RU2071503C1 - ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК - Google Patents
ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК Download PDFInfo
- Publication number
- RU2071503C1 RU2071503C1 SU5027679A RU2071503C1 RU 2071503 C1 RU2071503 C1 RU 2071503C1 SU 5027679 A SU5027679 A SU 5027679A RU 2071503 C1 RU2071503 C1 RU 2071503C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- vector
- dna
- pel5c
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 claims description 6
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 claims description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 5
- 101000925646 Enterobacteria phage T4 Endolysin Proteins 0.000 claims description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 241000702374 Enterobacteria phage fd Species 0.000 claims 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 15
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 15
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 abstract description 12
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 abstract description 7
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 abstract description 7
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 abstract description 7
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- CTETYYAZBPJBHE-UHFFFAOYSA-N Haloprogin Chemical compound ClC1=CC(Cl)=C(OCC#CI)C=C1Cl CTETYYAZBPJBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical class [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N Tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine Chemical compound CC(O)CN(CC(C)O)CCN(CC(C)O)CC(C)O NSOXQYCFHDMMGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 pH 4.8 Substances 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, и в частности к генетической инженерии, и может быть использовано при создании плазмид и соответствующих штаммов-продуцентов рекомбинантных белков, а также для очистки белковых продуктов. Преимущество заявленного вектора рЕL5с заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима, одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E. coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимого агломерата рекомбинантного белка.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, генетической инженерии и может быть использовано для получения плазмид, синтезирующих рекомбинантные белки.
Большие количества рекомбинантных белков можно синтезировать в клетках Escherichia coli, несущих системы экспрессии рекомбинантных генов на основе промоторов фага лямбда (см. например, Н. Bernard and D. R. Helinski. Methods Enzymol. vol. 68, pp. 482-492, 1979). Транскрипция в таких системах регулируется связыванием температурочувствительного репрессора фага лямбда, кодируемого мутантным геном с lts857, с операторным участком. Когда клетки растут при температуре 30-32oC, репрессор связывается с оператором и блокирует экспрессию. При повышении температуры роста до 42oС репрессор инактивируется, что позволяет РНК-полимеразе связаться с промотором и начать транскрипцию гена. В результате интенсивной транскрипции и последующей трансляции могут синтезироваться значительные количества белка.
Известны рекомбинантные плазмидные ДНК pЕХ1, рЕХ2 и рЕХ3, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белки во всех трех рамках считывания (К. К. Stanley and J. P. Luzio. The EMBO Journal, vol.3, pp. 1429-1434, 1984). Последовательности ДНК для экспрессии можно вставить в полилинкер, расположенный в 3'-конце гена lacZ. В указанных плазмидах РR промотор бактериофага лямбда обеспечивает экспрессию последовательностей ДНК, и продукт составляет значительную часть суммарного бактериального белка. Экспрессируемый белок в клетке накапливается в виде водонерастворимых агломератов.
Однако у этих векторов есть недостаток: для выделения водонерастворимых агломератов рекомбинатного белка необходимо разрушать клеточную стенку бактерии.
Вектор рЕХ3 выбран в качестве прототипа для получения вектора рЕL5c. Преимущество заявленного вектора рЕL5с заключается в том, что в результате использования оперона, состоящего из гена, кодирующего рекомбинантный белок, и гена лизоцима, одновременно с синтезом рекомбинантного белка идет синтез лизоцима, разрушающего полисахаридную оболочку E.coli, что существенно упрощает очистку водонерастворимых агломератов рекомбинантного белка.
Сущность изобретения состоит в том, что сконструирован вектор рЕL5с размером 6,4 тысячи пар оснований (т.п.о.), состоящий из следующих элементов:
-Xbal-Xbal-фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХ3 размером 5,8 т. п.о. который содержит слитный cro-lacZ ген, кодирующий слитный белок под контролем промотора PR бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена;
-BamH1-BamH1-фрагмента ДНК плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohenю J. Bacteriol. vol.134, рр.1141, 1978), содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.
-Xbal-Xbal-фрагмента плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХ3 размером 5,8 т. п.о. который содержит слитный cro-lacZ ген, кодирующий слитный белок под контролем промотора PR бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена;
-BamH1-BamH1-фрагмента ДНК плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohenю J. Bacteriol. vol.134, рр.1141, 1978), содержащего ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющего размер 0,6 т.п.о.
Для конструирования плазмиды рЕL5с ДНК плазмиды рЕХ3 гидролизуют рестриктазой Хbal и достраивают по три нуклеотида в липких концах с помощью ДНК-полимеразы PolIK. Параллельно получают BamH1 рестрикт размером 0,6 т.п. о. из плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohen. J. Bacteriol. vol.134, рр. 1141, 1978), содержащий ген лизоцима бактериофага Т4 и имеющий три достроенных с помощью PolIK нуклеотида в липких концах. Фрагмент рЕХ2 лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген лизоцима бактериофага Т4. Лигазной смесью трансформируют клетки E. coli, содержащие в хромосоме температурочувствительный ген бактериофага лямбда с Its857, например клетки штамма PLТ90. Трансформанты высевают на среду с ампициллином при 30oС. Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рEL5с. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0 1 мМ ЭДТА при -20oС.
Пример 1. Получение векторной плазмиды рEL5с с оперонной системой экспрессии и лизиса.
Клетки бактерий E. coli РLT90, содержащие плазмиду рЕХ3 (K. K. Stanley and J. P. Luzio. The EMBO Journal, vol.3, рр. 1429-1434, 1984), выращивают в 50 мл бульона 2YT (16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl на 1 л воды), содержащего 100 мкг/мл ампициллина до титра 109 кл/мл.
Клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 2 мл раствора (50 мМ глюкозы, 25 мМ трис HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 5 мг/мл лизоцима) и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 4 мл раствора 0,2 М NaOH, 1% додецилсульфата натрия, перемешивают, инкубируют 10 мин во льду, добавляют 3 мл охлажденного 5 М раствора ацетата калия, рН 4,8, перемешивают, оставляют на 10 мин во льду, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием. К надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропилового спирта и выдерживают 15 мин при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, ресуспендируют в 0,5 мл ТЕ8-буфера (10 мМ трис-НCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) и добавляют равный объем насыщенного раствора ацетата натрия. После инкубации в течение 30 мин при минус 20oС осадок удаляют центрифугированием, а к надосадочной жидкости добавляют 0,6 объема изопропанола и оставляют на 1 час при комнатной температуре. Осадок собирают центрифугированием, промывают 70%-ным этанолом и ресуспендируют в 100 мкл ТЕ8-буфера.
Плазмидную ДНК (1 мкг рЕХ3) обрабатывают эндонуклеазой рестрикции Хbal (10 ед.) в буфере А (50 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол, 100 мМ NaCl, 4 мМ спермидина) в течение 2 часов. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореза. Используя фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E. coli, достраивают три из четырех нуклеотидов в липких Xbal-концах. Белки удаляют фенольной экстракцией, ДНК осаждают этанолом и ресуспендируют в 5 мкл ТЕ8.
Для получения фрагмента ДНК с геном лизоцима проводят рестрикцию 10 мкг ДНК плазмиды pLysS (A.C.Y. Chang and S.N. Cohen. J. Bacteriol, vol.134, рр. 1141, 1978) рестриктазой BamH1. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы E.coli достраивают три из четырех нуклеотидов в липких BamH1-концах. Фрагмент -BamH1-BamH1- с частично достроенными липкими концами размером 0,6 т.п.о. выделяют с помощью электрофореза сорбцией на бумагу ДЕ81. Бумагу промывают, инкубируют 30 мин при 80oС в буфере 2 М ацетата натрия, 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ ЭДТА. ДНК, перешедшую в раствор, удаляют с бумаги центрифугированием, к раствору добавляют 2 объема этанола. После инкубации при -20o С в течение часа осадок собирают центрифугированием и растворяют в 5 мкл буфера ТЕ8.
0,5 мкг фрагмента ДНК вектора рЕХ3 смешивают с 0,2 мкг ДНК, содержащей ген лизоцима бактериофага Т4. Соединение фрагментов проводят с помощью 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 в буфере: 30 мМ трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ хлористого магния, 2 мг/мл желатины, 1 мМ спермидина, 0,1%-меркаптоэтанола, 0,2 мМ АТФ при 20oC в течение 2 часов.
Полученной смесью трансформируют клетки E.coli PLT90, содержащие cIts857 репрессор. Для этого ночную культуру клеток разводят средой LB с 10 мМ MgSO4 в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до плотности А550-0,3 ОЕ. После 15 мин охлаждения при 0oС клетки собирают центрифугированием, суспендируют в 1/3 первоначального объема буфером 30 мМ ацетата калия, рН 5,8, 100 мМ RbCL, 50 мМ MnCl2, 10 мМ СaCl2, 15% глицерина, и оставляют на 30-60 мин на льду. Клетки собирают центрифугированием, ресуспендируют в 1/12,5 первоначального объема в буфере 10 мМ MOPS, рН 6,8, содержащем 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl2, 15% глицерина и инкубируют 15 мин на льду. К суспензии клеток добавляют лигированные фрагменты ДНК, инкубируют 40 мин при 0oС, затем 2 мин при 34oС, 2-3 мин при 0oС, разбавляют в 5 раз средой 2YT, растят 30 мин при 30oС и высевают на агаризованную среду 2YT с ампициллином (50 мг/мл).
Клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды с геном лизоцима в нужной ориентации, отбирают с помощью анализа на способность к лизису после индукции синтеза белка. Экспрессию рекомбинантных белков индуцируют повышением температуры до 42oС. В клонах, продуцирующих лизоцим, после индукции белкового синтеза и последующего добавления хлороформа происходит лизис клеток. Из отобранных клонов стандартными способами выделяют плазмиду рEL5с. Векторная ДНК стабильна при хранении в 10 мМ трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА при -20oC.
Пример 2. Использование вектора рEL5c для получения рекомбинантных белков в виде водонерастворимых агломератов.
Клетки PLT90, содержащие плазмиду pEL5c, инокулируют в 1 мл среды LB со 100 мкг/мл ампициллина и растят ночь при 30oС. Ночную культуру разводят в 2 мл этой же среды в соотношении 1:100 и растят с аэрацией до 0,2 ОЕ при 550 нм, затем повышают температуру до 42oС для индукции синтеза слитного белка и растят еще 2 часа. Затем добавляют хлороформ до 1% и инкубируют при 37oС еще час. Далее лизат центрифугируют, ресуспендируют осадок в 75 мкл буфера ТЕ8 и добавляют равный объем буфера для электрофореза (160 мМ трис-НCl, рН 6,8, 20% глицерина, 4% додецилсульфата натрия, 4 мМ ЭДТФ, 6%-меркаптоэтанола, 0,05% бромфенолового синего). Клеточные белки анализируются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле по Лэммли (U. K. Lammli. Nature, vol. 227, рр. 680-685, 1970). После окончания электрофореза белки в гене фиксируют и окрашивают кумасси ярко-голубым R-250.
Анализ полученных результатов показывает, что в результате действия лизоцима происходит разрушение оболочки бактерии и высвобождение водорастворимых клеточных белков в среду, что проявляется в ослаблении минорных белковых полос. В контроле, в случае использования плазмиды рЕХ3, такого эффекта нет.
Таким образом, изобретение позволяет получать водонерастворимые агломераты рекомбинантных белков без использования дополнительных методов разрушения клеточных стенок.
Claims (1)
- Вектор рЕL5с, предназначенный для экспрессии чужеродной ДНК, размером 6,4 т.п.о. содержащий Хbа1-Хbа1 фрагмент плазмидной ДНК бактериального вектора рЕХ3 размером 5,8 т.п.о. со слитным сro-lacZ геном, кодирующим белок под контролем промотора PR бактериофага лямбда, полилинкер в 3'-конце lacZ-гена; ВаmН1-ВаmН1-фрагмент ДНК плазмиды pLysS с геном лизоцима бактериофага Т4 размером 0,6 т. п. о. уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК на 3'-конце гена LacZ: Sma1, BamH1, Sal1, Pst1; оператор OR и промотор PR бактериофага лямбда; терминаторы транскрипции фага fd; генетический маркер устойчивость к ампициллину; спектр хозяев - бактерии Escherichia coli, с геном clts 857 бактериофага лямбда.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5027679 RU2071503C1 (ru) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU5027679 RU2071503C1 (ru) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2071503C1 true RU2071503C1 (ru) | 1997-01-10 |
Family
ID=21597069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU5027679 RU2071503C1 (ru) | 1992-02-18 | 1992-02-18 | ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2071503C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6180367B1 (en) | 1998-10-28 | 2001-01-30 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
-
1992
- 1992-02-18 RU SU5027679 patent/RU2071503C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| The EMBO Journal, v.3, рр. 1429-1434, 1984. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6180367B1 (en) | 1998-10-28 | 2001-01-30 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US6258560B1 (en) | 1998-10-28 | 2001-07-10 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US7858339B1 (en) | 1998-10-28 | 2010-12-28 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US8183029B2 (en) | 1998-10-28 | 2012-05-22 | Genentech, Inc. | Replicable expression vector for bacterial expression of a mammalian polypeptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| García et al. | Cloning, purification, and biochemical characterization of the pneumococcal bacteriophage Cp-1 lysin | |
| US4758512A (en) | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields | |
| KR860001557B1 (ko) | 폴리펩티드의 제조방법 | |
| Inada et al. | Conditionally lethal amber mutations in the leader peptidase gene of Escherichia coli | |
| JPH07108221B2 (ja) | レンニンの製造方法 | |
| HU205386B (en) | Process for expressing cloned lysostaphin gene and for producing dna fragment containing the gene, expression vector and transformed host cell | |
| US5232840A (en) | Enhanced protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site | |
| JPH0669376B2 (ja) | 超高度原核発現系 | |
| US4954618A (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G | |
| EP0195303B1 (en) | Plasmid vectors for expression in escherichia coli and/or bacillus subtilis | |
| JPH07508169A (ja) | Ｄ−ｎ−カルバモイル−アミノ酸アミドヒドロラーゼおよびヒダントイナーゼ | |
| RU2071503C1 (ru) | ВЕКТОР pЕL5С, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК | |
| EP0293391A1 (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g | |
| RU2071501C1 (ru) | Вектор реl25а, предназначенный для экспрессии чужеродного днк | |
| RU2043415C1 (ru) | ВЕКТОР PEL 5b, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНОЙ ДНК | |
| KR100635426B1 (ko) | 재조합 성숙 리소스타핀의 발현 | |
| Van Kaer et al. | Interaction of the Bacillus subtilis phage phi 105 repressor DNA: a genetic analysis. | |
| GB2197651A (en) | Bacteriophage RNA polymerase gene | |
| US4518698A (en) | Plasmid and production thereof | |
| AU631360B2 (en) | A p1 bacteriophage cloning system for dna fragments as large as 95 kb | |
| US4845031A (en) | Recombinant DNA process for producing useful polypeptides | |
| Champness et al. | Bacteriophage T4 gol site: sequence analysis and effects of the site on plasmid transformation | |
| RU2103363C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк рвтn ii, определяющая синтез кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина cry iiia-типа, способ ее конструирования и штамм бактерий pseudomonas putida, содержащий рекомбинантную плазмиду днк рвтn ii-продуцент кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина cry iiia-типа, активного против насекомых отряда coleoptera | |
| US6162633A (en) | Process and kit for fragment cloning | |
| JPH0731480A (ja) | Ｌ−グルタミルｔＲＮＡレダクターゼをコードするＤＮＡ断片 |