ES2207340T3 - Procedimiento para la recuperacion de polipeptidos heterologos a partir de celulas bacterianas. - Google Patents
Procedimiento para la recuperacion de polipeptidos heterologos a partir de celulas bacterianas.Info
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Abstract
Procedimiento para la recuperación de polipéptido heterólogo a partir de células bacterianas, que comprende: (a) cultivo de las células, que comprenden un primer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo que está unido a un primer promotor inducible, un segundo ácido nucleico que codifica la lisozima fágica, un tercer ácido nucleico que codifica una proteína que muestra actividad digestora de ADN bajo el control de una secuencia de señal para la secreción de la proteína digestora de ADN, y gen t, en el que, o bien: (i) dichos segundo y tercer ácido nucleico y dicho gen t están operativamente unidos a un segundo promotor inducible que es el mismo para los tres, y en el que los tres están unidos sobre el mismo constructo de ácido nucleico, o (ii) dichos segundo y tercer ácido nucleico están operativamente unidos a un segundo promotor inducible que es el mismo para ambos, y en el que ambos están unidos sobre el mismo constructo de ácido nucleico, y dicho gen t está operativamente unido a un tercer promotor inducible, o (iii) dichos segundo y tercer ácidos nucleicos están operativamente unidos a un promotor constitutivamente débil o a un promotor con un nivel basal reducido que no requiere de la adición de un inductor para funcionar como un promotor, y dicho gen t está operativamente unido a un segundo promotor inducible.
Description
Procedimiento para la recuperación de
polipéptidos heterólogos a partir de células bacterianas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción y recuperación de polipéptidos
heterólogos a partir de células bacterianas. Más particularmente,
la presente invención se refiere a un procedimiento por el que se
facilita o incrementa la recuperación de polipéptidos heterólogos
recombinantes solubles o agregados procedentes de citoplasma y
periplasma bacteriano.
Escherichia coli ha sido ampliamente
utilizada para la producción de proteínas heterólogas en
laboratorios e industria. E. coli generalmente no excreta
proteínas al medio extracelular aparte de colicinas y hemolisina
(Pugsley y Schwartz, Microbiology, 32:3-38
(1985)). Las proteínas heterólogas expresadas por E. coli
pueden acumularse como producto soluble o como agregados insolubles.
Ver figura 1 en el presente documento. Pueden encontrarse
intracelularmente en el citoplasma o ser secretadas al periplasma
si van precedidas por una secuencia de señal. Cómo iniciar la
recuperación de los productos depende en gran medida de cómo y dónde
se acumula el producto. Generalmente, para aislar las proteínas,
las células pueden someterse a tratamientos para extracción
periplásmica o desintegrarse para liberar productos atrapados que,
de otra manera, serían inaccesibles.
El aislamiento convencional de polipéptidos
heterólogos de bacterias Gram-negativas presenta
problemas debido a las paredes celulares fuertes y rígidas que
rodean a estas células. La pared celular bacteriana mantiene la
forma de la célula y protege el citoplasma de presiones osmóticas
que pueden causar la lisis celular; lleva a cabo estas funciones
como resultado de un esqueleto de peptidoglicano altamente
entrecruzado (también conocido como mureína) que proporciona a la
pared su rigidez característica. Un modelo reciente describe el
espacio entre las membranas citoplasmática y la externa como una
fase continua llena con un gel polisacárido del periplasma interno
que se extiende hacia un gel peptidoglicano externo altamente
entrecruzado (Hobot et al., J.Bact., 160:143 (1984)).
Este sáculo de peptidoglicano constituye una barrera para la
recuperación de cualquier polipéptido heterólogo no excretado por el
bacteria hacia el medio.
Para liberar proteínas recombinantes del
periplasma de E.coli, se han utilizado tratamientos que
implican compuestos químicos tal como cloroformo (Ames et
al., J.Bacteriol., 160:1181-1183 (1984)),
guanidina-HCl, y Triton X-100
(Naglak y Wang, Enzyme Microb.Technol.,
12:603-611 (1990)). Sin embargo, estos compuestos
químicos no son inertes y pueden tener efectos perjudiciales sobre
muchos productos de proteína recombinante o sobre procedimientos
posteriores de purificación. El tratamieto con glicina de las
células de E.coli, que causa la permeabilización de la
membrana externa, también se ha dado a conocer como forma de
liberar el contenido periplasmático (Ariga et al.,
J.Ferm.Bioeng., 68:243-246 (1989)). Estos
métodos de liberación periplasmática a pequeña escala se han
diseñado para sistemas específicos. No se traducen fácilmente ni
eficientemente y generalmente son inadecuados como métodos a gran
escala.
Los métodos más ampliamente utilizados de
liberación periplasmática de proteínas recombinantes son el choque
osmótico (Nosal y Heppel, J.Biol.Chem.,
241:3055-3062 (1966); Neu y Heppel,
J.Biol.Chem., 240:3685-3692 (1965)), el
tratamiento con clara de huevo de gallina
(HEW)-lisozima/etilendiamina ácido tetraacético
(EDTA) (Neu y Heppel, J.Biol.Chem.,
239:3893-3900 (1964); Witholt et al.,
Biochim.Biophys.Acta, 443:534-544 (1976);
Pierce et al., ICheme Research Event,
2:995-997 (1995)), y el tratamiento combinado de
lisozima-HEW/choque osmótico (French et al.,
Enzyme and Microb.Tech., 19:332-338 (1996)).
Típicamente, estos procedimientos incluyen una disrupción inicial
en medio osmóticamente estabilizante, seguido de la liberación
selectiva en medio no estabilizante. La composición de estos medios
(pH, agente protector) y los métodos disruptivos utilizados
(cloroformo, lisozima-HEW, EDTA, sonicación) varían
entre los procedimientos específicos dados a conocer. Una variación
sobre el tratamiento lisozima-HEW/EDTA que hace uso
de un detergente iónico dipolar en lugar de EDTA se discute en
Stabel et al., Veterinary Microbiol.,
38:307-314 (1994). Para una evaluación general de la
utilización de sistemas enzimáticos intracelulares de lisis para
alterar E.coli, ver Dabora y Cooney en Advances in
Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol. 43, A. Fiechter,
ed. (Springer-Verlag: Berlin, 1990), páginas
11-30.
Los métodos convencionales para la recuperación
de proteína recombinante del citoplasma, como proteína soluble o
como partículas refráctiles, implicaban la desintegración de la
célula bacteriana mediante rotura mecánica. La disrupción mecánica
típicamente implicaba la generación de cavitación local en una
suspensión líquida, agitación rápida con perlas rígidas, sonicación,
o molido de la suspensión celular (Bacterial Cell Surface
Techniques, Hancock y Poxton (John Wiley & Sons Ltd.,
1988), Capítulo 3, página 55). Estos procedimientos requieren una
inversión significativa de capital y suponen un tiempo de
procesamiento largo.
Lisozima-HEW actúa
bioquímicamente para hidrolizar el esqueleto de peptidoglicano de
la pared celular. El método fue inicialmente desarrollado por
Zinder y Arndt, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
42:586-590 (1956), quienes trataron E.coli
con albúmina de huevo (que contiene lisozima-HEW)
para producir esferas celulares redondeadas, conocidas
posteriormente como esferoplastos. Estas estructuras conservaban
algunos componentes de la pared celular pero tenían grandes áreas
en las que la membrana citoplasmática quedaba expuesta.
La patente U.S. nº 5.169.772 da a conocer un
método de purificación de heparinasa a partir de bacterias que
comprende la disrupción de la cubierta de las bacterias en un medio
osmóticamente estabilizado, por ejemplo, en solución de sacarosa al
20%, por ejemplo, EDTA, lisozima, o un compuesto orgánico,
liberando las proteínas no similares a heparinasa del espacio
periplásmico de las bacterias alteradas mediante la exposición de
éstas a un tampón de baja fuerza iónica, y liberando las proteínas
similares a heparinasa mediante la exposición de las bacterias
lavadas con tampón de baja fuerza iónica a una solución salina
tamponada.
Existen varias desventajas en la utilización de
la adición lisozima-HEW para aislar proteínas
periplasmáticas. Las células deben tratarse con EDTA, detergente, o
pH elevado, todos los cuales ayudan a debilitar las células.
Además, el método no es adecuado para la lisis de grandes cantidades
de células porque la adición de lisozima es ineficiente y existe la
dificultad de dispersar el enzima en un pellet grande de
células.
Se han utilizado muchas modificaciones diferentes
de estos métodos sobre una amplia variedad de sistemas de expresión
con diversos grados de éxito (Joseph-Liazun et
al., Gene, 86:291-295 (1990); Carter
et al., Bio/Technology, 10:163-167
(1992)). Aunque estos métodos han funcionado a escala de
laboratorio, implican demasiadas etapas para un procedimiento de
recuperación eficiente a gran escala.
Se han dado a conocer esfuerzos para inducir en
cultivos celulares recombinantes la producción de lisozima. La
patente nº EP 155.189 da a conocer un medio para inducir un cultivo
celular recombinante a producir lisozimas, que generalmente se
esperaría que serían letales para tales células huésped mediante la
destrucción o lisado de la estructura de la pared celular. Las
patentes rusas nº 2043415, nº 2071503, y nº 2071501 dan a conocer
plásmidos y las cepas correspondientes para producir proteínas
recombinantes y purificar aglomerados proteicos insolubles en agua
que implican el gen de la lisozima. Específicamente, la utilización
de un operón consistente del gen de la lisozima y un gen que
codifica proteína recombinante permite la síntesis concurrente de
la proteína recombinante y de una lisozima que rompe la membrana
polisacárida de E.coli.
La patente U.S. nº 4.595.658 da a conocer un
método para facilitar la externalización de las proteínas
transportadas al espacio periplasmático de E.coli. Este
método permite el aislamiento selectivo de proteínas localizadas en
el periplasma sin necesidad de tratamiento con lisozima, molido
mecánico, o tratamiento de choque osmótico de las células. La
patente U.S. nº 4.637.980 da a conocer la producción de un producto
bacteriano mediante la transformación de un lisógeno sensible a la
temperatura con una molécula de ADN que codifica, directa o
indirectamente, el producto, el cultivo del transformante bajo
condiciones permisivas para expresar el producto génico
intracelularmente, y la externalización del producto mediante la
elevación de la temperatura para inducir funciones codificadas en
el fago. La patente nº JP 61-257931 publicada el 15
de noviembre, 1986, da a conocer un método de recuperación de
IL-2 utilizando lisozima-HEW. Asami
et al., J.Ferment. and Bioeng.,
83:511-516 (1997) dan a conocer la disrupción
sincronizada de células E.coli mediante infección por el
fago T4, y Tanji et al., J.Ferment. and Bioeng.,
85:74-78 (1998) dan a conocer la expresión
controlada de genes de lisis codificados en el fago T4 para la
disrupción suave de las células de E.coli.
El desarrollo de un método enzimático de
liberación para recuperar proteínas periplasmáticas recombinantes
adecuadas para su utilización a gran escala se da a conocer en
French et al., Enzyme and Microbial Technology,
19:332-338 (1996). Este método implica la
resuspensión de las células en un tampón de fraccionamiento seguido
de recuperación de la fracción periplasmática, donde el choque
osmótico sigue inmediatamente al tratamiento con lisozima. También
se discuten los efectos de la sobreexpresión de la proteína
recombinante S. thermoviolaceus
\alpha-amilasa, y la fase de crecimiento del
organismo huésped tras la recuperación.
En un procedimiento a escala de 10 kilolitros
para la recuperación de polipéptido IGF-I (Hart
et al., Bio/Technology, 12:1113 (1994)), los autores
intentaron el procedimiento típico de aislamiento que implica una
etapa de rotura mecánica de las células, seguida de una etapa de
centrifugación para recuperar los sólidos. Los resultados fueron
decepcionantes debido a que casi 40% del producto total se perdió
en el sobrenadante tras tres pasadas por el homogeneizador Gaulin.
Hart et al., Bio/Technology 12:1113 (1994). Ver
figura 2 en el presente documento. No se mejoró significativamente
la recuperación de producto incluso cuando se utilizaron las
técnicas clásicas de adición de EDTA y
lisozima-HEW.
Si bien la lisozima-HEW es la
única lisozima comercial que resulta práctica para los
procedimientos a gran escala, la lisozima es expresada por
bacteriófagos al infectar las células huésped. La lisis de
E.coli, un huésped natural para los bacteriófagos, por
ejemplo los fagos T4, requiere la acción de dos productos génicos:
e y t. El gen e codifica una lisozima (llamada
lisozima-T4, por el fago T4) que ha sido
identificada como una muramidasa (Tsugita y Inouye,
J.Biol.Chem., 243:391 (1968)), mientras que el gen t parece
que es necesario para la lisis, pero no parece tener actividad de
lisozima. El gen t es necesario para detener el metabolismo celular
que ocurre durante la lisis (Mukai et al., Vir.,
33:398 (1967)) y se cree que degrada o altera la membrana
citoplasmática, permitiendo, de esta manera, que el producto del
gen e alcance el periplasma y tenga acceso a la pared celular
(Josslin, Vir., 40:719 (1970)). Los fagos son formados por
mutantes gen t, pero la lisis del huésped E.coli no ocurre
excepto por adición de cloroformo (Josslin, supra). La
actividad lisozima-T4 de tipo salvaje es la que
primero se detecta, aproximadamente ocho minutos después de la
infección de T4 a 37ºC, y aumenta durante el resto de la infección,
incluso si se reduce la inhibición de lisis. En ausencia de
adsorción secundaria, las células infectadas por mutantes de gen e
detienen la producción de progenie y su metabolismo en el tiempo
normal, pero no lisan (Molecular Genetics of Bacteriophage
T4, J.D. Karam, editor jefe (American Society for Microbiology,
Washington DC, ASM Press, 1994), página 398).
Se dio a conocer la recuperación de
IGF-I insoluble utilizando
lisozima-T4 el 28 de octubre de 1997 en la
"Separation Technology VII meeting entitled 'Separations for
Clean Production'" en Davos, Suiza, patrocinado por la
Engineering Foundation.
Leung et al.,
Abstra.Pap.Am.Chem.Soc.216th ACS National Meeting,
23-27 de agosto de 1998, página 216, describen la
utilización de lisozima para potenciar la liberación de partículas
refráctiles periplasmáticas de su asociación con fragmentos de
pared celular.
Tras la lisis celular, el ADN genómico se escapa
del citoplasma al medio y resulta en un incremento significativo en
la viscosidad del líquido que puede impedir la sedimentación de
sólidos en el campo centrífugo. En ausencia de fuerzas
friccionales, tal como las ejercidas durante la disrupción mecánica
para romper los polímeros de ADN, la tasa de sedimentación de
sólidos más lenta en el líquido viscoso resulta en una separación
pobre de sólidos y líquido durante la centrifugación. Aparte de
fuerza mecánica friccional, existen enzimas nucleolíticos que
degradan el polímero de ADN.
En E.coli, el gen endA endógeno codifica
una endonucleasa (peso molecular de la proteína madura es de,
aproximadamente, 24,5 kD) que normalmente es segregada al
periplasma y corta ADN en oligodesoxirribonucleótidos de una manera
endonucleolítica. Se ha sugerido que endA es expresado de manera
relativamente débil por E.coli (Wackernagel et al.,
Gene, 154:55-59 (1995)).
Para controlar el coste de los materiales y
minimizar el tiempo de procesamiento, existe una necesidad
continuada de incrementar la recuperación total de polipéptido
heterólogo de las células. A grandes escalas, existe un incentivo
significativo de evitar la rotura mecánica de las células para
liberar los polipéptidos recombinantes solubles o agregados de los
compartimientos citoplasmático y periplasmático y para preparar el
lisado para la recuperación eficiente de producto en la etapa
posterior.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
da a conocer un procedimiento que utiliza la disrupción bioquímica
para recuperar productos heterólogos solubles e insolubles de las
células bacterianas, según se define en las reivindicaciones.
La lisis bioquímica o lisis mecánica asistida
bioquímicamente es superior a la disrupción mecánica en la
recuperación de polipéptidos heterólogos de células bacterianas. La
expresión coordinada de ácido nucleico que codifica lisozima de
fago con gen t y proteína de digestión de ADN, y de ácido nucleico
que codifica el polipéptido heterólogo de interés, proporciona un
método altamente efectivo para liberar los polipéptidos insolubles
o solubles enredados con la capa de peptidoglicano, así como para
liberar producto atrapado en el citoplasma. Cuando se clona el gen
de lisozima de fago detrás de un promotor de control estricto, por
ejemplo, el promotor pBAD (también denominado promotor ara), puede
inducirse la acumulación citoplasmática de lisozima de fago
mediante la adición de un inductor (tal como arabinosa) en un
momento apropiado cerca del final de la fermentación. Al colocar
bajo control de promotores separados la expresión de los ácidos
nucleicos en polipéptidos heterólogos y en enzimas líticos, uno
puede regular de manera independiente su producción durante la
fermentación. Sin una secuencia de señal, el lisozima de fago
acumulado se encuentra estrictamente encerrado en el compartimiento
citoplasmático, y el gen t funciona para liberar el lisozima de fago
para degradar la capa de peptidoglicano. Además, el pH óptimo para
la actividad de lisozima de fago T4, la cual es una realización
preferida, es aproximadamente 7,3, que es aproximadamente el pH
neutro para la mayoría de caldos de cultivo.
La inducción de los genes que codifican la
lisozima de bacteriófago, proteína de digestión del ADN, y gen t
tras la expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo, resulta en la recuperación en cantidad significativa
del citoplasma o periplasma de las bacterias. Además del
rendimiento de producto, el éxito de un procedimiento de
recuperación se valora a partir de la simplicidad de la operación,
flujo del procedimiento, y duración del ciclo, así como el coste de
la operación. La presente invención mitiga varios, si no todos,
estos cuellos de botella durante el procedimiento de recuperación a
gran escala.
El procedimiento en el presente documento también
permite la utilización de lisis bioquímica de la célula a elevada
densidad celular y escala incrementada. A densidad elevada, la
expresión excesiva de lisozima de T4, gen t, y endA podría tener
resultados desastrosos, tal como la lisis celular prematura y la
reducción en la producción de polipéptido heterólogo. Además, no
sería de esperar que la inducción al final de un largo proceso de
fermentación, y tras una acumulación sustancial de producto,
produjese suficientes enzimas líticos para ser efectivo. El presente
procedimiento no plantea problemas a elevadas densidades celulares,
tal como viscosidad incrementada y espumación excesiva durante el
proceso de fermentación. Se espera que el procedimiento en el
presente documento permitirá conseguir elevada densidad celular,
inducción y acción efectiva del sistema, y el procesamiento de
lisados de caldos derivados de cultivos de elevada densidad.
La figura 1 muestra un diagrama esquemático de
cómo se dispone un producto polipeptídico en el citoplasma y en el
periplasma, es decir, si forma un agregado, fragmento proteolítico,
o polipéptido soluble plegado.
La figura 2 muestra la recuperación de agregado
IGF-I del sobrenadante y pellet mediante el
procedimiento típico de aislamiento que implica la disrupción
mecánica celular seguida de centrifugación, tras tres pasadas por el
homogeneizador Gaulin.
La figura 3 muestra un mapa del plásmido pS1130,
un plásmido de expresión para el precursor de la cremallera de
rhuMAb CD18 F(ab')_{2}-leucina (también
denominado en el presente documento fragmento de anticuerpo
anti-CD18).
Las figuras 4A-4B muestran la
secuencia del cassette de expresión de pS1130 (SEC ID nº:1 y
nº:2).
La figura 5 muestra la construcción del plásmido
pJJ154, utilizado para co-expresar el lisozima y
endA de T4 (ADNasa de E.coli).
La figura 6 muestra un mapa del plásmido
pLBIGF57, utilizado para expresar IGF-I.
La figura 7 muestra la construcción del plásmido
pJJ155, utilizado para expresar el lisozima, endA, y gen t de T4,
construido a partir de pJJ154.
La figura 8 muestra un esquema del sistema de dos
plásmidos para la co-expresión de la lisozima de
T4, una lisozima preferente de fago, endA, una proteína digestora
preferente de ADN, y el gen t (pJJ155) con ácido nucleico
codificante de IGF-I de acuerdo con un ejemplo de la
presente invención.
Las figuras 9A-9E dan a conocer
fotografías de microscopía de contraste de fases del caldo de
cultivo y pellets resuspendidos procedentes de la centrifugación de
caldo de fermentación con y sin co-expresión de
lisozima, endA y gen t de T4, antes y después de la adición de
EDTA. Específicamente, las fotografías muestran el pellet
resuspendido procedente de la centrifugación de caldo de control,
sin co-expresión de enzima lítico, antes y después
de la adición de EDTA, respectivamente (figuras 9A y 9B), el caldo
completo no diluido de recolección de la fermentación resultante de
la co-expresión de IGF-I con los
tres enzimas líticos, lisozima, endA y gen t de T4 (figura 9C), el
pellet resuspendido procedente de la centrifugación de caldo de
recolección con co-expresión de
IGF-I con los tres enzimas líticos y sin adición de
EDTA (figura 9D), y el pellet resuspendido procedente de la
centrifugación de caldo de recolección con
co-expresión de IGF-I, con los tres
enzimas líticos y con adición de EDTA (figura 9E).
Las figuras 10A y 10B muestran, respectivamente,
la cuantificación de ácidos nucleicos en el sobrenadante y pellet
mediante determinación de la DO_{260} de E.coli que
expresa IGF-I con co-expresión de
los tres enzimas líticos frente al control, y proteína total en el
sobrenadante y pellet de E.coli que expresan
IGF-I, con co-expresión de los tres
enzimas líticos frente al control de no
co-expresión.
La figura 11 muestra la recuperación de producto
IGF-I mediante centrifugación utilizando tres
enzimas líticos frente al caldo de control sin lisis a varias
velocidades de centrifugación.
La figura 12 muestra la recuperación de sólidos
durante la centrifugación utilizando tres enzimas líticos
co-expresados con IGF-I frente al
caldo control de no lisis para varias velocidades de
centrifugación.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"lisozima de fago" se refiere a un enzima citoplasmático que
facilita la lisis de células bacterianas infectadas por fagos,
liberando de las mismas, partículas replicadas de fago. El lisozima
puede ser de cualquier origen bacteriófago, incluyendo los
bacteriófagos T7, T4, lambda y mu. De éstas, la lisozima preferente
en el presente documento es la lisozima de T4.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"lisozima-T4" o "proteína E" se refiere a
una muramidasa citoplasmática que facilita la lisis de células
bacterianas infectadas por fagos T4, liberando de esta manera
partículas replicadas de fago (Tsugita y Inouye,
J.Mol.Biol., 37:201-12 (1968); Tsugita y
Inouye, J.Biol.Chem., 243:391-97 (1968)).
Está codificado por el gen e del bacteriófago T4 e hidroliza los
enlaces entre los residuos de N-acetilglucosamina y
ácido N-acetilmurámico en la capa rígida de
peptidoglicano de la cubierta celular de E.coli. El enzima
es una cadena polipeptídica única de un peso molecular de 18,3 kDa.
Este enzima es aproximadamente 250 veces más activo que la
lisozima-HEW en su actividad contra el
peptidoglicano bacteriano (Matthews et al.,
J.Mol.Biol., 147:545-558 (1981)). El pH
óptimo para la actividad enzimática del lisozima de T4 es 7,3,
frente a 9 de la lisozima-HEW (The Worthington
Manual; páginas 219-221).
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"gen t" u "holin" se refieren a un gen lítico de
bacteriófago T4 que es necesario para la lisis pero que parece
tener actividad de lisozima. Ver también Molecular Genetics of
Bacteriophage T4, supra, páginas
398-399.
El término "proteína que muestra actividad
digestora de ADN" o "proteína de digestión de ADN" se
refiere a una proteína que digerirá ADN, tal como, por ejemplo,
ADNasa de mamífero o bacteriana. Preferentemente, la proteína
digestora de ADN es una ADNasa humana o endA bacteriana.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "enzimas líticos" se refiere colectivamente a por lo
menos lisozima de fago y proteína digestora de ADN; en su caso,
también se refiere a un producto génico de gen t de fago o
equivalente en combinación con lisozima y proteína digestora de ADN
de fago.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "agente que altera la pared celular externa" de las
bacterias se refiere a una molécula que incrementa la permeabilidad
de la pared celular externa de las bacterias, tal como agentes
quelantes, por ejemplo EDTA, y zwiteriones.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "bacterias" se refiere a cualquier bacteria que
produzca proteínas que sean transportadas al espacio
periplasmático. Generalmente, las bacterias, sean Gram positivas o
Gram negativas, tienen bajo control la expresión de las lisozimas y
nucleasas de fago de manera que sólo se expresan cerca del final de
la fermentación, una realización preferida, o se expresan a nivel
bajo durante la fermentación. La nucleasa es, en general,
relativamente estable cuando es secretada al periplasma o al medio.
El término "bacterias no sensibles térmicamente" se refiere a
cualquier bacteria que no es significativamente sensible a cambios
de temperatura. Una realización preferida en el presente documento
son bacterias que no son sensibles térmicamente. Las bacterias de
mayor preferencia en el presente documento son las bacterias Gram
negativas.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"tiempo suficiente para liberar el polipéptido contenido en el
citoplasma o periplasma" se refiere a una cantidad de tiempo
suficiente para permitir al lisozima digerir el peptidoglicano en
grado suficiente para liberar el polipéptido heterólogo agregado o
soluble, citoplasmático o periplasmático.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"secuencia de señal" o "polipéptido de señal" se refiere
a un péptido que puede ser utilizado para segregar el polipéptido o
proteína heteróloga que muestra actividad digestora de ADN hacia el
periplasma de las bacterias. Las señales para el polipéptido
heterólogo o proteína digestora de ADN pueden ser homólogos a la
bacteria, o pueden ser heterólogos, incluyendo señales nativas al
polipéptido heterólogo o proteína digestora de ADN que se está
produciendo en las bacterias.
Los promotores de la presente invención pueden
ser promotores "inducibles", es decir, promotores que dirigen
la transcripción a tasa incrementada o reducida tras la unión de un
factor transcripcional.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
promotor "con baja expresión basal" o un "promotor de baja
expresión basal" es un promotor que es ligeramente débil, es
decir, proporciona un nivel de expresión basal suficientemente bajo
para no afectar el crecimiento celular o acumulación de producto y
proporciona un nivel suficientemente bajo de promoción para no
resultar en la lisis celular prematura.
"Factores transcripcionales" tal como se
utiliza en la presente memoria incluye cualquier factor que pueda
unirse a un región reguladora o de control de un promotor y, de
esta manera, producir la transcripción. La síntesis o la capacidad
de unión al promotor de un factor transcripcional dentro de la
célula huésped puede controlarse mediante la exposición del huésped
a un "inductor", o eliminando un "represor" del medio de
la célula huésped. De acuerdo con esto, para regular la expresión
de un promotor inducible, se añade un inductor o se elimina un
represor del medio de crecimiento de la célula huésped.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
frase "inducir la expresión" significa incrementar la cantidad
de transcripción de genes específicos mediante la exposición de las
células que contienen tales genes a un efector o inductor.
Un "inductor" es un agente químico o físico
que, al administrarlo a una población de células, incrementará la
cantidad de transcripción de genes específicos. Éstas habitualmente
son moléculas pequeñas cuyos efectos son específicos de operones o
grupos de genes particulares, y pueden incluir azúcares, alcohol,
iones metálicos, hormonas, calor, frío, y similares. Por ejemplo,
isopropiltio-\beta-galactosidasa
(IPTG) y lactosa son inductores del promotor tacII, y la
L-arabinosa es un inductor adecuado del promotor
arabinosa.
Un "represor" es un factor que conduce
directa o indirectamente al cese de la acción del promotor o reduce
ésta. Un ejemplo de un represor es fosfato. Al agotarse el represor
fosfato en el medio, el promotor fosfatasa alcalina (AP) es
inducido.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"polipéptido" o "polipéptido de interés" se refiere
generalmente a péptidos y proteínas con más de, aproximadamente,
diez aminoácidos. Los polipéptidos son "heterólogos", es decir,
foráneos a la célula huésped que se está utilizando, tal como una
proteína humana producida por E.coli. El polipéptido puede
producirse como agregado insoluble o como un polipéptido soluble en
el espacio periplasmático o citoplasma.
Entre los ejemplos de polipéptidos de mamífero se
incluyen moléculas tales como, por ejemplo, la renina, una hormona
del crecimiento, incluyendo la hormona del crecimiento humana; la
hormona del crecimiento bovina; el factor de liberación de la
hormona del crecimiento; la hormona paratiroidea; la hormona
estimulante del tiroides; lipoproteínas;
\alpha1-antitripsina; cadena A de la insulina; la
cadena B de la insulina; proinsulina; trombopoyetina; hormona
folículo-estimulante; calcitonina; hormona
luteinizante; glucagón; factores de coagulación tal como el factor
VIIIC, factor IX, factor tisular, y factor de von Willebrands;
factores de anti-coagulación, tal como la Proteína
C; factor natriurético atrial; tensioactivo pulmonar; un activador
plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador
plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina;
trombina; factor del crecimiento hematopoyético; factor alfa y beta
del tumor necrótico; encefalinasa, una albúmina sérica tal como la
albúmina de suero humana; sustancia inhibidora mulleriana; relaxina
cadena A; relaxina cadena B; prorrelaxina; péptido asociado a
gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como la
beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor
de crecimiento vascular endotelial (VEGF); receptores de hormonas o
de factores del crecimiento; integrina; proteína A o D; factores
reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico
derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3, 4, 5 ó
6 (NT-3, NT-4, NT-5,
o NT-6), o un factor del crecimiento nervioso tal
como NGF-\beta; cardiotrofinas (factor de la
hipertrofia cardíaca) tal como cardiotrofina-1
(CT-1); factor del crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF); factor del crecimiento fibroblástico, tal como
aFGF y bFGF; factor del crecimiento epidérmico (EGF); factor del
crecimiento transformante (TGF), tal como TGF-alfa
y TGF-beta, incluyendo TGF-\beta1,
TGF- \beta2, TGF- \beta3, TGF- \beta4 o TGF- \beta5;
factor-I y factor-II de crecimiento
similar a insulina (IGF-I y IGF-II);
des(1-3)-IGF-I
(IGF-I cerebral), proteínas de unión a factor del
crecimiento similar a insulina; proteínas CD, tal como
CD-3, CD-4, CD-8, y
CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores;
inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón
tal como interferón-alfa, beta y gamma; factores
estimulantes de colonia (CSF), por ejemplo, M-CSF,
GM-CSF y G-CSF; interleuquinas (IL),
por ejemplo, IL-1 a IL-10;
anticuerpo anti-HER-2; superóxido
dismutasa; receptores de células T; proteínas membranales de
superficie; factor acelerador de la degeneración; antígeno viral
tal como, por ejemplo, una parte de la cubierta de HIV; proteínas de
transporte; receptores de tráfico celular; adresinas; proteínas
reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los
polipéptidos anteriormente mencionados.
Los polipéptidos exógenos preferentes de interés
son polipéptidos de mamífero, con la mayor preferencia polipéptidos
humanos. Entre los ejemplos de tales polipéptidos de mamífero se
incluyen t-PA, VEGF, gp120,
anti-HER-2,
anti-CD11a, anti-CD18, ADNasa,
IGF-I, IGF-II, IGF-I
cerebral, hormona del crecimiento, cadenas de relaxina, factor de
liberación de hormona del crecimiento, cadenas de insulina o
proinsulina, uroquinasa, inmunotoxinas, neurotrofinas, y antígenos.
Entre los polipéptidos de mamífero particularmente preferentes se
incluyen, por ejemplo, IGF-I, ADNasa, o VEGF, con la
mayor preferencia, IGF-I, si el polipéptido es
producido como un agregado insoluble en el periplasma, y
anticuerpos anti-CD18 o fragmentos de los mismos,
tal como fragmentos de anti-CD18 recombinante
humano Fab, Fab' y (Fab')_{2}, si el polipéptido es producido en
una forma soluble en el periplasma.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"IGF-I" se refiere a factor del crecimiento
similar a insulina de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina,
porcina, equina, y preferentemente humana, en secuencia nativa o en
forma variante y producida por recombinación. En un método
preferente, el IGF-I se clona y su ADN se expresa,
por ejemplo, mediante el procedimiento descrito en la patente nº EP
128.733 publicada el 19 de diciembre de 1984.
La expresión "secuencias de control" se
refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una
secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped
particular. Las secuencias de control que son adecuadas para
bacterias incluyen un promotor tal como el promotor fosfatasa
alcalina, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de
unión del ribosoma.
Un ácido nucleico está "operativamente
unido" cuando se sitúa en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una
pre-secuencia o líder secretorio está operativamente
unido a ADN para un polipéptido heterólogo si se expresa como una
preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un
promotor o potenciador está operativamente unido a una secuencia
codificante si afecta a la transcripción de la secuencia; o un
sitio de unión del ribosoma está operativamente unido a una
secuencia codificante si está situada de manera que facilite la
traducción. En general, "operativamente unido" significa que
las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas y, en el
caso de un líder secretorio, son contiguas y están dentro del marco
de lectura. El unido se consigue por ligación en sitios de
restricción convenientes. Si no existen tales sitios, se utilizan
adaptores oligonucleotídicos sintéticos o conectores de acuerdo con
la práctica convencional.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las
expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo
celular" se utilizan intercambiablemente, y todas tales
designaciones incluyen la progenie. De esta manera, las palabras
"transformantes" y "células transformadas" incluyen las
células primarias, y los cultivos derivados de las mismas, sin
importar el número de transferencias. También se entiende que toda
la progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN,
debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la
progenie mutante con la misma función o actividad biológica según se
ha explorado en la célula originariamente transformada. Cuando se
pretendan denominaciones diferentes, resultarán evidente a partir
del contexto.
En una realización, la invención da a conocer un
procedimiento de recuperación de un polipéptido heterólogo, soluble
o insoluble, de células bacterianas en las que es producido. Este
procedimiento implica, en una primera etapa, el cultivo de células
bacterianas, las cuales comprenden ácido nucleico que codifica el
polipéptido heterólogo, cuyo ácido nucleico está unido a un primer
promotor inducible, y ácido nucleico que codifica los enzimas
líticos, en las que estos ácidos nucleicos están unidos a un
segundo promotor. En una realización alternativa, el polipéptido
heterólogo está unido a un primer promotor inducible, el lisozima
de fago y proteína digestora de ADN están unidos a un segundo
promotor inducible o a un promotor de baja expresión basal, y el
gen t está unido al promotor inducible según se define en las
reivindicaciones.
El cultivo tiene lugar bajo condiciones en las
que la expresión de los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos, cuando son inducidos, comienza después de que se haya
acumulado 50% o más de polipéptido heterólogo, y bajo condiciones
en las que la lisozima de fago se acumula en un compartimiento
citoplasmático y la proteína digestora de ADN es secretada hacia el
compartimiento periplasmático.
En los procedimientos en el presente documento,
es preferente la inducción de los promotores; sin embargo, los
procedimientos también contemplan la utilización de un promotor
para el lisozima de fago y proteína digestora de ADN que es un
promotor de baja expresión basal (ligeramente débil), de manera que
no se lleva a cabo inducción alguna. Este tipo de promotor tiene
una debilidad suficientemente baja para no resultar en la lisis
celular prematura y resulta en un nivel de expresión basal
suficientemente bajo para no afectar al crecimiento celular o
acumulación de producto.
En una segunda etapa, se recupera de las células
bacterianas el polipéptido heterólogo acumulado. Puede añadirse un
agente que incremente la permeabilidad de la pared celular externa
de las células bacterianas, según se describe en detalle
posteriormente, antes de llevar a cabo la etapa de recuperación. La
necesidad de alterar mecánicamente las células para liberar la
lisozima de fago se ve reducida o completamente eliminada. En una
realización preferida, tras la expresión de los enzimas líticos,
las células se incuban durante un tiempo suficiente para liberar el
polipéptido heterólogo contenido en el citoplasma o en el
periplasma.
Si bien los procedimientos son de aplicación a la
recuperación de agregados insolubles, tal como
IGF-I, VEGF, y ADNasa por sedimentación del
producto, también son aplicables a polipéptidos heterólogos que son
solubles en el citoplasma o en el periplasma, tal como, por
ejemplo, fragmentos de anticuerpo anti-CD18. Entre
las ventajas de la recuperación de polipéptidos heterólogos
solubles por lisis celular bioquímica se incluyen la prevención o
reducción de la necesidad de lisis mecánica, evitando de esta manera
la pérdida de proteínas lábiles térmicamente, y obteniendo una
viscosidad del líquido baja y consistente, compatible con
procedimientos de recuperación corriente abajo, tal como la
tecnología de adsorción de lecho expandido y la centrifugación.
La cromatografía de adsorción de lecho expandido
(EBA), descrita, por ejemplo, en "Expanded Bed Adsorption:
Principles and Methods", Pharmacia Biotech, ISBN
91-630-5519-8), es
útil para la recuperación inicial de proteínas diana de carga de
alimentación o cultivos celulares crudos. Las etapas de
procedimiento de clarificación, concentración, y purificación
inicial pueden combinarse en una operación de unidad única,
mejorando la economía del procedimiento debido al número reducido
de etapas, incrementando el rendimiento, tiempo de procesamiento
global más corto, menores costes laborales, y costes reducidos. En
la cromatografía EBA se expande un adsorbente y se equilibra
mediante la aplicación de un flujo de líquido hacia arriba en la
columna. Se forma un lecho fluidizado estable cuando las partículas
adsorbentes se encuentran suspendidas en el equilibrio debido al
equilibrio entre la velocidad de sedimentación de las partículas y
la velocidad de flujo hacia arriba del líquido. Se aplica al lecho
expandido una mezcla celular o caldo lisado crudo con un flujo
hacia arriba. Las proteínas diana se unen al adsorbente, mientras
que los residuos celulares y otros contaminantes pasan a través sin
dificultad. El material unido débilmente se lava del lecho
expandido utilizando un flujo hacia arriba de un tampón de lavado.
A continuación, se detiene el flujo y se permite que el adsorbente
se deposite en la columna. A continuación, se baja el adaptador de
la columna a la superficie del lecho sedimentado. Se revierte el
flujo y las proteínas capturadas se eluyen del lecho sedimentado
utilizando un tampón apropiado. El eluido consiste en la proteína
diana en un volumen reducido de pool eluido, purificado
parcialmente en preparación de la cromatografía de lecho
empaquetado (Pharmacia Biotech, supra). En la EBA, en
la que el lisado celular completo que contiene el producto soluble
se bombea hacia arriba a través de la columna, la proteína se
adsorbe sobre una resina (lecho fluidizado), y los residuos
celulares fluyen a través y se eluyen, se hace uso de solamente una
etapa de cromatografía, ahorrando de esta manera una etapa.
En otra realización, la invención da a conocer un
procedimiento de recuperación de polipéptido heterólogo soluble del
periplasma de las células bacterianas. Este procedimiento implica
el cultivo de células bacterianas, las cuales comprenden ácido
nucleico que codifica lisozima fágido y ácido nucleico de fago que
codifica una proteína digestora de ADN que muestra actividad
digestora de ADN bajo el control de una secuencia de señal para la
secreción de dicha proteína secretora de ADN. En este
procedimiento, el ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo está unido a un promotor inducible, y se utiliza una
secuencia de señal para secretar el polipéptido heterólogo hacia el
periplasma de las células bacterianas. Este cultivo tiene lugar bajo
condiciones en las que la sobre-expresión del ácido
nucleico que codifica la lisozima de fago y proteína de fago
digestora de ADN es promovida débil y constitutivamente o, si es
inducida, comienza después de que se haya acumulado 50% o más del
polipéptido heterólogo, y bajo condiciones en las que el polipéptido
heterólogo y la proteína digestora de ADN son secretados hacia el
periplasma de las bacterias y la lisozima fágica se acumula en un
compartimiento citoplasmático.
En una segunda etapa, se recupera del caldo de
lisado el polipéptido heterólogo resultante.
En una tercera realización, la invención da a
conocer un procedimiento de recuperación de un polipéptido
heterólogo de células bacterianas en el que se utilizan tres
promotores diferentes. Específicamente, en la primera etapa, se
cultivan las células bacterianas, donde las células comprenden ácido
nucleico que codifica la lisozima de fago, el gen t, y el ácido
nucleico que codifica una proteína que muestra actividad digestora
de ADN, así como ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo. El ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo está unido a un primer promotor inducible, el ácido
nucleico que codifica la lisozima y proteína digestora de ADN están
unidos a un segundo promotor inducible, o a un promotor de baja
expresión basal, y el gen t está unido a un segundo/tercer promotor
inducible, según se define en las reivindicaciones.
El cultivo se lleva a cabo bajo condiciones en
las que, al añadir un inductor y cuando los tres promotores son
inducibles, se induce la expresión de los ácidos nucleicos que
codifican la lisozima de fago, del gen t, y de la proteína
digestora de ADN, tras acumularse 50% o más del polipéptido
heterólogo, siendo inducido el primer promotor antes que el segundo
promotor, y el tercer promotor, el último, y donde, si la lisozima
fágica y proteína digestora de ADN están unidas a un promotor de
baja expresión basal, se induce la expresión del gen t tras
acumularse 50% o más del polipéptido heterólogo. El cultivo también
se lleva a cabo bajo condiciones en las que la lisozima fágica se
acumula en un compartimiento citoplasmático, hacia donde la proteína
digestora de ADN se secreta y se acumula en el periplasma, y donde
se lisan las células, produciendo un caldo de lisado.
En una segunda etapa, se recupera polipéptido
heterólogo acumulado del caldo de lisado.
En los procedimientos anteriores, mientras que la
secuencia de señal para la proteína digestora de ADN puede ser
cualquier secuencia, preferentemente es una secuencia nativa de la
proteína digestora de ADN. Además, en una realización preferida, la
proteína digestora de ADN es ADNasa o es bacteriana, por ejemplo,
producto endA de E.coli.
En una realización preferida, la etapa de cultivo
tiene lugar bajo condiciones de elevada densidad celular, es decir,
generalmente a una densidad celular de, aproximadamente, 15 a 150 g
peso seco/litro, preferentemente por lo menos, aproximadamente, 40,
con mayor preferencia, aproximadamente 40-150, con
la mayor preferencia, aproximadamente 40 a 100. En densidad óptica,
120 DO_{550} (A_{550}) es, aproximadamente, 50 g peso
seco/litro. Además, el cultivo puede conseguirse utilizando
cualquier escala, incluso escalas muy grandes de 100.000 litros.
Preferentemente, la escala es de, aproximadamente, 100 litros o
mayor, con mayor preferencia de por lo menos, aproximadamente, 500
litros, y con la mayor preferencia, aproximadamente entre 500 litros
y 100.000 litros.
Los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos están unidos a un promotor, es decir, colocados en tándem,
como introduciendo un conector entre los ácidos nucleicos. El
promotor para la expresión del polipéptido heterólogo es diferente
del utilizado para los enzimas líticos, de manera que uno es
inducido antes que el otro. Si bien los promotores puede ser
cualquier promotor adecuado para este fin, preferentemente, los
promotores para los enzimas líticos, con o sin gen t, y polipéptido
heterólogo son, respectivamente, promotor arabinosa, y promotor
fosfatasa alcalina.
Los promotores para el polipéptido heterólogo y
para los enzimas líticos para los tres procedimientos en el
presente documento deben ser diferentes, de manera que la expresión
codificada en ácido nucleico del polipéptido heterólogo se induzca
antes de la expresión de los enzimas líticos codificados en ácido
nucleico, o a un nivel mucho más alto, cuando los promotores son
inducibles. Si bien los promotores pueden ser cualquier promotor
adecuado para este fin, preferentemente, los promotores para los
enzimas líticos y polipéptido heterólogo son, respectivamente, el
promotor arabinosa y el promotor fosfatasa alcalina.
Alternativamente, la compartimentalización de la lisozima de fago y
la proteína digestora de ADN puede permitir la utilización de un
promotor con baja expresión basal para la expresión del ácido
nucleico que codifica la lisozima de fago y la proteína digestora
de ADN. Si se utiliza un promotor con baja expresión basal, tal
como arabinosa, y no el promotor tac o el promotor
trp, entonces no se requiere una etapa activa de
inducción.
La inducción de la expresión del ácido nucleico
que codifica los enzimas líticos se lleva a cabo preferentemente
mediante la adición de un inductor al medio de cultivo. Si bien, en
este aspecto, los inductores para los promotores pueden añadirse en
cualquier cantidad, preferentemente si el inductor es arabinosa, se
añade en una cantidad de, aproximadamente, 0-1% en
peso, y si se añade inductor, 0,1-1% en peso.
En los procedimientos descritos anteriormente,
típicamente se introducen los elementos de expresión en las células
por transformación, pero también pueden integrarse en el genoma o
cromosoma de las células junto con sus regiones promotoras. Esto es
aplicable a cualquiera de los enzimas líticos o al gen del
polipéptido heterólogo. Las células bacterianas pueden transformarse
con uno o más vectores de expresión que contengan el ácido nucleico
que codifica los enzimas líticos, y el ácido nucleico que codifica
el polipéptido heterólogo. En una realización como ésta, las
células bacterianas son transformadas con dos vectores que
contienen, respectivamente, el ácido nucleico que codifica los
enzimas líticos y el ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo. En otra realización, el ácido nucleico que codifica los
enzimas líticos y el ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo se introducen en un solo vector con el que se
transforman las células bacterianas. En otra realización específica
que puede ser preferente, la lisozima de fago y enzima de fago
digestor de ADN se introducen en un plásmido para asegurar un
elevado número de copias y el gen t se integra en el cromosoma del
huésped para regular negativamente la expresión y evitar la lisis
celular prematura con el fin de evitar la debilidad de la
expresión.
En la primera etapa de los procedimientos
anteriores, el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, cADN o ADN
genómico) se inserta adecuadamente en un vector replicable para su
expresión en la bacteria bajo el control de un promotor adecuado
para las bacterias. Hay disponibilidad de muchos vectores para este
fin, y la selección del vector apropiado dependerá principalmente
del tamaño del ácido nucleico a insertar en el vector y de la
célula huésped particular a transformar con el vector. Cada vector
contiene diversos componentes, dependiendo de su función
(amplificación del ADN o expresión del ADN) y de la célula huésped
particular con la que es compatible. Los componentes vector para la
transformación bacteriana pueden incluir una secuencia de señal
para el polipéptido heterólogo e incluirán una secuencia de señal
para la proteína digestora de ADN, y también incluirán un promotor
inducible para el polipéptido heterólogo y el gen t, y un promotor
inducible o uno no inducible con baja expresión basal para los otros
enzimas líticos. También incluyen generalmente un origen de
replicación y uno o más genes marcadores.
En general, los vectores plásmidos que contienen
replicón y secuencias de control que se derivan de especies
compatibles con la célula huésped se utilizan con huéspedes
bacterianos. El vector habitualmente lleva un sitio de replicación,
así como secuencias marcadoras que pueden permitir la selección
fenotípica de células transformadas. Por ejemplo, E.coli se
transforma típicamente con pBR322, un plásmido derivado de una
especie de E.coli. Ver, por ejemplo, Bolivar et al.,
Gene, 2:95 (1977). pBR322 contiene genes que confieren
resistencia a la ampicilina y tetraciclina y, de esta manera,
proporcionan un medio fácil de identificar las células
transformadas. El plásmido pBR322, u otro plásmido microbiana o
fago, también contiene generalmente, o se modifica para que
contenga, promotores que pueden ser utilizados por el organismo
bacteriana para expresar los genes marcadores seleccionables.
Si el polipéptido heterólogo debe secretarse, el
ADN codificante del polipéptido heterólogo de interés en el
presente documento contiene una secuencia de señal, por ejemplo una
en el extremo N-terminal del polipéptido heterólogo
maduro. En general, la secuencia de señal puede ser un componente
del vector, o puede ser una parte del ADN insertado en el vector
que codifica el polipéptido heterólogo. La secuencia de señal
heteróloga seleccionada debería ser una secuencia que sea
reconocida y procesada (es decir, cortada mediante una peptidasa de
señal) por la célula huésped. Para las células huésped bacterianas
que no reconocen y procesan la secuencia de señal polipéptido
heterólogo nativo, la secuencia de señal se sustituye por una
secuencia bacteriana de señal seleccionada, por ejemplo entre el
grupo que consiste en los líderes fosfatasa alcalina, penicilasa,
lpp, o enterotoxina termoestable II.
Los vectores de expresión contienen una secuencia
de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más
células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas
en una diversidad de bacterias. El origen de replicación del
plásmido pBR322 es adecuada para la mayoría de bacterias
Gram-negativas.
Los vectores de expresión contienen generalmente
un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable.
Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o
crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio
selectivo de cultivo. Las células no transformadas con el vector
que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de
cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a)
confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo,
ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b)
complementan deficiencias auxotróficas, o (c) suministran
nutrientes críticos no disponibles en medios complejos, por ejemplo,
el gen que codifica la
D-alanina-racemasa para
Bacilli. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un
fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas
células que son transformadas con éxito con un gen heterólogo,
producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y, de
esta manera, sobreviven el régimen de selección.
El vector de expresión para producir un
polipéptido heterólogo también contiene un promotor inducible que
es reconocido por el organismo huésped bacteriana y está
operativamente unido al ácido nucleico que codifica el polipéptido
heterólogo de interés. También contiene un promotor separado
inducible o de basa expresión basal, que está operativamente unido
al ácido nucleico que codifica los enzimas líticos. Entre los
promotores inducibles adecuados para su utilización con huéspedes
bacterianos se incluyen los sistemas
\beta-lactamasa y promotor lactosa (Chang et
al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al.,
Nature, 281:544 (1979)), el sistema promotor arabinosa,
incluyendo el promotor araBAD (Guzman et al.,
J.Bacteriol., 174:7716-7728 (1992); Guzman
et al., J.Bacteriol., 177:4121-4130
(1995); Siegele y Hu, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
94:8168-8172 (1997)), el promotor ramnosa
(Haldimann et al., J.Bacteriol.,
180:1277-1286 (1998)), el promotor fosfatasa
alcalina, un sistema promotor triptófano (trp) (Goeddel,
Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980), y patente nº EP 36.776),
los promotores P_{Ltet0-1}y
P_{lac/ara-1}(Lutz y Bujard, Nucleic
Acids Res., 25:1203-1210 (1997)), y promotores
híbridos, tal como el promotor tac, deBoer et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 80:21-25 (1983). Sin
embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos,
inducibles y de baja expresión basal. Sus secuencias nucleotídicas
han sido publicadas, permitiendo a un experto, de esta manera,
ligarlos operativamente a ADN codificante del polipéptido heterólogo
de interés, o a los ácidos nucleicos que codifican los enzimas
líticos (Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980))
utilizando conectores o adaptadores para suministrar cualquier sitio
de restricción requerido. Si se utiliza un promotor fuerte y
altamente "leaky", tal como el promotor trp, se utiliza
generalmente sólo para la expresión del ácido nucleico que codifica
el polipéptido heterólogo y no para el ácido nucleico que codifica
los enzimas líticos. Los promotores tac y P_{L} podrían
utilizarse para uno entre el polipéptido heterólogo y los enzimas
líticos, pero no para ambos, aunque no son preferentes. Son
preferentes el promotor fosfatasa alcalina para el producto, y el
promotor arabinosa para los enzimas líticos.
Los promotores de uso en sistemas bacterianos
también contienen generalmente una secuencia
Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN
que codifica el polipéptido heterólogo de interés. El promotor
puede ser eliminado del ADN de origen bacteriano mediante digestión
con enzima de restricción e insertado en el vector que contiene el
ADN deseado. El promotor phoA puede ser eliminado del ADN de
origen bacteriano mediante digestión con enzima de restricción e
insertado en el vector que contiene el ADN deseado.
La construcción de vectores adecuados que
contienen uno o más de los componentes anteriormente mencionados
utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos o fragmentos
de ADN aislados se cortan, adaptan, y re-ligan en la
forma deseada para generar los plásmidos requeridos.
\newpage
Para el análisis de confirmación de las
secuencias correctas en los plásmidos construidos, se utilizan las
mezclas de ligación para transformar E.coli K12 cepa 294
(ATCC nº 31.446), u otras cepas, y se seleccionan los
transformantes exitosos utilizando la resistencia a la ampicilina o
tetraciclina según el caso. Se preparan plásmidos a partir de los
transformantes, se analizan mediante digestión de endonucleasa de
restricción, y/o se secuencian mediante el método de Sanger et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74:5463-5467
(1977), o de Messing et al., Nucleic Acids Res.,
9:309 (1981), o mediante el método de Maxam et al.,
Methods in Enzymology, 65:499 (1980).
Entre las bacterias adecuadas para este fin se
incluyen las arqueobacterias y eubacterias, especialmente las
eubacterias, con mayor preferencia las bacterias
Gram-negativas, y con la mayor preferencia, las
Enterobacteriaceae. Entre los ejemplos de bacterias útiles se
incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia,
Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia,
Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, y Paracoccus. Entre los
huéspedes E.coli se incluyen E.coli W3110 (ATCC nº
27.325), E.coli 294 (ATCC nº 31.446), E.coli B, y
E.coli X1776 (ATCC nº 31.537). Estos ejemplos son
ilustrativos y no limitativos. También pueden utilizarse células
mutantes de cualquiera de las bacterias anteriormente mencionadas.
Evidentemente es necesario seleccionar las bacterias apropiadas
teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de
una bacteria. Por ejemplo, las especies de E.coli, Serratia,
o Salmonella pueden ser utilizadas adecuadamente como
huésped cuando se utilicen plásmidos bien conocidos, tal como
pBR322, pBR325, pACYC177, o pKN410 para suministra el replicón.
E.coli cepa W3110 es un huésped preferente
porque es una cepa huésped común para las fermentaciones de
productos de ADN recombinante. Preferentemente, la célula huésped
debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticos. Por
ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para producir una mutación
genética en los genes que codifican proteínas. Ejemplos de tales
huéspedes incluyen E.coli W3110 cepa 1A2, la cual tiene el
genotipo completo tonA\Delta (también conocido como
\DeltafhuA); E.coli W3110 cepa 9E4, la cual tiene el
genotipo completo tonA\Delta ptr3; E.coli W3110
cepa 27C7 (ATCC nº 55.244), la cual tiene el genotipo completo
tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta
(argF-lac)169 ompT\Delta
degp41kan^{r}; E.coli W3110 cepa 37D6, la cual tiene
el genotipo completo tonA\Delta ptr3 phoA\DeltaE15 \Delta
(argF-lac)169 ompT\Delta degP41kan^{r}
rbs7\Delta ilvG; E.coli W3310 cepa 40B4, la cual es
la cepa 37D6 con una mutación por deleción degP de no
resistencia a la canamicina; E.coli W3110 cepa 33D3, la cual
tiene el genotipo completo tonA prt3 lacIq LacL8 ompT degP
kan^{r}; E.coli W3110 cepa 36F8, la cual tiene el
genotipo completo tonA phoA
\Delta(argF-lac) ptr3 degP kan^{R}
ilvG+, y es termo-resistente a 37ºC;
E.coli W3110 cepa 45F8, la cual tiene el genotipo completo
fhuA(tonA) \Delta(argF-lac) ptr3
degP41 (kanS) \Deltaomp\Delta (nmpc-fepE) ilvG+
phoA+ phoS*(T10Y); E.coli W3110 cepa 33B8, la cual tiene el
genotipo completo tonA phoA \Delta (argF-lac)
189 deoC degP IlvG+(kanS); E.coli W3110 cepa 43E7, la
cual tiene el genotipo completo fhuA(tonA)
\Delta(argF-lac) ptr3 degP41(kanS)
\Deltaompt\Delta (nmpc-fepE) ilvG+ phoA+; y
una cepa de E.coli con la o las proteasas periplasmáticas
mutantes que se dan a conocer en la patente U.S. nº 4.946.783
publicada el 7 de agosto de 1990.
Las células huésped se transforman con los
vectores de expresión anteriormente descritos de la presente
invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales,
modificados según resulte apropiado para inducir los diversos
promotores si se lleva a cabo inducción.
Transformación significa introducir ADN en un
organismo de manera que el ADN sea replicable, bien como elemento
extracromosómico, bien como parte integrante de un cromosoma.
Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación se
lleva a cabo utilizando técnicas estándar apropiadas para tales
células. Generalmente, se utiliza el tratamiento con calcio, con
cloruro de calcio, según se describe en la sección 1.82 de Sambrook
et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Nueva
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), para células
bacterianas que contengan barreras sustanciales de pared celular.
Otro método de transformación utiliza polietilenglicol/DMSO, según
se describe en Chung y Miller, Nucleic Acids Res., 16:3580
(1988). Aunque otro método es utilizar la técnica denominada
electroporación.
Las células bacterianas utilizadas para producir
el polipéptido heterólogo de interés descrito en la presente
invención, se cultivan en medios adecuados en los que pueden
inducirse los promotores como se describe generalmente en, por
ejemplo, Sambrook et al., supra.
También puede incluirse cualquier otro suplemento
necesario, aparte de las fuentes de carbono, nitrógeno, y fósforo
inorgánico, en concentraciones apropiadas, solos o en mezclas con
otro suplemento o medio, tal como una fuente compleja de nitrógeno.
El pH del medio puede ser cualquier pH en el intervalo aproximado
5-9, dependiendo, principalmente, del organismo
huésped.
Para la inducción, típicamente las células se
cultivan hasta alcanzar una densidad óptica determinada, por
ejemplo, una A_{550} de, aproximadamente, 80-100,
en cuyo punto se inicia la inducción (por ejemplo, por adición de un
inductor, por agotamiento de un represor, supresor, o componente
del medio, etc.), para inducir la expresión del gen que codifica el
polipéptido heterólogo. Cuando se ha acumulado aproximadamente 50%
o más del polipéptido heterólogo (según determina, por ejemplo, que
la densidad óptica alcance un cantidad-objetivo que
se ha observado en el pasado que se correlaciona con la acumulación
deseada de polipéptido heterólogo, por ejemplo, una A_{550} de,
aproximadamente, 120-140), se lleva a cabo la
inducción del promotor de los enzimas líticos. La inducción
típicamente tiene lugar en un momento en el tiempo después de la
inoculación de, aproximadamente, 75-90%, con
preferencia aproximadamente 80-90%, del tiempo
total del proceso de fermentación, según la experiencia y ensayos
anteriores. Por ejemplo, la inducción del promotor puede tener lugar
entre las 30 horas aproximadamente, con preferencia las 32 horas, y
hasta aproximadamente las 36 horas después de la inoculación, en un
proceso de fermentación de 40 horas.
La expresión génica puede medirse en una muestra
directamente, por ejemplo, mediante transferencia Northern
convencional, para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77:5201-5205 (1980)).
Pueden utilizarse diversos marcajes, más habitualmente
radioisótopos, en particular ^{32}P. Sin embargo, también pueden
utilizarse otras técnicas, tal como la utilización de nucleótidos
modificados con biotina, para su introducción en un polinucleótido.
A continuación, la biotina sirve como sitio de unión para la avidina
o para anticuerpos, los cuales pueden marcarse con una amplia
variedad de marcajes, tal como con radionucleidos, compuestos
fluorescentes, enzimas, o similares.
Para la acumulación de un producto génico
expresado, se cultiva la célula huésped bajo condiciones
suficientes para la acumulación del producto génico. Tales
condiciones incluyen, por ejemplo, las condiciones de temperatura,
nutrientes, y densidad celular que permitan la expresión proteica y
acumulación por parte de la célula. Además, tales condiciones son
aquéllas bajo las que la célula puede llevar a cabo funciones
celulares básicas de transcripción, traducción y transporte de
proteínas desde un compartimiento celular hacia otro de las
proteínas secretadas, como son conocidas por los expertos en la
materia.
Tras la acumulación de producto, cuando las
células han sido lisadas por los enzimas líticos expresados,
opcionalmente antes de la recuperación de producto, se incuba el
caldo de lisado durante un periodo de tiempo suficiente para
liberar el polipéptido heterólogo contenido en las células. Este
periodo de tiempo dependerá, por ejemplo, del tipo de polipéptido
heterólogo que se recupera y de la temperatura, pero
preferentemente estará comprendido entre, aproximadamente, 1 y 24
horas, más preferiblemente entre 2 y 24 horas, y con la mayor
preferencia, entre 2 y 3 horas. Si se da la
sobre-digestión con el enzima, la mejora en la
recuperación de producto no será tan grande.
En la segunda etapa de la presente invención, el
polipéptido heterólogo, como producto soluble o insoluble liberado
de la matriz celular, se recupera del lisado, de una manera que
minimice la co-recuperación de residuos celulares
con el producto. La recuperación puede realizarse de cualquier
manera, pero preferentemente comprende la sedimentación de
partículas refráctiles que contienen el polipéptido heterólogo, o
la recolección de sobrenadante que contenga producto soluble. Un
ejemplo de sedimentación es la centrifugación. En este caso, la
recuperación tiene lugar, preferentemente, antes de la EBA o
sedimentación, en presencia de un agente que altere la pared celular
externa incrementando su permeabilidad y permitiendo una mayor
recuperación de sólidos. Entre los ejemplos de tales agentes se
incluyen un agente quelante, tal como EDTA, o un zwiterión, tal
como, por ejemplo, un detergente iónico dipolar, tal como el
detergente ZWITTERGENT 316^{TM}. Ver Stabel et al.,
supra. Con la mayor preferencia, la recuperación tiene lugar
en presencia de EDTA. Otra técnica de recuperación de producto
soluble es EBA, como se ha descrito anteriormente.
Si se utiliza la centrifugación para la
recuperación, la fuerza relativa de centrifugación (RCF) es un
factor importante. La RCF se ajusta para minimizar la
co-sedimentación de residuos celulares con las
partículas refráctiles liberadas de la pared celular con la lisis.
La RCF específica utilizada para este fin variará dependiendo, por
ejemplo, del tipo de producto a recuperar, pero es,
preferentemente, de por lo menos, aproximadamente, 3.000 x g, más
preferentemente de, aproximadamente, 3.500-6.000 x
g, y con la mayor preferencia de, aproximadamente,
4.000-6.000 x g. En el caso de
co-expresarse el gen t, aproximadamente 6.000 rpm
proporcionan una recuperación tan buena a partir de partículas
refráctiles del caldo lisado como a partir de células intactas.
La duración de la centrifugación dependerá de
varios factores. La tasa de sedimentación dependerá de, por ejemplo,
el tamaño, forma, y densidad de la partícula refráctil y de la
densidad y viscosidad del líquido. El tiempo de sedimentación de
los sólidos dependerá, por ejemplo, de la distancia y tasa de
sedimentación. Es razonable esperar que las centrífugas continuas de
discos funcionarán bien para la recuperación de agregados de
polipéptido heterólogo liberado o para la eliminación de residuos
celulares a gran escala, ya que estas centrífugas pueden procesar a
elevadas velocidades de fluido debido a las relativamente grandes
fuerzas centrífugas y a la distancia relativamente pequeña de
sedimentación.
El polipéptido heterólogo capturado en la etapa
inicial de recuperación puede, a continuación, purificarse
adicionalmente separándolo de proteínas contaminantes. En una
realización preferida, se aislan los agregados de polipéptido
heterólogo, seguido de una solubilización simultánea y
re-plegamiento del polipéptido, según se da a
conocer en la patente nº 5.288.931. Alternativamente, se recupera
el producto soluble mediante técnicas estándar.
Los procedimientos siguientes ejemplifican los
procedimientos de purificación adecuados para el polipéptido
heterólogo soluble liberado del periplasma o del citoplasma:
fraccionamiento de inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico;
precipitación con etanol; HPLC en fase reversa; cromatografía en
sílice o en resina de intercambio catiónico, tal como DEAE;
cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato
amónico; y filtración en gel utilizando, por ejemplo,
SEPHADEX^{TM} G-75.
Los ejemplos siguientes se ofrecen a título
ilustrativo, pero sin limitación.
rhuMAb CD18 es un fragmento recombinante de
anticuerpo F(ab')_{2} con dos cadenas ligeras de residuo
214 y dos cadenas pesadas de residuo 241. Se une al receptor
MAC-1 (CD11b/CD18), bloqueando eficazmente la unión
de neutrófilos al endotelio. En el proceso de fermentación descrito
posteriormente, se produce rhuMab CD18 como un precursor de la
cremallera de F(ab')_{2}-leucina en
E.coli y se secreta hacia el periplasma. El procedimiento
deseado de recuperación se concentra en la fracción soluble del
producto acumulado y depende de la cremallera de
F(ab')_{2}-leucina que se libera del
periplasma para su captura inicial.
Se introdujo la co-expresión de
lisozima-T4 para debilitar el sáculo de
peptidoglicano, y se introdujo la sobre-expresión de
proteína endA para degradar el ADN genómico liberado de las células
bajo condiciones tales que las células son permeabilizadas o
lisadas.
En E.coli, el gen endA codifica una
endonucleasa normalmente secretada hacia el periplasma, que corta
el ADN en oligodesoxirribonucleótidos de una manera
endonucleolítica. Se ha sugerido que endA es expresado de manera
relativamente débil por E.coli (Wackernagel et al.,
supra). Sin embargo, la endonucleasa podría
sobre-expresarse utilizando un plásmido compatible.
Mediante la inserción de gen endA con su secuencia de señal detrás
del cassette lisozima-T4-ara en el
plásmido compatible pJJ153, ahora pJJ154, se inducirá la expresión
de ambos la lisozima-T4 y la endonucleasa al añadir
arabinosa. Si bien la lisozima-T4 está encerrada en
el citoplasma, la endonucleasa se secreta hacia el espacio
periplasmático y se mantiene alejada del ADN genómico, situado en
el citoplasma durante el proceso de fermentación. Se espera que una
degradación enzimática efectiva del ADN tras la lisis celular,
reducirá o incluso eliminará las pasadas múltiples por el
dispositivo de disrupción mecánica, una operación con frecuencia
necesaria para ambas la disrupción celular y la reducción de la
viscosidad. El éxito en esto comportaría una reducción
significativa en tiempo y costes del procedimiento de
recuperación.
Construcción del plásmido pS1130: Se
construyó el plásmido pS1130 (figura 3) para dirigir la producción
de precursor de cremallera de rhuMAb CD18
F(ab')_{2}-leucina en E.coli. Está
basado en el plásmido bien caracterizado pBR322, con un cassette de
expresión de 2138 pb (figura 4; SEC ID nº:1 y nº:2) insertado en el
sitio de restricción EcoRI. El plámido codifica la resistencia a
ambos los antibióticos tetraciclina y beta-lactama.
El cassette de expresión contiene copias únicas de cada gen unidas
en tándem. La transcripción de cada gen en un solo ARNm
dicistrónico está dirigida por el promotor phoA de
E.coli (Chang et al., Gene,
44:121-125 (1986)) y finaliza en el terminador
t_{0} del fago lambda (Scholtissek y Grosse, Nuc.Acids
Res., 15:3185 (1987)). Las señales de inicio de traducción para
cada cadena las proporciona las secuencias
Shine-Dalgarno de STII (enterotoxina
termo-estable) de E.coli (Picken et
al., Infection and Immunity, 42:269-275
(1983)).
rhuMAb CD18 se creó por humanización del
anticuerpo monoclonal murina muMAb H52 (Hildreth y August,
J.Immunology, 134:3272-3280 (1985))
utilizando un procedimiento previamente descrito para otros
anticuerpos (Carter et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
89:4285-4289 (1992); Shalaby et al.,
J.Exp.Med., 175:217-225 (1992); Presta et
al., J.Immunol., 151:2623-2632 (1993)).
Brevemente, se aislaron los ADNc que codifican los dominios de
cadenas variables de muMAb H52 ligeras (V_{L}) y pesadas
(V_{H}), utilizando RT-PCR en una línea celular de
hibridoma autorizada por Hildreth (Hildreth y August, obra
anteriormente citada). Las regiones determinantes de
complementariedad (CDR) de muMAb H52 se transplantaron en un gen
marco de anticuerpo humano que codificaba huMAb
UCHT1-1 (Shalaby et al., obra anteriormente
citada) mediante mutágenesis dirigida. Se identificaron los residuos
del marco murino no CDR que pudiesen influir sobre la afinidad del
anticuerpo humanizado con su diana, CD18 humana, utilizando modelos
moleculares. Estos residuos se alteraron mediante mutagénesis
dirigida y se ensayó su influencia sobre la unión de CD18. Aquellos
residuos del marco que mejoraron significativamente la afinidad, se
incorporaron en el anticuerpo humanizado. El vector de expresión
que codificaba la versión humanizada final de muMAb H52 en un
formato Fab' se denominó pH52-10,0 y es un derivado
de pAK19 (Carter et al., Bio/Technology,
10:163-167 (1992)).
El plásmido pS1130 difiere de
pH52-10,0 en la región codificante de cadena
pesada. El extremo C-terminal de la cadena pesada se
extendió desde CysProPro hasta la secuencia bisagra natural
CysProProCysProAlaProLeuLeuGlyGly (SEC ID nº:3) y a continuación se
fusionó con el dominio de cremallera de leucina de 33 residuos del
factor transcripcional GCN4 de levadura. Como se ha descrito
anteriormente, los dominios de cremallera de leucina se dimerizan
para reunir dos moléculas Fab' y promover la formación de complejo
F(ab')_{2}. Los dos residuos cisteína en la región bisagra
de la cadena pesada se unen a continuación por enlace disulfuro a
aquellos de un Fab' adyacente para formar un F(ab')_{2}
unido covalentemente.
Se construyó el plásmido pS1130 en un
procedimiento multi-etapa descrito a grandes rasgos
a continuación:
En primer lugar, se introdujo un origen de
replicación fago filamentoso (f1) en pH52-10,0 para
crear el plásmido pSO858. El plásmido pSO858 se construyó ligando
el fragmento HindIII-HindIII de 1.977 pb, que
contenía el cassette de expresión Fab' del
pH52-10,0, con el fragmento
HindIII-HindIII de 4.870 pb del plásmido pSO191
(denominado phGHr (1-238) en Fuh et al.,
J.Biol.Chem., 265:3111-3115 (1990)).
En segundo lugar, se llevó a cabo la mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos sobre pSO858 para crear el plásmido
zpi1#6. Se extendió la región codificante de cadena pesada para que
incluyese los residuos bisagra de cisteína y el sitio de corte de
la pepsina (CysProProCysProAlaProLeuLeuGlyGly; SEC ID nº:3).
También se introdujo un sitio de restricción NotI. Se confirmó la
secuencia del ADN introducida mediante secuenciación de ADN.
En tercer lugar, se generó un fragmento de ADN
que codificaba el dominio cremallera de leucina de GCN4 flanqueado
por los sitios de restricción NotI y SphI (patente nº WO98/37200
publicada el 27 de agosto de 1998). Este fragmento
NotI-SphI de ADN de 107 pb se clonó posteriormente
dentro de zip1#6, el cual se había cortado de manera similar, con
el fin de crear el plásmido pS1111.
En cuarto lugar, la secuenciación de ADN del
fragmento cremallera de leucina de GCN4 reveló un error en la
secuencia codificante. Se corrigió este error mediante mutagénesis
dirigida por oligonucleótidos y se confirmó mediante secuenciación
de ADN. El plásmido correcto resultante se denominó pS1117.
La etapa final en la construcción de pS1130 fue
restaurar el gen de resistencia a la tetraciclina y eliminar el
origen f1 de pS1117. Esto se consiguió ligando el fragmento
PstI-SphI de 2.884 pb de pS1117 que contenía el
cassette de expresión de la cremallera Fab' con el fragmento
PstI-SphI de 3.615 pb de
pH52-10,0.
Construcción del plásmido pJJ154: El
plásmido pJJ154 (figura 5) es un derivado de pACYC177 que es
compatible con los vectores pBR322. Para construir pJJ154, pJJ153
como se ha descrito anteriormente se digirió con MluI y el
fragmento de vector se ligó con gen endA amplificado por PCR
diseñado para codificar extremos MluI. Se filtró la orientación
correcta del plásmido mediante digestión de enzimas de restricción
con el fin de producir pJJ154.
Se muestra en la figura 5 la construcción de
pJJ153 (un derivado pACYC177 que es compatible con vectores
pBR322). Se insertó el fragmento ClaI/AlwNI de pBR322 en pBAD18
digerido con C1aI/AlwNI (Guzman et al., obra citada
anteriormente) con el fin de producir pJJ70. A continuación, se
llevó a cabo una ronda de mutagénesis dirigida, cambiando HindIII a
StuI con el fin de obtener pJJ75. Se llevó a cabo una segunda ronda
de mutagénesis dirigida para cambiar MluI por SacII, con el fin de
producir pJJ76. A continuación, se ligaron los fragmentos
XbaI/HindIII de pJJ76 y de pBKIGF2B, y se ligaron los fragmentos
XbaI/HindIII de este producto de ligación y del plásmido
lisozima-T4/tac para producir pT4LysAra. A
continuación, se ligó pACYC177, digerido con BamHI
(insertado)/ScaI, con pT4LysAra, digerido con ClaI/HindIII (ambos
extremos con inserción) con el fin de producir pJJ153. Se muestran
en la figura 5 los mapas de pACYC177, pT4LysAra y pJJ153.
Cepas bacterianas y condiciones de
crecimiento: Se utilizó la cepa 33B8 (E.coli W3110
tonA phoA \Delta(argF-lac) 189 deoC degP
ilvG+(kanS)) como el huésped de producción para la
co-expresión de lisozima-T4 y
proteína digestora de ADN del plásmido pJJ154 y la expresión de la
cremallera de rhuMab CD18
F(ab')_{2}-leucina del plásmido pS1130. Se
co-transformaron células competentes de 33B8 con
pJJ154 y pS1130 utilizando procedimientos estándar. Se escogieron
los transformantes de placas LB que contenían 20 \mug/ml de
tetraciclina y 50 \mug/ml de canamicina (LB+Tet20+Kan50), se
purificaron, y se cultivaron en caldo LB con 20 \mug/ml de
tetraciclina y 50 \mug/ml de canamicina en un
incubador-agitador a 37ºC o a 30ºC previamente a su
almacenamiento en DMSO a -80ºC.
Para los controles, se transformó el huésped 33B8
con pS1130 y pJJ96 (análogo a pJJ154 excepto en que no se
insertaron en el vector ácidos nucleicos que codificasen
lisozima-T4 ni producto endA) y se aisló en un medio
selectivo similar.
Proceso de fermentación de cremallera de
rhuMAb CD18 F(ab')_{2}-leucina: Se
preparó un inóculo de matraz agitado mediante la inoculación de
medio estéril con un cultivo stock recién descongelado. Se
añadieron al medio antibióticos apropiados para generar una presión
selectiva que asegurase la conservación del plásmido. En la Tabla 1
se proporciona la composición del medio del matraz agitado de
cultivo. Se incubaron los matraces bajo agitación a,
aproximadamente, 30ºC (28ºC-32ºC) durante
14-18 horas. A continuación, se utilizó este
cultivo para inocular el recipiente de producción fermentativa. El
volumen de inóculo era de 0,1% a 10% del volumen inicial de
medio.
La producción de la cremallera
F(ab')_{2}, precursor de rhuMAb CD18 se llevó a cabo en el
medio de producción que se muestra en la Tabla 2. Se llevó a cabo
el proceso de fermentación a una temperatura aproximada de 30ºC
(28-32ºC) y a un pH aproximado de 7,0
(6,5-7,9). Se establecieron la tasas de aireación y
de agitación para proporcionar una transferencia de oxígeno
adecuada al cultivo. La producción de cremallera
F(ab')_{2}, precursor de rhuMAb CD18 se inició al agotarse
el fosfato en el medio, típicamente 36-60 horas
después de la inoculación.
Ingrediente | Cantidad/litro | |
Tetraciclina | 4-20 mg | |
Triptona | 8-12 g | |
Extracto de levadura | 4-6 g | |
Cloruro sódico | 8-12 g | |
Fosfato sódico, añadido como solución de pH 7 | 4-6 mmol |
Ingrediente | Cantidad/litro | |
Tetraciclina | 4-20 mg | |
Glucosa^{a} | 10-250 g | |
Sulfato amónico^{a} | 2-8 g | |
Fosfato sódico, monobásico, dihidrato^{a} | 1-5 g | |
Fosfato potásico, dibásico^{a} | 1-5 g | |
Fosfato potásico, monobásico^{a} | 0,5-5 g | |
Citrato sódico, dihidrato^{a} | 0,5-5 g | |
Sulfato magnésico, heptahidrato^{a} | 1,0-10 g | |
FERMAX^{TMa} (antiespumante) | 0-5 ml | |
Cloruro férrico, hexahidrato^{a} | 20-200 mg | |
Sulfato de zinc, heptahidrato^{a} | 0,2-20 mg | |
Cloruro de cobalto, hexahidrato^{a} | 0,2-20 mg | |
Molibdato sódico, dihidrato^{a} | 0,2-20 mg | |
Sulfato cúprico, pentahidrato^{a} | 0,2-20 mg | |
Ácido bórico^{a} | 0,2-20 mg | |
Sulfato de manganeso, monohidrato^{a} | 0,2-20 mg | |
Digerido de caseína | 15-25 g | |
Metionina^{a} | 0-5 g | |
Leucina^{a} | 0-5 g | |
^{a}inicialmente, se añadió una parte de estos ingredientes al fermentador, mientras que el resto se introdujo | ||
durante la fermentación. Se añadió hidróxido amónico según se requirió para el control del pH. |
\newpage
El momento de adición de la arabinosa estuvo
comprendido entre 50 y 65 horas después de la inoculación. Se
ensayaron los efectos de adiciones de bolus de 0,1% a 1%
(concentración final) de arabinosa sobre la inducción de la
co-expresión de lisozima-T4 y
endonucleasa endA.
Se dejó fermentar durante aproximadamente 65
horas (60 a 72 horas), después de lo cual se recolectó el caldo
para el tratamiento posterior de recuperación del producto.
Evaluación de la reducción en viscosidad del
caldo mediante sobre-expresión de endonuclease
endA: Alícuotas de caldo de cultivo recolectado de la
fermentación de cremallera de rhuMAb CD18
F(ab')_{2}-leucina con o sin
co-expresión de producto endA, añadida además de la
lisozima fágica descrita anteriormente, se sometieron a un ciclo de
congelación-descongelación. El caldo descongelado
se diluyó 1:3 en agua, o en MgCl_{2} 20 mM, previamente a su
incubación al baño maría con agua a 37ºC bajo agitación. Se
retiraron las muestras a intervalos y se midió la viscosidad del
caldo diluido utilizando un viscómetro de caída de bola.
Efecto de la sobre-expresión
de EndA, añadido además de lisozima-T4, sobre la
viscosidad del caldo: Como se muestra en la Tabla 3, el caldo de
cultivo diluido descongelado-congelado procedente
del proceso de fermentación anterior en ausencia de
sobre-expresión de endA tenía una viscosidad
superior a 800 cP al inicio de la incubación a 37ºC. Tras 60
minutos de incubación, había cambiado poco la viscosidad del caldo
de fermentación diluido con H_{2}O y
congelado-descongelado, mientras que el caldo
diluido con tampón MgCl_{2} mostró una reducción significativa en
la viscosidad del caldo. Tras extender la incubación a 37ºC durante
más de 2,5 horas, se estabilizó la viscosidad del caldo de cultivo
diluido congelado-descongelado sin sobreexpresión de
endA en adición de T4-lisozima en un valor
aproximado de 40 cP. La viscosidad del caldo de cultivo diluido
congelado-descongelado con
sobre-expresión de endA era inferior a 20 cP
incluso antes de su incubación a 37ºC.
Según se describe en el Ejemplo IA, la
sobre-expresión de endA comporta beneficios
significativos en la reducción de la viscosidad de caldo
permeabilizado o lisado. Ayuda a condicionar el caldo de
fermentación para la etapa posterior de recuperación del producto.
Mediante la co-expresión del
lisozima-T4 y gen t, además de endA, las células
pueden lisarse bioquímicamente y al mismo tiempo rendir un caldo
lisado bien preparado con viscosidad de fluido suficientemente baja
y compatible con las etapas de aislamiento del producto, tal como
la centrifugación o la EBA.
El proceso de fermentación descrito anteriormente
se utilizó para producir rhuMAb CD18 como precursor de una
cremallera de F(ab')_{2}-leucina dirigida
por el plásmido pS1130 en E.coli, con la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN dirigida por el plásmido pJJ155 en E.coli.
El producto de fragmento de anticuerpo se secretó y acumuló en el
periplasma. Los enzimas líticos se acumularon en un compartimiento
alejado de su sustrato hasta su liberación por acción del producto
del gen t. El procedimiento deseado de recuperación se concentra en
la fracción soluble de la cremallera de
F(ab')_{2}-leucina liberada del periplasma
para su captura inicial.
Construcción del plásmido pJJ155: De
manera similar a pJJ154, pJJ155 es un derivado de pACYC177 que es
compatible con vectores pBR322. Para construir pJJ155, pJJ154 según
se ha descrito anteriormente, se digirió con KpnI, y el fragmento
del vector se ligó con gen t amplificado por PCR y diseñado para
codificar extremos KpnI. Se seleccionó el plásmido con la
orientación correcta mediante digestión con enzimas de restricción
para producir pJJ155. Se muestra en la figura 7 un mapa de
pJJ155.
Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo: La mayoría de los experimentos se llevaron a cabo con
33B8 transformado según se ha descrito anteriormente, excepto en
que se sustituyó pJJ154 por pJJ155.
Ver Ejemplo IA.
El crecimiento celular de 33B8
co-transformado con pS1130 y pJJ155
(33B8/pS1130/pJJ155) no fue significativamente diferente del
crecimiento del control (33B8 transformado solamente con pS1130).
Tras la adición de 0,5% a 1% de arabinosa a las
50-65 horas para inducir la
co-expresión de los enzimas líticos y la proteína
digestora de ADN, la DO_{550} del cultivo 33B8/pS1130/pJJ155 cayó
con ritmo constante hasta un 30-40% de la densidad
celular máxima, sugiriendo lisis celular.
La Tabla 4 muestra el efecto de la
co-expresión de lisozima-T4 + endA +
gen t sobre la liberación de fragmento soluble de anticuerpo
anti-CD18 hacia el medio. Se ensayó mediante
cromatografía HPLC de intercambio iónico el sobrenadante de la
centrifugación del caldo de cultivo lisado tras incubación en
presencia de EDTA 25 mM para cuantificar el producto. Se encontraron
más de 80% de los fragmentos solubles de anticuerpo
anti-CD18 en la fracción sobrenadante en la
condición experimental en la que se inducía la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN, en comparación con menos de 10% en el control y en
la condición en la que no había gen t (pJJ154) ni disrupción
mecánica.
Co-expresión | % liberado del producto total |
Ninguna (control) | <10 |
Lisozima-T4 + endA (pJJ154) | <10 |
Lisozima-T4 + endA + gen t (pJJ155) | >80 |
La endonucleasa degrada el ADN y reduce la
viscosidad del caldo. La sobre-expresión de la
endonucleasa endógena de E.coli además de la lisozima T4
reduce la necesidad de disrupción celular mecánica para la rotura de
ADN liberado. La liberación de la lisozima fágica del
compartimiento citoplasmático mediada por la proteína de expresión
del gen t inicia el proceso de disrupción bioquímica, resultando en
la lisis de las células y en la liberación del contenido celular,
incluyendo el polipéptido heterólogo, ADN genómico, y proteína
digestora del ADN, la cual había quedado atrapado en el periplasma
o en el citoplasma hasta este momento. Mediante el mantenimiento del
caldo lisado para la digestión apropiada de sustratos mediante la
co-expresión de enzimas líticos y proteína
digestora de ADN, se mejoraron la viscosidad del caldo y la
liberación de producto de la matriz celular para una mejor
recuperación del producto.
Debido a las necesidades a gran escala, se
seleccionó IGF-I como el polipéptido heterólogo
para la evaluación de la recuperación de partículas refráctiles. Se
utilizó la co-expresión de enzimas líticos y
proteína digestora de ADN para mejorar la liberación de las
partículas refráctiles de IGF-I de las estructuras
de pared celular sin utilizar disrupción mecánica.
Tras la lisis celular, además de liberar
lisozima-T4 del compartimiento citoplasmático, el
ADN genómico liberado del citoplasma habría contribuido
significativamente a la viscosidad del líquido lisado del caldo. Por
lo tanto, la co-expresión de una endonucleasa de
E.coli junto con enzimas líticos fue útil en la reducción de
la viscosidad del líquido tras la lisis celular y en la mejora de la
recuperación de producto durante la centrifugación.
Construcción del plásmido pLBIGF57: Se
construyó el plásmido pLBIGF57 para la expresión de
IGF-I (figura 6) a partir de un esqueleto básico de
pBR322. Las secuencias transcripcionales y traduccionales
requeridas para la expresión del ácido nucleico que codifica
IGF-I las proporcionó el promotor phoA y la
secuencia Shine-Dalgarno trp. La secreción de
la proteína la dirigió una variante TIR de la secuencia de señal
lamB. Esta variante TIR no altera la secuencia aminoacídica
primaria de la señal lamB; sin embargo, los cambios silenciosos en
la secuencia nucleotídica resultan, en esta variante particular, en
un nivel incrementado de proteína traducida.
A continuación, se proporcionan los detalles de
la construcción de pLBIGF57. Se construyó una biblioteca de codones
de la secuencia de señal lamB para explorar las variantes de
regiones de inicio de traducción (TIR) de diferente fuerza.
Específicamente, se varió la tercera posición de los codones 3 a 7
de la secuencia de señal lamB. Este diseño conservaba la secuencia
aminoacídica de tipo salvaje y, aún de esta manera, permitía las
divergencias dentro de la secuencia nucleotídica.
Como se ha descrito anteriormente en la
exploración de la biblioteca de codones de secuencia de señal STII
(patente sudafricana nº ZA 96/1688; Simmons y Yansura, Nature
Biotechnology, 14:629-634 (1996)), el producto
del gen phoA sirvió como indicador para la selección de las
variantes TIR de lamB. La biblioteca de codones de la secuencia de
señal lamB se insertó corriente abajo del promotor phoA y
del Shine-Dalgarno trp, y corriente arriba
del gen phoA. Bajo condiciones de baja actividad
transcripcional, la cantidad de fosfatasa alcalina secretada por
cada constructo a partir de este momento era dependiente de la
eficiencia de inicio traduccional proporcionada por cada variante
TIR en la biblioteca. Utilizando este método, se seleccionaron
variantes TIR de lamB que cubrían un intervalo aproximado de
actividades de factor 10. Específicamente, la variante TIR de lamB
#57 proporcionaba un TIR aproximadamente 1,8 veces más fuerte que
los codones lamB de tipo salvaje, según el ensayo de actividad
phoA.
El fragmento de vector para la construcción de
pLBIGF57 se generó mediante la digestión de pBK131Ran con XbaI y
SphI. Este vector XbaI-SphI contiene el promotor
phoA y las secuencias Shine-Dalgarno
trp. Las secuencias codificantes de IGF-I y
el terminador transcripcional t_{0} de lambda se aislaron a
partir de pBKIGF-2B (patente U.S. nº 5.342.763)
después de la digestión con NcoI-SphI. Se aisló la
secuencia de señal lamB a partir de pLBPhoTBK#57 (variante TIR #57;
generada como se ha descrito anteriormente) seguido de la digestión
con XbaI-NcoI. A continuación, se ligaron estos tres
fragmentos para construir pLBIGF57.
Cepas bacterianas y condiciones de
cultivo: La mayoría de los experimentos se llevaron a cabo con
la cepa 43E7 (E.coli W3110 fhuA(tonA)
\Delta(argF-lac) ptr3 degP41(kanS)
\DeltaompT\Delta (nmpc-fepE) ilvG+ phoA+).
Se utilizó un sistema de doble plásmido con plásmido de producto
(pLBIGF57) y pJJ155 para los enzimas líticos. Se
co-transformaron células competentes de 43E7 con
pLBIGF57 y pJJ155 utilizando el procedimiento estándar. Se
escogieron los transformantes tras cultivo en una placa LB que
contenía 50 \mug/ml de carbenicilina (LB + CARB50^{TM}) y 50
\mug/ml de canamicina, se purificaron y cultivaron en caldo LB
con 50 \mug/ml de CARB50^{TM} y 50 \mug/ml de canamicina en
un agitador/incubador a 37ºC, previamente a su ensayo en el
fermentador.
Para la comparación, se utilizaron 43E7
transformadas solamente con pLBIGF57 en el caso control, llevado a
cabo bajo condiciones similares. pLBIGF57 confiere resistencia a
ambas la carbenicilina y la tetraciclina al huésped de producción y
permite que 43E7/pLBIGF57 crezca en presencia de cualquiera de los
dos antibióticos.
Proceso de fermentación: La composición
del medio de fermentación y el protocolo experimental utilizado
para la co-expresión del ácido nucleico que
contenía IGF-I, endA, lisozima-T4, y
gen t en caso de utilizarse, eran similares a los del procedimiento
IGF-I a escala pequeña, de 10 kilolitros, de elevada
tasa metabólica y alto rendimiento. Brevemente, se utilizó un
cultivo original en matraz agitado de 43E7/pLBIGF57 ó
43E7/pLBIGF57/pJJ155 para inocular el medio enriquecido de
producción. A continuación, se describe la composición del medio
(con las cantidades de cada componente utilizadas por litro de medio
inicial):
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Ingrediente | Cantidad/litro |
Glucosa* | 200-500 g |
Sulfato amónico | 2-10 g |
Fosfato sódico, monobásico dihidrato | 1-5 g |
Fosfato potásico, dibásico | 1-5 g |
Citrato sódico, dihidrato | 0,5-5 g |
Cloruro potásico | 0,5-5 g |
Sulfato magnésico, heptahidrato | 0,5-5 g |
Poliol PLURONIC ^{TM}, L61 | 0,1-5 mL |
Cloruro férrico, heptahidrato | 10-100 mg |
Sulfato de zinc, heptahidrato | 0,1-10 mg |
Cloruro de cobalto, hexahidrato | 0,1-10 mg |
Molibdato sódico, dihidrato | 0,1-10 mg |
Sulfato cúprico, pentahidrato | 0,1-10 mg |
Ácido bórico | 0,1-10 mg |
Sulfato de manganeso, monohidrato | 0,1-10 mg |
Ácido hidroclórico | 10-100 mg |
Tetraciclina | 4-30 mg |
Extracto de levadura* | 5-25 g |
NZ Amina AS* | 5-25 g |
Metionina* | 0-5 g |
Hidróxido amónico | según se requiera para el control del pH |
Ácido sulfúrico | según se requiera para el control del pH |
*Inicialmente, se añadió al medio una parte de la
glucosa, extracto de levadura, NZ Amina AS, y metionina, añadiendo
el resto durante la fermentación.
La fermentación fue un proceso alimentado por
lotes en el que se fijaron los parámetros de fermentación de la
manera siguiente:
- Agitación:
- Inicialmente a 800 RPM, incrementando a 1.000 RPM a 8 DO
- Aireación:
- 15,0 slpm
- Control de pH:
- 7,3
- Temperatura:
- 37ºC
- Presión de retorno:
- 0,7 barios
- Carga de glucosa:
- controlada por ordenador utilizando un algoritmo que regulaba la tasa de crecimiento a, aproximadamente, 95% del máximo en las fases tempranas de la fermentación, y que después pasaba a estabilizar la concentración de oxígeno disuelto (DO_{2}) al 30% de saturación del aire a partir de su caída hasta el 30%.
- Carga de nitrógeno complejo:
- Tasa de alimentación constante de 0,5 mL/minuto durante todo el proceso.
- Duración del proceso:
- 40 horas
El tiempo de adición de arabinosa estaba
comprendido entre las 24 y las 36 horas. Se ensayaron adiciones de
bolus entre 0,1 y 1% de arabinosa (concentración final) para
definir la fuerza de inducción necesaria para producir las
cantidades de mayor preferencia de lisozima-T4 para
una mejor recuperación de producto en la etapa de
centrifugación.
Recuperación de partículas refráctiles del
caldo de cultivo: Se recolectó el caldo al final de la
fermentación al observar una caída objetivo de DO_{550}, y se
procesó poco después, o bien se almacenó por poco tiempo a 4ºC
previamente a su utilización. El protocolo de ensayo implicaba
cuatro etapas de procedimiento:
I. Adición de EDTA 1M al caldo de cultivo para
llevar la concentración final de EDTA a 25 mM. El EDTA quela los
cationes divalentes y altera la estructura de la superficie externa
de la célula. Esto hace que la capa de peptidoglicano en el
interior de las células no rotas sea accesible a la degradación por
lisozima-T4 y debilita la pared celular, promoviendo
la lisis de la célula.
II. Mantenimiento del lisado a temperatura
ambiente o incubación a 37ºC para la degradación adicional de la
pared celular. Esta etapa simula los tiempos más largos de
procesamiento asociados con el proceso a escala más grande.
III. Recuperación de partículas refráctiles y
sólidos del lisado mediante centrifugación. Se utilizó la
centrifugación a escala de laboratorio en un rotor GSA
SORVALL^{TM} a diferentes velocidades (3.000 rpm a 6.000 rpm;
equivalente a una RCF de, aproximadamente, 2.500 g a 6.000 g, a
rmax, respectivamente), para recoger los sólidos en forma de
pellet.
Una etapa adicional de lavado de los pellets con
tampón eliminaría el lisado arrastrado por los mismos, y
minimizaría la cantidad de proteínas contaminantes de E.coli
en las preparaciones de partículas refráctiles.
Se evaluó la recuperación de producto en muestras
de sobrenadante y pellet procedentes de la centrifugación del caldo
lisado resuspendido en tampón. Se analizó la cantidad de producto
presente en las muestras mediante un método de HPLC en fase
reversa. Se calculó la eficiencia de recuperación de producto
expresando la cantidad de producto, recuperado en el pellet mediante
la etapa del procedimiento, como un porcentaje del producto total
presente en la combinación de pellet y sobrenadante. Para evaluar
la calidad de las partículas refráctiles recuperadas, se midió la
cantidad de proteína total presente en el pellet y en el
sobrenadante mediante el método de Lowry (J.Biol.Chem.,
193:265 (1951)).
Se evaluó la contribución de la actividad
endonucleasa como la eficiencia de recuperación de sólidos durante
la sedimentación del caldo lisado por centrifugación. Además, se
midió la cantidad de ácidos nucleicos presentes en el pellet y en
el sobrenadante como las lecturas de DO_{260}.
Fermentación y expresión de producto
IGF-I:
La figura 8 muestra, en general, el sistema de
dos plásmidos utilizado en el presente Ejemplo para la
co-expresión de enzimas líticos y endA con
IGF-I utilizando pJJ155. La tasa inicial de
crecimiento de 43E7/pLBIGF57/pJJ155 no mostró diferencias
significativas con la del control 43E7/pLBIGF57. La densidades
celulares máximas alcanzadas en estos caldos fueron similares. Sin
embargo, en comparación con el control, se observó una pérdida
significativa de densidad óptica en los cultivos tras la inducción
para la co-expresión de enzimas líticos, indicando
lisis celular. El examen del caldo de cultivo por microscopía de
contraste de fases mostró que, en comparación con el control de no
co-expresión, había muy pocas células intactas de
E.coli y eran evidentes las partículas refráctiles liberadas
como resultado de la co-expresión de enzimas
líticos y proteína digestora de ADN. Ver las figuras
9A-9E.
Las tasas de respiración en este conjunto de
ensayos eran muy similares al control excepto por la pérdida
continua significativa de tasa de asimilación de oxígeno (OUR) con
pérdida concomitante en kla poco después de la adición de
arabinosa.
El éxito de la técnica de lisis celular
bioquímica según se describe en la presente invención es evidente a
partir de las diferencias observadas en la distribución de ácidos
nucleicos y proteína total entre fracción sólida (pellet) y líquida
(sobrenadante), como resultado de la co-expresión de
los enzimas líticos y la proteína digestora de ADN, en comparación
con el control, sin co-expresión (figuras 10A y
10B, respectivamente). Aumentaron ambos el porcentaje de ácidos
nucleicos totales, calculado a partir de las lecturas de A260, y el
porcentaje de proteína total, según mediciones por el ensayo de
Lowry, en el sobrenadante de centrifugación del caldo lisado
bioquímicamente en comparación con el caldo de control.
Se resume la recuperación de producto bajo las
dos condiciones en la figura 11. En el caldo IGF-I
lisado bioquímicamente, el producto IGF-I fue
liberado junto con polímero ADN degradado al caldo lisado. La
eficiencia de recuperación de las pequeñas y densas partículas
refráctiles aumentó con la RCF utilizada durante la centrifugación.
A medida que aumentaba la fuerza g utilizada, aumentaba el
porcentaje del caldo lisado que se recuperaba como pellet
(expresado como % pellet) (figura 12), al igual que la cantidad de
producto IGF-I en el pellet. A aproximadamente 6.000
x g, cerca del 95% del producto había sido capturado en el
pellet.
Según se da a conocer en el presente documento,
una manipulación simple de la expresión génica durante el proceso
de fermentación resulta en una lisis celular bioquímica que podría
sustituir la disrupción mecánica convencional utilizada
tradicionalmente para la recuperación de producto a escala de
producción. La co-expresión o expresión coordinada
de lisozima-T4 y producto de gen t in vivo
es una técnica altamente efectiva para la desintegración de
células, mientras que la proteína endA
sobre-expresada degrada el ADN que se escapa,
reduce la viscosidad del caldo, y condiciona eficientemente el caldo
lisado para la recuperación de producto en la etapa inicial de
captura del mismo. La lisis celular bioquímica es aplicable a la
recuperación de producto soluble así como de producto insoluble. Es
esencial la acumulación de los enzimas
co-expresados en compartimientos alejados de sus
sustratos hasta el momento deseado para la lisis celular, y esto
constituye un diseño crítico de la invención. La invención
proporciona una reducción significativa en el coste del proceso,
tiempo de procesamiento, y por lo tanto, un coste de oportunidad
respecto a otros productos que puedan compartir las mismas
facilidades de producción.
\newpage
<110> GENENTECH, INC. | |
<120> PROCEDIMIENTO | |
<130> P1711R1PCT | |
<160> 3 | |
<210> 1 | |
<211> 6550 | |
<212> ADN | |
<213> Humano | |
<400> 1 |
<210> 2 | |
<211> 537 | |
<212> PRT | |
<213> Humano | |
<400> 2 |
<210> 3 | |
<211> 11 | |
<212> PRT | |
<213> Artificial | |
<400> 3 |
Claims (11)
1. Procedimiento para la recuperación de
polipéptido heterólogo a partir de células bacterianas, que
comprende:
(a) cultivo de las células, que comprenden un
primer ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo que
está unido a un primer promotor inducible, un segundo ácido
nucleico que codifica la lisozima fágica, un tercer ácido nucleico
que codifica una proteína que muestra actividad digestora de ADN
bajo el control de una secuencia de señal para la secreción de la
proteína digestora de ADN, y gen t, en el que, o bien:
(i) dichos segundo y tercer ácido nucleico y
dicho gen t están operativamente unidos a un segundo promotor
inducible que es el mismo para los tres, y en el que los tres están
unidos sobre el mismo constructo de ácido nucleico, o
(ii) dichos segundo y tercer ácido nucleico están
operativamente unidos a un segundo promotor inducible que es el
mismo para ambos, y en el que ambos están unidos sobre el mismo
constructo de ácido nucleico, y dicho gen t está operativamente
unido a un tercer promotor inducible, o
(iii) dichos segundo y tercer ácidos nucleicos
están operativamente unidos a un promotor constitutivamente débil o
a un promotor con un nivel basal reducido que no requiere de la
adición de un inductor para funcionar como un promotor, y dicho gen
t está operativamente unido a un segundo promotor inducible;
en el que el primer, el segundo y el tercer
promotores inducibles son diferentes entre sí y responden a
inductores diferentes; o bien:
(b) cuando el cultivo se realiza mediante (a)(i)
anterior, adición de un inductor específico para la inducción de la
expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo
a partir del primer promotor inducible, y a continuación, adición
de un inductor específico para el segundo promotor inducible tras
la acumulación de 50% o más de la acumulación máxima del
polipéptido heterólogo a recuperar; o bien
(c) cuando el cultivo se realiza mediante (a)(ii)
anterior, adición de un inductor específico para la inducción de la
expresión del ácido nucleico que codifica el polipéptido heterólogo
a partir del primer promotor inducible, y a continuación, tras la
acumulación del 50% o más de la acumulación máxima del polipéptido
heterólogo a recuperar, adición de un inductor específico para el
segundo promotor inducible, y a continuación, adición de un inductor
específico para el tercer promotor inducible; o
(d) cuando el cultivo se realiza mediante
(a)(iii) anterior, adición de un inductor específico para la
inducción de la expresión del ácido nucleico que codifica el
polipéptido heterólogo a partir del primer promotor inducible, y a
continuación, adición de un inductor específico para el segundo
promotor inducible, tras la acumulación del 50% o más de la
acumulación máxima del polipéptido heterólogo a recuperar; y
(e) recuperación de polipéptido heterólogo
acumulado del caldo lisado producido de esta manera.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el polipéptido heterólogo es un polipéptido de mamífero,
preferentemente un polipéptido humano; en particular, en el que el
polipéptido humano es el factor del crecimiento similar a insulina
I (IGF-I), ADNasa, factor del crecimiento vascular
endotelial (VEGF), o anticuerpo anti-CD18 o
fragmento del mismo; en particular, en el que el polipéptido humano
es IGF-I o un fragmento de anticuerpo
anti-CD18.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que se utiliza una secuencia de señal para secretar el polipéptido
heterólogo hacia el periplasma de las células bacterianas; en
particular, en el que la secuencia de señal es una secuencia nativa
de la proteína digestora de ADN.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la proteína digestora de ADN es una ADNasa eucariótica o endA
bacteriana.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la lisozima fágica es lisozima de fago T4.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el polipéptido heterólogo es soluble en el espacio periplásmico
y la etapa de recuperación se realiza utilizando un proceso de
adsorción de lecho expandido o centrifugación; en particular, en el
que el polipéptido heterólogo es un anticuerpo
anti-CD18 o un fragmento del mismo.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que, previamente a la recuperación, se incuba el caldo lisado
durante un tiempo suficiente para liberar el polipéptido heterólogo
contenido en las células.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la recuperación comprende la sedimentación de partículas
refráctiles que contiene el polipéptido heterólogo o la recolección
del sobrenadante que contiene polipéptido heterólogo, dependiendo
de si el polipéptido heterólogo es soluble o insoluble.
9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que las células bacterianas son células
Gram-negativas; en particular en el que las células
bacterianas son E. coli.
10. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa de recuperación tiene lugar en presencia de un
agente que altera la pared celular externa de las células
bacterianas; en particular en el que el agente es un agente
quelante o zwiterión.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que uno o más de los ácidos nucleicos, o el gen t, incluyendo el
promotor de los mismos, están integrados en el genoma de las
células bacterianas.
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US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
WO2001050526A1 (en) * | 1999-12-30 | 2001-07-12 | Intel Corporation | Optimized driver layout for integrated circuits with staggered bond pads |
US6784558B2 (en) * | 1999-12-30 | 2004-08-31 | Intel Corporation | Semiconductor device inlcluding optimized driver layout for integrated circuit with staggered bond pads |
MXPA04001566A (es) * | 2001-08-27 | 2004-05-17 | Genentech Inc | Un sistema para expresion y ensamblado de anticuerpos. |
US20030198682A1 (en) * | 2002-02-12 | 2003-10-23 | Gruber James V. | Composition and method for protecting labile active components during high temperature drying |
US9453251B2 (en) | 2002-10-08 | 2016-09-27 | Pfenex Inc. | Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens |
US7195611B1 (en) * | 2002-12-31 | 2007-03-27 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Rapid exchange balloon catheter having a reinforced inner tubular member |
US20060134739A1 (en) * | 2003-03-11 | 2006-06-22 | Chatterjee Deb K | Synthesis of proteins by cell-free protein expression |
EP1687324B1 (en) | 2003-11-21 | 2012-08-22 | Pfenex, Inc. | Improved expression systems with sec-system secretion |
EP2412816B1 (en) | 2004-07-26 | 2014-12-03 | Pfenex Inc. | Process for improved protein expression by strain engineering |
MX2007001847A (es) * | 2004-08-16 | 2007-04-13 | Nature Technology Corp | Cepas mejoradas de e.coli para la produccion de adn de plasmido. |
US20060156998A1 (en) * | 2005-01-19 | 2006-07-20 | Shawn Bridy | Protective collar for animals |
KR101067525B1 (ko) | 2005-12-22 | 2011-09-27 | 제넨테크, 인크. | 헤파린 결합 단백질의 재조합 생산 |
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CA2677179C (en) * | 2007-01-31 | 2016-02-16 | Dow Global Technologies Inc. | Bacterial leader sequences for increased expression |
US9580719B2 (en) | 2007-04-27 | 2017-02-28 | Pfenex, Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
US9394571B2 (en) | 2007-04-27 | 2016-07-19 | Pfenex Inc. | Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins |
US9017966B2 (en) | 2007-05-23 | 2015-04-28 | Nature Technology Corporation | E. coli plasmid DNA production |
WO2009124012A1 (en) * | 2008-03-31 | 2009-10-08 | Dow Global Technologies Inc. | A design for rapidly cloning one or more polypeptide chains into an expression system |
ES2370947B1 (es) * | 2009-12-23 | 2012-11-02 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Sistema de autolisis celular para el procesado de la biomasa bacteriana en la produccion de polihidroxialcanoatos en pseudomonas putida kt2440 |
KR101222889B1 (ko) | 2010-02-25 | 2013-01-17 | 고려대학교 산학협력단 | 이중프로모터를 포함하는 발현 시스템 및 그 시스템을 이용한 유전자 과다 발현 방법 |
WO2013147043A1 (ja) * | 2012-03-29 | 2013-10-03 | 株式会社シノテスト | 核酸の検出又は定量方法及び検出又は定量用試薬キット |
GB201208367D0 (en) | 2012-05-14 | 2012-06-27 | Ucb Pharma Sa | Biological product |
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BR112018070139A2 (pt) * | 2016-03-29 | 2019-02-05 | Geltor Inc | expressão de proteínas em bactérias gram-negativas em que a razão entre o volume periplasmático e o volume citoplasmático é entre 0,5:1 e 10:1 |
US11180541B2 (en) | 2017-09-28 | 2021-11-23 | Geltor, Inc. | Recombinant collagen and elastin molecules and uses thereof |
GB201814590D0 (en) * | 2018-09-07 | 2018-10-24 | Oxford Biomedica Ltd | Viral vector production system |
JP2022024197A (ja) * | 2018-09-28 | 2022-02-09 | Spiber株式会社 | 組換え細胞、組換え細胞の破砕方法及び目的タンパク質の製造方法 |
KR20210151930A (ko) | 2019-04-12 | 2021-12-14 | 젤터, 인코포레이티드 | 재조합 엘라스틴 및 이의 제조 |
CN114829578A (zh) * | 2019-08-05 | 2022-07-29 | 瓦克化学股份公司 | 用于在发酵方法中释放重组蛋白的细菌菌株 |
WO2021202479A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Novozymes A/S | Submerged fermentation process |
EP3926039A1 (en) * | 2020-06-17 | 2021-12-22 | AB Enzymes GmbH | Use of a nuclease for reducing the viscosity and/or preventing an increase in viscosity of a fermentation broth |
WO2023019197A1 (en) * | 2021-08-11 | 2023-02-16 | Duke University | Rapid expression and purification of thermostable proteins including taq polymerase |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4595658A (en) | 1982-09-13 | 1986-06-17 | The Rockefeller University | Method for facilitating externalization of proteins synthesized in bacteria |
US4637980A (en) | 1983-08-09 | 1987-01-20 | Smithkline Beckman Corporation | Externalization of products of bacteria |
EP0155189A3 (en) | 1984-03-16 | 1987-09-16 | Genentech, Inc. | Expression of cell wall degrading proteins and host cells harboring dna encoding such protein |
DE3507648A1 (de) | 1985-03-05 | 1986-09-11 | Klöckner-Humboldt-Deutz AG, 5000 Köln | Vorrichtung und verfahren zum warmhalten von fluessigen metallschmelzen |
JPH0640832B2 (ja) | 1985-05-10 | 1994-06-01 | 味の素株式会社 | インタ−ロイキン2ポリペプチドの回収方法 |
SE8505027D0 (sv) * | 1985-10-24 | 1985-10-24 | Kabigen Ab | A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production |
US5169772A (en) | 1988-06-06 | 1992-12-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Large scale method for purification of high purity heparinase from flavobacterium heparinum |
US5512456A (en) * | 1990-05-25 | 1996-04-30 | James Madison University | Method for the improved production and recovery of poly-β-hydroxybutyrate from transformed Escherichia coli |
RU2043415C1 (ru) | 1992-02-18 | 1995-09-10 | Биотехнологическая компания "Биосервис" | ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК |
RU2071503C1 (ru) | 1992-02-18 | 1997-01-10 | Биотехнологическая компания "Биосервис" | ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК |
RU2071501C1 (ru) | 1992-02-18 | 1997-01-10 | Биотехнологическая компания "Биосервис" | Вектор реl25а, предназначенный для экспрессии чужеродного днк |
WO1994012214A1 (en) * | 1992-12-01 | 1994-06-09 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized antibodies reactive with cd18 |
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