JP2023053298A - 組み換えウイルスを産生するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、その全体において参照により本明細書に援用される、2017年4月10日に出願された米国仮特許出願第62/483,837号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
本発明の分野は、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法に関する。
癌を引き起こす基礎になる分子機構の広い知識に関わらず、ほとんどの進行した癌は、現在の化学療法および放射線プロトコルでは不治のままである。腫瘍崩壊性ウイルスは、種々の悪性疾患についての現在の標準的な治療を有意に増強させる可能性を有する基盤技術として明らかになっている(非特許文献1; 非特許文献2; 非特許文献3)。これらのウイルスは、感染-再生(reproduction)-溶解の一続きの反応により悪性細胞を直接的に破壊するだけでなく、抗腫瘍免疫を間接的に誘導もする腫瘍崩壊性剤としての将来性を示している。これらの免疫刺激特性は、ウイルスが複製するごとにコピーされて発現される治療的トランスジーンの挿入により高められる。
本発明は部分的に、A549宿主細胞、例えばSF-BMAdR 281 A549宿主細胞を、多くの組み換えウイルス、例えば腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するために使用し得るという発見に基づく。驚くべきことに、特定の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、血清非含有および懸濁適合性(suspension-adapted) A549細胞中、複製を許容する環境において、ウイルスベクター産生に広く使用されるHEK293細胞よりも高密度で増殖することが見出された。
項1
(a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程、または組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をA549宿主細胞に導入する工程;および
(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法であって、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、E1aタンパク質コーディング領域に操作可能に連結されたE1aプロモーターを含む、方法。
項2
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、項1記載の方法。
項3
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、項1または2記載の方法。
項4
A549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、項1~3いずれか一項記載の方法。
項5
工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、項1~4いずれか一項記載の方法。
項6
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がA549宿主細胞を溶解することを含む、項5記載の方法。
項7
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、項5または6記載の方法。
項8
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、項5~7いずれか一項記載の方法。
項9
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること;
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること;および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、項8記載の方法。
項10
工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をHEK293宿主に導入する工程、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養する工程;
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程;および/または
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程
を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項2~9いずれか一項記載の方法。
項11
E1aプロモーターが、機能性Pea3結合部位の欠失を有し、欠失が、任意に、E1aの開始部位の約-300~約-250上流に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の195~244に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/または任意に、E1aプロモーターが配列GGTGTTTTGG (配列番号:2)を含む、項2~10いずれか一項記載の方法。
項12
E1aプロモーターが、機能性TATAボックスの欠失を有し、任意に、欠失がTATAボックス全体の欠失、E1aプロモーターの-27~-24に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の472~475に対応するヌクレオチドの欠失、Ad5ゲノム(配列番号:1)の455~552に対応するヌクレオチドの欠失またはAd5ゲノム(配列番号:1)の353~552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項2~11いずれか一項記載の方法。
項13
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号:3)、AGTGCCCG (配列番号:8)および/またはTATTCCCG (配列番号:9)を含むウイルスを生じるE1aプロモーターTATAボックスのポリヌクレオチド欠失を含む、項2~12いずれか一項記載の方法。
項14
E1aプロモーターが、機能性CAATボックスの欠失を有し、任意に、欠失が、CAATボックス全体の欠失、E1aプロモーターの-76~-68に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の423~431に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/または任意に、E1aプロモーターが、配列TTCCGTGGCG (配列番号:10)を含む、項2~13いずれか一項記載の方法。
項15
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み、任意に、トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択されるポリペプチドをコードする、項2~14いずれか一項記載の方法。
項16
ヌクレオチド配列がE1b-19K挿入部位に挿入され、E1b-19K挿入部位がE1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置され、任意に、E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失、Ad5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1917に対応する欠失もしくはAd5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1916に対応する欠失を含み、任意に、トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号:1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間もしくは1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間もしくはCTGACCTC (配列番号:4)とTCACCAGG (配列番号:5)の間に挿入され、および/または任意に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、5'~3'の方向で、CTGACCTC (配列番号:4)、トランスジーンおよびTCACCAGG (配列番号:5)を含む、項15記載の方法。
項17
トランスジーンが外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない、および/または組み換えウイルスが、過増殖性細胞においてトランスジーンを選択的に発現する、項15または16記載の方法。
項18
組み換えウイルスが過増殖性細胞において選択的に複製する、項1~17いずれか一項記載の方法。
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
本発明は部分的に、A549宿主細胞、例えばSF-BMAdR 281 A549宿主細胞を、多くの組み換えウイルス、例えば腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するために使用し得るという発見に基づく。驚くべきことに、特定の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、血清非含有および懸濁適合性A549細胞中、複製を許容する環境において、ウイルスベクター産生に広く使用されるHEK293細胞よりも高い密度まで、増殖することが見出された。
用語「ウイルス」は、タンパク質合成機構またはエネルギー生成機構を有さない偏性細胞内寄生体のいずれかをいうために本明細書において使用される。ウイルスのゲノムはRNAまたはDNAであり得る。組み換えにより改変されたウイルスは、本明細書において「組み換えウイルス」と称される。組み換えウイルスは、例えば複製欠陥、条件的複製もしくは複製コンピテントとなるように組み換えDNA技術により改変され得るか、および/または外来性トランスジーンの発現を含むように組み換えDNA技術により改変され得る。親ベクターの特性のそれぞれの有利な要素を利用するキメラウイルスベクター(例えばFeng et al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870参照)も、本発明の実施に有用であり得る。治療される種由来のウイルスを使用することが一般的に好ましいが、ある例において、好ましい病原性特徴を有する異なる種由来のベクターを使用することが有利であり得る。
本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、治療的トランスジーンをコードする外来性ヌクレオチド配列を含み得る。用語「トランスジーン」は、外来性遺伝子またはポリヌクレオチド配列をいう。用語「治療的トランスジーン」は、ウイルス内で複製および/またはウイルスにより発現された場合に標的細胞、体液、組織、臓器、生理学系または被験体において治療的効果を付与するトランスジーンをいう。
治療的使用のために、本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、好ましくは薬学的に許容可能な担体と合わされる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を有さず、妥当な利益/リスク比と釣り合ったヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切なバッファ、担体および賦形剤を意味する。担体(1つまたは複数)は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能である」べきである。薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与に適合性であるバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。
組み換えウイルス、例えば本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、種々の医学的徴候、例えば癌を治療するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること;および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)、およびより好ましくはヒトが挙げられる。
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することを意図しない。
この実施例には、A549細胞における組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生が記載される。
この実施例には、HEK-293由来細胞と比較したA549由来細胞における組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生が記載される。
本明細書に参照される特許文献および科学論文のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての局面において本明細書に記載される発明の限定ではなく例示とみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明に含まれることが意図される。
項1
(a)A549宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程;および
(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養し、それにより組み換えウイルスを産生する工程
を含む、組み換えウイルスを産生するための方法。
項2
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、項1記載の方法。
項3
感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、項1または2記載の方法。
項4
工程(b)の後に、組み換えウイルスを精製する工程をさらに含む、項1~3いずれか一項記載の方法。
項5
組み換えウイルスを精製する工程が、感染したA549宿主細胞を溶解することを含む、項4記載の方法。
項6
組み換えウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、項4または5記載の方法。
項7
組み換えウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、項4~6いずれか一項記載の方法。
項8
組み換えウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること;
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること;および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、項4記載の方法。
項9
工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて感染したHEK293宿主細胞を産生する工程、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、項1~8いずれか一項記載の方法。
項10
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、項1~9いずれか一項記載の方法。
項11
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、項1~10いずれか一項記載の方法。
項12
組み換えウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、項1~10いずれか一項記載の方法。
項13
アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、項12記載の方法。
項14
組み換えウイルスが組み換え腫瘍崩壊性ウイルスである、項1~13いずれか一項記載の方法。
項15
(a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程;および
(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法。
項16
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、項15記載の方法。
項17
感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、項15または16記載の方法。
項18
工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、項15~17いずれか一項記載の方法。
項19
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が感染したA549宿主細胞を溶解することを含む、項18記載の方法。
項20
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、項18または19記載の方法。
項21
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、項18~20いずれか一項記載の方法。
項22
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること;
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること;および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、項21記載の方法。
項23
工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したHEK293宿主細胞を産生する工程、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項15~22いずれか一項記載の方法。
項24
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項15~23いずれか一項記載の方法。
項25
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項15~24いずれか一項記載の方法。
項26
(a)組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をA549宿主細胞に導入する工程;および
(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法。
項27
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、項26記載の方法。
項28
A549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、項26また27記載の方法。
項29
工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、項26~28いずれか一項記載の方法。
項30
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がA549宿主細胞を溶解することを含む、項29記載の方法。
項31
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、項29または30記載の方法。
項32
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、項29~31いずれか一項記載の方法。
項33
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること;
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること;および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、項32記載の方法。
項34
工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をHEK293宿主に導入する工程、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項26~33いずれか一項記載の方法。
項35
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項26~34いずれか一項記載の方法。
項36
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、項26~35いずれか一項記載の方法。
項37
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、項14~36いずれか一項記載の方法。
項38
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性Pea3結合部位の欠失を有するE1aプロモーターを含む、項14~37いずれか一項記載の方法。
項39
欠失が、E1aの開始部位の約-300~約-250上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項38記載の方法。
項40
欠失が、E1aの開始部位の-305~-255上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項38または39記載の方法。
項41
欠失が、E1aの開始部位の-304~-255上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項38または39記載の方法。
項42
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の195~244に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項38~41いずれか一項記載の方法。
項43
E1aプロモーターが配列GGTGTTTTGG (配列番号:2)を含む、項38~42いずれか一項記載の方法。
項44
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性TATAボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、項14~43いずれか一項記載の方法。
項45
欠失がTATAボックス全体の欠失を含む、項44記載の方法。
項46
欠失が、E1aプロモーターの-27~-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項44または45記載の方法。
項47
欠失が、E1aプロモーターの-31~-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項46記載の方法。
項48
欠失が、E1aプロモーターの-44~+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項47記載の方法。
項49
欠失が、E1aプロモーターの-146~+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項48記載の方法。
項50
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の472~475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項44~49いずれか一項記載の方法。
項51
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の468~475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項50記載の方法。
項52
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の455~552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項51記載の方法。
項53
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の353~552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項52記載の方法。
項54
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号:3)、AGTGCCCG (配列番号:8)および/またはTATTCCCG (配列番号:9)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、項14~53いずれか一項記載の方法。
項55
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号:3)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、項54記載の方法。
項56
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性CAATボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、項14~55いずれか一項記載の方法。
項57
欠失が、CAATボックス全体の欠失を含む、項56記載の方法。
項58
欠失が、E1aプロモーターの-76~-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項56または57記載の方法。
項59
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号:1)の423~431に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項56~58いずれか一項記載の方法。
項60
E1aプロモーターが、配列TTCCGTGGCG (配列番号:10)を含む、項56~59いずれか一項記載の方法。
項61
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含む、項14~60いずれか一項記載の方法。
項62
ヌクレオチド配列がE1b-19K挿入部位に挿入され、E1b-19K挿入部位がE1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される、項61記載の方法。
項63
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失を含む、項65記載の方法。
項64
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する202ヌクレオチドの欠失を含む、項62または63記載の方法。
項65
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する203ヌクレオチドの欠失を含む、項62または63記載の方法。
項66
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1917に対応する欠失を含む、項62~65いずれか一項記載の方法。
項67
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1916に対応する欠失を含む、項62~65いずれか一項記載の方法。
項68
トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号:1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間に挿入される、項62~67いずれか一項記載の方法。
項69
トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号:1)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される、項62~67いずれか一項記載の方法。
項70
トランスジーンがCTGACCTC (配列番号:4)とTCACCAGG (配列番号:5)の間に挿入される、項62~69いずれか一項記載の方法。
項71
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、5'~3'の方向で、CTGACCTC (配列番号:4)、トランスジーンおよびTCACCAGG (配列番号:5)を含む、項62~70いずれか一項記載の方法。
項72
トランスジーンが外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない、項61~71いずれか一項記載の方法。
項73
トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択されるポリペプチドをコードする、項61~72いずれか一項記載の方法。
項74
組み換えウイルスが過増殖性細胞において選択的に複製する、項1~73いずれか一項記載の方法。
項75
組み換えウイルスが、過増殖性細胞においてトランスジーンを選択的に発現する、項61~74いずれか一項記載の方法。
Claims (18)
- (a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程、または組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をA549宿主細胞に導入する工程;および
(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法であって、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、E1aタンパク質コーディング領域に操作可能に連結されたE1aプロモーターを含む、方法。 - 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項1記載の方法。
- A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、請求項1または2記載の方法。
- A549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、請求項1~3いずれか一項記載の方法。
- 工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、請求項1~4いずれか一項記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がA549宿主細胞を溶解することを含む、請求項5記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、請求項5または6記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項5~7いずれか一項記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること;
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること;および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、請求項8記載の方法。 - 工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をHEK293宿主に導入する工程、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養する工程;
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程;および/または
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程
を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項2~9いずれか一項記載の方法。 - E1aプロモーターが、機能性Pea3結合部位の欠失を有し、欠失が、任意に、E1aの開始部位の約-300~約-250上流に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の195~244に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/または任意に、E1aプロモーターが配列GGTGTTTTGG (配列番号:2)を含む、請求項2~10いずれか一項記載の方法。
- E1aプロモーターが、機能性TATAボックスの欠失を有し、任意に、欠失がTATAボックス全体の欠失、E1aプロモーターの-27~-24に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の472~475に対応するヌクレオチドの欠失、Ad5ゲノム(配列番号:1)の455~552に対応するヌクレオチドの欠失またはAd5ゲノム(配列番号:1)の353~552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項2~11いずれか一項記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号:3)、AGTGCCCG (配列番号:8)および/またはTATTCCCG (配列番号:9)を含むウイルスを生じるE1aプロモーターTATAボックスのポリヌクレオチド欠失を含む、請求項2~12いずれか一項記載の方法。
- E1aプロモーターが、機能性CAATボックスの欠失を有し、任意に、欠失が、CAATボックス全体の欠失、E1aプロモーターの-76~-68に対応するヌクレオチドの欠失および/またはAd5ゲノム(配列番号:1)の423~431に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/または任意に、E1aプロモーターが、配列TTCCGTGGCG (配列番号:10)を含む、請求項2~13いずれか一項記載の方法。
- 組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み、任意に、トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択されるポリペプチドをコードする、請求項2~14いずれか一項記載の方法。
- ヌクレオチド配列がE1b-19K挿入部位に挿入され、E1b-19K挿入部位がE1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置され、任意に、E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失、Ad5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1917に対応する欠失もしくはAd5ゲノム(配列番号:1)のヌクレオチド1714~1916に対応する欠失を含み、任意に、トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号:1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間もしくは1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間もしくはCTGACCTC (配列番号:4)とTCACCAGG (配列番号:5)の間に挿入され、および/または任意に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、5'~3'の方向で、CTGACCTC (配列番号:4)、トランスジーンおよびTCACCAGG (配列番号:5)を含む、請求項15記載の方法。
- トランスジーンが外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない、および/または組み換えウイルスが、過増殖性細胞においてトランスジーンを選択的に発現する、請求項15または16記載の方法。
- 組み換えウイルスが過増殖性細胞において選択的に複製する、請求項1~17いずれか一項記載の方法。
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