CN108201533A - 一种荷载小干扰rna的n-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种荷载小干扰RNA的N‑琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统及其制备方法和应用。所述的药物递送系统为N‑琥珀酰壳聚糖在水溶液中与化学合成的小干扰RNA自组装形成的带正电荷的纳米粒。本发明所述的荷载小干扰RNA的N‑琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统可在制备靶向治疗药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
自RNAi(RNA interference,RNAi)技术被发现以来，凭借其高效特异性被广泛应用于基因组功能、胚胎发育、抗病毒研究以及肿瘤的研究等领域。2002年报道合成的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)可以在培养的哺乳动物细胞中实现序列特异性的基因敲除。自首次成功运用siRNA的基因沉默作用对小鼠丙型肝炎进行治疗以来，研究者尝试将siRNA应用于各种疾病的治疗，包括肿瘤的基因治疗。
siRNA的作用原理为siRNA在细胞内能介导RNA干扰效应，通过识别与其序列互补的特异性mRNA致相关基因的沉默表达，作用高效、特异，是特异性抑制基因表达的强效方法，已成为临床许多疾病相关基因潜在的治疗手段，是一些疾病包括肿瘤基因治疗的新方法。
2008年12月Sun等(Nature 2001,411:494-498.)提出正义链和反义链长度不一致的不对称双链小干扰RNA(asymmetric interfering RNA，asiRNA，aiRNA)可以更加有效地使哺乳细胞中相应的靶基因沉默。与siRNA相比，aiRNA介导的基因沉默方式更持久、有效，其结构更稳定，且可以降低正义链的脱靶效应。
上述化学合成的小干扰RNA，无论是化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰分子(siRNA)，化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰分子(asiRNA，aiRNA)，均带有高负电荷，在进行静脉全身给药治疗时存在剂量高、稳定性不长等问题。其中，稳定性是主要问题。
自二十世纪九十年代初基因治疗首例临床试验获得成功后，人们对基因治疗的未来发展充满信心。虽然基因传递效率通过病毒载体递送将达到90％以上，但是仍然存在许多局限性难以被克服，如逆转录病毒不能对非分裂细胞进行感染；腺病毒不能在宿主细胞的基因组内稳定存在，故长期表达的稳定性难以保证，甚至可能导致机体产生强烈的免疫排斥；腺相关病毒载体的基因片段容量低，难以载较长的基因片段且不易制备。因而研究者把研究焦点集中于无免疫原性并且安全无毒的非病毒载体上。
传统的非病毒载体如脂质体，阳离子聚合物，虽然安全但基因转移的效率是非常低的，很难获得一个有意义的基因表达调控。因此，开发一种安全、有效并具有优良特性的非病毒基因递送载体成为了基因治疗研究的关键点。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中带有负电荷的小干扰RNA分子siRNA、aiRNA基因药物在进行静脉全身给药治疗时存在剂量高、转染细胞效率低等问题，提供一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统。
本发明的另一目的是提供该药物递送系统的制备方法。
本发明的又一目的是提供该药物递送系统的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，包括N-琥珀酰壳聚糖及其荷载的小干扰RNA。
所述的药物递送系统优选为N-琥珀酰壳聚糖在水溶液中与化学合成的小干扰RNA自组装形成的带正电荷的纳米粒。
所述的纳米粒粒径分布在189～258nm，纳米粒表面Zeta电位+8～+18mv；载药纳米粒呈不规则球状。
所述的小干扰RNA选自化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰分子，或者化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰分子。
所述的两条链对称的小核酸干扰分子优选正义链与反义链长度一致，能抑制目的基因表达，长度为19-25nt的双链配对的siRNA，每条链3’端含有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂。
所述的两条链配对不对称的小核酸干扰分子优选从靶基因对称性小干扰RNA分子siRNA出发，通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁剪1-5nt碱基，形成两条链碱基长度不一致，每条链3’端有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子aiRNA。
所述的化学修饰优选胆固醇修饰。
本发明所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统的制备方法，包括N-琥珀酰壳聚糖在水溶液中与化学合成的小干扰RNA通过自组装形成带正电荷的纳米粒。
所述的制备方法优选包括如下步骤：
(1)间歇式浓碱法对壳聚糖进行乙酰基的脱除，制备得到高脱乙酰度壳聚糖，采用双氧水氧化降解法对高脱乙酰度壳聚糖进行降解，搅拌反应20-30min，获得相对低分子质量壳聚糖，其粘均分子量4400～21000道尔顿；以低相对分子质量壳聚糖和丁二酸酐反应，采用乙酸/丙酮体系，室温下合成N-琥珀酰壳聚糖，所制备的N-琥珀酰壳聚糖取代度为0.58；
(2)取N-琥珀酰壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，配制成5mg/mL的N-琥珀酰壳聚糖溶液，经#3砂芯漏斗初滤，取滤液与aiRNA或siRNA溶液混合放入50-55℃恒温水浴，保温10-15min即得所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统。以50μL aiRNA或siRNA溶液和500μL N-琥珀酰壳聚糖溶液定义为制备比例为1:1的包载aiRNA或siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒。
本发明所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统在制备靶向治疗药物中的应用，优选在制备抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。
有益效果：
本发明对壳聚糖进行改性，得到的N-琥珀酰壳聚糖，通过自组装方式与小干扰RNA形成N-琥珀酰壳聚糖纳米粒。与现有技术相比具有以下特点：
1、本发明采用的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒表面Zeta电位均大于+8mv，为阳离子药物载体递送系统，具有无细胞毒性、生物相容性及生物可降解性等优秀的潜质，制备反应条件温和，增加药物在体内的滞留时间，缓释作用明显，纳米粒可被肿瘤细胞吞噬，其递送的小干扰RNA在细胞内具有使靶向基因沉默的作用，在肿瘤治疗中将有积极作用。
2、本发明制备的纳米粒形态呈类球形，粒径分布均匀，在水中分散性良好，药物包封率高。
3、本发明制备的无细胞毒性的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，由于N-琥珀酰壳聚糖对肿瘤细胞的亲和性和抑制细胞增殖的作用，可通过与小干扰RNA的协同作用，使包载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒具有更强的抗肿瘤作用。
附图说明
图1为本发明实施例提供的低相对分子质量壳聚糖(曲线a)和N-琥珀酰壳聚糖(曲线b)的红外图谱
图2为本发明实施例提供的N-琥珀酰壳聚糖的1H-NMR图谱
图3为本发明实施例提供的不同配比的N-琥珀酰壳聚糖与VEGF-aiRNA形成的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒载药量琼脂糖电泳图
图4为荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)粒径分布图(a:荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒b:荷载VEGF-siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒)
图5为荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)的透射电镜图(a:荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒b:荷载VEGF-siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒)
图6a、b、c分别为H460、MCF-7、A549肿瘤细胞对制备的N-琥珀酰壳聚糖的摄取率，d、e、f分别为H460、MCF-7、A549肿瘤细胞与FITC-NSC 37℃共培养72h后荧光显微镜照片(×200)
图7a为荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)对H460细胞增值抑制率(n＝6)；b为荷载Bcl2-siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)对H460细胞增值抑制率(n＝6)
图8为流式细胞检测荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)作用于H460细胞的凋亡状况
图9为荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)作用于H460细胞后细胞上清液和细胞内VEGF蛋白表达情况(n＝6)
图10为荷载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒(1:1)对H460细胞VEGF基因表达变化情况(n＝3)
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明做进一步的说明。实施例中涉及的小干扰RNA序列仅仅是为了说明本发明的技术方案和效果所举的例子，不应以此来局限本发明的保护范围。凡荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒均属于本发明保护范围内，能够解决本发明想要解决的技术问题，实现本发明的有益效果。
实施例1：
(1)称取5g原料壳聚糖置于250mL圆底烧瓶中，加入10M NaOH 50mL,搅拌均匀，110℃间歇水解3小时(水解1小时后，冷却至常温，将产品用蒸馏水洗至中性，布氏漏斗接真空泵抽干，再转移至圆底烧瓶中，按之前相同条件反应，往复2次)，将所得白色的沉淀用蒸馏水洗至中性，再分别用无水乙醇和无水乙酸抽滤三次，60℃真空干燥得到高脱乙酰壳聚糖。
(2)取2g的高脱乙酰壳聚糖溶于100mL 2％的乙酸溶液中，待温度达到60℃后缓慢加入6mL双氧水，搅拌反应20min。用稀氧氧化钠溶液中和至弱碱性时有大量白色沉淀产生，继续滴加1或2滴，再用蒸馏水洗涤至中性，无水乙醇、乙醚抽滤三次，真空干燥得淡黄色粉末状固体即为低相对分子质量壳聚糖。
(3)称取1g降解20min的低相对分子质量壳聚糖，溶于l0ml 2％乙酸溶液中。待完全溶解后,加20mL无水乙醇沉淀，再加入吡啶8mL，取2g琥珀酸酐溶于30ml丙酮溶液中，慢慢滴入反应体系，室温下磁力搅拌反应4小时，抽滤收集沉淀物，用丙酮洗涤沉淀，60℃真空干燥得到N-琥珀酰壳聚糖。
红外和核磁表征图谱分别见图1和图2。
红外图谱明显的变化是在1400～1700cm-1之间。与a曲线相比，b曲线在1652、1557和1403cm-1附近出现了强的吸收带。红外图谱上没有出现位于1720～1750cm-1的吸收带，说明酰化反应发生在N-位上；壳聚糖的分子中位于1585cm-1的NH2吸收带，在发生琥珀酰化后消失，出现了位于1652cm-1处的酰胺Ⅰ带和1557cm-1处的酰胺Ⅱ带，这进一步佐证了在壳聚糖的分子中形成了NH-CO结构。1403cm-1处是羧基的对称振动吸收带，该吸收带也随取代度增大而增强。综上所述，壳聚糖与丁二酸酐反应后，在壳聚糖的重复单元上引入了琥珀酰基，此酰化反应是N-位取代。
由图2可知，琥珀酰基的四个质子氢在δ(2.0-3.0)之间，和壳聚糖的基本骨架峰有部分重叠，谱图中各质子共振吸收峰的归属如下：H1(δ＝2.468)为-NH(CO)CH3的甲基质子吸收峰；H2(δ＝2.361)为-NH(CO)-CH2的亚甲基质子吸收峰；H3(δ＝2.548)为-CH2-COONa的亚甲基质子吸收峰；H4(δ＝2.867)为氨基葡萄糖单元C2上的次甲基质子吸收峰；2.257-3.663对应Ⅳ-酰化氨基葡萄糖单元的质子H4以及单糖单元的质子H5、H6和H7的共振吸收，其中部分有重叠。制备得到的N-琥珀酰壳聚糖，经核磁表征，从1H-NMR谱图分析得到N-琥珀酰壳聚糖的取代度为0.58，经热失重分析，N-琥珀酰壳聚糖的热分解温度是256℃。
实施例2
VEGF-siRNA为化学合成的胆固醇修饰的靶向血管内皮生长因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)的对称siRNA(序列为：正义链’chol-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA dTdT 3’，反义链为3’dTdTUACACUUACGUCUGGUUUCUU 5’)，将合成的VEGF-siRNA粉末用DEPC水溶解，配成20μM；VEGF-aiRNA为化学合成的胆固醇修饰的靶向血管内皮生长因子的不对称aiRNA(序列为：正义链’chol-GUGAAUGCAGACCAAAGAAdTdT 3’，反义链为3’dTdTUACACUUACGUCUGGUUUCUU 5’)，将合成的VEGF-aiRNA粉末用DEPC水溶解，配成20μM。(其中，chol-表示胆固醇修饰)；Bcl2-siRNA(序列为：正义链’chol-CGGAGGCUGGGAUGCCUUUdTdT 3’,反义链3’dTdTGCCUCCGACCCUACGGAAA 5’)将合成的Bcl2-siRNA粉末用DEPC水溶解，配成20μM。
实施例3
称取250mg N-琥珀酰壳聚糖溶于50mL 2％乙酸溶液中，配制成5mg/mL的N-琥珀酰壳聚糖溶液，经#3砂芯漏斗初滤，得到无杂质的澄清溶液。取经过0.22μm过滤的N-琥珀酰壳聚糖溶液500μL和20μM小干扰RNA溶液50μL混合放入55℃恒温水浴，保温10min，混合后体积约为550μL。混合液4℃冰箱放置备用。以50μL小干扰RNA溶液和500μL N-琥珀酰壳聚糖溶液作为制备比例为1:1的包载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒。再分别制备小干扰RNA溶液与N-琥珀酰壳聚糖比例为4:1、3:1、2:1、1:2、1:3、1:4的纳米粒。通过琼脂糖凝胶电泳试验判断N-琥珀酰壳聚糖包载aiRNA的情况。结果如图3所示，体积比为4:1和3:1的纳米粒对VEGF-aiRNA的包载并不完全，未包载的aiRNA顺着凝胶由负极向正极移动；体积比为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4的纳米粒对VEGF-aiRNA的包封率很高，与EB结合的VEGF-aiRNA的荧光集中在加样孔中。
其中1：1的纳米粒粒径分布见图4，测量的纳米粒粒径数据分布在200nm附近，粒径较小，同时测量的PDI为0.283；电位分析仪测得表面Zeta电位均大于+8mv，载药纳米粒系统稳定；透射电镜照片见图5，包载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒呈不规则球状，粒径分布均匀，粒子独立分散排列，且团聚现象不明显，这和纳米粒的表面带有正电荷有关；通过高速离心后紫外吸光光度法测得N-琥珀酰壳聚糖纳米粒的包封率达到95.28％，载药性能良好。
实施例4
对按本发明实施例1制备的N-琥珀酰壳聚糖作如下实验：
取对数生长期的细胞,0.25％胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。以96孔板每孔2×104个/mL个接种细胞,做6个复孔,待24h细胞贴壁后，吸弃孔内培养基，冰PBS洗2次，随后加入细胞裂解液，冰上裂解5min后，吹打均匀。再加入荧光素标记的琥珀酰壳聚糖，分别依次加入使终浓度为2.5μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、7.5μg/mL、10μg/mL和12.5μg/mL的FITC-NSC,在λexc＝485nm，λemi＝535nm下测定荧光强度，绘制标准曲线。(Min Huang,PharmaceuticalResearch,Vol.19,No.10,October 2002)
取对数生长期的肿瘤细胞，0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液。以96孔板每孔细胞浓度为2×104个/mL进行细胞接种，待24h后细胞贴壁后开始转染。
实验组：荧光标记的N-琥珀酰壳聚糖溶液(5mg/mL，pH＝5.5)用培养液稀释至每孔浓度为75μg/mL、125μg/mL和200μg/mL，并设置空白对照组。每组六个复孔。分别在培养24h，48h，72h后，将96孔细胞培养板从培养箱中取出，在超净工作台上，将实验组及对照组孔内的培养基吸弃，用冰PBS洗细胞3次。每孔加20μL RIPA细胞裂解液，冰上裂解5min，并吹打均匀。酶标仪检测荧光强度(λex＝485nm，λem＝535nm)，对照标准曲线得到细胞对FITC-NSC摄取量。N-琥珀酰壳聚糖对肿瘤细胞的亲和能力是通过其摄取率表示的，摄取率＝每孔实际摄取FITC-NSC量/每孔预加FITC-NSC量。
从图6中可以看出，肿瘤细胞对N-琥珀酰壳聚糖的摄取率与共孵育时间及N-琥珀酰壳聚糖溶液浓度成正相关。其中，H460与N-琥珀酰壳聚糖共孵育72h后的摄取率最高，达到了12.819％。
实施例5
对按本发明实施例3制备的包载VEGF-aiRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒，作如下实验：(1)取对数生长期的H460细胞，0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液。(2)取对数生长期的H460细胞，以96孔板每孔细胞浓度2×104个/mL接种细胞，待24h细胞贴壁后开始转染。设N-琥珀酰壳聚糖载靶向VEGF的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(VEGF)-NPs)实验组，NSC(Blank)组、aiRNA-Lipofectamine2000组和N-琥珀酰壳聚糖载非相关基因的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(NC)-NPs)对照组，只加培养基的空白组，各组设6个复孔，aiRNA-Lipofectamine2000组和NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组中aiRNA浓度相同，共孵育48h，72h后，每孔加5mg/mL的MTT溶液20μL，4h后，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜，置于震荡机上100r/min轻度震荡10min，于490nm波长测定吸光度。计算各实验组对细胞的增殖抑制率，用SPSS18.0分析实验结果，结果见图7a。
通过MTT法检测各组实验对H460肿瘤细胞的增殖抑制，实验数据表明，NSC(Blank)组和NSC-aiRNA(NC)-NPs组由于N-琥珀酰壳聚糖自身的抗肿瘤作用，对H460肿瘤细胞的增殖具有抑制效果；转染72h，NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组对H460的增殖抑制率最高达到58.94％，这可能是由于RNAi与N-琥珀酰壳聚糖抗肿瘤作用同时对H460细胞增殖抑制产生协同作用的结果。
实施例6
对按本发明实施例3制备的包载Bcl2-siRNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒，作如下实验：
(1)取对数生长期的MCF-7细胞，0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液。(2)取对数生长期的MCF-7细胞，以96孔板每孔细胞浓度2×104个/mL接种细胞，待24h细胞贴壁后开始转染。设N-琥珀酰壳聚糖载靶向Bcl2的siRNA纳米粒(NSC-siRNA(Bcl2)-NPs)实验组，NSC(Blank)组、siRNA-Lipofectamine2000和N-琥珀酰壳聚糖载非相关基因的asRNA纳米粒(NSC-aiRNA(NC)-NPs)对照组，只加培养基的空白组，各组设6个复孔，siRNA-Lipofectamine2000组和NSC-siRNA(Bcl2)-NPs组中siRNA浓度相同，共孵育48h，72h后，每孔加5mg/mL的MTT溶液20μL，4h后，吸弃孔内上清液，每孔加150μL二甲基亚砜，置于震荡机上100r/min轻度震荡10min，于490nm波长测定吸光度。计算各实验组对细胞的增殖抑制率，用SPSS18.0分析实验结果，结果见图7b。
通过MTT法检测各组实验对MCF-7肿瘤细胞的增殖抑制，实验数据表明，NSC(Blank)和NSC-siRNA(NC)-NPs组由于N-琥珀酰壳聚糖自身的抗肿瘤作用，对H460肿瘤细胞的增殖具有抑制效果；转染72h，NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组对MCF-7的增殖抑制率最高达到56.97％，这可能是由于RNAi治疗与N-琥珀酰壳聚糖抗肿瘤作用同时对MCF-7细胞增殖抑制产生协同作用的结果。
实施例7
按照实施例5中的方法至共孵育48h，72h，实验设N-琥珀酰壳聚糖载靶向VEGF的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(VEGF)-NPs)实验组，aiRNA-Lipofectamine2000组和N-琥珀酰壳聚糖载非相关基因的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(NC)-NPs)对照组，只加培养基的空白组，将细胞消化，上流式细胞仪检测。
H460细胞凋亡率如图8所示，NSC-aiRNA(VEGF)-NPs对H460细胞的凋亡作用比脂质体Lipofectamine2000载体更强，与未给药的空白对照组相比具有完全的统计学意义，且与前述的MTT检测结果基本吻合。72h时，NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组中H460细胞的凋亡率为约52.02％，其中晚期细胞凋亡率达到15％以上，各项指标较脂质体Lipofectamine2000载体对照组均有较大的差值。
实施例8
按照实施例5中的方法至共孵育72h，实验设N-琥珀酰壳聚糖载靶向VEGF的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(VEGF)-NPs)实验组，aiRNA-Lipofectamine2000组和N-琥珀酰壳聚糖载非相关基因的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(NC)-NPs)对照组，只有正常培养基的细胞空白对照组。按照人VEGF检测ELISA试剂盒说明书，分别检测各组细胞上清液及细胞内VEGF蛋白的浓度。
H460细胞上清液和细胞内VEGF蛋白表达抑制率结果如图9所示，三个实验组对H460细胞VEGF蛋白表达的抑制程度强弱顺序为NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组>Lipofectamine2000组>NSC-aiRNA(NC)-NPs组，说明此递送系统可将荷载的靶向VEGF基因aiRNA送至肿瘤细胞内，并特异性抑制细胞中VEGF蛋白表达。
实施例9
取对数生长期的H460细胞细胞，0.25％的胰酶消化，制成单细胞悬液后，接种于6孔细胞培养板(每孔细胞浓度1×106个/mL),待24h细胞贴壁后开始转染。设N-琥珀酰壳聚糖载靶向VEGF的aiRNA纳米粒(NSC-aiRNA(VEGF)-NPs)实验组，aiRNA-Lipofectamine2000对照组，各组设3个复孔，aiRNA-Lipofectamine2000和NSC-aiRNA(VEGF)-NPs组中aiRNA浓度相同，共孵育48h，72h后，按照总RNA提取试剂Trizol说明书收集转染48h，72h后的细胞的RNA，扩增VEGF基因上游引物序列为：5’-GGGCAGAATCATCACGAAGT-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为：5’-TGGTGATGTTGGACTCCTCA-3’(SEQ ID NO.2)，扩增内参照β-actin基因的上游引物序列为：5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为：5’-GCCGATCCACACGGAGTACT-3’(SEQ ID NO.4)，在一个总体积为10μL的反应体系，同时加入两对引物VEGF和β-actin，总RNA模板加4mg，逆转录条件为42℃，60min和75℃，5min。PCR反应条件为95℃预变性2min，循环参数为95℃15s，60℃1min，40个循环，反应结束后，使用2-ΔΔCt分析法对实验数据进行处理，ΔCt值为所测目的基因Ct值与对应样品的β-actin Ct值的差值，ΔΔCt为不同实验组的ΔCt与对照组ΔCt值的差值，其相对含量2-ΔΔCt即为各实验组相对于阴性对照组的细胞内mRNA表达的变化水平，因此，可相对确定VEGF基因表达状况的变化。计算公式如下：
CT，VEGF，CT，Actin为VEGF基因及β-actin基因的CT值，Time,0为空白组，Time,X为实验组
H460细胞VEGF基因的表达水平如图10所示，不论以N-琥珀酰壳聚糖纳米粒还是脂质体Lipofectamine2000为载体，进行aiRNA转染，都对H460细胞的VEGF基因转录产生了影响，且随着共孵育时间的增加，RNAi对H460细胞VEGF基因转录后mRNA水平的降低作用就越明显，以N-琥珀酰壳聚糖纳米粒为aiRNA递送系统转染细胞72h后，其显著降低肿瘤细胞中的VEGF的mRNA水平，仅为空白组的0.328倍，提示此递送系统可将荷载的靶向VEGF基因的aiRNA送至肿瘤细胞内，特异性降解mRNA，从而调节细胞基因靶向基因的表达。
<110> 南京理工大学
<120> 一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统及其制备方法和应用
<160> 4
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGF基因上游引物序列
<400> 1
gggcagaatc atcacgaagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> VEGF基因下游引物序列
<400> 2
tggtgatgtt ggactcctca 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增内参照β- actin基因的上游引物序列
<400> 3
cctggcaccc agcacaat 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 扩增内参照β- actin基因的下游引物序列
<400> 4
gccgatccac acggagtact 20
序列表
2
Claims (10)
1.一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于包括N-琥珀酰壳聚糖及其荷载的小干扰RNA。
2.根据权利要求1所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于所述的药物递送系统为N-琥珀酰壳聚糖在水溶液中与化学合成的小干扰RNA自组装形成的带正电荷的纳米粒。
3.根据权利要求1所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于纳米粒粒径分布在189～258nm，纳米粒表面Zeta电位+8～+18mv；载药纳米粒呈不规则球状。
4.根据权利要求1所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于所述的小干扰RNA选自化学修饰或不修饰的两条链对称的小核酸干扰分子，或者化学修饰或不修饰的两条链配对不对称的小核酸干扰分子。
5.根据权利要求4所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于所述的两条链对称的小核酸干扰分子为正义链与反义链长度一致，能抑制目的基因表达，长度为19-25nt的双链配对的siRNA，每条链3’端含有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂。
6.根据权利要求4所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于所述的两条链配对不对称的小核酸干扰分子是从靶基因对称性小干扰RNA分子siRNA出发，通过将siRNA正义链或反义链5’或3’端裁剪1-5nt碱基，形成两条链碱基长度不一致，每条链3’端有2-4个UU碱基或脱氧核糖核酸dTdT呈单链悬挂，具有14-21nt的能诱发RNA干扰的双链不对称小核酸干扰分子aiRNA。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的一种荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统，其特征在于所述的化学修饰为胆固醇修饰的小干扰RNA。
8.权利要求1～6中任一项所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统的制备方法，其特征在于包括N-琥珀酰壳聚糖在水溶液中与化学合成的小干扰RNA通过自组装形成带正电荷的纳米粒。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)间歇式浓碱法对壳聚糖进行乙酰基的脱除，制备得到高脱乙酰度壳聚糖，采用双氧水氧化降解法对高脱乙酰度壳聚糖进行降解，搅拌反应20-30min，获得相对低分子质量壳聚糖，其粘均分子量4400～21000道尔顿；以低相对分子质量壳聚糖和丁二酸酐反应，采用乙酸/丙酮体系，室温下合成N-琥珀酰壳聚糖，所制备的N-琥珀酰壳聚糖取代度为0.58；
(2)取N-琥珀酰壳聚糖溶于2％乙酸溶液中，配制成5mg/mL的N-琥珀酰壳聚糖溶液，经#3砂芯漏斗初滤，取滤液与aiRNA或siRNA溶液混合放入50-55℃恒温水浴，保温10-15min即得所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统。
10.权利要求1所述的荷载小干扰RNA的N-琥珀酰壳聚糖纳米粒药物递送系统在制备靶向治疗药物中的应用；优选在制备抗肿瘤靶向治疗药物中的应用。
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