JP2008509704A - プラスミドdna産生用大腸菌改良株 - Google Patents
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Abstract
一般的方法及び細菌株であって、これによって、ゲノムDNA、及びRNAに関してプラスミドDNAを劇的に精製できる一般的方法及び細菌株を記載する。1つの好ましい態様では、宿主の核酸の溶解及びヌクレアーゼによる除去は、発酵/回収工程の一体的構成要素であり、これによって下工程の精製を簡素化して収率及び純度を上げ、かつ排液を減らすことができ、その結果製造コストを下げることができる。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所が交付した研究助成金番号I R43 GM072141−01による政府の支援を一部受け、行われた。
本発明は、国立衛生研究所が交付した研究助成金番号I R43 GM072141−01による政府の支援を一部受け、行われた。
本出願は、2004年8月16日に提出された米国仮特許出願番号第60/602074号の利益を主張する。
技術分野
本発明は、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド等の、共有結合性環状(ccc)組換え体DNA分子の産生に関し、より具体的には、前記DNA分子を発酵に伴う汚染核酸分子から精製する方法である。
本発明は、プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド等の、共有結合性環状(ccc)組換え体DNA分子の産生に関し、より具体的には、前記DNA分子を発酵に伴う汚染核酸分子から精製する方法である。
背景技術
本発明は、共有結合性環状(ccc)組換え体DNA分子の産生に関する。このような分子は、バイオテクノロジー、トランスジェニック生物、遺伝子治療、治療ワクチン接種、農業、及びDNAワクチンに有用である。
本発明は、共有結合性環状(ccc)組換え体DNA分子の産生に関する。このような分子は、バイオテクノロジー、トランスジェニック生物、遺伝子治療、治療ワクチン接種、農業、及びDNAワクチンに有用である。
発明を考慮しながら、先行技術調査を行った。大腸菌プラスミドは長い間、組換え体DNA分子の唯一の重要な供給源として研究者及び産業界に用いられてきた。今日プラスミドDNAは、次世代のバイオテクノロジー製品(遺伝子医薬品及びDNAワクチン)として重要性を増しつつあり、臨床試験にかけられ、最終的には医薬品市場に登場することになるだろう。プラスミドDNAワクチンについては、ウイルス、細菌、又は寄生虫疾患用の予防ワクチン;高い免疫グロブリン産生をもたらすための免疫化剤;感染症用治療ワクチン;又は癌ワクチンとしての応用を見出すことができるだろう。
プラスミドを獲得するための(細菌発酵による)、及びアルカリ溶解法によるそれらの精製に関する基本的な方法は周知である(Bimboim,HC,Doly J.1979 Nucleic Acids Res.7:1513−1523)。まず発酵した細菌細胞のペーストを懸濁して溶解し(水酸化ナトリウム及びドデシル硫酸ナトリウムを組み合わせたものを用いて)、その後酸性塩(例えば酢酸カリウム)を加えて溶液を中和し、細菌DNA及び大部分の細胞破砕物を沈殿させる。スーパーコイルを形成しているプラスミドDNAの大部分は、汚染細菌RNA、DNA、及びタンパク質、更に大腸菌エンドトキシン(リポ多糖類若しくはLPS)と共に溶液中に残る。
代替として、非イオン性界面活性剤の存在下での熱/リソゾーム処理を用いた溶解を用いて、未変性のプラスミドDNAを放出する。超臨界液に高圧を加えるか、又は有機溶媒若しくは界面活性剤による処理でも細胞を溶解して、核酸を放出させることができる。
これらの溶解法は、細胞不純物を放出させ、次にこれらを取り除くための精製段階を必要とする。更に、現在プラスミドDNA製造に利用されているアルカリ溶解又は熱変性細胞溶解法は、コストが高く、効率が低く、また大量の有毒な廃液物を発生させる。これに代わる、コスト効率的な溶解法はまだ開発されていない。
次に可溶性分画は、濾過により分けられ、RNase消化;クロマトグラフィー(イオン交換ゲル濾過、ハイドロキシアパタイト、ゲル濾過、疎水性相互作用、逆相、HPLC等);透析濾過;有機的抽出、選択的沈殿等を含む、様々な精製段階に供される。
当技術分野で記述されている、溶解後の例示的な下工程のプラスミド精製工程は、ゲノムDNAのレベルを0.01〜1%以下まで下げる。当技術分野に記述されている以下の工程は網羅的なリストではないが、特定のゲノムDNAを削減する段階を含んでいる:ハイドロキシアパタイトによる0.01%のゲノム(Wils P,and Ollivier,M.2004 米国特許第6730781号)、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる0.05%のゲノム(Nochumson S,Durland Hayes R,Yu−Speight A,Welp J,Wu K,and R.2001 米国特許出願第2001/0034435号;Diogo MM,Querioz JA,Monteiro,GA,Martins SAM,Ferreira,GNM,and Prazeres DMF.2000 Biotech Bioeng 68:576−583)、硫安沈殿による1%ゲノム(McNeilly DS.2001 米国特許第6214586号)、サイズ排除クロマトグラフィーによる0.2%ゲノム(Lemmens R,Olsson U,Nyhammar T,and Stadlter J.2003.J Chromatography B 784:291−300)、タンジェンシャルフロー限外濾過による<1%ゲノム(Bussey LB,Admson R and Atchley A.2000 米国特許第6011148号)、ポリエチレングリコール分別沈殿による<1%ゲノム(Marquet M,Horn N,Meek J,and Budahazi G.米国特許第5591064号)、CTAB沈殿及びグリオライトLRA吸着(Lander RJ,Winters MA,and Meacle FJ.2002 米国特許出願第2002/0151048号)、トリプルへリックスクロマトグラフィーによる0.1%ゲノム(Crouzer J,Scherman D,and Wils P.2001 米国特許第6287762号)。
プラスミドDNAのヒトへの導入には、幾つかの特別に考慮すべき問題及び困難が存在しており、これらについては感染症予防プラスミドDNAワクチンに関する考慮点を含めFDA行政指針に説明されている(Food and Drug Administration,Center for Biologics Evaluation and Research.1996 Points to consider on plasmid DNA vaccines for preventive infectious disease indications DOCKET NO.96N−0400、及びFood and Drug Administration,Center for Biologics Evaluation and Research.1998 Guidance for industry:Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy.)。これら文書は、様々な汚染物質に関する関心事を示しており、また各汚染物質のレベルの評価に使用できる試験を提示している。しかしながらこの指針文書は、汚染RNA、DNA、又はタンパク質の最大許容レベルについては、それらが不明であるために提示していない。しかしながら、ゲノムDNAの許容可能な限界が100pgであるゲノムDNA/組換え体タンパク質薬物に関するFDAガイドラインが現在要求している投与量規格(FDA.1993 Points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologics)を1mgのDNAワクチン投与量に当てはめると、それは0.00001%となる。この値は、標準的な、大規模なDNA調製(0.01〜5%ゲノムDNA)に比べ数桁低いレベルであり、現時点で利用可能な経済効果的な製造方法を用いて達成することはできない。ゲノムDNAから、汚染物質を更に減らすための新規の方法が必要とされている。
核酸は、工程の初期(例えばヌクレアーゼ消化によって)又は後期(例えばクロマトグラフィー分離によって)取り除くことができる。最近まで、比較的一般的な方法では、RNAを分解するために、溶解バッファーの中にウシ膵臓リボヌクレアーゼ(RNase A)を使用していた。それは、RNAの量及びサイズの低減に関して応分の効果を有しているものの、同時にウシ由来のRNaseを持ち込むこととなり、これがウシ海綿状脳症(BSE)病原体として知られるプリオン病原体に汚染されている可能性があることから、管理上望ましくなかった。実際、動物製品を用いない(APF)状態で、細菌産物(ヒト又は動物への使用を目的とする)の発酵及び精製を全て実施することへの要望がますます強くなっている。
現在、我々は、大腸菌のゲノムDNAを、スーパーコイルを形成したプラスミドを未変性のまま特異的に分解できる、効率の高い市販酵素を知らない(「プラスミドセーフヌ」クレアーゼ)。しかしながら、特殊な例では、ATP依存性Rec BCDエクソヌクレアーゼ酵素(Qiagen Large Construct Kit Handbook,June 2003;Wahle,S,Schorr J,and Weber M.2001 米国特許第6242220;Isfort RJ 1992 BioTechniques 12:798−804)のようなヌクレアーゼが、部分精製したプラスミドDNA調製物に加えられている。これと関連するアプローチでは、粗プラスミド調製物を加熱処理し、非環状DNAを全て単鎖型に変性し、次にSIヌクレアーゼ、ヤエナリヌクレアーゼ、P1ヌクレアーゼ、T7エクソヌクレアーゼ、Bal31ヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼI、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼVII又はラムダエクソヌクレアーゼ(Hyman ED.国際特許出願第92/13963号)のような単鎖エクソヌクレアーゼが加えられる。これらのDNase酵素は溶解物に直接加えることはできないが(RNaseのように)、それはこれらの酵素が一般的にRNaseよりも脆弱であり、かつアルカリ/SDS環境内で不活性化されるからである。それ故にこのようなアプローチは、商業規模のプラスミド製造にとっては不経済であり、実用的ではない。
プラスミドDNA調製物への精製ヌクレアーゼ添加に伴う障害を克服するために、内因性ヌクレアーゼを利用してゲノムDNAを除去する別の方法が開発されている。初期の方法は、全体的なDNA損傷(修復欠失宿主での紫外線照射(Sancar A,Hack AM,and Rupp WD.1979 J Bacteriol.137:692−693)、又は染色体に比べ損傷を受ける確率が低いことで(即ちゲノムより標的の方が小さい)プラスミドが生き残る電離放射線照射(MacPhee DG,Radford,AJ,and Reanney DC、1988 米国特許第4755464号)を用いた;内因性ヌクレアーゼ(例えばRecBCD)が仲介する分解は、ゲノム内のDNA切断部位から進行する。制限エンドヌクレアーゼを用いてゲノムDNAを切断する、より特異的なシステムが報告されているが、このシステムでは制限エンドヌクレアーゼ活性は、熱感受性メチラーゼによって制御されている。制限温度への移行によりメチラーゼは不活性化され、ゲノムDNAの切断、続いて内因性エクソヌクレアーゼ消化が起こる(Hanak,J,Alexis J,and Ward JM.2001 国際特許出願第01/29209号)。しかしながら、これらの方法でのゲノムの減少レベルは小さく、またプラスミドは遺伝子工学的に作り変えて制限酵素部位を欠くようにする必要があることもあり、この方法を一般的に利用することはできない。
組換え体ヌクレアーゼをその周辺細胞質空間内に発現させて、細胞増殖中の大腸菌遺伝子の発現を妨害しないようにした特殊な大腸菌株が開発されている。1つの例では、ウシ膵臓RNaseは、分泌シグナルを用いて周辺細胞質空間に向けられており、溶解するとRNaseはRNAと混じり合い、これを分解する(Cooke GD,Cranenburgh RM,Hanak JAJ,Dunnill P,Thatcher DR,Ward JM.2001 A.J.Biotechnology 85:297−304)。このシステムを利用し、アルカリ溶解中にRNAレベルを下げる。この方法では、ゲノムDNAは減らない。タンパク質又はその他生物材料調製物の核酸汚染を減らすために、周囲細胞質にブドウ球菌ヌクレアーゼ(Cooke GD,Cranenburgh RM,Hanak JAJ,Ward JM.2003 J.Biotechnology 101:229−239;Huisman GW,Luo LZ,and Peoples OP.2004 米国特許出願第2004/0014197号;Boynton ZL,Koon JL,Brennan EM,Clouart JD,Horowitz DM,Gerngross TU,and Huisman GW.1999 Pseudomonas putida.Appl.Environ.Microbiol.65:1524−1529)、又は内因性大腸菌EndA周辺細胞質ヌクレアーゼ(Leung WS,and Swartz JR.2001 米国特許第6258560号)を過剰発現させる類似のシステムが開発されている。これらのシステムはプラスミドにとって安全ではなく、活性にとって穏やかなタンパク質精製工程及び緩衝液を必要とする。発酵培養におけるプラスミド−セーフDNaseの誘導は、2003年にKellyによって理論的な観点で論じられているが(Kelly WJ.2003 Biotechnol Appl Biochem 37:219−223)、方法論又はヌクレアーゼについては明記されていない。
タンパク質製造を容易にするための自己溶解細胞株が開発されている(Leung and Swartz、上記、2001)。この細胞株では、細胞はリソゾームを細胞質内で発現しており、リソゾームが漏出できるチャンネルを作るホリン(膜拡張ペプチド又はタンパク質)を同時発現させることによって、望む時間に周辺細胞質に放出させることができる。利用可能な例示的リソゾーム/ホリンの組み合わせは、当技術分野で公知である。いくつかのリソゾーム/ホリンの組み合わせは、1992年Youngが論じており(Young R 1992 Microbiol Molec Reviews、56:430−481)、参照によって本明細書内に組み入れられている。ラムダファージ溶解タンパク質が、タンパク質製造向け自己溶解細胞株に用いられている(Leung and Swartz、上記2001)。
自己溶解条件では、アルカリ又は熱溶解とは異なりゲノムDNAを選択的に変性することはない。溶解産物は非常に粘性であり、処理上問題となっている。タンパク質の製造では、細胞株に非特異的ヌクレアーゼを加えるか、又は周辺細胞質に発現させて(例えば、endAヌクレアーゼ Leung and Swartz、上記、2001、Staphylococcus nuclease,Cookeら、上記、2003、Huismanら、上記、2005、Boyntonら、上記1999)細胞溶解後に粘度を下げる。このようなシステムは、プラスミド製造には利用できない。
プラスミド製造に用いられる精製工程は、非経済的、非効率であり、かつ大量の有毒廃液を生じる。残留ゲノムDNAのレベルは、市販製品に関する現在受け入れ可能な基準よりも遙かに高い。これら制約は、プラスミドDNA製造工程の商業化にとって大きな費用及び純度の負担となっている。
先行技術を見る限り、ゲノムDNA削減の経済効果的な方法は今も求められている。同様に、不経済な、又は有毒な化学物質を減らす、簡便で安価な精製工程も求められている。
発明は、DNA精製方法であり、この方法ではプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)をコードする1又はそれ以上の遺伝子が細菌ゲノム内に挿入され、それは周辺細胞質空間内に分泌されるタンパク質として発現される。プラスミド又はDNAレプリコンが細胞内で増殖すると、ヌクレアーゼが細胞質に再導入され、所望のレプリコン以外の核酸を排除し、レプリコンの精製を容易にする。1つの好ましい態様では、ヌクレアーゼはキメラヌクレアーゼである。別の好ましい態様では、キメラヌクレアーゼは、融合相手としてRNase酵素の少なくとも一部分を有するDNAseである。更に別の好ましい態様は、ファージT5 D15エクソヌクレアーゼとRNaseA又はRNaseSを融合したキメラ酵素を利用する。好ましい形態の方法では、ヌクレアーゼは、シグナルペプチド又は同等の工程を手段として周辺細胞質空間に向けられ、細胞は、細菌ゲノムDNA及び/又はRNAは消化され、導入されたレプリコンのDNAは消化されない形で自己溶解し、それによって導入されたレプリコンの精製を容易にする。更に別の好ましい態様では、自己溶解は細胞内で発現させたファージ溶解タンパク質の使用を通じて、又は抗生物質の使用を通じて達成される。発明は、融合相手を持つ、又は持たない、少なくとも1つのプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を有する細菌株、及びプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)によりその精製が簡便化されるプラスミドを含む。
本発明の概要
本発明の目的、及び/又は目標は、問題の組成物及びプラスミド精製工程を提供することである。本発明の別の目標は、精製したプラスミドDNA中の核酸不純物を減らす方法を提供することである。本発明の更に別の目標は、プラスミドDNA精製の製造コストを下げることである。本発明の更に別の目的及び/又は目標は、プラスミドDNA精製中の有毒廃液を減らすことである。別の開示は、:切れ目の入った(開環型)又は直鎖型のプラスミドの量を減らすことによるプラスミドの品質の向上;複数の製造段階を排除することによる簡素化;複数の製造段階を排除することによるコスト軽減;下工程進行前に主要な汚染物質を排除することによる、プラスミド精製後の核酸不純物の減量によるプラスミドの品質向上;最終プラスミド調製物からのゲノムDNA排除による法律遵守の向上;リボヌクレアーゼAのような動物産物起源材料を排除することによる法律遵守の向上;並びに有害廃液を排除することによる法律遵守の向上により改善された、当技術分野に画定されている工程に対し改良されたプラスミド製造工程である。
本発明の目的、及び/又は目標は、問題の組成物及びプラスミド精製工程を提供することである。本発明の別の目標は、精製したプラスミドDNA中の核酸不純物を減らす方法を提供することである。本発明の更に別の目標は、プラスミドDNA精製の製造コストを下げることである。本発明の更に別の目的及び/又は目標は、プラスミドDNA精製中の有毒廃液を減らすことである。別の開示は、:切れ目の入った(開環型)又は直鎖型のプラスミドの量を減らすことによるプラスミドの品質の向上;複数の製造段階を排除することによる簡素化;複数の製造段階を排除することによるコスト軽減;下工程進行前に主要な汚染物質を排除することによる、プラスミド精製後の核酸不純物の減量によるプラスミドの品質向上;最終プラスミド調製物からのゲノムDNA排除による法律遵守の向上;リボヌクレアーゼAのような動物産物起源材料を排除することによる法律遵守の向上;並びに有害廃液を排除することによる法律遵守の向上により改善された、当技術分野に画定されている工程に対し改良されたプラスミド製造工程である。
本発明の更なる目標及び利点は、図面及び以下の記載を考慮することによって明らかになるだろう。
本発明の詳細な説明
次に図面1を見ると、大規模なプラスミド調製における、T5エクソヌクレアーゼを用いた変性プラスミド及び大腸菌ゲノムDNAの消化が描かれている:1)DNA分子量マーカー[最大バンドは12キロベースである];2)大規模プラスミド調製工程中のプラスミドサンプル;3)T5エクソヌクレアーゼ付加なしのコントロールT5エクソヌクレアーゼで反応させた同一のサンプル;4)2%w/wのT5エクソヌクレアーゼで消化した同一のサンプル。最下部のバンドは、スーパーコイル体、中央のバンドは、スーパーコイル形成ダイマーと切れ目の入ったモノマーの混合物、最上部のバンドは切れ目の入ったダイマーとゲノムDNAとの混合物である。ゲノムDNA及び切れ目入りプラスミドは、中央及び最上部のバンドから定量的に取り除かれる。同様の結果は、1%w/wのT5エクソヌクレアーゼでも見られる。
次に図面1を見ると、大規模なプラスミド調製における、T5エクソヌクレアーゼを用いた変性プラスミド及び大腸菌ゲノムDNAの消化が描かれている:1)DNA分子量マーカー[最大バンドは12キロベースである];2)大規模プラスミド調製工程中のプラスミドサンプル;3)T5エクソヌクレアーゼ付加なしのコントロールT5エクソヌクレアーゼで反応させた同一のサンプル;4)2%w/wのT5エクソヌクレアーゼで消化した同一のサンプル。最下部のバンドは、スーパーコイル体、中央のバンドは、スーパーコイル形成ダイマーと切れ目の入ったモノマーの混合物、最上部のバンドは切れ目の入ったダイマーとゲノムDNAとの混合物である。ゲノムDNA及び切れ目入りプラスミドは、中央及び最上部のバンドから定量的に取り除かれる。同様の結果は、1%w/wのT5エクソヌクレアーゼでも見られる。
図2には、pVEXSapIスタッファーベクターを例示している。
図3には、cDNA配列の定方向増幅及びpVEXベクター内へのクローニングの方法を例示している:A)クラスIIS酵素を用いた消化により創られた切断点間に位置する、2つの固有のアドレスタグを含むプラスミド、及び;B)クラスIIS酵素認識シグナル(SapI)、少なくとも1つの介在ヌクレオチド、及び固有の非パリンドローム配列を有する重複領域(GGG、この例でのアドレスタグ)を含む、典型的プライマー。
図4には、pVEXSapIOmpAスタッファーベクターを例示している。
図5には、pVEXBSapIOmpAスタッファーベクターが示されている。
図6には、pVEXBOmpARNaseベクターを例示している。
図7には、pVEXBOmpAT5RNaseベクターが示されている。
図8には、T5RNaseエクソヌクレアーゼによるゲノムDNAの除去が示されている。好ましいT5エクソヌクレアーゼ及びRNase遺伝子が存在する場合と存在しない場合のプラスミドDNA調製物のゲルの写真が示されている:レーン1、5及び9は、T5RNase誘導例である;レーン3、7及び11はT5RNase非誘導例である;レーン2、6及び10は、RNase誘導例であり;レーン4、8及び12はRNase非誘導例である。サンプル1〜8は、Qiagen調製したアルカリ溶解後の核酸である。サンプル9〜12は、急速抽出した全DNAである。サンプル5〜12は、4℃保存した細胞のものであり、一方サンプル1〜4は−20℃保存した細胞のものである。M)はDNA分子量マーカーを表す。最大のバンドは12キロメースである。上から、最大分子量バンドはゲノムDNA(gDNA)であり、次のバンドはスーパーコイル形成ダイマープラスミドDNA[pDNA(2x)]、次がスーパーコイル形成モノマープラスミドDNA(pDNA)であり、最も速く移動するバンドはRNA(RNA)である。レーン1の矢印は、ゲノムDNAの減少を強調している。
図9では、Sペプチド及びSタンパク質の会合を用いたRNaseS−T5キメラ作成を図解している。
図10には、キメラヌクレアーゼによる核酸の加水分解が示されている。
図11には、Sペプチド−T5+Sタンパク質及びT5RNase構築体によるRNAの減少が示されている。アルカリ溶解物を、指示したプラスミドを含むDH5α細胞の誘導培養物から調製し、核酸をエタノールで沈殿させてから1%アガロースゲルで分析した。SYBR Green II(Molecular Probes)を用いた後染色によって、RNA(主要バンド)が検出された:レーン1=pVEXBOmpAS−ペプチドT5+pACYCBOmpASタンパク質;レーン2=pVEXBOmpAT5−Sペプチド+pACYCBOmpASタンパク質;レーン3=pVEXBPhoRNase;レーン4=pVEXBOmpAT5RNase;レーン5=pVEXBOmpAT5;及びレーン6=pVEXBPhoA(フレームシフト)RNase(陰性コントロール)。
図12には、Sペプチド−T5+Sタンパク質構築体によるRNA及びゲノムDNAの削減が示されている。アルカリ溶解物は、指示したプラスミドを含むDH5α細胞の誘導(レーン1〜4及び6)並びに非誘導(レーン5)培養物から調製し、核酸をエタノールで沈殿させ、1%アガロースゲルで分析した。RNA及びDNAは、SYBR Green IIを用いた後染色によって検出した:レーン1=pVEXBOmpAS−ペプチドT5;レーン2=pVEXBOmpAS−ペプチドT5+pACYCBOmpASタンパク質;レーン3=pACYCBOmpASタンパク質;レーン4=pVEXBPhoASペプチド−T5;レーン5=pVEXBPhoASペプチド−T5+pACYCBOmpASタンパク質(非誘導);及びレーン6=pVEXBPhoASペプチド−T5+pACYCBOmpASタンパク質(誘導)。レーン2の矢印は、RNAバンド(最下層)及びゲノムDNAバンド(最上部)の削減を強調している。
図13には、PhiX174遺伝子E小孔を通る、大腸菌細胞質内容物の放出が示されている
図14には、pACYCB未変性スタッファーベクターが示されている。
図15には、pACYCB遺伝子Eベクターを例示している。
図16には、遺伝子E溶解タンパク質が仲介するプラスミド放出が示されている。1のpACYCB遺伝子E+pDNAVACCUltra−EGFPと共に培養した細胞は非誘導であり、2はアラビノースAで40分間誘導したものである:A=全核酸(沈殿);B=PIバッファー抽出後に残った全核酸(沈殿);C=PI(50mM Tris、10mM EDTA、pH8)抽出核酸;D=LB(培地)核酸;E=PBS抽出核酸;F=10mM Tris pH8.5抽出核酸;G=50mMリン酸ナトリウム、0.3M NaCl pH7抽出核酸;及びH=10mM MgCl2抽出核酸。M)はDNA分子量マーカーを表す。最大バンドは12キロベースである。上から、最大分子量バンドはゲノムDNA(gDNA)であり、次のバンドはスーパーコイル形成ダイマープラスミドDNA[pDNA(2x)]及びスーパーコイル形成モノマープラスミドDNA(pDNA)であり、最も速く移動しているバンドはRNA(RNA)である。
図17には、抗生物質誘導自己溶解後の、ヌクレアーゼによるゲノムDNA除去が示されている。レーン1=DNA分子量マーカー;レーン2=自己溶解後の全DNA(pACYCBT5RNase+gWizGFP株);レーン3=自己溶解後の全DNA(pACYCB未変性スタッファー+gWizGFP株);及びレーン4=レーン2のサンプルを37℃で30分間インキュベーションしたもの。矢印は、T5RNase株においてゲノムDNAバンドが除去されていることを強調している。
図18には、プラスミド製造での周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用が示されている。形式1は、細胞溶解前に前処理を利用してゲノムDNA、切れ目入り、若しくは直鎖型プラスミド、及び/又はRNAを除去しているが、形式2は細胞溶解後の後処理(又は同時処理)を利用して、ゲノムDNA、切れ目入り若しくは直鎖型プラスミド、及び/又はRNAを除去する。
図19には、自己溶解プラスミド製造工程での周辺細胞質ヌクレアーゼ発現製造用宿主の使用を例示している。
定義
自己溶解:βラクタム誘導細胞溶解、phiX174ファージ溶解タンパク質誘導ゴースト形成、ファージリソゾーム/ファージホリン同時発現によるT4又はラムダファージ誘導細胞溶解等の細胞を自己溶解させる溶解方法。
自己溶解:βラクタム誘導細胞溶解、phiX174ファージ溶解タンパク質誘導ゴースト形成、ファージリソゾーム/ファージホリン同時発現によるT4又はラムダファージ誘導細胞溶解等の細胞を自己溶解させる溶解方法。
ccc:共有結合性環状
キメラ酵素:酵素と第二タンパク質との融合物、例えばファージT5 D15エクソヌクレアーゼとウシRNaseAの断片若しくは全体との融合物。
DNAレプリコン:プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BACs)、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド。
ゴーストバンド:変性したcccDNA。
pDNA:プラスミドDNA
ファージ溶解タンパク質:細胞に自己溶解又はphiX174ファージ溶解タンパク質により誘導されるゴースト形成のようなゴースト形成を引き起こす、或いはT4、又はラムダファージリソゾーム−ホリン同時発現により誘導される細胞溶解を引き起こすタンパク質。
プラスミド:プラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BACs)、バクテリオファージ、ウイルスベクター、及びそれらのハイブリッド。
プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases):様々な形態のDNAを分解するが、プラスミドを含む共有結合性環状(ccc)DNAは分解しないエンドヌクレアーゼ。
RNase:リボヌクレアーゼ。
RNaseA:ウシ膵臓リボヌクレアーゼA。
T5エクソヌクレアーゼ:バクテリオファージT5 D15エクソヌクレアーゼ。
本発明は、機械式発酵容器を用いた、グラム陰性細菌の大腸菌を製造用宿主として用いるプラスミドDNA(pDNA)製造中にゲノムDNAを削減するための方法に関する。
精製技術の大きな問題は、大腸菌ゲノムDNAからのpDNAの分離である。本発明は、共有結合性環状(ccc)DNAを単離する間にゲノムDNAを削減するための方法である。プラスミド製造にヌクレアーゼを利用する、費用効率の良いアプローチが開発されている。「プラスミド−セーフ」ヌクレアーゼを周辺細胞質空間に分泌させて、それにより細胞増殖中は細胞を保護し、かつ回収時又は細胞溶解中にはヌクレアーゼとゲノムDNAとが接触するように制御する。
ヌクレアーゼ産生の好ましい態様
発明の、1つの好ましい態様では(図10)、1又はそれ以上の特殊な「プラスミド−セーフ」加水分解酵素(T5 D15エクソヌクレアーゼ、RecBCDエクソヌクレアーゼ、その他ATP依存的エクソヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼVII、又はキメラ、ハイブリッド酵素)は、シグナルペプチド又はその等価物を手段として周辺細胞質空間内に分泌され、その後酵素は細胞増殖又はpDNA誘導/製造が完了するまでその場所に隔離される。酵素と細胞質内容物とが制御的に合わされると(膜の破断又は細胞質内への制御的な移入により)、酵素は、核酸(DNA、RNA)、タンパク質、炭水化物、リポ多糖類等のような不要な細菌性物質を消化又は加水分解し、実質的に精製されたプラスミドDNAを生ずる。
発明の、1つの好ましい態様では(図10)、1又はそれ以上の特殊な「プラスミド−セーフ」加水分解酵素(T5 D15エクソヌクレアーゼ、RecBCDエクソヌクレアーゼ、その他ATP依存的エクソヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼVII、又はキメラ、ハイブリッド酵素)は、シグナルペプチド又はその等価物を手段として周辺細胞質空間内に分泌され、その後酵素は細胞増殖又はpDNA誘導/製造が完了するまでその場所に隔離される。酵素と細胞質内容物とが制御的に合わされると(膜の破断又は細胞質内への制御的な移入により)、酵素は、核酸(DNA、RNA)、タンパク質、炭水化物、リポ多糖類等のような不要な細菌性物質を消化又は加水分解し、実質的に精製されたプラスミドDNAを生ずる。
未変性ヌクレアーゼを用いることもできる。RecBC(エクソヌクレアーゼV)、及びRecBCDエクソヌクレアーゼ、関係するグラム陽性RexAB若しくはAddABエクソヌクレアーゼ、アルケオン(Archeon)エクソヌクレアーゼ(例えばGeobacillus kaustophilus AddAB)その他ATP依存性エクソヌクレアーゼ、エクソヌクレアーゼIII、エクソヌクレアーゼVIIのような任意のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が利用できる。これは網羅的なリストではなく、大腸菌由来の、又はその他細菌、アルケオン、又は真核生物を供給源とするヌクレアーゼも考えられる。「ゴーストバンド」を除去するバクテリオファージT5 D15エクソヌクレアーゼのようなヌクレアーゼが好ましい。
プラスミド−セーフ好熱性ヌクレアーゼの場合は、必要とされる増殖温度において酵素の活性が十分低いのであれば、ヌクレアーゼを周辺細胞質に分泌させる必要はないだろう。これにより、発酵中に熱処理(42〜95℃)するといった別のゲノム削減法が利用できるようになるだろう。
本発明は、スーパーコイルを形成したプラスミドDNAを消化することなく、ゲノムDNA、及び好ましくは変性され、切れ目の入ったプラスミドDNAを消化する「プラスミド−セーフ」エクソヌクレアーゼの使用を考える。好ましくは、バクテリオファージT5 D15エクソヌクレアーゼ(T5エクソヌクレアーゼ)は、プラスミド処理に用いる候補DNaseである。T5エクソヌクレアーゼは、スーパーコイルを形成したプラスミドは消化しないが、直鎖型の単鎖及び二本鎖DNA(Sayers JR and Eckstein F.1990 J.Biol.Chem.265:18311−18317)を消化するだけでなく、生物学的活性を保持していることが多く、かつ制限酵素消化に対し退縮性である「ゴースト又はシャローバンド」DNAのような変性ループを持つDNAも消化できる(Sayers JR,Evans D,and Thomson JB. 1996 Anal.Biochem. 241:186−189)。我々は、精製されたT5エクソヌクレアーゼを利用して、大規模(1グラム)なプラスミド調製のサンプルに存在する、全ての非スーパーコイル形成DNA種を特異的に排除できることを証明した(図1)。
キメラヌクレアーゼも考えられる。これは、ヌクレアーゼ酵素を、それ自体はアルカリ溶解、又は想定される大規模なプラスミド調製方法の最中に予想される不活性化又は除去に対し耐性である融合相手と会合させることによって達成できる可能性がある。融合相手は、所望する安定化又は局在化の特性を付与する任意のタンパク質又はペプチドでよい。好ましい態様では、「プラスミド−セーフ」ヌクレアーゼの1つであるT5 D15エクソヌクレアーゼを融合相手と融合させたキメラヌクレアーゼが用いられる。例えば、ウシ膵臓RNase Aは、過酷なアルカリ溶解プラスミド調製法における不活性化又は除去に耐性である。同様に、大腸菌で発現されたRNaseは、アルカリ溶解物の透明な上清中に、活性な形で回収される。又は、チオレドキシン(Lu Z,DiBlaio−Smith EA,Grant KL,Warne NW,LaVallie ER,Collins−Racie LA,Follettie MT,Williamson MJ,and McCoy JM 1996 J Biol Chem.271:5059−5065)、アルファ−シヌクレインのC末端安定化ドメイン(Kim JS.2003、米国特許出願第2003/0125522号;Park SM,Ahn KJ,Jung HY,Park JH,and Kim J.2004 Protein Eng.Des.SeI.17:251−60)、Methanopyrus Kandleri由来の熱安定性Ftr(de Marco A,Casatta E,Savaresi S,Geerlof A.2004 J.Biotechnol.107:125−33)、又は融合相手の安定性を高めるその他のタンパク質(Zhou P,Alexey L,and Wagner G.2003 米国特許出願第2003/0092885号;Sanders MC.2002.米国特許出願第2002/0142384)も考えられる。
最も好ましくは、RNaseとDNase酵素の活性を、DNA処理方法に適合するような様式に合わせることが望ましい。これを行う1つの方法は、少なくともRNase及びDNase活性を含むハイブリッド酵素が同時発現している細菌株を開発することである。このアプローチを成功させるためには、ハイブリッド酵素をまずは周辺細胞質に分泌させて(核溶解から細胞保護する)、溶解中にその活性を失わないようにDNase酵素を保護する必要がる。
我々は、本明細書の中で、RNaseA又はRNaseSと融合したT5エクソヌクレアーゼを周辺細胞質に局在的に発現している複数の細胞株において、プラスミド製造中にゲノムDNA及びRNAが除去されることを証明する。我々は、これら融合酵素が、アルカリ溶解、自己溶解、又は抽出によるプラスミド加工中の汚染核酸の除去に応用できることを証明した。
プラスミドDNA製造を改善するための、製造用宿主へのT5エクソヌクレアーゼの使用は、先行技術において提案も実施もされていない。キメラヌクレアーゼへのRNase及びDNaseヌクレアーゼの結合もまた、先行技術において提案されていない。これに加えて、キメラヌクレアーゼのプラスミド製造への使用も、先行技術で提案されていない。本明細書に報告されているT5エクソヌクレアーゼ及びRNaseの新規の融合は、二種類の主要な核酸汚染物を同時に削減することを可能にする。二つの重要な要素を組み合わせることに加え、RNase要素は、予想外にもDNase成分の活性を増進した(図12)。この相乗的な結果が、キメラヌクレアーゼの性能を、非融合型の親構築体に対し高いものにしている。同様に、会合していない二成分(例えばRNase及びT5エクソヌクレアーゼ)に比べると、単一のタンパク質成分は製造用細胞株に遺伝子工学的に作り変え易く、かつ発現時の制御も容易である。
プラスミド製造工程の好ましい態様
プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)発現細胞は、発酵培養によって製造される。製造後、細胞からプラスミドを精製する。プラスミド精製は、当技術分野に記載されているアルカリ溶解、熱溶解、又は機械式溶解法を選好して利用できる。
プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)発現細胞は、発酵培養によって製造される。製造後、細胞からプラスミドを精製する。プラスミド精製は、当技術分野に記載されているアルカリ溶解、熱溶解、又は機械式溶解法を選好して利用できる。
ゲノムDNAの削減は、溶解前、及び/又は溶解中、及び/又は溶解後に起こってよい。ゲノムの削減は、浸透圧ショック(Baker,M,Taylor M,and Uppal S.2003 WO 03/046177Al)のようなプラスミド抽出中に起こってもよいが、この場合、発明の周辺細胞質に存在するか、又は分泌されたヌクレアーゼは、細胞からDNAを抽出する間にゲノムDNAを排除する。
プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)含有株は、二つの好ましいプラスミド精製形式に利用される(形式1及び2、図18)。
形式1は、細胞溶解前(前処理段階)のゲノムDNA(及びキメラヌクレアーゼによるRNA)の排除を含む。ヌクレアーゼは、製造後に細胞質内に導入される(即ち内膜浸透化)。我々は、OmpAS−ペプチドT5+OmpASタンパク質構築体(図11〜12)及びOmpAT5RNase(図8)構築体を用いた前処理とアルカリ溶解により、RNA及びDNAが削減されることを証明した。
バクテリオファージホリンのような誘導性の膜破壊因子、又は膜破壊化学物質若しくは界面活性剤を相前後して使用して、発酵サイクルの最後、加工が始まる前に加水分解酵素を細胞質に直接、選択的に誘導できるかもしれない。この前処理によって、細胞ペーストを加工する前に細胞内での消化範囲をいくらか制御することができる。この改良によって、酵素を溶解剤から保護する必要がなくなる(それらが溶解前に活性となるため)。同様に、この形式では、RecBCDのような内因性ヌクレアーゼも、標的となるゲノムDNAの分解に関与することができる。
形式2は、特定の前処理段階を加えないゲノムDNA(及びキメラヌクレアーゼによるRNA)の排除を含む。ゲノムDNAの削減は、細胞調製中、又は溶解中若しくは溶解後に起こってよい。削減が溶解後に起こる場合は、細胞溶解状態中は酵素が安定であること、及びその後の後処理による酵素の活性化が必要となるだろう。熱溶解及びアルカリ溶解の場合は、それぞれ高い熱安定性又はアルカリSDS安定性と、その後のバッファー交換による高濃度のEDTA及びSDSの除去が求められるだろう。我々は、OmpAT5RNase(図17)構築体を用いた前処理なし(形式2)の自己溶解において、RNA及びゲノムDNAが削減されることを証明している。
形式2は、圧縮化剤存在下での機械式溶解(Wilson RC and Murphy JC.2002 米国特許出願第20020197637号)、又は微小流体(含浸ジェットホモジェナイザー)又はビーズミリング(Jem KJ 2002米国特許第6455287号)を用いた機械式溶解法のような、熱安定性又はアルカリSDS安定性を要しないその他溶解法についても有望である。
好ましい態様では、細胞は自己溶解を利用し溶解する。自己溶解の1つの方法は、Bラクタム系抗生物質のような細胞壁破壊剤を発酵物に加えることによって細胞を破壊することである。又は、リソゾーム、若しくはペプチド系抗生物質をコードするファージを宿主菌株に産生させて細胞を破壊させることもできる。組換え体リソゾームは、細胞に細胞質型として発現させ、かつ細胞質から周辺細胞質に漏洩させるチャンネルを作るホリン(膜拡張ペプチド又はタンパク質)を同時発現させることによって、リソゾーム及びその他細胞質タンパク質を希望する時間に周辺細胞質に放出させることができる。利用可能なリソゾーム/ホリンの組み合わせの例は、当技術分野で公知であり、かつ参照により本明細書に組み入れられる。
自己溶解状態は、アルカリ又は熱溶解とは逆に、選択的にゲノムDNAを変性しない。溶解産物は非常に粘性であり、加工に際して問題となる。
我々は、本明細書において、抗生物質又はファージが仲介する溶解のような自己溶解が、プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が存在するとゲノムDNAを選択的に除去し、粘度を下げることを証明する(図17)。
自己溶解とプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)との組み合わせは、当技術分野において提案も実施もされていない。実際自己溶解法は、おそらくは、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)がなければゲノムDNAの汚染レベルが高いことを理由に、プラスミド製造での使用は考えられていない。今日の自己溶解法は、DNA以外の生体分子の製造への使用だけが考えられており、プラスミド及びゲノムDNAを排除するために非特異的ヌクレアーゼが組み入れられることが多い。発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)は、プラスミドDNA大規模製造への各種自己溶解法の使用を容易にする。
自己溶解プラスミド精製はまた、従来解決不可能と思われていた問題、即ちプラスミド加工処理における、多重的な細胞溶解及び清浄化段階の削減の問題も解決する。典型的なプラスミド精製工程は、発明の自己溶解精製を組み入れることによって劇的に短縮化でき、経済的効果的にすることができる(図19)。この精製法は、その能力を犠牲にすることなしに、有毒な試薬及びプラスミド精製の多重的要素(段階)を排除する。
ヌクレアーゼ産生
ヌクレアーゼ遺伝子の発現は、構成的、又は、より好ましくは誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダRP及びPL、T5、T7のようなその他ファージプロモータ、tac及びtrcのような合成プロモータ、lacのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ(cspA)、araBAD、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度(rmf)pH(cadA)、又は低酸素反応性(nar)プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇(PL、tac)、熱安定性レプレッサー(ラムダレプレッサー、lacレプレッサー)と同時の温度低下(cspA;コールドショックプロモータ)、インデューサー(tac、trc及びlacについてはIPTG;AraBADについてはアラビノース)、又はその他の手段(例えば定常期への移行、pH若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓;Makrides SC.1996 Microbiol.Rev.60:512−538に概説されている)によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスRNAによって誘導できる。
ヌクレアーゼ遺伝子の発現は、構成的、又は、より好ましくは誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダRP及びPL、T5、T7のようなその他ファージプロモータ、tac及びtrcのような合成プロモータ、lacのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ(cspA)、araBAD、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度(rmf)pH(cadA)、又は低酸素反応性(nar)プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇(PL、tac)、熱安定性レプレッサー(ラムダレプレッサー、lacレプレッサー)と同時の温度低下(cspA;コールドショックプロモータ)、インデューサー(tac、trc及びlacについてはIPTG;AraBADについてはアラビノース)、又はその他の手段(例えば定常期への移行、pH若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓;Makrides SC.1996 Microbiol.Rev.60:512−538に概説されている)によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスRNAによって誘導できる。
当技術分野では、複数の周辺細胞質又は細胞外を標的とするシグナルペプチドが知られており、参照によって本明細書に組み入れられる(例えば、Choi JH,and Lee SY.2004 S Appl.Microbiol.Biotechnol.64:625−635)。周辺細胞質を標的とする例示のリーダーペプチドはOmpA、PhoAOmpT、及びPelBである。
ヌクレアーゼはまた、NlpAリーダー及びファーストシックス(first six)アミノ酸のようなリーダーを用いた「アンカード周囲細胞質発現」のような公知のアンカータグを利用して膜に固定化してもよい(Harvey BR,Georgiou G,Hayhurst A,Jeong KJ,Iverson BL,and Rogers GK.2004 Proc.Natl.Acad.Sci.101:9193−9198)。又は、ヌクレアーゼは、細胞から増殖培地に分泌させ、溶解中にDNAと接触させることもできる。
代替として、ヌクレアーゼは、部位指定突然変異誘導を用いるか、小型のペプチド標的化タグの付加、又は分子育種法(Ness JE,Kim S,Gottman A,Pak R,Krebber A,Borchert TV,Govindarajan S,Mundorff EC,and Minshull J.2002 Nat.Biotechnol.20:1251−5;Kurtzman AL,Govindarajan S,Vahle K,Jones JT,Heinrichs V,Patten PA.2001 Curr.Opin.Biotechnol.12:361−70)を利用した定方向進化(Zhao H,Chockalingam K,and Chen Z.2002 Curr.Opin.Biotechnol.13:104−10)を用いて遺伝子工学的に変更し、活性若しくは安定性を高めるか、又は精製中に分離するようにすることもできる(Collen A,Ward M,Tjerneld F,and Stalbrand H.2001 J.Chromatogr.A.910:275−84)。
細胞自己溶解のためのポーリンシステム
膜に孔を作るファージポーリンタンパク質には二種類ある。これらは文献に明らかにされており、発明の実施の可能性を有するポーリンの非限定的リストは、参照により本明細書に組み入れられている(Young 1992,Supra;Wang IN,Smith DL and Young R.2000 Annu.Rev.Microbiol.54:799−825)。1つの種類は、大腸菌(E.coli)のT4及びラムダファージ、又はLactobacillusのバクテリオファージLL−Hのような二本鎖型DNAバクテリオファージに由来するものである。これらのポーリンタンパク質はホリンと呼ばれ、それらは細胞質膜内に集まり、周辺細胞質内に放出される細胞壁消化タンパク質のための孔を創る。これらの孔の範囲は、小さな(リソゾームに適合すると思われるT4tタンパク質で、細胞質から周辺細胞質に漏れる)ものからBガラクトシダーゼのような100kdを超えるタンパク質が通り抜けるのに適した(ラムダS;孔内径>10〜12nm、ステプチノマイシンO/リステリアリシンOサイトトキシンと同様のサイズ)十分大きなものまである。我々は、これらポーリン及びリソゾームを、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)と組み合わせて利用する製造用菌株の、プラスミド製造への使用法を考えている。これらポーリンを利用する自己溶解株は、タンパク質製造のために創られたものであり(Leung and Swartz,Supra,2001)、プラスミド製造での利用については当技術分野では記載されていない。
膜に孔を作るファージポーリンタンパク質には二種類ある。これらは文献に明らかにされており、発明の実施の可能性を有するポーリンの非限定的リストは、参照により本明細書に組み入れられている(Young 1992,Supra;Wang IN,Smith DL and Young R.2000 Annu.Rev.Microbiol.54:799−825)。1つの種類は、大腸菌(E.coli)のT4及びラムダファージ、又はLactobacillusのバクテリオファージLL−Hのような二本鎖型DNAバクテリオファージに由来するものである。これらのポーリンタンパク質はホリンと呼ばれ、それらは細胞質膜内に集まり、周辺細胞質内に放出される細胞壁消化タンパク質のための孔を創る。これらの孔の範囲は、小さな(リソゾームに適合すると思われるT4tタンパク質で、細胞質から周辺細胞質に漏れる)ものからBガラクトシダーゼのような100kdを超えるタンパク質が通り抜けるのに適した(ラムダS;孔内径>10〜12nm、ステプチノマイシンO/リステリアリシンOサイトトキシンと同様のサイズ)十分大きなものまである。我々は、これらポーリン及びリソゾームを、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)と組み合わせて利用する製造用菌株の、プラスミド製造への使用法を考えている。これらポーリンを利用する自己溶解株は、タンパク質製造のために創られたものであり(Leung and Swartz,Supra,2001)、プラスミド製造での利用については当技術分野では記載されていない。
又は、PhiX174のような単鎖型DNAファージは、ファージの放出に必要な単一の溶解タンパク質(遺伝子E)を産生する。このタンパク質、及びその他の単鎖型DNAファージに由来する溶解タンパク質は、ペニシリンに類似の様式で細胞壁の形成を阻止できる(Bernhardt TG,Wang IN,Struck DK and Young R.2002 Res.Microbiol.153:493−501に概説されている)。遺伝子E産物は、外膜と内膜の間に直径1μMのチャンネルを形成し、周辺細胞質を効果的に密封して、プラスミドDNAを含む細胞質内容物を非溶解性に(Witte A and Lubitz W.1989 Eur.J Biochem.180:393−398)培地内に放出する(図13;Young R,Wang IN and Roof WD.2000 Trends Micro.8:120−128に概説されている)。phiX174遺伝子Eシステムは、抗原又はDNAワクチン送達のための細菌ゴーストの作製に用いられている(Jalava K,Iko FO,Riedmann E and Lubitz W.2003 Expert Rev.Vaccines 2:45−51)。DNAワクチンの送達では、ゴーストはプラスミドDNAで埋め戻される。ゴーストの製造方法は、高マグネシウム(例えば0.1M MgSO4)中での増殖が溶解を防止するという観察に基づいて開発されている。製造法は:1)mg存在下での遺伝子Eの発現する段階;2)細胞のバッファーを交換する段階;及び3)マグネシウムを下げてチャンネルを形成させ、細胞質内容物を放出させる段階を含む(Jalava et al,上記、2003に概説されている)。
細菌ゴーストは、DNAプラスミド製造への応用について評価されたことはなく、放出されたプラスミドの完全性がこれまで評価されたことはない(Witte and Lubitz,Supra,1989)
ヌクレアーゼ及び/又は自己溶解遺伝子発現のための宿主株
ヌクレアーゼ遺伝子は、標的プラスミドに適合するプラスミドの中に存在してよく、又は好ましくはゲノム中に組み入れることができる。株の遺伝子工学的変更は、プラスミド製造に好適な任意の細菌株で実施できる。
ヌクレアーゼ遺伝子は、標的プラスミドに適合するプラスミドの中に存在してよく、又は好ましくはゲノム中に組み入れることができる。株の遺伝子工学的変更は、プラスミド製造に好適な任意の細菌株で実施できる。
ヌクレアーゼ発現プラスミドの統合コピーを持つ細菌株は、例えばラムダred gam組換えのような様々な技術を用いて作られる(Murphy KC 1998 J.Bad.180:2063−2071;Datsenko KA,Wanner BL.2000 Proc.Natl.Acad.ScL(USA).;97:6640−6645)。この技術は、一般的なプラスミド製造用宿主であるDH5αのようなrecA−株で上手く利用されている。要約すると、フランキング抗生物質耐性遺伝子を含む発現カセットを、統合部位に相同な配列を含むプライマーを用いてPCR増幅する。標的のDH5α株を、アンピシリン耐性ラムダRed組み換え機能を含むプラスミドpKD46を用いて、アラビノースを用いてRedリコンビナーゼ産生を誘導して形質転換する。細胞を調製し、報告されているようにしてPCR断片をエレクトロポレーションする。相同組換え体を、カナマイシンを用いて選択し、非許容温度(pKD46は複製の温度感受起点有する)にシフトさせてpKD46ヘルパープラスミドを治癒し、アンピシリン耐性の消失を確認する。
プラスミド製造
統合ヌクレアーゼ遺伝子を持つ大腸菌(E.coli)株を利用して、発酵培養でプラスミドDNAを製造でききる。例示的発酵工程は、当技術分野で公知である(概説についてはCarnes 2005参照:Carnes AE.2005 BioProcess International,October 2005,印刷中)。Nature Technology Corporationは、プラスミド製造に最適化された無動物産物バッチ(NTC3018)及び供給バッチ(NTC3019)発酵培地に、バッチ及び供給バッチ工程を用いている。これらの培地は、低い増殖速度を支持し、プラスミドの安定性と完全性を維持するために開発された。比増殖速度を0.12/時に維持するように供給が管理された、自動供給バッチ工程により、1100mg/L、及びOD600が120のプラスミド収量が達成されている。
統合ヌクレアーゼ遺伝子を持つ大腸菌(E.coli)株を利用して、発酵培養でプラスミドDNAを製造でききる。例示的発酵工程は、当技術分野で公知である(概説についてはCarnes 2005参照:Carnes AE.2005 BioProcess International,October 2005,印刷中)。Nature Technology Corporationは、プラスミド製造に最適化された無動物産物バッチ(NTC3018)及び供給バッチ(NTC3019)発酵培地に、バッチ及び供給バッチ工程を用いている。これらの培地は、低い増殖速度を支持し、プラスミドの安定性と完全性を維持するために開発された。比増殖速度を0.12/時に維持するように供給が管理された、自動供給バッチ工程により、1100mg/L、及びOD600が120のプラスミド収量が達成されている。
我々は、プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を産生する宿主株を利用して、例示的なプラスミド精製工程に、発酵培養物からプラスミドを多く含む供給流を作ることを考えている。ヌクレアーゼ株と高収率発酵及び例示的精製工程との組み合わせは、遺伝子治療及びDNAワクチン応用に受け入れ可能なレベルまでゲノムDNAを更に削減する、経済効果的な方法を提供するだろう。
実施例
発明の方法を、以下の実施例で詳しく例示する。これらは例示であり、いかなる形でも、発明の範囲を制限するものではない。
発明の方法を、以下の実施例で詳しく例示する。これらは例示であり、いかなる形でも、発明の範囲を制限するものではない。
実施例1:pVEX発現ベクター
pVEXSapIスタッファータンパク質発現ベクターは、図2に示している。プラスミドはpBR322の複製起点(ROP欠失)及びアンピシリン耐性マーカーを有している。
pVEXSapIスタッファータンパク質発現ベクターは、図2に示している。プラスミドはpBR322の複製起点(ROP欠失)及びアンピシリン耐性マーカーを有している。
このベクターは、大腸菌(E.coli)に対象の遺伝子を発現させる誘導性Tacプロモータを有している。発現はlacIq遺伝子産物(プラスミドにコードされている)によって抑制され、培地へのIPTGの付加によって誘導される。
対象の遺伝子は、図3に概要を示すようにATG及びTAAの接着末端を作り出すSapIタイプIISクローニング部位からなる「スタッファー」にクローニングされる。遺伝子は、クローンからの増幅、又は一般的なアドレスタグ及び固有配列特異的な配列を持つプライマーを用いたゲノムDNAからの増幅によってコピーが作られる。標的遺伝子内部にあるSapI部位が害を及ぼすことは、内部のSapI部位がアドレスタグの1つに一致する確率は1/16に過ぎないことから一般的にはない。
このプラスミドの誘導体、pVEXSapIHNタグスタッファーは、対象の遺伝子を、エンテロキナーゼ切断部位が後に続いているN末端NHタグと融合させる。このタグは、hisタグ同様に固定化された金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)樹脂に結合し、アフィニティー精製を可能にする。遺伝子は、SapI(New England Biolabs,Beverley NJ)で消化されて5’TAAG(エンテロキナーゼ切断部位の最後のリジン残基)及び3’TAAの3bpの接着末端を生ずるSapI部位を末端に組み入れたプライマーを用いてPCR増幅される。
実施例2:pVEXSapIOmpA分泌ベクターの構築
OmpA分泌シグナルペプチドは、次のようにして遺伝子工学的にpVEXスタッファーベクターに組み入れられる。OmpA分泌シグナルペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドをpVEXSapIスタッファーのNcoI部位にアニーリングさせて、その中にクローニングし、pVEXSapIOmpAスタッファーを作った。得られたクローンは、対象のタンパク質を周辺細胞質に向かわせるOmpAリーダーを発現する。OmpAリーダーを切り離して、対象の遺伝子のMetコドンの前に2アミノ酸リーダー(Ala−Thr)が付いた対象のタンパク質を残す。このべクターのマップは図4に示されている。細胞質構築体は、対象の遺伝子を含むNcoI/XhoI断片を、このベクター内に移入させることで分泌型構築体に変換できる。N末端HNタグをコードしているOmpAHNタグスタッファーは、オリゴをアニーリング挿入するためにNcoI消化したpVEXSapIHNタグスタッファーを用いて、上記と全く同じに構築された。
OmpA分泌シグナルペプチドは、次のようにして遺伝子工学的にpVEXスタッファーベクターに組み入れられる。OmpA分泌シグナルペプチドをコードしているオリゴヌクレオチドをpVEXSapIスタッファーのNcoI部位にアニーリングさせて、その中にクローニングし、pVEXSapIOmpAスタッファーを作った。得られたクローンは、対象のタンパク質を周辺細胞質に向かわせるOmpAリーダーを発現する。OmpAリーダーを切り離して、対象の遺伝子のMetコドンの前に2アミノ酸リーダー(Ala−Thr)が付いた対象のタンパク質を残す。このべクターのマップは図4に示されている。細胞質構築体は、対象の遺伝子を含むNcoI/XhoI断片を、このベクター内に移入させることで分泌型構築体に変換できる。N末端HNタグをコードしているOmpAHNタグスタッファーは、オリゴをアニーリング挿入するためにNcoI消化したpVEXSapIHNタグスタッファーを用いて、上記と全く同じに構築された。
実施例3:pVEXOmpAHNRNase発現ベクターの構築
ウシ膵臓RNase遺伝子を、ウシゲノムDNAからPCR増幅した。全てのPCRは、Pfu DNAポリメラーゼを用いて(余分な塩基が平滑断片の端部に付加されるのを回避するため)、標準的なPCR法により行われた。
ウシ膵臓RNase遺伝子を、ウシゲノムDNAからPCR増幅した。全てのPCRは、Pfu DNAポリメラーゼを用いて(余分な塩基が平滑断片の端部に付加されるのを回避するため)、標準的なPCR法により行われた。
400bpのPCR産物をSapIで消化し、100及び300bp(内部SapI部位)の断片をゲル精製し、標準的なクローニング法を用いて、SapI消化したpVEXOmpAHNスタッファーベクターにクローニングした。組換え体(pVEXOmpAHNRNase)は配列を確認した。
実施例4:T5エクソヌクレアーゼのクローニング
T5 D15エクソヌクレアーゼ遺伝子をファージT5(ATCC 11303−B5)からPCB増幅し、クローニングして、配列の確認を行った。900bpの断片を精製し、鋳型として用いてHNスタッファー適合断片をPCR増幅した。これらの断片を精製し、変更されたポリリンカーを持つpUC19誘導体であるpW2.0ベクターのSmaI部位に平滑断端クローニングした。PW2.0−T5及びpW2.0−HNT5クローンを単離し、配列を確認した。
T5 D15エクソヌクレアーゼ遺伝子をファージT5(ATCC 11303−B5)からPCB増幅し、クローニングして、配列の確認を行った。900bpの断片を精製し、鋳型として用いてHNスタッファー適合断片をPCR増幅した。これらの断片を精製し、変更されたポリリンカーを持つpUC19誘導体であるpW2.0ベクターのSmaI部位に平滑断端クローニングした。PW2.0−T5及びpW2.0−HNT5クローンを単離し、配列を確認した。
実施例5:pVEXBOmpAスタッファー発現ベクターの構築
漏洩発現及び全体の誘導性発現がより低い第二発現系を構築した。このベクター、pVEXBSapIOmpAスタッファーは、AraBADプロモータを含み、かつtacプロモータを含む親のpVEXSapIOmpAスタッファーベクターがIPTGで誘導されるのに対し、アラビノースの付加によって誘導ができる。
漏洩発現及び全体の誘導性発現がより低い第二発現系を構築した。このベクター、pVEXBSapIOmpAスタッファーは、AraBADプロモータを含み、かつtacプロモータを含む親のpVEXSapIOmpAスタッファーベクターがIPTGで誘導されるのに対し、アラビノースの付加によって誘導ができる。
AraBADプロモータ及び、それに続くaraCレプレッサーを、DH5αゲノムDNAからPCR増幅した。この増幅産物(1.3kb)をAraIで消化し、EcoRI/XhoIで消化したpVEXベクターにクローニングした。得られたクローンは、スタッファーの下流にAraBADオペロンを含んだ。AraBAD領域をXhoI及びEcoRIで切り出し、dNTP及びクレノーで埋めて接着端を平端化した。1.3kbの断片をpVEXSapIOmpAスタッファーベクター(bp247〜3108)及びpVEXSapIOmpANHタグスタッファーベクターの2.8kbの主鎖断片にクローニングした。主鎖断片は、MluI及びXbaIで消化したベクターをゲル精製して獲得し、クレノー及びdNTPで平滑端化し、CIP処理した。得られたクローンを、制限消化及び配列確認によってAraBADの方向についてスクリーニングした。最終的な構築体、pVEXBSapIOmpAスタッファー(図5)及びpVEXBSapIOmpHNタグスタッファーは、lacIq遺伝子及びtacプロモータが、AraCレプレッサー及びaraBADプロモータで交換されている。
実施例6:pVEXBOmpAHNRNaseの構築
NHRNase遺伝子を、NcoI/XhoIを用いた消化によってpVEXOmpAHNRNaseから切り出し、NcoI/XhoIで消化したpVEXBSapIOmpAHNタグスタッファーベクターに移入した。
NHRNase遺伝子を、NcoI/XhoIを用いた消化によってpVEXOmpAHNRNaseから切り出し、NcoI/XhoIで消化したpVEXBSapIOmpAHNタグスタッファーベクターに移入した。
実施例7:pVEXBOmpARNase発現ベクターの構築
HNタグは、AraIを含むプライマーを用いてプラスミド全体をPCR増幅することによって、pVEXBOmpAHNRNaseから取り除いた。PCR増幅はベクター長のPCR断片を生じた。精製したPCR産物をAarIで切断し、連結するとHNタグが正確に削除される適合接着端(プライマー中に二重下線を付けた)を創った。pVEXBOmpARNaseのクローン(図6)を単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
HNタグは、AraIを含むプライマーを用いてプラスミド全体をPCR増幅することによって、pVEXBOmpAHNRNaseから取り除いた。PCR増幅はベクター長のPCR断片を生じた。精製したPCR産物をAarIで切断し、連結するとHNタグが正確に削除される適合接着端(プライマー中に二重下線を付けた)を創った。pVEXBOmpARNaseのクローン(図6)を単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
実施例8:pVEXBOmpAT5RNase発現ベクターの構築
HNタグは、AarI含有プライマーを用いたプラスミド全体のPCR増幅によってpVEXBOmpAHNRNaseから削除した。次にT5エクソヌクレアーゼを、ギャップを入れたプラスミドにクローニングした。pVEXBOmpAHNRNaseのPCR増幅は、ベクター長のPCR断片を生じた。T5特異的プライマーを用いたpW2.0T5のPCR増幅は、900bpのT5遺伝子を生じた。精製したPCR産物をAarIで切断し、連結によってHNタグが正確に削除され、かつT5遺伝子が挿入される適合接着端を創った。pVEXBOmpAT5RNase(図7)のクローンを単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
HNタグは、AarI含有プライマーを用いたプラスミド全体のPCR増幅によってpVEXBOmpAHNRNaseから削除した。次にT5エクソヌクレアーゼを、ギャップを入れたプラスミドにクローニングした。pVEXBOmpAHNRNaseのPCR増幅は、ベクター長のPCR断片を生じた。T5特異的プライマーを用いたpW2.0T5のPCR増幅は、900bpのT5遺伝子を生じた。精製したPCR産物をAarIで切断し、連結によってHNタグが正確に削除され、かつT5遺伝子が挿入される適合接着端を創った。pVEXBOmpAT5RNase(図7)のクローンを単離し、制限消化及び配列決定によって確認した。
実施例9:プラスミド調製中のゲノムDNAのT5RNase消化
pVEXBOmpARNase(RNase)又はpVEXBOmpAT5RNase(T5RNase)プラスミドを含むDH5α細胞株を、5mMのMgSO4を含むLP液体培地の中で、37℃で増殖させ、対数期半ばに(約0.5OD600/mL)アラビノースを0.2%まで加えてタンパク質の発現を誘導した。4時間、29℃で誘導した後、培養物を回収した。コントロールの非誘導培養物も、同一条件で増殖した。細胞を沈降させ、−20℃、又は4℃で一晩貯蔵した。
pVEXBOmpARNase(RNase)又はpVEXBOmpAT5RNase(T5RNase)プラスミドを含むDH5α細胞株を、5mMのMgSO4を含むLP液体培地の中で、37℃で増殖させ、対数期半ばに(約0.5OD600/mL)アラビノースを0.2%まで加えてタンパク質の発現を誘導した。4時間、29℃で誘導した後、培養物を回収した。コントロールの非誘導培養物も、同一条件で増殖した。細胞を沈降させ、−20℃、又は4℃で一晩貯蔵した。
−20℃に貯蔵した細胞を融解し、10分間、37℃でインキュベーションした。4℃の細胞は、追加の前処理を行わずに加工した。RNase誘導細胞には溶解が観察されたが、T5RNase誘導細胞又は非誘導細胞には溶解は観察されなかった。
核酸の分解は、二つのアッセイで評価した。第一のアッセイでは、全DNAを4℃の細胞から、Williamsらの迅速スクリーニングプロトコール(Williams,J.A.,Langeland,J.A.,Thalley,B.,Skeath,J.B.,and Carroll,S.B.(1994).Production and purification of polyclonal antibodies against proteins expressed in 大腸菌(E.coli).DNA Cloning:Expression Systems、IRL Press)を利用して抽出した。簡単に説明すると、細胞を細胞破壊バッファー(10mM Tris pH8.0、100mM NaCl、10mM EDTA)に浮遊し、フェノールで抽出して、RNase処理し、トラッカー色素を加えた後DNAを1%アガロースゲルで分析した。第二のアッセイでは、全核酸(RNaseを含む)をQiagen miniprepのバッファー(P1、P2、N3)を用い、P1バッファーにRNaseを加えない以外はそのプロトコール(Qiagen QIAprep minprep Handbook、March 2002)に従って単離した。遠心分離により浄化した溶解液を調製した後、溶解液を37℃で10分間インキュベーションし、3倍容積量の95%エタノールを加えて核酸を沈降させ、遠心分離して回収し、70%エタノールで洗った後、10mMのMgSO4を含むQiagenバッファー(10mM Tris、pH8.5)に再浮遊した。サンプルを10分間、37℃でインキュベーションし、トラッカー色素を加え、1%アガロースゲルで核酸を分析した。
結果(図8)は、アルカリ溶解プラスミド製造において、T5RNase融合体による「プラスミド−セーフ」ゲノムDNAの特異的分解を証明した。誘導した細胞は生存し(誘導後引き続き増殖し)、凍結融解中も溶解しなかった。レーン1及び5では、非誘導及びRNaseコントロールと比べると、誘導されたT5RNaseによりアルカリ溶解物中から染色体のDNAバンド(>12kbの大バンド)が完全に除去されていることに注意せよ。−20℃貯蔵サンプルにはプラスミドDNAの分解が見られないのに対し(レーン1と3を比較せよ;レーン1に残った大きなバンドはスーパーコイルを形成しているダイマーである)、4℃で調製したサンプルではゲノムDNAは完全に除去され、かつプラスミドDNAの部分的な消化が観察される。このことは、前処理が異なると(4℃一晩のインキュベーション、対−20℃サンプルの凍結溶解及び10分間、37℃)、細胞質へのヌクレアーゼの誘導に差が生じることを示している。全核酸抽出物からゲノムDNAがT5RNaseによって一部除去されることはレーン9にも観察されるが、アルカリ溶解によって精製した前処理サンプルほど完全なものではない。ゲルをスキャニングし、レーン1〜4のバンドを積算して定量化した。結果を表1にまとめる。ゲノムDNAのレベルは、RNase誘導レーンでは低いが、これは観察された細胞溶解によるものである。T5RNase誘導サンプルでは、T5RNase非誘導サンプルに比べ、ゲノムDNA量は50倍減少しているが、プラスミドのレベルは下がっていない。このことは、キメラヌクレアーゼがプラスミド下降中のゲノムDNA削減に利用できることを証明している。
実施例10:RNaseS−T5融合体
ゲノムDNA及びRNAの除去に有用なキメラヌクレアーゼを作るために、T5エクソヌクレアーゼとは別のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を、SペプチドSタンパク質システムを用いて創った。ここでは、我々は、このような融合体の構築と評価について記載し、プラスミド製造における有用性を証明する。これら融合体は、以下に示すように、RNase活性と強化されたDNase活性の両方を保持している。
ゲノムDNA及びRNAの除去に有用なキメラヌクレアーゼを作るために、T5エクソヌクレアーゼとは別のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を、SペプチドSタンパク質システムを用いて創った。ここでは、我々は、このような融合体の構築と評価について記載し、プラスミド製造における有用性を証明する。これら融合体は、以下に示すように、RNase活性と強化されたDNase活性の両方を保持している。
RNaseAのN末端Sペプチドに異種タンパク質を融合させたものは、RNaseのSタンパク質と会合した後RNase活性を獲得することが証明されている。Sペプチドは、20アミノ酸長のウシ膵臓RNaseAのN末端断片であり、サブチリシン切断によって放出され、C末端断片(21〜124)はSタンパク質である。Sタンパク質とSペプチドは、高い親和力(pH8.3において3.1×10〜11M)で結合してRNaseSとなり、これは元のRNase7と同等の酵素活性を有している。Sタグシステム(McCormick M and Mierendorf R.1994 InNovations 1:4−7)は、機能的なRNaseに異種タンパク質を融合させるのに利用されているタンパク質精製システムである。SタグはSペプチドのN末端側15アミノ残基であり、異種タンパク質と結合した場合でもSタンパク質と相互作用して活性なRNaseを生成する。Sタグ(及びSペプチド)はきわめて可溶性であり、大腸菌(E.coli)ないで高レベルに発現され、いずれの末端と融合した場合でも、Sタンパク質との高親和性相互作用を仲介できる。Sタグ又はSペプチド、融合体を迅速に検出し、定量化するための、Sタンパク質との会合(Sタグウエスタンブロット)又は機能的RNaseSの再構築(Sタグ陣属アッセイ)に基づいた試薬がNovagenより市販されている。キメラヌクレアーゼ作製へのこのシステムの利用を図9に示す。
pVEXBOmpA−Sタンパク質は、OmpA分泌リーダー配列(シグナル配列)をRNaseのSタンパク質断片に融合する。OmpASタンパク質(16〜124)又はOmpASタンパク質(20〜124)のいずれかをコードする二種類のベクターを作製した。両ベクターとも、インビボでは同様の機能を示す。これら構築体は、周辺細胞質分泌中にOmpAリーダーが切断された後、正確にSタンパク質断片を放出するように設計されている。これら構築体の発現ベクターは、同時発現研究のために、pACYC177(pVEXに適合している)に移された。pACYC177は、pVEXに比べるとコピー数が少なく、作られるSタンパク質の数はSペプチドより少なくなる。これは、Sタンパク質の折りたたみ促進にはSペプチドが必要とされることから、意図的に行ったものである。
S−ペプチド(S−タンパク質と会合するための)をT5エクソヌクレアーゼのN末端(S−ペプチド−T5)に融合させ分泌型S−ペプチド−T5融合ベクター(pVEXBOmpAS−ペプチドT5)を作るか、又はC末端に融合させ分泌型のT5−Sペプチドベクター(pVEXBOmpAT5−Sペプチド)を作製した。S−ペプチドの未変性のN末端を正確に放出させるために、OmpA又はPhoA分泌リーダー配列を利用した。
同時発現させた時、Sペプチド及びSタンパク質断片はRNaseSとして会合し、RNase機能だけでなく、融合したT5エクソヌクレアーゼからDNase機能も与えられるように設計されている。
実施例11:プラスミド生成RNaseS−T5融合体
一例として、RNaseS−T5を用いたゲノムDNA削減の全般的な方策を図10に示す。発現及び分析は、実施例9のT5RNaseに関する記載と同様にして行われた。これら融合体を発現している細胞株では、ゲノムDNA及びRNAの削減か観察された(図11〜12)。OmpASペプチド−T5構築体は、いずれかのOmpASタンパク質構築体(16〜124又は20〜124)が共存すると、いずれかの構築体単独の場合に比べてゲノムDNA及びRNAを削減した。OmpAT5−Sペプチド構築体はタンパク質分解感受性(SDS−PAGE分析により分解バンドが検出された)であり、予想通りOmpASペプチド−T5構築体に比べRNase及びDNaseの活性が低下していた。他のT5又はSペプチド−T5構築体は全てタンパク質分解安定(SDS−PAGE分析により、予想通りのバンドが観察された)であった。このことは、T5エクソヌクレアーゼの活性が、RNaseSとの会合によって高められ、かつRNase活性も保持していることを証明している。
一例として、RNaseS−T5を用いたゲノムDNA削減の全般的な方策を図10に示す。発現及び分析は、実施例9のT5RNaseに関する記載と同様にして行われた。これら融合体を発現している細胞株では、ゲノムDNA及びRNAの削減か観察された(図11〜12)。OmpASペプチド−T5構築体は、いずれかのOmpASタンパク質構築体(16〜124又は20〜124)が共存すると、いずれかの構築体単独の場合に比べてゲノムDNA及びRNAを削減した。OmpAT5−Sペプチド構築体はタンパク質分解感受性(SDS−PAGE分析により分解バンドが検出された)であり、予想通りOmpASペプチド−T5構築体に比べRNase及びDNaseの活性が低下していた。他のT5又はSペプチド−T5構築体は全てタンパク質分解安定(SDS−PAGE分析により、予想通りのバンドが観察された)であった。このことは、T5エクソヌクレアーゼの活性が、RNaseSとの会合によって高められ、かつRNase活性も保持していることを証明している。
実施例12:PhiX174遺伝子E発現ベクターの構築
phiX174遺伝子Eタンパク質を、AraBAD制御の下で、既存の高コピーpUC起源プラスミド(たとえばgWiz−GFP、pDNAVACCUltra−EGFP)及びpBR322起源プラスミド(例えばpVEXBT5RNase)と適合するプラスミドにクローニングした。
phiX174遺伝子Eタンパク質を、AraBAD制御の下で、既存の高コピーpUC起源プラスミド(たとえばgWiz−GFP、pDNAVACCUltra−EGFP)及びpBR322起源プラスミド(例えばpVEXBT5RNase)と適合するプラスミドにクローニングした。
pVEXB−未変性スタッファー
pVEXSaplスタッファーベクターをXhaI及びMluIで消化した。接着端はクレノー及びdNTPを用いて埋め、加熱して殺した。この端部を、ウシ小腸ホスファターゼを使って脱リン酸化した。2.8kbの断片を、1.5kbの断片からゲル精製した。pVEXBベクターをEcoRI及びXhoIで消化した。接着端はクレノー及びdNTPを用いて埋めた。araBプロモータを含む1.3kbの断片を4.3kbからゲル精製した。ステップ1の断片とステップ2の断片を連結し、形質転換し、Ampについてスクリーニングした。正しい方向のクローン(pVEXB−未変性スタッファー)を制限消化により選び、配列決定して確認した。
pVEXSaplスタッファーベクターをXhaI及びMluIで消化した。接着端はクレノー及びdNTPを用いて埋め、加熱して殺した。この端部を、ウシ小腸ホスファターゼを使って脱リン酸化した。2.8kbの断片を、1.5kbの断片からゲル精製した。pVEXBベクターをEcoRI及びXhoIで消化した。接着端はクレノー及びdNTPを用いて埋めた。araBプロモータを含む1.3kbの断片を4.3kbからゲル精製した。ステップ1の断片とステップ2の断片を連結し、形質転換し、Ampについてスクリーニングした。正しい方向のクローン(pVEXB−未変性スタッファー)を制限消化により選び、配列決定して確認した。
pACYCBの未変性ベクター(図14)及びOmpAスタッファーベクター
pVEXBOmpAスタッファー及び未変性のスタッファー発現ベクターからのカセットは、pACYCベクターに移して、pUCとpBR322をベースとする起源ベクター(例えばpVEX及びpDNAVACCUltraベクター)と同時発現させることができる。CIP処理し、ゲル精製したXmnI消化pACYC−RILプラスミド(断片A)を発現させた。pVEXBOmpAスタッファー及びpVEXB未変性スタッファーをEcoRIで消化し(クレノー及びdNTPで埋める)、より小型の断片(pVEXBOmpAスタッファーは2703、1466、断片B1である;pVEXB未変性スタッファーはわずかにこれより小さい断片B2である)を精製した。断片A、B1(pACYCBOmpAスタッファー)又はAとB2(pACYCB未変性スタッファー)を混合し、連結した。連結物でDH5αコンピテント細胞を形質転換し、黒ラムふぇにコール寒天プレートで選択した。クローン、及び方向を、制限消化により確認した。
pVEXBOmpAスタッファー及び未変性のスタッファー発現ベクターからのカセットは、pACYCベクターに移して、pUCとpBR322をベースとする起源ベクター(例えばpVEX及びpDNAVACCUltraベクター)と同時発現させることができる。CIP処理し、ゲル精製したXmnI消化pACYC−RILプラスミド(断片A)を発現させた。pVEXBOmpAスタッファー及びpVEXB未変性スタッファーをEcoRIで消化し(クレノー及びdNTPで埋める)、より小型の断片(pVEXBOmpAスタッファーは2703、1466、断片B1である;pVEXB未変性スタッファーはわずかにこれより小さい断片B2である)を精製した。断片A、B1(pACYCBOmpAスタッファー)又はAとB2(pACYCB未変性スタッファー)を混合し、連結した。連結物でDH5αコンピテント細胞を形質転換し、黒ラムふぇにコール寒天プレートで選択した。クローン、及び方向を、制限消化により確認した。
pACYCB遺伝子(図15)
phiX174遺伝子Eタンパク質は、10ngのphiX174ゲノムDNAを鋳型として用いてPCR増幅した。5×45Cアニーリング、25×55Cアニーリングを、1分間、72℃での伸張及び95℃での30秒間の変性と組み合わせて用いた。pACYC−B未変性スタッファーをSapIで消化し、二種類の断片(4375、282、34)を精製した。PCR断片もSapIで消化した。三種類の断片を混合し、連結した。連結物でDH5αを形質転換し、LB+クロラムフェニコール+グルコース(0.2%)上で形質転換させた(グルコースは漏洩発現を下げるために加えられる)。pACYCB phiX174遺伝子Eベクターを、制限消化で確認し、配列を決定した。
phiX174遺伝子Eタンパク質は、10ngのphiX174ゲノムDNAを鋳型として用いてPCR増幅した。5×45Cアニーリング、25×55Cアニーリングを、1分間、72℃での伸張及び95℃での30秒間の変性と組み合わせて用いた。pACYC−B未変性スタッファーをSapIで消化し、二種類の断片(4375、282、34)を精製した。PCR断片もSapIで消化した。三種類の断片を混合し、連結した。連結物でDH5αを形質転換し、LB+クロラムフェニコール+グルコース(0.2%)上で形質転換させた(グルコースは漏洩発現を下げるために加えられる)。pACYCB phiX174遺伝子Eベクターを、制限消化で確認し、配列を決定した。
実施例13:遺伝子E誘導細胞のゴースト化による高コピーpUC起源プラスミドの放出
細胞株は、Zコンピテント(Zymos)大腸菌(E.coli)細胞を精製したプラスミドで形質転換し、抗生物質及び0.2%グルコース(アラビノースプロモーターからの遺伝子E漏洩発現を低下させるため)を含むアガロースプレートで増殖させて作製した。この細胞株を、34ug/mLのクロラムフェニコール(遺伝子E発現プラスミドを含む株)及び/又は50ug/mlのカナマイシン(pDNAVACCUltraプラスミドを含む株)、又は100ug/mLのアンピシリン(pVEXプラスミドを含む株)を含有するLB培地で、37℃で増殖させ、対数増殖期に誘導した(約0.5OD600/mL)。100倍濃度の保存液から最終濃度0.2%になるようにアラビノースを加え、アラビノース誘導を行った。ゲル分析用の培地抽出物は、1)浄化した培地を用いるか、又は2)フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿及びTE(20倍濃度)へ再懸濁することによって調製した。ゲル分析用の細胞沈殿抽出物は、細胞沈殿物をバッファー(10〜20倍濃度)に再懸濁し、規定温度及び時間インキュベーションし、続いてフェノールクロロホルム抽出することで調製した。上清は、ゲル電気泳動により直接分析した。細胞沈殿物中の全核酸は、Williamsら、上記、1994に記載されている細胞破壊バッファーを用いて、10〜20倍濃度(元の培地容積と比べ)の細胞破壊バッファーを用いて、かつRNaseは加えずに抽出した。抽出物はアガロースゲル電気泳動を用いて核酸について分析し、RNA及びDNAは、1/10,000に希釈したSYBR Gree II(Sigma)を用いて後染色して視覚化した。
細胞株は、Zコンピテント(Zymos)大腸菌(E.coli)細胞を精製したプラスミドで形質転換し、抗生物質及び0.2%グルコース(アラビノースプロモーターからの遺伝子E漏洩発現を低下させるため)を含むアガロースプレートで増殖させて作製した。この細胞株を、34ug/mLのクロラムフェニコール(遺伝子E発現プラスミドを含む株)及び/又は50ug/mlのカナマイシン(pDNAVACCUltraプラスミドを含む株)、又は100ug/mLのアンピシリン(pVEXプラスミドを含む株)を含有するLB培地で、37℃で増殖させ、対数増殖期に誘導した(約0.5OD600/mL)。100倍濃度の保存液から最終濃度0.2%になるようにアラビノースを加え、アラビノース誘導を行った。ゲル分析用の培地抽出物は、1)浄化した培地を用いるか、又は2)フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿及びTE(20倍濃度)へ再懸濁することによって調製した。ゲル分析用の細胞沈殿抽出物は、細胞沈殿物をバッファー(10〜20倍濃度)に再懸濁し、規定温度及び時間インキュベーションし、続いてフェノールクロロホルム抽出することで調製した。上清は、ゲル電気泳動により直接分析した。細胞沈殿物中の全核酸は、Williamsら、上記、1994に記載されている細胞破壊バッファーを用いて、10〜20倍濃度(元の培地容積と比べ)の細胞破壊バッファーを用いて、かつRNaseは加えずに抽出した。抽出物はアガロースゲル電気泳動を用いて核酸について分析し、RNA及びDNAは、1/10,000に希釈したSYBR Gree II(Sigma)を用いて後染色して視覚化した。
遺伝子E溶解タンパク質発現による核酸の放出
三種類の細胞株:1)pACYC−B−遺伝子E、2)pACYC−B−遺伝子E+pDNAVACCUltra−GCP、及び3)pDNAVACCultra−GFPを作製し、評価した。pDNAVACCultraは、pACYCプラスミドと適合する、高コピーカナマイシンpMB1起源プラスミドである。
三種類の細胞株:1)pACYC−B−遺伝子E、2)pACYC−B−遺伝子E+pDNAVACCUltra−GCP、及び3)pDNAVACCultra−GFPを作製し、評価した。pDNAVACCultraは、pACYCプラスミドと適合する、高コピーカナマイシンpMB1起源プラスミドである。
細胞は;A)非誘導;又はB)0.2%までのアラビノースにより誘導;又はC)0.2M MgSO4存在下(ゴースト化を阻害するため)で0.2%までのアラビノースにより誘導した。上清を、アガロースゲル電気泳動を用いて、核酸について分析し、RNA及びDNAは、1/10,000希釈したSYBR Green II(Sigma)で後染色して視覚化した。1.5mLの細胞からの沈殿物を100uLのTEバッファー(10mM Tris、1mM EDTA、pH8.0)に再懸濁し、RTで1時間インキュベーションし、細胞を沈降させた。TE細胞抽出物を、ゲル電気泳動を用いて上記同様に分析した。
誘導後、プラスミド(pDNAVACCultra−GFP)からLB及び抽出上清へのPhiX174遺伝子Eの放出が観察された。RNA及びゲノムDNAもまた放出された。細胞内のプラスミドは、その大部分が誘導されたサンプルから(MgSO4なし)培地及びTE抽出物中に放出された。遺伝子Eを0.2MのMgSO4存在下に誘導すると、プラスミドはLBには放出されなかったが、TE抽出バッファーのMg濃度を下げると放出された。これらの実験は、培養物のゴースト化が、遺伝子E及び高コピープラスミドが存在すると起こること、及びプラスミドの放出が遺伝子E誘導に依存していることを証明している。pDNAVACCUltraのみの細胞株からはプラスミドは放出されず、プラスミドの放出がphiX174遺伝子E産物に依存していることが実証された。更に培地へのプラスミドの放出は、培地に0.2MのMgSO4を加えることによって阻止できる。これにより細胞を回収することができ、バッファーを交換してマグネシウムを取り除き、プラスミドを放出させることができるようなる。
phiX174遺伝子E誘導によるpDNAVACCultra−GFPプラスミド放出の経時変化を追った。20〜40分誘導後に、細胞から無傷のプラスミドが放出された。
Phix174遺伝子E+pDNAVACCultra−GFP非誘導及び誘導沈殿物由来のプラスミドをPI、TE、PBS、EB(10mM Tris、pH8.5)、BB(50mM PO4、300mM NaCl)又は10mM MgCl2を用いて抽出した。プラスミド及びRNA及びゲノムDNAは、すべてのこれらの条件で抽出した(図16)。PI又はEBを用いて大量のプラスミドを抽出したところ、抽出後細胞沈殿物中のプラスミドはほとんど残っていなかった(図16、レーンB2とB1とを比較せよ)。EBでのプラスミド放出は、プラスミドの放出にEDTAが必要ないことを証明している。このことは、加工中にEDTAなしの処理でLPSの放出が可能になることから有益である。
プラスミド及びゲノムDNAの抽出、及びRNAの完全性を比較すると、いくつか差が見られた。例えば、RNAの抽出は BB、10mM MgCl2、及びPBSで少なく、一方ゲノムDNA及びプラスミドは10mM MgCl2で少なかった。これらの塩及びカチオンの作用を最適化して、放出されるプラスミドの純度を高めることができる。
非誘導、誘導及び誘導+10又は30mMスペルミン時のプラスミド放出を比較することで、スペルミン存在下でのpDNAVACCultra−GFPのphiX174遺伝子E放出を決定した。LBへのプラスミド及びゲノムの放出は、30mMのスペルミンによって阻害され、10mMのスペルミンにより部分的に阻害された。全沈殿物及び30mMスペルミンの溶出物については、RNAは検出されなかった。スペルミン処理細胞は、PI、TE、又はEBによるプラスミド抽出に耐性であったが、30mMスペルミン処理細胞からは、PBS、BB(50mM PO4、300mM NaCl)又は10mM MgCl2で一部のプラスミドが抽出された。誘導化細胞を一晩RTでインキュベーションすると、三種類の誘導条件全てについて、培地へのプラスミドの放出が観察された。スペルミンによってより多くのRNAが放出され(又は圧縮された)、かつLB中で一晩インキュベーションした後のプラスミドへの切れ込みがきわめて少ないことが観察された。このことは、放出されたプラスミドが、培地中に保存された場合は安定であることを証明している。
phiX174遺伝子Eが仲介するプラスミドの放出について、細胞沈殿物を、バッファーPI又は50mM Tris、10mM MgCl2、pH8.0の中、RT、37℃、55℃、及び65℃で30分間インキュベーションして試験した。RT、37℃、又は55℃は、プラスミドの放出及び完全性に影響せず、PI中、65℃では一部が溶解し、プラスミドに切れ目が入り、またゲノムが増加した。RTと比較したとき、37℃での一部RNAの分解がPIで観察されたが、Tris/mgでは観察されなかった。
全体として、これらの結果は、遺伝子E溶解タンパク質が誘導するプラスミドの放出が、細胞からの、高い収率での無傷プラスミドの放出に適していることを実証している。プラスミドの放出は、培地中にスペルミジン、又はその他圧縮剤があってもなくても、抽出バッファーのイオン強度/pHを変えることによって制御できる。このことはまた、バッファーを各種バッファーに交換することによって、酵素によるゲノムDNA/RNA除去の最適条件下で細胞からプラスミドを放出させられることも証明している。しかしながら、この方法を用いると、高レベルのゲノムDNA及びRNAが放出される。
実施例14:遺伝子E溶解タンパク質が誘導する細胞ゴースト化で放出されたゲノムDNA及びRNAの除去
RNA及びゲノムDNAのヌクレアーゼによる削減
五種類の細胞株:1)pACYC−B−遺伝子E;2)pACYC−B−遺伝子E+pDNAVACCUltra−GFP;3)pDNAVACCultra−GFP;4)pACYC−B−遺伝子E+pVEXBT5RNase;及び5)pVEXBT5RNaseを作製し、評価した。pVEXBT5RNaseは、適度のコピーを持つアンピシリン耐性pMB1起源のプラスミドで、pACYCプラスミドに適合しており、RNA、ゲノムDNAに対し活性であるが、スーパーコイルを形成しているプラスミドには活性でないアラビノース誘導性ヌクレアーゼを含んでいる。
RNA及びゲノムDNAのヌクレアーゼによる削減
五種類の細胞株:1)pACYC−B−遺伝子E;2)pACYC−B−遺伝子E+pDNAVACCUltra−GFP;3)pDNAVACCultra−GFP;4)pACYC−B−遺伝子E+pVEXBT5RNase;及び5)pVEXBT5RNaseを作製し、評価した。pVEXBT5RNaseは、適度のコピーを持つアンピシリン耐性pMB1起源のプラスミドで、pACYCプラスミドに適合しており、RNA、ゲノムDNAに対し活性であるが、スーパーコイルを形成しているプラスミドには活性でないアラビノース誘導性ヌクレアーゼを含んでいる。
培養物を誘導しないか、又は誘導後(0.2%アラビノースで遺伝子E及びT5RNaseの両方を誘導)70分間増殖させ、培養上清及び浸透圧ショック処理した細胞沈殿物中の核酸をゲル電気泳動を使って調べた。PhiX174遺伝子E溶解タンパク質及びpVEXBT5RNaseを含む誘導処理された細胞株では、T5TNaseを誘導すると、培地中に放出されるゲノムDNAの量が大きく減少した。同じ効果は、浸透圧ショックを加えた細胞沈殿物(5mM MgSO4、データ未提示)についても観察された。非誘導細胞からのゲノムの放出は、今回の実験で、高いOD600値の非誘導コントロールにおいてゴースト化が起こった原因である、溶解タンパク質の漏洩発現によるものである。このことは、T5RNaseの同時発現が、遺伝子Eが放出させたゲノムDNAを破壊すること、並びに放出されたプラスミドの純度の向上及び溶解物の粘度の低下に利用できることを証明している。
実施例15:PhiX174遺伝子Eタンパク質仲介自己溶解を用いたプラスミドDNAの製造
プラスミド製造では、プリオン遺伝子の発現をゲノム内に組み入れる必要があるだろう。プリオン遺伝子の発現は、誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダRP及びPL、T5、T7のようなその他ファージプロモータ、tac及びtrcのような合成プロモータ、lacのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ(cspA)、araBAD、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度(rmf)pH(cadA)、又は低酸素反応性(nar)プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇(PL、tac)、熱安定性レプレッサー(ラムダレプレッサー、lacレプレッサー)と同時の温度低下(cspA;コールドショックプロモータ)、インデューサー(tac、trc及びlacについてはIPTG;AraBADについてはアラビノース)、又はその他の手段(例えば定常期への移行、pH若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓;Makrides SC.1996 Microbiol.Rev.60:512−538に概説されている)によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスRNAによって誘導できる。様々な誘導性phiX174遺伝子E発現システムが開発されており、熱(C1857により制御される突然変異誘導ラムダPR;Jechlinger W,Szostak MP,Witte A,and Lubitz W.1999 FEMS Micro.Lett.173:347−352)、寒さ(lac又はファージレギュレータと組み合わせたC1857により制御されるラムダPR、Jechlinger W,Szostak MP and Lubitz W.1998 Gene 218:1−7)、或いは化学物質(ラクトース若しくはIPTGとlacPO/Ptac、又は3MBZとxylSレプレッサー−PTol)によって制御される。
プラスミド製造では、プリオン遺伝子の発現をゲノム内に組み入れる必要があるだろう。プリオン遺伝子の発現は、誘導性プロモータによって駆動できる。好ましい誘導性プロモータとしては、ラムダRP及びPL、T5、T7のようなその他ファージプロモータ、tac及びtrcのような合成プロモータ、lacのような内因性プロモータ、コールドショックプロモータ(cspA)、araBAD、定常期若しくは飢餓期プロモータ、増殖速度(rmf)pH(cadA)、又は低酸素反応性(nar)プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。誘導は、温度上昇(PL、tac)、熱安定性レプレッサー(ラムダレプレッサー、lacレプレッサー)と同時の温度低下(cspA;コールドショックプロモータ)、インデューサー(tac、trc及びlacについてはIPTG;AraBADについてはアラビノース)、又はその他の手段(例えば定常期への移行、pH若しくは酸素シフト、グルコース若しくはアミノ酸飢餓;Makrides SC.1996 Microbiol.Rev.60:512−538に概説されている)によって実施できる。又は、遺伝子は、調整されたアンチセンスRNAによって誘導できる。様々な誘導性phiX174遺伝子E発現システムが開発されており、熱(C1857により制御される突然変異誘導ラムダPR;Jechlinger W,Szostak MP,Witte A,and Lubitz W.1999 FEMS Micro.Lett.173:347−352)、寒さ(lac又はファージレギュレータと組み合わせたC1857により制御されるラムダPR、Jechlinger W,Szostak MP and Lubitz W.1998 Gene 218:1−7)、或いは化学物質(ラクトース若しくはIPTGとlacPO/Ptac、又は3MBZとxylSレプレッサー−PTol)によって制御される。
培地へのプラスミド放出は、遺伝子E発現により誘導されるだろう。バッファーを培地に直接加えることにより、放出又は選択性を高めることができる。次に、濾過又は遠心分離によって細胞塊を取り除いて、プラスミドを浄化したブロスに残す。浄化したブロス中のゲノムDNA及びRNAは、ヌクレアーゼ(株のゲノム内に取り込まれ、細胞株で発現しているもの、又は外から加えられたもののいずれか)の使用により削減できる。
又は、汚染RNA及びゲノムDNAは、清明化ブロスの熱又はアルカリ処理による選択的変性又は分解のような、既存の公知の方法を利用して削減できる。この例では、清明化した培養物からのゲノムDNA及びRNAの除去は完全な細胞溶解後ではなく、むしろゴースト化後に起こり、LPSのような細胞成分の放出は減少するだろう。細胞からのプラスミドの放出はまた、EDTAのような金属キレート化剤なしでも実施でき、ゴースト化細胞からのLPS流出を更に減らすことができる。PEG又はCTABのような圧縮剤、或いはCaCl2のような二価カチオンを利用して、ゲノム及びRNA汚染物からプラスミドDNAを選択的に精製できる。このようなゲノムDNA又はRNA削減法は、当技術分野で公知である。
又は、プラスミド放出は、膜の剛性を変える(例えば0.2M MgSO4又はDNAの圧縮度を挙げる(例えばスペルミン)作用物質を、遺伝子E誘導の前後に加えることによって遅らせることができる。最終的な細胞集団を回収し、バッファーをプラスミド放出を促進するバッファー(例えばMgSO4の例では、Mg濃度を下げることによる)に交換する。
実施例16:抗生物質仲介自己溶解を用いたプラスミドDNAの製造
細胞壁阻害抗生物質を利用する別の自己溶解法を評価した。pVEXBOmpAT5RNase構築体中のT5RNaseカセットをpACYCB構築体に移した。それぞれgWisGFPプラスミドと同時形質転換した、pACYCBT5RNase又はpACYCB未変性スタッファー(コントロール)の培養物を、LB+50ug/mLカナマイシン+34ug/mLクロラムフェニコール+4mM MgSO4で増殖させ、対数増殖中期に最終濃度0.2%のアラビノースを用いて、1時間、30℃でタンパク質発現を誘導し、ペニシリン及びセフォタキシム(Fluka)(βラクタム系抗生物質)をそれぞれ最終濃度100及び10ug/mL加えて細胞の自己溶解を誘導した。培養物は、一晩、30℃で振盪して溶解及びヌクレアーゼ消化した。細胞破砕物を遠心分離によって取り除き、フェノールクロロホルム抽出によってタンパク質を除いた後に、アガロースゲル(SYBR greenII後染色)を用いて上清の核酸含有量を調べた。T5RNase株では、ゲノムDNAが劇的に減少したが、コントロールでは減少しなかった。残留ゲノムDNAは、インキュベーション(37℃、30分)によって取り除いた。溶解培養物を、温度を上げ、更に長時間インキュベーションしても、プラスミドの減少は観察されなかった。予想通り、T5RNase細胞株では、コントロールの細胞株に比べ溶解物の粘度が大きく低下した。
細胞壁阻害抗生物質を利用する別の自己溶解法を評価した。pVEXBOmpAT5RNase構築体中のT5RNaseカセットをpACYCB構築体に移した。それぞれgWisGFPプラスミドと同時形質転換した、pACYCBT5RNase又はpACYCB未変性スタッファー(コントロール)の培養物を、LB+50ug/mLカナマイシン+34ug/mLクロラムフェニコール+4mM MgSO4で増殖させ、対数増殖中期に最終濃度0.2%のアラビノースを用いて、1時間、30℃でタンパク質発現を誘導し、ペニシリン及びセフォタキシム(Fluka)(βラクタム系抗生物質)をそれぞれ最終濃度100及び10ug/mL加えて細胞の自己溶解を誘導した。培養物は、一晩、30℃で振盪して溶解及びヌクレアーゼ消化した。細胞破砕物を遠心分離によって取り除き、フェノールクロロホルム抽出によってタンパク質を除いた後に、アガロースゲル(SYBR greenII後染色)を用いて上清の核酸含有量を調べた。T5RNase株では、ゲノムDNAが劇的に減少したが、コントロールでは減少しなかった。残留ゲノムDNAは、インキュベーション(37℃、30分)によって取り除いた。溶解培養物を、温度を上げ、更に長時間インキュベーションしても、プラスミドの減少は観察されなかった。予想通り、T5RNase細胞株では、コントロールの細胞株に比べ溶解物の粘度が大きく低下した。
これらの結果は、プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)と各種自己溶解法の組み合わせの、プラスミド製造に関する普遍的有用性を証明している。
従って、読者は、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)及び関係する製造工程が、改良されたプラスミド製造のための組成物及び方法を提供することが分かるだろう。
上記の記載は多くの特異性を含むが、これらは発明を制限するものと解釈してはならず、むしろその1つの好ましい態様の例示として解釈しなければならない。多くのその他の変形が可能である。例えば、制限エンドヌクレアーゼ(Hanak and Ward、2001)又はガンマー線照射(MacPheeら、1988)を用いて染色体切断を誘導した時には、内因性のエクソヌクレアーゼ(recBCD)を利用したゲノムDNAの削減が観察されている;これら産物は、次にエンドヌクレアーゼの基質となる。この形式では、細胞は染色体切断誘導(放射線照射の場合一晩)後も増殖を続ける。この方法は、内因性エクソヌクレアーゼ活性を利用してDNAを除く場合には上手く機能しないが、発明のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を用いることで大きく改善されるだろう。
従って、発明の範囲は、例示の態様によってではなく、添付の請求の範囲、及びそれらの合法的均等物によって決定されるものである。
Claims (14)
- 共有結合性スーパーコイル状プラスミドDNAの製造方法であって:
A)1又はそれ以上のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)をコードする遺伝子を大腸菌(E.coli)ゲノム内に導入する段階;及びB)シグナルペプチド及び均等のプロセスを手段とすることによって前記酵素が周辺細胞質内に向けられるように導入遺伝子配列からの前記ヌクレアーゼの産生を方向付けする段階;及びC)プラスミド、コスミド、又は細菌人工染色体レプリコン等のDNAレプリコン存在下に大腸菌(E.coli)細胞を増殖させる段階;及びD)大腸菌(E.coli)ゲノムDNAは消化されるが、導入されたレプリコンDNAは消化されないようにヌクレアーゼを、細胞質内容物に導く段階;及びE)導入された前記レプリコンDNAを細菌内容物から精製する段階を含み;
それにより、前記方法が、プラスミドの純度を上げることを特徴とする製造方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、1又はそれ以上のキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、融合相手として、RNase酵素の少なくとも一部を有するDNAseを含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、ファージT5 D15エクソヌクレアーゼとRNaseAとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、ファージT5 D15エクソヌクレアーゼとRNaseSとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 共有結合性スーパーコイル状プラスミドDNAの製造方法であって:
A)1又はそれ以上のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)をコードする遺伝子を大腸菌(E.coli)ゲノム内に導入する段階;及びB)シグナルペプチド及び均等のプロセスを手段とすることによって前記酵素が周辺細胞質内に向けられるように導入遺伝子配列からの前記ヌクレアーゼの産生を方向付けする段階;及びC)プラスミド、コスミド、又は細菌人工染色体レプリコン等のDNAレプリコン存在下に大腸菌(E.coli)細胞を増殖させる段階;及びD)大腸菌(E.coli)ゲノムDNAは消化されるが導入されたレプリコンDNAは消化されないように細胞を自己溶解する段階;及びE)導入された前記レプリコンDNAを細菌内容物から精製する段階を含み;
それにより、前記方法が、プラスミドの純度を上げる前期製造方法。 - 請求項6に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、1又はそれ以上のキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、ファージT5 D15エクソヌクレアーゼとRNaseAとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、ファージT5 D15エクソヌクレアーゼとRNaseSとを融合したキメラ酵素を含むことを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)が、融合相手として、RNase酵素の少なくとも一部を有するDNaseを含むことを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記自己溶解を、ファージ溶解タンパク質を用いて行うことを特徴とする方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記自己溶解を、抗生物質を用いて行うことを特徴とする方法。
- 1又はそれ以上の細菌の菌株を具える物質の組成物であって:
A)1又はそれ以上の融合相手と共に、或いは無しに、少なくとも1つのT5 D15エクソヌクレアーゼ等のプラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)と;B)少なくとも1つのプラスミドであって、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)を用いて精製により得られるプラスミドの純度を向上させるプラスミドと;を含有する組成物。 - 請求項13に記載の組成物において、前記プラスミド−セーフヌクレアーゼ(plasmid−safe nucleases)がT5 D15エクソヌクレアーゼであることを特徴とする組成物。
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