CN106110331A - 叶酸分子靶向磁性纳米药物及其制备方法 - Google Patents

叶酸分子靶向磁性纳米药物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种叶酸分子靶向磁性纳米药物及其制备方法，所述药物包括内核和外壳，所述内核是携带有抗癌药物的高分子材料改性的磁性纳米颗粒，所述外壳是通过PH敏感的化学键偶联的叶酸分子和高亲水材料。构建叶酸受体靶向和磁靶向的双重靶向纳米抗癌药物，利用其靶向转运、pH敏感释药、细胞内化疗的特征，可避免抗癌药物如顺铂对非靶器官的损伤；另外，在外加磁场作用下，磁性纳米粒会提高肿瘤细胞内温度加速其死亡或凋亡。

Description

叶酸分子靶向磁性纳米药物及其制备方法
技术领域
本申请涉及叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法。
背景技术
叶酸(folic acid，FA)又称蝶酰谷氨酸、维生素B11，是一种人体必需的维生素，在细胞内可还原为四氢叶酸，后者是一碳单位转移酶的辅酶，参与一碳单位代谢和嘌呤、胸腺嘧啶的合成，是细胞代谢、DNA合成及修复的基本组成成分。肿瘤细胞的快速生长需要充足的叶酸以维持DNA的合成。动物细胞内缺少合成叶酸的酶，细胞的生长和增殖依赖从外界环境获得叶酸。叶酸受体(folate receptor,FR)是细胞膜表面糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定的糖化多肽，包括三种异构体：α-FR、β-FR和γ-FR。β-FR是细胞膜相关蛋白，通过GPI锚定在细胞膜上，二者具有约70％的同源性。α-FR和γ-FR缺少修饰GPI锚附着的羧基末端信号肽，组成上属于分泌型蛋白。叶酸受体有三个显著特点：1.FR与游离叶酸的亲和力非常高，解离常数Kd<1nmol/L；2.FR对叶酸分子通过化学键与其他大分子物质连接形成的复合物的亲和力和胞吞效应与游离叶酸相当，具有良好的入胞转运潜能；3.FR对叶酸及其衍生物的结合、转运是特异的受体－配体结合，并能被游离叶酸竞争抑制。叶酸与受体结合，通过内化方式穿过细胞膜，是叶酸进入细胞内的主要途径。已有研究发现叶酸受体在卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌、头颈癌等多种上皮源性恶性肿瘤细胞表面过表达，已证实喉癌和鼻咽癌高表达叶酸受体。而在正常组织细胞除脉络丛、胎盘、肺、胸腺、肾低水平表达外，均高度保守。叶酸受体表达分布的肿瘤特异性、高效的转运潜能和与叶酸的高亲和力，为叶酸分子靶向药物载体的制备及抗肿瘤分子靶向治疗提供了基础。
发明内容
本发明提供一种新的叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法。
本发明提供一种叶酸分子靶向磁性纳米药物，包括内核和外壳，所述内核是携带有抗癌药物的高分子材料改性的磁性纳米颗粒，所述外壳是通过PH敏感的化学键偶联的叶酸分子和高亲水材料。
所述抗癌药物是顺铂，所述高亲水材料是PEG，所述高分子材料是醛基化海藻酸钠。
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法，包括：
a)制备醛基化海藻酸钠ASA溶液的步骤；
b)制备Fe3O4磁性纳米粒子MNPs水溶液的步骤；
c)制备醛基化海藻酸钠改性Fe3O4磁性纳米粒子ASA-MNPs的步骤；
d)制备醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-ASA-MNPs的步骤；
e)制备叶酸修饰的双肼基PEG的步骤，所述步骤的产物是FA-PEG-NHNH2；
f)制备肼基PEG叶酸修饰的醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的步骤；
g)合成MMP-9-ASODN的步骤；
h)制备磁性纳米复合物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN的步骤。
所述步骤a)中，将海藻酸钠溶于双蒸水中，避光条件下加入高碘酸钠，搅拌均匀后避光反应，加入无水乙醇终止反应，超滤得到所需ASA溶液。
所述步骤b)中，取FeCl3·6H2O及FeSO4·4H2O溶解于去离子水中，在搅拌条件下加入NH3·H2O调节pH值，直至溶液的颜色变为深黑色，磁洗至上清液电导率值＜50μs，超声振荡使磁性纳米颗粒均匀分散于去离子水中，得到磁性纳米粒子MNPs水溶液。
所述步骤c)中，将制备好的ASA溶液加入搅拌中的所述磁性纳米粒子MNPs水溶液，高温下反应，离心后取上清液超滤除去游离的SA，直至滤出液电导率值＜50μs，产物冷冻干燥后得到所述磁性纳米粒子ASA-MNPs。
所述步骤d)中，将CDDP与ASA-MNPs反应，反复透析和超滤，制备出纳米颗粒CDDP-ASA-MNPs。
所述步骤e)中，将叶酸溶于无水二甲基亚砜中，室温、搅拌条件下加入二环己基碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，然后加入双肼聚乙二醇，继续搅拌反应，反应结束后加入双蒸水，过滤除去不溶物后，得到所述FA-PEG-NHNH2。
所述步骤g)中，MMP-9的反义序列如SEQ ID NO:1所示，MMP-9的无义序列如SEQ IDNO:2所示，所述序列中的碱基采用硫代修饰，5’氨基修饰，得到所述MMP-9-ASODN。
所述步骤h)中，取CDDP-ASA-MNPs、FA-PEG-NHNH2、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN，搅拌均匀，避光反应，加入硼氢化钠溶液，充分离心沉淀，沉淀物用PBS溶液重新分散均匀，得到所述磁性纳米复合物CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN。
本发明的有益效果是：以磁性纳米粒为核，通过高分子材料携带抗癌药物如顺铂，外壳采用偶联叶酸分子的高亲水材料如聚乙二醇通过pH敏感的化学键如腙键连接，构建叶酸受体靶向和磁靶向的双重靶向纳米抗癌药物，利用其靶向转运、pH敏感释药、细胞内化疗的特征，可避免抗癌药物如顺铂对非靶器官的损伤；另外，在外加磁场作用下，磁性纳米粒会提高肿瘤细胞内温度加速其死亡或凋亡，这种集磁热放化疗于一体的综合治疗可实现对肿瘤细胞的靶向杀伤和放射增敏，有望在提高疗效的同时减轻局部和全身毒副反应，改善治愈后的生存质量，这种基于叶酸靶向磁性纳米药物的综合治疗模式适合所有叶酸受体阳性的肿瘤。
附图说明
图1是FA-PEG-ASAMNPs中铁含量标准曲线；
图2是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs中顺铂含量标准曲线；
图3是SA-MNPs、ASA-MNPs及CDDP-FA-ASA-MNPs的流体力学粒径分布示意图；
图4是SA-MNPs、ASA-MNPs及CDDP-FA-ASA-MNPs的zeta电位拟合曲线；
图5是透射电镜下CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的分布图；
图6是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的粒径分布直方图；
图7是SA、ASA、SA-MNPs及ASA-MNPs的红外光谱图；
图8是FA、ASA-MNPs及FA-ASA-MNPs的紫外光谱图；
图9是ASA-MNPs的磁化曲线图；
图10是FA的紫外光谱图；
图11是FA-PEG-NH2的紫外光谱图；
图12是CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN的紫外光谱图；
图13是叶酸含量标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法，包括：
a)制备醛基化海藻酸钠ASA溶液的步骤；
b)制备Fe3O4磁性纳米粒子MNPs水溶液的步骤；
c)制备醛基化海藻酸钠改性Fe3O4磁性纳米粒子ASAMNPs的步骤；
d)制备醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-ASAMNPs的步骤；
e)制备叶酸修饰的双肼基PEG的步骤，所述步骤的产物是FA-PEG-NHNH2；
f)制备肼基PEG叶酸修饰的醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-FA-PEG-ASA-MNPS的步骤；
g)合成MMP-9-ASODN的步骤；
h)制备磁性纳米复合物CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的步骤。
实施例2：
一种叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法，其包括以下步骤：
1)醛基化海藻酸钠(ASA)溶液的制备：醛基化海藻酸钠(aldehyde sodiumalginate，ASA)的制备：40g海藻酸钠溶于1000ml双蒸水中，避光条件下加入高碘酸钠10g，搅拌均匀后于4℃条件下避光反应24h，加入50ml无水乙醇终止反应，超滤并使溶液体积减少至400ml备用。
2)磁性纳米粒子MNPs溶液的制备：分别取27g FeCl3·6H2O及139g FeSO4·4H2O溶解于1000ml去离子水中，使其浓度分别为0.01mol/L及0.005mol/L，在搅拌条件下加入25％(w/w)NH3·H2O调节pH值至9.5，直至溶液的颜色变为深黑色，得到Fe3O4(四氧化三铁)，磁洗至上清液电导率值＜50μs。超声振荡使磁性纳米颗粒均匀分散于600ml去离子水中，备用。
3)醛基化海藻酸钠改性磁性纳米粒子ASAMNPs的制备：将制备好的400ml ASA加入搅拌中的600ml Fe3O4磁性纳米颗粒水溶液，85℃高温下反应40min，4000rpm离心后取上清液超滤除去游离的SA，直至滤出液电导率值＜50μs，产物冷冻干燥后备用。该产物实际就是醛基化海藻酸钠包裹Fe3O4。
4)醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒的制备
CDDP100mg与一定体积ASA-MNPs(CDDP:ASA＝13.3:1,Fe3O410mg/mL,ASA50mg/mL)。每2～3mlASA改性水溶性磁性液体中加入10mg顺铂(CDDP)，在37℃条件下反应24h，反复透析和超滤，制备出载顺铂磁性纳米药物(CDDP-ASAMNPs)。
5)叶酸修饰的双肼基PEG的制备
将已干燥好的PEG(聚乙二醇)200g溶于600mL无水二氯甲烷中，然后在冰水浴条件下逐滴加入含60.5g对硝基氯甲酸苯酯的无水二氯甲烷溶液400mL和125ml的无水三乙胺中，PEG、对硝基氯甲酸苯酯、三乙胺的摩尔比为1：3：9。体系在避光条件下反应12小时。然后旋蒸除去大部分二氯甲烷溶剂，加入无水乙醚沉淀。将沉淀物真空干燥，即得对硝基氯甲酸苯酯活化的PEG。
将上述产物溶于1000mL二氯甲烷中，然后滴加291ml的水合肼溶液，PEG与肼的摩尔比为1：30。反应液在室温条件下反应4小时，然后旋蒸除去大部分二氯甲烷溶剂，加入一定量的无水乙醚沉淀。将沉淀物真空干燥，即得肼修饰的PEG。
8.8g叶酸(FA)溶于300ml无水二甲基亚砜(DMSO)中，室温、搅拌条件下加入二环己基碳二亚胺(DCC)8.4g及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)4.4g，搅拌反应4h。然后加入双肼聚乙二醇(PEG2000(NHNH2)2)40g，继续搅拌反应8h。反应结束后加入双蒸水1200ml，过滤除去不溶物后，产物冷冻干燥，该产物即FA-PEG-NHNH2。双肼聚乙二醇即上述肼修饰的PEG。
6)肼基PEG叶酸修饰的醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒的制备
取3g的FA-PEG-NHNH2，溶解于100ml双蒸水中，然后再缓慢滴入300ml含5g醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米粒液体中，以冰乙酸调节pH至5，氮气保护，反应液在室温下搅拌48小时，肼基与醛基充分反应形成腙键，反应产物在蒸馏水中透析3天(截留分子量5000-14000)，然后冷冻干燥，得到的产物即CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs。
7)MMP-9-ASODN的合成：根据人MMP-9基因cDNA序列，选择含起始密码子及上游的6个碱基及后续的11个碱基，共20个碱基作为靶序列的反义寡核苷酸(ASODN)，经Genbank计算机网上检索证实与MMP-9以外的己知人类基因无同源性；无义寡核苷酸(NSODN)序列经计算机网上检索证实与己知人类基因无同源性。MMP-9反义序列如下：5’-TGCCAGAGGCTCATGGTGAG-3’(SEQ ID NO:1)，无义序列为：5’-CGTCCCTATACGACC-3’(SEQ IDNO:2)。上述寡核苷酸碱基均采用硫代修饰，5’氨基(NH2)修饰，修饰后的MMP-9-ASODN的总分子量为6682.4，用水稀释至100μmol/L，-20℃保存备用；
8)CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物的制备：取CDDP-ASA-MNPs、FA-PEG-NHNH2、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN，搅拌均匀，于4-8℃下避光反应24-36小时，加入一定量的硼氢化钠溶液，使体系中硼氢化钠的浓度为0.5-0.7mol.l-1，体系继续反应3-6小时后，充分离心沉淀，沉淀物用0.01mol/L的PBS溶液重新分散均匀，制备成CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN的磁性纳米复合物；
对比例1：
SAMNPs的制备：
制备方法与实施例1中步骤3)一样，只是将ASA溶液换成SA溶液。
测试部分：
测试例1：
铁含量测定(邻二氮菲法)
该方法的测定原理是：以盐酸羟胺将Fe3+还原为Fe2+,在pH＝2～9的范围内，与邻二氮菲反应生成稳定的橙红色配合物[(C12H8N2)3Fe]2+,最大吸收峰在510nm处。
试剂：配制标准Fe溶液：准确称取0.8634克NH4Fe(SO4)2·12H2O，加入20ml 1∶1的浓HCl和少量水，溶解后，定量转移至1L容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。每毫升含Fe3+100μg；邻二氮菲(0.15％水溶液，临时配制)；盐酸羟胺(10％水溶液，临时配制)；醋酸钠溶液(1mol·L-1)
标准曲线的绘制：分别准确吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准Fe溶液(含Fe3+100μg/ml)于6只已编号的50ml容量瓶中，各加入1ml 10％盐酸羟氨溶液，充分摇动后加入2ml 0.15％邻二氮菲溶液和5ml 1mol/L NaAc溶液，以水稀释到刻度，摇匀。在在UVIKON923紫外-可见光分光光度计上，用1cm比色皿，以空白溶液为参比溶液，在510nm波长下，分别测定各溶液的吸光度。以Fe2+的组成量度(μg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线如图1所示。
CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN中Fe含量的测定
Fe3O4+8HCl＝FeCl2+2FeCl3+8H2O (1-1)
取1ml CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN样品，加入一定量的浓HCl，使Fe3O4转化成Fe3+离子(见式1-1)，然后稀释至含Fe浓度为10～100μg/ml，并保证溶液pH在2～9的范围内。用1ml吸量管吸取1ml未知溶液置于50ml容量瓶中，依次加入1ml 10％盐酸羟氨溶液、2ml 0.15％邻二氮菲溶液和5ml1mol/L NaAc溶液，以水稀释至刻度，摇匀。在510nm波长下测定其吸光度，再对比标准曲线及稀释倍数计算样品中Fe的含量。
反应式1-1 邻苯二胺与顺铂的配位反应
采用邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPDA)比色法测定CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs中顺铂的含量。即OPDA通过配位络和作用与CDDP结合，发生显色反应，在一定的CDDP浓度范围内，溶液在703nm处的吸光度与浓度成线性关系，可用于CDDP的定量分析。由于OPDA对CDDP的亲和性与DNA相似，将载体上可与OPDA反应的CDDP视为可逆释放的CDDP。测定原理如反应式1-1所示。
测定步骤和方法：
标准曲线的绘制
配置1.2mg/ml OPDA/DMF溶液100ml(溶液Ⅰ)，10mg/250ml CDDP溶液(溶液Ⅱ)，取六支大试管，按表1-1数据配制一系列溶液。
表1-1 CDDP标准曲线溶液配制表
将上述各试管浸于沸水浴中，煮沸10分钟后取出，迅速冷却后在703nm波长下比色。以标准CDDP溶液的浓度(μg/ml)为横坐标，以吸光度值为纵坐标，作标准曲线，如图2所示。吸光度测定在UVIKON 923紫外-可见光分光光度计上进行，结果如图。
样品测试：
将样品稀释至CDDP含量在0～30μg/ml范围内，吸取6毫升已稀释的样品，加入6ml1.2mg/ml OPDA/DMF溶液，浸于沸水浴中，煮沸10分钟后取出，迅速冷却后在703nm波长下比色，记录吸光度，对比标准曲线得出CDDP的含量。
测试例2：
包封率及载药量的测定：
收集透析滤出液并以邻苯二胺分光光度法测量滤出液中CDDP的含量，以下述公式分别计算包封率(drug encapsulation efficiency，DEE)。
包封率(％)＝[(理论药物含量－滤出液药物含量)/理论药物含量]×100％；将CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs冷冻干燥后以下述公式计算载药量(drug loading efficiency，DLE)：
载药量(％)＝(微球内药物质量/微球的总质量)×100％。
测试例3：
ASA中醛基浓度测定：
采用盐酸羟胺-电位滴定法测定氧化后海藻酸钠表面的醛基浓度。此方法是利用盐酸羟胺与ASA上的醛基进行反应生成HCl，并用NaOH对其进行滴定，从而根据滴定所用NaOH的体积，计算出醛基含量。其反应式如式(Ⅵ)所示：
SA-(CHO)n+n(H2N-OH-HCl)＝SA-(CH＝N-OH)n+nH2O+n HCl (Ⅵ)
ΔV×0.001×nNaOH＝nCHO (Ⅶ)
OD＝(nCHO/2)/(wSA/198.11) (Ⅷ)
具体步骤：将1.75g盐酸羟胺溶于水中后，加入质量含量为0.5％的甲基橙水溶液0.6ml，稀释至100ml，配成0.25mol/L的盐酸羟胺溶液。取0.1g干燥后ASA加入25ml盐酸羟胺溶液中，充分溶解后，以0.1mol/L的氢氧化钠溶液滴定，颜色由红色变为黄色后停止，此时pH约为5。由计算所得醛基量进一步可由式(Ⅶ)、(Ⅷ)推出海藻酸钠的氧化程度(oxidationdegree，OD)：被氧化的海藻酸钠单体数目与总的海藻酸钠单体数目之比，nCHO为醛基的摩尔量，wSA为起始海藻酸钠的质量，海藻酸钠单体分子量为198.11。以上过程均在不同时间重复数遍取平均值。最后得到海藻酸钠的氧化程度为21.78±0.98％，即每5个海藻酸钠单体中约有一个生成了2,3-CHO。
测试例4：
流体力学直径与Zeta电位的测定：
高分辨Zeta电位及激光粒度分析仪(Zeta PALS Brook Haven InstrumentsCo.USA)上进行，测试之前CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs稀释到一定浓度(Fe含量均为0.02mg/ml)，用0.1mol/L的HCl或NaOH调节待测液pH为7.4，并用0.45μm的滤器过滤。测试参数为：散射角90°，温度25℃，测试数遍取平均值，重点考察制备过程纳米粒粒径变化。最后得到SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs平均流体力学粒径分别为45.3±2.3nm、48.7±1.7nm及66.5±1.5nm。后者与前两者相比，其流体力学粒径略大，一方面证明叶酸及顺铂均连接在聚合物表面，另一方面说明连接了靶向配体叶酸及抗肿瘤药物顺铂之后，其粒径仍然符合靶向载药系统对粒径的要求(<200nm)。SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的流体力学粒径均呈正态对称分布(图3所示)。zeta电位拟合曲线如图4所示。
表3给出了和图4分别给出了SA-MNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-SAMNPs的zeta电位值及拟合曲线，可以看出ASAMNPs的Zeta电位最高，SA-MNPs及CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta电位相当。CDDP-FA-PEG-SAMNPs的Zeta电位值低于ASAMNPs，估计与顺铂替代了表面阴性电荷有关。由图4的Zeta电位曲线可知，SAMNPs的稳定性较差，ASAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs稳定性相当。
表3 SAMNPs、ASAMNPs及CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的Zeta电位测定
由图4的Zeta电位值可知，ASAMNPs的稳定性非常好，SAMNPs和CDDP-FA-PEG-ASAMNPs稳定性也很满意，表明海藻酸钠醛基化后可提高改性产物的稳定性。
测试例5：
磁核粒径、形状及分散度的测定：
制样方法为将CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs稀释至一定浓度，然后滴在衬有高分子膜的铜网上成膜，缓慢干燥后于样品上蒸镀一层约10-20nm厚的碳膜，透射电镜(JEOL-TEM 100)观察并摄片，图5为透射电镜下CDDP-FA-PEG-ASAMNPs的分布情况及形状，可以看出其表面形状为圆形，基本为单颗粒分散，但因其粒径小，且表面含有多种活性基团，故镜下可见轻微聚集现象。从中随机选取100个纳米颗粒，利用软件测量其粒径，可得平均粒径8.116±0.24nm，并绘制成直方图如图6所示，由图可知其分布为正态对称分布。
测试例6：
傅里叶变换红外光谱测定：
取1～2mg的样品在玛瑙研钵中与干燥的溴化钾粉末(A.R.级)混合并研磨成细粉末，装入模具内，在压片机上压制成片后在NEXVS 670FTIR(美国Nicolet公司)上测试。
SA及ASA：图7显示，3700～3100cm-1为0-H的伸缩振动，1600cm-1附近的吸收峰为羧酸盐(―COO-)基团的非对称伸缩振动；1410cm-1附近的吸收峰为羧酸盐(―COO-)基团的对称伸缩振动；1030cm-1附近的吸收峰为C-O伸缩振动；均为海藻酸钠的典型吸收峰。与SA相类似，ASA上1603cm-1及1411cm-1附近的深宽吸收峰为海藻酸钠羧酸盐(―COO-)基团的非对称及对称伸缩振动，说明海藻酸钠氧化后并未改变表面的羧基基团，为表面修饰Fe3O4及偶联CDDP提供了条件。但醛基的C＝O无明显的峰出现，与2，3-CHO之间形成半缩醛有关。
SAMNPs及ASAMNPs：SAMNPs及ASAMNPs分别在609及615cm-1附近出现了Fe-O键的伸缩振动，由此可以证明，SA及ASA都成功的吸附在Fe3O4的表面。
测试例7：
紫外光谱测定：
紫外光谱显示，与ASAMNPs相比，FA-PEG-ASAMNPs在350nm及366nm各出现了一个明显的吸收峰，而叶酸也在360nm附近出现了明显的吸收峰，故FA-PEG-ASAMNPs的吸收峰应该为叶酸上的苯环上的共轭键所产生(图8)，由此表明叶酸已连接在ASAMNPs上。
测试例8：
饱和磁化强度的测定和磁响应性评定
25℃条件下，-10KOe～10KOe范围内扫描样品的磁滞曲线，如图9所示为ASA-MNPs的磁化曲线图。分别取两个5ml离心管，取叶酸修饰的载顺铂磁性纳米药物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs8ml，分装到两个离心管中，每管4ml，其中一个放置到恒定磁场中，2小时后观察磁性粒子分布情况。
测试例9
CDDP-FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN中的叶酸成分及含量测定：
由于叶酸分子包含高度共轭的苯环结构，在363nm处存在特征性的强吸收峰，利用这个特点可采用紫外光分光光度计法分析该磁性纳米复合物中的叶酸成分结构及测定含量，先称取适量叶酸于蒸馏水稀释溶解充分混匀，得到含叶酸1mg.ml-1的标准溶液，分别吸弃0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml标准FA溶液于8只50ml的容量瓶中，分别加入蒸馏水至50ml，摇匀后，用1cm比色杯，以蒸馏水作空白对照，在紫外-可见分光光度计363nm波长测定各浓度的吸光度(OD值)。根据叶酸的不同浓度和相对应的363nm波长下吸光度绘制标准曲线。以吸光度OD值为横坐标，叶酸浓度为纵坐标。测定磁性纳米复合物稀释10倍后的吸光度值，重复5次，根据标准曲线来得出其叶酸浓度。
从图10、11、12可以看出，叶酸有个特征峰在363nm处，连上叶酸的FA-PEG-NH2及FA-PEG-ASAMNPs-MMP-9-ASODN磁性纳米复合物都可检测到这处特征峰，可见均连上了叶酸。
由图13可见，在0～100μg.ml-1范围内FA的含量与OD值有良好的线性关系(回归公式Y＝112.08X-0.3832；R2＝0.9996)。FA-PEG-ASAMNPS-MMP-9-ASODN磁性纳米稀释10倍后的吸光度值为0.8508±0.0013，按此方法测得该纳米复合物中叶酸的浓度为0.9498±0.0014mg.ml-1。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种叶酸分子靶向磁性纳米药物，其特征在于，包括内核和外壳，所述内核是携带有抗癌药物的高分子材料改性的磁性纳米颗粒，所述外壳是通过PH敏感的化学键偶联的叶酸分子和高亲水材料。
2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述抗癌药物是顺铂，所述高亲水材料是PEG，所述高分子材料是醛基化海藻酸钠。
3.一种叶酸分子靶向磁性纳米药物的制备方法，其特征在于，包括：
a)制备醛基化海藻酸钠ASA溶液的步骤；
b)制备Fe3O4磁性纳米粒子MNPs水溶液的步骤；
c)制备醛基化海藻酸钠改性Fe3O4磁性纳米粒子ASA-MNPs的步骤；
d)制备醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-ASA-MNPs的步骤；
e)制备叶酸修饰的双肼基PEG的步骤，所述步骤的产物是FA-PEG-NHNH2；
f)制备肼基PEG叶酸修饰的醛基化海藻酸钠改性载顺铂磁性纳米颗粒CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs的步骤；
g)合成MMP-9-ASODN的步骤；
h)制备磁性纳米复合物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN的步骤。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中，将海藻酸钠溶于双蒸水中，避光条件下加入高碘酸钠，搅拌均匀后避光反应，加入无水乙醇终止反应，超滤得到所需ASA溶液。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中，取FeCl3·6H2O及FeSO4·4H2O溶解于去离子水中，在搅拌条件下加入NH3·H2O调节pH值，直至溶液的颜色变为深黑色，磁洗至上清液电导率值＜50μs，超声振荡使磁性纳米颗粒均匀分散于去离子水中，得到磁性纳米粒子MNPs水溶液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中，将制备好的ASA溶液加入搅拌中的所述磁性纳米粒子MNPs水溶液，高温下反应，离心后取上清液超滤除去游离的SA，直至滤出液电导率值＜50μs，产物冷冻干燥后得到所述磁性纳米粒子ASA-MNPs。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤d)中，将CDDP与ASAMNPs反应，反复透析和超滤，制备出纳米颗粒CDDP-ASA-MNPs。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤e)中，将叶酸溶于无水二甲基亚砜中，室温、搅拌条件下加入二环己基碳二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，然后加入双肼聚乙二醇，继续搅拌反应，反应结束后加入双蒸水，过滤除去不溶物后，得到所述FA-PEG-NHNH2。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤g)中，MMP-9的反义序列如SEQID NO:1所示，MMP-9的无义序列如SEQ ID NO:2所示，所述序列中的碱基采用硫代修饰，5’氨基修饰，得到所述MMP-9-ASODN。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤h)中，取CDDP-ASA-MNPs、FA-PEG-NHNH2、硫代及氨基修饰的MMP-9-ASODN，搅拌均匀，避光反应，加入硼氢化钠溶液，充分离心沉淀，沉淀物用PBS溶液重新分散均匀，得到所述磁性纳米复合物CDDP-FA-PEG-ASA-MNPs-MMP-9-ASODN。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785161A (zh) * 2005-10-14 2006-06-14 中山大学 一种载顺铂磁性纳米球及其制备方法
CN101721967A (zh) * 2010-01-20 2010-06-09 华南理工大学 含有超顺磁性Fe3O4纳米晶的中空微球及其制备方法
CN102145177A (zh) * 2011-04-13 2011-08-10 南方医科大学 叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法
CN102228425A (zh) * 2011-07-01 2011-11-02 华南师范大学 一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统及其构建方法和应用
CN102228437A (zh) * 2011-07-01 2011-11-02 华南师范大学 一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用
CN102698282A (zh) * 2012-06-01 2012-10-03 淮阴工学院 用于负载药物的多重响应性磁性复合纳米粒子制备方法
CN104244928A (zh) * 2012-01-18 2014-12-24 株式会社百奥尼 磁性纳米颗粒-SAMiRNA复合物及其制备方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1785161A (zh) * 2005-10-14 2006-06-14 中山大学 一种载顺铂磁性纳米球及其制备方法
CN101721967A (zh) * 2010-01-20 2010-06-09 华南理工大学 含有超顺磁性Fe3O4纳米晶的中空微球及其制备方法
CN102145177A (zh) * 2011-04-13 2011-08-10 南方医科大学 叶酸分子靶向磁性纳米药物载体及靶向基因药物的制备方法
CN102228425A (zh) * 2011-07-01 2011-11-02 华南师范大学 一种肿瘤靶向磁性水凝胶纳米递药系统及其构建方法和应用
CN102228437A (zh) * 2011-07-01 2011-11-02 华南师范大学 一种共固定TNF-a/IFN-g/DOX/FA/Fe3O4-OA磁性靶向纳米粒及其制备方法和应用
CN104244928A (zh) * 2012-01-18 2014-12-24 株式会社百奥尼 磁性纳米颗粒-SAMiRNA复合物及其制备方法
CN102698282A (zh) * 2012-06-01 2012-10-03 淮阴工学院 用于负载药物的多重响应性磁性复合纳米粒子制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陈帅君: "叶酸受体介导的载顺铂磁性纳米pH敏感靶向给药系统研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111358957A (zh) * 2020-03-06 2020-07-03 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒
CN111358957B (zh) * 2020-03-06 2024-03-26 西安组织工程与再生医学研究所 磁性纳米颗粒

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