KR20180118259A - 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

Abstract

노화, 질환, 또다른 상태와 연관된 세포 내에서의 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 핵산-기반 발현 구축물이 제공된다. 또한 상기 핵산-기반 발현 구축물의 전달을 위한 벡터 및 시스템 뿐 아니라, 노화-, 질환-, 또는 상태-연관 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거하기 위해 및 노화, 질환 또는 상태 연관 세포와 연관된 질환 또는 상태의 치료의 치료를 위해 이러한 핵산-기반 발현 구축물, 벡터 및 시스템을 사용하는 방법이 제공된다.

Description

표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR THE TARGETED PRODUCTION OF A THERAPEUTIC PROTEIN WITHIN A TARGET CELL}

관련 출원에 대한 교차-참조

2014 년 3 월 24 일에 출원된 본 PCT 국제 특허 출원은, 그 전체가 참조로서 본원에 인용된 가특허 출원인 2013 년 3 월 24 일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 61/804,716 의 우선권을 주장한다.

배경기술

본 발명은 일반적으로, 질병 치료, 장수 촉진, 노화 방지 및 건강 증진을 포함하는 의료 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 노화, 질병 및 다른 질환과 관련된 세포의 성장 및/또는 생존을 감소시키는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 표적 세포 내에 존재하지만 정상 비-표적 세포에는 존재하지 않거나 실질적으로 감소한, 전사 조절 기능을 포함하는 고유의 세포내 기능을 구축하는, 치료적 단백질의 표적 세포 특이적 발현을 위한 발현 구축물이 제공된다. 상기 발현 구축물은 핵산을 표적 세포에 전달하기 위한 벡터를 포함하는 시스템에서 사용되며, 상기 벡터는, 필수적으로 요구되지는 않지만, 표적 세포로의 발현 구축물의 전달을 증가시키기 위한 표적화 부분을 포함할 수 있다.

암 세포, 노화 세포, 및 바람직하지 않은 표현형을 갖는 다른 세포는 인간의 생애 과정 전반에 걸쳐 축적될 수 있으며, 적절한 치료를 하지 않을 경우, 상기 세포는 인간의 병적 상태 및 궁극적으로 사망에 기여할 수 있거나 심지어 이를 유발할 수 있다.

질병에서의 노화 세포의 역할 및 노화 세포를 제거하는 것의 잠재적인 장점은 예컨대 Baker et al. Nature 479:232-6 (2011) 와 같은 과학 간행물에서 논의되었다. 노화 세포가 축적되는 문제를 해결하기 위해 주장된 시스템 및 방법이 기재되었다. 예를 들어, Grigg 의 PCT 특허공개 제 WO1992/009298 호에는 카르노신과 유사한 화학 화합물을 이용하여 세포 노화를 방지하거나 역전시키기 위한 시스템이 기재되고, Gruber 의 미국 특허공개 제 2012/0183534 호에는 방사선, 초음파, 독소, 항체 및 항체-독소 컨쥬게이트 (conjugates) 를 이용하여 노화 세포를 사멸시키기 위한 시스템이 기재되며, 상기 시스템은 치료 분자의 표적화에 사용하기 위한 노화 세포-표면 단백질을 포함한다.

노화 세포의 선택적 사멸은 유전자 변형된 실험실 연구 동물 이외의 포유류에는 비실용적인 것으로 입증되었다. 현재 적용가능한 시스템 및 방법은 상당한 전신 독성, 대상 세포의 부적절한 표적화, 및 적절한 안전 요소의 결여를 나타낸다. 관련 분야의 이러한 단점은 특정 암의 치료 및 노화의 영향을 늦추기 위한 안전하고 효과적인 치료법의 개발을 저해하였다.

본 발명은, 노화, 질병 및/또는 다른 질환과 관련된 세포와 같은 세포 (총체적으로, "표적 세포") 를, 표적 세포에 치료제를 표적화하여 전달할 필요 없이, 표적 세포-특이적 방식으로 선택적으로 사멸시킬 수 있다는 발견을 기초로 한다. 본 발명에 기재된 발현 구축물, 시스템 및 방법은, 필요로 하는 환자에 대한 치료적 이점이 제한된, 치료제의 표적화된 전달을 이용하는 기존 기술과 관련된 안전성 및 효율성 문제를 극복한다.

본 발명에 기재된 바와 같이, 본 발명은, 세포 내에서 생성될 경우 노화, 질병 및/또는 다른 질환과 관련된 세포와 같은 세포의 성장 및/또는 생존을 감소시키거나 제거하는 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현을 표적 세포-특이적 방식으로 유도하기 위한, 발현 카세트, 시스템 및 방법을 제공한다.

본 발명에 기재된 발현 카세트, 시스템 및 방법은 노화 (예컨대, 노화 세포), 질병 (예컨대, 암, 감염 질병 및 박테리아 질병) 뿐만 아니라, 다른 질환과 관련된 특정 세포에 본질적인 고유한 전사 조절 기작을 이용하며, 상기 전사 조절 기작은 노화, 질병 또는 다른 질환과 관련되지 않은 정상 세포 (즉, "비-표적 세포") 에서 작동하지 않거나 활성이 상당히 감소한다.

현재 개시된 발현 카세트, 시스템 및 방법은, 표적 세포에 의해 제공되며, 표적 세포에 고유한 세포내 기능의 결과로서 높은 정도의 표적 세포 특이성을 달성하며, 상기 세포내 기능은 정상 비-표적 세포에 의해 제공되지 않거나 정상 비표적 세포에서 상당히 감소한다. 따라서, 현재 개시된 시스템 및 방법은 핵산이 전달되는 세포 유형에 대해 비특이적인 핵산 전달 벡터를 이용하며, 사실상, 본 발명에 기재된 벡터는 표적 세포 특이성, 및 결과적으로 표적 세포의 성장 및/또는 생존의 치료적으로 유효한 감소, 방지 및/또는 제거를 달성하기 위해 핵산(예를 들어, 발현 카세트)의 표적 세포-특이적 전달을 위해 구성될 필요가 없다.

특정 구현예 내에서, 본 발명은 노화, 질병 및/또는 다른 질환과 관련된 세포와 같은 표적 세표 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생성을 위한 발현 구축물을 제공한다. 본 발명에 개시된 발현 구축물은: (1) 표적 세포 내에서 각각 생성된 하나 이상의 인자에 반응하여 활성화된 전사 프로모터, 및 (2) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되고 전사 프로모터의 조절 제어하에 있는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 표적 세포를 포함하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩한다.

상기 구현예의 특정 양태 내에서, 전사 프로모터는 질병, 질환 또는 노화와 관련된 표적 세포에서 활성화되지만, 질환, 상태 또는 노화와 연관되지 않은 정상 포유류 세포에서는 활성화되지 않는다. 표적 세포-특이적 전사 활성화는, 표적 세포에서 생성되지만, 정상 세포가 질환, 상태 또는 노화와 연관되지 않은, 정상 골격근아세포, 정상 지방 세포, 정상 눈 세포, 정상 뇌세포, 정상 간 세포, 정상 대장 세포, 정상 폐 세포, 정상 췌장 세포 및/또는 정상 심장 세포와 같은 정상 인간 세포를 포함하는 정상 포유류 세포에서 생성되지 않는 하나 이상의 인자의 작용에 의해 달성된다.

상기 구현예의 다른 양태 내에서, 표적 세포는 포유류 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 표적 포유류 세포는 노화 세포, 암 세포, 전암성 세포(precancerous cells), 형성이상 세포(dysplastic cells), 및 감염원으로 감염된 세포와 같은 인간 세포를 포함할 수 있다.

인간 표적 세포가 노화 세포인 상기 구현예의 특정 양태에서, 전사 프로모터는 p16INK4a/CDKN2A 전사 프로모터를 포함할 수 있으며, 이는 SP1, ETS1, 및/또는 ETS2 와 같은 전사 인자에 의한 활성화에 반응한다. 인간 표적 세포가 노화 세포인 상기 구현예의 다른 양태에서, 전사 프로모터는 p53/TP53에 반응성인, p21/CDKN1A 전사 프로모터를 포함할 수 있다. 노화 세포와 같은 표적 세포에서, 전사 프로모터는, 예를 들어 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 및 시토신 디아미나아제 (cytosine deaminase) 와 같은 치료적 단백질뿐만 아니라 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 및 시토신 디아미나아제의 유도성 변종을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도하며, 상기 치료적 단백질은, 예를 들어, 세포자멸사 (apoptosis) 를 포함하는 세포 과정을 통해 노화 세포에서 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거한다. 예를 들어, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 를 포함하는 세포 과정을 통한 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거하는 다른 치료적 단백질이 사용될 수 있다.

인간 표적 세포가 뇌종양 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 혈액암 세포 및 골암 세포와 같은 암 세포인 상기 구현예의 다른 양태에서, 전사 프로모터는 p21^cip1/waf1 프로모터, p27^kip1 프로모터, p57^kip2 프로모터, TdT 프로모터, Rag-1 프로모터, B29 프로모터, Blk 프로모터, CD19 프로모터, BLNK 프로모터, 및/또는 λ5 프로모터를 포함할 수 있고, 상기 전사 프로모터는 EBF3, O/E-1, Pax-5, E2A, p53, VP16, MLL, HSF1, NF-IL6, NFAT1, AP-1, AP-2, HOX, E2F3, 및/또는 NF-κB 전사 인자와 같은 하나 이상의 전사 인자에 의한 활성화에 반응성이며, 상기 전사 활성화는, 예를 들어 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 또는 시토신 디아미네이즈와 같은 치료적 단백질뿐만 아니라 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 및 시토신 디아미네이즈의 유도성 변종을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도하며, 상기 치료적 단백질은, 예를 들어, 세포자멸사를 포함하는 세포 과정을 통해 노화 세포에서의 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거한다. 예를 들어, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 를 포함하는 세포 과정을 통한 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거하는 다른 치료적 단백질이 사용될 수 있다.

표적 세포가, 예를 들어 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 간염 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 리노 (rhino) 바이러스와 같은 감염원으로 감염된 인간 세포이거나, 표적 세포가 박테리아 세포인 상기 구현예의 또 다른 양태에서, 전사 프로모터는 감염원 또는 박테리아 세포에 의해 발현된 인자에 의해 활성화될 수 있으며, 상기 전사 활성화는, 예를 들어 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 또는 시토신 디아미네이즈와 같은 치료적 단백질뿐만 아니라 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 및 시토신 디아미네이즈의 유도성 변종을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도하며, 상기 치료적 단백질은, 예를 들어, 세포자멸사를 포함하는 세포 과정을 통해 노화 세포에서의 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거한다. 예를 들어, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs)를 포함하는 세포 과정을 통한 세포 사멸을 유도함으로써, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거하는 다른 치료적 단백질이 사용될 수 있다.

다른 구현예 내에서, 본 발명은 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생성을 위한 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 표적 세포뿐만 아니라 비-표적 세포를 포함하는 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터를 포함하며, 상기 벡터는 비-표적 세포 내에서는 생성하지 않고 표적 세포(예를 들어, 노화, 질병 또는 다른 질환에 관련된 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생성을 위한 발현 구축물을 포함하며, 상기 발현 구축물은 상기 표적 세포 내에 각각 생성된 하나 이상의 인자에 반응하여 활성화된 전사 프로모터; 및 상기 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되고 상기 전사 프로모터의 조절 제어하에 있는 핵산을 포함하고, 상기 핵산은 표적 세포를 포함하여 상기 핵산이 생성된 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩한다.

상기 구현예의 추가 양태 내에서, 시스템은, 예를 들어, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미네이즈뿐만 아니라 이의 유도성 변종의 이량체화를 촉진함으로써, 발현 구축물 내에서 프로모터의 전사 활성화를 촉진하거나 치료적 단백질의 기능을 촉진하는 세포내 인자에 추가하여, 예를 들어, 표적 세포를 화학적 또는 생물학적 화합물과 접촉시킬 것을 요구함으로써, 발현 구축물 내의 핵산의 발현 또는 핵산에 의해 인코딩된 치료적 단백질의 기능에 대한 추가 제어를 허용하는 하나 이상의 안전 요소를 추가로 포함한다.

본 발명의 발현 구축물 및 시스템에 사용될 수 있는 추가 안전 요소는 포유류 발현을 위한 pDEST26 플라스미드를 이용한 Life Technologies Gateway Cloning Vector System 을 이용한 타목시펜-유도성 Cre 구축물을 포함한다. 예를 들어, Cre 및 에스트로겐 리셉터의 융합 단백질은 타목시펜 첨가시 항시적으로 발현 및 유도될 수 있고, 이는 활성화된 Cre가 전사 프로모터를 재배향 (re-orient) 시켜 치료적 단백질을 발현할 수 있도록 한다.

상기 구현예의 또 다른 양태 내에서, 시스템은 생물 발광 (bioluminescent) 마커와 같은 검출가능 마커를 인코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있어서, 치료적 단백질을 발현하는 세포를 식별하는 것을 가능하게 하며, 유도성 CASP3, CASP8, 또는 CASP9와 같은 유도성 치료적 단백질의 경우에, 예를 들어 유도성 CASP3, CASP8, 또는 CASP9의 이합체화를 유도함으로써 치료적 단백질의 활성을 촉진하는 화합물을 투여함으로써 사멸될 것이다.

추가의 구현예에서, 본 공개는 표적 세포의 성장을 감소, 방지, 및/또는 제거하기 위한 방법으로서, 표적 세포를 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 시스템은 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 비-표적 세포 내에서가 아니라 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고, 상기 발현 구축물은 (a) 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터 및 (b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 핵산의 발현시 생산되는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서의 치료적 단백질의 생산은 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거한다.

여전히 추가의 구현예에서, 본 공개는 노화하는 인간 또는 질환 또는 또다른 상태로 고생하는 인간을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 노화, 질환, 또는 기타 상태는 인간 내의 표적 세포와 연관되고, 인간에게 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템을 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 시스템은 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터를 포함하고, 상기 벡터는 비-표적 세포 내에서가 아니라 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고, 상기 발현 구축물은 (a) 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터 및 (b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 핵산의 발현시 생산되는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고, 상기 표적 세포 (즉, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서의 치료적 단백질의 생산은 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거하여 인간에서 노화를 둔화시키고/거나 인간에서 질환 또는 상태를 둔화, 역전, 및/또는 제거한다.

본 공개의 이들 및 기타 관련 양상은 다양한 구현예의 특정 양상을 예시하는 하기 도면 및 상세한 설명에 비추어 더 잘 이해될 것이다.

도 1 은 예시적 발현 카세트를 포함하는 플라스미드의 지도이며, 프로모터 서열은 p16 전사 프로모터 (Baker et al., Nature 479(7372):232-67 (2011) 로부터의) 이고, 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 유도성 카스파아제 9 변이체 FC1s.dCasp9 를 인코딩한다.
도 2 는 예시적 발현 카세트의 지도이며, 프로모터 서열은 p16 전사 프로모터 (Baker et al., Nature 479(7372):232-67 (2011) 로부터의) 이고, 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 카스파아제 9 (비-유도성) 를 인코딩한다. 이러한 발현 카세트는 타목시펜-유도성 Cre 구축물을 포함하는 추가의 안전성 요소를 포함한다.
도 3 은 예시적 발현 카세트를 포함하는 플라스미드의 지도이며, 프로모터 서열은 p16 전사 프로모터 (Baker et al., Nature 479(7372):232-67 (2011) 로부터의) 이고, 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 카스파아제 9 (비-유도성) 를 인코딩한다. 이러한 구현예는 포유류 발현을 위한 pDEST26 플라스미드를 이용하는 Life Technologies Gateway Cloning Vector System 을 사용하는 타목시펜-유도성 Cre 구축물을 포함하는 추가의 안전성 요소를 포함한다. Cre 및 에스트로겐 수용체의 융합 단백질은 활성화된 Cre 가 p16-프로모터를 재배향시키는 것을 허용하는 타목시펜의 첨가시 구성적으로 발현되고 유도되어, 카스파아제 9 를 발현한다.
도 4 는 예시적 발현 카세트를 포함하는 플라스미드의 지도이며, 프로모터 서열은 p16 전사 프로모터 (Baker et al., Nature 479(7372):232-67 (2011) 로부터의) 이고, 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 유도성 카스파아제 9 변이체 FC1s.dCasp9 를 인코딩한다. 이러한 구현예는 포유류 발현을 위한 pDEST26 플라스미드를 이용하는 Life Technologies Gateway Cloning Vector System 을 사용하는 타목시펜-유도성 Cre 구축물을 포함하는 추가의 안전성 요소를 포함한다. Cre 및 에스트로겐 수용체의 융합 단백질은 활성화된 Cre 가 p16-프로모터를 재배향시키는 것을 허용하는 타목시펜의 첨가시 구성적으로 발현되고 유도되어, 유도성 카스파아제 9 변이체 FC1s.dCasp9 를 발현한다.
도 5 는 도 1-4 에 제시된 바와 같고 Baker et al., Nature 479(7372):232-67 (2011) 및 Wang et al., J Biol Chem 276(52):48655-61 (2001) 에 기재된 바와 같은 p16 프로모터의 뉴클레오티드 서열이다.
도 6 은 Noureddine et al., PLoS Genet 5(5):e1000462 (2009) 에 기재된 바와 같은 인간 ConA Gene 으로부터의 높은 친화도 p53 결합 서열이다.
도 7 은 인간 카스파아제9α (GeneID: 842, Validated mRNA Sequence NM_001229) 을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
도 8 은 인간 카스파아제3 pre-단백질 (GeneID: 836, Validate mRNA NM_004346) 을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.
도 9 는 인간 DFFB 단백질 (GeneID: 1677, Validated mRNA NM_001282669) 을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

본 공개는 노화, 질환, 또는 또다른 상태와 연관되는 세포 (집합적으로 "표적 세포") 의 성장 및/또는 생존의 선별적 감소, 방지, 및/또는 제거를 위한 발현 카세트, 시스템, 및 방법을 제공하며, 여기에서 상기 발현 카세트, 시스템, 및 방법은, 치료적 화합물의 표적화된 전달에 의존하고, 예를 들어, 비효율적 표적 세포 전달 및/또는 오프 타겟 (off-target) 효과의 결과로서, 제한된 치료적 유익을 갖는 기존 기술과 연관되는 안전성 및 효능 염려를 극복한다.

더욱 구체적으로, 본원에 공개된 발현 카세트, 시스템, 및 방법은 표적 세포에 고유한 세포-특이적 전사 조절 기구를 활용하고, 그에 의해 치료적 화합물의 표적화된-전달에 대한 필요 없이 표적 세포-특이적 치료적 유익을 달성한다. 이들 발현 카세트, 시스템, 및 방법은 자신을 생산하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현의 표적 세포-특이적 유도를 허용한다.

따라서, 본 공개에 의해 제공되는 다양한 구현예는 하기를 포함한다:

(1) 표적 세포, 예컨대 노화, 질환, 및/또는 또다른 상태와 연관되는 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물로서, 하기를 포함하는 발현 구축물:

(a) 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터 및

(b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 표적 세포를 포함하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산.

(2) 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템으로서, 하기를 포함하는 시스템:

표적 세포 뿐만 아니라 비-표적 세포를 포함하는 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터,

여기에서 상기 벡터는 비-표적 세포 내에서가 아니라 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고,

상기 발현 구축물은

(a) 각각 상기 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터; 및

(b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 표적 세포를 포함하는 자신을 생산하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함함.

(3) 표적 세포의 성장을 감소, 방지, 및/또는 제거하기 위한 방법으로서, 표적 세포를 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는 방법,

여기에서 상기 시스템은 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터를 포함하고,

상기 벡터는 비-표적 세포 내에서가 아니라 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고,

상기 발현 구축물은

(a) 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터 및

(b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 핵산의 발현시 생산되는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고,

상기 표적 세포 (즉, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서의 치료적 단백질의 생산은 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거함.

(4) 인간에서 노화, 질환, 또는 기타 상태를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 노화, 질환, 또는 기타 상태는 표적 세포와 연관되고, 인간에게 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템을 투여하는 것을 포함하는 방법,

여기에서 상기 시스템은 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터를 포함하고,

상기 벡터는 비-표적 세포 내에서가 아니라 표적 세포 (예를 들어, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고,

상기 발현 구축물은

(a) 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터, 및

(b) 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산으로서, 핵산의 발현시 생산되는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하고,

상기 표적 세포 (즉, 연령, 질환, 또는 기타 상태와 연관되는 세포) 내에서의 치료적 단백질의 생산은 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거하여 인간에서 노화를 둔화시키고/거나 인간에서 질환 또는 상태를 둔화, 역전, 및/또는 제거함.

본 공개의 이들 및 기타 양상은 하기 비제한적 정의를 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "전사 프로모터" 는 특정 유전자의 전사를 개시하는 DNA 의 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자의 전사 시작 자리 근처에, 동일한 가닥에, DNA 의 상류에 (주형 가닥 및 비-코딩 가닥으로도 호칭되는 안티-센스 가닥의 3' 영역을 향하여) 위치한다. 프로모터는 약 100-1000 염기쌍 길이일 수 있다. 전사가 일어나기 위해서, RNA 폴리머라아제로서 알려진, RNA 를 합성하는 효소가 유전자 근처의 DNA 에 부착해야 한다. 프로모터는 RNA 폴리머라아제 및 RNA 폴리머라아제를 동원하는 전사 인자로서 호칭되는 단백질을 위한 확실한 초기 결합 자리를 제공하는 특이적 DNA 서열 및 응답 요소를 함유한다. 이들 전사 인자는 특이적 프로모터에 부착하여 유전자 발현을 조절하는 상응하는 뉴클레오티드의 특이적 활성화인자 또는 억제인자 서열을 갖는다. 그 과정은 더욱 복잡하고, 프로모터에 대한 RNA 폴리머라아제 II 의 결합에 적어도 7 가지 상이한 인자가 필수적이다. 프로모터는 소정의 유전자의 전사 수준을 지시하는 기타 조절 영역 (인핸서 (enhancer), 사일런서 (silencer), 경계 요소/절연자 (insulator)) 과 협력하여 작용할 수 있는 중요한 요소에 해당한다.

진핵생물 전사 프로모터는 핵심 프로모터 (즉, 전사 개시에 요구되는 프로모터의 최소 부분) 를 집합적으로 구성하는 다수의 본질적 요소들을 포함한다. 이들 요소들은 (1) 전사 시작 자리 (TSS), (2) RNA 폴리머라아제 결합 자리 (특히 메신저 RNA 를 인코딩하는 유전자를 위한 프로모터 내의 RNA 폴리머라아제 II 결합 자리), (3) 일반적 전사 인자 결합 자리 (예를 들어, TATA-결합 단백질 (TBP) 을 위한 결합 자리인, 공통 서열 TATAAA 를 갖는 TATA 박스), (4) B 인지 요소 (BRE), (5) 조절 요소를 함유하는 대략 250 bp 의 근위 프로모터, (6) 전사 인자 결합 자리 (예를 들어, BMAL11-Clock nad cMyc 를 포함하는 기본 나선-고리-나선 (basic helix-loop-helix) (bHLH) 전사 인자를 위한 결합 자리인, 서열 CACGTF 를 갖는 E-박스), 및 (7) 부가적 조절 요소를 함유하는 원위 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "전사 프로모터" 는 용어 "인핸서" 와 구별되며, 인핸서는 전사 시작 자리로부터 멀리 떨어져 있는 조절 요소를 지칭한다.

진핵생물 프로모터는 흔히 하기 클래스에 따라 분류된다: (1) AT-기반 클래스, (2) CG-기반 클래스, (3) ATCG-컴팩트 (compact) 클래스, (4) ATCG-밸런스드 (balanced) 클래스, (5) ATCG-미들 (middle) 클래스, (6) ATCG-레스 (less) 클래스, (7) AT-레스 클래스, (8) CG-스파이크 (spike) 클래스, (9) CG-레스 클래스, 및 (10) AT-스파이크 클래스. Gagniuc and Ionescu-Tirgoviste, BMC Genomics 13:512 (2012) 참조.

진핵생물 프로모터는 "단방향" 또는 "양방향" 일 수 있다. 단방향 프로모터는 단일 유전자의 전사를 조절하고, TATA 박스의 존재를 특징으로 한다. 양방향 프로모터는 양방향 유전자 쌍 (즉, 서로를 향해 배향된 5' 말단을 갖는 반대 가닥 상에 코딩된 2 개의 인접 유전자) 에서 유전자의 5' 말단 사이의 DNA 의 짧은 (<1 kbp) 유전자간 영역이다. 양방향 유전자는 흔히 기능적으로 관련되고, 단일 프로모터를 공유하기 때문에 동시조절되고 동시발현될 수 있다. 단방향 프로모터와는 달리, 양방향 프로모터는 TATA 박스를 함유하지 않으나 GpC 섬 (island) 을 함유하고, 한쪽의 우세한 Cs 및 As 및 다른 쪽의 Gs 및 Ts 의 중심점 주위에서 대칭을 나타낸다. CCAAT 박스는 NRF-1, GABPA, YY1, 및 ACTACAnnTCCC 모티프와 같은 양방향 프로모터에서 흔하다.

전사 프로모터는 종종 둘 이상의 전사 인자 결합 부위를 함유한다. 따라서, 다중 전사 인자 결합 부위를 갖는 프로모터의 다운스트림인 핵산의 효과적인 발현에는 통상적으로 다중 전사 인자의 협동 작용이 요구된다. 따라서, 전사 조절의 특수성, 및 이에 따른 관련 핵산의 발현은, 둘 이상의 전사 인자 결합 부위를 갖는 전사 프로모터를 이용함으로써 증가될 수 있다.

본원에 사용된 바, 용어 "전사 인자" 는 전사 프로모터 내 특정 서열에 결합하여, 프로모터의 다운스트림 및 이에 근접하게 작동가능한 핵산의 전사를 조절하는 서열-특이적 DNA-결합 인자를 지칭한다. 전사 인자에는, 전사를 촉진하는 활성자, 및 RNA 중합효소의 결합 또는 모집을 방지함으로써 전사를 억제하는 억제자가 포함된다. 전사 인자는 통상적으로 (1) 전사 프로모터 내 동족 전사 인자 결합 부위 (소위, 반응 요소) 에의 서열 특이적 결합을 가능하게 하는, 하나 이상의 DNA-결합 도메인 (DBD); (2) 외부 신호에 반응하는 리간드 결합 도메인을 포함하는, 하나 이상의 신호-감지 도메인 (SSD); 및 (3) 전사 공조절자 (coregulator) 를 비롯하여, 기타 단백질에 대한 결합 부위를 함유하는, 하나 이상의 전사활성화 도메인 (TAD) 을 함유한다.

본원에 사용된 바, 용어 "전사 인자" 는 배타적으로 하나 이상의 DBD 를 갖는 인자이며, DBD 를 함유하지 않는 기타 조절 단백질, 예컨대 공활성자, 크로마틴 개조제, 히스톤 아세틸라아제, 디아세틸라아제, 키나아제, 및 메틸라아제를 포함하지 않는 것으로 의도된다.

DNA-결합 도메인을 함유하는 약 2,600 종의 인간 단백질 중, 다수가 전사 인자로 여겨진다. 전사 인자는 DNA-결합 도메인의 구조 특징에 따라 구분되며, 이에는 기본 나선-고리-나선 (helix-loop-helix) 도메인, 염기성-류신 지퍼 (basic-leucine zipper) (bZIP 도메인), 2부분 반응 조절자의 C-말단 작동자 도메인, GCC 박스 도메인, 나선 대 나선 (helix-turn-helix) 도메인, 동종도메인, 람다 억제자-유사 도메인, 혈청 반응 인자-유사 (srf-유사) 도메인, 쌍이룬 박스 (paired box) 도메인, 날개있는 나선형 (winged helix) 도메인, 아연 집게 (zinc finger) 도메인, 다중-Cys₂His₂ 아연 집게 도메인, Zn₂Cys₆ 도메인, 및 Zn₂Cys₈ 핵 수용체 아연 집게 도메인이 포함된다.

다수의 전사 인자는 종양 억제자 또는 발암유전자이기 때문에, 이와 같은 전사 인자 내 돌연변이 및 이의 일탈 발현은 일부 암 및 기타 질환 및 병태와 관련이 있다. 예를 들어, (1) NF-kappaB 패밀리, (2) AP-1 패밀리, (3) STAT 패밀리, 및 (4) 스테로이드 수용체 패밀리 내 전사 인자는, 신경발달 장애 레트 (Rett) 증후군 (MECP2 전사 인자), 당뇨병 (간세포 핵 인자 (HNF) 및 인슐린 프로모터 인자-1 (IPF1/Pdx1)), 발달적 언어 실행장애 (FOXP2 전사 인자), 자가면역 질환 (FOXP3 전사 인자), 리-라우메니 (Li-Raumeni) 증후군 (p53 종양 억제자), 및 다발성 암 (전사 인자의 STAT 및 HOX 패밀리) 과 연루되어 있다. [Clevenger, Am. J. Pathol. 165(5):1449-60 (2004)]; [Carrithers et al., Am J Pathol 166(1):185-196 (2005)]; [Herreros-Villanueve et al., World J Gastroenterology 20(9):2247-2254 (2014)]; 및 [Campbell et al., Am J Pathol 158(1):25-32 (2001)].

[Olsson et al., Oncogene 26(7):1028-37] 에는 인간 방광 및 전립선암에서의 세포 주기의 핵심 조절자인, 전사 인자 E2F3 의 상향조절이 기재되어 있다. [Cantile et al., Curr Med Chem 18(32):4872-84] 에는 비뇨생식기 암에서의 HOX 유전자의 상향조절이 기재되어 있고; [Cillo et al., Int J. Cancer 129(11):2577-87 (2011)] 에는 간세포 암종에서의 HOX 유전자의 상향조절이 기재되어 있고; [Cantile et al., Int J. Cancer 125(7):1532-41 (2009)] 에는 79 종의 종양 조직 유형에 걸친 HOX D13 발현이 기재되어 있고; [Cantile et al., J Cell Physiol 205(2):202-10 (2005)] 에는 전립선암에서의 HOX D 발현의 상향조절이 기재되어 있고; [Cantile et al., Oncogene 22(41):6462-8 (2003)] 에는 인간 방광 이행 세포 암종에서의 HOX 네트워크 내 C 자리 유전자의 과발현이 기재되어 있고; [Morgan et al., BioMed Central 14:15 (2014)] 에는 전립선암의 표적으로서의 HOX 전사 인자가 기재되어 있고; [Alharbi et al., Leukemia 27(5):1000-8 (2013)] 에는 조혈 및 급성 백혈병에서의 HOXC 유전자의 역할이 기재되어 있다.

AP-2 패밀리에는 억제자 및 활성자 둘 모두로서 작용할 수 있는 5 종의 전사 인자가 포함된다. AP-2γ 는 p21CIP 유전자의 p53 활성화를 차단함으로써 암 세포 생존을 조절한다. 고 수준의 AP-2γ 는 유방암의 불량한 예후와 관련이 있다. [Gee et al., J Pathol 217(1):32-41 (2009)] 및 [Williams et al., EMBO J 28(22):3591-601 (2009)]. 세포 생존을 촉진하는 추가의 전사 인자는 포크헤드 (forkhead) 전사 인자 (FOX) 로서, 이는 약물 내성과 관련된 단백질의 발현을 촉진 및, 또한 예정된 세포사를 차단할 수 있기 때문에, 암 세포를 화학요법적 약물로부터 보호할 수 있다. [Gomes et al., Chin J. Cancer 32(7):365-70 (2013)] 에는 발암 및 약물 내성에서의 FOXO3a 및 FOXM1 의 역할이 기재되어 있다.

전사 인자는 프로모터 뿐 아니라 인핸서에도 결합할 수 있다. 본 개시에 사용된 바, 용어 전사 인자는 프로모터 내 전사 인자 결합 부위에 결합하는 전사 인자의 부분집합을 지칭하며, 인핸서 서열에 결합하는 인자는 제외된다. 전사 인자는 또한 관련 핵산의 발현을 상향조절 또는 하향조절할 수 있다. 본 개시는 발현을 억제하기보다 촉진함으로써, 관련 핵산 발현의 상향조절을 야기하는 전사 인자에 대한 전사 인자 결합 부위를 갖는 전사 프로모터를 이용한다. 핵산 발현을 상향조절하는 이와 같은 전사 인자에는, 예를 들어, 비제한적으로, (1) 이의 동족 결합 부위에의 RNA 중합효소 결합을 안정화시키고, (2) 전사 인자 DNA 복합체로 공활성자 또는 공억제자 단백질을 모집하고/하거나, (3) 히스톤 단백질의 아세틸화를 촉매작용하는 (또는 히스톤 단백질의 아세틸화를 촉매작용하는 하나 이상의 기타 단백질을 모집하는) 전사 인자가 포함된다. 이와 같은 히스톤 아세틸전달효소 (HAT) 활성은 DNA 에의 히스톤 결합의 친화성을 감소시켜, DNA 를 보다 전사에 용이하도록 만든다.

본원에 사용된 바, 용어 "괴사" 는 세포가 외력, 예컨대 독, 신체 손상, 감염, 또는 혈액 공급의 손실에 의해 손상되는 경우에 발생되는, 세포사 유도 과정을 지칭한다. 괴사로부터의 세포사는 염증을 야기하고, 이는 신체 내 추가의 고통 및 손상을 야기할 수 있다. 본원에 사용된 바, 용어 "세포자멸사" 는 예정된 일련의 사건들이 유해 물질의 방출 없이 세포의 제거를 유도하는, 세포사 유도 과정을 지칭한다. 세포자멸사는 오래된 세포, 불필요한 세포, 및 건강하지 못한 세포를 제거함으로써 신체의 건강을 발전 및 유지하는 중요한 역할을 수행한다. 세포자멸사는 생존에 필요한 세포 성분을 파괴하고, 핵 DNA 를 파괴하는 DNA 가수분해효소의 생성을 유도하는, 카스파아제 (caspase) 단백질을 비롯한 자살 유전자에 의해 생성되는 단백질에 의해 매개된다.

본원에 사용된 바, 용어 "자살 유전자" 는 p53-매개 세포자멸사적 세포 사멸을 유도하는 단백질을 생성하는 유전자의 부류를 지칭한다. 본 개시의 발현 구축물 및 시스템에 이용될 수 있는 자살 유전자에는, 카스파아제, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase) (HSV-TK), 및 시토신 디아미나아제가 포함되고, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, Herpes HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제의 유도가능한 변형도 포함된다.

본원에 개시된 발현 구축물 및 시스템은 노화, 암, 감염성 질환, 세균 감염, 및/또는 기타 병태의 치료 방법 뿐 아니라, 노화, 암, 감염성 질환, 세균 감염, 및/또는 기타 병태와 관련된 세포 사멸 방법에 사용되고, 표적 세포의 성장 및/또는 증식을 감소시키는 치료적 단백질 이용한다. 특정 구현예에서, 치료적 단백질은 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 또는 시토신 디아미나아제 뿐 아니라, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 또는 시토신 디아미나아제의 유도가능한 변형을 인코딩하는, 자살 유전자에 의해 발현될 수 있다. 발현 카세트 및 시스템은 또한 노화, 암, 감염성 질환, 세균 감염 및 기타 질환 및 병태의 치료를 위한 치료법의 유효성을 증진시키기 위하여 통상의 화학요법과 조합으로 사용될 수 있다.

본 개시의 실행은, 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 바이러스학, 종양학, 면역학, 미생물학, 분자 생물학, 및 재조합 DNA 의 분야에서 통상적으로 사용되는 방법 및 기법을 이용할 수 있고, 상기 방법 및 기법은 당업자에게 공지된 것으로, 당업자에 의해 용이하게 이용가능하다. 이와 같은 방법 및 기법은 실험실 매뉴얼 뿐 아니라, 과학 및 특허 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들어, 하기를 참조한다: [Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)]; [Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982)]; "DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II" (Glover, ed.)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (Gait, ed., 1984); Ausubel et al. (eds.)], ["Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, 1994)]; ["핵산 Hybridization" (Hames & Higgins, eds., 1985); "Transcription and Translation" (Hames & Higgins, eds., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1986)]; 및 [Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984)]. 상기 및 하기에서, 본원에 인용된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

표적 세포의 성장 및/또는 생존의 감소, 방지, 및/또는 제거를 위한 시스템 및 발현 구축물

특정 구현예에서, 본 개시는 표적 세포의 성장 및/또는 생존에서의 표적 세포 특이적 감소, 방지, 및/또는 제거를 달성하기 위한 발현 구축물 및 전달 벡터를 포함하는 발현 구축물 및 시스템을 제공한다.

시스템

본 개시의 시스템은 (1) 세포가 표적 세포이든 비(非)-표적 세포이든 관계없이, 세포로의 핵산의 비-특이적 전달을 가능하게 하는 벡터, 및 (b) 표적 세포 특이적 전사 프로모터 및 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 발현 구축물을 포함하며, 상기 발현 구축물은 치료적 단백질의 표적 세포 특이적 생성을 가능하게 한다. 본원에 개시된 시스템은, 표적 세포, 예컨대 노화, 질환, 또는 또 다른 병태와 관련된 세포의 성장 또는 생존 형질을 유발하면서, 동시에 노화, 질환, 또는 또 다른 병태와 관련이 없는 정상, 비-표적 세포의 성장 또는 생존 형질을 유발시키지 않는 것이 바람직한, 광범위한 치료적 적용에 유용할 수 있다.

본 개시는, 유사하게 (1) 비-특이적 핵산 전달 벡터 및 (2) (a) 표적 세포 특이적 전사 프로모터 및 (b) 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는, 발현 구축물을 포함하는, 노화, 질환, 또는 또 다른 병태와 관련된 광범위한 세포의 성장 및/또는 생존을 유발하는 시스템을 제공한다. 본원에 개시된 시스템의 이러한 각각의 측면은 이하 보다 상세하게 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 하기를 포함하는, 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 유발하는 시스템이 제공된다: (1) 비-특이적 핵산 전달 벡터 및 (2) (a) 전사 프로모터 (상기 전사 프로모터는 정상, 비-표적 세포가 아닌 표적 세포에서 활성화됨), 및 (b) 전사 프로모터의 제어 하에 있는 핵산 (상기 핵산은, 예를 들어 이들이 생성되는 세포 내 예정된 세포사의 메카니즘을 유도함으로써, 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩함) 을 포함하는, 발현 구축물. 따라서, 이러한 시스템은 독소의 사용 없이 및 발현 구축물의 표적 세포 특이적 전달의 부재 하에서, 표적 세포에 내재된 및 여기서 생성되는 전사 기계를 이용함으로써 표적 세포의 선택적 사멸을 가능하게 한다.

이러한 구현예의 특정 측면에서, 인간 표적 세포가 노화 세포인 경우, 전사 프로모터는 적어도 [Wang et al., J. Biol. Chem. 276(52):48655-61 (2001)] 에 기재된 바와 같은 p16INK4a/CDKN2A 의 전사 인자 결합 부위 (즉, 반응 요소) 를 포함할 수 있고, 상기 전사 프로모터는 SP1, ETS1, 및 ETS2 와 같은 인자에 의한 활성화에 반응한다. 전사 프로모터는 또한 적어도 p21/CDKN1A 의 전사 인자 결합 부위 (즉, 반응 요소) 를 포함할 수 있고, 상기 전사 프로모터는 p53/TP53 와 같은 인자에 의한 활성화에 반응한다. 전사 활성화는 치료적 단백질, 예컨대 CASP3, CASP8, CASP9, DFF40, BAX, HSV-TK, 또는 탄산 탈수효소 또는 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 또는 시토신 디아미나아제의 유도가능한 변형을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도한다.

이러한 구현예의 기타 측면에서, 인간 표적 세포가 암 세포, 예컨대 뇌암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 혈액암 세포, 및 골암 세포인 경우, 전사 프로모터는 적어도 p21^cip1/waf1 프로모터, p27^kip1 프로모터, p57^kip2 프로모터, TdT 프로모터, Rag-1 프로모터, B29 프로모터, Blk 프로모터, CD19 프로모터, BLNK 프로모터, 및/또는 λ5 프로모터의 전사 인자 결합 부위 (즉, 반응 요소) 를 포함할 수 있고, 상기 전사 프로모터는 하나 이상의 전사 인자, 예컨대 EBF3, O/E-1, Pax-5, E2A, p53, VP16, MLL, HSF1, NF-IL6, NFAT1, AP-1, AP-2, HOX, E2F3, 및/또는 NF-κB 전사 인자의 활성화에 반응하고, 상기 전사 활성화는 치료적 단백질, 예를 들어, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 또는 시토신 디아미나아제 또는 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 또는 시토신 디아미나아제의 유도가능한 변형을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도하고, 상기 치료적 단백질은, 예를 들어, 세포자멸사를 비롯한 세포 과정을 통해 노화 세포 내 세포사를 유도함으로써 암 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거한다. 기타 치료적 단백질은, 예를 들어, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 를 비롯한 세포 과정을 통해 세포사를 유도함으로써, 암 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거하는데 이용될 수 있다.

표적 세포가 예를 들어, 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 간염 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 리노 바이러스를 포함하는 바이러스와 같은 감염제로 감염된 인간 세포이거나, 또는 표적 세포가 박테리아 세포인 상기 구현예의 추가 측면에서, 전사 프로모터는 감염제 또는 박테리아 세포에 의해 발현된 인자에 의해 활성화될 수 있고, 이의 전사 활성화는 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 또는 사이토신 디아미나아제, 또는 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK 또는 사이토신 디아미나아제의 유도성 변이체와 같은 치료학적 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도하고, 치료학적 단백질은 예를 들어 세포자멸사를 비롯한 세포 프로세스를 통해 노화 세포의 세포 사멸을 유도하는 것에 의한 것과 같이, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방해 및/또는 제거한다. 예를 들어, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 를 포함하는 세포 프로세스를 통한 세포 사멸을 유도하는 것에 의해, 노화 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방해 및/또는 제거하는 다른 치료학적 단백질이 활용될 수 있다.

본 개시의 시스템의 상기 측면 각각을 본원에서 추가 상세히 기술한다.

비특이적 핵산 전달 벡터

본 개시의 시스템은 표적 세포에 독특한 전사 기계를 활용함으로써 표적 세포 특이성을 달성한다. 그리하여, 본원에서 기재된 시스템은 이에 제한되는 것은 아니나 표적 세포를 비롯한 세포에 대한 발현 구축물의 비특이적 전달에 용이하게 적합할 수 있는 핵산 전달 벡터를 활용한다.

다양한 비(非)바이러스성 및 바이러스성 핵산 전달 벡터 양자 모두는, 당업계에 익히 공지되어 있으며 용이하게 입수가능하고, 본원에 개시된 발현 구축물의 비특이적 세포 전달에 사용되도록 적합될 수 있다. 예를 들어, 바이러스성 및 비(非)바이러스성 핵산 전달 방법론의 일반 기술을 위해 문헌 [Elsabahy et al., Current Drug Delivery 8(3):235-244 (2011)] 을 참조한다. 포유류 세포로의 핵산의 성공적인 전달은 효율적인 전달 벡터의 이용에 좌우된다. 바이러스 벡터는 바람직한 수준의 전달 효율을 보이나, 종종 또한 바람직하지 않은 면역원성, 염증 반응 및 스케일-업 (scale-up) 과 연관된 문제점 (이들 모두는 그의 임상학적 용도를 제안할 수 있음) 을 보이기도 한다. 핵산 전달을 위한 이상적인 벡터는 안전하지만, 핵산 안정성 및 핵산의 적절한 세포 구획으로의 효율적인 이동을 확보해야 한다.

비바이러스성 및 바이러스성 핵산 전달 벡터의 비제한적인 예는 본원에 기재되어 있으며 과학 및 특허 문헌에 개시되어 있다. 보다 구체적으로, 본 개시의 시스템은 하나 이상의 리포좀 벡터, 바이러스 벡터, 나노입자, 폴리플렉스 덴드리머 (polyplexesm dendrimer)를 이용하는데, 이들 각각은 핵산의 비특이적 전달을 위해 개발된 바 있고, 본원에 기재된 발현 구축물의 비특이적 전달에 맞게 조절될 수 있고, 관심 표적 세포로의 시스템의 표적화 전달을 촉진하여 본 개시의 시스템의 표적 세포 특이성을 강화할 수 있는 하나 이상의 제제를 혼입하도록 개질될 수 있다.

1. 리포좀 벡터

발현 카세트는 지질막, 지질 이중층, 및/또는 지질 복합체, 예컨대 예를 들어 리포좀, 소포, 미셸 및/또는 마이크로스피어 내에 혼입될 수 있고/있거나 이와 결합되어 있을 수 있다. 본 개시의 발현 구축물과 함께 이용될 수 있는 지질-기재 전달 시스템을 제조하기 위한 적합한 방법은 문헌 [Metselaar et al., Mini Rev. Med. Chem. 2(4):319-29 (2002); O'Hagen et al., Expert Rev. Vaccines 2(2):269-83 (2003); O'Hagan, Curr. Durg Targets Infect. Disord. 1(3):273-86 (2001); Zho et al., Biosci Rep. 22(2):355-69 (2002); Chikh et al., Biosci Rep. 22(2):339-53 (2002); Bungener et al., Biosci. Rep. 22(2):323-38 (2002); Park, Biosci Rep. 22(2):267-81 (2002); Ulrich, Biosci. Rep. 22(2):129-50; Lofthouse, Adv. Drug Deliv. Rev. 54(6):863-70 (2002); Zhou et al., J. Immunother. 25(4):289-303 (2002); Singh et al., Pharm Res. 19(6):715-28 (2002); Wong et al., Curr. Med. Chem. 8(9):1123-36 (2001); and Zhou et al., Immunomethods 4(3):229-35 (1994)] 에 기재되어 있다. 문헌 [Midoux et al., British J. Pharmacol 157:166-178 (2009)] 은 중합체, 펩티드 및 지질을 포함하는 핵산의 전달을 위한 화학적 벡터를 기술하고 있다. 문헌 [Sioud and Sorensen, Biochem Biophys Res Commun 312(4):1220-5 (2003)] 은 핵산 전달용 양이온성 리포좀을 기술하고 있다.

이들의 양 (positive) 전하로 인해, 양이온성 지질은 음전하를 띤 DNA 분자를 농축하고 DNA 의 리포좀으로의 캡슐화를 촉진하는데 이용된 바 있다. 양이온성 지질은 또한 높은 수준의 리포좀과의 안정성을 제공한다. 양이온성 리포좀은 세포막과 상호작용하고, 엔도사이토시스의 프로세스를 통해 세포에 의해 취해진다. 엔도사이토시스에 의한 결과로서 형성된 엔도솜은 세포질에서 분해되어 이로써 그 카르고 (cargo) 핵산을 방출한다. 그러나, 양이온성 리포좀의 고유 안정성 때문에, 트랜스펙션 효율은 카르고 핵산의 라이소좀 분해의 결과로 인해 낮을 수 있다.

헬퍼 지질 (예컨대, 전기적 중성 지질 DOPE 및 L-a-디올레오일 포스파티딜 콜린 (DOPC)) 이 양이온성 지질과 조합되어 사용되어, 안정성이 감소된 리포좀을 형성하고, 그리하여 트랜스펙션 효율을 개선시킬 수 있다. 이들 전기적 중성 지질을 융합성 (fusogenic) 지질로서 언급한다. 문헌 [Gruner et al., Biochemistry 27(8):2853-66 (1988) and Farhood et al., Biochim Biophys Acta 1235(2):289-95 (1995)] 을 참조한다. DOPE 는 5℃ 내지 10℃ 초과의 온도에서 지질 이중층의 융합을 도모하는 초분자 배열을 유도하는 HII 상 구조를 형성한다. DOPE 의 리포좀으로의 혼입은 또한 엔도솜 막을 탈안정화하는 HII 상의 형성을 보조한다.

리포좀 벡터가 정맥내 투여되는 적용을 위해 콜레스테롤이 DOPE 리포좀과 조합되어 이용될 수 있다. 문헌 [Sakurai et al., Eur J Pharm Biopharm 52(2):165-72 (2001)]. DOPE 의 아실 사슬에서 하나의 불포화의 존재는 막 융합 활성에 있어 중대한 인자이다. 문헌 [Talbot et al., Biochemistry 36(19):5827-36 (1997)].

DF4C11PE (rac-2,3-디[11-(F-부틸)운데카노일) 글리세로-1-포스포에탄올아민) 과 같은 포화 사슬을 갖는 플루오르화 헬퍼 지질은 또한 리포폴리아민 리포좀의 트랜스펙션 효율을 강화한다. 문헌 [Boussif et al., J Gene Med 3(2):109-14 (2001); Gaucheron et al., Bioconj Chem 12(6):949-63 (2001); and Gaucheron et al., J Gene Med 3(4):338-44 (2001)].

헬퍼 지질 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP) 은 DOPE 리포플렉스 (lipoplex) 와 필적하는 시험관 내 세포 트랜스펙션의 효율을 강화한다. 문헌 [Prata et al., Chem Commun 13:1566-8 (2008)]. 디스테아르-4-이노일 L-a-포스파티딜에탄올아민 [DS(9-yne)PE] 에서와 같은 3중 결합으로의 DOPE 의 올레산 사슬의 이중 결합의 대체가 또한 보다 안정적인 리포플렉스를 생성한다는 것이 밝혀진 바 있다. 문헌 [Fletcher et al., Org Biomol Chem 4(2):196-9 (2006)].

IFN7 (GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYG) 및 E5CA (GLFEAIAEFIEGGWEGLIEGCA) 과 같은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌의 HA-2 서브유닛의 N-말단 분절로부터 유래된 양친매성 음이온성 펩티드는 수 배 리포좀의 트랜스펙션 효율을 증가시키는데 사용될 수 있다. 문헌 [Wagner et al., Proc Natl Acad Sci U.S.A. 89(17):7934-8 (1992); Midoux et al., Nucl Acids Res. 21(4):871-8 (1993); Kichler et al., Bioconjug Chem 8(2):213-21 (1997); Wagner, Adv Drug Deliv Rev 38(3):279-289 (1999); Zhang et al., J Gene Med 3(6):560-8 (2001)]. 일부 인위적 펩티드, 예컨대 GALA 가 융합성 펩티드로서 이용된 바 있다. 예를 들어 문헌 [Li et al., Adv Drug Deliv Rev 56(7):967-85 (2004) and Sasaki et al., Anal Bioanal Chem 391(8):2717-27 (2008)] 참조. 단순 헤르페스 바이러스로부터 당단백질 H 의 융합성 펩티드는 인간 세포에서의 전이유전자 발현 및 DNA/리포펙타민 리포플렉스의 엔도솜 방출을 개선한다 (Tu and Kim, J Gene Med 10(6):646-54 (2008)).

PCT 특허 공보 No. WO 2002/044206 에는, 막 융합을 조장하는 리오바이러스 과 (family Reoviridae) 로부터 유래된 단백질 부류가 기재되어 있다. 이들 단백질의 전형적인 예는 파충류 레오바이러스의 p14 단백질 및 수인리오바이러스 (aquareovirus) 의 p16 단백질이 있다. PCT 특허 공보 WO 2012/040825 에는, 막 융합을 촉진하는 재조합 폴리펩티드가 기재되어 있는데, 상기 폴리펩티드는 p14 융합-연합 소 트랜스멤브레인 (fusion-associated small transmembrane; FAST) 단백질의 엑토도메인과 80% 이상의 서열 동일성을 지니고, 작용성 미리스토일화 모티프, FAST 단백질의 트랜스멤브레인 도메인 및 p15 FAST 단백질의 엔도도메인과 80% 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 갖는다. 상기 WO 2012/040825 PCT 에는 선택적 융합을 위한 재조합 폴리펩티드로의 표적 리간드의 부가가 추가로 기재되어 있다. 상기 WO 2012/040825 PCT 에 제시된 재조합 폴리펩티드는 리포좀의 막 내에 혼입되어 핵산 전달을 촉진할 수 있다. 리포좀 파괴 및 그 결과에 따른 카르고 핵산의 전 (systemic) 분산을 감소시키고/시키거나 엔도솜 및 결과로서 생긴 핵산 파괴물로 흡수하는, 핵산을 비롯한 치료학적 화합물을 포유류 세포의 세포질로의 전달을 위한 융합성 (fusogenix) 리포좀이 Innovascreen Inc. (Halifax, Nova Scotia, CA) 에서 시판중이다.

2. 나노입자

금, 실리카, 산화철, 티타늄, 히드로겔 및 칼슘 포스페이트를 비롯한 다양한 무기 나노입자가 핵산 전달에 있어 기재된 바 있으며, 본원에서 기재된 발현 구축물의 전달을 위해서도 조정될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Wagner and Bhaduri, Tissue Engineering 18(1):1-14 (2012) (핵산 서열의 전달을 위한 무기 나노입자를 기술); Ding et al., Mol Ther e-pub (2014) (핵산 전달을 위한 금 나노입자를 기술); Zhang et al., Langmuir 30(3):839-45 (2014) (DNA 올리고뉴클레오티드의 전달을 위한 이산화티탄 나노입자를 기술); Xie et al., Curr Pharm Biotechnol 14(10):918-25 (2014) (유전자 전달을 위한 생분해성 칼슘 포스페이트 나노입자를 기술); Sizovs et al., J Am Chem Soc 136(1):234-40 (2014) (sub-30 단분산 올리고뉴클레오티드 나노입자를 기술)] 을 참조한다.

무기 벡터의 이점 중에서도, 그의 보관 안정성, 낮은 면역원성 및 미생물 공격에 대한 저항이 있다. 100 nm 미만의 나노입자는 핵산을 효율적으로 트랩핑하고, 분해 없이 엔도솜으로부터 이의 탈피를 허용할 수 있다. 무기 나노입자는 이들의 높은 밀도 및 배양 접시의 기저에서 바람직한 위치로 인해 부착된 세포주에 있어서 시험관 내 트랜스펙션 개선을 보인다. 안정적인 형광 마커로 핵산 전달의 커플링을 허용하는 퀀텀 점이 기재되어 있다.

정의된 차원 및 조성의 히드로겔 나노입자는 PRINT (Particle Replication in Non-wetting Templates) 로서 지칭된 입자 몰딩법을 통해 제조될 수 있고, 본원에서 개시된 발현 구축물의 전달 벡터로서 이용될 수 있다. 핵산은 정전기 연합 및 물리적 고정 (entrapment) 을 통해 입자 내에 캡슐화될 수 있다. 전신 투여 후 나노입자로부터 카르고 핵산의 분리를 막기 위해, 분해성 디술파이드 결합을 갖는 중합성 컨쥬게이트를 이용할 수 있다.

PRINT 기술은 표적 세포로의 발현 카세트의 표적화를 강화하기 위한 크기, 형상, 모듈러스, 화학적 조성 밀 표면 작용성을 포함하는 정밀히 제어된 특성을 갖는 조작된 나노입자의 제조를 허용한다. 예를 들어, 문헌 [Wang et al., J Am Chem Soc 132:11306-11313 (2010); Enlow et al., Nano Lett 11:808-813 (2011); Gratton et al., Proc Natl Acad Sci USA 105:11613-11618 (2008); Kelly, J Am Chem Soc 130:5438-5439 (2008); Merkel et al. Proc Natl Acad Sci USA 108:586-591 (2011)] 참조. PRINT 는 또한 양호한 제조 실시 (GMP) 조건 하에서 입자 제작의 스케일-업을 허용하는 연속적인 롤-투-롤 (roll-to-roll) 제작을 할 수 있다.

나노입자는 구강 생이용능을 개선시키고, 효소적 분해를 최소화하고, 혈액 뇌 장벽을 건너도록 지질 코팅으로 캡슐화될 수 있다. 나노입자 표면은 또한 PEG화되어 수용성, 생체 내 순환 및 잠행 특성이 개선될 수 있다.

3. 바이러스 벡터

다양한 바이러스 벡터가 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연합 바이러스 벡터를 포함해 당업자에게 익히 공지되어 있으며 이들이 용이하게 이용가능하고, 상기 바이러스 벡터는 핵산의 전달을 위해, 특히 치료적 단백질의 표적 세포 특이적 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 핵산의 전달을 위해 본원에서 개시된 시스템에서 사용되도록 조정될 수 있다.

특정 수용체에 대한 천연 또는 조작된 바이러스의 향성 (tropism) 이 핵산 전달용 바이러스 벡터를 구축하는데 기초가 된다. 이들 벡터의 표적 세포로의 부착은 바이러스 벡터 상 리간드에 의한 세포 표면 상 특정 수용체의 인지 여부에 따른다. 그 표면 상에서 바이러스를 제시하는 고 특이적 리간드는 세포 상 특이적 수용체 위에 고정된다. 바이러스를 조작하여 관심 표적 세포의 표면 상에 제시된 수용체에 대한 리간드를 전시할 수 있다. 세포 수용체와 바이러스 리간드간의 상호작용은 톨 유사 수용체에 의해 생체 내에서 조정된다.

바이러스 벡터의 세포 내로의 진입은, 수용체 매개된 엔도사이토시스를 통하던지 또는 막 융합을 통하던지 간에 엔도솜 및/또는 라이소좀 경로로부터 바이러스 벡터의 탈출을 허용하는 도메인의 특정 세트를 요구한다. 기타 도메인은 핵으로의 진입을 촉진시킨다. 복제, 어셈블리 및 잠복기는 벡터와 세포간의 상호작용의 역학을 결정하므로, 암 자살 유전자 치료 설계에서, 바이러스 벡터의 선택에서뿐 아니라 치료학적 카르고 보유 세포를 조작하는데 있어서 중요한 고려사항이다.

단순 포진 바이러스 (HSV) 는 헤르페스 패밀리에 속하는 것으로, 외피 DNA 바이러스이다. HSV 는 세가지 주요 리간드 당단백질인 gB, gH, 및 gL 의 오르토로그 (ortholog) 를 통해 세포 수용체에 결합하고, 때로는 부속 단백질을 사용한다. 이러한 리간드는 구강, 안구, 및 생식기 형태의 질병으로의 바이러스 유입의 주요 경로에서 결정적인 역할을 담당한다. HSV 는 신경계의 세포 수용체에 대하여 높은 향성을 보유하여, 노화 세포, 암 세포, 및 감염원에 의해 감염된 세포를 비롯한, 표적 세포로의 발현 카세트의 전달을 위한 재조합 바이러스 처리에 이용될 수 있다. 치료 방관자 효과는 구조체 내에 커넥신 코딩 시퀀스를 포함시킴으로써 향상된다. 표적 세포로의 핵산 전달을 위한 단순 포진 바이러스 벡터는 [Anesti and Coffin, Expert Opin Biol Ther 10(1):89-103 (2010); Marconi et al., Adv Exp Med Biol 655:118-44 (2009)] 및 [Kasai and Saeki, Curr Gene Ther 6(3):303-14 (2006)] 에서 고찰된 바 있다.

렌티바이러스는 레트로바이러스 패밀리에 속하는 것으로, 외피를 갖는, 단일 가닥 RNA 레트로바이러스이고, 이로는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 를 포함한다. HIV 외피 단백질은 CD4+ T 세포, 대식세포 및 수지상 세포와 같이, 인간 면역계의 세포에 존재하는 CD4 를 결합시킨다. 세포내 유입시, 바이러스 RNA 게놈은 이중 가닥 DNA 에 역전사되어, 세포 핵내로 이입되어 세포 DNA 내에 통합된다. HIV 벡터는 백혈병 세포에 치료 유전자를 전달하는데 사용되어 왔다. 재조합 렌티바이러스는, 정상 세포에 대한 실질적인 비-특이적 전달 없이, 핵산을 췌장 암 세포, 상피 난소 암 세포, 및 신경교종 세포로 뮤신-매개 전달한다는 것이 개시된 바 있다. 표적 세포로의 핵산 전달을 위한 렌티바이러스 벡터는 [Primo et al., Exp Dermatol 21(3):162-70 (2012); Staunstrup and Mikkelsen, Curr Gene Ther 11(5):350-62 (2011)] 및 [Dreyer, Mol Biotechnol 47(2):169-87 (2011)] 에서 고찰된 바 있다.

아데노바이러스는 이중 가닥 선형 DNA 게놈 및 캡시드로 이루어진 비-외피 바이러스이다. 당연히, 아데노바이러스는 아데노이드에 상주하고 있으며 상기도 감염의 원인이 될 수 있다. 아데노바이러스는 비강, 기관, 및 폐 상피 세포로의 유입을 위해 아데노바이러스 섬유 단백질에 대한 세포의 콕사키바이러스와 아데노바이러스 수용체 (CAR) 를 이용한다. CAR 은 노화와 암 세포에 대해 낮은 수준에서 발현된다. 재조합 아데노바이러스는 표적 세포에 대한 핵산 전달이 가능한 것이 생성될 수 있다. 복제 가능 아데노바이러스-매개 자살 유전자 요법 (ReCAP) 이 새롭게 진단된 전립선 암에 대한 임상 실험 중에 있다. 표적 세포로의 핵산 전달을 위한 아데노바이러스 벡터는 [Huang and Kamihira, Biotechnol Adv. 31(2):208-23 (2013); Alemany, Adv Cancer Res 115:93-114 (2012)]; [Kaufmann and Nettelbeck, Trends Mol Med 18(7):365-76 (2012)]; 및 [Mowa et al., Expert Opin Drug Deliv 7(12):1373-85 (2010)] 에서 고찰된 바 있다.

아데노-연관 바이러스 (AAV) 는 인간과 일부 다른 영장류 종을 감염시키는 작은 바이러스이다. AAV 는 현재 질병을 야기하는 것으로 알려져 있지 않으며, 따라서 이 바이러스는 매우 온화한 면역 반응을 유발한다. AAV 를 사용하는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내에 통합하지 않으면서 분할 세포와 정지 세포를 둘 모두 감염시키고 염색체외 상태로 유지할 수 있다. 이러한 특징으로 인해 AAV 는 본 개시물의 시스템에 사용되는 바이러스 벡터를 생성하기 위한 매우 매력적인 후보가 된다. 표적 세포로의 핵산 전달을 위한 아데노-연관 바이러스는 [Li et al., J. Control Release 172(2):589-600 (2013); Hajitou, Adv Genet 69:65-82 (2010)]; [McCarty, Mol Ther 16(10):1648-56 (2008)]; 및 [Grimm et al., Methods Enzymol 392:381-405 (2005)] 에서 고찰된 바 있다.

4. 폴리플렉스 (Polyplexes)

폴리플렉스는 DNA 와 중합체의 복합체이다. 폴리플렉스는 양이온성 중합체로 이루어지며 그 제조는 이온성 상호작용에 의한 자기-조립에 기초한다. 폴리플렉스 및 리포좀 및 리포플렉스의 작용 방법 간의 한가지 중요한 차이점은 폴리플렉스는 핵산 카르고를 표적 세포의 세포질내에 직접 방출할 수 없다는 점이다. 그 결과, 입자 흡수 중에 만들어진 세포내 소포로부터의 탈출을 용이하게 하기 위해서는, 불활성화 아데노바이러스 등의 엔도좀-용해제와의 공동-트랜스펙션이 요구된다. DNA 가 엔도라이소좀 경로로부터 탈출할 수 있는 메카니즘 (즉, 양성자 스폰지 효과) 을 더욱 이해하고자 하는 것이, 중합체 골격 내 양성자화가능 (protonable) 잔기의 도입 등 새로운 중합체 합성 전략을 촉발시키는 도화선이 되어 폴리양이온 기반 시스템에 대한 연구를 소생시켰다. 예를 들어, [Parhamifar et al., Methods e-pub (2014); Rychgak and Kilbanov, Adv Drug Deliv Rev e-pub (2014)], [Jafari et al., Curr Med Chem 19(2):197-208 (2012)] 를 참조한다.

낮은 독성, 높은 적재 용량, 및 제조 용이성으로 인해, 폴리양이온성 나노캐리어는, 면역원성 및 잠재적인 발암성을 나타내는 바이러스 벡터, 및 용량 의존적 독성을 일으키는 지질계 벡터에 비하여 실질적인 이점을 나타낸다. 폴리에틸렌이민, 키토산, 폴리(베타-아미노 에스테르), 및 폴리포스포르아미데이트가 핵산 전달에 관해 개시된 바 있다. 예를 들어, [Buschmann et al., Adv Drug Deliv Rev 65(9):1234-70 (2013)] 을 참조한다. 이들 중합체성 나노-캐리어의 크기, 형상, 및 표면 화학은 용이하게 조작 가능하다.

5. 덴드리머

덴드리머는 구형 형상을 갖는 고도로 분지된 거대분자이다. 덴드리머 입자의 표면은, 예를 들어, 양의 표면 전하를 갖도록 관능화될 수 있으며 (양이온성 덴드리머), 이는 핵산의 전달에 이용될 수 있다. 덴드리머-핵산 복합체는 엔도시토시스를 통해 세포 내로 흡수된다. 덴드리머는 강한 공유결합 구성 및 분자 구조 및 크기에 대한 극단적인 제어를 제공한다. 덴드리머는 Dendritic Nanotechnologies Inc. (Priostar; Mt Pleasant, MI) 사로부터 상업적으로 입수가능한데, 이 회사는, 핵산 전달에 적응될 수 있고 낮은 독성과 함께 높은 효율로 세포를 트랜스펙션시킬 수 있는, 동력학적 구동 화학 (kinetically driven chemistry) 을 이용하여 덴드리머를 제조한다.

본 개시물의 시스템은 발현 구축물의 표적 전달을 요구하지 않고, 표적 세포의 성장 및/또는 생존에 있어서의 표적화된 감소, 방지 및/또는 제거가 표적 세포에 대해 독창적인 표적 세포의 세포내 전사 기구를 활용함으로써 달성될 수 있지만, 정확한 적용 대상에 따라서는, 적어도 일부가 본 개시물의 발현 구축물에 의해 성장 및/또는 생존 저해되기 쉬운 표적 세포를 포함하고 있는 세포의 서브세트로 표적화된 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 성분을, 다른 점에서는 비-특이적인 전달 벡터 내로, 혼입시키는 것이 바람직할 수 있는 것으로 이해된다.

본원에 기재된 리포좀, 나노입자, 바이러스 및 기타 벡터에 의한 핵산의 표적 전달은 과학 및 특허 문헌에 기재되어 있으며 당업자에게 공지되어 있고 용이하게 이용가능하다. 이와 같은 표적 전달 기술은, 따라서, 본 개시물의 발현 구축물의 전달을 표적화하는데 적당히 적응되어, 표적 세포 내부에서 달성되는 성장 및/또는 생존 감소, 방지 및/또는 제거의 특이성을 향상시킬 수 있다. 이하 제공된 표적 전달 기술 예시는, 본 개시물의 시스템을 달성하는데 적응될 수 있는 표적 전달 벡터를 예시하는 것이며, 이를 제한하는 것이 아니다.

발현 구축물

본 개시물의 발현 구축물은 하기를 포함한다: (a) 표적 세포에서 생성된 인자 또는 인자들에 반응성인 전사 프로모터로서, 그 인자 중 하나 이상이 비-표적 세포에서 생성되지 않고, 실질적으로 감소된 수준으로 생성되고, 불활성화이고 및/또는 실질적으로 감소된 활성을 나타내는 것; 및 (b) 전사 프로모터의 규제력 있는 조절 하에서 작동가능하게 연결되어 있는 핵산으로서, 상기 핵산이 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거할 수 있는 단백질을 코딩하는 것.

1. 표적 세포 특이적 전사 프로모터

본 개시물은, 핵산이 표적 세포에서 탈억압 또는 활성화되지만 비-표적 세포인 정상 세포에서는 억압 또는 비활성화되는 프로모터의 전사가 제어되는, 핵산 전달을 위한 벡터를 포함하는 시스템을 제공한다.

표적 세포에 대한 현재 개시된 시스템의 특이성은, 따라서, 세포가 표적 세포인지에 상관없이 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거하는 단백질을 코딩하는 핵산의 표적 세포-특이적 전사 활성화를 통해, 달성되는 것으로 이해된다. 따라서, 현재 개시된 시스템의 표적 세포 특이성은 표적 세포에 의해 제공되고 그 표적 세포에 대해 독창적인 전사-규제 기구와 함께 발현 카세트 내부 핵산의 발현을 조절하는 전사 프로모터로부터 유도된다.

따라서, 본 개시물의 발현 구축물에서 적절히 이용될 수 있는 전사 프로모터, 시스템, 및 방법은, 표적 세포 (즉, 노화, 질병 또는 다른 징후와 관련된 세포) 에서는 핵산의 발현을 촉진시킬 수 있지만, 비-표적 세포에서는 핵산의 발현을 촉진시킬 수 없거나, 실질적으로 그 발현 능력이 감소된 전사 프로모터를 포함한다.

본원에서는 전사 프로모터가 노화, 질병 또는 또다른 징후와 관련된 표적 세포에서 활성화되는 발현 구축물을 포함하는 발현 구축물 및 시스템을 예시한다.

일부 구현예에서, 본 개시물은 노화와 관련된, 노화 세포 등의, 세포의 성장 및/또는 생존의 감소, 방지 및/또는 제거의 노화 치료 방법에서 이용될 수 있는 발현 구축물 및 시스템을 제공한다. 상기 구현예의 특정 양태에서, 발현 구축물은, 노화 세포 등의 표적 세포 내부에서 생성되는 하나 이상의 인자에는 반응하지만, 하나 이상의 인자가 전사 프로모터를 탈억압 및/또는 활성화하는 비-표적 세포에서는 생성되지 않으며, 따라서, 노화 세포를 비롯한, 노화와 관련된 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지 및/또는 제거하는 치료적 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 촉진시키는 전사 프로모터를 이용한다.

전사 프로모터 자체는, 노화 세포가 본 개시물에 기재된 시스템에 의해 우선적으로 표적화되는, 주요 메카니즘이다. 본 개시물의 시스템에 따라 사용되는 표적 특이적 전사 프로모터의 모범적인 예시는 노화 세포에서 오직 활성이거나 또는 주로 활성인 프로모터이다. 노화 세포에서 활성인 것으로 숙련자들에게 공지되어 있는 다수의 프로모터가 본 시스템에 사용될 수 있다.

인간 표적 세포가 노화 세포인 상기 구현예의 특정 양태에서, 전사 프로모터는 [Wang et al., J. Biol. Chem. 276(52):48655-61 (2001)] 에 기재된 바와 같이 p16INK4a/CDKN2A 의 프로모터 영역을 포함할 수 있으며, 그 전사 프로모터는 SP1, ETS1 및 ETS2 등의 인자에 의한 활성화에 대해 반응성을 가진다. 전사 프로모터는 P21/CDKN1A 의 프로모터 영역도 또한 포함할 수 있으며, 그 전사 프로모터는 p53/TP53 등의 인자에 의한 활성화에 대해 반응성을 가진다.

인간 표적 세포가 암 세포, 예컨대 뇌암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 결장암 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 혈액암 세포 및 골암 세포인 이러한 구현예의 다른 양태에서, 전사 프로모터는 p21^cip1/waf1 프로모터, p27^kip1 프로모터, p57^kip2 프로모터, TdT 프로모터, Rag-1 프로모터, B29 프로모터, Blk 프로모터, CD19 프로모터, BLNK 프로모터, 및/또는 λ5 프로모터를 포함할 수 있으며, 상기 전사 프로모터는 EBF3, O/E-1, Pax-5, E2A, p53, VP16, MLL, HSF1, NF-IL6, NFAT1, AP-1, AP-2, HOX, E2F3, 및/또는 NF-κB 전사 인자와 같은 하나 이상의 전사 인자에 의한 활성화에 대해 반응을 갖고, 상기 전사 활성화는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도한다.

표적 세포가 예를 들어 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 간염 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스, 및 리노 바이러스를 포함하는 바이러스와 같은 감염성 작용제로 감염되는 인간 세포이거나, 표적 세포가 박테리아 세포인 이러한 구현예의 추가 양태에서, 전사 프로모터는 감염성 작용제 또는 박테리아 세포에 의해 발현되는 인자에 의해 활성화될 수 있고, 상기 전사 활성화는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현을 유도한다.

p16 전사 프로모터

한 구현에에서, 자살 유전자 (suicide gene) 는, 노화 세포에서는 전사적으로 활성이나 비-노화 세포에서는 활성이 아닌 p16Ink4a 유전자 프로모터와 같은 p16 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있다.

인간에서, p16 은 CDKN2A 유전자에 의해 인코딩되며, 상기 유전자는 광범위한 종양에서 빈번하게 돌연변이화되거나 결실된다. p16 은 망막아세포종 단백질 (pRB) 을 인산화시킴으로써 G1 상에서 S 상으로의 진행을 초래하는 CDK4 및 CDK6 과 같은 사이클린 의존적 키나아제의 저해제이다. p16 은 G1 상에서 S 상으로의 세포 진행 속도를 감소시켜 세포 주기 조절에 있어서 중요한 역할을 하며, 따라서 예를 들어 흑색종, 입인두 편평 세포암 및 식도암을 포함하는 암의 예방에 관련되는 종양 억제제로서 역할한다. p16Ink4A 라는 명칭은 CDKN2A 유전자의 스플라이스 변이체 중 하나에 의해 인코딩되는 단백질의 분자량 (15,845) 및 CDK4 저해에 있어서의 이의 역할을 나타낸다.

인간에서, p16 은 염색체 9 (9p21.3) 에 위치한 CDKN2A 유전자에 의해 인코딩된다. 상기 유전자는 그의 제 1 엑손에 있어서 상이한 여러 전사 변이체를 생성한다. 별개의 단백질을 인코딩하는 3 개 이상의 선택적 스플라이싱 (alternatively spliced) 된 변이체가 보고되어 있으며, 구조적으로 관련된 동형을 인코딩하는 것들 중 2 개는 CDK4 의 저해제로서 기능하는 것으로 알려져 있다. 남아 있는 전사체는 유전자 나머지의 20 kb 업스트림에 위치한 대체적 엑손 1 을 포함하고; 이러한 전사체는 다른 변이체의 생성물과 구조적으로 관련되지 않는 단백질을 명시하는 대체적 개방 해독틀 (ARF) 을 포함한다. ARF 생성물은, p53 의 분해에 있어서 그 역할을 하는 단백질인 MDM2 와 상호작용할 수 있고 이를 격리시킬 수 있으므로, 종양 억제제 단백질 p53 의 안정화제로서 기능한다. 그의 구조적 및 기능적 차이에도 불구하고, 상기 유전자에 의해 인코딩된 ARF 생성물 및 CDK 저해제 동형은 세포 주기 G1 진행에서 CDK4 및 p53 의 조절적 역할을 통해, 세포 주기의 G1 상의 제어에 있어서 통상적 기능성을 공유한다. 이러한 유전자는 광범위한 종양에서 빈번하게 돌연변이화되거나 결실되고, 중요한 종양 억제제 유전자인 것으로 알려져 있다.

p16INK4a 의 농도는 조직 연령에 따라 극적으로 증가한다. Liu et al., Aging Cell 8(4):439-48 (2009) 및 Krishnamurthy et al., Nature 443(7110):453-7 (2006). 연령에 따라 증가한 p16 유전자의 발현은 줄기 세포의 증식을 감소시킴으로써 인간에서의 세포 노화-연관된 건강 위험성을 증가시킨다.

p16 은 G1 상에서 S 상으로의 진행을 금지시킴으로써 세포 주기를 둔화시키는 사이클린-의존적 키나아제 (CDK) 저해제이다. 보통, CDK4/6 은 사이클린 D 에 결합하고, 망막아세포종 단백질 (pRB) 을 인산화시키는 활성 단백질 복합체를 형성한다. 인산화되고 나면, pRB 는 전사 인자 E2F1 로부터 분리되어, 그의 세포질 결합 상태로부터 E2F1 을 유리시켜 핵으로 들어갈 수 있게 한다. 핵 내에 유입되고 나면, E2F1 은 G1 상에서 S 상으로의 전환에 필수적인 표적 유전자의 전사를 촉진한다.

p16 은 CDK4/6 에 결합하고 사이클린 D 와의 이의 상호작용을 방지함으로써 종양 억제제로서 역할한다. 이러한 상호작용은 궁극적으로 E2F1 과 같은 전사 인자의 다운스트림 활성을 저해하고, 세포 증식을 저지한다. 이러한 경로는 종양 발암 및 노화의 과정을 연결시켜, 이들을 스펙트럼의 양단에 고정시킨다. 한쪽 말단에서, p16 의 과메틸화, 돌연변이 또는 결실은 유전자의 하향조절을 일으키며 세포 주기 진행의 조절장애를 통해 암을 초래할 수 있다. 반대로, ROS 경로를 통한 p16 의 활성화, DNA 손상 또는 노화는 조직에서의 p16 증강을 초래하며 세포의 노화에 관련된다.

p16 의 조절은 복잡하며 여러 전사 인자 뿐 아니라 프로모터 부위의 억제 및 메틸화를 통한 후생적 변형에 관련된 여러 단백질의 상호작용을 포함한다. PRC1 및 PRC2 는 p16 의 전사를 억제할 수 있는 메틸화 패턴을 실행하는 각종 전사 인자의 상호작용을 통해 p16 의 발현을 변형하는 2 개의 단백질 복합체이다. 이러한 경로는 노화를 감소시키기 위한 세포 반응에서 활성화된다.

p21 전사 프로모터

치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 노화, 및 암 또는 전암 세포에서 종종 전사적으로 활성인 p21/CDKN1A 전사 프로모터의 제어 하에 위치할 수 있다. p53/TP53 은 p21 의 조절, 및 그에 따라, 손상시 세포의 성장 저지에 있어서 중심적 역할을 한다. p21 단백질은 세포 주기를 유도하는 사이클린-CDK 복합체에 직접적으로 결합하며 그의 키나아제 활성을 저해함으로써 세포 주기 저지를 초래하여 회복이 이루어지게 한다. p21 은 또한 분화와 연관된 성장 저지 및 세포 노화와 연관된 보다 영구적인 성장 저지를 매개한다. p21 유전자는 p53 단백질의 직접적 결합을 매개하여, p21 단백질을 인코딩하는 유전자의 전사적 활성을 초래하는 여러 p53 반응 요소를 포함한다. 세포 노화에서의 p53 유전자 조절의 역할은 [Kelley et al., Cancer Research 70(9):3566-75. (2010)] 에 기재되어 있다.

2. 핵산 및 그에 의해 인코딩된 치료적 단백질

본 개시물의 발현 구축물, 시스템 및 방법에서 적합하게 이용될 수 있는 핵산은 상기 핵산이 생성되는 세포 (표적 세포 포함) 의 성장 및/또는 생존을 감소시키고, 방지하고/하거나 없앨 수 있는 단백질을 인코딩한다. 따라서, 본 개시된 발현 구축물 및 시스템의 표적 세포 특이성은 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산의 표적 세포 내 (비-표적 세포 내에서는 아님) 의 발현에 의해 이루어진다.

본 개시물의 발현 구축물 및 시스템에서 이용될 수 있는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 핵산이 생성되는 세포에서의 세포자멸사를 유도하는 하나 이상의 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 본원에 예시된 것은 하나 이상의 "자살 유전자", 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나아제 (HSV-TK), 시토신 디아미나아제, CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, 시토신 디아미나아제를 인코딩하는 핵산, 또는 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있는 단백질을 인코딩하는 기타 핵산을 포함하는 발현 구축물 및 시스템이다.

세포자멸사, 또는 예정세포사 (PCD) 는 모든 후생동물의 통상적이고 진화적으로 보존된 특성이다. 많은 생물학적 과정에서, 세포자멸사는 필요이상의 또는 위험한 (예컨대 전암) 세포를 제거하고 정상 발생을 촉진하기 위해 필요하다. 따라서 세포자멸사의 조절장애는 암, 자가면역 및 신경변성 장애를 포함하는 수많은 주요 질환의 발생을 초래할 수 있다. 대부분의 경우, 카스파아제 패밀리의 단백질은 세포 사멸을 일으키는 유전적 프로그램을 실행한다.

세포자멸사는 포유류 세포, 특히 인간 세포에서 카스파아제 단백질, 특히 카스파아제 단백질 CASP3, CASP8 및 CASP9 의 활성화를 통해 촉발된다. 예를 들어 [Xie et al., Cancer Res 61(18):186-91 (2001)]; [Carlotti et al., Cancer Gene Ther 12(7):627-39 (2005)]; [Lowe et al., Gene Ther 8(18):1363-71 (2001)]; 및 [Shariat et al., Cancer Res 61(6):2562-71 (2001)] 을 참조한다.

DNA 단편화 인자 (DFF) 는 DNase DFF40 (CAD) 및 이의 샤프론/저해제 DFF45 (ICAD-L) 의 복합체이다. 이의 불활성 형태에서, DFF 는 45kDa 샤프론 저해제 서브유닛 (DFF45 또는 ICAD), 및 40kDa 잠재적 엔도뉴클레아제 서브유닛 (DFF40 또는 CAD) 으로 이루어진 이종이량체이다. DFF45 의 카스파아제-3 절단시, DFF40 은 활성 엔도뉴클레아제 호모-올리고머를 형성한다. 이는 세포자멸사 동안 활성화되어 DNA 단편화를 유도한다. DFF 에 의한 DNA 결합은 뉴클레아제 서브유닛에 의해 매개되는데, 이는 또한 DFF 로부터 배출된 후 안정한 DNA 복합체를 형성할 수 있다. 뉴클레아제 서브유닛은 DNA 절단에 있어서는 저해되나 DNA 결합에 있어서는 저해되지 않는다. DFF45 는 또한 카스파아제-7 에 의해 절단되고 불활성화될 수 있으나 카스파아제-6 및 카스파아제-8 에 의해서는 그렇지 않다. 절단된 DFF45 단편은 DFF40 으로부터 분리되어, DFF40 이 올리고머화되게 하여, 이중 가닥 파단물 도입에 의해 DNA 를 절단하는 큰 복합체를 형성한다. 히스톤 H1 은 DFF 에 DNA 결합 능력을 부여하며 DFF40 의 뉴클레아제 활성을 자극한다. 세포자멸사적 엔도뉴클레아제 DFF-40 의 활성화는 [Liu et al., J Biol Chem 274(20):13836-40 (1999)] 에 기재되어 있다.

티미딘 키나아제 (TK) 는 모든 살아 있는 세포 뿐 아니라 특정 바이러스 예컨대 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV), 바리셀라 조스터 바이러스 (VZV) 및 엡스타인-바 바이러스 (EBV) 에 존재하는 ATP-티미딘 5'-포스포트랜스퍼라아제이다. 티미딘 키나아제는 데옥시티미딘을 데옥시티미딘 5'-모노포스페이트 (TMP) 로 전환시키는데, 이는 각각 티미딜레이트 키나아제 및 뉴클레오시드 디포스페이트 키나아제에 의해 데옥시티미딘 디포스페이트 및 데옥시티미딘 트리포스페이트로 인산화된다. 데옥시티미딘 트리포스파아제는 DNA 중합효소 및 바이러스 역전사효소에 의해 세포 DNA 에 혼입된다.

DNA 에 혼입시, 특정 dNTP 유사체, 예컨대 2'-데옥시-구아노신의 합성 유사체 (예를 들어, 간시클로비르 (Ganciclovir)) 는 DNA 합성의 때이른 종료를 일으켜, 세포자멸사를 촉발시킨다.

특정 구현예 내에서, 본 개시물의 발현 카세트 및 시스템은 HSV-TK 를 인코딩하는 핵산을 이용한다. HSV-TK 를 인코딩하는 핵산을 이용하는 시스템을 인간에게 투여한 후, 2'-데옥시-뉴클레오티드의 유사체, 예컨대 2'-데옥시-구아노신을 인간에게 투여한다. HSV-TK 는 2'-데옥시-뉴클레오티드 유사체를 dNTP 유사체로 효율적으로 전환시켜, 이는 DNA 에 혼입시 표적 세포에서 세포자멸사를 유도한다.

시토신 디아미나아제 (CD) 는 시토신의 우라실 및 암모니아로의, DNA 에서의 가수분해적 전환을 촉진시킨다. CD-변형된 부위가 엔도뉴클레아제에 의해 인지되는 경우, 포스포디에스테르 결합이 절단되고, 정상 세포에서, 새로운 시토신을 혼입함으로써 회복된다. 5-플루오로시토신 (5-FC) 의 존재 하에, 시토신 디아미나아제는 5-FC 를 5-플루오로우라실 (5-FU) 로 전환시키는데, 이는 표적 세포 성장을 저해할 수 있다. 따라서 표적 세포에서의 CD 의 유전자이식성 발현은 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소시킨다.

본 개시물은 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산의 발현이 원하는 시간에 걸쳐, 및/또는 특정 수준으로, 적절한 세포에서 상향조절된다는 것을 확실히 하기 위해 하나 이상의 안전성 특징을 추가로 포함하는 발현 구축물 및 시스템을 제공한다.

이러한 한 구현예 내에서, 본 개시물의 발현 구축물 및 시스템은 예를 들어 CASP3, CASP8 및 CASP9 의 유도가능 변이체를 포함하는 치료적 단백질의 유도가능 변이체를 인코딩하는 핵산을 이용하며, 이는 세포와의 추가적인 접촉 또는 치료적 단백질을 활성화하는 화학적 또는 생물학적 화합물의 인간에 대한 투여를 필요로 한다.

유도가능 자살 유전자 시스템은 널리 알려져 있으며 당업계에서 용이하게 이용가능하고, 예를 들어 Miller et al., PCT 특허 공개 번호 WO 2008/154644 및 Brenner, US 특허 공개 번호 2011/0286980 에 기재되어 있다. 또한, [Shah et al., Genesis 45(4):104-199 (2007)] 은 RU486 및 이량체화의 화학적 유도제 (CID) 를 이용하는 카스파아제 3 및 9 에 대한 이중-유도가능 시스템을 기재하고 있다. [Straathof et al., Blood 105(11):4247-4254 (2005)] 는 유도가능 카스파아제 9 시스템을 기재하고 있는데, 여기서 카스파아제 9 는 인간 FK506 결합 단백질 (FKBP) 에 융합되어, FK506 의 비-독성 합성 유사체인 소분자 AP20187 (ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA) 를 사용하여 조건부적 이량체화가 가능하게 한다. [Carlotti et al., Cancer Gene Ther 12(7):627-39 (2005)] 는 ARIAD^TM 동종이량체화 시스템 (FKC8; ARIAD Pharmaceuticals) 을 이용함으로써 유도가능 카스파아제 8 시스템을 기재하고 있다.

전체 길이 유도가능 카스파아제 9 (F'F-C-Casp9.I.GFP) 는 전체 길이 카스파아제 9 를 포함하는데, 이는 유연성이 증진되도록 FKBP 및 카스파아제 9 를 연결하는 Ser-Gly-Gly-Gly-Ser 링커에 의해 연결되며 [Clackson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:10437-10442 (1998)] 에서 기재된 바와 같이 F36V 돌연변이를 포함하는 2 개의 12 kDa 인간 FK506 결합 단백질 (FKBP12; GenBank AH002 818) 에 연결된 이의 카스파아제 유도 도메인 (CARD; GenBank NM001 229) 을 포함한다.

추가 구현예에서, 유도가능 자살 유전자는 루시퍼라아제 또는 녹색 형광 단백질과 같은 검출가능 바이오마커에 대한 핵산 서열에 연결되어, 유도가능 치료적 단백질을 활성화하기 위해 화합물을 투여하기 전에 표적화 세포가 검출될 수 있게 한다.

벡터 및 발현 카세트 (expression cassette) 를 포함하는 시스템의 조성물 및 제형

본 개시 내용은 벡터 및 발현 카세트를 포함하는 시스템을 제공하는데, 여기서 발현 카세트는 치료적 단백질을 인코딩하는 핵산 및 표적 세포에서 발현되는 전사 인자 하나 이상에 응답하는 전사 프로모터를 포함한다. 시스템은 그 자체로 또는 약학 조성물 중에 인간 환자에게 투여될 수 있는데, 여기서 이는 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료 또는 개선하기 위한 투약량으로 적합한 담체 또는 부형제(들) 과 혼합된다. 이러한 시스템의 혼합물은 또한 단순 혼합물로서 또는 약학 조성물 중으로 환자에게 투여될 수 있다.

본 개시 내용의 범주 이내의 조성물은 치료제가 표적 세포 예컨대 노화 세포, 암 세포, 감염원에 의해 감염된 세포, 박테리아 세포 또는 또다른 질환 또는 상태와 연관된 세포의 성장 및/또는 생존을 감소 또는 제거하는데 유효한 양으로 벡터 및 발현 카세트를 포함하는 시스템인 조성물을 포함한다. 각각의 성분의 유효량의 최적 범위의 측정은 당업계의 기술 이내에 있다. 유효 투약량은 인자의 수 (특이적 시스템 포함), 하나 조성물 내에 있거나 시스템과 동시에 주어진 하나 이상의 추가 치료제의 존재, 치료 빈도, 및 환자의 임상 상태, 연령, 건강 및 체중의 함수이다.

시스템을 포함하는 조성물은 비경구로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "장관외 투여" 는 장관 투여 및 일반적으로 주사에 의한 국소 투여 이외의 투여 방식을 나타내고, 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 피내, 관절-내, 피막하, 지주막하, 척수내, 및 흉골내 주입 및 인퓨전을 포함한다. 대안적으로 또는 동시에, 투여는 경구일 수 있다.

시스템을 포함하는 조성물은 예를 들어 정맥내 푸쉬 (push) 또는 볼루스 (bolus) 를 통해 정맥내로 투여될 수 있다. 대안적으로, 시스템을 포함하는 조성물은 정맥내 인퓨전을 통해 투여될 수 있다.

조성물은 치료적 유효량의 시스템 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "약학적으로 허용가능한" 은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전, 또는 동물, 더욱 특히 인간에서의 사용에 관한 기타 일반적으로 인식된 약전에 열거됨을 의미한다. 용어 "담체" 는 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 나타내고, 이와 함께 치료제가 투여된다. 상기 약학적 담체는 살균액, 예컨대 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩유, 대두유, 미네랄유, 참깨유 등일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥내로 투여될 때 바람직한 담체이다. 염류 용액 및 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주입가능 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 나트륨 클로라이드, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 바람직한 경우 조성물은 또한 습윤제 또는 에멀전화제 또는 pH 완충제를 부수적 양으로 함유할 수 있다.

이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 통상적인 결합제 및 담체 예컨대 트리글리세리드와 함께, 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형은 표준 담체 예컨대 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 치료적 유효량의 저해제를 바람직하게는 정제된 형태로, 적합한 양의 담체와 함께 함유하여, 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 것이다. 제형은 투여 방식에 맞춰져야 한다.

조성물은 인간에 대한 정맥내 투여에 적합화된 약학 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화될 수 있다. 전형적으로, 정맥내 투여용 조성물은 살균 등장성 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 국소 마취제 예컨대 주입 부위에서의 고통을 완화시키기 위한 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 단위 투약 형태, 예를 들어 전밀폐 용기 예컨대 앰플 또는 활성제의 양을 나타내는 작은 봉지 (sachette) 중의 건조 동결 분말 또는 무수 농축물로서 별도로 공급되거나 함께 혼합된다. 조성물이 인퓨전에 의해 투여되는 경우, 이는 살균 약학적 등급 물 또는 염류를 함유하는 인퓨전 병에 의해 제공될 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 주입을 위한 살균수 또는 염류의 앰플은 성분이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

본원에 개시된 시스템은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 음이온에 의해 형성된 것 예컨대 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유래된 것, 및 양이온에 의해 형성된 것 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2철 히드록시드, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것을 포함한다.

노화, 암, 감염성 질환, 박테리아 감염 및/또는 기타 질환 또는 상태와 연관된 질환 또는 상태의 치료를 위한, 및 상기와 관련된 세포의 성장 및/또는 생존을 저하, 저해 및/또는 예방하기 위한 방법

본 개시 내용은 노화, 암, 감염성 질환, 박테리아 감염 및/또는 기타 질환 또는 상태와 연관된 세포의 성장 및 생존을 저하, 저해 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 표적 세포 또는 표적 세포를 포함하는 집단 (population) 을 본원에 기재된 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는데, 이 시스템은 벡터 및 전사 프로모터 및 핵산을 포함하는 발현 구조물 (발현 구축물) 을 포함한다.

본 개시 내용은 또한 전사 프로모터 및 핵산을 포함하는 발현 구조물 및 벡터를 포함하는 본원에 기재된 시스템의 투여를 포함하는, 환자에서 노화, 암, 감염성 질환, 박테리아 감염 및/또는 기타 질환 또는 상태의 치료 방법을 제공한다.

본 치료 방법은 노화, 암, 감염성 질환, 박테리아 감염 또는 또다른 질환 또는 상태와 연관되는 세포의 성장 및/또는 생존을 저하 및/또는 제거하기 위해 인간 환자에게 벡터 및 발현 카세트를 포함하는 하나 이상의 시스템을 포함하는 조성물과 표적 세포를 접촉시키거나, 이를 인간 환자에게 투여하는 것을 포함한다.

노화, 암, 감염성 질환, 박테리아 감염 또는 하나 이상의 전사 인자의 상승된 발현과 연관된 기타 질환 또는 상태에서 유효할 시스템의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 시험관내 (in vitro) 검정은 임의로 최적 투약 범위의 식별을 돕는데 사용될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 투약량은 또한 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 심각성에 가변적일 것이다. 유효 투약량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로서 유래된 약물-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.

본 개시 내용의 시스템 또는 약학 조성물은 인간에서 사용되기 전에 시험관내에서 시험되고, 이후 원하는 치료적 또는 예방적 활성을 위해 생체내에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 약학 조성물의 치료적 또는 예방적 유용성을 측정하기 위한 시험관내 검정은 세포주 또는 인간 조직 샘플에 대한 시스템의 효과를 포함한다. 세포계 및/도는 조직 샘플에 대한 시스템 또는 이의 약학 조성물의 효과는, 제한 없이 증식 및 세포자멸 검정을 포함하는 당업자에 공지된 기술을 이용하여 측정될 수 있다. 본 개시내용에 따르면, 특이적 화합물의 투여가 나타나는 지를 측정하는데 사용될 수 있는 시험관내 검정은, 인간 조직 샘플이 배양에서 성장되고, 화합물에 노출되거나 다르게는 화합물이 투여되고, 조직 샘플에 따른 상기 화합물의 효과가 관찰되는 시험관내 세포 배양 검정을 포함한다.

본 개시 내용은 본원에 기재된 바와 같은 시스템 또는 이의 약학 조성물의 유효량의 대상체에 대한 투여에 의한, 치료 및 성장 및/또는 생존 저해 방법을 개시한다. 한 양상에서, 시스템은 이것이 그 효과를 제한하거나 원치 않는 부작용을 생성하는 성분을 포함하지 않도록 실질적으로 정제된다.

투여 방법은 제한 없이, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함한다. 시스템 또는 이의 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들어 인퓨전 또는 볼루스 주입에 의해, 상피 또는 피부점막 라이닝 (lining) 을 통한 흡수 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 창자 점막 등) 에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소일 수 있다. 또한, 심실내 및 척추강내 주입을 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추 신경계에 조성물 또는 저해제를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 심실내 주입은 예를 들어 저장소 (reservoir) 예컨대 오마야 저장소 (Ommaya reservoir) 에 부착된 심실내 카테터에 의해 용이해질 수 있다. 폐 투여는 예를 들어 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 갖는 제형의 사용에 의해 사용될 수 있다.

치료를 필요로 하는 영역에 국소로 시스템 또는 이의 조성물을 투여하는 것이 바람직할 수 있고; 이는 예를 들어 수술 동안의 국소 인퓨전, 국소 적용, 주입, 카테터, 좌약 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 다공성, 비다공성 또는 젤라틴 물질, 예컨대 막, 예컨대 시알라스틱 막 (sialastic membrane) 또는 섬유이다.

시스템은 치료 표적에 근접하여 위치된 방출조절 시스템에서 전달될 수 있어, 오로지 전신 투약량의 일부만을 필요로 한다 (예를 들어 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release 2:115-138 (1984) 참조).

시스템을 포함하는 조성물의 정맥내 인퓨전은 약 1 일 이상, 또는 약 3 일 이상, 또는 약 7 일 이상, 또는 약 14 일 이상, 또는 약 21 일 이상, 또는 약 28 일 이상, 또는 약 42 일 이상, 또는 약 56 일 이상, 또는 약 84 일 이상, 또는 약 112 일 이상의 기간 동안 지속될 수 있다.

시스템을 포함하는 조성물의 연속적 정맥내 인퓨전은 특정 기간 동안일 수 있고, 이후 또다른 기간의 휴지기가 뒤따른다. 예를 들어 연속적 인퓨전 기간은 약 1 일, 내지 약 7 일, 내지 약 14 일, 내지 약 21 일, 내지 약 28 일, 내지 약 42 일, 내지 약 56 일, 내지 약 84 일, 또는 내지 약 112 일일 수 있다. 연속적 인퓨전은 이후 약 1 일, 내지 약 2 일, 내지 약 3 일, 내지 약 7 일, 내지 약 14 일, 또는 내지 약 28 일의 휴지기가 뒤따를 수 있다. 연속적 인퓨전은 이후 상기와 같이 반복될 수 있고, 이후 또다른 휴지기가 뒤따를 수 있다.

적합화된 정확한 인퓨전 프로토콜에 상관없이, 시스템을 포함하는 조성물의 연속적 인퓨전은 원하는 효율이 달성되거나 독성의 허용가능하지 않은 수준이 명백해질 때까지 지속될 것임이 이해될 것이다.

* * *

달리 나타나지 않는 한, 용어는 "개방적" (예를 들어, 용어 "포함하는" 은 "제한 없이 포함하는" 으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는" 은 "적어도 갖는" 으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다" 는 "제한 없이 포함하다" 를 의미함, 등) 인 것으로 의도됨이 이해될 것이다. 구절 예컨대 "적어도 하나" 및 "하나 이상" 및 용어 예컨대 "단수 형태" 는 단수 및 다수를 모두 포함한다.

또한 개시 내용의 특징 또는 양상이 마쿠쉬 그룹 (Markush group) 의 측면에서 기재되는 경우, 개시 내용은 또한 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 측면에서 기재되는 것으로 의도된다. 유사하게는, 본원에 개시된 모든 범위는 또한 모든 가능한 하위 범위 및 하위 범위의 조합을 포함하고, 이러한 언어 예컨대 "내지", "이하", "이상", "초과", "미만" 등은 범위에 언급된 수를 포함하고, 각각의 개별 구성원을 포함한다.

상기에서 또는 하기에서, 본원에 언급된 모든 참조문은 제한 없이 특허, 특허 출원, 및 특허 공개 (미국, PCT 또는 비미국, 외국) 를 포함하고, 모든 기술적 및/또는 과학적 간행물은 이에 따라 그 전체가 참조 인용된다.

다양한 구현예가 본원에 개시되기는 하지만, 다른 구현예가 당업자에게 명백할 것이다. 본원에 개시된 다양한 구현예는 설명의 목적이고 제한되는 것으로 의도되지 않고, 실제 범주 및 취지는 청구항에 의해 나타난다.

본 개시 내용은 하기 비제한적 실시예를 참조로 추가 기재될 것이다. 모든 특허, 특허 출원 및 본원에 언급된 모든 기타 문헌의 교시는 그 전체가 참조 인용된다.

<110> Oisin Biotechnologies <120> SYSTEMS AND METHODS FOR THE TARGETED PRODUCTION OF A THERAPEUTIC PROTEIN WITHIN A TARGET CELL <130> OSIN-11-0115KRWO <140> PCT/US14/31638 <141> 2014-03-24 <150> US 61/804,716 <151> 2013-03-24 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3017 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttcagagaaa tccctgaatt cactgaaagt tttatctaga aatacatgtg caagtgaaca 60 catctttttt aaaaaaaatc attacctact ttcttttttg agaagaaggt atttatttca 120 acagactctt gaaggagcct actcttccca ctctcccacc cccattaaga accactgtag 180 gccgggcacg atggctcatg cctgtaatcc cagcactttg ggaggctaag gtgggtggat 240 cacctgaggt caggagttcg agacaagcct agccaacata gtgaaacccc gtctctacta 300 ataatacaaa aattagctgg gtatggcagc atgtgcctgt aatcccagct actcgggagg 360 ctgaggcagg agaattgctc gaacccggga ggcggaggtt gcagtgaacc gagagagatc 420 gtgcggtgcc atttcactcc agcctgggca acagagcgaa actccatctc aaaaaaacac 480 acaaaacaaa caaacaaaaa gaaagaacca ttgtattagt gatggaaatg tgttccctcc 540 ctcccatcct ggcaaccact ttcttcctcc tccatcataa aatatcttaa 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1440 tccaaagcat tttttttttt ttttttgagt cggagtctca ttctgtcacc caggctggag 1500 ggtggtggcg cgatctcggc ttactgcaac ctctgcctcc cgggttcaag cgattctcct 1560 gcctcagcct cctgagtagc tggaattaca cacgtgcgcc accatggcca gctaattttt 1620 gtatttttag tagagacggg gtgtcaccat tttggccaag ctggcctcga actcctgacc 1680 tcaggtgatc tgcccgcctc ggcttcccaa agtgctggga ttacaggtgt gagccaccgc 1740 gtcctgctcc aaagcatttt ctttctatgc ctcaaaacaa gattgcaagc cagtcctcaa 1800 agcggataat tcaagagcta acaggtatta gcttaggatg tgtggcactg ttcttaaggc 1860 ttatatgtat taatacatca tttaaactca caacaacccc tataaagcag ggggcactca 1920 tattcccttc cccctttata attacgaaaa atgcaaggta ttttcagtag gaaagagaaa 1980 tgtgagaagt gtgaaggaga caggacagta tttgaagctg gtctttggat cactgtgcaa 2040 ctctgcttct agaacactga gcactttttc tggtctagga attatgactt tgagaatgga 2100 gtccgtcctt ccaatgactc cctccccatt ttcctatctg cctacaggca gaattctccc 2160 ccgtccgtat taaataaacc tcatcttttc agagtctgct cttataccag gcaatgtaca 2220 cgtctgagaa acccttgccc cagacagccg ttttacacgc aggaggggaa ggggagggga 2280 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Claims (46)

1. 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물로서, 하기를 포함하는 발현 구축물:
   a. 각각 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터; 및
   b. 상기 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산, 상기 핵산은 상기 표적 세포를 포함하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩함.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 상기 표적 세포에서 활성화되나, 상기 질환과 연관되지 않은 정상 포유류 세포에서는 활성화되지 않는 발현 구축물.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 인자 중 하나 이상이 상기 질환과 연관되지 않은 상기 정상 포유류 세포에서 생산되지 않는 발현 구축물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 정상 포유류 세포가 정상 인간 세포인 발현 구축물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 정상 인간 세포가 질환, 상태 또는 노화와 연관되지 않은, 정상 골격근아세포, 정상 지방 세포, 정상 눈 세포, 정상 뇌세포, 정상 간 세포, 정상 대장 세포, 정상 폐 세포, 정상 췌장 세포 및/또는 정상 심장 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 구축물.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 세포가 포유류 세포 및 박테리아 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 구축물.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 표적 세포가 포유류 세포인 발현 구축물.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 포유류 표적 세포가 노화 세포, 암 세포, 및 감염성 질환 작용제로 감염된 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 세포인 발현 구축물.
9. 제 8 항에 있어서, 상기 인간 표적 세포가 노화 세포인 발현 구축물.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 p16INK4a/CDKN2A 전사 프로모터 및 p21/CDKN1A 전사 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 구축물.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 SP1, ETS1, ETS2, 및 p53/TP53 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자에 반응성인 발현 구축물.
12. 제 9 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 구축물.
13. 제 9 항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 상기 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 발현 구축물.
14. 제 13 항에 있어서, 상기 유도된 세포 사멸이 세포자멸사, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 프로세스를 통해 발생하는 발현 구축물.
15. 제 8 항에 있어서, 상기 인간 포유류 표적 세포가 암 세포인 발현 구축물.
16. 제 13 항에 있어서, 상기 암 세포가 뇌암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 혈액암 세포 및 골암 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 구축물.
17. 제 13 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 p21^cip1/waf1 프로모터, p27^kip1 프로모터, p57^kip2 프로모터, TdT 프로모터, Rag-1 프로모터, B29 프로모터, Blk 프로모터, CD19 프로모터, BLNK 프로모터, 및 λ5 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 발현 구축물.
18. 제 13 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 EBF3, O/E-1, Pax-5, E2A, p53, VP16, MLL, HSF1, NF-IL6, NFAT1, AP-1, AP-2, HOX, E2F3, 및/또는 NF-κB 전사 인자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자에 반응성인 발현 구축물.
19. 제 13 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 구축물.
20. 제 8 항에 있어서, 상기 표적 세포가 감염성 질환 작용제로 감염된 인간 세포 또는 박테리아 세포인 발현 구축물.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 감염성 작용제가 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 간염 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 리노 (rhino) 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스인 발현 구축물.
22. 제 20 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 발현 구축물.
23. 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템으로서, 하기를 포함하는 시스템:
    a. 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터, 상기 벡터는 발현 구축물을 포함함;
    b. 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물, 상기 발현 구축물은 하기를 포함함:
    i. 각각 상기 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터; 및
    ii. 상기 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산, 상기 핵산은 상기 표적 세포를 포함하는 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거할 수 있는 치료적 단백질을 인코딩함.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 벡터가 리포좀, 바이러스 벡터, 나노입자, 폴리플렉스 (polyplex) 및 덴드리머로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
25. 제 23 항에 있어서, 상기 벡터가 리포좀이며, 상기 리포좀이 융합성 펩티드를 포함하는 시스템.
26. 제 23 항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터이며, 상기 바이러스 벡터가 단순 헤르페스 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연합 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
27. 제 23 항에 있어서, 상기 벡터가 나노입자이며, 상기 나노입자가 금 나노입자, 실리카 나노입자, 철 옥시드 나노입자, 티타늄 나노입자, 히드로겔 나노입자, 및 칼슘 포스페이트 나노입자를 포함하여 이로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
28. 제 23 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 상기 표적 세포에서 활성화되나, 상기 질환과 연관되지 않은 정상 포유류 세포에서는 활성화되지 않는 시스템.
29. 제 23 항에 있어서, 상기 인자 중 하나 이상이 상기 질환과 연관되지 않은 상기 정상 포유류 세포에서 생산되지 않는 시스템.
30. 제 23 항에 있어서, 상기 포유류 표적 세포가 노화 세포, 암 세포, 및 감염성 질환 작용제로 감염된 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인간 세포인 시스템.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 인간 표적 세포가 노화 세포인 시스템.
32. 제 30 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 p16INK4a/CDKN2A 전사 프로모터 및 p21/CDKN1A 전사 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
33. 제 32 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 SP1, ETS1, ETS2, 및 p53/TP53 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자에 반응성인 시스템.
34. 제 30 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 시스템.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 치료적 단백질이 상기 표적 세포에서 세포 사멸을 유도하는 시스템.
36. 제 35 항에 있어서, 상기 유도된 세포 사멸이 세포자멸사, 괴사/네크롭토시스 (necroptosis), 자가소화성 (autophagic) 세포 사멸, 소포체-스트레스 관련 세포독성, 유사분열 카타스트로피 (mitotic catastrophe), 파랍토시스 (paraptosis), 피롭토시스 (pyroptosis), 피로네크로시스 (pyronecrosis) 및 엔토시프 (entosifs) 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포 프로세스를 통해 발생하는 시스템.
37. 제 30 항에 있어서, 상기 인간 포유류 표적 세포가 암 세포인 시스템.
38. 제 37 항에 있어서, 상기 암 세포가 뇌암 세포, 전립선암 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 유방암 세포, 간암 세포, 혈액암 세포 및 골암 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
39. 제 37 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 p21^cip1/waf1 프로모터, p27^kip1 프로모터, p57^kip2 프로모터, TdT 프로모터, Rag-1 프로모터, B29 프로모터, Blk 프로모터, CD19 프로모터, BLNK 프로모터, 및 λ5 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 시스템.
40. 제 37 항에 있어서, 상기 전사 프로모터가 EBF3, O/E-1, Pax-5, E2A, p53, VP16, MLL, HSF1, NF-IL6, NFAT1, 및 NF-κB 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 인자에 반응성인 시스템.
41. 제 37 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 시스템.
42. 제 30 항에 있어서, 상기 표적 세포가 감염성 질환 작용제로 감염된 인간 세포인 시스템.
43. 제 42 항에 있어서, 상기 감염성 작용제가 헤르페스 바이러스, 소아마비 바이러스, 간염 바이러스, 레트로바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 리노 (rhino) 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 바이러스인 시스템.
44. 제 42 항에 있어서, 상기 핵산이 CASP3, CASP8, CASP9, BAX, DFF40, HSV-TK, 및 시토신 디아미나아제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치료적 단백질을 인코딩하는 시스템.
45. 표적 세포의 성장을 감소, 방지, 및/또는 제거하기 위한 방법으로서, 표적 세포를 상기 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템과 접촉시키는 것을 포함하는 방법으로, 상기 시스템이:
    a. 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터, 상기 벡터는 발현 구축물을 포함함; 및
    b. 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고, 상기 발현 구축물이
    i. 각각 상기 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터; 및
    ii. 상기 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 치료적 단백질을 인코딩함,
    상기 표적 세포 내에서의 치료적 단백질의 생산은 상기 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거하는 방법.
46. 표적 세포를 갖는 환자에서, 질환 또는 상태를 치료하기 위한 방법으로서, 상기 환자에게 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 시스템을 투여하는 것을 포함하는 방법으로, 상기 시스템이:
    a. 세포에 핵산을 전달할 수 있는 벡터, 상기 벡터는 발현 구축물을 포함함; 및
    b. 표적 세포 내에서 치료적 단백질의 표적화된 생산을 위한 발현 구축물을 포함하고, 상기 발현 구축물이
    i. 각각 상기 표적 세포 내에서 생산되는 하나 이상의 인자에 응답하여 활성화되는 전사 프로모터; 및
    ii. 상기 전사 프로모터에 작동가능하게 연결되어 그의 조절 제어 하에 있는 핵산을 포함하며, 상기 핵산은 치료적 단백질을 인코딩함,
    상기 표적 세포 내에서의 치료적 단백질의 생산은 상기 표적 세포의 성장 및/또는 생존을 감소, 방지, 및/또는 제거함으로써, 상기 환자에서의 상기 질환 또는 상태를 감속, 역행 및/및 또는 제거하는 방법.

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