KR20070053268A

KR20070053268A - 플라스미드 디엔에이 제조에 사용되는 이.콜리의 개량된변종

Info

Publication number: KR20070053268A
Application number: KR1020077006133A
Authority: KR
Inventors: 제임스 에이. 윌리암스; 클라그 피. 호드슨
Original assignee: 네이쳐 테크놀로지 코포레이션; 클라그 피. 호드슨
Priority date: 2004-08-16
Filing date: 2005-08-15
Publication date: 2007-05-23
Also published as: EA010864B1; NZ553658A; JP2008509704A; AU2005280356B2; IL181319A0; EA200700415A1; EP1781801A2; US20070249042A1; US8748168B2; EP1781801A4; ZA200701265B; WO2006026125A2; MX2007001847A; BRPI0515418A; CN101035905A; AU2005280356A1; CA2577419A1; WO2006026125A3

Abstract

게놈 디엔에이와 알엔에이에 비하여 플라스미드 디엔에이를 획기적으로 정화할 수 있는 방법에 의하는 일반적 방법과 박테리아 스트레인을 기술하였다. 바람직한 일 실시예에서 호스트 핵산의 용해와 뉴클레아제 제거는 발효/하베스트(harvest) 공정의 내부 구성요소이고, 그럼으로써 단순화된 다운스트림 정화와 줄어든 폐기물 스트림과 동시에 증가된 수율과 순도를 획득하여 생산비용을 절감시킨다.

플라스미드, 알엔에이, 디엔에이

Description

플라스미드 디엔에이 제조에 사용되는 이.콜리의 개량된 변종{Improved Strains of E.Coli Plasmid DNA Production}

본 발명은 플라스미드, 코스미드, 인공 박테리아 크로모좀(BACs), 박테리오파지, 바이러스성 벡터와 이들의 잡종 등의 공유결합 폐쇄 환상형(ccc) 재조합 디엔에이 분자의 제조에 관련된 것이며, 더욱 특이한 점은 상기 디엔에이 분자를 발효와 관련된 핵산으로부터 정화하는 방법이다.

본 발명은 보건부 수상 R43 GM072141-01에 기반하여 부분적인 정부 원조에 의하여 이루어졌으며, 정부는 본 발명에 대하여 확실한 권리를 보유하고 있다. 본 발명은 2004년8월 16일에 출원된 임시 특허출원 US60/602074호의 권리를 청구하고 있다.

본 발명은 공유결합한 폐쇄 환상형(ccc) 재조합 디엔에의 분자의 제조에 관련된 것이다. 이러한 분자들은 생명공학, 유전자이식 유기체, 유전자 치료, 치료용 접종, 농업, 디엔에이 백신에 유용하다.

발명을 염두에 두고서 선행기술 조사가 이루어졌다. 이.콜리(E.coli)는 오랫 동안 연구자들과 산업계에서 사용된 재조합 디엔에이 분자의 유일하게 중요한 재료였다. 오늘날, 플라스미드 디엔에이는 생명공학 생산물(유전자 약품과 디엔에이 백신)의 다음 세대가 임상실험과 결과적으로 제약시장에 선을 보임에 따라 점자 중요해지고 있다. 플라스미드 디엔에이 백신은 바이러스성, 박테리아성, 기생충 질병에 대한 예방백신; 초 면역성 글로불린 생산물의 제조를 위한 면역체; 전염성 질병을 위한 치료용 백신; 또는 암 백신에 대한 출원에 관련된 것일 수 있다.

(박테리아성 발효에 의하여) 플라스미드를 획득하는 하는 기본적인 방법과 알칼리성 용해 방법에 의하여 플라스미드를 정제하는 기본적인 방법은 잘 알려져 있다.(Birnboim, HC, Doly J. 1979 Nucleic Acids Res. 7:1513-1523) 처음에는 발효된 박테리아 세포 페이스트가 재현탁되어 용해되고(수산화 나트륨과 소듐 도데실설페이트의 화합물을 이용), 그 후 용액은 산성염(예를 들면, 아세트산 칼륨)을 첨가하여 중화되고 박테리아 디엔에이와 세포 잔해물들을 침전시킨다. 슈퍼 코일 플라스미스 디엔에이 덩어리는 이.콜리 독소(lipopolysaccharide, 또는 LPS)와 더불어 오염시키는 박테리아 알엔에이, 디엔에이, 단백질과 함께 용액 내에 남아있다.

대신에 비이온성 세정제에서 열/리소자임을 처리를 이용한 용해는 온전한 플라스미드 디엔에이를 방출하는 데 사용되어 왔다. 초임계 유체에 높은 압력을 가하거나 유기 용매 또는 세정제로 처리하여 세포들 또한 용해될 수 있고 핵산은 방출된다.

이러한 용해방법은 세포 불순물을 방출하며 이러한 불순물을 제거하기 위한 정화단계가 필요하다. 또한, 플라스미드 디엔에이 제조에 통상적으로 사용되는 알칼리성 용해 또는 열 변성 세포 용해 방법론은 비용이 많이 들고, 비효율적이며 많은 양의 독성 폐기물을 발생시킨다. 이를 대체할 수 있는 경제적이고 효과적인 용해 방법은 개발되지 못하고 있다.

용해 가능한 파편은 여과법에 의하여 분리되고 다양한 정화단계로 넘어가는 데, 이는 다음을 포함할 수 있다:알엔에이즈제 분해(RNase digestion); 크로마토그래피(이온 교환 겔 여과법, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 겔 여과법, 소수성 상호작용, 역상(reverse phase), 에이치피엘씨(HPLC), 등); 다이어여과작용; 유기 추출법, 선별적 침전법, 등.

문헌에 기술된 전형적인 아래의 용해 후 플라스미드 정화 방법들은 게놈 디엔에이 수치를 0.01-1% 또는 그 이하로 떨어뜨린다. 문헌에 기술된 다음 방법들은 모든 기술을 망라한 목록은 아니고, 특정한 게놈 디엔에이 감소 단계들만 포함하다. : 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 0.01% 게놈(Wils P, 와 Oliver, M. 2004 US Patent 6730781), 소수성 상호작용 크로마토그래피로 0.05% 게놈 (Nochumson S, Durland R, Yu-Speight A, Welp J, Wu K, 와 Hayes R. 2001 US Patent Application 2001/0034435; Diogo MM, Querioz JA, Monterio, GA, Martins SAM, Ferreira, GNM, 과 Prazeres DMF, 2000 Biotech Bioeng 68:576-583), 황산 암모늄으로 1% 게놈 여과법(McNeilly DS. 2001 US Patent No 6214586), 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 0.2% 게놈(Lemmens R, Olsson U, Nyhammar T, 와 Stadler J. 2003. J Chromatography B 784:291-300), 탄젠셜 플로우 한외여과(tangential flow ultrafilatration)로 1% 미만의 게놈(Bussey LB, Adamson R, 과 Atchley A. 2000 US Pstent No 6011148), 폴리에틸렌 글리콜 차이 침전법(differential polyethylene glycol precipitation)으로 1% 미만의 게놈(Marquet M, Horn N, Meek J와 Budahazi G. 1996 US Patent No 5591064), CTAB 침전법과 그리올라이트 LRA 흡수법(gryolite LRA absorption)(Lander RJ, Winters MA, 와 Meacle FJ. 2002 US Patent Application2002/0151048), 삼중 헬릭스 크로마토그래피(triple helix chromatography)(Crouzet J, Scherman D, 와 Wils P. 2001 US Patent No 6287762).

플라스미드 디엔에이를 인체에 주입하는 것은 특별한 주의와 도전을 요하는 데, 이는 전염병 예방 지침을 위한 플라스미드 디엔에이 백신을 위한 주의사항을 포함하여 FDA 규제 가이드에 소개되어 왔다(Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, 1996 Points to consider on plasmid DNA vaccines for preventive infentious disease indications DOCKET NO.96N-0400, 과 Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, 1998 Guidance for industry: Guidance for human somatic cell therapy and gene therapy.). 이러한 문헌들은 다양한 오염 물질들에 대한 고려사항을 지시하고 있고, 각 오염원들의 정도를 평가하는 데 사용되어지는 평가법을 제안하고 있다. 그러나 이러한 안내 문헌들은 오염 알엔에이, 디엔에이 또는 단백질의 수용가능한 최대치를 제안하고 있지는 않고 있으며, 이에 대하여는 알려져 있지 않다. 그러나 게놈 디엔에이의 허용가능한 한계는 만약 재조합 단백질 약품을 위한 FDA 기준(FDA. 1993 Points to consider in the characterization of cell lines used to produce biologics)에서 통상 요구하는 100 pg 게놈 디엔에이/도스가 1 mg 디엔에이 백신 도스에 적용될 경우라면 디엔에이는 0.00001%일 것이다. 이것은 표준의 큰 규모 플라스미드 디엔에이 제공양(0.05 - 5% 게놈 디엔에이)보다 대여섯 단계 낮은 수준이고 통상 비용 절감의 제조 방법론을 이용하여서는 얻어질 수 없다. 새로운 방법은 게놈 디엔에이를 보다 더 감소시키는 것을 제공하는 데에 필요하다.

핵산은 공정 과정에서 일찍(예를 들면, 핵산 가수분해 효소 소화에 의하여), 또는 늦게(예를 들면, 크로마토그래피 분리에 의하여) 제거될 수 있다. 최근까지 상대적으로 일반적으로 행해지던 방법은 알엔에이를 분해하기 위해 용해 완충제에서 소의 췌장 리보뉴클리아제(RNase A)를 사용하는 것이다. 비록 이것이 알엔에이의 양과 크기를 줄이는 데 효과적이기는 하지만, 이는 또한 소로부터 유래한 알엔에이를 제공하는 데 이것은 조절의 관점에서 보면 프리즌 에이전트, 특히 소의 스폰지형태 뇌염(BSE) 에이전트들로부터 오염될 수 있기 때문에 바람직하지 못하다. 즉, 애니멀 프로덕트 프리(APF) 조건에 전적으로 부합하는 (인간에 사용되든 동물 에 사용되기 위한 것이든) 박테리아 생산물의 발효와 정화의 수행이 갈수록 요구되고 있다.

최근에 우리는 슈퍼 코일 플라스미드를 손상시키지 않고 이.콜리(E. coli) 게놈 디엔에이를 특정하여 분해시키는 높은 효과를 보이지 않는 상업 효소를 알고 있다('플라스미드-보호' 뉴클레아제). 그러나 때때로, 에이티피-의존 Rec BCD 엑소뉴클레아제 효소(Qiagen Large Construct Kit Handbook, June 2003; Wahle, S, Schorr J, and Weber M. 2001 US Patent 6242220; Isfort RJ 1992 BioTechiques 12:798-804)와 같은 뉴클레아제들이 부분적으로 정화된 플라스미시드 디엔에이 표본에 첨가된다. 이와 관련하여, 가공되지 않은 플라스미드 표본은 모든 비-원형 디엔에이를 단일 선형으로 변성시키기 위하여 열처리되고, 그러면 SI 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제, PI 뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, Bal31 뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 VII 또는 람다 엑소뉴클레아제(Hyman ED. 1992 World Patent Application 92/13963)와 같은 단일 선형 엑소뉴클레아제가 첨가된다. 이러한 디엔에이즈(DNase) 효소들은 (알엔에이즈와 마찬가지로) 용해에 직접 첨가될 수는 없는 데, 이는 이러한 효소들은 일반적으로 알엔에이즈(RNase)보다 연약해서 알칼리성/SDS 환경에서 비활성화될 것이기 때문이다. 그러므로 이러한 접근들은 가격이 많이 들고 상업적인 규모의 플라스미드 제조에는 실용적이지 못하다.

플라스미드 제조에 정화된 뉴클레아제를 첨가하는 데 존재하는 문제점을 극복하기 위하여 대체적인 접근이 개발되어 왔는 데 내생적 뉴클레아제를 게놈 디엔에이를 제거하기 위하여 활용하는 것이다. 초기의 방법들은 일반적인 디엔에이 손상(예를 들어, 수복 결핍 호스트에 자외선 조사(Sancar A, Hack AM, and Reanney DC. 1988 US Patent No.4755464), 또는 이온화 조사(MacPhae DG, Radford, AJ, and Reanney DC. 1988 US Patent No.4755464) 을 초래하는 데, 플라스미드는 염색체와 비교하여 낮은 확률의 손상도(즉, 게놈보다 타겟이 될 낮은 확률)로 인하여 생존한다; 내생성 뉴클레아제(예를 들어, RecBCD)에 의하여 중재되는 분해는 게놈 내의 디엔에이 절단부로부터 일어난다. 제한 엔도뉴클레아제를 게놈 디엔에이를 절단하는 사용하는 보다 자세한 시스템이 보고되어 있는 데, 제한 엔도뉴클레아제 활동은 열민감 메틸라제에 의하여 조절된다. 제한 온도로 옮기면 메틸라제는 불활성화되고, 게놈 디엔에이의 절단이 일어나며, 내생성 엑소뉴클레아제 소화가 일어난다(Hanak, J, Alexis J, and Ward JM. 2001 World Patent Application WO 01/29209). 그러나 이 방법들에 의하면 게놈 감수분열의 정도가 크지 않고 플라스미드는 관계되는 제한부를 없애기 위한 공정을 필요로 하기 때문에 이 방법은 일반적으로 효용성이 없다.

특별화된 이.콜리(E. coli) 균주가 개발되었는 데, 세포 성장 동안 이.콜리(E. coli) 유전자 발현을 방해하지 않기 위해서 주변세포질 공간의 재조합 뉴클레아제를 발현시킨다. 용해시에 소 췌장 알엔에이즈(RNase)가 분비신호에 의해서 주 변세포질 공간으로 향하는 경우에 알엔에이즈는 알엔에이와 혼합되고 그것을 분해한다(Cooke GD, Craneburgh RM, Hanak JAJ, Dunhill P, Thatcher DR, Ward JM. 2001 A J. Biotechnology 85:297-304). 이 시스템은 알칼리성 용해시에 알엔에이 레벨을 떨어뜨리는 데 사용된다. 이 방법에 의하면 게놈 디엔에의의 감수분열이 일어나지 않는다. 주변세포질 스타필로코컬(Staphylococcal) 뉴클레아제를 과다발현시키기 위한 비슷한 시스템(Cooke GD, Craneburgh RM, Hanak JAJ, Ward JM. 2003 J.Biotechnology 101:229-239; Huisman GW, Luo LZ, and Peoples OP. 2004 US Patent Application 2004/0014197; Boynton ZL, Koon JL, Brennan EM, Clouart JD, Horowitz DM, Gerngross TU, and Huisman GW. 1999 Pseudomonas putida . Appl . Environ. Microbiol . 65:1524-1529), 또는 내생적 이.콜리(E. coli) 세포질 뉴클레아제(Leung WS, and Swartz JR. 2001 US6258560)이 개발되었는 데, 단백질이나 다른 생체적응재료의 핵산 오염을 줄일 수 있다. 이러한 시스템들은 플라스미드-보호가 아니고, 적당한 단백질 정화과정과 활동 버퍼(buffers for activity)를 필요로 한다. 발효 배양에서 플라스미드-보호 디엔에이즈(plasmid-safe DNase)의 유도는 Kelly 2003(Kelly WJ. 2003 Biotechnol Appl Biochem 37:219-223)의 이론적 문맥에서 논의되고 있으나 방법론이나 뉴클레아제는 특정되어 있지 않다.

자가용해 세포 라인들이 단백질 생산을 쉽게 하기 위하여 개발되어졌다(Leung and Swartz, Supra, 2001). 이러한 세포 라인에서는 리소자임은 세포질에서 세포에 의해 발현되고, 홀린(holin)(세포막 스패닝 펩타이드 또는 단백질)의 협 력하에 원하는 시간에 주변세포질로 방출되어 리소자임과 다른 원형질 단백질을 원형질로부터 주변세포질로 누출시킬 수 있는 통로를 형성한다. 활용가능한 리소자임/홀린 결합의 예시는 당업계에 알려져있다. 일부 리소자임/홀린 결합들은 Young 1992(Young R. 1992 Microbiol . Molec . Reviews, 56:430-481)에 논의되고 있으며 여기서는 참고자료로 포함되어 있다. 파지 람다 용해(The Phage lambda lysis) 단백질은 단백질 생산을 위한 자가용해 세포계에 사용된다(Leung and Swartz, Supra, 2001).

알칼리성 또는 열 용해와는 반대로, 자가용해 조건은 게놈 디엔에이를 선택적으로 변성시키지 않는다. 용해의 산물은 매우 점성이 있고, 제조상 문제점을 발생시킨다. 단백질 생산을 위하여 불특정 뉴클레아제들이 첨가되거나 또는 세포 용해 후 점도를 줄이기 위하여 균주의 주변세포질에 발현된다(예를 들면 endA nuclease Leung and Swartz, Supra, 2001; Staphylococcus nuclease; Cooke et al, Supra, 2003, Huisman et al, Supra, 2005, Boynton et al, Supra, 1999). 이러한 시스템들은 플라스미드 생산을 위해서는 활용될 수 없었다.

플라스미드 디엔에이 제조에 사용되는 정화 공정은 비용이 많이 들고, 비효율적이며 많은 독성 폐기물을 발생시킨다. 잔여 게놈 디엔에이 농도는 상업적 생산을 위한 통상적으로 수용가능한 기준을 훨씬 초과한다. 이러한 한계들은 플라스미드 제조 공정의 상업화에 비용과 부담을 발생시킨다.

선행기술을 살펴 보더라도, 게놈 디엔에이 감소를 위한 비용적으로 효과적인 방법의 필요성은 남게 된다. 또한, 독성물질을 줄이면서도 간단하고 비용이 적게 드는 정화공정이 필요하다.

본 발명은 디엔에이 생산 방법으로써 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)을 인코딩한 하나 이상의 유전자가 박테리아 게놈으로 삽입되고 주변 세포질 공간으로 분비되는 단백질로 발현되는 것이다. 플라스미드 또는 디엔에이 레플리콘이 세포들에서 성잘할 때 뉴클레아제는 원형질로 재도입되고 레플리콘의 정화를 촉진시키면서 바람직한 레플리콘보다는 핵산을 제거한다. 바람직한 실시예에서 뉴클레아제는 키메릭 뉴클레아제이다. 또 다른 바람직한 실시예에서 키메릭 뉴클레아제는 적어도 융합 파트너로써 알엔에이즈 효소의 단백질과 함께 디엔에이즈이다. 그러나 다른 바람직한 실시예는 RNaseA 또는 RNaseS와 함께 키메릭 효소 융합 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제를 사용한다. 방법의 바람직한 구현에서 뉴클레아제(들)은 신호 펩타이드의 신호 또는 이와 등가의 과정에 의하여 주변 세포질 공간으로 향하고, 세포들은 자가용해 되어서 박테리아 게놈 디엔에이 및/또는 알엔에이가 분해되고 도입된 리플리콘은 분해되지 않아서 도입된 레플리콘의 정화를 촉진시키게 된다. 다른 실시예에서 자가용해는 세포에서 발현된 파지 용해 단백질의 사용 또는 항생물질의 사용을 통하여 이루어진다. 본 발명은 융합 파트너의 존재가 있거나 또는 없는 상태에서 적어도 하나의 플라스미드-보호 뉴클레아제, 플라스미드를 가지고 있고 정 화는 플라스미드-보호 뉴클레아제에 의하여 촉진된다.

본 발명은 조성물과 플라스미드 정화 공정을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 정화된 플라스미드 디엔에이에서 핵산 불순물을 줄이는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 플라스미드 디엔에이 정화의 비용을 절감하기 위한 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 플라스미드 디엔에이 정화에서 독성 폐기물을 줄이는 데 있다. 종래 기술에 개시된 공정에 비하여 개선된 플라스미드 생산 공정: 닉(열린 환상형) 또는 선형 플라스미드의 수를 줄임으로써 플라스미드의 양을 증가; 확고한 생산 단계를 사용한 간이화된 생산; 다단계 생산 단계의 제거를 통한 간이화된 생산; 다단계 생산단계의 제거를 통한 비용 절감; 플라스미드 정화 후 핵심 오염물질의 제거를 다운스트림 공정 전에 위치시킴으로써 핵산과 불순물 제거를 통한 플라스미드의 질 향상; 최종 플라스미드 제공으로부터 게놈 디엔에이의 제거를 통한 향상된 조절 적응성; 리보뉴클레아제 A와 같은 동물성 유래 물질의 제거를 통한 향상된 조절 적응성;과 독성 폐기물의 제거를 통한 향상된 조절 적응성의 개선된 점을 개시하고 있다.

본 발명의 이외 목적과 효과는 도면과 발명의 상세한 설명에서 명백하게 드러난다.

도면을 살펴 보면, 도 1에서는 대규모의 플라스미드 제조에 있어서 T5 엑소뉴클레아제에 의한 변성된 플라스미드와 이.콜리(E. coli) 게놈 디엔에이의 소화를 보여준다: 1) 디엔에이 분자량 마커[가장 넓은 밴드는 12 kilobases 이다]; 2) 대규모의 플라스미드 제조로부터 공정 중의 플라스미드 샘플; 3) 동일 샘플, T5 엑소뉴클레아제 첨가 없이 T5 엑소뉴클레아제 반응의 조절; 4) 동일 샘플, 2%w/w T5 엑소뉴클레아제로 소화. 바닥의 밴드는 슈퍼-코일 상태이고, 중간 밴드는 슈퍼-코일 이량체와 닉 단량체(nicked monomer)의 혼합이고, 상단의 밴드는 닉 이량체(nicked dimer)와 게놈 디엔에이의 혼합이다. 게놈 디엔에이와 닉 플라스미드는 중간 밴드와 상단 밴드에서 양적으로 제거되어 졌다. 비슷한 결과가 1%w/w T5 엑소뉴클레아제일 때 보여진다.

도 2에서는 pVEXSapIstuffer 벡터를 보여준다.

도 3에서는 방향성 증폭과 cDNA 서열을 pVEX로 클로닝하는 방법을 보여준다: A) 두 개의 특이 어드레스 택을 가졌으며, 컷(cuts) 사이에 위치한 클래스 IIS 효소로 소화되어 만들어진 플라스미드;와 B) 클래스 IIS 효소 인식 신호(SapI)를가지고, 적어도 하나의 매개 뉴클레오타이드와 특이한 비-회문식 서열(GGG, 이 예에서의 어드레스 태그)를 가진 중첩 지역을 가진 통상의 프라이머.

도 4에서는 pVEXSapIOmpAStuffer vector를 도시하고 있다.

도 5에서는 pVEXBSapIOmpAStuffer vector를 보여준다.

도 6에서는 pVEXBOmpARNase vector를 보여준다.

도 7에서는 pVEXBOmpAT5RNase vector를 보여준다.

도 8에서는 게놈 디엔에이에서 T5RNase 엑소뉴클레아제의 제거를 보여준다. 더 선호되는 T5 엑소뉴클레아제와 RNase 유전자(들)을 사용하여 및 사용하지 않은 상태로 플라스미드 디엔에이 생산의 겔 사진이 보여진다: 레인 1,5,9는 T5RNase가 유도되어 있다; 그리고 레인 4,8,12는 RNase가 유도되어 있지 않다. 샘플 1-8은 Qiagen-prepared 포스트 알칼리성 용해 핵산들이다. 샘플 9-12는 급속-추출 토탈 디엔에이이다. 샘플 5-12는 4℃에서 저장된 세포들에서 나왔으며, 샘플 1-4는 -20℃에서 저장된 세포들에서 나왔다. M)은 디엔에이 분자량 마커를 나타낸다. 가장 넓은 밴드는 12 킬로베이스(kilobases) 이다. 위에서부터, 가장 큰 분자량 밴드는 게놈 디엔에이(gDNA)이고, 그 다음 밴드는 슈퍼-코일 이량체 플라스미드 디엔에이[pDNA(2x)]이고, 그 다음 밴드는 슈퍼-코일 단량체 플라스미드 디엔에이(pDNA)이고 가장 빠르게 이동한 밴드는 알엔에이(RNA)이다. 레인 1의 화살표는 게놈 디엔에이의 감소를 나타낸다.

도 9에서는 RNaseS-T5 키메라를 만들기 위해 S-펩타이드와 S-단백질 군집을 사용하는 것을 보여준다.

도 10에서는 키메라 뉴클레아제에 의한 핵산 가수분해를 보여준다.

도 11에서는 S펩타이드-T5 + S단백질과 T5RNase 구성체로 RNA를 감소시키는 것을 보여준다. 알칼리성 용해물들은 지시된 플라스미드들을 포함하는 DH5α세포의 유도된 배양들로부터 제공되었고, 핵산들은 에탄올에 의하여 침전되고 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 용해되었다. 알엔에이(주된 밴드)는 SYBR 그린 II(분자 탐침)으로 포스트-스테이닝(post-staining)되어 탐지되었다: 레인 1 = pVEXBOmpAS-펩타이드T5 + pACYCBOmpAS단백질; 레인 2 = pVEXBOmpAT5-S펩타이드 + pACYCBOmpAS단백질; 레인 3 = pVEXBPhoARNase; 레인 4 = pVEXBOmpAT5RNase; 레인 5 = pVEXBOmpAT5 ;와 레인 6 = pVEXBPhoA(프레임시프트)RNase(음제어).

도 12에서는 S펩타이드-T5 + S단백질 구성체로 RNA와 게놈 디엔에이를 감소시키는 것을 보여준다. 알칼리성 용해물들은 지시된 플라스미드들을 포함하는 DH5α세포의 유도된(레인 1-4, 6), 그리고 유도되지 않은(레인 5) 배양들로부터 제공되었고, 핵산은 에탄올에 의하여 침전되고 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에 용해되었다. 알엔에이와 디엔에이는 SYBR 그린 II로 포스트-스테이닝(post-staining)되어 탐지되었다: 레인 1 = pVEXBOmpAS-펩타이드T5; 레인 2 = pVEXBOmpAS-펩타이드T5 + pACYCBOmpASP단백질; 레인 3 = pACYCBOmpASP단백질; 레인 4 = pVEXBPhoAS펩타이드-T5; 레인 5 = pVEXBPhoAS펩타이드-T5 + (유도되지 않은)pACYCBOmpAS단백질;과 레인 6 = pVEXBPhoAS펩타이드-T5 + (유도된)pACYCBOmpAS단백질. 화살표는 알엔에이 밴드(바닥)과 레인 2의 게놈 디엔에이(상단)의 감소를 보여준다.

도 13에서는 PhiX174 유전자 E 포자들을 통하여 E. coli 원형질 내용물을 방출시키는 것을 보여준다.

도 14에서는 pACYCB 고유 충진(stuffer) 벡터를 보여준다.

도 15에서는 pACYCB 유전자 E 벡터를 보여준다.

도 16에서는 E 유전자 용해 단백질이 플라스미드 방출을 매개하는 것을 보여준다. 1에서 pACYCB E 유전자 + pDNAVACCUltra-EGFP로 배양된 세포들은 유도되지 않고, 2는 아라비노즈(arabinose)로 40분간 유도된다: A = 총핵 산(펠릿); B = PI 버퍼 추출 이후에 남아 있는 총 핵산(펠릿); C = PI(50mM Tris, 10mM EDTA, pH8) 추출된 핵산들; D = LB(media) 핵산들; E = PBS 추출된 핵산들; F = 10mM Tris pH 8.5 추출된 핵산들; G = 50mM 인산 나트륨, 0.3 M NaCl pH7 추출된 핵산들;과 H = 10 mM MgCl₂ 추출된 핵산들. M)은 디엔에이 분자량 마커를 나타낸다. 가장 넓은 밴드는 12 킬로베이스(kilobases)이다. 위에서부터 가장 큰 분자량 밴드는 게놈 디엔에이(gDNA)이고, 그 다음 밴드는 슈퍼-코일 이량체 플라스미드 디엔에이[pDNA(2x)]와 닉 단량체 플라스미드이고, 그 다음 밴드는 슈퍼-코일 단량체 플라스미드 디엔에이(pDNA; 화살표)이고 가장 빠르게 이동한 밴드는 알엔에이(RNA)이다.

도변 17에서는 항생 유도성 자가용해 이후 게놈 디엔에이에서 뉴클라아제가 제거되는 것을 보여준다. 레인 1 = 디엔에이 분자량 마커; 레인 2 = 자가용해 이후 총 디엔에이(pACYCBT5RNase + gWizGFP 스트레인); 레인 3 = 자가용해 이후 총 디엔에이(pACYCBNative 충진 + gWizGFP 스트레인); 레인 4 - 37℃에서 30분간 배양 후 레인 2로부터의 샘플. 화살표는 T5RNase 스트레인에서 제거된 게놈 디엔에이를 나타낸다.

도 18에서는 플라스미드 제조에 있어서 주변세포질 뉴클레아제-발현 생산 숙주들의 이용을 보여준다. 1 포맷은 게놈 디엔에이, 닉 또는 선형 플라스미드, 및/또는 알엔에이를 제거하기 위한 세포 용해에 선행하는 전단계 처리를 이용하고 있고, 포맷 2는 게놈 디엔에이, 닉 또는 선형 플라스미드, 및/또는 알엔에이를 제거하기 위한 세포 용해이후에 후행하는 처리(또는 동시 처리)를 이용하고 있다.

도 19에서는 자가용해 플라스미드 생산 공정에 있어서 주변세포질 뉴클레아제-발현 생산 숙주들의 이용을 보여준다.

정의

자가용해 : 세포가 스스로 용해하도록 유도하는 용해 방법을 말하는 데, β락탐이 세포 용해를 유도하거나, phiX174 파지 용해 단백질이 고스팅(ghosting)을 유도하는 것이나, T4 또는 람다 파지가 파지 리소자임/파지 홀린(holin) 동시발현(coexpression)에 의하여 세포 용해를 유도하는 것등이다.

ccc : 공유성 폐쇄성 원형

키메라 효소 : 효소와 두번째 단백질을 혼합하는 것인데, 예를 들면 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제와 소의 RNase A의 조각이나 완전체를 혼합하는 것이다.

디엔에이 레플리콘(replicon) : 플라스미드, 코스미드, 박테리아성 인공 염색체(BACs), 박테리오파지, 바이러스성 벡터와 그 잡종들.

고스트 밴드 : 변성 ccc 디엔에이

p디엔에이 : 플라스미드 디엔에이

파지 용해 단백질 : 단백질은 세포로 하여금 자기 용해를 하도록 하거나 phiX174 파지 용해 단백질에 의하여 유도되는 고스팅과같은 고스팅을 하도록 하거나 T4 나 람다 파지 리소자임-홀린 동시발현에 의하여 유도되는 세포 용해를 하도록 한다.

플라스미드 : 플라스미드, 코스미드, 박테리아성 인공 염색체(BACs), 박테리오 파지, 바이러스성 벡터 와 이들의 잡종.

플라스미드-보호 뉴클레아제 : 다양한 형태의 디엔에이를 변성시키나 플라스미드를 포함하는 공유성 폐쇄성 원형(ccc) 디엔에이는 변성시키지 않는 엑소뉴클레아제

알엔에이즈(RNase) : 리보뉴클레아제

알엔에이즈에이(RNaseA) : 소 췌장 리보뉴클레아제 에이

T5 엑소뉴클레아제(T5 exonuclease) : 박테리오파지 T5 D15 엑소뉴클레아제

본 발명은 생산 호스트로서 그람 음성 박테리아 이.콜리를 사용하고, 기계적 발효 용기를 사용하여 플라스미드 디엔에이(pDNA)의 정화를 하는 중에 게놈 디엔에이를 줄이는 방법에 관한 것이다.

정화 기술의 큰 문제점은 이.콜리 게놈 디엔에이로부터 피디엔에이(pDNA)의 분리가 있다는 점이었다. 본 발명은 공유성 폐쇄성 원형(ccc) 디엔에이의 격리 중 게놈 디엔에이를 줄이는 방법에 관한 것이다. 플라스미드 제조에 뉴클레아제를 활용하는 방법이 경제적인 접근법으로 개발되어졌다. '플라스미드-보호' 뉴클레아제는 주변세포질 공간으로 분비되고, 세포 생장 중 세포를 보호하며, 뉴클레아제와 게놈 디엔에이의 접촉은 하베스트(harvest)시 또는 세포 용해중에 일어나도록 조절된다.

바람직하게 구현된 뉴클레아제 생산

본 발명의 하나의 바람직한 구현에 있어서(도 10), (T5 D15 엑소뉴클레아제, RecBCD 엑소뉴클레아제, 다른 에이티피-의존 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 VII, 또는 키메라 잡종 효소들 같은)하나 이상의 특정한 '플라스미드-보호' 가수분해성 효소들은 하나의 펩타이드에 의하여 주변세포질 공간으로 분비되거나 이와 등가의 과정에 의하여 분비되고, 거기서 효소(들)은 세포생장과 피디엔에이 유도/생산이 끝날때까지 격리되어진다. (세포막 파열 또는 세포질로의 조절된 재주입을 통하여) 효소와 세포질 내용물들의 재결합을 조절하면서, 효소는 원하지 않는 박테리아 물질들(예를 들어 핵산들(디엔에이, 알엔에이), 단백질들, 탄수화물들, 지질다당류들등)을 소화하거나 가수분해시킨다.

천연 뉴클레아제도 사용될 수 있다. 어떤 플라스미드-보호 뉴클레아제는 RecBC(엑소뉴클레아제 V), RecBCD 엑소뉴클레아제, 관련된 그램 파지티브(gram positive) RexAB 또는 AddAB 엑소뉴클레아제, 아키온 엑소뉴클레아제(Archeon exonucleases)(예를 들어, 지오바실루스 카우스토필루스(Geobacillus kaustophilus) AddAB) 다른 에이티피-의존 엑소뉴클레아제, 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 VII로써 사용될 수 있다. 이것은 모두를 포괄하는 리스트는 아니며, 이.콜리, 또는 다른 박테리아성, 아키온, 또는 진핵세포로부터 유래된 뉴클레아제가 고려된다. '고스트 밴드들'을 제고하는 박테리오파지 T5 D15 엑소뉴클레아제와 같은 뉴클레아제들이 선호된다.

플라스미드-보호 호열성(thermophilic) 뉴클레아제의 경우에는 만약 효소 활성이 적절한 생육 온도로 충분히 맞춰진다면 뉴클레아제를 주변세포질로 방출하는 것은 필요하지 않을 수 있다. 이것은 발효동안의 열처리(42-95℃)와 같은 추가적인 게놈 리덕션 방법론이 사용될 수 있도록 해 줄 것이다.

본 발명은 슈퍼-코일 디엔에이를 분해하지 않으면서 게놈의(genomic) 선별적으로 변성된 닉 플라스미드 디엔에이를 분해시키는 '플라스미드-보호' 엑소뉴클레아제의 사용을 고려한다. 바람직하게는 박테리오파지 T15 D15 엑소뉴클레아제(T5 엑소뉴클레아제)는 플라스미드 공정에 사용되는 후보 디엔에이즈이다. T5 엑소뉴클레아제는 슈퍼-코일 디엔에이를 분해하지는 않으나 선형 단일- 그리고 이중-선형 디엔에이를 분해시킬 뿐만 아니라(Sayers JR, and Eckstein F. 1990 J. Biol . Chem . 265:18311-18317) 때때로 생물학적 활성을 유지하고 제한 효소 분해에 신축가능한 '고스트 또는 그림자(shadow) 밴드'같은 변성 루프들(loops)을 가진 디엔에이도 분해할 수 있다(Sayers JR, Evans D, and Thomson JB. 1996 Anal . Biochem . 241:186-189). 우리는 정화된 T5 엑소뉴클레아제가 대 규모의(1 mg) 플라스미드 시료(도 1.)로부터의 샘플들에 존재하는 모든 비 슈퍼-코일 디엔에이를 특정하게 제거할 수 있도록 사용되도록 보여 주었다.

키메릭 뉴클레아제도 또한 고려된다. 이것은 뉴클레아제 효소를 알칼리성 용해 또는 다른 대규모 플라스미드 제조방법론 동안에 그 스스로 비활성 또는 제거에 저항하는 혼합 파트너와 화합시킴으로써 잠재적으로 가능해진다. 혼합 파트너는 바람직한 안정화나 국소화 기능을 주는 어떠한 단백질이나 펩타이드도 될 수 있다. 바람직한 실시예에서, '플라스미드-보호' 엑소뉴클레아제가 혼합 파트너와 혼합되는 T5 D15 엑소뉴클레아제에서 키메릭 뉴클레아제가 이용된다. 예를 들어, 소의 췌장 알엔에이즈A는 거친 알칼리성 용해 플라스미드 제조 방법중에 불활성화나 제거에 저항성이 있다. 또한, 이.콜리에서 발현되는 알엔에이즈 A는 알칼리성 용해로부터 맑은 상청액에서 활성화된 형태로 재생된다. 대체하여, 씨오레독신(thioredoxin)에 혼합(Lu Z, DiBlaio-Smith EA, Grant KL, Warne NW, LaVallie ER, Collins-Racie LA, Follettie MT, Williamson MJ, and McCoy JM 1996 J Biol . Chem 271:5059-5065), 알파-시뉴클라인(alpha-synuclein)의 씨-터미널-솔루빌라이징 도메인(C-terminal-solubilizing Domain)(Kim JS.2003, US Patent Application 2003/0125522; Park SM, Ahn KJ, Jung HY, Park JH, and Kim J.2004 Protein Eng.Des.Sel. 17:251-60), 메타노피루스 칸들레리(Methanopyrus kandleri)에서 나온 열안정적인 Ftr(de Marco A, Casatta E, Savaresi S, Geerlof A.2004 J.Biotechnol. 107:125-33) 또는 혼합 파트너의 안정성을 증가시켜 주는 다른 단백질에 혼합(Zhou P, Alexey L, and Wagner G.2003 US Patent Application 2003/0092885; Sanders MC.2002 미국특허출원 2002/0142384)하는 것들도 또한 고려된다.

가장 바람직하게는, 디엔에이 생산 공정에 적당한 방법으로 알엔에이즈와 디엔에이즈 효소들을 결합하는 것이 바람직하다. 이를 실행하는 방법은 적어도 알엔에이즈와 디엔에이즈 활성을 지닌 잡종 효소들이 동시에 발현되는 박테리아 스트레인을 개발하는 것이다. 이것을 성공시키기 위해, (뉴클레오라이시스(nucleolysis)로부터 세포를 보호하기 위해) 그들을 처음에 주변 세포질에 분비하는 것이 필요하고, 디엔에이즈 효소가 용해 중 활성을 잃지 않게 보호하는 것이 필요하다.

우리는 여기서 알엔에이즈A 또는 알엔에이즈에스(RNaseS)와 혼합된 주변세포질의 국지적인 T5 엑소뉴클레아제가 발현되는 몇가지(several) 세포 라인들에서 플라스미드 생산 중에 게놈 디엔에이와 알엔에이가 제거되는 것을 보인다. 우리는 이러한 혼합 효소들이 알칼리성 용해, 자가용해 또는 추출에 의한 플라스미드 공정 중에 오염성 핵산들을 제거하는 데 관여하고 있다는 것을 보여주었다.

플라스미드 디엔에이 생산을 개선하는 생산 호스트 내의 T5 엑소뉴클레아제의 사용은 선행기술에서는 제시되거나 암시되지 않는다. 알엔에이즈와 디엔에이즈 뉴클레아제를 키메릭 뉴클레아제로 결합하는 것 또한 선행기술에서 제시되지 않는다. 더하여, 플라스미드 생산에 키메릭 뉴클레아제를 사용하는 것도 선행기술에서 제시되지 않는다. 여기서 기술된 T5 엑소뉴클레아제와 알엔에이즈의 신규한 혼합들은 두 핵심 핵산 오염원을 동시에 감소시키는 것을 가능하게 해 준다. 두 중요한 요소들의 결합에 더하여, 알엔에이즈 요소는 디엔에이즈 일부의 활성을 예기치 않게 개선시켰다(도 12) 이러한 합성 결과는 합성되지 않은 모체 구성체(parental constructs)에 비하여 키메릭 뉴클레아제의 활동을 개선시킨다. 또한, 단일 단백질은 화합하지 않은 두 구성성분(예를 들어 알엔에이즈와 T5 엑소뉴클레아제)보다 엔지니어가 발현 중 세포 라인들의 생산과 조절을 하는 것을 보다 쉽게 해 준다.

플라스미드 생산공정의 바람직한 실시예들

플라스미드-보호 뉴클레아제를 발현하는 세포들은 발효 배양(fermentation culture)에서 생산된다. 생산 후, 플라스미드는 세포들로부터 정화된다. 플라스미드 정화는 바람직하게는 선행기술에 기술된 알칼리성 용해, 열 용해, 기계적 용해 방법들을 사용할 수 있다.

게놈 디엔에이 감소는 용해 전 및/또는 중 및/또는 후에 발생할 수 있다. 게놈 감소는 삼투압 충격(Baker, M, Taylor M, and Uppal S.2003/WO 03/046177A1)하에서 플라스미드 추출 중에 또한 나타날 수 있는 데, 삼투압 충격에서 본 발명의 주변세포질의 또는 분비된 뉴클라아제는 세포로부터 디엔에이 추출 중에 게놈 디엔에이를 제거한다.

스트레인을 포함하는 플라스미드 보호 뉴클라아제는 두 바람직한 플라스미드 정화 포맷들로 이용된다.(포맷 1과 2, 도 18).

포맷 1은 세포 용해(선처리 단계)에 선행하는 게놈 디엔에이(와 키메릭 뉴클레아제를 가진 알엔에이)의 제거에 관여한다. 뉴클라아제는 원형질 포스트 생산(즉, 내부 막 투과)으로 도입이다. 우리는 OmpAS-peptideT5 + OmpASProtein constructs(도 11-12)와 OmpAT5RNase( 도8) 구조물들을 사용하는 선처리(포맷 1)로 알칼리성 용해에서 알엔에이와 게놈 디엔에이 리덕션을 보였다.

박테리오파지 홀린들같은 요인들을 분쇄하는 유도성 막 또는 화학 물질 또는 세정제를 분쇄하는 막은 가수분해 효소들을 공정이 시작되기 전, 발효 단계의 마지막에 곧바로 원형질로 선택적으로 도입하기 위하여 연계하여 잠재적으로 사용될 수 있다. 이러한 선처리는 세포 페이스트를 가공하기 전에 세포 내에 분해 정도를 어느 정도 조절할 수 있게 하여 준다. 이러한 개선은 용해 시약들로부터 (용해전 활성화 되는 것처럼) 효소들을 보호하기 위한 필요성을 없애준다. 또한, 이러한 포맷에서는 RecBCD와 같은 내생성 뉴클라아제가 목표 게놈 디엔에이 분해에 참여할 수 있다.

포맷 2는 규정화된 선처리 단계의 추가 없는 게놈 디엔에이(와 키메릭 뉴클라아제를 지닌 알엔에이)의 제거와 관련되어 있다. 게놈 디엔에이 리덕션은 세포 제조 중 또는 용해 중 또는 용해 후에 발생할 수 있다. 만약 리덕션이 용해후에 일어난다면, 세포 용해 조건을 통한 효소의 안정화와 효소를 활성화시키기 위한 후속 처리가 필요하게 될 수 있다. 열 용해와 알칼리성 용해의 경우에 이는 증가된 열안정성 또는 알칼리성 SDS 안정성과 고농도의 EDTA와 SDS를 제거하기 위한 이어지는 완충 교환을 필요로 한다. 우리는 OmpAT5RNase(도 17) 구조물을 사용한 선처리(포맷 2) 없는 자가용해에서의 알엔에이와 게놈 디엔에이 리덕션을 보였다.

포맷 2는 또한 콤팩테이션 약품들(Wilson RC and Murphy JC. 2002 US Patent Application 20020197637)의 존재하의 기계적 용해, 또는 미시유동화(microfluidization)(충돌-분사 균질화기(impinging-jet homogenizer))를 사용한 기계적 용해 또는 열안정화를 필요로 하지 않는 베드 밀링(bead milling)(Jem KJ 2002 US Patent No.6455287), 또는 알칼리성 SDS 안정화와 같은 대체적 용해 방법들을 위한 제시이다.

보다 바람직한 실시예에서, 세포는 자가용해를 이용하여 용해된다. 자가용해의 한 방법은 비 락탐 항생물질(B lactam antibiotics)과 같은 세포벽 붕괴 작용제(disrupting agents)를 발효에 첨가함으로써 세포들을 붕괴시키는 것이다. 대체 리소자임 또는 파지가 인코드된 펩타이드 항생물질은 세포를 붕괴시키기 위한 호스트 스트레인에 의해 생산될 수 있다. 재조합 리소자임은 원형질 형태로 세포에 의하여 발현될 수 있고, 원형질로부터 주변세포질로 리소자임과 다른 원형질 단밸질들이 누출되는 통로를 만드는 홀린(펩타이드 또는 단백질을 스패닝하는 막)의 동시발현에 의하여 원하는 시점에 주변세포질로 방출될 수 있다. 사용될 수 있는 예시 리소자임/홀린 복합체들은 선행기술로부터 알려졌고 인용문헌에 의하여 포함되어 있다.

알칼리성 또는 열 용해와는 반대로, 자가용해 조건은 게놈 디엔에이를 선택적으로 분해하지 않는다. 용해의 결과물은 매우 점성이 크고, 공정상 문제점들을 발생시킨다.

우리는 여기서 플라스미드-보호 뉴클레아제 존재하에서 항생물질성 또는 파지 중재 용해와 같은 자가용해가 선택적인 게놈 디엔에이 제거와 점성의 감소를 초래하는 새로운 관찰결과를 보였다.(도 17)

플라스미드-보호 뉴클레아제와의 자가용해의 이러한 결합은 선행기술에는 제시되거나 암시되지 않는다. 즉, 자가용해 방법들은 본 발명의 플라스미드-보호 뉴클레아제가 없다면 높은 수준의 게놈 디엔에이 오염의 존재로 인하여 플라스미드 생산에 사용되는 것은 고려되지 않아왔다. 현재까지의 자가용해 방법들은 단지 비-디엔에이 생체분자들과 때때로 플라스미드와 게놈 디엔에이를 제거하기 위한 비 특정 뉴클레아제를 조직하는 데에 사용하는 것만이 고려되어 졌다. 본 발명의 플라스미드-보호 뉴클레아제들은 대규모의 플라스미드 디엔에이 제조를 위한 여러가지 자가용해 방법들을 위한 새로운 사용을 용이하게 한다.

자가용해 플라스미드 정화는 또한 예전에는 해결이 불가능하다고 여겨졌던 문제들, 즉, 플라스미드 공정에 있어서 복수 세포 용해와 정화 단계들의 제거라는 문제를 해결하였다. 통상의 플라스미드 정화 공정은 굉장히 단축되어 질 수 있고 본 발명의 자가용해 정화의 조직화(도 19)에 의하여 비용적으로도 효율적이 될 수 있다.

뉴클레아제 생산

뉴클레아제 유전자의 발현은 구조성 또는, 더욱 바람직하게는 유도성 프로모터들에 의하여 이루어질 수 있다. 바람직한 유도성 프로모터들은 람다 피알과 피엘(lambda PR and PL), 티5, 티7과 같은 다른 파지 프로모터들, tac와 trc와 같은 합성 프로모터들, 엘에이씨(lac)와 같은 내생성 프로모터들, 냉 쇼크 프로모터들(cold shock promoters)(cspA), 에이알에이비에이디(araBAD), 정지 상태 또는 기아상태 프로모터들, 생장률(rmf)pH(cadA) 또는 산소결핍 반응성(nar) 프로모터들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 유도는 증가된 온도(PL, tac), 열안정성 억제물질(람다 억제물질, 엘에이씨 억제물질)과 함께 감소하는 기압(cspA; 냉 쇼크 프로모터), 유도체(티에이씨, 티알씨, 엘에이씨를 위한 아이피티지(IPTG); 에이알에이비에이디(AraBAD)를 위한 아라비노즈(Arabinose)) 또는 다른 수단들(예를 들어, entry into stationary phase, pH or oxygen shift, glucose or amino acid starvation; reviewed in: Makrides SC. 1996 Microbiol . Rev. 60:512-538). 이에 대체하여, 유전자는 조절된 안티센스 알엔에이에 의하여 유도될 수도 있다.

대여섯의 주변세포질 또는 세포외 목표 신호 펩타이드들은 선행기술에서 알려져 있으며 여기서는 인용문헌(예를 들어, Choi JH, and Lee SY. 2004 S Appl . Microbiol. Biotechnol. 64:625-635)에서 포함되어 있다. 목표 주변세포질을 위한 리더 펩타이드의 예는 OmpA, PhoAOmpT와 PelB이다.

뉴클레아제는 또한 엔엘피에이(NlpA) 리더와 첫 여섯 아미노 산(Harvey BR, Georgiou G, Hayhurst A, Jeong KJ, Iverson BL, and Rogers GK. 2004 Proc. Natl. Acad. Sci. 101:9193-9198) 같은 리더들을 사용한 "고정된 주변세포질 발현(anchored periplasmic expression)"과 같은 알려진 고정 택을 이용하여 고정된 막이다. 이에 대체하여, 뉴클레아제는 용해 중에 세포로부터 생장배양액과 접촉 게놈 디엔에이로 분비될 수 있다.

이에 대체하여, 뉴클레아제는 정화 중에 특정부위 돌연변이 유발, 작은 펩타이드 타겟팅 택의 첨가, 또는 분자 증식 접근(Ness JE, Kim S, Gottman A, Pak R, Krebber A, Borchert TV, Govindarajan S, Mundorff EC, and Minshull J. 2002 Nat.Biotechnol. 20:1251-5; Kurtzman AL, Govindarajan S, Vahle K, Jones JT, Heinrichs V, Patten PA. 2001 Curr . Opin . Biotechnol. 12:361-70)을 사용한 방향성 발달(Zhao H, Chockalingam K, and Chen Z. 2002 Curr . Opin . Biotechnol. 13:104-10)을 사용하여 정화 중에 활성 또는 안정성 또는 분할을 증대시키기 위하여 조작될 수 있다(Collen A, Ward M, Tjerneld F, and Stalbrand H. 2001 J.Chromatogr.A. 910:275-84).

세포 자가용해를 위한 포린 시스템

막공을 만들 수 있는 파지 포린 단백질은 두 종류가 있다. 이들은 문헌에서 알려져 있고, 인용문헌(Young 1992, Supra; Wang IN, Smith and Young R. 2000 Annu. Rev . Microbiol. 54:799-825)에 의하여 여기에 포함된 발명의 실시를 위한 잠재적인 포린들의 비한정적인 목록에 알려져 있다. 한 종류는 티4와 이.콜리의 람다파지, 또는 락토바실러스(Lactobaccillus)의 박테리오파지 엘엘-에이치(LL-H)와 같은 이중 나선 박테리오 파지로부터 나온다. 이러한 포린 단백질은 홀린이라 불리고 그들은 원형질 막에 결합하여 주변세포질로 방출되는 단백질을 분해하는 세포벽의 구멍을 만든다. 이러한 구멍들의 크기는 작은 것(리소자임에 일치되어 원형질로부터 주변세포질로 누출되는 티4 티 단백질(T4 t proteins))에서부터 비 갈락토시다제(B galactosidase)와 같이 100 kd를 초과하는 단백질이 (내부 구멍 직경이 10-12 nm를 초과하고 스텝티노마이신 오(stepyinomycin O)/리스테리아리신 오 시토톡신(listerialysin O cytotoxins)와 크기가 비슷한 람다 에스(lambda S))를 통하여 일치될 수 있도록 충분히 큰 것까지 있다. 우리는 플라스미드 제조를 위한 본 발명의 플라스미드-보호 뉴클레아제와 이러한 포린들과 리소자임을 결합하는 것을 사용한 생산 스트레인의 사용을 고찰한다. 이러한 포린들을 사용한 자가용해 스트레인은 단백질 제조를 위하여 만들어졌으나(Leung and Swartz, Supra, 2001), 플라스미드 생산에의 사용은 선행기술에 제시되지는 않았다.

이에 대체하여, 피에이치아이엑스174(PhiX174)와 같은 단일 나선 디엔에이 파지는 파지 방출을 위하여 필요한 단일 용해 단백질(유전자 E)를 생산한다. 이 단백질과 다른 단일 나선 디엔에이 파지로부터 나온 용해 단백질은 페니실린과 비슷한 방식으로 세포벽 형성을 방해할 수 있고(reviewed in: Bernhardt TG, Wang IN, Struck DK and Young R. 2002 Res . Microbiol. 153:493-501), 유전자 E 생산물은 외부와 내부 막 사이에 유엠(uM) 직경 통로를 형성하여 주변세포질을 효과적으로 밀봉하고 비용해적으로 플라스미드 디엔에이를 포함한 원형질 내용물(Witte A and Lubitz W. 1989 Eur . J. Biochem. 180:393-398)을 미디어에 효과적으로 쏟아붙는다(도.13; reviewed in: Young R, Wang IN and Roof WD. 2000 Trends Micro. 8:120-128). 피에이치엑스174 유전자 이 시스템(The phiX174 gene E system)은 항원 또는 디엔에이 백신 전달을 위한 박테리아 고스트를 만드는 데 이용된다(Jalava K, Iko FO, Riedmann E and Lubitz W. 2003 Expert Rev . Vaccines 2 : 45-51). 디엔에이 백신 전달을 위해 고스트들은 플라스미드 디엔에이로 도로 메워진다. 고스트를 제조하는 방법들은 고농도의 마그네슘(예를 들어, 0.1M MgSO₄) 증가가 용해를 방해한다는 관찰에 근거하여 개발된 것이다. 제조방법은 다음 과정을 포함한다: 1)마그네슘 존재하에 유전자 E의 발현 2) 세포들의 완충 교환; 과 3) 마그네슘을 통로를 형성하기 위하여 떨어뜨리고 원형질 내용물을 쏟아 붙는 것(reviewed in Jalava et al., Supra, 2003).

박테리아 고스트는 플라스미드 디엔에이 제조를 출원하기 위하여 개발된 적이 없고 방출된 플라스미드의 보전은 이전에는 평가된 적이 없다(Witee and Lubitz, Supra, 1989).

뉴클레아제 및/또는 자가용해 유전자 발현을 위한 호스트 스트레인

뉴클레아제 유전자는 타겟 플라스미드와 양립하거나 가장 바람직하게는 게놈내에 결합한 플라스미드에 존재할 수 있다. 스트레인 기술은 플라스미스 제조에 적합한 어떠한 박테리아 스트레인에서도 활용할 수 있다.

뉴클레아제 발현 플라스미드들의 통합된 카피들을 포함하는 박테리아 스트레인들은 다양한 방법들을 사용하여 만들어지는 데, 예를 들면 람다 레드 갬(lambda red gam) 재조합(Murphy KC 1998 J.Bact. 180:2063-2071; Datsenko KA, Wanner BL. 2000 Proc . Natl . Acad .. Sci.(U S A).;97:6640-6645)이다. 이 기술은 디에이치5알파(DH5α)와 같은 알이씨에이-스트레인(recA-strains), 통상의 플라스미드 생산 호스트에서 성공적으로 사용되어졌다. 간단하게 말해서, 플랭킹(flanking) 항생물질 저항 유전자를 포함하는 발현 카세트(들)은 통합부에 상동하는 서열을 포함하는 프라이머들을 사용하여 피씨알(PCR) 증폭된다. 타겟 디에이치5알파(DH5α) 스트레인은 플라스미드 피케이디46(pKD46)과 아라비노스로 유도되는 레드 리콤비나제 생산을 포함하는 생산암피실린 저항 람다 레드 재조합 기능으로 형질전환된다. 세포들은 기술된 피씨알 조각들로 제공되고 전기청공된다. 상동 재조합은 카나마이신으로 선택되고 복제가 허용되지 않은 온도로 옮기고(피케이디46은 열에 민감한 복제 성질을 가지고 있다) 확인된 암피실린 저항성을 제거함으로써 피케이디46 헬퍼 플라스미드가 낫게 된다.

플라스미드 생산

통합된 뉴클레아제 유전자들을 지닌 이.콜리 스트레인은 발효 배양에서 플라스미드 디엔에이를 만드는 데 이용될 수 있다. 예시된 발효 과정은 선행기술로부터 알려져 있다(Carned 2005 참조 : Carnes AE. 2005 BioProcess International, October 2005, in press). 네이쳐 테크날리지 코포레이션은 배취와 페드-배취(fed-batch)(NTC3018) 공저들과 플라스미드 생산에 적정화된 페드 배취(NTC3019) 발효 미디어를 사용한다. 이러한 미디어들은 감소된 생장률을 지지하고 플라스미드 안정성과 보전을 유지하기 위하여 개발되었다. 1100mg/L의 플라스미드 수율과 120의 OD600은 0.12/h의 특정한 생장률을 유지하게 위하여 조절된 공급을 가지고 자동화된 페드-배취 발효 공정으로 달성되어졌다.

우리는 예시된 플라스미드 정화 공정에서의 발효 배양으로부터 피드 스트림(feed streams)이 풍부한 플라스미드를 생산하기 위한 플라스미드-보호 뉴클레아제를 만들기 위한 호스트 스트레인을 이용하는 것을 고안하였다. 고수율 발효의 뉴클레아제 스트레인과 예시된 정화 과정의 결합은 게놈 디엔에이 레벨을 유전자 치료와 디엔에이 백신 적용이 가능한 레벨로 더욱 낮춰 줌으로써 비용 절감적인 방법론을 제공하여 줄 수 있다.

도 1은 T5 엑소뉴클레아제에 의한 변성된 플라스미드와 이.콜리(E. coli) 게놈 디엔에이의 소화도이다.

도 2는 pVEXSapIstuffer 벡터를 보여준다.

도 3은 방향성 증폭과 cDNA 서열을 pVEX로 클로닝하는 방법을 보여준다.

도 4는 pVEXSapIOmpAStuffer vector를 도시하고 있다.

도 5는 pVEXBSapIOmpAStuffer vector를 보여준다.

도 6은 pVEXBOmpARNase vector를 보여준다.

도 7은 pVEXBOmpAT5RNase vector를 보여준다.

도 8은 게놈 디엔에이에서 T5RNase 엑소뉴클레아제의 제거를 보여준다. 플라스미드 디엔에이의 젤 사진이다. 더 선호되는 T5 엑소뉴클레아제와 RNase 유전자(들)을 사용하여 및 사용하지 않은 상태로 시료가 보여진다.

도 10은 키메라 뉴클레아제에 의한 핵산 가수분해를 보여준다.

도 11은 S펩타이드-T5 + S단백질과 T5RNase 구성체로 RNA를 감소시키는 것을 보여준다.

도 12는 S펩타이드-T5 + S단백질 구성체로 RNA와 게놈 디엔에이를 감소시키는 것을 보여준다.

도 13은 PhiX174 유전자 E 포자들을 통하여 E. coli 원형질 내용물을 방출시키는 것을 보여준다.

도 14는 pACYCB 고유 충진(stuffer) 벡터를 보여준다.

도 15는 pACYCB 유전자 E 벡터를 보여준다.

도 16은 E 유전자 용해 단백질이 플라스미드 방출을 매개하는 것을 보여준다.

도 17은 항생 유도성 자가용해 이후 게놈 디엔에이에서 뉴클라아제가 제거되는 것을 보여준다.

도 18은 플라스미드 제조에 있어서 주변세포질 뉴클레아제-발현 생산 숙주들의 이용을 보여준다.

도 19는 자가용해 플라스미드 생산 공정에 있어서 주변세포질 뉴클레아제-발현 생산 숙주들의 이용을 보여준다.

본 발명의 방법은 다음 실시예에 더욱 잘 설명되어 있다. 이들은 설명의 방안으로 제공된 것이며 어떠한 의도로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1 : 피비이엑스(pVEX) 발현 벡터

pVEXSapIstuffer 단백질 발현 벡터는 도 2에 나타나 있다. 플라스미드는 피비알322(pBR322) 복제기점(ROP 결손)과 앰피실린 저항 마커를 가지고 있다.

이 벡터는 이.콜리에 관심 유전자의 발현을 유도하는 유도성 티에이씨(Tac) 프로모터를 가진다. 발현은 (플라스미드상에 코드화된) 엘에이씨아이큐(lacIQ) 유 전자 생산물에 의하여 억제되며 배양에 아이피티지(IPTG)를 첨가함으로써 유도된다.

관심 유전자들은 도 3에 개설된 것 같이 ATG와 TAA 점착성 말단들을 생성하는 에스에이피아이(SapI)형 아이아이에스(IIS) 클로닝 사이트를 구성하는 '스터퍼(stuffer)'로 클론화된다. 유전자들은 유전자 어드레스 택과 함게 프라이머를 사용하고 특이-서열 특정 서열(unique-sequence specific sequences)을 사용하여 클론들 또는 게놈 디엔에이로부터 증폭화되어 복제된다. 타겟 유전자의 내부 에스에이피아이(SapI) 사이트들은 내부 에스에이피아이(SapI) 사이트가 어드레스 택 중 하나에 맞을 확률이 단 1/16에 불과하기 때문에 일반적으로 해롭지는 않다.

이 플라스미드의 유도체, pVEXSapIHNtagstuffer는 관심 유전자를 엔테로키나제 절단 사이트가 따르는 엔 터미널 에이치 엔 택(N terminal HN tag)과 혼합시킨다. 이 택은 고정된 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC) 수지를 친화 정화를 수용하면서 히스택에 동일하게 묶는다. 유전자들은 에스에이피아이(SapI) 사이트들을 에스에이피아이(SapI)로 분해시키면서(New England Biolabs, Beverley NJ) 5'AAG(엔테로키나제 절단 사이트의 마지막 리신 잔류물)과 3'TTA 3 bp 점착성 말단들을 발생시키는 말단에 조직시키는 프라이머로 피씨알 증폭된다.

실시예 2 : pVEXSapIOmpA 분비 벡터의 구성

오엠피에이(OmpA) 분비 신호 펩타이드는 다음과 같이 pVEXstuffer내로 처리된다. 오엠피에이 분비 펩타이드를 인코딩한 올리고뉴클레오타이드는 어닐되고(annealed) pVEXSapIOmpA 스터퍼를 만들기 위한 pVEXSapI 스터퍼의 NcoI 사이트로 클론된다. 결과로서 생기는 클론은 주변세포질로 관심 단백질을 표적하는 오엠피에이 리더를 발현한다. 오엠피에이 리더는 관심 유전자의 Met 코돈에 선행하여 2 아미노산 리더(Ala-Thr)와 함께 관심 단백질을 남겨 놓으면서 잘라진다. 이 벡터의 맵은 도.4에 보여진다. 원형질 구조물들은 관심 유전자를 가진 NcoI/XhoI 조각들을 이 벡터 내로 옮긺으로써 분비된 구조물들로 전환될 수 있다. 엔 터미널 에이치엔(N terminal HN)을 인코딩하고 있는 OmpAHNtagstuffer는 어닐된(annealed) 올리고 삽입을 위한 NcoI 분해된 NcoI digested pVEXSapIHNtagstuffer를 사용하여 상기에 설명된 대로 정확하게 구성된다.

실시예 3 : pVEXOmpAHNRNase 발현 벡터의 구성

소 췌장의 알엔에이즈 유전자는 소 게놈 디엔에이로부터 피씨알 증폭되었다. 모든 피씨알은 (블런트(blunt) 조각들의 말단들에 초과 염기들이 첨가되는 것을 피하기 위하여)표준 피씨알 방법론을 사용한 Pfu 디엔에이 폴리머라제를 사용함으로써 이루어진다.

400 bp 피씨알 생산물은 에스에이피아이(SapI)과 표준 클로닝 방법론을 사용한 에스에이피아이(SapI) 분해된 pVEXOmpAHNstuffer 벡터로 정화되고 클론된 100과 300bp 조각들(내부 에스에이피아이(SapI) 사이트)겔로 분해되었다. 재조합물(pVEXOmpAHNRNase)은 서열이 밝혀졌다.

실시예 4 : 클로닝 T5 엑소뉴클레아제

T5 D15 엑소뉴클레아제 유전자는 파지 T5(ATCC 11303-B5)으로부터 피씨알 증폭되고, 클론되어, 서열이 확정된다. 900bp 조각은 정화되었고 피씨알 HN스터퍼 호환 조각에 주형으로 사용되어 졌다. 이러한 조각들은 정화되어 변형된 폴리링커(poly linker)로 유도된 pW2.0-T5 벡터, pUC19의 SmaI 사이트로 둔단(blunt end) 클론되었다. pW2.0-T5 와 pW2.0-HNT5 클론들은 고립되었고 서열이 검증되었다.

실시예 5 : pVEXSapIOmpAstuffer 발현 벡터의 구성

보다 낮은 누출 발현과 낮은 전체적인 유도 발현을 가진 두번째 발현 시스템이 구축되었다. 이 벡터, pVEXSapIOmpAstuffer는 AraBAD 프로모터를 가지고 있고, 어미 pVEXSapIOmpAstuffer 벡터를 가지는 tac 프로모터를 위한 IPTG 유도와는 반대로 아라비노즈 첨가에 의하여 유도된다.

AraBAD 프로모터와 플랭킹 araC 억제인자는 DH5α 게놈 디엔에이로부터 피씨알 증폭되었다. 이 증폭된 생산물(1.3 kb)은 AarI로 분해되고 pVEX 벡터 분해된 EcoRI/XhoI로 클론되었다. 결과로 나온 클론은 스터퍼의 AraBAD 오페론 다운스트림을 포함하였다. AraBAD 지역은 XhoI와 EcoRI로 절제되었고, 점착성 말단들은 dNTPs와 클레노우로 채워짐으로써 블런트되었다. 1.3 kb 조각은 pVEXSapIOmpAstuffer(bp 247-3108)과 pVEXSapIOmpAHNtagstuffer 벡터들의 2.8 kb 척추 조각에 클론되었다. 척추조각은 MluI 와 XbaI로 분해된 벡터의 겔 정화에 의하여 얻어졌고 클레노우와 dNTP로 블런트 되었고 CIP 처리되었다. 결과로 나온 클론들은 제한 분해(restricion digestion)에 의하여 AraBAD 유전자 좌의 배향을 위하여 스크린 되었다. 마지막 구조물, pVEXSapIOmpAstuffer(도 5)와 pVEXSapIOmpAHNtagstuffer는 lacIq 유전자와 tac 프로모터를 Ara C 억제제와 ara BAD 프로모터로 교환한다.

실시예 6 : pVEXBOmpAHNRNase의 구성

HNRNase 유전자는 NcoI/Xhol에 의하여 pVEXOmpAHNRNase로부터 절제되고 NcoI/Xhol 분해된 pVEXBSapIOmpAHNtagstuffer 벡터로 전환된다.

실시예 7 : pVEXBOmpARNase 발현 벡터의 구성

HNtag은 프라이머들을 가진 AarI를 사용하여 완전한 플라스미드의 피씨알 증 폭에 의하여 pVEXBOmpAHNRNase로부터 제거되었다. 그러면 T5 엑소뉴클레아제는 틈이 벌어진 플라스미드로 클론되었다. 피씨알 증폭 pf pVEXBOmpAHNRNase는 벡터 길이 피씨알 조각으로 되었다. T5-특정 프라이머를 가진 pW2.0T5의 피씨알 증폭은 T5 유전자의 900bp로 된다. AarI로 정화된 피씨알 생산물을 절제하는 것은 (프라이머들에서 이중으로 선이 그어진) 친화성의 점착성 말단들을 만들었고 결합 위에 HN 택의 정밀한 결실이 만들어졌다. pVEXBOmpARNase의 클론들(도 6)은 격리되고 제한 분해와 서열화에 의하여 확인되어 졌다.

실시예 8 : pVEXBOmpAT5RNase 발현 벡터의 구성

HNtag은 프라이머들을 가진 AarI를 사용하여 완전한 플라스미드의 피씨알 증폭에 의하여 pVEXBOmpAHNRNase로부터 제거되었다. 그러면 T5 엑소뉴클레아제는 틈이 벌어진 플라스미드로 클론되었다. 피씨알 증폭 pf pVEXBOmpAHNRNase는 벡터 길이 피씨알 조각으로 되었다. T5-특정 프라이머를 가진 pW2.0T5의 피씨알 증폭은 T5 유전자의 900bp T5 유전자로 된다. AarI로 정화된 피씨알 생산물을 절제하는 것은 친화성의 점착성 말단들을 만들었고 결합 위에 HN 택의 정밀한 결실과 T5 유전자의 삽입을 만들어냈다. pVEXBOmpARNase의 클론들(도 7)은 격리되고 제한 분해와 서열화에 의하여 확인되어 졌다.

실시예 9 : 플라스미드 제조 중 게놈 디엔에이의 T5RNase 분해

pVEXBOmpARNase(알엔에이즈)를 함유하는 DH5α 세포 라인들 또는 pVEXBOmpAT5RNase(T5RNase) 플라스미드들은 5mM MgSO₄ 와 0.2% 아라비노즈의 첨가에 의하여 미드로그 상태(대체적으로 0.5 OD600/mL)에서 유도된 단백질 발현을 포함하는 LB 액체 미디어에서 37℃에서 키워졌다. 배양들은 29℃에서 4시간 유도 후에 수확되었다. 조절이 유도되지 않은 배양들은 동일한 조건들에서 키워졌다. 세포들은 작게 뭉쳐져서 -20℃에서 또는 4℃에서 밤새 보관되어 졌다.

-20℃에서 보관된 세포들은 녹아서 37℃에서 10분간 배양되었다. 4℃에서 보관된 세포들은 추가 선처리없이 진행되었다. 용해는 알엔에이즈 유도된 세포에서 발견되었으나, T5TRNase 유도나 유도되지 않은 세포들에서는 발견되지 않았다.

핵산 분해는 두 분석에서 평가되었다. 첫번째 분석에서, 모든 디엔에이는 Williams et . al.의 빠른 스크리닝 프로토콜을 사용하여 4℃ 세포들로부터 추출되었다(Williams, J.A., Langeland, J.A., Thalley, B., Skeath, J.B., and Carroll, S.B.(1994). Production and purification of polyclonal antibodies against proteins expressed in E. Coli . DNA Cloning:Expression Systems, IRL Press). 간단하게 말해서, 세포들은 세포 붕괴 버퍼(10mM Tris pH 8.0, 100mM NaCl, 10mM EDTA)에서 재현탁되었고, 페놀, 처리된 알엔에이즈 처리되었고, 트래커 염 료(tracker dye)의 첨가후 1% 아가로즈 겔에 용해된 디엔에이로 추출되었다. 두번째 분석에서, 모든 핵산(알엔에이즈 포함)는 알엔에이즈가 P1 버퍼에 첨가되지 않는다는 것을 제외한다면 퀴아젠 미니프렙 버퍼(Quiagen miniprep buffers)(P1, P2, P3)와 프로토콜을 사용하여 분리되었다(Quiagen QIAprep miniprep Handbook, March 2002). 원심분리법에 의하여 맑아진 용해물을 만든 후에 용해물은 37℃에서 10분간 배양되었고, 핵산은 95% 에탄올 3 볼륨을 첨가하여 침전시켰고 ,원심분리에 의하여 모았으며, 70% 에탄올로 세척하였고, 10mM MgSO₄ 를 함유하는 퀴아젠 버퍼 EB(10 mM Tris, pH 8.5)에서 재현탁되었다. 샘플은 37℃에서 10분 배양되었고 트래커 염료가 첨가되었고, 핵산은 1% 아가로즈 겔에 용해하였다.

결과들은 알칼리성 용해 플라스미드 생산 중 T5RNase 합성에 의해 게놈 디엔에이의 '플라스미드-보호' 특정 분해를 보여주었다(도 8). 유도된 세포들은 (유도 후에 계속된 성장) 셍존이 가능하였고 해동시 용해가 일어나지 않았다. 레인 1과 5의 유도된 T5RNase로부터의 알칼리성 용해물들의 염색체 디엔에이 밴드(큰 밴드 >12kb)의 제거를 유오되지 않은 알엔에이즈 조절과 비교하여 주목하라. 게놈 디엔에이의 완전한 제거동안에는 -20℃에서 저장된 샘플들(레인 1과 3을 비교; 레인 1의 나머지 큰 밴드는 슈퍼-코일 2량체이다)에서는 플라스미드 디엔에이의 분해가 관찰되지 않았고, 플라스미드 디엔에이의 부분적 분해는 4℃ 제공된 샘플들에서 관찰되었다. 이것은 다른 선처리(-20℃의 샘플들을 4℃에서 밤새 배양한 것과 37℃에 서 10분간 해동한 것을 비교)가 다르게 뉴클레아제를 원형질로 도입시킨다는 것을 보여준다. T5RNase로부터 총 핵산 추출물의 게놈 디엔에이의 부분적 제거는 또한 레인 9에서 관찰되었으나 알칼리성 용해에 의하여 정화된 선처리 샘플들처럼 완전하지는 않다. 겔은 스캔되고 레인 1-4의 밴드들은 통합되고 정량된다.결과들은 표.1에 요약되어 있다. 게놈 디엔에이 레벨은 관찰된 세포 용해에 관찰된 세포 용해로 인하여 알엔에이즈 유도 레인에서 더 낮다. 레놈 디엔에이는 플라스미드 ㄹ레레벨에서는 어떠한 감소 없이, RNase 유도 샘플에서는 50 폴드 감소한다. 이것은 플라스미드 공정 중에 게놈 디엔에이를 감소하기 위한 키메릭 뉴클레아제의 유용성을 보여준다.

[표 1] 도 8에서의 레인 1-4의 겔 밴드 정량화

밴드	레인 1	레인 2	레인 3	레인 4
슈퍼코일 단량체 플라스미드	27103	31328	21726	27180
슈퍼코일 이량체 플라스미드	2160	1409	3615	558
게놈 디엔에이	824	5967	42406	23671

실시예 10 : RNaseS-T5 융합들

T5 엑소뉴클레아제와 함께 다른 플라스미드-보호 키메릭 뉴클레아제는 게놈 디엔에이와 알엔에이 제거를 위하여 유용한 미케릭 뉴클라아제를 만들기 위한 S-펩타이드 S-단백질 시스템을 사용하여 만들어졌다. 여기서 우리는 이러한 융합들의 구성과 평가를 기술하고, 플라스미드 제조에서의 유용성을 보인다. 이러한 융합은 아래에 보여지는 바와 같이, 알엔에이즈와 증강된 디엔에이즈 활성을 모두 유지한다.

이종 단백질을 알엔에이즈 A의 N 터미널 S-펩타이드에 융합하는 것은 알엔에이즈의 S-단백질과 결합한 후 알엔에이즈 활성을 획득하는 것을 보여준다. S-펩타이드는 서브틸리신 절제에 의하여 방출된 소 췌장의 알엔에이즈 A의 20 아미노산 N 터미널 조각이다; C 터미널 조각(21-124)는 S-단백질이다. S-단백질과 S-펩타이드는 알엔에이즈 S가 천연 알엔에이즈7과 동일한 효소 활성을 가지는 것 같이 높은 친화성(pH 8.3에서 3.1 × 10-11 M)을 가지고 결합한다. S-택 시스템(McComick M and Mierendorf R. 1994 InNonations 1:4-7)은 이종 단백질을 기능성 알엔에이즈에 융합하기 위하여 사용되어진 단백질 정화 시스템이다. S-택은 S-펩타이드의 N 터미널 15 아미노산 잔류물들이고, 이종 단백질에 융합될 때에도 활성 알엔에이즈를 생성시키기 위한 S-단백질과 반응한다. S-택(과 S-단백질)은 이.콜리에서 고농도로 발현되었을 때 매우 용해성이 높고, 어느 말단과 융합할 때에 S-단백질과 높은 친화성의 반응을 중재할 수 있다. S-단백질(S-택 Western Blot)과의 결합 또는 기능성 알엔에이즈S(S-택 급속 시험)의 재구성에 기반한 반응물들은 S 택, 또는 S-펩타이드, 융합들을 빠르게 검출하거나 정량화하기 위하여서는 Novagen으로부터 상업적으로 이용가능하다. 키메릭 뉴클레아제를 만들기 위한 이 시스템의 이용은 도.9에 나타나 있다.

pVEXBOmpA-S-protein은 OmpA 분비 리더 서열(신호 서열)을 알엔에이즈의 S-단백질 조각에 융합한다. OmpASprotein(16-124) 또는 OmpASProtein(20-124)의 융합을 인코딩하는 두 가지 버젼이 개발되었다. 이들은 생체조건내에서 동일한 기능을 보여주었다. 이러한 구성들은 주변세포질 분비 중에 OmpA 리더의 절제 후 정확한 S-단백질을 방출하기 위하여 개발되었다. 이러한 구성들로부터의 발현 카세트는 동시 발현 연구를 위하여 (pVEX와 융화성이 있는)pACYC177로 전환되었다. pACYC177은 pVEX보다 낮은 복제 수이므로 펩타이드보다 적은 S 단백질이 만들어져야 한다. S 펩타이드는 S 단백질의 접힙을 활성화하기 위하여 채택될 수 있으므로 이렇게 디자인되었다.

(S-단백질과 회합하는) S-펩타이드는 분비된 S-펩타이드-T5 융합 벡터(pVEXBOmpA S-peptide-T5)를 반들기 위하여 T5 엑소뉴클레아제(S-peptide-T5)의 N말단 또는 분비된 T5-S펩타이드 벡터(pVEXOmpA T5-Speptide)를 만들기 위한 C 말단에 융합되었다. OmpA 또는 PhoA 분비 리더 서열은 S-펩타이드의 천연 n 말단을 정확하게 방출하기 위하여 사용되어졌다.

동시 발현되었을 때, S펩타이드와 S단백질 조각들은 융합된 T5 엑소뉴클레아제로부터 디엔에이즈 기능과 마찬가지로 알엔에이즈 기능을 염두에 둔 알엔에이즈 와 회합하기 위하여 디자인되었다.

실시예 11 : 플라스미드 정화 RNaseS-T5 융합들

예를 들어, 알엔에이즈S-T5을 사용하여 게놈 디엔에이를 감소하는 대략적 방법은 도 10에 나타나 있다. 발현과 분석은 T5알엔에이즈를 위한 실시예 9에서 기술한 바와 같이 실시되었다. 게놈 디엔에이와 알엔에이의 리덕션은 이러한 융합들을 발현시키는 세포 라인에서 관찰되었다(도 11-12). OmpASprotein 구조물(16-124 또는 20-124)의 존재하에, OmpAS 펩타이드-T5 구조물은 다른 단일 구조물에 비하여 게놈 디엔에이와 알엔에이를 감소시켰다. OmpAT5-Speptide 구조물은 단백질 가수분해에 민감했고(SDS-PAGE 분석에 의하여 검출된 분해 밴드들) 예상된 대로 OmpASpeptide-T5 구조물에 비하여 알엔에이즈와 디엔에이즈 활성을 감소시켰다. 모든 다른 T5 또는 ,Speptide-T5 구조물들은 가수분해에 안정하였다(SDS-PAGE 분석에 의하여 예상된 크기의 밴드가 관찰되었다). 이것은 알엔에이즈 활성을 보존한 RNase S와 회합함에 의하여 T5 엑소뉴클레아제의 활성을 증강시키는 것을 보여준다.

실시예 12 : PhiX174 유전자 E 발현 벡터의 구성

PhiX174 유전자 E 단백질은 높은 복제 pCU 오리진 플라스미드(예를 들어, gWiz-GFP, pDNAVACCUltra-EGFP)와 pBR322 오리진 플라스미드들(예를 들어, 구굼 EXRNase)에 친화성이 있는 플라스미드상에 AraBAD 조절을 하여 클론되었다.

pVEXB-native 스터퍼

pVEXSapIstuffer 벡터는 XbaI와 MluI로 분해되었다. 점착성 말단들은 클레노우와 dNTP로 채워졌고 열에 소멸되었다. 이 말단들은 송아지 내장 포스파타아제로 탈인산화되었다. 2.8 kb 조각은 1.5 kb 조각으로부터 겔 정화되었다. pVEX 벡터는 EcoRI와 XhoI로 분해되었다. 점착성 말단들은 클레노우와 dNTP로 채워졌다. araB 프로모터를 가진 1.3 kb 조각은 4.3kb로부터 겔 정화되었다. 단계 1과 2로부터 조각들은 연결되었고, 형질변환되었고 Amp에 스크린되었다. 정확한 기원을 가진 클론(pVEXB-Native 스터퍼)은 제한 분해에 의하여 선택되고 서열에 의하여 확인되었다.

pACYCB-native(도 14)와 OmpA 스터퍼 벡터들

pVEXBOmpAstuffer와 천연 스터퍼 발현 벡터들로부터의 카세트는 오리진 벡터들(예를 들어, pVEX와 pDNAVACCUltra 벡터들)에 기반한 pUC와 pBR322과 동시 발현하게 해 주는 pACYC 벡터로 전사되었다. CIP처리되고, 겔 정화 XmnI 분해된 pACYC-RIL 플라스미드(조각 A)가 제조되었다. pVEXBOmpAstuffer와 pVEXBnativestuffer는 (클레노우와 dNTP로 채워진) EcoRI로 분해되고, 더 작은 조각들(pVEXBOmpAstuffer 는 2703, 1466, 조각 B1이다; 약간 더 작은 pVEXBnative 스터퍼, 조각 B2)는 정화된다. 조각 A, B1(pACYCBOmpAstuffer) 또는 A와 B2(pACYCBNative 스터퍼)sms 혼합되고 연결되었다. 연결들은 DH5α 복합 세포들로 형질전환되고 클로로암페니콜 아가 플레이트상에 선별되었다. 클론들과 오리엔테이션은 제한 분해에 의하여 확인되었다.

pACYCB 유전자 E(도 15)

phiX174 유전자 E 단백질은 10ng phiX174 디엔에이을 주형으로 하여 피씨알 증폭되었다. 72C에서 1분의 연장시간과 95C에서 30초의 분해로 5×45C 어닐, 25×55C 어닐을 사용되었다. pACYC-Bnative 스터퍼는 SapI와 정화된 두 조각(4375, 282, 34)으로 분해되었다. 3 조각들은 혼합되어 연결되었다. 연결들은 DH5α로 형질전환되었고 LB+클로암페니콜+글루코오스(0.2%)로 형질전환되었다(글루코오스는 누출 발현을 감소시키기 위하여 첨가된다). pACYCB phiX174 유전자 E 벡터는 제한 분해와 서열에 의하여 확인되었다.

실시예 13 : 유전자 E 유도 세포 고스팅에 의한 높은 카피 pUC 오리진 플라스미드의 방출

세포 라인들은 정화된 플라스미드들을 가진 Z 구성(Zymos) 이.콜리의 형질전 환에 의하여 만들어졌고 (아라비노즈 프로모터로부터 누출 유전자 E 발현을 줄이기 위한) 항생물질과 0.2% 글루코오스를 포함하는 아가로즈 플레이트 상에서 키워진다. 세포 라인들은 34 ug/mL 클로암페니콜(유전자 E 발현 플라스미드를 포함하는 스트레인들) 및/또는 50 ug/mL 카나마이신(pDNAVACCUltra 플라스미드를 포함하는 스트레인들) 또는 100 mg/mL 암피실린(pVEX 플라스미드를 포함하는 스트레인들)을 포함하는 37℃ LB 미디어에서 키워졌고 미드로그(약 0.5 OD600/ml)에서 유도되었다. 아라비노즈 유도는 100x 스톡에서 0.2% 마지막 농도까지 아라비노즈 첨가에 의한 것이다. 겔 분석을 위한 미디어 추출물은 1) 정화된 미디어를 사용하여 또는 2) 페놀 클로로포름 추출, 에탄올 침전과 TE(20x 농도)에서 재현탁 중 하나에 의하여 이루어졌다. 겔 분석을 위한 세포 펠렛 추출물은 버퍼(10-20x 농도)에서 세포 펠렛의 재현탁, 규정된 온도와 기간에서의 배양, 이후 페놀 클로로포름 추출에 의하여 이루어졌다. 상청액들은 겔 전기이동에 의하여 곧바로 분석되었다. 세포 펠렛의 총 핵산들은 Williams et . al ., Supra , 1994에 기술된 바대로 세포 붕괴 버퍼를 사용하고, (원 미디어 볼륨에 비교하여) 세포 붕괴 버퍼의 10-20 폴드 농도를 사용하여 추출되었고, 알안에이즈는 첨가되지 않았다. 추출물들은 아가로즈 겔 전기이동에 의하여 핵산이 분석되었고 알엔에이와 디엔에이는 1/10,000 희석된 SYBR 그린 II(Sigma)로 포스트스테이닝에 의하여 시각화되었다.

유전자 E 용해 단백질 발편에 의한 핵산 방출

세 세포 라인들이 만들어지고 평가되었다: 1)pACYC-B-gene E 2)pACYC-B-gene E+pDNAVACCUltra-GFP 와 3)pDNAVACCUltra-GFP. pDNAVACCUltra는 높은 카피 카나마이신 저항 pMB1 오리진 플라스미드이고 pACYC 플라스미드들에 친화성이 있다.

세포들은 A)유도되지 않거나; 또는 B)아라비노즈로 0.2%로 유도되거나; 또는 C)(고스팅을 막기 위하여) 0.2 M MgSO₄ 존재하에서 아라비노즈로 0.2%로 유도되었다. 세포들은 30분간 유도되었고 할수(aliquots) 수확되었다. 상청액들은 아가로즈 겔 전기이동에 의하여 핵산이 분석되었고, 알엔에이와 디엔에이는 1/10,000 희석 SYBR 그린 II(Sigma)로 포스트스테이닝에 의하여 시각화되었다. 1.5mL 세포들로부터의 펠렛은 TE 버퍼(10mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)의 100 uL에서 재현탁되었고, 1시간동안 RT에서 배양되었고, 세포들은 펠렛되었다. TE 세포 추출물들은 상기와 같이 겔 전기이동에 의하여 분석되었다.

플라스미드(pDNAVACCultra-GFP)의 PhiX174 유전자 E의 LB로의 방출과 추출 상청액은 유도 후에 관찰되었다. 알엔에이와 게놈 디엔에이도 또한 방출되었다. 세포들 내의 플라스미드 대부분은 유도된 (MgSO₄가 없는) 샘플로부터 미디어와 TE 추출물로 방출되었다. 만약 유전자 E가 0.2 M MgSO₄ 플라스미드의 존재하에서 유도되었다면, 플라스미드는 LB로 방출되지는 않으나, MG 농도가 TE 추출 버퍼에서 더 낮아질 때 방출되었다. 이러한 실험들은 배양 고스팅이 유전자 E, 높은 카피 플라스 미드의 존재하에서 일어났고 플라스미드 방출이 유전자 E 유도에 의존한다는 것을 보여주었다. 어떠한 플라스미드도 홀로 있는 pDNAVACCUltra 세포 라인으로부터 방출되지 않았고 플라스미드 방출은 phiX174 유전자 E 생산물에 의존한다는 것을 보여주었다. 또한, 미디어로의 플라스미드 방출은 미디어에서 0.2M MgSO₄의 포함에 의하여 방지될 수 있다. 이것은 세포가 수확될 수 있게 해 주고, 마그네슘을 제거하기 위하여 버퍼가 교환될 수 있게 하고 플라스미드가 방출하게 해 준다.

pDNAVACCultra-GFP 플라스미드의 방출을 유도하는 phiX174 유전자 E의 시간 진행이 실시되었다. 완전한 플라스미드는 30-40분 유도 후 세포들로부터 방출되었다.

phiX174 gene E+ pDNAVACCultra-GFP 유도되지 않거나 유도된 펠렛들로부터의 플라스미드는 PI, TE, PBS, EB(10mM Tris, pH 8.5), BB(50 mM PO₄, 30mM NaCl) 또는 10mM MgCl₂와 추출되었다. 플라스미드오 알엔에이와 게놈 디엔에이는 이러한 조건들에서 추출되었다(도 16). PI 또는 EB와 함께 플라스미드 덩어리가 방출되었는 데, 추출 후 세포 펠렛에 약간의 플라스미드가 남았다(레인 B2와 B1을 비교, 도 16). EB에서의 플라스미드 방출은 EDTA는 플라스미드 방출에 필요하지 않다는 것을 보여주었다. 이것은 공정 중 LPS 방출을 유도하는 EDTA 없이도 공정이 가능하다는 것이기 때문에 매우 효과적이다.

플라스미드와 게놈 디엔에이 그리고 완전한 알엔에이의 추출을 비교한 약간의 차이점들이 관찰되었다. 예를 들어, 게놈 디엔에이와 플라스미드가 10 mM MgCl₂에서 적게 추출이 되는 반면, 알엔에이는 BB, 10 mM MgCl₂와 PBS에서 적게 추출이 된다. 이러한 염과 양이온 효과는 방출된 플라스미드의 정화를 높이는 데 최적화될 수 있다.

유도되지 않은, 유도된 그리고 + 10 또는 30 mM 스페르민 플라스미드 방출을 비교함에의하여 스페르민 존재하에서 pDNAVACCultra-GFP의 PhiX174 유전자 E 방출이 결정되었다. 플라스미드와 유전자의 LB로의 방출은 30 mM 스페르민에 의하여 방해되었고, 10mM에 의하여 부분적으로 방해되었다. 알엔에이는 총 펠렛이나 30 mM 스페르민의 용리에서는 전혀 검출되지 않았다. 스페르민 처리된 세포들은 PI, TE, 또는 EB와 추출된 플라스미드에 저항성이 있었으나, 일부 플라스미드는 PBS, BB(50mM PO₄, 300mM NaCl) 또는 10mM MgCl₂와 스페르민 처리된 세포들 30 mM로부터 추출되었다. 유도된 세포들이 RT에서 밤새 배양되었을 때, 모든 세 유도 조건들을 지닌 플라스미드의 미디어로의 방출이 관찰되었다. 보다 많은 알엔에이가 스페르민과 함게 방출(또는 압착)되었고, LB에서 밤새 배양 후 플라스미드의 닉은 거의 관찰되지 않았다. 이것은 방출된 플라스미드가 미디어에서 저장되었을 때 안정된다는 것을 보여주었다.

플라스미드의 PhiX174 유전자 E 매개방출이 버퍼 PI 또는 50 mM Tris, 10mM MgCl₂, pH 8.0의 RT, 37℃, 55℃와 65℃에서 30분간의 세포 펠렛의 배양으로 시험되었다. 플라스미드 방출과 완전성은 플라스미드 닉과 증가된 게놈을 가진 RT, 37℃ 또는 55℃ 온도, PI의 65℃에서는 일부 용해에서는 기대되지 않았다. Tris/mg가 아닌 PI를 지닌 RT와 비교할 때 일부 알엔에이 분해가 37℃에서 관찰되었다.

총괄하여, 이러한 결과들은 유전자 E 용해 단백질 유도 플라스미드 방출이 완전한 플라스미드의 세포들로부터 높은 수율의 방출에 적합하다는 것을 보여준다. 플라스미드 방출은 추출 버퍼 또는 미디어의 다른 압축기들이 스페르딘을 가지고 또는 가지지 않고 변경되는 이온 강도/pH에 의해 조절될 수 있다. 플라스미드는 미디어로 방출될 때 또는 추출 버퍼시 안정하다. 이것은 또한 세포가 게놈 디엔에이/알엔에이의 최적의 효소의 제거를 위한 조건 하에서 플라스미드를 방출하기 위하여 다양한 버퍼들로 버퍼 교환될 수 있음을 보여준다. 그러나 게놈 디엔에이와 알엔에이의 고 레벨은 이 방법을 이용하여 방출된다.

실시예 14 : 유전자 E 용해 단백질 유도 세포 고스팅에 의하여 방출된 게놈 디엔에이와 알엔에이의 제거

알엔에이와 게놈 디엔에이의 뉴클레아제 리덕션

다섯 세포 라인들이 만들어지고 평가되었다: 1)pACYC-B-gene E; 2)pACYC-B-gene E+pDNAVACCUltra-GFP; 3)pDNAVACCultra-GFP; 4)pACYC-B-gene E+pVEXBT5RNase; 와 5)pVEXBT5RNase. pVEXBT5RNase는 알엔에이, 게놈 디엔에이에 대항한 활성을 가진 아라비노즈 유도성 뉴클레아제를 지닌 중간 카피 앰피실린 저항성 pMBI 오리진 플라스미드이고, pACYC 플라스미드에 친화성이 있으나, 슈퍼-코일 플라스미드는 아니다.

배양들은 유도되지 않거나, (0.2% 아라비노즈, 유전자 E와 T5RNase를 모두 유도하기 위한) 포스트 유도로 70분 키워지고, 배양 상청액에서 핵산, 세포 펠렛의 삼투압 충격, 겔 전기 이동에 의하여 평가되었다. PhiX174 유전자 E 용해 단백질과 pVEXBT5RNase를 지닌 유도된 세포 라인들은 T5RNase가 유도될 때 미디어로 방출되는 게놈 디엔에이를 많이 감소시켰다. 삼투압 충격된 세포 펠렛들(5mM MgSO₄, 데이터가 보여지지 않음)에서 동일한 효과가 관찰되었다. 유도되지 않은 세포들로부터 게놈의 방출은 용해 단백질의 누설 발현으로 인한 것이고 이는 이 실험에서 유도되지 않은 조절을 위하여 유용한 고 OD600에서 고스팅을 유발한다. 이는 T5RNase의 동시-발현이 유전자 E 방출 게놈 디엔에이를 파괴하는 것을 보여주고 방출된 플라스미드 정화와 용해물의 점도를 감소시키는 데 유용하다는 것을 보여준다.

실시예 15 : PhiX174 유전자 E 단백질 중재 자가용해를 사용한 플라스미드 디엔에이의 제조

플라스미드 제조에 있어서, 포린 유전자의 발현은 게놈으로 통합하기 위하여 필요하다. 포린 유전자의 발현은 유도성 프로모터들에 의하여 개시될 수 있다. 유도성 프로모터들은 람다 PR과 PL, T5,T7와 같은 다른 파지 프로모터들, tac와 trc같은 합성 프로모터들, lac 같은 내생성 프로코터들, 냉 충격 프로모터들(cspA), araBAD, 정지상 또는 기아 프로모터들, 생장률(rmf) pH (cadA) 또는 아녹시아 반응성(nar) 프로모터들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 유도는 열안정성 억제제(람다 억제제, lac 억제제), 유도제(tac, trc와 lac를 위한 IPTG; AraBAD를 위한 아라비노즈) 또는 다른 수단들(예를 들어, 정지 상, pH 또는 산소 변화, 글루코오스 또는 아미노 산 기아로의 도입; reviewed in Makrides SC. 1996) 증가된 온도(PL, tac), 떨어지는 온도(cspA; 냉 충격 프로모터)에 의하여 될 수 있다. 대체하여, 유전자는 조절된 안티센스 알엔에이에 의하여 유도될 수 있다. 여러가지 유도성 PhiX174 E 발현 시스템이 개발되었고 열(C1857에 의하여 조절되는 돌연변히 람다 PR; Jechlinger W, Szostak MP, Witte A 와 Lubitz W. 1999 FEMS Micro . Lett. 173:347-352), 냉(lac 또는 파지 조정기와 결합하녀 C1857에 의하여 조절되는 람다 PR, Jechlinger W, Szostak MP 와 Lubitz W. 1998 Gene 218:1-7) 또는 화합물들(락토오스 또는 lacPO/Ptac와 결합한 IPTG 또는 xylS 억제제-PTol과 결합한 3MBZ)에 의하여 조절된다.

미디어로의 플라스미드 방출은 유전자 E 발현에 의하여 유도될 것이다. 미디어로 버퍼를 직접 투입하는 것은 방출 또는 선택도를 향상시키는 데 사용될 수 있다. 세포 부피는 맑아진 배양액에 플라스미드를 남기고 여과법 또는 원심분리법에 의하여 제거될 것이다. 맑아진 배양액의 게놈 디엔에이와 알엔에이는 (스트레인의 게놈내로 혼합되고, 세포 라인에서 발현되거나 외생성 첨가된) 뉴클레아제의 사용에 의하여 줄어들 수 있다.

대체하여, 오염 알엔에이와 게놈 디엔에이는 현재 알려진 방법들을 사용하여 줄어들 수 있는 데, 맑아진 배양액을 선택적 분해 또는 열 또는 알칼리 처리에 의한 분해같은 것들이다. 이 경우에 맑아진 배양으로부터 게놈 디엔에이와 알엔에이를 제거하는 것은 완전한 세포 용해보다는 고스팅 후에 발생하고 LPS 같은 세포 구성물의 방출은 줄어들 수 있다. 세포들로부터 플라스미드 방출은 또한 고스트화된 세포들로부터 LPS 발산을 더욱 감소시키기 위해 EDTA같은 금속 킬레이트없이 이루어질 수 있다. PEG 또는 CTAB 같은 압축 작용제 또는 CaCl₂ 같은 이가 양이온은 게놈과 알엔에이 오염원들로부터 플라스미드 디엔에이를 선택적으로 정화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 게놈 디엔에이 또는 알엔에이 리덕션 방법들은 선행기술에서 알려져 있다.

대체하여, 플라스미드 방출은 유전자 E 유도 전 또는 후에 막 경직도(예를 들어 0.2 M MgSO₄)를 변화시키거나 디엔에이 압축(예를 들어 스페르민)을 증가시키거는 작용제의 포함에 의하여 연기될 수 있다. 마지막 세포 개체군은 수확될 것이고, 버퍼는 (예를 들어, MgSO₄의 경우에 Mg 농도를 줄임으로써) 플라스미드 방출을 용이하게 하는 버퍼로 변화할 것이다.

실시예 16 : 항생물질 중개 자가용해를 이용한 플라스미드 디엔에이의 제조

항생물질을 억제하는 세포별을 이용하는 대체적 자가용해 방법이 평가되었다. pVEXBOmpATRNase 구조물의 T5RNase 카세트는 pACYCB 구조물로 전사되었다. gWizGFP 플라스미드와 함께 전사되는 각각의 pACYCBTRNase 또는 pACYCBNative 스터퍼(control) 배양들은 LB+50ug/mL 카마이신+34ug/mL 클로암페니콜+4mM MgSO₄에서 길러졌고 단백질 발현은 미드 로그 생장 동안 30℃에서 1시간 동안 0.2% 최종 농도까지 아라비노즈로 유도되었고 세포 자기용해는 암피실린과 세로포탁심(Fulka)의 첨가(B 락탐 항생물질)의 첨가에 의하여 100과 10ug/mL의 최종 농도로 유도되어졌다. 매양들은 용해와 뉴클레아제 분해에 영향을 미치기 위하여 30℃에서 밤새 흔들어졌다. 세포 파편들은 원심분리에 의하여 제거되었고 상청액의 핵산 내용물은 단백질을 제거하기 위하여 페놀 클로로포름 추출 후 아가로즈 겔(SYBR green II post- stain)에 의하여 평가되었다. 게놈 디엔에이는 T5RNase에서 결정적으로 줄어들었으나 조절은 아니다. 잔여 게놈 디엔에이는 배양에 의하여 제거되었다(37℃ 30분). 상승된 온도에서 용해된 배양의 연장된 배양에도 불구하고 플라스미드 리덕션은 관찰되지 않았다. 예상한 바대로 용해물 점도는 조절 세포 라인에 비교하여 T5RNase 세포 라인에서 크게 줄어들었다.

이러한 결과들은 플라스미드 생산을 위한 여러가지 자가용해 방법들에서 플라스미드-보호 뉴클레아제의 조합의 일반적인 유용성을 보여준다.

즉, 독자들은 본 발명의 플라스미드-보호 뉴클레아제와 관련 생산 공정이 개선된 플라스미드 생산을 위한 구성과 공정을 제공하는 것을 볼 것이다.

상기 설명은 많은 특징들을 포함하고 있으나, 이들에 의하여 본 발명이 제한되는 것은 아니고, 오히려 바람직한 실시예의 구체화라고 할 것이다. 변형이 다양하게 이루어질 수 있다. 예를 들어 게놈 디엔에이 리덕션, 내생성 엑소 뉴클레아제(recBCD)를 사용하여,은 염색체 파괴가 제한 엔도뉴클레아제(Hank and Ward, 2001) 또는 감마선 조사(MacPhaee et . al., 1988)를 사용하여 유도될 때 관찰된다; 이 말단들은 내생성 뉴클레아제의 대체물이다. 이러한 포맷에서 세포들은 염색체가 유도된 후(밤새 조사) 생장을 계속한다. 이것은 디엔에이를 제거하기 위하여 내생성 엑소뉴클레아제를 사용할 때는 잘 작동이 되지 않고 본 발명의 플라스미드-보호 엔도뉴클레아제를 사용하여 크게 개선이 된 것이다.

따라서 본 발명의 범위는 제시된 실시예에 의하여 제한되지 않고 첨부된 청구항과 그들의 법적인 균등물에 의하여 결정된다.

Claims

A)이.콜리 게놈에 하나 이상의 플라스미드-보호 뉴클레아제를 인코딩한 유전자를 도입하는 단계; B)도입된 유전자 서열들로부터 상기 뉴클레아제의 생산을 지시하고 그 결과로써 신호 펩타이드에 의하여 주변 세포질 공간으로 효소들이 향하게 하는 단계 또는 이와 등가의 공정 단계; 그리고 C)플라스미드, 코스미드, 또는 박테리아성 인공 염색체 레플리콘과 같은 디엔에이 레플리콘의 존재 하에 상기 이.콜리 세포들을 생장시키는 단계; 그리고 D)뉴클레아제(들)을 원형질 내용물로 도입하고 그 결과로써 상기 이.콜리 게놈 디엔에이는 분해되고 유도된 레플리콘 디엔에이는 분해되지 않는 단계; 그리고 E)박테리아 내용물로부터 유도된 레플리콘을 정화시키는 단계들로 구성되어 플라스미드 순도를 증가시키는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 하나 이상의 키메릭 효소들을 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 융합 파트너로써 적어도 알엔에이즈 효소의 부분과 함께 디엔에이즈를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 알엔에이즈A와 함께 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제를 융합하는 키메릭 효소를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 1항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 알엔에이즈S와 함께 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제를 융합하는 키메릭 효소를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
A)이.콜리 게놈에 하나 이상의 플라스미드-보호 뉴클레아제를 인코딩한 유전자를 도입하는 단계; B)도입된 유전자 서열들로부터 상기 뉴클레아제의 생산을 지시하고 그 결과로써 신호 펩타이드에 의하여 주변 세포질 공간으로 효소들이 향하게 하는 단계 또는 이와 등가의 공정 단계; 그리고 C)플라스미드, 코스미드, 또는 박테리아성 인공 염색체 레플리콘과 같은 디엔에이 레플리콘의 존재 하에 상기 이.콜리 세포들을 생장시키는 단계; 그리고 D)세포들을 자가용해시키고 그 결과로써 상기 이.콜리 게놈 디엔에이는 분해되고 유도된 레플리콘 디엔에이는 분해되지 않는 단계; 그리고 E)박테리아 내용물로부터 유도된 레플리콘 디엔에이를 정화시키는 단계들로 구성되어 플라스미드 순도를 증가시키는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 하나 이상의 키메 릭 효소들을 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 알엔에이즈A와 함께 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제를 융합하는 키메릭 효소를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 알엔에이즈S와 함께 파지 T5 D15 엑소뉴클레아제를 융합하는 키메릭 효소를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제(들)은 융합 파트너로써 적어도 알엔에이즈 효소의 부분과 함께 디엔에이즈를 포함하는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 자가용해는 파지 용해 단백질들을 이용하여 이루어지는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
제 6항에 있어서, 자가용해는 항생물질을 이용하여 이루어지는, 공유성 폐쇄 슈퍼-코일 플라스미드 디엔에이의 생산 방법.
A)하나 이상의 융합 파트너의 존재가 있거나 없는 상태에서 T5 D15 엑소뉴클레아제와 같은 적어도 하나 플라스미드-보호 뉴클레아제나; B)플라스미드-보호 뉴클레아제가 정화로부터 얻어지는 플라스미드의 순도를 증가시키는 데 사용되는 적어도 하나의 플라스미드를 함유하는 하나 이상의 박테리아 스트레인을 포함하는 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 플라스미드-보호 뉴클레아제는 T5 D15 엑소뉴클레아제인 조성물.