WO2023120903A1 - 다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법 - Google Patents

다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법 Download PDF

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박소현
황경아
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    • C12Q2521/101—DNA polymerase
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    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)

Definitions

  • the present invention relates to a polymer, and more particularly, to a polymer in which a protein is conjugated to a polysaccharide, a method for preparing the same, an enzyme stabilizing composition including the polymer, and a method for detecting a target nucleic acid using the polymer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a specific fragment of a target nucleic acid molecule to be analyzed can be selectively amplified through PCR.
  • PCR requires a very short time, has a simple analysis process, and can efficiently amplify a specific fragment by performing it with a fully automated machine. Therefore, it is currently widely used in various areas such as molecular biology, medical care, crime, biological classification, and diagnosis.
  • a composition including a target nucleic acid molecule, a template DNA to be replicated, a primer to designate a starting point of DNA replication, a DNA polymerase, a probe, dNTP, and the like is used.
  • Taq polymerase which is mainly used in the PCR process, can maintain activity for about 1 hour at 95 ° C, but loses activity due to poor stability when stored at room temperature. In order to maintain activity, it is stored and transported in a frozen state before use. Accordingly, storage costs and time are required until the PCR reaction.
  • An object of the present invention is to provide a polysaccharide and protein conjugated polymer capable of stably maintaining enzyme activity even when stored for a long time at room temperature, a method for preparing the same, a polymerase chain reaction stabilizing composition, and a method for detecting a target nucleic acid will be.
  • a polymer in which bovine serum albumin (BSA) is conjugated to a polysaccharide is disclosed.
  • a polysaccharide-serum albumin complex comprising a polysaccharide and serum albumin conjugated to the polysaccharide is provided.
  • albumin of the present invention is one of the proteins constituting the basic substance of cells, and is present in a very large amount in the blood and is produced in the liver. It has the lowest molecular weight among simple proteins that exist in nature. Serum albumin in blood has the function of maintaining and restoring plasma volume, so it prevents shock due to excessive bleeding and is used for surgery and burn treatment. It is also known to have an oxygen transport ability similar to that of hemoglobin. Human serum albumin, egg white albumin, bovine serum albumin, etc. may be included without limitation.
  • the polysaccharide is cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, glycosaminoglycan, pullulan, alginic acid, carrageenan, arabinogalactan, hemicellulose, dextran, chitosan, glycol chitosan, starch, and combinations thereof It can be selected from the constituting group.
  • a mixture of polysaccharide and bovine serum albumin (BSA) is 0.1 to 20% ( dissolving in distilled water at a concentration of w/v); and reacting the solution in which the polysaccharide and the bovine serum albumin are dissolved at 40 to 200° C. for 6 to 72 hours to induce hydrothermal synthesis.
  • a step of dialysis treatment of the hydrothermal synthesized polymer may be further included.
  • the dialysis treatment may be performed in distilled water for 24 to 72 hours using a 100 to 500 MWCO (molecular weight cut off) dialysis membrane.
  • MWCO molecular weight cut off
  • the step of freezing the polymer at a temperature of -20 ° C to -70 ° C and then freeze-drying may be further included.
  • an enzyme stabilizing composition comprising a polymer in which bovine serum albumin (BSA) is conjugated to a polysaccharide is disclosed.
  • BSA bovine serum albumin
  • a nucleic acid polymerase may be further included.
  • a primer may be further included.
  • a probe may be further included.
  • dNTP deoxyribonucleotide triphosphate
  • NTP nucleotide triphosphate
  • an additive for nucleic acid amplification reaction may be further included.
  • preparing the enzyme stabilizing composition described above adding a biological sample containing nucleic acid molecules to the enzyme stabilization composition; and performing a nucleic acid amplification reaction using the enzyme stabilizing composition to which the biological sample is added.
  • the enzyme stabilizing composition Before the biological sample is added to the enzyme stabilizing composition, the enzyme stabilizing composition may be lyophilized after frozen storage at -20°C to -70°C.
  • the nucleic acid amplification reaction polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR), reverse transcription Reverse Transcription, Complementary DNA Synthesis, Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP), Real-time Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA), Strand Displacement Amplification (Strand Displacement Amplification (SDA), Multiple Displacement Amplification (MDA), Rolling Circle Amplification (RCA), Ligase Chain Reaction (LCR), Helicase Dependent Amplification , HDA), branch-extension amplification method (RAM), transcription-based amplification system (in vitro transcription-based amplification system, TAS), and a method selected from the group consisting of combinations thereof may be used. .
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction
  • Real-Time PCR real-time polymerase chain reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal
  • Preparing the enzyme stabilizing composition described above in another aspect adding a biological sample containing nucleic acid molecules to the enzyme stabilization composition; performing a nucleic acid amplification reaction using the enzyme stabilizing composition to which the biological sample is added; And a method for analyzing the presence of a target nucleic acid molecule in a biological sample comprising the step of detecting whether the nucleic acid molecule is amplified is disclosed.
  • Polymerase chain reaction stabilization composition to which polysaccharide and bovine serum albumin are conjugated polymer according to the present invention is added, the activity of nucleic acid polymerase is stably maintained even when stored for a long time at room temperature or high temperature.
  • the polymer of the present invention does not inhibit the reverse transcription (RT) process.
  • the polymer of the present invention and a composition containing the same can be usefully used for diagnosing a disease by efficiently detecting a target nucleic acid molecule associated with the development of an infectious disease and/or cancer.
  • 1 to 4 are schematic diagrams schematically illustrating a process of synthesizing a polymer in which bovine serum albumin is conjugated to polysaccharide.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of 1 H-NMR analysis of a conjugate of pullulan and bovine serum albumin synthesized by hydrothermal synthesis according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FT-IR) analysis of a conjugate of pullulan and bovine serum albumin synthesized by hydrothermal synthesis according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • FT-IR Fourier Transform Infrared Spectroscopy
  • FIG. 7 is a graph showing the results of measuring the size and zeta potential of a conjugate of pullulan and bovine serum albumin synthesized by hydrothermal synthesis according to an exemplary embodiment of the present invention using a Zetasizer.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of 1 H-NMR analysis of a conjugate of hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin synthesized by hydrothermal synthesis according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of FT-IR) analysis of a conjugate of hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin synthesized by hydrothermal synthesis according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • 10a to 10c show a target nucleic acid sequence obtained by adding a biological sample to an enzyme stabilization composition containing a pullulan and bovine serum albumin conjugate synthesized according to an exemplary embodiment of the present invention, and performing a real-time PCR reaction. It is a graph showing the result of measuring the degree of amplification of
  • FIG. 11 shows a biological sample added to an enzyme-stabilizing composition containing a conjugate of pullulan and bovine serum albumin synthesized according to an exemplary embodiment of the present invention, real-time PCR, and the presence of a target nucleic acid using electrophoresis. This is a picture showing the result of detection.
  • FIG. 12 is a biological sample added to an enzyme-stabilizing composition containing a hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin conjugate synthesized according to another exemplary embodiment of the present invention, real-time PCR was performed, and the presence or absence of a target nucleic acid was determined by electrochemical analysis. It is a photograph showing the result of measurement using electrophoresis.
  • lanes 1 and 2 show the enzyme stabilizing composition containing a mixture of polysaccharide and bovine serum albumin after an accelerated aging test
  • lanes 3 and 4 show the formulation of the present invention.
  • the enzyme-stabilizing composition containing the compound was used after an accelerated aging test
  • lane 5 was an enzyme-stabilized composition stored frozen at -20 ° C without a compound
  • lane 6 was an enzyme-stabilized composition without a compound, freeze-dried and accelerated aging. It will be used after testing.
  • Lanes 1 to 4 and 6 were subjected to nucleic acid amplification after accelerated aging at 40° C. for 14 days, respectively.
  • FIG. 13 to 18 show an enzyme stabilization composition containing a synthesized pullulan and bovine serum albumin conjugate and an enzyme stabilization composition containing hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin conjugate, respectively, synthesized according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • a graph showing the result of measuring the degree of amplification of a target nucleic acid sequence by adding a biological sample to the enzyme stabilization composition containing Comparative Synthesis Example 1 and performing a real-time PCR reaction.
  • FIG. 19 is a comparative synthesis of an enzyme stabilizing composition containing a synthesized pullulan and bovine serum albumin conjugate and an enzyme stabilizing composition containing hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin conjugate synthesized according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • lanes 7 and 8 show the enzyme stabilization composition containing the conjugate of the present invention after an accelerated aging test
  • lanes 9 and 10 show enzyme stabilization containing the conjugate of Comparative Synthesis Example 1.
  • the composition was used after an accelerated aging test
  • lane 11 was an enzyme-stabilized composition stored frozen at -20 ° C without compound
  • lane 12 was used after lyophilizing the enzyme-stabilized composition without compound and used after an accelerated aging test.
  • nucleic acid amplification was performed after accelerated aging at 40° C. for 14 days, respectively.
  • BSA bovine serum albumin
  • PUL Pullulan
  • HPC hydroxypropyl cellulose
  • PUL-BSA pullulan and bovine serum albumin conjugate
  • HPC-BSA is hydroxypropyl cellulose and bovine serum albumin conjugate.
  • amino acid herein is used in its broadest sense and is intended to include naturally-occurring L-amino acids or residues.
  • Amino acids include D-amino acids as well as chemically-modified amino acids, such as amino acid analogs, naturally-occurring amino acids not commonly incorporated in proteins, such as norleucine, and chemically modified amino acids having properties known in the art to be characteristic of amino acids.
  • amino acid analogs For example, synthetic peptides synthesized by standard solid-phase synthesis techniques are not limited to the amino acids encoded by genes, and thus allow for a wider variety of substitutions for a given amino acid. Amino acids not encoded by the genetic code are referred to herein as "amino acid analogs".
  • amino acid analogs include 2-amino adipic acid (Aad) for Glu and Asp; 2-aminopimelic acid (Apm) for Glu and Asp; 2-aminobutyric acid (Abu) for Met, Leu and other aliphatic amino acids; 2-aminoheptanoic acid (Ahe) for Met, Leu and other aliphatic amino acids; 2-aminobutyric acid (Aib) for Gly; cyclohexylalanine (Cha) for Val, Leu and Ile; homoarginine (Har) for Arg and Lys; 2,3-diaminopropionic acid (Dap) for Lys, Arg and His; N-ethylglycine (EtGly) for Gly, Pro and Ala; N-ethylglycine (EtGly) for Gly, Pro and Ala; N-ethylasparagine (EtAsn) for Asn and Gln;
  • peptide includes all proteins, protein fragments, and peptides isolated from naturally occurring, recombinant techniques, or chemically synthesized.
  • the peptides of the present invention may consist of at least 5 amino acids, such as at least 10 amino acids.
  • variants of compounds are provided, such as variants of peptides with one or more amino acid substitutions.
  • peptide variants means substitutions, deletions, additions, and/or insertions of one or more amino acids into the amino acid sequence of a peptide, and original amino acids. It means that it exerts almost the same biological function as the peptide composed of Peptide variants should have 70% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more identity with the original peptide.
  • substitutions may include amino acid substitutions known as "conservative”.
  • Variants may also contain nonconservative changes.
  • the sequence of the variant polypeptide differs from the original sequence by substitution, deletion, addition or insertion of 5 or fewer amino acids.
  • Variants can also be altered by deletion or addition of amino acids that minimally affect the immunogenicity, secondary structure and hydropathic nature of the peptide.
  • Constant substitution means that there is no significant change in properties such as secondary structure and hydropathic nature of a polypeptide even when one amino acid is substituted with another amino acid.
  • Amino acid variations are based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature. can be obtained by
  • amino acids are i) hydrophobic (norleucine, methionine, alanine, valine, leucine, isoleucine) ii) neutral hydrophilic (cysteine, serine, threonine, asparagine, glutamine), iii) acidic (aspartic acid). acid, glutamic acid), iv) basic (histidine, lysine, arginine), v) residues that influence chain orientation (glycine, proline), vi) aromatic (tryptophan, tyrosine, phenylalanine). Conservative substitutions will entail exchanging a member of one of these respective classes for another member of the same class.
  • arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cysteine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
  • the hydrophobic amino acid index is very important in conferring the interactive biological function of proteins. It is a known fact that amino acids having similar hydrophobicity indexes should be substituted to retain similar biological activities. When a mutation is introduced with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids exhibiting a difference in hydrophobicity index, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
  • hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: arginine (+3.0); Lysine (+3.0); aspartic acid (+3.0 ⁇ 1); glutamic acid (+3.0 ⁇ 1); serine (+0.3); asparagine (+0.2); glutamine (+0.2); glycine (0); threonine (-0.4); proline (-0.5 ⁇ 1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); cysteine (-1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); Lysine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
  • substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity value, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, even more preferably within ⁇ 0.5.
  • Amino acid exchanges in proteins that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ Exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • peptides including fusion proteins
  • polynucleotides referred to herein are isolated.
  • An "isolated" peptide or polynucleotide is one that has been removed from its original environment. For example, a protein that exists in its natural state is separated by removing all or some of the substances that coexist in that state. Such a polypeptide should have a purity of at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
  • Polynucleotides are isolated by cloning in vectors.
  • Peptides can be isolated by recombinant means or by making them through chemical synthesis.
  • Recombinant peptides encoded by the nucleotide sequences mentioned herein, for example, peptides consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1 and/or SEQ ID NO: 2 can be used in any of the many known expression vectors. Whether used, it can be easily prepared by a known method.
  • Expression can be carried out in an appropriate host cell transformed with an expression vector containing a DNA sequence encoding the recombinant protein. Suitable host cells include prokaryotes, yeast and eukaryotes. For example, it is preferable to use a cell line derived from eukaryotes such as yeast, insect cells or mammalian cell lines (such as Cos or CHO) as a host cell.
  • a supernatant containing the recombinant protein secreted into the culture medium obtained from a water-soluble host/vector system is concentrated using a commercially available filter.
  • the concentrate obtained above is purified using an appropriate purification matrix such as an affinity matrix or an ion exchange resin.
  • pure recombinant protein can be obtained by performing one-step or multi-step reverse phase HPLC.
  • a peptide or protein described herein can be secreted into and recovered from the periplasm of a host cell.
  • recovery of peptides and/or proteins involves disrupting the microorganisms, generally by means such as osmotic shock, sonication, or lysis. Once the cells are disrupted, cell debris or pre-cells can be removed by centrifugation or filtration. Peptides and/or proteins can be further purified, for example by affinity resin chromatography.
  • peptides and/or proteins can be transferred to the culture medium and isolated therefrom.
  • the cells are removed from the culture, and the culture supernatant is filtered and concentrated to further purify the peptides and/or proteins produced.
  • Expressed polypeptides can be prepared by commonly known methods, such as immunoaffinity or fractional distillation on an ion-exchange column; ethanol precipitation; reverse phase HPLC; chromatography on silica or a cation exchange resin such as DEAE; chromatofocusing; SDS-PAGE; ammonium sulfate precipitation; gel filtration using, for example, Sephadex G-75; It can be further isolated and confirmed using a hydrophobic affinity resin, ligand affinity using a suitable antigen immobilized on a matrix, and Western blot assays.
  • Polynucleotide or “nucleic acid” are used interchangeably herein and refer to polymers of nucleotides of any length and include DNA (eg cDNA) and RNA molecules generically.
  • Nucleotides the building blocks of nucleic acid molecules, are deoxyribonucleotides, ribonucleotides, modified nucleotides or bases, and/or their analogues, or incorporated into polymers by DNA or RNA polymerases, or by synthetic reactions. It can be any substrate that can be.
  • Polynucleotides may include modified nucleotides, sugar or base modified analogs, such as methylated nucleotides and their analogs.
  • nucleic acids do not lead to variations in proteins.
  • Such nucleic acids include functionally equivalent codons or codons encoding identical amino acids (e.g., by codon degeneracy, there are six codons for arginine or serine), or codons encoding biologically equivalent amino acids. It includes a nucleic acid molecule that Also, mutations in nucleotides can lead to changes in the protein itself. Even in the case of a mutation resulting in a change in the amino acid of the protein, one exhibiting almost the same activity as the protein of the present invention can be obtained.
  • the characteristics of the nucleic acid molecules or polynucleotides of the present invention are not limited to the amino acid sequences or base sequences listed in the sequence listing. It is clear to the skilled person.
  • a coding region operably linked to an expression control sequence and/or a biological functional equivalent that may be included in a recombinant protein/peptide expressed therefrom exhibits equivalent biological activity as the aforementioned coding region and/or recombinant protein. It may be a protein/peptide having a polynucleotide having a mutation in the nucleotide sequence and/or a mutation in the amino acid sequence.
  • nucleic acid molecules encoding peptides and/or proteins are construed to include sequences exhibiting substantial identity with the sequences described in the Sequence Listing.
  • the above substantial identity is obtained when the sequence of the present invention and any other sequence described above are aligned so as to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art to which the present invention belongs. , means a sequence exhibiting at least 61% homology, more preferably 70% homology, even more preferably 80% homology, and most preferably 90% homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
  • the term "primer” is complementary to the 5'-terminal sequence and/or 3'-terminal sequence of a target nucleic acid molecule to be amplified in a nucleic acid amplification reaction, respectively, in an appropriate buffer at an appropriate temperature and under suitable conditions. It refers to a single-stranded oligonucleotide that can act as an initiation point for a polymerase reaction between template-directed nucleic acids (eg, under four different (di)nucleoside triphosphates and polymerases).
  • the appropriate length of the primer may vary depending on various factors, such as temperature and the use of the primer, but is usually 15 to 50 nucleotides.
  • probe is a single-stranded nucleic acid molecule, an oligonucleotide that is complementary under stringent conditions to a target nucleic acid sequence.
  • a probe may consist of 10 to 20 nucleotides.
  • hybridization under stringent conditions refers to two single-stranded nucleic acid molecules in which at least 70%, for example, 80% or more or 90% or more of the nucleotides are complementary nucleotides. do.
  • the present inventors studied a method for stably maintaining the activity of an enzyme even when stored for a long time at room temperature or high temperature in relation to nucleic acid amplification. Accordingly, it was found that the stability of the nucleic acid amplification enzyme can be maintained when a conjugate of polysaccharide and bovine serum albumin (BSA) is added to the nucleic acid amplification reaction stabilization composition.
  • BSA bovine serum albumin
  • the present invention is a polymer in which bovine serum albumin (BSA) is conjugated to a polysaccharide.
  • BSA bovine serum albumin
  • the activity of a nucleic acid polymerase is stably maintained even when an enzyme-stabilizing composition containing a polysaccharide and bovine serum albumin-conjugated polymer is stored for a long period of time.
  • polysaccharide containing bovine serum albumin is not particularly limited as long as it can have any glycosidic bond between monosaccharides as unit components.
  • polysaccharides include cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, glycosaminoglycans, pullulan, alginic acid, carrageenan, arabinogalactan, hemicellulose, dextran, chitosan, glycol chitosan, starch and these It may be selected from the group consisting of a combination of, but is not limited thereto.
  • the polysaccharide may be selected from the group consisting of cellulose, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl methylcellulose, pullulan, and combinations thereof.
  • a polymer in which bovine serum albumin is conjugated to a polysaccharide can be synthesized through a hydrothermal reaction between the polysaccharide and bovine serum albumin. More specifically, dissolving a polysaccharide and a mixture of the polysaccharide and bovine serum albumin (BSA) in distilled water at a concentration of 0.1 to 20% (w/v), Inducing hydrothermal synthesis by reacting at 200 ° C for 6 to 72 hours, optionally dialysis treatment of a solution in which a polymer is produced after hydrothermal synthesis, and the synthesized polymer at -20 ° C to -70 ° C After freezing at a temperature of , it may further include the step of lyophilization.
  • BSA bovine serum albumin
  • FIGS. 1 to 4 are schematic diagrams schematically illustrating a process of synthesizing a polymer in which bovine serum albumin (BSA) is conjugated to pullulan as an example of polysaccharide according to an exemplary embodiment of the present invention by hydrothermal synthesis.
  • BSA bovine serum albumin
  • pullulan is exemplified as a polysaccharide in FIGS. 1 to 4
  • bovine serum albumin may be conjugated to any polysaccharide having a glycosidic bond.
  • 1 to 4 illustrate that bovine serum albumin is conjugated to the glycoside-binding site of polysaccharide, but bovine serum albumin is not necessarily incorporated into the glycoside-binding site of polysaccharide.
  • a carboxylic acid group which is part of a terminal and/or a specific amino acid side branch of bovine serum albumin, is incorporated into the glycosidic binding site of pullulan.
  • bovine serum albumin and pullulan may be connected through an ester bond.
  • an amide group which is part of the terminal and/or amino acid side branch of bovine serum albumin, is conjugated to the glycoside binding site of pullulan.
  • bovine serum albumin and pullulan may be linked through an N-acetylglucosamine form, that is, an N-linked glycosidic bond.
  • an amino group which is part of an amino acid side chain constituting bovine serum albumin, is conjugated to the glycoside binding site of pullulan.
  • a hydroxyl group which is part of an amino acid side chain constituting bovine serum amino acids, is incorporated into the glycoside binding site of pullulan.
  • the content of bovine serum albumin in a polysaccharide-conjugated polymer may be 0.01 to 70% by weight, for example, 10 to 70% by weight or 40 to 60% by weight.
  • the content of bovine serum albumin in the polymer is less than 0.01% by weight, it is difficult to expect an enzyme stabilization effect by conjugation of bovine serum albumin because the content of bovine serum albumin incorporated into the polysaccharide is too small.
  • the content of bovine serum albumin in the polymer exceeds 70% by weight, the activity of the polymerase may decrease while bovine serum albumin affects reverse transcription of the polymerase.
  • the hydrothermally synthesized polymer may be subjected to dialysis.
  • the dialysis treatment may be performed in distilled water for 24 to 72 hours using a 100 to 500 MWCO (molecular weight cut off) dialysis membrane.
  • the pH of the solution in the dialysis step may be 5 to 9.
  • the polymer in which bovine serum albumin is incorporated into polysaccharide may be frozen at a temperature of -20°C to -70°C, followed by lyophilization.
  • polymers incorporating bovine serum albumin into polysaccharides stabilize enzymes, such as nucleic acid polymerases. Accordingly, in another aspect, the present invention relates to an enzyme stabilizing composition comprising a polymer in which bovine serum albumin is conjugated to a polysaccharide.
  • bovine serum albumin in the enzyme-stabilizing composition is 0.01 to 10% (w/v), such as 0.5 to 5% (w/v) or 0.5 to 3% (w/v) of the polymer incorporated into the polysaccharide. ) may be included at a concentration of When the content of the polymer in which bovine serum albumin is conjugated to polysaccharide in the enzyme-stabilizing composition is less than 0.01% (w/v), it is difficult to realize the effect of stabilizing enzyme activity.
  • the intended reaction such as a nucleic acid amplification reaction may not be performed efficiently while the content of other components decreases. there is.
  • DNA and/or RNA polymerases that may be added to the enzyme-stabilizing composition are not particularly limited as long as the target nucleic acid molecule can be amplified using the polymerase.
  • DNA polymerases may include "Klenow fragment" of E. coli DNA polymerase I, thermostable DNA polymerase and bacteriophage T7 DNA polymerase.
  • the polymerase is a thermostable DNA polymerase obtained from various bacterial species, such as Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis , Thermis flavus , Thermococcus literalis and/or Pyrococcus furiosus (Pfu). Including, but not limited to.
  • polymerases and dNTPs may be commercially available in the form of a premix.
  • the polymerase and dNTP mixture may be included in a concentration of 5 to 40% (w/v), for example, 10 to 30% (w/v) or 15 to 25% (w/v) in the enzyme stabilizing composition. there is.
  • the nucleic acid amplification reaction solution may include a dNTP mixture (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), a nucleic acid amplification reaction buffer, other nucleic acid amplification reaction additives, and a nucleic acid polymerase cofactor.
  • a dNTP mixture dATP, dCTP, dGTP, dTTP
  • a nucleic acid amplification reaction buffer e.g., dTTP
  • other nucleic acid amplification reaction additives e.gRNA polymerase cofactor
  • annealing is performed under stringent conditions that enhance specific binding between a nucleotide sequence of a target nucleic acid molecule and a primer sequence.
  • annealing or priming refers to the apposition of an oligonucleotide or nucleic acid to a template nucleic acid molecule, whereby a polymerase polymerizes the nucleotides to form a complementary nucleic acid molecule from the template nucleic acid molecule or fragment thereof.
  • Stringent conditions for annealing are sequence-dependent and vary depending on environmental parameters.
  • the primer may be included in the enzyme stabilizing composition at a concentration of 5 to 40% (w/v), for example, 5 to 30% (w/v) or 5 to 20% (w/v).
  • the enzyme stabilizing composition may further include an additive for a nucleic acid amplification reaction.
  • the additive for the nucleic acid amplification reaction may be selected from the group consisting of mannitol, polyethylene glycol (eg, PEG 10,000), trehalose, betaine, and combinations thereof.
  • the additive for the nucleic acid amplification reaction in the enzyme stabilization composition is added at a concentration of 0.5 to 30% (w / v), for example, 0.5 to 20% (w / v) or 1 to 15% (w / v).
  • the enzyme stabilizing composition may include an appropriate buffer for the nucleic acid amplification reaction.
  • the type of buffer is not particularly limited, but organic acids, glycine, histidine, glutamate, succinate, phosphate, acetate, citrate, Tris (eg, Tris-EDTA), HEPES (Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), amino acids and these It may be selected from the group consisting of a combination of.
  • the amplified target sequence may be labeled with a detectable labeling substance.
  • the labeling material may be a fluorescent, phosphorescent, chemiluminescent or radioactive material, but is not limited thereto.
  • the labeling substance may be fluorescein, phycoerythrin, rhodamine, lissamine, Cy-5 or Cy-3.
  • nucleic acid amplification reaction eg, real-time polymerase chain reaction
  • Nucleic acids can be labeled with detectable fluorescent labels.
  • radioactive isotopes such as P 32 and / or S 35 are added to the enzyme stabilizing composition according to the present invention to label using a radioactive material.
  • oligonucleotide primer sets used to amplify the target nucleic acid may be used.
  • Labeling may use various methods commonly practiced in the art to which the present invention pertains.
  • the nick translation method the random priming method (Multiprime DNA labeling systems booklet, “Amersham” (1989)) and the kination method (Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499 (1986))
  • a label is a signal that can be detected by fluorescence, radioactivity, phosphorescence, chromometry, gravimetry, X-ray diffraction or absorption, magnetism, enzymatic activity, mass analysis, binding affinity, hybridization radiofrequency, nano-crystal.
  • a primer and/or a probe may specifically bind to a target nucleic acid molecule present in a biological sample.
  • a target nucleic acid molecule may be derived from a cancer, tumor, or pathogen, and may be in the form of DNA or RNA.
  • cancers or tumors include, but are not limited to, gastric cancer, lung cancer, liver cancer, colon cancer, small intestine cancer, skin cancer, pancreatic cancer, and prostate cancer.
  • pathogens may include, but are not limited to, pathogenic viruses (eg, human papillomavirus (HPV), influenza virus, coronavirus, etc.) and pathogenic bacteria (pneumococci, etc.).
  • the target nucleic acid molecule may be a nucleic acid molecule specific to a cancer, tumor or pathogen, or a nucleic acid molecule as a marker indicating whether a cancer or tumor has been developed or whether a pathogen has been infected.
  • the enzyme stabilizing composition may be stored frozen at -20°C to -70°C followed by lyophilization. At this time, the polymer containing bovine serum albumin in the polysaccharide may be rehydrated after lyophilization and then added to the enzyme stabilizing composition together with additives for nucleic acid amplification reaction.
  • a nucleic acid amplification reaction is not particularly limited as long as it can amplify a target nucleic acid molecule that may exist in a biological sample.
  • nucleic acid amplification reactions include polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and real-time polymerase chain reaction (Real-Time PCR).
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • NASBA Nucleic Acid Sequence-Based Amplification
  • SDA Strand Strand Displacement Amplification
  • MDA Multiple Displacement Amplification
  • RCA Rolling Circle Amplification
  • LCR Ligase Chain Reaction
  • HDA Helicase Dependent Amplification Dependent Amplification
  • RAM branch-extension amplification method
  • TAS in vitro transcription-based amplification system
  • bovine serum albumin BSA
  • Teflon-coated mold After dissolving 100 mg pullulan and 1 ⁇ 200 mg of bovine serum albumin (BSA) in 100 ml of distilled water, put them in 50 ml of Teflon-coated mold and react at 40 ⁇ 200°C for 6 ⁇ 72 hours to obtain the primary compound did The obtained primary compound was dialyzed in distilled water between pH 5.0 and 9.0 for 3 days using a 100 to 500 molecular weight cutoff (MWCO) dialysis membrane. The dialysis-completed compound was lyophilized to recover a polymer for enzyme stabilization.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • Figure 5 shows the results of 1 H NMR analysis of the polymer incorporating BSA into Pullulan, the results of FT-IR analysis in Figure 6, and the results of size and zeta potential analysis of the polymer using a Zetasizer are shown in Figure 7.
  • a polymer in which BSA was conjugated to hydroxypropyl cellulose was synthesized by repeating the procedure of Synthesis Example 1, except that 100 mg of hydroxypropyl cellulose (HPC) was used as a starting material instead of Pullulan.
  • Fig. 8 shows the results of 1 H NMR analysis of the polymer in which BSA is incorporated into hydroxypropyl cellulose
  • Fig. 9 shows the results of FT-IR analysis.
  • BSA bovine serum albumin
  • a nucleic acid amplification reaction stabilization composition was prepared as an example of an enzyme stabilization composition containing a polymer in which pullulan and BSA were conjugated.
  • the components and contents added to the nucleic acid amplification reaction stabilization composition are shown in Table 1 below.
  • 10 ⁇ l of the nucleic acid amplification reaction stabilization composition was dispensed into a 0.2 ml PCR tube or 96-well plate, frozen at -20 ° C for 24 hours, and then lyophilized for 24 to 72 hours to crystallize.
  • the crystallized nucleic acid amplification reaction stabilization composition was subjected to an accelerated aging test at 40° C. for 2 weeks.
  • a nucleic acid amplification reaction stabilization composition was prepared by simply mixing pullulan and BSA, and an accelerated aging test was performed according to the same procedure.
  • Nucleic acid amplification reaction stabilization composition Group Pullulan + BSA (40°C) conjugated polymer (40°C) frozen (-20°C) freeze drying (40°C) division One 2 3 4 5 6 Polymer (5%) 4 ⁇ l 6 ⁇ l 4 ⁇ l 6 ⁇ l - - premix * 4 ⁇ l 4 ⁇ l 4 ⁇ l 4 ⁇ l 4 ⁇ l 4 ⁇ l 4 ⁇ l Additives * 5 ⁇ l 5 ⁇ l 5 ⁇ l 5 ⁇ l - - TE buffer 7 ⁇ l 5 ⁇ l 7 ⁇ l 5 ⁇ l - 16 ⁇ l total volume 20 ⁇ l 20 ⁇ l 20 ⁇ l 20 ⁇ l 20 ⁇ l 20 ⁇ l 4 ⁇ l 20 ⁇ l Premix: Taq polymerase (5 Unit/ ⁇ l), 2.5 mM dNTP mix Additives: Mannitol, PEG 10000, Trehalose, Betaine (5-40% by weight)
  • nucleic acid amplification reaction stabilization composition prepared in Example 1 positive samples from corona19 virus (COVID-19) patients were reduced to 1/100 in the nucleic acid amplification reaction stabilization composition stored after the accelerated aging test.
  • Nucleic acid amplification after adding forward and reverse primers specific to the RNA Dependent RNA polymerase (RdRP) region and the N (Nucleocapsid) region among the diluted sample and the open reading frame (ORF) of the COVID-19 virus reaction was carried out. 10 ⁇ l of positive sample RNA, 4 ⁇ l of RdRP region-specific primer, 4 ⁇ l of N region-specific primer, and 0.1 ⁇ l of internal control were added.
  • the nucleic acid amplification reaction was performed at 50°C for 5 minutes and at 94°C for 20 seconds, followed by 38 cycles of 90°C for 1 second and 64°C for 10 seconds.
  • FIGS. 10A to 10C The results of measuring the degree of amplification in the nucleic acid amplification reaction according to the accelerated aging time are shown in FIGS. 10A to 10C.
  • the samples in lane 1 and lane 2 in which pullulan and BSA were simply mixed and added significantly reduced the activity of the polymerase because BSA affected the reverse transcription process of the polymerase.
  • an enzyme stabilization composition containing the HPC-BSA conjugated polymer synthesized in Synthesis Example 2 instead of the PUL-BSA conjugate polymer synthesized in Synthesis Example 1 a nucleic acid amplification reaction stabilization composition was prepared, Experimental Example 1 and Experimental Example A nucleic acid amplification reaction was performed in the same manner as in 2, and the amplification of the target nucleic acid was detected using electrophoresis.
  • the analysis results are shown in FIG. 12 . Polymerase activity was stably maintained in the composition containing the conjugated polymer of polysaccharides HPC and BSA, but the activity of the polymerase was greatly reduced in the composition containing a simple combination of HPC and BSA.
  • the enzyme stability of the dextran-BSA compound of Comparative Synthesis Example 1, the pullulan-BSA compound of Synthesis Example 1, and the hydroxypropyl cellulose-BSA compound of Synthesis Example 2 was evaluated. Specifically, an enzyme-stabilized composition was prepared in the same manner as in Example 1, and nucleic acid amplification was performed in the same manner as in Experimental Examples 1 and 2, and the amplification of the target nucleic acid was detected using electrophoresis. HPC stands for hydroxypropyl cellulose and BSA stands for bovine serum albumin.
  • the components and contents added to the nucleic acid amplification reaction stabilization composition are shown in Table 2 below.
  • FIG. 13 to 19 show the nucleic acid amplification reaction according to the acceleration period
  • FIG. 19 shows the result of electrophoresis analysis.

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Abstract

본 발명은 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 다당류에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용하여 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 증폭 또는 검출하는 방법에 간한 것이다. 폴리머를 사용하여 조성물 내에 효소, 예를 들어 핵산 중합효소가 가수분해, 산화, 환원되는 것을 방지하여 조성물의 안정성을 유지한다. 폴리머를 포함한 조성물은 상온 및 고온에서 보관하더라도 냉동 보관한 조성물에 버금가는 효소 활성을 안정적으로 유지할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 폴리머 및 이를 포함하는 조성물은 감염성 질환 및/또는 암 발병과 관련이 있는 표적 핵산 분자를 효율적으로 검출하여 질병의 진단에 유용하게 적용될 수 있다.

Description

다당류에 단백질이 포합된 폴리머, 그 제조 방법, 이를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 이를 이용한 표적 핵산 분자 검출 방법
본 발명은 폴리머에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 다당류에 단백질이 포합(conjugation)된 폴리머, 그 제조 방법, 폴리머를 포함하는 효소 안정화 조성물 및 폴리머를 이용한 표적 핵산 검출 방법에 관한 것이다.
2019년도에 중국에서 발생한 COVID-19가 세계적인 범유행(pandemic)을 초래하였다. 이에 따라, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 활용하여 COVID-19의 감염 여부를 신속하게 진단할 수 있는, PCR 검사가 주목을 받고 있다. PCR은 DNA(deoxyribonucleic acid)나 RNA(ribonucleic acid)의 원하는 부분을 복제 및 증폭하는 분자생물학적 기술이다.
PCR을 통해 분석하고자 하는 표적 핵산 분자의 특정 단편(fragment)을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. PCR은 필요한 시간이 매우 짧으며, 분석 과정이 단순하고, 전자동 기기로 수행하여 특정 단편을 효율적으로 증폭시킬 수 있다. 따라서, 현재 분자생물학, 의료, 범죄, 생물 분류, 진단 등 다양한 분양에서 널리 사용되고 있다.
PCR을 수행하기 위해서, 표적 핵산 분자인 복제할 주형 DNA, DNA 복제가 시작되는 지점을 지정할 프라이머(primer), DNA 중합효소, 프로브(probe), dNTP 등을 포함하는 조성물을 사용되고 있다. PCR 과정에 주로 사용되는 Taq polymerase는 95℃에서 1시간 정도 활성을 유지할 수 있으나, 상온에서 보관 시 안정성이 떨어져 활성을 잃게 된다. 활성을 유지하기 위해 사용 전에는 냉동 상태로 보관 및 운송을 한다. 이에 따라 PCR 반응 전까지 보관 비용 및 시간이 소요된다.
상온에서 장기간 보관 시 떨어지는 Taq polymerase의 활성을 보존하고자 다양한 고분자 물질과 첨가제가 첨가된다. 이러한 첨가물들은 상온에 Taq polymerase의 활성을 유지시켜 장기간 보관할 수 있다고 알려져 있다. 하지만 동결건조 형태로 보관 시, 건조과정과 재수화 과정에서 Taq polymerase의 활성이 저하되는 것으로 알려져 있다. 동결건조에 주로 첨가되는 물질인 Bovine serum albumin(BSA)의 경우, PCR 반응에서는 큰 영향을 미치지 않으나, 역전사(Reverse transcription, RT) 과정을 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 상온에서도 저장 및 보관하더라도 핵산 중합효소의 활성이 저하되지 않는 소재 및 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 상온에서 장기간 보관하더라도 효소의 활성이 안정적으로 유지될 수 있는 다당류와 단백질이 포합(conjugation)된 폴리머, 그 제조 방법, 중합효소연쇄반응 안정화 조성물 및 표적 핵산 검출 방법을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에 따르면, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 다당류(polysaccharide)에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머가 개시된다.
일 구체예에 있어서, 다당류(polysaccharide), 및 상기 다당류에 접합(conjugation)된 혈청알부민(serum albumin)을 포함하는 다당류-혈청알부민 복합체를 제공한다.
본 발명의 용어 "알부민"은 세포의 기본 물질을 구성하는 단백질의 하나로, 혈액 중에 매우 많이 존재하며, 간에서 생성된다. 자연상태에 존재하는 단순 단백질 중 가장 분자량이 적다. 혈액 중의 혈청 알부민은 혈장부피를 유지하고 회복시키는 기능이 있어서 과다 출혈에 따른 쇼크를 방지하고 수술 및 화상치료 등에 사용된다. 또한 헤모글로빈과 유사한 산소전달 능력을 갖는 것으로 알려져 있다. 인간혈청알부민, 난백알부민, 소혈청알부민 등을 제한없이 포함할 수 있다.
상기 다당류는 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
다른 측면에 따르면, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 다당류(polysaccharide)에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머를 합성하는 방법으로서, 다당류와 소혈청알부민(BSA)의 혼합물을 0.1 ~ 20 %(w/v)의 농도로 증류수에 용해시키는 단계; 및 상기 다당류와 상기 소혈청알부민이 용해된 용액을 40 내지 200℃에서 6시간 내지 72시간 반응시켜, 수열합성을 유도하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
상기 수열합성을 유도하는 단계 이후에, 수열 합성된 상기 폴리머를 투석 처리하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 투석 처리하는 단계는, 100 내지 500 MWCO(molecular weight cut off) 투석막을 이용하여, 24 시간 내지 72 시간 동안 증류수에서 수행될 수 있다.
선택적으로, 상기 투석 처리하는 단계 이후에, 상기 폴리머를 -20℃ 내지 -70℃의 온도에서 냉동 처리한 뒤, 동결건조하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 다당류에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머를 포함하는 효소 안정화 조성몰이 개시된다.
핵산 중합효소(polymerase)를 더욱 포함할 수 있다.
선택적으로, 프라이머(primer), 프로브(probe), 디옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP) 중에서 적어도 하나를 더욱 포함할 수 있다.
필요한 경우, 핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 전술한 효소 안정화 조성물을 준비하는 단계; 상기 효소 안정화 조성물에 핵산 분자가 포함된 생물학적 샘플을 첨가하는 단계; 및 상기 생물학적 샘플이 첨가된 상기 효소 안정화 조성물을 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 핵산 분자를 증폭하는 방법이 개시된다.
상기 생물학적 샘플이 상기 효소 안정화 조성물에 첨가되기 전에, 상기 효소 안정화 조성물은 -20℃ 내지 -70℃에서 냉동 보관 후에 동결건조 될 수 있다.
상기 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있다.
또 다른 측면에서 전술한 효소 안정화 조성물을 준비하는 단계; 상기 효소 안정화 조성물에 핵산 분자가 포함된 생물학적 샘플을 첨가하는 단계; 상기 생물학적 샘플이 첨가된 상기 효소 안정화 조성물을 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 상기 핵산 분자의 증폭 여부를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자의 존재를 분석하는 방법이 개시된다.
본 발명에 따라 다당류와 소혈청알부민이 포합(conjugation)된 폴리머를 첨가한 중합효소연쇄반응 안정화 조성물은 상온 및 고온에서 장기간 보관하더라도 핵산 중합효소의 활성이 안정적으로 유지된다. 특히, 다당류와 소혈청알부민이 단순이 혼합된 것과 달리, 본 발명의 폴리머는 역전사(RT) 과정을 억제하지 않는다.
본 발명의 폴리머 및 이를 포함하는 조성물은 감염성 질환 및/또는 암 발병과 관련이 있는 표적 핵산 분자를 효율적으로 검출하여 질병의 진단에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1 내지 도 4는 다당류에 소혈청알부민이 포합된(conjugated) 폴리머를 합성하는 과정을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 수열 합성에 의하여 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 수열 합성에 의하여 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물의 푸리에 변환 적외선분광법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 수열 합성에 의하여 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물의 size와 zeta potential을 Zetasizer를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 수열 합성에 의하여 합성된 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물의 1H-NMR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 수열 합성에 의하여 합성된 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물의 FT-IR) 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 10a 내지 도 10c는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물(conjugate)을 함유하는 효소 안정화 조성물에 생물학적 샘플을 첨가하고, 실시간 PCR 반응을 진행하여 표적 핵산 서열의 증폭 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물을 함유하는 효소 안정화 조성물에 생물학적 샘플을 첨가하고, 실시간 PCR을 진행한 뒤, 표적 핵산의 존재를 전기영동을 이용하여 검출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 12는 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 합성된 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물을 함유하는 효소 안정화 조성물에 생물학적 샘플을 첨가하고, 실시간 PCR을 진행한 뒤, 표적 핵산의 존재 여부를 전기영동을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 10a 내지 도 10c, 도 11 및 도 12에서, 레인 1과 레인 2는 다당류와 소혈청알부민의 혼합물을 포함하는 효소 안정화 조성물을 가속노화시험 후에 사용한 것이고, 레인 3과 레인 4는 본 발명의 포합물을 포함하는 효소 안정화 조성물을 가속노화시험 후에 사용한 것이며, 레인 5는 -20℃에서 포합물 없이 냉동 보관한 효소 안정화 조성물을 사용한 것이고, 레인 6은 포합물 없이 효소 안정화 조성물을 동결건조하고 가속노화시험 후에 사용 것이다. 레인 1 내지 4, 레인 6은 각각 40℃에서 14일 동안 가속노화 후에 핵산 증폭반응을 수행하였다.
도 13 내지 도 18은 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물(conjugate)을 함유하는 효소 안정화 조성물 및 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물을 함유하는 효소 안정화 조성물과 비교 합성예 1을 함유하는 효소 안정화 조성물에 생물학적 샘플을 첨가하고, 실시간 PCR 반응을 진행하여 표적 핵산 서열의 증폭 정도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 합성된 pullulan과 소혈청알부민 포합물(conjugate)을 함유하는 효소 안정화 조성물 및 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물을 함유하는 효소 안정화 조성물과 비교 합성예 1을 함유하는 효소 안정화 조성물에 생물학적 샘플을 첨가하고, 실시간 PCR 반응을 진행한 뒤, 표적 핵산의 존재를 전기영동을 이용하여 검출한 결과를 나타낸 사진이다.
도 13 내지 도 19에서, 레인 7과 레인 8은 본 발명의 포합물을 포함하는 효소 안정화 조성물을 가속노화시험 후에 사용한 것이며, 레인 9과 레인 10는 비교 합성예 1의 포합물을 포함하는 효소 안정화 조성물을 가속노화시험 후에 사용한 것이며, 레인 11은 -20℃에서 포합물없이 냉동 보관한 효소 안정화 조성물을 사용한 것이고, 레인 12는 포합물없이 효소 안정화 조성물을 동결건조하고 가속노화시험 후에 사용 것이다. 레인 7 내지 10, 레인 12는 각각 40℃에서 14일 동안 가속노화 후에 핵산 증폭반응을 수행하였다.
도 5 내지 도 19에서 BSA는 소혈청알부민, PUL은 Pullulan, HPC는 hydroxypropyl cellulose, PUL-BSA는 pullulan과 소혈청알부민 포합물, HPC-BSA는 hydroxypropyl cellulose와 소혈청알부민 포합물을 나타낸다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.
용어의 정의
본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신, 및 아미노산의 특징인 것으로 당업계에 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 Phe 또는 Pro와 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭된다.
예를 들어, 표준 고체-상 합성 기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 암호화되는(encoded) 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 암호화되지 않은 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로서 지칭된다.
일례로, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노 아디프산 (Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산 (Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산 (Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산 (Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산 (Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌 (Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌 (Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산 (Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴 (EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신 (Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신 (AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린 (3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val에 대한 알로-이소류신 (AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-메틸글리신 (MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신 (MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린 (Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신 (Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술(recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다. 예를 들어 본 발명의 펩타이드는 적어도 5개, 일례로, 적어도 10개의 아미노산으로 구성될 수 있다.
특정 실시형태에서, 화합물의 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 "펩타이드 변이체 (peptide variants)"란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환 (substitutions), 결실 (deletions), 첨가 (additions) 및/또는 삽입 (insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다. 이러한 치환체로서 "보존성"이라고 알려진 아미노산 치환제가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비보존성(nonconservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 예시적인 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입됨으로써, 원래의 서열과 달라진다. 변이체들은 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
"보존성" 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다.
예를 들어 아미노산은 공통적인 곁사슬 특성에 따라 i) 소수성 (노르류신, 메티오닌, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신) ii) 중성 친수성 (시스테인, 세린, 트레오닌, 아스파라진, 글루타민), iii) 산성 (아스파르트산, 글루탐산), iv) 염기성 (히스티딘, 리신, 아르기닌), v) 쇄 방향에 영향을 미치는 잔기 (글리신, 프롤린), vi) 방향족 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌)으로 분류될 수 있다. 보존적 치환은 이들 각각의 클래스 중 하나의 구성원을 동일한 클래스의 다른 구성원으로 교환하는 것을 수반할 것이다.
아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 리신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글리신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글리신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 티로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 티로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르트산 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능 (interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값 (hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 다음과 같은 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파르트산 (+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 리신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 티로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4). 친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
일반적으로, 본 명세서상에 언급되어 있는 펩타이드들(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드들은 분리된 (isolated) 것이다. "분리된 (isolated)" 펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드란 원래의 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들어, 자연 상태로 존재하는 단백질은 그 상태에서 함께 존재하는 물질들 전부 혹은 일부를 제거함으로써 분리되는 것이다. 이러한 폴리펩타이드는 적어도 90% 이상의 순도를 지녀야 하며, 바람직하게는 95%, 더욱 바람직하게는 99% 이상의 순도를 가져야 한다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터 내에서 클로닝 시킴으로써 분리된다.
펩타이드는 재조합 방법(recombinant means) 또는 화학적 합성을 통해 제조함으로써 분리될 수 있다. 본 명세서 상에 언급된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화(encode)되는 재조합 펩타이드, 예를 들어 서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2의 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드는 알려져 있는 많은 발현 벡터들 중 어느 것을 이용하든지 간에 공지의 방법으로 손쉽게 제조될 수 있다. 발현은 재조합 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현벡터로 형질전환 된 적절한 숙주 세포(host cell) 내에서 시킬 수 있다. 적절한 숙주 세포에는 원핵세포들(prokaryotes), 효모(yeast) 및 진핵세포들(eukaryotes)이 포함된다. 일례로, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포주(Cos 또는 CHO 등의)와 같은 진핵생물 유도의 세포주를 숙주세포로 이용하는 것이 바람직하다.
재조합 단백질의 정제를 위해서는 먼저 수용성의 숙주/벡터 시스템에서 얻은, 배양액으로 분비된 재조합 단백질을 포함하는 상등액을 시판되는 필터를 이용하여 농축시킨다. 다음 단계로 상기에서 얻은 농축액을 친화 매트릭스(affinity matrix) 또는 이온교환수지(ion exchange resin) 등의 적절한 정제 매트릭스(purification matrix)를 이용하여 정제한다. 마지막으로 한 단계 또는 여러 단계의 역상(reverse phase) HPLC 를 수행함으로써 순수한 재조합 단백질을 얻을 수 있다.
본 명세서에 기재된 펩타이드 또는 단백질은 숙주 세포의 주변 세포질로 분비되고 그로부터 회수될 수 있다. 전형적으로, 펩타이드 및/또는 단백질의 회수는 일반적으로 삼투압 충격, 초음파처리 또는 용해와 같은 수단에 의해 미생물을 분쇄하는 것을 포함한다. 세포가 파괴되면, 세포 잔해 또는 전-세포를 원심분리 또는 여과에 의해 제거할 수 있다. 펩타이드 및/또는 단백질은 예를 들어 친화성 수지 크로마토그래피에 의해 추가로 정제할 수 있다.
대안적으로, 펩타이드 및/또는 단백질을 배양 배지로 옮기고, 그로부터 단리할 수 있다. 세포를 배양물로부터 제거하고, 배양 상층액(supernatant)을 여과하고 농축하여 생산된 펩타이드 및/또는 단백질을 추가로 정제할 수 있다. 발현된 폴리펩타이드는 통상적으로 공지된 방법, 예컨대 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상의 분별 증류; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환수지, 예컨대 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 사용하는 겔 여과; 소수성 친화도 수지, 매트릭스 상에 고정화된 적합한 항원을 사용하는 리간드 친화도 및 웨스턴 블롯 검정을 이용하여 추가로 단리 및 확인될 수 있다.
본 명세서에서 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 지칭하고 DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 "뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합 효소(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다. 또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드가 가지는 특징, 예를 들어 백신 및/또는 면역증강제로서의 효과를 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다. 예를 들어, 발현 조절 서열과 작동 가능하게 연결되는 코딩 영역 및/또는 이로부터 발현되는 재조합 단백질/펩타이드에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 전술한 코딩 영역 및/재조합 단백질과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 염기 서열의 변이를 가지는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열의 변이를 가지는 단백질/펩타이드일 수 있다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(alignment)하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 정렬 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지되어 있다.
본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 핵산 증폭 반응에서 증폭되는 표적 핵산 분자의 5'-말단 서열 및/또는 3'-말단 서열에 각각 상보적이며, 적절 한 온도에서 적절한 완충액 내에서 적합한 조건(일례로, 4종의 다른 (디)뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합 효소)하에서 주형-지시 핵산 사이의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적절한 길이는 다양한 인자, 예를 들어 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있을 수 있으나, 통상적으로 15개 내지 50 개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"는 단일 사슬 핵산 분자이며, 표적 핵산 서열에 엄격한 조건에서 상보적인 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 프로브는 10개 내지 20개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 "엄격한 조건(stringent condition)에서 혼성화(hybridization)"은 2개의 단일 가닥 핵산 분자가 적어도 70%, 예를 들어 80% 이상 또는 90% 이상의 뉴클레오타이드가 상보적(complementary) 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 지칭한다.
본 발명자들은 핵산 증폭과 관련해서 상온 및 고온에서 장기간 보관하더라도 효소의 활성이 안정적으로 유지될 수 있는 방법을 연구하였다. 이에 다당류(polysaccharide)와 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)의 포합물(conjugate)을 핵산 증폭 반응 안정화 조성물에 첨가하였을 때, 핵산 증폭효소의 안정성이 유지될 수 있다는 점을 발견하였다.
일 측면에서, 본 발명은 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이 다당류(polysaccharide)에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머이다. 본 발명에 따르면, 다당류와 소혈청알부민이 포합된(conjugated) 폴리머가 함유된 효소 안정화 조성물을 장기간 보관하더라도 핵산 중합 효소의 활성이 안정적으로 유지된다.
소혈청알부민이 포함되는 다당류는 단위 성분인 단당류 사이에 임의의 글리코사이드 결합(glycosidic bond)을 가질 수 있다면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 다당류는 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예시적인 측면에서, 다당류는 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 풀루란 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
다당류에 소혈청알부민이 포합된 폴리머는 다당류와 소혈청알부민 사이의 수열(hydrothermal) 반응을 통해 합성될 수 있다. 보다 구체적으로, 다당류와 다당류와 소혈청알부민(BSA)의 혼합물을 0.1 ~ 20 %(w/v)의 농도로 증류수에 용해시키는 단계와, 상기 다당류와 상기 소혈청알부민이 용해된 용액을 40 내지 200℃에서 6시간 내지 72시간 반응시켜, 수열 합성을 유도하는 단계를 포함하고, 선택적으로 수열합성 이후에 폴리머가 생성된 용액을 투석 처리하는 단계와, 합성된 폴리머를 -20℃ 내지 -70℃의 온도에서 냉동 처리한 뒤, 동결건조하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
도 1 내지 도 4는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 다당류의 일례로서 풀루란에 소혈청알부민(BSA)이 포합되는 폴리머를 수열 합성에 의하여 합성하는 과정을 개략적으로 나타낸 모식도이다. 도 1 내지 도 4에서는 다당류로서 풀루란을 예시하였으나, 글리코사이드 결합을 가지는 임의의 다당류에 소혈청알부민이 포합될 수 있다. 또한, 도 1 내지 도 4에서는 다당류의 글리코사이드 결합 부위에 소혈청알부민이 포합되는 것을 예시하였으나, 소혈청알부민이 반드시 다당류의 글리코사이드 결합 부위에 포합되는 것은 아니다.
도 1에서 소혈청알부민의 말단 및/또는 특정 아미노산 곁가지의 일부인 카르복실산기가 풀루란의 글리코사이드 결합 부위에 포합된다. 이 경우, 소혈청알부민과 풀루란은 에스테르 결합을 통하여 연결될 수 있다. 도 2에서 소혈청알부민의 말단 및/또는 아미노산 곁가지의 일부인 아마이드기가 풀루란의 글리코사이드 결합 부위에 포합된다. 이 경우, 소혈청알부민과 풀루란은 N-아세틸글루코자민 형태, 즉 N-linked 글리코사이드 결합을 통해 연결될 수 있다. 선택적으로, 도 3에서 소혈청알부민을 구성하는 아미노산 곁가지의 일부인 아미노기가 풀루란의 글리코사이드 결합 부위에 포합된다. 또한, 도 4에서 소혈청아미노산을 구성하는 아미노산 곁가지의 일부인 하이드록시기가 풀루란의 글리코사이드 결합 부위에 포합된다.
일례로, 소혈청알부민이 다당류에 포합된 폴리머 중에 소혈청알부민의 함량은 0.01 내지 70 중량%, 예를 들어, 10 내지 70 중량% 또는 40 내지 60 중량%의 비율로 포함될 수 있다. 폴리머 중에 소혈청알부민의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우, 다당류에 포합되는 소혈청알부민의 함량이 너무 적어서 소혈청알부민의 포합에 의한 효소 안정화 효과를 기대하기 어렵다. 반면, 폴리머 중에 소혈청알부민의 함량이 70 중량%를 초과하는 경우, 소혈청알부민이 중합 효소의 역전사에 영향을 미치면서 중합 효소의 활성이 저하될 수 있다.
수열 합성이 완료된 이후, 수열 합성된 폴리머는 투석 처리될 수 있다. 일례로, 상기 투석 처리하는 단계는, 100 내지 500 MWCO(molecular weight cut off) 투석막을 이용하여, 24 시간 내지 72 시간 동안 증류수에서 수행될 수 있다. 선택적으로, 투석 처리하는 단계에서 용액의 pH는 5 내지 9일 수 있다.
다른 선택적인 측면에서, 투석 처리 이후에, 소혈청알부민이 다당류에 포합된 상기 폴리머를 -20℃ 내지 -70℃의 온도에서 냉동 처리한 뒤, 동결건조 될 수 있다.
전술한 바와 같이, 소혈청알부민이 다당류에 포합된 폴리머는 효소, 일례로 핵산 중합효소를 안정화시킨다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 소혈청알부민(bovine serum albumin)이 다당류에 포합(conjugation)된 폴리머를 포함하는 효소 안정화 조성물에 관한 것이다.
예시적인 측면에서, 효소 안정화 조성물 중에 소혈청알부민이 다당류에 포합된 폴리머는 0.01 내지 10%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 5%(w/v) 또는 0.5 내지 3%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. 효소 안정화 조성물 중에 소혈청알부민이 다당류에 포합된 폴리머의 함량이 0.01%(w/v) 미만인 경우, 효소 활성 안정화라는 효과를 구현하기 어렵다. 효소 안정화 조성물 중에 소혈청알부민이 다당류에 포합된 폴리머의 함량이 10%(w/v)를 초과하는 경우, 다른 성분의 함량이 감소하면서 핵산 증폭 반응과 같은 의도하였던 반응이 효율적으로 수행되지 못할 수 있다.
효소 안정화 조성물 중에 첨가될 수 있는 DNA 및/또는 RNA 중합 효소는 해당 중합효소를 이용하여 표적 핵산 분자의 증폭 반응이 수행될 수 있다면 특별히 제한되지 않는다. DNA 중합 효소는 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 예시적인 측면에서, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소로서, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및/또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일례로, 효소 안정화 조성물 중에 중합 효소와 dNTP은 프리믹스 형태로 상용화된 것을 사용할 수 있다. 이 경우, 중합 효소와 dNTP 혼합물은 효소 안정화 조성물 중에 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 10 내지 30%(w/v) 또는 15 내지 25%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
효소 안정화 조성물의 일례로서 핵산 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 핵산 증폭 반응 완충액, 기타 핵산 증폭 반응 첨가제 및 핵산 중합효소 조인자를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응을 수행할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dNTP를 원하는 증폭 반응이 달성될 수 있을 정도로 반응액에 공급될 수 있다.
예를 들어, 핵산 증폭 반응에서 어닐링(annealing)은 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가증하게 하는 엄격한 조건 하에서 수행된다. 용어 어닐링 또는 프라이밍(priming)은 주형 핵산 분자에 올리고 뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 이에 따라 중합 효소가 뉴클레오타이드를 중합하여 주형 핵산 분자 또는 그 단편에서 상보적인 핵산 분자가 형성된다. 어닐링을 위한 엄격한 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 예시적인 측면에서 프라이머는 효소 안정화 조성물 중에 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 5 내지 30%(w/v) 또는 5 내지 20%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
필요한 경우, 효소 안정화 조성물은 핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 핵산 증폭 반응용 첨가제는 만니톨(mannitol), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG 10,000), 트레할로오스, 베타인 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 이때, 효소 안정화 조성물 중에 상기 핵산 증폭 반응용 첨가제는 0.5 내지 30%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 20%(w/v) 또는 1 내지 15%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다.
효소 안정화 조성물은 핵산 증폭 반응을 위한 적절한 완충제를 포함할 수 있다. 완충제의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(예를 들어, 트리스-EDTA), HEPES(Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), 아미노산 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 증폭 방법 및 표적 핵산 분자를 검출하는 방법에서, 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 예시적인 측면에서, 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다.
표적 핵산을 증폭할 때, 프라이머의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하고, 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행하면, 표적 핵산이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행할 때, P32 및/또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 본 발명에 따른 효소 안정화 조성물에 첨가하여, 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 핵산을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머 세트를 이용할 수 있다.
표지는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 수행될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 인광, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노-크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 신호(signal)을 제공한다.
프라이머(primer) 및/또는 프로브(probe)는 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 분자는 암(cancer), 종양(tumor) 또는 병원체에서 유래할 수 있으며, DNA 또는 RNA 형태일 수 있다. 예를 들어, 암 또는 종양은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 피부암, 췌장암, 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
선택적으로, 병원체는 병원성 바이러스(예를 들어, 인유두종바이러스(HPV), 인플루엔자바이러스, 코로나바이러스 등) 및 병원성 박테리아 (폐렴균 등)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 표적 핵산 분자는 암, 종양 또는 병원체에 특이적인 핵산 분자이거나, 암 또는 종양의 발병 여부 또는 병원체 감염 여부를 나타내는 마커로서의 핵산 분자일 수 있다.
필요한 경우, 표적 핵산 분자를 포함하는 생물학적 샘플이 효소 안정화 조성물에 첨가되기 전에, 효소 안정화 조성물은 -20℃ 내지 -70℃에서 냉동 보관 후에 동결건조 될 수 있다. 이때, 소혈청알부민이 다당류에 포함된 폴리머는 동결건조 후에 재수화한 뒤, 핵산 증폭 반응용 첨가제와 함께 효소 안정화 조성물에 첨가될 수 있다.
생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 표적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다면, 핵산 증폭 반응은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있다.
이하, 예시적인 실시예를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
합성예 1: 풀루란 및 소혈청알부민의 포합물 합성
100 ㎎ pullulan과 1~200 mg의 소혈청알부민(BSA)를 100 ㎖의 증류수에 녹인 후, 50 ㎖의 Teflon이 코팅된 mold에 넣고 40~200℃에서 6~72 시간 반응시켜 1차 합성물을 수득하였다. 수득한 1차 합성물을 100~500 분자량 컷오프(MWCO) 투석막을 이용하여 pH 5.0~9.0 사이의 증류수에서 3일간 투석하였다. 투석이 완료된 합성물을 동결건조하여 효소 안정화용 폴리머를 회수하였다. Pullulan에 BSA가 포합된 폴리머에 대한 1H NMR 분석 결과를 도 5에, FT-IR 분석 결과를 도 6에, Zetasizer를 이용한 폴리머의 size와 zeta potential 분석 결과를 도 7에 나타낸다.
합성예 2: 하이드록시프로필 셀룰로오스 및 소혈청알부민의 포합물 합성
Pullulan을 대신하여 100 ㎎ 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 출발 물질로 사용한 것을 제외하고, 합성예 1의 절차를 반복하여, 하이드록시프로필 셀롤로오스에 BSA가 포합된 폴리머를 합성하였다. 하이드록시프로필 셀룰로오스에 BSA가 포합된 폴리머에 대한 1H NMR 분석 결과를 도 8에, FT-IR 분석 결과를 도 9 에 나타낸다.
비교 합성예 1: 덱스트란 및 소혈청알부민의 포합물 합성
문헌 [Sonali S. Rohiwal et al., 'Self-assembly of bovine serum albumin (BSA)-dextran bio-nanoconjugate: structural, antioxidantand in vitro wound healing studies', RSC Adv., 2021, 11, 4308-4317 (2021.01.21.)]에 개시된 바와 같이, 덱스트란 및 소혈청알부민의 포합물은 상기 문헌에 따라 덱스트란과 BSA를 7일간 Maillard 반응하여 합성하였다.
실시예 1: 효소 안정화 조성물 제조
합성예 1에 따라 pullulan과 BSA가 포합된 폴리머를 포함하는 효소 안정화 조성물의 일례로서 핵산 증폭 반응 안정화 조성물을 제조하였다. 핵산 증폭 반응 안정화 조성물에 첨가된 성분 및 함량을 하기 표 1에 나타낸다. 구체적으로, 핵산 증폭 반응 안정화 조성물을 0.2 ㎖ PCR tube 또는 96-well plate에 10 ㎕씩 분주하고, -20℃에서 24시간 냉동한 후, 24~72 시간 동결건조하여 결정화시켰다. 결정화된 핵산 증폭 반응 안정화 조성물을 40℃에서 2주간 가속노화 시험을 실시하였다.
가속노화 시험은 『의료기기의 안정성 시험 기준 제정고시』를 참조하였으며, 가속노화계수(Accelerated Aging Factor, AAF)는 다음 식에 따라 측정하였다.
AAF = Q10 [(TAA-TRT)/10]
TAA = 가속노화온도 (℃); TRT = 제품 보관 온도 (℃); 가속노화시간(AAT)=설정된 (RT)/AAF
40℃의 온도 조건으로 0,7과 14일간 노출시킨 후, 실험을 진행하였다. -20℃ 기준으로 환산하였을 때, 7일은 448일, 14일은 896일의 안정성을 유지할 수 있음을 의미한다.
한편, 대조군을 설정하기 위하여, pullulan과 BSA를 단순히 혼합하고 핵산 증폭 반응 안정화 조성물을 제조하고 동일한 절차에 따라 가속노화시험을 진행하였다. 또한, 다른 대조군으로 액상의 Taq 폴리머라아제를 -20℃에 보관한 그룹, buffer를 첨가하고 동결건조하여 40℃에서 2주간 보관하여 가속노화시험을 진행한 그룹으로 구분하였다.
핵산 증폭 반응 안정화 조성물
Group Pullulan + BSA
(40℃)		 포합 폴리머
(40℃)		 냉동
(-20℃)		 동결건조
(40℃)
구분 1 2 3 4 5 6
폴리머(5%) 4 ㎕ 6 ㎕ 4 ㎕ 6 ㎕ - -
프리믹스* 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕
첨가제* 5 ㎕ 5 ㎕ 5 ㎕ 5 ㎕ - -
TE buffer 7 ㎕ 5 ㎕ 7 ㎕ 5 ㎕ - 16 ㎕
총 부피 20 ㎕ 20 ㎕ 20 ㎕ 20 ㎕ 4 ㎕ 20 ㎕
프리믹스: Taq 중합효소(5 Unit/㎕), 2.5 mM dNTP 혼합
첨가제: Mannitol, PEG 10000, Trehalose, Betaine (5~40 중량%)
실험예 1: 핵산 증폭 성능 평가
실시예 1에서 제조한 핵산 증폭 반응 안정화 조성물의 중합효소 안정화 성능을 평가하기 위하여, 가속노화시험 후에 보관된 핵산 증폭 반응 안정화 조성물에 코로나19 바이러스(COVID-19) 환자의 양성 검체를 1/100로 희석한 샘플과, 코로나19 바이러스의 열린해독틀(Open Reading Frame, ORF) 중에서 RdRP(RNA Dependent RNA polymerase) 영역과, N(Nucleocapsid) 영역에 특이적인 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 첨가한 뒤, 핵산 증폭 반응을 수행하였다. 양성 검체 RNA는 10 ㎕, RdRP 영역에 특이적인 프라이머 4 ㎕, N 영역에 특이적인 프라이머 4 ㎕, Internal control 0.1 ㎕을 첨가하였다. 핵산 증폭 반응은 50℃에서 5분, 94℃에서 20초 동안 1 cycle을 진행한 뒤, 90℃에서 1초 64℃에서 10초의 사이클을 38회 수행하였다.
가속노화 시간에 따른 핵산 증폭 반응에서의 증폭 정도를 측정한 결과를 도 10a 내지 도 10c에 나타낸다. 본 발명에 따라 pullulan과 BSA의 포합 폴리머를 첨가한 레인 3과 레인 4의 샘플은 냉동 상태의 대조군인 레인 5와 비교해서 중합 효소의 활성도 차이는 거의 없었다. 반면, pullulan과 BSA가 단순히 배합하여 첨가한 레인 1과 레인 2의 샘플은 BSA가 중합 효소의 역전사 과정에 영향을 미쳐서 중합 효소의 활성도가 크게 저하된 것을 확인하였다.
실험예 2: 전기영동을 이용한 핵산 증폭 성능 평가
실험예 1에서 핵산 증폭 반응을 이용하여 샘플 내의 표적 핵산 분자를 증폭한 후, 아가로스 겔 상에서 전기영동(100V, 20분)을 수행하였다. 전기영동 분석 결과를 도 11에 나타낸다. 실험예 1에서와 같이, 본 발명에 따라 pullulan과 BSA의 포합 폴리머는 중합 효소의 안정성을 크게 향상시킨 반면, pullulan과 BSA가 단순히 배합된 샘플에서 중합 효소의 활성도가 크게 저하되었다.
실험예 3: 전기영동을 이용한 핵산 증폭 성능 평가
합성예 1에서 합성한 PUL-BSA 포합 폴리머를 대신하여, 합성예 2에서 합성한 HPC-BSA 포합 폴리머가 배합된 효소 안정화 조성물의 일례로서 핵산 증폭 반응 안정화 조성물을 제조하고, 실험예 1 및 실험예 2와 동일한 방법으로 핵산 증폭 반응을 진행하고, 전기영동을 이용하여 표적 핵산의 증폭 여부를 검출하였다. 분석 결과를 도 12에 나타낸다. 다당류인 HPC와 BSA의 포합 폴리머를 첨가한 조성물에서 중합 효소의 활성이 안정적으로 유지되었으나, HPC와 BSA의 단순 배합물을 첨가한 조성물에서 중합 효소의 활성이 크게 저하되었다.
실험예 4: 합성예 1, 2 및 비교 합성예 1의 비교
비교 합성예 1의 덱스트란-BSA의 포합물과, 합성예 1의 풀루란-BSA의 포합물 및 합성예 2의 하이드록시프로필 셀룰로오스-BSA의 포합물의 효소 안정성 여부를 평가하였다. 구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 효소 안정화 조성물을 제조하고 실험예 1 및 실험예 2와 동일한 방법으로 핵산 증폭 반응을 진행하고, 전기영동을 이용하여 표적 핵산의 증폭 여부를 검출하였다. HPC는 하이드록시프로필 셀룰로오스를 나타내고, BSA는 소혈청알부민을 나타낸다.
핵산 증폭 반응 안정화 조성물에 첨가된 성분 및 함량을 하기 표 2에 나타낸다.
Group 풀루란-BSA
(40℃)		 HPC-BSA
(40℃)		 덱스트란-BSA
(40℃)		 냉동
(-20℃)		 동결건조
(40℃)
구분 7 8 9 10 11 12
폴리머(5%) 4 ㎕ 6 ㎕ 4 ㎕ 6 ㎕ - -
프리믹스* 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕ 4 ㎕
첨가제* 5 ㎕ 5 ㎕ 5 ㎕ 5 ㎕ - -
TE buffer 7 ㎕ 5 ㎕ 7 ㎕ 5 ㎕ - 16 ㎕
총 부피 20 ㎕ 20 ㎕ 20 ㎕ 20 ㎕ 4 ㎕ 20 ㎕
프리믹스: Taq 중합효소(5 Unit/㎕), 2.5 mM dNTP 혼합
첨가제: Mannitol, PEG 10000, Trehalose, Betaine (5~40 중량%)
그 결과를 도 13 내지 19에 나타내었다. 도 13 내지 18은 가속 기간에 따른 핵산 증폭 반응을 나타내고, 도 19는 전기영동분석 결과를 나타낸다.
도 13 내지 19에 나타낸 바와 같이, 비교 합성예 1을 이용한 9 및 10과 비교해서, 풀루란 및 하이드록시프로필 셀룰로오스 중에서 어느 하나인 다당류와 BSA의 포합물을 이용한 7 및 8에 있어서 효소 안정화 효과가 크게 향상되었음을 알 수 있다.
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

Claims (15)

  1. 혈청알부민(serum albumin)이 다당류(polysaccharide)에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 다당류는 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 폴리머.
  3. 혈청알부민(serum albumin)이 다당류(polysaccharide)에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머를 합성하는 방법으로서,
    다당류와 혈청알부민의 혼합물을 0.1 ~ 20 %(w/v)의 농도로 증류수에 용해시키는 단계; 및
    상기 다당류와 상기 혈청알부민이 용해된 용액을 40 내지 200℃에서 6시간 내지 72시간 반응시켜, 수열합성을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 수열합성을 유도하는 단계 이후에, 수열 합성된 상기 폴리머를 투석 처리하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 투석 처리하는 단계는, 100 내지 500 MWCO(molecular weight cut off) 투석막을 이용하여, 24 시간 내지 72 시간 동안 증류수에서 수행되는 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 투석 처리하는 단계 이후에, 상기 폴리머를 -20℃내지 -70℃의 온도에서 냉동 처리한 뒤, 동결건조하는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  7. 혈청알부민(serum albumin)이 다당류에 포합(conjugation) 되어 있는 폴리머를 포함하는 효소 안정화 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 다당류는 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 효소 안정화 조성물.
  9. 제 7항에 있어서,
    핵산 중합효소(polymerase)를 더욱 포함하는 효소 안정화 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    프라이머(primer), 프로브(probe), 디옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP) 중에서 적어도 하나를 더욱 포함하는 효소 안정화 조성물.
  11. 제 7항에 있어서,
    핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함하는 효소 안정화 조성물.
  12. 제 7항 내지 제 11항 중에서 어느 하나의 청구항에 기재된 효소 안정화 조성물을 준비하는 단계;
    상기 효소 안정화 조성물에 핵산 분자가 포함된 생물학적 샘플을 첨가하는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플이 첨가된 상기 효소 안정화 조성물을 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계
    를 포함하는 핵산 분자를 증폭하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플이 상기 효소 안정화 조성물에 첨가되기 전에, 상기 효소 안정화 조성물은 -20℃내지 -70℃에서 냉동 보관 후에 동결건조 되는 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용하는 방법.
  15. 제 7항 내지 제 11항 중에서 어느 하나의 청구항에 기재된 효소 안정화 조성물을 준비하는 단계;
    상기 효소 안정화 조성물에 핵산 분자가 포함된 생물학적 샘플을 첨가하는 단계;
    상기 생물학적 샘플이 첨가된 상기 효소 안정화 조성물을 이용하여 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 핵산 분자의 증폭 여부를 검출하는 단계
    를 포함하는 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자의 존재를 분석하는 방법.
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