CN111770763A - 增强型病毒递送制剂 - Google Patents

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Ascend Biopharmaceuticals Pty Ltd
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Abstract

本发明一般涉及重组腺病毒药物制剂。更具体地，本发明涉及基于SiO2凝胶的控释重组腺病毒药物制剂。

Description

增强型病毒递送制剂
技术领域
本发明一般涉及重组腺病毒药物制剂。更具体地，本发明涉及基于SiO2凝胶的控释重组腺病毒药物制剂。
背景技术
非复制型重组腺病毒已被广泛使用于多个治疗领域，例如基因治疗和癌症治疗领域。然而，在临床上非复制型重组腺病毒的有效应用仍然面临许多挑战，包括在高(非低温)温下稳定感染的能力、长期治疗中控制其释放和表达模式以及给药后的免疫反应的最小化。
因此，仍旧需要控释的基于重组非复制型腺病毒的药物制剂，以优化治疗的效果和安全性。
发明概述
本发明人惊奇地发现，一种或多种用SiO2水凝胶颗粒配制的非复制型重组腺病毒，除了能够稳定腺病毒的感染能力外，还可以提高编码的生物治疗剂的表达。
因此，本发明一方面提供了一种药物组合物，其包含：
(i)用于表达一种或多种生物治疗剂的一种或多种非复制型重组腺病毒；
(ii)SiO2基质凝胶颗粒；其中所述的一种或多种非复制型重组腺病毒散布在SiO2基质水凝胶中，并且其中所述的药物组合物不包含化学治疗剂。
在一个特别优选的实施方案中，药物组合物中的一种或多种非复制型重组腺病毒的治疗有效量低于未配制在该药物组合物中的相同的非复制型重组腺病毒的治疗有效量。
在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂选自由：细胞因子、趋化因子、趋化因子激动剂、趋化因子拮抗剂、趋化因子受体拮抗剂、共刺激分子、检查点抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和抗体组成的组。在其他实施方案中，一种或多种生物治疗剂选自由干扰素γ、干扰素α、白介素12、白介素15、CD40L、Ox40L、4-1BB、ICOS-L、LIGHT、CD70、TGF-β、透明质酸酶(PH20)、CD200拮抗剂、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、CD27激动剂、TGF-β拮抗剂、白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂和LAIR 1拮抗剂组成的组。在一些优选的实施方案中，CD200拮抗剂、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、TGF-β拮抗剂、白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂或LAIR-1拮抗剂中的一种或多种为抗体。
在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含趋化因子。在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含共刺激分子。在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含检查点抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含金属蛋白酶抑制剂。在一些实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂。
在其他实施方案中，待表达的一种或多种编码的生物治疗剂包括细胞因子。在一些优选的实施方案中，细胞因子为干扰素γ。在一些优选的实施方案中，非复制型重组腺病毒为编码干扰素γ的ASN-002。
在一个实施方案中，当与缺少SiO2基质水凝胶的相应药物组合物相比时，至少一种生物治疗剂在体内的表达更高。在一个实施方案中，当与缺少SiO2基质水凝胶的相应药物组合物相比时，至少一种生物治疗剂在体内的表达高约2倍至约10倍，或约2倍至约5倍，或至少2倍，或至少4倍。
在一些实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒包括第一非复制型重组腺病毒和第二非复制型重组腺病毒，其各自用于表达不同的生物治疗剂。在一些优选的实施方案中，其中一种非复制型重组腺病毒编码细胞因子作为一种或多种生物治疗剂中的其中一种。在一些实施方案中，其中一种非复制型重组腺病毒编码CD40L或CD27激动剂，作为一种或多种生物治疗剂的其中一种。
在一些实施方案中，SiO2基质水凝胶包含正硅酸四乙酯(TEOS)。在一些实施方案中，SiO2基质水凝胶包含水和TEOS，两者的最终摩尔比为约5:1至约4,000:1，或约5:1至约1,000:1。在一些优选的实施方案中，水与TEOS的最终摩尔比为约400:1。
在一些实施方案中，当施用药物组合物时，其在约一天至约48小时的时间内或约1天至约30天的时间内在体内释放一种或多种非复制型腺病毒。
在一些实施方案中，在药物组合物与细胞培养基在37℃接触24小时后，一种或多种非复制型腺病毒保留其约50％至约75％，或至少约50％的感染能力。
在一些实施方案中，当药物组合物在约4℃下保持约12个月至约24个月时，一种或多种非复制型重组腺病毒保留其至少约50％至约75％，或至少约50％的感染能力。
在一些实施方案中，药物组合物为储库制剂。
在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，一种或多种药学上可接受的赋形剂包含一种或多种多元醇。在一些实施方案中，一种或多种多元醇选自由蔗糖、甘露醇、乙醇、海藻糖、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇组成的组。在一些优选的实施方案中，一种或多种多元醇包含蔗糖和乙醇。在其他优选的实施方案中，一种或多种多元醇包含甘油和蔗糖。在一些优选的实施方案中，药学上可接受的赋形剂包括甘油、蔗糖、磷酸盐缓冲液、NaCl和MgCl2。
在一些实施方案中，一种或多种药学上可接受的赋形剂进一步包含一种或多种去污剂。在一些实施方案中，一种或多种去污剂选自由聚氧乙烯(20)山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯(聚山梨脂20)和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸酯(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)组成的组。在一些实施方案中，一种或多种去污剂包括聚山梨酯80。
在一些实施方案中，一种或多种药学上可接受的赋形剂进一步包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括组氨酸、三乙醇胺(TEOA)、柠檬酸盐(citrate)和乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些优选的实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括EDTA和组氨酸。在一些优选的实施方案中，一种或多种药学上可接受的赋形剂包括蔗糖、乙醇、EDTA、组氨酸、聚山梨酯80、NaCl和MgCl2。
在一些实施方案中，药物组合物包含约1×1010个病毒颗粒/ml至约5×1012个病毒颗粒/ml。
在一个相关方面，本发明提供了一种用于治疗患有疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的任何前述的药物组合物。
在一个实施方案中，所述疾病为癌症。在一些实施方案中，所述受试者患有选自由基底细胞癌、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌组成的组。在一些实施方案中，所述受试者患有基底细胞癌或鳞状细胞癌。在一些实施方案中，所述受试者患有的癌症包含一种或多种病变(lesion)或肿瘤。在一些实施方案中，将药物组合物注射至至少一种所述的一种或多种病变或肿瘤中。
在一个相关方面，本发明提供了任何上述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了：
(i)一种或多种用于表达一种或多种生物治疗剂的非复制型重组腺病毒；和
(ii)SiO2基质水凝胶：
在制备用于治疗患有疾病的受试者的药物中的用途中，其中一种或多种非复制型重组腺病毒散布在SiO2基质水凝胶中，并且其中所述的药物组合物不包含化学治疗剂。
在另一个相关方面，本发明提供了一种药物组合物用于治疗疾病的用途。
除非另有明确说明，否则本发明的任何实施方案均可以作必要的变通而应用于任何其他实施方案。
本发明的范围不受本发明所述的具体实施方案的限制，这些具体实施方案仅旨在作为举例说明的目的。如本发明所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的保护范围内。
在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则提及的单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应视为包含一个或数个(例如一个或多个)的这些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。
以下将通过下述非限制性实施例并参考附图描述本发明。
附图说明
图1显示了37℃下ASN-002在细胞培养基中的生物学活性的稳定性。散点图显示了在37℃时在不同比例的病毒颗粒/细胞(vp/细胞)下H-1299细胞被ASN-002感染后并且孵育不同的时间后IFN-γ的释放情况(n＝3)。
图2显示了在37℃下孵育24小时后，在不同pH值下R400溶胶中ASN-002的生物活性。散点图显示了在各种vp/细胞比率下，用ASN-002-R400 SiO2凝胶基质制剂(用不同的pH制成)感染后，以及在37℃下孵育24小时后，H-1299细胞中IFN-γ的释放情况(n＝3)。
图3显示了在37℃下孵育24小时后，ASN-002在溶胶中的生物活性。图3的条形图数据概括。这些数据显示了感染率为3.3个病毒颗粒/细胞。与最初的T＝0相比，R400(pH 6和7)病毒制剂在感染时产生了明显更多的IFN-γ。
图4显示了ASN-002与储库制剂中的ASN-002的生物活性比较。线性图显示了在H1299细胞中孵育未配制的ASN-002和ASN-002制剂R5-400和R150-400 24小时后测得的IFN-γ的表达。应注意感染以x轴上的细胞/病毒颗粒来表征。
图5显示了完整的ASN-002在解冻后和在4℃下保存12天后的生物学活性的稳定性。散点图比较了在4℃下储存12天后ASN-002(未配制)的感染能力与刚解冻的ASN-002的感染能力。
图6显示了封装的ASN-002和完整的ASN-002之间的生物学活性比较。散点图比较了在4℃下储存7天后ASN-002R150-400和R5-400制剂的感染能力与对照ASN-002(“安慰剂”-仅含SiO2微粒的ASN-002)的感染能力。
图7显示了基于生物活性的溶出度测试中ASN-002的释放。图5和图6所示结果的条形图概括了3.3的VP/细胞比。
图8显示了ASN-002R150-400储库制剂的溶出度情况。散点图显示了R150-400制剂在不同稀释度下孵育2个小时、3个小时和5个小时后，在培养基中释放ASN-002的的感染能力。
图9显示了在ASN-002R150-400储库制剂溶出时病毒颗粒释放的IE-HPLC分析。在Tris缓冲液中孵育1、2和4小时后，由ASN-002R150-400制剂释放的病毒颗粒的汇总表。
图10显示了R100-400的病毒颗粒释放和感染滴度分析。在Tris缓冲液中孵育1、2和4小时后，由ASN-002R100-400制剂释放的病毒颗粒的汇总表。
图11显示了R100-400储库制剂的体外溶出度测试：病毒颗粒的累积释放及其感染性滴度。散点图显示了在Tris缓冲液中孵育1、2和4小时后，ASN-002R100-400制剂的病毒颗粒释放和感染能力。
图12显示了R100-400储库制剂的体外溶出度测试：溶出度样品的IFNγ测定。线性图显示了孵育未配制的ASN-002和ASN-002制剂R5-400和R100-400 24小时后测得的H1299细胞的IFN-γ的表达。
发明详述
通用技术和定义
除非另有明确定义，否则本发明所用的所有技术术语和科学术语均应理解为与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(例如，在细胞培养、细胞生物学、病毒载体构建、基因治疗、分子遗传学中、癌症生物学、癌症治疗、免疫学、药理学、蛋白质化学和生物化学等领域)。
除非另有说明，否则本发明中使用的细胞培养和免疫技术是本领域技术人员众所周知的标准步骤。这些技术在诸如J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(editor),EssentialMolecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991),D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995and 1996)以及F.M.Ausubel et al.(editors),Current Protocols inMolecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止的所有更新),Ed Harlow and David Lane(editors)Antibodies:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)以及J.E.Coligan et al.(editors)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括迄今为止的所有更新)等文献中均有描述和解释。
除非另有说明，否则如本发明所用的术语“约”表示指定值的+/-10％，更优选为指定值的+/-5％。
在整个说明书中，单词“包括”或诸如“包含”或“含有”之类的变体应理解为包括所述的元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的群组，但不排除任何其他的元素、整数或步骤或元素、整数或步骤的群组。
本申请中所使用的术语“或”旨在表示包含性的“或”而非排除性的“或”。即除非另有说明或上下文中明确指示，否则“X使用A或B”旨在表示任何自然的包含性排列。也就是说，如果X使用A；X使用B；或者X使用A和B两者，则“X使用A或B”满足前述任何情况。此外，A和B等中的至少一个通常表示A或B或者A和B两者。此外，除非另有说明或上下文中明确指示为单数形式，否则本申请和权利要求书中使用的不定冠词“一”通常解释为“一种或多种”。
如本发明所用，术语“重组腺病毒”是指通过实验干预进行遗传修饰的任何腺病毒。
如本发明所用，术语“生物治疗剂”是指可以从重组非复制型腺病毒表达的任何生物活性分子，例如可以是用于治疗癌症的分子。此类生物治疗剂仅作为示例，可以包括细胞因子、抗体、受体、RNAi、miRNA或sgRNA。
术语“化学治疗剂”是指一类对癌细胞具有细胞生长抑制作用和/或细胞毒性的小分子。为了避免任何疑问，该生物治疗剂可以是化学治疗剂。但是，本发明的药物组合物将不包含非病毒表达的化学治疗剂。换句话说，病毒仅在从基质释放，并感染细胞时才会表达生物治疗剂。因此，药物组合物本身不包含通过人为干预而添加到制剂中的化学治疗剂。
如本发明所用，术语“当与缺少SiO2基质水凝胶的相应药物组合物相比时，至少一种生物治疗剂在体内的表达更高”是指本发明的组合物导致生物治疗剂的表达水平更高。
如本发明所用，术语“受试者”可以是任何动物。在一个实施方案中，动物为脊椎动物。例如，动物可以是哺乳动物、禽类、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性的受试者包括但不限于人、灵长类动物、牲畜(例如绵羊、牛、鸡、马、驴、猪)、伴侣动物(例如狗、猫)、实验室试验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养的野生动物(例如狐狸、鹿)。在一个实施方案中，哺乳动物是人类。
本发明所用的术语“抗体”包含多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性抗体、融合双抗体、三抗体、异源偶联抗体、嵌合抗体等的完整分子及其片段，以及其他抗体类分子。抗体包含多种形式的修饰，包括例如但不限于，VH或VL结构域的结构域抗体、重链可变区的二聚体(VHH，如对于骆驼科所描述的)、轻链可变区的二聚体(VLL)、仅含有可以直接连接的或通过连接子连接的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的Fv片段或含有重链可变区和CH1结构域的Fd片段。
如本发明所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足够量的至少一种重组病毒，其将在某种程度上减轻所治疗的疾病或病症(例如癌症)的一种或多种症状。结果可以是减轻和/或缓解疾病的体征、症状或诱因，或生物系统的任何其他期望的改变。
如本发明所用，术语“治疗”是指由医学专业人员直接治疗受试者(如通过向受试者施用治疗剂)，或由至少一方(如医生、护士、药剂师或药品销售代表)，以任何形式提供以下指令实施间接治疗：(i)指示受试者根据要求的方法进行自我治疗(如自己施用药物组合物)或(ii)指示第三方根据要求的方法治疗受试者。术语“治疗”的含义还包含预防复发或减缓待治疗的疾病，例如，通过在疾病的足够的早期阶段施用治疗剂以预防或延缓其进展。
控释非复制型重组腺病毒药物组合物
本发明提供了控释非复制型重组腺病毒药物组合物。控释是指腺病毒从掺入了其的剂型中在延长的时间段内根据期望的特性进行释放。控释的特性包括例如持续释放、延长释放、脉冲式释放和延迟释放的特性。与速释组合物相反，控释组合物允许根据预定特征在延长的时间段内将一种或多种非复制型重组腺病毒递送至受试者。与常规的快速释放形式相比，这样的释放速率可以在延长的时间内提供治疗有效水平的腺病毒介导的基因表达，从而提供更长的治疗应答时间，同时使副作用最小化。另外，与以标准制剂施用的重组腺病毒相比，此类组合物不太可能诱导免疫应答。如此长的响应时间提供了许多益处，而相应的短效速释制剂则无法实现。
本发明的药物组合物包含(i)用于表达一种或多种生物治疗剂的一种或多种非复制型重组腺病毒；(ii)SiO2基体水凝胶；其中一种或多种非复制型重组腺病毒散布在SiO2基质水凝胶中；其中所述的药物组合物不包含化学治疗剂。在一个实施方案中，药物组合物中的一种或多种非复制型重组腺病毒的治疗有效量较低，例如较未配制在药物组合物中的相同的非复制型重组腺病毒的治疗有效量低10％至90％，或10％至50％，或低约5倍至约10倍。
本发明提供的控释药物组合物能够对制剂中的一种或多种非复制型重组腺病毒的释放特性进行定制，从而使它们中的一种或多种的释放在优选的时间间隔内发生。在一些实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒在约一小时至约五周的时间段内释放，例如2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、5天、1周、10天、2周、18天、3周、4周或其他大约1小时至大约5周的时间。在其他实施方案中，体内的释放发生约3天至约30天的时间段内。在一些实施方案中，在约1小时至约48小时的时间段内或约18小时至约36小时的时间段内释放一种或多种非复制型重组腺病毒。
在一些实施方案中，控释的特性在施用后的释放期开始时具有较高的释放速率，然后随时间有所降低(一级释放动力学)。在其他实施方案中，释放速率在施用后的释放期内逐渐增加。在优选的实施方案中，在施用后的整个释放期间内释放的特性保持相对恒定直至所有一种或多种非复制型重组腺病毒被释放(零级释放动力学)。
在优选的实施方案中，在施用药物组合物后一种或多种非复制型重组腺病毒的释放特性能够避免在人受试者中诱导超过中等程度的免疫应答。在一些实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒的释放速率为总剂量的约5％/每天至总剂量的约100％/每天，例如6％、8％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、60％、70％、80％、90％、95％，或总剂量的其他百分比，从约0.5％到约100％/每天。
SiO2基质水凝胶
在一些实施方案中，SiO2基质水凝胶是生物可吸收的溶胶-凝胶衍生的正硅酸四乙酯(AKA“四乙氧基硅烷”或“TEOS”)Si(OC2H5)4基质凝胶(“SiO2基质凝胶”)，如WO2005082781和WO2007135224中所述。该技术已由DelSiTech Ltd(Turku,Finland)商业化。
例如，SiO2基体凝胶溶胶-凝胶通过溶胶-凝胶法(sol-gel process)制备，其中SiO2基体凝胶由已变成凝胶的包含SiO2的溶胶制备。溶胶-凝胶衍生的SiO2通常是由醇盐或无机硅酸盐制备的，这些醇盐或无机硅酸盐通过水解形成包含部分水解的二氧化硅或完全水解的硅酸的溶胶。随后含有SiOH的物质的缩合反应会导致随着硅氧烷键数量的增加而形成更大的二氧化硅。此外，物质聚集以形成纳米尺寸的颗粒和/或更大的聚集物，直到形成凝胶。以凝胶的形式，固态占主导，但是系统仍然包含变化的量的液体，并且在干燥之前，该材料通常是软的和粘弹性的，而如果充分干燥的话，那么该材料会是硬的且脆的。以溶胶的形式，液态占主导地位，但系统中固相的含量不同，材料仍可流动。从制备SiO2溶胶到溶胶变成凝胶的时间称为溶胶老化时间。当溶胶老化时，通常会发生自然干燥，因此该系统允许在外界条件下蒸发。通过在凝胶形成之前将所需滴度的一种或多种非复制型重组腺病毒滴加至溶胶中以表达一种或多种生物治疗剂，来实现控释药物组合物的产生。
可以根据需要调节基于SiO2凝胶的控释药物组合物中活性试剂的释放速率。通常，当SiO2水凝胶中的水与醇盐的最终摩尔比约为2时，SiO2凝胶基质的最大溶解速率和活性剂的释放速率发生，低于或高于该摩尔比时将会导致溶解和释放的速率较慢。此外，还应注意的是，SiO2凝胶基质中包含的大量活性试剂增加了基质的溶解度和活性剂的释放速率。
在一些实施方案中，对于本发明所述的药物组合物观察到的腺病毒在体外发生的释放速率(溶解速率)约为其在体内发生的速率的十倍。
在示例性的、非限制性的实施方案中，用盐酸将初始摩尔比为约100:1至150:1的水和正硅酸四乙酯(TEOS)混合物的pH调节至pH为2，并在室温下剧烈搅拌25分钟。然后通过添加0.1M NaOH将溶胶的pH值调节至所需的pH值(6、6.5或7)。将溶胶在冰水浴中冷却，并加入所需量的重组腺病毒(例如约5×1010vp/ml至5×1011vp/ml)。然后将溶胶用水稀释，以使最终的水与TEOS之比为400:1。
将如下所述产生的安慰剂微粒(在本发明中也称为“次级微粒”)以每1ml 0.5g安慰剂微粒的比例添加到溶胶中。然后使悬浮液凝胶化并用于填充注射器，或者可以用悬浮液填充注射器并使其在旋转器中凝胶化(24℃放置3天，4℃放置9天)。
在示例性实施方案中，通过使用比例为5:1的水:TEOS并以HCl作为催化剂(pH 2)来产生安慰剂微粒(在本发明中也称为“次级微粒”)。然后将所得溶胶用乙醇稀释，并将pH调节至6.3。使用喷雾干燥器将稀释的溶胶喷雾干燥。在一些实施方案中，次级微粒中的水:TEOS的比例为约2:1至约20:1，例如约4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、15:1、18:1，或其他的比例约为2:1至20:1的水与TEOS。
在一些实施方案中，药物组合物中的SiO2基质水凝胶包含水和TEOS，其最终摩尔比为约5:1至约4,000:1，例如，10:1、25:1、50:1、75:1、100:1、150:1、200:1、300:1、400:1、500:1、750:1、1,000:1、2,000:1、3,000:1，或水与TEOS的另一最终摩尔比为约50:1至约700:1，或约5:1至约1,000:1。在一些优选的实施方案中，水与TEOS的最终摩尔比为约400:1。
本发明描述的药物组合物的另一个优点是在升高的温度下具有稳定的腺病毒感染性。在本发明所述的药物组合物的一些实施方案中，在药物组合物与哺乳动物细胞培养基在37℃下接触24小时后，一种或多种非复制型重组腺病毒保留其至少约50％至约75％的感染能力。在其他实施方案中，当药物组合物在4℃下保持约12个月至24个月，例如13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、20个月、21个月、22个月、23个月或其他约12个月至24个月的时间时，一种或多种非复制型重组腺病毒保留其至少约50％至约75％的感染能力。
非复制型重组腺病毒
腺病毒基因组是线性的36Kb的双链DNA(dsDNA)分子，其包含多个高度剪接的转录本。在基因组的任一端是反向末端重复序列(ITR)。基因分为早期(E1-4)转录本和晚期(L1-5)转录本。腺病毒基因转移的优势包括能够感染多种细胞类型，包括非分裂细胞、中等大小的基因组，易于操作，具有高感染力，并且它们可以生长至高滴度(Volpers and Kochanek,2004；Wilson,1996)。此外，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体的整合，因为腺病毒DNA仍然是游离基因，没有与其他病毒载体所携带的潜在基因毒性。腺病毒在结构上也是稳定的(Marienfeld et al.,1999)，并且在大量扩增后检测到无基因组重排(Parks et al1997；Bett et al 1993)。
非复制型重组腺病毒通常在病毒复制所必须的至少一种基因的功能上存在不足，从而产生“非复制型”腺病毒载体。如本发明所用，术语“非复制型”是包含缺乏至少一种复制所必需的基因功能(即，使得腺病毒载体不在宿主细胞中复制)的腺病毒基因组的重组腺病毒。如本发明所用，基因、基因功能、或基因或基因组区域的缺陷被定义为缺失了病毒基因组足够的遗传物质，以削弱或消除其核酸序列整体缺失或部分缺失的基因的功能。复制所必需的基因的功能是复制(例如繁殖)所必需的那些基因的功能，并由例如腺病毒的早期区域(例如E1、E2和E4区)，晚期区域(例如L1-L5区)，参与病毒包装的基因(例如IVa2基因)和病毒相关的RNA(例如VA-RNA-1和/或VA-RNA-2)所编码。
在一些实施方案中，非复制型重组腺病毒包含一种腺病毒基因组，在该腺病毒基因组的一个或多个区域的至少一种复制必需基因的功能上存在不足。在优选的实施方案中，非复制型重组腺病毒在病毒复制所需的腺病毒基因组的E1区的至少一种必需基因的功能上存在不足。除了E1区的缺陷外，重组腺病毒还可以在主要晚期启动子(MLP)中具有突变。如在WO 00/00628中所讨论的，MLP中的突变可以是在任何MLP的控制元件中，从而其改变启动子的响应。更优选地，在一些实施方案中，非复制型重组腺病毒在E1区域和至少一部分的E3区域(例如E3区域XbaI的缺失)的至少一种所必需的基因的功能上存在不足。对E1区而言，非复制型重组腺病毒在至少一部分的E1a区和至少一部分的E1b区上可能是存在不足的。例如，非复制型重组腺病毒可包含腺病毒基因组的整个E1区和部分E3区的缺失(例如，核苷酸第355-3,511位和第28,593-30,470位)。制备非复制型重组腺病毒的方法的实例在US 5,837,511,US 5,851,806,US 5,994,106,US 6,579,522,US 2001/0043922,US 2002/0004040,US 2002/0031831,US 2002/0110545,WO 95/34671,WO 97/12986以及WO 97/21826中有所描述。
用于驱动的生物治疗剂(来自配制在本发明所述药物组合物中的重组腺病毒)表达的合适的启动子实例包括但不限于组成型启动子，例如CMV、CAG、EF-1-I、HSV1-TK、SV40、θ-肌动蛋白和PGK启动子。在其他实施方案中，启动子是诱导型启动子，例如含有TET操纵子元件的那些启动子。在某些实施方案中，靶标选择性的启动子用于驱动生物治疗剂在特定细胞类型中或在癌细胞中的表达。可用于本发明所述方法的合适的癌症/细胞类型的选择性启动子的实例包括但不限于erb 2启动子(乳腺癌)、癌胚抗原启动子(结肠直肠癌)、尿激酶型纤溶酶原激活剂受体启动子(结肠直肠癌)、酪氨酸酶启动子(黑色素瘤)、黑色素受体(黑色素瘤)、人类端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子(多种癌症)、RAS相关核蛋白启动子(多种癌症)、乳腺癌转移抑制因子1启动子(多种癌症)、Rad51C启动子(多种癌症)和微染色体维持蛋白复合物组分5启动子(多种癌症)。
在一些实施方案中，一种或多种重组腺病毒不包含β-半乳糖苷酶或萤光素酶的表达盒。在其他实施方案中，一种或多种重组腺病毒不包含报告蛋白的表达盒。
在一些实施方案中，当要从重组病毒表达两种或更多种蛋白质时，一种或多种重组腺病毒包含编码多顺反子mRNA的表达盒(“多顺反子表达盒”)，其在翻译时产生独立的多肽，其包含不同的氨基酸序列或功能。在一些实施方案中，多顺反子表达盒编码包含多个多肽序列的“多蛋白”，所述多肽序列被细小核糖核酸病毒(例如口蹄疫病毒(FMDV)病毒2A肽序列)编码而分开。2A肽序列在共同翻译时通过防止保守的甘氨酸和最后一个脯氨酸之间正常肽键的形成从而使得核糖体跳到下一个密码子，而新生的肽在Gly和Pro之间发生切割。切割后，短的2A肽保持融合在“上游”蛋白的C端，而脯氨酸被添加到“下游”蛋白的N端，其在翻译过程中允许将新生多肽序列切割成单独的多肽(参见例如Trichas等人(2008)。
在其他实施方案中，多顺反子表达盒可在并入了多顺反子表达盒的开放阅读框之间并入一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)序列。IRES序列及其用途是本领域已知的，例如在Martinez-Sales(1999)中有所举例说明。
在一些实施方案中，在该方法中使用的重组腺病毒具有靶向的嗜性，例如在Yamamoto et al.(2017)和Yoon et al.(2016)中所述的针对特定细胞类型的嗜性。待掺入重组病毒衣壳表面的合适的靶向部分包括与癌细胞过度表达的细胞表面受体结合的配体。例如，CXCL12已被用于通过CXCR4趋化因子受体将腺病毒载体重新靶向至癌细胞(Bhatia等，2016)。
表达的生物治疗剂
适用于本发明所述药物组合物的生物治疗剂包括可以由此类药物组合物中的一种或多种非复制型重组腺病毒的基因编码并表达的生物分子。因此，生物治疗剂可以包括肽、蛋白质以及非编码RNA如短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA抑制剂、反义RNA或它们的任何组合。优选地，在人类中表达的生物治疗剂与人类同源物具有最高的序列同源性。在一些实施方案中，在人类中表达的生物治疗剂的序列与人类同源物具有至少约80％的同源性，例如82％、85％、88％、90％、92％、95％、97％、99％，或与人类的同源序列具有其他的约80％至100％的同源性的百分比。
在一些优选的实施方案中，药物组合物中一种或多种非复制型重组腺病毒的治疗有效量低于未配制在药物组合物中的相同类型的非复制型重组腺病毒的治疗有效量。在一些实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒的治疗有效量比未配制在药物组合物中的相同类型的非复制型重组腺病毒的治疗有效量低约20％至约80％，例如降低了约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或降低了其他的约20％至约80％的百分比剂量。
在一些实施方案中，一种或多种生物治疗药试剂选自由：细胞因子、趋化因子、趋化因子拮抗剂、趋化因子受体拮抗剂、共刺激分子、检查点抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和抗体组成的组。
在其他实施方案中，一种或多种生物治疗剂选自由干扰素γ、干扰素α、白介素12、白介素15、CD40L(GenBank NP_000065.1)、Ox40L(GenBank NP_003317.1)、4-1BB(GenBankAAA53133)、ICOS-L(GenBank AAH64637.1)、LIGHT(GenBank CAG46652.1)、CD70(GenBankAAH00725.1)、TGF-β、透明质酸酶(PH20；GenBank AAH26163.1)、CD200拮抗剂、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、TGF-β拮抗剂、白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂和LAIR-1拮抗剂组成的组。在一些优选的实施方案中，CD200拮抗剂、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、TGF-β拮抗剂、白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂或LAIR-1拮抗剂中的一种或多种为抗体。
在一个实施方案中，趋化因子拮抗剂是CxCL12(SDF1)拮抗剂。
在一个实施方案中，趋化因子受体拮抗剂是CxCR4拮抗剂。
在一些优选的实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含趋化因子。在其他优选的实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含共刺激分子。在其他优选的实施方案中，一种或多种生物治疗剂包含检查点抑制剂。
在一些优选的实施方案中，一种或多种生物治疗剂包括细胞因子。在一个特别优选的实施方案中，细胞因子是干扰素γ。在一个实施方案中，其中所述细胞因子是干扰素γ，所述药物组合物中的一种或多种非复制型重组腺病毒中的一种是ASN-002(也称为Tg1042)(Urosevic,2007；Liu et al.,2004；Dummer et al.,2004and 2010；Accart etal.,2013；Khammari et al.,2015；Dreno et al.,2014；Hillman et al.,2004)。
其他合适的待表达的细胞因子包括但不限于干扰素γ、干扰素α、B细胞活化因子(BAFF)、TL1、TNFα、TRAIL、淋巴毒素α、淋巴毒素β、OX-40配体、LIGHT(也称为肿瘤坏死因子超家族成员14)、FAS-配体、4-1BB配体、RANK配体、CD30配体、CD40配体、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白配体(GITRL)或其任何组合。
在本发明描述的任何药物组合物的一些实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒包含第一非复制型重组腺病毒和第二非复制型重组腺病毒，其各自用于表达不同的生物治疗剂。在一些实施方案中，其中一种非复制型重组腺病毒编码CD40L或CD27激动剂作为一种或多种生物治疗剂的其中之一。在一些实施方案中，其中一种非复制型重组腺病毒编码一种细胞因子作为一种或多种生物治疗剂的其中一种。
在一些优选的实施方案中，待表达的生物治疗剂的序列包括人同源物的序列(例如，人IFNγ的氨基酸序列或编码人IFNγ的人核酸序列)。
待表达的蛋白质生物治疗剂的其他合适类型包括但不限于细胞因子、调节凋亡性细胞死亡的蛋白质、调节坏死性细胞死亡的蛋白质、调节PARP-1依赖性细胞死亡(parthanatos cell death)的蛋白质或调节自噬细胞死亡的蛋白质，或结合细胞受体并通过细胞凋亡、坏死性凋亡、PARP-1依赖性细胞死亡、自噬细胞死亡而激活的细胞死亡的激动剂，或其任何组合。
在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂是针对FAS受体(FasR)的激动剂抗体，例如，scFv抗体如Chodorge et al.(2012)中所述的“E09”scFv抗体。
在其他实施方案中，用于治疗方法中的重组病毒表达的生物治疗剂包括非编码RNA。此类非编码RNA包括影响RNA干扰的短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、miRNA抑制剂、反义RNA(包括针对miRNA的反义RNA)(例如，如Ebert et al.,2007中所述的“miRNA海绵(miRNA sponges)”)。
术语“RNA干扰”、“基因沉默”及相关短语通常是指其中双链RNA分子降低核酸序列的表达的过程，该核酸序列与该双链RNA分子具有大部分的同源性或完全的同源性。然而，近期显示使用非RNA双链分子可以实现RNA干扰(参见例如US 20070004667)。
“shRNA”或“短发夹RNA”是指少于约50个核苷酸，优选约19个至约23个核苷酸的RNA分子，其核苷酸与位于同一RNA分子上的互补序列碱基配对，并且其中所述序列和互补序列被至少约4个至约15个核苷酸的未配对区域隔开，通过这两个区域的碱基互补在茎结构上方形成单链环。
所包含的shRNA是双指和多指发夹dsRNA，其中RNA分子包含两个或多个由单链间隔区分隔的茎-环结构。
在一些实施方案中，待表达的生物治疗剂的非编码RNA是针对癌症靶标的shRNA。合适的shRNA癌症靶标包括但不限于细胞周期蛋白D1(GenBank BC023620.2)、III类β-微管蛋白(GenBank NM_006086)、活化的C激酶1受体(RACK1；GenBank NM006098)、Ras同源基因家族成员A(RHOA；GenBank BC001360)、丝裂原活化蛋白激酶激活的蛋白激酶5(MAPKAPK5；GenBank NM003668)、生长分化因子11(GDF11；GenBank AF028333)、Engrailed 1(EN1；GenBank NM_001426.3)和小眼相关转录因子(microphthalmia-associatedtranscription factor；MITF；GenBank NM_000248)。
在其他实施方案中，待表达的非编码RNA是miRNA。在本发明所述的治疗方法中表达的miRNA的合适实例包括但不限于mir-491、mir-133a、mir-204、let 7miRNA、mir-24、mir-15a、mir 16、mir-26a、mir-148b、mir-199a-3p、mir-512、mir 874a或其任何组合。用于抑制癌细胞(例如通过表达miRNA海绵)的合适miRNA靶标的合适实例包括但不限于mir-223、mir-211、mir-10b、mir-9、mir-17-92、mir-103、mir-106b、mir-107、mir-155、mir-21、mir-128或其任何组合。
在进一步的实施方案中，待表达的非编码RNA是向导RNA(“sgRNA”)，其可以与可编程核酸酶例如Cas9核酸酶结合用于基于CRISPR的基因的靶向破坏，由单个重组腺病毒共表达或与第二重组腺病毒分开表达。sgRNA的合适实例包括但不限于针对CTLA4或PD-1、PDL1、CTLA-4、LAG3、TFG-β受体或LAIR-1的sgRNA。sgRNA序列可商购，例如购自Thermo FisherScientific。
在某些实施方案中，在治疗方法中使用的重组病毒表达至少两种生物治疗剂，例如两种蛋白质；一种非编码RNA和蛋白质；或两个非编码RNA。
在一些优选的实施方案中，两种待表达的生物治疗剂包括细胞因子和选自MLKL、SMAC、SMAC的N末端四肽(AVPI)(Guo等，2002)、BAX、DAI、环状GMP-AMP合酶(cGAS；GenBankNP_612450.2)和RIPK3的蛋白质。
药学上可接受的赋形剂以及施用
本发明所述的非复制型腺病毒可被配制成适于施用于受试者的药物组合物。在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类赋形剂可以提供额外的益处，即稳定本发明所述的药物组合物中包含的一种或多种重组的非复制型腺病毒的感染能力。赋形剂的选择将部分地由将组合物施用的特定部位和施用组合物的特定方法来确定。根据特定的给药途径的不同，可以使用本领域已知的多种可接受的赋形剂，例如在《雷明登氏药学全书》(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)中有所描述。
合适的药物组合物包括水性溶液和非水性溶液、水凝胶、等渗无菌溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使组合物在给药部位与体液等渗的溶液，以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。
本发明所述的药物组合物可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿和小瓶，并且可以存储在冻干(冻干)条件下，在使用之前仅需要添加无菌液体载体例如水即可使用。可以例如由无菌粉末、颗粒和片剂制备临时溶液和悬浮液。在一些实施方案中，非复制型重组腺病毒被配制成药物组合物的形式进行施用(给药)，以在施用前保护和/或稳定腺病毒免受损害。例如，可以配制成药物组合物以减少非复制型重组腺病毒在用于制备、储存或施用表达载体的装置例如玻璃器皿、注射器、药丸、缓释装置、泵或针头时的损失。
还可以通过配制药物组合物以降低其中的非复制型重组腺病毒的光敏感性和/或温度敏感性。为此，药物组合物优选包含例如上述的那些药学上可接受的液体载体，以及选自由聚山梨酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其组合组成的组的稳定剂。此类药物组合物的使用可以延长非复制型重组腺病毒的保质期、促进给药并提高基因转移的效率。就这方面而言，可以配制药物组合物以增强其转导效率。
在一些优选的实施方案中，药物组合物被制备为适于注射的制剂。在一些优选的实施方案中，适于注射的制剂是储库制剂。
适用于病灶内注射、肌肉注射、皮下注射或静脉内注射的制剂可以包括生理学上可接受的无菌水性溶液或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳剂。
在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物中包含的药学上可接受的赋形剂包括一种或多种多元醇。在一些实施方案中，一种或多种多元醇选自由蔗糖、甘露醇、乙醇、海藻糖、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇组成的组。在其他实施方案中，一种或多种多元醇包含蔗糖和乙醇。在一些优选的实施方案中，本发明所述的药物组合物包含约0.5％的乙醇(v/v)和约5％的蔗糖(w/v)。在其他优选的实施方案中，一种或多种多元醇包含甘油和蔗糖。在一些优选的实施方案中，本发明所述的药物组合物包含约10％的甘油(w/v)和约2％的蔗糖(w/v)。
在一个示例性的实施方案中，本发明所述的药物组合物中包含的药学上可接受的赋形剂包括甘油、蔗糖、磷酸盐缓冲液、NaCl和MgCl2。
在一些实施方案中，任何上述药物组合物还包含一种或多种去污剂。在一些实施方案中，一种或多种去污剂选自由聚氧乙烯(20)山梨醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯(聚山梨酯20)和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸酯组成的组。在一些实施方案中，一种或多种去污剂包括聚山梨酯80。
在一些实施方案中，任何上述药物组合物还包含一种或多种抗氧化剂。在一些实施方案中，一种或多种抗氧化剂选自由组氨酸、三乙醇胺(TEOA)、柠檬酸(盐)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的组。在一些优选的实施方案中，一种或多种抗氧化剂包括EDTA和组氨酸。
在一个实施方案中，组合物包含鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸和聚乙烯亚胺中的一种或多种或全部。
在一些优选的实施方案中，本发明所述的药物组合物中的赋形剂包括蔗糖、乙醇、EDTA、组氨酸、聚山梨酯80、NaCl和MgCl2。
本发明所述的药物组合物可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中例如汉克氏溶液(Hank’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理盐水缓冲液中进行配制。
在一个示例性实施方案中，药物组合物包含10mM Tris、75mM NaCl、5％(w/v)蔗糖、0.020％(w/v)聚山梨酯80、1mM MgCl2、100μM EDTA、0.5％(v/v)乙醇、10mM His，pH7.4。
在另一个示例性的实施方案中，药物组合物包含10％甘油、10-20mM磷酸盐缓冲液、pH 8或14mM Tris/HCl(pH 7.80)、100mM NaCl mM、MgCl2、2％蔗糖和任选地0.015％(w/v)聚山梨酯80。
在另一个示例性实施方案中，药物组合物包含5％蔗糖或5％海藻糖、5％人血清白蛋白或1％PEG3500、10mM Tris(pH8.2)、0.15M NaCl和1mM MgCl2。
在另一个示例性实施方案中，药物组合物包含5％蔗糖、1％甘氨酸、1mM MgCl2、10mM Tris(pH 7.8)和0.05％Tween80。在另一个示例性实施方案中，药物组合物包含5％蔗糖、1％甘氨酸、1mM MgCl2、10mM Tris、8％F-127(CAS编号9003-11-6)。
在一些实施方案中，药物组合物被制备为适于局部给药的制剂。适于局部给药的制剂是本领域技术人员众所周知的。这样的制剂适用于例如受试者的眼睛、皮肤或病变。贴剂、角膜防护罩(请参阅US 5,185,152)和眼科溶液(请参阅US 5,710,182)和软膏例如眼药水的使用也在本领域的技术范围内。药物制剂也可以使用无针注射装置(例如可从Bioject，Inc.获得的Biojector 2000无针注射管理系统(Biojector 2000Needle-FreeInjection Management
Figure BDA0002646560100000171
))进行非侵入性的给药。
加药剂量
本领域普通技术人员将理解，本发明描述的药物组合物中提供的一种或多种重组非复制型腺病毒的合适的治疗有效量将取决于诸如待表达的特定生物治疗剂、重组腺病毒的细胞转导特性、疾病的阶段、需要治疗的受试者或宿主的特性(例如体重)以及要治疗的特定疾病类型的特性等因素，但是仍然可以通过本领域已知的以下方式根据围绕病例的特定情况，包括例如给药途径，所治疗的疾病和所治疗的受试者来确定。所需剂量可以方便地以单剂量或同时(或在短时间段内)或以适当的间隔例如以每天两次、三次、四次或更多次亚剂量给药的分剂量进行给药。
本领域技术人员将理解，可以根据多种因素来改变治疗寻求缓解疾病的剂量方案。这些因素包括所使用的治疗剂的特定组合，受试者所患有的疾病类型和阶段以及受试者的年龄、体重、性别、饮食和医学状况。
本发明所述的药物组合物可包含一定范围的病毒滴度，表示为50％组织培养物感染剂量(TCID50)/ml和/或病毒颗粒(vp)/ml，具体取决于包括待治疗的疾病、待治疗的受试者、所需的释放速率和所需的每剂量治疗时间在内的多种因素。在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物具有的滴度为约1×109TCID50/ml至约3×1010TCID50/ml，例如1.5×109TCID50/ml，1.8×109TCID50/ml，2.0×109TCID50/ml，3.0×109TCID50/ml，4.0×109TCID50/ml，5.0×109TCID50/ml，5.5×109TCID50/ml，6.0×109TCID50/ml，6.5×109TCID50/ml，7.0×109TCID50/ml，7.5×109TCID50/ml，8.0×109TCID50/ml，8.5×109TCID50/ml，9.0×109TCID50/ml，1.0×1010TCID50/ml，1.5×1010TCID50/ml，2.0×1010TCID50/ml，2.5×1010TCID50/ml，或另一种TCID50/ml数值，从约1×109TCID50/ml至约3×1010TCID50/ml。在一些优选的实施方案中，TCID50/ml为约4×109TCID50/ml至8×109TCID50/ml。
在一些实施方案中，vp/TCID50的当量为约20-100vp/TCID50。因此，在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物的滴度为约2×1010vp/ml至约3×1012vp/ml，例如为2×1010vp/ml，3×1010vp/ml，4×1010vp/ml，5×1010vp/ml，6×1010vp/ml，7×1010vp/ml，8×1010vp/ml，9×1010vp/ml，1×1011vp/ml，2×1011vp/ml，3×1011vp/ml，4×1011vp/ml，5×1011vp/ml，6×1011vp/ml，7×1011vp/ml，8×1011vp/ml，9×1011vp/ml，1×1012vp/ml，2×1012vp/ml，或从2×1010vp/ml至约3×1012vp/ml的另一种滴度数值。在一些优选的实施方案中，滴度从约3×1010vp/ml至约8×1011vp/ml。在其他优选的实施方案中，药物组合物的滴度为约3×1010病毒颗粒/ml至约5×1012病毒颗粒/ml.
要求保护的发明的一个特别的优势是，由于本发明的组合物导致增强的转基因表达，使得从业者可以使用较少的病毒。这不仅节省了制造成本，而且患者通常更偏向于使用尽可能低的重组病毒进行给药。较低剂量也可以帮助减少试剂的不良副作用。在一个实施方案中，一种或多种非复制型重组腺病毒在药物组合物中的治疗有效量较低，例如较未配制在药物组合物中的相同非复制型重组腺病毒的治疗有效量降低10％至90％，或降低10％至50％，或降低约5倍至约10倍。
在一些优选的实施方案中，本发明所述药物组合物的重组病毒是通过病变内给药途径进行施用。在一些实施方案中，本发明所述的药物组合物中存在的一种或多种重组非复制型腺病毒的病变内施用剂量为约1×107vp/病变至约1×1012vp/病变，例如2×107，3×107，4×107，5×107，6×107，8×107，1×108，1.5×108，2×108，3×108，4×108，6×108，8×108，9×108，1×109，2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，8×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，8×1010，9×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，8×1011，9×1011，或从约1×107vp/病变到约1×1012感染性颗粒/病变的其他数量的vp/病变。在一些优选的实施方案中，病变内的病毒剂量为约1×108vp/病灶至约1×1011vp/病灶。
在其他实施方案中，通过全身性、腹膜内或胸膜内的途径施用表达一种或多种生物治疗剂的一种或多种重组非复制腺病毒。在一些实施方案中，一种或多种重组的非复制型腺病毒的全身性、腹膜内或胸膜内的剂量为每次施用约1×108vp至约1×1013vp，例如2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，8×108，1×109，1.5×109，2×109，3×109，4×109，6×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，8×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，8×1011，9×1011，1×1012，1.5×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，8×1012，9×1012，或每次施用从约1×108vp至约1×1013vp的其他剂量。在优选的实施方案中，剂量为约1×109至约1×1012vp。
在其他实施方案中，当一种或多种重组非复制腺病毒在病变内施用时，每个治疗周期的重组病毒颗粒的总剂量为约1×108vp/病变至约1×1013vp/病变，例如为2×108，3×108，4×108，5×108，6×108，8×108，1×109，1.5×109，2×109，3×109，4×109，6×109，8×109，9×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，8×1010，1×1011，2×1011，3×1011，4×1011，5×1011，6×1011，8×1011，9×1011，1×1012，1.5×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，8×1012，9×1012或每个治疗周期的总剂量从约1×108vp/病变至约1×1013vp/病变。
在一些实施方案中，当通过全身性、腹膜内或胸膜内施用一种或多种重组非复制型腺病毒时，重组病毒在每个治疗周期的总病毒剂量为约1×109vp至约1×1014，例如为2×109，3×109，4×109，5×109，6×109，8×109，1×1010，2×1010，3×1010，4×1010，5×1010，6×1010，8×1010，9×1010，1×1011，1.5×1011，2×1011，3×1011，4×1011，6×1011，8×1011，9×1011，1×1012，2×1012，3×1012，4×1012，5×1012，6×1012，8×1012，9×1012，1×1013，2×1013，3×1013，4×1013，5×1013，6×1013，8×1013，9×1013或每个治疗周期的总剂量从约1×109vp至约1×1014颗粒的其他剂量。
在一个实施方案中，病毒是ASN-002，并且有效量，即施用于受试者的部位(例如病变)的组合物中病毒的量低于约2×1011vp，或约1010至约7×1010vp。
在一些实施方案中，在多个治疗周期中，用本发明所述的药物组合物对待治疗的受试者进行治疗。治疗周期的数目可以在1-7的范围内，例如2、3、4、5、6，或者1-7之间的其他治疗周期的数目。当在多个施用周期内对受试者进行治疗时，每个治疗周期中的总剂量的重组病毒可以在不同的治疗周期中有所不同。
在一些实施方案中，在待治疗的受试者患有基底细胞癌的情况下，该受试者的治疗周期包括在一周内进行2-3次给药。在其他实施方案中，当待治疗的受试者患有基底细胞癌时，治疗周期包括在两周内进行2-3次给药。
在受试者的状况确实得到改善的情况下，根据可靠的医疗建议，可以暂时减少或暂时中止一定时间段(例如，“治疗假期”)的剂量。治疗假期的长度可以在2天至1年之间变化，仅作为示例包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天、35天、50天或60天。在治疗假期期间病毒剂量的减少可以为10％-100％，仅作为示例包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
治疗疾病的方法
本发明还提供了一种治疗患有疾病的受试者(例如人类受试者)的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本发明所述的药物组合物。可以治疗的疾病的示例根据所使用的生物治疗剂包括但不限于癌症、囊性纤维化、纤维化、伤口愈合、自身免疫性疾病、感染、眼疾、HIV、精神病、神经系统疾病、冠心病和肌肉疾病。使用腺病毒治疗此类疾病的实例在Liu et al.(2011),Rosenfield et al.(1992),McElrath et al.(2008),Han et al.(1999),Lesch(1999),Hermens and Verhaagen(1998),Feldman et al.(1996),Petrof(1998),Dorai et al.(1999),Irie et al.(1999),Mincheff et al.(2000),Blackwellet al.(1999),Stewart et al.(1999),Batra et al.(1999)以及Vanderkwaak andAlvarez(1999)等中有所描述。
癌症
可以通过施用本发明提供的药物组合物治疗的癌症包括但不限于急性淋巴细胞白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、肛门癌、星形细胞瘤、基底细胞癌、膀胱癌、骨肿瘤、乳腺癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、宫颈癌、软骨肉瘤、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、食道癌、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、胆囊癌、胃癌、毛细胞白血病、头颈癌、肝癌、霍奇金淋巴瘤、卡波济肉瘤(Kaposisarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、口腔癌、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴瘤、骨/骨肉瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌、骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、尤因家族肿瘤(Ewing family of tumors)、子宫癌、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、睾丸癌、喉癌、甲状腺癌、甲状腺癌和子宫癌。在一些优选的实施方案中，待治疗的受试者患有选自结肠直肠癌、基底细胞癌、乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、非黑色素瘤皮肤癌、胃癌和胰腺癌的癌症。在一些实施方案中，待治疗的癌症包括一种或多种待治疗的肿瘤。
适用于各种类型的癌症的症状、诊断测试和预后测试在本领域中是已知的。参见例如美国国立综合癌症网络的网站(nccn.org/professionals/physician_gls/f_guidelines.asp)。
在一些实施方案中，通过本发明所述的方法治疗的受试者是被鉴定为患有对化学治疗剂难治或耐药的癌症的受试者。在一些实施方案中，待治疗的受试者是先前通过施用一种或多种化学治疗剂未成功被治疗癌症的受试者。在其他实施方案中，本发明所述的治疗方法还包括在治疗之前确定受试者是否患有对化学治疗剂难治或耐药的癌症。在一些实施方案中，本发明所述的治疗方法特别排除了用本发明所述的药物组合物与化学治疗剂(例如核苷酸类似物化学治疗剂)组合治疗患有癌症的受试者。
具体实施方式
实施例1-可注射的ASN-002腺病毒载体二氧化硅水凝胶储库制剂的制备和体外测 试
材料和方法
ASN-002(又称Tg1042)是一种基于基因修饰的复制缺陷型5型腺病毒载体，其中E1和E3区已缺失，该病毒经过改造以表达干扰素-γ(IFN-γ)。更具体地说，其基因组包括：
·人5型腺病毒(Ad5)的左端，包括左侧ITR、衣壳化信号和腺病毒E1a启动子的增强子；
·取代缺失的E1区的乘客基因(passenger gene)包括：
-人巨细胞病毒(pCMV)的极早期增强子/启动子区域；
-由人β-珠蛋白内含子1的供体位点和鼠IgG基因的受体和分支点组成的嵌合内含子(Int)，以提高重组基因的整体转录效率；
-编码IFNγ的cDNA序列，其一级结构与可从Genbank(参考号：V00543)中所述的RNA序列推导的结构相同。IFNg序列从有丝分裂原活化的人外周血淋巴细胞的mRNA产生的cDNA片段获得。
-来自牛生长激素(BGHpolyA)的晚期聚腺苷酸化位点，可确保转录终止；
·从核苷酸第3512位到右端的腺病毒基因组的其余部分，包括E3区的缺失。
由于ASN-002在较高温度下的稳定性有限，因此需要在-80℃下存储。
R150-400储库
用盐酸将初始摩尔比为150：1的水和正硅酸四乙酯(TEOS)混合物的pH调节至pH2，并在室温下剧烈搅拌25分钟。通过添加0.1M NaOH将溶胶的pH调节至所需的pH(6、6.5或7)。将溶胶在冰水浴中冷却，并加入所需量的ASN-002(1.5×1011vp/ml)。用水稀释溶胶，以使最终的水与TEOS之比为400:1。安慰剂微粒(见下文)以每1毫升0.5克颗粒的比例添加到溶胶中。可以使悬浮液凝胶化并用于填充注射器，或者可以用悬浮液填充注射器并使其在旋转器中凝胶化(24℃放置3天，4℃放置9天)。
R5-400储库
该储库制剂按上面的R150-400制得，但是使用的水和TEOS的摩尔比为5:1。使悬浮液在4℃下如上所述凝结12天。
安慰剂(“次级”)R5微粒
R5溶胶是使用水:TEOS以5:1的比例，并以HCl作为催化剂(pH 2)所制得。用乙醇稀释溶胶，并将pH调节至6.3。使用GeaMinor移动式小型喷雾干燥器对稀释的溶胶进行喷雾干燥。
R400水凝胶
使用水:TEOS以400:1的比例并如上所述用HCl将pH调节至2来制备R400水凝胶。用0.1M NaOH将pH调节至6、6.5或7。将混合物在冰水浴中冷却，并添加ASN-002至所需浓度。
R100-400储库
该储库制剂按上面的R150-400制得，但使用的水和TEOS的初始摩尔比为100:1，并用0.1M NaOH将pH调节至6。最终病毒含量为1.5×1011vp/ml。
分析测定
使用HPLC测定实验检测ASN-002或各种制剂中病毒颗粒的数量。使用生物惰性Agilent 1260infinity II uHPLC进行离子交换-HPLC分析，进样量为500μl(Ball etal.2010:Rapid Analysis of Adenoviruse Type 5Particles with Bio-MonilithAnion-Exchange HPLC Columns)。
ASN-002转导宿主细胞并诱导IFN-γ表达的能力通过在定量细胞因子ELISA中测定转导的H-1299细胞的IFN-γ分泌来进行检测。简而言之，将H-1299细胞在96孔细胞培养板中以恒定数量进行培养(50,000个细胞/孔)，并将ASN-002或ASN 002制剂稀释成系列的稀释液，然后添加到细胞中。所有的稀释度的计算为每个细胞数的理论病毒颗粒数。感染24小时后，将培养孔排干并用PBS洗涤，加入新鲜培养基，然后将培养板在37℃细胞培养箱中培养24小时。收集上清液，并通过ELISA检测感染细胞在24小时内产生的IFN-γ浓度。
使用HEK293T细胞检测ASN-002的感染能力和形成活病毒颗粒的能力。使用TCID50测定实验比较其感染能力。
结果
在37℃和4℃的温度下预孵育后，单独的ASN-002和与SiO2形成的制剂的稳定性
相对于在感染前未在37℃孵育的病毒而言，在感染宿主H-1299细胞之前将ASN-002病毒(3×109vp/ml)在37℃孵育长达一小时至24小时后，根据IFN-γ的释放评估可知，大多数的病毒活性有所损失(图1)。因此，ASN-002在暴露于生理温度时会迅速丧失活性。
为了确定ASN-002是否可以在高温下保持稳定，将其配制成在不同pH值的R400溶胶中，并在37℃下孵育24小时。将样品稀释至不同的vp/细胞，然后添加至H-1299细胞。如前所述检测IFN-γ的释放。如图2所示，不同的R400溶胶制剂之间没有显著差异，但是每种制剂都比未配制的病毒更具活性(与图1进行比较，见图4)。在R 400ASN-002制剂中，观察到与在感染前未在37℃孵育的相同制剂相比，在37℃的预孵育产生的活性更高(图3)。
为了评估未配制的ASN-002与配制的ASN-002的长期稳定性，发明人比较了刚解冻的ASN-002与ASN-002在4℃下保存12天的感染能力。如图5所示，ASN-002在12天的孵育期后损失了大量活性。发明人随后评估了ASN-002的R150-400和R5-400制剂在4℃的延长存储时间内是否能保持ASN-002的活性。如图6所示，这两种制剂在4℃储存7天后的ASN-002活性均显著高于对照制剂(其中ASN-002与二氧化硅微粒混合(未封装))的活性。如图7所示，当将ASN-002配制成R150-400和R5-400时，病毒活性有所增加。相对于刚解冻的(未配制的)ASN-002和预孵育的(4℃)未配制的ASN-002而言，活性均得到提高。有趣的是，甚至在ASN-002+Si-微粒对照制剂(“ASN-002+安慰剂”)中也观察到了ASN-002活性的轻微增加。
ASN-002R150-400制剂的溶出特性
在后续实验中，根据时间和估计的病毒颗粒(“vp计数”/细胞数)函数来评估ASN-002R150-400制剂的溶出度。用培养基感染细胞，其中将ASN-002R150-400制剂溶解2、3和5小时。如图8所示，在2-5小时内病毒释放趋于平稳。为了更直接地进行评估，如上所述的在1、2和4小时测定缓冲的Tris溶液中病毒颗粒的释放。如图9所示，分别在1、2和4小时释放出约62％、96％和100％的病毒颗粒。
以上数据表明，基于SiO2凝胶基质的配方可在4℃-37℃的高温下长时间保持ASN002的活性。另外，相对于未配制的ASN-002而言，这些制剂增强了ASN-002的感染能力。因此，基于SiO2-凝胶基质的制剂为ASN-002和其他重组病毒的受控和延长释放的应用(特别是在体内例如用于联合治疗癌症治疗时的应用)提供了相当大的优势。
R100-400储库制剂中配制的病毒的感染能力和IFNγ分泌
对在-80℃下储存的ASN-002参考标准品的HEK293T感染测定法中测定的病毒颗粒数(3×1011)和TCID50(6.7×109TCID50/ml)进行分析，得出vp/TCID50的比例为45(变化范围为38-75)。为了量化病毒的释放、感染和IFNγ表达的程度，将100ul具有1.5×1010vp的R100-400储库制剂的样品在室温下溶于50ml Tris-Tween缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，0.01％吐温80)中。基于vp/TCID50为45，计算得出的总感染滴度为3.3×108TCID。在5、12和24小时分析样品的vp和TCID50。
根据病毒颗粒计数和感染测定实验，很明显地观察到在24小时后，可回收到80％以上的活性和>70％的vp(图10和11)。类似地，在12小时和24小时时，IFNγ的表达水平接近最大值。在表达分析中还使用了未配制的参考ASN-002对照，图12清楚地表明，从储备制剂中释放的ASN-002比未配制的ASN-002产生了更多的IFNγ。
本领域技术人员应当理解的是，在不脱离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本实施例在任何方面都应被认为是说明性的而非限制性的。
本申请要求于2018年1月23日提交的AU2018900204的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
本申请讨论的和/或引用的所有出版物均通过引用其全文并入本发明。
本说明书中包含的对文件、法案、材料、设备、物品等的任何讨论仅是为本发明提供了上下文。不应将其视为承认任何或所有这些事项构成现有技术基础的一部分或者是在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在的与本发明相关的领域中的公知常识。
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Claims (39)

1.一种药物组合物，其包含：
(i)用于表达一种或多种生物治疗剂的一种或多种非复制型重组腺病毒；和
(ii)SiO2基质水凝胶；
其中，所述的一种或多种非复制型重组腺病毒散布在所述的SiO2基质水凝胶中，且其中所述的药物组合物不包含化学治疗剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中的一种或多种非复制型重组腺病毒的治疗有效量低于未配制在所述药物组合物中的相同的非复制型重组腺病毒的治疗有效量。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述的一种或多种生物治疗剂选自由：细胞因子、趋化因子、趋化因子激动剂、趋化因子拮抗剂、趋化因子受体拮抗剂、共刺激分子、检查点抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)和抗体组成的组。
4.如权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于，所述的一种或多种生物治疗剂选自由：干扰素γ、干扰素α、白介素12、白介素15、CD40L、Ox40L、4-1BB、ICOS-L、LIGHT、CD70、TGF-β、透明质酸酶(PH20)、CD200拮抗剂、PD1拮抗剂、PDL1拮抗剂、CTLA-4拮抗剂、LAG3拮抗剂、CD27激动剂、TGF-β拮抗剂、白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂和LAIR 1拮抗剂组成的组。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述CD200拮抗剂、所述PD1拮抗剂、所述PDL1拮抗剂、所述CTLA-4拮抗剂、所述LAG3拮抗剂、所述TGF-β拮抗剂、所述白细胞免疫球蛋白样受体拮抗剂或所述LAIR-1拮抗剂中的一种或多种为抗体。
6.如权利要求1-5任一项所述的药物组合物，其特征在于，至少一种所述的生物治疗剂为细胞因子。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述细胞因子为干扰素γ。
8.如权利要求1-7任一项所述的药物组合物，其特征在于，一种或多种非复制型重组腺病毒中的一种为ASN-002。
9.如权利要求1-8任一项所述的药物组合物，其特征在于，至少一种所述的生物治疗剂为CD40L或CD27激动剂。
10.如权利要求1-9任一项所述的药物组合物，其特征在于，与缺少所述SiO2基质水凝胶的相应药物组合物相比，至少一种所述的生物治疗剂在体内的表达更高。
11.如权利要求1-10任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种非复制型重组腺病毒包括第一非复制型重组腺病毒和第二非复制型重组腺病毒，其各自用于表达不同的生物治疗剂。
12.如权利要求1-11任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述SiO2基体水凝胶包含水和正硅酸四乙酯(TEOS)，两者的最终摩尔比为约5:1至约4,000:1。
13.如权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述水和TEOS的摩尔比为约400:1。
14.如权利要求1-13任一项所述的药物组合物，其包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂包括一种或多种多元醇。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种多元醇选自由蔗糖、甘露醇、乙醇、海藻糖、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇组成的组。
17.如权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种多元醇包括蔗糖和乙醇。
18.如权利要求16所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种多元醇包括甘油和蔗糖。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂包括甘油、蔗糖、磷酸盐缓冲液、NaCl和MgCl2。
20.如权利要求14-19任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂还包含一种或多种去污剂。
21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种去污剂选自由聚氧乙烯(20)山梨糖醇单油酸酯(聚山梨酯80)、聚乙二醇山梨糖醇单棕榈酸酯(聚山梨酯40)、聚氧乙烯(20)山梨醇单月桂酸酯(聚山梨脂20)和3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸酯组成的组。
22.如权利要求21所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种去污剂包括聚山梨酯80。
23.如权利要求14-22任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂还包含一种或多种抗氧化剂。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述抗氧化剂选自由组氨酸、三乙醇胺(TEOA)、柠檬酸盐和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的组。
25.如权利要求24所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种抗氧化剂包括EDTA和组氨酸。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其特征在于，所述一种或多种药学上可接受的赋形剂包括蔗糖、乙醇、EDTA、组氨酸、聚山梨酯80、NaCl和MgCl2。
27.如权利要求1-26任一项所述的药物组合物，其特征在于，当将所述的药物组合物在约4℃下保持约12个月至约24个月时，所述一种或多种非复制型重组腺病毒保留其至少约50％至约75％的感染能力。
28.如权利要求1-27任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为储库制剂。
29.如权利要求1-28任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含约1×1010个病毒颗粒/ml至约5×1012个病毒颗粒/ml。
30.一种用于治疗患有疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-29任一项所述的药物组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述疾病为癌症。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述癌症选自由基底细胞癌、鳞状细胞癌、结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌和胰腺癌组成的组。
33.如权利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述癌症包括一种或多种病变或肿瘤。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，将所述药物组合物注射至至少一种所述的一种或多种病变或肿瘤。
35.如权利要求32-34任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症为基底细胞癌或鳞状细胞癌。
36.如权利要求1-29任一项所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
37.如权利要求1-29任一项所述的药物组合物，其用于治疗疾病。
38.治疗有效量的如权利要求1-29任一项所述的药物组合物在治疗患有疾病的受试者中的用途。
39.(i)用于表达一种或多种生物治疗剂的一种或多种非复制型重组腺病毒；和
(ii)SiO2基质水凝胶；
在制备用于治疗患有疾病的受试者的药物中的用途，其中所述的一种或多种非复制型重组腺病毒散布在所述的SiO2基质水凝胶中，且其中所述的药物组合物不包含化学治疗剂。
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