한(유효한) 수준의 분비된 뉴클레아제 활성을 달성하기 위해 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에 첨가된 헬퍼 세포의 총 수일 것이다.
바이러스 벡터 플라스미드(이전 실시예 참조)와 함께 분비된 뉴클레아제 플라스미드의 공동-형질감염의 접근법은 사용되는 프로모터의 강도에 따라 1-5%의 일반적인 범위의 백분율 투입 수준(형질감염되는 플라스미드 DNA의 총량에 비해)을 드러내었다. 그러나, 이러한 접근법에서, 바이러스 벡터 플라스미드는 서로에 대해 및 또한, 분비되는 뉴클레아제 플라스드에 대해 '담체' DNA로서 작용한다. 바람직한 구현예에서 GMP 생산과 양립가능하게 하기 위한 헬퍼 세포 접근법에 있어서, 단지 분비되는 뉴클레아제 플라스미드만이 세포 내로 형질감염되어야 하며(어떠한 '스터퍼' DNA 없이), 더욱이, 잔여 DNA의 최대 제거를 달성하기 위해 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에 낮은 수의 헬퍼 세포를 적용할 수 있게 하기 위해 헬퍼 세포로부터 분비된 뉴클레아제의 최대 발현/분비를 달성하는 것이 바람직할 것이다. 이를 평가하기 위해, 무혈청 현탁 HEK293T 세포를 투입량 범위(최종 배양물 mL 당 100 내지 900 ng)에서 더 약한 SV40 프로모터 또는 더 강한 CMV 프로모터에 의해 구동된 VcEndAH6-1glc 또는 SmNucAH6 인코딩 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염은 2개의 군으로 수행될 수 있다: 소듐 부티레이트 유도의 존재 또는 부재(10 mM 최종 농도). 소듐 부티레이트 유도는 소듐 부티레이트 유도 시에(또는 이를 넘어서) (소듐 부티레이트는 HEK293-기반 세포에서 CMV와 같은 프로모터에 의해 구동되는 유전자의 발현을 상향-조절하는 것으로 공지됨) 주요 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 헬퍼 세포를 첨가하는 효과를 모방하기 위해 형질감염 후 20시간 이내에 수행하였다(렌티바이러스 벡터 생산의 소듐 부티레이트 유도를 위한 전형적인 체제). 각각의 분비되는 뉴클레아제 플라스미드에 대해 공동-형질감염 대조군을 포함시켰으며, 이에 의해 pSecNuc(총 5%; 최종 배양물 mL 당 62 ng)를 pBlueScript(총 95%)와 혼합하였다; 이는 헬퍼 세포 배양물의 분비되는 뉴클레아제 발현을 본원의 다른 실시예에서 예시된 공동-형질감염 접근법과 비교할 수 있도록 수행되었다. 형질감염 2일 후, 형질감염된 헬퍼 세포로부터의 상청액을 수확하고, 분비된 뉴클레아제(항-HisTag)에 대한 면역블롯팅에 의해 분석하였다; 세포 용해물은 또한 분비된 뉴클레아제 및 GAPDH에 대한 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 분비된 뉴클레아제 밴드 세기를 정량화하고, 세포에서 발현된 분비된 뉴클레아제의 수준을 평가하기 위해 GAPDH 밴드로 정규화하였으며(도 28a), 이는 상청액에서 분비된 뉴클레아제의 면역블롯과 비교하였다(도 28b).
데이터는 (예상대로) 프로모터 강도의 선택이 세포에서 분비된 뉴클레아제의 발현 수준과 관련이 있으며, CMV-프로모터 구동 카세트가 SV40-프로모터 대응물보다 더 높은 수준의 발현을 달성한다는 것을 보여준다. ≥700 ng 플라스미드 DNA의 형질감염 투입(세포 배양물 mL 당, ≥8x105 생존 세포 포함)이 최대 수준에 가까운 수준의 분비된 뉴클레아제 발현을 달성한다는 것이 확인되었다. 소듐 부티레이트 유도의 효과는 일반적으로 CMV-프로모터 구동 카세트로 관찰되었다; VcEndAH6-1glc 발현의 증가는 SmNucAH6과 비교하여 VcEndAH6-1glc로 더욱 분명하였다. 이는 SmNucAH6 발현이 어떤 방식으로든 '자기-제한적'일 수 있음을 나타내는 이전 연구와 일치하며, VcEndAH6-1glc 뉴클레아제가 본 발명의 적용에서 우수한 선택이라는 추가적인 증거를 구축한다. PSV40-VcEndAH6-1glc(본원의 다른 실시예에서 예시된 '공동-형질감염' 접근법에 주로 사용됨)를 사용하여 달성된 VcEndAH6-1glc 발현 수준을 ≥700ng/mL 투입 수준에서 pCMV-VcEndAH6-1glc 작제물과 비교할 경우, 후자는 전자보다 적어도 10배 더 많은 발현을 달성할 수 있었다.
실시예 20: 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 첨가될 경우 뉴클레아제 헬퍼 세포의 뉴클레아제 활성 출력의 정량
실시예 19는 극도로 높은 수준의 뉴클레아제 분비 및 뉴클레아제 활성으로 뉴클레아제 헬퍼 세포 배양물이 생성될 수 있음을 입증하였다. 분명하게는, 본 발명은 뉴클레아제 헬퍼 세포를 생성하는 많은 방법을 기술하고 있으며, 주어진 헬퍼 세포 배양물의 뉴클레아제 출력 활성은 다양할 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 헬퍼 세포를 첨가함으로써 바이러스 벡터 생산 배양물로 바람직한/유효한 수준의 뉴클레아제 활성을 달성하기 위해, 보충되는 헬퍼 세포의 수는 사용되는 헬퍼 세포의 뉴클레아제 활성 출력에 따라 달라질 것이다. 그러나, 가장 바람직한 접근법은 벡터 생산 공정에 미치는 영향(예를 들어, 희석 효과와 같은 바이러스 벡터 생산 세포에 대한 효과 및/또는 성장 대사산물 경쟁)을 최소화하기 위해 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에 추가할 경우 가능한 한 적은 헬퍼 세포가 필요한 접근법이다. 바람직한 구현예에서 이를 달성하기 위해, 분비된 뉴클레아제의 최대 발현이 바람직하거나, 일부 경우에 필요하다; 이는 실시예 19에서 예시되었다. 헬퍼 세포를 첨가함으로써 바이러스 벡터 생산 배양물 내에서 DNA 제거의 효율성을 평가하기 위해, 초기 실험을 수행하였으며, 이에 의해 뉴클레아제 헬퍼 세포는 배양물 mL 당 750 ng 플라스미드 DNA로 무혈청 현탁 HEK293T 세포를 일시적으로 형질감염시킴으로써 생성하고, 주요 렌티바이러스 벡터 생산 용기에 있는 총 세포 수에 비해 다양한 백분율 투입량으로 렌티바이러스 벡터 생산 배양물에 첨가하였다; 이들은 10%, 5%, 2.5% 및 1%였다. 이러한 초기 실험에서 VcEndAH6-1glc 및 SmNucAH6에 대한 SV40-프로모터 구동된 뉴클레아제 플라스미드를 사용하였다. 주요 바이러스 벡터 생산 및 헬퍼 배양물로부터의 세포를 관련 구성요소로 동시에 형질감염시킨 다음, 원래의 벡터 생산 배양물로부터 분리된 바이러스 벡터 생산 배양물을 복제하기 위해 적절한 부피의 헬퍼 세포 배양물 현탁액(상기 백분율을 나타냄)을 첨가하기 전에 형질감염 후 ~20시간째에 계수하였다. 그 후, 이 시점으로부터 정상 벡터를 계속해서 생산시키고(이 경우, 소듐 부티레이트 유도가 헬퍼 세포 첨가와 수반하여 발생함), 벡터 수확물은 면역블롯에 의한 뉴클레아제 분비의 적정 및 분석을 위해 및 잔여 DNA 함량을 위해 취하였다(도 29). 헬퍼 세포의 존재 또는 부재하에 생성된 벡터 역가는 >1x107 TU/mL였으며, 10% 및 5% 헬퍼 세포 투입(< 2배)에서 최소한의 영향을 받았으며, 이는 아마도 바이러스 벡터 생산 배양물 내로의 10% 초과의 헬퍼 세포 첨가가 바람직하지 않을 수 있음을 나타낸다(도 29a). 헬퍼 세포 배양물에서 달성된 분비된 뉴클레아제의 수준은 극도로 높았으며(면역블롯에서 밴드의 소진에 의해 표시됨), 벡터 생산 배양물 중 분비된 뉴클레아제의 생성 수준은 투입 백분율과 매우 관련이 있다(도 29b). 또한, SmNucAH6와 비교하여 더 높은 수준의 VcEndAH6-1glc 단백질 수준이 달성되었다. 놀랍게도, 1%의 가장 낮은 투입 수준에서도 모든 분비된 뉴클레아제 조건에 대해 매우 우수한 수준의 잔여 DNA 제거가 관찰되었다(도 29c). 이는 적당한 활성의 프로모터를 사용하는 분비된 뉴클레아제 발현 카세트를 사용하여 뉴클레아제 헬퍼 세포 접근법이 이용될 수 있지만, 중요하게는, 바람직한 구현예에서 더 강한 프로모터가 사용되면 더 적은 수의 뉴클레아제 헬퍼 세포가 바이러스 벡터 생산 배양물에 첨가되어, 잠재적으로 벡터 역가에 대한 임의의 관찰가능한 영향을 피할 수 있음을 나타내었다.
뉴클레아제 헬퍼 세포 접근법의 대한 추가 평가는 pCMV-VcEndAH6-1glc 플라스미드의 사용에 초점을 맞추고, 주요 바이러스 벡터 생산 배양물에 추가된 헬퍼 세포의 수를 감소시킴으로써 수행되었다. 헬퍼 세포 및 렌티바이러스 벡터 생산 세포를 각각의 플라스미드로 동시에 형질감염시킨 다음, 상이한 비율의 헬퍼 세포를 소듐 부티레이트 유도 지점에서 형질감염 후 ~20시간에 벡터 생산 배양물에 첨가하였다. 이전과 유사하게, 뉴클레아제 헬퍼 세포는 배양물 mL 당 750 ng 플라스미드 DNA로의 무혈청 현탁 HEK293T 세포의 일시적인 형질감염에 의해 생성시켰다. CMV-프로모터 구동된 카세트가 SV40-프로모터보다 10배 초과의 VcEndAH6-1glc 단백질을 생산하였음이 이전에 입증되었기 때문에, 헬퍼 세포의 세포 투입 범위는 (벡터 생산 배양물 내의 세포 수와 관련하여) 단지 0.1%까지 감소되었다. 생존 세포 계수를 고려한 후, 이는 40 mL의 벡터 생산 배양물에 첨가된 30 μL의 헬퍼 세포 배양물에 해당하였다. 이 실험에서 추가 대조군은 수확 1시간 전에 표준 Benzonase/SAN(5U/mL) 처리를 포함하였으며, 5% '공동-형질감염' 대조군(LV 구성요소와 혼합된 pSV40-VcEndAH6-1glc)을 포함하여 헬퍼 세포 접근법을 '공동-형질감염' 접근법과 직접적으로 비교하였다. 이전과 마찬가지로 벡터 생산은 정상적으로 계속되었으며, 잔여 DNA 함량의 적정 및 분석을 위해 벡터 수확물을 취하였다(도 30). 헬퍼 세포의 존재 또는 부재하에 생성된 벡터 역가는 >1x107 TU/mL였으며, 5% 및 1% 헬퍼 세포 투입(< 3배)에서 최소한의 영향을 받았다(도 30a).
농축된(44배) 벡터 생산 배양물에서 잔여 DNA 제거의 평가는 분비된 VcEndAH6-1glc에 의한 잔여 DNA 제거가 매우 우수한 것으로 나타났으며, 이는 Benzonase/SAN 처리된 벡터 샘플의 것과 동일하거나 더욱 우수한 것으로 나타났다(도 30b). 놀랍게도, 벡터 생산 배양물 내 총 세포 수의 0.1%만이 헬퍼 세포를 포함할 경우, 명백한 잔여 DNA 제거 수준은 높은 투입 수준의 헬퍼 세포 대비 효과적이었다. 흥미롭게도, 모든 농축된 벡터 상청액에 있어서 '뉴클레아제-내성' 밴드('피드-특이적(Feed-specific)')가 관찰되었지만, 농축된 헬퍼 세포 상청액에서는 관찰되지 않았다. 이는 이 밴드가 렌티바이러스 벡터-함유 상청액에 특이적이었음을 나타내었으며, 이는 VcEndAH6-1glc의 RNAse 활성으로부터 보호되는 (세포) RNA - 가능하게는 비리온 내에 잔류함 -일 수 있음을 시사한다. 렌티바이러스 벡터 생산 동안 분비된 뉴클레아제의 사용의 다른 많은 실시예를 살펴보면 유사한 밴드가 때때로 관찰될 수 있다. 이러한 실시예에서, 벡터 상청액의 배수-농도는 이전 실시예보다 컸으며, 아마도 이 실험에서 이러한 밴드의 검출 감도를 증가시킬 수 있다. 그러나, 이러한 밴드는 정제된 벡터 물질에서 관찰되지 않으며(실시예 11 및 21 참조), 이는 이 물질이 비리온 내에 있을 가능성이 낮으며 완충액-교체와 같은 추가 처리에 의해 제거될 수 있음을 나타낸다. 실시예 21에서 입증된 5 L 생물반응기 생산 규모에서 VcEndAH6-1glc에 의한 모든 명백한 에티듐 브로마이드 염색 오염물질의 매우 효율적인 제거를 고려할 때, 아가로스 겔 분석에서 이 밴드가 가끔 나타나는 것은 일부 가변적이고 확인되지 않은 오염물질- 가능하게는 유리 세포/리보솜 RNA -로 인한 것일 수 있으며, 이는 일반적으로 다운스트림 처리된 벡터 내에서 검출되지 않는다.
헬퍼 세포 및 바이러스 벡터 생산 세포 배양물 둘 모두에서 달성된 분비된 뉴클레아제의 수준을 유닛-규정된 뉴클레아제 활성에 연결할 수 있도록, 배양 상청액을 DNAse Alert 검정에 의해 및 또한, VcEndAH6-1glc(항-HisTag)에 대한 면역블롯에 의해 뉴클레아제 활성에 대해 평가하였다. 공지된 뉴클레아제 활성의 시중의 Benzonase® 효소 스톡을 검정 내에서 표준 곡선으로서 사용하였다. 도 31은 이러한 관계를 나타내며, 본 발명이 객관적인 뉴클레아제 활성 유닛에 있어서 바람직한 분비되는 뉴클레아제 발현 범위를 설명할 수 있게 한다. 뉴클레아제 활성(도 31a) 및 면역블롯(도 31b) 데이터는 검정 유형 간에 뿐만 아니라 벡터 생산 배양물 내에 첨가된 뉴클레아제 헬퍼 세포의 비율에 대해서도 매우 관련이 있다. 중요하게는, 5 U/mL Benzonase®로 처리된 대조군 벡터 배양물이 평균 4.5 U/mL를 포함하는 것으로 계산되었기 때문에 DNAse Alert 검정은 매우 정확한 방법인 것으로 검증되었다. 데이터는, 5% 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하는 벡터 생산 배양물에 있어서 배양 배지 내에서 뉴클레아제의 활성이 mL 당 ~100 Benzonase® 유닛 당량이었음을 보여준다. 1%, 0.5% 및 0.1% 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하는 배양물의 뉴클레아제 활성은 mL 당 15.2, 8.8 및 2.1 Benzonase® 유닛 당량이었으며, 벡터 생산 배양물에 첨가된 헬퍼 세포의 비례 감소와 잘 일치한다. 이 실험에서, '공동-형질감염된' 벡터 생산 배양물은 mL 당 26.3 Benzonase® 유닛 당량을 달성하였다. 중요하게는, 0.1% 뉴클레아제 헬퍼 세포-함유 벡터 생산 배양물이 5 U/mL의 Benzonase® 또는 SAN으로 처리된 '표준' 벡터 배양물과 비교하여 '단지' mL 당 2.1 Benzonase® 유닛 당량을 달성하면서, 잔여 DNA의 제거는 적어도 이러한 표준 처리만큼 우수하였다. 이는 분비되는 뉴클레아제의 사용이 (매우 감소된 비용으로) 더 높은 뉴클레아제 활성 수준을 달성하는 관점에서 뿐만 아니라 (심지어 더 낮은 수준에서) 벡터 생산을 통한 뉴클레아제의 강장성 수준을 공급하는 것이 더욱 효과적인 잔여 DNA 제거 모드를 제공한다는 관점에서 시중의 뉴클레아제의 사용보다 우위를 차지함을 나타낸다. 벡터 생산 배양물 내에서 측정된 뉴클레아제 활성을 이용하여 헬퍼 배양물 내에서 분비된 뉴클레아제 활성의 양을 역-계산하는 것이 가능하다; 이는 mL 당 ~2000 Benzonase® 유닛 당량이었다.
실시예 21: 다운스트림 공정에서 추가 뉴클레아제 처리의 사용을 무효화하는 수준으로 무혈청 현탁 생물반응기로 잔여 DNA를 분해하는데 있어서 VcEndAH6-1glc의 용도
실시예 10 및 11은 중규모 내지 대규모 현탁 생물반응기에서 렌티바이러스 벡터 생산 배양물에 분비된 뉴클레아제의 적용이 잔여 DNA의 제거를 돕는다는 것을 보여준다. 5 L 규모에서 VsEndAH6 사용은 이러한 특정 뉴클레아제가 더 낮은 pH에서 배양물 중 활성이 제한될 수 있음을 시사하는데, 왜냐하면 다운스트림 공정 물질에서 잔여 DNA의 최대 제거율은 중공 섬유 카트리지에 추가된 시중의 뉴클레아제의 사용에 의해 여전히 지원되었기 때문이다. 이 pH 감도는 나중에 확인되었으며, 'pH-내성' VcEndAH6-1glc 뉴클레아제의 개발로 이어졌다(실시예 15-17). 업스트림 단계에 적용된 VcEndAH6-1glc 뉴클레아제가 동일한 다운스트림 공정 동안 (정용-/한외-여과 동안) 시중의 뉴클레아제 처리의 철회를 가능하게 할 수 있는지를 평가하기 위해, GFP를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터는 하기 방식으로 생산하였다. 현탁 무혈청 적합화된 HEK293T 세포를 pBluescript(대조군; 표준 Benzonase® 처리) 또는 pSV40-VcEndAH6-1glc와 함께 HIV-1 기반 렌티바이러스 벡터 구성요소(GFP 발현 게놈)로 형질감염시킨 2개의 5 L 생물반응기에 5% 총 플라스미드 투입으로 시딩하였다. 형질감염 후 20시간째에 소듐 부티레이트를 10 mM의 최종 농도에서 모든 생물반응기에 첨가하였다. 벡터 수확 1시간 전에 '인 바이오(In Bio)' 샘플을 취하고(세포 제거 및 상청액 여과), 그 후 대조군 생물반응기에 2 mM MgCl2와 함께 최종 농도 5 U/ml의 Benzonase®를 접종하였다. PSV40-VcEndAH6-1glc 공동-형질감염된 생물반응기에는 단지 2 mM MgCl2만 공급하였다. 두 생물반응기 모두는 수확 전 표준 성장 조건하에 1시간 동안 인큐베이션하였으며, 여기서 5 L의 배양물을 정화시키고(10 μm > 0.45 μm) 샘플을 취하였다(CLH). 그 후 약 2.5 L의 수확물을 다운스트림 프로세싱으로 처리하였다. 물질을 이온-교환(IEX) 크로마토그래피로 처리하여, ~215 mL IEX 용출물을 생성시키고, 정용-/한외-여과에 의한 추가 처리 전에, 중공 섬유 카트리지를 사용하여 이 부피를 65-70 mL로 감소시켰다. 첫 번째 단계는 샘플을 취한 염 'HFF-전'(Benzonase® 처리 전)으로부터 완충액 교환을 허용하며, 그 후, 400 U/ml Benzonase®를 표준('+Benzonase®') 처리된 벡터 및 VcEndAH6-1lgc 처리된 벡터 둘 모두에 첨가하였다; 이는 분비된-뉴클레아제 벡터 물질에 필요한 경우 on-HFF 뉴클레아제 단계의 임의의 추가 이점을 평가하기 위해 수행되었다. 마지막으로, 완충액 교환을 발생시켜 Benzonase®('HFF 후')를 제거하였다. 도 32a는 생산 실행 동안 두 생물반응기의 pH 프로파일을 보여주며, 이는 목표 pH 6.7이 달성되었음을 입증한다. 정화된 수확 벡터(CLH) 샘플은 FACS 검정에 의해 적정하고, 표준 및 VcEndAH6-1glc 벡터에 대해 각각 1.7x107 및 1.0x107 TU/mL의 역가를 나타내었다. 전체 생산 공정의 샘플을 3K 컷-오프 원심분리 장치에서의 원심분리에 의해 농축시킨 후, 샘플을 잔여 DNA 분석을 위해 아가로스 겔(에티듐 브로마이드) 상에 로딩하였다(도 32b). 잔여 DNA 분석은 VcEndAH6-1glc를 사용하여 잔여 DNA의 탁월한 제거를 입증하며, 업스트림 생산에서 이러한 뉴클레아제의 사용은 본질적으로 정용-/한외-여과 단계에서 대부분의 오염 잔여 DNA를 제거할 수 있음을 입증한다 - 시중의 뉴클레아제를 추가로 사용할 필요가 없다. 확장하기 위해, IEX 칼럼으로부터 VcEndAH6-1glc 벡터 용출물 내에 검출가능한 잔여 DNA가 있지만, 이는 정확하게는 완충액 교환 동안 벡터 물질로부터 추출될 수 있는 형태로 존재한다. 정용-/한외-여과 중공 섬유 기공 크기가 0.2 μm라는 점을 감안할 때, 이는 벡터와 공동-용출된 잔여 DNA가 벡터 입자보다 작다는 것을 (또는 더 작은 단백질 복합물 내에 존재하였음을) 나타내었다. 또한, 정용-/한외-여과 단계시 또는 그 전에 분명하게 손실되는 비처리된 샘플 중의 '피드-특이적' 밴드(실시예 20 참조)의 존재를 주지한다. 잔여 DNA는 'HFF 후' 대조군(2x 처리된 Benzonase®) 벡터 물질 내에서 여전히 관찰될 수 있다. 이것은 처음으로 시중의 재조합 뉴클레아제의 사용에 의존하지 않는 뉴클레아제 접근법을 이용하여 렌티바이러스 벡터 생산으로부터 잔여 DNA를 제거하는 능력을 나타낸다.
실시예 22: 세포 분획에서 VcEndAH6-1glc-KDEL을 풍부하게하기 위한 KDEL 보유 신호의 용도
실시예 18은 AAV 벡터의 업스트림 생산 동안 잔여 DNA를 제거하기 위한 분비되고 ER-보유된 뉴클레아제의 용도를 입증하였다. 도 33은 pSV40-VcEndAH6-1glc 또는 pSV40-VcEndAH6-1glc-KDEL로의 무혈청 현탁 HEK293T 세포의 형질감염에 의해 발생한 수확 세포 용해물의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 분석은 뉴클레아제 단백질의 C-말단에 첨부된 ER-보유 신호를 사용하여 뉴클레아제가 세포내에서 보유/풍부화되도록 지시될 수 있음을 나타내는 이전 작업을 뒷받침한다.
재료 및 방법
뉴클레아제 발현 작제물
뉴클레아제 오픈-리딩 프레임은 GeneArt. smNucA (NCBI 참조 서열: WP_047571650.1), VsEndA (GenBank: CAQ78235.1), VcEndA (NCBI 참조 서열: WP_000972597.1), BacNucB (NCBI 참조 서열: WP_003182220.1)에 의한 호모 사피엔스에서의 높은 발현을 위해 최적화된 코돈 및 서열이었다. 모든 뉴클레아제는 SV40 프로모터 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 사용하는 유전자 발현 카세트를 설계하여 평가되었다(도 3a-c). 일반적으로, 전체 발현 카세트를 프로모터-5'utr-뉴클레아제-3'utr-폴리A를 인코딩하는 하나의 단편으로 합성하고, GeneArt pMK 백본 내에 수용시켰다. 3'utr 영역은 6xHis-태그에 융합된 대체 C-말단을 수용하도록 설계되어, 각 뉴클레아제의 His-태깅된 변이체는 간단한 제한 효소 분해 및 플라스미드의 재-결찰에 의해 생성될 수 있다. ER 신호 펩티드 변이체 및 NxS/T 세쿠온 결실/삽입 변이체의 작제는 일반적으로 상기 설명한 기존 뉴클레아제 플라스미드에 재-유래된 합성 단편(GeneArt)을 클로닝함으로써 수행되었다. 유도성 뉴클레아제 발현 카세트(도 3d)는 표준 클로닝 기술을 사용하여 HindIII/NotI를 통해 pf pcDNA5/TO의 재-유래된 버전 내로 뉴클레아제 ORF를 삽입함으로써 클로닝하였다. 광범위하게 효소(pDNA 마이크로그램 당 5-10 유닛)를 사용하여 37℃에서 1-2시간 동안 분해를 수행한 다음 백본 단편(Roche)에 대한 '신속한' 탈인산화 반응을 10분간 수행하고, 이어서 100V에서 1시간 동안 1% 아가로스 겔 상에서 진행시켰다. 관련 밴드는 QIAQuick 겔 추출 키트(QIAGEN)를 사용하여 추출하였다. 결찰은 권장 조건에서 20 μL 부피의 '신속(Rapid)' DNA 결찰 키트(Roche)를 사용하여 1:3의 백본:삽입 비율로 수행하였다. 약 25-50 μL Turbo(NEB) 또는 Stbl2(Thermo) 적격 세포를 2-3 μL의 결찰 반응으로 형질전환시켰다. 박테리아는 LBKAN 아가로스 플레이트 및 미니프렙용 LBKAN 배지에서 성장시켰다. 제한 효소 분석 및 서열 확인 후 플라스미드 DNA를 Plus Mega 키트(QIAGEN)에서 제조하였다.
부착 세포 배양, 형질감염 및 렌티바이러스 벡터 생산
HEK293T 세포는 벡터 생산 및 적정에 사용하였다. 세포는 완전 배지(10% 열-불활성화 (FBS)(Gibco), 2mM L-글루타민(Sigma) 및 1% 비-필수 아미노산(NEAA)(Sigma)이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)(Sigma))에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다.
부착 모드에서 HIV-1 벡터의 표준 규모 생산은 다음 조건 하에 10cm 디쉬에서 수행하였다(다른 형식으로 수행되는 경우 모든 조건은 면적에 따라 등급화하였다): HEK293T 세포는 완전 배지에 ml 당 3.5 x 105세포로 시딩하고, 대략 24시간 후 세포를 10 cm 플레이트 당 하기 질량비의 플라스미드를 사용하여 형질감염시켰다: 4.5 μg 게놈, 1.5 μg Gag-Pol, 1.1μg Rev, 0.7 μg VSV-G(즉, 총 7.8 μg/플레이트). 적절한 경우, 뉴클레아제 발현 플라스미드를 총 DNA의 표시된 % 투입으로 (전형적으로 0.001 내지 10% 범위) 이러한 벡터 혼합물 내에 첨가하였다.
형질감염은 제조업체의 프로토콜에 따라 Opti-MEM에서 리포펙타민 2000CD와 DNA를 혼합함으로써 매개되었다. 소듐 부티레이트(Sigma)를 ~18hr 후에 5-6h 동안 10 mM 최종 농도로 첨가한 후, 10 ml 신선한 무혈청 배지로 형질감염 배지를 대체하였다. 전형적으로, 벡터 상청액을 20-24h 후에 수확한 후, 여과하고(0.22 μm), -20/-80℃에서 동결시켰다. 뉴클레아제 처리에 대한 양성 대조군으로서, 전형적으로 Benzonase®를 여과 전 1시간 동안 5 U/mL로 수확물에 첨가하였다.
HEK293T.GFP.PrCL(안정한 세포주)은 확립된 HEK293T.tetR14 부착 세포주를 사용하여 자체 개발하였다. 모든 패키징 구성요소와 HIV-GFP 게놈을 선택 마커와 함께 HEK293T.TetR 세포 내로 안정적으로 미리 형질감염시켰다. Rev 및 VSV-G는 제오신(Zeo)의 선택 하에 두고, Gag-Pol은 블라스티시딘(Bsr)의 선택 하에 두고, GFP 게놈은 하이그로마이신(Hyg)의 선택 하에 두었다. HIV-1 기반 벡터 생산자 세포주 내에서 분비된 뉴클레아제 접근법을 평가하기 위해, 뉴클레아제-발현 플라스미드를 표시된 총 투입 %에서 배양물 내로 형질감염시켰다(여기서 pBlueScript는 총 7.8 μg/10cm 플레이트 또는 동등한 규모의 양/영역에 스터프(stuff)로서 첨가됨). 벡터 생산을 유도하기 위해, 소듐 부티레이트 유도 단계로부터 독시사이클린을 1 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다.
현탁 세포 배양, 형질감염 및 렌티바이러스 벡터 생산
HEK293T.TetR14S(안정적으로 통합된 코돈-최적화된 tetR) 및 HEK293T.1-65s 현탁액 세포는 진탕 인큐베이터(190 RPM으로 설정된 25 mm 오르비트)에서 37℃ 및 5% CO2에서 프리스타일 + 0.1% CLC(Gibco)에서 성장시켰다. 현탁액을 사용하는 모든 벡터 생산은 작업 부피가 12 mL인 AMBR-15 생물반응기에서 또는 작업 부피가 25 ml인 125 ml 진탕 플라스크에서 수행하였다. HEK293T 세포는 무혈청 배지에서 ml 당 8 x 105 세포로 접종하고 37℃ 및 5% CO2에서 벡터 생산 전반에 걸쳐 진탕시키면서 인큐베이션하였다. AMBR-15 생물반응기 생산을 위해 배양물을 pH 7.2로 설정하였다. 시딩 후 약 24시간째에 세포를 게놈(GFP), gagpol, rev 및 VSVG를 인코딩하는 벡터 구성요소 플라스미드의 혼합물로 형질감염시켰다. 적절한 경우, 뉴클레아제 발현 플라스미드를 총 DNA의 표시된 % 투입으로 (전형적으로 0.1 내지 10% 범위) 이러한 벡터 혼합물 내에 첨가하였다.
형질감염은 제조업체의 프로토콜(Life Technologies)에 따라 Opti-MEM에서 리포펙타민 2000CD와 DNA를 혼합함으로써 매개되었다. AMBR-15 생물반응기 생산을 위해, 배양물은 형질감염 직후 pH6.6 또는 pH7.2로 설정하였다. 소듐 부티레이트(Sigma)를 ~18시간 후에 10 mM 최종 농도로 첨가하였다. 전형적으로, 벡터 상처액을 20-24h 후에 수확한 후, 여과하고(0.22 μm), -20/-80℃에서 동결하였다. 뉴클레아제 처리를 위한 양성 대조군으로서, 전형적으로 Benzonase® 또는 SAN을 여과 전 1시간 동안 5 U/mL로 수확물에 첨가하였다. AMBR-15 생물반응기 생산을 위해, pH 및 세포 생존율을 공정 전반에 걸쳐 모니터링하였다.
0.5 또는 5 L 교반-탱크 생물반응기 및 다운스트림 프로세싱에서 렌티바이러스 벡터의 생산
현탁액 적합화된 HEK293T 세포주, 클론 1.65s 및 보충된 무혈청 배지를 생물반응기 연구에 사용하였다. MCB에서 배양된 세포를 Erlenmeyer 플라스크에서 소생하고 확대시키고, 가습 분위기 하에 37℃의 공기 인큐베이터에서 사전-평형화된 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 세포는 오르비탈 진탕기 플랫폼에서 현탁액 중에 유지시켰다.
생물반응기는 용존 산소와 pH에 걸쳐 적극적으로 관리하였다; 대사산물 및 부산물 수준 또한 모니터링하였다. 세포 생존율을 모니터링하고, 적절한 경우 소포제를 사용하였다. 생물반응기 배양물을 4개의 플라스미드로 공동-형질감염시켰다; 형질감염 시약을 사용하여 pHIV-CMV-GFP(게놈), pSynGPK(gagpol), pOB-Rev 및 pOB-VSVG. 표시된 경우, p뉴클레아제를 일반적으로 전체의 5%로 pDNA 혼합물에 첨가하였다. 생물응기 배양물은 10 mM 소듐 부티레이트로 형질감염 후 20시간째에 유도하였다. 벡터 수확물은 유도 후 24시간째에 취하였으며, 수확 전 1시간 동안 5 U/mL 또는 25 U/mL 시중 뉴클레아제(Benzonase® 또는 SAN-HQ)로의 선택적 처리를 나타내었다.
벡터 상청액을 사전-정화시키고(≥ 10 μm), 그 후 0.22-0.45 μm 여과에 의해 추가로 정화하였다. 적어도 1 L의 정화된 벡터 수확물을 일반적으로 저농도 염 세척 및 사전-용리 세척 완충액을 포함하는 Sarto-Q 카트리지를 사용하여 이온-교환 크로마토그래피로 처리한 후, > 1M NaCl-함유 완충액에서 용출시키고 용출물을 즉시 희석하여 벡터 비리온 활성을 보존하였다. 그 후, 용출물은 중공 섬유 한외/정용여과로 신속하게 처리하여 저염 조건으로의 첫 번째 완충액을 교체한 후, 400 U/mL의 시중의 뉴클레아제 및 2 mM 염화마그네슘을 두 번째 뉴클레아제 처리 폴리싱 단계로서 첨가하였다. 마지막으로 최종 완충액 교환을 수행하여 시중의 뉴클레아제를 제거하였다.
최대 뉴클레아제 발현을 달성하는 일시적 형질감염에 의한 뉴클레아제 헬퍼 세포의 생성
현탁액 적합화된 무혈청 HEK293T 세포를 주요 바이러스 벡터 생산 배양물과 동시에 mL 당 8x105 세포로 시딩하고, 5% CO2 및 37℃에서 프리스타일 + 0.1% CLC(Gibco)에서 밤새 성장시켰다. 다음날 세포는 Lipofectamine 2000CD를 사용하여 배양물 mL 당 > 750ng pCMV-VcEndAH6-1glc로 형질감염시켰다(벡터 생산 배양물은 벡터 구성요소로 형질감염시켰다). 소듐 부티레이트 유도(최종 10 mM) 시점에서 뉴클레아제 헬퍼 세포를 표적 세포 투입 수준으로 접종하여 주요 벡터 생산 용기에서 총 세포 수의 명시된 백분율을 달성하였다. 그 후, 벡터 생산은 상기 설명된 바와 같이 계속되었다.
렌티바이러스 벡터 적정 검정
렌티바이러스 벡터 적정을 위해, HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 1.2 x 104 세포/웰로 시딩하였다. GFP-인코딩 바이러스 벡터를 사용하여 8 mg/ml 폴리브렌 및 1 x 페니실린 스트렙토마이신을 포함하는 완전 배지에서 약 5-6시간 동안 세포를 형질도입 한 후 새로운 배지를 추가하였다. 형질도입된 세포는 5% CO2 및 37℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. 그 후, FACSVerse(BD Biosciences)에 의한 흐름세포측정을 위해 배양물을 제조하고, GFP 발현 퍼센트를 측정하고, 2일 인큐베이션 후 예측된 세포 수를 사용하여 벡터 역가를 추정하였다.
AAV 벡터 생산
AAV 벡터 생산을 위해, HEK293T-1.65S 무혈청 현탁 적합화된 세포를 형질감염 전에 ~20시간에 8x105 세포/mL로 배양 용기에 시딩하였다. 형질감염시 자기-상보성(sc) AAV-GFP 벡터 생산은, 총 pDNA의 5% 질량에서 뉴클레아제 인코딩 플라스미드 또는 pBluescript(음성 대조군)와 함께 동일한 질량의 pscAAV-CMV-GFP(게놈), pRepCap2(어셈블리-활성화 단백질[AAP]을 포함하는 모든 필요한 바이러스 패키징 구성요소를 인코딩) 및 p헬퍼(아데노 E2A, E4 및 VA RNA 기능)로 세포를 형질감염시킴으로써 개시하였다. 형질감염은 제조업체의 프로토콜에 따라 무혈청 배지에서 리포펙타민 2000CD와 DNA를 혼합함으로써 매개시켰다(Life Technologies). 2일 후, 세포를 저속 원심분리에 의해 수확하고, 세제 세포용해 완충액의 존재하에 3회 동결-해동 사이클로 세포를 용해시켰다. 다음으로, 용해물을 무혈청 DMEM의 8개 세포 펠릿 부피에서 위아래로 피펫팅하였다. 염화마그네슘을 최종 농도 2 mM로 용해물에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. '시중의' 양성 대조군에 있어서, 염 활성 뉴클레아제(SAN-HQ; Articzymes)를 복제 음성 대조군 용해물의 0.5 mL 유효 세포 펠렛 부피당 25 U로 첨가하고, 2 mM MgCl2의 존재하에 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 음성 대조군 용해물을 뉴클레아제 없이 인큐베이션하였다. 처리된 세포 용해물을 저속으로 원심분리하여 잔해물을 제거한 다음 추가 분석 전에 -20℃≤에서 저장하기 전에 상청액을 여과하였다(0.45 μm).
AAV 벡터 적정 검정
AAV 벡터 적정을 위해, HEK293T 세포를 96-웰 플레이트에 1.2 x 104 세포/웰로 시딩하였다. GFP-인코딩 바이러스 벡터를 사용하여 1 x 페니실린 스트렙토마이신을 함유하는 무혈청 배지에서 세포를 약 5시간 동안 형질도입하고, 그 후 신선한 혈청-함유 배지를 첨가하였다. 형질도입된 세포는 5% CO2 및 37℃에서 3일 동안 인큐베이션하였다. 그 후 Attune NxT(Thermofisher)에 의해 흐름세포측정을 위해 배양물을 제조하였다; GFP 발현 퍼센트를 측정하고 벡터 역가를 세포 수 및 벡터 희석을 사용하여 추정하였다.
PicoGreen® 검정에 의한 잔여 DNA 검출
Quant-iT ™ PicoGreen® dsDNA 검정 키트(Life Technologies)를 사용하여 수확한 벡터 물질 중 잔여 DNA를 검정하였다. Lambda 스톡 DNA를 Tris 및 EDTA (TE) 완충액으로 연속 희석하여 DNA 표준을 제조하였다. 또한, TE 완충액을 사용하여 수확된 벡터 샘플을 1:10으로 희석한 후, PicoGreen 검정 시약(제조업체의 프로토콜에 따라 준비됨)을 추가하고 샘플을 어둠 속에서 2~5분 동안 인큐베이션하였다. 샘플 중 PicoGreen 시약의 형광은 EM 마이크로플레이트 리더(Microplate Reader)(Gemini)를 사용하여 탑 리드(top read)로 측정하였다.
정량적 PCR 검정에 의한 잔여 DNA 검출
QIAamp DNA 미니 키트(Mini Kit)(QIAGEN)를 사용하여 벡터 샘플로부터 DNA를 추출하였다. 추출 공정 동안, 뉴클레아제 비함유 물(NFW)(Gibco)을 포함하는 모의 샘플을 공정 제어(IPC)에서와 같이 사용하였다.
추출된 DNA를 18S 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR)(qPCR)으로 처리하였다; 반응은 세포 유래된 18S DNA의 짧은 단편을 증폭시켰다. 혼합물은 SYBR® Green PCR Mastermix(Life Technologies), 18S 프라이머(10mM Tris-HCl에서 준비됨, pH7)(Sigma) 및 NFW를 포함하였다.
전방 프라이머: 5' ACCGCAGCTAGGAATAATGG 3'
역방향 프라이머: 5' CTCAGTTCCGAAAACCAACA 3'
DNA 표준을 생성하기 위해, 선형화된 18S 플라스미드를 1 x 106 복사체/5 μl로부터 1 x 102 복사체/5 μl로 연속 희석하였다. 샘플을 1:5로 희석한 후, 반응 혼합물을 첨가하였다. 반응은 QuantStudio™ 6 Flex System(Life Technologies)을 사용하여 표준 화학 qPCR 조건 하에서 수행하였다. qPCR 실행을 설정하고, QuantStudio™ 6 Flex System Software(Life Technologies)를 사용하여 분석하였다.
제어 설정은 PRC 반응 혼합물 오염을 제어하기 위한 주형 비함유 대조군(NTC), 추출 공정 동안 DNA 오염을 제어하기 위한 IPC 샘플을 포함하며, 마지막으로 PCR 억제를 모니터링하기 위해, 첨가된 PCR 억제 대조군(SPIC)은 18S 표준 DNA의 1 x 104 복사체를 IPC 샘플에 첨가함으로써 포함되었다.
추출된 DNA를 KanR 정량적 중합효소 연쇄 반응(PCR)(qPCR)으로 처리하였다; 반응은 플라스미드 유래된 KanR DNA의 짧은 단편을 증폭시켰다. 혼합물은 TaqMan® Universal PCR Master Mix(Life Technologies), KanR 프라이머 및 프로브 세트(10mM Tris-HCl, pH7로 준비됨)(Sigma) 및 NFW를 포함하였다.
전방향 프라이머: 5' AGATGGATTGCACGCAGGTT 3'
역방향 프라이머: 5' TGCCCAGTCATAGCCGAATAG 3'
프로브: 5' (FAM) CTCCACCCAAGCGGCCGGA (TAMRA) 3'
DNA 표준을 생성하기 위해, 선형화된 KanR+ 플라스미드를 1 x 106 복사체/5μl로부터 1 x 102 복사체/5 μl로 연속 희석하였다. 샘플을 1:5로 희석한 후, 반응 혼합물을 첨가하였다. 반응은 QuantStudio™ 6 Flex System(Life Technologies)을 사용하여 표준 화학 qPCR 조건 하에서 수행하였다. qPCR 실행을 설정하고, QuantStudio™ 6 Flex System Software(Life Technologies)를 사용하여 분석하였다.
제어 설정은 PRC 반응 혼합물 오염을 제어하기 위한 주형 비함유 대조군(NTC), 추출 공정 동안 DNA 오염을 제어하기 위한 IPC 샘플을 포함하며, 마지막으로 PCR 억제를 모니터링하기 위해, 첨가된 PCR 억제 대조군(SPIC)이 KanR 표준 DNA의 1 x 104 복사체를 IPC 샘플내에 첨가함으로써 포함시켰다.
겔 전기영동에 의한 잔여 DNA 검출의 시각화
LV 미정제 벡터 상청액을 여과-정화하고, 선택적으로 37℃에서 1시간 동안 프로테이나제-K로 처리하였다. 정화된 샘플을 Amicon Ultra-15 3K 컷-오프 필터 유닛에서 원심분리하여 DNA를 최대 150배까지 농축시켰다. 샘플을 2% 아가로스/TBE 겔(에티듐 브로마이드에 의해 시각화된 DNA)에서 표준 전기영동으로 처리하고, 1kbp/100bp 래더를 동시 진행시켰다.
DNAse Alert TM 검정에 의한 뉴클레아제 활성의 정량화(본원에서 "검정법 1"으로서 언급됨)
DNAse AlertTM 검정(IDT)은 바이러스 벡터 배양 배지 내에서 뉴클레아제 활성을 정량화하는데 사용될 수 있으며 사용되었다. 검정의 기초는 뉴클레아제에 의해 분해될 때에만 형광 신호를 방출하는 형광 표지되고 켄칭된 뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것이다. 키트는 5 U/mL으로부터 0.08 U/mL로의 연속 희석된 Benzonase®로 구성된 표준 곡선을 사용하여 제조업체 권장 사항에 따라 사용하였다. 분비된 뉴클레아제를 포함하는 바이러스 벡터 배양 상청액은 형광 활성이 표준 곡선의 상한 및 하한 내에 속하도록 연속 희석되어야 한다. Benzonase®(이 작업 당시)의 유닛 정의는 다음과 같다: “한 유닛은 초음파 처리된 연어 정자 DNA를 37℃에서 pH 8.0에서 30분 안에 ΔA260 1.0에 해당하는 산-용해성 올리고뉴클레오티드로 분해할 것이다(반응 부피 2.625 ml)". 이러한 유닛 정의가 앞으로 변경될 것으로 예상되지 않으며, 따라서 이러한 표준 유닛 활성에 대해 QC 체크된 시중에서 입수가능한 Benzonase®를 DNAse Alert 검정에 사용하여 본 발명에서 달성된 분비된 뉴클레아제 활성을 확인할 수 있다. 어떤 이유로든 Benzonase®의 공급업체가 유닛 정의를 변경하는 경우, '이전' 및 '새' 유닛 정의 간의 관계가 알려질 것으로 예상되며, 따라서 본 발명에서 보고되고 청구된 분비 뉴클레아제 활성에도 적용된다.
상기 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 수정 및 변형은 본 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정 바람직한 구현예와 관련하여 기술되었지만, 청구된 본 발명은 그러한 특정 구현예에 부당하게 제한되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxford Biomedica (UK) Ltd <120> Viral Vector Production System <130> P114763PCT <150> US 62/644,373 <151> 2018-03-16 <150> GB 1814590.4 <151> 2018-09-07 <150> US 62/795,222 <151> 2019-01-22 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 231 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 1 Met Met Ile Phe Arg Phe Val Thr Thr Leu Ala Ala Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala 20 25 30 Val Lys Ile Tyr Arg Asp His Pro Val Ser Phe Tyr Cys Gly Cys Glu 35 40 45 Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly 50 55 60 Tyr Gln Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu 65 70 75 80 His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln 85 90 95 Gln Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln 100 105 110 Met Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Thr Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn 115 120 125 Gly Asn Arg Ser Asn Phe Ser Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ile Asp Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Glu Arg Thr 145 150 155 160 Ala Met Pro Pro Glu Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu 165 170 175 Tyr Met Ser Glu Gln Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Val Arg Glu Gln Cys Pro Asn 225 230 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Vibrio salmonicida <400> 2 Met Lys Leu Ile Arg Leu Val Ile Ser Leu Ile Ala Val Ser Phe Thr 1 5 10 15 Val Asn Val Met Ala Ala Pro Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Glu Ala Val Lys Ile Tyr Leu Asp Tyr Pro Thr Ser Phe Tyr Cys Gly 35 40 45 Cys Asp Ile Thr Trp Lys Asn Lys Lys Lys Gly Ile Pro Glu Leu Glu 50 55 60 Ser Cys Gly Tyr Gln Val Arg Lys Gln Glu Lys Arg Ala Ser Arg Ile 65 70 75 80 Glu Trp Glu His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Arg Gln 85 90 95 Cys Trp Gln Lys Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Asn Asp Lys Gln 100 105 110 Phe Lys Ser Met Glu Ala 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Asp Pro Ala Leu Asn Pro Ala Asp Thr Leu Ala Pro Ala Asp 85 90 95 Tyr Thr Gly Ala Asn Ala Ala Leu Lys Val Asp Arg Gly His Gln Ala 100 105 110 Pro Leu Ala Ser Leu Ala Gly Val Ser Asp Trp Glu Ser Leu Asn Tyr 115 120 125 Leu Ser Asn Ile Thr Pro Gln Lys Ser Asp Leu Asn Gln Gly Ala Trp 130 135 140 Ala Arg Leu Glu Asp Gln Glu Arg Lys Leu Ile Asp Arg Ala Asp Ile 145 150 155 160 Ser Ser Val Tyr Thr Val Thr Gly Pro Leu Tyr Glu Arg Asp Met Gly 165 170 175 Lys Leu Pro Gly Thr Gln Lys Ala His Thr Ile Pro Ser Ala Tyr Trp 180 185 190 Lys Val Ile Phe Ile Asn Asn Ser Pro Ala Val Asn His Tyr Ala Ala 195 200 205 Phe Leu Phe Asp Gln Asn Thr Pro Lys Gly Ala Asp Phe Cys Gln Phe 210 215 220 Arg Val Thr Val Asp Glu Ile Glu Lys Arg Thr Gly Leu Ile Ile Trp 225 230 235 240 Ala Gly Leu Pro Asp Asp Val Gln Ala Ser Leu Lys Ser Lys Pro Gly 245 250 255 Val Leu Pro Glu Leu Met Gly Cys Lys Asn 260 265 <210> 4 <211> 142 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 4 Met Ile Lys Lys Trp Ala Val His Leu Leu Phe Ser Ala 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Leu Ala Ala Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala 20 25 30 Val Lys Ile Tyr Arg Asp His Pro Val Ser Phe Tyr Cys Gly Cys Glu 35 40 45 Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly 50 55 60 Tyr Gln Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu 65 70 75 80 His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln 85 90 95 Gln Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln 100 105 110 Met Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Thr Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn 115 120 125 Gly Asp Arg Ser Asn Phe Ser Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ile Asp Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Glu Arg Thr 145 150 155 160 Ala Met Pro Pro Glu Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu 165 170 175 Tyr Met Ser Glu Gln Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn 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Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Val Arg Glu Gln Cys Pro Asn 225 230 <210> 9 <211> 231 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 9 Met Met Ile Phe Arg Phe Val Thr Thr Leu Ala Ala Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala 20 25 30 Val Lys Ile Tyr Arg Asp His Pro Val Ser Phe Tyr Cys Gly Cys Glu 35 40 45 Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly 50 55 60 Tyr Gln Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu 65 70 75 80 His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln 85 90 95 Gln Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln 100 105 110 Met Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Val Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn 115 120 125 Gly Asn Arg Ser Asn Phe Arg Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ile Asp Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Glu Arg Thr 145 150 155 160 Ala Met Pro Pro Glu Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu 165 170 175 Tyr Met Ser Glu Gln Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Val Arg Glu Gln Cys Pro Asn 225 230 <210> 10 <211> 231 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 10 Met Met Ile Phe Arg Phe Val Thr Thr Leu Ala Ala Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala 20 25 30 Val Lys Ile Tyr Arg Asp His Pro Val Ser Phe Tyr Cys Gly Cys Glu 35 40 45 Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly 50 55 60 Tyr Gln Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu 65 70 75 80 His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln 85 90 95 Gln Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln 100 105 110 Met Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Val Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn 115 120 125 Gly Asp Arg Ser Asn Phe Ser Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ile Asp Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Glu Arg Thr 145 150 155 160 Ala Met Pro Pro Glu Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu 165 170 175 Tyr Met Ser Glu Gln Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Val Arg Glu Gln Cys Pro Asn 225 230 <210> 11 <211> 231 <212> PRT <213> Vibrio cholerae <400> 11 Met Met Ile Phe Arg Phe Val Thr Thr Leu Ala Ala Ser Leu Pro Leu 1 5 10 15 Leu Thr Phe Ala Ala Pro Ile Ser Phe Ser His Ala Lys Asn Glu Ala 20 25 30 Val Lys Ile Tyr Arg Asp His Pro Val Ser Phe Tyr Cys Gly Cys Glu 35 40 45 Ile Arg Trp Gln Gly Lys Lys Gly Ile Pro Asp Leu Glu Ser Cys Gly 50 55 60 Tyr Gln Val Arg Lys Asn Glu Asn Arg Ala Ser Arg Ile Glu Trp Glu 65 70 75 80 His Val Val Pro Ala Trp Gln Phe Gly His Gln Leu Gln Cys Trp Gln 85 90 95 Gln Gly Gly Arg Lys Asn Cys Thr Arg Thr Ser Pro Glu Phe Asn Gln 100 105 110 Met Glu Ala Asp Leu His Asn Leu Val Pro Ala Ile Gly Glu Val Asn 115 120 125 Gly Asp Arg Ser Asn Phe Arg Phe Ser Gln Trp Asn Gly Ile Asp Gly 130 135 140 Val Thr Tyr Gly Gln Cys Glu Met Gln Val Asn Phe Lys Glu Arg Thr 145 150 155 160 Ala Met Pro Pro Glu Arg Ala Arg Gly Ala Ile Ala Arg Thr Tyr Leu 165 170 175 Tyr Met Ser Glu Gln Tyr Gly Leu Arg Leu Ser Lys Ala Gln Asn Gln 180 185 190 Leu Met Gln Ala Trp Asn Asn Gln Tyr Pro Val Ser Glu Trp Glu Cys 195 200 205 Val Arg Asp Gln Lys Ile Glu Lys Val Gln Gly Asn Ser Asn Arg Phe 210 215 220 Val Arg Glu Gln Cys Pro Asn 225 230 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> signal peptide <400> 12 Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Pro Met Val Trp Ala 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys 20 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 16 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser 20 <210> 17 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Vesicular stomatitis virus <400> 18 Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys 1 5 10 15 <210> 19 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> retention signal <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Lys, Arg, His, Gln, Ser, Ala <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa is Asp, Glu, Asn or Gln <400> 19 Xaa Xaa Glu Leu 1 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> retention signal <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 20 Lys Lys Xaa Xaa 1 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> retention signal <400> 21 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 accgcagcta ggaataatgg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ctcagttccg aaaaccaaca 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 agatggattg cacgcaggtt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tgcccagtca tagccgaata g 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 ctccacccaa gcggccgga 19

Claims (82)

1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제가 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
1) 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템으로서, 뉴클레아제가 발현되고 1)의 생산 세포와 2)의 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 바이러스 벡터 생산 시스템.
1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열로 바이러스 벡터 생산 세포를 형질감염시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 바이러스 벡터 구성요소 및 뉴클레아제가 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제가 헬퍼 세포에서 발현되고 생산 세포와 헬퍼 세포의 공동-배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
1) 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 2) 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포로부터의 액체 피드(feed)와 접촉시키는 것을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 뉴클레아제가 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법으로서, 개선된 방법은 핵산 서열을 바이러스 벡터 생산 세포 내에 도입시키는 것을 포함하며, 핵산 서열은 1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하며, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
바이러스 벡터를 생산하는 개선된 방법으로서, 개선된 방법은 바이러스 벡터 구성요소를 발현하는 바이러스 벡터 생산 세포를 뉴클레아제를 발현하는 뉴클레아제 헬퍼 세포와 공동-배양물에서 접촉시키는 것을 포함하며, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물이 6.5 내지 7.2의 pH 범위에서 유지되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포외 뉴클레아제가 smNucA, VsEndA, VcEndA 및 BacNucB로 구성된 군으로부터 선택되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 세포외 뉴클레아제인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 당-비-특이적 뉴클레아제인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 3의 세르라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 뉴클레아제 A 또는 SEQ ID NO:3에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 1의 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae) 엔도뉴클레아제 I 또는 SEQ ID NO: 1에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제13항에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 5의 VcEndA-12glc, SEQ ID NO: 6의 VcEndA-123glc, SEQ ID NO: 7의 VcEndA-124glc, SEQ ID NO: 8의 VcEndA-134glc, SEQ ID NO: 9의 VcEndA-13glc, SEQ ID NO: 10의 VcEndA-14glc 및 SEQ ID NO: 11의 VcEndA-1glc로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레아제 변이체인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제13항에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 11의 뉴클레아제 변이체 VcEndA-1glc인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 염-활성 뉴클레아제를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제16항에 있어서, 염-활성 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 2의 비브리오 살모니시다(Vibrio salmonicida) 엔도뉴클레아제 I 또는 SEQ ID NO: 2에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 SEQ ID NO: 4의 BacNucB 또는 SEQ ID NO: 4에 대해 적어도 90% 아미노산 동일성을 갖는 이의 변이체를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제가 천연 또는 비-천연 N-말단 분비 신호를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 잠재적인 스플라이스 부위 및/또는 불안정한 요소를 제거하도록 서열-최적화되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열이 생산 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 생산 시스템 및/또는 방법이 하나 이상의 추가적인 뉴클레아제를 추가로 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제22항에 있어서, 뉴클레아제가 하나 이상의 추가적인 뉴클레아제 중 적어도 하나에 융합되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물이 적어도 약 5 리터 부피의 배지를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제24항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 현탁 또는 부착 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물이 무혈청 배양물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 생산 세포가 진핵 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제27항에 있어서, 생산 세포가 포유동물 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제28항에 있어서, 생산 세포가 인간 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, 생산 세포가 HEK293 세포 또는 이의 유도체인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제30항에 있어서, HEK293 생산 세포가 HEK293T 세포인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 관심 뉴클레오티드(NOI)를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제32항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 레트로바이러스 벡터 구성요소인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제33항에 있어서, 레트로바이러스 벡터 구성요소가 렌티바이러스 벡터 구성요소인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제34항에 있어서, 바이러스 벡터 구성요소가 i) gag-pol; ii) env; iii) 선택적으로, 레트로바이러스 벡터의 RNA 게놈; 및 iv) 선택적 rev, 또는 이의 기능적 치환물을 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제35항에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 동일한 유전자좌에 위치한 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 모듈형 작제물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제35항에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 역방향 및/또는 교차 방향으로 바이러스 벡터 구성요소를 인코딩하는 모듈형 작제물인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제35항에 있어서, 핵산 서열 중 적어도 2개가 gag-pol 및/또는 env를 인코딩하는 모듈형 작제물이며, 모듈형 작제물은 적어도 하나의 조절인자 요소와 회합된, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제35항 내지 제38항 중의 어느 한 항에 있어서, env가 VSV-G env인, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 일시적 형질감염 후 뉴클레아제가 발현되고 세포로부터 분비되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포의 안정한 통합 후 뉴클레아제가 발현되고 세포로부터 분비되는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제41항에 있어서, 뉴클레아제의 발현이 유도성(inducible) 또는 조건부(conditional) 발현이며, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 유도성 또는 조건부 프로모터 또는 조절인자 요소를 포함하는, 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제가 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하고, 생산 세포가 진핵 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
제43항에 있어서, 뉴클레아제가 엔도뉴클레아제인, 세포.
제44항에 있어서, 엑소뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 세포.
제45항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 엑소뉴클레아제에 융합되는, 세포.
제43항에 있어서, 뉴클레아제가 엑소뉴클레아제인, 세포.
제48항에 있어서, 엑소뉴클레아제가 엔도뉴클레아제에 융합되는, 세포.
제43항에 있어서, 세포가 일시적 생산 세포인, 세포.
제43항에 있어서, 세포가 안정한 생산 세포인, 세포.
제50항에 있어서, 뉴클레아제 발현 및 분비가 안정한 생산 세포에서의 유도성 발현 및 분비인, 세포.
1) 바이러스 벡터 구성요소; 및 2) 뉴클레아제 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포로서, 뉴클레아제 융합 단백질은 엔도뉴클레아제 도메인에 융합된 엑소뉴클레아제 도메인을 포함하며, 뉴클레아제 융합 단백질은 바이러스 벡터 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하며, 생산 세포는 진핵 생산 세포인, 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
제52항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 VcEndA 또는 이의 변이체인, 세포.
제52항에 있어서, 엔도뉴클레아제가 SEQ ID NO: 11의 VcEndA-1glc인, 세포.
1) 바이러스 벡터 구성요소 및 2) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템을 포함하는 세포 배양 장치로서, 뉴클레아제는 생산 세포에서 발현되고 세포 배양물에서 분비되어 바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해하는, 세포 배양 장치.
제46항에 있어서, 교반-탱크 생물반응기 또는 웨이브-백 또는 iCELLis® 생물반응기인 세포 배양 장치.
바이러스 벡터 생산 동안 잔여 핵산을 분해할 수 있는 분비된 뉴클레아제의 변이체로서, 상기 변이체는 SEQ ID NO:11의 아미노산 서열을 포함하는, 변이체.
진핵 세포의 분비 경로를 통해 발현되는, 세포-보유 및/또는 세포-회합이 증가된 변형된 뉴클레아제로서, 변형된 뉴클레아제가 이의 C-말단에서 보유 신호를 포함하는, 변형된 뉴클레아제.
제58항에 있어서, 변형된 뉴클레아제가 소포체(ER) 및/또는 골지 구획에 국소화되어 상응하는 비변형된 뉴클레아제의 세포 보유와 비교하여 증가된 세포 보유를 발생시키는, 변형된 뉴클레아제.
제58항에 있어서, 변형된 뉴클레아제가 ER 보유-결함 보완 그룹의 ER 수용체 결합되는, 변형된 뉴클레아제.
제58항에 있어서, 보유 신호가 콘센서스 [KRHQSA]-[DENQ]-E-L 또는 KKXX의 C-말단에 위치하는, 변형된 뉴클레아제.
제58항에 있어서, 보유 신호가 콘센서스 KDEL의 C-말단에 위치하는, 변형된 뉴클레아제.
제58항의 변형된 뉴클레아제를 발현하는 진핵 세포.
제63항의 세포를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템.
제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는 바이러스 벡터를 생산하기 위한 생산 세포.
제43항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는 생산 세포.
제52항 내지 제54항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 바이러스 생산 세포를 포함하는 생산 세포.
제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
제43항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
제52항 내지 제54항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 생산 세포를 포함하는 세포 배양 장치.
제1항 내지 제42항 중의 어느 한 항에 있어서, 제57항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 뉴클레아제를 포함하는 바이러스 벡터 생산 시스템 또는 방법.
제1항 내지 제71항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 1 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제1항 내지 제72항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제1항 내지 제73항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 배양물 내에 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제72항 내지 제74항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 활성이 바이러스 벡터 생산 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제72항 내지 제74항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 활성이 뉴클레아제 헬퍼 세포에 의해 공급되는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 10 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 100 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
헬퍼 세포 배양물 내의 분비된 뉴클레아제 활성이 본원의 검정법 1로서 제시된 검정에 의해 결정가능한 바와 같이 mL 당 적어도 약 2000 유닛의 등가의 Benzonase® 뉴클레아제 활성인, 뉴클레아제 헬퍼 세포.
제1항 내지 제79항 중의 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 발현 카세트가 강한 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제1항 내지 제80항 중의 어느 한 항에 있어서, 소듐 부티레이트 보충시 또는 보충 후에 주요 바이러스 벡터 생산 용기에 첨가되는 뉴클레아제 헬퍼 세포를 사용하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
제1항 내지 제81항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 생산 용기 내의 뉴클레아제 발현이 추가의 뉴클레아제 처리에 대한 필요 없이 다운스트림 프로세싱(downstream processing)의 사용을 가능하게 하는, 바이러스 벡터 생산 시스템, 방법, 생산 세포, 세포 배양 장치, 분비된 뉴클레아제의 변이체, 변형된 뉴클레아제 또는 진핵 세포.
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