CN112760342B - 一种用于glp-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株 - Google Patents

一种用于glp-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于GLP‑1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株。该载体包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE‑Mini promoter元件和编码GFP的基因。本发明通过将该重组载体与表达RFP的重组载体分别通过病毒液形式感染表达GLP‑1R的细胞株，筛选分离，得到用于GLP‑1及其类似物活性测定的细胞株。本发明采用GFP作为报告基因，检测GLP‑1及其类似物活性时，无需裂解细胞等繁琐步骤，可直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒；所得到的细胞株拥有内参RFP矫正数据，检测结果更准确，稳定可信；所构建的细胞株检测药物范围广，通用性好。

Description

一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株
技术领域
本发明属于药物生物活性测定技术领域，尤其涉及一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株。
背景技术
胰高血糖素样肽-1(Glucogan-like Peptide 1,GLP-1)由小肠L细胞分泌，其作用于胰岛β细胞可以促进胰岛素基因的转录翻译和胰岛素释放，达到降血糖的效果。此外，GLP-1及其类似物还可以通过减少胰高血糖素的分泌、减慢肠蠕动、抑制胃排空、促进胰岛β细胞的增殖与分化、抑制β细胞凋亡等方式来综合调控血糖，更重要的是其降血糖效应具有明显的血糖依赖性，相比传统的降血糖药物其安全性更高，疗效更可靠。因此，GLP-1及其类似物已成为糖尿病治疗领域新的热门药物。
我国是糖尿病大国，GLP-1及其类似物是糖尿病药物研究的重点领域，随着大量不同来源、结构性质各异的GLP-1及其类似物产生，能够快速检测、准确评价新的GLP-1及其类似物活性的方法是药物开发的重要依据和手段。
GLP-1及其类似物作用于胰岛β细胞上胰高血糖素样肽-1受体(Glucogan-likePeptide1 Receptor，GLP-1R)后的一条信号转导通路为：受体和配体结合后活化腺苷酸环化酶(AdenylateCyclase，AC)，进而促进胞内第二信使--环磷酸腺苷(Cyclic Adenosinemonophosphate，cAMP)的生成，cAMP依赖的转录因子表达增加，cAMP进而激活蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)，PKA磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP responseelement binding protein，CREB)，CREB与CRE结合进而促进下游基因转录表达。目前用于检测GLP-1及其类似物活性的方法主要基于以下两方面：(1)检测胞内cAMP含量的变化间接反映GLP-1活性，该方法易受内源性因素干扰，准确性和稳定性都较差；(2)利用荧光素酶报告基因表达强度来反映GLP-1活性，该方法准确性和稳定性都较高，但需要相应的荧光素酶检测试剂盒，操作较为繁琐，成本较高。因此，开发一种准确性高、稳定性高、操作简便、成本低的GLP-1及其类似物活性检测方法具有重要现实意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，发明人通过设计并合成CRE反应元件序列，构建CRE-Mini promoter-GFP复合元件；其中，GFP(green fluorescentprotein)为绿色荧光蛋白，所述慢病毒载体为自主灭活型(Self inactivating)慢病毒载体，即慢病毒整合到宿主基因组后，5’LTR(long terminal repeat)没有转录功能，且能够阻挡上游启动子序列的转录，因此，CRE-Mini promoter转录活性不受上游启动子活性影响。含有上述复合元件的慢病毒感染并将其基因组整合入宿主细胞基因组，GLP-1及其类似物结合细胞上GLP-1受体GLP-1R后，激活下游信号转导通路，磷酸化的CREB结合cAMP反应元件(cAMP responseelement,CRE)进而促进GFP转录表达，通过GFP表达强度可以反映出GLP-1及其类似物的活性。该方法通过高性能多功能微孔板检测仪的荧光检测系统直接读取GFP荧光强度，敏感性高，无需裂解细胞、无需额外试剂或试剂盒，操作简便经济，可为GLP-1类药物早期研发及筛选评价提供重要评价手段。
从而，本发明的首要目的是提供一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其含CRE-Mini promoter-GFP复合元件的。
本发明的另一目的在于提供上述用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的应用。
本发明的的再一目的在于提供应用上述用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体制备得到的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株及其应用。
为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，包括复制缺陷型慢病毒载体骨架、CRE-Mini promoter元件和编码GFP的基因，CRE-Mini promoter元件和编码GFP的基因分别与复制缺陷型慢病毒载体骨架连接，CRE-Mini promoter元件设置在编码GFP的基因的上游，通过CRE-Mini promoter控制GFP的表达。
所述的复制缺陷型慢病毒载体骨架优选为自主灭活型慢病毒载体。
所述的CRE-Mini promoter元件的序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，优选通过如下步骤制备得到：以序列如SEQ ID NO.1所示的复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP为骨架，将序列如SEQID NO.2所示的CRE-Mini promoter构建到复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP的GFP基因上游，得到用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体；其序列优选如SEQ ID NO.3所示。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体在制备用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株中的应用。
一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，包含上述复制缺陷型慢病毒重组载体中的CRE-Mini promoter-GFP复合元件。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，优选为其基因组具有如SEQ IDNO.4所示的序列。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，还含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列；更优选为：其基因组含有能表达红色荧光蛋白RFP的基因序列。所述的红色荧光蛋白RFP用于做内参，矫正数据。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，包括如下步骤：
(1)将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；或是将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；
(2)将步骤(1)获得的病毒液感染表达GLP-1R的细胞株，经抗生素筛选后获得稳转细胞库；
(3)对步骤(2)的细胞库进行分离、筛选得到用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。
步骤(1)中所述的含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体具有如下结构：RFP的启动子为SV40启动子，哺乳动物细胞抗性筛选标记与所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的哺乳动物细胞抗性筛选标记不同，优选通过如下步骤制备得到：
(A)将复制缺陷型慢病毒载体pLenti-GFP上的6xTetO-mini CMV更换为SV40启动子，得到含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；
(B)将含SV40-GFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上GFP片段更换为RFP，得到含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体；
(C)将含SV40-RFP复合元件的复制缺陷型慢病毒载体上嘌呤霉素抗性(PuroR)基因片段更换为新霉素抗性(NeoR)基因，获得含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体。
步骤(1)中所述的包装的方法按本领域采用的慢病毒载体的包装方法即可，优选的步骤如下为：
(a)将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；当使用用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体进行包装时，是将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒混合后，得到DNA混合液A和DNA混合液B，再分别转染包装细胞；
(b)转染18-20小时后，加入丁酸钠(Sodium butyrate)以增强病毒包装效率，处理10-12小时后弃上清换新鲜无血清培养基；
(c)转染43-50小时后，培养上清过滤，获得含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液，或是得到含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含RFP元件的病毒液。
步骤(a)中所述的包装质粒包括但不限于pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G；优选由pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G按质量比1:1:1配比得到。
步骤(a)中所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与所述的包装质粒优选按质量比2：3进行配比。
步骤(a)中所述的含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体与所述的包装质粒优选按质量比2：3进行配比。
步骤(a)中所述的转染方法包括但不限于电击转染法、脂质体转染法、PEI转染法和磷酸钙转染法；优选为脂质体转染法。
步骤(a)中所述的包装细胞优选为HEK-293T。
所述的包装细胞的汇合度优选为转染时接近90％。
步骤(b)中所述的丁酸钠的终浓度优选为10mM。
步骤(b)中所述的培养基优选为DMEM培养基。
步骤(c)中所述的过滤方式优选为通过0.45μm滤膜过滤。
步骤(2)中所述的慢病毒感染的步骤优选如下：
①取步骤(1)获得的含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液感染表达GLP-1R的细胞株；或是分别取步骤(1)获得的含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含RFP元件的病毒液同时感染表达GLP-1R的细胞株；
②病毒感染后3～5小时，补加新鲜的完全培养基；
③病毒感染后40～60小时，更换加入含抗生素的完全培养基进行筛选，获得稳转细胞库。
步骤①中所述的含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和所述的含RFP元件的病毒液优选按体积比1：1配比。
步骤①中所述的表达GLP-1R的细胞株的细胞汇合度优选感染时为30-50％。
所述的表达GLP-1R的细胞株优选为RIN-m5F。
步骤②中所述的补加新鲜的完全培养基的时间优选为病毒感染后4h。
步骤③中所述的进行筛选的时间优选为病毒感染后48小时。
步骤③中所述的抗生素是对应所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和所述的含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体上的哺乳动物细胞抗性筛选标记。
所述的抗生素优选为嘌呤霉素和新霉素G418。
所述的嘌呤霉素在筛选体系中的终浓度优选为5μg/ml。
所述的G418在筛选体系中的终浓度优选为500ng/ml。
步骤③中所述的完全培养基为含10％血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基。
所述的血清优选为小牛血清或胎牛血清。
步骤(3)中所述的分离的方法优选为有限稀释法。
所述的有限稀释法中孔板的细胞密度优选为0.3-0.5个细胞/孔。
步骤(3)中所述的筛选的步骤优选为：加入腺甘酸环化酶激活剂Forskolin刺激分离得到的单克隆细胞，测定GFP荧光强度；筛选得到GFP荧光响应强度高的单克隆细胞株，即可作为用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。
所述的Forskolin的浓度优选为10μM/L。
所述的刺激时间优选为6h。
一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，通过上述制备方法得到。
所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株在GLP-1及其类似物活性测定中的应用，优选包括如下步骤：
(I)将所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株接种入96孔板中，静置培养；
(II)制备GLP-1及其类似物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；
(III)弃去96孔板培养上清，加入配制好的梯度浓度的标准品溶液，继续静置培养；
(IV)弃上清，加入PBS洗涤，再加入PBS，使用多功能微孔板检测仪测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度；
(V)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以绿色荧光蛋白强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。
步骤(I)中所述的接种量按100μl细胞悬液/孔接种，其中细胞悬液的细胞密度为0.7M/ml。
步骤(I)中所述的培养条件优选为于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下培养18-24小时。
步骤(II)中所述的GLP-1及其类似物包括但不限于杜拉鲁肽(Dulaglutide)、利拉鲁肽(Liraglutide)和索玛鲁肽(Semaglutide)。
步骤(III)中所述的培养的时间优选为6h。
步骤(III)中所述的标准品溶液优选为100μl/孔。
步骤(IV)中所述的洗涤的次数优选为2次。
步骤(IV)中所述的测定顺序优选为先测红色荧光蛋白，后测绿色荧光蛋白。
步骤(IV)中所述的红色荧光蛋白强度用于复孔之间绿色荧光蛋白强度数据矫正。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用自主灭活型慢病毒载体，其包装、逆转录、整合的过程如图1所示。其具有安全、高效等优点。
(2)本发明采用GFP而非荧光素酶作为报告基因，检测GLP-1及其类似物活性时，操作简便，无需裂解细胞等繁琐步骤，直接检测活细胞，从而检测成本低，不需要专门配套检测试剂盒。
(3)本发明所构建的细胞株拥有内参RFP矫正数据，检测结果更准确，稳定可信。RFP和GFP荧光蛋白稳定性较好，不存在或较少存在荧光淬灭的问题，检测更加灵活，利于高通量样品检测。
(4)本发明的研究人员在研究中发现用传统的化学转染方法构建细胞株，抗生素加压筛选后获得的稳定细胞库药物刺激后响应强度不高，不宜用作药物活性测定细胞株，且进一步筛选获得高响应强度的单克隆细胞株也比较困难；而采用慢病毒感染方法构建细胞株，细胞感染率几乎100％，且能将多个拷贝的慢病毒整合序列整合入细胞基因组。抗生素筛选后获得的稳定细胞库对药物的响应强度高，有限稀释法分离获得的单克隆细胞株对药物响应强度高，药物浓度拟合曲线好，检测稳定性好，对不同GLP-1及其类似物通用性好。
(5)本发明所选用的宿主细胞为RIN-m5F(大鼠胰岛β瘤细胞)，该细胞自身表达GLP-1R，无需外源转染表达GLP-1R。
(6)GLP-1及其类似物活性均可用本发明方法制备的细胞株测定，检测药物范围广，通用性好。
附图说明
图1为自主灭活型慢病毒载体包装、逆转录、整合的过程示意图。
图2为载体pLentiCRE-GFP的构建流程图。
图3为载体pLenti-GFP的物理图谱图。
图4为载体pLentiSV40Neo-RFP的构建流程图。
图5为不同单克隆细胞株对腺苷酸环化酶激活剂Forskolin的响应强度图。
图6为细胞株对杜拉鲁肽(Dulaglutide)标准品的量效曲线关系图。
图7为细胞株对利拉鲁肽(Liraglutide)标准品的量效曲线关系图。
图8为细胞株对索马鲁肽(Semaglutide)标准品的量效曲线关系图。
图9为载体pTBpCRE-GFP的构建流程图。
图10为化学转染活性细胞株对杜拉鲁肽标准品的量效曲线关系。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中，未详尽说明的操作为常规操作。
实施例1
一、pLentiCRE-GFP重组载体构建(构建流程如图2所示)
(1)将质粒pLenti-GFP(其物理图谱见图3，序列如SEQ ID NO.1所示)进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(2)合成ClaI-4xCRE-Mini promote-PstI核酸片段(序列如SEQ ID NO.2所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，ClaI和PstI双酶切后胶回收纯化获得带开放性粘性末端的4xCRE-Mini promoter片段。
(3)将pLenti-GFP线性化载体与4xCRE-Mini promoter片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定ClaI-PstI酶切后大小分别为7792bp、209bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiCRE-GFP重组质粒(序列如SEQ ID NO.3所示)及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
二、pLentiSVNeo-RFP重组载体构建(构建流程如图4所示)
(1)以pcDAN3.0质粒(Invitrogen)为模板，PCR扩增SV40片段，ClaI和PstI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：
SVClaI:5’–ACCATCGATCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGG-3’；
SVPstI:5’-CAACCTGCAGTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCA-3’。
PCR反应体系为50μl：模板pcDNA3.0质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物SVClaI 2μl、浓度为5μM的引物SVPstI 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃30s，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。
(2)将质粒pLenti-GFP进行ClaI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(3)将pLenti-GFP线性化载体与纯化回收的SV40基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定ClaI-PstI酶切后大小分别为7786bp、348bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLenti-SV40-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
(4)以pTRIPZ质粒(Invitrogen)为模板，PCR扩增RFP基因片段，PstI和XhoI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：
RFPstI:5’-CAACCTGCAGGTCGCCACCATGAGCGA-3’；
RFPXhoI:5’-TGAGCTCGAGATCGATTATCTGTGCCCCAGT-3’。
PCR反应体系为50μl：模板pTRIPZ质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物RFPstI 2μl、浓度为5μM的引物RFPXhoI 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃1min，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。
(5)将质粒pLenti-SV40-GFP进行XhoI和PstI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(6)将pLenti-SV40-GFP线性化载体与纯化回收的RFP基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定XhoI-PstI酶切后大小分别为7352bp、712bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLenti-SV40-RFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
(7)以pcDAN3.0质粒(Invitrogen)为模板，PCR扩增NeoR基因片段，BamHI和SalI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：
NeoBamHI:5’-AGCGGATCCTGAGGATCGTTTCGCATGATTGA-3’；
NeoSalI:5’-ACGCGTCGACCGCTCAGAAGAACTCGTCA-3’。
PCR反应体系为50μl：模板pcDNA3.0质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物NeoBamHI 2μl、浓度为5μM的引物NeoSalI 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水μp to 50μl。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃1min，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。
(8)将pLenti-SV40-RFP进行BamHI和SalI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(9)将pLenti-SV40-RFP线性化载体与纯化回收的NeoR基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定BamHI-SalI酶切后大小分别为7445bp、819bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pLentiSVNeo-RFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
三、慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVNeo-RFP包装和感染
(1)质粒提取：将慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVNeo-RFP及包装载体pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒(参照PureLinkTMHiPure Plasmid Filter Midiprep Kit(Thermo)中方法)。
(2)细胞培养：复苏HEK-293T贴壁细胞，以常规传代培养方法在DMEM完全培养基(含10％胎牛血清，4mM L-谷氨酰胺)中进行传代培养3代以上，用于慢病毒包装实验。
(3)慢病毒重组载体pLentiCRE-GFP和pLentiSVNeo-RFP的包装
(A)共转染前一天(约24小时)，将铺满的HEK-293T细胞以1：2.5-3的比例进行传代；转染当天，HEK-293T细胞汇合度接近90％。
(B)将1μg pRSV-Rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiCRE-GFP(质量比为1：1：1：2)和1μg pRSV-Rev、1μg pMDLg/pRRE、1μg pMD2.G、2μg pLentiSV40Neo-RFP(质量比为1：1：1：2)分别混合均匀，得到DNA混合液A和DNA混合液B。
(C)在步骤(B)中混匀的DNA混合液A中加入300μl Opti-MEM和12μl P3000，混合均匀，得到稀释的DNA溶液(1号管)；同时，将300μl Opti-MEM和12μl
Figure BDA0002260698980000061
3000混合均匀，得到转染试剂混合液(2号管)。对混合液B的处理方式同对混合液A的处理方式。
(D)分别设置阳性对照组和阴性对照组，阳性对照组以相同的方式共转染pLVX-ZsGreen1-N1(Clontech)质粒和包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE、pMD2.G(质量比为2：1：1：1)，阴性对照组只转染包装质粒pRSV-Rev、pMDLg/pRRE和pMD2.G(质量比为1：1：1)。
(E)将步骤(C)中稀释后的质粒混合液(1号管)分别加入到转染试剂混合液(2号管)中，轻轻混匀(终体积600μl)，室温下静置20分钟使形成DNA-转染试剂复合体。然后，将DNA-转染试剂复合体混合液分别加入待转染HEK-293T细胞中，继续培养。
(F)共转染后第二天(18-20小时后)，在转染HEK-293T细胞中分别加入终浓度为10mM的丁酸钠。
(G)继续培养10-12小时，小心移除上清，分别加入3.5ml新鲜无血清DMEM培养基后继续培养。
(H)培养15-18小时后，培养上清分别经过0.45μm滤膜过滤后即可获得可用于感染的病毒液(分别为含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有SV40-RFP元件的病毒液)。
(4)慢病毒感染
(A)病毒感染前一天，对待感染大鼠胰岛β细胞瘤细胞RIN-m5F贴壁细胞进行传代，感染当天，RIN-m5F细胞汇合度为30-50％。所用的培养基为RPMI-1640+10％FBS+2mM/L谷氨酰胺。
(B)吸去RIN-m5F细胞培养上清，加入步骤(3)获得的含有CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含有SV40-RFP元件的病毒液各1.5ml，轻轻混匀后，5％CO2、37℃继续培养。
(C)病毒感染后4小时，补加7ml新鲜的RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)，5％CO2、37℃继续培养。
(D)病毒感染2天(约48小时)后，更换含有5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)和500ng/ml G418的新鲜的RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)进行筛选，在此步骤中，荧光显微镜下可见离心收集的阳性对照组细胞具有较强的绿色荧光，阴性对照组未见荧光，慢病毒感染实验成功。
(E)筛选培养一周左右直至阴性对照组细胞全部死亡，此时可认为完成了细胞筛选。
四、有限稀释法分离单克隆细胞及单克隆细胞荧光响应分析
(1)取样检测RIN-m5F/CRE-GFP活细胞(步骤三制备的慢病毒感染后筛选得到的稳定细胞库)密度，细胞活率并观察生长状态；将生长状态良好的细胞用新鲜的RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)逐步稀释至0.3个细胞/40μl，用排枪将稀释后的细胞接种至96孔板，40μl/孔，即0.3个细胞/孔。
(2)接种的96孔板放置于CO2培养箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下绝对静置培养4小时后，显微镜下逐孔观察，确认并标记只含有一个细胞的孔并将培养基补加至200μl；将细胞重新置于CO2培养箱继续静置培养。
(3)绝对静置培养7-9天，镜下观察单克隆细胞生长状况，找到有明显细胞增殖的孔并作标记，明显细胞增殖的孔进行100μl/孔新鲜RPMI-1640完全培养基(含10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺)半量换液。
(4)继续静置培养并每2-3天进行半量换液，镜下观察单克隆细胞增殖情况。
(5)培养8-12天后将生长较好的单克隆细胞放大至24孔板培养。
(6)放大培养的单克隆细胞加入10μM/L腺甘酸环化酶激活剂Forskolin，刺激6h后测定GFP荧光强度。
(7)根据GFP荧光强度检测结果，挑选GFP荧光响应强度高的细胞扩大培养，进行细胞株冷冻保藏。
(8)实验结果：有限稀释分离得到11株单克隆细胞，加入Forskolin刺激6h后，大部分加药组细胞GFP表达强度明显增强，未加药组细胞基本无绿色荧光，具体结果如图5所示。
五、建立杜拉鲁肽(Dulaglutide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、索马鲁肽(Semaglutide)标准品量效曲线关系
(1)取步骤四筛选得到的7号单克隆细胞株以0.07M/100μl/孔的密度种入96孔板，置于CO2培养箱，在37℃、5％CO2及饱和湿度条件下静置培养过夜。
(2)分别制备杜拉鲁肽、利拉鲁肽、索马鲁肽标准品溶液，设置稀释浓度梯度(杜拉鲁肽起始200nM/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度；利拉鲁肽起始3.2nM/L，3倍倍比稀释10个浓度梯度；索马鲁肽起始200nM/L，4倍倍比稀释10个浓度梯度)。
(3)小心吸去96孔板培养上清，加入配置好的梯度浓度的标准品溶液100ul/孔，置于CO2培养箱中静置培养6h。
(4)再次小心吸去培养上清，加入100μl PBS洗涤2遍，最后加入100μl PBS，多功能微孔板检测仪的荧光检测模块读取荧光强度。
(5)复孔之间偏差较大的绿色荧光强度数据使用红色荧光蛋白强度矫准。
(6)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。
(7)实验结果：筛选得到的单克隆细胞在不同药物刺激下所得到的剂量效应曲线呈典型的反S型曲线，曲线拟合程度高(结果见图6-8)，说明药物浓度与GFP荧光强度存在明显的剂量相关性。
对比例1化学转染活性细胞株制备与应用
为了比较传统化学转染方法和病毒载体感染法制备细胞株的差异，我们同时将4xCRE-Mini promoter-GFP复合元件亚克隆入pcDNA3.0载体中构建得到pTBpCRE-GFP表达载体(构建流程如图9所示)，再以pTBpCRE-GFP转染RIN-m5F细胞制备了以pTBpCRE-GFP为基础的活性细胞株。具体过程如下所示：
(1)将质粒pcDNA3.0(Invitrogen)进行SmaI和BstBI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(2)以pLPCX质粒(Clontech)为模板，PCR扩增Puro基因片段，扩增产物大小为640bp，NruI和ClaI双酶切后纯化回收酶切产物。PCR的引物为：
PuroP1:5’-ACATCGCGACCCCTCACAAGGAGACGA-3’；
PuroP2:5’-TGGATCGATTCAGGCACCGGGCTTGC-3’。
PCR反应体系为50μl：模板pLPCX质粒1ng(1μl)、浓度为5μM的引物PuroP1 2μl、浓度为5μM的引物PuroP2 2μl、PrimerSTAR Max mix 25μl、灭菌水补足至50μl。
PCR反应条件如下：98℃3min；98℃10s、55℃5s、72℃45s，共34个循环；最后，72℃5min；4℃∞。
(3)将pcDNA3.0线性化载体与Puro基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定BamHI-SalI酶切后大小分别为7445bp、819bp片段的为阳性克隆)，可获得pcDNA3.0-Puro(简写为pPuro)重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
(4)再将质粒pPuro载体进行XhoI和NruI双酶切，通过胶回收纯化方法获得带开放性粘性末端线性化载体。
(5)合成NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote-GFP-XhoI核酸片段(序列如SEQ ID NO.5所示，南京金斯瑞生物科技有限公司合成)，并使用NruI和XhoI酶切胶回收获得带开放性粘性末端的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote-GFP-XhoI基因片段。
(6)将pPuro线性化载体与纯化回收的NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Minipromote-GFP-XhoI基因片段通过T4 DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，经阳性单克隆筛选实验(通过测序确定NruI-XhoI酶切后大小分别为4517bp、1429bp片段的为阳性克隆)，最终可获得pTBpCRE-GFP重组质粒及能够稳定复制该重组质粒的工程菌株。
(7)提取高浓度高纯度无内毒素的pTBpCRE-GFP质粒，转染RIN-m5F细胞，具体操作方法同实施例1转染步骤(参考InvitrogenTMLipofectamineTM3000Transfection ReagentL3000008)。
(8)转染48h后进行终浓度为2μg/ml嘌呤霉素加压筛选，筛选方法同实施例1筛选步骤，得到稳定细胞库。
(9)步骤(8)获得的稳定细胞库，加入10μM/L腺甘酸环化酶激活剂Forskolin，刺激6h后测定GFP荧光强度。
(10)步骤(8)获得的稳定细胞库进行杜拉鲁肽量效曲线分析，操作方法同实施例1。
(11)实验结果：化学转染方法加压获得的稳定细胞库加入Forskolin刺激后GFP表达强度增加不明显，远远小于病毒感染法获得的稳定细胞库，由于化学转染法获得的稳定细胞库Forskolin刺激后GFP表达强度较低，筛选获得高响应强度的单克隆细胞株比较困难，而未进行有限稀释分离单克隆细胞株，此稳定细胞库进行杜拉鲁肽量效曲线分析，结果见图10，曲线拟合程度也很高，说明本发明化学转染法制备的低响应强度稳定细胞库进行杜拉鲁肽活性分析，药物浓度与GFP荧光强度也存在较明显的剂量相关性，但GFP表达强度较低。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 珠海联邦制药股份有限公司
<120>一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体及细胞株
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> pLenti-GFP载体序列
<400> 1
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacataa acgggtctct 240
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 300
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 360
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 420
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagagctct ctcgacgcag gactcggctt 480
gctgaagcgc gcacggcaag aggcgagggg cggcgactgg tgagtacgcc aaaaattttg 540
actagcggag gctagaagga gagagatggg tgcgagagcg tcagtattaa gcgggggaga 600
attagatcgc gatgggaaaa aattcggtta aggccagggg gaaagaaaaa atataaatta 660
aaacatatag tatgggcaag cagggagcta gaacgattcg cagttaatcc tggcctgtta 720
gaaacatcag aaggctgtag acaaatactg ggacagctac aaccatccct tcagacagga 780
tcagaagaac ttagatcatt atataataca gtagcaaccc tctattgtgt gcatcaaagg 840
atagagataa aagacaccaa ggaagcttta gacaagatag aggaagagca aaacaaaagt 900
aagaccaccg cacagcaagc ggccgctgat cttcagacct ggaggaggag atatgaggga 960
caattggaga agtgaattat ataaatataa agtagtaaaa attgaaccat taggagtagc 1020
acccaccaag gcaaagagaa gagtggtgca gagagaaaaa agagcagtgg gaataggagc 1080
tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct 1140
gacggtacag gccagacaat tattgtctgg tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag 1200
ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca actcacagtc tggggcatca agcagctcca 1260
ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct aaaggatcaa cagctcctgg ggatttgggg 1320
ttgctctgga aaactcattt gcaccactgc tgtgccttgg aatgctagtt ggagtaataa 1380
atctctggaa cagatttgga atcacacgac ctggatggag tgggacagag aaattaacaa 1440
ttacacaagc ttaatacact ccttaattga agaatcgcaa aaccagcaag aaaagaatga 1500
acaagaatta ttggaattag ataaatgggc aagtttgtgg aattggttta acataacaaa 1560
ttggctgtgg tatataaaat tattcataat gatagtagga ggcttggtag gtttaagaat 1620
agtttttgct gtactttcta tagtgaatag agttaggcag ggatattcac cattatcgtt 1680
tcagacccac ctcccaaccc cgaggggacc cgacaggccc gaaggaatag aagaagaagg 1740
tggagagaga gacagagaca gatccattcg attagtgaac ggatctcgac ggtatcggtt 1800
aacttttaaa agaaaagggg ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat 1860
aatagcaaca gacatacaaa ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaat tcaaaatttt 1920
atcgatgcag gtccgaggtt ctagacgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgatgt 1980
cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata 2040
gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttatccc 2100
tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc 2160
gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga 2220
tcgcaccggt cagctagcac tgcagcgtct caagcttcag aattctcaga tccgctagcg 2280
ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 2340
ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 2400
ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 2460
gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 2520
cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 2580
gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 2640
gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 2700
aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 2760
gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 2820
agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 2880
ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 2940
cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 3000
gagctgtaca agtccggact ctgatctcga gggggttggg gttgcgcctt ttccaaggca 3060
gccctgggtt tgcgcaggga cgcggctgct ctgggcgtgg ttccgggaaa cgcagcggcg 3120
ccgaccctgg gtctcgcaca ttcttcacgt ccgttcgcag cgtcacccgg atcttcgccg 3180
ctacccttgt gggccccccg gcgacgcttc ctgctccgcc cctaagtcgg gaaggttcct 3240
tgcggttcgc ggcgtgccgg acgtgacaaa cggaagccgc acgtctcact agtaccctcg 3300
cagacggaca gcgccaggga gcaatggcag cgcgccgacc gcgatgggct gtggccaata 3360
gcggctgctc agcagggcgc gccgagagca gcggccggga aggggcggtg cgggaggcgg 3420
ggtgtggggc ggtagtgtgg gccctgttcc tgcccgcgcg gtgttccgca ttctgcaagc 3480
ctccggagcg cacgtcggca gtcggctccc tcgttgaccg aatcaccgac ctctctcccc 3540
agggggatcc accggagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc 3600
gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca 3660
cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct 3720
tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg 3780
tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc 3840
cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg gaaggcctcc 3900
tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg 3960
accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc 4020
gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc 4080
ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca 4140
tgacccgcaa gcccggtgcc tgagtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 4200
gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 4260
tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 4320
cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 4380
gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 4440
tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 4500
ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 4560
ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 4620
cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 4680
tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 4740
tttgggccgc ctccccgcct ggaattaatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt 4800
acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 4860
ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc 4920
agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa 4980
gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga 5040
gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc 5100
ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt 5160
ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 5220
catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 5280
tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 5340
cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 5400
ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 5460
cgggcccaaa ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca 5520
caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag 5580
tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 5640
cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 5700
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 5760
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 5820
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 5880
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 5940
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 6000
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 6060
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 6120
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 6180
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 6240
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 6300
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 6360
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 6420
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 6480
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 6540
tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 6600
ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 6660
gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 6720
tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 6780
cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 6840
ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 6900
gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta 6960
caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac 7020
gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc 7080
ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac 7140
tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact 7200
caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa 7260
tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 7320
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 7380
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 7440
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac 7500
tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 7560
gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc 7620
gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata 7680
ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac 7740
acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag 7800
cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat 7860
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 7920
ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc 7980
gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc 8040
gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg 8100
ccaagctg 8108
<210> 2
<211> 218
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ClaI-4xCRE-Mini promote-PstI序列
<400> 2
atcgataacc ggattaccgg gatccatgct agcgcaccag acagtgacgt cagctgccag 60
atcccatggc cgtcatactg tgacgtcttt cagacacccc attgacgtca atgggagaac 120
agatctggcc tcggcggcca agcttcgaag acactagagg gtatataatg gaagctcgac 180
ttccagcttg gcaatccggt actgttggta cactgcag 218
<210>3
<211> 8001
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体
<400>3
cagcttggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca 60
acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg 120
caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta 180
ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat 240
ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc 300
ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag 360
ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt 420
gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg 480
cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa 540
tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa 600
gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct 660
tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg 720
tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg 780
ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt 840
atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga 900
cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga 960
attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac 1020
gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg 1080
ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac 1140
gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct 1200
agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct 1260
gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg 1320
gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat 1380
ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg 1440
tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat 1500
tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct 1560
catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa 1620
gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa 1680
aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc 1740
gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta 1800
gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct 1860
gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg 1920
atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag 1980
cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc 2040
cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg 2100
agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt 2160
tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg 2220
gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca 2280
catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg 2340
agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc 2400
ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag 2460
ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag 2520
ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg 2580
tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgaatt 2640
tgggcccgca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag 2700
aggccgaggc ggcctcggcc tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag 2760
aatgggcgga actgggcgga gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggatagcta 2820
gagccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 2880
aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 2940
tgcaataaac aagttcctct cactctctga tattcatttc tttgcaagtt ataaatactg 3000
aataataaga tgacatgaac tactactgct agagattttc cacactgact aaaagggtct 3060
gagggatctc tagttaccag agtcacacaa cagacgggca cacactactt gaagcactca 3120
aggcaagctt tattgaggct taagcagtgg gttccctagt tagccagaga gctcccaggc 3180
tcagatctgg tctaaccaga gagacccagt acaagcaaaa agcagatctt gtcttcgttg 3240
ggagtgaatt agcccttcca gtcccccctt ttcttttaaa aagtggctaa gatctacagc 3300
tgccttgtaa gtcattggtc ttaaaggtac cgagctcgaa ttaattccag gcggggaggc 3360
ggcccaaagg gagatccgac tcgtctgagg gcgaaggcga agacgcggaa gaggccgcag 3420
agccggcagc aggccgcggg aaggaaggtc cgctggattg agggccgaag ggacgtagca 3480
gaaggacgtc ccgcgcagaa tccaggtggc aacacaggcg agcagccatg gaaaggacgt 3540
cagcttcccc gacaacacca cggaattgtc agtgcccaac agccgagccc ctgtccagca 3600
gcgggcaagg caggcggcga tgagttccgc cgtggcaata gggaggggga aagcgaaagt 3660
cccggaaagg agctgacagg tggtggcaat gccccaacca gtgggggttg cgtcagcaaa 3720
cacagtgcac accacgccac gttgcctgac aacgggccac aactcctcat aaagagacag 3780
caaccaggat ttatacaagg aggagaaaat gaaagccata cgggaagcaa tagcatgata 3840
caaaggcatt aaagcagcgt atccacatag cgtaaaagga gcaacatagt taagaatacc 3900
agtcaatctt tcacaaattt tgtaatccag aggttgattg tcgactcagg caccgggctt 3960
gcgggtcatg caccaggtgc gcggtccttc gggcacctcg acgtcggcgg tgacggtgaa 4020
gccgagccgc tcgtagaagg ggaggttgcg gggcgcggag gtctccagga aggcgggcac 4080
cccggcgcgc tcggccgcct ccactccggg gagcacgacg gcgctgccca gacccttgcc 4140
ctggtggtcg ggcgagacgc cgacggtggc caggaaccac gcgggctcct tgggccggtg 4200
cggcgccagg aggccttcca tctgttgctg cgcggccagc cgggaaccgc tcaactcggc 4260
catgcgcggg ccgatctcgg cgaacaccgc ccccgcttcg acgctctccg gcgtggtcca 4320
gaccgccacc gcggcgccgt cgtccgcgac ccacaccttg ccgatgtcga gcccgacgcg 4380
cgtgaggaag agttcttgca gctcggtgac ccgctcgatg tggcggtccg gatcgacggt 4440
gtggcgcgtg gcggggtagt cggcgaacgc ggcggcgagg gtgcgtacgg ccctggggac 4500
gtcgtcgcgg gtggcgaggc gcaccgtggg cttgtactcg gtcatggtaa gctccggtgg 4560
atccccctgg ggagagaggt cggtgattcg gtcaacgagg gagccgactg ccgacgtgcg 4620
ctccggaggc ttgcagaatg cggaacaccg cgcgggcagg aacagggccc acactaccgc 4680
cccacacccc gcctcccgca ccgccccttc ccggccgctg ctctcggcgc gccctgctga 4740
gcagccgcta ttggccacag cccatcgcgg tcggcgcgct gccattgctc cctggcgctg 4800
tccgtctgcg agggtactag tgagacgtgc ggcttccgtt tgtcacgtcc ggcacgccgc 4860
gaaccgcaag gaaccttccc gacttagggg cggagcagga agcgtcgccg gggggcccac 4920
aagggtagcg gcgaagatcc gggtgacgct gcgaacggac gtgaagaatg tgcgagaccc 4980
agggtcggcg ccgctgcgtt tcccggaacc acgcccagag cagccgcgtc cctgcgcaaa 5040
cccagggctg ccttggaaaa ggcgcaaccc caaccccctc gagatcagag tccggacttg 5100
tacagctcgt ccatgccgag agtgatcccg gcggcggtca cgaactccag caggaccatg 5160
tgatcgcgct tctcgttggg gtctttgctc agggcggact gggtgctcag gtagtggttg 5220
tcgggcagca gcacggggcc gtcgccgatg ggggtgttct gctggtagtg gtcggcgagc 5280
tgcacgctgc cgtcctcgat gttgtggcgg atcttgaagt tcaccttgat gccgttcttc 5340
tgcttgtcgg ccatgatata gacgttgtgg ctgttgtagt tgtactccag cttgtgcccc 5400
aggatgttgc cgtcctcctt gaagtcgatg cccttcagct cgatgcggtt caccagggtg 5460
tcgccctcga acttcacctc ggcgcgggtc ttgtagttgc cgtcgtcctt gaagaagatg 5520
gtgcgctcct ggacgtagcc ttcgggcatg gcggacttga agaagtcgtg ctgcttcatg 5580
tggtcggggt agcggctgaa gcactgcacg ccgtaggtca gggtggtcac gagggtgggc 5640
cagggcacgg gcagcttgcc ggtggtgcag atgaacttca gggtcagctt gccgtaggtg 5700
gcatcgccct cgccctcgcc ggacacgctg aacttgtggc cgtttacgtc gccgtccagc 5760
tcgaccagga tgggcaccac cccggtgaac agctcctcgc ccttgctcac catggtggcg 5820
accggtagcg ctagcggatc tgagaattct gaagcttgag acgctgcagt gtaccaacag 5880
taccggattg ccaagctgga agtcgagctt ccattatata ccctctagtg tcttcgaagc 5940
ttggccgccg aggccagatc tgttctccca ttgacgtcaa tggggtgtct gaaagacgtc 6000
acagtatgac ggccatggga tctggcagct gacgtcactg tctggtgcgc tagcatggat 6060
cccggtaatc cggttatcga taaaattttg aattttgtaa tttgtttttg taattcttta 6120
gtttgtatgt ctgttgctat tatgtctact attctttccc ctgcactgta ccccccaatc 6180
cccccttttc ttttaaaagt taaccgatac cgtcgagatc cgttcactaa tcgaatggat 6240
ctgtctctgt ctctctctcc accttcttct tctattcctt cgggcctgtc gggtcccctc 6300
ggggttggga ggtgggtctg aaacgataat ggtgaatatc cctgcctaac tctattcact 6360
atagaaagta cagcaaaaac tattcttaaa cctaccaagc ctcctactat cattatgaat 6420
aattttatat accacagcca atttgttatg ttaaaccaat tccacaaact tgcccattta 6480
tctaattcca ataattcttg ttcattcttt tcttgctggt tttgcgattc ttcaattaag 6540
gagtgtatta agcttgtgta attgttaatt tctctgtccc actccatcca ggtcgtgtga 6600
ttccaaatct gttccagaga tttattactc caactagcat tccaaggcac agcagtggtg 6660
caaatgagtt ttccagagca accccaaatc cccaggagct gttgatcctt taggtatctt 6720
tccacagcca ggattcttgc ctggagctgc ttgatgcccc agactgtgag ttgcaacaga 6780
tgctgttgcg cctcaatagc cctcagcaaa ttgttctgct gctgcactat accagacaat 6840
aattgtctgg cctgtaccgt cagcgtcatt gacgctgcgc ccatagtgct tcctgctgct 6900
cccaagaacc caaggaacaa agctcctatt cccactgctc ttttttctct ctgcaccact 6960
cttctctttg ccttggtggg tgctactcct aatggttcaa tttttactac tttatattta 7020
tataattcac ttctccaatt gtccctcata tctcctcctc caggtctgaa gatcagcggc 7080
cgcttgctgt gcggtggtct tacttttgtt ttgctcttcc tctatcttgt ctaaagcttc 7140
cttggtgtct tttatctcta tcctttgatg cacacaatag agggttgcta ctgtattata 7200
taatgatcta agttcttctg atcctgtctg aagggatggt tgtagctgtc ccagtatttg 7260
tctacagcct tctgatgttt ctaacaggcc aggattaact gcgaatcgtt ctagctccct 7320
gcttgcccat actatatgtt ttaatttata ttttttcttt ccccctggcc ttaaccgaat 7380
tttttcccat cgcgatctaa ttctcccccg cttaatactg acgctctcgc acccatctct 7440
ctccttctag cctccgctag tcaaaatttt tggcgtactc accagtcgcc gcccctcgcc 7500
tcttgccgtg cgcgcttcag caagccgagt cctgcgtcga gagagctctg gtttcccttt 7560
cgctttcaag tccctgttcg ggcgccactg ctagagattt tccacactga ctaaaagggt 7620
ctgagggatc tctagttacc agagtcacac aacagacggg cacacactac ttgaagcact 7680
caaggcaagc tttattgagg cttaagcagt gggttcccta gttagccaga gagctcccag 7740
gctcagatct ggtctaacca gagagacccg tttatgtatc gagctaggca cttaaataca 7800
atatctctgc aatgcggcaa ttcagtggtt cgtccaatcc atgtcagacc cgtctgttgc 7860
cttcctaata aggcacgatc gtaccacctt acttccacca atcggcatgc acggtgcttt 7920
ttctctcctt gtaaggcatg ttgctaactc atcgttacca tgttgcaaga ctacaagagt 7980
attgcataag actacacgcg t 8001
<210>4
<211> 4796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 基因组含有的CRE-Mini promoter-GFP复合元件
<400>4
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 240
cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 300
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 360
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 420
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 480
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 540
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 600
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 660
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 720
taagaccacc gcacagcaag cggccgctga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 780
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 840
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 900
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 960
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1020
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1080
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1140
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1200
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1260
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1320
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1380
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1440
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1500
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1560
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1620
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1680
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1740
tatcgataac cggattaccg ggatccatgc tagcgcacca gacagtgacg tcagctgcca 1800
gatcccatgg ccgtcatact gtgacgtctt tcagacaccc cattgacgtc aatgggagaa 1860
cagatctggc ctcggcggcc aagcttcgaa gacactagag ggtatataat ggaagctcga 1920
cttccagctt ggcaatccgg tactgttggt acactgcagc gtctcaagct tcagaattct 1980
cagatccgct agcgctaccg gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 2040
gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 2100
ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 2160
ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 2220
gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 2280
aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 2340
ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 2400
tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 2460
tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 2520
acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 2580
acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 2640
accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 2700
ctctcggcat ggacgagctg tacaagtccg gactctgatc tcgagggggt tggggttgcg 2760
ccttttccaa ggcagccctg ggtttgcgca gggacgcggc tgctctgggc gtggttccgg 2820
gaaacgcagc ggcgccgacc ctgggtctcg cacattcttc acgtccgttc gcagcgtcac 2880
ccggatcttc gccgctaccc ttgtgggccc cccggcgacg cttcctgctc cgcccctaag 2940
tcgggaaggt tccttgcggt tcgcggcgtg ccggacgtga caaacggaag ccgcacgtct 3000
cactagtacc ctcgcagacg gacagcgcca gggagcaatg gcagcgcgcc gaccgcgatg 3060
ggctgtggcc aatagcggct gctcagcagg gcgcgccgag agcagcggcc gggaaggggc 3120
ggtgcgggag gcggggtgtg gggcggtagt gtgggccctg ttcctgcccg cgcggtgttc 3180
cgcattctgc aagcctccgg agcgcacgtc ggcagtcggc tccctcgttg accgaatcac 3240
cgacctctct ccccaggggg atccaccgga gcttaccatg accgagtaca agcccacggt 3300
gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc 3360
cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga 3420
gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga 3480
cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt 3540
cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca 3600
gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt 3660
cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt 3720
ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct 3780
ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc 3840
gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgagtc gacaatcaac ctctggatta 3900
caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 3960
atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc 4020
ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 4080
acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 4140
cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 4200
catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 4260
cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 4320
gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 4380
ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 4440
gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctggaatt aattcgagct cggtaccttt 4500
aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccac tttttaaaag aaaagggggg 4560
actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatctg ctttttgctt gtactgggtc 4620
tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 4680
taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 4740
ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagca 4796
<210>5
<211> 1251
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NruI-Transcription Blocker-4xCRE-Mini promote-GFP-XhoI序列
<400>5
tcgcgaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 60
cacatgtaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc 120
catagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata 180
ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tggcctaact ggccggtacc 240
tgagctcatc gataaccgga ttaccgggat ccatgctagc gcaccagaca gtgacgtcag 300
ctgccagatc ccatggccgt catactgtga cgtctttcag acaccccatt gacgtcaatg 360
ggagaacaga tctggcctcg gcggccaagc ttcgaagaca ctagagggta tataatggaa 420
gctcgacttc cagcttggca atccggtact gttggtacac tgcagcgtct caagcttcag 480
aattctcaga tccgctagcg ctaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt 540
tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca 600
gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct 660
gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg 720
tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca 780
tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga 840
cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca 900
tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc 960
acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc 1020
gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca 1080
tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga 1140
gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg 1200
ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtccggact ctgatctcga g 1251
<210>6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SVClaI
<400>6
accatcgatc tgtggaatgt gtgtcagtta gg 32
<210>7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SVPstI
<400> 7
caacctgcag ttgcaaaagc ctaggcctcc a 31
<210>8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RFPstI
<400>8
caacctgcag gtcgccacca tgagcga 27
<210>9
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RFPXhoI
<400>9
tgagctcgag atcgattatc tgtgccccag t 31
<210>10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NeoBamHI
<400>10
agcggatcct gaggatcgtt tcgcatgatt ga 32
<210>11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NeoSalI
<400>11
acgcgtcgac cgctcagaag aactcgtca 29
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PuroP1
<400> 12
acatcgcgac ccctcacaag gagacga 27
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PuroP2
<400> 13
tggatcgatt caggcaccgg gcttgc 26

Claims (7)

1.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体，其特征在于：使用GFP作为报告基因；所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体在制备用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株中的应用。
3.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；或是将权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒共转染包装细胞进行包装，获得可用于感染的病毒液；
（2）将步骤（1）获得的病毒液感染表达GLP-1受体的细胞株，经抗生素筛选后获得稳转细胞库；
（3）对步骤（2）的细胞库进行分离、筛选得到用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。
4.根据权利要求3所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株的制备方法，其特征在于：
步骤（1）中所述的包装的步骤如下：
（a）将权利要求1所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体与包装质粒混合后，得到DNA混合液转染包装细胞；当使用用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体进行包装时，是将用于GLP-1及其类似物活性测定的慢病毒载体和含表达红色荧光蛋白RFP的复制缺陷型慢病毒重组载体分别与包装质粒混合后，得到DNA混合液A和DNA混合液B，再分别转染包装细胞；
（b）转染18-20小时后，加入丁酸钠以增强病毒包装效率，处理10-12小时后弃上清换新鲜无血清培养基；
（c）转染43-50小时后，培养上清过滤，获得含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液，或是得到含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含RFP元件的病毒液；
步骤（2）中所述的慢病毒感染的步骤如下：
①取步骤（1）获得的含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液感染表达GLP-1受体的细胞株；或是分别取步骤（1）获得的含CRE-Mini promoter-GFP的病毒液和含RFP元件的病毒液同时感染表达GLP-1受体的细胞株；
②病毒感染后3～5小时，补加新鲜的完全培养基；
③病毒感染后40～60小时，更换加入含抗生素的完全培养基进行筛选，获得稳转细胞库；
步骤（3）中所述的分离的方法为有限稀释法；
步骤（3）中所述的筛选的步骤为：加入腺甘酸环化酶激活剂Forskolin刺激分离得到的单克隆细胞，测定GFP荧光强度；筛选得到GFP荧光响应强度高的单克隆细胞株，即可作为用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。
5.一种用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株，其特征在于：根据权利要求3或4所述的制备方法获得的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株。
6.权利要求5所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株在GLP-1及其类似物活性测定中的应用，包括如下步骤：
（I）将所述的用于GLP-1及其类似物活性测定的细胞株接种入96孔板中，静置培养；
（II）制备GLP-1及其类似物标准品溶液，设置稀释浓度梯度；
（III）弃去96孔板培养上清，加入配制好的梯度浓度的标准品溶液，继续静置培养；
（IV）弃上清，加入PBS洗涤，再加入PBS，使用多功能微孔板检测仪测定红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的强度；
（V）以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以绿色荧光蛋白强度为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到药物的剂量效应曲线。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
步骤（I）中所述的接种量按100μl细胞悬液/孔接种，其中细胞悬液的细胞密度为0.7M/ml；
步骤（I）中所述的培养条件为于37℃、5%CO2及饱和湿度的条件下培养18-24小时；
步骤（II）中所述的GLP-1及其类似物包括但不限于杜拉鲁肽、利拉鲁肽和索玛鲁肽；
步骤（III）中所述的培养的时间为6h；
步骤（IV）中所述的测定顺序为先测红色荧光蛋白，后测绿色荧光蛋白。
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