CN102228437B - 一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用。本发明是将三种高效抗癌药物肿瘤坏死因子-a、干扰素-g、阿霉素和具有癌细胞靶向的叶酸连接上光活性基团，并通过光化学固定法将这三种光活性肿瘤坏死因子-a、干扰素-g、阿霉素和叶酸通过酰胺化反应连接在纳米载体上，得到了具有多层结构的、多功能的磁性纳米复合粒子。本发明所述共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒具有良好的体外抑制HeLa细胞生长的效果，且对正常组织无明显毒副作用，可以用于制备治疗肿瘤的药物。
Description
一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物化学合成制备技术领域，具体涉及一种共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
子宫颈癌(Carcinoma of Cervix)是全球女性所患恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的常见恶性肿瘤，在一些发展中国家妇女中其发病率仍属第1位，而在北美及欧洲妇女中其发病率远低于乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌。它是通常发生在宫颈阴道部或移行带的鳞状上皮细胞及颈管内膜的柱状上皮细胞交界处的恶性肿瘤。近50年来，随着社会经济和卫生事业的发展，子宫颈癌在发达国家的发病率已大幅度下降，但是在发展中国家，子宫颈癌的发病率和死亡率仍居高不下。据国际癌症研究中心近年估计其5年患病为15518万人，其中100余万在发展中国家，30余万在发达国家。
现有医学技术对子宫颈癌还没有彻底治愈的方法，但会根据患者的不同情况施以不同的治疗方法与药物。在临床上常见的宫颈癌治疗方法有手术治疗，药物治疗和物理治疗。化学药物和放射药物的选择性不高，既能抑制和杀伤肿瘤细胞，也可损伤体内正常组织和细胞，在治疗中出现明显的毒副作用，治疗效果不理想；而物理疗法，如激光、冷冻、电灼等治疗较多出现活动性渗血，造成下腹隐痛不适，出现阴道流液甚至感染等副作用，给病人带来极大的生理上和心理上的痛苦。2006 年以来，子宫颈癌预防性Rardasil 疫苗已在全球49个国家获得批准，获批国家规模还在不断扩大。在加拿大，推荐Rardasil 疫苗给9～13 岁女性使用。相关研究发现其显著降低宫颈癌发病率的潜力，并且经济实惠，但是仍然存在很多问题，例如子宫颈癌预防性疫苗成本较高，难以在发展中国家广泛推广，另外接种的年龄、对象、阶段以及潜在的毒副作用尚未清楚，而治疗性疫苗尚停留在Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段，目前还没有在人体进行相关试验，真正应用于广大癌患者还需要相当长的一段时间。
细胞因子药物由于其强大的抗癌作用与免疫调节等作用多年来一直倍受关注。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是人体内对肿瘤有直接杀伤作用的一种细胞因子，由激活的单核巨噬细胞产生，可使瘤体缩小或消失，在体内体外均能有效杀伤肿瘤细胞，对多种肿瘤的中晚期患者有一定治疗作用，但在临床应用中发现有明显的毒副反应，如发热、寒战、恶心呕吐、头痛、肝肾功能改变等。干扰素-γ(IFN-γ)是在病毒感染后机体细胞产生的一种抗病毒的糖蛋白，是广谱抗病毒物质，它以诱导方式在细胞内抗RNA或DNA病毒。它本身无毒性，也不影响正常细胞功能，但可抑制快速分裂的细胞，如各种肿瘤细胞，临床可用于肿瘤的辅助治疗。干扰素的毒副作用发生率比较高，最常见的是发热及流感样综合征，患者体重减轻、脱发、情绪激动，骨髓抑制致血细胞、血小板减少，轻度贫血，偶可发生神经系统损伤，影响内分泌系统功能，亦有产生干扰素抗体者。
阿霉素(Doxorubicin)或盐酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride, DOX)是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，它被认为是目前蒽环类抗癌药物中最好的药物。阿霉素的化学名称为10-[(3-氨基-2,3,6-三去氧-a-L-来苏己吡喃基)-氧]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮盐酸盐，其结构中具有脂溶性的蒽环配基，水溶性的柔红糖胺，又有酸性酚羟基和碱性氨基。DOX除具有较强的抗肿瘤作用外，还具有严重的副作用,除胃肠道反应和脱发外，可以发生骨髓抑制、心肌毒性反应，严重者可以发生充血性心力衰竭。
叶酸(Folic acid, FA)，化学名称为N-[4-[(2-氨基-4-氧代-1,4-二氢-6-蝶啶)甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，它是一种小分子维生素。与其他靶向分子如单克隆抗体相比，FA相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物或载体之间的化学键合简单易行，FA 受体(Folate Receptor, FR)在多数肿瘤细胞膜表面过度表达，通常比正常细胞系高出20-200倍，细胞可通过FR介导的内吞作用 (folate receptors mediated endocytosis)将FA吸收入胞内而FA通过其羧基与药物或药物载体系统连接形成FA 复合物后其与细胞表面FR的亲和力基本保持不变， 因此以FA为靶向分子构建递药系统已成为主动靶向治疗肿瘤的研究热点之一。
高效治疗和高毒副作用之间的矛盾成为临床应用的严重阻碍。因此，如何减低用药剂量，减少毒副作用，提高治疗效果是解决问题的关键。有研究证实，IFN-γ可增强TNF诱导的细胞凋亡，有协同促进TNF-α杀伤肿瘤细胞的功能，能一定程度减低TNF-α的用量和毒副作用。关于IFN-γ协同TNF-α对肿瘤的杀伤效应的机理，目前有研究认为IFN-γ能上行性调节靶细胞表面的TNF受体的数量，使靶细胞对TNF的敏感性增加。TNF-α和IFN-γ所作用细胞周期的不同也增强了对靶细胞的杀伤。IFN-γ与TNF-α协同抗肿瘤，可在一定程度上减轻TNF-α的毒副反应，我们的前期研究也证明了两者的协同作用抑制率明显高于单独使用任何一种细胞因子的抑制率，同时降低了单一细胞因子的剂量。本实验室从2004年开始，采用能对生物医用高分子材料表面改性的最高效方法——光化学固定法，将具有杀伤肿瘤细胞作用的TNF-α/IFN-γ共同偶联到生物相容性良好的聚苯乙烯(PSt)等高分子材料上，制备抗子宫癌的高分子载体药物，着重研究共固定化肿瘤坏死因子-α/干扰素-γ(TNF-α/IFN-γ)对宫颈癌HeLa细胞程序性死亡的诱导及分子机制。研究结果显示，共固定化TNF-α/IFN-γ聚苯乙烯生物材料，能够高效抑制HeLa细胞体外生长，诱导癌细胞死亡。本发明尝试联合用药TNF-α/IFN-γ/DOX共同抑制癌细胞生长，利用FA对癌细胞的靶向作用，提高疗效，降低药物毒副作用。
一般癌症治疗的最大问题是无法将药物针对性地富集到癌症细胞上，从而不能最大程度上减少副作用。纳米生物材料是当前国际上生物工程技术领域的前沿和热点研究课题，在医学领域应用方面的研究尚处于初级阶段，却又有广阔的应用前景。自从70年代制备第一个纳米粒(nanoparticle, NP)以来，纳米在恶性肿瘤的靶向治疗取得了巨大的进展。纳米粒是利用天然高分子或合成的化学物质为载体制成的载药微粒，直径10-500nm。依据结构的不同，可分为纳米球(nanospheres)和纳米囊(nanocapsules)。近来，随着纳米技术的不断发展，纳米粒子有望用于靶向药物释放及同步肿瘤成像的研究。由于纳米粒子独特的药代动力学特性，即纳米粒子既不能被在短时间内肾脏排泄又不能被肝脏及脾脏中的网状内皮组织系统显著吸收，因此尺寸在10-100 nm之间的纳米粒子与其它小分子相比具有更长的体内循环时间。此外，研究表明肿瘤系统发育不全且存在漏点，这使得尺寸小于100 nm的纳米粒子可以穿过内皮细胞层进入肿瘤病灶。使用纳米粒子进行药物传递可以提高疏水药物的水溶性及生物利用度。由于纳米粒子具有较大的表面区域及多种多样的表面化学特性，纳米粒子与其他系统相比，在肿瘤病灶部位同时进行多功能应用方面更具优势。此外，可以将在肿瘤细胞中高度表达的受体靶向性配体连接到纳米粒子上能直接向靶器官、靶细胞或细胞内靶结构输送药物，同时具有缓释、保护药物、提高疗效、降低毒副作用等优点。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒。
本发明另一目的在于提供上述共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒的制备方法。
本发明还有一个目的在于提供上述共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
本发明设计新型纳米抗癌药物——光固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒，主要运用形态学、病理学、物理化学等多种方法，对该纳米粒子进行表征，细胞层面和动物层面探讨其抗癌功效，在实际应用方面，为开发新型高活性抗肿瘤高分子纳米药物提供实验依据。
一种共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒，是将三种高效抗癌药物肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、阿霉素和具有癌细胞靶向的叶酸连接上光活性基团，并通过光化学固定法将这三种光活性肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、阿霉素和叶酸通过酰胺化反应连接在纳米载体上得到的。
本发明上述共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒的制备方法包括如下步骤：
（1）游离TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备：将TNF-α、IFN-γ、DOX和FA溶解、过滤灭菌，备用；
（2）光活性TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备：先将TNF-α、IFN-γ分别加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，冰浴避光条件下搅拌反应48h，合成结束后，超滤离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；将DOX加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，将FA加入含4-叠氮苯胺盐酸盐的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，分别冰浴避光条件下搅拌反应48h，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；
（3）Fe3O4-OA磁性纳米粒的制备：用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子，并通过油酸对其进行表面改性，形成Fe3O4-OA磁性纳米粒；
（4）固态共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子的制备：将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA和Fe3O4-OA磁性纳米粒加入到PBS溶液中，避光反应48h后，恒温超声30min，干燥成固态，紫外照射将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA共固定到Fe3O4-OA磁性纳米粒上，光固定完毕后，透析纯化药物，干燥。
在步骤（4）中，也可以通过液态共固定的方法。当使用液态共固定方法时，所述共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒的制备方法步骤如下：
（1）游离TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备：将TNF-α、IFN-γ、DOX和FA溶解、过滤灭菌，备用；
（2）光活性TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备：先将TNF-α、IFN-γ分别加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，冰浴避光条件下搅拌反应48h，合成结束后，超滤离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；将DOX加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，将FA加入含4-叠氮苯胺盐酸盐的二甲基酰胺DΜF/PBS溶液中，分别冰浴避光条件下搅拌反应48h，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；
（3）Fe3O4-OA磁性纳米粒的制备：用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子，并通过油酸对其进行表面改性，形成Fe3O4-OA磁性纳米粒；
（4）液态共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子的制备：将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA和Fe3O4-OA磁性纳米粒加入到PBS溶液中，避光反应48h后，恒温超声30min，将溶液转移至培养皿上，放置摇床，速度设置为100rpm/min，同时使用紫外灯照射，将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA共固定到Fe3O4-OA磁性纳米粒上，光固定完毕后，透析纯化药物，干燥。
本发明所述共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒可以用于制备治疗肿瘤的药物，特别是用于治疗子宫颈癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明采用光化学固定技术，并将该技术从固态法优化为液态法，从而大大提高纳米粒子表面药物的接枝效率。分别制备固态和液态光固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒，利用TNF-α、IFN-γ、DOX的协同抗癌作用和FA的癌细胞靶向作用，增强抗癌纳米药物对癌细胞的靶向选择性，并降低其毒副作用及提高疗效。
附图说明
图1为光活性TNF-α/IFN-γ/DOX/FA合成路线图；
图2为高效液相色谱仪检测AzPh-DOX/FA的合成图；
图3为红外色谱仪表征固态光接枝(5min)TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子示意图；最上面的曲线代表固态光接枝(5min)AzPh-TNF-α/IFN-γ/DOX/FA+NP的红外吸收；中间曲线代表混合物TNF-α+IFN-γ+4-azidobenzoic acid+4-azidoaniline hydrochloride+DOX+FA+NP的红外吸收图谱；下面的曲线代表Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒子的红外吸收图谱；
图4为光载药纳米粒子作用后的HeLa细胞体外存活率示意图；
图5为透镜观察纳米粒子作用HeLa细胞后形态变化；其中，A-空白对照；B-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/well); C-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/well)+NP (1000ng)；D-固态光接枝(20min) TNF-α+IFN-γ+ DOX+FA纳米粒子；E-液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+DOX+ FA纳米粒子；
图6为流式细胞仪分析HeLa细胞周期DNA含量直方图；其中，A-空白对照；B-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX (10ng/well)+FA(10ng/well)；C-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/well)+NP (1000ng)；D-固态光接枝 (20min) TNF-α+ IFN-γ+DOX+FA纳米粒子；E-液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+DOX+ FA纳米粒子；
图7为荷瘤鼠外观及肿瘤体重存活率曲线；其中，A-F图是裸鼠处死前拍摄的代表性图片；
图8为裸鼠细胞形态观察和裸鼠血清检测示意图；其中，A图是液态固定纳米粒组的HeLa肿瘤细胞形态图，可以明显地看到细胞核染色质凝集加深，肿瘤细胞呈现凋亡现象。B图和C图是液态固定纳米粒组的正常肝细胞形态图，细胞核染色质均匀分布，无凝集现象。D图、E图、F图是注射药物前后(第一次给药前和最后一次给药后作用两天)于裸鼠尾部取血的血清检测结果，D图是白细胞(WBC)检测结果，E图是血小板(PLT)检测结果，F图是红细胞(RBC)检测结果，其柱形图中A是阴性对照，没有接种HeLa细胞，没有注射药物；B是实验组1，接种HeLa细胞并注射游离药物TNF-α+IFN-γ+DOX+FA；C是固态光接枝(20min) TNF-α+IFN-γ+DOX+FA+NP；D是液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+ DOX + FA+NP；
图9为HE染色后裸鼠肿瘤形态观察；
图10为HE染色后裸鼠肝组织形态观察。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1 共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe 3 O 4 -OA磁性靶向纳米粒的制备
1 游离TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备
用50μl的PBS(-)溶液分别溶解50μg的TNF-α(肿瘤坏死因子因子-α)、IFN-γ(干扰素-γ)、Doxorubicin, DOX(阿霉素)、Folic Acid, FA(叶酸)，并调整至所需浓度1ng/μl后，使用一次性过滤膜分别进行过滤灭菌，分装备用。
光活性TNF-α/IFN-γ/DOX/FA的制备与表征
2.1 光活性TNF-α/IFN-γ的制备
将50μg的TNF-α和IFN-γ分别加入25μl含768μg N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS(pH7.4，体积比为4:1)溶液中，在4℃(冰浴、避光)的条件下搅拌反应48h。合成结束后，分别用超滤离心管(Μilipore Μolecut Ⅱ, 10KNa)，在4000rpm/min的转速下，离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥后，加入50μl的PBS(-)溶液溶解，并调整光活性TNF-α/ IFN-γ(AzPh-TNF-α和AzPh-IFN-γ)至所需浓度1ng/μl，制备原理如图1所示。
光活性DOX/FA的制备
将50μg的DOX加入25μl含1.25μg N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DΜF/PBS (pH=7.4，体积比为4:1)溶液中，将50μg的FA加入25μl含1μg的4-叠氮苯胺盐酸盐的二甲基酰胺DΜF/PBS(pH=7.4，体积比为4:1)溶液中，分别在4℃(冰浴、避光)的条件下搅拌反应48h。合成结束后，使用透析袋(ΜWCO: Nominal: 500)进行透析以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥后，加入50μl的PBS(-)溶液溶解，并调整至所需浓度1ng/μl，制备原理如图1所示。
共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子的制备
3.1 Fe
3
O
4
-Oleic Acid磁性纳米粒的制备
本研究所用的Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒由本实验室提供，称取FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O，加入超纯水，置于油浴锅内，通入氮气保护，60℃下搅拌30min；取NaOH加入超纯水，在60℃下搅拌使其充分溶解，再将溶解的NaOH加入到铁盐溶液中，反应10min后，升温至70℃，然后向其中加入HCl溶液至pH等于3，最后加入油酸，搅拌3h后，在磁铁辅助下用无水乙醇洗涤，再用丙酮洗涤，并通过油酸对其进行表面改性形成Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒，经透射电子显微镜(Transμission electron μicroscopy, TEΜ)、X射线衍射(X-ray diffraction, XRD)、傅利叶转换红外线光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy, FTIR)、激光粒度分析仪等物理化学表征证明其粒径约13.5±1.45nm，具有粒径小、单分散、超顺磁性等特点。
利用PBS(-)溶液分别制备DOX和AzPh-DOX两种样品，取等量的溶液，通过液相色谱仪(Alliance 2695，美国Waters公司)分析这两种物质，采用C-18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 mm)，流动相是甲醇：磷酸水溶液(0.5%)=90:10，柱温：室温，检测波长：254nm，流速：0.8μl /min，极性大的样品先出峰。（图2）。图中显示DOX大约在1.46min左右出现最大吸收峰值，光桥联剂4-azidobenzoic aid大约在3.29min左右出现最大吸收峰值，两者反应后生成的光活性DOX在1.55min左右出现最大吸收峰值；FA大约在1.25min左右出现最大吸收峰值，光桥联剂4-azidoaniline hydrochloride大约在2.52min左右出现最大吸收峰值，两者反应后生成的光活性FA在1.54min左右出现最大吸收峰值。结果显示DOX和光活性DOX、FA和光活性FA最大吸收峰值的时间发生移动，说明DOX和FA通过光固定方法成功接上光活性基团，极性变小，成功制备了光活性的DOX和FA(AzPh-DOX和AzPh-FA)。
固态共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子的制备
光活性TNF-α(10μg)、IFN-γ(10μg)、DOX(10μg)、FA(10μg)、Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒(NP, 1μg)加入10μl的PBS(-)溶液，4℃下避光反应48h后，于4℃恒温超声30min，4℃干燥成固态，在紫外灯(125W)下10cm处照射，利用叠氮基十分活泼的特性，将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA共固定到Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒子(NP)上。光固定化后，用透析袋(ΜWCO: Nominal: 10000)进行透析以纯化药物，将药物干燥后，加入10μl的PBS(-)溶液溶解，使用时根据实验需求量加入药物。
将药物冷冻干燥后收集样品，分别得到固态光接枝(5min)AzPh-TNF-α/ IFN-γ/DOX/FA+NP、混合物TNF-α+IFN-γ+4-azidobenzoic acid+4-azidoaniline hydrochloride+DOX+FA+NP和Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒三个样品，通过FTIR 傅氏转换红外线光谱分析仪(NEXUS870，美国NICOLET公司)获得红外吸收图谱，如图3所示。图3证明固态共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子合成成功。
液态共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子的制备
光活性TNF-α(10μg)、IFN-γ(10μg)、DOX(10μg)、FA(10μg)、Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒(NP, 1μg)加入10μl的PBS(-)溶液，4℃下避光反应48h后，于4℃恒温超声30min，将溶液转移至玻璃培养皿上，放置摇床，100rpm/min，同时使用紫外灯(125W)于液面上方10cm处照射，利用叠氮基十分活泼的特性，将光活性TNF-α、IFN-γ、DOX、FA共固定到Fe3O4-Oleic Acid磁性纳米粒子(NP)上。光固定化后，用透析袋(ΜWCO: Nominal: 10000)进行透析以纯化药物，将药物干燥后，加入10μl的PBS(-)溶液溶解，使用时根据实验需求量加入药物。
实施例2 药效试验
1. 人子宫颈癌细胞（HeLa细胞系）的培养
使用RPMI 1640培养基（含10%新生小牛血清、0.03μg /μl青霉素、0.05μg /μl链霉素，pH=7.2-7.4），在37℃，5%CO2培养箱中进行常规继代培养。
子宫颈癌裸鼠模型的构建
选取BALB / c裸小鼠( nudemice)，4周龄，体质量11.5±1.50 g，共 18只，均为雌性，购于广东省医学实验动物中心生产部，SPF级，许可证号：SCXK(粤) 2008-0002。在中山大学北校区动物实验中心屏障系统内(SPF级)饲养。裸鼠适应性生长一周后，在相应的实验裸鼠右大腿背侧接种HeLa细胞5×107cell/μl，0.2μl/只。3周后裸鼠成瘤率100%，开始注射药物，实验设置6组，编号A、B、C、D、E、F。A组是阴性对照，共2只裸鼠，没有接种HeLa细胞，没有注射药物；B组是阳性对照，共3只裸鼠，分别接种HeLa细胞(1×107cells/只)，注射0.25μl无菌生理盐水；C组是实验组1，共3只裸鼠，分别接种HeLa细胞(1×107cells/只)，游离药物TNF-α(40ng)+ IFN-γ(40ng)+DOX(40ng)+FA(40ng)用无菌PBS(-)溶液制备成0.25μl溶液，于裸鼠腹腔注射药物溶液，每两天注射该药物，共注射4次；D组是实验组2，共3只裸鼠，分别接种HeLa细胞(1×107cells/只)，游离药物TNF-α(40ng)+IFN-γ(40ng)+DOX(40ng)+FA(40ng)+NP(4μg)用无菌PBS(-)溶液制备成0.25μl溶液，于裸鼠腹腔注射药物溶液，每两天注射该药物，共注射4次；E组是实验组3，共3只裸鼠，分别接种HeLa细胞(1×107cells/只)，固态光接枝（20min）药物TNF-α(40ng)+IFN-γ(40ng)+DOX(40ng)+FA(40ng)+NP（4μg）用无菌PBS(-)溶液制备成0.25μl溶液，于裸鼠腹腔注射药物溶液，每两天注射该药物，共注射4次；F组是实验组4，共4只裸鼠，分别接种HeLa细胞(1×107cells/只)，液态光接枝(20min)药物TNF-α(40ng)+IFN-γ(40ng)+DOX(40ng)+FA(40ng)+NP(4μg)用无菌PBS(-)溶液制备成0.25μl溶液，于裸鼠腹腔注射药物溶液，每两天注射该药物，共注射4次。
3. 共固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA纳米粒子体外抑制HeLa细胞生长
取处于对数生长期的细胞，用含胰蛋白酶0.25%（W/V）和EDTA 0.02%（W/V）的PBS(-)溶液消化，并先后使用血清培养基和无血清培养基洗涤。最后，以无血清培养基调整为1×106 cell/μl的细胞悬液，将吹打均匀的HeLa细胞加入24孔细胞培养板(1×106cell/well)进行培养，实验设置5组，A-空白对照；B-游离TNF-α(10ng/well) +IFN-γ(10ng/well) + DOX (10ng/well) + FA(10ng/well)；C-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/well)+NP (1μg/well)；D-固态光接枝(20min)TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX (10ng/well)+FA(10ng/well)+NP(1μg/well); E-液态光接枝(20min) TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/well)+NP(1μg/well)，HeLa细胞和不同药物共培养24h后采用血球计数板通过细胞计数法在光学显微镜下检测HeLa细胞存活率，实验进行三次，求取平均值并计算标准误差。
结果如图4所示，以空白对照组细胞存活率100%计算，其他实验组与空白对照组相比，液态光接枝的共固定TNF-α+IFN-γ+DOX+FA纳米粒子对HeLa细胞的体外生长抑制效果最明显，存活率仅7.06%。
4. 透射电镜观察细胞形态
取处于对数生长期的细胞，用含胰蛋白酶0.25%（W/V）和EDTA 0.02%（W/V）的PBS(-)溶液消化，并先后使用血清培养基和无血清培养基洗涤。最后，以无血清培养基调整为1×106 cell/μl的细胞悬液，将吹打均匀的HeLa细胞(1×106cell/well)加入细胞培养板进行培养，设置5组平行实验，A-空白对照；B-游离TNF-α(10ng/well)+ IFN-γ(10ng/well)+ DOX (10ng/well)+FA(10ng/well)；C-游离TNF-α(10ng/well)+ IFN-γ(10ng/well)+DOX (10ng/well)+FA(10ng/well)+NP (1000ng)；D-固态光接枝(20min) TNF-α+IFN-γ+ DOX+FA纳米粒子；E-液态光接枝(20min)TNF-α+ IFN-γ+ DOX+ FA纳米粒子，培养24h后收集细胞样品，用2.5%戊二醛固定样品后送样，通过分析型透射电子显微镜(型号：FEI Tecnai 12)进行观察。如图5所示，与A图空白对照组相比，B、C、D、E图中细胞胞质浓缩更为明显，细胞核染色质凝集程度加深，部分附着于细胞核膜边缘，细胞发生程序性死亡。其中，以D图和E图细胞核质比最大，染色质聚集加深，细胞死亡现象比较显著。
5. 流式细胞仪检测HeLa细胞周期
取处于对数生长期的细胞，用含胰蛋白酶0.25%（W/V）和EDTA 0.02%（W/V）的PBS(-)溶液消化，并先后使用血清培养基和无血清培养基洗涤。最后，以无血清培养基调整为1×106 cell/μl的细胞悬液，将吹打均匀的HeLa细胞加入24孔细胞培养板(1×106cell/well)进行培养，设置5组平行实验，A-空白对照；B-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX(10ng/well)+FA(10ng/ well)；C-游离TNF-α(10ng/well)+IFN-γ(10ng/well)+DOX (10ng/well) + FA(10ng/well) + NP (1000ng)；D-固态光接枝 (20min) TNF-α+IFN-γ+DOX+FA纳米粒子；E-液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+DOX+FA纳米粒子，培养24h后收集细胞样品，75%乙醇过夜固定后通过流式细胞仪测出的DNA含量直方图。如图6所示，与A图空白对照组相比，B、C、D、E图中HeLa细胞在不同药物作用下周期阻滞在S期，S期是DNA合成期，将细胞阻滞在这一时期，可以有效地抑制HeLa细胞的生长，其中，以液态光接枝(20min)TNF-α+ IFN-γ+ DOX+ FA纳米粒子将HeLa细胞阻滞在S期的效果更为明显(%S=37.8)。
6. 宫颈癌HeLa裸鼠体内模型构建及光载药纳米粒子的传送
6.1 荷瘤鼠一般特征及肿瘤指标观察
每隔两天观察小鼠的精神状态、活动力、反应、体重及皮下接种区域外观及触感，每两天以电子游标卡尺测量瘤体最长径a(mm)与最短径b(mm)，按公式V(mm3)＝1/2(ab2)计算肿瘤体积，以肿瘤体积和天数为坐标绘制不同接种浓度下的肿瘤生长曲线。
如图7所示，A-F图是裸鼠处死前拍摄的代表性图片，B-F图肉眼观移植瘤呈不规则状，肿瘤组织血供丰富，无明显周围组织和皮肤浸润，界限清楚，可以看出B图裸鼠的肿瘤平均体积最大(2688.20mm3±1283.90mm3），其次是C图(2031.99 mm3±1005.44mm3)、D图(1980.71mm3±976.03mm3)、F图(1884.385mm3 ± 303.50mm3)，E图裸鼠的肿瘤平均体积是最小(1234.91mm3±979.18mm3）。图R显示裸鼠的体重变化，可以看出，除了阴性对照裸鼠体重呈现上升趋势外，其他药物处理组裸鼠体重从第14天开始均有下降的趋势。H图显示荷瘤裸鼠肿瘤的变化曲线，从整体上看，液态固定药物组从第14天开始，肿瘤体积出现明显的下降，其次是以固态固定药物组肿瘤体积的生长趋势较为缓和，由此可见，不管是液态或者固态药物对肿瘤的生长具有一定的抑制作用。I图显示裸鼠的存活率，阴性对照组和液态固定纳米粒组裸鼠的总体存活天数最长。整体上初步判断，固态和液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+DOX+FA+NP能有效的抑制荷瘤HeLa裸鼠肿瘤的增长，降低裸鼠的死亡率。
荷瘤鼠毒性检测
荷瘤裸鼠处死后，将其进行解剖并取出肿瘤细胞和肝细胞，制备成样品，在透射电子显微镜(飞利浦CΜ10, 荷兰)下进行观察。
如图8所示，A图是液态固定纳米粒组的HeLa肿瘤细胞形态图，可以明显地看到细胞核染色质凝集加深，肿瘤细胞呈现凋亡现象。B图和C图是液态固定纳米粒组的正常肝细胞形态图，细胞核染色质均匀分布，无凝集现象。D图、E图、F图是注射药物前后(第一次给药前和最后一次给药后作用两天)于裸鼠尾部取血的血清检测结果，D图是白细胞(WBC)检测结果，E图是血小板(PLT)检测结果，F图是红细胞(RBC)检测结果，其柱形图中A是阴性对照，没有接种HeLa细胞，没有注射药物；B是实验组1，接种HeLa细胞并注射游离药物TNF-α+IFN-γ+DOX+FA；C是固态光接枝(20min) TNF-α+IFN-γ+DOX+FA+NP；D是液态光接枝(20min)TNF-α+IFN-γ+DOX+FA+NP，三组血清检测结果共同呈现液态固定纳米粒组给药前后其变化值相差不大，说明此药物在有效促进肿瘤细胞死亡的同时对正常组织的毒副作用比较弱。
荷瘤鼠组织学检测
荷瘤裸鼠统一处死后，将其进行解剖取出肿瘤组织和正常肝组织，以4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、常规切片和HE染色、光镜下观察肿瘤细胞。
如图9所示，A图中肿瘤细胞直径约在8-11mm，视野下多数细胞大小相对一致，细胞核染色较浅，B、C、D、E图肿瘤细径约在10-12mm，其中D图部分肝细胞直径约在5-8mm，从细胞核蓝染现象上观察，以B图和C图的染色最深，D图和E图次之。图10显示HE染色后裸鼠肝组织形态，A图中正常肝细胞直径约在10-15mm，B图和C图肝细胞直径约在5-8mm，D图和E图肝细胞直径约在10-12mm，其中D图部分肝细胞直径约在5-8mm，从细胞核蓝染现象上观察，以B图和C图的染色最深，D图和E图次之。综合以上分析，液态光接枝(20min) TNF-α+IFN-γ+DOX+FA磁性纳米粒子能够有效诱导肿瘤细胞死亡并且对正常肝组织的毒副作用不明显。
通过上述实验证实，光化学固定法在液态环境和固态环境均能高效对纳米粒子进行表面改性，而在液态环境中荷载在纳米粒子上的药物具有更高的体内外抗宫颈癌活性和低毒的效果；光固定TNF-α/IFN-γ/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒有望开发成临床治疗宫颈癌药物。
Claims (2)
1.一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒，其特征在于其制备方法包括如下步骤（1）、（2）、（3）和（4）或者（1）、（2）、（3）和（5）：
（1）游离TNF-a/IFN-g/DOX/FA的制备：将TNF-a、IFN-g、DOX和FA溶解、过滤灭菌，备用；
（2）光活性TNF-a/IFN-g/DOX/FA的制备：先将TNF-a、IFN-g分别加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液中，冰浴避光条件下搅拌反应48h，合成结束后，超滤离心30min以纯化叠氮苯基衍生物，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；将DOX加入含N-琥珀酰亚胺的二甲基酰胺DMF/PBS溶液中，将FA加入含4-叠氮苯胺盐酸盐的二甲基酰胺DMF/PBS溶液中，分别冰浴避光条件下搅拌反应48h，冷冻干燥，用PBS溶解，调整浓度；
（3）Fe3O4-OA磁性纳米粒的制备：用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子，并通过油酸对其进行表面改性，形成Fe3O4-OA磁性纳米粒；
（4）固态共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA纳米粒子的制备：将光活性TNF-a、IFN-g、DOX、FA和Fe3O4-OA磁性纳米粒加入到PBS溶液中，避光反应48h后，恒温超声30min，干燥成固态，紫外照射将光活性TNF-a、IFN-g、DOX、FA共固定到Fe3O4-OA磁性纳米粒上，光固定完毕后，透析纯化药物，干燥；
（5）液态共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA纳米粒子的制备：将光活性TNF-a、IFN-g、DOX、FA和Fe3O4-OA磁性纳米粒加入到PBS溶液中，避光反应48h后，恒温超声30min，将溶液转移至培养皿上，放置摇床，速度设置为100rpm/min，同时使用紫外灯照射，将光活性TNF-a、IFN-g、DOX、FA共固定到Fe3O4-OA磁性纳米粒上，光固定完毕后，透析纯化药物，干燥。
2.权利要求1所述制备方法制得的共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒。
3. 权利要求2所述共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
4. 根据权利要求3所述共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒的应用，其特征在于所述肿瘤为子宫颈癌。
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