CN112314631A

CN112314631A - 一种生物源杀虫剂及其制备方法

Info

Publication number: CN112314631A
Application number: CN202011242311.0A
Authority: CN
Inventors: 王正亮; 俞晓平; 付贤树
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2020-11-09
Filing date: 2020-11-09
Publication date: 2021-02-05
Anticipated expiration: 2040-11-09
Also published as: CN112314631B

Abstract

本发明涉及生物防治领域，具体地，本发明提供一种生物源杀虫剂及其制备方法，其包含对于害虫有杀虫或抗虫活性的活性成分，所述生物源杀虫剂可避免害虫产生抗药性，本发明提供的杀虫剂具有广谱高效、不杀伤有益生物、无有害残留、无污染、无毒副作用等优点。

Description

一种生物源杀虫剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物防治领域，尤其涉及一种生物源杀虫剂及其制备方法。

背景技术

水稻是我国重要的粮食作物之一，在我国农业生产和国计民生中占据举足轻重的位置，其中害虫防治是保障水稻安全生产的关键环节。目前主要采用的化学防治策略不仅造成农业生态系统结构的破坏，生物多样性的降低，而且致使害虫抗药性增强，虫害再猖獗，环境污染加剧，严重威胁人体健康和生存环境。随着害虫综合治理技术的推广和人们对高质量绿色有机食品的需求，化学农药防治逐渐被生物防治等环境相容性防治措施所取代，其中采用昆虫病原微生物防治害虫是一种行之有效的生物防治措施。昆虫病原微生物具有广谱高毒力、对环境友好以及不易使害虫产生抗药性等诸多优点。其中，昆虫病原真菌主要通过独特的体壁接触侵染模式而致死各类害虫，对刺吸式口器害虫的防治具有明显的优势，已经得到了大量应用。近些年来，以绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)为代表的真菌杀虫剂在玉米螟、烟粉虱、褐飞虱、蝗虫和金龟子等害虫生物防治中发挥的作用越来越受到人们的关注。目前国内外已有学者通过分离真菌菌株的培养性状和生物测定方法筛选到了诸多对农业害虫具有毒力的病原真菌菌株。

缺少较高致病力的菌株在一定程度上限制了昆虫病原微生物应用。因此，筛选高毒力和抗逆性好的优良微生物菌株成为了当前利用其防治水稻害虫所需解决的主要问题。

发明内容

为了解决上述技术问题，提高植物抗虫能力，本发明提供一种生物源杀虫剂及其制备方法。

本发明是以如下技术方案实现的：

一种生物源杀虫剂，其包含对于害虫有杀虫或抗虫活性的活性成分。

进一步地，所述活性成分为真菌，所述真菌为一种构巢曲霉，其分类命名为Aspergillus nidulans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19901，保藏时间为2020年05月21，保藏地点为中国北京。

进一步地，所述杀虫剂的靶标害虫为褐飞虱。

进一步地，所述杀虫剂的靶标害虫为二化螟。

进一步地，以权利要求2所述真菌菌株作为菌种，接种到PDA液体培养基中，并置于摇床上于28℃下培养1天，制成菌丝液体种子，所述菌丝液体种子按照1/10(v/w)的比例接入经蒸汽湿热灭菌至适当熟度的稻米培养基上，在温度为25℃～30℃条件下培养5～7天，待米粒表面布满孢子后于 33℃下鼓风烘干2天，将米粒上产出的孢子粉用200目标准筛过筛收集。

进一步地，所述生物源杀虫剂为所述真菌孢子和藜芦碱按照重量比2:5 混合而成；所述真菌孢子在该杀虫剂中的含量为1×10⁷～1×10¹⁰孢子/克；所述藜芦碱为含藜芦总碱的纯净物。

进一步地，所述生物源杀虫剂还包括助剂，所述助剂包括但不限于石粉、粘土、草木灰、陶土、高岭土、硅藻土、活性白土、泥煤。

本发明的有益效果是：

1)本研究从稻田中采集褐飞虱罹病虫尸，采用平板划线和稀释涂布法，分离得到一株对于褐飞虱毒性较强的病原真菌。通过对该菌的ITS序列进行PCR扩增、测序及系统发育分析，在分子水平上对其进行种类鉴定，继而测定其在不同浓度下对褐飞虱成虫的毒力，为褐飞虱的生物防治提供原始出发菌株，从而为开发褐飞虱的微生物防治技术奠定基础。

2)毒力强、效果彻底。由于本发明所述构建体包含两种不同杀虫机制，使得包含本发明所述构建体的工程菌的杀虫毒力强，尤其是二化螟和褐飞虱，对初孵幼(若)虫的防治效果几乎为百分之百。

3)无污染。现有技术使用的化学防治方法虽然对控制害虫的为害起到了一定作用，但同时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制害虫的构建体及其方法，可以消除上述不良后果。

4)简单、方便、经济。现有技术使用的生物杀虫剂在环境中易被降解，因此需要重复生产和重复应用，并为在农业生产上的实际应用带来困难，大大地增加了成本；本发明只需培育真菌孢子并喷施即可。

5)抗虫谱广。本申请提供的杀虫剂既可以防治多种水稻害虫，也能够同时防治半翅目和鳞翅目害虫，尤其是褐飞虱和二化螟。

下面通过实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1是本实施例提供的真菌形态鉴定示意图；

图2是本实施例提供的真菌系统发育树示意图；

图3是本实施例提供的真菌接种靶标害虫后的累计死亡率示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在。在这种排列中，一条链与另一条链互补，反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了 DNA的其它互补链。这样，本发明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用。本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质，典型将DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质。mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽。本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和 PNA(肽核酸)。

本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特定的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在内和/或末端缺失)、变体、突变体、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白。所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗鳞翅目昆虫害虫的生物活性的蛋白。

说无特殊说明，本申请所述蛋白质均可根据本领域技术人员的公知常识获得其编码核苷酸，所述编码核苷酸也在本申请保护范围内。

本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有致死效应的。更具体地，目标昆虫是褐飞虱或二化螟。

实施例1：获得病原真菌

褐飞虱病虫尸体采集自浙江省余姚市农业区水稻田中，采集后于4℃冰箱中保存，备用。供试褐飞虱种群为实验室建立及保存，在人工气候室内(温度26℃±1℃、光周期14L:10D、相对湿度75％-85％)以TN1水稻苗隔离饲养，维持种群；TN1水稻种植条件同褐飞虱饲养条件，待分蘖期后用于实验。

病原真菌的分离和纯化：以马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)为分离纯化培养基，首先用100％的酒精对褐飞虱罹病虫尸进行表面消毒后，用无菌蒸馏水洗涤5次，晾干后捣碎虫体。用无菌水适当稀释后涂布PDA平板，置于25℃恒温培养箱中培养3-5天。待长出的真菌菌落产生分生孢子时，取少量分生孢子粉用0.02％吐温80溶液配成低浓度的孢子悬浮液，进行单孢分离纯化。

将分离纯化的菌株涂布于PDA平板上连续培养7天后，刮取分生孢子粉，充分震荡使分生孢子均匀悬浮于0.02％吐温80溶液中，配成浓度为1×10⁸个/mL的孢子悬液，用喷雾法将孢子悬液喷洒于饲养有褐飞虱成虫的TN1水稻苗上，连续饲养过程中将死亡褐飞虱取出,于25℃培养箱中保湿培养。取典型真菌致死症状的虫尸，按上述平板划线和稀释涂布的方法分离纯化病原真菌，比较新分离菌株与原始菌株的生物学性状，完成科赫法则的鉴定程序。

实施例2：病原真菌鉴定与保藏

形态学鉴定：在PDA培养基上，菌落初期白色丝状，以后逐渐扩大，在第5天直径平均达到6.20cm，第7天几乎覆盖整个平皿底部。菌落培养 5天后其上产生稀疏、暗绿色的分生孢子层，并呈环状分布(图1A)，显微制片观察，显示培养5天后菌丝有分支，有隔膜，光滑(图1B)，其中A图bar 值为1.5cm，B图中bar为15μm.

分子水平鉴定：利用真菌基因组提取试剂盒(天根生化科技公司)，按操作说明书提取病原真菌的基因组DNA，通用引物如下：

ITS1(5'-GTTTCCGATAGGTGAACCTGC-3')；

ITS4(5'-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3')，上述引物由上海生物工程有限公司合成。ITS序列的PCR扩增体系为：DNA模板2μL，EX Taq 25 μL，正反引物各1.5μL，去离子水补充至50μL。扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min；4℃foever。PCR反应完成后，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物数量及分子量大小。目标扩增产物经清洁回收、连接转化后，挑取阳性转化子送上海生物工程有限公司测序。所得核苷酸序列在 GenBank中进行基因序列同源性比较分析，构建系统发育树，如图2所示，其中，(A)表示提取真菌总基因组DNA；(B)表示PCR扩增ITS序列；图中 M-分子量Marker，1-病原真菌，CK-空白对照，(C)表示基于ITS序列的病原真菌系统发育树构建，粗体字体表示本研究中从褐飞虱罹病虫尸分离的菌株.

分离纯化得到的菌株的rDNA-ITS经过克隆测序，琼脂糖凝胶电泳检测结果表明扩增片段长为565bp。通过Blast与GenBank中已有的核酸序列进行比对，结果表明该菌株与构巢曲霉具有一定同源性，所述菌株为一种构巢曲霉，其分类命名为Aspergillus nidulans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19901，保藏时间为2020年05月21，保藏地点为中国北京，以下称为杀虫真菌-233。

实施例3：生物测定

将保藏的菌种在PDA斜面上于25℃和光周期12L:12D条件下活化培养7天至产孢，将活化菌种的分生孢子转接到装有20mL PDA液体培养基(不加琼脂的PDA培养基)的三角瓶中，25℃振荡(～150r/min)培养2天，然后取1mL菌液转接至50mL培养液后继续培养1天左右。将所获菌丝液按1/10(v/w)的比例接入经蒸汽湿热灭菌至适当熟度的稻米上，充分混合后将菌米平摊于直径15cm的灭菌培养皿中(100g米/皿)，于25℃和12L: 12D条件下发酵产孢5～7天，待米粒表面布满孢子后于33℃下鼓风烘干2 天，将米粒上产出的孢子粉用200目标准筛过筛收集。收集的曲霉孢子以 0.02％的吐温80溶液悬浮，充分震荡使分生孢子均匀分布在溶液中。在显微镜下用血球计数板检查计算出孢子数和浓度，用0.02％吐温80溶液将其分别配置成浓度为1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个/mL的孢子悬液。取事先准备好的稻苗，每杯稻苗接褐飞虱成虫40头，吸取1mL各浓度孢子液，用喷雾法处理成虫，喷雾后在杯口覆盖事先已经刺孔的塑料盖以防止试虫逃跑。每个浓度重复3次，以1mL 0.02％吐温80溶液作为对照。在 25℃和14L:10D条件下饲养，逐日定时观察记录死亡率，连续观察10天，并及时将虫尸移出，置于25℃下保湿培养，根据虫尸表面长出的菌落特征确定真菌致死的显症率。实际接种剂量用平放于稻苗旁的盖玻片(20×20 mm)收集孢子，棉兰染色后在显微镜下镜检孢子数，从而将沉降到褐飞虱及水稻叶片上的孢子附着量标准化为孢子数。

接种后3-4d褐飞虱成虫才逐渐表现出感染症状。感病致死的褐飞虱虫体发暗皱缩，体表早期可见少量灰白色菌丝，后期产生大量分生孢子。接种孢子悬浮液3d后，褐飞虱成虫开始出现死亡，但死亡率较低，各组差异不是很明显，自接种4d起，不同浓度处理组与对照组存在明显差异，不同浓度处理组之间也存在明显差异。褐飞虱的死亡高峰在接种后5-7d，其累计死亡率与孢子浓度及接种后时间呈正相关。第10d时，褐飞虱累死死亡率达到最高值，1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个/mL的孢子悬液处理组校正后累计死亡率分别为45.3％，62.7％和85.7％，半致死中时分别为6.7天， 4.9天和3.8天，死虫尸经保湿培养后均出现典型的真菌感染致死症状，如图3所示，其中，CK为空白对照(0.02％吐温80处理)，实验组分别用低、中和高浓度孢子(1×10⁶、1×10⁷和1×10⁸个孢子/mL,1mL)接种处理。

实施例4：

Cry9E-like-01杀虫蛋白质的氨基酸序列(652个氨基酸)，如序列表中 SEQ IDNO:1所示；所述Cry9E-like-01核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述Cry9E-like-01核苷酸序列的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry9E-like-01核苷酸序列的3’端还连接有BamHI酶切位点。

Cry9E-like-02杀虫蛋白质的氨基酸序列(645个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO:2所示；所述Cry9E-like-02核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述Cry9E-like-02核苷酸序列的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry9E-like-02核苷酸序列的3’端还连接有BamHI酶切位点。

Cry9E-like-03杀虫蛋白质的氨基酸序列(663个氨基酸)，如序列表中 SEQ IDNO:3所示；所述Cry9E-like-03核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述Cry9E-like-03核苷酸序列的5’端还连接有NcoI酶切位点，所述Cry9E-like-03核苷酸序列的3’端还连接有BamHI酶切位点。

实施例5：

构建含有靶核苷酸序列的重组克隆载体。将合成的Cry9E-like-01、 Cry9E-like-02、Cry9E-like-03核苷酸序列分别连入克隆载体pGEM-T (Promega，Madison，USA，CAT：A3600)上，操作步骤按说明书进行，之后将重组克隆载体用热激方法转化大肠杆菌感受态细胞，培养后提取质粒酶切鉴定后，对阳性克隆进行测序验证，结果表明核苷酸序列的正确插入。分别得到含有Cry9E-like-01的重组克隆载体Tsl-01、含有Cry9E-like-02 的重组克隆载体Tsl-02、含有Cry9E-like-03的重组克隆载体Tsl-03。

构建含有靶核苷酸序列的重组表达载体。利用常规的酶切方法，用限制性内切酶NcoI和BamHI分别酶切重组克隆载体Tsl-01、Tsl-02、Tsl-03 和表达载体(载体骨架：pBHt2-GFP)，将切下的Cry9E-like-01、Cry9E-like-02、 Cry9E-like-03核苷酸序列片段分别插到表达载体pBHt2-GFP的NcoI和BamHI位点之间，最终构建成重组表达载体Tsl-0001、Tsl-0002、Tsl-0003，酶切验证序列的正确插入。

实施例6：

重组表达载体转化农杆菌，对己经构建正确的重组表达载体Tsl-0001、 Tsl-0002、Tsl-0003用液氮法转化到农杆菌LBA4404中，具体地，100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10分钟， 37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度 28℃、转速200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平和100mg/L 的卡那霉素的LB平板上直至长出阳性单克隆，挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切后进行酶切验证，结果表明重组表达载体Tsl-0001、Tsl-0002、Tsl-0003结构完全正确。

从YEP平板上挑取含有重组表达载体的农杆菌单克隆菌落接种于含有合适抗生素的7mL YEP液体培养基中，250rpm/min，28℃过夜培养。次日用含200μM乙酰丁香酮的诱导培养基IM稀释到OD660为0.15，然后继续培养至OD660为0.6～0.8。

将100μL诱导活化的根癌农杆菌和等体积的杀虫真菌-233菌体悬液混合后均匀地涂布在含有200μM乙酰丁香酮的IM培养基平板上，28℃条件下培养48h，然后在IM培养基平板上覆盖一层含100μg/mL潮霉素(或其他抗生素)的PDA培养基(含有50μg/mL的四环素以杀死根癌农杆菌)。继续培养7d，将长出的转化子挑到含潮霉素培养基上进行筛选培养。将抗性菌转接到含药培养基上继续培养，提取基因组DNA，通过PCR扩增鉴定 T-DNA的拷贝数，获得转入Cry9E-like-01、Cry9E-like-02、Cry9E-like-03 核苷酸序列的菌体，分别命名为杀虫真菌-233-01、杀虫真菌-233-02、杀虫真菌-233-03。

实施例7：

将杀虫真菌-233-01、杀虫真菌-233-02、杀虫真菌-233-03的菌株分别涂布于PDA平板上，孢子粉生产方法与实施例3相同，分别收集孢子粉备用。取十个无菌培养皿，每个培养皿中放10头人工饲养的二化螟初孵幼虫，虫试培养皿加盖后，在温度26-28℃、相对湿度70％-80％、光周期(光/暗) 16：8的条件下放置3天，于第四天起每个培养皿每天喷洒5g孢子粉，连续喷洒5天后(D1、D2、D3、D4、D5)，从D2开始记录二化螟幼虫存活数量，喷洒杀虫真菌-233-01的共3个培养皿(Z1、Z2和Z3)，喷洒杀虫真菌-233-02的共3个培养皿(Z4、Z5和Z6)，喷洒杀虫真菌-233-03的共 3个培养皿(Z7、Z8和Z9)，无喷洒剂1个培养皿(CK)，结果如表1 所示。

表1、杀虫试验结果

表1的实验结果表明：杀虫真菌-233-01和杀虫真菌-233-03均对二化螟具有较好的杀虫效果。杀虫真菌-233-02杀虫效果一般，但对二化螟仍有一定杀虫作用。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> 一种生物源杀虫剂及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> Cry9E-like-01

<400> 1

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Ser Asn

1 5 10 15

Cys Gly Cys Ala Ser Asp Asp Val Val Gln Tyr Pro Leu Ala Arg Asp

20 25 30

Pro Asn Ala Val Phe Gln Asn Met His Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Thr

35 40 45

Tyr Asp Gly Asp Tyr Thr Gly Ser Phe Ile Asn Pro Asn Leu Ser Ile

50 55 60

Asn Pro Arg Asp Val Leu Gln Thr Gly Ile Asn Ile Val Gly Arg Leu

65 70 75 80

Leu Gly Phe Leu Gly Val Pro Phe Ala Gly Gln Leu Val Thr Phe Tyr

85 90 95

Thr Phe Leu Leu Asn Gln Leu Trp Pro Thr Asn Asp Asn Ala Val Trp

100 105 110

Glu Ala Phe Met Ala Gln Ile Glu Glu Leu Ile Asn Gln Arg Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Val Val Gly Thr Ala Ala Asp His Leu Thr Gly Leu His Asp

130 135 140

Asn Tyr Glu Leu Tyr Val Glu Ala Leu Glu Glu Trp Leu Glu Arg Pro

145 150 155 160

Asn Ala Ala Arg Thr Asn Leu Leu Phe Asn Arg Phe Thr Thr Leu Asp

165 170 175

Ser Leu Phe Thr Gln Phe Met Pro Ser Phe Gly Thr Gly Pro Gly Ser

180 185 190

Gln Asn Tyr Ala Val Pro Leu Leu Thr Val Tyr Ala Gln Ala Ala Asn

195 200 205

Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Glu Ile Tyr Gly Ala Arg Trp

210 215 220

Gly Leu Asn Gln Asn Gln Ile Asn Ser Phe His Thr Arg Gln Gln Glu

225 230 235 240

Arg Thr Gln Tyr Tyr Thr Asn His Cys Val Thr Thr Tyr Asn Thr Gly

245 250 255

Leu Asp Arg Leu Arg Gly Thr Asn Thr Glu Ser Trp Leu Asn Tyr His

260 265 270

Arg Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Val Ala Leu

275 280 285

Phe Pro Tyr Tyr Asn Val Arg Gln Tyr Pro Asn Gly Ala Asn Pro Gln

290 295 300

Leu Thr Arg Glu Ile Tyr Thr Asp Pro Ile Val Tyr Asn Pro Pro Ala

305 310 315 320

Asn Gln Gly Ile Cys Arg Arg Trp Gly Asn Asn Pro Tyr Asn Thr Phe

325 330 335

Ser Glu Leu Glu Asn Ala Phe Ile Arg Pro Pro His Leu Phe Asp Arg

340 345 350

Leu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asn Arg Tyr Thr Ala Pro Thr Thr

355 360 365

Asn Ser Tyr Leu Asp Tyr Trp Ser Gly His Thr Leu Gln Ser Gln Tyr

370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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645 650

<210> 2

<211> 645

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> Cry9E-like-02

<400> 2

Met Asn Arg Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Val Ile Asp Ala Ser Asn

1 5 10 15

Cys Gly Cys Ala Ser Asp Asp Val Val Gln Tyr Pro Leu Ala Arg Asp

20 25 30

Pro Asn Ala Val Phe Gln Asn Met His Tyr Lys Asp Tyr Leu Gln Thr

35 40 45

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50 55 60

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130 135 140

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145 150 155 160

Ala Ala Arg Thr Asn Leu Leu Phe Asn Arg Phe Thr Thr Leu Asp Ser

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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245 250 255

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275 280 285

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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Phe Gly Asn Leu Tyr Ala Asn Leu Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Asn Ile

420 425 430

Phe Pro Thr Gly Val Met Ser Glu Ile Thr Ser Ala Pro Asn Thr Cys

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Phe Asn Leu Leu Ser His Val Thr Leu Arg Phe Asn Thr Thr Gln Gly

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Gly Pro Leu Ala Thr Val Gly Phe Val Pro Thr Tyr Val Trp Thr Arg

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Lys Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asp Val Ile Arg Arg Thr Asn Thr

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Gly Gly Phe Gly Ala Ile Arg Val Ser Phe Thr Gly Pro Leu Gln Arg

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Tyr Arg Ile Arg Phe Arg Tyr Ala Ser Thr Ile Asp Phe Asp Phe Phe

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645

<210> 3

<211> 663

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> UNSURE

<223> Cry9E-like-03

<400> 3

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645 650 655

Ala Ala Arg Gln Ile Glu Asp

660

Claims

1.一种生物源杀虫剂，其特征在于，其包含对于害虫有杀虫或抗虫活性的活性成分。

2.根据权利要求1所述杀虫剂，其特征在于，所述活性成分为真菌，所述真菌为一种构巢曲霉，其分类命名为Aspergillus nidulans，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19901，保藏时间为2020年05月21，保藏地点为中国北京。

3.根据权利要求2所述杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂的靶标害虫为褐飞虱。

4.根据权利要求2所述杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂的靶标害虫为二化螟。

5.一种制备生物源杀虫剂的方法，其特征在于，以权利要求2所述真菌菌株作为菌种，接种到PDA液体培养基中，并置于摇床上于28℃下培养1天，制成菌丝液体种子，所述菌丝液体种子按照1/10(v/w)的比例接入经蒸汽湿热灭菌至适当熟度的稻米培养基上，在温度为25℃～30℃条件下培养5～7天，待米粒表面布满孢子后于33℃下鼓风烘干2天，将米粒上产出的孢子粉用200目标准筛过筛收集。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述生物源杀虫剂为所述真菌孢子和藜芦碱按照重量比2:5混合而成；所述真菌孢子在该杀虫剂中的含量为1×10⁷～1×10¹⁰孢子/克；所述藜芦碱为含藜芦总碱的纯净物。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述生物源杀虫剂还包括助剂，所述助剂包括但不限于石粉、粘土、草木灰、陶土、高岭土、硅藻土、活性白土、泥煤。