CN1889937A - 糖基聚乙二醇化的因子ⅸ - Google Patents

Abstract

本发明提供因子IX和PEG部分之间的缀合物。该缀合物通过介于并共价附着于肽和修饰基团间的完整糖基连接基团连接。该缀合物由糖基化的肽通过糖基转移酶作用形成。糖基转移酶将修饰的糖部分连接在肽的糖基残基上。还提供了制备该缀合物的方法、用该缀合物治疗多种病症的方法和包含该缀合物的药物制剂。

Description

糖基聚乙二醇化的因子IX 与相关申请相互参考

本申请要求下列申请的优先权：U.S.临时专利申请No.60/527,089(在2003年12月3日提交，此处引用其整体作为参考用于所有目的)；U.S.临时专利申请No.60/539,387(2004年1月26日提交)；U.S.临时专利申请No.60/592,744(2004年7月29日提交)；U.S.临时专利申请号60/614,518(2004年9月29日提交)；和U.S.临时专利申请号60/623,387(2004年10月29日提交)，此处引用其各自整体作为参考用于所有目的。

发明背景

维生素K依赖性蛋白质(例如因子IX)在其氨基端45个残基中包含9到13个γ-羧基谷氨酸残基(Gla)。Gla残基通过肝中利用维生素K羧化蛋白质前体中谷氨酸残基侧链的酶产生。维生素K依赖性蛋白质与大量生物学过程有关，其中最详细描述的为凝血(Nelsestuen，Vitam.Horm.58：355-389(2000)综述)。维生素K依赖性蛋白质包括蛋白质Z、蛋白质S、凝血酶原(因子II)、因子X、因子IX、蛋白质C、因子VII、Gas6和基质GLA蛋白质。因子VII、IX、X和II用于促凝过程而蛋白质C、蛋白质S和蛋白质Z用于抗凝作用。Gas6是由生长停滞特异基因6(gas6)编码的生长停滞激素并与蛋白质S相关。见Manfioletti等，Mol.Cell.Biol.13：4976-4985(1993)。基质GLA蛋白质通常发现于骨中并对阻止循环中软组织钙化是关键的。Luo等，Nature 386：78-81(1997)。

调节血液凝固是代表了许多主要健康问题(包括不能形成血块和血栓、形成不需要的血块)的过程。在许多情形下使用阻止不需要的血块形成的试剂且许多试剂是可用的。不幸的是，多数现有疗法具有不良的副作用。口服抗凝血剂例如华法林(Warfarlin)通过抑制维生素K在肝中的作用而作用，从而阻止维生素K依赖性蛋白质谷氨酸残基的完全羧化，引起循环系统中活性蛋白质浓度降低和形成血块能力降低。药物与其靶标的竞争性使华法林疗法复杂化。饮食中维生素K的波动可引起华法林过量或不足。凝结活性的波动为该疗法的不良结果。

注射的物质例如肝素(包括低分子量肝素)也是常用的抗凝血剂。另外，这些化合物使用过量并必须小心监控。

更新种类的抗凝血剂包括活性位点修饰的维生素K依赖性凝血因子例如因子VIIa和IXa。活性位点被丝氨酸蛋白酶抑制剂例如氨基酸或短肽的氯甲基酮衍生物封闭。活性位点修饰的蛋白质保留与其各自的辅因子形成复合物的能力，但是是失活的，从而不产生酶活性并阻止辅因子与各自的活性酶复合。简言之，这些蛋白质显示提供无其他抗凝血剂不良副作用的抗凝疗法的益处。活性位点修饰的因子Xa为该组中另一可能的抗凝血剂。其辅因子蛋白质为因子Va。活性位点修饰的激活蛋白C(APC)可能也是凝血的有效抑制子。见Sorensen等，J.Biol.Chem.272：11863-11868(1997)。活性位点修饰的APC结合因子Va并阻止因子Xa结合。

使用维生素K依赖性凝血因子的主要阻碍在于成本。维生素K依赖性蛋白质的生物合成依赖于完整的谷氨酸羧化体系，其存在于少量动物细胞类型中。这些蛋白质的超量生产受限于该酶体系。另外，这些蛋白质的有效剂量较高。通常剂量为1000ug肽/kg体重。见Harker等，1997，如上。

另一阻止治疗肽使用的现象是众所周知的蛋白质糖基化方面，即这些肽显示的体内相对短的半衰期。总之，短的体内半衰期问题意味着治疗糖肽必须时常以高剂量给药，最终转化为必须更高(与制备更有效的产生更长效用的糖蛋白治疗剂的方法相比)的医疗费。

例如，因子VIIa说明了该问题。因子VII和VIIa在人中有大约2-4小时的循环半衰期。即在2-4小时内，肽在血清中的浓度减少一半。当使用因子VIIa作为促凝血剂治疗某些形式的血友病时，标准方案为每两小时注射高剂量(45到90.mu.g/kg体重)VIIa。见Hedner等，Transfus.Med.Rev.7：78-83(1993)。因此，使用这些蛋白质作为促凝血剂或抗凝血剂(在因子VIIa情况下)要求以频繁间隔和高剂量施用蛋白质。

提供成本效益好的糖肽疗法问题的一种解决方法为提供具有更长体内半衰期的肽。例如，已经通过将合成聚合物附着在肽主链上产生了具有改进的药物代谢动力学性质的糖肽治疗剂。示例性的与肽缀合的多聚体为聚乙二醇(“PEG”)。使用PEG衍生肽治疗剂被证明减少了肽的免疫原性。例如，U.S.专利No.4,179,337(Davis等)公开了非免疫原的多肽例如与聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶联的酶和肽激素。除减少免疫原性外，循环中的清除时间也因为所述多肽的PEG缀合物的尺寸增大而延长。

PEG及其衍生物附着肽的主要方式为通过肽氨基酸残基的非特异性成键(见例如U.S.专利号4,088,538、U.S.专利号4,496,689、U.S.专利号4,414,147、U.S.专利号4,055,635和PCT WO 87/00056)。PEG附着肽的另一方式为通过非特异性氧化糖肽上的糖基残基(见例如WO 94/05332)。

在这些非特异性方法中，聚乙二醇以随机、非特异性方式加至肽主链的反应性残基上。当然，随机加入PEG具有其缺点，包括缺乏最终产物同质性，和可能降低肽的生物学或酶活性。因此，为了产生治疗肽，引起特异标记的、容易鉴定的、基本同质的产物的衍生策略是占优势的。已经发展了这样的方法。

特异标记的、同质的肽治疗剂可通过酶作用在体外产生。与通常的合成多聚体或其他标记附着至肽的非特异性方法不同，基于酶的合成具有区域选择性和立体选择性的优点。用于标记的肽合成中的两种主要类型的酶为糖基转移酶(例如唾液酸转移酶、寡糖基转移酶和N-乙酰氨基葡糖转移酶)和糖苷酶。这些酶可用于糖的特异附着，糖随后可被修饰以包含治疗部分。另外，糖基转移酶和修饰的糖苷酶可用于将修饰的糖直接转移至肽主链(见例如U.S.专利6,399,336和U.S.专利申请出版物20030040037、20040132640、20040137557、20040126838和20040142856，此处引用各项作为参考)。结合化学和酶合成元素的方法也是已知的(见例如Yamamoto等，Carbohydr.Res.305：415-422(1998)和U.S.专利申请出版物20040137557，此处引用作为参考)。

因子IX是非常有价值的治疗肽。尽管现在使用市售形式的因子IX，这些肽可通过增强产生的分离糖蛋白产物药物代谢动力学的修饰来改进。因此，本领域仍需要具有改进效用和更佳药物代谢动力学的更长效的因子IX肽。此外，为了对最大数量的个体有效，必须能够以工业规模产生具有改进治疗药物代谢动力学的因子IX肽，其具有可预测的、基本同质的结构，该结构能够容易地一次又一次地复制。

幸运的，现在已经发现具有改进的药物代谢动力学的因子IX肽和制备他们的方法。除了具有改进的药物代谢动力学的因子IX肽之外，本发明还提供工业可行的和成本效益好的用于生产这些因子IX肽的方法。本发明的因子IX肽包含修饰基团例如PEG部分、治疗部分、生物分子等等。本发明因此满足了对用于治疗疾病和病症(其中因子IX提供了有效的治疗)具有改进的治疗功效和改进的药物代谢动力学的因子IX肽的需要。

发明概述

目前发现用一个或多个聚乙二醇部分受控修饰因子IX提供了具有改进的药物代谢动力学性质的新因子IX衍生物。此外，已发现并发展了用于可靠制造本发明修饰的因子IX肽的成本效益好的方法。

一方面，本发明提供包括

部分的因子IX肽。在上式中，D为-OH或R¹-L-HN-。符号G代表R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烃基。R¹为包含直链或分支聚乙二醇残基的部分；且L为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头。通常，当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。如本领域技术人员将理解的，在文中公布的唾液酸类似物中，COOH还代表COO^-或其盐。

在另一方面，本发明提供制造包含上述部分的PEG化因子IX的方法。本发明的方法包括(a)在适合转移的条件下，将底物因子IX肽与PEG-唾液酸供体和转移PEG-唾液酸至因子IX肽氨基酸或糖基残基上的酶接触。示范的PEG-唾液酸供体部分具有式

在一个实施方案中宿主细胞为哺乳动物细胞。在其他实施方案中宿主细胞为昆虫细胞、植物细胞、细菌或真菌。

在另一方面，本发明提供治疗有此需要的受试者中疾病的方法，其中该疾病特征为受试者中凝血受损。该方法包括向受试者施用能够有效改善受试者中病症的数量的本发明因子IX肽缀合物的步骤。该方法能治疗的示范的病症为血友病。

在另一方面，本发明提供包含本发明因子IX肽和药学可用载体的药物制剂。

本领域技术人员将根据下文详述明白其他本发明的目的和优点。

附图描述

图1为因子IX的结构，显示潜在糖基化位点Asn 157、Asn 167；Ser 53、Ser 61、Thr 159、Thr 169和Thr 172的存在和定位。

图2为显示示范的本发明实施方案的图，其中因子IX肽上糖残基被重构并糖基聚乙二醇化：(A)唾液酸部分用唾液酸酶去除且产生的半乳糖残基用图5的唾液酸衍生物糖基聚乙二醇化；(B)甘露糖残基用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(C)N-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(D)O-聚糖的唾液酸部分用唾液酸PEG糖基聚乙二醇化；(E)来自2(A)的因子IX的SDS PAGE凝胶；(F)来自产生2(C)和2(D)的反应的因子IX的SDS PAGE凝胶。

图3为比较未糖基化的因子IX和酶促糖基聚乙二醇化的因子IX的体内停留寿命的曲线。

图4为比较图3所示种类活性的表格。

图5为因子IX的氨基酸序列。

图6为与未聚乙二醇化的因子IX比较，多种糖基聚乙二醇化的因子IX分子的药物代谢动力学性质图形表示。

图7是本发明中使用的代表性的修饰的糖种类图表。

图8是本发明中使用的代表性修饰的糖种类的图表。

图9是用于将修饰的唾液酸部分(如文中公开的那些)和未修饰的唾液酸部分转移至受体的唾液酸转移酶图表。

发明详述及优选的实施方案

缩写

PEG，聚乙二醇；PPG，聚丙二醇；Ara，阿拉伯糖基；Fru，果糖基；Fuc，岩藻糖基；Gal，半乳糖基；GalNAc，N-乙酰半乳糖胺基；Glc，葡萄糖基；GlcNAc，N-乙酰氨基葡糖基；Man，甘露糖基；ManAc，甘露糖胺基乙酸(mannosaminyl acetate)；Xyl，木糖基和NeuAc，唾液酸(N-乙酰神经氨酸基)；M6P，甘露糖-6-磷酸；Sia，唾液酸，N-乙酰神经氨酸基及其衍生物和类似物。

定义

除非另有说明，文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。通常，文中使用的术语以及细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学和杂交中的实验室操作为本领域熟知并常规使用的。标准技术用于核酸和肽合成。技术和操作通常根据本文件中各处提供的本领域常规方法和多种一般参考(一般参见Sambrook等《MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL》，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，文中引用作为参考)执行。文中使用的术语以及分析化学和下述有机合成的实验室操作为本领域熟知并通常使用的。标准技术或其变更用于化学合成和化学分析。

所有文中描述的寡糖以非还原糖(即Gal)名称或缩写描述，跟着是糖苷键构型(α或β)、环键(1或2)、与键有关的还原糖的环位置(2、3、4、6或8)，然后是还原糖的名称或缩写(即GlcNAc)。每种糖优选吡喃糖。标准糖生物学命名法综述见《Essentials ofGlycobiology》，Varki等编辑，CSHL Press(1999)。

寡糖被认为具有还原性末端和非还原性末端，无论还原性末端的寡糖是否事实上为还原性糖。与公认的术语相同，文中所述的寡糖用左侧为非还原性末端和右侧为还原性末端表示。

术语“唾液酸”是指九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族最常见的成员为N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺基-3，5-双脱氧-D-甘油基-D-galactononulopyranos-1-onic acid(常缩写为Neu5Ac、NeuAc或NANA)。该家族的另一成员为N-乙醇酰-神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基团被羟基化。再一唾液酸家族成员为2-酮-3-脱氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等(1986)J.Biol.Chem.261：11550-11557；Kanamori等，J.Biol.Chem.265：21811-21819(1990))。还包括9-取代唾液酸例如9-O-C1-C6酰基-Neu5Ac如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac、9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮基-9-脱氧-Neu5Ac。唾液酸家族综述见例如Varki，Glycobiology 2：25-40(1992)；《Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function》R.Schauer编辑(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化过程中唾液酸化合物的合成及使用在1992年十月1日公布的国际申请书WO 92/16640中公开。

“肽”是指多聚体，其中单体为氨基酸并通过酰胺键结合，也可称为多肽。另外，非天然氨基酸例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸亦包括在内。非基因编码的氨基酸也可用于本发明。另外，本发明也可使用被修饰含有活性基团、糖基化位点、多聚体、治疗部分、生物分子等的氨基酸。本发明中使用的所有氨基酸可为d-或1-异构体。通常优选1-异构体。此外，其他肽模拟物(peptidomimetics)也可用于本发明。文中所用“肽”是指糖基化和非糖基化的肽。还包括被表达肽的体系不完全糖基化的肽。一般的综述见Spatola，A.F.，Chemistry and Biochemistry of Amino Acids，Peptides andProteins，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，New York，267页(1983)。

术语“肽缀合物”是指本发明的种类，其中肽与文中公开的修饰的糖缀合。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸以相似方式作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为由遗传密码编码的以及随后被修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的α碳、羧基、氨基和R基团(例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。这些类似物有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保持了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸一般化学结构不同的结构，但以与天然存在氨基酸类似形式作用的化学化合物。文中使用“氨基酸”，无论其在接头中或肽序列组成中，都指该氨基酸的D-和L-异构体以及这两种异构体的混合。

文中使用术语“修饰的糖”是指天然或非天然存在的碳水化合物，其在本发明方法中被酶促加至肽的氨基酸或糖基残基上。修饰的糖选自许多酶底物，包括但不仅限于糖核苷酸(单-、双-和三磷酸)、活化的糖(例如糖基卤化物、糖基甲磺酸)、和既未活化又非核苷酸的糖。“修饰的糖”用“修饰基团”共价官能化。有用的修饰基团包括但不仅限于PEG部分、治疗部分、诊断部分、生物分子等。修饰基团优选不是天然存在或未修饰的碳水化合物。选择用修饰基团官能化的部位使得其不阻碍“修饰的糖”被酶加至肽上。

术语“水溶性的”是指在水中具有若干可检测程度溶解性的部分。检测和/或定量溶解性的方法为本领域所熟知的。示范的水溶性多聚体包括肽、糖、聚醚、聚胺、聚羧酸等。肽可具有混合序列或由单一氨基酸序列组成(例如聚赖氨酸)。示范的多糖为聚唾液酸。示范的聚醚为聚乙二醇。聚乙二胺为示范的聚胺，且聚丙烯酸为代表性的聚羧酸。

水溶性多聚体的多聚体主链可为聚乙二醇(即PEG)。然而，应该理解其他相关的多聚体也适合用于本发明实践，而且术语PEG或聚乙二醇的使用旨在包括并不仅限于该方面。术语PEG包括聚乙二醇的任何形式，包括烷氧基PEG、双官能PEG、多臂PEG、叉状PEG、分支PEG、侧挂型PEG(即有一个或多个官能团悬挂在多聚体主链上的PEG或相关多聚体)或带有可降解键的PEG。

多聚体主链可以是线性的或分支的。分支的多聚体主链通常为本领域已知。一般的，分支的多聚体具有中枢分支核心部分和结合在中枢分支核心的许多线性多聚体链。PEG通常以分支形式使用，其可通过向多种多元醇(例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇)加成环氧乙烷来制备。中枢分支部分还可产生自一些氨基酸例如赖氨酸。分支聚乙二醇通常可以R(-PEG-OH)_m方式表示，其中R代表核心部分例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的数目。多臂PEG分子(例如U.S.专利No.5,932,462中所述，在文中引用其整体作为参考)也可作为多聚体主链使用。

许多其他的多聚体也适用于本发明。非肽且水溶性的具有2到大约300末端的多聚体主链在本发明尤其有用。合适的多聚体实例包括但不仅限于其他聚亚烷基二醇例如聚丙二醇(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物等、聚氧乙基多元醇、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚α-羟基酸、聚乙烯醇、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)(例如在U.S.Pat.No.5,629,384中所描述的，文中引用其整体作为参考)和其共聚物，三元共聚物及混合物。尽管多聚体主链每条链的分子量可变，其一般在从大约100Da至大约100,000Da的范围内，通常从大约6000Da到大约80,000Da。

文中在向病人施用肽药物的上下文中使用“曲线下面积”或“AUC”是指从零到无穷大作为时间函数的描述病人体循环中药物浓度的曲线下的总面积。

文中在向病人施用肽药物的上下文中使用术语“半衰期”或“t_1/2”是指药物在病人中的血浆浓度降至一半需要的时间。依赖于多重清除机制、重新分配和本领域其他熟知的机制，可以存在超过一个关于肽药物的半衰期。通常，定义α和β半衰期使得α期与重新分配相关，且β期与清除相关。然而，对于大部分被限制在血液中的蛋白质药物而言，至少存在两个清除半衰期。对一些糖基化的肽来说，快速β期清除可由巨噬细胞或内皮细胞上识别末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖或岩藻糖的受体介导。较慢的β期清除可通过肾小球对有效半径＜2nm(大约68kD)分子的过滤和/或在组织中特异或非特异吸收和代谢发生。糖基聚乙二醇化可给末端糖(例如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)加帽从而阻断通过识别这些糖的受体的快速α期清除。还可给予较大的半径并因此减少分布容量及组织吸收，从而延长晚β期。因此，糖基聚乙二醇化对α期和β期半衰期的精确影响将依赖于大小、糖基化状态和如本领域熟知的其他参数而变化。“半衰期”的进一步解释可见《Pharmaceutical Biotechnology》(1997，DFA Crommelin和RD Sindelar编辑，Harwood Publishers，Amsterdam，101-120页)。

文中使用术语“糖缀合”是指修饰的糖种类与多肽(例如因子IX肽底物)的氨基酸或糖基残基的酶介导结合。“糖缀合”的下位类别为“糖基聚乙二醇化”，其中修饰的糖的修饰基团为聚乙二醇和其烃基衍生物(例如m-PEG)或其活性衍生物(例如H₂N-PEG，HOOC-PEG)。

术语“大规模的”和“工业规模的”可互换使用，并指在单个反应循环完成时产生至少大约250mg，优选至少大约500mg，且更优选至少大约1g糖缀合物的反应循环。

文中使用术语“糖基连接基团”是指与修饰基团(例如PEG部分、治疗部分、生物分子)共价结合的糖基残基；糖基连接基团连接修饰基团和缀合物残余部分。在本发明方法中，“糖基连接基团”共价结合在糖基化的或非糖基化的肽上，从而将试剂连接在肽的氨基酸和/或糖基残基上。“糖基连接基团”通常通过“修饰的糖”酶促附着在肽的氨基酸和/或糖基残基上而从“修饰的糖”得来。糖基连接基团可为糖衍生的结构，其在修饰基团-修饰的糖盒形成时降解(例如氧化→Schiff碱形成→还原)或糖基连接基团可是完整的。“完整的糖基连接基团”是指衍生自其中将修饰基团结合至缀合物残余部分的糖单体未降解(例如被如高碘酸钠氧化)的部分的连接基团。本发明的“完整的糖基连接基团”可衍生自天然存在的寡糖，通过向亲本糖结构加成糖基单位或从中移除一个或多个糖基单位。

文中使用术语“靶向部分”是指将选择性定位于身体特定组织或区域的种类。定位由分子决定子的特异识别、靶向剂或缀合物的分子大小、离子相互作用、疏水性相互作用等介导。其他将试剂靶向至特定组织或区域的机制为本领域技术人员已知。示范的靶向部分包括抗体、抗体片段、运铁蛋白、HS-糖蛋白、凝血因子、血清蛋白、β-糖蛋白、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)等。

文中使用“治疗部分”是指任何可用于治疗的试剂，包括但不仅限于抗生素、抗炎剂、抗肿瘤药物、细胞毒素和放射性试剂。“治疗部分”包括生物活性剂前药(其中多于一个的治疗部分结合在载体上的构建体例如多价体)。治疗部分还包括蛋白质和包含蛋白质的构建体。示范的蛋白质包括但不仅限于粒细胞集落刺激因子(GCSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、干扰素(例如干扰素α、-β、-γ)、白介素(例如白介素II)、血清蛋白(例如因子VII、VIIa、VIII、IX和X)、人体绒毛膜促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)和黄体生成素(LH)和抗体融合蛋白质(例如肿瘤坏死因子受体(TNFR)/Fc结构域融合蛋白质)。

文中使用“可药用载体”包括任何与缀合物组合后保留缀合物活性并与受试者免疫系统无反应的物质。实例包括但不仅限于任何标准药物载体例如磷酸盐缓冲盐水、水、乳液(例如油/水乳液)以及多种类型的湿润剂。其他载体也可包括灭菌溶液、片剂(包括包衣片剂)和胶囊。一般这些载体包含赋形剂例如淀粉、乳、糖、某种类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油脂、树胶、二元醇或其他已知赋形剂。这些载体还可包括香料添加剂或着色添加剂或其他成分。包含这些载体的组合物根据熟知的常规方法配制。

文中使用“施用”是指口服、作为栓剂使用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内或鼻内或皮下施用，或向受试者植入缓释装置(例如微型渗透泵)。施用通过任何途径进行，包括肠胃外和跨粘膜(例如口腔的、鼻的、阴道的、直肠的或经皮肤的)。肠胃外给药包括例如静脉内、肌肉内、微动脉内、皮内、皮下的、腹膜内的、心室内和颅内的。另外，当注射旨在治疗肿瘤例如诱导细胞调亡时，可直接施用至肿瘤和/或肿瘤周围组织。其他模式的递送包括但不仅限于使用脂质体制剂、静脉输注液、透皮贴剂等。

术语“改善”是指在治疗病理或病症中任何成功的标记，包括任何客观的或主观的参数例如症状的减轻、缓和或消除或病人身体或精神状态的改善。症状的改善可基于客观的或主观的参数，包括体格检查和/或精神评估的结果。

术语“治疗”是指对疾病或病症的“治疗”，包括阻止病症或疾病在可能患该疾病但未经历或显示该疾病症状的动物上发生(预防疗法)、抑制疾病(减缓或阻止其发展)、使得疾病症状或副作用减轻(包括姑息疗法)和解除疾病(使疾病消退)。

术语“有效量”或“治疗有效量”或任何语法上相等的术语是指当施用于动物以治疗疾病时足够引起对该疾病治疗的数量。

术语“分离的”是指物质，其本质上或基本上不含有用于产生该物质的成分。就本发明肽缀合物而言，术语“分离的”是指本质上或基本上不含有用于制备肽缀合物的混合物中通常伴随材料的成分的材料。“分离的”和“纯的”可互换使用。一般的，本发明分离的肽缀合物具有的纯度水平优选以范围表达。肽缀合物纯度范围的下限为大约60％、大约70％或大约80％，且纯度范围的上限为大约70％、大约80％或大于大约90％。

当肽缀合物纯度大于大约90％时，其纯度也优选以范围表示，纯度范围的下限为大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。纯度范围的上限为大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约100％纯度。

纯度由领域公认的任何分析方法确定(例如银染凝胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳上的谱带强度、HPLC或相似方法)

文中使用“群体的基本上每个成员”描述本发明肽缀合物群体的特征，其中加至肽的选定比例的修饰的糖被加至肽上多个同样的受体位点。“群体的基本上每个成员”是讲与修饰的糖缀合的肽上位点的“同质性”并涉及本发明的缀合物，其为至少约80％、优选至少约90％和更优选至少约95％同质。

“同质性”指与修饰的糖基结合的受体部分群体的结构一致性。因此，在本发明肽缀合物(其中每个修饰的糖部分与受体位点结合，该受体位点与每个其他修饰的糖结合的受体位点有相同结构)中，肽缀合物被称为大约100％同质的。同质性通常以范围表达。肽缀合物同质性范围的下限为大约60％、大约70％或大约80％，且纯度范围上限为大约70％、大约80％、大约90％或大于大约90％。

当肽缀合物大于或等于大约90％同质时，其同质性也优选以范围表达。同质性范围的下限为大约90％、大约92％、大约94％、大约96％或大约98％。纯度范围的上限为大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约100％同质性。肽缀合物的同质性通常通过一种或多种本领域技术人员已知的方法确定，例如液相层析质谱法(LC-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDITOF)、毛细管电泳等。上述讨论同样适用于其他O-糖基化和N-糖基化位点。

当涉及糖肽种类时，“基本均一的糖型”或“基本均一的糖基化模式”是指被目的糖基转移酶(例如岩藻糖基转移酶)糖基化的受体部分比例。例如，在α1，2岩藻糖基转移酶情况下，如果在本发明肽缀合物中基本所有的(如下定义)Galβ1，4-GlcNAc-R和其唾液酸化的类似物均被岩藻糖化，则存在基本均一的岩藻糖化模式。本领域技术人员将理解起始物质可含有糖基化的受体部分(例如岩藻糖化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因此，计算出的糖基化百分比将包括被本发明方法糖基化的受体部分以及在起始材料中已经被糖基化的受体部分。

上述“基本均一的”定义中术语“基本”通常是指至少大约40％、至少大约70％、至少大约80％、或更优选的至少大约90％，和更优选的至少大约95％的特定糖基转移酶受体部分被糖基化。例如，如果因子IX肽缀合物包括Ser连接的糖基残基，群体中至少大约70％、80％、90％、95％、97％、99％、99.2％、99.4％、99.6％、或更优选99.8％的肽将有相同的糖基残基与相同的Ser残基共价结合。

当取代基团被其常用由左至右写的化学式指定时，其同等地包含由从右至左书写所造成的化学相等的取代基，例如-CH₂O-也旨在描述-OCH₂-。

除非另有说明，术语“烃基(alkyl)”自身或作为另一取代基的一部分是指具有指定数量碳原子(即C₁-C₁₀是指一到十个碳)的直链或支链或环烃基，或其组合，其可为完全饱和的、单或多不饱和的，并可包含双或多价基团。饱和烃基的实例包括(但不仅限于)例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、环己基甲基、环丙甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物或异构体。不饱和烃基为具有一个或多个双键或三键的烃基。不饱和烃基的实例为(但不仅限于)乙烯基、2-丙烯基、丁烯基、2-异戊烯基、2-丁二烯基、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和高级同系物及异构体。

除非另有说明，术语“烃基”还旨在包括如下更详细定义的烃衍生物，例如“杂烃基(heteroalkyl)”。被限制为碳氢化合物基团的烃基称为“同烃基(homoalkyl)”。

术语“亚烷基”自身或作为另一取代物的部分是指来自于烷的二价基团，如以-CH₂CH₂CH₂CH₂-(但不仅限于)为例，并还包括如下文作为“杂亚烷基”描述的那些基团。通常，烃基(或亚烷基)基团会有1到24个碳原子，本发明优选具有10或更少碳原子的那些基团。“低级烃基”或“低级亚烷基”为较短链的烃基或亚烷基基团，通常具有八个或更少的碳原子。

术语“烷氧基”、“烷氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常规含义使用，并指各自通过氧原子、氨基或硫原子与分子剩余部分结合的烷基。

除非另有说明，术语“杂烃基”自身或与另一术语组合是指稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，由所述数量的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成，其中氮和硫原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N、S和Si可被置于杂烃基基团任何内部位置或烃基基团结合分子剩余部分的位置。实例包括(但不仅限于)-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂、-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多可有两个连续杂原子，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似的，术语“杂亚烷基”自身或作为另一取代基的部分是指来自杂烃基的二价基团，如以-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-(但不仅限于)为例。对于杂亚烷基基团，杂原子也可占据链末端之一或两端(例如亚烷氧基、亚烷基双氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。另外，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团式的书写方向不表示连接基团的方向。例如，式-C(O)₂R’-既代表-C(O)₂R＇-也代表-R′C(O)₂-。

除非另有说明，术语“环烃”和“杂环烃”自身或与其他术语组合分别表示“烃基”和“杂烃基”的环状形式。另外，对杂环烃来说，杂原子可占据杂环与分子剩余部分连接的位置。环烃的实例包括但不仅限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烃的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

除非另有说明，术语“卤素”自身或作为另一取代基的部分是指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤烃基”旨在包括单卤烃基和多卤烃基。例如，术语“卤代(C1-C4)烃基”旨在包括(但不仅限于)三氟甲基、2，2，2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有说明，术语“芳基”是指多不饱和的、芳香族取代基，其可为单环或相互稠合或共价连接的多环(优选1到3个环)。术语“杂芳基”是指包含一个到四个选自N、O和S的杂原子的芳香基团(或环)，其中氮和硫原子可任选地被氧化，且氮原子可任选地季铵化。杂芳基可通过杂原子附着于分子的剩余部分。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基、四唑基、苯并[b]呋喃基、苯[b]噻吩基、2，3-二氢苯[1，4]二氧芑-6基、苯[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基和6-喹啉基。上述各芳基和杂芳基环体系的取代基选自下述合适的取代基。

简言之，与其他术语(例如芳氧基、arylthioxy，芳烃基)组合使用的术语“芳基”包括如上文定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳烃基“旨在包括其中芳基附着于烃基基团的那些基团(例如苯甲基、苯乙基、吡啶甲基等)，包括其中碳原子(如亚甲基)被例如氧原子代替的烃基(如苯氧甲基、2-吡啶氧甲基、3-(1-萘氧)丙基等)。

各上述术语(例如“烃基”、“杂烃基”、“芳基”和“杂芳基”)旨在包括所指基团的取代或非取代形式。下文提供了每种类型基团的优选的取代基。

烃基和杂烃基的取代基(包括通常被称为亚烷基、链烯基、杂亚烷基、杂链烯基、炔基、环烃、杂环烷烃、环烯基和杂环烯基)通常被称为“烃基取代基”，且其可为一个或多个选自(但不仅限于)-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’-、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂的基团，数量从0到(2m’+1)，其中m’为该基团中碳原子总数量。R′、R″、R和R””各自优选独立的表示氢、取代或非取代的杂烃基、取代或非取代的芳基(例如1-3个卤素取代的芳基)、取代或非取代的烃基、烷氧基、或硫代烷氧基基团或芳烃基。当本发明化合物包含多于一个R基团，例如当存在超过一个这些基团时每个R基团被独立地选择例如各自为R′、R″、R和R””。当R’和R”结合在同一氮原子上时，它们可与氮原子一起形成5-、6-或7-元的环。例如，-NR’R”旨在包括但不仅限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上述取代基的讨论，本领域技术人员将理解术语“烃基”旨在包括含有与除氢基团外基团例如卤烃基(例如-CF₃和-CF₂CF₃)和酰基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)结合的碳原子的基团。

与烃基的取代基类似，芳基和杂芳基基团的取代基通常被称为“芳基取代基”。该取代基选自例如：卤素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R、-OC(O)R’、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂、-R′、-N₃、-CH(Ph)₂、氟代(C₁-C₄)烷氧基和氟代(C₁-C₄)烃基，数量从0到芳环体系开价的总数量；且其中R′、R″、R和R””优选的独立选自氢、取代或非取代的烃基、取代或非取代的杂烃基、取代或非取代的芳基和取代或非取代的杂芳基。当本发明化合物包含多于一个R基团，例如当存在多于一个这些基团时每个R基团被独立地选择例如各自为R′、R″、R和R””。在下面的方案中，符号X代表上述的“R”。

芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基代替，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR’-或单键，且q为从0到3的整数。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-A-(CH₂)r-B-的取代基代替，其中A和B独立的为-CRR′-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR′-或单键，且r为从1到4的整数。这样形成的新环的一个单键可任选地被双键代替。或者，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可任选地被式-(CRR′)s-X-(CR”R)d-的取代基代替，其中s和d独立地为从0到3的整数，且X为-O-、-NR′-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S-(O)₂NR＇-。取代基R、R′、R″和R优选独立选自氢或取代的或非取代的(C1-C6)烃基。

文中使用术语“杂原子”旨在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

序论

如上所述，因子IX在凝血级联系统中是至关重要的。图1提供了因子IX的结构和序列。体内因子IX的缺乏表征了一种类型的血友病(B型)。该疾病的治疗通常限于静脉传输因子IX的人血浆蛋白浓缩物。然而，除时间和费用的实践缺点外，传输血液浓缩物涉及使病人传染病毒性肝炎、获得性免疫缺陷综合症或血栓栓塞性疾病的风险。

当因子IX证明其自身是治疗应用的重要和有用化合物时，从重组细胞制备因子IX的现有方法(U.S.专利No.4,770,999)引起具有相当短生物学半衰期以及不准确糖基化方式的产物，该产物可能引起免疫原性、功能缺失、对达到相同效应的更大和更频繁剂量的提高的需要等。

为了提高用于治疗目的的重组因子IX的效力，本发明提供了糖基化的和非糖基化的因子IX肽与多聚体如PEG(m-PEG)、PPG(m-PPG)等的缀合物。该缀合物可另外地或可选地通过与不同种类例如治疗部分、诊断部分、靶向部分等进一步缀合而被修饰。

本发明的缀合物通过修饰的糖酶促附着至糖基化或非糖基化的肽上形成。糖基化位点和糖残基为修饰基团缀合(例如通过糖缀合)肽提供了位点。示范的修饰基团为水溶性多聚体，如聚乙二醇(例如甲氧基聚乙二醇)。因子IX肽的修饰可促进重组的因子IX在患者循环中的稳定性和滞留时间，和/或减少重组的因子IX的抗原性。

本发明的方法使得装配具有基本上同质衍生模式的肽和糖肽成为可能。本发明中使用的酶通常对肽的特定的氨基酸残基、氨基酸残基组合或特定的糖基残基具有选择性。该方法也实用于大规模制备修饰肽和糖肽。因此，本发明的方法提供了大规模制备具有预选的均一衍生模式的糖肽的实用方法。

本发明还提供了具有提高的治疗半衰期(归功于例如降低的清除率，或降低的被免疫系统或网状内皮系统(RES)吸收的速率)的糖基化或非糖基化肽缀合物。此外，本发明的方法提供了掩蔽肽上抗原决定簇的方法，从而降低或消除了对该肽的宿主免疫应答。也可使用靶向剂的选择性附着以将肽靶向至对特定靶向剂特异的特定组织或细胞表面受体。

缀合物

首先，本发明提供了选择的修饰基团和因子IX肽之间的缀合物。

肽和修饰基团之间的连接包括插入肽和选定部分之间的糖基连接基团。如文中所述，选定的部分基本上是任意可附着在糖单位上，产生被合适的转移酶(其将修饰的糖加至肽上)识别的“修饰的糖”的种类。修饰的糖的糖元件被插入肽和选定的部分之间时，成为“糖基连接基团”，例如“完整的糖基连接基团”。糖基连接基团由任何在用修饰基团修饰后成为酶(其将修饰的糖加至肽的氨基酸或糖基残基上)底物的单糖或寡糖形成。

糖基连接基团可为，或可包括，在加入修饰基团前或加入修饰基团时被降解性修饰的糖部分。例如，糖基连接基团可衍生自糖残基，其由完整糖例如通过偏高碘酸的作用氧化降解为相应的醛，并随后用适当的胺转化为席夫碱，然后还原为相应的胺。

示范的本发明缀合物符合一般的结构：

其中符号a、b、c、d和s代表正的非零整数；且t为0或正整数。“试剂”为治疗剂、生物活性剂、可探测标记、水溶性部分(例如PEG、m-PEG、PPG和m-PPG)等。“试剂”可为肽例如酶、抗体、抗原等。接头可为任何广范围的连接基团，如下。或者，接头可为单键或“零级接头”。

在示范的实施方案中，选择的修饰基团为水溶性多聚体如m-PEG。水溶性多聚体通过糖基连接基团共价附着在肽上。糖基连接基团共价附着于肽的氨基酸残基或糖基残基上。本发明还提供了氨基酸残基和糖残基用糖基连接基团修饰的缀合物。

示范的水溶性多聚体为聚乙二醇例如甲氧基聚乙二醇。本发明使用的聚乙二醇不受限制于任何特定的形式或分子量范围。对于非分支的聚乙二醇分子，分子量优选在500和100,000之间。优选使用分子量2,000-60,000道尔顿且更优选从大约5,000至大约30,000道尔顿。

在另一实施方案中，聚乙二醇为含有多于一个附着的PEG部分的分支PEG。分支PEG的实例描述于U.S.专利No.5,932,462；U.S.专利No.5,342,940；U.S.专利No.5,643,575；U.S.专利No.5,919,455；U.S.专利No.6,113,906；U.S.专利No.5,183,660；WO 02/09766；Kodera Y.，Bioconjugate Chemistry 5：283-288(1994)；和Yamasaki等，Agric.Biol.Chem.，52：2125-2127，1998。文中公开了另外的分支多聚体种类。

在优选的实施方案中，分支PEG的各聚乙二醇分子量等于或大于大约2,000、5,000、10,000、15,000、20,000、40,000、50,000和60,000道尔顿。

除提供通过酶促加入糖基连接基团形成的缀合物外，本发明提供取代模式高度同质的缀合物。使用本发明的方法可能形成肽缀合物，其中本发明缀合物群体中基本上所有修饰的糖部分都结合在多拷贝结构一致的氨基酸或糖基残基上。因此，另一方面，本发明提供了具有通过完整的糖基连接基团共价结合肽的水溶性多聚体部分群体的肽缀合物。在优选的本发明缀合物中，群体中基本上每个成员通过糖基连接基团结合肽糖基残基，且糖基连接基团结合的各肽糖基残基具有相同的结构。

还提供了具有通过糖基连接基团与之结合的水溶性多聚体部分群体的肽缀合物。在优选的实施方案中，水溶性多聚体部分群体中的基本上每个成员通过糖基连接基团结合肽的氨基酸残基，且糖基连接基团附着的各氨基酸残基具有相同的结构。

本发明还提供了上述缀合物的类似缀合物，其中肽通过完整的糖基连接基团缀合治疗部分、诊断部分、靶向部分、毒素部分等。上述各部分可为小分子、天然多聚体(如多肽)或合成多聚体。本发明的肽包含至少一个N-或O-连接的糖基化位点，其被包括PEG部分的糖基残基糖基化。PEG通过完整的糖基连接基团共价附着于因子IX肽。糖基连接基团共价附着于因子IX肽的氨基酸残基或糖基残基。或者，糖基连接基团附着于糖肽的一个或多个糖基单位。本发明还提供糖基连接基团既附着于氨基酸残基又附着于糖基残基的缀合物。

在示范的实施方案中，因子IX肽包含具有式：

的部分。

在上式中，D选自-OH和R¹-L-HN-。G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基。R¹为包含直链或支链聚乙二醇残基的部分。L为接头，其为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的成员。因此，当D为OH时，G为R¹-L-，而当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

在一个实施方案中，R¹-L具有式

其中a为0至20的整数。

在示范的实施方案中，R¹具有选自：

的结构，其中e和f为独立地选自从1到2500的整数，而q为从1到20的整数。在其他实施方案中，R¹具有选自：

的结构，其中e、f和f’为独立地选自从1到2500的整数，而q和q’为独立地选自1到20的整数。

在另一实施方案中，本发明提供因子IX肽缀合物，其中R¹具有选自：

的结构，其中e、f和f’为独立选自1到2500的整数；而q、q’和q’’为独立的选自1到20的整数。

在其他实施方案中，R¹具有选自

的结构，其中e和f为独立地选自1到2500的整数。

在另一示范的实施方案中，本发明提供包含具有式：

的部分的肽。该Gal可附着于氨基酸或直接或间接(例如通过糖基残基)附着于氨基酸的糖基残基上。

在其他实施方案中，该部分具有式：

Gal可附着于氨基酸或直接或间接(例如通过糖基残基)附着于氨基酸的糖基残基上。

在示范的实施方案中，该结构伴随因子IX上O-糖基化位点的糖基聚乙二醇化(图2B)

在另一示范的实施方案中，该肽包含根据式

的部分，其中AA为所述肽的氨基酸残基，且在上述的每个结构中，D和G如文中所述。

示范的肽氨基酸残基(一个或多个上述种类可与之缀合)包括丝氨酸和苏氨酸，例如SEQ.ID.NO：1的丝氨酸53或61或苏氨酸159、162或172。

在另一示范的实施方案中，本发明提供包含具有式

的糖基残基的因子IX缀合物。

其中a、b、c、d、i、r、s、t和u为独立地选自0和1的整数。指数q为1。指数e、f、g和h独立地选自从0到6的整数。指数j、k、l和m为独立地选自从0到100的整数。指数v、w、x和y独立地选自0和1，且v、w、x和y中至少一个为1。符号AA代表因子IX肽的氨基酸残基。

符号Sia-(R)代表具有式：

的基团，其中D选自-OH和R¹-L-HN-。符号G代表R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烃基。R¹代表包括直链或支链聚乙二醇残基的部分。L为接头，其为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的成员。一般的，当D为OH时，G为R¹-L-，而当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-HN-。

在另一个示范的实施方案中，在本发明的缀合物中PEG修饰的唾液酸部分具有式：

其中“s”代表从0到20的整数，且n为从1到2500的整数。在选定的实施方案中，s为1而PEG为大约20kD。

在另一示范的实施方案中，PEG修饰的唾液酸具有式：

其中L为连接唾液酸部分和PEG部分的取代或非取代烃基或取代或非取代的杂烃基接头部分。

在示范的实施方案中，其中糖基残基具有上文公开的结构，其与Asn157和Asn167的一个或二者都缀合。

因子IX已被克隆及测序。基本上具有任何序列的任何因子IX肽被作为本发明缀合物的因子IX肽组分使用。在示范的实施方案中，该肽具有SEQ ID NO：1给出的序列：YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT.

本发明绝非仅限于文中公开的序列。因子IX变体为本领域所熟知的，如描述于例如U.S.专利Nos.4,770,999、5,521,070(其中第一个位置的酪氨酸被丙氨酸取代)、U.S.专利No.6,037,452(其中因子XI与烯化氧基团连接)和U.S.专利No.6,046,380(其中编码因子IX的DNA在至少一个剪接位点被修饰)。如文中所指，因子IX的变体为本领域所熟知的，且本公开内容包括这些已知的或将来将要发展的或公开的变体。

用于确定突变的或修饰的因子IX活性的方法可通过使用本领域描述的方法来实现，例如如Biggs(1972，Human Blood CoagulationHaemostasis and Thrombosis第一版，Oxford，Blackwell，Scientific，614页)中所述的一步活化部分凝血致活酶时间实验法。简言之，为了测定根据本发明方法发展的因子IX分子的生物活性，该测定法可使用等体积的活化部分凝血致活酶试剂、使用本领域熟知的无菌静脉切开放血术从血友病B患者中分离的缺乏因子IX的血浆和正常混合血浆作为标准，或样品来完成。在该实验中，一个单位的活性被定义为一毫升正常混合血浆中存在的数量。另外，根据因子IX将缺乏因子IX患者的血浆凝血时间降低至正常能力测定生物活性可如例如Proctor和Rapaport(Amer.J.Clin.Path.36：212(1961)所述来完成。

本发明的肽包括至少一个N连接或O连接的糖基化位点，其中至少一个与包含PEG部分的糖基残基缀合。PEG通过完整的糖基连接基团共价附着于肽。该糖基连接基团共价附着于肽的氨基酸残基或糖基残基。或者，糖基连接基团附着于糖肽的一个或多个糖基单位。本发明还提供缀合物，其中糖基连接基团既附着于氨基酸残基又附着于糖基残基。

PEG部分直接附着于完整的糖基接头，或通过非糖基接头(例如取代或非取代的烃基、取代或非取代的杂烃基)附着。

修饰的糖

本发明使用修饰的糖和修饰的糖核苷酸以形成修饰的糖的缀合物。在本发明的修饰的糖化合物中，糖部分优选为糖、脱氧糖、氨基糖或N-酰基糖。术语“糖”及其等价物″糖基″是指单体、二聚体、寡聚体和多聚体。糖部分还用修饰基团官能化。修饰基团通常通过与糖上胺、巯基或羟基(例如伯羟基)部分缀合而缀合在糖部分上。在示范的实施方案中，修饰基团通过胺部分附着在糖上，例如通过在胺与修饰基团的活性衍生物间反应形成的酰胺、氨基甲酸乙酯或脲。

任何糖可用于本发明缀合物的糖核心。在形成本发明组合物时有用的示范的糖核心包括但不仅限于葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和唾液酸。其他有用的糖包括氨基糖例如葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、唾液酸的5-氨基类似物等。糖核心可为天然存在的结构或其可被修饰以产生用于缀合修饰基团的位点。例如，在一个实施方案中，本发明提供唾液酸衍生物，其中9-羟基部分被胺代替。该胺非常容易用选择的修饰基团的活性类似物衍生。

在示范的实施方案中，本发明利用具有式：

的修饰的糖胺。其中G为糖基部分，L为键或接头而R¹为修饰基团。示范的键为糖基部分上NH₂和修饰基团上互补反应性的基团之间形成的键。因此，示范的键包括(但不局限于)NHR¹、OR¹、SR¹等。例如，当R¹包含羧酸部分时，该部分可被激活并与糖基残基上NH₂部分偶联，提供具有NHC(O)R¹结构的键。类似的，OH和SH基团可各自转化为相应的醚或硫醚衍生物。

示范的接头包括烃基和杂烃基部分。接头包括连接基团，例如以酰基为基础的连接基团如-C(O)NH-、-OC(O)NH-等。连接基团为本发明种类组分之间形成的键，例如在糖基部分和接头(L)之间，或接头和修饰基团(R¹)之间。其他连接基团为醚、硫醚和胺。例如，在一个实施方案中，接头为氨基酸残基，例如甘氨酸残基。甘氨酸的羧酸部分通过与糖基残基上的胺反应转化为相应的酰胺，且甘氨酸的胺通过与修饰基团上活性羧酸或碳酸酯反应转化为相应的酰胺或氨基甲酸乙酯。

另一个示范的接头为PEG部分或用氨基酸残基官能化的PEG部分。该PEG通过PEG一端的氨基酸残基与糖基基团结合并通过另一PEG末端与R¹结合。或者，氨基酸残基结合R¹而不与氨基酸结合的PEG端与糖基基团结合。

可作为NH-L-R¹范例的种类有式：-NH{C(O)(CH₂)_aNH}_s{C(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNH}_tR¹，其中指数s和t为独立的0或1。指数a、b和d为独立的从0到20的整数，且c为从1到2500的整数。其他类似的接头以其中-NH部分被另一基团例如-S、-O或-CH₂代替的种类为基础。

更具体的，本发明利用其中NH-L-R¹为：NHC(O)(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NH(CH₂)_aNHC(O)(CH₂)_b(OCH₂CH₂)_cO(CH₂)_dNHR¹、NHC(O)(CH₂)_aNHR¹、NH(CH₂)_aNHR¹和NHR¹的化合物。在这些式中，指数a、b和d为独立选自从0到20的整数，优选从1到5。指数c为1到2500的整数。

在下面的讨论中，本发明使用选定的唾液酸衍生物进行说明。本领域技术人员将认可讨论着眼于说明的清晰度且公开的结构和组成通常适用于糖基团、修饰的糖基团、有活性的修饰的糖基团和修饰的糖基团缀合物种类。

在说明性的实施方案中，G为唾液酸且本发明使用的选定的化合物具有式：

如本领域技术人员将理解的，上面示范的化合物中唾液酸部分可用任何其他的氨基糖代替，包括但不局限于葡糖胺、半乳糖胺、甘露糖胺、它们的N-乙酰基衍生物等。

在另一说明性的实施方案中，糖的伯羟基部分用修饰基团官能化。例如，唾液酸的9-羟基可转化为相应的胺并官能化以产生本发明的化合物。根据该实施方案的通式包括：

在另一示范的实施方案中，本发明利用修饰的糖，其中6-羟基的位置转化为相应的胺部分，该部分带有例如上面公开的接头-修饰基团盒。可作为这些修饰的糖的核心的示范的糖基团包括Gal、GalNAc、Glc、GlcNAc、Fuc、Xyl、Man等。根据该实施方案代表性的修饰的糖具有式：

其中R³-R⁵和R⁷为独立选自H、OH、C(O)CH₃、NH和NHC(O)CH₃的成员。R⁶为如上所述的OR¹、NHR¹或NH-L-R¹。

本发明使用的选定的缀合物基于甘露糖、半乳糖或葡萄糖，或基于具有甘露糖、半乳糖或葡萄糖立体化学的种类。这些化合物的通式为：

在另一示范的实施方案中，本发明利用如上公开的活化为相应的核苷酸糖的化合物。本发明使用的示范的糖核苷酸的修饰形式包括核苷酸单、双或三磷酸或其类似物。在优选的实施方案中，修饰的糖核苷酸选自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。更优选地，修饰的糖核苷酸的糖核苷酸部分选自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖胺、GDP-甘露糖、GDP-岩藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。在示范的实施方案中，核苷酸磷酸附着于C-1。

因此，在糖基部分为唾液酸的说明性的实施方案中，本发明利用具有式：

的化合物。其中L-R¹如上所述，且L¹-R¹代表结合修饰基团的接头。如同L，根据L¹的示范的接头类型包括键、烃基或杂烃基部分。根据这些实施方案，示范的修饰的糖核苷酸化合物在图7和图8中公开。

在另一示范的实施方案中，本发明提供本发明修饰的糖和底物因子IX肽之间形成的缀合物。在该实施方案中，修饰的糖的糖部分成为底物和修饰基团间的糖基连接基团。示范的糖基连接基团为完整的糖基连接基团，其中形成连接基团的糖基部分不被化学(如偏高碘酸钠)或酶(如氧化酶)降解。本发明选定的缀合物包含结合在氨基糖(例如甘露糖胺、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸等)的胺部分的修饰基团。根据该基序的示范的修饰基团-完整的糖基连接基团盒基于唾液酸结构，例如具有式：

的那些。

在上式中，L¹和R¹如上所述。

在另一示范的实施方案中，缀合物在底物因子IX和糖部分之间形成，其中修饰基团通过糖基部分6-碳位置的接头附着。因此，根据该实施方案的说明性的缀合物具有式：

其中基团如上所述。技术人员将理解上面公开的修饰的糖部分还可通过2、3、4、或5碳原子上的氧或氮原子与底物缀合。

该实施方案中使用的说明性化合物包括具有式：

的化合物，其中R基团和指数如上所述。

本发明还提供了用L-R¹在6-碳位置修饰的糖核苷酸用途。根据本实施方案的示范的种类包括：

其中R基团和L代表上述部分。指数“y”为0、1或2。

本发明使用的另一示范的核苷酸糖基于具有GDP甘露糖立体化学的种类。根据本实施方案示范的种类有结构：

在另一示范的实施方案中，本发明提供了缀合物，其中修饰的糖基于UDP半乳糖的立体化学。本发明使用的示范的核苷酸糖有结构：

在另一示范的实施方案中，核苷酸糖基于葡萄糖的立体化学。根据本实施方案的示范的种类有式：

修饰基团R¹为许多种类例如水溶性多聚体、水不溶性多聚体、治疗剂、诊断剂等中之任一。示范的修饰基团性质在下文更详细地描述。

修饰基团

水溶性多聚体

许多水溶性多聚体为本领域技术人员已知，并在实践本发明中有用。术语水溶性多聚体包括例如糖(例如葡聚糖、直链淀粉、透明质酸、聚唾液酸、类肝素、肝素等)、聚氨基酸(例如聚天冬氨酸和聚谷氨酸)、核酸、合成聚合体(如聚丙烯酸、聚醚例如聚乙二醇)、肽、蛋白质等种类。本发明可应用任何水溶性多聚体，唯一的限制为该多聚体必须包含缀合物剩余部分可与之缀合的位点。

活化多聚体的方法还可见WO 94/17039、U.S.专利No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193，U.S.专利No.5,219,564、U.S.专利No.5,122,614、WO 90/13540、U.S.专利No.5,281,698以及WO 93/15189，且关于活化的多聚体和肽例如凝血因子VIII(WO94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、氧载体分子(U.S.专利No.4,412,989)核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。

优选的水溶性多聚体为多聚体样品中大部分多聚体分子有大致相同的分子量；这样的多聚体为″单分布的(homodisperse)″。

还通过聚乙二醇缀合物说明了本发明。可获得若干关于PEG官能化和缀合的综述和专题文章。见例如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology，135：30-65(1987)；Wong等，EnzymeMicrob.Technol.14：866-874(1992)；Delgado等，Critical Reviewsin Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)；和Bhadra等，Pharmazie，57：5-29(2002)。制备反应性PEG分子并使用反应性分子形成缀合物的途径为本领域已知。例如U.S.专利No.5,672,662公开了选自线性或分支聚环氧烷、聚(氧乙基化的多元醇)、聚烯醇和聚烯丙酰吗啉的多聚体酸的活性酯的水溶性且可分离的缀合物。

U.S.专利No.6,376,604公开了通过将多聚体的末端羟基与双(1-苯三唑基碳酸酯)在有机溶剂中反应制备水溶性且非肽多聚体的水溶性1-苯三唑基碳酸酯的方法。该活性酯用于与生物活性剂例如蛋白质或肽形成缀合物。

WO 99/45964描述了包含生物活性剂和活性水溶性多聚体的缀合物，其包含的多聚体主链有至少一个末端与多聚体主链通过稳定键连接，其中至少一个末端含有具有与分支部分连接的近端反应基团的分支部分，其中生物活性剂与至少一个近端反应基团连接。其他分支聚乙二醇描述于WO 96/21469、U.S.专利No.5,932,462描述了由包含含有反应官能团的分支末端的分支PEG分子形成的缀合物。自由反应基团能够与生物活性种类例如蛋白质或肽反应，形成聚乙二醇和生物活性种类间的缀合物。U.S.专利No.5,446,090描述了双功能PEG接头及其在形成PEG接头两端均有肽的缀合物中的用途。

包含可降解PEG键的缀合物描述于WO 99/34833；和WO 99/14259，以及U.S.专利No.6,348,558。这些可降解键适用于本发明。

在本发明上下文中，在文中公开的分支多聚体的形成和这些分支多聚体与其他种类例如糖、糖核苷酸等缀合中使用上面公开的本领域公认的多聚体活化方法。

本发明中使用的示范的聚乙二醇分子包括但不仅限于具有式：

的聚乙二醇分子。其中R⁸为H、OH、NH₂、取代或未取代的烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂环烃基、取代或未取代的杂烃基，例如缩醛、OHC-、H₂N-(CH₂)_q-、HS-(CH₂)_q、或-(CH₂)_qC(Y)Z¹。指数“e”表示从1到2500的整数。指数b、d和q独立地表示从0到20的整数。符号Z和Z¹独立的表示OH、NH₂、离去基团例如咪唑、对硝基苯基、HOBT、四唑、卤化物、S-R⁹、活性酯类的醇部分；-(CH₂)_pC(Y¹)V或-(CH₂)_pU(CH₂)_sC(Y¹)_v。符号Y表示H(2)、＝O、＝S、＝N-R¹⁰。符号X、Y、Y¹、A¹和U独立的表示部分O、S、N-R¹¹。符号V表示OH、NH₂、卤素、S-R¹²、活性酯类的醇部分、活性酰胺的胺部分、糖核苷酸和蛋白质。指数p、q、s和v为独立地选自0到20整数的成员。符号R⁹、R¹⁰、R¹¹和R¹²独立地表示H、取代或未取代的烃基、取代或未取代的杂烃基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂环烃基和取代或未取代的杂芳基。

在另一示范的实施方案中，聚乙二醇分子选自下面：

在形成本发明缀合物中有用的聚乙二醇可为线性或分支的。适用于本发明用途的分支聚乙二醇分子包括但不仅限于下式所述的：

其中R⁸和R^8’独立地选自上文定义为R⁸的基团。A¹和A²独立地选自上文定义为A¹的基团。指数e、f、o和q如上所述。Z和Y如上所述。X¹和X^1’独立的选自S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O、OC(O)NH。

在其他示范的实施方案中，分支PEG基于半胱氨酸、丝氨酸和双赖氨酸核心。因此，更多的示范的分支PEG包括：

在另一实施方案中，分支PEG部分基于三赖氨酸肽。该三赖氨酸可被单、双、三或四PEG化。根据该实施方案示范的种类具有式：

其中e、f和f’独立地选自从1到2500的整数；且q、q’和q”独立选自从1到20的整数。

在本发明示范的实施方案中，PEG为m-PEG(5kD、10kD、15kD、20kD或30kD)。示范的分支PEG种类为丝氨酸或半胱氨酸-(m-PEG)₂，其中m-PEG为20KD的m-PEG。

如技术人员将理解的，本发明使用的分支多聚体包括上文公开的主题的变体。例如上面所示双赖氨酸-PEG缀合物可包含三个聚合的亚基，第三个结合在上文结构中显示未修饰的α-胺上。类似地，用三个或四个聚合的亚基官能化的三赖氨酸的应用在本发明范围内。

本发明使用的另外的示范的种类包括：

和这些种类的碳酸酯及活性酯，例如：

其他适合于活化制备文中公开的化合物时使用的线性PEG的活化基团或离去基团包括，但不仅限于种类：

被这些和其他种类活化的PEG分子和制造活化的PEG的方法在WO04/083259中公开。

本领域技术人员将理解分支多聚体的一个或多个m-PEG臂可被具有不同末端例如OH、COOH、NH₂、C₂-C₁₀-烃基等的PEG部分替代。另外，上述结构容易通过在α-碳原子和“氨基酸”侧链官能团之间插入烃基接头(或去除碳原子)而被修饰。因此，“同系”衍生物及高级同系物，以及低级同系物为本发明使用的分支PEG的有用“氨基酸”核心。

文中公开的分支PEG种类通过例如下面方案公开的方法可容易地制备：

其中X_a为O或S且r为从1到5的整数。参数e和f为从1到2500的独立选择的整数。

因此，根据该方案，天然或非天然的氨基酸与活性m-PEG衍生物接触(在本情况下为甲苯磺酸酯)，通过烷化侧链杂原子X^a而形成1。单官能化的m-PEG氨基酸与活性m-PEG衍生物处于N-酰化条件下，从而组合成分支m-PEG2。如技术人员会理解的，甲苯磺酸离去基团可用任何合适的离去基团代替，例如卤素、甲磺酸、三氟甲基磺酸酯等。类似的，用于酰化胺的反应性碳酸酯可用活性酯例如N-羟基琥珀酰亚胺等代替，或该酸可用脱水剂如二环己基碳二亚胺、羰二咪唑等原位活化。

在示范的实施方案中，修饰基团为PEG部分，然而，任何修饰基团(如水溶性多聚体、水不溶性多聚体、治疗部分等)可通过适当的键被整合进糖基部分。修饰的糖通过酶方法、化学方法或其组合形成，从而产生修饰的糖。在示范的实施方案中，糖在任何允许修饰基团结合并仍然允许糖作为能够将修饰的糖与肽偶合的酶的底物的位点用活性胺取代。在示范的实施方案中，当半乳糖胺为修饰的糖时，胺部分在6-位附着于碳原子。

水溶性多聚体修饰的种类

本发明使用水溶性多聚体修饰的核苷酸糖种类，其中糖部分用水溶性多聚体修饰。示范的修饰的糖核苷酸带有通过糖上胺部分修饰的糖基团。修饰的糖核苷酸例如糖核苷酸的糖基胺衍生物在本发明的方法中也是有用的。例如(无修饰基团的)糖基胺可与肽(或其他种类)酶促缀合且游离的糖基胺部分随后与所需的修饰基团缀合。另外，修饰的糖核苷酸可作为将修饰糖转移至底物(例如肽、糖肽、脂类、苷元(aglycone)、糖脂等)上糖基受体的酶的底物。

在一个实施方案中，糖核心为半乳糖或葡萄糖，R⁵为NHC(O)Y。

在示范的实施方案中，修饰的糖基于6-氨基-N-乙酰基-糖部分。如下所示关于N-乙酰半乳糖胺，6-氨基-糖部分通过标准方法容易制得。

在上图中，指数n表示从1到2500的整数，优选从10到2500，并更优选从10到1200。符号“A”表示活化基团，例如卤素、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)的组分、碳酸酯(对硝基苯基碳酸酯)的组分等。本领域技术人员会理解，其他PEG-酰胺核苷酸糖通过该方法及类似方法可容易制得。

在其他示范的实施方案中，酰胺部分被基团例如氨基甲酸乙酯或尿素代替。

在另一实施方案中，R¹为分支PEG，例如上文公开的种类之一。根据本实施方案的说明性化合物包括：

其中X⁴为键或O。

另外，如上所讨论的，本发明提供用水溶性多聚体修饰的核苷酸糖，其可为直链或分支的。例如，有下示式的化合物在本发明范围内：

其中X⁴为键或O。

类似的，本发明提供那些修饰的糖种类的核苷酸糖，其中6-位碳被修饰：

其中X⁴为O或键。

还提供了包含本发明组成的肽和糖肽、脂和糖脂的缀合物。例如，本发明提供了有下式的缀合物：

水不溶性多聚体

在另一实施方案中，与上面所讨论的类似，修饰的糖包括水不溶性多聚体而非水溶性多聚体。本发明的缀合物也可以包括一个或多个水不溶性多聚体。本发明的本实施方案通过缀合物作为以受控方式投送治疗肽的载体的用途进行说明。多聚体药物投送系统为本领域已知。参阅如Dunn等编辑，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS》，ACS Symposium Series 469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991。本领域技术人员会理解，基本上所有已知的药物投送系统都可应用于本发明的缀合物。

代表性水不溶性多聚体包括但不仅限于polyphosphazines、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚丙烯酰胺、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚亚烷基对苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚卤乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚异丁烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸异丁酯、聚异丁烯酸己酯、聚异丁烯酸异癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚异丁烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸异丙酯、聚丙烯酸异丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对苯二酸乙酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯苯酚及其共聚物。

可用于本发明缀合物的合成修饰的天然多聚体包括但不仅限于烃基纤维素、羟烃基纤维素、纤维素醚、纤维素酯和硝酸纤维素。多种合成修饰的天然多聚体中特别优选的成员包括但不仅限于甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丁基甲基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素、羧甲基纤维素、三醋酸纤维素、纤维素硫酸钠盐和丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的多聚体。

本文中讨论的这些和其他多聚体可以便利地从商业来源如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)获得，或使用标准技术从这些供应商处获得的单体合成。

可用于本发明缀合物的代表性可生物降解多聚体包括但不仅限于聚乳酸交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物，聚对苯二酸乙酯、聚丁酸、聚戊酸、聚丙交酯-共-己内酯、聚丙交酯-共-乙交酯、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。特别有用的是形成凝胶的组合物，如含有胶原、pluronics等等的那些。

可用于本发明的多聚体包括含有水不溶性物质的“杂合”多聚体，所述水不溶性物质在其结构的至少一部分中具有可生物再吸收分子。这些多聚体的实例为含有水不溶性共聚物的多聚体，所述共聚物的每条多聚体链具有可生物再吸收区、亲水区和多个可交联官能团。

就本发明而言，“水不溶性物质”包括基本不溶于水或含水环境的物质。因此，尽管共聚物的某些区域或片段可能是亲水的或甚至是水溶性的，多聚体分子整体在水中无任何显著程度的溶解。

就本发明而言，术语“可生物再吸收分子”含有能够代谢或降解并被身体再吸收和/或通过正常排泄途径排出的区域。该代谢产物或降解产物优选基本上对身体无害的。

只要共聚物组合物整体不是水溶性的，可生物再吸收区可以是疏水的或亲水的。因此，基于使多聚体整体保持水不溶性来选择可生物再吸收区。因此，选择相对特性(即所含有的官能团种类、可生物再吸收区的相对比例和亲水区)以保证有用的可生物再吸收组合物保持为水不溶性。

示范的可再吸收多聚体包括如合成产生的聚α-羟基羧酸/聚氧化烯的可再吸收嵌段共聚物(参阅Cohn等，U.S.专利No.4,826,945)。这些共聚物无交联且为水溶性，从而身体可以排泄降解的嵌段共聚物组分。参阅Younes等，J Biomed.Mater.Res.21：1301-1316(1987)和Cohn等，J Biomed.Mater.Res.22：993-1009(1988)。

目前优选的可生物再吸收多聚体包括一个或多个选自以下的组分：聚酯、聚羟酸、聚内酯、聚酰胺、聚酯-酰胺、聚氨基酸、聚酸酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、poly(phosphazines)、聚磷酸酯、聚硫代酯、多糖及其混合物。更优选的可生物再吸收多聚体包括聚羟酸组分。在聚羟酸中，优选聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物。

除了形成体内可吸收(“生物再吸收”)的片段以外，可用于本发明方法的优选多聚体包衣还可形成可排泄和/或可代谢的片段。

本发明中还可以使用高级共聚物。例如1984年3月20日公布的Casey等，U.S.专利No.4,438,253公开了从聚乙醇酸和羟基末端的聚亚烷基二醇的酯交换作用产生的三嵌段共聚物。这些组合物用于可再吸收的单丝缝合线。通过向共聚物结构中掺入原碳酸芳香酯如原碳酸-4-对甲苯酯来控制这些组合物的柔性。

还可以使用基于乳酸和/或乙醇酸的其他多聚体。例如1993年4月13日公布的Spinu的U.S.专利No.5,202,413公开了具有聚乳酸和/或聚乙醇酸交酯连续嵌段的可生物降解多嵌段共聚物，通过将丙交酯和/或乙交酯开环聚合到二醇寡聚体或二氨残基、接着用双功能化合物如二异氰酸酯、二酰氯或二氯硅烷进行链延伸来产生所述嵌段共聚物。

可以将可用于本发明的包衣的可生物再吸收区设计成可水解和/或酶切割的。就本发明而言，“可水解切割”指共聚物特别是可生物再吸收区在水或含水环境中对水解的敏感性。类似的，本文所使用的“可酶切割”指共聚物特别是可生物再吸收区对内源或外源酶切割的敏感性。

置于身体中时，亲水区可以加工成可排泄和/或可代谢片段。因此，亲水区可以包括如聚醚、聚环氧烷、多元醇、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚烃基唑啉、多糖、碳水化合物、肽、蛋白质及其共聚物和混合物。另外，亲水区还可以是如聚环氧烷。这些聚环氧烷可以包括如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷及其混合物和共聚物。

是水凝胶组分的多聚体也可用于本发明。水凝胶是能够吸收相对大量水的聚合物质。形成水凝胶的化合物实例包括但不仅限于聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明胶、角叉菜胶和其他多糖、羟基亚乙基甲基丙烯酸(HEMA)及其衍生物等等。可以产生稳定、可生物降解和可生物再吸收的水凝胶。另外，水凝胶组合物可以包含表现一种或多种这些特性的亚基。

可通过交联控制完整性的生物相容的水凝胶组合物是已知的，并优选用于本发明的方法。例如Hubbell等，1995年4月25日公布的U.S.专利No.5,410,016和1996年6月25日公布的5,529,914公开了为交联的嵌段共聚物的水溶性系统，所述嵌段共聚物具有夹在两个易水解延长部分中的水溶性中心嵌段片段。这些共聚物由可光聚合的丙烯酸酯官能团进一步末端加帽。在交联时，这些系统成为水凝胶。这些共聚物的水溶性中心嵌段可以包括聚乙二醇，而易水解延伸部分可以是聚α-羟酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。参阅Sawhney等，Macromolecules 26：581-587(1993)。

在另一优选实施方案中，凝胶为热可逆凝胶。目前优选包含如pluronics、胶原、明胶、透明质酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝胶、尿素-聚氨基甲酸酯水凝胶及其组合的热可逆凝胶。

在另一实施方案中，本发明的组合物包含脂质体组分。可以根据本领域技术人员已知的方法制备脂质体，如1985年6月11日公布的Eppstein等，U.S.专利No.4,522,811中所述。例如，脂质体制剂的制备可以通过将合适的脂质(如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于无机溶剂中，随即蒸发溶剂，在容器表面留下干脂质的薄膜。然后向容器中引入活性化合物或其可药用盐的水溶液。然后用手旋动以从容器表面释放脂质物质并分散脂质聚集体，从而形成脂质体悬液。

上述微粒和制备微粒的方法用于举例，并无意用于限定可用于本发明的微粒的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，用不同方法制备的一系列的微粒都可用于本发明。

在上文水溶性多聚体的上下文中讨论的结构形式(直链和分支)一般也可用于水不溶性多聚体。因此，例如可以用两个水不溶性多聚体部分使半胱氨酸、丝氨酸、二赖氨酸和三赖氨酸分支核心官能化。用于产生这些种类的方法一般与用于产生水溶性多聚体的方法非常相似。

可以通过选择化学剂量、可用糖基化位点的数目、选择对特定位点具有选择性的酶等等控制缀合物中PEG取代的程度(图2F)。糖基PEG化的因子IX种类相对于未标记的因子IX表现出增强的循环半衰期(图3、图6)。

方法

除了上文讨论的缀合物以外，本发明提供制备这些及其他缀合物的方法。另外，本发明提供通过对具有发生疾病的风险的受试者或患病的受试者施用本发明的缀合物来预防、治疗或改善疾病状态的方法。

因此，本发明提供在所选择部分和因子IX肽之间形成共价缀合物的方法。

在示范的实施方案中，在水溶性多聚体、治疗部分、靶向部分或生物分子和糖基化或非糖基化的因子IX肽之间形成缀合物。多聚体、治疗部分或生物分子通过糖基连接基团与肽缀合，所述糖基连接基团插入肽和修饰基团(如水溶性多聚体)之间并与二者共价连接。该方法包括将肽与含有修饰的糖和将修饰的糖与底物(如肽、苷元、糖脂)缀合的酶(如糖基转移酶)的混合物接触。在适于在修饰的糖和因子IX肽间形成共价键的条件下进行反应。

受体因子IX肽一般从新合成，或在原核细胞(如细菌细胞如大肠杆菌)或真核细胞如哺乳动物、酵母、昆虫、真菌或植物细胞中重组表达。肽可以是全长蛋白质或片段。另外，肽可以是野生型或突变的肽。在示范的实施方案中，肽包含在肽序列中加入或去除一个或多个N-或O-连接糖基化位点的突变。

在示范的实施方案中，按以下方式使因子IX O-糖基化并用水溶性多聚体官能化。将肽产生为具有可用的氨基酸糖基化位点，或者如果肽是糖基化的，切除糖基部分以暴露氨基酸。例如，α-1N-乙酰氨基半乳糖基化(GalNAc)丝氨酸或苏氨酸，并使用ST6GalNAcT1用唾液酸-修饰基团盒使NAc-半乳糖基化的肽唾液酸化。或者，用核心-GalT-1使NAc-半乳糖基化的肽半乳糖基化，并使用ST3GalT1用唾液酸-修饰基团盒使产物唾液酸化。本方法的示例缀合物具有以下键：Thr-α-1-GalNAc-β-1，3-Gal-α2，3-Sia*，其中Sia*为唾液酸-修饰基团盒。

在使用多种酶和糖基供体的本发明的方法中(如上文所公开)，单独的糖基化步骤可分别进行，或者在“单釜”反应中组合。例如，在上文公开的三个酶的反应中，GalNAc转移酶、GalT和SiaT及其供体可以在一个容器中组合。或者，可以单独进行GalNAc反应，并作为单一的步骤加入GalT和SiaT及适当的糖基供体。进行反应的另一种模式涉及依次加入每种酶及适当的供体，并以“单釜”模式进行反应。上文公开的每种方法的组合也可用于制备本发明的化合物。

在本发明的缀合物中，特别是糖基聚乙二醇化的N-连接聚糖中，唾液酸-修饰基团盒可以以α-2，6或α-2，3键与Gal连接。

本发明的方法还提供重组产生的不完全糖基化因子IX肽的修饰。在本发明方法中使用修饰的糖可以使肽同时发生进一步的糖基化和用如水溶性多聚体、治疗剂等等进行衍生。修饰的糖的糖部分可以是与完全糖基化的肽中的受体缀合的残基，或者具有所需特性的其他糖部分。

可用于本发明的修饰肽的示范的方法公开于WO 04/099231、WO03/031464以及其中公开的参考文献。

在示范的实施方案中，本发明提供产生含有部分：

的PEG化因子IX，其中D为-OH或R¹-L-HN-。符号G代表R¹-L-或-C(O)(C₁-C₆)烃基。R¹是含有直链或分支聚乙二醇残基的部分。符号L代表选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头。通常当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。本发明的方法包含(a)使底物因子IX肽与PEG-唾液酸供体以及能够将PEG-唾液酸部分从供体转移到底物因子IX肽的酶相接触。

示范的PEG-唾液酸供体为例如具有式：

的核苷酸糖，以及在适于转移的条件下将PEG-唾液酸转移到因子IX肽的氨基酸或糖基残基上的酶。

在一个实施方案中，在形成本发明的缀合物以前在宿主细胞中表达底物因子IX肽。示范的宿主细胞为哺乳动物细胞。在其他实施方案中，宿主细胞为昆虫细胞、植物细胞、细菌或真菌。

本文所述方法可用于上文章节公开的每种因子IX缀合物。

通过本发明方法修饰的因子IX肽可以是合成或野生型肽，或者可以是通过本领域已知的方法如定点诱变产生的突变肽。肽的糖基化一般是N-连接或O-连接。示范的N-连接为将修饰的糖附着于天冬酰胺残基侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X为除脯氨酸以外的任何氨基酸)为碳水化合物部分酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在的所述其中任一种三肽序列产生可能的糖基化位点。O-连接糖基化指一个糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、岩藻糖或木糖)附着于羟基氨基酸的羟基侧链，所述羟基氨基酸优选丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用不常见或非天然氨基酸如5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

可以通过改变氨基酸序列在肽或其他结构中便利地加入糖基化位点，以使其含有一个或多个糖基化位点。可以通过在肽序列内掺入一个或多个含有-OH基团的种类(优选丝氨酸或苏氨酸残基)来进行添加(以获得O-连接糖基化位点)。也可以通过肽的突变或完全化学合成来进行添加。优选通过DNA水平的变化改变肽的氨基酸序列，特别是通过在预选的碱基处突变编码肽的DNA，从而产生将翻译成所需氨基酸的密码子。优选通过本领域已知的方法进行DNA突变。

在示范的实施方案中，通过改组多核苷酸加入糖基化位点。可以用DNA改组实验流程调控编码候选肽的多核苷酸。DNA改组是递归重组和突变的方法，通过随机片段化相关基因库并接着用与聚合酶链式反应类似的方法重新组装片段来实施。参阅如Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747-10751(1994)；Stemmer，Nature 370：389-391(1994)和U.S.专利No.5,605,793、5,837,458、5,830,721和5,811,238。

加入或去除糖基化位点和加入或去除糖基结构或亚结构的示范的方法在WO 04/099231、WO 03/031464及相关U.S.和PCT申请中有详细描述。

本发明还使用在因子IX肽中加入(或去除)一个或多个选定的糖基残基的方法，其后使修饰的糖与肽中至少一个选定的糖基残基缀合。例如当需要使修饰的糖与因子IX肽中不存在或不以所需的量存在的糖基残基缀合时，可以使用该技术。因此，在使修饰的糖与肽偶联之前通过酶或化学偶联使选定的糖基残基与肽缀合。在另一实施方案中，在缀合修饰的糖之前通过从糖肽中去除碳水化合物残基来改变糖肽的糖基化模式。参阅如WO 98/31826。例如在使用PEG修饰的唾液酸进行糖基PEG化之前，可以从因子IX中去除唾液酸基团以形成无唾液酸的因子IX(图2E)。

选定的糖基残基的示范的附着点包括但不仅限于：(a)N-连接糖基化的共有位点和O-连接糖基化的位点；(b)是糖基转移酶受体的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和组氨酸；(d)游离羧基；(e)游离巯基，如半胱氨酸中的那些；(f)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸或色氨酸中的游离羟基；(g)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的芳族残基或(h)谷氨酰胺的酰胺基。可用于本发明的示范的方法描述于1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC CRIT.REV.BIOCHEM.，259-306页(1981)。

使PEG修饰的糖与糖基化或非糖基化的肽缀合，使用适当的酶介导缀合。优选地，选择修饰的供体糖、酶和受体肽的浓度以使糖基化进行到直至将受体消耗尽。在唾液酸转移酶上下文中公开的以下考虑的因素通常可用于其他糖基转移酶反应。

已知大量使用糖基转移酶合成所需寡糖结构的方法并通常可用于本发明。示例方法描述于例如本文引入作为参考文献的WO 96/32491、Ito等，Pure Appl.Chem.65：753(1993)、U.S.专利No.5,352,670、5,374,541、5,545,553和共同所有的U.S.专利No.6,399,336和6,440,703。

本发明使用单种糖基转移酶或糖基转移酶组合实施。例如，可以使用唾液酸转移酶和半乳糖转移酶的组合。在使用多于一种酶的实施方案中，优选在起始反应混合物中组合酶和底物，或者在第一个酶反应完成或接近完成时向反应介质中加入第二个酶反应的酶和试剂。通过在一个容器中依次进行两个酶反应，与分离中间产物的程序相比提高了总产率。另外，清除并处理额外的溶剂和副产品的需求减少了。

在优选的实施方案中，第一种和第二种酶均为糖基转移酶。在另一优选的实施方案中，一种酶为内切糖苷酶。在另外的优选实施方案中，使用两种以上的酶装配本发明的修饰的糖蛋白。在向肽中加入修饰的糖之前或之后任意时刻使用酶改变肽的糖结构。

在另一实施方案中，本方法使用一种或多种糖苷外切酶或内切酶。糖苷酶一般是经设计以形成而非破坏糖基键的突变体。突变体聚糖酶一般包含活性位点酸性氨基酸残基被氨基酸残基取代。例如当内切聚糖酶为endo-H时，取代的活性位点残基一般为130位置的天冬氨酸、132位置的谷氨酸或其组合。该氨基酸一般被丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代。

突变体酶一般通过与内切聚糖酶水解步骤的逆反应相似的合成步骤催化反应。在这些实施方案中，糖基供体分子(如所需的寡或单糖结构)含有离去基团，通过将供体分子加到蛋白质的GlcNAc残基上进行反应。例如，离去基团可以是卤素如氟。在其他实施方案中，离去基团为Asn或Asn-肽部分。在其他实施方案中，修饰了糖基供体分子上的GlcNAc残基。例如GlcNAc残基可以含有1，2唑啉部分。

在优选的实施方案中，用于产生本发明缀合物的每种酶均以催化量存在。具体酶的催化量根据该酶底物的浓度以及反应条件(如温度、时间和pH值)而改变。在预选的底物浓度和反应条件下确定给定酶的催化量的方法为本领域技术人员所熟知。

进行上述方法的温度的范围可以从刚高于冰点到最敏感的酶变性的温度。优选的温度范围为从约0℃到约55℃，并更优选约20℃到约37℃。在另一示范的实施方案中，使用嗜热酶在提高的温度下进行本方法的一个或多个部分。

使反应混合物保持足以使受体糖基化的一段时间，从而形成所需的缀合物。一些缀合物常常可以在若干小时后检测到，通常在24小时或更短时间内得到可回收的量。本领域技术人员会理解，反应速率取决于可对选定的系统进行优化的多种因素(如酶浓度、供体浓度、受体浓度、温度、溶剂体积)。

本发明还提供修饰的肽的工业规模生产。本文使用的工业规模一般产生至少250mg、优选至少500mg并更优选至少1g纯化的最终缀合物。

在下文的讨论中，通过将修饰的唾液酸部分缀合到糖基化肽来示例本发明。用PEG标记示范的修饰的唾液酸。下文关于PEG修饰的唾液酸和糖基化肽的集中讨论是为了说明的清晰性，而不意味着本发明仅限于这两种配偶体的缀合物。技术人员会理解，本讨论可以普遍应用于加入唾液酸以外的修饰的糖基部分。另外，本讨论同样可以应用于用PEG以外的试剂(包括其他PEG部分、治疗部分和生物分子)修饰糖基单位。

可以使用酶促方法将PEG化或PPG化碳水化合物选择性引入肽或糖肽。该方法使用含有PEG、PPG或被屏蔽的反应性官能团的修饰的糖，并与适当的糖基转移酶或糖合酶组合。通过选择产生所需碳水化合物键并使用修饰的糖作为供体底物的糖基转移酶，可以将PEG或PPG直接引入肽骨架，引入糖肽中原有的糖残基或引入加入至肽中的糖残基。

唾液酸转移酶的受体以天然存在的结构或重组、酶或化学方法放置的结构存在于待用本发明方法修饰的肽中。合适的受体包括如半乳糖受体如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、乳-N-四糖、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和本领域技术人员已知的其他受体(参阅如Paulson等，J.Bio.Chem.253：5617-5624(1978))。

在一个实施方案中，唾液酸转移酶的受体通过糖肽的体内合成存在于待用本发明方法修饰的糖肽上。可以不预先修饰糖肽的糖基化模式而使用所述的方法将这些糖肽唾液酸化。或者，本发明的方法可以用于唾液酸化不含有适当受体的肽；首先通过本领域技术人员已知的方法修饰肽使其含有受体。在示范的实施方案中，通过GalNAc转移酶的作用加入GalNAc残基。

在示范的实施方案中，通过将半乳糖残基附着于与肽相连的适当受体(如GlcNAc)来装配半乳糖受体。该方法包括将待修饰的肽与含有适当量的半乳糖基转移酶(如Galβ1，3或Galβ1，4)和适当的半乳糖供体(如UDP-半乳糖)的反应混合物孵育。使反应基本完成或者在加入预选量的半乳糖残基时中止反应。装配选定的糖受体的其他方法对本领域技术人员是显而易见的。

在另一实施方案中，首先整体或部分“剪切”与糖肽连接的寡糖，以暴露糖基转移酶受体或可以加入一个或多个适当残基以得到适当受体的部分。附着和剪切反应中可以使用酶如糖基转移酶和内切糖苷酶(参阅如U.S.专利No.5,716,812)。

在以下讨论中，通过具有附着的PEG部分的修饰的糖示例本发明的方法。讨论着眼于说明的清晰性。技术人员会理解，本讨论同样与修饰的糖带有治疗部分、生物分子等等的实施方案相关。

在加入修饰的糖之前预先“剪切”碳水化合物残基的本发明示例实施方案中，将高级甘露糖“剪回”第一级双触角结构。将带有PEG部分的修饰的糖与通过“剪回”暴露的一个或多个糖残基缀合。在一个实施例中，通过与PEG部分缀合的GlcNAc部分加入PEG部分。修饰的GlcNAc附着于双触角结构末端甘露糖残基中的一个或两个。或者，未修饰的GlcNAc可以加入分支种类的一个或两个末端。

在另一实施方案中，通过具有半乳糖残基的修饰的糖将PEG部分加至双触角结构的一个或两个末端甘露糖残基，所述修饰的糖与加至末端甘露糖残基的GlcNac残基缀合。或者，可以在一个或两个末端GlcNAc残基中加入未修饰的Gal。

在另一实施例中，使用修饰的唾液酸将PEG部分加至Gal残基。

在另一示范的实施方案中，将高级甘露糖结构“剪回”至双触角结构从中所分支出的甘露糖。在一个实施例中，通过用多聚体修饰的GlcNAc加入PEG部分。或者，将未修饰的GlcNAc加至甘露糖，接着加入带有附着的PEG部分的Gal。在另一实施方案中，依次将未修饰的GlcNAc和Gal加至甘露糖，接着加入用PEG部分修饰的唾液酸部分。

在另一实施方案中，将高级甘露糖“剪回”至附着第一个甘露糖的GlcNAc。将GlcNAc与带有PEG部分的Gal残基缀合。或者，将未修饰的Gal加至GlcNAc，接着加入用水溶性糖修饰的唾液酸。在另一实施方案中，末端GlcNAc与Gal缀合，接着用带有PEG部分的修饰的岩藻糖将GlcNAc藻糖化。

还可以将高级甘露糖(high mannose)剪回至附着于肽的Asn的第一个GlcNAc。在一个实施例中，GlcNAc-(Fuc)_a残基的GlcNAc与带有水溶性多聚体的GlcNAc缀合。在另一实施例中，用带有水溶性多聚体的Gal修饰GlcNAc-(Fuc)_a的GlcNAc。在另一实施方案中，用Gal修饰GlcNAc，接着与用PEG部分修饰的唾液酸的Gal缀合。

另一示范的实施方案公开于共同所有的U.S.专利申请出版物：20040132640、20040063911、20040137557、U.S.专利申请No：10/369,979、10/410,913、10/360,770、10/410,945和PCT/US02/32263，均在本文中引入作为参考文献。

上文公开的实施例提供对本文所公开方法能力的说明。使用本文所述的方法可以“剪回”和建立基本任何所需结构的碳水化合物残基。可以如上文所公开将修饰的糖加至碳水化合物部分的末端，或者可以插入肽核心和碳水化合物的末端之间。

在示范的实施方案中，使用唾液酸酶从因子IX糖肽中去除原有的唾液酸，从而暴露全部或多数下面的半乳糖残基。或者，用半乳糖残基或者具有半乳糖单位末端的寡糖残基标记肽或糖肽。暴露或加入半乳糖残基之后，使用适当的唾液酸转移酶加入修饰的唾液酸。本方法概述于方案1。

方案1

在概括于方案2的另一方法中，在唾液酸上存在屏蔽的反应官能团。屏蔽的反应基团优选未被用于将修饰的唾液酸附着到因子IX的条件影响。在将修饰的唾液酸共价附着于肽之后，去除屏蔽并使肽与试剂如PEG缀合。试剂通过其与修饰的糖残基的未屏蔽反应基团的反应以特异性方式与肽缀合。

方案2

取决于糖肽寡糖侧链的末端糖(表1)，本文公开的任何修饰的糖可以与其适当的糖基转移酶一起使用。如上文所讨论的，引入PEG化结构所需的糖肽末端糖可以在表达中天然引入，或者可在反应后使用适当的糖苷酶、糖基转移酶或糖苷酶和糖基转移酶的混合物产生。

表1

x＝O，NH，S，CH2，N-(R1-5)2.Y＝X；Z＝X；A＝X；B＝X.Q＝H2，O，S，NH，N-R.R，R1-4＝H，接头-M，M.M＝PEG，e.g.，m-PEG

在另一实施方案中，UDP-半乳糖-PRG与牛乳β1，4-半乳糖转移酶反应，从而将修饰的半乳糖转移到适当的末端N-乙酰葡糖胺结构。糖肽的末端GlcNAc残基可以在表达中产生(如在哺乳动物、昆虫、植物或真菌的表达系统中发生)，也可以如所需通过用唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基转移酶处理糖肽而产生。

在另一示范的实施方案中，使用GlcNAc转移酶如GNT1-5将PEG化GlcN转移到糖肽的末端甘露糖残基。在另一示范的实施方案中，从糖肽中酶促去除N-和/或O-连接聚糖结构以暴露接着与修饰的糖缀合的氨基酸或末端糖基残基。例如，使用内切糖苷酶去除糖肽的N-连接结构以暴露糖肽上作为GlcNAc-连接-Asn的末端GlcNAc。使用UDP-Gal-PEG和适当的半乳糖转移酶在暴露的GlcNAc上引入PEG-半乳糖官能团。

在另一可选实施方案中，使用已知将糖残基转移到肽骨架的糖基转移酶直接将修饰的糖加入肽骨架。该示范的实施方案公开于方案3。在本发明的实用中可以使用的示范的糖基转移酶包括但不仅限于GalNAc转移酶(GalNAc T1-14)、GlcNAc转移酶、岩藻糖转移酶、葡萄糖转移酶、木糖转移酶、甘露糖转移酶等等。使用本方法可以将修饰的糖直接加到缺少任何碳水化合物的肽或者加到原有糖肽。在这两种情况下，修饰的糖的加入在以糖基转移酶的底物特异性定义的肽骨架的特定位置发生，而不以如使用化学方法修饰蛋白质肽骨架中出现的随机方式发生。可以通过将适当的氨基酸序列设计到多肽链中而在缺少糖基转移酶底物肽序列的蛋白质或糖肽中引入一系列的试剂。

方案3

在上文公开的各个示范的实施方案中，可以在将修饰的糖与肽缀合后使用一个或多个额外的化学或酶修饰步骤。在示例实施方案中，使用酶(如岩藻糖转移酶)将糖基单位(如岩藻糖)附加到肽上附着的末端修饰糖。在另一实施例中，使用酶反应使修饰的糖不能缀合的位点“加帽”。或者，使用化学反应改变所缀合的修饰的糖的结构。例如，使所缀合的修饰的糖与试剂反应，所述试剂使其与修饰的糖所附着的肽组分之间的键稳定或不稳定。在另一实施例中，在与肽缀合后去保护修饰的糖的组分。技术人员会理解，在修饰的糖与肽缀合之后，可以在本发明方法中使用一系列的酶和化学方法。修饰的糖-肽缀合物的进一步加工在本发明的范围内。

酶

除了上文形成酰基-连接缀合物的内容中所讨论的酶以外，可以通过使用其他酶的方法加工、剪回或修饰缀合物和起始底物(如肽、脂质)的糖基化模式。使用将糖供体转移到受体的酶重构肽和脂质的方法在2003年4月17日公布的DeFrees，WO 03/031464 A2中有非常详细的描述。下文中公开了本发明方法中使用酶的简要概述。

糖基转移酶

糖基转移酶催化以分步的方式将活化的糖(供体NDP-或NMP-糖)加到蛋白质、糖肽、脂质或糖脂或正延长的寡糖的非还原末端。通过转移酶和与脂质连接的寡糖供体Dol-PP-NAG₂Glc₃Man₉的模块(enblock)转移和接着的剪切核心来合成N-连接糖肽。在这种情况下，“核心”糖的性质与随后的附着存在某些差异。多种糖基转移酶为本领域已知。

本发明中可以使用任何糖基转移酶，只要其能利用修饰的糖作为糖供体。这些酶的实例包括Leloir途径糖基转移酶，如半乳糖转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、岩藻糖转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖转移酶、木糖转移酶、葡糖醛酸转移酶等等。

对于涉及糖基转移酶反应的酶促糖合成，可以从任何来源克隆或分离糖基转移酶。许多克隆的糖基转移酶以及它们的多核苷酸序列是已知的。参阅如“The WWW Guide To Cloned Glycosyltransferases”( http：//www.vei.co.uk/TGN/gt-guide.htm)。也可以在多种公共数据库(包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等等)中发现糖基转移酶的氨基酸序列和可推导出氨基酸序列的编码糖基转移酶的核苷酸序列。

可用于本发明方法中的糖基转移酶包括但不仅限于半乳糖转移酶、岩藻糖转移酶、葡萄糖转移酶、N-乙酰半乳糖胺转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、葡糖醛酸基转移酶、唾液酸转移酶、甘露糖转移酶、葡糖醛酸转移酶、半乳糖醛酸转移酶和寡糖转移酶。合适的糖基转移酶包括得自真核细胞和原核细胞的糖基转移酶。

编码糖基转移酶的DNA可以通过化学合成获得、通过筛选来自适当细胞或细胞系培养物的mRNA逆转录本获得、通过筛选来自适当细胞的基因组文库获得、或通过这些方法的组合获得。可以用产生自糖基转移酶基因序列的寡核苷酸探针筛选mRNA或基因组DNA。可以根据已知方法用常规杂交试验中所用的可检测基团(如荧光基团、放射性原子或化学发光基团)标记探针。另外，可以用产生自糖基转移酶基因序列的PCR寡核苷酸引物通过聚合酶链式反应(PCR)方法获得糖基转移酶基因序列。参阅如Mullis等的U.S.专利No.4,683,195和Mullis的U.S.专利No.4,683,202。

可以在用含有编码糖基转移酶的DNA的载体转化的宿主细胞中合成糖基转移酶。载体用于扩增编码糖基转移酶的DNA和/或表达编码糖基转移酶的DNA。表达载体是可复制的DNA构建体，其中编码糖基转移酶的DNA序列与能够使糖基转移酶在适当宿主中表达的适当的控制序列有效连接。对这些控制序列的需求取决于选择的宿主细胞和选定的转化方法而不同。控制序列一般包括转录启动子、任选的控制转录的操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译的终止的序列。扩增载体不需要表达控制结构域。所需的仅为在宿主中复制的能力(通常由复制起点赋予)和便于识别转化体的选择标记。

在示范的实施方案中，本发明利用原核酶。这样的糖基转移酶包括许多革兰氏阴性菌产生的脂寡糖(LOS)的合成中所涉及的酶(Preston等，Critical Reviews in Microbiology 23(3)：139-180(1996))。这些酶包括但不仅限于如大肠杆菌(E.coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等物种的rfa操纵子蛋白(包括β1，6半乳糖转移酶和β1，3半乳糖转移酶(参阅如EMBL登录号M80599和M86935(大肠杆菌)、EMBL登录号S56361(鼠伤寒沙门氏菌))、葡萄糖基转移酶(Swiss-Prot登录号P25740(大肠杆菌)、β1，2-葡萄糖基转移酶(rfaJ)(Swiss-Prot登录号P27129(大肠杆菌)和Swiss-Prot登录号P19817(鼠伤寒沙门氏菌))和β1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶(rfaK)(EMBL登录号U00039(大肠杆菌))。氨基酸序列已知的其他糖基转移酶包括已在如肺炎克来伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、小肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)、结肠耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leprosum)中表征的操纵子及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操纵子所编码的。

另外适用于本发明的是产生含有乳糖-N-新四糖、D-半乳糖基-β-1，4-N-乙酰-D-葡糖氨-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖和已在粘膜病原体淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中鉴定出的Pk血型三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的结构中涉及的糖基转移酶(Scholten等，J.Med.Microbiol.41：236-243(1994))。来自脑膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的编码这些结构的生物合成中所涉及的糖基转移酶的基因鉴定自脑膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等，Mol.Microbiol.18：729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突变体F62(Gotshlich，J.Exp.Med.180：2181-2190(1994))。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，由三个基因lgtA、lgtB和lgE组成的基因座编码添加乳糖-N-新四糖链中最后三个糖所需的糖基转移酶(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271：19166-73(1996))。近年来已证明了lgtB和lgtA基因产物的酶活性，提供了其预计的糖基转移酶功能的第一个直接证据(Wakarchuk等，J.Biol.Chem.271(45)：28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中有两个额外的基因，即，将β-D-GalNAc加到乳糖-N-新四糖结构末端半乳糖的3位置的lgtD，和将末端α-D-Gal加到截短LOS的乳糖元件，从而产生Pk血型抗原结构(前述Gotshlich(1994))的lgtC。在脑膜炎奈瑟氏球菌中，分离的抗原型L1也表达P^k血型抗原并显示带有lgtC基因(前述Jennings等，(1995))。奈瑟氏球菌糖基转移酶及相关基因还描述于USPN5,545,553(Gotschlich)。来自幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)的α1，2-岩藻糖基转移酶和α1，3-岩藻糖基转移酶的基因也已表征(Martin等，J.Biol.Chem.272：21349-21356(1997))。空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的糖基转移酶也可用于本发明(参阅如http：//afmb.cnrs-mrs.fr/～pedro/CAZY/gtf_42.html)。

岩藻糖基转移酶

在一些实施方案中，本发明方法中所使用的糖基转移酶为岩藻糖基转移酶。岩藻糖基转移酶为本领域技术人员所公知。示范的岩藻糖基转移酶包括将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到受体糖的羟基位置的酶。将非核苷酸糖转移至受体的岩藻糖基转移酶也可用于本发明。

在一些实施方案中，受体糖为例如寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GalNAc β-基团中的GlcNAc。适用于该反应的岩藻糖基转移酶包括最先从人乳中表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶(FTIIIE.C.No.2.4.1.65)(参阅如Palcic等，CarbohydrateRes.190：1-11(1989)、Prieels等，J.Biol.Chem.256：10456-10463(1981)和Nunez等，Can.J.Chem.59：2086-2095(1981))和发现于人血清的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α岩藻糖基转移酶(FTIV、FTV、FTVI)。还表征了FTVII(E.C.No.2.4.1.65)，即唾液酸基α(2→3)Galβ((1→3)GlcNAc β岩藻糖基转移酶。还表征了Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-α(1→3，4)岩藻糖基转移酶的重组形式(参阅Dumas等，Bioorg.Med.Letters 1：425-428(1991)和Kukowska-Latallo等，Genes and Development 4：1288-1303(1990))。其他示范的岩藻糖基转移酶包括如α1，2岩藻糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.69)。可以通过Mollicone等Eur.J.Biochem.191：169-176(1990)或U.S.专利No.5,374,655中所述的方法进行酶促岩藻糖基化。用于产生岩藻糖基转移酶的细胞还包括合成GDP-岩藻糖的酶系统。

半乳糖基转移酶

在另一组实施方案中，糖基转移酶为半乳糖基转移酶。示范的半乳糖基转移酶包括α(1，3)半乳糖基转移酶(E.C.No.2.4.1.151，参阅如Dabkowski等，Transplant Proc.25：2921(1993)和Yamamoto等，Nature 345：229-233(1990)、牛(GenBank j04989，Joziasse等，J.Biol.Chem.264：14290-14297(1989))、鼠(GenBank m26925；Larsen等，Proc.Nat’1.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989))、猪(GenBank L36152；Strahan等，Immunogenetics 41：101-105(1995))。另一合适的α(1，3)半乳糖基转移酶为参与合成B血型抗原的酶(EC 2.4.1.37，Yamamoto等，J.Biol.Chem.265：1146-1151(1990)(人))。另一示范的半乳糖基转移酶为核心Gal-T1。

同样适合本发明方法用途的是β(1，4)半乳糖基转移酶，其包括如EC 2.4.1.90(LacNAc合成酶)和EC 2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛(D′Agostaro等，Eur.J.Biochem.183：211-217(1989))、人(Masri等，Biochem.Biophys.Res.Commun.157：657-663(1988))、鼠(Nakazawa等，J.Biochem.104：165-168(1988)))以及E.C.2.4.1.38和神经酰胺半乳糖基转移酶(EC 2.4.1.45，Stahl等，J.Neurosci.Res.38：234-242(1994)))。其他合适的半乳糖基转移酶包括如α1，2半乳糖基转移酶(来自如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等，Mol.Biol.Cell 5：519-528(1994))。

唾液酸转移酶

唾液酸转移酶是可用于本发明的重组细胞和反应混合物的另一类型的糖基转移酶。产生重组唾液酸转移酶的细胞还会产生唾液酸转移酶的唾液酸供体CMP-唾液酸。适合本发明用途的唾液酸转移酶的实例包括ST3Gal III(如大鼠或人ST3Gal III)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST3Gal II、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAc III(本文使用的唾液酸转移酶命名法如Tsuji等，Glycobiology 6：V-xiv(1996)中所述)。示范的α(2，3)唾液酸转移酶指将唾液酸转移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非还原末端Gal的α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。参阅Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.256：3159(1981)、Weinstein等，J.Biol.Chem.257：13845(1982)和Wen等，J.Biol.Chem.267：21011(1992)。另一示范的α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.4)将唾液酸转移到二糖或糖苷的非还原末端Gal上。参阅Rearick等，J.Biol.Chem.254：4444(1979)和Gillespie等，J.Biol.Chem.267：21004(1992)。其他示范的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAc α-2，6唾液酸转移酶(参阅Kurosawa等，Eur.J.Biochem.219：375-381(1994))。

优选地，对于糖肽类碳水化合物的糖基化，唾液酸转移酶能够将唾液酸转移到序列Galβ1，4GlcNAc-(完全唾液酸化的碳水化合物结构上末端唾液酸后最普遍的次级(penultimate)序列)上(见表2)。

表2：使用Galβ1，4GlcNAc序列作为受体底物的唾液酸转移酶

唾液酸转移酶	来源	形成的序列	Ref.
				ST6Gal I	哺乳动物	NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc-	1
ST3Gal III	哺乳动物	NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-	1
				ST3Gal IV	哺乳动物	NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-NeuAcα2，3Galβ1，3GlcNAc-	1
ST6Gal II	哺乳动物	NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc-
				ST6Gal II	发光细菌	NeuAcα2，6Galβ1，4GlcNAc-	2
ST3Gal V	脑膜炎奈瑟氏球菌淋病奈瑟氏球菌	NeuAcα2，3Galβ1，4GlcNAc-	3

1)Goochee等，Bio/Technology 9：1347-1335(1991)

2)Yamamoto等，J.Biochem.120：104-110(1996)

3)Gilbert等，J.Biol.Chem.271：28271-28276(1996)

本发明中有用的其他唾液酸转移酶包括上文图4表格中的那些。该唾液酸转移酶可用于将PEG化的唾液酸部分从PEG化的唾液酸供体种类转移到肽的N-连接糖基残基(图2C)或IX因子的O-连接糖基残基(图2D)上。

可用于所述方法的唾液酸转移酶实例为ST3Gal III，也称为α(2，3)唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。该酶催化将唾液酸转移到Galβ1，3GlcNAc或Galβ1，4GalNAc糖苷的Gal上(参阅如Wen等，J.Biol.Chem.267：21011(1992)、Van den Eijnden等，J.Biol.Chem.256：3159(1991))并负责糖肽中与天冬酰胺相连的寡糖的唾液酸化。该唾液酸通过在两个糖之间形成α键与Gal相连。糖之间的成键(连接)是在NeuAc的2位置和Gal的3位置之间。这一具体酶可分离自大鼠肝(weinstein等，J.Biol.Chem.257：13845(1982))；并且人cDNA(Sasaki等，(1993)J.Biol.Chem.268：22782-22787、kitagawa& Paulson(1994)J.Biol.Chem.269：1394-1401)和基因组(Kitagawa等，(1996)J.Biol.Chem.271：931-938)DNA序列已知，便于通过重组表达产生该酶。在优选的实施方案中，所述的唾液酸化方法使用大鼠ST3Gal III。

本发明中有用的其他示范的唾液酸转移酶包括分离自空肠弯曲杆菌的那些酶，包括α(2，3)。参阅如WO 99/49051。

除了表2中列出之外的唾液酸转移酶也可用于唾液酸化具有商业重要性的糖肽的经济高效的大规模方法中。作为找出这些其他酶的可用性的简单测试，将多种量(1-100mU/mg蛋白质)的每种酶与无唾液酸基-α₁AGP(1-10mg/ml)进行反应，以将目的唾液酸转移酶唾液酸化糖肽的能力与牛ST6Gal I、ST3Gal III或两者进行比较。另外，在该评估中可以使用其他糖肽或从肽骨架上酶促释放的糖肽或N-连接寡糖代替无唾液酸基-α₁AGP。具有比ST6Gal I更高效的唾液酸化糖肽的N-连接寡糖的能力的唾液酸转移酶可用于肽唾液酸化的大规模实用方法中。

GalNAc转移酶

N-乙酰半乳糖氨基转移酶在本发明的实践中是有用的，特别是对于将GalNAc部分与肽的O-连接糖基化位点的氨基酸连接。合适的N-乙酰半乳糖氨基转移酶包括但不仅限于α(1，3)N-乙酰半乳糖氨基转移酶、β(1，4)-N-乙酰半乳糖氨基转移酶(Nagata等，J.Biol.Chem.267：12082-12089(1992)和Smith等，J.Biol.Chem.269：15162(1994))和多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶(Homa等，J.Biol.Chem.268：12609(1993))。

通过基因操作从克隆的基因产生蛋白质如GalNAc T_I-XX酶为本领域所熟知。参阅如U.S.专利No.4,761,371。一种方法涉及收集足够的样品，然后通过N端测序确定酶的氨基酸序列。使用该信息分离编码全长(与膜结合的)转移酶的cDNA克隆，所述cDNA克隆在昆虫细胞系Sf9中的表达合成完全活性的酶。然后使用16种不同蛋白质的已知糖基化位点周围的氨基酸的半定量分析和接着的合成肽体外糖基化研究确定酶的受体特异性。该工作已经证明，糖基化肽片段中的某些氨基酸残基是过量(overrepresent)的，并且糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基周围特定位置的残基可能比其他氨基酸部分对受体效率具有更显著的影响。

与细胞结合的糖基转移酶

在另一实施方案中，本发明方法所使用的酶为与细胞结合的糖基转移酶。尽管已知有许多可溶性糖基转移酶(参阅如U.S.专利No.5,032,519)，糖基转移酶与细胞结合时一般为与膜结合的形式。迄今已研究的许多与膜结合的酶被认为是膜内蛋白，即它们被声处理后不从膜中解离，并需要洗涤剂来溶解。已经在脊椎动物和无脊椎动物细胞上鉴定了表面糖基转移酶，并且已认识到这些表面糖基转移酶在生理条件下保持了催化活性。然而，细胞表面糖基转移酶认识更深入的功能是对于细胞间的识别(Roth，《MOLECULAR APPROACHES toSUPRACELLULAR PHENOMENA》，1990)。

已经发展了改变细胞所表达的糖基转移酶的方法。例如，Larson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8227-8231(1989)报道了分离决定细胞表面寡糖结构及其相关糖基转移酶表达的克隆序列的遗传方法。将从已知表达UDP-半乳糖：.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖转移酶的鼠细胞系分离的mRNA所产生的cDNA文库转染进COS-1细胞中。然后培养转染的细胞并测试α1-3半乳糖转移酶活性。

Francisco等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：2713-2717(1992)公开了将β-内酰胺酶锚定到大肠杆菌外表面的方法。产生了由(i)外膜蛋白的信号序列、(ii)外膜蛋白跨膜区段和(iii)完整的成熟β-内酰胺酶序列组成的三体融合物，最终产生活性表面结合的β-内酰胺酶分子。然而，Francisco方法仅限于原核细胞系统，并且作者认识到，其发挥正常功能需要完整的三体融合物。

磺基转移酶

本发明还提供产生肽(包括硫酸化分子)的方法，所述硫酸化分子包括如硫酸多糖如肝素、硫酸类肝素、carragenen及相关化合物。合适的磺基转移酶包括如软骨素-6-磺基转移酶(Fukuta等，J.Biol.Chem.270：18575-18580(1995)描述的鸡cDNA；GenBank登录号D49915)、糖胺聚糖N-乙酰葡萄糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶1(Dixon等，Genomics 26：239-241(1995)；UL 18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡萄糖胺N-脱乙酰酶/N-磺基转移酶2(Orellana等，J.Biol.Chem.269：2270-2276(1994)和Eriksson等，J.Biol.Chem.269：10438-10443(1994)中描述的鼠cDNA；GenBank登录号U2304中描述的人cDNA)。

糖苷酶

本发明还包括野生型和突变体糖苷酶的用途。已经证明突变体β-半乳糖苷酶通过α-糖基氟化物与半乳糖受体分子的偶联催化形成二糖。(Withers，U.S.专利No.6,284,494，2001年9月4日颁发)。本发明有用的的其他糖苷酶包括如β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露糖苷酶、β-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、β-木糖苷酶、β-岩藻糖苷酶、纤维素酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、半纤维素酶、淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、α-木糖苷酶、α-岩藻糖苷酶和神经氨酸酶/唾液酸酶。在示范的实施方案中，在糖基PEG化之前使用唾液酸酶从因子IX(图2A)的N-聚糖中去除唾液酸。本发明还提供无需预先除去唾液酸的方法。因此，涉及使用修饰的唾液酸部分的和ST3Gal3的唾液酸交换反应的方法可以用于本发明。

固定化的酶

本发明还提供固定于固体和/或可溶支持物的酶的用途。在示范的实施方案中，提供了通过本发明方法的完整糖基接头与PEG缀合的糖基转移酶。PEG-接头-酶缀合物任选地附着于固体支持物。在本发明方法中使用固体支持的酶简化了反应混合物的建立和反应产物的纯化，并使酶容易回收。本发明的方法中使用了糖基转移酶缀合物。酶和支持物的其他组合对于本领域的技术人员而言是显而易见的。

融合蛋白

在另一示范的实施方案中，本发明的方法使用融合蛋白，所述融合蛋白具有一种以上与合成所需糖肽缀合物相关的酶活性。融合多肽可以由例如糖基转移酶的催化活性结构域与辅助酶的催化活性结构域相连组成。辅助酶催化结构域可以催化例如核苷酸糖(糖基转移酶的供体)形成中的一个步骤，或催化与糖基转移酶循环相关的反应。例如，编码糖基转移酶的多核苷酸可以与编码参与核苷酸糖合成的酶的多核苷酸按读码框连接。从而得到的融合蛋白不仅可以催化合成核苷酸糖，还可以催化将糖部分转移到受体分子。融合蛋白可以是连接成一个可表达核苷酸序列的两个或多个循环酶。在其他实施方案中融合蛋白包括两个或多个糖基转移酶的催化活性结构域。参阅如5,641,668。可以使用多种合适的融合蛋白方便地设计和生产本发明的修饰的糖肽(参阅如PCT专利申请PCT/CA98/01180，1999年6月24日作为WO 99/31224公布)。

制备修饰的糖

一般通过使用反应基团将糖部分或糖部分-接头盒或PEG或PEG-接头盒基团连接在一起，所述反应基团一般通过连接方法转化成新有机官能团或非活性种类。糖反应性官能团位于糖部分的任何位置。可用于本发明的实践中的反应基团和反应类型一般为生物缀合化学领域的技术人员所熟知。目前偏好的适于反应性糖部分的反应类型是在相对温和条件下进行的。它们包括但不仅限于亲核取代(如酰基卤化物、活性酯和醇、胺的反应)、亲电取代(如烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子多重键的加成(如Michael反应、Diels-Alder加成)。这些及其他有用的反应在例如March，《ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY》，第三版，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，《BIOCONJUGATETECHNIQUES》，Academic Press，San Diego，1996和Feeney等，《MODIFICATION OF PROTEINS》、《Advances in Chemistry Series》，第198卷，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982中有所讨论。

侧挂于糖核或修饰基团的有用的反应性官能团包括但不仅限于：

(a)羧基基团及其多种衍生物，包括但不仅限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟苄基三唑酯、酰基卤、酰基咪唑、硫脂、对硝基苯基酯、烷基、烯基、炔基和芳香酯；

(b)羟基基团，其可转化为如酯、醚、醛等；

(c)卤烃基基团，其中卤化物可以随后用亲核基团(如胺、羧酸阴离子、硫醇阴离子、碳负离子或醇盐离子替换，从而引起卤素原子官能团处新基团的共价附着；

(d)能够参与Diels-Alder反应的亲双烯体，例如马来酰亚胺基团；

(e)醛或酮基团，可以通过形成羰基衍生物如亚胺、腙、缩氨基脲或肟，或通过这些机制如Grignard加成或烷基锂加成进一步衍生；

(f)与胺继发反应例如形成氨磺酰的磺酰卤化物基团；

(g)巯基，其可以转换为如二硫化物或与酰卤反应；

(h)胺或巯基基团，其可以是如酰化的、烃基化的或氧化的；

(i)能够进行环加成、酰化、Michael加成等等的烯烃；和

(j)能够与如胺和羟基化合物反应的环氧化物。

可以选择反应性官能团使其不参与或不干扰组装反应性糖核或修饰基团所必需的反应。另外，可以通过保护基的存在来保护反应性官能团，使其不参与反应。本领域技术人员会了解如何保护特定的官能团以使其不与选定的一组反应条件发生干扰。有用的保护基的实例参阅如Greene等，《PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS》，JohnWiley & Sons，New York，1991。

在接下来的讨论中，给出了可用于本发明的实用的修饰的糖的大量具体实例。在示范的实施方案中，使用唾液酸衍生物作为修饰基团附着的糖核。唾液酸衍生物的讨论着重于使说明更清楚，而不应理解为限制本发明的范围。本领域技术人员会理解，可以用以唾液酸为示例所述的类似方式活化和衍生多种其他糖部分。例如，大量方法可用于修饰半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和岩藻糖以成为若干糖底物，其可容易地用本领域已知的方法修饰。参阅如Elhalabi等，Curr.Med.Chem.6：93(1999)和Schafe等，J.Org.Chem.65：24(2000)。

在示范的实施方案中，用本发明方法修饰的肽为在哺乳动物细胞(如CHO细胞)或转基因动物中产生，并因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-连接寡糖链的糖肽。缺乏唾液酸并含有末端半乳糖残基的糖肽的寡糖链可以PEG化、PPG化或用修饰的唾液酸进行修饰。

在方案4中，用被保护的氨基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯处理氨基糖苷1，将糖胺残基转变为相应的被保护的氨基酸酰胺加合物。用醛缩酶处理加合物以形成α-羟基羧酸盐2。通过CMP-SA合成酶的作用将化合物2转变为相应的CMP衍生物，接着通过催化氢化CMP衍生物产生化合物3。使用通过将化合物3与活性PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PEG-OC(O)O-p-硝基苯)反应形成甘氨酸加合物而引入的胺作为PEG附着的位点，分别产生如4或5的种类。

方案4

表3描述了用PEG部分衍生的单磷酸糖的代表性实例。表3中的某些化合物通过方案4的方法制备。其他衍生物通过本领域已知的方法制备。参阅如Keppler等，《Glycobiology》11：11R(2001)和Charter等，《Glycobiology》10：1049(2000)。其他胺反应性的PEG或PPG类似物是市售的，或者可以通过本领域技术人员容易获得的方法制备。

表3

在本发明的实践中有用的修饰的磷酸糖可以在上文所述位置和其他位置进行取代。目前优选的唾液酸取代在下式中公开：

其中X为连接基团，优选选自-O-、-N(H)-、-S、CH₂-和-N(R)₂，其中各个R分别独立选自R¹-R⁵。符号Y、Z、A和B各代表选自上文所述X定义的基团。X、Y、Z、A和B各自独立选择，因此它们可以相同或不同。符号R¹、R²、R³、R⁴和R⁵代表H、PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分。另外，这些符号代表与PEG部分、治疗部分、生物分子或其他部分结合的接头。

本发明公开的附着于缀合物的示范的部分包括但不仅限于PEG衍生物(如酰基-PEG、酰基-烃基-PEG、烃基-酰基-PEG、氨基甲酰基-PEG、芳基-PEG)、PPG衍生物(如酰基-PPG、酰基-烃基-PPG、烃基-酰基-PPG、氨基甲酰基-PPG、芳基-PPG)、治疗部分、诊断部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、类肝素、SLeX、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、Sialyl LewisX、FGF、VFGF、蛋白质、软骨素、角质素、皮肤素、白蛋白、整合素、触角寡糖、肽等等。将多种修饰基团与糖部分缀合的方法是本领域技术人员容易获得的(《POLY(ETHYLENE GLYCOL CHEMISTRY：BIOTECHNICAL AND BIOMEDICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris编辑，Plenum Pub.Corp.，1992；《POLY(ETHYLENE GLYCOL)CHEMICALAND BIOLOGICAL APPLICATIONS》，J.Milton Harris编辑，ACSSymposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，《BIOCONJUGATE TECHNIQUES》，Academic Press，SanDiego，1996和Dunn等编辑，《POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERYSYSTEMS》，ACS Symposium Series Vol.469，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991》。

接头基团(交联基团)

制备可用于本发明方法的修饰的糖包括将PEG部分附着到糖残基并优选形成稳定的加合物，所述加合物为糖基转移酶的底物。因此，经常优选使用接头(例如PEG和糖部分与交联剂反应缀合PEG和糖)。可用于将修饰基团附着于碳水化合物部分的示范的双功能化合物包括但不仅限于双功能聚乙二醇、聚酰胺、聚醚、聚酯等等。将碳水化合物与其它分子连接的一般方法为文献中已知。参阅如Lee等，《Biochemistry》28：1856(1989)、Bhatia等，Anal.Biochem.178：408(1989)、Janda等，J.Am.Chem.Soc.112：8886(1990)和Bednarski等，WO 92/18135。在下文的讨论中，新生修饰的糖中的糖部分的反应基团进行温和处理。讨论着重于使说明更清楚。本领域技术人员会理解，该讨论也适用于修饰基团的反应基团。

多种试剂可用于修饰带有分子内化学交联的修饰的糖的成分(交联试剂和交联方法的综述参阅：Wold，F.，Meth.Enzymol.25：623-651，1972、Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，在《ENZYMES ASDRUGS》(Holcenberg和Roberts编辑)，395-442页，Wiley，New York，1981中、Ji，T.H.，Meth.Enzymol.91：580-609，1983、Mattson等，Mol.Biol.Rep.17：167-183，1993，在本文中全部整体引入作为参考)。优选的交联试剂来自多种零长度、同双功能和异双功能交联试剂。零长度交联试剂包括不引入外部材料的两个内部化学基团直接缀合。催化形成二硫键的试剂属于这一类别。另一实例为诱导羧基和伯氨基缩合形成酰胺键的试剂，如碳二亚胺、乙基氯代甲酸酯、Woodward’s试剂K(2-乙基-5-苯基异噁唑-3’-磺酸酯)和羰二咪唑。除了这些化学试剂以外，转谷氨酰胺酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰转移酶；EC 2.3.2.13)可以用作零长度交联试剂。该酶在与蛋白质结合的谷氨酰胺残基的氨甲酰基团处催化酰基转移反应，通常以伯氨基作为底物。优选的同和异双功能试剂分别含有两个相同的或两个不同的位点，其可以对氨基、巯基、胍基、吲哚或非特异基团具有反应性。

纯化因子IX缀合物

通过上述方法产生的产物可以不经纯化而使用。然而，通常优选回收产物。可以使用熟知的标准技术回收糖基化的糖，如薄层或厚层层析、柱层析、离子交换层析或膜过滤。如下文以及本文所引用的文献所讨论，优选使用膜过滤(更优选使用反渗透膜)或一种或多种柱层析技术进行回收。例如，可以使用分子量截止值约3000到约10000的膜去除蛋白质如糖基转移酶。然后可以使用纳米过滤或反渗透去除盐和/或纯化产物糖(参阅如WO 98/15581)。纳米过滤膜是反渗透膜的一种，其透过一价盐而截留多价盐和大于约100到约2000道尔顿的不带电溶质(取决于所使用的膜)。因此，在一般应用中，通过本发明方法制备的糖将留在膜上而污染盐将透过。

如果在细胞内产生修饰的糖蛋白，第一步去除宿主细胞或裂解片段的微粒碎屑(例如通过离心或超滤)，任选地，可以用市售的蛋白浓缩滤器浓缩蛋白质，接着通过一个或多个步骤从其他杂质中分离多肽变体，所述步骤选自免疫亲和层析、离子交换柱分级分离(如二乙基氨基乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基基团的基质)、Blue-Sepharose、CM Blue-Sepharose、MONO-Q、MONO-S、lentillectin-Sepharose、WGA-Sepharose、Con A-Sepharose、EtherToyopearl、Butyl Toyopearl、Phenyl Toyopearl或A蛋白Sepharose上的层析、SDS-PAGE层析、硅胶层析、层析聚焦、反相HPLC(如带有侧挂脂肪基团的硅胶)、使用如Sephadex分子筛或大小排阻层析的凝胶过滤、与多肽选择性结合的柱上的层析以及乙醇或硫酸铵沉淀。

在培养物中产生的修饰糖肽一般通过首先从细胞、酶等中提取和接着的一次或多次浓缩、盐析、含水离子交换或分子排阻层析步骤进行分离。另外，可以通过亲和层析纯化修饰的糖蛋白。最后可以使用HPLC进行最后的纯化步骤。

可以在任何前述步骤中引入蛋白酶抑制剂(如甲磺酰氟(PMSF))以抑制蛋白酶解，并可以含有抗生素以阻止外来污染物的生长。

在另一个实施方案中，首先使用市售的蛋白质浓缩滤器(如Amicon或Millipore Pellicon超滤设备)浓缩来自产生本发明修饰糖肽的系统的上清液。在浓缩步骤之后，可以将浓缩液应用于合适的纯化基质。例如，合适的亲和基质可以含有与合适的支持物结合的肽的配体、凝集素或抗体分子。另外，可以使用阴离子交换树脂，如含有侧挂的DEAE基团的基质或底物。合适的基质包括丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或在蛋白质纯化中普遍使用的其他类型。另外，可以应用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基基团的多种不溶基质。特别优选磺丙基基团。

最后，为进一步纯化多肽变体组合物，可以应用一个或多个使用疏水RP-HPLC介质(如具有侧挂的甲基或其他脂肪基团的硅胶)的RP-HPLC步骤。还可以利用某些或全部上述纯化步骤的多种组合来提供同质修饰的糖蛋白。

可以通过与Urdal等，J.Chromatog.296：171(1984)中所公开的相类似的方法纯化从大规模发酵得到的本发明修饰糖肽。该参考文献描述了用于纯化重组人IL-2的在制备级HPLC柱上进行的两个连续的RP-HPLC步骤。另外，可以利用如亲和层析的技术纯化修饰的糖蛋白。

药物组合物

在另一方面中，本发明提供药物组合物。药物组合物包含可药用稀释剂以及非天然存在的PEG部分、治疗部分或生物分子和糖基化的或非糖基化的因子IX肽的共价缀合物。多聚体、治疗部分或生物分子通过完整的糖基连接基团与肽缀合，所述连接基团插入肽和多聚体、治疗部分或生物分子之间并与二者共价连接。

本发明的药物组合物适用于多种药物投送系统。本发明中有用的合适制剂可见于《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，第十七版，(1985)。药物投送方法的简单综述参阅Langer，Science 249：1527-1533(1990)。

可以为任何适当的给药方式配制药物组合物，包括如局部、口服、鼻、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌内给药。对于肠胃外给药(如皮下注射)，载体优选含有水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服给药，可以使用任何上述载体或固体载体如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可以使用可生物降解微球(如多聚乳酸、聚乙醇酸)作为本发明药物组合物的载体。合适的可生物降解微球公开于如U.S.专利No.4,897,268和5,075,109。

药物组合物一般经肠胃外(如静脉内)给药。因此，本发明提供经肠胃外给药的组合物，其含有溶解于或悬浮于可接受载体(优选水性载体如水、缓冲水、盐水、PBS等等)的化合物。组合物可以含有接近生理条件所需的可药用辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调整剂、湿润剂、洗涤剂等等。

这些组合物可以使用常规灭菌技术灭菌或进行过滤灭菌。得到的水溶液可以原样包装待用或冻干，冻干的制剂在给药前与无菌水性载体组合。制剂的pH一般在3和11之间，优选从5到9并最优选从7到8。

在一些实施方案中，本发明的糖肽可以掺入由标准小泡形成性脂质所形成的脂质体中。多种方法可用于制备脂质体，如Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)、U.S.专利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028中所述。使用多种靶向剂(如本发明的唾液酸半乳糖苷)靶向脂质体为本领域所熟知(参阅如U.S.专利No.4,957,773和4,603,044)。

可以使用将靶向剂与脂质体偶联的标准方法。这些方法一般涉及将脂质组分(如磷脂酰乙醇胺)掺入脂质体中，所述脂质组分可以被活化用于附着靶向剂，或衍生的亲脂化合物，如本发明的脂质衍生的糖肽。

靶向机制一般需要以使靶向部分可与靶标(如细胞表面受体)相互作用的方式将靶向剂置于脂质体的表面。可以使用本领域技术人员已知的方法(如分别用长链烷基卤或脂肪酸烷基化或酰化碳水化合物上存在的羟基)在脂质体形成前将本发明的碳水化合物附着于脂质分子。另外，可以按以下方式形成脂质体：在形成膜时首先将连接体部分掺入膜中。该连接体部分必须具有能紧密嵌入并锚定在膜中的亲脂部分。它还必须具有可在脂质体的水性表面有化学活性的反应性部分。选择反应性部分，以使其在化学上适合与随后加入的靶向剂或碳水化合物形成稳定的化学键。在一些情况下，可以将靶向剂直接附着于连接体分子，但在多数情况下更适合使用第三个分子作为化学桥，从而将膜中的连接体分子与三维扩张到小泡表面外的靶向剂或碳水化合物连接。

通过本发明方法制备的化合物还可以用作诊断剂。例如，可以使用经标记的化合物在怀疑具有炎症的患者中定位炎症或肿瘤转移的区域。对于该用途，化合物可以使用¹²⁵I、¹⁴C或氚进行标记。

本发明的药物组合物中使用的活性成分为糖基聚乙二醇化的因子IX及其具有参与凝血级联系统的生物特性的衍生物。本发明的脂质体分散体可作为肠胃外制剂用于治疗以低或缺陷型凝血为特征的凝血障碍，如多种类型的血友病。优选肠胃外施用本发明的因子IX组合物(如IV、IM、SC或IP)。取决于受治疾病和给药途径，有效剂量预计将发生可观的变化，但预计活性物质在约0.1到000μg/kg体重的范围内。治疗凝血障碍优选的剂量为每周三次约50到约3000μg/kg。更优选每周三次约500到约2000μg/kg。更优选每周三次约750到约1500μg/kg，并最优选每周三次约1000μg/kg。由于本发明提供具有增强的体内停留时间的因子IX，在施用本发明的组合物时可以任选地降低所述的剂量。(这些剂量是否合适？)

提供以下实施例用于说明本发明的缀合物和方法，而非限制所要求的发明。

实施例

实施例1

制备UDP-GalNAc-6’-CHO

将UDP-GalNAc(200mg，0.30mmole)溶于1mM CuSO₄溶液(20mL)和25mM NaH₂PO₄溶液(pH6.0，20mL)中。接着加入半乳糖氧化酶(240U，240μL)和过氧化氢酶(13000U，130μL)，用充满氧的气球装配反应系统并在室温下搅拌七天。接着过滤(离心管，MWCO 5K)反应混合物，在4℃储存滤液(～40mL)待用。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；R_f＝0.77；茴香醛染色显影)。

实施例2

制备UDP-GaINAc-6’-NH₂

在0℃下向上述UDP-GalNAc-6’-CHO溶液(2mL或～20mg)中加入乙酸铵(15mg，0.194mmole)和NaBH₃CN(1M THF溶液；0.17mL，0.17mmole)并在室温下温育过夜。用含水的G-10柱过滤反应物，并收集产物。将合适的级分冻干并冷冻储存。TLC(二氧化硅；乙醇/水(7/2)；R_f＝0.72；茚三酮染色显影)。

实施例3

制备UDP-GaINAc-6-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1KDa)

将半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1KDa)(58mg，0.045mmole)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接着加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmole)并在70℃将所得的混合物搅拌48小时。在反应混合物中通入氮气泡除去溶剂并通过反相层析(C-18二氧化硅，不连续梯度在10到80％之间，甲醇/水)纯化残留物。收集所需的级分并减压干燥以获得50mg(70％)白色固体。TLC(二氧化硅，丙醇/H₂O/NH₄OH，(30/20/2)，R_f＝0.54)。MS(MALDI)：观察值1485、1529、1618、1706。

实施例4

制备半胱氨酸-PEG₂(2)

4.1合成(1)

在氩氛中向L-半胱氨酸(93.7mg，0.75mmol)的无水甲醇溶液(20mL)中加入氢氧化钾(84.2mg，1.5mmol，粉末)。在室温下将混合物搅拌30分钟，接着分若干部分在2小时中加入分子量20千道尔顿的mPEG-O-甲苯磺酸(Ts；1.0g，0.05mmol)。在室温下将混合物搅拌5天，旋转蒸发进行浓缩。将残留物溶于水(30mL)中，并在室温下搅拌2小时以破坏所有过量的20千道尔顿mPEG-O-甲苯磺酸。用乙酸中和溶液，将pH调整至pH5.0并装入(C-18硅)反相层析柱。用甲醇/水梯度洗脱柱(产物在约70％甲醇处洗脱)，用蒸发光散射监控产物洗脱液，收集适当的级分并溶于水(500mL)中。层析(离子交换，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氢氧化物型，从水到水/乙酸-0.75N的梯度)该溶液并用乙酸将适当级分的pH调低至6.0。在反相柱(C-18硅)上加载该溶液并用上述甲醇/水梯度洗脱。将产物级分合并、浓缩、重溶于水并冻干以得到453mg(44％)白色固体(1)。该化合物的结构数据如下：¹H-NMR(500MHz；D₂O)δ2.83(t，2H，O-C-CH₂-S)，3.05(q，1H，S-CHH-CHN)，3.18(q，1H，(q，1H，S-CHH-CHN)，3.38(s，3H，CH₃O)，3.7(t，OCH₂CH₂O)，3.95(q，1H，CHN)。通过SDS PAGE确认产物纯度。

4.2合成(2)

向1(440mg，22μmol)溶于无水CH₂Cl₂(30mL)的溶液中逐滴加入三乙胺(～0.5mL)直至溶液呈碱性。室温下在1小时中将CH₂Cl₂(20mL)中的20千道尔顿mPEG-O-对硝基苯碳酸酯(660mg，33μmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg，30.8μmol)分若干份加入。在室温下将反应混合物搅拌24小时。旋转蒸发除去溶剂，将残留物溶于水(100mL)中，并用1.0N NaOH将pH调整至9.5。在室温下将碱性溶液搅拌2小时，接着用乙酸中和至pH7.0。然后将溶液装入反相层析(C-18硅)柱。用甲醇/水梯度洗脱柱(产物在约70％甲醇处洗脱)，用蒸发光散射监控产物洗脱液，收集适当的级分并溶于水(500mL)中。层析(离子交换，XK 50 Q，BIG Beads，300mL，氢氧化物型，从水到水/乙酸-0.75N的梯度)该溶液并用乙酸将适当级分的pH调低至6.0。在反相柱(C-18硅)上加载该溶液并用上述甲醇/水梯度洗脱。将产物级分合并、浓缩、重溶于水并冻干以得到575mg(70％)白色固体(2)。该化合物的结构数据如下：¹H-NMR(500MHz；D₂O)δ2.83(t，2H，O-C-CH₂-S)，2.95(t，2H，O-C-CH₂-S)，3.12(q，1HS-CHH-CHN)，3.39(s，3H，CH₃O)，3.71(t，OCH₂CH₂O)。通过SDS PAGE确认产物纯度。

实施例5

制备UDP-GalNAc-6-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1KDa)

将半乳糖氨基-1-磷酸-2-NHCO(CH₂)₂-O-PEG-OMe(1千道尔顿)(58mg，0.045mmole)溶于DMF(6mL)和吡啶(1.2mL)中。接着加入UMP-morpholidate(60mg，0.15mmole)并在70℃将所得的混合物搅拌48小时。在反应混合物中通入氮气泡除去溶剂并通过反相层析(C-18硅，不连续梯度在10到80％之间，甲醇/水)纯化残留物。收集所需的级分并减压干燥以获得50mg(70％)白色固体。TLC(硅，丙醇/H₂O/NH₄OH，(30/20/2)，R_f＝0.54)。MS(MALDI)：观察值1485、1529、1618、1706。

实施例6

糖PEG化CHO细胞中产生的因子IX

本实施例公开制备无唾液酸的因子IX并用CMP-唾液酸-PEG使其唾液酸化。

6.1重组因子IX去唾液酸

在CHO细胞中产生重组形式的凝血因子IX(重组因子IX)。将6000IU重组因子IX溶于总体积12mL的USP水中。用另外6mL USP水将该溶液转移至Centricon Plus20，PL-10离心滤器中。将溶液浓缩至2mL，接着用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl₂、0.05％NaN₃稀释并重浓缩。重复四次稀释/浓缩以将缓冲液有效改变为终体积3.0mL。将2.9mL该溶液(约29mg重组因子IX)转移到小塑料管中并加入530mU α2-3，6，8-神经氨酸酶-琼脂糖缀合物(霍乱弧菌(Vibrip chlerae)，Calbiochem，450μL)。在32℃将反应混合物柔和旋转26.5小时。10000rpm将混合物离心2分钟并收集上清液。用0.5mL 50mM Tris-HCl pH7.12、1M NaCl、0.05％NaN₃洗涤(含有神经氨酸酶的)琼脂糖珠6次。10000rpm下将混合的洗涤液和上清液再次离心2分钟以除去所有残留的琼脂糖树脂。用同样的缓冲液将混合的去唾液酸蛋白质溶液稀释到19mL，并在Centricon Plus 20，PL-10离心滤器中浓缩到～2mL。将该溶液用15mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN₃稀释两倍并浓缩到2mL。用Tris缓冲液将最终的去唾液酸化重组因子IX溶液稀释到3mL终体积(～10mg/mL)。用IEF-电泳分析天然和去唾液酸化的重组因子IX样品。先用10μLTris缓冲液稀释1.5μL(15μg)样品再与12μL上样缓冲液混合进行等电聚焦电泳(pH3-7)。使用标准程序上样、跑胶和固定。凝胶用Colloidal Blue Stain染色(图154)，显示去唾液酸化因子IX的条带。

实施例7

制备PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX

将去唾液酸化的重组因子IX(29mg，3mL)分成两份1.5mL(14.5mg)样品置于两个15mL离心管中。用12.67mL 50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN₃稀释每一溶液并加入CMP-SA-PEG-1k或10k(7.25μmol)。将管轻轻颠倒混匀并加入2.9U ST3Gal3(326μL)(总体积14.5mL)。再次将管颠倒并在32℃轻柔旋转65小时。在-20℃冷冻终止反应。用SDS-PAGE分析10μg反应样品。在使用Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液pH7.1(Gibco)，6mL/分钟的Toso HaasBiosep G3000SW(21.5×30cm，13μm)HPLC柱上纯化PEG化的蛋白质。用SDS Page和IEF凝胶监控反应和纯化。用2μL 50mM Tris-HClpH 7.4、150mM NaCl、0.05％NaN₃缓冲液稀释10μL(10μg)样品后与12μL上样缓冲液和1μL 0.5M DTT混合并在85℃加热6分钟，然后上样至Novex Tris-Glycine 4-20％ 1mm凝胶。凝胶用ColloidalBlue Stain染色(图155)，显示PEG(1kDa和10kDa)-SA-因子IX条带。

实施例8

直接唾液酸-糖基PEG化因子IX

本实施例公开不预先用唾液酸酶处理制备唾液酸-PEG化因子IX。

8.1用CMP-SA-PEG-(10KDa)唾液酸-PEG化因子IX

将在CHO细胞中表达并完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶于5mL 20mM组氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN₃和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接着将CMP-SA-PEG-(10KDa)(27mg，2.5μmol)溶于该溶液并加入1U ST3Gal3。在32℃轻柔混合28小时完成反应。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反应物。用磷酸缓冲盐溶液pH7.0(PBS)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上纯化产物蛋白质，1mL/分钟，R_t＝9.5分钟。

实施例9

用CMP-SA-PEG-(20KDa)唾液酸-PEG化因子IX

将在CHO细胞中表达并完全唾液酸化的因子IX(1100 IU)溶于5mL 20mM组氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN₃和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0。接着将CMP-SA-PEG-(20KDa)(50mg，2.3μmol)溶于该溶液并加入CST-II。反应混合物在32℃轻柔混合42小时后结束。如Invitrogen所述用SDS-PAGE分析反应物。

用磷酸缓冲盐溶液pH7.0(Fisher)在Amersham Superdex 200(10×300mm，13μm)HPLC柱上纯化产物蛋白质，1mL/分钟，R_t＝8.6分钟。

实施例10

糖基PEG化因子IX的唾液酸加帽

本实施例公开唾液酸-糖基PEG化肽的唾液酸加帽程序。此处因子IX为示范的肽。

10.1因子IX-SA-PEG(10kDa)的N-连接和O-连接聚糖的唾液酸加帽

在Centricon^Plus 20 PL-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)离心滤器中浓缩纯化的重组因子IX-PEG(10kDa)(2.4mg)，并将缓冲液更换为50mM Tris-HCl pH7.2、0.15M NaCl、0.05％NaN₃至终体积1.85mL。用372μL同一Tris缓冲液稀释蛋白质溶液并加入7.4mg固体CMP-SA(12μmol)。轻轻颠倒溶液混匀并加入0.1U ST3Gal 1和0.1U ST3Gal 3。在32℃将反应混合物轻柔旋转42小时。

用SDS-PAGE分析10μg反应物样品。使用Novex Tris-Glycine4-12％ 1mm凝胶并如Invitrogen所述用Colloidal Blue染色。简言之，将10μL(10μg)样品与12μL上样缓冲液和1μL 0.5M DTT混合并在85℃加热6分钟(图156，第4道)。

实施例11

糖基聚乙二醇化的因子IX的药代动力学研究

在正常小鼠的PK研究中测试了四种糖基聚乙二醇化的因子IX变体(PEG-9变体)。先前已经在体外通过凝血、内源性凝血酶潜力(ETP)和血栓弹性描记法(TEG)测试建立了四种化合物的活性。活性结果概括于表I。

化合物	凝血活性(％血浆)	ETP(相对比活性)	TEG(相对比活性)
				BeneFIX	45％	1.0	1.0
PEG-9-2K(LS)	27％	0.3	0.2
				PEG-9-2K(HS)	20％	0.2	0.1
PEG-9-10K	11％	0.6	0.3
				PEG-9-30K	14％	0.9	0.4

为评估四种PEG-9化合物在循环中的活性延长，设计并进行了PK研究。使用非血友病小鼠，每个时间点2只动物，每只动物3个样品。采样时间点为施用化合物后0、0.08、0.17、0.33、1、3、5、8、16、24、30、48、64、72和96小时。离心血样并保存为两份等分试样；一份用于凝血分析，一份用于ELISA。由于材料的限制，以不同剂量进行PEG-9给药：BeneFIX 250U/kg；2K(低取代：“LS”(每个肽分子1-2个PEG取代)200U/kg；2K(高取代：“HS”(每个肽分子3-4个PEG取代)200U/kg；10K 100U/kg；30K 100U/kg。所有剂量基于测试的凝血试验单位。

结果概括于图6和表II。

表II

化合物	剂量(U/kg)	Cmax(U/mL)	AUC(h-U/mL)	CL(mL/h/kg)
					BeneFIX	250	0.745	1.34	187
PEG-9-2K(LS)	200	0.953	4.69	42.7
					PEG-9-2K(HS)	200	0.960	9.05	22.1
PEG-9-10K	100	0.350	2.80	35.7
					PEG-9-30K	100	1.40	8.83	11.3

结果证明了所有PEG-9化合物的延长的趋势。不直接比较AUC和Cmax的值。然而，比较了清除率(CL)，并且PEG-9化合物的CL低于BeneFIX，表示在小鼠中较长的存在时间。尽管BeneFIX以最高剂量给药，与BeneFIX相比，PEG-9化合物的最后可检测凝血活性的时间增长了。

实施例12

制备LS和HS糖基PEG化因子IX

通过ST3Gal-III催化的交换反应从天然因子IX制备低PEG取代程度的糖基PEG化因子IX。在10mM组氨酸、260mM甘氨酸、1％蔗糖和0.02％吐温80，pH7.2的缓冲液中进行反应。对于使用CMPSA-PEG(2kD和10kD)的PEG化，在32℃下将因子IX(0.5mg/mL)与ST3Gal III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小时。对于使用CMP-SA-PEG 30kD的PEG化，因子IX的浓度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的浓度降低到0.17mM。在这些条件下，超过90％的因子IX分子被至少1个PEG部分取代。

通过酶促去唾液酸化从天然因子IX制备高度PEG取代的糖基PEG化因子IX。用PD10柱将因子IX肽缓冲液更换至50mM mES，pH6.0，将浓度调整至0.66mg/mL并在32℃下用AUS唾液酸酶(5mU/mL)处理16小时。用SDS-PAGE、HPLC和MALDI聚糖分析证实去唾液酸化。在QSepharose FF柱上纯化无唾液酸的因子IX以去除唾液酸酶。用Ultra15浓缩器浓缩CaCl₂级分，并用PD10柱将缓冲液更换为MES，pH6.0。

通过在32℃下与ST3Gal-III(50mU/mL)和CMP-SA-PEG(0.5mM)孵育16小时进行无唾液酸的因子IX(0.5mg/mL)的2kD和10kD PEG化。对于使用CMPSA-PEG-30kD的PEG化，因子IX的浓度提高到1.0mg/mL，CMP-SA-PEG的浓度降低到0.17mM。PEG化16小时后，通过加入1mMCMP-SA并在32℃继续额外孵育8小时用唾液酸使带有末端半乳糖的聚糖加帽。在这些条件下，超过90％的因子IX分子被至少1个PEG部分取代。在SDS-PAGE中，通过本方法产生的因子IX具有较高的表观分子量。

实施例13

制备O-糖基PEG化因子IX

通过在32℃将肽与GalNAcT-II(25mU/mL)和1mM UDP-GalNAc孵育从头将O-聚糖链引入天然因子IX(1mg/mL)中。孵育4小时后，通过加入CMPSA-PEG(0.5mM的2Kd或10Kd或0.17mM的30kD)和ST6GalNAc-I(25mU/mL)起始PEG化反应并额外孵育20小时。

应该理解本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，其多种修饰或改变将暗示给本领域技术人员，并包括于本申请的精神和范围以及附带的权利要求书的范围内。本文所引用的所有出版物、专利和专利申请在所有目的中以其整体引入作为参考文献。

Claims (33)

1.含有至少一个具有以下通式的部分的因子IX肽：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基；

R¹为含有选自直链或分支聚乙二醇残基的成员的部分；且

L为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头，

从而当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

2.根据权利要求1的因子IX肽，其中L-R¹具有下式：

其中

a为从0到20的整数。

3.根据权利要求1的因子IX肽，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e和f为独立选自1到2500的整数；且

q为从0到20的整数。

4.根据权利要求1的因子IX肽，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e、f和f’为独立选自1到2500的整数；且

q和q’为独立选自1到20的整数。

5.根据权利要求1的因子IX肽，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e、f和f’为独立选自1到2500的整数；且

q、q’和q”为独立选自1到20的整数。

6.根据权利要求1的因子IX肽，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e和f为独立选自1到2500的整数。

7.根据权利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式：

8.根据权利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式：

9.根据权利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式：

其中

AA为所述肽的氨基酸残基。

10.根据权利要求9的因子IX肽，其中所述氨基酸残基选自丝氨酸或苏氨酸。

11.根据权利要求1的因子IX肽，其中所述肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

12.根据权利要求11的因子IX肽，其中所述氨基酸残基为SEQ.ID.NO：1位置61处的丝氨酸。

13.根据权利要求1的因子IX肽，其中所述部分具有下式：

其中

a、b、c、d、i、r、s、t和u为独立选自0和1的整数；

q为1；

e、f、g和h为独立选自0到6的整数；

j、k、l和m为独立选自0到100的整数；

v、w、x和y独立选自0和1，且v、w、x和y中至少一个为1；

AA为所述因子IX肽的氨基酸残基；

Sia-(R)具有下式：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基；

R¹为含有选自直链或分支聚乙二醇残基的成员的部分；且

L为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头，

从而当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

14.根据权利要求7的因子IX肽，其中所述糖基残基附着于选自Asn157、Asn167及其组合的成员。

15.含有根据权利要求1的因子IX和可药用载体的药物制剂。

16.在哺乳动物中刺激凝血的方法，所述方法包含对所述哺乳动物施用根据权利要求1的所述因子IX肽。

17.在受试者中治疗血友病的方法，所述方法包含对所述受试者施用根据权利要求1的所述因子IX肽。

18.产生含有下面部分的因子IX肽缀合物的方法：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基；

R¹为含有选自直链或分支聚乙二醇残基的成员的部分；且

L为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头，

从而当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

所述方法包括：

(a)在适于转移的条件下，使底物因子IX肽与具有式：

的PEG-唾液酸供体部分以及将所述PEG-唾液酸转移到所述因子IX肽的氨基酸或糖基残基上的酶相接触。

19.根据权利要求18的方法，其中L-R¹具有下式：

其中

a为从0到20的整数。

20.根据权利要求18的方法，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e和f为独立选自1到2500的整数；且

q为从0到20的整数。

21.根据权利要求18的方法，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e、f和f’为独立选自1到2500的整数；且

q和q’为独立选自1到20的整数。

22.根据权利要求18的方法，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e、f和f’为独立选自1到2500的整数；且

q、q’和q”为独立选自1到20的整数。

23.根据权利要求18的方法，其中R¹具有选自下列的结构：

其中

e和f为独立选自1到2500的整数。

24.根据权利要求18的方法，其中所述因子IX肽缀合物含有具有下式的部分：

25.根据权利要求18的方法，其中所述因子IX肽缀合物含有具有式下式的部分：

26.根据权利要求18的方法，其中所述因子IX肽缀合物含有具有下式的部分：

其中

AA为所述因子IX肽的氨基酸残基。

27.根据权利要求26的方法，其中所述氨基酸残基选自丝氨酸或苏氨酸。

28.根据权利要求18的方法，其中所述因子IX底物肽具有SEQ.ID.NO：1的氨基酸序列。

29.根据权利要求28的因子IX肽，其中所述氨基酸残基为SEQ.ID.NO：1位置61处的丝氨酸。

30.根据权利要求18的方法，其中所述因子IX缀合物含有具有通式：

的糖基残基，其中

a、b、c、d、i、r、s、t和u为独立选自0和1的整数；

q为1；

e、f、g和h为独立选自0到6的整数；

j、k、l和m为独立选自0到100的整数；

v、w、x和y独立选自0和1，且v、w、x和y中至少一个为1；

AA为所述因子IX肽的氨基酸残基；

Sia-(R)具有下式：

其中

D选自-OH和R¹-L-HN-；

G选自R¹-L-和-C(O)(C₁-C₆)烃基；

R¹为含有选自直链或分支聚乙二醇残基的成员的部分；且

L为选自键、取代或非取代烃基和取代或非取代杂烃基的接头，

从而当D为OH时，G为R¹-L-，且当G为-C(O)(C₁-C₆)烃基时，D为R¹-L-NH-。

31.根据权利要求30的方法，其中所述糖基残基附着于选自Asn157、Asn167及其组合的成员。

32.权利要求18的方法，所述方法在步骤(a)之前还包含：

(b)在合适的宿主细胞中表达所述底物因子IX肽。

33.权利要求32的方法，其中所述宿主选自昆虫细胞和哺乳动物细胞。

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