CN115397838A

CN115397838A - 溶瘤病毒样囊泡的组合物和使用方法

Info

Publication number: CN115397838A
Application number: CN202180020228.5A
Authority: CN
Inventors: B·阿尔玛西亚; V·纳卡尔; 马先勇; B·R·玛迪娜; 王克鹏; T·亚罗温斯基
Original assignee: Carogan
Current assignee: Carogan
Priority date: 2020-01-10
Filing date: 2021-01-08
Publication date: 2022-11-25
Also published as: US20230063041A1; JP2023509966A; EP4087858A1; WO2021142366A1

Abstract

本发明涉及产生病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体以及用于靶向恶性肿瘤或感染性疾病的其组合物和方法。VLV是无衣壳、自我复制的人工病毒平台，所述人工病毒平台携带正链加帽且多聚腺苷酸化的RNA，所述RNA编码体外进化的西门利克森林病毒(SFV)RNA依赖性RNA复制酶和水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白。本发明的VLV及其药物组合物编码可用于治疗、防预和预防恶性肿瘤和感染性疾病的方法中的多核苷酸和/或多肽治疗剂。

Description

溶瘤病毒样囊泡的组合物和使用方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C§119(e)要求2020年1月10日提交的美国临时申请号62/959,435的优先权，将所述申请通过引用以其整体特此并入本文。

序列表

本申请含有已以ASCII格式电子提交的序列表并且将其通过引用以其整体特此并入。所述ASCII拷贝创建于2021年1月7日，命名为25133-8-104384-101_SL.txt，并且大小为51,554字节。

技术领域

本发明涉及产生病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体以及用于靶向恶性肿瘤或感染性疾病的其组合物和方法。VLV是一种无衣壳、自我复制的人工病毒平台，所述人工病毒平台携带正链加帽且多聚腺苷酸化的RNA，所述RNA编码体外进化的西门利克森林病毒(SFV)RNA依赖性RNA复制酶和水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白。本发明的VLV及其药物组合物编码可用于治疗、防预和预防恶性肿瘤和感染性疾病的方法中的多核苷酸和/或多肽治疗剂。

背景技术

溶瘤病毒可以靶向癌细胞并且在癌细胞中特异性复制，导致癌细胞溶解和/或死亡。这些病毒可以表达转基因，所述转基因可以将病毒引导至癌细胞，增加其激活T细胞浸润或活性的潜力，或赋予多种其他增强溶瘤作用的活性。

已经构成并且临床测试了许多形式的溶瘤病毒。然而，仅单一种溶瘤病毒被批准用于医疗用途：talimogene laherparepvec(T-VEC)，T-VEC是经基因修饰的疱疹病毒，其表达用于恶性黑色素瘤的转基因粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。不幸的是，T-VEC由于其活性有限而具有微乎其微的商业成功。T-VEC和许多其他类型的溶瘤病毒缺乏成功可能是由于多种因素，包括：

-预先存在的中和抗体免疫；

-经由先天免疫通路(补体、干扰素通路)快速清除；

-转基因表达导致差的病毒复制能力；

-转基因表达可以促进病毒的免疫清除；

-无法在肿瘤中诱导足够的先天免疫反应；

-添加一个或多个转基因的容量有限；

-残留太大致病性；

-难以大规模制造。

已用于溶瘤活性的病毒包括细小病毒、腺病毒、疱疹病毒(如上述的T-VEC)、痘病毒、小核糖核酸病毒、甲病毒、逆转录病毒、副粘病毒、弹状病毒和呼肠孤病毒。然而，这些类型的病毒中的每一种具有上面列出的影响其成功的一个或多个缺陷。

病毒样囊泡(VLV)是一种无衣壳、自我复制的人工病毒平台，所述人工病毒平台携带正链加帽且多聚腺苷酸化的RNA，所述RNA编码体外进化的西门利克森林病毒(SFV)RNA依赖性RNA复制酶和水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白。VLV能够克服天然病毒载体所具有的许多缺陷。作为缺乏编码的衣壳蛋白的人工病毒，VLV是非致病性的。缺乏衣壳蛋白还避免了对包装到VLV中的RNA的大小的任何限制，因此允许非常大的RNA包装容量以及转基因抗原或蛋白质的表达。源自不会在人群中流行的动物病毒，预先存在的中和免疫可能很少或不存在。VLV可以生长至高滴度，从而能够实现大规模制造。对于溶瘤病毒而言，VLV的这些特征是理想的。

于2018年6月5日公布并且通过引用以其整体并入本文的Robek等人的美国专利9,987,353涉及用于使用由高滴度杂合乙型肝炎病毒载体产生的VLV组合物进行治疗性免疫以治疗慢性乙型肝炎的组合物和方法。

于2019年10月8日公布并且通过引用以其整体并入本文的Rose等人的美国专利10,435,712涉及使用高滴度杂合病毒载体进行免疫的组合物和方法。其中产生进化的VLV组合物的高滴度杂合病毒载体包含具有多个突变的甲病毒非结构蛋白。

发明内容

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作地连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

d)包含至少一个序列结构域的第四DNA序列，每个序列结构域独立地选自由编码细胞因子激动剂多肽的序列结构域、编码细胞因子拮抗剂多肽的序列结构域、编码短发夹RNA(shRNA)的序列结构域及其组合组成的组，

e)编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述第一DNA序列的DNA启动子序列包括用于RNA依赖性RNA聚合酶的组成型启动子。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述DNA启动子序列包括用于噬菌体RNA聚合酶的组成型启动子。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述启动子序列是巨细胞病毒(CMV)启动子序列。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第二DNA序列的甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列是西门利克森林病毒(SFV)非结构蛋白多核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中由第二DNA序列编码的SFV非结构蛋白多肽序列包含一个或多个氨基酸突变。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述SFV非结构蛋白多肽序列包括与SEQ ID NO.13具有至少约70％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述SFV非结构蛋白多肽序列包括SEQ ID NO.13。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第二DNA序列的甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列包括甲病毒RNA依赖性聚合酶。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述甲病毒RNA依赖性聚合酶是西门利克森林病毒(SFV)RNA依赖性聚合酶。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第三DNA序列的甲病毒亚基因组RNA启动子是西门利克森林病毒(SFV)亚基因组RNA启动子。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列包含至少一个序列结构域，所述至少一个序列结构域编码细胞因子激动剂或拮抗剂多肽，各自独立地选自由IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-19、IL-35、IL-21、GM-CSF、IL-17、Flt3L及其组合组成的组。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列包含至少一个序列结构域，所述至少一个序列结构域编码shRNA多核苷酸检查点抑制剂，各自独立地选自由PD-L2、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD90、BTLA、CD160、PD-1及其组合组成的组。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列包含三个序列结构域。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列包含：

a)编码IL-12的序列结构域，

b)编码IL-17RA-DN的序列结构域；和

c)编码PD-L1-shRNA的序列结构域。

a)与SEQ ID NO.6具有至少70％序列同一性的序列结构域，

b)与SEQ ID NO.8具有至少70％序列同一性的序列结构域；和

c)与SEQ ID NO.10具有至少70％序列同一性的序列结构域。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列的每个序列结构域之前是独立地选自由亚基因组启动子、编码2A肽序列的序列或其组合组成的组中的序列。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述高滴度杂合病毒载体是三价的；并且其中所述第四DNA序列由三个序列结构域组成。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列由以下组成：

a)亚基因组启动子序列和编码IL-12的序列结构域，

b)亚基因组启动子序列和编码IL-17RA-DN的序列结构域；和

c)亚基因组启动子序列和编码PD-L1-shRNA的序列结构域。

a)亚基因组启动子序列和与SEQ ID NO.6具有至少70％序列同一性的序列结构域，

b)亚基因组启动子序列和与SEQ ID NO.8具有至少70％序列同一性的序列结构域；和

c)亚基因组启动子序列和与SEQ ID NO.10具有至少70％序列同一性的序列结构域。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列进一步包含编码免疫抑制调节因子的多核苷酸或多肽抑制剂的序列结构域，所述免疫抑制调节因子选自由TDO、IDO1、IDO2及其组合组成的组。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列的每个序列结构域在单个或多个亚基因组启动子的控制下表达，产生单个或多个亚基因组RNA。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中第四DNA序列的每个序列结构域是从共享的亚基因组RNA共翻译的，所述共享的亚基因组RNA包含核糖体跳跃2A肽。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，所述高滴度杂合病毒载体进一步包含第六DNA序列，所述第六DNA序列包含表达所述恶性肿瘤或感染性疾病的单个或多个特异性抗原的表达盒；以及。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述表达盒表达肿瘤或感染因子的特异性抗原以诱导针对所述抗原的体液和/或细胞免疫反应。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中所述第五DNA序列的水疱病毒糖蛋白包括水疱性口炎印第安纳病毒、水疱性口炎新泽西病毒、金迪普拉病毒或结构相关水疱病毒的包膜糖蛋白。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中获得至少5×10⁷噬斑形成单位(pfu)/mL病毒样囊泡(VLV)的滴度。

在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，其中获得至少1×10⁸噬斑形成单位(pfu)/mL病毒样囊泡(VLV)的滴度。

在一些实施方案中，本发明涉及用于产生溶瘤病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

d)第四DNA序列，所述第四DNA序列包含表达所述恶性肿瘤或感染性疾病的单个或多个特异性抗原的表达盒；和

e)编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。

在一些实施方案中，本发明涉及由用于产生溶瘤病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体产生的含有复制子RNA的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方案中，本发明涉及由用于产生溶瘤病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体产生的含有复制子RNA的病毒样囊泡(VLV)，其中所述复制子RNA是正链加帽且多聚腺苷酸化的。

在一些实施方案中，本发明涉及组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

e)编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。

在本发明的一些实施方案中，所述VLV是自我复制的。

在本发明的一些实施方案中，所述VLV是溶瘤的。

在本发明的一些实施方案中，所述VLV是无衣壳的。

在一些实施方案中，本发明涉及生产用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的病毒样囊泡(VLV)的方法，所述方法包括以下步骤：

a)产生高滴度病毒载体，所述高滴度病毒载体包含至少一个序列结构域，每个序列结构域独立地选自由编码细胞因子激动剂多肽的序列结构域、编码细胞因子拮抗剂多肽的序列结构域、编码短发夹RNA(shRNA)的序列结构域及其组合组成的组，

b)将BHK-21细胞用步骤(a)的高滴度病毒载体转染，

c)将步骤(b)的转染的BHK-21细胞在缓冲溶液中在合适的温度下孵育合适的时间以繁殖VLV；以及

d)通过选自由超滤、离心、切向流过滤、亲和纯化、离子交换色谱法及其组合组成的组中的技术从所述BHK-21细胞和缓冲溶液中分离所述VLV；

其中步骤(d)的分离产生高滴度的VLV。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗和预防受试者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物或人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有感染性疾病的受试者的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物或人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方案中，本发明涉及免疫受试者以对抗感染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物或人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方案中，本发明涉及下调与恶性肿瘤相关的基因的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物或人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

在一些实施方案中，本发明涉及下调与恶性肿瘤相关的基因的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物或人类受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)，其中所述基因选自由PD-L1、CXCL1、CXCL2及其组合组成的组。

在一些实施方案中，本发明涉及这样的方法，其中有需要的哺乳动物受试者是人或动物。

在一些实施方案中，本发明涉及组合物在制造用于治疗、防预或预防有需要的哺乳动物或人类受试者的恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的用途，所述组合物是包含由用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

d)包含至少一个序列结构域的第四DNA序列，每个序列结构域独立地选自由编码细胞因子激动剂多肽的序列结构域、编码细胞因子拮抗剂多肽的序列结构域、编码短发夹RNA(shRNA)的序列结构域及其组合组成的组。

附图说明

图1.用VLV感染各种化疗抗性癌症系(源自小鼠或人)引起>70％的细胞死亡(图1A)。图1B示出了VLV对几种类型的急性淋巴母细胞白血病B型(B-ALL)癌细胞系MN60、REH和RS4,11的溶瘤作用。VLV以不同的功效杀死不同阶段的这些白血病细胞，因为数据显示VLV对恶性程度更高且分化程度更低的细胞具有更高的溶瘤活性。图1C是常规B细胞和用各自表达的分化标志物标记的不同癌细胞系的图示。

图2.癌细胞系(L929鼠纤维肉瘤细胞)或“正常”(即，非癌性)鼠成纤维细胞系(NIH3T3)的VLV感染的比较显示了受感染癌细胞的选择性死亡。图2A示出了在有或没有VLV的情况下，在感染复数(MOI)为1和10下，在24h后L929癌细胞的显微照片。图2B示出了在有或没有VLV的情况下，在MOI为1和10下，在24h后正常3T3细胞系的显微照片。图2C示出了A和B中的显微照片数据的图形表示。

图3.VLV通过凋亡引起癌细胞的细胞死亡。在蛋白质印迹中用针对指定蛋白质的抗体检测凋亡级联中的蛋白质。

图4.VLV可以在体外表达IL-12。图4A示出了具有IL-12转基因的VLV(DP-G(NJ)-IL12)的序列示意图，其包含DNA启动子(PRO)、编码西门利克森林病毒非结构蛋白(SFVnsp1-4)的序列、编码亚基因组启动子(SGP)的序列、编码水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)的序列、编码SGP的序列和编码IL-12的序列。图4C示出了与未感染细胞相比，来自VLV-IL-12感染的BHK21细胞的细胞上清液的抗IL-12抗体蛋白质印迹证明由VLV-IL-12表达的IL-12是分泌的和可溶的。

图5.将VLV-IL-12接种到荷瘤小鼠中导致肿瘤体积的限制。将MC38细胞皮下移植到同基因小鼠品系中允许肿瘤在小鼠皮肤下生长。用VLV-IL-12接种荷瘤小鼠限制了肿瘤的生长，而接种PBS(对照)的小鼠产生预期尺寸的大肿瘤。具有IL-12转基因的VLV的序列示意图描绘在图4A中。图5A示出了实验设计和时间线的示意图。图5B是肿瘤体积随实验时间变化的图形表示。星号表示统计学意义(P<0.05)。

图6.VLV可以在体外表达IL-17RA。图6A示出了在BHK21细胞中表达IL-17RA胞外结构域(ECD)的具有IL-17RA转基因的VLV(DP-G(NJ)-IL17RA)的示意图。图6B示出了IL-17RA可以在体外表达，如通过抗IL-17蛋白质印迹检测的。

图7.VLV可以产生shRNA，其降低转染细胞中PD-L1的表达。图7A示出了四种不同的VLV-PD-L1shRNA构建体的示意图。图7B)示出了来自PD-L1转染细胞的裂解物的抗PD-L1蛋白质印迹。图7C示出了图7B中的蛋白质印迹数据的图形图示。

图8.包含CARG-2020的三价VLV产生编码的转基因多肽和shRNA。图8A示出了可以表达三种组分：IL-12、IL-17RA-DN和PD-L1shRNA的三价VLV(即，CARG-2020)的示意图。在此上下文中多个亚基因组启动子(SGP)的使用是新颖的。图8B示出了蛋白质印迹，所述蛋白质印迹证明在感染BHK-21细胞后IL-12、IL-17RA-DN和VSV-G多肽各自的表达。图8C示出了对于用缺乏编码PDL1 shRNA的序列的VLV-IL-12处理的动物与包含编码PDL1shRNA的序列的三价VLV(CARG-2020)相比，在MC38同基因CRC小鼠模型中检测的相对PDL1 mRNA的体内比较。用CARG-2020的PDL1下调表明shRNA的产生和功能。

图9.三价VLV有效抑制肿瘤体积。图9A示出了实验设计和时间线的示意图。将MC38肿瘤植入到小鼠皮肤的侧腹。携带GFP、IL-12或CARG2020的VLV以指定间隔以每次注射5×10⁷个颗粒进行瘤内注射。图9B示出了肿瘤体积与自肿瘤接种后天数的关系。基于口径(caliber)测量计算肿瘤体积。图9C示出了对小鼠的CARG-2020处理导致7只处理小鼠中有5只在长期处理和监测下实现了肿瘤完全根除。

图10.在肿瘤细胞注射后第14天和第16天时，将携带MC38肿瘤的小鼠通过肿瘤内注射用指定VLV处理。图10A示出了实验设计和时间线的示意图。将小鼠用GFP对照、VLV-IL-12或三价VLV CARG-2020处理并且在第20天处死，并且收获它们的脾脏和肿瘤组织。图10B-E示出了流式细胞术分析结果。图10F-H示出了PD-L1、CXCL1和CXCL2的q-RT-PCR分析结果。

图11.VLV对在共培养中的NIH 3T3与L929细胞的溶瘤作用。将正常鼠成纤维细胞NIH3T3用CFSE染料(绿色)标记，而将引起纤维肉瘤的致瘤成纤维细胞系L929用eFluor670(红色)标记。将细胞共培养并且进行模拟物处理(对照)或用VLV以感染复数(MOI)为10处理。大多数L929正在经历由VLV复制引起的凋亡，而大多数NIH 3T3细胞则幸免。红色和绿色通道被分开用于灰度表示，其中在图11的四个图中的每一个中，白色或白/灰色度指示在图左侧的行标记中指示的荧光颜色，并且黑色着色是背景，表明没有检测到荧光的区域。

具体实施方式

本发明涉及出乎意料的发现，即病毒样囊泡(VLV)可以配备有一个或多个序列，所述一个或多个序列编码细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、短发夹RNA和其他多核苷酸或多肽，这些物质各自可用于治疗、防预和预防癌症、恶性肿瘤或感染性疾病。本发明的VLV由编码其的高滴度杂合病毒载体产生。病毒样囊泡(VLV)是无衣壳、自我复制的人工病毒平台，其携带编码甲病毒非结构蛋白和水疱病毒糖蛋白的正链加帽且多聚腺苷酸化的RNA。

在一些方面，通过VLV是溶瘤的出乎意料的发现，进一步补充了可用于治疗、防预和预防癌症、恶性肿瘤的本发明VLV。肿瘤细胞、癌细胞、恶性肿瘤细胞或具有恶性肿瘤特征的细胞由于不受约束的VLV复制而允许VLV复制作为裂解过程，而VLV复制在正常细胞中不会不受约束地进行。在正常细胞的一些实例中，VLV复制受到模式识别受体对dsRNA的识别和I型干扰素的诱导的限制，这会阻止在正常细胞中VLV的复制。如果I型干扰素通路受损，诸如在癌症或肿瘤细胞中，则VLV可以不受约束地进行。因此，它们允许VLV复制作为裂解过程进行：一旦VLV复制开始，它会引起宿主细胞蛋白质合成关闭并且引起凋亡。即使肿瘤细胞中缺乏凋亡通路，具有高VLV负荷的细胞也会裂解。

因此，本发明的VLV可以通过其产生一种或多种细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、短发夹RNA和可用于治疗、防预和/或预防恶性肿瘤的其他多核苷酸或多肽以及通过在其自我复制期间进一步具有溶瘤活性而对肿瘤细胞、癌细胞和恶性肿瘤具有至少两种有益作用。在宿主细胞中作为VLV的RNA的复制或翻译产物产生的所述细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、短发夹RNA和可用于治疗、防预和/或预防恶性肿瘤或感染性疾病的其他多核苷酸或多肽可以称为“治疗剂”。

在本发明的一个实施方案中，VLV能够在体外溶瘤几种类型的癌细胞(图1A-C)，包括结肠癌、卵巢癌和急性淋巴母细胞白血病，但在正常哺乳动物细胞中的感染性差(图2)。急性淋巴母细胞白血病B型(B-ALL)癌细胞系MN60、REH和RS4,11的特征在于它们的分化标记物表达，如图1C所示。RS4,11是一种相对小的细胞，其具有规则的形状、精细分散的染色质和一个或多个核仁小斑。RS4,11表达CD38和CD19。REH是一种小/中型尺寸的细胞，其具有规则或锯齿状的形状、精细分散的染色质和/或粗凝聚染色质和一个或多个核仁小斑。REH表达CD38、CD19和CD10。MN60是一种相对中/大型的细胞，其具有不规则和/或分叶状的形状(shapte)、细条和/或均一的染色质，并且具有突出的两个或多个细胞核。MN60表达CD38、CD19、CD10、CD20和IgM。用VLV感染癌细胞系诱导了半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的激活、肿瘤坏死因子(TNF)的表达和聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)的切割，表明癌细胞的溶瘤通过凋亡机制发生(图3)。

在本发明的另一个实施方案中，VLV可以配备有IL-12，即具有抗癌活性的细胞因子。当配备IL-12时，VLV可以感染MC38小鼠结肠癌细胞系和幼仓鼠肾(BHK21)细胞，并且在体外表达分泌的IL-12蛋白(图4)。与用磷酸盐缓冲盐水作为对照处理的小鼠相比，当使用配备IL-12的VLV处理携带MC38肿瘤的小鼠时，肿瘤体积显著减少(图5)。

在另一个实施方案中，VLV可以配备IL-17A受体(IL-17RA)的显性失活(DN)突变体(图6)。IL-17促进肿瘤生长并且抑制抗癌免疫。因此，VLV通过IL-17RA-DN的表达干扰IL-17信号传导应展现出增强的肿瘤病毒活性。

在另一个实施方案中，VLV可以配备针对PD-L1的shRNA，PD-L1是程序性死亡1受体的配体，程序性死亡1受体是当在单独的细胞上表达的配体和受体相互作用时减弱CD8⁺T细胞的活性的免疫检查点蛋白。当表达PD-L1的BHK21细胞被编码PD-L1-shRNA的VLV感染时，shRNA以特定方式抑制PD-L1的表达(不被加扰形式(SCR)的shRNA抑制)(图7)。表达这种shRNA的VLV可以预期具有增强的溶瘤活性，因为募集到肿瘤的CD8 T细胞不会因为PD-L1的缺失而减弱。

在另一个实施方案中，可以制备表达IL-12、IL-17RA-DN和PD-L1-shRNA(CARG2020)的三价VLV(图8)。由于这三种转基因元件之间的协同作用，CARG2020显示出大大增强的抗肿瘤活性(图9)。用IL-12-VLV和CARG2020两者的处理诱导了增强的Th1和CD8⁺T细胞向肿瘤的募集以及增加的其活性水平(图9)。用IL-12-VLV和CARG2020的处理还减少了肿瘤中调节性T细胞的数量(图10)。CARG2020还特异性抑制PD-L1和IL-17靶基因CXCL1和CXCL2的表达(图10)。

在进一步的实施方案中，VLV显示是溶瘤的(图11)。将正常鼠成纤维细胞NIH 3T3用CFSE染料(绿色)标记，而将引起纤维肉瘤的致瘤成纤维细胞系L929用eFluor670(红色)标记。据观察，由于VLV复制的溶瘤作用，致瘤成纤维细胞系L929经历了凋亡，而NIH 3T3没有经历凋亡。

定义

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。除了本文所述的材料和方法之外，与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料或者适合于实施本发明范围的任何方法和材料都可以用于实践或测试本发明。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。还应理解，本文所使的术语仅出于描述特定实施方案的目的并且不旨在是限制性的。

如本文所用，冠词“一(a)”和“一(an)”用于指代一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种)冠词的语法对象。通过举例，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。

如本文所用，术语“对照”或“参考”可互换使用并且是指用作比较标准的值。

“疫苗接种”是指向受试者接种抗原以在受试者中引发免疫反应的过程，所述过程有助于预防或治疗与抗原相关的疾病或障碍。术语“免疫”在本文中可与疫苗接种互换使用。

如本文所用，术语“免疫原性”是指当将抗原或生物体施用于动物时，所述抗原或生物体在动物中引发免疫反应的先天能力。因此，“增强免疫原性”是指当将抗原或生物体施用于动物时增加所述抗原或生物体在动物中引发免疫反应的能力。抗原或生物体引发免疫反应的能力增加可以尤其通过以下测量：较大数量的结合至抗原或生物体的抗体、较大多样的针对抗原或生物体的抗体、较大数量的对抗原或生物体特异的T细胞、对抗原或生物体产生较大的细胞毒性或辅助性T细胞反应、较大的响应于抗原的细胞因子的表达等。

如本文所用，术语“激活”是指细胞在足够的细胞表面部分连接以诱导明显的生化或形态变化后的状态。在T细胞的上下文中，这样的激活是指T细胞的已被充分刺激以诱导细胞增殖的状态。T细胞的激活还可以诱导细胞因子的产生和调节性或细胞溶解效应功能的执行。在其他细胞的上下文中，此术语推断特定物理化学过程的上调或下调。

术语“激活的T细胞”意指当前正在经历细胞分裂、细胞因子产生、调节性或细胞溶解效应功能的执行和/或最近已经历“激活”过程的T细胞。

“体液免疫”或“体液免疫反应”两者是指B细胞介导的免疫，并且由B淋巴细胞(B细胞)产生和分泌的高度特异性抗体介导。

“预防”是指药物组合物用于针对障碍进行疫苗接种的用途。

“佐剂”是指能够加强抗原免疫原性的物质。佐剂可以是一种物质或多种物质的混合物，并且通过直接作用于免疫系统或通过提供抗原的缓慢释放而发挥功能。佐剂的例子是铝盐、聚阴离子、细菌糖肽和缓慢释放剂，作为弗氏不完全佐剂。

“递送媒介物”是指帮助抗原靶向特定细胞并且促进免疫系统有效识别抗原的组合物。最著名的递送媒介物是脂质体、病毒体、包括微球和纳米球在内的微颗粒、聚合物、细菌菌蜕、细菌多糖、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒和ISCOM。

“掺入......中”或“包封在......中”是指在递送媒介物内的抗原肽，所述递送媒介物诸如微颗粒、细菌菌蜕、减毒细菌、病毒样颗粒、减毒病毒、ISCOM、脂质体以及优选病毒体。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可能包括蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，术语是指短链和较长链两者，所述短链在本领域中也通常称为例如肽、寡肽和寡聚体，所述较长链在本领域中通常称为蛋白质，其中有很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

如本文所用，“融合蛋白”是指这样的蛋白质，其中所述蛋白质包含通过肽键或其他化学键连接在一起的两个或多个蛋白质。

蛋白质可以通过肽或其他化学键或用两个或多个蛋白质之间的一个或多个氨基酸直接连接在一起，本文称为“间隔物”。

在本发明的上下文中，使用以下通常存在的核酸碱基的缩写。“A”是指腺苷，“C”是指胞嘧啶，“G”是指鸟苷，“T”是指胸苷，并且“U”是指尿苷。

如本文所用，术语“RNA”定义为核糖核酸。术语“dsRNA”用于定义双链RNA。

“转化(transform)”、“转化(transforming)”和“转化(transformation)”在本文中用于指将分离的核酸引入生物体内部的过程。

如在本发明的上下文中所使的术语“治疗”意在包括针对疾病或障碍的治疗性治疗以及防预性或抑制性措施。如本文所用，术语“治疗”和相关术语诸如“治疗(treat)”和“治疗(treating)”意指疾病状况或其至少一种症状的进展、严重性和/或持续时间的减少。因此，术语“治疗”是指可以使受试者受益的任何方案。治疗可以针对现有病症或可以是防预性的(预防性治疗)。治疗可能包括治愈、缓解或预防效果。本文对“治疗性”和“防预性”治疗的提及被认为在其最广泛的上下文中。术语“治疗性”不一定暗示对受试者进行治疗直到完全康复。类似地，“防预性”不一定意味着受试者将最终不会患上疾病状况。因此，例如，术语治疗包括在疾病或障碍发作之前或之后施用药剂，从而预防或去除疾病或障碍的所有体征。作为另一个实例，在疾病的临床表现之后施用药剂以对抗疾病的症状包括疾病的“治疗”。

术语“生物”或“生物样品”是指从生物体或从生物体的组分(例如，细胞)获得的样品。样品可以是任何生物组织或流体。通常，样品将是“临床样品”，它是源自患者的样品。这种样品包括但不限于骨髓、心脏组织、痰液、血液、淋巴液、血细胞(例如，白细胞)、组织或细针活检样品、尿液、腹膜液和胸膜液或来自其的细胞。生物样品还可以包括组织切片，诸如为了组织学目的而取得的冷冻切片。

术语“等效”在用于提及核苷酸序列时应理解为是指编码功能等效多肽的核苷酸序列。等效的核苷酸序列将包括不同之处在于一个或多个核苷酸取代、添加或缺失的序列，诸如等位基因变体；并且因此将包括由于遗传密码的简并性而不同于本文所述核酸的核苷酸序列的序列。

“杂交”是指核酸链通过碱基配对与互补链结合的任何过程。两条单链核酸在它们形成双链的双链体时“杂交”。双链性区域可以包括单链核酸之一或两者的全长或一条单链核酸的全部和另一条单链核酸的子序列，或者双链性区域可以包括每个核酸的子序列。杂交还包括形成含有某些错配的双链体，条件是两条链仍形成双链螺旋。“严格杂交条件”是指导致基本上特异性杂交的杂交条件。探针与模板核酸的靶位点的术语“特异性杂交”是指探针主要与靶标杂交，使得可以清楚地解释杂交信号。如本文进一步所述，导致特异性杂交的这种条件根据同源区域的长度、所述区域的GC含量、杂交体的解链温度“Tm”而变化。因此，杂交条件将在杂交溶液和洗涤液的盐含量、酸度和温度方面有所不同。

如本文关于核酸诸如DNA或RNA所用的术语“分离的”是指分别与存在于大分子的天然来源中的其他DNA或RNA分离的分子。如本文所用的术语分离的还指当通过重组DNA技术产生时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或当化学合成时基本不含化学前体或其他化学物质的核酸或肽。此外，“分离的核酸”意在包括不作为片段天然存在并且不会在天然状态下发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指与其他细胞蛋白分离的多肽，并且意在涵盖纯化多肽和重组多肽两者。“分离的细胞”或“分离的细胞群体”是不存在于其自然环境中的细胞或细胞群体。

如本文所用，术语“核酸”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)，并且在适当的情况下是指核糖核酸(RNA)。所述术语还应理解为包括作为等效物的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物，并且当适用于所描述的实施方案时包括单链(有义或反义)和双链多核苷酸。EST、染色体、cDNA、mRNA和rRNA是可称为核酸的分子的代表性实例。

当在多核苷酸序列的上下文中使用时，术语“变体”可以涵盖与基因或其编码序列的多核苷酸序列相关的多核苷酸序列。此定义还可以包括例如“等位基因”、“剪接”、“物种”或“多态性”变体。多肽通常将具有相对于彼此显著的氨基酸同一性。多态性变体是给定物种的个体之间特定基因的多核苷酸序列的变化。多态性变体可以涵盖“单核苷酸多态性”(SNP)，其中多核苷酸序列具有一个碱基的变化。SNP的存在可以指示例如某个群体、疾病状态或疾病状态的倾向。

如本文所用，术语“沉默突变”是指构成DNA的核苷酸碱基的序列或同一性的变化，而整体蛋白质功能的氨基酸序列随后没有变化。

术语“改善”或“治疗”意指与疾病相关的临床体征和/或症状由于所执行的动作而减轻。待监测的体征或症状对于熟练的临床医生而言将是众所周知的。

如本文所用，“组合疗法”意指第一药剂与另一种药剂结合施用。“与......组合”或“与......结合”是指除了一种治疗模式之外还施用另一种治疗模式。因此，“与......组合”是指在向个体递送一种治疗模式之前、期间或之后施用另一种治疗模式。这种组合被认为是单一治疗方案或体系的一部分。

“滴度”是与参考样品相比病毒或病毒载体的浓度的数值量度，其中所述浓度由病毒的活性或通过测量单位体积缓冲液中的病毒数量来确定。例如，通过使用软琼脂方法测量病毒的一种或多种溶液(典型地连续稀释液)例如对HeLa细胞的感染性(参见Graham&VanDer eb(1973)Virology 52:456-467)或通过监测赋予细胞的抗性(例如，由病毒或载体编码的G418抗性)或通过UV分光光度法对病毒进行定量(参见Chardonnet&Dales(1970)Virology40:462-477)来确定病毒原液的滴度。在一些实施方案中，滴度以噬斑形成单位(pfu)/mL(pfu/mL)的单位提供。

如本文所用，术语“高滴度”描述了在一些实施方案中至少约1×10⁷pfu/mL、或在一些实施方案中至少约5×10⁷pfu/mL、或在一些实施方案中至少约1×10⁸pfu/mL的滴度。

如本文所用，术语“药物组合物”是指至少一种可用于本发明的化合物与其他化学组分(诸如载体、稳定剂、稀释剂、佐剂、分散剂、助悬剂、增稠剂和/或赋形剂)的混合物。药物组合物有助于将化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于：静脉内、口服、气雾剂、肠胃外、眼科、肺部和局部施用。

措辞“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或载体，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，其参与将一种或多种本发明化合物携带或运输至受试者体内或向受试者携带或运输，使得它可以执行其预期功能。典型地，这种化合物从身体的一个器官或部分被携带或运输至身体的另一个器官或部分。每种盐或载体必须是在与配制品的其他成分相容并且对受试者无害的意义上“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，诸如丙二醇；多元醇，诸如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；造粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；释放剂；包衣剂；甜味剂；调味剂；加香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；定型剂；助悬剂；表面活性剂；保湿剂；载体；稳定剂；以及在药物配制品中使用的其他无毒相容物质，或其任何组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与化合物的活性相容并且对于受试者而言生理学上可接受的任何和所有包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。补充的活性化合物也可以掺入组合物中。

如本文所用，术语“抗体”或“Ab”是指源自特异性结合至抗原上的特定表位的免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。可用于本发明的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、胞内抗体(“内抗体(intrabody)”)、Fv、Fab和F(ab).sub.2，以及单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow et.al,1998,Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow et.al,1989,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.；Houston et.al,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird et.al,1988,Science 242:423-426)。抗体可以源自天然来源或重组来源。抗体典型地是免疫球蛋白分子的四聚体。

如本文所用，术语“抗原”或“Ag”被定义为引发免疫反应的分子。这种免疫反应可能涉及抗体的产生、或特定免疫活性细胞的激活、或两者都有。技术人员应理解，包括几乎所有蛋白质或肽在内的任何大分子都可以用作抗原。此外，抗原可以源自重组DNA或基因组DNA。技术人员应理解，包括编码引发免疫反应的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员应理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。很明显，本发明包括但不限于使用多于一种基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所希望的免疫反应。此外，技术人员应理解抗原根本不需要由“基因”编码。很明显，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

本文使用的“异源抗原”是指对包含或表达抗原的生物体而言不是内源性的抗原。例如，包含或表达病毒或肿瘤抗原的病毒疫苗载体包含异源抗原。如本文所用，术语“异源蛋白”是指在受试者中引发有益的免疫反应的蛋白质，无论其来源如何。

如本文所定义，“甲病毒”是IV组披膜病毒科(Togaviridae)病毒的成员。甲病毒包括但不限于奥拉病毒(Aura virus)、巴班肯病毒(Babanki virus)、巴马森林病毒(BarmahForest virus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、卡巴斯欧病毒(Cabassou virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)、东部马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)、埃弗格赖德病毒(Everglades virus)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、盖塔病毒(Getahvirus)、高地病毒(Highlands virus)、孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)、马雅罗病毒(Mayaro virus)、Me Tri病毒、米德尔堡病毒(Middelburg virus)、莫斯达斯佩德拉斯病毒(Mosso das Pedras virus)、穆坎布病毒(Mucambo virus)、恩杜穆病毒(Ndumu virus)、欧尼恩病毒(O'nyong'nyong virus)、皮克孙纳病毒(Pixuna virus)、里奥内格罗病毒(RioNegro virus)、罗斯河病毒(Ross River virus)、鹭山病毒(Sagiama virus)、鲑鱼胰腺病病毒(Salmon pancreas disease virus)、西门利克森林病毒(Semliki Forest virus)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)、南方象海豹病毒(Southern elephant seal virus)、图那特病毒(Tonate virus)、特罗卡拉病毒(Trocara virus)、乌纳病毒(Una virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、西部马脑炎病毒(Western equineencephalitis virus)和瓦塔罗阿病毒(Whataroa virus)。

如本文所定义，“甲病毒非结构蛋白”可以是nsp1、nsp2、nsp3和nsp4及其组合和变体中的任一种。

如本文所定义，“甲病毒结构蛋白”可以选自由甲病毒衣壳蛋白和至少一种刺突蛋白组成的组。

术语“特异性结合”、“选择性结合”或“结合特异性”是指本发明的人源化抗体或结合化合物以比与非靶表位结合时产生的亲和力更大的亲和力与VSV上存在的靶表位结合的能力。在某些实施方案中，特异性结合是指以与针对非靶表位的亲和力相比大至少10、50、100、250、500或1000倍的亲和力结合至靶标。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”意指由本发明载体产生的病毒样颗粒的量，所述量是预防特定疾病状况所需的或所述量降低疾病状况或其至少一种症状或与其相关的病症的严重程度和/或使其改善。

如本文所用，术语“启动子”定义为由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的DNA序列，其需要启动多核苷酸序列的特异性转录。

如本文所用，术语“启动子/调控序列”意指与启动子/调控序列可操作连接的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，此序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。例如，启动子/调控序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时导致在细胞的大部分或所有生理条件下在细胞中产生基因产物。

“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作连接时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时，才导致在细胞中产生基因产物。

“载体”是这样的物质组合物，其包含分离的核酸并且可以用于将分离的核酸递送至细胞内部。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。在本公开文本中，术语“载体”包括自主复制病毒。

术语“2A”或“2A肽”是自我加工的病毒肽。2A肽可以在单个ORF转录单位中分隔不同的蛋白质编码序列(Ryan et.al,1991,J Gen Virol 72:2727-2732)。最初，2A肽切割被认为是由自身蛋白水解事件介导的，并且2A肽被称为“自切割肽”。最终，提出了核糖体跳跃机制，并且2A和2A样序列现在称为CHYSEL(顺式作用水解酶元件)而不是自切割肽(Donnelly et.al,2001,J Gen Virol 82:1013-1025)，将蛋白质与2A或2A样肽序列连接导致细胞表达源自单个ORF的多种离散蛋白质(基本上等摩尔量)(de Felipe et.al,2006,Trends Biotechnol24:68-75)。

如本文所用，“可操作连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列和以反式或一定距离作用以控制目的基因的表达控制序列两者。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；高效RNA加工信号，诸如剪接和多聚腺苷酸化(聚A)信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当希望时，增强编码产物分泌的序列。存在许多表达控制序列，包括本领域已知的可用于本发明组合物的天然、组成型、诱导型和/或组织特异性启动子。“可操作连接”应解释为除了DNA表达和控制序列之外还包括RNA表达和控制序列。“可操作连接”不应进一步解释为定义被定义为可操作连接以便形成所列举的构建体(诸如载体)的序列元件的任何特定排序，并且可以理解，可操作连接的序列元件可以以任何顺序组装，使得包含可操作连接的序列的构建体对于其预期目的是有用的，即使是粗略的也是如此。

如本文所用，“溶瘤”是指病毒或VLV通过凋亡机制感染和杀死癌细胞的特性。同样，“溶瘤作用”是指病毒或VLV诱导溶瘤的特性。

如本文所用，“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，诸如绵羊类、牛类、猪类、犬类、猫类和鼠类哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。

如本文所用，“水疱病毒糖蛋白”是当掺入编码SFV非结构蛋白的SFV复制子时促进病毒样囊泡的形成的任何合适水疱病毒糖蛋白。在一些实施方案中，所述水疱病毒糖蛋白是水疱性口炎病毒(SFV)糖蛋白。

如本文所用，“恶性肿瘤”是指癌症或肿瘤的状态或存在，并且旨在指代任何癌性状态。术语“恶性肿瘤”还旨在描述具有癌变倾向或可能发展成为癌变倾向的细胞，或具有恶性肿瘤特征的细胞。术语“恶性肿瘤”在本文中可与“癌症”和“肿瘤”互换使用。

如本文所用，“治疗剂”是指VLV的RNA的任何组分或由VLV的RNA编码的任何组分，诸如在宿主细胞中作为VLV的RNA的复制或翻译产物产生的细胞因子激动剂、细胞因子拮抗剂、短发夹RNA和可用于治疗、防预和/或预防恶性肿瘤或感染性疾病的其他多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，VLV可以包含或编码多于一种或多种治疗剂。在仅希望溶瘤作用的一些实施方案中，VLV可能不编码任何治疗剂。用于产生VLV的高滴度病毒载体将包含编码治疗剂的DNA序列并且可以包含亚基因组启动子(SGP)、2A序列或与编码治疗剂的DNA序列相关的其他序列。

如本文所用，“配备(armed)”是指包含或编码一种或多种治疗剂的VLV或高滴度病毒载体的状态。例如，“配备IL-12的VLV”将包含编码IL-12的序列元件。还可以理解，给定的VLV具有编码它的相应高滴度杂合病毒载体，并且因此，为了同一目的而提及“配备有IL-12的高滴度病毒载体”或“配备有IL-12的载体”是适当的。

“百分比同一性”是用于描述多肽的两个或多个多核苷酸之间的序列关系的术语。在一些情况下，给定序列的序列(例如，参见序列表)被称为“参考序列”，所考虑的变体序列与之比较。通常，在参考序列与所考虑的变体的最佳比对之后沿着参考序列的长度进行比较。计算机实现的算法，诸如BLAST家族程序所使用的那些算法，可以用于产生最佳比对，用于比较目的。本发明公开的任何序列可以与参考序列具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的同一性或同源性。

描述

组合物

本发明的高滴度杂合病毒载体包含五个可操作连接的序列元件：包含DNA启动子序列的第一DNA序列；编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列；编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列；包含至少一个序列结构域的第四DNA序列，所述至少一个序列结构域各自独立地选自由编码细胞因子激动剂多肽的序列结构域、编码细胞因子拮抗剂多肽的序列结构域、编码短发夹RNA(shRNA)的序列结构域及其组合组成的组；和编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。当载体在细胞培养物中繁殖时，获得高的病毒样囊泡(VLV)滴度，例如获得至少1×10⁷噬斑形成单位(pfu)/ml的滴度。

制造本发明高滴度杂合病毒载体的方法详细描述在本文的实验实施例部分中。

在一方面，甲病毒是西门利克森林病毒(SFV)。在另一方面，亚基因组RNA启动子是西门利克森林病毒(SFV)启动子。在另一方面，甲病毒非结构蛋白包括RNA依赖性RNA复制酶。在另一方面，西门利克森林病毒(SFV)非结构蛋白包括SFV RNA依赖性RNA复制酶。

在一方面，编码VSV G蛋白的VSV可以来自本领域已知的任何VSV血清型。VSV血清型的非限制性实例包括印第安纳(IND-VSV)血清型和新泽西(NJ-VSV)血清型。在一个实施方案中，NJ-VSV血清型糖蛋白由包含SEQ ID NO.11的DNA序列和包含SEQ ID NO.12的多肽序列定义。在另一个实施方案中，NJ-VSV血清型糖蛋白由DNA序列或多肽序列定义，所述DNA序列或多肽序列包含与SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或同源性的序列。

在一方面，尽管本文举例说明了巨细胞病毒立即早期启动子，但本发明不应被解释为限于此启动子序列。可用于本发明的启动子序列包括诱导高基因表达水平的任何启动子。这种启动子可以包括但不限于本文别处公开的那些。

在本发明组合物的进一步的方面，其包含插入在亚基因组甲病毒启动子与编码VSV G蛋白的DNA之间的编码异源蛋白的DNA，其中编码异源蛋白的DNA与编码来自明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A肽的DNA可操作连接(Szymczak et.al,2004.NatureBiotechnology 22:589-594)，其进而可操作连接至编码VSV G蛋白的DNA。以这种方式，所得的本发明VLV中异质蛋白的表达有效地与VSV G蛋白的表达有关，后者对于载体的复制是必不可少的。因此，异源蛋白的表达被稳定化，并且确保在杂合载体中持续存在表达此蛋白质的基因。

在一些实施方案中，所述2A肽选自由本领域中已知的甲型马鼻炎病毒(E2A)、口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(T2A)或其任何2A肽或片段组成的组。在进一步的实施方案中，所述2A肽是本领域中已知的T2A肽或其任何T2A片段。

在一些实施方案中，异源基因可以处于RNA病毒启动子序列的控制下，所述RNA病毒启动子序列可能不一定是甲病毒亚基因组启动子序列。驱动异源启动子序列表达的RNA启动子序列的这种修饰和变化对于本领域技术人员在实践本发明时将变得显而易见。所述载体还可以包含常规控制元件，所述常规控制元件以允许其在被本发明产生的杂合病毒载体感染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作连接至异源基因。

由载体编码的元件

所述高滴度杂合病毒载体除其他元件外尤其包含：包含至少一个序列结构域的DNA序列，每个序列结构域独立地选自由编码细胞因子激动剂多肽的序列结构域、编码细胞因子拮抗剂多肽的序列结构域、编码短发夹RNA(shRNA)的序列结构域及其组合组成的组。由其产生的VLV包含在shRNA的情况下含有或在多肽的情况下编码当递送至靶细胞或在靶细胞内产生时具有治疗作用的元件的RNA。这种元件被称为“治疗剂”并且可用于治疗、防预和预防恶性肿瘤或感染性疾病。在一些实施方案中，治疗剂是异源蛋白。

本发明的一个重要方面是给定的高滴度杂合病毒载体可以编码几种不同的治疗剂。在一些方面，多种多肽治疗剂可以由给定的高滴度杂合病毒载体编码。在一些方面，多种多核苷酸或shRNA治疗剂可以由给定的高滴度杂合病毒载体编码。在进一步的方面，给定的高滴度杂合病毒载体可以编码一种或多种多肽治疗剂和一种或多种多核苷酸或shRNA治疗剂。

由高滴度杂合病毒载体产生的VLV或包含VLV的组合物包含dsRNA，包括某些治疗剂诸如shRNA，或编码多肽治疗剂。在一些实施方案中，所述VLV或包含VLV的组合物包含或编码单一治疗剂。在一些实施方案中，所述VLV或包含VLV的组合物包含或编码多种治疗剂。在一些实施方案中，所述VLV或包含VLV的组合物包含或编码1-10种治疗剂、或1-7种治疗剂、或1-5种治疗剂、或1-3种治疗剂。在一些实施方案中，所述VLV或包含VLV的组合物是三价的，意味着包含或编码三种治疗剂。

可以理解，可用于治疗、防预和预防恶性肿瘤和/或感染性疾病的任何治疗剂可以掺入本发明的高滴度杂合病毒载体和VLV中。在一些实施方案中，治疗剂与恶性肿瘤或癌症有关。在一些实施方案中，治疗剂是细胞因子激动剂或拮抗剂多肽。在一些实施方案中，治疗剂是shRNA多核苷酸检查点抑制剂。

所编码的细胞因子激动剂或拮抗剂多肽治疗剂可以是对恶性肿瘤或癌症的治疗、防预和/或预防有用或在其中起作用的任何这种多肽。在一些实施方案中，所编码的细胞因子激动剂或拮抗剂多肽可以是以下中的任一个：IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-19、IL-35、IL-21、GM-CSF、IL-17、Flt3L或其组合。

在一些实施方案中，所述shRNA多核苷酸检查点抑制剂可以是选自以下中任一种的多核苷酸：PD-L2、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD90、BTLA、CD160、PD-1或其组合。在进一步的实施方案中，所述shRNA多核苷酸检查点抑制剂可以是对恶性肿瘤或癌症的治疗、防预和/或预防有用或在其中起作用的任何这种多核苷酸。

表1提供了对本发明示例性序列的描述。在一些方面，治疗剂多核苷酸或多肽序列包括与本文所述任何参考序列(参见例如，序列表)具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或同源性的序列。典型地，所考虑的变体将维持参考序列的至少一部分生物活性。

在一些实施方案中，所述高滴度杂合病毒载体是三价的并且编码IL-12、IL-17RA-DN和PD-L1 shRNA。在另一个实施方案中，所述高滴度杂合病毒载体包含与SEQ ID NO.6具有至少约70％序列同一性的序列结构域、与SEQ ID NO.8具有至少约70％序列同一性的序列结构域和与SEQ ID NO 10具有至少约70％序列同一性的序列结构域。

表1.SEQ ID NO的描述。

本发明的高滴度杂合病毒载体除其他元件外尤其编码甲病毒非结构蛋白。本发明的甲病毒非结构蛋白可以是适合实施本发明范围和方法的任何这种蛋白质。在一些实施方案中，所述甲病毒非结构蛋白包括RNA依赖性RNA复制酶。在其他实施方案中，所述甲病毒非结构蛋白是西门利克森林病毒(SFV)非结构蛋白。在一些实施方案中，所述SFV非结构蛋白包括SFV RNA依赖性RNA复制酶。

在实施本发明的一些实施方案中，所述甲病毒非结构蛋白包含增强本发明方法中产生的VLV的滴度的突变。参见通过引用以其整体并入本文的Rose等人的美国专利10,435,712，所述专利涉及使用高滴度杂合病毒载体进行免疫的组合物和方法。其中产生进化的VLV组合物的高滴度杂合病毒载体包含SFV甲病毒非结构蛋白，所述SFV甲病毒非结构蛋白具有改善产生的VLV滴度的至少两个突变。

表2.SFV非结构蛋白的突变。

氨基酸变化	受影响的蛋白质
		G-106-E(AAS<u>E</u>KVL)	nsP1
V-351-I(ATD<u>I</u>TPE)	nsP1
		L-481-S(KRE<u>S</u>IPV)	nsP1
I-516-T(LVP<u>T</u>APA)	nsP1
		D-555-G(QPN<u>G</u>VLL)	nsP2
A-1151-T(ALV<u>T</u>EYK)	nsP2
		M-1494-T(AID<u>T</u>RTA)	nsP3
A-1610-T(ERI<u>T</u>RLR)	nsP3
		N-2015-S(TLQ<u>S</u>VLA)	nsP4

在实施本发明的一些实施方案中，本发明的甲病毒非结构蛋白是包含如表2中所述的至少一种突变的SFV甲病毒非结构蛋白。表2中列出的突变在表1的SEQ ID NO.13中以粗体和下划线示出。在表2中，所示出的氨基酸突变与野生型序列有关。即，当存在表2中的每个突变时，SFV非结构蛋白序列被定义为SEQ ID NO.13。SEQ ID NO.13包含四个SFV非结构蛋白片段，即nsP1(氨基酸1-537)、nsP2(氨基酸538-1136)、nsP3(氨基酸1137-1818)和nsP4(氨基酸1819-2432)。

编码突变甲病毒非结构蛋白的本发明高滴度杂合病毒载体可以用用于产生所希望的氨基酸序列的任何合适多核苷酸序列制备。可以理解，用于产生本发明多肽序列的核苷酸序列可以潜在地或任选地包含突变，包括沉默突变，或作用是产生相关氨基酸序列的替代密码子。对于熟练的从业者来说，给定的多核苷酸序列是否产生给定的多肽序列将是显而易见的。

在一些实施方案中，本发明的高滴度杂合病毒载体包含编码与SEQ ID NO:13具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相似性的SFV非结构蛋白的DNA序列。在进一步的实施方案中，本发明的高滴度杂合病毒载体包含编码包括SEQ ID NO:13的SFV非结构蛋白的DNA序列。

本发明的方法

本发明的载体可用于产生可用于治疗、防预和/或预防恶性肿瘤或感染疾病的VLV的多种应用。所述载体进一步可用于将受试者免疫以对抗恶性肿瘤或疾病，和/或治疗、预防受试者的恶性肿瘤或感染性疾病或降低其风险。

本发明包括将受试者免疫以对抗与感染性疾病相关的异源蛋白的方法。所述方法包括向受试者施用包含由高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中高滴度杂合病毒载体包含编码异源基因的DNA。异源基因的表达在受试者中诱导对与由其编码的感染性疾病相关异源蛋白的免疫反应。本发明进一步包括治疗有需要的受试者的方法，其中所述方法包括向受试者施用包含由本发明高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中所述高滴度杂合病毒载体包含编码异源基因的DNA，并且其中异源基因的表达为受试者提供益处。在一方面，本发明包括在受试者中产生对异源蛋白的记忆T细胞免疫反应的方法。在另一方面，在受试者中产生对异源蛋白的适应性B细胞免疫反应。

本发明还包括降低受试者将患上感染性疾病的风险的方法。所述方法包括向受试者施用包含由高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)的组合物，其中高滴度杂合病毒载体包含编码异源基因的DNA。异源基因的表达在受试者中诱导对与由其编码的感染性疾病相关异源蛋白的免疫反应，从而降低受试者将患上与异源蛋白相关的感染性疾病的风险。

本发明还包括选择高滴度RNA病毒样囊泡(VLV)的方法。这种选择通过以下方式进行：在细胞培养物中传代包含编码病毒结构蛋白的RNA序列的杂合病毒载体，其中病毒结构蛋白不包含甲病毒结构蛋白，以及通过使用在细胞培养物中VLV的广泛传代、VLV的直接诱变或本领域中已知的任何其他选择方法针对高滴度VLV对产生的VLV进行筛选。在一方面，所述杂合病毒载体RNA序列编码甲病毒非结构蛋白。在另一方面，所述非结构蛋白是西门利克森林病毒(SFV)非结构蛋白。

药物组合物和配制品

本发明的VLV可以配制成药物组合物。这种药物组合物可以呈适合施用于受试者的形式，或者所述药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体、一种或多种另外的成分或这些的一些组合。所述药物组合物的各种组分的存在形式可以是生理学上可接受的盐，诸如与生理学上可接受的阳离子或阴离子组合，如本领域众所周知的。

在一个实施方案中，可以施用可用于实践本发明方法的药物组合物以递送在1×10⁵与1×10⁹PFU之间的剂量。

在一个实施方案中，可用于实践本发明方法的药物组合物可以包含佐剂。本发明考虑的合适佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)、弗氏不完全佐剂(Freund's incomplete adjuvant)、Quil A、Detox、ISCOM或角鲨烯。

可用于本发明方法的药物组合物可以适当地开发用于吸入、口服、直肠、阴道、肠胃外、局部、透皮、肺、鼻内、颊、眼科、鞘内、静脉内或另一种施用途径。其他考虑的配制品包括计划中的纳米颗粒、脂质体制剂、含有活性成分的重新密封的红细胞、和基于免疫学的配制品。一种或多种施用途径对本领域技术人员来说是显而易见的并且取决于任何数量的因素，包括所治疗疾病的类型和严重程度、所治疗的兽医或人类患者的类型和年龄等。

尽管本文提供的药物组合物的描述主要针对的是适合伦理上施用于人的药物组合物，但本领域技术人员应理解，此类组合物通常适合施用于所有种类的动物。对适合施用于人的药物组合物进行修改以便使所述组合物适合施用于各种动物是充分了解的，并且普通技术的兽医药理学家可以通过仅仅普通的(如果有的话)实验来设计和执行这种修改。考虑施用本发明药物组合物的受试者包括但不限于人和其他灵长类动物；哺乳动物，包括商业相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、羊、猫和狗。

本发明的组合物可以包含按组合物总重量计约0.005％至2.0％的防腐剂。防腐剂用于防止在暴露于环境中的污染物的情况下变质。

施用/给药

施用方案可能影响有效量的构成因素。例如，由本发明高滴度杂合病毒载体或其组合物产生的VLV可以以单剂量、以若干个分开的剂量施用于受试者，以及可以每天或顺序地施用错开的剂量，或者剂量可以连续输注或可以推注注射。此外，可以如治疗或预防情况的紧急情况所指示，按比例增加或减少剂量。

可以使用已知的程序以有效治疗受试者疾病的剂量和时间段将本发明的组合物施用于受试者、优选哺乳动物、更优选人。实现预期结果所必需的组合物有效量将变化并且取决于诸如待治疗或预防的疾病、所治疗受试者的年龄、性别、体重、状况、一般健康状况和既往病史等因素，以及医学领域中众所周知的类似因素。在特定的实施方案中，尤其有利的是将组合物配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每单位含有预定量的治疗化合物，所述预定量计算为产生与所需药物媒介物相关的希望治疗作用。本发明的剂量单位形式由(a)组合物和待表达异源蛋白的独特特征以及待实现的特定治疗作用决定并且直接依赖于(a)。

施用途径

本领域技术人员应认识到，尽管可以使用多于一种途径进行施用，但特定途径可能提供比另一种途径更直接且更有效的反应。本发明的任何组合物的施用途径包括吸入、口服、经鼻、直肠、肠胃外、舌下、透皮、透粘膜(例如，舌下、舌、(透)颊、(透)尿道、阴道(例如，透阴道和阴道周围)、鼻(内)和(透)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌内、皮内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。

试剂盒

在一些实施方案中，提供了用于治疗、预防或改善如本文所述的给定疾病、障碍或病症或其症状的试剂盒，其中所述试剂盒包含：a)如本文所述的化合物或组合物；和任选地b)如本文所述的另外的药剂或疗法。所述试剂盒可以进一步包含使用试剂盒治疗、预防或改善疾病、障碍或病症的说明书或标签。在又一些实施方案中，本发明扩展至用于如本文所述的给定疾病、障碍或病症或其症状的试剂盒测定。例如，这种试剂盒可以含有来自PCR或其他核酸杂交技术(微阵列)的试剂或用于基于免疫学的检测技术(例如，ELISpot、ELISA)的试剂。

实施例

现在参考以下实施例描述本发明。这些实施例仅提供用于说明的目的，并且本发明绝不应被解释为限于这些实施例，而应被解释为涵盖由于本文提供的传授内容而变得明显的任何和所有变化。

在没有进一步描述的情况下，据信本领域普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制备和利用本发明的化合物并且实践所要求保护的方法。

材料和方法

用AscI/SbfI限制性消化将VLV双启动子(dp)载体线性化以插入VSV新泽西G片段(Carolina Chialeet.al vaccines 2020,8,279)。编码新泽西水疱病毒包膜糖蛋白的DNA片段由Synbio Technologies基因合成，并且注入到在第二亚基因组启动子下游的AscI和SbfI克隆位点中。将所得VLV dp VSV新泽西G载体用BamHI/PacI消化并且用于克隆在第一亚基因组启动子下游的IL12和CARG2020插入物。

为了用VSV新泽西G构建体将单链IL-12克隆至dp-IL12中，由赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)合成小鼠IL12 p40和IL12p35片段，作为串片段。使用用弹性蛋白接头序列扩展((gttcctggagtaggg/gtcccaggtgtgggc(VPGVGVPGVG))以及侧翼BamHI和PacI克隆位点修饰的引物对进行p40和p35片段的PCR扩增。将所有PCR片段用

高保真DNA聚合酶扩增，从凝胶中纯化，并且注入在第一亚基因组启动子下游的VLV dp VSVG新泽西载体BamHI/PacI克隆位点中。

为了组合IL17RA ECD HA标签和三个shRNA片段，用含有HA-标签序列(YPYDVPDYA)的经修饰的反向引物进行17A受体结构域(N端972bp片段)的胞外结构域(ECD)部分的PCR扩增。由Synbio Technologies合成在486、373和9位置的靶向PDL1基因的三个小鼠shRNA序列。为了向IL17RA ECD HA标签片段注入shRNA片段，从凝胶中纯化两个片段并且注入在第一亚基因组启动子下游的VLV dp VSVG新泽西载体BamHI/PacI克隆位点中。

为了克隆最终的三重亚基因组启动子(Tp)CARG-2020VSV新泽西G构建体，使用

高保真DNA聚合酶扩增具有亚基因组启动子序列(如上生成)的全长IL12片段和IL17RA ECD HA标签/shRNA片段。将所有PCR片段从凝胶中纯化，并且注入在第一亚基因组启动子下游的VLV dp VSVG新泽西载体BamHI/PacI克隆位点中。此克隆步骤在IL12与IL17RAECD之间产生额外的亚基因组启动子。

所有用于扩增DNA片段的引物均根据NEBuilder说明设计，并且根据NEB HiFi DNA组装试剂盒方案(E5520S)注入。通过DNA限制性消化针对阳性插入物对重组克隆进行筛选。通过DNA测序(GENEWIZ，NJ)进一步证实最终阳性克隆。

实施例1：表达IL-12细胞因子的VLV

用几个序列元件构建高滴度杂合病毒载体(Dp-G(NJ)-IL12)以便产生能够产生IL-12多肽(SEQ ID NO.2)的VLV，即DNA启动子序列、编码西门利克森林病毒非结构蛋白的DNA序列(SFV nsp1-4)、编码水疱性口炎病毒糖蛋白的DNA序列(VSV-G；SEQ ID NO:11)、编码IL-12的DNA序列(SEQ ID NO:1)，如图4所示。

使用标准方案用Dp-G(NJ)-IL12高滴度杂合病毒载体转染BHK-21细胞。将转染细胞在缓冲液中孵育48小时以进行VLV的产生。孵育未转染细胞作为对照。在孵育期之后，在抗IL-12蛋白质印迹中检测上清液中IL-12的存在，并且在转染细胞的上清液中观察到IL-12，但在对照中未观察到。

实施例2：分泌的IL-12的定量

使用UV-可见光谱法确定孵育48小时后分泌的IL-12的量(参见实施例1)。使用在0至500pg/mL浓度范围内的多种IL-12p70稀释液制备标准曲线。校准数据曲线在下表2中示出。

表3.分泌的IL-12的UV-可见光谱定量的校准曲线。

线性最佳拟合获得表3中所示的方程。在4,000倍稀释度下测量上清液光密度(OD)，以获得0.3945的OD分数450/750nm，对应于0.745μg IL-12/mL上清液。此值对应于产生2μg IL-12/百万个转染细胞。

实施例3：小鼠中的VLV-IL-12施用限制肿瘤体积

将MC38细胞皮下移植至同基因小鼠品系中以允许肿瘤在小鼠皮肤下生长。产生和制备产生IL-12的VLV(参见实施例1；VLV-IL-12)，作为在用于注射的在PBS缓冲液中的组合物。不含VLV的PBS缓冲液用作对照。实验设计和时间线连同获得的结果一起示出在图5中。在第0天，皮下移植MC38细胞并且允许生长4天的时间段，然后施用PBS对照的VLV组合物，其在第4、6、8、10、12和14天施用。在施用处理或对照的每一天，从卡尺(caliper)测量值计算肿瘤体积。结果表明，与对照相比，VLV-IL-12的施用显著限制了处理小鼠中的肿瘤生长，表明VLV-IL-12是有效的治疗。

实施例4：表达IL-17RA-DN的VLV

用几个序列元件构建高滴度杂合病毒载体(Dp-G(NJ)-IL17RA)以便产生能够产生显性失活IL-17RA-DN胞外结构域(ECD)多肽(SEQ ID NO.4)的VLV，即DNA启动子序列、编码西门利克森林病毒非结构蛋白的DNA序列(SFV nsp1-4)、编码水疱性口炎病毒糖蛋白的DNA序列(VSV-G；SEQ ID NO:11)、编码IL-17RA-DN的DNA序列(SEQ ID NO.3)，如图6所示。

使用标准方案用Dp-G(NJ)-IL17RA高滴度杂合病毒载体转染BHK-21细胞。将转染细胞在缓冲液中孵育48小时以进行VLV的产生。孵育未转染细胞作为对照。在孵育期之后，在蛋白质印迹中检测上清液中IL-17RA-DN的存在，并且在转染的细胞的上清液中观察到IL-17RA-DN，但在对照中未观察到。另外，BHK-21细胞裂解物的蛋白质印迹表明用载体转染的细胞中存在IL-17RA-DN。

实施例5：表达PD-L1 shRNA检查点抑制剂的VLV

构建四种高滴度杂合病毒载体，各自具有几个序列元件，以便产生能够产生编码的shRNA序列的VLV，即DNA启动子序列、编码西门利克森林病毒非结构蛋白的DNA序列(SFVnsp1-4)、编码水疱性口炎病毒糖蛋白的DNA序列(VSV-G；SEQ ID NO.11)和编码shRNA序列的DNA序列，或如图7A所示序列。一个载体含有加扰shRNA(Scr)作为对照，而三个载体含有shRNA 486序列、shRNA 373序列或shRNA 486/373序列。

如实施例1和4所述，在BHK-21细胞中产生四种不同载体的VLV。然后将表达PD-L1的BHK-21细胞用产生的VLV处理。虽然表达加扰(Scr)shRNA的VLV未显示出抑制PD-L1的抑制，而表达shRNA 486序列、shRNA 373序列或shRNA 486/373的VLV中的每一个显示出抑制PD-L1。这些结果表明，VLV可以经工程化以表达一种或多种有效对抗与癌症和恶性肿瘤相关的基因靶标的shRNA。

实施例6：三价CARG2020 VLV

用几个序列元件构建高滴度杂合病毒载体(Tp-IL12-IL17RA/shRNA-G(NJ)；CARG2020)以便产生能够产生IL-12多肽(SEQ ID NO.2)、显性失活IL-17RA-DN胞外结构域(ECD)多肽(SEQ ID NO.4)和PD-L1检查点抑制剂shRNA 486/373/9中的所有三种的VLV，即DNA启动子序列、编码西门利克森林病毒非结构蛋白的DNA序列(SFV nsp1-4)、编码水疱性口炎病毒糖蛋白的DNA序列(VSV-G；SEQ ID NO.11)、编码IL-12的DNA序列(SEQ ID NO.1)、编码IL-17RA-DN的DNA序列(SEQ ID NO.3)和编码shRNA 486/373/9的DNA序列(SEQ IDNO.5)，如图8所示。

如实施例1和4所述，在BHK-21细胞中产生三价CARG2020载体的VLV。使用蛋白质印迹检测多肽产物，表明三价VLV能够产生IL-12、IL-17RA-DN和VSV糖蛋白(VSVG)。在表达PD-L1的BHK-21细胞中，体内PD-L1下调表明，与缺乏shRNA的对照VLV IL-12相比，CARG2020VLV(含有shRNA 486/373/9)更有效地下调PD-L1。

实施例7：小鼠中的三价CARG2020 VLV施用限制肿瘤体积

实验设计和结果在图9中示出。在第0天将MC38肿瘤细胞植入小鼠皮肤的侧腹，然后在第15、17和21天以5×10⁷个颗粒/注射的量注射GFP-VLV对照、IL-12-VLV或三价CARG2020 VLV。在未接受GFP-VLV对照的处理动物中，肿瘤体积受到抑制，表明三价CARG-2020VLV具有活性并且能够抑制肿瘤生长。延长的处理和监测显示，用三价CARG2020 VLV处理的7只小鼠中有5只实现了完全根除肿瘤。

实施例8：CARG2020激活Th1免疫并且下调肿瘤中的PD-L1和IL-17相关信号传导

为了测试CARG-2020和VLV-IL-12在肿瘤免疫中的作用，我们经由瘤内注射用2剂处理MC38肿瘤(图10A)。在第二剂后4天处死小鼠，并且通过流式细胞术和q-RT-PCR分析它们的肿瘤和脾脏。CARG-2020和VLV-IL-12均在脾脏和肿瘤中诱导稳健的Th1免疫激活，表明这些药剂强的免疫刺激活性(图10B)。CARG-2020和VLV-IL-12的处理还减少了肿瘤中调节性T细胞(Treg)的数量(图10C)并且导致肿瘤和脾脏中的CD8⁺T细胞活性显著增加(图10D、E)。与VLV-IL-12相比，CARG-2020降低了肿瘤中PD-L1、CXCL1和CXCL2 mRNA的水平，分别证明了PD-L1 shRNA和IL-17RA-DN转基因的有效性。

实施例9：VLV是溶瘤的

将正常鼠成纤维细胞NIH 3T3用CFSE染料(绿色)标记，而将引起纤维肉瘤的致瘤成纤维细胞系L929用eFluor670(红色)标记。将细胞共培养并且进行模拟物处理(对照)或用VLV以感染复数(MOI)为10处理。经过72小时的孵育后，使用荧光显微术查看细胞。显微术图像表明大部分L929正在经历由VLV复制引起的凋亡，而正常NIH 3T3没有裂解。

实施例10：结肠癌细胞、卵巢癌细胞和急性淋巴母细胞白血病细胞中的溶瘤鉴定

通过流式细胞术分析进行溶瘤鉴定。按照制造用户手册使用活/死细胞染色试剂盒(eBioscience^TM Fixable Viability Dye eFluor^TM 780(赛默飞世尔科技公司,65-0865-14))。简而言之，通过胰蛋白酶消化收获细胞并且用冷PBS洗涤两次，在4℃下以1500rpm离心5min，使用96孔板进行细胞的三重重悬，其中每孔100ul细胞(5×10⁴个细胞/孔)，离心并且用冷1X PBS洗涤2次。向每个孔中添加100ul活/死染色物(在PBS中以1:1000稀释)。在4℃下避光孵育15分钟；用200ul FACS缓冲液洗涤2次。添加100ul固定溶液，并且在4℃下避光孵育45min，将细胞用透化缓冲液洗涤，并且先用一抗染色1h。2-3次洗涤后，在二抗中染色30min。用FACS缓冲液洗涤2次，并且将细胞重悬在200ul FACS缓冲液中，转移到簇管中进行流式细胞术(在流式细胞分选仪(Cell Sorter Core Facility)的LSR II流式细胞仪(UCNN的The Health Center)分析。

图1A中所示的结果证明，当向卵巢癌细胞和结肠癌细胞施用VLV时，卵巢癌细胞和结肠癌细胞经历溶瘤过程。在人细胞中，观察到F2卵巢癌细胞系和HCT116结肠癌细胞系均被施用的VLV的溶瘤作用杀死。在小鼠细胞中，观察到TKO卵巢癌和MC38结肠癌细胞系均被施用的VLV的溶瘤作用杀死。

图1B中的结果显示，急性淋巴母细胞白血病B型癌细胞系MN60、REH和RS4,11由于施用VLV而经历不同程度的溶瘤作用。通过VLV施用最有效地杀死分化程度最小的RS4,11癌细胞系，并且随着细胞系中的分化程度更高，溶瘤作用变得不太普遍。此外，从较大剂量的VLV中可以看到增强的溶瘤作用(1的感染复数(MOI)与5的MOI相比)。相对于REH和RS4-11细胞系，正常B细胞没有经历显著的溶瘤作用。这些结果证明，VLV对于治疗恶性且有化疗抗性的白血病具有高的临床价值。

实施例11.溶瘤通路分析

观察到VLV对恶性肿瘤和癌细胞有溶瘤作用，但对正常细胞没有。使用蛋白质印迹进一步研究溶瘤通路(图3)。在指定的时间点将HCT116癌细胞用5MOI的VLV(VLV-GFP和VLV-depCC2(mIL35))感染。通过胰蛋白酶消化、沉淀物裂解以及经由蛋白质印迹来收获细胞。针对PARP1、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、TNFα、β-肌动蛋白的一抗用于检测细胞死亡相关蛋白或作为负载对照。(一抗来自细胞信号传导物质(Cell Signaling)，二级抗小鼠或兔IgGHRP购自西格玛奥德里奇贸易有限公司(Sigma-Aldrich))。

结果表明，用5MOI的VLV感染HCT116癌细胞系导致诱导半胱天冬酶8和半胱天冬酶9的激活、肿瘤坏死因子(TNF)的表达和聚(ADP)核糖聚合酶(PARP)的切割，表明癌细胞的溶瘤通过凋亡机制发生(图3)。

通过引用并入

每个专利文件的全部公开内容，包括更正证明书、专利申请文件、科学文章、政府报告、网站和本文提及的其他参考资料，出于所有目的通过引用以其整体并入本文。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。

等效方案

在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他特定形式体现。前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而不是限制本文描述的发明。在本发明组合物和方法的各种实施方案中，其中所包括的术语是关于所述组合物或所述方法的列举步骤使用的，还考虑了所述组合物和方法基本上由或由列举的组合物或步骤或组分组成。此外，应当理解，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是不重要的，只要本发明保持可操作即可。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

在说明书中，单数形式也包括复数形式，除非上下文另有明确规定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以本说明书为准。

此外，应当认识到，在某些情况下，组合物可以被描述为在混合之前或在进一步加工步骤(诸如干燥、粘合剂去除、加热、烧结等)之前由组分构成。认识到某些组分可以进一步反应或转化为新材料。

本文使用的所有百分比和比率均以体积(体积/体积)或重量(重量/重量)为基础，如所示或以其他方式指示。

序列表

<110> 卡罗根公司

<120> 溶瘤病毒样囊泡的组合物和使用方法

<130> 25133-8-104384-101

<140>

<141>

<150> 62/959,435

<151> 2020-01-10

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1617

<212> DNA

<213> Mus sp.

<400> 1

atgtgtcctc agaagctaac catctcctgg tttgccatcg ttttgctggt gtctccactc 60

atggccatgt gggagctgga gaaagacgtt tatgttgtag aggtggactg gactcccgat 120

gcccctggag aaacagtgaa cctcacctgt gacacgcctg aagaagatga catcacctgg 180

acctcagacc agagacatgg agtcataggc tctggaaaga ccctgaccat cactgtcaaa 240

gagtttctag atgctggcca gtacacctgc cacaaaggag gcgagactct gagccactca 300

catctgctgc tccacaagaa ggaaaatgga atttggtcca ctgaaatttt aaaaaatttc 360

aaaaacaaga ctttcctgaa gtgtgaagca ccaaattact ccggacggtt cacgtgctca 420

tggctggtgc aaagaaacat ggacttgaag ttcaacatca agagcagtag cagttcccct 480

gactctcggg cagtgacatg tggaatggcg tctctgtctg cagagaaggt cacactggac 540

caaagggact atgagaagta ttcagtgtcc tgccaggagg atgtcacctg cccaactgcc 600

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atgaagcctt tgaagaactc acaggtggag gtcagctggg agtaccctga ctcctggagc 780

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<210> 2

<211> 538

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 2

Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu

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Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val

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Val Glu Val Asp Trp Thr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Thr Val Asn Leu

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Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Asp Ile Thr Trp Thr Ser Asp Gln

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Arg His Gly Val Ile Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Thr Val Lys

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Glu Phe Leu Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Thr

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Leu Ser His Ser His Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asn Gly Ile Trp

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Ser Thr Glu Ile Leu Lys Asn Phe Lys Asn Lys Thr Phe Leu Lys Cys

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Glu Ala Pro Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Ser Trp Leu Val Gln

130 135 140

Arg Asn Met Asp Leu Lys Phe Asn Ile Lys Ser Ser Ser Ser Ser Pro

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Asp Ser Arg Ala Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Leu Ser Ala Glu Lys

165 170 175

Val Thr Leu Asp Gln Arg Asp Tyr Glu Lys Tyr Ser Val Ser Cys Gln

180 185 190

Glu Asp Val Thr Cys Pro Thr Ala Glu Glu Thr Leu Pro Ile Glu Leu

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Ala Leu Glu Ala Arg Gln Gln Asn Lys Tyr Glu Asn Tyr Ser Thr Ser

210 215 220

Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn Leu Gln

225 230 235 240

Met Lys Pro Leu Lys Asn Ser Gln Val Glu Val Ser Trp Glu Tyr Pro

245 250 255

Asp Ser Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Lys Phe Phe Val

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Arg Ile Gln Arg Lys Lys Glu Lys Met Lys Glu Thr Glu Glu Gly Cys

275 280 285

Asn Gln Lys Gly Ala Phe Leu Val Glu Lys Thr Ser Thr Glu Val Gln

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Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn

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Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Val

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Pro Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly Arg Val Ile Pro Val Ser Gly

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Pro Ala Arg Cys Leu Ser Gln Ser Arg Asn Leu Leu Lys Thr Thr Asp

355 360 365

Asp Met Val Lys Thr Ala Arg Glu Lys Leu Lys His Tyr Ser Cys Thr

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Ala Glu Asp Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Arg Asp Gln Thr Ser Thr

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Leu Lys Thr Cys Leu Pro Leu Glu Leu His Lys Asn Glu Ser Cys Leu

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Ala Thr Arg Glu Thr Ser Ser Thr Thr Arg Gly Ser Cys Leu Pro Pro

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Gln Lys Thr Ser Leu Met Met Thr Leu Cys Leu Gly Ser Ile Tyr Glu

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Asp Leu Lys Met Tyr Gln Thr Glu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Leu

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Asn Arg Val Met Gly Tyr Leu Ser Ser Ala

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<212> DNA

<213> Mus sp.

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<212> PRT

<213> Mus sp.

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Met Ala Ile Arg Arg Cys Trp Pro Arg Val Val Pro Gly Pro Ala Leu

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Pro Arg Leu Leu Asp Phe Pro Ala Pro Val Cys Ala Gln Glu Gly Leu

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Ser Cys Arg Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His

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Pro Lys Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asn Ile Tyr Ile Asn Leu

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Ser Val Ser Ser Thr Gln His Gly Glu Leu Val Pro Val Leu His Val

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Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Lys

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165 170 175

Ser Lys Ile Ile Phe Val Pro Asp Cys Glu Asp Ser Lys Met Lys Met

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Glu Asn His Ser Cys Phe Asp Val Val Lys Gln Ile Phe Ala Pro Arg

245 250 255

Gln Glu Glu Phe His Gln Arg Ala Asn Val Thr Phe Thr Leu Ser Lys

260 265 270

Phe His Trp Cys Cys His His His Val Gln Val Gln Pro Phe Phe Ser

275 280 285

Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ala Val Thr Val Pro Cys Pro

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Val Ile Ser Asn Thr Thr Val Pro Lys Pro Val Ala Asp Tyr Ile Pro

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<212> DNA

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tt 422

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> PRT

<213> 智人

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Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys

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Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe

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Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp

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Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser

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Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp

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Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Val Pro Gly Val Gly Val Pro Gly

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Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu

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Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu

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Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met

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Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile

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Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln

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Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu

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<212> DNA

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tag 963

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<213> 智人

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Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser

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Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg

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Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe

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Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln

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Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val

180 185 190

Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr

195 200 205

Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp

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Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met

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Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg

245 250 255

Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn

260 265 270

Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser

275 280 285

Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro

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<212> DNA

<213> 智人

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<212> DNA

<213> 水疱性口炎病毒

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cacatcgtga ccgtgacacc tcacagcgtg aaggtggacg agtacacagg cgagtggatc 480

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atcagaagca actacttccc ctacatcagc accgagggaa tctgcaagat gcccttctgt 720

cggaagcagg gctacaagct gaagaacgac ctgtggttcc agatcatgga ccccgacctg 780

gataagaccg tgcgggatct gccccacatc aaggactgtg atctgagcag cagcatcatc 840

acccctggcg agcacgccac agacatcagc ctgatcagcg acgtggaacg catcctggac 900

tacgccctgt gccagaacac ctggtctaag atcgagtccg gcgagcccat cacacccgtg 960

gatctgtctt atctgggccc caagaatcct ggcgtgggcc ctgtgttcac catcatcaat 1020

ggcagcctgc actacttcac cagcaagtac ctgagagtgg aactggaaag ccctgtgatc 1080

cccagaatgg aaggcaaggt ggccggcaca agaatcgtca gacagctgtg ggaccagtgg 1140

ttcccattcg gcgaggtgga aatcggccct aacggcgtgc tgaaaacaaa gcaggggtat 1200

aagttcccgc tgcacatcat cggcaccggc gaagtggaca gcgacatcaa gatggaacgg 1260

gtcgtgaagc actgggagca ccctcacatt gaggccgctc agaccttcct gaagaaggac 1320

gatacaggcg aggtgctgta ctacggcgat accggggtgt caaagaaccc cgtcgaactg 1380

gtggaaggat ggtttagcgg atggcggtct agcctgatgg gagtgctggc cgtgatcatc 1440

ggcttcgtga tcctgatgtt cctgattaag ctgatcgggg tgctgagcag cctgttcaga 1500

cccaagagaa ggcccatcta caagagcgac gtcgagatgg cccacttccg gtag 1554

<210> 12

<211> 517

<212> PRT

<213> 水疱性口炎病毒

<400> 12

Met Leu Ser Tyr Leu Ile Phe Ala Leu Ala Val Ser Pro Ile Leu Gly

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Lys Ile Glu Ile Val Phe Pro Gln His Thr Thr Gly Asp Trp Lys Arg

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Val Pro His Glu Tyr Asn Tyr Cys Pro Thr Ser Ala Asp Lys Asn Ser

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His Gly Thr Gln Thr Gly Ile Pro Val Glu Leu Thr Met Pro Lys Gly

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Leu Thr Thr His Gln Val Glu Gly Phe Met Cys His Ser Ala Leu Trp

65 70 75 80

Met Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His

85 90 95

Ser Ile His Asn Glu Glu Pro Thr Asp Tyr Gln Cys Leu Glu Ala Ile

100 105 110

Lys Ser Tyr Lys Asp Gly Val Ser Phe Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln

115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Gly Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala His Ile Val Thr

130 135 140

Val Thr Pro His Ser Val Lys Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Ile

145 150 155 160

Asp Pro His Phe Ile Gly Gly Arg Cys Lys Gly Gln Ile Cys Glu Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Lys Trp Phe Thr Ser Ser Asp Gly Glu Ser Val

180 185 190

Cys Ser Gln Leu Phe Thr Leu Val Gly Gly Ile Phe Phe Ser Asp Ser

195 200 205

Glu Glu Ile Thr Ser Met Gly Leu Pro Glu Thr Gly Ile Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Phe Pro Tyr Ile Ser Thr Glu Gly Ile Cys Lys Met Pro Phe Cys

225 230 235 240

Arg Lys Gln Gly Tyr Lys Leu Lys Asn Asp Leu Trp Phe Gln Ile Met

245 250 255

Asp Pro Asp Leu Asp Lys Thr Val Arg Asp Leu Pro His Ile Lys Asp

260 265 270

Cys Asp Leu Ser Ser Ser Ile Ile Thr Pro Gly Glu His Ala Thr Asp

275 280 285

Ile Ser Leu Ile Ser Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ala Leu Cys

290 295 300

Gln Asn Thr Trp Ser Lys Ile Glu Ser Gly Glu Pro Ile Thr Pro Val

305 310 315 320

Asp Leu Ser Tyr Leu Gly Pro Lys Asn Pro Gly Val Gly Pro Val Phe

325 330 335

Thr Ile Ile Asn Gly Ser Leu His Tyr Phe Thr Ser Lys Tyr Leu Arg

340 345 350

Val Glu Leu Glu Ser Pro Val Ile Pro Arg Met Glu Gly Lys Val Ala

355 360 365

Gly Thr Arg Ile Val Arg Gln Leu Trp Asp Gln Trp Phe Pro Phe Gly

370 375 380

Glu Val Glu Ile Gly Pro Asn Gly Val Leu Lys Thr Lys Gln Gly Tyr

385 390 395 400

Lys Phe Pro Leu His Ile Ile Gly Thr Gly Glu Val Asp Ser Asp Ile

405 410 415

Lys Met Glu Arg Val Val Lys His Trp Glu His Pro His Ile Glu Ala

420 425 430

Ala Gln Thr Phe Leu Lys Lys Asp Asp Thr Gly Glu Val Leu Tyr Tyr

435 440 445

Gly Asp Thr Gly Val Ser Lys Asn Pro Val Glu Leu Val Glu Gly Trp

450 455 460

Phe Ser Gly Trp Arg Ser Ser Leu Met Gly Val Leu Ala Val Ile Ile

465 470 475 480

Gly Phe Val Ile Leu Met Phe Leu Ile Lys Leu Ile Gly Val Leu Ser

485 490 495

Ser Leu Phe Arg Pro Lys Arg Arg Pro Ile Tyr Lys Ser Asp Val Glu

500 505 510

Met Ala His Phe Arg

515

<210> 13

<211> 2432

<212> PRT

<213> 西门利克森林病毒

<400> 13

Met Ala Ala Lys Val His Val Asp Ile Glu Ala Asp Ser Pro Phe Ile

1 5 10 15

Lys Ser Leu Gln Lys Ala Phe Pro Ser Phe Glu Val Glu Ser Leu Gln

20 25 30

Val Thr Pro Asn Asp His Ala Asn Ala Arg Ala Phe Ser His Leu Ala

35 40 45

Thr Lys Leu Ile Glu Gln Glu Thr Asp Lys Asp Thr Leu Ile Leu Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Pro Ser Arg Arg Met Met Ser Thr His Lys Tyr His

65 70 75 80

Cys Val Cys Pro Met Arg Ser Ala Glu Asp Pro Glu Arg Leu Val Cys

85 90 95

Tyr Ala Lys Lys Leu Ala Ala Ala Ser Glu Lys Val Leu Asp Arg Glu

100 105 110

Ile Ala Gly Lys Ile Thr Asp Leu Gln Thr Val Met Ala Thr Pro Asp

115 120 125

Ala Glu Ser Pro Thr Phe Cys Leu His Thr Asp Val Thr Cys Arg Thr

130 135 140

Ala Ala Glu Val Ala Val Tyr Gln Asp Val Tyr Ala Val His Ala Pro

145 150 155 160

Thr Ser Leu Tyr His Gln Ala Met Lys Gly Val Arg Thr Ala Tyr Trp

165 170 175

Ile Gly Phe Asp Thr Thr Pro Phe Met Phe Asp Ala Leu Ala Gly Ala

180 185 190

Tyr Pro Thr Tyr Ala Thr Asn Trp Ala Asp Glu Gln Val Leu Gln Ala

195 200 205

Arg Asn Ile Gly Leu Cys Ala Ala Ser Leu Thr Glu Gly Arg Leu Gly

210 215 220

Lys Leu Ser Ile Leu Arg Lys Lys Gln Leu Lys Pro Cys Asp Thr Val

225 230 235 240

Met Phe Ser Val Gly Ser Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Arg Lys Leu Leu

245 250 255

Arg Ser Trp His Leu Pro Ser Val Phe His Leu Lys Gly Lys Gln Ser

260 265 270

Phe Thr Cys Arg Cys Asp Thr Ile Val Ser Cys Glu Gly Tyr Val Val

275 280 285

Lys Lys Ile Thr Met Cys Pro Gly Leu Tyr Gly Lys Thr Val Gly Tyr

290 295 300

Ala Val Thr Tyr His Ala Glu Gly Phe Leu Val Cys Lys Thr Thr Asp

305 310 315 320

Thr Val Lys Gly Glu Arg Val Ser Phe Pro Val Cys Thr Tyr Val Pro

325 330 335

Ser Thr Ile Cys Asp Gln Met Thr Gly Ile Leu Ala Thr Asp Ile Thr

340 345 350

Pro Glu Asp Ala Gln Lys Leu Leu Val Gly Leu Asn Gln Arg Ile Val

355 360 365

Val Asn Gly Arg Thr Gln Arg Asn Thr Asn Thr Met Lys Asn Tyr Leu

370 375 380

Leu Pro Ile Val Ala Val Ala Phe Ser Lys Trp Ala Arg Glu Tyr Lys

385 390 395 400

Ala Asp Leu Asp Asp Glu Lys Pro Leu Gly Val Arg Glu Arg Ser Leu

405 410 415

Thr Cys Cys Cys Leu Trp Ala Phe Lys Thr Arg Lys Met His Thr Met

420 425 430

Tyr Lys Lys Pro Asp Thr Gln Thr Ile Val Lys Val Pro Ser Glu Phe

435 440 445

Asn Ser Phe Val Ile Pro Ser Leu Trp Ser Thr Gly Leu Ala Ile Pro

450 455 460

Val Arg Ser Arg Ile Lys Met Leu Leu Ala Lys Lys Thr Lys Arg Glu

465 470 475 480

Ser Ile Pro Val Leu Asp Ala Ser Ser Ala Arg Asp Ala Glu Gln Glu

485 490 495

Glu Lys Glu Arg Leu Glu Ala Glu Leu Thr Arg Glu Ala Leu Pro Pro

500 505 510

Leu Val Pro Thr Ala Pro Ala Glu Thr Gly Val Val Asp Val Asp Val

515 520 525

Glu Glu Leu Glu Tyr His Ala Gly Ala Gly Val Val Glu Thr Pro Arg

530 535 540

Ser Ala Leu Lys Val Thr Ala Gln Pro Asn Gly Val Leu Leu Gly Asn

545 550 555 560

Tyr Val Val Leu Ser Pro Gln Thr Val Leu Lys Ser Ser Lys Leu Ala

565 570 575

Pro Val His Pro Leu Ala Glu Gln Val Lys Ile Ile Thr His Asn Gly

580 585 590

Arg Ala Gly Arg Tyr Gln Val Asp Gly Tyr Asp Gly Arg Val Leu Leu

595 600 605

Pro Cys Gly Ser Ala Ile Pro Val Pro Glu Phe Gln Ala Leu Ser Glu

610 615 620

Ser Ala Thr Met Val Tyr Asn Glu Arg Glu Phe Val Asn Arg Lys Leu

625 630 635 640

Tyr His Ile Ala Val His Gly Pro Ser Leu Asn Thr Asp Glu Glu Asn

645 650 655

Tyr Glu Lys Val Arg Ala Glu Arg Thr Asp Ala Glu Tyr Val Phe Asp

660 665 670

Val Asp Lys Lys Cys Cys Val Lys Arg Glu Glu Ala Ser Gly Leu Val

675 680 685

Leu Val Gly Glu Leu Thr Asn Pro Pro Phe His Glu Phe Ala Tyr Glu

690 695 700

Gly Leu Lys Ile Arg Pro Ser Ala Pro Tyr Lys Thr Thr Val Val Gly

705 710 715 720

Val Phe Gly Val Pro Gly Ser Gly Lys Ser Ala Ile Ile Lys Ser Leu

725 730 735

Val Thr Lys His Asp Leu Val Thr Ser Gly Lys Lys Glu Asn Cys Gln

740 745 750

Glu Ile Val Asn Asp Val Lys Lys His Arg Gly Leu Asp Ile Gln Ala

755 760 765

Lys Thr Val Asp Ser Ile Leu Leu Asn Gly Cys Arg Arg Ala Val Asp

770 775 780

Ile Leu Tyr Val Asp Glu Ala Phe Ala Cys His Ser Gly Thr Leu Leu

785 790 795 800

Ala Leu Ile Ala Leu Val Lys Pro Arg Ser Lys Val Val Leu Cys Gly

805 810 815

Asp Pro Lys Gln Cys Gly Phe Phe Asn Met Met Gln Leu Lys Val Asn

820 825 830

Phe Asn His Asn Ile Cys Thr Glu Val Cys His Lys Ser Ile Ser Arg

835 840 845

Arg Cys Thr Arg Pro Val Thr Ala Ile Val Ser Thr Leu His Tyr Gly

850 855 860

Gly Lys Met Arg Thr Thr Asn Pro Cys Asn Lys Pro Ile Ile Ile Asp

865 870 875 880

Thr Thr Gly Gln Thr Lys Pro Lys Pro Gly Asp Ile Val Leu Thr Cys

885 890 895

Phe Arg Gly Trp Val Lys Gln Leu Gln Leu Asp Tyr Arg Gly His Glu

900 905 910

Val Met Thr Ala Ala Ala Ser Gln Gly Leu Thr Arg Lys Gly Val Tyr

915 920 925

Ala Val Arg Gln Lys Val Asn Glu Asn Pro Leu Tyr Ala Pro Ala Ser

930 935 940

Glu His Val Asn Val Leu Leu Thr Arg Thr Glu Asp Arg Leu Val Trp

945 950 955 960

Lys Thr Leu Ala Gly Asp Pro Trp Ile Lys Val Leu Ser Asn Ile Pro

965 970 975

Gln Gly Asn Phe Thr Ala Thr Leu Glu Glu Trp Gln Glu Glu His Asp

980 985 990

Lys Ile Met Lys Val Ile Glu Gly Pro Ala Ala Pro Val Asp Ala Phe

995 1000 1005

Gln Asn Lys Ala Asn Val Cys Trp Ala Lys Ser Leu Val Pro Val

1010 1015 1020

Leu Asp Thr Ala Gly Ile Arg Leu Thr Ala Glu Glu Trp Ser Thr

1025 1030 1035

Ile Ile Thr Ala Phe Lys Glu Asp Arg Ala Tyr Ser Pro Val Val

1040 1045 1050

Ala Leu Asn Glu Ile Cys Thr Lys Tyr Tyr Gly Val Asp Leu Asp

1055 1060 1065

Ser Gly Leu Phe Ser Ala Pro Lys Val Ser Leu Tyr Tyr Glu Asn

1070 1075 1080

Asn His Trp Asp Asn Arg Pro Gly Gly Arg Met Tyr Gly Phe Asn

1085 1090 1095

Ala Ala Thr Ala Ala Arg Leu Glu Ala Arg His Thr Phe Leu Lys

1100 1105 1110

Gly Gln Trp His Thr Gly Lys Gln Ala Val Ile Ala Glu Arg Lys

1115 1120 1125

Ile Gln Pro Leu Ser Val Leu Asp Asn Val Ile Pro Ile Asn Arg

1130 1135 1140

Arg Leu Pro His Ala Leu Val Thr Glu Tyr Lys Thr Val Lys Gly

1145 1150 1155

Ser Arg Val Glu Trp Leu Val Asn Lys Val Arg Gly Tyr His Val

1160 1165 1170

Leu Leu Val Ser Glu Tyr Asn Leu Ala Leu Pro Arg Arg Arg Val

1175 1180 1185

Thr Trp Leu Ser Pro Leu Asn Val Thr Gly Ala Asp Arg Cys Tyr

1190 1195 1200

Asp Leu Ser Leu Gly Leu Pro Ala Asp Ala Gly Arg Phe Asp Leu

1205 1210 1215

Val Phe Val Asn Ile His Thr Glu Phe Arg Ile His His Tyr Gln

1220 1225 1230

Gln Cys Val Asp His Ala Met Lys Leu Gln Met Leu Gly Gly Asp

1235 1240 1245

Ala Leu Arg Leu Leu Lys Pro Gly Gly Ser Leu Leu Met Arg Ala

1250 1255 1260

Tyr Gly Tyr Ala Asp Lys Ile Ser Glu Ala Val Val Ser Ser Leu

1265 1270 1275

Ser Arg Lys Phe Ser Ser Ala Arg Val Leu Arg Pro Asp Cys Val

1280 1285 1290

Thr Ser Asn Thr Glu Val Phe Leu Leu Phe Ser Asn Phe Asp Asn

1295 1300 1305

Gly Lys Arg Pro Ser Thr Leu His Gln Met Asn Thr Lys Leu Ser

1310 1315 1320

Ala Val Tyr Ala Gly Glu Ala Met His Thr Ala Gly Cys Ala Pro

1325 1330 1335

Ser Tyr Arg Val Lys Arg Ala Asp Ile Ala Thr Cys Thr Glu Ala

1340 1345 1350

Ala Val Val Asn Ala Ala Asn Ala Arg Gly Thr Val Gly Asp Gly

1355 1360 1365

Val Cys Arg Ala Val Ala Lys Lys Trp Pro Ser Ala Phe Lys Gly

1370 1375 1380

Glu Ala Thr Pro Val Gly Thr Ile Lys Thr Val Met Cys Gly Ser

1385 1390 1395

Tyr Pro Val Ile His Ala Val Ala Pro Asn Phe Ser Ala Thr Thr

1400 1405 1410

Glu Ala Glu Gly Asp Arg Glu Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ala Val

1415 1420 1425

Ala Ala Glu Val Asn Arg Leu Ser Leu Ser Ser Val Ala Ile Pro

1430 1435 1440

Leu Leu Ser Thr Gly Val Phe Ser Gly Gly Arg Asp Arg Leu Gln

1445 1450 1455

Gln Ser Leu Asn His Leu Phe Thr Ala Met Asp Ala Thr Asp Ala

1460 1465 1470

Asp Val Thr Ile Tyr Cys Arg Asp Lys Ser Trp Glu Lys Lys Ile

1475 1480 1485

Gln Glu Ala Ile Asp Thr Arg Thr Ala Val Glu Leu Leu Asn Asp

1490 1495 1500

Asp Val Glu Leu Thr Thr Asp Leu Val Arg Val His Pro Asp Ser

1505 1510 1515

Ser Leu Val Gly Arg Lys Gly Tyr Ser Thr Thr Asp Gly Ser Leu

1520 1525 1530

Tyr Ser Tyr Phe Glu Gly Thr Lys Phe Asn Gln Ala Ala Ile Asp

1535 1540 1545

Met Ala Glu Ile Leu Thr Leu Trp Pro Arg Leu Gln Glu Ala Asn

1550 1555 1560

Glu Gln Ile Cys Leu Tyr Ala Leu Gly Glu Thr Met Asp Asn Ile

1565 1570 1575

Arg Ser Lys Cys Pro Val Asn Asp Ser Asp Ser Ser Thr Pro Pro

1580 1585 1590

Arg Thr Val Pro Cys Leu Cys Arg Tyr Ala Met Thr Ala Glu Arg

1595 1600 1605

Ile Thr Arg Leu Arg Ser His Gln Val Lys Ser Met Val Val Cys

1610 1615 1620

Ser Ser Phe Pro Leu Pro Lys Tyr His Val Asp Gly Val Gln Lys

1625 1630 1635

Val Lys Cys Glu Lys Val Leu Leu Phe Asp Pro Thr Val Pro Ser

1640 1645 1650

Val Val Ser Pro Arg Lys Tyr Ala Ala Ser Thr Thr Asp His Ser

1655 1660 1665

Asp Arg Ser Leu Arg Gly Phe Asp Leu Asp Trp Thr Thr Asp Ser

1670 1675 1680

Ser Ser Thr Ala Ser Asp Thr Met Ser Leu Pro Ser Leu Gln Ser

1685 1690 1695

Cys Asp Ile Asp Ser Ile Tyr Glu Pro Met Ala Pro Ile Val Val

1700 1705 1710

Thr Ala Asp Val His Pro Glu Pro Ala Gly Ile Ala Asp Leu Ala

1715 1720 1725

Ala Asp Val His Pro Glu Pro Ala Asp His Val Asp Leu Glu Asn

1730 1735 1740

Pro Ile Pro Pro Pro Arg Pro Lys Arg Ala Ala Tyr Leu Ala Ser

1745 1750 1755

Arg Ala Ala Glu Arg Pro Val Pro Ala Pro Arg Lys Pro Thr Pro

1760 1765 1770

Ala Pro Arg Thr Ala Phe Arg Asn Lys Leu Pro Leu Thr Phe Gly

1775 1780 1785

Asp Phe Asp Glu His Glu Val Asp Ala Leu Ala Ser Gly Ile Thr

1790 1795 1800

Phe Gly Asp Phe Asp Asp Val Leu Arg Leu Gly Arg Ala Gly Ala

1805 1810 1815

Tyr Ile Phe Ser Ser Asp Thr Gly Ser Gly His Leu Gln Gln Lys

1820 1825 1830

Ser Val Arg Gln His Asn Leu Gln Cys Ala Gln Leu Asp Ala Val

1835 1840 1845

Glu Glu Glu Lys Met Tyr Pro Pro Lys Leu Asp Thr Glu Arg Glu

1850 1855 1860

Lys Leu Leu Leu Leu Lys Met Gln Met His Pro Ser Glu Ala Asn

1865 1870 1875

Lys Ser Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Val Glu Asn Met Lys Ala Thr

1880 1885 1890

Val Val Asp Arg Leu Thr Ser Gly Ala Arg Leu Tyr Thr Gly Ala

1895 1900 1905

Asp Val Gly Arg Ile Pro Thr Tyr Ala Val Arg Tyr Pro Arg Pro

1910 1915 1920

Val Tyr Ser Pro Thr Val Ile Glu Arg Phe Ser Ser Pro Asp Val

1925 1930 1935

Ala Ile Ala Ala Cys Asn Glu Tyr Leu Ser Arg Asn Tyr Pro Thr

1940 1945 1950

Val Ala Ser Tyr Gln Ile Thr Asp Glu Tyr Asp Ala Tyr Leu Asp

1955 1960 1965

Met Val Asp Gly Ser Asp Ser Cys Leu Asp Arg Ala Thr Phe Cys

1970 1975 1980

Pro Ala Lys Leu Arg Cys Tyr Pro Lys His His Ala Tyr His Gln

1985 1990 1995

Pro Thr Val Arg Ser Ala Val Pro Ser Pro Phe Gln Asn Thr Leu

2000 2005 2010

Gln Ser Val Leu Ala Ala Ala Thr Lys Arg Asn Cys Asn Val Thr

2015 2020 2025

Gln Met Arg Glu Leu Pro Thr Met Asp Ser Ala Val Phe Asn Val

2030 2035 2040

Glu Cys Phe Lys Arg Tyr Ala Cys Ser Gly Glu Tyr Trp Glu Glu

2045 2050 2055

Tyr Ala Lys Gln Pro Ile Arg Ile Thr Thr Glu Asn Ile Thr Thr

2060 2065 2070

Tyr Val Thr Lys Leu Lys Gly Pro Lys Ala Ala Ala Leu Phe Ala

2075 2080 2085

Lys Thr His Asn Leu Val Pro Leu Gln Glu Val Pro Met Asp Arg

2090 2095 2100

Phe Thr Val Asp Met Lys Arg Asp Val Lys Val Thr Pro Gly Thr

2105 2110 2115

Lys His Thr Glu Glu Arg Pro Lys Val Gln Val Ile Gln Ala Ala

2120 2125 2130

Glu Pro Leu Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Ile His Arg Glu Leu

2135 2140 2145

Val Arg Arg Leu Asn Ala Val Leu Arg Pro Asn Val His Thr Leu

2150 2155 2160

Phe Asp Met Ser Ala Glu Asp Phe Asp Ala Ile Ile Ala Ser His

2165 2170 2175

Phe His Pro Gly Asp Pro Val Leu Glu Thr Asp Ile Ala Ser Phe

2180 2185 2190

Asp Lys Ser Gln Asp Asp Ser Leu Ala Leu Thr Gly Leu Met Ile

2195 2200 2205

Leu Glu Asp Leu Gly Val Asp Gln Tyr Leu Leu Asp Leu Ile Glu

2210 2215 2220

Ala Ala Phe Gly Glu Ile Ser Ser Cys His Leu Pro Thr Gly Thr

2225 2230 2235

Arg Phe Lys Phe Gly Ala Met Met Lys Ser Gly Met Phe Leu Thr

2240 2245 2250

Leu Phe Ile Asn Thr Val Leu Asn Ile Thr Ile Ala Ser Arg Val

2255 2260 2265

Leu Glu Gln Arg Leu Thr Asp Ser Ala Cys Ala Ala Phe Ile Gly

2270 2275 2280

Asp Asp Asn Ile Val His Gly Val Ile Ser Asp Lys Leu Met Ala

2285 2290 2295

Glu Arg Cys Ala Ser Trp Val Asn Met Glu Val Lys Ile Ile Asp

2300 2305 2310

Ala Val Met Gly Glu Lys Pro Pro Tyr Phe Cys Gly Gly Phe Ile

2315 2320 2325

Val Phe Asp Ser Val Thr Gln Thr Ala Cys Arg Val Ser Asp Pro

2330 2335 2340

Leu Lys Arg Leu Phe Lys Leu Gly Lys Pro Leu Thr Ala Glu Asp

2345 2350 2355

Lys Gln Asp Glu Asp Arg Arg Arg Ala Leu Ser Asp Glu Val Ser

2360 2365 2370

Lys Trp Phe Arg Thr Gly Leu Gly Ala Glu Leu Glu Val Ala Leu

2375 2380 2385

Thr Ser Arg Tyr Glu Val Glu Gly Cys Lys Ser Ile Leu Ile Ala

2390 2395 2400

Met Ala Thr Leu Ala Arg Asp Ile Lys Ala Phe Lys Lys Leu Arg

2405 2410 2415

Gly Pro Val Ile His Leu Tyr Gly Gly Pro Arg Leu Val Arg

2420 2425 2430

Claims

1.一种用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的高滴度杂合病毒载体，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

e)编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。

2.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第一DNA序列的DNA启动子序列包括用于RNA依赖性RNA聚合酶的组成型启动子。

3.根据权利要求2所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述DNA启动子序列包括用于噬菌体RNA聚合酶的组成型启动子。

4.根据权利要求2所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述启动子序列是巨细胞病毒(CMV)启动子序列。

5.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第二DNA序列的甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列是西门利克森林病毒(SFV)非结构蛋白多核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的高滴度杂合病毒载体，其中由所述第二DNA序列编码的SFV非结构蛋白多肽序列包含一个或多个氨基酸突变。

7.根据权利要求6所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述SFV非结构蛋白多肽序列包括与SEQ ID NO.13具有至少约70％序列同一性的序列。

8.根据权利要求6所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述SFV非结构蛋白多肽序列包括SEQ ID NO.13。

9.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第二DNA序列的甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列包括甲病毒RNA依赖性聚合酶。

10.根据权利要求9所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述甲病毒RNA依赖性聚合酶是西门利克森林病毒(SFV)RNA依赖性聚合酶。

11.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第三DNA序列的甲病毒亚基因组RNA启动子是西门利克森林病毒(SFV)亚基因组RNA启动子。

12.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列包含至少一个序列结构域，所述至少一个序列结构域编码细胞因子激动剂或拮抗剂多肽，各自独立地选自由IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-19、IL-35、IL-21、GM-CSF、IL-17、Flt3L及其组合组成的组。

13.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列包含至少一个序列结构域，所述至少一个序列结构域编码shRNA多核苷酸检查点抑制剂，各自独立地选自由PD-L2、PD-L1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CD90、BTLA、CD160、PD-1及其组合组成的组。

14.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列包含三个序列结构域。

15.根据权利要求14所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列包含：

a)编码IL-12的序列结构域，

b)编码IL-17RA-DN的序列结构域；和

c)编码PD-L1-shRNA的序列结构域。

16.根据权利要求14所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列包含：

a)与SEQ ID NO.6具有至少70％序列同一性的序列结构域，

b)与SEQ ID NO.8具有至少70％序列同一性的序列结构域；和

c)与SEQ ID NO.10具有至少70％序列同一性的序列结构域。

17.根据权利要求16所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列的每个序列结构域之前是独立地选自由亚基因组启动子、编码2A肽序列的序列或其组合组成的组中的序列。

18.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述高滴度杂合病毒载体是三价的；并且其中所述第四DNA序列由三个序列结构域组成。

19.根据权利要求18所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列由以下组成：

a)亚基因组启动子序列和编码IL-12的序列结构域，

b)亚基因组启动子序列和编码IL-17RA-DN的序列结构域；和

c)亚基因组启动子序列和编码PD-L1-shRNA的序列结构域。

20.根据权利要求19所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列由以下组成：

21.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列进一步包含编码免疫抑制调节因子的多核苷酸或多肽抑制剂的序列结构域，所述免疫抑制调节因子选自由TDO、IDO1、IDO2及其组合组成的组。

22.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列的每个序列结构域在单个或多个亚基因组启动子的控制下表达，产生单个或多个亚基因组RNA。

23.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第四DNA序列的每个序列结构域是从共享的亚基因组RNA共翻译的，所述共享的亚基因组RNA包含核糖体跳跃2A肽。

24.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其进一步包含第六DNA序列，所述第六DNA序列包含表达所述恶性肿瘤或感染性疾病的单个或多个特异性抗原的表达盒；以及。

25.根据权利要求23所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述表达盒表达肿瘤或感染因子的特异性抗原以诱导针对所述抗原的体液和/或细胞免疫反应。

26.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中所述第五DNA序列的水疱病毒糖蛋白包括水疱性口炎印第安纳病毒、水疱性口炎新泽西病毒、金迪普拉病毒或结构相关水疱病毒的包膜糖蛋白。

27.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中获得至少5×10⁷噬斑形成单位(pfu)/mL病毒样囊泡(VLV)的滴度。

28.根据权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体，其中获得至少1×10⁸噬斑形成单位(pfu)/mL病毒样囊泡(VLV)的滴度。

29.一种用于产生溶瘤病毒样囊泡(VLV)的高滴度杂合病毒载体，所述高滴度杂合病毒载体包含以下可操作连接的序列元件：

a)包含DNA启动子序列的第一DNA序列，

b)编码甲病毒非结构蛋白多核苷酸序列的第二DNA序列，

c)编码甲病毒亚基因组RNA启动子的第三DNA序列，

e)编码水疱病毒糖蛋白的第五DNA序列。

30.由权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体产生的含有复制子RNA的病毒样囊泡(VLV)。

31.根据权利要求30所述的VLV，其中所述复制子RNA是正链加帽且多聚腺苷酸化的。

32.一种组合物，所述组合物包含由权利要求1所述的高滴度杂合病毒载体产生的病毒样囊泡(VLV)。

33.根据权利要求30或32所述的VLV，其中所述VLV是自我复制的。

34.根据权利要求30或32所述的VLV，其中所述VLV是溶瘤的。

35.根据权利要求30或32所述的VLV，其中所述VLV是无衣壳的。

36.一种生产用于治疗、防预或预防恶性肿瘤或感染性疾病的病毒样囊泡(VLV)的方法，所述方法包括以下步骤：

b)将BHK-21细胞用步骤(a)的高滴度病毒载体转染，

其中步骤(d)的分离产生高滴度的VLV。

37.一种治疗和预防受试者的恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的组合物。

38.一种治疗患有感染性疾病的受试者的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的组合物。

39.一种免疫受试者以对抗感染性疾病的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的组合物。

40.一种下调与恶性肿瘤相关的基因的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物受试者施用治疗有效量的权利要求32所述的组合物。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述基因选自由PD-L1、CXCL1、CXCL2及其组合组成的组。

42.根据权利要求37-40中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物受试者是人或动物。

43.权利要求32所述的组合物在制造用于治疗、防预或预防有需要的哺乳动物受试者的恶性肿瘤或感染性疾病的药物中的用途。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述哺乳动物受试者是人或动物。