JP2023509966A - 腫瘍溶解性ウイルス様小胞の組成物および使用方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を産生する高力価ハイブリッドウイルスベクター、ならびに悪性腫瘍または感染性疾患を標的にするための組成物およびその方法に関する。ＶＬＶは、インビトロで進化したセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼと、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質をコードする、プラス鎖キャップポリアデニル化ＲＮＡを有する、キャプシドを含まない自己複製人工ウイルスプラットフォームである。本発明のＶＬＶおよびその医薬組成物は、悪性腫瘍および感染性疾患の処置、予防および防止のための方法において有用なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド治療薬をコードする。

Description

関連出願への相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０２０年１月１０日付で出願された米国特許仮出願第６２／９５９，４３５号に基づく利益を主張し、その内容は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
配列表

本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されており、これによりその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩのコピーは、２０２１年１月７日に作成されており、名称は２５１３３－８－１０４３８４－１０１＿ＳＬ．ｔｘｔ、サイズは５１，５５４バイトである。

発明の分野
本発明は、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を産生する高力価ハイブリッドウイルスベクター、ならびに悪性腫瘍または感染性疾患を標的にするための組成物およびその方法に関する。ＶＬＶは、インビトロで進化したセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼと、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質をコードする、プラス鎖キャップポリアデニル化ＲＮＡを有する、キャプシドを含まない自己複製人工ウイルスプラットフォームである。本発明のＶＬＶおよびその医薬組成物は、悪性腫瘍および感染性疾患の処置、予防および防止のための方法において有用なポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド治療薬をコードする。

発明の背景
腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を標的として癌細胞で特異的に複製し、癌細胞の溶解および／または死滅をもたらすことができる。これらのウイルスは、ウイルスを癌細胞に向けたり、Ｔ細胞の浸潤または活性を活性化する可能性を高めたり、腫瘍溶解を促進する他の複数の活性を注入したりする導入遺伝子を発現することができる。

多くの形態の腫瘍溶解性ウイルスが構成され、臨床試験されている。しかし、医療用途で承認されている腫瘍溶解性ウイルスは１つだけである。それは、タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ－ＶＥＣ）という、悪性黒色腫に使用するための導入遺伝子である顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を発現する遺伝子組み換えヘルペスウイルスである。残念ながら、Ｔ－ＶＥＣは、その活性が限定的であるため、商業的な成功はわずかであった。Ｔ－ＶＥＣおよび他の多くの種類の腫瘍溶解性ウイルスが成功しないのは、次の複数の要因による可能性が高い：
－中和抗体免疫がすでに存在する；
－自然免疫経路（補体、インターフェロン経路）を介するクリアランスが迅速である；
－導入遺伝子の発現によりウイルスの複製能力が低下する；
－導入遺伝子発現によりウイルスの免疫クリアランスが促進される；
－腫瘍に十分な自然免疫応答を誘導できない；
－１または複数の導入遺伝子を追加する能力に制限がある；
－病原性が高いままである；
－大規模な製造が困難である。

腫瘍溶解活性に使用されているウイルスには、パロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（上記のＴ－ＶＥＣで）、ポックスウイルス、ピコルノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、およびレオウイルスが含まれる。しかし、これらの種類のウイルスはそれぞれ、成功を妨げる１またはそれを超える上記の欠点がある。

ウイルス様小胞（ＶＬＶ）は、インビトロで進化したセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼと、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質をコードするプラス鎖キャップポリアデニル化ＲＮＡを有する、キャプシドを含まない自己複製人工ウイルスプラットフォームである。ＶＬＶは、天然のウイルスベクターが抱える多くの欠点を克服することができる。コードされたキャプシドタンパク質を欠く人工ウイルスとして、ＶＬＶは非病原性である。キャプシドタンパク質がないことにより、ＶＬＶにパッケージされるＲＮＡのサイズの制限も回避されるため、ＲＮＡのパッケージ化と導入遺伝子の抗原またはタンパク質の発現のための非常に大きな容量が可能になる。ヒト集団に固有ではない動物ウイルスに由来しているため、既存の中和免疫はまれであるか、存在しない可能性が高い。ＶＬＶは高力価まで成長させることができ、大規模な製造が可能になる。ＶＬＶのこれらの特徴は、腫瘍溶解性ウイルスに理想的である。

２０１８年６月５日に発行され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｋらによる米国特許第９，９８７，３５３号は、高力価ハイブリッドＢ型肝炎ウイルスベクターから産生されるＶＬＶ組成物を使用する慢性Ｂ型肝炎の処置のための治療免疫のための組成物および方法に関する。

２０１９年１０月８日に発行され、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｓｅらによる米国特許第１０，４３５，７１２号は、高力価ハイブリッドウイルスベクターを使用する免疫化のための組成物および方法に関する。進化したＶＬＶ組成物をその中で産生する高力価ハイブリッドウイルスベクターは、複数の変異を有するアルファウイルス非構造タンパク質を含む。

米国特許第９，９８７，３５３号明細書 米国特許第１０，４３５，７１２号明細書

発明の要旨
一部の実施形態では、本発明は、以下の動作可能に連結された配列要素：
ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
ｄ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む第４のＤＮＡ配列、
ｅ）ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする第５のＤＮＡ配列、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第１のＤＮＡ配列のＤＮＡプロモーター配列が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの構成的プロモーターを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ＤＮＡプロモーター配列が、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの構成的プロモーターを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第２のＤＮＡ配列のアルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列が、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列である、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第２のＤＮＡ配列によりコードされるＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が１またはそれを超えるアミノ酸変異を含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が配列番号１３に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が配列番号１３を含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第２のＤＮＡ配列のアルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列がアルファウイルスＲＮＡ依存性ポリメラーゼを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、アルファウイルスＲＮＡ依存性ポリメラーゼが、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ依存性ポリメラーゼである、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第３のＤＮＡ配列のアルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターが、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）サブゲノムＲＮＡプロモーターである、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１７、Ｆｌｔ３Ｌ、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択されるサイトカインアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列ドメインを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９０、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択されるｓｈＲＮＡポリヌクレオチドチェックポイント阻害剤をコードする少なくとも１つの配列ドメインを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が３つの配列ドメインを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が以下：
ａ）ＩＬ－１２をコードする配列ドメイン、
ｂ）ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードする配列ドメイン；および
ｃ）ＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡをコードする配列ドメイン、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が以下：
ａ）配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、
ｂ）配列番号８と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン；および
ｃ）配列番号１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列の各配列ドメインの前に、サブゲノムプロモーター、２Ａペプチド配列をコードする配列、またはそれらの組合せからなる群から独立して選択される配列がある、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、高力価ハイブリッドウイルスベクターが三価であり；第４のＤＮＡ配列が、３つの配列ドメインからなる、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が以下：
ａ）サブゲノムプロモーター配列と、ＩＬ－１２をコードする配列ドメイン、
ｂ）サブゲノムプロモーター配列と、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードする配列ドメイン；および
ｃ）サブゲノムプロモーター配列と、ＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡをコードする配列ドメイン、からなる悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が以下：
ａ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、
ｂ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号８と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン；および
ｃ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、からなる悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列が、ＴＤＯ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫抑制調節因子のポリヌクレオチドまたはポリペプチド阻害剤をコードする配列ドメインをさらに含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列の配列ドメインのそれぞれが、単一または複数のサブゲノムプロモーターの制御下で発現し、単一または複数のサブゲノムＲＮＡをもたらす、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第４のＤＮＡ配列の配列ドメインのそれぞれが、リボソームスキッピング２Ａペプチドを含む共通サブゲノムＲＮＡから同時翻訳される、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍または感染性疾患の単一または複数の特異的抗原を発現する発現カセットを含む第６のＤＮＡ配列をさらに含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関し；そして

一部の実施形態では、本発明は、発現カセットが腫瘍または感染病原体の特異的抗原を発現して、その抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答を誘導する、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、第５のＤＮＡ配列のベシクロウイルス糖タンパク質が、水疱性口内炎インディアナウイルス、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス、チャンディプラウイルスまたは構造的に関連するベシクロウイルスのエンベロープ糖タンパク質を含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）１ｍＬあたり少なくとも５×１０^７個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価が得られる、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）１ｍＬあたり少なくとも１×１０^８個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価が得られる、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、以下の動作可能に連結された配列要素：
ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
ｄ）悪性腫瘍または感染性疾患の単一または複数の特異的抗原を発現する発現カセットを含む第４のＤＮＡ配列；および
ｅ）ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする第５のＤＮＡ配列、を含む腫瘍溶解性ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を生成するための高力価ハイブリッドウイルスベクターに関する。

一部の実施形態では、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を生成するための高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生成されるレプリコンＲＮＡを含有するウイルス様小胞（ＶＬＶ）に関する。

一部の実施形態では、本発明は、腫瘍溶解性ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を生成するための高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生成されるレプリコンＲＮＡを含有するウイルス様小胞（ＶＬＶ）に関し、該レプリコンＲＮＡはプラス鎖キャップされポリアデニル化されている。

一部の実施形態では、本発明は、以下の動作可能に連結された配列要素：
ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
ｄ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む第４のＤＮＡ配列、
ｅ）ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする第５のＤＮＡ配列、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物に関する。

本発明の一部の実施形態では、ＶＬＶは自己複製する。

本発明の一部の実施形態では、ＶＬＶは腫瘍溶解性である。

本発明の一部の実施形態では、ＶＬＶはキャプシドを含まない。

一部の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のためのウイルス様小胞（ＶＬＶ）を産生する方法に関する：
ａ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む高力価ウイルスベクターを生成するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）の高力価ウイルスベクターでＢＨＫ－２１細胞をトランスフェクトするステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）のトランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞を緩衝液中で適切な時間および適切な温度でインキュベートしてＶＬＶを増殖させるステップ；および
ｄ）限外濾過、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、およびそれらの組合せからなる群から選択される技術によって、ＶＬＶをＢＨＫ－２１細胞および緩衝液から単離するステップ；
ここで、ステップ（ｄ）の単離は、高力価のＶＬＶをもたらす。

一部の実施形態では、本発明は、対象の悪性腫瘍を処置および防止する方法に関し、この方法は、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む治療有効量の組成物を、それと必要とする哺乳動物またはヒト対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、感染性疾患を有する対象を処置する方法に関し、この方法は、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む治療有効量の組成物を、それと必要とする哺乳動物またはヒト対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、感染性疾患に対して対象を免疫する方法に関し、この方法は、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む治療有効量の組成物を、それと必要とする哺乳動物またはヒト対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍に関連する遺伝子をダウンレギュレートする方法に関し、この方法は、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む治療有効量の組成物を、それと必要とする哺乳動物またはヒト対象に投与することを含む。

一部の実施形態では、本発明は、悪性腫瘍に関連する遺伝子をダウンレギュレートする方法に関し、この方法は、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む治療有効量の組成物を、それと必要とする哺乳動物またはヒト対象に投与することを含み、ここで、遺伝子は、ＰＤ－Ｌ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、およびそれらの組合せからなる群から選択される。

一部の実施形態では、本発明は、必要とする哺乳動物対象がヒトまたは動物である方法に関する。

一部の実施形態では、本発明は、必要とする哺乳動物またはヒト対象における悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための薬物の製造における組成物の使用に関し、前記組成物は、以下の動作可能に連結された配列要素：
ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
ｄ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む第４のＤＮＡ配列、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されたウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物である。
図面の簡単な説明

図１。様々な化学療法抵抗性の癌株（マウスまたはヒト由来）にＶＬＶを感染させると、＞７０％の細胞が死滅する（図１Ａ）。図１Ｂは、ＭＮ６０、ＲＥＨおよびＲＳ４，１１の数種類の急性リンパ芽球性白血病Ｂ型（Ｂ－ＡＬＬ）癌細胞株に対するＶＬＶの腫瘍溶解作用を示す。データにより、ＶＬＶは、より悪性度が高く低分化の細胞に対してより高い腫瘍溶解活性を有することが示されているように、ＶＬＶは、これらの白血病細胞の異なる段階を異なる効力で死滅させることができる。図１Ｃは、通常のＢ細胞と、それぞれが発現する分化マーカーで標識された異なる癌細胞株を表示する。 同上。

図２。癌細胞株（Ｌ９２９ネズミ線維肉腫細胞）または「正常な」（すなわち、非癌性）ネズミ線維芽細胞細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）のＶＬＶ感染の比較は、感染した癌細胞の選択的死滅を示している。図２Ａは、ＶＬＶを感染多重度（ＭＯＩ）１および１０で含むまたは含まない、２４時間後のＬ９２９癌細胞の顕微鏡写真を示す。図２Ｂは、ＶＬＶをＭＯＩ１および１０で含むまたは含まない、２４時間後の正常な３Ｔ３細胞株の顕微鏡写真を示す。図２Ｃは、ＡおよびＢの顕微鏡写真データのグラフ表示を示す。 同上。

図３。ＶＬＶは、アポトーシスによる癌細胞の細胞死を引き起こす。アポトーシスカスケード内のタンパク質は、示されたタンパク質の抗体を用いるウエスタンブロットで検出された。

図４。ＶＬＶは、インビトロでＩＬ－１２を発現することができる。図４Ａは、ＤＮＡプロモーター（ＰＲＯ）、セムリキ森林熱ウイルス非構造タンパク質（ＳＦＶ ｎｓｐ１～４）をコードする配列、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）をコードする配列、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ－Ｇ）をコードする配列、ＳＧＰをコードする配列、およびＩＬ－１２をコードする配列を含む、ＩＬ－１２導入遺伝子を含むＶＬＶ（ＤＰ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１２）の配列概略図を示す。図４Ｃは、非感染細胞と比較した、ＶＬＶ－ＩＬ－１２感染ＢＨＫ２１細胞からの細胞上清の抗ＩＬ－１２抗体のウエスタンブロットを示し、ＶＬＶ－ＩＬ－１２から発現したＩＬ－１２が分泌され可溶性であることを実証する。

図５。担癌マウスに接種されたＶＬＶ－ＩＬ－１２は、腫瘍体積の制限をもたらす。シンジェニックマウス系統に皮下移植されたＭＣ３８細胞は、マウスの皮下で腫瘍を成長させる。担癌マウスにＶＬＶ－ＩＬ－１２を接種すると、腫瘍の成長が制限されるが、ＰＢＳ（コントロール）を接種したマウスでは、予想したサイズの大きな腫瘍が生成された。ＩＬ－１２導入遺伝子を有するＶＬＶの配列概略図を図４Ａに示す。図５Ａは、実験デザインと時間軸の概略図を示す。図５Ｂは、実験の経時的な腫瘍体積のグラフ表示である。アスタリスクは、統計的有意性（Ｐ＜０．０５）を示す。

図６。ＶＬＶは、インビトロでＩＬ－１７ＲＡを発現することができる。図６Ａは、ＢＨＫ２１細胞でＩＬ－１７ＲＡ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を発現する、ＩＬ－１７ＲＡ導入遺伝子を有するＶＬＶ（ＤＰ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１７ＲＡ）の模式図を示す。図６Ｂは、抗ＩＬ－１７ウエスタンブロッティングによって検出されるように、ＩＬ－１７ＲＡがインビトロで発現され得ることを示す。

図７。ＶＬＶは、トランスフェクトした細胞でＰＤ－Ｌ１の発現を低下させるｓｈＲＮＡを産生することができる。図７Ａは、ＶＬＶ－ＰＤ－Ｌ１ｓｈＲＮＡの４つの異なる構築物の模式図を示す。図７Ｂ）は、ＰＤ－Ｌ１トランスフェクト細胞からのライセートの抗ＰＤ－Ｌ１ウエスタンブロッティングを示す。図７Ｃは、図７Ｂのウエスタンブロットデータのグラフ表示を示す。

図８。ＣＡＲＧ－２０２０を含む三価のＶＬＶは、コード化された導入遺伝子ポリペプチドおよびｓｈＲＮＡを産生する。図８Ａは、３つの成分：ＩＬ－１２、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ、およびＰＤ－Ｌ１ｓｈＲＮＡを発現することのできる三価のＶＬＶ（すなわち、ＣＡＲＧ－２０２０）の模式図を示す。この文脈で複数のサブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）を使用することは新しいことである。図８Ｂは、ＢＨＫ－２１細胞の感染後のＩＬ－１２、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ、およびＶＳＶ－Ｇ ポリペプチドの各々の発現を実証するウエスタンブロットを示す。図８Ｃは、ＰＤＬ１ ｓｈＲＮＡをコードする配列を含む三価のＶＬＶ（ＣＡＲＧ－２０２０）と比較した、ＰＤＬ１ ｓｈＲＮＡをコードする配列を含まないＶＬＶ－ＩＬ－１２で処置した動物について、ＭＣ３８同系ＣＲＣマウスモデルで検出された相対的ＰＤＬ１ ｍＲＮＡのインビボ比較を示す。ＣＡＲＧ－２０２０によるＰＤＬ１のダウンレギュレーションは、ｓｈＲＮＡの産生および機能を示す。 同上。

図９。三価のＶＬＶは、腫瘍体積の抑制に効果的である。図９Ａは、実験デザインと時間軸の概略図を示す。ＭＣ３８腫瘍をマウスの脇腹の皮膚に移植した。ＧＦＰ、ＩＬ－１２またはＣＡＲＧ２０２０を有するＶＬＶを示された間隔で１回あたり５×１０^７個の粒子で腫瘍内注射した。図９Ｂは、腫瘍接種降の日数の関数としての腫瘍体積を示す。腫瘍体積は、内径測定に基づいて計算した。図９Ｃは、マウスにおけるＣＡＲＧ－２０２０処置により、処置された７匹のマウスのうち５匹が長期間の処置およびモニタリング下で完全な腫瘍の根絶を達成したことを示す。 同上。

図１０。ＭＣ３８腫瘍を有するマウスを、腫瘍細胞注入後１４日目と１６日目に、示されたＶＬＶの腫瘍内注入によって処置した。図１０Ａは、実験デザインと時間軸の概略図を示す。マウスをＧＦＰコントロール、ＶＬＶ－ＩＬ－１２、または三価のＶＬＶ ＣＡＲＧ－２０２０のいずれかで処置し、２０日目に屠殺し、その脾臓および腫瘍組織を採取した。図１０Ｂ～Ｅは、フローサイトメトリー分析結果を示す。図１０Ｆ～Ｈは、ＰＤ－Ｌ１、ＣＸＣＬ１、およびＣＸＣＬ２のｑ－ＲＴ－ＰＣＲ分析結果を示す。 同上。 同上。

図１１。共培養したＮＩＨ３Ｔ３細胞とＬ９２９細胞におけるＶＬＶの腫瘍溶解効果の比較。正常なネズミ線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をＣＦＳＥ染料（緑色）で標識し、線維肉腫を引き起こすＬ９２９株の腫瘍形成性線維芽細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０（赤色）で標識した。細胞を共培養し、モック処置（コントロール）するか、または感染多重度（ＭＯＩ）１０のＶＬＶで処置した。大部分のＬ９２９がＶＬＶの複製に起因するアポトーシスを起こしているのに対し、大部分のＮＩＨ３Ｔ３細胞は免れている。赤色と緑色のチャネルは、グレースケール表示のために分けられ、グレースケール表示では、図１１の４つのパネルの各々において、白または白／グレーの色調が図の左側の行ラベルに示された蛍光色を示し、黒の着色が背景であり、蛍光が検出されない領域を示す。

発明の詳細な説明
本発明は、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）は、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、ショートヘアピンＲＮＡ、および他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする１つまたは複数の配列で武装することができ、その各々が、癌、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、および防止に有用であるという予期せぬ発見に関する。本発明のＶＬＶは、これをコードする高力価ハイブリッドウイルスベクターから産生される。ウイルス様小胞（ＶＬＶ）は、アルファウイルス非構造タンパク質およびベシクロウイルス糖タンパク質をコードするプラス鎖キャップポリアデニル化ＲＮＡを有する、キャプシドを含まない自己複製人工ウイルスプラットフォームである。

一部の態様では、癌、悪性腫瘍の処置、予防、および防止に有用な本発明のＶＬＶは、ＶＬＶが腫瘍溶解性であるという予期せぬ発見によってさらに補完される。腫瘍細胞、癌細胞、悪性腫瘍細胞、または悪性腫瘍の特徴をもつ細胞は、ＶＬＶの複製がチェックされないために溶解プロセスとしてＶＬＶの複製を許容にするが、正常細胞ではＶＬＶの複製がチェックされずに進行することはない。いくつかの正常細胞の例では、ＶＬＶの複製は、パターン認識受容体によるｄｓＲＮＡの認識と、正常細胞でのＶＬＶの複製を遮断するＩ型インターフェロンの誘導によって制限される。Ｉ型インターフェロン経路が癌または腫瘍細胞などで障害を受けると、ＶＬＶはチェックされずに進行することがある。それにより、Ｉ型インターフェロン経路はＶＬＶの複製を溶解プロセスとして進行させる：ひとたびＶＬＶの複製が開始されると、宿主細胞タンパク質の合成が遮断され、アポトーシスを引き起こす。腫瘍細胞のアポトーシス経路が不十分な場合でも、ＶＬＶの負荷が高い細胞は溶解される。

そのため、本発明のＶＬＶは、悪性腫瘍の処置、予防、および／または防止に有用な１つまたは複数のサイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、ショートヘアピンＲＮＡ、および他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそれらが産生することによって、さらにそれらの自己複製中にさらなる腫瘍溶解活性を有することによって、腫瘍細胞、癌細胞、および悪性腫瘍に対して少なくとも２つの有益な効果を有し得る。ＶＬＶのＲＮＡの複製または翻訳産物として宿主細胞で産生される前記サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、ショートヘアピンＲＮＡ、およびその他の悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、および／または防止に有用なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「治療薬」と呼ぶことができる。

本発明の一実施形態では、ＶＬＶは、結腸癌、卵巣癌および急性リンパ芽球性白血病を含む、いくつかの種類の癌細胞をインビトロで腫瘍溶解する能力があるが（図１Ａ～Ｃ）、正常な哺乳動物細胞では感染性が低い（図２）。急性リンパ芽球性白血病Ｂ型（Ｂ－ＡＬＬ）癌細胞株ＭＮ６０、ＲＥＨおよびＲＳ４，１１は、図１Ｃに示されるように、分化マーカーの発現が特徴である。ＲＳ４，１１は、規則的な形状、細かく分散したクロマチン、および１またはそれを超える核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｏｌｉ）を備えた比較的小さな細胞である。ＲＳ４，１１はＣＤ３８とＣＤ１９を発現する。ＲＥＨは、規則的またはでこぼこした形状をした小型／中型の細胞であり、細かく分散した、および／または粗く凝縮したクロマチンと、１またはそれを超える核小体（ｎｕｃｌｅｏｌｏｌｉ）を備えている。ＲＥＨは、ＣＤ３８、ＣＤ１９、およびＣＤ１０を発現する。ＭＮ６０は、不規則および／または分葉状の形状（ｓｈａｐｔｅ）をした比較的中型／大型の細胞であり、細かく粒状のおよび／または均一なクロマチンを有し、顕著な２またはそれを超える核を有する。ＭＮ６０は、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ１０、ＣＤ２０、およびＩｇＭを発現する。癌細胞株のＶＬＶによる感染は、カスパーゼ８およびカスパーゼ９の活性化、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現、およびポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を誘導し、癌細胞の腫瘍溶解がアポトーシス機構を通して起こることが示された（図３）。

本発明のもう一つの実施形態では、ＶＬＶは、抗癌活性を有するサイトカインであるＩＬ－１２で武装することができる。ＩＬ－１２で武装すると、ＶＬＶはＭＣ３８マウス結腸癌細胞株とベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞を感染させることができ、分泌されたＩＬ－１２タンパク質をインビトロで発現することができる（図４）。ＩＬ－１２で武装したＶＬＶを用いてＭＣ３８担癌マウスを処置すると、コントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水で処置したマウスと比較して、腫瘍体積が大幅に減少した（図５）。

さらに別の実施形態では、ＶＬＶは、ＩＬ－１７Ａ受容体（ＩＬ－１７ＲＡ）のドミナントネガティブ（ＤＮ）変異体で武装することができる（図６）。ＩＬ－１７は、腫瘍の成長を促進し、抗癌免疫を阻害する。そのため、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮの発現を介してＩＬ－１７シグナル伝達を妨害するＶＬＶは、オンコウイルス活性の増強を示すはずである。

もう一つの実施形態では、ＶＬＶは、別々の細胞に発現したリガンドと受容体が相互作用するとＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性を減弱する免疫チェックポイントタンパク質である、Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ－Ｄｅａｔｈ－１受容体のリガンドであるＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡで武装することができる。ＰＤ－Ｌ１を発現しているＢＨＫ２１細胞が、ＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡをコードするＶＬＶに感染すると、ＰＤ－Ｌ１の発現はｓｈＲＮＡによって特異的に抑制される（ｓｈＲＮＡのスクランブル型（ＳＣＲ）による抑制はない）（図７）。ＰＤ－Ｌ１がないことに起因して腫瘍に動員されるＣＤ８Ｔ細胞は弱毒化されないため、このｓｈＲＮＡを発現しているＶＬＶは、腫瘍溶解活性が増強されると予想され得る。

もう一つの実施形態では、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ、およびＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡ（ＣＡＲＧ２０２０）を発現する三価のＶＬＶを作製することができる（図８）。これらの３つの導入遺伝子要素間の相乗作用により、ＣＡＲＧ２０２０は、大幅に増強された抗腫瘍活性を示す（図９）。ＩＬ－１２－ＶＬＶとＣＡＲＧ２０２０による処置は両方とも、腫瘍へのＴｈ１およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の動員と、その活性レベルの増加を誘導した（図９）。ＩＬ－１２－ＶＬＶとＣＡＲＧ２０２０による処置はまた、腫瘍内の制御性Ｔ細胞の数も減少させた（図１０）。ＣＡＲＧ２０２０はまた、ＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１７標的遺伝子ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２の発現を特異的に阻害した（図１０）。

さらなる実施形態では、ＶＬＶは腫瘍溶解性であることが示されている（図１１）。正常なネズミ線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をＣＦＳＥ染料（緑色）で標識し、線維肉腫を引き起こすＬ９２９株の腫瘍形成性線維芽細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０（赤色）で標識した。Ｌ９２９株の腫瘍形成性線維芽細胞は、ＶＬＶ複製の腫瘍溶解性作用にのためにアポトーシスを起こしたが、ＮＩＨ３Ｔ３はアポトーシスを起こさなかったことが観察された。
定義

別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される材料および方法に加えて、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料、あるいは本発明の範囲を実行するために適切な方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができる。本発明の説明および特許請求においては、以下の用語が使用される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

本明細書において、冠詞「ａ」および「ａｎ」は、冠詞の文法的対象の１つ、または複数（すなわち、少なくとも１つ）をさすために使用される。例として、「１つの（ａｎ）要素」とは、１つの要素または１よりも多い要素を意味する。

本明細書において、「コントロール」、または「基準」という用語は、同義的に使用され、比較の標準として使用される値を指す。

「ワクチン接種」とは、対象に抗原を接種して対象の免疫応答を誘発するプロセスを指し、抗原が関係している疾患または障害を予防または処置するのに役立つ。「免疫化」という用語は、本明細書ではワクチン接種と同義的に使用される。

本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗原または生物が動物に投与されたときに動物の免疫応答を誘発する抗原または生物の生来の能力を指す。従って、「免疫原性を増強する」とは、抗原または生物が動物に投与されたときに動物の免疫応答を誘発する抗原または生物の生来の能力を高めることを指す。抗原または生物の免疫応答を誘発する能力の増加は、とりわけ、抗原または生物に結合する抗体の数の増加、抗原または生物に対する抗体の多様性の増加、抗原または生物に特異的なＴ細胞の数の増加、抗原または生物に対する細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞の応答の増加、抗原に応答するサイトカインの発現の増加などによって測定され得る。

「活性化」という用語は、本明細書において、顕著な生化学的または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分の連結後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈の中で、そのような活性化とは、十分に刺激されて細胞の増殖を誘導したＴ細胞の状態を指す。Ｔ細胞の活性化はまた、サイトカイン産生および制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の実行を誘導することもある。他の細胞の文脈の中で、この用語は、特定の物理化学的プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを判断する。

「活性化Ｔ細胞」という用語は、細胞分裂、サイトカイン産生、制御性または細胞溶解性のエフェクター機能の実行を現在受けており、かつ／あるいは最近「活性化」のプロセスを経験したＴ細胞を意味する。

「体液性免疫」または「液性免疫応答」は、いずれもＢ細胞媒介免疫を指し、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）により産生および分泌される、高度に特異的な抗体によって媒介される。

「予防」とは、障害に対するワクチン接種のための医薬組成物の使用を指す。

「アジュバント」とは、抗原の免疫原性を増強できる物質を指す。アジュバントは１つの物質でも複数の物質の混合物でもよく、免疫系に直接作用することによるかまたは抗原の緩徐放出をもたらすことによって機能する。アジュバントの例は、アルミニウム塩、ポリアニオン、細菌のグリコペプチドおよびフロイント不完全のような徐放剤である。

「送達ビヒクル」とは、抗原を特定の細胞に標的化し、免疫系による抗原の効果的な認識を促進するのに役立つ組成物を指す。最もよく知られた送達ビヒクルは、リポソーム、ビロソーム、ミクロスフェアおよびナノスフェアを含む微小粒子、ポリマー（ｐｏｌｙｍｅｒｅｓ）、細菌ゴースト、細菌多糖類、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルスおよびＩＳＣＯＭＳである。

「組み込まれた」または「封入された」とは、微小粒子、細菌ゴースト、弱毒化細菌、ウイルス様粒子、弱毒化ウイルス、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、好ましくはビロソームなどの送達ビヒクル内にある抗原ペプチドを指す。

本明細書において、「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含んでいる必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数には制限がない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに結合された２またはそれを超えるアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書において、この用語は、例えば、当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも呼ばれる短い鎖と、当技術分野で一般に多くの種類があるタンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物活性断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。

本明細書において使用される「融合タンパク質」は、タンパク質が、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結された２またはそれを超えるタンパク質で構成されているものを指す。

タンパク質は、ペプチドまたは他の化学結合によって直接に、または２またはそれを超えるタンパク質間の、本明細書において「スペーサー」と呼ばれる１またはそれを超えるアミノ酸によって、一緒に連結され得る。

本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシトシン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジン、「Ｕ」はウリジンを指す。

「ＲＮＡ」という用語は、本明細書において、リボ核酸と定義される。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡを定義するために使用される。

「形質転換する」、「トランスフォーミング」、および「トランスフォーメーション」は、本明細書において、単離された核酸を生物の内部に導入するプロセスを指すために使用される。

本発明の文脈内で使用される「処置」という用語は、疾患または障害の治療的処置だけでなく、予防的処置または抑制的処置を含むことを意味する。本明細書において、「処置」と、「処置する」および「処置すること」などの関連する用語は、疾患症状またはその少なくとも１つの症状の進行、重症度および／または持続時間の減少を意味する。したがって、「処置」という用語は、対象に利益をもたらし得るあらゆるレジメンを指す。処置は、既存の症状に関するものであってもよいし、予防的（予防的処置）であってもよい。処置には、治癒的効果、緩和的効果、または予防的効果が含まれてよい。本明細書における「治療的」および「予防的」処置への言及は、その最も広い文脈で考慮されるものとする。「治療的」という用語は、必ずしも対象が完全に回復するまで処置されることを意味するものではない。同様に、「予防的」とは、必ずしも対象が最終的に疾患症状に罹患しないことを意味するものではない。したがって、例えば、処置という用語には、疾患または障害の発症前または発症後に薬剤を投与し、それにより疾患または障害のすべての徴候を予防または除去することが含まれる。別の例として、疾患の臨床症状の後に疾患の症候と闘うために薬剤を投与することは、疾患の「処置」を構成する。

「生物学的」または「生体試料」という用語は、生物から、または生物の成分（例えば、細胞）から得られた試料を指す。試料は、生体組織または体液のいずれのものであってもよい。多くの場合、試料は患者由来の試料である「臨床試料」となる。そのような試料としては、限定されるものではないが、骨髄、心臓組織、痰、血液、リンパ液、血液 細胞（例えば、白血球）、組織または細針生検試料、尿、腹水、および胸腔内液、またはそれらの細胞が挙げられる。生体試料には、組織学的目的で採取された凍結切片などの組織切片が含まれることもある。

「同等」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、機能的に同等なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を指すと理解される。同等なヌクレオチド配列には、対立遺伝子変異体など、１またはそれを超えるヌクレオチド置換、付加または欠失により異なる配列が含まれ、そのため、遺伝子コードの縮重に起因して本明細書に記載される核酸のヌクレオチド配列とは異なる配列が含まれることになる。

「ハイブリダイゼーション」とは、核酸の鎖が塩基対形成を介して相補鎖と結合するプロセスを指す。２つの一本鎖核酸は、それらが二本鎖を形成するときに「ハイブリダイズする」。二本鎖の領域には、一本鎖核酸の一方または両方の全長が含まれてもよいし、一方の一本鎖核酸のすべてと他方の一本鎖核酸の部分配列が含まれてもよいし、各核酸の部分配列が含まれてもよい。ハイブリダイゼーションには、特定のミスマッチを含む二本鎖の形成も含まれるが、２本の鎖がまだ二本鎖らせんを形成しているということが条件である。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、本質的に特異的なハイブリダイゼーションをもたらすハイブリダイゼーション条件を指す。鋳型核酸の標的部位へのプローブの「特異的ハイブリダイゼーション」という用語は、ハイブリダイゼーションシグナルが明確に解釈され得るように、主に標的へのプローブのハイブリダイゼーションを指す。本明細書でさらに記載されるように、特異的ハイブリダイゼーションをもたらすこのような条件は、相同領域の長さ、領域のＧＣ含量、ハイブリッドの融解温度「Ｔｍ」によって変動する。したがって、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション溶液および洗浄液の塩含有量、酸性度、および温度が異なることになる。

核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡなどに関して本明細書において使用される「単離」という用語は、高分子の天然の供給源に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡからそれぞれ分離された分子を指す。本明細書において使用される単離という用語は、組換えＤＮＡ技術によって生成される場合には細胞材料、ウイルス材料、または培養液を、または化学的に合成される場合には化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然に存在せず、自然状態では見出されないであろう核酸断片を含むことを意味する。「単離」という用語は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すためにも使用され、精製ポリペプチドと組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。「単離された細胞」または「単離された細胞集団」は、その自然環境に存在しない細胞または細胞集団である。

本明細書において、「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、適切な場合にはリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。また、この用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されたＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体、および記載される実施形態に適用可能なように、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＥＳＴ、染色体、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、核酸と呼ばれ得る分子の代表的な例である。

「変異体」という用語は、ポリヌクレオチド配列の文脈で使用される場合、遺伝子またはそのコード配列の配列に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」、または「多型」変異体も含まれ得る。ポリペプチドは、一般に、互いに対して重要なアミノ酸同一性を有することになる。多型変異体は、所与の種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列が変異している。多型変異体には、ポリヌクレオチド配列が１塩基だけ異なる「一塩基多型」（ＳＮＰ）が含まれ得る。ＳＮＰの存在は、例えば、特定の集団、病状、または病状の傾向を示し得る。

本明細書で使用される「サイレント変異」という用語は、ＤＮＡを構成するヌクレオチド塩基の配列または同一性が変化し、その後にタンパク質全体の機能のアミノ酸配列が変化しないことを指す。

「寛解させる」または「処置する」という用語は、行われた行為の結果として、疾患に関連する臨床徴候および／または症候が軽減されることを意味する。監視される徴候または症候は、熟練した臨床医には周知である。

本明細書において使用される、「併用療法」とは、第１の薬剤が別の薬剤と併用して投与されることを意味する。「組み合わせて」または「併用して」とは、ある処置様式（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｍｏｄａｌｉｔｙ）を別の処置様式に加えて投与することを指す。したがって、「と組み合わせて」とは、個体に１つの処置様式を、他の処置様式を送達する前、間、または後に投与することを指す。このような組合せは、単一の処置レジメンまたはレジームの一部と見なされる。

「力価」は、基準試料と比較したウイルスまたはウイルスベクターの濃度の数値尺度であり、濃度は、ウイルスの活性によるか、または単位体積の緩衝液中のウイルスの数を測定することによって決定される。ウイルスストックの力価は、例えば、ウイルスの１または複数の溶液（通常、段階希釈）の感染力を、例えば軟寒天法を使用してＨｅＬａ細胞で測定することによる（Ｇｒａｈａｍ＆Ｖａｎ Ｄｅｒ ｅｂ（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６－４６７参照）か、あるいは、細胞に付与された耐性、例えば、ウイルスまたはベクターにコードされるＧ４１８耐性をモニターすることによるか、あるいはＵＶ分光光度測定によってウイルスを定量化することにより（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ＆Ｄａｌｅｓ（１９７０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０：４６２－４７７参照）、決定される。一部の実施形態では、力価は、１ｍＬあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ）の単位（ｐｆｕ／ｍＬ）で提供される。

本明細書において、「高力価」という用語は、一部の実施形態では少なくとも約１×１０^７ｐｆｕ／ｍＬ、または一部の実施形態では少なくとも約５×１０^７ｐｆｕ／ｍＬ、または一部の実施形態では少なくとも約１×１０^８ｐｆｕ／ｍＬの力価を説明する。

本明細書において、「医薬組成物」という用語は、本発明内で有用な少なくとも１つの化合物と、他の化学成分、例えば担体、安定剤、希釈剤、アジュバント、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤との混合物を指す。医薬組成物は、化合物の生物への投与を容易にする。化合物を投与する複数の技術が当技術分野に存在し、それには、限定されるものではないが、静脈内、経口、エアロゾル、非経口、眼科、肺および局所投与が含まれる。

「薬学的に許容され得る担体」という用語には、本発明の１または複数の化合物がその意図する機能を実行することができるように対象内または対象に運搬または輸送されることに関与する、薬学的に許容され得る塩、薬学的に許容され得る材料、組成物または担体、例えば液体または固体の増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などが含まれる。通常、このような化合物は、ある器官または体の一部から、別の器官または体の一部に運搬または輸送される。各塩または担体は、製剤の他の構成成分と適合しており、かつ対象に害を与えないという意味で「許容され得る」ものでなければならない。薬学的に許容され得る担体とした役立ち得る材料のいくつかの例としては：糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなど；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤ワックスなど；油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；グリコール、例えばプロピレングリコールなど；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；希釈剤；造粒剤；滑沢剤；バインダ；崩壊剤；湿潤剤；乳化剤；着色剤；離型剤；コーティング剤；甘味剤；香味剤；香料；防腐剤；酸化防止剤；可塑剤；ゲル化剤；増粘剤；硬化剤；硬化剤；懸濁剤；界面活性剤；保水剤；担体；安定剤；および他の医薬製剤に用いられる他の無毒の適合性物質、またはその任意の組合せが挙げられる。本明細書において、「薬学的に許容され得る担体」には、化合物の活性と適合性があり、対象に生理学的に許容され得るありとあらゆるコーティング、抗菌剤および抗真菌剤、および吸収遅延剤なども含まれる。補助的な活性化合物を組成物に組み込んでもよい。

本明細書において使用される「抗体」または「Ａｂ」という用語は、抗原上の特定のエピトープに特異的に結合するタンパク質、または免疫グロブリン分子由来のポリペプチド配列を指す。抗体は、天然源由来または組換え源由来の無傷の免疫グロブリンであっもよいし、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。本発明において有用な抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）_２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る（Ｈａｒｌｏｗら、１９９８、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗら、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；Ｈｏｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。抗体は、天然源由来であっても組換え原由来であってもよい。抗体は、通常、免疫グロブリン分子の四量体である。

本明細書において使用される用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特定の免疫学的に適格な細胞の活性化、またはその両方のいずれかが含まれ得る。実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含むどんな高分子も抗原として働くことができることを当業者は理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、そのため、その用語が本明細書において使用される「抗原」をコードすることを当業者は理解するであろう。さらに、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを当業者は理解するであろう。本発明が、限定されるものではないが、１より多く遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために様々な組合せで配置されることは容易に明らかである。さらに、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを当業者は理解するであろう。抗原を合成によって生成することができること、または生体試料から誘導することができることは容易に明らかである。そのような生体試料としては、限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的流体を挙げることができる。

本明細書において使用される「異種抗原」とは、抗原を含むまたは発現している生物に内在しない抗原を指す。一例として、ウイルス抗原または腫瘍抗原を含むまたは発現しているウイルスワクチンベクターは、異種抗原を含む。本明細書において使用される「異種タンパク質」という用語は、その供給源にかかわらず対象において有益な免疫応答を誘発するタンパク質を指す。

本明細書で定義されるように、「アルファウイルス」は、ウイルスのＩＶ族トガウイルス科のメンバーである。アルファウイルスには、限定されるものでないが、オーラウイルス、ババンキウイルス、バーマフォレストウイルス、ベバルウイルス、カバスー（Ｃａｂａｓｓｏｕ）ウイルス、チクングニアウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エバーグレーズウイルス、フォートモーガンウイルス、ゲタウイルス、ハイランズウイルス、Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈウイルス、マヤロウイルス、メトリウイルス、ミデルブルフウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、ヌドゥムウイルス、オニョンニョンウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、ロスリバーウイルス、サギアマ（Ｓａｇｉａｍａ）ウイルス、サケ膵臓病ウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス、ミナミゾウアザラシウイルス、トネート（Ｔｏｎａｔｅ）ウイルス、トロカラウイルス、ウナウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスおよびワタロアウイルスが含まれる。

本明細書で定義されるように、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４のいずれか、ならびにそれらの組合せおよび変種であり得る。

本明細書で定義されるように、「アルファウイルス構造タンパク質」は、アルファウイルスキャプシドタンパク質および少なくとも１つのスパイクタンパク質からなる群から選択され得る。

「特異的に結合する、選択的に結合する」という用語または「結合特異性」とは、本発明のヒト化抗体または結合化合物が、ＶＳＶ上に存在する標的エピトープに、非標的エピトープに結合した場合に生じるよりも大きな親和性で結合する能力を指す。ある種の実施形態では、特異的結合とは、非標的エピトープに対する親和性よりも少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍大きい親和性で標的に結合することを指す。

本明細書において、「有効量」または「治療有効量」という用語は、特定の疾患症状を防ぐために必要な、あるいは、疾患症状またはその少なくとも１つの症候またはそれに関連する症状の重症度を低下させる、かつ／あるいは疾患症状またはその少なくとも１つの症候またはそれに関連する症状を寛解させる、本発明のベクターから生成されるウイルス様粒子の量を意味する。

本明細書において使用される「プロモーター」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始するために必要な細胞の合成機構、または導入された合成機構に認識されるＤＮＡ配列として定義される。

本明細書において、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に動作可能に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。一部の例では、この配列は、コアプロモーター配列であってよく、他の例では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節要素を含んでいてもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方法で遺伝子産物を発現するものであってよい。

「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能に連結されている場合に、細胞のほとんどまたはすべての生理学的条件下で遺伝子産物を細胞で産生させるヌクレオチド配列である。

「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは特定するポリヌクレオチドと動作可能に連結されている場合に、実質的に、そのプロモーターに対応する誘導物質が細胞内に存在する場合にのみ、遺伝子産物を細胞で産生させるヌクレオチド配列である。

「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用され得る物質の組成物である。多数のベクターが当技術分野で公知であり、それには、限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合しているポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスが含まれる。本開示では、「ベクター」という用語には、自己複製ウイルスが含まれる。

「２Ａ」または「２Ａペプチド」という用語は、自己プロセシングウイルスペプチドである。２Ａペプチドは、単一のＯＲＦ転写単位において異なるタンパク質コード配列を分離することができる（Ｒｙａｎら、１９９１、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７２：２７２７－２７３２）。当初、２Ａペプチドによる切断は、自己タンパク質分解事象により媒介されると考えられており、２Ａペプチドは「自己切断ペプチド」と呼ばれていた。最終的に、リボソームのスキップ機構が提案され、２Ａおよび２Ａ様配列は、現在、自己切断ペプチドではなくＣＨＹＳＥＬｓ（シス作用性加水分解酵素要素）と呼ばれている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、２００１、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８２：１０１３－１０２５）。タンパク質を２Ａまたは２Ａ様ペプチド配列と連結させることにより、単一のＯＲＦに由来する複数の別個のタンパク質（本質的に等モル量）の細胞発現がもたらされる（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、２００６、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２４：６８－７５）。

本明細書において、「動作可能に連結されている」配列には、目的の遺伝子に隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスまたは遠距離で作用する発現制御配列の両方が含まれる。発現制御配列には、適切な転写開始、終了、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；および、必要に応じて、コードされた生成物の分泌を高める配列が含まれる。天然、構成的、誘導性および／または組織特異的なプロモーターを含む多数の発現制御配列が当技術分野で公知であり、本発明の組成物中で使用されてよい。「動作可能に連結された」は、ＤＮＡ発現配列および制御配列に加えて、ＲＮＡ発現配列および制御配列を含むと解釈されるべきである。「動作可能に連結された」は、さらに、ベクターなどの列挙された構築物を形成するために、作動可能に連結されると定義される配列要素の特定の順序を定義すると解釈されるべきでなく、作動可能に連結された配列要素は、たとえ粗雑であっても、作動可能に連結された配列を含む構築物がその意図する目的に有用であるように、任意の順序で組み立てることができることが理解され得る。

本明細書において使用される「腫瘍溶解性」とはウイルスまたはＶＬＶが癌細胞に感染し、アポトーシス機構を介して癌細胞を死滅させる特性を指す。同様に、「腫瘍溶解効果」とは、ウイルスまたはＶＬＶが腫瘍溶解を誘導する特性を指す。

本明細書において使用される「対象」または「患者」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であってよい。ヒト以外の哺乳動物には、例えば、家畜およびペット、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコおよびネズミの哺乳動物などが含まれる。一部の実施形態では、対象はヒトである。

本明細書において使用される「ベシクロウイルス糖タンパク質」は、ＳＦＶ非構造タンパク質をコードするＳＦＶレプリコンに組み込まれると、ウイルス様小胞の形成を促進する、任意の適切なベシクロウイルス糖タンパク質である。一部の実施形態では、ベシクロウイルス糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ｖｒｕｓ）（ＳＦＶ）糖タンパク質である。

本明細書において使用される「悪性腫瘍」とは、癌または腫瘍の状態または存在を指し、任意の癌性状態を指すことを意図している。「悪性腫瘍」という用語は、癌性となる傾向があるか、または癌性となる傾向を発達させ得る細胞、または悪性腫瘍の特徴を有する細胞を説明することを意図している。「悪性腫瘍」という用語は、本明細書では「癌」および「腫瘍」と互換的に使用される。

本明細書において使用される「治療薬」とは、ＶＬＶのＲＮＡのあらゆる成分またはＲＮＡによってコードされるあらゆる成分、例えば、ＶＬＶのＲＮＡの複製または翻訳産物として宿主細胞で産生される、サイトカインアゴニスト、サイトカインアンタゴニスト、ショートヘアピンＲＮＡ、およびその他の悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、および／または防止に有用なポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどを指す。一部の実施形態では、ＶＬＶは、１を超えるまたは複数の治療薬を含むか、またはコードすることがある。腫瘍溶解性効果だけを望む一部の実施形態では、ＶＬＶは治療薬をまったくコードしていなくてもよい。ＶＬＶを産生するために使用される高力価ウイルスベクターは、治療薬をコードするＤＮＡ配列を含み、サブゲノムプロモーター（ＳＧＰ）、２Ａ配列、または治療薬をコードするＤＮＡ配列に関連する他の配列を含み得る。

本明細書において使用される「武装した」とは、１またはそれを超える治療薬を含むかまたはコードしているＶＬＶまたは高力価ウイルスベクターの状態を指す。例えば、「ＩＬ－１２で武装したＶＬＶ」は、ＩＬ－１２をコードする配列要素を含むことになる。また、所与ＶＬＶが、それをコードする対応する高力価ハイブリッドウイルスベクターを有していること、したがって「ＩＬ－１２で武装した高力価ウイルスベクター」または「ＩＬ－１２で武装したベクター」を同じ目的で呼ぶことが適切であることも理解され得る。

「パーセント同一性」は、ポリペプチドの２またはそれを超えるポリヌクレオチド間の配列の関係を説明するために使用される用語である。一部の例では、所与配列の１つの配列（例えば、配列表を参照）は、企図される変異配列と比較される「参照配列」と呼ばれる。一般に、比較は、参照配列と企図される変異体の最適なアラインメントを行った後に、参照配列の長さに沿って行われる。ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムで利用されるようなコンピュータ実装アルゴリズムを使用して、比較の目的に最適なアラインメントを生成してもよい。本発明に開示される配列はいずれも、参照配列に対して約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性または相同性を有し得る。
説明
組成物

本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、動作可能に連結された配列要素を５つ：ＤＮＡプロモーター配列を含む、第１のＤＮＡ配列；アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする、第２のＤＮＡ配列；アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする、第３のＤＮＡ配列；サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む、第４のＤＮＡ配列；および、ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする、第５のＤＮＡ配列、を含む。このベクターを細胞培養で増殖させると、高力価のウイルス様小胞（ＶＬＶ）が得られ、例えば、１ｍｌあたり少なくとも１×１０^７個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価が得られる。

本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターを作製する方法は、本明細書の実験例の項に詳細に記載されている。

一態様では、アルファウイルスは、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）である。別の態様では、サブゲノムＲＮＡプロモーターはセムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）プロモーターである。別の態様では、アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼを含む。別の態様では、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）非構造タンパク質は、ＳＦＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼを含む。

一態様では、ＶＳＶ Ｇタンパク質をコードするＶＳＶは、当技術分野で公知のＶＳＶ血清型に由来し得る。ＶＳＶ血清型の限定されない例には、インディアナ（ＩＮＤ－ＶＳＶ）血清型およびニュージャージー（ＮＪ－ＶＳＶ）血清型が含まれる。一実施形態では、ＮＪ－ＶＳＶ血清型糖タンパク質は、配列番号１１を含むＤＮＡ配列と、配列番号１２を含むポリペプチド配列によって定義される。もう一つの実施形態では、ＮＪ－ＶＳＶ血清型糖タンパク質は、配列番号１１または１２に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性または相同性を有する配列を含むＤＮＡ配列またはポリペプチド配列によって定義される。

一態様では、本明細書ではサイトメガロウイルス前初期プロモーターが例示されているが、本発明は、このプロモーター配列に限定されると解釈されるべきではない。本発明において有用なプロモーター配列には、高レベルの遺伝子発現を誘導するあらゆるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターとしては、限定されるものではないが、本明細書の他所に開示されるものを挙げることができる。

さらなる態様では、本発明の組成物は、サブゲノムのアルファウイルスプロモーター間に挿入された異種タンパク質をコードするＤＮＡと、ＶＳＶ Ｇタンパク質をコードするＤＮＡを含み、ここで、異種タンパク質をコードするＤＮＡは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来のＴ２ＡペプチドをコードするＤＮＡ（Ｓｚｙｍｃｚａｋら、２００４．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：５８９－５９４）に動作可能に連結されており、これは、次に、ＶＳＶ Ｇタンパク質をコードするＤＮＡに動作可能に連結されている。このように、結果として得られる本発明のＶＬＶにおける不均一タンパク質の発現は、ＶＳＶ Ｇタンパク質の発現と効果的に結び付けられており、後者はベクターの複製に不可欠である。したがって、異種タンパク質の発現が安定化され、このタンパク質を発現する遺伝子がハイブリッドベクターに継続して存在することが保証される。

一部の実施形態では、２Ａペプチドは、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、ブタテシオウイルス－１（Ｐ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）および当技術分野で公知の２Ａペプチドまたはそのフラグメントからなる群から選択される。さらなる実施形態では、２Ａペプチドは、当技術分野で公知のＴ２Ａペプチドまたはその任意のＴ２Ａ断片である。

一部の実施形態では、異種遺伝子は、必ずしもアルファウイルスサブゲノムプロモーター配列でなくてもよい、ＲＮＡウイルスプロモーター配列の制御下にある可能性がある。異種プロモーター配列の発現を駆動するＲＮＡプロモーター配列のそのような修飾および変異は、本発明を実施すると当業者に明らかになるであろう。ベクターには、本発明によって作製されたハイブリッドウイルスベクターに感染した細胞での異種遺伝子の転写、翻訳および／または発現を可能にする方法で異種遺伝子に動作可能に連結された従来の制御要素も含まれてよい。
ベクターにコードされる要素

高力価ハイブリッドウイルスベクターは、他の要素の中でも、サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含むＤＮＡ配列を含む。それから産生されるＶＬＶは、標的細胞に送達されるかまたは標的細胞内で産生されたときに治療効果を有する要素を、ｓｈＲＮＡの場合には含み、ポリペプチドの場合にはコードするＲＮＡを含む。そのような要素は、「治療薬」と呼ばれ、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、および防止に有用である。一部の実施形態では、治療薬は、異種タンパク質である。

本発明の重要な態様は、所与の高力価ハイブリッドウイルスベクターが、数個の異なる治療薬をコードし得ることである。一部の態様では、複数のポリペプチド治療薬は、所与の高力価ハイブリッドウイルスベクターにコードされ得る。一部の態様では、複数のポリヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡ治療薬は、所与の高力価ハイブリッドウイルスベクターにコードされ得る。さらなる態様では、所与の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、１またはそれを超えるポリペプチド治療薬および１またはそれを超えるポリヌクレオチドまたはｓｈＲＮＡ治療薬をコードすることができる。

高力価ハイブリッドウイルスベクターから産生されたＶＬＶを含むＶＬＶまたは組成物は、ｓｈＲＮＡなどの特定の治療薬を含むｄｓＲＮＡ、またはポリペプチド治療薬をコードするｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ＶＬＶまたはＶＬＶを含む組成物は、単一の治療薬を含むかまたはコードする。一部の実施形態では、ＶＬＶまたはＶＬＶを含む組成物は、複数の治療薬を含むかまたはコードする。一部の実施形態では、ＶＬＶまたはＶＬＶを含む組成物は、１～１０の治療薬、または１～７の治療薬、または１～５の治療薬、または１～３の治療薬を含むかまたはコードする。一部の実施形態では、ＶＬＶまたはＶＬＶを含む組成物は三価である、つまり３つの治療薬が含まれているかまたはコードされている。

悪性腫瘍および／または感染性疾患の処置、予防、および防止に有用な治療薬が、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターおよびＶＬＶに組み込まれ得ることは理解され得る。一部の実施形態では、治療薬は、悪性腫瘍または癌に関連している。一部の実施形態では、治療薬は、サイトカインアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドである。一部の実施形態では、治療薬は、ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドチェックポイント阻害剤である。

コードされるサイトカインアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチド治療薬は、悪性腫瘍または癌の処置、予防、および／または防止に有用であるか、または役割を果たすポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、コードされるサイトカインアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１７、Ｆｌｔ３Ｌ、またはそれらの組合せのいずれかであり得る。

一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９０、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、またはそれらの組合せのいずれかから選択されるポリヌクレオチドであり得る。さらなる実施形態では、ｓｈＲＮＡポリヌクレオチドチェックポイント阻害剤は、悪性腫瘍または癌の処置、予防、および／または防止に有用であるかまたは役割を果たすポリヌクレオチドであり得る。

表１は、本発明の例示的な配列についての説明を提供する。一部の態様では、治療薬のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、本明細書に記載される参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｅｑｕｅｃｅ）（例えば、配列表参照）のいずれかに対して、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の同一性または相同性を有する配列を含む。一般に、企図される変異体は、参照配列の生物活性の少なくとも一部を維持することになる。

一部の実施形態では、高力価ハイブリッドウイルスベクターは三価であり、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ、およびＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡをコードする。もう一つの実施形態では、高力価ハイブリッドウイルスベクターは、配列番号６と少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、配列番号８と少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、および配列番号１０と少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列ドメインを含む。
表１．配列番号の説明

本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、他の要素の中でも、アルファウイルス非構造タンパク質をコードしている。本発明のアルファウイルス非構造タンパク質は、本発明の範囲および方法を実施するのに適切なタンパク質であり得る。一部の実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼを含む。他の実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）非構造タンパク質である。一部の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｎｔｓ）では、ＳＦＶ非構造タンパク質は、ＳＦＶ ＲＮＡ依存性ＲＮＡレプリカーゼを含む。

本発明を実施する一部の実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、本発明の方法で産生されたＶＬＶの力価を高める変異を含む。高力価ハイブリッドウイルスベクターを使用する免疫化のための組成物および方法に関する、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｒｏｓｅらによる米国特許第１０，４３５，７１２号を参照されたい。進化したＶＬＶ組成物をその中で産生する高力価ハイブリッドウイルスベクターは、産生されたＶＬＶの力価を改善する少なくとも２つの変異をもつＳＦＶアルファウイルス非構造タンパク質を含む。
表２．ＳＦＶ非構造タンパク質に対する変異。

本発明を実施する一部の実施形態では、本発明のアルファウイルス非構造タンパク質は、表２に記載されるような少なくとも１つの変異を含むＳＦＶアルファウイルス非構造タンパク質である。表２に記載される変異は、表１の配列番号１３において太字および下線で示されている。表２では、示されるアミノ酸変異は野生型配列との比較である。つまり、表２の各々の変異が存在する場合、ＳＦＶ非構造タンパク質配列は、配列番号１３と定義される。配列番号１３は、４つのＳＦＶ非構造タンパク質セグメント、すなわち、ｎｓＰ１（アミノ酸１～５３７）、ｎｓＰ２（アミノ酸５３８～１１３６）、ｎｓＰ３（アミノ酸１１３７～１８１８）、およびｎｓＰ４（アミノ酸１８１９～２４３２）を含む。

変異したアルファウイルス非構造タンパク質をコードする本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、所望のアミノ酸配列を生成するための適切なポリヌクレオチド配列を用いて調製することができる。本発明のポリペプチド配列を生成するために利用されるヌクレオチド配列は、潜在的にまたは必要に応じて、サイレント変異を含む変異、または関連するアミノ酸配列を生成するように機能する代替コドンを含み得ることが理解され得る。所与ポリヌクレオチド配列が所与ポリペプチド配列を生成するかどうかは、当業者には容易に明らかであろう。

一部の実施形態では、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、配列番号１３と少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の類似性をもつＳＦＶ非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。さらなる実施形態では、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターは、配列番号１３を含むＳＦＶ非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む。
発明の方法

本発明のベクターは、悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、および／または防止に有用なＶＬＶを生成するための多様な適用において有用である。ベクターはさらに、悪性腫瘍または疾患に対する対象の免疫化、および／または対象における悪性腫瘍または感染性疾患の処置、防止、またはリスクの低減に有用である。

本発明には、感染性疾患に関連する異種タンパク質に対して対象を免疫化する方法が含まれる。この方法は、高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、高力価ハイブリッドウイルスベクターは、不均一遺伝子をコードするＤＮＡを含む。不均一遺伝子の発現により、それによってコードされる感染性疾患に関連する異種タンパク質に対する免疫応答が対象において誘導される。本発明は、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されたウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を処置する方法をさらに含み、ここで、高力価ハイブリッドウイルスベクターは、不均一遺伝子をコードするＤＮＡを含み、不均一遺伝子の発現が対象に利益をもたらす。一態様では、本発明には、対象において異種タンパク質に対するメモリーＴ細胞の免疫応答を生成する方法が含まれる。別の態様では、対象において異種タンパク質に対するＢ細胞の適応免疫応答を生成する方法が含まれる。

本発明には、対象が感染性疾患を発症するリスクを低減する方法も含まれる。この方法は、高力価ハイブリッドウイルスベクターによって産生されるウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、高力価ハイブリッドウイルスベクターは、不均一遺伝子をコードするＤＮＡを含む。不均一遺伝子の発現は、それによってコードされる感染性疾患に関連する異種タンパク質に対する免疫応答を対象において誘導する。それにより、対象が異種タンパク質に関連する感染性疾患を発症するリスクが低減される。

本発明には、高力価ＲＮＡ ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を選択する方法も含まれる。この選択は、ウイルス構造タンパク質をコードするＲＮＡ配列を含むハイブリッドウイルスベクターを細胞培養で掲題することにより（ここで、ウイルス構造タンパク質は、アルファウイルス構造タンパク質を含まない）、そして、細胞培養でのＶＬＶの広範な継代、ＶＬＶの直接変異誘発または当技術分野で公知の他の選択方法を使用して、生成されるＶＬＶを高力価ＶＬＶについてスクリーニングすることにより、達成される。一態様では、ハイブリッドウイルスベクターのＲＮＡ配列は、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする。別の態様では、非構造タンパク質は、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）非構造タンパク質である。
医薬組成物および製剤

本発明のＶＬＶは、医薬組成物として製剤化されてよい。本発明のＶＬＶは、医薬組成物として製剤化されてよい。そのような医薬組成物は、対象への投与に適した形態であってよく、または医薬組成物は、１またはそれを超える薬学的に許容され得る担体、１またはそれを超える追加の成分、またはこれらのいくつかの組合せをさらに含んでもよい。医薬組成物の様々な成分は、当技術分野で周知のように、生理学的に許容され得る陽イオンまたは陰イオンとの組み合わせなど、生理学的に許容され得る塩の形態で存在し得る。

一実施形態では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、１×１０^５～１×１０^９個のＰＦＵの間の用量を送達するように投与され得る。

一実施形態では、本発明の方法を実施するのに有用な医薬組成物は、アジュバントを含むことがある。本発明で企図される適切なアジュバントとしては、限定されるものではないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、Ｑｕｉｌ Ａ、Ｄｅｔｏｘ、ＩＳＣＯＭｓまたはスクアレンが挙げられる。

本発明の方法に有用な医薬組成物は、吸入、経口、直腸、膣、非経口、局所、経皮、肺、鼻腔内、頬側、眼、くも膜下腔内、静脈内または別の投与経路のために適切に開発され得る。その他の企図される製剤としては、突起を有するナノ粒子、リポソーム調製物、有効成分を含有する再封入された赤血球、および免疫学に基づいた製剤が挙げられる。１または複数の投与経路は、当業者には容易に明らかであり、処置される疾患の種類および重症度、処置される獣医学またはヒト患者の種類および年齢などをはじめとする任意の数の要因に依存する。

本明細書で提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物に向けられているが、当業者には、そのような組成物が一般にあらゆる種類の動物への投与に適していることが理解される。ヒトへの投与に適した医薬組成物を、様々な動物への投与に適したものにするために改変することはよく理解されており、通常の熟練した獣医薬学者は、そのような改変を、たとえあったとしても通常の実験だけで設計し実行することができる。本発明の医薬組成物の投与が企図される対象には、限定されるものではないが、ヒトおよび他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌなどの商業的に関連する哺乳動物をはじめとする哺乳動物が含まれる。

本発明の組成物は、組成物の総重量で約０．００５％～２．０％の防腐剤を含んでよい。防腐剤は、環境中の汚染物質にさらされた場合の腐敗を防ぐために使用される。
投与／投薬

投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼすことがある。例えば、本発明の高力価ハイブリッドウイルスベクターまたはその組成物によって産生されるＶＬＶは、単回投与で、数回に分割された投与量で対象に投与されてもよく、時差投与量が毎日または連続して投与されてもよく、用量が連続的に注入されてもよく、ボーラス注射であってもよい。さらに、投与量は、治療的または予防的状況の緊急性によって示されるように、比例的に増加または減少させてよい。

本発明の組成物の対象、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与は、既知の手順を使用して、対象の疾患を処置するのに効果的な投与量および期間で実施されてよい。意図する結果を達成するために必要な組成物の有効量は変動し、処置または防止される疾患、処置される対象の年齢、性別、体重、症状、全体的な健康および以前の病歴などの要因、および医学分野で周知の同様の要因に依存する。特定の実施形態では、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される投与単位形態とは、処置される対象の単位投与量として適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な医薬用ビヒクルに関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の治療化合物を含有する。本発明の投与単位形態は、（ａ）組成物および発現させる異種タンパク質の固有の特徴、および達成するべき特定の治療効果によって決定され、直接左右される。
投与経路

当業者は、１より多くの経路を投与のために用いることができるが、特定の経路が別の経路よりも即時的でより効果的な反応を提供することができることを認識するであろう。本発明の組成物のいずれかの投与経路には、吸入、経口、鼻腔、直腸、非経口、舌下、経皮、経粘膜（例えば、舌下、舌、（経）頬側、（経）尿道、膣（例えば、経膣的および膣周囲）、（経）鼻腔、および（経）直腸）、膀胱内、肺内、十二指腸内、胃内、くも膜下腔内、皮下、筋肉内、皮内、動脈内、静脈内、気管支内、吸入、および局所投与が挙げられる。
キット

一部の実施形態では、本明細書に記載されるように、所与の疾患、障害または症状、またはその症状を処置、防止、または寛解させるためのキットが提供され、このキットは、ａ）本明細書に記載される化合物または組成物；および、必要に応じて、ｂ）本明細書に記載される追加の薬剤または治療を含む。キットは、疾患、障害または症状を処置、防止、または寛解させるためにキットを使用するための説明書またはラベルをさらに含むことができる。さらに他の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるように、所与の疾患、障害または症状、またはその症状についてのキットアッセイ（ｋｉｔｓ ａｓｓａｙ）にまで及ぶ。そのようなキットは、例えば、ＰＣＲまたは他の核酸ハイブリダイゼーション技術（マイクロアレイ）からの試薬、または免疫学的な検出技術（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ）のための試薬を含んでよい。

実施例
次に、以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本発明は決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。

さらなる説明は行わないが、当業者であれば、前述の説明および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を製造および利用し、特許請求される方法を実施することができると考える。
材料および方法

ＶＬＶダブルプロモーター（ｄｐ）ベクターをＡｓｃＩ／ＳｂｆＩ制限消化によって線状にし、ＶＳＶニュージャージーＧ断片を挿入した（Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｃｈｉａｌｅら、ｖａｃｃｉｎｅｓ ２０２０、８、２７９）。ニュージャージーベシクロウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質をコードするＤＮＡ断片は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより遺伝子合成され、第２のサブゲノムプロモーターの下流のＡｓｃＩとＳｂｆＩのクローニング部位に注入された。得られたＶＬＶ ｄｐ ＶＳＶニュージャージーＧベクターをＢａｍＨＩ／ＰａｃＩで消化し、ＩＬ１２およびＣＡＲＧ２０２０インサートを第１のサブゲノムプロモーターの下流にクローニングするために使用した。

ＶＳＶニュージャージーＧ構築物を用いて一本鎖ＩＬ－１２をｄｐ－ＩＬ１２にクローニングするために、マウスＩＬ１２ｐ４０およびＩＬ１２ｐ３５断片をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃよりストリングフラグメントとして合成した。ｐ４０およびｐ３５断片は、エラスチンリンカー配列の拡張（（ｇｔｔｃｃｔｇｇａｇｔａｇｇｇ／ｇｔｃｃｃａｇｇｔｇｔｇｇｇｃ（ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ））と隣接するＢａｍＨＩおよびＰａｃＩクローニング部位を用いて修飾されたプライマー対を使用してＰＣＲ増幅された。すべてのＰＣＲ断片は、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼで増幅され、ゲルから精製され、第１のサブゲノムプロモーターの下流のＶＬＶ ｄｐ ＶＳＶＧニュージャージーベクターＢａｍＨＩ／ＰａｃＩクローニング部位に注入された。

ＩＬ１７ＲＡ ＥＣＤ ＨＡタグと３つのｓｈＲＮＡフラグメントを結合させるために、１７Ａ受容体ドメインの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）部分（Ｎ末端９７２ｂｐ断片）を、ＨＡタグ配列（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を含む改変リバースプライマーでＰＣＲ増幅した。ＰＤＬ１ 遺伝子の４８６，３７３と９の位置を標的とする３つのマウスｓｈＲＮＡ配列は、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより合成された。ＩＬ１７ＲＡ ＥＣＤ ＨＡ断片とｓｈＲＮＡ断片を注入するために、両方の断片をゲルから精製し、第１のサブゲノムプロモーターの下流にあるＶＬＶ ｄｐ ＶＳＶＧニュージャージーベクターＢａｍＨＩ／ＰａｃＩクローニング部位に注入した。

最終的なトリプルサブゲノムプロモーター（Ｔｐ）ＣＡＲＧ－２０２０ ＶＳＶ ニュージャージーＧ構築物をクローニングするために、全長ＩＬ１２断片、およびサブゲノムプロモーター配列（上記で生成）を含むＩＬ１７ ＲＡ ＥＣＤ ＨＡタグ／ｓｈＲＮＡ断片を、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅させた。すべてのＰＣＲ断片をゲルから精製し、第１のサブゲノムプロモーターの下流のＶＬＶ ｄｐ ＶＳＶＧニュージャージーベクターＢａｍＨＩ／ＰａｃＩクローニング部位に注入した。このクローニングステップにより、ＩＬ１２とＩＬ１７ＲＡ ＥＣＤの間に余分なサブゲノムプロモーターが作成される。

ＤＮＡ断片を増幅するすべてのプライマーは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒの説明書に従って設計し、ＮＥＢ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ｅ５５２０Ｓ）に従って注入した。組換えクローンは、陽性のインサートについてＤＮＡ制限消化によりスクリーニングした。最終的な陽性クローンは、ＤＮＡシーケンシング（ＧＥＮＥＷＩＺ、ＮＪ）によってさらに確認された。
実施例１：ＩＬ－１２サイトカインを発現するＶＬＶ

ＩＬ－１２ポリペプチド（配列番号２）を産生する能力のあるＶＬＶを生成するために、図４に示されるように、いくつかの配列要素、すなわち、ＤＮＡプロモーター配列、セムリキ森林熱ウイルス非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＳＦＶ ｎｓｐ１～４）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＶＳＶ－Ｇ；配列番号１１）、ＩＬ－１２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を用いて、高力価ハイブリッドウイルスベクター（Ｄｐ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１２）を構築した。

ＢＨＫ－２１細胞に、Ｄｐ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１２高力価ハイブリッドウイルスベクターを標準的なプロトコールを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＶＬＶ産生を進行させるために、緩衝液中で４８時間インキュベートされた。トランスフェクトされていない細胞をコントロールとしてインキュベートした。インキュベーション期間後、抗ＩＬ－１２ウエスタンブロットでＩＬ－１２の存在について上清を試験し、ＩＬ－１２はトランスフェクトされた細胞の上清で観察されたが、コントロールでは観察されなかった。
実施例２：分泌されたＩＬ－１２の定量化

４８時間のインキュベーション（実施例１を参照）の後に分泌されたＩＬ－１２の量を、ＵＶ－可視分光法を用いて測定した。検量線は、０～５００ｐｇ／ｍＬの濃度範囲のＩＬ－１２ｐ７０の様々な希釈液を使用して作成した。較正データ曲線を下の表２に示す。
表３．分泌されたＩＬ－１２の紫外可視分光法による定量化のための較正曲線。

線形最良適合により、表３に示す式を得た。上清の光学濃度（ＯＤ）を４，０００倍希釈で測定して、上清１ｍＬあたり０．７４５μｇのＩＬ－１２に相当する０．３９４５のＯＤ比率４５０／７５０ｎｍを得た。この値は、１００万個のトランスフェクトされた細胞あたり２μｇのＩＬ－１２が産生されることに相当する。
実施例３：マウスにおけるＶＬＶ－ＩＬ－１２投与は腫瘍体積を制限する

ＭＣ３８細胞をシンジェニックマウス系統に皮下移植して、マウスの皮下で腫瘍を増殖させた。ＩＬ－１２を産生するＶＬＶ（実施例１；ＶＬＶ－ＩＬ－１２参照）が産生され、注射用のＰＢＳ緩衝液中の組成物として調製された。ＶＬＶを含まないＰＢＳ緩衝液をコントロールとして使用した。実験デザインと時間軸を、図５に得られた結果とともに示す。０日目に、ＭＣ３８細胞を皮下に移植し、４日間増殖させた後、４、６、８、１０、１２、１４日目に、ＶＬＶ組成物かＰＢＳコントロールのいずれかを投与した。処置またはコントロールが投与されたそれぞれの日に、ノギスによる測定値から腫瘍体積を計算した。結果は、ＶＬＶ－ＩＬ－１２の投与がコントロールと比較して処置されたマウスの腫瘍増殖を有意に制限したことを示し、ＶＬＶ－ＩＬ－１２が効果的な処置であることを示している。
実施例４：ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮを発現するＶＬＶ

ドミナントネガティブＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ポリペプチド（配列番号４）を産生する能力のあるＶＬＶを生成するために、図６に示されるように、いくつかの配列要素、すなわち、ＤＮＡプロモーター配列、セムリキ森林熱ウイルス非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＳＦＶ ｎｓｐ１～４）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＶＳＶ－Ｇ；配列番号１１）、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）を用いて、高力価ハイブリッドウイルスベクター（Ｄｐ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１７ＲＡ）を構築した。

ＢＨＫ－２１細胞に、Ｄｐ－Ｇ（ＮＪ）－ＩＬ１７ＲＡ高力価ハイブリッドウイルスベクターを標準的なプロトコールを用いてトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞は、ＶＬＶ産生を進行させるために、緩衝液中で４８時間インキュベートされた。トランスフェクトされていない細胞をコントロールとしてインキュベートした。インキュベーション期間後、ウエスタンブロットでＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮの存在について上清を試験し、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮはトランスフェクトされた細胞の上清で観察されたが、コントロールでは観察されなかった。さらに、ＢＨＫ－２１細胞ライセートのウエスタンブロットは、ベクターでトランスフェクトした細胞にＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮが存在することを示した。
実施例５：ＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡチェックポイント阻害剤を発現するＶＬＶ

コードされたｓｈＲＮＡ配列の産生する能力のあるＶＬＶを生成するために、図７Ａに示されるように、いくつかの配列要素、すなわち、ＤＮＡプロモーター配列、セムリキ森林熱ウイルス非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＳＦＶ ｎｓｐ１～４）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＶＳＶ－Ｇ；配列番号１１）、および１または複数のｓｈＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列をそれぞれ用いて、４つの高力価ハイブリッドウイルスベクターを構築した。１つのベクターにはコントロールとしてスクランブルされたｓｈＲＮＡ（Ｓｃｒ）が含まれ、３つのベクターにはｓｈＲＮＡ４８６配列、ｓｈＲＮＡ３７３配列、またはｓｈＲＮＡ４８６／３７３配列が含まれていた。

４つの異なるベクターのＶＬＶは、実施例１および４に記載されているように、ＢＨＫ－２１細胞で産生させた。次に、ＰＤ－Ｌ１を発現しているＢＨＫ－２１細胞を、産生されたＶＬＶで処置した。スクランブルされた（Ｓｃｒ）ｓｈＲＮＡを発現しているＶＬＶは、ＰＤ－Ｌ１抑制の抑制を示さなかったが、ｓｈＲＮＡ４８６配列、ｓｈＲＮＡ３７３配列、またはｓｈＲＮＡ４８６／３７３を発現している各々のＶＬＶは、ＰＤ－Ｌ１の抑制を示した。これらの結果は、ＶＬＶを、癌および悪性腫瘍に関連する遺伝子標的に対して有効な１またはそれを超えるｓｈＲＮＡを発現するように設計することができることを示している。
実施例６：三価のＣＡＲＧ２０２０ ＶＬＶ

ＩＬ－１２ポリペプチド（配列番号２）、ドミナントネガティブＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ポリペプチド（配列番号４）、およびＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤ｓｈＲＮＡ４８６／３７３／９の３つすべてを産生する能力のあるＶＬＶを生成するために、図８に示されるように、いくつかの配列要素、すなわち、ＤＮＡプロモーター配列、セムリキ森林熱ウイルス非構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＳＦＶ ｎｓｐ１～４）、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列（ＶＳＶ－Ｇ；配列番号１１）、ＩＬ－１２をコードするＤＮＡ配列（配列番号１）、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）、およびｓｈＲＮＡ４８６／３７３／９をコードするＤＮＡ配列（配列番号５）を用いて、高力価ハイブリッドウイルスベクター（Ｔｐ－ＩＬ１２－ＩＬ１７ＲＡ／ｓｈＲＮＡ－Ｇ（ＮＪ）；ＣＡＲＧ２０２０）を構築した。

三価のＣＡＲＧ２０２０ベクターのＶＬＶは、実施例１および４に記載されているように、ＢＨＫ－２１細胞で産生させた。ポリペプチド産物は、ウエスタンブロットを使用して検出され、三価のＶＬＶがＩＬ－１２、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ、およびＶＳＶ糖タンパク質（ＶＳＶＧ）を産生できることを示している。ＰＤ－Ｌ１を発現するＢＨＫ－２１細胞におけるインビボでのＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションは、ＣＡＲＧ２０２０ ＶＬＶ（ｓｈＲＮＡ４８６／３７３／９を含有）が、ｓｈＲＮＡを含まないコントロールのＶＬＶ ＩＬ－１２よりも効率的にＰＤ－Ｌ１をダウンレギュレートしたことを示した。
実施例７：マウスにおける三価のＣＡＲＧ２０２０ ＶＬＶの投与は腫瘍体積を制限する

実験デザインおよび結果は図９に示されている。ＭＣ３８腫瘍細胞を０日目にマウスの脇腹の皮膚に移植し、続いてＧＦＰ－ＶＬＶコントロール、ＩＬ－１２－ＶＬＶ、または三価のＣＡＲＧ２０２０ ＶＬＶのいずれかを１５日、１７日、および２１日に１回あたり５×１０^７個の粒子量で注射した。ＧＦＰ－ＶＬＶコントロールを投与されていない処置動物では、腫瘍体積が抑制され、三価のＣＡＲＧ－２０２０ ＶＬＶが活性であり、腫瘍増殖を抑制できることが示された。長期の処置およびモニタリングにより、三価のＣＡＲＧ－２０２０ ＶＬＶで処置した７匹のマウスのうち５匹が完全な腫瘍の根絶を達成したことが示された。
実施例８：ＣＡＲＧ２０２０はＴｈ１免疫を活性化し、腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１およびＩＬ－１７関連シグナル伝達をダウンレギュレートする。

腫瘍免疫におけるＣＡＲＧ－２０２０とＶＬＶ－ＩＬ－１２の効果を試験するために、本発明者らは腫瘍内注入を介して２回の用量でＭＣ３８腫瘍を処置した（図１０Ａ）。２回目の投与から４日後にマウスを屠殺し、それらの腫瘍および脾臓をフローサイトメトリーおよびｑ－ＲＴ－ＰＣＲで分析した。ＣＡＲＧ－２０２０とＶＬＶ－ＩＬ－１２は両方とも脾臓および腫瘍で強力なＴｈ１武装免疫活性化を誘導し、これらの薬剤の強い免疫模倣活性を示唆している（図１０Ｂ）。ＣＡＲＧ－２０２０およびＶＬＶ－ＩＬ－１２の処置はまた、腫瘍における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）の数を減少させ（図１０Ｃ）、腫瘍および脾臓においてＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性が大幅に増加した（図１０Ｄ、Ｅ）。ＶＬＶ－ＩＬ－１２と比較して、ＣＡＲＧ－２０２０は腫瘍内のＰＤ－Ｌ１、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ ｍＲＮＡのレベルを低下させ、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡおよびＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮ導入遺伝子の有効性を示している。
実施例９：ＶＬＶは腫瘍溶解性である

正常なネズミ線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３をＣＦＳＥ染料（緑色）で標識し、線維肉腫を引き起こすＬ９２９株の腫瘍形成性線維芽細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０（赤色）で標識した。細胞を共培養し、モック処置（コントロール）するか、または感染多重度（ＭＯＩ）１０のＶＬＶで処置した。７２時間のインキュベーションが経過した後、蛍光顕微鏡を使用して細胞を観察した。顕微鏡画像は、Ｌ９２９のほとんどがＶＬＶの複製に起因するアポトーシスを起こしているが、正常なＮＩＨ３Ｔ３は溶解していないことを示している。
実施例１０：結腸癌細胞、卵巣癌細胞および急性リンパ芽球性白血病細胞における腫瘍溶解性の同定

腫瘍溶解性の同定は、フローサイトメトリー分析によって実施された。生／死細胞染色用キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（商標）７８０（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、６５－０８６５－１４））を、製造ユーザーマニュアルに従って使用した。手短に言えば、細胞をトリプシン処理によって回収し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間４℃で遠心分離し、１００ｕｌの細胞を各ウェルに含む９６ウェルプレート（５×１０^４細胞／ウェル）を使用して細胞を三つ組で再懸濁し、遠心沈殿して冷１×ＰＢＳで２回洗浄した。１００ｕｌの生／死染色剤（ＰＢＳで１：１０００に希釈）を各ウェルに加える。暗所で４℃で１５分間インキュベートし；２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄する。１００ｕｌの固定液を添加し、暗所で４５分間４℃でインキュベートし、細胞を透過処理用緩衝液で洗浄し、最初に一次抗体で１時間染色する。２～３回洗浄した後、二次抗体で３０分間染色する。ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、細胞を２００ｕｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリー（セルソーターコア施設（ＵＣＮＮのヘルスセンター）のＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター）分析用にクラスターチューブに移す。

図１Ａに示す結果は、卵巣および結腸癌細胞にＶＬＶが投与されると、これらの細胞が腫瘍溶解プロセスを受けることを示しているヒト細胞では、Ｆ２卵巣癌細胞株とＨＣＴ１１６結腸癌細胞株はともに、投与されたＶＬＶからの腫瘍溶解によって死滅することが観察されている。マウス細胞では、ＴＫＯ卵巣癌とＭＣ３８結腸癌細胞株はともに、投与されたＶＬＶからの腫瘍溶解（ｏｎｃｏｌｏｓｉｓ）によって死滅することが観察されている。

図１Ｂの結果は、ＭＮ６０、ＲＥＨ、およびＲＳ４，１１の急性リンパ芽球性白血病Ｂ型癌細胞株が、ＶＬＶの投与の結果として異なる程度の腫瘍溶解を受けることを示している。最も分化度の低いＲＳ４，１１癌細胞株は、ＶＬＶ投与によって最も効果的に死滅し、細胞株の分化度が高くなると、腫瘍溶解はあまり一般的ではなくなる。さらに、より多くの用量のＶＬＶから腫瘍溶解が増強される（５ＭＯＩに対して１感染多重度（ＭＯＩ））ことが見られる。正常なＢ細胞は、ＲＥＨおよびＲＳ４－１１細胞株と比較して有意な腫瘍溶解を受けなかった。これらの結果は、ＶＬＶが悪性腫瘍および化学療法抵抗性白血病の処置に対して高い臨床的価値を有することを示す。
実施例１１：腫瘍溶解経路分析

ＶＬＶは、悪性腫瘍および癌細胞に対して腫瘍溶解性であることが観察されているが、正常細胞に対しては腫瘍溶解性ではない。腫瘍溶解経路を、ウエスタンブロットを使用してさらに調査した（図３）。ＨＣＴ１１６癌細胞を、示された時点に５ＭＯＩのＶＬＶ（ＶＬＶ－ＧＦＰおよびＶＬＶ－ｄｅｐＣＣ２（ｍＩＬ３５））で感染させた。細胞を、トリプシン処理、ペレットの溶解、およびウエスタンブロットによって回収した。ＰＡＲＰ１、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＴＮＦα、β－アクチンに対する一次抗体を、細胞死関連タンパク質を検出するために、またはローディングコントロールとして使用した。（一次抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから、二次抗マウスまたはウサギＩｇＧ ＨＲＰは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）。

結果は、ＨＣＴ１１６癌細胞株を５ＭＯＩのＶＬＶで感染させると、カスパーゼ８およびカスパーゼ９の活性化、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の発現、およびポリ（ＡＤＰ）リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断が誘導されることを示しており、癌細胞の腫瘍溶解がアポトーシス機構を通して起こることを示している（図３）。
参照による組み込み

本明細書において言及される、補正証明書、特許出願文書、科学記事、政府報告書、ウェブサイト、および他の参考文献を含む、各特許文書の完全な開示は、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる。用語に矛盾がある場合には、本明細書が優先される。
等価物

本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、その他の特定の形態で具体化することができる。前述の実施形態は、本明細書に記載の本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。本発明の組成物および方法の様々な実施形態において、含むという用語が、組成物または方法の列挙されたステップに関して使用される場合、その組成物および方法は、列挙された組成物またはステップまたは構成要素から本質的になるか、またはそれからなることも企図される。さらに、本発明が動作可能である限り、ステップの順序または特定のアクションを実行するための順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２またはそれを超えるステップまたはアクションを同時に実行することもできる。

本明細書において、単数形は、文脈上明らかに示されている場合を除き、複数形も含む。別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。矛盾がある場合には、本明細書が優先される。

さらに、特定の例では、組成物は、混合する前の、または乾燥、バインダ除去、加熱、焼結などのさらなる処理ステップの前の成分で構成されていると説明することができることが認識されるはずである。特定の成分がさらに反応したり、新しい材料に変換されたりする可能性があることは認識されている。

本明細書で使用されるすべての百分率および比率は、示されているように、体積（体積／体積）または重量（重量／重量）に基づいているか、または他に示されている通りである。

Claims (44)

1. 以下の動作可能に連結された配列要素：
   ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
   ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
   ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
   ｄ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む、第４のＤＮＡ配列、
   ｅ）ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする第５のＤＮＡ配列、を含む悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための高力価ハイブリッドウイルスベクター。
2. 前記第１のＤＮＡ配列の前記ＤＮＡプロモーター配列が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの構成的プロモーターを含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
3. 前記ＤＮＡプロモーター配列が、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの構成的プロモーターを含む、請求項２に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
4. 前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である、請求項２に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
5. 前記第２のＤＮＡ配列の前記アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列が、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列である、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
6. 前記第２のＤＮＡ配列によってコードされる前記ＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が、１またはそれを超えるアミノ酸変異を含む、請求項５に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
7. 前記ＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が、配列番号１３に対して少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
8. 前記ＳＦＶ非構造タンパク質ポリペプチド配列が、配列番号１３を含む、請求項６に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
9. 前記第２のＤＮＡ配列の前記アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列が、アルファウイルスＲＮＡ依存性ポリメラーゼを含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
10. 前記アルファウイルスＲＮＡ依存性ポリメラーゼが、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）ＲＮＡ依存性ポリメラーゼである、請求項９に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
11. 前記第３のＤＮＡ配列の前記アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターが、セムリキ森林熱ウイルス（ＳＦＶ）サブゲノムＲＮＡプロモーターである、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
12. 前記第４のＤＮＡ配列が、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３５、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１７、Ｆｌｔ３Ｌ、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択されるサイトカインアゴニストまたはアンタゴニストポリペプチドをコードする少なくとも１つの配列ドメインを含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
13. 前記第４のＤＮＡ配列が、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９０、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＰＤ－１、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択されるｓｈＲＮＡポリヌクレオチドチェックポイント阻害剤をコードする少なくとも１つの配列ドメインを含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
14. 前記第４のＤＮＡ配列が３つの配列ドメインを含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
15. 前記第４のＤＮＡ配列が、
    ａ）ＩＬ－１２をコードする配列ドメイン、
    ｂ）ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードする配列ドメイン；および
    ｃ）ＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡをコードする配列ドメイン
    を含む、請求項１４に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
16. 前記第４のＤＮＡ配列が、
    ａ）配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、
    ｂ）配列番号８と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン；および
    ｃ）配列番号１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン
    を含む、請求項１４に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
17. 前記第４のＤＮＡ配列の各配列ドメインの前に、サブゲノムプロモーター、２Ａペプチド配列をコードする配列、またはそれらの組合せからなる群から独立して選択される配列がある、請求項１６に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
18. 前記高力価ハイブリッドウイルスベクターが三価であり、前記第４のＤＮＡ配列が３つの配列ドメインからなる、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
19. 前記第４のＤＮＡ配列が、
    ａ）サブゲノムプロモーター配列と、ＩＬ－１２をコードする配列ドメイン、
    ｂ）サブゲノムプロモーター配列と、ＩＬ－１７ＲＡ－ＤＮをコードする配列ドメイン；および
    ｃ）サブゲノムプロモーター配列と、ＰＤ－Ｌ１－ｓｈＲＮＡをコードする配列ドメイン
    からなる、請求項１８に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
20. 前記第４のＤＮＡ配列が、
    ａ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号６と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン、
    ｂ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号８と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン；および
    ｃ）サブゲノムプロモーター配列と、配列番号１０と少なくとも７０％の配列同一性を有する配列ドメイン
    からなる、請求項１９に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
21. 前記第４のＤＮＡ配列が、ＴＤＯ、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、およびそれらの組合せからなる群から選択される免疫抑制調節因子のポリヌクレオチドまたはポリペプチド阻害剤をコードする配列ドメインをさらに含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
22. 前記第４のＤＮＡ配列の前記配列ドメインのそれぞれが、単一または複数のサブゲノムプロモーターの制御下で発現し、単一または複数のサブゲノムＲＮＡをもたらす、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
23. 前記第４のＤＮＡ配列の前記配列ドメインのそれぞれが、リボソームスキッピング２Ａペプチドを含む共通サブゲノムＲＮＡから同時翻訳される、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
24. 前記悪性腫瘍または感染性疾患の単一または複数の特異的抗原を発現する発現カセットを含む第６のＤＮＡ配列をさらに含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター；および
25. 前記発現カセットが腫瘍または感染病原体の特異的抗原を発現して、前記抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答を誘導する、請求項２３に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
26. 前記第５のＤＮＡ配列の前記ベシクロウイルス糖タンパク質が、水疱性口内炎インディアナウイルス、水疱性口内炎ニュージャージーウイルス、チャンディプラウイルスまたは構造的に関連するベシクロウイルスのエンベロープ糖タンパク質を含む、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
27. ウイルス様小胞（ＶＬＶ）１ｍＬあたり少なくとも５×１０^７個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価が得られる、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
28. ウイルス様小胞（ＶＬＶ）１ｍＬあたり少なくとも１×１０^８個のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価が得られる、請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクター。
29. 以下の動作可能に連結された配列要素：
    ａ）ＤＮＡプロモーター配列を含む第１のＤＮＡ配列、
    ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質ポリヌクレオチド配列をコードする第２のＤＮＡ配列、
    ｃ）アルファウイルスサブゲノムＲＮＡプロモーターをコードする第３のＤＮＡ配列、
    ｄ）前記悪性腫瘍または感染性疾患の単一または複数の特異的抗原を発現する発現カセットを含む第４のＤＮＡ配列；および
    ｅ）ベシクロウイルス糖タンパク質をコードする第５のＤＮＡ配列、を含む腫瘍溶解性ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を生成するための高力価ハイブリッドウイルスベクター。
30. 請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより生成されるレプリコンＲＮＡを含有するウイルス様小胞（ＶＬＶ）。
31. 前記レプリコンＲＮＡが、プラス鎖をキャップされポリアデニル化されている、請求項３０に記載のＶＬＶ。
32. 請求項１に記載の高力価ハイブリッドウイルスベクターにより産生されたウイルス様小胞（ＶＬＶ）を含む組成物。
33. 前記ＶＬＶが自己複製する、請求項３０または３２に記載のＶＬＶ。
34. 前記ＶＬＶが腫瘍溶解性である、請求項３０または３２に記載のＶＬＶ。
35. 前記ＶＬＶがキャプシドを含まない、請求項３０または３２に記載のＶＬＶ。
36. 悪性腫瘍または感染性疾患の処置、予防、または防止のための、ウイルス様小胞（ＶＬＶ）を産生する方法であって、
    ａ）サイトカインアゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、サイトカインアンタゴニストポリペプチドをコードする配列ドメイン、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする配列ドメイン、およびそれらの組合せからなる群からそれぞれ独立して選択される少なくとも１つの配列ドメインを含む高力価ウイルスベクターを生成するステップと、
    ｂ）ステップ（ａ）の前記高力価ウイルスベクターでＢＨＫ－２１細胞をトランスフェクトするステップと、
    ｃ）ステップ（ｂ）の前記トランスフェクトされたＢＨＫ－２１細胞を緩衝液中で適切な時間および適切な適切な温度でインキュベートしてＶＬＶを増殖させるステップと、
    ｄ）限外濾過、遠心分離、タンジェンシャルフロー濾過、アフィニティー精製、イオン交換クロマトグラフィー、およびそれらの組合せからなる群から選択される技術によって、前記ＶＬＶを前記ＢＨＫ－２１細胞および緩衝液から単離するステップとを含み、
    ステップ（ｄ）の前記単離により、高力価のＶＬＶが得られる方法。
37. 対象において悪性腫瘍を処置および防止する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項３２に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
38. 感染性疾患を有する対象を処置する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項３２に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
39. 感染性疾患に対して対象を免疫化する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項３２に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
40. 悪性腫瘍に関連する遺伝子をダウンレギュレーションする方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項３２に記載の組成物を、それを必要とする哺乳動物の対象に投与することを含む方法。
41. 前記遺伝子が、ＰＤ－Ｌ１、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記哺乳動物対象がヒトまたは動物である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
43. 悪性腫瘍または感染性疾患の、必要とする哺乳動物対象における前記処置、予防、または防止のための薬物の製造における請求項３２に記載の組成物の使用。
44. 前記哺乳動物対象がヒトまたは動物である、請求項４３に記載の使用。

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