CN107345210A - 一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株，构巢曲霉重组菌株培养方法简单，成本低廉，此外其粗提产物具有较强的杀虫效率，并且产物提取方法简单，可有效用于昆虫的防治。具有广泛的实用价值和经济价值。

Description

一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株，和其粗提产物的杀虫效果。

背景技术

在与环境相互作用过程中，丝状真菌形成了独特的应对环境胁迫机制。其中，合成真菌毒素抵御敌害生物的吞食是其重要的生存策略之一。大多数丝状真菌在昆虫吞食时合成诱导性毒素。有些丝状真菌如烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黄曲霉(Aspergillusflavus)等在正常生理条件下合成组成性毒素。粗糙脉孢菌基因组中含有6个聚酮类合成酶基因(polyketide synthase gene,pks)。前期研究发现pks-6基因的敲除菌株极易遭致跳虫的吞食。利用乙酸乙酯分别提取pks-6基因的敲除菌株和pks-6基因高表达菌株的代谢产物，并给大蜡螟注射相同剂量的后发现：在培养的第12天，pks-6基因的敲除菌株代谢产物导致的大蜡螟的死亡率为68％，pks-6基因高表达菌株的代谢产物导致大蜡螟的死亡率为100％，由上可见pks-6基因的产物呋喃香豆素(neurosporin A)具有杀虫效果。但是，呋喃香豆素在野生型粗糙脉孢菌中的积累水平较低，模式真菌构巢曲霉生长速度较快，遗传背景清晰，且次级代谢产物积累量较多。

发明内容

为了解决上述问题，本发明是利用同源重组的原理，将粗糙脉孢菌pks-6基因在遗传改造后的构巢曲霉中进行异源表达，获得了一株高产呋喃香豆素的重组菌株，并且该菌株的乙酸乙酯粗提取产物具有较强的杀虫效果。

本发明的第一个目的在于提供一种可大量合成呋喃香豆素的构巢曲霉重组菌株；

本发明的第二个目的在于提供利用上述重组菌的构建方法；

本发明的第三个目的在于提供一种该菌株的乙酸乙酯粗提物用于杀虫的用途。

为了实现上述目的，本发明首先提供一种pks-6重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks6，其特征在于，所述重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

另一方面，本发明提供一种包含重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的重组菌株。

另一方面，本发明提供一种重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转化的宿主细胞。

另一方面，重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转化的宿主细胞是构巢曲霉L08030。

另一方面，本发明提供一种重组载体pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接。

另一方面，本发明提供一种pks-6构巢曲霉重组菌株的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接；利用原生质体转化的方法将pYH-WA-PyrG-KI-pks6转入构巢曲霉L08030中，利用不含PyrG的培养基筛选重组菌株，并利用PCR进行验证。

另一方面，本发明提供一种含有pks-6基因重组构巢曲霉L08030的粗提产物的杀虫剂。所述的提取溶剂为乙酸乙酯。

另一方面，本发明提供一种杀虫剂用于杀灭昆虫的应用，所述昆虫为大蜡螟、果蝇。

发明详述：

(1)重组菌株的构建

以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接。利用原生质体转化的方法将pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转入构巢曲霉L08030中，利用不含PyrG的培养基筛选重组菌株，并利用PCR进行验证。

(2)重组菌株的大量培养

将大米和自来水的比例以1：1混合均匀后，放入灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌。待冷却后，加入重组菌株的液体培养物，并利用无菌的玻璃棒搅拌均匀，置于温度为30℃，相对湿度为50％的培养箱中进行培养14天。

(3)对果蝇毒性的影响

利用乙酸乙酯分别提取构巢曲霉L08030和pks-6基因重组菌株代谢产物，利用旋转蒸发仪挥干溶剂后，加入DMSO溶解代谢产物。将上述溶液加入熔化后且温度降至45℃的果蝇培养基中。待培养基凝固冷却后，每组接种50条果蝇幼虫，以仅加入DMSO的培养基作为对照组。观察并记录果蝇的生长发育情况。

(4)对大蜡螟毒性的影响

利用乙酸乙酯分别提取构巢曲霉L08030和pks-6基因重组菌株代谢产物，利用旋转蒸发仪挥干溶剂后，加入DMSO溶解代谢产物，利用生理盐水将DMSO的浓度稀释至2％，将按每支蜡螟0.1毫克粗提物的剂量进行注射，以2％DMSO生理盐水溶液作为对照组。每组50条大蜡螟。观察并计算大蜡螟的存活率。

本发明中的PKS6基因与PKS-6基因是同一种基因。

有益效果

本发明中PKS6重组质粒转化构巢曲霉能大量积累呋喃香豆素，PKS6重组质粒转化构巢曲霉培养方法简单，成本低廉，且该菌株的乙酸乙酯粗提物可有效杀死大蜡螟并抑制果蝇的生长发育，可有效用于昆虫的防治。

附图说明

图1:pYH-WA-PyrG-KI载体及酶切电泳图(M：1Kb DNA Ladder；1:pYH-WA-PyrG-KI质粒；2:Nhe I酶切后的pYH-WA-PyrG-KI)

图2：pks-6基因PCR扩增后的电泳图谱(M：1Kb DNA Ladder；1:pks-6)

图3：重组质粒PYH-WA-PyrG-KI-pks-6(M：1Kb DNA Ladder；1:pYH-WA-PyrG-KI质粒；2，3:重组质粒PYH-WA-PyrG-KI-pks-6)

图4:培养7天时，pks-6基因重组构巢曲霉L08030代谢产物(实验组)对果蝇羽化率和死亡率的影响。

图5：pks-6基因重组构巢曲霉L08030代谢产物(实验组)对大蜡螟存活率的影响。

具体实施方式

实施例1：

1.重组载体的构建

1.1载体的准备

pYH-WA-PyrG-KI全长7162bp,包含Swa I、Nhe I、Not I等多个常用酶切位点。此载体上WA序列与构巢曲霉中WA基因序列相同，且载体上含有营养筛选标记基因PyrG，载体上还带有Amp抗性基因，在构建质粒时起筛选作用。利用试剂盒(高纯度质粒小提试剂盒，康为世纪公司)提取质粒后，Nhe I单酶切质粒，并回收(图1、图2、图3)。

1.2 DNA片段的扩增

在超净工作台中挑取野生型粗糙脉孢菌菌丝到试管斜面培养基中，30℃黑暗条件培养7d后转接到含有30mL液体培养基三角瓶中，150rpm，30℃摇床培养4d。收集菌丝体，利用试剂盒方法提取基因组DNA。根据粗糙脉孢菌基因组DNA序列，通过primer blast软件设计引物，获得引物序列：PKS6-F：TCCTTCTCCTGATCGCTAGCATGGCCCCTCACAGCACTC(SEQ IDNo.2)；PKS6-R：ACAGAATAACTCTCGCTAGCTCAAGCATCCTGAGCCTCCATC(SEQ ID No.3)，片段大小为长度为7293bp。

1.3构建pYH-WA-PyrG-KI-pks-6重组质粒的构建

本实验利用无缝克隆试剂盒(NovoRec PCR一步定向克隆试剂盒，NEB(北京)有限公司)构建重组载体。以氨苄霉素为筛选标记，利用PCR技术对重组载体进行验证。检验引物为：

TPKS6-F：ACTAGCCACACTCGTGACAG(SEQ ID No.4)；和TPKS6-R：

CTCGAAGTCAATTGCAGCCG(SEQ ID No.5)，长度为1475。

2.构巢曲霉原生质体制备

2.1构巢曲霉原生质体制备

从-80℃冰箱中取出构巢曲霉菌株，放在冰上融化。待融化后，用牙签蘸取少量孢子悬液在含有GMM培养基的平板上划线，在37℃培养箱中培养7天。向三角瓶中倒入30mL液体培养基，用牙签在平板上刮取适量的孢子于液体培养基中，摇匀成孢子悬液。放在37℃,200rpm摇床中摇6-8h。吸取少许悬液制片，在光学显微镜下镜检。当萌发的孢子芽的长度为孢体直径两倍时即可。将孢子液倒入50mL离心管中，离心机离心，沉淀菌体。离心机离心条件：12000rpm,4℃,离心5min。缓慢倒掉上清液，在离心管中加入4-5mL的STC Buffer,用移液枪吹匀离心，条件同上。用移液枪轻轻吸掉上清液，向离心管中加入3-5mL的酶液(OM+Enzyme),移液枪轻轻吹打混匀。在200rpm,37℃摇床中摇14-16小时。吸取少量制片，在光学显微镜下观察。当观察到大部分出芽的孢子细胞壁酶解，孢子成圆形透明戒指状时即表示细胞壁酶解成功。将酶解好的原生质体分装到1.5mL离心管中，每管750μL。向离心管中加入750μL的Trapping Buffer,注意加入Trapping Buffer时应该沿着离心管壁缓慢加入，切忌上下颠倒混匀。5000rpm，4℃离心15min。将离心管中悬浮的白色絮状物转移到新离心管中，加入500μL STC Buffer，吹打混匀，6000rpm，4℃离心6min。弃上清，加入300μL STCBuffer，重悬原生质体，4℃冰箱保存待用。

2.2PKS6重组质粒转化构巢曲霉

(1)将SMM上层培养基在微波炉融化，于50℃水浴锅中保温待用。

(2)20μL pYH-WA-PyrG-KI-pks-6与100μL原生质体混合，冰浴50min。

(3)加入1.25mL的PEG solution,将离心管横放手中，轻轻搓动10-15次，室温下静置20min。

(4)加入6mL STC Buffer,上下颠倒混匀。

(5)取50mL离心管，倒入10mL上层培养基，慢慢冷却至40℃左右。将原生质体混合液倒入培养基中，轻轻上下颠倒混匀，倒入提前准备好的下层平板培养基中，37℃培养箱培养2天。

2.3转化子PCR检测

将转化平板上的白色单菌落挑到缺陷培养基上连续传代后，提取其基因组DNA，通过PCR检测PyrG基因是否存在于转化子的基因组DNA中。根据已知的PyrG序列，通过PrimerBlast软件设计扩增PyrG片段，引物为：PyrG-F：GTACCTGACTACAGAGTAGT(SEQ ID No.6)，PyrG-R：CAGCTTCCGTACGGTCAGCG(SEQ ID No.7)。

3.对昆虫的毒性作用

3.1对果蝇的影响

果蝇属于双翅目短角亚目昆虫，是一种常用的实验室动物模型。将果蝇随机分成3组，每组60只。分别为：空白对照组、构巢曲霉L08030组，实验组(pks-6基因重组构巢曲霉L08030代谢产物)。分组后的果蝇在26℃条件下饲养。饲喂后，于各指管中随机取300条蝇蛆，放入相应的含有不同物质的饲料中。进行观察。由图4可知，实验组可以抑制果蝇的羽化，并且可以导致果蝇的死亡。

3.2对大蜡螟的影响

大蜡螟属于鳞翅目、螟蛾科、蜡螟亚科、蜡螟属的昆虫，是世界范围内蜂群中普遍存在的一种害虫，由于其幼虫生长周期短易于繁殖，被用于模式昆虫。将大蜡螟随机分成3组，每组80只。分别为：空白对照组、构巢曲霉L08030组，实验组(pks-6基因重组构巢曲霉L08030代谢产物)。对其进行血腔药物注射。观察其死亡率。给大蜡螟注射不同的物质后将其置于室温条件下进行培养，在培养的第一天，实验组的存活率为80％，随着时间的进行，大蜡螟的死亡率急剧升高，在注射后的第五天，实验组的大蜡螟全部死亡，毒性明显高于粗糙脉孢菌中pks6高表达菌株。而对照组在培养的第六天存活率为96％，构巢曲霉L08030组中大蜡螟的存活率较对照组略有下降(图5)。

<110>江苏师范大学

<120>一株呋喃香豆素基因转化的杀虫工程菌株及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 14455

<212> DNA

<213>人工序列

<223>重组质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6

<400> 1

ctctggaaca gtctcgccgt cttgctcgtg catttgacca agccactttt caggtggctt 60

ttggtccctc atgatttacg aatgattcaa gcaggaaatc tcttgttgag cgaggagtct 120

ctcggcagtg atgacgtcta ttgtagagcc tccatgcagt cggctcgaga atgtaaccta 180

atgaaagaca accaattcaa cggataccca ctacgctgaa tagtgctgac tggtacgatc 240

gcatttgctc aggtcaagct tagatcaagg atcataatca gtgctctcaa tgaccgatcc 300

atcgacgagg cccaatagat agtagatata gcttgttttt cgatatgatg gtgacacgtg 360

acgccagctc tcttcccttt ccggaacaca tgcaaagaac ttgattttga gacctaccgg 420

gagcgtcgca atcaaatctg ttgaatttct cttcgactca tgttccttga ttctcaggtt 480

tttgttgcta tcgggccgat gcataacaag gtcaatctat ccgtccagca cattcctaga 540

acaatcatcg ggaatccgaa cgagtgttgg acccgaaaac agaccgttgc ctctttcatc 600

atgacggaag ccctgcaagg ctgaagcaca gttaggatta gtggaagagt tccacttggt 660

tcccaagact gattccgatc tagatctttc cattcatgaa tcgaccaaat aggagccttg 720

cgtgatggcc cacaaaacag tgagggttgt attcgaacaa cctgattaga acggcttgcc 780

gatgctacat tgcctacgat ccaggaatag cacagagatg tacggagcgg actcgaagta 840

tgttgcaacc aggtatagga agtggcccac ctcgcgaaaa ggcaaaaagg actgcatcag 900

tataaaagtc tgctcataga agatcgcggc gtattccgcc gctgattctg ggatgaactc 960

aattgcctga tcagcggact tgactctcct tctcctgatc gatggcccct cacagcactc 1020

tcgactccga ctactcgtcg ggttcttcta ctccgactag tgccagtgcc gctggcgatg 1080

gcttcgtcga tggcctcaac ggactcaaca atgggcgcgc cgtggaccct caagagccca 1140

tcgctatcat tggaatgggt aagtctggcc actagccaca ctcgtgacag cattaaactt 1200

tcccagatca taaggctaac acccgcttgc taggatgtcg tttgcccggt ggaagccact 1260

ccagctccaa gctctgggag ctcctcaagg ccgggcgcac cgcccagagc cgcttcccac 1320

cgtcgcgttt caacatcgat ggcttctacc accccaactc ggaccggccc ggctcgctca 1380

acatggaggg tggctacttc atcgaggacg atatccgcgg gttcgagaac tccttcttcg 1440

gcatcaacaa cctcgaggcc acgtacatgg atccccagca gcgcaagcta ctcgaggtgg 1500

tctttgagac gttcgagaac gccggcttca cgctggatca ggtctccgat gccaacattg 1560

gttgctatgt cggcaacttc gtgacggatt tcatcactat gcagctcaag gattcagagt 1620

acactcatcg ctactcggcg acaggtttgg gtaccaccat cttggccaac agaatcagcc 1680

atgtgttcaa catgaagggg cccagcttcg tcatcgatac tgcttgctct tcctcgcttt 1740

actgcttgca tgcggccgtt gccgccttga ttgctggaga atgcgactct gccatcgtgg 1800

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tgtccaagac ctccacttgc cataccttcg actcgtctgc cgatggttac ggcagagctg 1920

atggtatcgg cgctattctc gtcaagaggc tcagcgatgc catccgtgac ggagacccaa 1980

tccgctccgt catccgcggt actgctatca actccaacgg caagaccaac ggtatcaccc 2040

tgcctagtgc tgatggccag gaggccgtta tccgcaaggc ttatgctcaa gccgggcttg 2100

gcttcaacga gaccgactac attgagtgcc acggtactgg taccgccgtc ggtgacccga 2160

tcgaagtcga agccgtgtcc cgcgtgttca agaagcccca gggtgctccc ctcttgatcg 2220

gctccgtcaa gagtaacctc ggtcactccg aggctgcttc tggtctttcc agcatcatca 2280

aggtcgccat ggcccttgag aagggcgaga tccctcccac gtatggcgtc aagaacatca 2340

accccaaaat caagactgat gagtggaacg ttcaaatcgt taccgaaacg accccctggc 2400

caaagaacct tcctcacaac gccggcaggc tcttccgccg tgctggtgtc aactccttcg 2460

gatatggtgg tgccaatgcc cacgccattc tcgaggcccc ccagatgcac gtcccggttg 2520

gatacaaccg cggctccctg ccggcttctc tcacccgctc gactttgttc ctccccttct 2580

ccggctccaa caccgcggct ctcgagcgca gagtcaccga cattgcggct gcaattgact 2640

tcgagaatgt caacatcgcc gacctggcat ataccctcgg tgtcaagcgc acccacctca 2700

gtactcgtgg ctacattctc agcggccagg acactctcaa ggatgacctc aagcccgaga 2760

acctccgcgt tgctctccag ggcaagacct actccaagct tcctttggct tttgtcttca 2820

ccggccaggg tgctcagtgg cctgagatgg gcaaggagtt gatgaaggag tttcccagct 2880

tccgtcgcac catccaaagg ctcgatgctg ctttgcagat gctcccacat gctcccacct 2940

ggactctcca gggtgccatt ctcgagccgg ccaagaccag catgatcaac catgcctcgc 3000

gctctcagcc tgtctgcact gctgtccaga tcgccctggt ccagctgctc gcttcttggg 3060

gcatcaagcc cgagagtgtc atcggccact cttccggaga aattgccgct gcctacaccg 3120

ctggctacct cactcccgag cagtccatca tcatcgctta ctaccgtggc cactgtgtca 3180

ccaagagcac catggtcggt gccatgatgg ctgccggtct cggcgctgag gatgccaaca 3240

agaagatcag cgagcttgac ctcgttggca agatccgtgt tgcttgcgtc aactcccccg 3300

agagcgtcac catctccggt gacaccgagg gcatcgagac tctccgtgcc cagttcgacc 3360

aggccggcac gttcgccaga gtcctcaaga ccgatggcaa ggcctaccac tcccaccaca 3420

tggctgtcat tggccaagag tacgaggacc tcctcaccga ggctctcgac ggcgacgact 3480

tccccaccac cagcaacgga gtccgcttca tttcctccgt caccgatgcc gtcgtgaacc 3540

atgccgttgg ccctgcctac tggcgcgcca atctggagtc gcccgtcttg tttgccaacg 3600

tcgtcgagcg tctcatcaag gacaccgcct cgcacctcgt tgaactcggc ccccactccg 3660

ctctcgagct tcccatcaag cagacccgta ccaagctcaa catcagcgag accaaggtac 3720

actacggctc cgccctctcg cgcggcaaga actccatcac caccatcctt aacctggtcg 3780

gtgacctctt cctgcacggg cacgacatct ccttcaaggg cgtcaactac gtcgactcag 3840

ctttcaacag ccccaaggcg cgcaagaacg tgaagaccca ggagaagatg ctgctcgacc 3900

tgcccaacta cacctgggac tacagcggca ccgtcttcaa cgagtcccgt gtcagcgtcg 3960

agtggcgtaa ccgcaagtat ccccgccacg acctgctcgg ctctcaagtc cacggcggca 4020

atggcatctc caccaattgg aggaacgtcg tcaaggccaa ggacattccc tggatggagg 4080

gccacaagct cgacaccacc accgtcttcc cggccgctgg ctacctcgcc atggcggttg 4140

aagccatgtg ccaggtcgcc gacgtgacca aggagcaaga gcctgcgctc agcctgcgca 4200

acgtcaacat caccaaggcc ctaactctcg gcagtgaaga gaccgacgcc ggtgtcgagc 4260

tgttcaccac gctctacccc gcccagctcc ccggcggcgc caccgacgca ggctggtacc 4320

agttcaacat cagctcctac actaacggca cagccaccac gcacgccaac ggtctcgtca 4380

agatcgactc cgcgcccgct ccgctggaag tcaacctgcc catcgtgccg tccaccatgg 4440

agccccaggc gccgcgcacg tggtacggca agttcgccaa gggcgggctc aacttccagg 4500

gccagttcca atcccttacc gagatccaga acccccgcaa gaaggagaac ccgcacacgc 4560

tggccaagac ggagctccgc cagggcggtg gcagcggccc ttcgaccgag tcggagtacc 4620

ttatccaccc gatcacgatc gatgccctct tccaggcggg tatcattgct agcacctctg 4680

gcgttgtccg cgagttgcgg gccaaggtgc ctgttcacat cgaggagatg cacctccgcg 4740

ctccagttgg cgggcaaaag gagctcaagg ttaacgccac ctctgaggcg gttggttttg 4800

gtaccatccg tgttgatggc gagctgttcg atgacgaggg acgggtcttc ctccagatca 4860

accggtgccg acaggtttcc taccagagcg gtatccagca ggaggcgggt gatgagcgtc 4920

acccaatgct tcgtgttgtc tggaagccgg atgtgactag gcttggagcc ggtgatgcga 4980

aggagttctc gcagtacatt gagcagtatg ctgcaaagtc tgagagcaaa gttgatgatg 5040

ctactgttcg cttgggagct gctcttgatc tgttgatcca caagcacccc agacttcgca 5100

tcttgaacct tgatgtcaac ttgaccgagt tcctggttga caccctccgt ctcgagactg 5160

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ttgaggacct taccaacgaa ggcaagacct caaccgccgc tcaggtcttt gacgtcgtca 5280

tcctcggctc caaggcccag gaacttgaag ccgccaagga gctcgttgac gagaatggct 5340

ccatcatcgt taacggttcc cctgccgatg ccgacaagct ccaaactctc ggcttcacca 5400

ccctccaagc cccctccgac acgatcctcg cccaaacccc ccaggagatc accgccaagc 5460

agcaaaagac tctctccaag caggtcctca tcgtcgagcg caatgccgac cacgtcctca 5520

acagcgccat tgccgcccag gccaaaaaga tcactggtct tgaggccaag cggatcccgc 5580

ttgagagcgt caccgccgac atcatcgcgg cgcacacccg cgtcatttcc actatcgagc 5640

tcgagaaccc cgttctctcg cgtgtcacgg aggacgagat gaagcacatc aagactttga 5700

ctgataactg caccaacctt gtctgggtca ccggcggccg tctcttccag tctgcttcgc 5760

ccgagcatgc tgtggtctat ggtctctctc gtgcgctgat gcttgaacag ccatcgctcc 5820

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ttgttgaggt tcttcagcag gctcttatcg aggcggatcc tgactacgag tttgtccaga 5940

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gtgagaagca gggcgctgag aagcttgctc tgccgctcaa ggatgccaga cccttccgcc 6060

ttggtaccga catggtcggc cagattgatt ccatcttctt ccgccgtgag gaagccaagg 6120

atgtccagct ggctgatggc cacgtcgagg tctccgtcaa ggctgtgggc ttaaacacca 6180

aggatctcca ggccatcaac ggcgacggcg acaacaccag cggctccttc tgtacttcgc 6240

agtacactgc tgttgttgcc aacgtgggca ccggtgttga gaacctcgct gtcggtgatc 6300

gtgtcgtcgt catgacaccc ggttactttg ccactaccga aagtgtccca gcctgggctt 6360

gccagaagct ggccgacaac gaggacttca cgaccctgtc tagcgttcct ctccagctca 6420

gcaccgccat ctatgccgtc aacaaccgtg ctcacgtcca agccggcgag tccgttctcg 6480

tcatcactgg aagcgacatc gctgctgacc aggccgccat ccgcgtcgct caactagctg 6540

gtgccgaagt gttcgccgtt ggtgagagca ccaacctacc ctccgagcgc gtcttcacca 6600

agggtgacaa ggctctcgtt gccaagctgc tcaaggccac tgaaggccgc ggtgtcgatg 6660

tcgtcctcaa ctttgccaac gatgctgccc ctatctccag cattggcaac gtcttcgccg 6720

actgtggacg tcttgtgcat gtcggcaagt ctagccttgc tgaggccatc gctaccgact 6780

cgaccctctt ccgcaagagc gtcaccgtca cgacctttga cattgccaac atcctgtctc 6840

tcaagaccgt tgctggacag aagatccggt cccaactgtt ggctgacagc atcgcgctct 6900

accgccaggg ccagctgaac cttgcctcct ctcccaaggt ctttgacgtc tccgaggtcc 6960

gcgacgcctt ccgcgcactg gcggccaagg gccactctgg ctcagtcgtg gtctcccttg 7020

agaacgaggc ctcgcttgtc cccacccttc cgctcaagta tgataccgtc ctcagcccgg 7080

agaagagcta cctccttgtt ggctgcctcg gtggtctcgg tcggtccatg tccaagtgga 7140

tgcttgctcg tggtgctcgc aagtttgtgt tcatgggccg tagtggtacg gacagggctc 7200

ctgctcgtcg cttggtcgag gatcttgagc ttgctggtgc gcaggtgacg gtggttcgtg 7260

gtgatgttat caacatggag gatgttgagt tggctgtcaa tggtatcgat ggaccgatcg 7320

gcggtgttat tcaggctgcc atgggtcttg atgtgagttc acttttcctt ttcctccgat 7380

gatgatgaag caaatactga ccggtaactc ccccaaaaca ggaagctctc ttcaccacca 7440

tgccccgcga ctactggctt accggcctca agcccaagat cgtcggctcg tggaacctgc 7500

acaacgccat ccgcggccgc gactccgagc tcgacttctt cctcatgact tcctccatct 7560

ctggcagcgt cggcaccgcc accgagtcca actactgctc ggccaactac ttcctcgacg 7620

tcttcgcgcg ccaccgccac tccctcggtt tgcctgctac gtccatcggt ctgggcatga 7680

tttccgaggt cggctacctg cacgagaacc ccgagatcga agccatgctc ctccgcaagg 7740

gtatccaagc catcaacgaa gacgagatgc tgcaaatcat cgacgcctcc ctggccaccc 7800

ctaccgctgt cccaggtagc tacgacgagc tcgcccgcgc ccacgtcctc accggtctcg 7860

agcctcttgg cctcaaggaa ttgcgcgcca agggcttcga gggcacctct cccgtgctcg 7920

gtgacccgcg cgcttctctc ctgtccgccg cgctcgacga gtccacggat gcggccagca 7980

gcaacgcagc gagcggtatg cccgccgagg tcgccgaggc cattgccacg ggcgcctcgg 8040

tggaggacgc cgtcctcaag atgatctcca agaagttctc caacttggtg ctgattcccg 8100

aggacaagct gaacctgacc aagccgatca gcgaggtggg cgtggacagc atgttggctg 8160

ccgagtttag ggcatggatc ttccaggctt tcaaggtgga tgtgccctac ttgacgctgt 8220

tgtcggcggc ggctacactg accttgttgt cggagctgat tacgaagaag atgatggagg 8280

ctcaggatgc ttgactagcg agagttattc tgtgtctgac gaaatatgtt gtgtatatat 8340

atatatgtac gttaaaagtt ccgtggagtt accagtgatt gaccaatgtt ttatcttcta 8400

cagttctgcc tgtctacccc attctagctg tacctgacta cagagtagtt taattgtggt 8460

tgaccccaca gtcggaggcg gaggaataca gcaccgatgt ggcctgtctc catccagatt 8520

ggcacgcaat ttttacacgc ggaaaagatc gagatagagt acgactttaa atttagtccc 8580

cggcggcttc tattttagaa tatttgagat ttgattctca agcaattgat ttggttgggt 8640

caccctcaat tggataatat acctcattgc tcggctactt caactcatca atcaccgtca 8700

taccccgcat ataaccctcc attcccacga tgtcgtccaa gtcgcaattg acttacggtg 8760

ctcgagccag caagcacccc aatcctctgg caaagagact ttttgagatt gccgaagcaa 8820

agaagacaaa cgttaccgtc tctgctgatg tgacgacaac ccgagaactc ctggacctcg 8880

ctgaccgtac ggaagctgtt ggatccaata catatgccgt ctagcaatgg actaatcaac 8940

ttttgatgat acaggtctcg gtccctacat cgccgtcatc aagacacaca tcgacatcct 9000

caccgatttc agcgtcgaca ctatcaatgg cctgaatgtg ctggctcaaa agcacaactt 9060

tttgatcttc gaggaccgca aattcatcga catcggcaat accgtccaga agcaatacca 9120

cggcggtgct ctgaggatct ccgaatgggc ccacattatc aactgcagcg ttctccctgg 9180

cgagggcatc gtcgaggctc tggcccagac cgcatctgcg caagacttcc cctatggtcc 9240

tgagagagga ctgttggtcc tggcagagat gacctccaaa ggatcgctgg ctacgggcga 9300

gtataccaag gcatcggttg actacgctcg caaatacaag aacttcgtta tgggtttcgt 9360

gtcgacgcgg gccctgacgg aagtgcagtc ggatgtgtct tcagcctcgg aggatgaaga 9420

tttcgtggtc ttcacgacgg gtgtgaacct ctcttccaaa ggagataagc ttggacagca 9480

ataccagact cctgcatcgg ctattggacg cggtgccgac tttatcatcg ccggtcgagg 9540

catctacgct gctcccgacc cggttgaagc tgcacagcgg taccagaaag aaggctggga 9600

agcttatatg gccagagtat gcggcaagtc atgatttcct cttggagcaa aagtgtagtg 9660

ccagtacgag tgttgtggag gaaggctgca tacattgtgc ctgtcattaa acgatgagct 9720

cgtccgtatt ggcccctgta atgccatgtt ttccgccccc aatcgtcaag gttttccctt 9780

tgttagattc ctaccagtca tctagcaagt gaggtaagct ttgccagaaa cgccaaggct 9840

ttatctatgt agtcgataag caaagtggac tgatagctta atatggaagg tccctcagga 9900

caagtcgacc tgtgcagaag agataacagc ttggcatcac gcatcagtgc ctcctctcag 9960

acagaatgcg gccgcatgac gcgaatcact ttactatgac aaagggcgaa aaggcaaagg 10020

agcttgctac tttcatgaag aatgcgttgg gggtttgtga gcgccggttg gtctgataat 10080

gtcaatttgt ttgctttggt tttggcttag gttttgatcc attaatgcta ttctattgtt 10140

gctcataagg ttttactttc ccgtttcatc ttgtactcta aacataaagg gtaaacaata 10200

ataatcctct ggttctaata taaaggttct tgagagactg catctaagtg ttcagccaca 10260

atcaattgcg atactctatt tcctagctat ttaacgccca aagttttgga aacccggaca 10320

atagtgcgaa caacccaact agtagccgcg gtataaacgg tgtcgcataa aaagagcaaa 10380

tgtacactag cattgcagtc aaaacaaccc tgggtcaatg caatgtcata attcataaag 10440

ggccgcaata tgatgacatg ctgtagtcgt ctaagcaagt gaaggcatgt aaggtagtag 10500

taggcacggt aacatccagt ttcagcactc cctgtaaacg tcatagagtg tctggcagtg 10560

gggaaagagg cccaagaaac ccagtccaac gtcaaatctg aacagaaaag atttcagaag 10620

gataggactt tccgtgagct ttccactcag aaaaacccgg aagatgaatg gattgctctg 10680

gtttgtattg atcgattgaa gtaaaactta attgagagag gaggcatatg gtatgtaggc 10740

gcgacgggtt tattcatagg gacatctcag aactaaacct aagagcgctt ccgcggcctg 10800

gaaaattaga tccgttatta ttgattccag ggcttgtagg acggctgtag ttgttcgcat 10860

ttaactttgg gcttcgtggt tgggtgcttg ttgagcgtgt ggatgggcga ttcttgcgga 10920

tctcgcggag ctcgtcctct ttcttctgga ggagatcttc gcgtactgac agcacagggg 10980

ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 11040

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 11100

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 11160

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 11220

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 11280

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 11340

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 11400

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 11460

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 11520

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 11580

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 11640

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 11700

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 11760

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 11820

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 11880

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 11940

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 12000

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 12060

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 12120

gcgcaacgtt gttgccattg ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 12180

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 12240

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 12300

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 12360

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 12420

gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 12480

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 12540

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 12600

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 12660

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 12720

tcagggttat tgtctcatga gccattatac gaagttatgc accacgcttt tcaattcaat 12780

tcatcatttt ttttttattc ttttttttga tttcggtttc cttgaaattt ttttgattcg 12840

gtaatctccg aacagaagga agaacgaagg aaggagcaca gacttagatt ggtatatata 12900

cgcatatgta gtgttgaaga aacatgaaat tgcccagtat tcttaaccca actgcacaga 12960

acaaaaacct gcaggaaacg aagataaatc atgtcgaaag ctacatataa ggaacgtgct 13020

gctactcatc ctagtcctgt tgctgccaag ctatttaata tcatgcacga aaagcaaaca 13080

aacttgtgtg cttcattgga tgttcgtacc accaaggaat tactggagtt agttgaagca 13140

ttaggtccca aaatttgttt actaaaaaca catgtggata tcttgactga tttttccatg 13200

gagggcacag ttaagccgct aaaggcatta tccgccaagt acaatttttt actcttcgaa 13260

gacagaaaat ttgctgacat tggtaataca gtcaaattgc agtactctgc gggtgtatac 13320

agaatagcag aatgggcaga cattacgaat gcacacggtg tggtgggccc aggtattgtt 13380

agcggtttga agcaggcggc agaagaagta acaaaggaac ctagaggcct tttgatgtta 13440

gcagaattgt catgcaaggg ctccctatct actggagaat atactaaggg tactgttgac 13500

attgcgaaga gcgacaaaga ttttgttatc ggctttattg ctcaaagaga catgggtgga 13560

agagatgaag gttacgattg gttgattatg acacccggtg tgggtttaga tgacaaggga 13620

gacgcattgg gtcaacagta tagaaccgtg gatgatgtgg tctctacagg atctgacatt 13680

attattgttg gaagaggact atttgcaaag ggaagggatg ctaaggtaga gggtgaacgt 13740

tacagaaaag caggctggga agcatatttg agaagatgcg gccagcaaaa ctaaaaaact 13800

gtattataag taaatgcatg tatactaaac tcacaaatta gagcttcaat ttaattatat 13860

cagttattac ccataacttc gtatagcata cattatacga agttatcccg ggtaccgagc 13920

tcgaattcgt aacttacacg cgcctcgtat cttttaatga tggaataatt tgggaattta 13980

ctctgtgttt atttattttt atgttttgta tttggatttt agaaagtaaa taaagaaggt 14040

agaagagtta cggaatgaag aaaaaaaaat aaacaaaggt ttaaaaaatt tcaacaaaaa 14100

gcgtacttta catatatatt tattagacaa gaaaagcaga ttaaatagat atacattcga 14160

ttaacgataa gtaaaatgta aaatcacagg attttcgtgt gtggtcttct acacagacaa 14220

gatgaaacaa ttcggcatta atacctgaga gcaggaagag caagataaaa ggtagtattt 14280

gttggcgatc cccctagagt cttttacatc ttcggaaaac aaaaactatt ttttctttaa 14340

tttctttttt tactttctat ttttaattta tatatttata ttaaaaaatt taaattataa 14400

ttatttttat agcacgtgat gaattcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgt 14455

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物PKS6-F

<400> 2

tccttctcct gatcgctagc atggcccctc acagcactc 39

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物PKS6-R

<400> 3

acagaataac tctcgctagc tcaagcatcc tgagcctcca tc 42

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物TPKS6-F

<400> 4

actagccaca ctcgtgacag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物TPKS6-R

<400> 5

ctcgaagtca attgcagccg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物PyrG-F

<400> 6

gtacctgact acagagtagt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<223>引物PyrG-R

<400> 7

cagcttccgt acggtcagcg 20

Claims (9)

1.一种重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6，其特征在于，所述重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的碱基序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种包含如权利要求1所述的重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的重组菌株。

3.根据权利要求2所述的重组菌株，其特征在于，宿主细胞为构巢曲霉L08030。

4.一种如权利要求1所述的重组表达质粒pYH-WA-PyrG-KI-pks-6的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接。

5.一种如权利要求2或3所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，该方法以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板，扩增pks-6基因，利用无缝克隆试剂盒将pks-6基因与载体pYH-WA-PyrG-KI连接；利用原生质体转化的方法将pYH-WA-PyrG-KI-pks-6转入构巢曲霉L08030中，利用不含PyrG的培养基筛选重组菌株，并利用PCR进行验证。

6.一种含有pks-6基因重组构巢曲霉L08030的粗提产物的杀虫剂。

7.根据权利要求5所述的粗提产物的提取溶剂为乙酸乙酯。

8.根据权利要求5所述的杀虫剂用于杀灭昆虫的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的昆虫为大蜡螟、果蝇。