MX2007001847A

MX2007001847A - Cepas mejoradas de e.coli para la produccion de adn de plasmido.

Info

Publication number: MX2007001847A
Application number: MX2007001847A
Authority: MX
Inventors: James A Williams; Clague P Hodgson
Original assignee: Nature Technology Corp
Priority date: 2004-08-16
Filing date: 2005-08-15
Publication date: 2007-04-13
Also published as: US8748168B2; JP2008509704A; EA010864B1; KR20070053268A; IL181319A0; WO2006026125A2; NZ553658A; ZA200701265B; EP1781801A4; CA2577419A1; BRPI0515418A; AU2005280356B2; US20070249042A1; WO2006026125A3; CN101035905A; EP1781801A2; EA200700415A1; AU2005280356A1

Abstract

Se describe un metodo general y cepas de bacterias, por medio de los cuales es posible purificar dramaticamente el ADN de plasmido con respecto al ADN y ARN genomicos. En una modalidad preferida, la lisis y retiro de nucleasas de los acidos nucleicos del huesped es un componente integral del proceso de fermentacion/cosecha, y como tal, logra el rendimiento y pureza incrementados con purificacion simplificada corriente abajo y reducidas corrientes de desecho, reduciendo asi los costos de produccion.

Description

CEPAS MEJORADAS DE E. COLI PARA LA PRODUCCIÓN DE ADN DE PLÁSMIDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de moléculas de ADN recombinantes circulares covalentemente cerradas (ccc) tales como plásmidos, cósmidos, cromosomas bacterianos artificiales (BACs) bacteriófagos, vectores virales e híbridos de estos y más particularmente es un método para la purificación de dichas moléculas de ADN separándolas de las moléculas de ácido nucleico contaminantes asociadas con la fermentación. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de moléculas de ADN recombinantes circulares covalentemente cerradas (ccc) . Tales moléculas son útiles en la biotecnología, organismos transgénicos, terapia genética, vacunación terapéutica, agricultura y vacunas de ADN. Con la invención en mente, se condujo una investigación de la técnica anterior. Durante mucho tiempo, los plásmidos de E. coli han sido la única fuente más importante de moléculas de ADN recombinantes utilizadas por los investigadores y por la industria. Actualmente, el ADN de plásmido es cada vez más importante ya que la siguiente generación de productos biotecnológicos (medicinas genéticas y vacunas de ADN) están haciendo camino en los estudios clínicos y, eventualmente, en el mercado farmacéutico. Las vacunas de ADN de plásmido pueden encontrar aplicación como vacunas preventivas para enfermedades virales, bacterianas o parasitarias; agentes inmunizantes para la preparación de productos de globulinas hiper inmunes; vacunas terapéuticas para enfermedades infecciosas; o como vacunas para el cáncer. Los métodos básicos para obtener plásmidos (por fermentación bacteriana) y para su purificación por el método de lisis alcalina son bien conocidos (Birnboim, HC, Doly J. 1979 Nucleic Acids Res . 7:1513-1523). Inicialmente, la pasta de células bacterianas fermentadas se resuspende y se lisa (utilizando una combinación de hidróxido de sodio y dodecilsulfato sódico) , después de lo cual se neutraliza la solución mediante la adición de sal acídica ( e . g. , acetato de potasio) , el cual precipita el ADN bacteriano y la mayoría de los residuos celulares. La mayor parte del ADN de plásmido de superhélice permanece en la solución, junto con el ARN bacteriano contaminante, el ADN y las proteínas, así como con la endotoxina de E. coli (lipopolisacárido, o LPS) . Alternativamente la lisis que utiliza tratamiento térmico/lisozima en la presencia de detergente no-iónico se ha utilizado para liberar el ADN intacto de plásmido. Las células también se pueden lisar, y liberarse los ácidos nucleicos, utilizando la exposición a alta presión de los fluidos supercríticos o por el tratamiento con solventes orgánicos, o detergentes. Estos métodos de lisado liberan impurezas celulares, lo cual requiere entonces etapas de purificación para su retiro. También, las metodologías de lisis alcalina o lisis celular por desnaturalización térmica que se utilizan actualmente en la elaboración de ADN de plásmido son costosas, ineficientes y crean grandes corrientes de desechos tóxicos. No se han desarrollado métodos de lisis alternativos, de costo efectivo. La fracción soluble se separa después por filtración y se somete a una variedad de etapas de purificación, las cuales pueden incluir: digestión de RNasa; cromatografía (filtración en gel de intercambio iónico, hidroxiapatita, filtración en gel, interacción hidrofóbica, fase inversa, HPLC, etc.); diafiltración; extracción orgánica, precipitación selectiva, etc. Los procesos de purificación de plásmido corriente abajo después de la lisis que se ejemplifican descritos en la técnica reducen los niveles de ADN genómico a 0.01-1% o menos. Los siguientes procesos descritos en la técnica no son una lista exhaustiva e incluyen las etapas de reducción de ADN genómico que se especifican: 0.01% de genómico con hidroxiapatita (Wils P, y Ollivier, M. 2004 Patente E.U. 6730781), 0.05% de genómico con cromatografía de interacción hidrofóbica (Nochumson S, Durland R, Yu-Speight A, Welp J, Wu K, y Hayes R. 2001 Solicitud de Patente de E.U. 2001/0034435; Diogo MM, Querioz JA, Monteiro, GA, Martins SAM, erreira, GNM y Prazeres DMF. 2000 Biotech Bioeng 68:576-583), 1% de genómico con precipitación de sulfato de amonio (McNeilly DS.2001 Patente E.U. No. 6214586), 0.2% de genómico con cromatografía de exclusión de tamaño (Lemmens R, Olsson U, Nyhammar T. y Stadler J. 2003. J Chromatography B 784:291-300) , <1% de genómico con ultrafiltración de flujo tangencial (Bussey LB, Adamson R y Atchley A. 2000 Patente E.U. No. 6011148), <1% de genómico con precipitación diferencial de polietilenglicol (Marquet M, Horn N, Meek J y Budahazi G. 1996 Patente E.U. No. 5591064), precipitación de CTAB y absorción de LRA de griolita (Lander RJ, Winters MA y Meacle FJ. 2002 Solicitud de Patente E.U. 2002/0151048), 0.1% de genómico con cromatografía de triple hélice (Crouzet J, Scher an D y Wils P. 2001 Patente E.U. No. 6287762) . La introducción de ADN de plásmido en humanos presenta algunas consideraciones y retos especiales, los cuales han sido tratados en la guía de reglamentación de la FDA, incluyendo los Puntos a considerar sobre las vacunas de ADN de plásmido para las indicaciones preventivas de enfermedad infecciosa (Food and Drug Administration, Centro de Evaluación e investigación Biológica. 1996 Puntos a considerar sobre las vacunas de ADN de plásmido para las - indicaciones preventivas de enfermedades infecciosas CASO NO. 96N-0400, y la Food and Drug Administration, Centro de Evaluación e Investigación Biológica. Guía 1998 para la industria: Guía de terapia celular somática y tratamiento génico en humanos.). Estos documentos muestran las preocupaciones acerca de las diferentes sustancias contaminantes y sugieren pruebas que se pueden utilizarse para evaluar los niveles de cada contaminante. Sin embargo, los documentos de la guía se detienen bruscamente, de sugerir los niveles máximos aceptables de ARN, ADN o proteínas contaminantes, ya que estos se desconocen. Sin embargo, el límite permisible de ADN genómico sería de 0.00001% si los 100 pg de ADN genómico/especificación de la dosis requerida actualmente por las guías de la FDA para drogas de proteína recombinante (FDA. 1993 Puntos a considerar en la caracterización de líneas celulares usadas para la producción de biológicos) se aplicaron a una dosis de vacuna de ADN de 1 mg. Esto está varios niveles de logaritmos más abajo que las preparaciones estándar de ADN de plásmido a gran escala (0.01-5% de ADN genómico) y no se pueden lograr utilizando las metodologías de elaboración de costo efectivo actualmente disponibles. Se requieren nuevos métodos para producir reducciones adicionales en el ADN genómico. Los ácidos nucleicos se pueden eliminar al principio del proceso (e.g., por digestión de nucleasas), o - más tarde (e.g., por separación cromatográfica). Hasta fechas recientes, una práctica relativamente común fue el uso de ribonucleasas pancreáticas de bovino (RNasa A) en el amortiguador de lisis, para degradar el ARN. Aunque ésto fue razonablemente efectivo para reducir la cantidad y tamaño del ARN, también introdujo la RNasa de fuente bovina, la cual es indeseable desde un punto de vista reglamentario, ya que se podría contaminar con agentes prion, notablemente con el agente de encefalitis espongiforme de bovino (BSE) . Ciertamente, existe un creciente deseo de efectuar fermentaciones y purificaciones de productos bacterianos (propuestos para uso humano o animal) completamente bajo condiciones libres de productos animales (APF) . Actualmente, conocemos enzimas comerciales que no son altamente efectivas para degradar específicamente el ADN genómico de E. coli mientras que dejan intacto el plásmido de superhélice (nucleasas de plásmido seguro' ) . Ocasionalmente, sin embargo, las nucleasas tales como las enzimas de exonucleasas Rec BCD dependientes de ATP (Qiagen Large Construct Kit Handbook, Junio 2003; Wahle, S, Schorr J, y Weber M. 2001 Patente E.U. 6242220; Isfort RJ 1992 BioTechniques 12: 798-804) se agregan a preparaciones de ADN plásmido parcialmente purificadas. En un procedimiento referido, la preparación de plásmido crudo se somete a tratamiento térmico para desnaturalizar todo el ADN no circular a la forma monocatenaria, después se agregan exonucleasas monocatenarias tales como nucleasas SI, nucleasas de poroto mung, nucleasas Pl, exonucleasas T7, nucleasas Bal31, Exonucleasas I, Exonucleasas III, Exonucleasas VII o Exonucleasas Lambda (Hyman ED. 1992 Solicitud de Patente Mundial 92/13963) . Estas enzimas DNasa no se pueden agregar directamente a la lisis (como con la RNasa, ya que estas enzimas generalmente son más frágiles que la RNasa y se inactivarían en un ambiente alcalino/SDS . Tales procedimientos son, por lo tanto, costosos e imprácticos para la elaboración de plásmido a escala comercial . A fin de superar los obstáculos que existen con la adición de nucleasas purificadas a las preparaciones de ADN de plásmido, se han desarrollado procedimientos alternativos que utilizan nucleasas endógenas para retirar el ADN genómico. Los primeros métodos indujeron un daño general al ADN ( e . g. , radiación ultravioleta para reparar huéspedes deficientes (Sanear A, Hack AM y Rupp WD. 1979 J Bacteriol . 137:692-693), o irradiación ionizante (MacPhee DG, Radford, AJ y Reanney DC. 1988 Patente de E.U. No. 4755464) en la que los plásmidos sobreviven debido a una probabilidad más baja de daño (i.e., objetivo más pequeño que el genoma) con respecto al cromosoma; la degradación, mediada por nucleasas endógenas (e.g., RecBCD) , procede de los sitios de fragmentación del ADN en el genoma. Se ha reportado un sistema más específico que utiliza endonucleasas de restricción para desdoblar el ADN genómico, en donde la actividad de las endonucleasas de restricción es controlada por una metilasa termosensible. El cambio en la temperatura restrictiva, inactiva la metilasa, lo que lleva al desdoblamiento del ADN genómico y a la subsecuente digestión de exonucleasas endógenas (Hanak, J, Alexis J y Ward JM. 2001 Solicitud de Patente Mundial WO 01/29209) . Sin embargo, el nivel de reducción genómica es modesto con estos métodos y sería necesario que los plásmidos fueran genéticamente modificados para que carecieran de los sitios relevantes de restricción, por lo que este método no tiene utilidad general. Se han desarrollado cepas especializadas de E. coli , las cuales expresan nucleasas recombinantes en el espacio periplásmico a fin de no interrumpir la expresión genética de E. coli durante el crecimiento celular. En un caso se dirige la RNsa pancreática de bovino al espacio periplásmico por medio de una señal de secreción. Después de la lisis, la RNsa se mezcla con el ARN, degradándolo (Cooke GD, Granenburgh RM, Hanak JAJ, Dunnill P, Thatcher DR, Ward JM. 2001 A J. Biotechnology 85:297-304). Este sistema se utiliza para reducir los niveles de ARN durante la lisis alcalina. Este método no proporcionó reducción alguna en el ADN genómico por este método. Se han desarrollado sistemas similares para sobreexpresar las nucleasas Estafilococales periplásmicas (Cooke GD, Cranenburgh RM, Hanak JAJ, Ward JM. 2003 J. Biotechnology 101:229-239; Huis an GW, Luo LZ y Peoples OP. 2004 Solicitud de Patente E.U. 2004/0014197; Boynton ZL, Koon JL, Brennan EM, Clouart JD, Horowitz DM, Gerngross TU y Husman GW. 1999 Pseudomonas putida . Appl . Environ . Microbiol . 65:1524-1529) o nucleasas endógenas EndA periplásmica de E. coli (Leung WS y Swartz JR. 2001 EU6258560) para reducir la contaminación por ácidos nucleicos de la proteína u otras preparaciones de biomateriales . Estos sistemas no son de plásmido seguro y requieren procesos suaves de purificación de las proteínas y amortiguadores para la actividad. La inducción de las DNasas de plásmido seguro en el cultivo de fermentación se trata en un contexto teórico por Kelly 2003 (Kelly WJ. 2003 Biotechnol Appl Biochem 37:219-223), pero no se especifica una metodología o nucleasa. Se han desarrollado líneas celulares autolíticas para facilitar la producción de proteínas (Leung y Swartz, Supra, 2001) . En esta línea celular, la lisozima se expresa por la célula en el citoplasma y se libera en el periplasma en el momento deseado por la co-expresión de un holin (péptido o proteína que se extiende sobre la membrana) que crea un canal que permite la filtración de lisozima, y otras proteínas citoplásmicas, del citoplasma al periplasma. En la técnica se conocen ejemplos de combinaciones lisozima/holin que se pueden utilizar. Algunas combinaciones de lisozima/holin se tratan en Young 1992 (Young R. 1992 Microbiol . Molec. Reviews, 56:430-48) y se incluyen en la presente mediante la referencia. Las proteínas fago lambda de lisis se han utilizado en líneas celulares autolíticas para la producción de proteínas (Leung y Swartz, Supra, 2001) . Las condiciones de autolisis, en oposición a la lisis alcalina o térmica, no desnaturaliza selectivamente el ADN genómico. El producto de la lisis es muy viscoso, creando problemas para el procesamiento. Para la producción de proteínas, no se agregan nucleasas específicas o se expresan periplásmicamente en la cepa (e.g. nucleasas de extremo A, Leung y Swartz, Supra, 2001; nucleasa Staphylococcus; Cooke et al, Supra, 2003, Huisman et ai, Supra, 2005, Boynton et al , Supra, 1999) para reducir la viscosidad después de la lisis celular. Tales sistemas no podrían ser utilizados para la producción de plásmido. Los procesos de purificación utilizados en la elaboración de ADN de plásmido son costosos, ineficientes y crean grandes corrientes de desechos tóxicos. Los niveles residuales de ADN genómico exceden grandemente los estándares de productos comerciales aceptables actualmente. Estas limitaciones colocan una carga de costo y pureza en la comercialización de los procesos de producción de ADN de plásmido. Aún en vista de la técnica anterior, existe aún una necesidad de un método de costo efectivo para la reducción de ADN genómico. Igualmente, se necesita un proceso de purificación simplificado, menos costoso que reduzca el uso de químicos costosos o tóxicos. EXPOSICIÓN DE LA INVENCIÓN La invención es un método para la producción de ADN, en el cual una o más nucleasa (s) de plásmido seguro que codifican genes se insertan en el genoma bacteriano y que se expresan como proteína secretada dentro del espacio periplásmico. Cuando se cultiva un plásmido o replicón de ADN en las células, la nucleasa se reintroduce en el citoplasma, eliminando los ácidos nucleicos distintos al replicón deseado, facilitando la purificación del replicón. En una modalidad preferida, la nucleasa es una nucleasa quimérica. En otra modalidad preferida, la nucleasa quimérica es una ADNasa con al menos una porción de una enzima RNasa como un socio de fusión. Aún otras modalidades preferidas utilizan una enzima quimérica que fusiona la exonucleasa T5 D15 de fago con RNasaA o RNasaS. En una forma preferida del método, la(s) nucleasa (s) se dirige al espacio periplásmico por medio de un péptido de señal o proceso equivalente, y las células se autolisan de tal forma que se digiere el ADN genómico bacteriano y/o el ARN y el ADN del replicón introducido no se digiere, lo que facilita la purificación del replicón introducido. Aún en otras modalidades preferidas, la autolisis se logra también a través del uso de proteínas fago de lisis que se expresan en las células o a través del uso de antibióticos. La invención incluye cepas de bacterias que tienen al menos una nucleasa de plásmido seguro, con o sin un socio de fusión y un plásmido, cuya purificación se facilita por la nucleasa de plásmido seguro. SUMARIO DE LA INVENCIÓN Es un propósito y/o un objetivo de la presente invención proporcionar las composiciones del tema y un proceso de purificación de plásmidos. Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para reducir impurezas de ácido nucleico en el ADN de plásmido purificado. Aún otro objetivo de la invención es reducir los costos de producción de la purificación de ADN de plásmido. Aún otro objetivo y/o propósito de la invención es reducir las corrientes de desechos tóxicos en la purificación de ADN de plásmido. Otra exposición son los procesos de producción de plásmido mejorados que, comparados con los procesos definidos en la técnica se mejoran por: el incremento en la calidad del plásmido por los niveles reducidos de las versiones cortadas (circular abierto) o linealizada del plásmido; la producción simplificada que utiliza etapas robustas de producción; la producción simplificada a través de la eliminación de múltiples etapas de producción; la reducción del costo a través de la eliminación de múltiples etapas de producción; el incremento en la calidad del plásmido por la reducción de impurezas de ácido nucleico después de la purificación del plásmido debido a la eliminación de contaminantes clave corriente abajo del proceso; cumplimiento mejorado de las reglamentaciones por la eliminación del ADN genómico de las preparaciones finales de plásmido; cumplimiento mejorado de las reglamentaciones por la eliminación de materiales provenientes de productos animales tales como la ribonucleasa A; y cumplimiento mejorado de las reglamentaciones por la eliminación de corrientes de desechos tóxicos . Otros objetos y ventajas de la invención se harán evidentes después de considerar los dibujos y la siguiente descripción. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DE DIBUJOS La Figura 1 ilustra la digestión de plásmido desnaturalizado y ADN genómico de E. coli mediante exonucleasa T5. La Figura 2 muestra el vector pVEXSapIstuffer La Figura 3 revela un método para la amplificación direccional y la clonación de las secuencias de ADNc en los vectores pVEX. La Figura 4 ilustra el vector pVEXSapIOmpAStuffer . La Figura 5 muestra el vector pVEXBSapIOmpAStuffer . La Figura 6 revela el vector pVEXBOmpARNasa. La Figura 7 ilustra el vector pVEXB0mpAT5RNasa. La Figura 8 muestra el retiro de la exonucleasa T5RNasa del ADN genómico. Se muestra una foto en gel de las preparaciones de ADN de plásmido, con y sin el uso de gen (es) de exonucleasa T5 y RNasa preferidos. La Figura 9 ilustra el uso de la asociación de S-péptido y S-proteína para hacer la quimera RNasaS-T5. La Figura 10 demuestra la hidrólisis de ácido nucleico por una nucleasa quimérica. La Figura 11 muestra la reducción de ARN con construcciones de Spéptido-T5 + Sproteína y T5RNasa. La Figura 12 revela la reducción de ARN y ADN genómico con una construcción de Spéptido-T5 + Sproteína. La Figura 13 ilustra la liberación de contenidos citoplásmicos de E. coli a través del poro del gen E PhiX174. La Figura 14 muestra el vector stuffer nativo pACYCB . La Figura 15 ilustra el vector pACYCB del gen E. La Figura 16 muestra la liberación de plásmido mediada por la proteína de lisis del gen E. La Figura 17 ilustra la eliminación de nucleasa del ADN genómico después de la autolisis inducida por antibióticos . La Figura 18 ilustra el uso de huéspedes de producción que expresan nucleasa periplásmica en la elaboración de plásmido. La Figura 19 ilustra el uso de huéspedes de producción que expresan nucleasa periplásmica en un proceso de producción de plásmido autolítico. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Regresando ahora a los dibujos, la Figura 1 muestra la digestión de plásmido desnaturalizado y ADN genómico de E. coli mediante exonucleasa T5 en una preparación de plásmido a gran escala: 1) marcador del peso molecular de ADN [la banda más grande es de 12 kilobases]; 2) Muestra de plásmido en proceso, de la preparación de plásmido a gran escala; 3) La misma muestra, reacción de exonucleasa T5 de control sin adición de exonucleasa T5; 4) La misma muestra, digerida con 2% p/p de exonucleasa T5. La banda inferior es de superhélice, la banda media es una mezcla de dímero de superhélice y monómero cortado, la banda superior es una mezcla de dímero cortado y ADN genómico. El ADN genómico y el plásmido cortado se retiren cuantitativamente de la banda media y superior. Se observan resultados similares con 1% p/p de exonucleasa T5. En la Figura 2 se ilustra el vector pVEXSapIstuffer . En la Figura 3 se ilustra un método para la amplificación direccional y clonación de las secuencias de ADNc en los vectores pVEX: A) Plásmido que contiene dos únicas etiquetas de dirección, creadas por digestión con enzimas clase IIS localizadas entre los cortes; y B) Iniciador típico que contiene una señal de reconocimiento de la enzima clase IIS ( SapI) , al menos un nucléotido interpuesto y una región superpuesta con una secuencia única, no-palindrómica (GGG, la etiqueta de dirección en este ejemplo) . En la Figura 4 se ilustra el vector pVEXSapIOmpAStuffer . En la Figura 5 se muestra el vector pVEXBSapIOmpAStuffer. En la Figura 6 se ilustra el vector pVEXBOmpARNasa. En la Figura 7 se muestra el vector pVEXBO pAT5RNasa . En la Figura 8 se muestra el retiro de la exonucleasa T5RNasa de ADN genómico. Se ilustra una foto en gel de las preparaciones de ADN de plásmido, con y sin gen (es) de exonucleasa T5 y RNasa preferidos: Las vías 1, 5 y 9 son inducidas por T5RNasa; las vías 3, 7 y 11 son no-inducidas por T5RNasa; las vías 2, 6 y 10 son inducidas por RNasa; y las vías 4, 8 y 12 son no-inducidas por RNasa. Las muestras 1-8 son ácidos nucleicos de lisis post alcalina preparadas con Qiagen. Las muestras 9-12 son ADN total de extracción rápida. Las muestras 5-12 provienen de células almacenadas a 4° C, mientras que las muestras 1-4 provienen de células almacenadas a -20° C. La M) marca el marcador del peso molecular del ADN. La banda más grande es de 12 kilobases. Desde la parte superior, la banda de peso molecular más alto es ADN genómico (gADN) , mientras que la siguiente banda es ADN de plásmido de dímero de superhélice [pADN(2x)], la siguiente banda es ADN de plásmido de monómero de superhélice (pADN) y la banda de migración más rápida es ARN (ARN) . La flecha en la vía 1 destaca la reducción de ADN genómico . En la Figura 9 se muestra una ilustración del uso de la asociación de S-péptido y S-proteína para hacer la quimera RNasaS-T5. En la Figura 10 se muestra la hidrólisis de ácido nucleico por una nucleasa quimérica. En la Figura 11 se muestra la reducción de ARN con construcciones de Spéptido-T5 + Sproteína y T5RNasa. Los lisados alcalinos se prepararon de cultivos inducidos de células DH5a que contenían los plásmidos indicados, se precipitaron ácidos nucleicos con etanol y se resolvieron en 1% de gel de agarosa. Se detectó ARN (banda principal) por post-tinción con Verde SYBR II (Sondas Moleculares) : Vía 1 = pVEXB0mpAS-péptidoT5 + pACYCBOmpASProteína; Vía 2 pVEXB0mpAT5-Spéptido + pACYCBOmpASProteína; Vía 3 pVEXBPhoARNasa; Vía 4 = pVEXB0mpA 5R asa; Vía 5 pVEXB0mpAT5; y Vía 6 = pVEXBPhoA (desplazamiento de estructura) RNasa (control negativo). En la Figura 12 se muestra la reducción de ARN y ADN genómico con construcción de Spéptido-T5 + Sproteína.

Los lisados alcalinos se prepararon de cultivos inducidos (vías 1-4 y 6) y no inducidos (Vía 5) de células DH5a que contenían los plásmidos indicados, los ácidos nucleicos precipitados con etanol y reducidos en 1% de gel de agarosa. El ARN y ADN se detectaron por post-coloración con Verde SYBR II: Vía 1 = pVEXBOmpAS-péptidoT5; Vía 2 = pVEXBOmpAS-péptidoT5 + pACYCBOmpASProteína; Vía 3 = pACYCBOmpASProteína; Vía 4 = pVEXBPhoASpéptido-T5; Vía 5 = pVEXBPhoASpéptido-T5 + pACYCBOmpASproteína (no inducida) ; y Vía 6 = pVEXBPhoASpéptido-T5 + pACYCBOmpASproteína (inducida) . Las flechas destacan la reducción en la banda de ARN (inferior) y la banda de ADN genómico (superior) en la Vía 2. En la Figura 13 se muestra la liberación de contenidos citoplásmicos de E. coli a través del poro del gen E PhiX174. En la Figura 14 se muestra el vector stuffer natural pACYCB. En la Figura 15 se ilustra el vector pACYCB del gen E. En la Figura 16 se muestra la liberación de plásmido mediada por proteína de lisis del gene E. Las células cultivadas con el gen E pACYCB + pDNAVACCUltra-EGFP de 1 son no-inducidas, 2 son inducidas 40 min con arabinosa: A = ácidos nucleicos totales (pellet) ; B = ácidos nucleicos totales (pellet) restantes después de la extracción del amortiguador Pl; C = ácidos nucleicos extraídos con Pl (50 mM Tris, lOmM EDTA, pH 8); D = ácidos nucleicos LB (medio); ácidos nucleicos extraídos con PBS; F = ácidos nucleicos extraídos con 10 mM Tris pH 8.5; G = ácidos nucleicos extraídos con 50 mM de fosfato sódico, 0.3 M de NaCl pH 7; y H = ácidos nucleicos extraídos con 10 mM de MgCl2. La M) marca el marcador del peso molecular del ADN. La banda más grande es de 12 kilobases. Desde la parte superior, la banda de peso molecular más alto es ADN genómico (gADN) , mientras que la siguiente banda es ADN de plásmido de dímero de superhélice [pADN(2x)] y plásmido de monómero cortado, la siguiente banda es ADN de plásmido de monómero de superhélice (pADN; flecha) y las bandas que migran más rápido son ARN (ARN) . En la Figura 17 se muestra la eliminación de nucleasa del ADN genómico después de la autolisis inducida por antibiótico: Vía 1 = marcador del peso molecular de ADN; Vía 2 = ADN total después de la autolisis (pACYCBT5RNasa + cepa gWizGFP) ; Vía 3 = ADN total después de la autolisis (stuffer pACYCBNativo + cepa gWizGFP) ; y Vía 4 = Muestra de la Vía 2, después de incubar 30 min a 37° C. La flecha destaca la banda de ADN genómico eliminada en la cepa T5RNasa. En la Figura 18 se muestra el uso de huéspedes de producción que expresan nucleasa periplásmica en la elaboración de plásmido. El formato 1 utiliza un pretratamiento anterior a la lisis celular para eliminar el ADN genómico, el plásmido cortado o lineal y/o ARN, mientras que el formato 2 utiliza un post-tratamiento (o tratamiento concurrente) después de la lisis celular para eliminar el ADN genómico, plásmido cortado o lineal y/o ARN. En la Figura 19, se ilustra el uso de huéspedes de producción que expresan nucleasa periplásmica en un proceso de producción de plásmido autolítico. Definiciones autolisis: métodos de lisis que causan que la célula pase por autolisis, tal como la lisis celular inducida por ß lactama, efecto fantasma inducido por la proteína de lisis de fago phiXl74, lisis celular inducida por T4 o fago lambda por la co-expresión de lisozima de fago/holin de fago, etc. ccc: Circular Covalentemente Cerrado enzima quimérica: fusión entre una enzima y una - segunda proteína, por ejemplo una fusión de exonucleasa T5 D15 de fago y fragmentos de o la RNasa A de bovino completa. replicón de ADN: plásmidos, cósmidos, cromosomas bacterianos artificiales (BACs) , bacteriófagos, vectores virales e híbridos de éstos. Banda de fantasma: ADN ccc desnaturalizado. pADN: ADN de plásmido Proteinas de lisis de gos: Las proteínas causan que la célula experimente su propia lisis o efecto fantasma tal como el efecto fantasma inducido por la proteína de lisis de fago phiX174 o lisis celular inducida por T4 o coexpresión de lisozima ? bacteriófaga-holin. plásmido: plásmidos, cósmidos, cromosomas bacterianos artificiales (BACs) , bacteriófagos, vectores virales e híbridos de éstos. Nucleasa de plásmido seguro: exonucleasa que degrada varias formas de ADN, pero no de ADN circular covalentemente cerrado (ccc) incluyendo ADN de plásmido. RNasa: ribonucleasa RNasaA: ribonucleasa A pancreática de bovino T5 exonucleasa: exonucleasa bacteriofaga T5 D15 La invención se refiere a los métodos para reducir el ADN genómico durante la purificación del ADN de plásmido (pADN) utilizando la bacteria gram-negativa E. coli, como huésped de producción, utilizando un vehículo mecánico de - fermentación . Un problema importante de la tecnología de purificación ha sido la separación de ADNp del ADN genómico de E. coli . La invención es un método para reducir el ADN genómico durante el aislamiento del ADN circular covalentemente cerrado (ccc) . Se ha desarrollado un procedimiento de costo efectivo que utiliza nucleasas en la elaboración de plásmido. Una nucleasa de ?plásmido seguro' se secreta en el espacio periplásmico, con lo que se protege a la célula durante el crecimiento celular y hay un control para evitar que la nucleasa y el ADN genómico se pongan en contacto en la recolección o durante la lisis celular. Modalidades preferidas de la producción de nucleasa En una modalidad preferida de la invención (Figura 10) , una o más enzimas hidrolíticas de ?plásmido seguro' especializadas (tales como la exonucleasa T5 D15, exonucleasa RecBCD, otras exonucleasas dependientes de ATP, Exonucleasa III, Exonucleasa VII o enzimas quiméricas, híbridas) se secretan dentro del espacio periplásmico por medio de un péptido de señal o su equivalente, en donde después de que la enzima (s) permanece fija hasta que se completa el crecimiento celular y la inducción/producción de ADNp. Después de la reunión controlada de la enzima con el contenido citoplásmico (a través de la ruptura de la membrana o el re-ingreso controlado al citoplasma) , la enzima digiere o hidroliza los materiales bacterianos no deseados, tales como ácidos nucleicos (ADN, ARN) , proteínas, carbohidratos, lipopolisacáridos, etc.), que producen un ADN de plásmido sustancialmente purificado. Se pueden utilizar nucleasas naturales. Cualquier nucleasa de plásmido seguro se puede utilizar tal como RecBC (Exonucleasa V) , y exonucleasas RecBCD, exonucleasas RexAB o AddAB gram positivo relacionadas, exonucleasas Archeon ( e . g. , Geobacillus kaustophilus AddAB) otras exonucleasas dependientes de ATP, Exonucleasa III, Exonucleasa VII. Esta no es una lista exhaustiva y se contemplan las nucleasas de E. coli o de otra fuente bacteriana, archeon o eucariótica. Se prefieren las nucleasas tales como la exonucleasa T5 D15 de fago que eliminan las bandas de fantasma' . En el caso de nucleasas termofílicas de plásmido seguro, es probable que no sea necesario secretar la nucleasa al periplasmo, si la actividad de la enzima se reduce suficientemente a la temperatura requerida para el crecimiento. Esto permitiría que se utilizaran metodologías de reducción genómica adicionales, tales como el tratamiento térmico (42-95° C) durante la fermentación. La invención contempla el uso de exonucleasas de ?plásmido seguro' que digieren el ADN genómico y preferiblemente el ADN de plásmido desnaturalizado y cortado, sin digerir el ADN de plásmido de superhélice.

- Preferiblemente, la exonucleasa T5 D15 de fago (exonucleasa T5) es una DNnasa candidato para utilizarla en el procesamiento de plásmido. La exonucleasa T5 no digiere el plásmido de superhélice, pero es capaz de digerir no sólo eA ADN mono y bicatenario lineal (Sayers JR, y Eckstein f. 1990 J. Biol . Chem 265:18311-18317), si no también el ADN con anillos de desnaturalización, tales como el ADN ?de banda fantasma o sombra', el cual retiene frecuentemente la actividad biológica y es retráctil a la digestión enzimática de restricción (Sayers JR, Evans D y Thomson JB. 1996 Anal. Biochem. 241:186-189). Nosotros hemos demostrado que la exonucleasa T5 purificada se puede utilizar para eliminar específicamente todas las especies de ADN sin superhélice presentes en las muestras de una preparación de plásmido a gran escala 81 gm) (Figura 1) . Las nucleasas quiméricas también se contemplan. Esto se podría efectuar potencialmente por la asociación de la enzima nucleasa con un socio de fusión que es resistente en si mismo a la inactivación o eliminación durante la lisis alcalina u otras metodologías contempladas para la preparación de plásmido a gran escala. El socio de fusión puede ser cualquier proteína o péptido que confiere la propiedad deseada de estabilización o localización. En una modalidad preferida, se utiliza una nucleasa quimérica, en la que se fusiona una exonucleasa T5 D15, una nucleasa de plásmido seguro' , a un socio de fusión. Por ejemplo, la RNasa A pancreática de bovino es resistente a la inactivación o eliminación durante el procedimiento rudo de preparación de plásmido de lisis alcalina. También, la RNasa A expresada en E. coli se recupera en forma activa en sobrenadantes aclarados de la lisis alcalina. Alternativamente, también se contempla la fusión a tioredoxina (Lu Z, DiBlaio-Smith EA, Grant KL, Warne NW, LaVallie ER, Collins-Racie LA, Follettie MT, Williamson MJ y McCoy JM 1996 J Biol . Chem . 271:5059-5065) , el dominio de solubilización de la C-terminal de alfa-sinucleina (Kim JS . 2003, Solicitud de Patente E.U. 2003/0125522; Park SM, Ahn KJ, Jung HY, Park JH y Kim J. 2004 Protein Eng. Des Sel . 17-251-60), el Ftr termoestable de Methanopyrus kandler (de Marco A, Casatta E, Savaresi S, Geerlof A. 2004 J. Biotehnol . 107:125-33) o a otras proteínas que incrementan la estabilidad de los socios de fusión (Zhou P, Alexey L y Wagner G. 2003 Solicitud de Patente E.U. 2003/0092885; Sanders MC 2002. Solicitud de Patente E.U. 2002/0142384) . Más preferentemente, sería deseable combinar las actividades enzimáticas de la RNasa y DNasa en una manera que fuera compatible con los procedimientos del procesamiento de ADN. Una forma de hacer esto sería desarrollar cepas de bacterias en las que las enzimas híbridas, que al menos contengan actividades de RNasa y DNasa, se co-expresen. A fin de que este procedimiento sea exitoso, sería necesario secretarlas inicialmente dentro del periplasma (para proteger a la célula de la nucleolisis) y proteger la enzima DNasa de perder su actividad durante la lisis. En la presente, demostramos la eliminación del ADN y ARN genómico durante la producción de plásmido en varias líneas celulares que expresan la exonucleasa T5 periplásmicamente localizada fusionada con RNasaA o RNasaS . Hemos demostrado que estas enzimas de fusión tienen aplicación en la eliminación de los ácidos nucleicos contaminantes durante el procesamiento de plásmido por lisis alcalina, autolisis o extracción. El uso de exonucleasa T5 en un huésped de producción para mejorar la producción de ADN de plásmido no se sugiere ni está implicado en la técnica anterior. La combinación de nucleasas RNasa y DNnasa en una nucleasa quimérica tampoco se sugiere en la técnica anterior. Adicionalmente, el uso de nucleasas quiméricas en la producción de plásmido no se sugieren en la técnica anterior. Las fusiones nuevas de exonucleasa T5 y RNasa reportadas en la presente permiten la reducción simultánea de dos contaminantes importantes de ácido nucleico. Además de combinar dos elementos importantes, el elemento RNasa mejoró inesperadamente la actividad de la porción DNasa (Figura 12) . Este resultado sinérgico mejora el desempeño de la nucleasa quimérica contra las construcciones originales no fusionadas.

También, una entidad proteínica única es más fácil de genomanipular dentro de las líneas celulares de producción, y controlar durante la expresión, que los dos componentes (e.g., RNasa y exonucleasa T5)que no se asocian. Modalidades preferidas del proceso de producción de plásmido Las células que expresan una nucleasa de plásmido seguro se producen en cultivo de fermentación. Después de la producción, el plásmido se purifica a partir de las células. La purificación de plásmido puede utilizar preferiblemente los métodos de lisis alcalina, lisis térmica o lisis mecánica descritos en la técnica. La reducción de ADN genómico puede ocurrir antes y/o durante y/o después de la lisis. La reducción genómica también puede ocurrir durante la extracción del plásmido, como bajo choque osmótico (Baker M, Taylor M y Uppal S. 2003 WO 03/046177A1) en donde la nucleasa periplásmica o secretada, de la invención, elimina el ADN genómico durante la extracción de ADN de la célula. La cepas que contienen nucleasa de plásmido seguro se utilizan en dos formatos preferidos de purificación de plásmido (formatos 1 y 2, Figura 18) . El formato 1 incluye la eliminación de ADN genómico (y ARN con nucleasas quiméricas) antes de la lisis celular (fase pre-tratamiento) . La nucleasa se introduce en el citoplasma después de la producción (i . e . permeabilización de la membrana interna) . Hemos demostrado la reducción de ARN y ADN genómico en lisis alcalina con pre-tratamiento (formato 1) utilizando construcciones 0mpAS-péptidoT5 + OmpASProteína (Figuras 11-12) y construcciones 0mpAT5RNasa (Figura 8) . Los factores inducibles de la ruptura de la membrana tales como holins bacteriófagos o químicos o detergentes que rompen la membrana se pueden utilizar potencialmente en tándem para introducir selectivamente las enzimas hidrolíticas directamente en el citoplasma al final del ciclo de fermentación, antes de que comience el procesamiento. Este pre-tratamiento permitirá cierto control sobre el grado de digestión dentro de la célula antes del procesamiento de la pasta celular. Esta mejora eliminará la necesidad de proteger las enzimas de los reactivos de lisis (ya que estarían activos antes de la lisis) . De la misma forma, en este formato las nucleasas endógenas tales como RecBCD pueden participar en la degradación del ADN genómico objetivo. El formato 2 incluye la eliminación de ADN genómico (y ARN con nucleasas quiméricas) sin la adición de una etapa definida de pre-tratamiento. La reducción de ADN genómico se puede presentar durante la preparación celular o durante o después de la lisis. Si la reducción se presenta después de la lisis, podría ser necesaria la estabilización de la enzima a través de las condiciones de lisis celular y del posttratamiento subsecuente para activar la enzima. En el caso de la lisis térmica y la lisis alcalina, esta podría requerir mayor termoestabilidad o estabilidad del SDS alcalino, respectivamente y el intercambio subsecuente de amortiguador para eliminar la alta concentración de EDTA y SDS. Hemos demostrado la reducción de ARN y ADN genómico en la autolisis sin pre-tratamiento (formato 2) utilizando la construcción 0mpAT5RNasa (Figura 17) . El formato 2 también promete métodos alternativos de lisis tales como lisis mecánica en presencia de agentes de compactación (Wilson RC y Murphy JC. 2002 Solicitud de Patente E.U. 20020197637), o lisis mecánica con microfluidificación (homogenizador impinging-jet) o molido de microesferas (Jem KJ 2002 Patente E.U. No. 6455287) que no requieren la termoestabilidad o estabilidad de SDS alcalino. En una modalidad preferida, las células se lisan utilizando autolisis. Un método de autolisis es la alteración de las células por la adición de agentes de alteración de la pared celular, tales como antibióticos B lactama, a la fermentación. Alternativamente, la lisozima, o los antibióticos peptídicos codificados por fago, se pueden producir por la cepa huésped para alterar la célula. La lisozima recombinante se puede expresar por la célula en forma citoplásmica y liberarla al periplasma en el momento deseado por la co-expresión de un holin (péptido o proteína que expande la membrana) que crea un canal que permite la filtración de lisozima y otras proteínas citoplásmicas, del citoplasma al periplasma. Ejemplos de combinaciones lisozima/holin que se pueden utilizar se conocen en el campo y se incluyen en la presente mediante la referencia. Las condiciones de autolisis, en oposición a la lisis alcalina o térmica, no desnaturalizan selectivamente el ADN genómico. El producto de la lisis es muy viscoso, creando problemas para el procesamiento. En la presente demostramos la nueva observación de que la autolisis, tal como la lisis mediada por antibiótico o bacteriófago, en la presencia de una nucleasa de plásmido seguro produce la eliminación selectiva de ADN genómico y disminuciones en la viscosidad (Figura 17). Esta combinación de autolisis con una nucleasa de plásmido seguro no se sugiere ni está implicada en la técnica. Ciertamente, quizá no se han contemplado métodos de autolisis para su uso en la producción de plásmido debido a los elevados niveles de contaminación del ADN genómico presente sin las nucleasas de plásmido seguro de la invención. Los métodos actuales de autolisis se han contemplado para utilizarlos únicamente en la producción de biomoléculas no de ADN y frecuentemente incorporan nucleasa no específica para eliminar el ADN de plásmido y genómico.

- - Las nucleasas de plásmido seguro de la invención facilitan el nuevo uso de varios métodos de autolisis para la elaboración a gran escala de ADN de plásmido. La purificación de plásmido autolítico también resuelve el problema que se había pensado previamente como insoluble, es decir, la eliminación de la lisis celular múltiple y de las etapas de clarificación en el procesamiento de plásmido. Un proceso típico de purificación de plásmido se puede abreviar dramáticamente y hacerlo de costo efectivo por la incorporación de la purificación autolítica (Figura 19) . Esto elimina los reactivos tóxicos y múltiples elementos (etapas) de la purificación de plásmido sin pérdida de la capacidad. Producción de nucleasas La expresión del gen de nucleasa se puede conducir por medio de promotores constitutivos o, más preferiblemente, inducibles. Los promotores inducibles que se prefieren incluyen, pero no están limitados a, PR y PL ?, otros promotores bacteriófagos tales como los promotores sintéticos, T5, T7 tales como tac y tre, promotores endógenos tales como lac, promotores de choque frío (cspA) , araBAD, promotores de fase estacionaria o de inanición, tasa de crecimiento (rmf) pH (cadA) o promotores sensibles a la anoxia (nar) . La inducción se puede efectuar por incremento en la temperatura (PL, tac) , disminución de la temperatura (cspA; promotor de choque frío) con represores termoestables (represor lambda, represor lac) , inductores (IPTG para tac, tre y lac; Arabinosa para AraBAD) u otros medios (e.g. ingresar en fase estacionaria, cambio de pH o de oxígeno, inanición de glucosa o aminoácido; revisado en: Makrides SC. 1996 Microbiol . Rev. 60:512-538). Alternativamente, el gen puede ser inducido por un ARN de hebra no codificante regulada. En el campo se conocen varios péptidos de señal con objetivo periplásmico o extracelular y se incluyen en la presente mediante la referencia (e.g. Choi JH y Lee SY. 2004 S Appl . Microbiol . Biotechnol . 64:625-635). Los péptidos líderes que se ejemplifican para llegar al periplasma son OmpA, PhoAOmpT y PelB. La nucleasa también puede estar anclada en la membrana utilizando marcadores de anclaje conocidos, tales como la "expresión periplásmica anclada" que utiliza líderes tales como el líder NlpA y los seis primeros aminoácidos (Harvey BR, Georgiou G, Hayhurst A, Jeong KJ, Iverson BL y Rogers GK. 2004 Proc. Natl . Acad. Sci . 101:9193-9198). Alternativamente, la nucleasa se puede secretar de la célula al medio de crecimiento y ponerse en contacto con el ADN genómico durante la lisis. Alternativamente, las nucleasas se pueden genomanipular para mejorar la actividad o estabilidad, o - - dividir durante la purificación (Collen A, Ward M, Tjerneld F y Stalbrand H. 2001 J. Chromatogr. A. 910:275-84), utilizando mutagénesis dirigida al sitio, la adición de pequeños marcadores peptídicos de objetivo o de evolución dirigida (Zhao H, Chockalinga K y Chen Z. 2002 Curr. Opin . Biotechnol . 13:104-10) utilizando procedimientos de alimentación molecular (Ness JE, Kim S, Gottman A, Pak Rf Krebber A, Borchert TV, Govindarajan S, Mundorff EC y Minshull J. 2002 Nat . Biotechnol . 20:1251-5; Kurtz an AL, Govindarajan S, Vahle K, Jones JT, Heinrichs V, Patten PA. 2001 Curr. Opin . Biotechnol . 12:361-70). Existen dos clases de proteínas fago porin que producen poros de membrana. Estos son conocidos en la literatura y se incluye una lista no limitante de porins potenciales para la práctica de la invención, en la presente mediante la referencia (Young 1992, Supra; Wang I?, Smith DL y Young R. 2000 Annu . Rev. Microbiol . 54:799-825). Una clase es de bacteriófagos de AD? bicatenerio tales como bacteriófago T4 y lambda de E. coli, o bacteriófago LL-H de Lactobacillus . A estas proteínas porin se les llama holins y se juntan en la membrana citoplásmica, para crear poros para las proteínas que digieren la pared celular que se liberarán en el periplasma. Estos orificios varían de pequeños (proteína T4 t que sólo apenas parece ajustarse a la lisozima que se filtra del citoplasma al periplasma) a suficientemente grandes de manera que las proteínas >100 kd tales como B galactosidasa pueden pasar (lambda S, diámetro interior del poro >10-12 nm, similar en tamaño a las citotoxinas de esteptinomicina O/listerialisina 0. Nosotros contemplamos el uso de cepas de producción utilizando estas porins y lisozima en combinación con nucleasas de plásmido seguro de la invención para la elaboración de plásmido. Se han creado cepas de autolisis que utilizan estas porins para la producción de proteínas (Leung y Swartz, Supra, 2001) , pero su uso en la producción de plásmido no se ha descrito en la materia. Alternativamente, el bacteriófago ADN monocatenario, tal como PhiXl74, produce una sola proteína de lisis (gen E) requerida para la liberación de bacteriófago. Esta proteína y las proteínas de lisis de otros bacteriófagos de ADN monocatenario, pueden inhibir la formación de la pared celular de manera similar a la penicilina (revisado en: Bernhardt TG, Wang IN, Struck DK y Young R. 2002 Res . Microbiol . 153:493-501). El producto del gene E forma un canal de diámetro uM entre las membranas externas e internas, sellando efectivamente el periplasma y vierte no-líticamente el contenido citoplásmico incluyendo el ADN de plásmido (Witte A y Lubitz W. 1989 Eur. J. Biochem. 180:393-398), dentro del medio (Figura 13; revisado en: Young R, Wang IN y Roof WD. 2002 Trends Micro . 8:120-128). El sistema de gen E phiX174 se utiliza para hacer fantasmas bacterianos, para la administración de la vacuna de ADN o antígeno (Jalava K, Iko FO, Riedmann E y Lubitz W. 2003 Expert Rev. Vaccines 2 : 45-51) . Para la administración de vacuna de ADN, los fantasmas se llenan de nuevo con ADN de plásmido. Se han desarrollado métodos para la elaboración de fantasmas basados en la observación de que el crecimiento en magnesio alto (e.g. O.lM MgS04) previene la lisis. La elaboración incluye: 1) expresión del gen E en la presencia de mg; 2 ) intercambio de amortiguador de las células; y 3) goteo de magnesio para formar canales y verter el contenido citoplásmico (revisado en Jalava et al . , Supra, 2003). Los fantasmas bacterianos no han sido evaluados para aplicaciones en la elaboración de ADN de plásmido y la integridad del plásmido liberado no se ha evaluado previamente (Witte y Lubitz, Supra , 1989) . Cepas de huéspedes para la expresión de endonucleasa y/o gen autolitico . El gen de nucleasa puede estar en un plásmido que es compatible con el plásmido objetivo o más preferiblemente integrado en el genoma. La genomanipulación de cepas se puede efectuar en cualquier cepa de bacterias que sea apropiada para la producción de plásmido. Las cepas de bacterias que llevan copias integradas de plásmidos de expresión de nucleasa se hacen utilizando una variedad de técnicas, por ejemplo la recombinación de lambda red gam (Murphy KC 1998 J. Bact . 180:2063-2071; Datsenko KA, Wanner BL. 2000 Proc. Natl . Acad. Sci . (E.U.A.); 97:6640-6645) . Esta técnica ha sido utilizada exitosamente en cepas recA tales como DH5a, un huésped común para producción de plásmido. En resumen, el cassette (s) de expresión que incluye un gen lateral de resistencia antibiótica se amplifica por PCR utilizando iniciadores que contienen secuencias homologas al sitio de integración. La cepa DH5a objetivo se transforma con la función de recombinación lambda Red resistente a la ampicilina que contiene pKD46 de plásmido y la producción de recombinasa Red inducida con arabinosa. Las células se preparan y se electroporan con el fragmento de PCR, como se describe. Los recombinantes homólogos se seleccionan con canamicina y se curan de plásmido pKD46 auxiliar al cambiarlos a la temperatura no-permisiva (pKD46 tiene un origen de replicación sensible a la temperatura) y se verifica la pérdida de la resistencia a la ampicilina. Producción de plásmido Se pueden utilizar cepas de E. coli con genes de nucleasa integrados para la elaboración de ADN de plásmido en el cultivo de fermentación. Los procesos de fermentación que se ejemplifican son conocidos en el campo (ver Carnes 2005 para una revisión: Carnes AE. 2005 BioProcess International, Octubre 2005, en imprenta) . La Nature Technology Corporation utiliza procesos de lote y de alimentación por lotes en lotes libres de productos animales (NTC3018) y medio de fermentación alimentación por lotes (NTC3019) optimizado para la producción de plásmido. Estos medios se desarrollaron para sustentar las tasas reducidas de crecimiento y mantener la estabilidad e integridad del plásmido. Se han logrado producciones de plásmido de 1100 mg/l y OD600 de 120 con un proceso automatizado de fermentación de lote alimentado con alimentación controlada para mantener una tasa específica de crecimiento de 0.12/h. Nosotros contemplamos el uso de cepas huésped que elaboran nucleasas de plásmido seguro para producir flujos de alimentación enriquecidas con plásmido del cultivo de fermentación en los procesos de purificación de plásmido que se ejemplifican. La combinación de cepas de nucleasa con fermentación de alto rendimiento y los procesos de purificación que se ejemplifican pueden proporcionar metodologías costo efectivo para reducir más los niveles de ADN genómico a niveles aceptables para las aplicaciones de terapia genética y vacunación de ADN. EJEMPLOS El método de la invención se ilustra más ampliamente en los siguientes ejemplos. Estos son proporcionados por medio de ilustración y sin que se proponga de manera alguna limitar el ámbito de la invención.

Ejemplo 1: vectores de expresión pVEX El vector de expresión proteínico pVEXSapIstuffer se muestra en la Figura 2. El plásmido tiene un origen de replicación pBR322 (eliminación ROP) y marcador de resistencia a la ampicilina. Este vector tiene una expresión inducible conductora del promotor Tac del gen de interés en E. coli .

La expresión es reprimida por el producto genético laclq (codificado en el plásmido) e inducida por la adición de IPTG al cultivo. Los genes de interés se clonan en un stuffer' que consiste de sitios de clonación SapI tipo IIS que generan extremos pegajosos ATG y TAA, como se describe en la Figura 3. Los genes se copian por amplificación de clones o ADN genómico utilizando iniciadores con marcadores genéricos de tratamiento y secuencias específicas de una sola secuencia. Generalmente, los sitios SapI internos en el gen objetivo no son nocivos ya que existe sólo 1/16 posibilidades de que un sitio SapI interno coincida con una de los marcadores de tratamiento. Un derivado de este plásmido, pVEXSapIHNtagstuffer fusiona el gen de interés con un marcador HN de N-terminal seguido por un sitio de desdoblamiento de enterocinasa. Este marcador enlaza una resina por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) de forma similar al marcador his/ (histag) , que se produce por purificación por afinidad. Los genes se amplifican por PCR con iniciadores que incorporan en las terminales de sitios Saplsi para generar extremos pegajosos 5' AAG (último residuo de lisina del sitio de desdoblamiento de la enterocinasa) y 3' TAA 4bp después de la digestión con SapI (New England Biolabs, Beverley New Jersey) . ?jemplo 2: Construcción del vector de secreción pVEXSapIOmpA El péptido de señal de secreción OmpA se genomanipuló en el vector pVEXstuffer de la siguiente manera. Los oligonucleótidos que codifican el péptido de señal de secreción OmpA se renaturalizaron y clonaron en el sitio Ncol del stuffer pVEXSapI para hacer stuffer pVEXSapIOmpA. El clon resultante expresa al líder OmpA que llega hasta la proteína de interés con un líder de 2 aminoácidos (Ala-Thr) antes del codón Met del gen de interés . En la Figura 4 se muestra un gráfico de este vector. Las construcciones citoplásmicss se pueden convertir en construcciones secretadas por la transferencia del fragmento Ncol/Xhol que contienen el gen de interés dentro de su vector. El OmpAHNtagstuffer, que codifica un marcador HN N-terminal se construyó exactamente como se describe arriba utilizando pVEXSapIHNtagstuffer digerido con Ncol para la inserción de oligo renaturalizado.

Ejemplo 3: Construcción del vector de expresión pVEXOmpAHNRasa El gen de RNasa pancreática de bovino se amplificó por PCR de ADN genómico de bovino. Toda la PCR se efectuó utilizando Pfu ADN polimerasa (para evitar la adición de bases extras sobre los extremos de los fragmentos mitigados) utilizando metodologías PCR estándar. El producto PCR de 400 pb se digirió con SapI y los fragmentos de 100 y 300 pb (sitio SapI interno) se purificaron en gel y se clonaron en el vector pVEXOmpAHNstuffer diferido en SapI utilizando metodologías de clonación estándar. Los recombinantes (pVEXOmpAHNRNasa) se verificaron por secuencia. Ejemplo 4: Clonación de exonucleasa T5 El gen de exonucleasa T5 D15 se amplificó por PCR a partir del bacteriófago T5 (ATOC11303-B5) , se clonó y se confirmó la secuencia. El fragmento 900 pb se purificó y utilizó como plantilla para someter a PCR un fragmento compatible con HNstuffer. Estos fragmentos se purificaron y el extremo despuntado se clonó en el sitio Smal del vector pW2.0, un derivado de pUC19 con un polienlazador modificado. Los clones pW2.0-T5 y pW2.0-HNT5 se aislaron y la secuencia se verificó. Ejemplo 5: Construcción del vector de expresión pVEXBOmpAstuffer Se construyó un segundo sistema de expresión con expresión de filtrado más baja y expresión general inducible más baja. Este vector, pVEXBSapIOmpAstuffer contiene el promotor AraBAD y es inducible por adición de arabinosa, en oposición a la inducción IPTG para el promotor tac que contiene el vector original pVEZSapIOmpAstuffer . El promotor Ara BAD y el represor lateral araC se amplificaron por PCR de ADN genómico DH5a. Este producto amplificado (1.3 kb) se digirió con Aarl y se clonó al vector pVEX digerido con JScoRl/XhoI . El clon resultante contenía el operón AraBAD anterógrado del stuffer. La región AraBAD se extirpó con Shol y EcoRI , y los extremos pegajosos mitigados por el llenado con dNTPs y klenow. El fragmento de 1.3 kb se clonó al fragmento de estructura de 2.8 kb de los vectores pVEXSapIOmpAstuffer (bp 247-3108) y pVEXSapIOmpAHNtagstuffer . Los fragmentos de estructura se obtuvieron por purificación de gel del vector digerido con Mlul y Xbal , mitigados con klenow y dNTP y se trataron con CIP. Los clones resultantes se detectaron para orientación del sitio AraBAD por digestión de restricción y se verificaron por secuencia. Las construcciones finales, pVEXBSapIOmpAstuffer (Figura 5) y pVEXBSapIOmpAHNtagstuffer, remplazan el gen laclq y el promotor tac con el represor Ara C y el promotor ara BAD. Ejemplo 6: Construcción de pVEXBOmpAHNRNasa El gen HNRNasa se extirpó de pVEXOmpAHNRNasa por digestión con Ncol/Xhol y se transfirió en Ncol/Xhol digerido con vector pVEXBSapIOmpAHNtagstuffer . Ejemplo 7: Construcción del vector de expresión pVEXBOmpARNasa El marcadorHN se eliminó de pVEXBOmpAHNRNasa por amplificación PCR de todo el plásmido utilizando iniciadores con Aarl. La amplificación PCR produjo un fragmento de PCR de la longitud de un vector. El desdoblamiento del producto de PCR purificado con AarI creó extremos pegajosos compatibles (subrayado doble en los iniciadores) que después de la ligadura creó una eliminación precisa del marcador HN. Los clones de pVEXBOmpARNasa (Figura 6) se aislaron y confirmaron por digestión de restricción y se secuenciaron. Ejemplo 8: Construcción del vector de expresión pVEXBOmpAT5RNasa El marcador HN se eliminó de pVEXBOmpAHNRNasa por amplificación de PCR de todo el plásmido utilizando iniciadores que contienen AarI . La exonucleasa T5 se clonó en el plásmido con intersticio. La amplificación de PCR de pVEXBOmpAHNRNasa dio como resultado un fragmento de PCR de la longitud de un vector. La amplificación de PCR de pW2.0T5 con iniciadores T5-específicos dio como resultado un gen T5 de 900 pb. El desdoblamiento de productos de PCR purificados con AarI creó extremos pegajosos compatibles, los cuales después de la ligadura crearon una eliminación precisa del - marcador HN y la inserción del gen T5. Los clones de pVEXB0mpAT5RNasa (Figura 7) se aislaron y confirmaron por digestión de restricción y se secuenciaron. Ejemplo 9: Digestión con T5RNasa de ADN genómico durante la preparación de plásmido Las líneas celulares DH5a que contienen plásmidos pVEXBOmpARNasa (RNasa) o pVEXB0mpAT5RNasa (TSRNasa) se cultivaron a 37° C en medio líquido LB que contiene 5mM MgS04 y la expresión proteínica se indujo en fase de medio logaritmo (aproximadamente 0.5 OD600/ml) por la adición de arabinosa a 0.2%. Los cultivos se cosecharon después de 4 hrs de inducción a 29° C. Los cultivos no inducidos de control también se proliferaron bajo idénticas condiciones. A las células se les dio forma de pellets y se almacenaron a -20° C durante la noche. Las células del almacenaje a -20° C se deshielaron e incubaron 10 min a 37° C. Las células de 4° C se procesaron sin pre-tratamiento adicional. En las células inducidas por RNasa se observó la lisis, pero no en las células inducidas o no inducidas con T5RNasa. La degradación por ácido nucleico se evaluó en dos ensayos. En el primer ensayo se extrajo el ADN de las células de 4o C utilizando el protocolo de detección rápida de Williams et al . (Williams, J.A. , Langeland, J.A. , Thalley, B., Skeath, J. B. y Carroll, S.B. (1994). Producción y purificación de anticuerpos policlonales contra proteínas expresadas en la clonación de ADN de E. coli : Sistemas de Expresión, IRL Press) . En resumen, las células fueron resuspendidas en amortiguador de rompimiento celular (10 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 M EDTA), se extrajeron con fenol, se trataron con RNasa y se redujeron con ADN en un gel de azarosa al 1% después de la adición de colorante seguidor. En el segundo ensayo se aisló el ácido nucleico total (incluyendo RNasa) utilizando amortiguadores miniprep (Pl, P2, N3) y protocolo Qiagen excepto que la RNasa no se agregó al amortiguador Pl (Cuaderno de miniprep Qiagen QIAprep, Marzo 2002) . Después de preparar un lisado clarificado por centrifugación, el lisado se incubó a 37° C por 10 min, los ácidos nucleicos se precipitaron por la adición de 3 volúmenes de 95% etanol, se colectaron por centrifugación, se lavaron con 70% etanol y se resuspendieron en amortiguador EB Qiagen (10 mM Tris, pH 8.5) que contenía 10 mM de MgS0 . la muestra se incubó 10 min a 37° C, se agregó colorante seguidor y los ácidos nucleicos se resolvieron en un gel de 1% agarosa. Los resultados (Figura 8) demostraron la degradación específica de ?plásmido seguro' del ADN genómico por la fusión de T5RNasa durante la producción de plásmido de lisis alcalina. Las células inducidas fueron viables (proliferación continua después de la inducción) y no se sometió a lisis durante el deshielo. Hay que destacar que la eliminación completa de la banda cromosómica de ADN (banda grande >2 kb) en lisados alcalinos de T5RNasa inducida en las vías 1 y 5 se compararon con los controles no inducidos y de RNasa. No se observó degradación del ADN de plásmido con las muestras almacenadas a -20° C (comparar vías 1 y 3; la banda grande restante en la Vía 1 es dímero de superhélice) mientras que la eliminación completa del ADN genómico y la digestión parcial de ADN de plásmido se observó con las muestras preparadas a 4° C. Esto indica que los diferentes pre-tratamientos (incubación nocturna a 4° C contra las muestras deshieladas y 10 min a 37° C) introducen diferencialmente la nucleasa en el citoplasma. La eliminación parcial del ADN genómico en extractos de ácido nucleico total de T5RNasa también se observó en la Vía 9, pero no de forma tan completa como las muestras pre-tratadas purificadas por lisis alcalina. El gel se detectó y las bandas de las vías 1-4 se integraron y cuantificaron. Los resultados se resumen en la Tabla 1. El nivel de ADN genómico es más bajo en la Vía inducida por RNasa debido a la lisis celular observada. En la muestra de T5RNasa inducida, el ADN genómico está reducido 50 veces, en lo que se refiere a la muestra de T5RNasa no inducida, sin alguna reducción en el nivel de plásmido. Esto demuestra la utilidad de la nucleasa quimérica para reducir el ADN genómico durante el procesamiento de plásmido. Tabla 1: Cuantificación de la banda de gel de las vías 1-4 de la Figura 8 Ejemplo 10: Fusiones de RNasaS-T5 Se crearon otras nucleasas quiméricas de plásmido seguro con exonucleasa T5 utilizando el sistema proteínico S- péptido S-proteína para hacer nucleasas quiméricas útiles para la eliminación de ADN y ARN genómico . En la presente describimos la construcción y evaluación de tales fusiones y se demuestra la utilidad en la elaboración de plásmido. Estas fusiones retienen tanto la RNasa como la actividad aumentada de DNasa, como se muestra abajo. Se ha demostrado la fusión de proteínas heterólogas al S-péptido N-terminal de RNasa A adquiere actividad RNasa Después de la asociación con la S-proteína de RNasa. El S- péptido es el fragmento N-terminal de 20 aminoácidos de RNasa - - A pancreática de bovino que se libera por el desdoblamiento de subtilisina; el fragmento C-terminal (21-124) es la S-proteína. La S-proteína y el S-péptido se unen con alta afinidad (3.1 x 10-11 M en pH 8.3) como RNasa S, la cual tiene actividad enzimática similar a la RNasa7 natural. El sistema de S-marcador (McCormick M y Mierendorf R. 1994 InNovations 1:4-7) es un sistema de purificación de proteínas que se ha utilizado para fusionar proteínas heterólogas a RNasa funcional. El S-marcador es la N-terminal de residuos de 15 aminoácidos del S-péptido y, aún cuando se fusiona con una proteína heteróloga, interactúa con la S-proteína para generar RNasa activa. El S-marcador (y S-péptido) es altamente soluble, se expresa en alto nivel en E. coli y puede mediar la interacción de alta afinidad con la S-proteína cuando se fusiona en cualquiera de las terminales.

Los reactivos, basados en la asociación con S-proteína (análisis Western de inmunotransferencia del S-marcador) o reconstitución de la RNasa S funcional (ensayo Rápido del S-marcador) , están disponibles comercialmente producidos por Novagen para detectar y cuantificar rápidamente las fusiones del S-marcador, o S-péptido. La utilización de este sistema para hacer una nucleasa quimérica se ilustra en la Figura 9. La S-proteína-pVEXB OmpA fusiona la secuencia líder de secreción de OmpA (secuencia de señal) al fragmento de S-proteína de RNasa. Se crearon dos versiones, codificando ya - - sea una fusión de OmpASproteína (16-124) u OmpASProteína (20-124) . Ambas mostraron función similar in vivo . Estas construcciones están diseñadas para liberar el fragmento preciso de S-proteína después del desdoblamiento del líder OmpA durante la secreción periplásmica. El cassette de expresión de estas construcciones se transfirió a pACYC177 (compatible con pVEX) para estudios de co-expresión. El pACYC177 es un número de copia más bajo que pVEX, de manera que se debe elaborar menos S-proteína que S-péptido. Esto es por diseño, ya que el S-péptido se podría requerir para facilitar la replicación de S-proteína. El S-péptido (para asociación con S-proteína) se fusionó con la N-terminal de exonucleasa T5 (S-péptido-T5) para hacer un vector de fusión de S-péptido-T5 secretado (pVEXBOmpA S-péptido-T5) o la C-terminal para hacer un vector T5-S péptido secretado (pVEXBOmpA T5-Spéptido) . Se utilizó OmpA o secuencia líder de secreción de PhoA para liberar con precisión la N-terminal natural del S-péptido. Cuando se co-expresan, los fragmentos de Spéptido y Sproteína están diseñados para asociarse como RNasaS, confiriendo la función RNasa, así como la función DNasa de la exonucleasa T5 fusionada. Ejemplo 11: Fusiones de RNasaS-T5 de purificación de plásmido La estrategia general para reducir el ADN genómico utilizando RNasaS-T5 como un ejemplo, se muestran en la Figura 10. Se ejecutó la expresión y el análisis como se describe en el Ejemplo 9 para T5RNasa. Se observan reducciones en ADN genómico y ARN con líneas celulares que expresan estas fusiones (Figuras 11-12) . La construcción OmpAS péptido-T5, en la presencia de cualquier construcción OmpASproteína (16-124 o 20-124), redujo el ADN genómico y ARN en comparación con cualquier a de las construcciones solas. La construcción OmpAT5-Spéptido fue proteolíticamente sensible (bandas de degradación detectadas por análisis SDS-PAGE) y como se esperaba redujo la actividad RNasa y DNasa en comparación con la construcción OmpASpéptido-T5. Todas las otras construcciones T5 o Spéptido-T5 fueron proteolíticamente estables (una banda del tamaño esperado se observó por el análisis SDS-PAGE) . Esto demuestra el aumento de la actividad de la exonucleasa T5 por asociación con RNasa S, la cual también retiene la actividad RNasa. Ejemplo 12: Construcción del vector de expresión del gen E PhiX174 La proteína del gen E phiX174 se clonó bajo control AraBAD a un plásmido que es compatible con plásmidos de origen pUC de alta reproducción existentes (e.g. gWiz-GFP, pDNAVACCUltra-EGFP) y plásmidos de origen pBR322 (e.g. pVEXBT5RNasa) . El vector pVEXSapIstuffer se digirió con Xbal y - - Mlul . Los extremos pegajosos se llenaron con Klenow y dNTP y se sometieron a aniquilación térmica. Los extremos se desfosforilaron con fosfatasa intestinal de ternera. El fragmento de 2.8 kb se purificó en gel del fragmento de 1.5 kb. El vector pVEXB se digirió con .EcoRI y Xhol. Los extremos pegajosos se llenaron con Klenow y dNTP. El -^fragmento de 1.3 kb que contiene el promotor araB se purificó en gel de los 4.3 kb. Los fragmentos de las etapas 1 y 2 se ligaron, transformaron y detectaron en Amp. El clone (stuffer pVEXB-Nativo) con la orientación correcta se seleccionó por digestión de restricción y se confirmó por secuencia. Vectores pACYCB-natural (Figura 14) y OmpA stuffer El cassette de los vectores de expresión de pVEXBOmpAstuffer y stuffer natural se transfirió a un vector pACYC para permitir la co-expresión con vectores de origen con base pUC y pBR322 (e.g., vectores pVEX y pDNAVACCUltra) . Se preparó plásmido pACYC-RIL tratado con CIP, purificado en gel digerido con Xmnl (fragmento A) . El pVEXBOmpAstuffer y pVEXBnaturalstuffer se digirieron con EcoKL (llenado con Klenow y dNTPs) y los fragmentos más pequeños (pVEXBO pAstuffer es 2703, 1466, Fragmento Bl; stuffer pVEXBnatural ligeramente más pequeño, Fragmento B2) se purificaron. Los fragmentos A, Bl (pACYCBOmpAstuffer) o A y B2 (stuffer pACYCBNativo) se mezclaron y ligaron. Las - ligaduras se transformaron en células DH5a competentes y se seleccionaron en placas agar de cloramfenicol. Los clones y la orientación se confirmaron por digestión de restricción. Gene E pACYCB (Figura 15) La proteína de gen E phiXl74 se amplificó por PCR utilizando 10 ng de ADN genómico phiXl74 como plantilla. Se utilizó renaturalización 5x 45C, 25x 55C, con tiempo de extensión de 1 minuto a 72C y desnaturalizaciónn de 30 segundos a 95C. El stuffer pACYC-Bnatural se digirió con SapI y se purificaron los dos fragmentos (4375, 282, 34) . El fragmento de PCR también se digirió con SapI . Los 3 fragmentos se mezclaron y ligaron. Las ligaduras se transformaron en DH5a y se transformaron en LB+Cloramfenicol+glucosa (0.2%) (la glucosa se agrega para reducir la expresión permeable) . El vector del gen E pACYCBphiX174 se confirmó por digestión de restricción y secuencia. Ejemplo 13: Liberación de plásmido de origen pUC de alta reproducción por efecto fantasma celular inducido por el gen E Las líneas celulares se crearon por transformación de células de E. coli Z competentes (Zymos) con plásmidos purificados y proliferados en placas de agarosa que contenían antibiótico y 0.2% de glucosa (para reducir la expresión permeable del gen E del promotor de arabinosa) . Las líneas celulares se proliferaron en medio LB a 37 °C con 34 ug/ml de cloramfenicol (las cepas contenían el plásmido de expresión del gen E) y/o 50 ug/ml de canamicina (cepas que contenían el plásmido pDNAVACCUltra) o 100 ug/ml de ampicilina (cepas que contenían plásmidos PVEx) y se indujeron en medio logaritmo (aproximadamente 0.5 OD6000/ml) . La inducción por Arabinosa se efectuó por la adición de arabinosa de una concentración de almacén lOOx a 0.2% de concentración final. Los extractos de medios para el análisis en gel se prepararon por 1) uso de medio clarificado o 2) extracción de fenol cloroformo, precipitación por etanol y resuspensión en Te (concentración 20x) . Los extractos de pellet celular para el análisis en gel se prepararon por la resuspensión de la pellet celular en amortiguador (concentración 10-20x) , incubación en una temperatura y duración definidas, seguida por el extracto de fenol cloroformo. Los sobrenadantes se analizaron directamente por electroforesis en gel. Los ácidos nucleicos totales en las pellets celulares se extrajeron utilizando amortiguador de rompimiento celular como se describió en Williams et. al . , Supra , 1994, utilizando una concentración de 10-20 veces (comparada con el volumen de los medios originales) de amortiguador de rompimiento celular y no se agregó RNasa. Los extractos se analizaron para ácidos nucleicos por electroforesis en gel de agarosa, y se visualizó el ARN y ADN por post-coloración con Verde II (Sigma) SYBR diluido 1/10,000. Liberación de ácido nucleico por la expresión de proteinas de lisis del gen E Se elaboraron y evaluaron tres estirpes celulares: 1) pACYC-B-gen E 2) pACYC-B.gen E + pDNAVACCUltra-GFP y 3) pDNAVACCultra-GFP . pDNAVACCultra es un plásmido de origen pMBl altamente complementario resistente a la canamicina, compatible con los plásmidos pACYC. Las células fueron ya sea: A) no inducidas; o B) inducidas con arabinosa a 0.2%; o C) inducidas con arabinosa a 0.2% en la presencia de 0.2 M MgS0 (para inhibir el efecto fantasma). Las células se indujeron durante 30 minutos y se cosecharon alícuotas. Los sobrenadantes se analizaron para ácidos nucleicos por electroforesis en gel de agarosa, y se visualizó el ARN y ADN por post-coloración con Verde II SYBR (Sigma) diluido 1/10,000. Las pellets de cl.5 L de células se resuspendieron en 100 uL de amortiguador TE (10 mM Tris, lmM EDTA, pH 8.0), se incubaron en RT por 1 hr y las células se formaron como pellets. Los extractos celulares TE se analizaron por electroforesis en gel, como arriba. Después de la inducción se observó la liberación del gen E PhiX174 del plásmido (pDNAVACCultra-GFP) en LB y sobrenadante de extracción. También se liberaron el ARN y ADN genómico. La mayor parte del plásmido dentro de las células se liberó de la muestra inducida (sin MgS0 ) dentro - - del medio y del extracto TE. Si el gen E se indujo en la presencia de 0.2 M MgS0 , el plásmido no se liberó en LB, pero se liberó cuando la concentración de Mg se redujo en el amortiguador de extracción TE. Estos experimentos demostraron que el efecto fantasma del cultivo ocurre en presencia de gen E y un plásmido altamente complementario, y que la liberación de plásmido depende de la inducción del gen E. No se liberó plásmido de la línea celular del pDNAVACCUltra solo, lo que demostró que la liberación de plásmido depende del producto de gen E phiX174. Así mismo, la liberación de plásmido en los medios se puede prevenir por la inclusión de 0.2 M MgS0 en los medios. Esto permite que las células sean cosechadas y que el amortiguador se intercambie para eliminar el Magnesio y permitir la liberación de plásmido. Se efectuó un curso de tiempo de la liberación inducida por gen E phiX174 de plásmido pDNAVACCultra-GFP . Se liberó plásmido intacto de las células después de 30-40 min de inducción. El plásmido de pellets inducidos y no inducidos por el gen E phiX174 + pDNAVACCultra-GFP se extrajo con Pl, TE, PBS, EB (10 mM Tris, pH 8.5), BB (50 mM P04, 300 mM NaCl) o 10 mM MgCl2. Bajo todas estas condiciones se extrajo plásmido y ARN y ADN genómico (Figura 16). Con Pl o EB, se extrajo el volumen de plásmido, con poco plásmido restante en la pellet celular después de la extracción (comparar Vía B2 y Bl, Figura 16) . La liberación de plásmido en EB demuestra que no se requiere EDTA para la liberación de plásmido. Esto es conveniente, ya que esto permite el procesamiento sin la liberación de LPS inducida por EDTA durante el procesamiento. Se observaron algunas diferencias en la extracción relativa de plásmido y ADN genómico y la integridad de ARN. Por ejemplo, se extrajo menos ARN con BB, 10 mM MgCl2, y PBS mientras que se extrajo menos ADN genómico y plásmido con 10 mM MgCl2. Estos efectos salinos y catiónicos se pueden mejorar para mejorar la pureza del plásmido liberado. La liberación de gen E phiX174 de pDNAVACCultra-GFP en la presencia de espermina se determinó al comparar la liberación de plásmido en espermina no inducida, inducida e inducida + 10 o 30 mM. La liberación de plásmido y genómico en LB se inhibió con 30 mM de espermina y se inhibió parcialmente con 10 mM. No se detectó ARN en la pellet total o en cualquier elución con 30 mM de espermina. Las células tratadas con espermina fueron resistentes a la extracción de plásmido con Pl, TE o EB, pero se extrajo algo de plásmido de las células tratadas con 30 M de espermina con PBS, BB (50 mM P04, 300 mM NaCl) o 10 mM de MgCl2. Cuando las células inducidas se incubaron durante la noche en RT, se observó la liberación de plásmido en los medios con las tres condiciones de inducción. Se liberó más ARN (o compactó) con espermina y se observó muy poco acortamiento de plásmido después de la incubación nocturna en LB. Esto demostró que el plásmido liberado es estable cuando se almacena en medios. La liberación de plásmido mediada por gen E phiX174 se probó con incubaciones de 30 min de las pellets celulares en RT, 37 °C y 65° C en amortiguador Pl o 50 mM Tris, 10 mM MgCl2, pH 8.0) La liberación e integridad del plásmido no fue afectada en RT, con temperatura de 37°C o 55° C, alguna lisis a 65° C en Pl, con acortamiento del plásmido y genómico incrementado. Se observó cierta degradación de ARN a 37° C comparado con RT con Pl, no Tris/mg. Colectivamente, estos resultados demuestran que la liberación de plásmido inducida por proteína de lisis del gen E es factible para la liberación de alto rendimiento de plásmido intacto de las células . La liberación de plásmido se puede controlar por la alteración de la potencia iónica/pH del amortiguador de extracción, con o sin espermidina, u otros compactadores en medios. El plásmido es estable cuando se libera en los medios o amortiguador de extracción. Esto también demuestra que la célula se pueden intercambiar por amortiguador en una variedad de amortiguadores para liberar plásmido bajo condiciones de eliminación enzimática óptima de ADN/ARN genómico. Sin embargo, se liberan altos niveles de ADN genómico y ARN utilizando este método. Ejemplo 14 : .Eliminación de ADN genómico y ARN liberado por el efecto fantasma celular inducido por proteína de lisis del gen E. Reducción de la nucleasa de ARN y ADN genómico Se elaboraron y evaluaron cinco estirpes celulares: 1) pACYC-B-gen E; 2) pACYC-B-gen E + pDNAVACCUltra-GFP; 3) pDNAVACCultra-GFP; 4) pACYC-B-gen E + pVEXBTSRNasa; y 5) pVEXBT5RNasa. La pVEXBT5RNasa es un plásmido de origen pMBl resistente a la ampicilina de complementariedad moderada, compatible con plásmidos pACYC, que contienen una nucleasa inducible por arabinosa con actividad contra ARN, ADN genómico, pero no contra plásmido de superhélice. Los cultivos fueron ya sea no inducidos o cultivados 70 min después de la inducción (0.2% de arabinosa, para inducir tanto el gen E como T5RNasa) y ácidos nucleicos en sobrenadantes de cultivo y choque osmótico de las pellets celulares, evaluados por electroforesis de gel. En las líneas celulares inducidas que contenían la proteína de lisis del gen E PhiX174 y pVEXBT5RNasa disminuyó mucho el ADN genómico liberado en los medios cuando se indujo T5RNasa. El mismo efecto se observó en las pellets celulares con choque osmótico (5 mM de MgS04, no se muestran los datos) . La liberación de genómico de las células no inducidas se debe a la expresión permeable de la proteína de lisis, que causa el efecto fantasma en valores OD600 altos utilizados para el control no inducido en este experimento. Esto demuestra que - la co-expresión de T5RNasa destruye el ADN genómico liberado por el gen E y que se puede utilizar para mejorar la pureza del plásmido liberado y reducir la viscosidad del lisado. ?jemplo 15: Elaboración de ADN de plásmido utilizando autolisis mediada por proteina del gen E PhiX174 Para la elaboración de plásmido, sería necesario integrar la expresión de los genes porin en el genoma. La expresión del gen porin se puede conducir por promotores inducibles. Los promotores inducibles que se prefieren incluyen, pero no están limitados a, lambda PR y PL, otros promotores bacteriófagos tales como T5, T7, promotores sintéticos tales como tac y tre, promotores endógenos tales como lac, promotores de choque frío (cspA) , araBAD, fase estacionaria o promotores de inanición, promotores de tasa de crecimiento (r f) pH (cadA) o sensibles a la anoxia (nar) .

La inducción se puede lograr por el incremento de la temperatura (PL, tac) , reducción de la temperatura (cspA; promotor de choque frío) con represores termoestables (represor lamda, represor lac) , inductores (IPTG para tac, tre y lac; Arabinosa para AraBAD) u otros medios (e.g. entrada en la fase estacionaria, cambio de pH u oxígeno, inanición de glucosa o aminoácidos, revisado en Makrides SC. 1996) . Alternativamente, el gen se puede inducir por un ARN de hebra no codificante regulado. Se han desarrollado varios sistemas de expresión phiX174 gen E y son sometidos a - - regulación térmica (lambda PR mutado regulado por C1857; Jechlinger W, Szostak MP, Witte A y Lubitz W. 1999 FEMS Micro . Lett . 173: 347-352), frío (lambda PR regulado por C1857 combinado con reguladores lac o bacteriófagos, Jechlinger W, Szostak MP y Lubitz W. 1998 Gene 218:1-7) o químicos (lactosa o IPTG con lacPO/Ptac o 3MBZ con represor xyIS-Ptol) . La liberación de plásmido en los medios se induciría por la expresión del gen E. La adición de amortiguadores directamente a los medios se puede utilizar para mejorar la liberación o selectividad. La masa celular se eliminaría después por filtración o centrifugación, dejando el plásmido en el caldo clarificado. El ADN genómico y ARN en el caldo clarificado se puede reducir por el uso de una nucleasa (ya sea incorporada en el genoma de la cepa y expresada en la línea celular o agregada de forma exógena) . Alternativamente, el ARN contaminante y el ADN genómico se pueden reducir utilizando los métodos conocidos existentes, tal como la desnaturalización selectiva o degradación térmica o tratamiento con álcali del caldo clarificado. En este caso, la eliminación de ADN genómico y ARN del cultivo clarificado ocurriría después del efecto fantasma más que de la lisis celular completa y la liberación de componentes celulares tales como LPS se puede reducir. La liberación de plásmido de las células también se puede efectuar sin un quelante metálico, tal como EDTA, para lograr una reducción adicional del desprendimiento de LPS de las células de efecto fantasma. Los agentes de compactación tales como PEG o CTAB o cationes divalentes tales como CaCl2, se pueden utilizar para purificar selectivamente el ADN de plásmido de los contaminantes genómicos y de ARN. Tales métodos de reducción de ADN genómico o ARN son conocidos en el campo . ?jemplo 16: Elaboración de ADN de plásmido con el uso de autolisis mediada por antibióticos Se evaluó un método alternativo de autolisis que utiliza antibióticos que inhiben la pared celular. El cásete T5RNasa en la construcción pVEXBOmpAT5RNasa se transfirió a la construcción pACYCB. Los cultivos de stuffer pACYCBT5RNasa o pACYCBNativo (control), cada uno co-transformado con plásmido gWizGFP, se proliferaron en LB + 50 ug/ml de canamicina + 34 ug/ml de cloramfenicol + 4mM de MgS04, expresión proteínica inducida con arabinosa a una concentración final de 0.2% durante 1 hr a 30°C durante la proliferación de medio logaritmo y autolisis celular inducida por la adición de ampicilina y cefotaxima (Fluka) (antibióticos B lactama) a concentraciones finales de 100 y ug/ml, respectivamente. Los cultivos se agitaron durante la noche a 30° C para efectuar la lisis y la digestión de la nucleasa. El desecho celular se eliminó por centrifugación y el contenido en el ácido nucleico contenido en el sobrenadante se evaluó por gel de agarosa (post-coloración con verde SYBR II) después de la extracción de fenol cloroformo para eliminar proteínas. El ADN genómico se redujo dramáticamente en la cepa T5RNasa, pero en el control. El ADN genómico residual se eliminó por incubación (37° C 30 min) . No ,se observó reducción del plásmido a pesar de la incubación prolongada del cultivo lisado a temperaturas elevadas. Como se esperaba, la viscosidad del lisado se redujo dramáticamente con la línea celular T5RNasa, comparativamente con la línea celular de control. Estos resultados demuestran la utilidad general de la combinación de nucleasas de plásmido seguro con varios métodos de autolisis para la producción de plásmido. Por lo tanto, el lector verá que las nucleasas de plásmido seguro y los procesos de producción asociados de la invención proporcionan composiciones y métodos para la producción mejorada de plásmido. Aunque la descripción anterior contiene muchas especificidades, estas no se deberán considerar como limitaciones de la invención, sino como una ejemplificación de una modalidad preferida de esta. Muchas otras variaciones son posibles. Por ejemplo, la reducción de ADN genómico, utilizando exonucleasas endógenas (recBCD) se ha observado cuando se inducen las alteraciones cromosómicas utilizando nucleasas de restricción (Hanak y Ward, 2001) o irradiación gamma (MacPhee et al., 1988); estos extremos son después el sustrato para las nucleasas endógenas. En este formato, las células continúan creciendo después de que se inducen las alteraciones cromosómicas (irradiación durante la noche) . Esto funciona deficientemente cuando se utiliza la actividad de exonucleasa endógena para liberarse del ADN, y se podría mejorar de manera importante utilizando las endonucleasas de plásmido seguro de la invención. Consecuentemente, el ámbito de la invención se deberá determinar no por las modalidades ilustradas, si no por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes legales.

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un método para la producción de ADN de plásmido de superhélice covalentemente cerrado caracterizado por que comprende las etapas de A) introducir un gen que codifica una o más nucleasas de plásmido seguro en el genoma de Escherichia coli (E. coli) ; y B) dirigir la producción de las nucleasas de las secuencias genéticas introducidas de tal forma que las enzimas se dirigen al espacio periplásmico por medio de un péptido de señal o proceso equivalente; y C) desarrollar las células de E. coli en la presencia de un replicón de ADN tal como un plásmido, cósmido o replicón de cromosoma artificial bacteriano; y D) introducir la(s) nucleasa (s) a los contenidos citoplásmicos, de tal forma que el ADN genómico de E. coli se digiera y el replicón de ADN introducido no se digiera; y E) purificar el replicón de ADN introducido a partir de los contenidos bacterianos; Por medio de lo cual el método incrementa la pureza del plásmido.
2. El método de la reivindicación 1 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una o más enzimas quiméricas.
3. El método de la reivindicación 1 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una ADNsa con al menos una porción de una enzima RNasa como socio de fusión.
4. El método de la reivindicación 1 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una enzima quimérica que fusiona la exonucleasa T5 D15 de fago con RNasaA.
5. El método de la reivindicación 1 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una enzima quimérica que fusiona la exonucleasa T5 D15 de fago con RNasaS.
6. Un método para la producción de ADN de plásmido de superhélice covalentemente cerrado caracterizado por que comprende las etapas de A) introducir un gen que codifica una o más nucleasas de plásmido seguro en el genoma de E. coli; y B) dirigir la producción de las nucleasas de las secuencias genéticas introducidas de tal forma que las enzimas se dirijan al espacio periplásmico por medio de un péptido de señal o proceso equivalente; y C) desarrollar las células de E. coli en la presencia de un replicón de ADN tal como un plásmido, cósmido o replicón de cromosoma artificial bacteriano; y D) autolisar las células, de forma que el ADN genómico de E. coli se digiera y el replicón de ADN introducido no se digiera; y E) purificar el replicón de ADN introducido, de los contenidos bacterianos; Por medio de lo cual el método incrementa la pureza del plásmido.
7. El método de la reivindicación 6 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una o más enzimas quiméricas.
8. El método de la reivindicación 6 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una enzima quimérica que fusiona la exonucleasa T5 D15 de fago con RNasaA.
9. El método de la reivindicación 6 caracterizado por que la(s) nucleasa(s) de plásmido seguro comprende una enzima quimérica que fusiona la exonucleasa T5 D15 de fago con RNasaS.
10. El método de la reivindicación 6 caracterizado por que la(s) nucleasa (s) de plásmido seguro comprende una DNasa con al menos una porción de una enzima RNasa como socio de fusión.
11. El método de la reivindicación 6 caracterizado por que la autolisis se efectúa utilizando proteínas fago de lisis .
12. El método de la reivindicación 6 en donde la autolisis se efectúa utilizando antibióticos.
13. Una composición de materia caracterizada por que comprende una o más cepas de bacteria que contienen: A) al menos una nucleasa de plásmido seguro, tal como la exonucleasa T5 D15, con o sin uno o más socios de fusión; y B) al menos un plásmido, en donde la nucleasa de plásmido seguro se utiliza para mejorar la pureza del plásmido obtenido de la purificación.
14. La composición de la reivindicación 13 caracterizado por que la nucleasa de plásmido seguro es exonucleasa T5 D
15.