CN114316086A - 改性琥珀酰壳聚糖、载药纳米颗粒及其制备靶向肝癌细胞药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了改性琥珀酰壳聚糖、载药纳米颗粒及其制备靶向肝癌细胞药物中的应用。该改性琥珀酰壳聚糖具有如式II～XI所示的分子结构。通过同时引入长链烷基和具有双羟基的氨基酸，由此使得制得的改性琥珀酰壳聚糖同时具有亲水、疏水等性能，由此表现出对索拉非尼的高效包封，并且有利于其缓释和热稳定。另外，本申请还通过体外细胞试验和肝癌荷瘤小鼠体内试验证实了由该类改性琥珀酰壳聚糖制得的载药纳米颗粒对于肝癌细胞的靶向性，并能够有效减少荷瘤小鼠肝脏肿瘤体积，起到真正抗肿瘤作用。

Description

改性琥珀酰壳聚糖、载药纳米颗粒及其制备靶向肝癌细胞药 物中的应用

技术领域

本申请涉及改性壳聚糖技术领域，尤其涉及改性琥珀酰壳聚糖、载药纳米颗粒及其制备靶向肝癌细胞药物中的应用。

背景技术

壳聚糖及其衍生物具有无毒、良好的生物相溶性和可生物降解性以及在体内保留时间长等优点，近年来在医药领域已被广泛用于聚合物药物载体研究。由于壳聚糖的侧链上具有氨基，赋予其可与琥珀酸酐反应，在氨基葡萄糖单元的N端引入羧基可望实现对壳聚糖性能的有效。

然而，琥珀酰基的改造并不能有效满足壳聚糖作为一种药物载体的需要，比如如何提高其作为一种药物载体对药物的包封效果、靶向效果、释放效果等。

发明内容

有鉴于此，本申请的目的在于提供一种改性琥珀酰壳聚糖，以一定程度上解决上述技术问题之一。

第一方面，本申请实施例公开了一种改性琥珀酰壳聚糖，具有

任一项所示的分子结构；

式II～式XI中，A+B+C+D＝100％。

在本申请实施例的改性琥珀酰壳聚糖分子结构中，A代表壳聚糖的琥珀酰基取代度，B代表壳聚糖的烷基化取代度，D代表乙酰基取代度。

在本申请实施例的改性琥珀酰壳聚糖分子结构中，A＝0.21～0.31，B＝0.11～0.18，D＝0.1。

第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的改性琥珀酰壳聚糖的制备方法，包括以下步骤：

获得乙酰基取代度不大于0.1的壳聚糖；

获得以所述的壳聚糖制得的琥珀酰基化壳聚糖；

获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖，所述烷基-琥珀酰基化壳聚糖是由琥珀酰基化壳聚糖与3-氧代月桂醛进行反应得到；

获得改性琥珀酰壳聚糖，所述改性琥珀酰壳聚糖是由所述烷基-琥珀酰基化壳聚糖与天冬氨酸或谷氨酸反应得到。

在本申请实施例中，获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖的步骤中，琥珀酰壳聚糖与3-氧代月桂醛反应的反应摩尔比为1:(2～7)，反应时长为14～18h。

在本申请实施例中，获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖的步骤中，所述琥珀酰壳聚糖的乙酰基取代度不大于0.1，琥珀酰基取代度为0.21～0.31。

在本申请实施例中，获得改性琥珀酰壳聚糖的步骤中，天冬氨酸或谷氨酸与烷基-琥珀酰基化壳聚糖的反应摩尔比例为(13.3～32.3):1。

第三方面，一种由第一方面所述的改性琥珀酰壳聚糖自组装得到的载药纳米颗粒。

在本申请实施例提供的载药纳米颗粒中，还包括负载的索拉非尼。

第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的改性琥珀酰壳聚糖、第二方面所述的制备方法制得的改性琥珀酰壳聚糖、或第三方面所述的载药纳米颗粒在制备靶向肝癌细胞药物中的应用。

与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：

本申请以经过充分脱乙酰化的壳聚糖为基础，先后进行琥珀酰化、烷基化和氨基酸化，由此制得了一类同时具有琥铂酸基、烷基和氨基酸的改性壳聚糖，其分子结构如式II～XI所示。

并且，本申请在制备该类改性琥珀酰壳聚糖的过程中，使用了具有碳链的3-氧代月桂醛进行烷基化，并使用具有双羟基的氨基酸对其进行氨基酸化，由此使得制得的改性琥珀酰壳聚糖同时具有亲水、疏水等性能，由此表现出对索拉非尼的高效包封，并且有利于其缓释和热稳定。

另外，本申请还通过体外细胞试验和肝癌荷瘤小鼠体内试验证实了由该类改性琥珀酰壳聚糖制得的载药纳米颗粒对于肝癌细胞的靶向性，并能够有效减少荷瘤小鼠肝脏肿瘤体积，起到真正抗肿瘤作用。

附图说明

图1为本申请实施例1提供的壳聚糖、化合物H1、化合物H2的红外图谱。

图2为本申请实施例1提供的化合物H3(Glu制备)、化合物H3(Asp制备)的红外图谱。

图3为本申请实施例1～6提供的载药纳米颗粒的索拉非尼释药曲线。

图4为本申请对比例1～7提供的载药纳米颗粒的索拉非尼释药曲线。

图5为本申请实施例1提供的载药纳米颗粒对MCF-7细胞靶向作用结果。

图6为本申请实施例1提供的载药纳米颗粒对HepG2细胞靶向作用结果。

图7为本申请实施例1提供的载药纳米颗粒对BERH-2细胞靶向作用结果。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

改性琥珀酰壳聚糖的合成

1、壳聚糖的降解及脱乙酰化

一个具体的降解及脱乙酰化的实施过程为：称取5.0g壳聚糖(食品级壳聚糖，15～30万分子量，脱乙酰化度≧70％，南京熙美诺生物科技有限公司)加入到500mL 1％甲酸溶液中，搅拌使之溶解过滤，向滤液中按照壳聚糖重量的5wt％的10wt％的双氧水溶液进行氧化反应，同时向反应溶液中通入臭氧，流量为1.0L/min，然后于65℃下，剧烈搅拌下反应2h，冷却后，用5％NaOH调pH值到10左右得到。经过下述方法对脱乙酰化的壳聚糖的分子量和脱乙酰度的检测发现，本实施过程得到的壳聚糖的粘均分子量为10534，D.D值达到90％以上。

壳聚糖黏均分子量的测定：

采用粘度法(Roberts G A F,Domsy J G D.Etermination of the viscometricconstants for chitosan[J]，Int J Biol Macromol.1982,4:374-377.)测定各降解时间壳聚糖的粘均分子量(M)，以0.1mol/L醋酸钠/0.2mol/L醋酸为溶剂，将壳聚糖配制成不同浓度的溶液，在30℃条件下，用乌氏粘度计测定各样品的相对粘度[η_r]，计算特性粘度[η]，带入Mark-Houwink方程式，

[η]＝K×M_η ^a(K＝6.589×10^-3,a＝0.88)求得样品的粘均分子量。

壳聚糖脱乙酰度D.D的测定：称取0.1g壳聚糖样品置于100mL锥形瓶中，用移液管加入0.1mo1/L的标准盐酸10mL蒸馏水10mL，电磁搅拌，溶液澄清后滴加3滴甲基橙指示剂，然后用0.1mo1/L的NaOH标准溶液滴定至试液从红色变为橙黄色为终点，壳聚糖的脱乙酰度(D.D)按下式计算：

D.D＝[N_lV₁－N₂V₂]/W×1000/161×100％；

式中，N₁V₁为盐酸标准溶液的浓度及滴加的体积；N₂V₂为NaOH标准溶液的浓度及滴加的体积；W为称样品质量。

2、琥珀酰基化

一个具体的琥珀酰壳聚糖(简称为H1)的实施过程为：

以上述脱乙酰化的壳聚糖或未经脱乙酰化的壳聚糖为原料，准确称取5.0g，充分分散于100mL的二甲亚砜中，磁力搅拌下加入2.0g丁二酸酐，室温反应10～20h，反应结束后过滤，取滤渣用pH＝10的95％以上的乙醇水溶液淋洗多次后，再次过滤，取滤渣溶于蒸馏水中，用3倍体积的丙酮沉淀，沉淀物依次用乙醇和丙酮洗脱多次，干燥后即可得到N-琥珀酰壳聚糖。

合成产物红外扫描分析：分别取干燥壳聚糖及N-琥珀酰壳聚糖样品适量，样品和KBr粉末混研压片后在傅立叶红外光谱仪(Vector 33型，Bruker公司，德国)中进行分析。扫描次数为256次，分辨率为2cm^-1。

合成产物红外波谱数据：3423(-OH，-NH₂)，3082(-NH-)，2940(-CH₃)，2874(-CH-)，1655(-C＝O)，1574(C-N)，1400(-COOH)，1026(C-O)。

灰化分析法测定N-琥珀酰壳聚糖取代度：利用灰化酸碱滴定法进行测定，称取2,4,8,16h制得样品护唬拍酞壳聚糖0.200g置于30mL的瓷坩锅中，放入SX2-8-12箱式电阻炉中，逐渐升温至700℃，灼热1h灰化处理后关闭电源，冷却后取出。用20mL的蒸馏水将柑塌中的剩余物全部转移到100mL的锥形瓶中，滴加3～4滴甲基橙指示剂，准确加入10mL硫酸标准液，溶液颜色呈红色，电炉上加热溶液至沸腾，10min后用NaOH标准液回滴至溶液颜色由红变黄，记下用取得NaOH溶液的体积，则琥珀酰基取代度(D.S)按下式计算：

D.S＝0.1662×Y/(1－0.123×Y)，Y＝(2M₁V₁－M₂V₂)/W；

式中，M₁V₁为硫酸标准溶液的摩尔浓度及滴加的体积，M₂V₂为NaOH标准溶液的摩尔浓度及滴加的体积；W为取样品质量。

本实验所得的实施例1～3和对比例1～3制得的琥珀酰壳聚糖D.S值如表1所示。

表1

3、烷基化

一个具体的烷基化的琥珀酰壳聚糖(简称为H2)的实施过程为：

取琥珀酰壳聚糖10g(实施例1制得)溶于1％醋酸100mL中，过滤，滤液中加入651.7mg 3-氧代月桂醛(CAS：56505-80-7，Mitachieve)，搅拌4h。然后用1mol/L NaOH调节pH至4～5，加入NaBH₄水溶液，继续搅拌12h，用1mol/L NaOH调节pH至7，过滤，将沉淀溶于水50mL中，蒸馏水透析，透析液冷冻干燥，即得烷基化的琥珀酰壳聚糖。

烷基取代度(D.S)及计算：

为琥珀酰壳聚糖的结构单元，其可分为式I中所示的四单元结构。在氨基连接琥珀酸的单元中，C/N原子比为10；在氨基连接烷基的单元中，C/N原子比为18；在氨基未连接任何侧链的单元中，C/N原子比为6；在氨基未脱乙酰化的单元中，C/N原子比为8。

由此，整个烷基化琥珀酰壳聚糖的结构中：(C/N)总元素比＝10A+18B+6C+8D，(式I)；其中，A,B,C,D分别为图中各自对应单元的摩尔百分比，则A+B+C+D＝100％。其中，A＝D.S(琥珀酰基取代度)；(A+B+C)＝脱乙酰度(D.D)；

结合上述诸式，则B＝1/12[(C/N)_总+2D.D－4D.S－8)]；

利用元素分析仪(产品型号：FlashSmart，品牌：ThermoFisher/赛默飞)检测烷基化琥珀酰壳聚糖的分子中的总碳氮比C/N，结合D.D和D.S值代入上式，经过计算B值。结果如表2所示。

表2

图1中，H2相对于H1的红外吸收光谱曲线有几处基带发生了明显的变化，是特征基团出现的象征。在2922cm^-1处出现的峰为-CH₂-的反对称伸缩振动，2856cm^-1处出现的峰为-CH₂-的对称伸缩振动，1459cm^-1处的峰为-CH₂-的面内弯曲振动，与壳聚糖的红外光谱曲线相比较，说明有烷基链存在。

表2中，对比例6采用庚醛与琥珀酰壳聚糖进行反应，制得H2化合物。由表2的结果可知，实施例1～6和对比例6制得的烷基化琥珀酰壳聚糖的B值在0.15～0.18之间，而对比例1～5的B值均不在此区间。

4、氨基酸化

一个制备氨基酸化的烷基-琥珀酰壳聚糖(简称为H3)的实施过程为：

称取73.89mg天冬氨酸(Asp，产品编号：U1043819，国药集团)加入到20mL去离子水中超声分散30min，得到Asp水分散液。取2g H2(实施例1制得)溶解于50ml去离子水中，加入0.383g的EDC和0.23g NHS活化40min，再加入Asp水分散液，搅拌反应24h，过滤除去未反应的Asp，将滤液用截留分子量2000Da的透析袋透析3d，干燥后研磨得到H3粉末。通过改变H2与Asp的摩尔比，能够使得到的H3，其分子结构如式II～VI所示。

另一个制备H3的实施过程为：将上述的天冬氨酸替换为谷氨酸，则得到的H3的分子结构如式VII～或式XI所示。

采用傅里叶变换红外光谱仪对样品的结构进行表征。结果如图所示，在2962cm^-1处的宽而强的谱带可归属于NH₃官能团的N-H伸缩振动。在1180～900cm^-1之间有大量的羧基负离子的吸收峰，由此可见氨基酸连接成功，H3合成成功。

具体的上述H3制备过程中，基于实施例1制得的H2，其分子结构中A＝0.21，B＝0.18，C＝0.51，D＝0.1；基于此，在上述氨基酸化过程中，充分添加天冬氨酸或谷氨酸，促使式V中第一单元或羧基或第三单元的氨基被缩合，因而控制氨基酸与H2的摩尔比例为(13.3～32.3):1。具体的，其他各实施例和对比例制得的H3化合物的结果如表3所示。表3中的氨基酸化反应条件主要列出了氨基酸与H2的加入摩尔比例。

表3

实施方式	氨基酸化反应条件
		实施例1	13.3:1(Asp)
实施例2	25:1(Asp)
		实施例3	32.3:1(Asp)
实施例4	13.3:1(Glu)
		实施例5	25:1(Glu)
实施例6	32.3:1(Glu)
		对比例1	13.3:1(Asp)
对比例2	13.3:1(Asp)
		对比例3	13.3:1(Asp)
对比例4	13.3:1(Asp)
		对比例5	13.3:1(Asp)
对比例6	13.3:1(Asp)
		对比例7	13.3:1(Asp)

体外性能表征

1、改性琥珀酰壳聚糖自组装纳米粒的制备及药物装载

将上述制得H3(100mg)分散在pH值7.4的PBS中，缓解滴加到100mL的含20％乙醇的Span-80溶液中，超声处理后，功率30W，每次3min(超声5s，停1s)；40℃抽真空挥去水分，4000rpm离心30min，沉淀用石油醚洗涤2次，加10mL水超声处理，用0.45μm微孔滤膜过滤，得到自组装的空白纳米粒。

取空白纳米粒适量，用DMSO配成质量浓度为2mg/mL的稀释液，取纳米粒稀释液1mL，向其中加入等体积不同质量浓度的索拉非尼溶液(100、500、1000和1500μg/mL，DMSO)，避光搅拌24h，未被包载的索拉非尼用超滤膜(截留分子质量为10kD)除去，冻干后得到载药纳米粒。

2、载药纳米粒的形态观察及粒径测定

采用透射电镜(透射电镜Talos F200X S/TEM，Thermo ScientificTM)观察载药纳米粒的形态。用PBS适当稀释后滴至覆有支持膜的铜网上，停留2min，以滤纸吸去多余溶液，然后向铜网上滴加质量分数为2％的磷钨酸溶液负染色，用滤纸吸取多余溶液，自然干燥，然后用透射电镜观察粒子的形态。

采用激光粒度仪(Winner802光子相关纳米粒度仪，济南微纳颗粒仪器股份有限公司)和动态光散射法测定纳米粒的粒径。

3、包封率

索拉非尼的含量参照(刘伟峰等，HPLC检测人血浆中索拉非尼浓度[J].中国现代应用药学,2015,(第2期).)检测。则纳米粒的包封率(LE)可通过如下两式计算；LE(％)＝(A－B)/A×100％；其中，A为溶液中索拉非尼的总量；B为超滤后上清液中索拉非尼的含量。

4、体外释放特性

供试品：取已制备好纳米溶液样品，加入12％的甘露醇，搅拌使其溶解，分装入西林瓶中，每瓶2mL，置－45℃的超低温冰柜预冻8h，然后迅速移入冷冻干燥机中，在负压下维持真空度不再增加，关闭制冷开关，程序升温至－25℃，维持48h，取出后立即压盖密封，并封蜡，即得的冻干样品，即为供试品。

取供试品分别重新分散在pH值为7.4的含75％的DMSO缓冲液中，将溶液装入透析袋(截留分子质量为14kD)中并分别置于含50mL，在恒温37℃振荡箱中以100r/min进行释放，在预定的时间间隔，取出3mL，透析液并补充加入相应pH的等量新鲜PBS溶液，索拉非尼的含量参照上述方法测定，计算药物累积释放量。

5、热稳定性分析

将上述制得的纳米溶液样品分别在－10℃、25℃、45℃三种温度下各存放1个月，采用上述相同的方法，检测其包封率(100μg/mL索拉非尼)。

6、统计学分析

所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。

二、结果

表4

表4列出了实施例1～6和对比例1～7制得的纳米载药颗粒的粒径，负载不同浓度索拉非尼的包封率。结果可知，实施例1～6和对比例1～7制得的纳米载药颗粒的粒径均分别较为集中，呈现纳米尺寸。在对100μg/mL索拉非尼的包封率检测结果中，实施例1～6提供的纳米载药颗粒均达到了90％以上的包封率，显著高于对比例1～4。在对500μg/mL索拉非尼的包封率检测结果中，实施例1～6提供的纳米载药颗粒均达到了80％以上的包封率，显著高于对比例1～5。在对1000μg/mL索拉非尼的包封率检测结果中，实施例1～6提供的纳米载药颗粒均达到了75％以上的包封率，显著高于对比例1～6。在对1500μg/mL索拉非尼的包封率检测结果中，实施例1～6提供的纳米载药颗粒均达到了70％以上的包封率，显著高于对比例1～7。

由此可知，实施例1～6提供的纳米微球对索拉非尼的载药包封率达到最佳，而对比例5～7提供的纳米微球虽然对低浓度索拉非尼的包封率较高，但是对高浓度索拉非尼的包封率较差，即其对索拉非尼的包封量不如实施例1～6。结合表2可知，对比例5～7提供的H2化合物的A～D值均与实施例1相差无几，但是其烷基化反应过程与实施例1有较大差别，由此推测，可能由于这些差别导致了对比例5～7对索拉非尼的包封量下降。

表5 LE％

表5列出了各实施例和对比例制得的纳米溶液样品在－10℃、25℃、45℃三种温度下各存放1个后的包封率。结果可知，在－10℃、25℃、和45℃温度条件下，实施例1～6制得的载药纳米颗粒的包封率均未出现显著下降。而在45℃温度条件下，对比例1～7制得的载药纳米颗粒的包封率出现显著下降。由此说明，本申请实施例1～6制得的载药纳米颗粒具有更好的热稳定性。

如图3所示，实施例1～6制得的索拉非尼载药纳米颗粒的释药曲线较为陡峭，说明索拉非尼在其中的释放较为平缓，具有一定的缓释效果。而在图4中，对比例1～4制得的索拉非尼载药纳米颗粒的释药曲线在0～36h较为陡峭，其后时间趋于平缓，说明索拉非尼在其中，在前36h内快速释放，而后几乎不释放，说明对比例1～4提供的索拉非尼载药纳米颗粒的药物缓释效果较差。而对比例5～7具有与实施例1～6相当的药物缓释性能。

体内外试验

一、材料与方法

1、实验动物

自发性肿瘤模型小鼠(肝脏肿瘤)(DMY34Mu03)，武汉云克隆诊断试剂研究所有限公司。

2、载药纳米颗粒的荧光标记

取100mg载药纳米颗粒分散于5mL pH约为8.3的碳酸氢钠缓冲溶液，5mg FICT溶于5mL相同的缓冲液中，然后加入到上述反应液中，室温避光反应24h后减压浓缩至2mL，加入乙醇沉淀产物，反复用水溶醇沉处理以除去大量游离的FICT，再用蒸馏水透析处理至透析液无荧光，冷冻干燥即得荧光标记的Suc-Chi,避光冷冻保存。荧光基团的含量用可见分光光度法于490nm波长进行检测。

3、载药纳米颗粒的体外靶向实验

收集对数期生长的MCF-7(人乳腺癌细胞，ECACC)、及HepG2细胞(人肝癌细胞，北京晶莱华科生物技术有限公司)和BERH-2(大鼠肝癌细胞，ECACC)，细胞按照1×10⁶细胞/孔在六孔板中培养，分别加入100μg/mL荧光标记的载药纳米球，分别培养48小时，用PBS洗3次，用多聚甲醛(4％)固定30分钟。PBS洗3次，用1mg/mL DAPI染核5分钟，用PBS洗3次，在倒置荧光显微镜下观察各种细胞对纳米粒子的蓄积数量。

并在培养48h后，分别加入10μL CCK-8溶液，继续培养3h，吸光度在全波长酶标仪上450nm波长处测定，根据实验组和未治疗组的活细胞百分比表示，计算载药纳米颗粒对各组细胞的杀伤率。

4、体内靶向作用

取自发性肿瘤模型小鼠分为模型组和实验组，实验组有分为实施例1～6和对比例1～7的组别。实验组中，分别注射10μL含经过Cy5.5标记的实施例1～6和对比例1～7制得的载药纳米颗粒的100mg/mL溶液，注射后12h禁食，给药后第48天，人道处死小鼠，制作心、肝、肾、肺、脾组织切片，分别用两倍于组织质量的生理盐水进行匀浆，取0.2mL匀浆液，加入纤维素酶1mL，37℃水浴孵育30min，涡旋混合3min，12000rpm离心10min，取上清液待用。

-70℃冷冻，用薄片切片机制成6μm的切片，固定在载玻片上烘干，然后，用PBS(pH7.4)溶液洗出包埋在组织中的OCT混合物。切片用甲醇脱水后，置于荧光显微镜下观察各组织切片中荧光标记的载药纳米球的蓄积数量。蓄积数量通过拍摄照片使用Bruker MISE软件分析得到。

5、统计学方法

数据的统计评估使用双尾非配对t检验表现，P<0.05表示有统计学差异。每组重复6个孔，结果用均数±标准差表示。

二、结果

表6分布量占总量百分比

实施方式	MCF-7	HepG2	BERH-2
				实施例1	－	0.17±0.024a	0.25±0.016a
实施例2	－	0.18±0.021a	0.29±0.017a
				实施例3	－	0.19±0.018a	0.31±0.018a
实施例4	－	0.22±0.035a	0.27±0.020a
				实施例5	－	0.26±0.038a	0.29±0.017a
实施例6	－	0.28±0.034a	0.31±0.014a
				对比例1	－	0.11±0.016b	0.13±0.021b
对比例2	－	0.09±0.018b	0.11±0.018b
				对比例3	－	0.07±0.021b	0.08±0.014c
对比例4	－	0.08±0.014b	0.06±0.019c
				对比例5	－	0.09±0.013b	0.07±0.015c
对比例6	－	0.07±0.016b	0.06±0.014c
				对比例7	－	0.05±0.015b	0.08±0.017c

图5为实施例1制得的索拉非尼载药纳米球处理MCF-7细胞后的结果。图6为实施例1制得的索拉非尼载药纳米球处理HepG2细胞后的结果。图7为实施例1制得的索拉非尼载药纳米球处理BERH-2细胞后的结果。结果可知，MCF-7细胞中无见明显的索拉非尼载药纳米颗粒；在HepG2细胞表面出现大量的载药纳米颗粒；而在BERH-2细胞内也出现大量的载药纳米颗粒，并且HepG2细胞和BERH-2细胞几乎不成细胞形状。

进一步对上述细胞中累积的载药纳米数量进行分析，结果如表6所示，表6中，“－”表示未检出到纳米颗粒。由表6可知，实施例1～6和对比例1～7制得载药纳米颗粒在作用MCF-7细胞后均为见载药纳米颗粒的累积量，说明对MCF-7细胞均不具有明显的靶向作用。而相对于MCF-7细胞，实施例1～6和对比例1～7制得的索拉非尼载药纳米颗粒均对HepG2细胞和BERH-2细胞具有靶向作用。而且对HepG2细胞和BERH-2细胞，实施例1～6制得的索拉非尼载药纳米颗粒对分布量均显著高于对比例1～7，说明本申请实施例提供的索拉非尼载药纳米颗粒对于HepG2细胞和BERH-2细胞具有更强的靶向作用。

表7分布量占总量百分比

实施方式	肾	肺	脾	肝肿瘤
					实施例1	－	－	－	0.21±0.013a
实施例2	－	－	－	0.23±0.014a
					实施例3	－	－	－	0.25±0.012a
实施例4	－	－	－	0.22±0.016a
					实施例5	－	－	－	0.25±0.015a
实施例6	－	－	－	0.28±0.013a
					对比例1	0.05±0.011	－	－	0.09±0.015b
对比例2	0.04±0.014	－	－	0.08±0.013b
					对比例3	0.06±0.012	－	－	0.07±0.014b
对比例4	0.07±0.016	－	－	0.06±0.019b
					对比例5	－	－	－	0.05±0.015b
对比例6	－	－	0.01±0.004	0.06±0.014b
					对比例7	－	－	0.01±0.007	0.06±0.017b

本申请进一步使用实施例1～6和对比例1～7提供的制得载药纳米颗粒对自发性肝癌模型小鼠进行注射后进行各组织切片，各组织中载药纳米微球的分别量结果如表6所示。

由表7可知，实施例1～6制得载药纳米颗粒在肝癌小鼠的肾、肺和脾脏上均为检测到有分布，而在肝脏肿瘤部位发现了大量的载药纳米颗粒富集，说明本申请实施例提供的载药纳米颗粒具有明显的靶向肿瘤部位的能力。而对比例1～4虽然也具有一定的靶向肝癌小鼠肿瘤部位的作用，但是其在肝癌小鼠的肾脏上也发现了有载药纳米颗粒，由此可见，对比例1～4提供的载药纳米颗粒对于肝癌小鼠的肾脏产生了毒副作用。同样地，对比例6、7提供的载药纳米颗粒对于肝癌小鼠的脾脏产生了毒副作用。

表8肿瘤生长抑制率％

实施方式	第7天	第14天	第28天
				实施例1	0.11±0.012a	0.17±0.012ab	0.23±0.015a
实施例2	0.12±0.013a	0.19±0.015a	0.26±0.014a
				实施例3	0.16±0.013a	0.21±0.014a	0.29±0.014a
实施例4	0.13±0.015a	0.18±0.013ab	0.21±0.018a
				实施例5	0.16±0.011a	0.21±0.015a	0.23±0.018a
实施例6	0.19±0.014a	0.23±0.017a	0.26±0.015a
				对比例1	0.11±0.011a	0.13±0.008b	0.13±0.007b
对比例2	0.12±0.014a	0.13±0.012b	0.13±0.011b
				对比例3	0.10±0.012a	0.12±0.011b	0.12±0.010b
对比例4	0.12±0.016a	0.13±0.017b	0.13±0.013b
				对比例5	0.13±0.012a	0.14±0.015b	0.14±0.008b
对比例6	0.14±0.016a	0.15±0.018b	0.15±0.015b
				对比例7	0.13±0.016a	0.15±0.017b	0.15±0.014b

肝癌荷瘤小鼠按上述方法给药后，隔天测量荷瘤小鼠的肿瘤体积(可用电子照射设备检测)，则肿瘤抑制率＝(V0－Vt)/V0；其中，V0和Vt分别代表分别代表肝癌荷瘤小鼠肿瘤初始体积、以及注射载药纳米颗粒后第t天肿瘤的体积。通过计算各给药组肿瘤抑制率，来评价载药纳米颗粒对小鼠体内肝脏肿瘤的药效。

结果如表8所示，实施例1～7提供的载药纳米颗粒在给药后第14天和第28天的肿瘤生长抑制率均显著高于对比例1～7，说明本申请实施例提供的载药纳米颗粒具有更好的抗肿瘤作用。

综上所述，本申请以经过充分脱乙酰化的壳聚糖为基础，先后进行琥珀酰化、烷基化和氨基酸化，由此制得了一类同时具有琥铂酸基、烷基和氨基酸的改性壳聚糖，其分子结构如式II～XI所示。

并且，本申请在制备该类改性琥珀酰壳聚糖的过程中，使用了具有碳链的3-氧代月桂醛进行烷基化，并使用具有双羟基的氨基酸对其进行氨基酸化，由此使得制得的改性琥珀酰壳聚糖同时具有亲水、疏水等性能，由此表现出对索拉非尼的高效包封，并且有利于其缓释和热稳定。

另外，本申请还通过体外细胞试验和肝癌荷瘤小鼠体内试验证实了由该类改性琥珀酰壳聚糖制得的载药纳米颗粒对于肝癌细胞的靶向性，并能够有效减少荷瘤小鼠肝脏肿瘤体积，起到真正抗肿瘤作用。

以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种改性琥珀酰壳聚糖，具有

任一项所示的分子结构；

式II～式XI中，A+B+C+D＝100％。

2.根据权利要求1所述的改性琥珀酰壳聚糖，其特征在于，A代表壳聚糖的琥珀酰基取代度，B代表壳聚糖的烷基化取代度，D代表乙酰基取代度。

3.权利要求1或2所述的改性琥珀酰壳聚糖，其特征在于，A＝0.21～0.31，B＝0.11～0.18，D＝0.1。

4.权利要求1～3任一项所述的改性琥珀酰壳聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

获得乙酰基取代度不大于0.1的壳聚糖；

获得以所述的壳聚糖制得的琥珀酰基化壳聚糖；

获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖，所述烷基-琥珀酰基化壳聚糖是由琥珀酰基化壳聚糖与3-氧代月桂醛进行反应得到；

获得改性琥珀酰壳聚糖，所述改性琥珀酰壳聚糖是由所述烷基-琥珀酰基化壳聚糖与天冬氨酸或谷氨酸反应得到。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖的步骤中，琥珀酰壳聚糖与3-氧代月桂醛反应的反应摩尔比为1:(2～7)，反应时长为14～18h。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，获得烷基-琥珀酰基化壳聚糖的步骤中，所述琥珀酰壳聚糖的乙酰基取代度不大于0.1，琥珀酰基取代度为0.21～0.31。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，获得改性琥珀酰壳聚糖的步骤中，天冬氨酸或谷氨酸与烷基-琥珀酰基化壳聚糖的反应摩尔比例为(13.3～32.3):1。

8.一种由权利要求1～3任一项所述的改性琥珀酰壳聚糖自组装得到的载药纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的载药纳米颗粒，其特征在于，还包括负载的索拉非尼。

10.权利要求1～3任一项所述的改性琥珀酰壳聚糖、权利要求4～7任一项所述的制备方法制得的改性琥珀酰壳聚糖、或权利要求8所述的载药纳米颗粒在制备靶向肝癌细胞药物中的应用。

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