CN102241790B - 一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA，本发明通过点击化学反应和酰胺化反应将PAMAM基元和脱氧胆酸基元先后接枝到壳聚糖主链上，制备出PAMAM-Cs-DCA，该制备方法反应条件温和、高效、有选择性，本发明还公开了两亲性壳聚糖衍生物在制备抗癌药物载体中的应用，两亲性壳聚糖衍生物在水溶液中自组装形成以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳、DCA基元为疏水内核的纳米胶束。其内核可以包裹疏水抗癌药物，外壳可复合pDNA，从而实现药物和基因的共传递。两亲性壳聚糖衍生物独特的分子结构使其在基因治疗、药物控释和组织工程等领域具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子材料领域，具体涉及一种两亲性壳聚糖衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
目前，通过抗癌药物治疗癌症患者是临床研究的热点之一，但抗癌药物较大的副作用和多重抗药性限制了其临床应用，而使用基因治疗方法则可避免上述不足(Heike，Y.；Kasono，K.；Kunisaki，C.，et al.Int.J.Cancer，2001，92：115.)。由于肿瘤细胞扩散较快，单一的基因治疗方法难以达到长期有效的抑制，因此联合基因和药物治疗来抑制肿瘤细胞已成为新的研究方向。Bae等(Qiu，L.Y.；Bae，Y.H.Biomaterials，2007，28：4132.)将聚己内酯(PCL)接枝到聚乙烯亚胺(PEI)上合成一系列两亲性阳离子胶束，其胶束亲水外壳的PEI链段通过静电相互作用复合DNA，PCL链段聚集形成的内核通过疏水作用力包裹疏水药物，从而实现药物和基因的共传递。Zhang等(Zhu，J.；Cheng，H.；Jin，Y.；Cheng，S.；Zhang，X.；Zhuo，R.J.Mater.Chem，2008，18：4433.)合成聚乙二醇单甲醚-b-聚{N-[3-(二甲氨基)丙基]甲基丙烯酰胺-co-[2-羟乙基甲基丙烯酸酯-聚(3-己内酯)]}，通过自组装形成阳离子胶束实现药物和基因的共传递，并初步研究了两者的协同效应。目前这种基因和药物共传递体系在肿瘤治疗上已体现出巨大的潜力，但有关研究主要集中在合成聚合物类载体上，很少涉及天然高分子的改性研究。壳聚糖(chitosan，Cs)是一种安全无毒、生物相容性好的多聚阳离子，且免疫原性低、生物黏附性好，并具有独特的跨细胞膜运输能力，因此开发壳聚糖衍生物用作基因和药物共传递载体具有潜在的应用前景。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足，本发明首要目的在于提供一种两亲性壳聚糖衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，本发明通过点击化学反应和酰胺化反应将三代的含炔基聚酰胺-胺树枝状大分子基元(PAMAM基元)和脱氧胆酸(DCA)基元先后接枝到壳聚糖主链上，制备出两亲性壳聚糖衍生物，该制备方法反应条件温和、高效、有选择性。
本发明的第三个目的在于提供两亲性壳聚糖衍生物在制备抗癌药物载体中的应用，两亲性壳聚糖衍生物在水溶液中自组装形成以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳、DCA基元为疏水内核的纳米胶束。其内核可以包裹疏水抗癌药物，外壳可复合基质粒DNA(pDNA)，从而实现药物和基因的共传递。两亲性壳聚糖衍生物独特的分子结构使其在基因治疗、药物控释和组织工程等领域具有潜在应用价值。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA，其特征在于：所述的PAMAM-Cs-DCA以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳，脱氧胆酸基元为疏水内核，所述的壳聚糖的重均分子量为10000～14000，脱乙酰度为70～90％；所述的PAMAM基元的接枝率为10～20％，脱氧胆酸基元的接枝率为6～12％；
所述的PAMAM-Cs-DCA的分子式为：
所述的PAMAM基元的结构式为：
上述一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物的合成：
a氮气保护下，将壳聚糖溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，加入邻苯二甲酸酐，在100～120℃下搅拌反应8～10小时，反应结束后，冷却至25～30℃，用冰水沉淀，过滤，用甲醇洗涤，真空干燥，得到N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
b氮气保护下，将N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮中，搅拌溶解，在冰水浴中，加入N-溴代琥珀酰亚胺和三苯基膦，在70～80℃搅拌反应4～6小时，反应结束后，将产物离心，过滤，用丙酮洗涤，真空干燥，得到6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
c氮气保护下，将叠氮钠和6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮中，在60～80℃搅拌反应8～12小时，反应结束后，将产物过滤，用乙醇沉降，离心收集产物，并用丙酮洗涤，真空干燥，得到6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
d氮气保护下，将6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中，在90～100℃搅拌反应4～5小时，反应结束后，将反应产物用乙醇沉降，洗涤，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖；
e将6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于质量百分比1～3％的醋酸溶剂中，加入稀释溶剂乙醇，并滴入脱氧胆酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于乙醇形成的溶液，在25～30℃中搅拌反应24～28小时，反应结束后，使用乙醇和氨水混合溶剂沉淀产物，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物(6-N3-Cs-g-DCA)；
(2)PAMAM-Cs-DCA的合成：
将步骤(e)得到的6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物和PAMAM基元(PAMAM基元的制备方法按照中国专利CN 102002117A所述的方法进行)溶于二甲基亚砜(DMSO)与水的混合溶剂中得到反应液，搅拌充分溶解，氮气保护下，将五水硫酸铜与抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液中，升温到50～55℃并在氮气保护下搅拌反应24～28小时，反应结束后，将反应产物透析，过滤并冷冻干燥得到PAMAM-Cs-DCA。
步骤a中所述的N，N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95∶5～90∶10，壳聚糖溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为0.05～0.06g/ml，邻苯二甲酸酐溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为0.15～0.20g/ml。
步骤b中所述的N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖、N-溴代琥珀酰亚胺与三苯基膦的质量比为1∶(6～7)∶(10～12)，N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮形成的质量体积比浓度为10～20mg/ml。
步骤c中所述的6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖和叠氮钠的质量比为1∶(1.8～2.2)，6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮形成的质量体积比浓度为0.01～0.02g/mL。
步骤d中所述的混合溶剂中N-甲基-吡咯烷酮与一水合肼的体积比为1∶(1～1.2)，6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂形成的质量体积比浓度为5～6mg/mL。
步骤e中所述的6-叠氮-N-氨基-壳聚糖、脱氧胆酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1∶(3～4)∶(1～1.2)，6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于质量百分比1～3％的醋酸溶剂形成的质量体积比浓度为10～15mg/mL，稀释溶剂乙醇与质量百分比1～3％的醋酸的体积比为1∶(1～1.2)，脱氧胆酸溶于乙醇形成质量体积比浓度为310～430mg/mL，乙醇和氨水混合溶剂中乙醇与氨水的体积比为7∶3～8∶2。
步骤(2)中所述的二甲基亚砜与水的体积比为(5～6)∶1，6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为4～5mg/mL，PAMAM基元溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为100～150mg/ml，五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是1∶(2～2.5)，五水硫酸铜与抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液后五水硫酸铜与最终溶剂形成的质量体积比浓度为2.5～3mg/mL，透析条件为3000～5000Da透析袋透析36～60小时。
上述一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA在制备抗癌药物载体中的应用。
所述的抗癌药物是阿霉素，应用方法包括以下操作步骤：
将PAMAM-Cs-DCA溶于二甲基亚砜溶剂中，PAMAM-Cs-DCA质量浓度为5～6mg/mL，滴入由盐酸阿霉素及三乙胺溶于二甲基亚砜溶剂形成的混合溶液，混合溶液中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶(3～5)，盐酸阿霉素质量浓度为3～5mg/mL，PAMAM-Cs-DCA与盐酸阿霉素的质量比为(8～10)∶1，搅拌10～14小时，然后使用3000～5000Da透析袋在磷酸盐缓冲溶剂中透析12～36小时，透析结束后，用0.45μm过滤头过滤，得到以壳聚糖和PAMAM基元为亲水外壳、DCA为疏水内核，抗癌药物阿霉素被包裹在疏水内核中的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束。
本发明PAMAM-Cs-DCA的合成过程如下式所示：
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
(1)本发明制备的PAMAM-Cs-DCA所用原料之一壳聚糖是一种由甲壳素脱去乙酰基制得的天然高分子聚氨基多糖，来源十分丰富。
(2)本发明采用点击化学反应和酰胺化反应来制备PAMAM-Cs-DCA，不但其制备反应条件温和、易于实施，而且高效、具有选择性。
(3)本发明制备的PAMAM-Cs-DCA能在水中自组装形成以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳、DCA基元为疏水内核的纳米胶束。该胶束不仅能够包裹疏水抗癌药物，而且能同时复合基因，并在细胞中实现药物和基因的共传递，在生物医药领域具有潜在的应用价值。
附图说明
图1是实施例1制备的6-N3-Cs-g-DCA和PAMAM-Cs-DCA的1H NMR图谱(DMSO-d6，300MHz)，其中(a)为6-N3-Cs-g-DCA、(b)为PAMAM-Cs-DCA；
图2是通过动态光散射和透射电镜测试PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束的粒径大小和分布图；
图3是通过紫外光谱仪测试的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束在PBS(pH＝7.4和5.2)中的体外药物释放曲线；
图4琼脂糖凝胶电泳测试结果，其中1为pDNA，2-7分别为不同N/P值下(N/P比值是指阳离子聚合物中的NH4 +与pDNA中的PO3 -摩尔比例)的PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物(2-7分别代表N/P值为0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和20∶1)；
图5是通过流式细胞仪测试的不同N/P值下PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物在人肾上皮细胞中的转染效率(1-3分别代表N/P值为5∶1、10∶1、20∶1)；
图6是不同N/P值下PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物(a代表N/P值为5∶1；b代表N/P值为10∶1；c代表N/P值为20∶1)在人肾上皮细胞中转染48小时后的荧光照片。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 PAMAM-Cs-DCA的制备
(1)6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物的合成：
a氮气保护下，将3.0g壳聚糖(重均分子量为10000，脱乙酰度为70％)溶于60mLN，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中(95∶5，v/v)，加入9.0g邻苯二甲酸酐，在120℃下搅拌反应8小时，反应结束后，冷却至25℃，用冰水沉淀，过滤，将所得产物用甲醇三次洗涤，真空干燥后得到N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：80％。
b氮气保护下，将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL N-甲基-吡咯烷酮中，搅拌溶解，在冰水浴中，加入6.05g N-溴代琥珀酰亚胺和10.3g三苯基膦，升温到70℃并在氮气保护下磁力搅拌反应6小时(转速为600转/分钟)，反应结束后，将产物离心，过滤，用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：75％。
c氮气保护下，将1.0g 6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖和1.84g叠氮钠溶于100mL N-甲基-吡咯烷酮中，升温到80℃并在氮气保护下磁力搅拌反应8小时(转速为600转/分钟)，反应结束后，将产物过滤，用乙醇沉降，离心收集产物，并用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：90％。
d氮气保护下，0.6g 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中(1∶1，v/v)，完全溶解后，升温到100℃并在氮气保护下搅拌反应4小时，反应结束后，将反应产物用乙醇沉淀，三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖。
e取0.1g 6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于10mL质量浓度为1％的醋酸溶剂中，并加入8mL乙醇溶剂稀释，并滴入0.634g脱氧胆酸和0.083g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于2mL乙醇溶剂形成的溶液，在25℃中搅拌反应24小时，反应结束后，使用20mL乙醇和氨水混合溶液剂(体积比为7∶3)沉淀产物，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖与脱氧胆酸的接枝聚合物(6-N3-Cs-g-DCA)，产率为70％。
(2)PAMAM-Cs-DCA的合成：
取40mg 6-N3-Cs-g-DCA和1.0g三代含炔基PAMAM基元(PAMAM基元的制备方法按照中国专利CN 102002117A所述的方法进行)，溶于10mL DMSO与水的混合溶剂(DMSO与水的体积比为5∶1)中得到反应液，搅拌充分溶解，氮气保护下，取32mg五水硫酸铜溶与50mg抗坏血酸钠溶于1mL水中，滴入圆底烧瓶中，升温到50℃并在氮气保护下搅拌反应24小时，反应结束后，将反应产物用透析袋(3000Da)透析60小时，过滤，冷冻干燥得到PAMAM-Cs-DCA，产率为80％。
通过元素分析计算步骤(1)得到的产物6-N3-Cs-g-DCA中DCA基元的接枝率为11.4％，步骤(2)得到的产物的PAMAM-Cs-DCA中PAMAM基元的接枝率为11.6％。
得到的产物PAMAM-Cs-DCA以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳，DCA基元为疏水内核，PAMAM-Cs-DCA的分子式为：
实施例2 PAMAM-Cs-DCA的制备
(1)6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物的合成：
a氮气保护下，将3.0g壳聚糖(重均分子量为14000，脱乙酰度为90％)溶于50mL N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中(90∶10，v/v)，加入10g邻苯二甲酸酐，在100℃下搅拌反应10小时，反应结束后，冷却至室温25℃，用冰水沉淀，过滤，将所得产物用甲醇三次洗涤，真空干燥后得到N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：85％。
b氮气保护下，将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于50mL N-甲基-吡咯烷酮中，搅拌溶解，在冰水浴中，加入7.26g N-溴代琥珀酰亚胺和12.4g三苯基膦，升温到80℃并在氮气保护下磁力搅拌反应4小时(转速为1200转/分钟)，反应结束后，将产物离心，过滤，用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：78％。
c氮气保护下，将1.0g 6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖和2.21g叠氮钠溶于50mL N-甲基-吡咯烷酮中，升温到60℃并在氮气保护下磁力搅拌反应12小时(转速为1200转/分钟)，反应结束后，将产物过滤，用乙醇沉降，离心收集产物，并用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：92％。
d氮气保护下，0.5g 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中(1∶1.2，v/v)，完全溶解后，升温到90℃并在氮气保护下搅拌反应5小时，反应结束后，将反应产物用乙醇沉淀，三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖。
e取0.1g 6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于7mL质量浓度为3％的醋酸溶剂中，并加入7mL乙醇溶剂稀释，并滴入0.85g脱氧胆酸和0.104g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于2mL乙醇溶剂形成的溶液，在25℃中搅拌反应24小时，反应结束后，使用20mL乙醇和氨水混合溶液剂(体积比为8∶2)沉淀产物，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖与脱氧胆酸的接枝聚合物(6-N3-Cs-g-DCA)，产率为75％。
(2)PAMAM-Cs-DCA的合成：
取60mg 6-N3-Cs-g-DCA和1.8g PAMAM基元，溶于12mLDMSO与水的混合溶剂(DMSO与水的体积比为6∶1)中得到反应液，搅拌充分溶解，氮气保护下，取32mg五水硫酸铜与62.5mg抗坏血酸钠溶于1mL水中，滴入圆底烧瓶中，升温到50℃并在氮气保护下搅拌反应24小时，反应结束后，将反应产物用透析袋(5000Da)透析12小时，过滤，冷冻干燥得到PAMAM-Cs-DCA，产率为85％。
通过元素分析计算步骤(1)得到的产物6-N3-Cs-g-DCA中DCA基元的接枝率为6.6％，步骤(2)得到的产物的PAMAM-Cs-DCA中PAMAM基元的接枝率为13.8％。
得到的产物PAMAM-Cs-DCA以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳，DCA基元为疏水内核，PAMAM-Cs-DCA的分子式为：
实施例3 PAMAM-Cs-DCA的制备
(1)6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物的合成：
a氮气保护下，将3.2g壳聚糖(重均分子量为12000，脱乙酰度为80％)溶于60mL N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中(14∶1，v/v)，加入10g邻苯二甲酸酐，在110℃下搅拌反应9小时，反应结束后，冷却至30℃，用冰水沉淀，过滤，将所得产物用甲醇三次洗涤，真空干燥后得到N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：83％。
b氮气保护下，将1.0g N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于75mL N-甲基-吡咯烷酮中，搅拌溶解，在冰水浴中，加入6.50g N-溴代琥珀酰亚胺和11.0g三苯基膦，升温到75℃并在氮气保护下磁力搅拌反应5小时(转速为900转/分钟)，反应结束后，将产物离心，过滤，用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：75％。
c氮气保护下，将1.0g 6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖和2.0g叠氮钠溶于75mL N-甲基-吡咯烷酮中，升温到70℃并在氮气保护下磁力搅拌反应10小时(转速为900转/分钟)，反应结束后，将产物过滤，用乙醇沉降，离心收集产物，并用丙酮三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖，产率：90％。
d氮气保护下，0.55g 6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于100mL一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中(1∶1.1，v/v)，完全溶解后，升温到95℃并在氮气保护下搅拌反应4.5小时，反应结束后，将反应产物用乙醇沉淀，三次洗涤，真空干燥得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖。
e取0.1g 6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于8mL质量浓度为2％的醋酸溶剂中，并加入7.2mL乙醇溶剂稀释，并滴入0.79gDCA和0.091g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于2mL乙醇溶剂形成的溶液，在30℃中搅拌反应28小时，反应结束后，使用20mL乙醇和氨水混合溶液剂(体积比为3∶1)沉淀产物，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖与DCA的接枝聚合物(6-N3-Cs-g-DCA)，产率为70％。
(2)PAMAM-Cs-DCA的合成：
取50mg 6-N3-Cs-g-DCA和1.4g三代含炔基PAMAM基元(PAMAM的制备方法按照中国专利CN 102002117A所述的方法进行)，溶于11mL DMSO与水的混合溶剂(DMSO与水的体积比为5.5∶1)中得到反应液，搅拌充分溶解，氮气保护下，取32mg五水硫酸铜溶与55mg抗坏血酸钠溶于1mL水中，滴入圆底烧瓶中，升温到55℃并在氮气保护下搅拌反应28小时，反应结束后，将反应产物用透析袋(3500Da)透析48小时，过滤，冷冻干燥得到PAMAM-Cs-DCA，产率为80％。
通过元素分析计算步骤(1)得到的产物6-N3-Cs-g-DCA中DCA基元的接枝率为9％，步骤(2)得到的产物的PAMAM-Cs-DCA中PAMAM基元的接枝率为13％。
得到的产物PAMAM-Cs-DCA以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳，DCA基元为疏水内核，PAMAM-Cs-DCA的分子式为：
测试实施例4
将实施例1-3制备得到的6-N3-Cs-g-DCA溶于氘代DMSO中，进行氢谱核磁表征。结果如图1(a)所示：0.60ppm为DCA上18-CH3的质子共振信号，0.90ppm为DCA上19-CH3的质子共振信号，0.99ppm为DCA上21-CH3的质子共振信号，1.0-2.30ppm为DCA上其它甲基和亚甲基上的质子共振信号，3.0-5.0ppm为壳聚糖骨架链上质子共振信号。将实施例1-3制备得到的PAMAM-Cs-DCA溶于氘代DMSO中，进行氢谱核磁表征。结果如图1(b)所示：0.60ppm为DCA上18-CH3的质子共振信号，0.90ppm为DCA上19-CH3的质子共振信号，0.99ppm为DCA上21-CH3的质子共振信号，1-2.30ppm为DCA上其它甲基和亚甲基上的质子共振信号，2.30-3.30ppm处为PAMAM基元上的质子共振信号，3.30-5.0ppm为壳聚糖骨架链上质子共振信号。
实施例5 PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束的制备
将实施例1制备的20mg PAMAM-Cs-DCA溶于4mL DMSO溶剂中，滴入由2.6mg盐酸阿霉素及3.2μL三乙胺(盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶5)溶于0.8mL DMSO溶剂形成的混合溶液，并搅拌12小时，使用透析袋(3500Da)透析24小时，透析结束后，使用0.45μm的过滤头过滤，得到恒定浓度为1mg/mL的聚合物胶束溶液。所形成的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束以壳聚糖和PAMAM基元为亲水外壳、DCA基元为疏水内核，抗癌药物阿霉素被包裹在疏水内核中。通过动态光散射和透射电镜测定胶束的粒径大小和形态，结果如图2所示：动态光散射测试胶束的有效粒径为197.3nm，且粒径分布较窄；透射电镜测试表明负载药物的聚合物胶束为紧缩球形，粒径大约为170-180nm左右，符合动态光散射测试结果。
实施例6 PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束体外药物释放实验
将实施5制备的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束溶液装入3500Da的透析袋，置于45mL磷酸缓冲溶液中(PBS)释放液中(pH＝7.4或5.2)，在37℃的恒温水槽中震荡。每间隔一段时间(间隔时间见图3横坐标)精确取出3mL释放液，同时补加3mL PBS溶液。通过紫外光谱仪测试为484nm波长处的吸收峰强度，得到药物释放曲线。结果如图3所示：在pH值为7.4时，整个释放过程中药物释放速率，360小时后才释放了药物总量的10％左右，可能是因为亲水外壳PAMAM基元的枝状结构，阻碍了药物分子的扩散，导致释放速率。在pH值为5.2时，释放速率明显加快，但仍然保持稳定，在360小时释放了药物总量的20％左右，可能是因为在酸性条件下，PAMAM基元的胺基质子化，静电排斥作用导致亲水外壳的膨胀，使核内的药物分子容易扩散出来，导致释放速率加快。以上结果表明负载抗癌药物阿霉素的纳米胶束对具有良好的药物缓释能力，并且其药物释放速率随环境pH值的降低而变快。
实施例7 琼脂糖凝胶电泳测试
恒定0.5μg pDNA[质粒pEGFP-N1(4.7kb)，Invitrogen公司]，按照不同的N/P值(0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和20∶1)，加入实施例5制备的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束溶液，混合均匀后在37℃下静置30分钟，使其形成稳定的PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物。通过琼脂糖凝胶电泳测试裸pDNA及胶束复合pDNA的能力，裸pDNA在凝胶电泳中出现明显的迁移(见图4中的1)；pDNA在加入较少的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束(N/P为0.5∶1)时，部分pDNA未能被完全复合而向阳极做定向迁移(见图4中的2)；而当N/P大于或等于1∶1时，pDNA被完全复合而滞留在凝胶点样孔内(见图4中的3-7)，说明PAMAM-Cs-DCA-DOX具有较强的复合能力，能完全包裹pDNA并形成稳定的复合物达到保护的目的。
实施例8 体外转染实验
对数生长期的人肾上皮细胞(ATCC 827)按照1×105/孔种于24孔板内，培养液(DMEM，Invitrogen公司)终体积为500μl，将实施例5制备的PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束溶液与表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N1(4.7kb，Invitrogen公司)(2μg)按照不同的N/P值(5∶1、10∶1和20∶1)混合形成复合物，振荡10秒后分别加入各孔中。然后将细胞置于培养箱中，在37℃、5％CO2的环境下培养4小时，将培养液换掉，加入新鲜DMEM培养液继续培养44小时。在荧光显微镜(Olympus IX 100)下研究绿色荧光蛋白的表达情况，采用流式细胞仪(Accuri C6)分析样品的转染效率。
流式细胞仪测试结果如图5所示：PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物表现出良好的转染效果，其转染效率随N/P值的增加而增加；在N/P值为5∶1时，PAMAM-Cs-DCA-DOX/pDNA复合物的转染效率为27.65％；N/P值为10∶1时，转染效率为37％；N/P值为20∶1时，转染效率为48.65％。
荧光显微镜观察结果(如图6所示)与转染效率检测结果一致，随着复合物的N/P值增加，荧光表达的细胞数量逐渐增加。以上结果说明PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束能够有效地将pDNA导入细胞，并得到良好的表达。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA，其特征在于：所述的PAMAM-Cs-DCA以PAMAM基元和壳聚糖为亲水外壳，脱氧胆酸基元为疏水内核，所述的壳聚糖的重均分子量为10000～14000，脱乙酰度为70～90％；所述的PAMAM基元的接枝率为10～20％，脱氧胆酸基元的接枝率为6～12％；
所述的PAMAM-Cs-DCA的分子式为：
所述的PAMAM基元的结构式为：
2.权利要求1所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物的合成：
a氮气保护下，将壳聚糖溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，加入邻苯二甲酸酐，在100～120℃下搅拌反应8～10小时，反应结束后，冷却至25～30℃，用冰水沉淀，过滤，用甲醇洗涤，真空干燥，得到N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
b氮气保护下，将N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮中，搅拌溶解，在冰水浴中，加入N-溴代琥珀酰亚胺和三苯基膦，在70～80℃搅拌反应4～6小时，反应结束后，将产物离心，过滤，用丙酮洗涤，真空干燥，得到6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
c氮气保护下，将叠氮钠和6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮中，在60～80℃搅拌反应8～12小时，反应结束后，将产物过滤，用乙醇沉降，离心收集产物，并用丙酮洗涤，真空干燥，得到6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖；
d氮气保护下，将6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂中，在90～100℃搅拌反应4～5小时，反应结束后，将反应产物用乙醇沉降，洗涤，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖；
e将6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于质量百分比1～3％的醋酸溶剂中，加入稀释溶剂乙醇，并滴入脱氧胆酸和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于乙醇形成的溶液，在25～30℃中搅拌反应24～28小时，反应结束后，使用乙醇和氨水混合溶剂沉淀产物，真空干燥，得到6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物；
(2)PAMAM-Cs-DCA的合成：
将步骤(e)得到的6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物和PAMAM基元溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂中得到反应液，搅拌充分溶解，氮气保护下，将五水硫酸铜与抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液中，升温到50～55℃并在氮气保护下搅拌反应24～28小时，反应结束后，将反应产物透析，过滤并冷冻干燥得到PAMAM-Cs-DCA。
3.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤a中所述的N，N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95∶5～90∶10，壳聚糖溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为0.05～0.06g/ml，邻苯二甲酸酐溶于N，N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为0.15～0.20g/ml。
4.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤b中所述的N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖、N-溴代琥珀酰亚胺与三苯基膦的质量比为1∶(6～7)∶(10～12)，N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮形成的质量体积比浓度为10～20mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤c中所述的6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖和叠氮钠的质量比为1∶(1.8～2.2)，6-溴代-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于N-甲基-吡咯烷酮形成的质量体积比浓度为0.01～0.02g/mL。
6.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤d中所述的混合溶剂中N-甲基-吡咯烷酮与一水合肼的体积比为1∶(1～1.2)，6-叠氮-N-邻苯二甲酰胺基-壳聚糖溶于一水合肼与N-甲基-吡咯烷酮的混合溶剂形成的质量体积比浓度为5～6mg/mL。
7.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤e中所述的6-叠氮-N-氨基-壳聚糖、脱氧胆酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1∶(3～4)∶(1～1.2)，6-叠氮-N-氨基-壳聚糖溶于质量百分比1～3％的醋酸溶剂形成的质量体积比浓度为10～15mg/mL，稀释溶剂乙醇与质量百分比1～3％的醋酸的体积比为1∶(1～1.2)，脱氧胆酸溶于乙醇形成质量体积比浓度为310～430mg/mL，乙醇和氨水混合溶剂中乙醇与氨水的体积比为7∶3～8∶2。
8.根据权利要求2所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的二甲基亚砜与水的体积比为(5～6)∶1，6-叠氮-N-氨基-壳聚糖-g-脱氧胆酸接枝聚合物溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为4～5mg/mL，PAMAM基元溶于二甲基亚砜与水的混合溶剂形成的质量体积比浓度为100～150mg/ml，五水硫酸铜与抗坏血酸钠的摩尔比是1∶(2～2.5)，五水硫酸铜与抗坏血酸钠溶于水形成的混合溶液滴入反应液后五水硫酸铜与最终溶剂形成的质量体积比浓度为2.5～3mg/mL，透析条件为3000～5000Da透析袋透析36～60小时。
9.权利要求1所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA在制备抗癌药物载体中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种两亲性壳聚糖衍生物PAMAM-Cs-DCA在制备抗癌药物载体中的应用，其特征在于：所述的抗癌药物是阿霉素，应用方法包括以下操作步骤：
将PAMAM-Cs-DCA溶于二甲基亚砜溶剂中，PAMAM-Cs-DCA质量浓度为5～6mg/mL，滴入由盐酸阿霉素及三乙胺溶于二甲基亚砜溶剂形成的混合溶液，混合溶液中盐酸阿霉素与三乙胺的摩尔比为1∶(3～5)，盐酸阿霉素质量浓度为3～5mg/mL，PAMAM-Cs-DCA与盐酸阿霉素的质量比为(8～10)∶1，搅拌10～14小时，然后使用3000～5000Da透析袋在磷酸盐缓冲溶剂中透析12～36小时，透析结束后，用0.45μm过滤头过滤，得到PAMAM-Cs-DCA-DOX纳米胶束。
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