ES2357001T3 - Conjugados de almidón hidroxialquilico y de g-csf. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar un conjugado que comprende una proteína y un derivado polimérico, en el que el polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar al menos un grupo A funcional del derivado polimérico con al menos un grupo Z funcional de la proteína y formar de dicha forma un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en el que A se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, en el que el procedimiento comprende además introducir A en el polímero para dar un derivado polimérico haciendo reaccionar el polímero con un al menos compuesto bifuncional, un grupo funcional que se hace reaccionar con el polímero y al menos otro grupo funcional que es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que está químicamente modificado de manera adicional para dar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el que la reacción del derivado polimérico con la proteína es una aminación reductora.
Description
Conjugados de almidón hidroxialquílico y de
G-CSF.
La presente invención se refiere a conjugados de
almidón hidroxialquílico y a una proteína del factor estimulador de
colonias de granulocitos (G-CSF) en la que estos
conjugados se forman mediante un enlace covalente entre el almidón
hidroxialquílico o un derivado del almidón hidroxialquílico y la
proteína. La presente invención se refiere también al procedimiento
para producir estos conjugados y al uso de estos conjugados.
Se acepta generalmente que se puede mejorar la
estabilidad de las proteínas y reducirse la respuesta inmune frente
a estas proteínas cuando estas proteínas se acoplan a moléculas
poliméricas. El documento WO 94/28024 da a conocer que las
proteínas fisiológicamente activas modificadas con el
polietilenglicol (PEG) presentan inmunogenicidad y antigenicidad
reducidas y circulan en el torrente sanguíneo considerablemente más
tiempo que las proteínas no conjugadas, es decir, tienen una
reducida velocidad de aclaramiento.
G-CSF es una glucoproteína de 21
kDa estabilizada mediante dos enlaces disulfuro intracadena que
contienen un único resto carbohidrato unido a O.
G-CSF madura tiene 174 aminoácidos. En el cuerpo
animal, G-CSF se sintetiza en las células
estromales, en macrófagos y en fibroblastos de la médula ósea. Su
función principal es la de ser un factor de crecimiento y de
diferenciación de los neutrófilos y de sus células precursoras. Sin
embargo, se conoce en la materia que G-CSF activa
los neutrófilos maduros. Además, estimula el
crecimiento/diferenciación de otras diversas células progenitoras
hematopoyéticas (en sinergia con factores de crecimiento
hematopoyéticos adicionales) y promueve la proliferación y la
migración de las células endoteliales. Clínicamente,
G-CSF se administra para el tratamiento de las
deficiencias en los niveles de neutrófilos (producidas, por ejemplo,
por la anemia aplásica, la mielodisplasia, el SIDA, o la
quimioterapia).
El documento WO 02/09766 da a conocer, entre
otros, compuestos de proteína-polímero
biocompatibles que se producen mediante conjugación de proteínas
biológicamente activas con un derivado de polímero biocompatible.
Los polímeros biocompatibles usados son polímeros ramificados muy
reactivos, y los conjugados resultantes contienen un enlazante
largo entre el derivado de polímero y la proteína. Como polímeros
biocompatibles, se describen los polímeros de fórmula
(P-OCH_{2}CO-NH-CHR-CO-)_{n}-L-Q_{k}-A,
en la que P y Q son restos poliméricos y k puede ser 1 ó 0. Para P
y Q, se mencionan polietilenglicol, polipropilenglicol,
polioxietileno, politrimetilenglicol, ácido poliláctico y sus
derivados, ácido poliacrílico y sus derivados, poliaminoácido,
alcohol polivinílico, poliuretano, polifosfaceno,
poli(L-lisina) óxido de polialquileno,
poliacrilamida, y polímeros solubles en agua tales como dextrano o
polisacáridos. Como proteínas, se mencionan entre otras,
interferones alfa, beta y gamma, factores de la sangre, citocinas
tales como interleucinas, G-CSF,
GM-CSF. En los ejemplos del documento WO 02/09766
se dan a conocer únicamente derivados de mono, di y
tripolietilenglicol, que se acoplan exclusivamente al interferón y
al factor de crecimiento epidérmico, y a la hormona del crecimiento
humana.
El documento WO 94/01483 da a conocer conjugados
de polímeros biocompatibles que se forman mediante enlace covalente
de un polímero o derivado de polímero biológicamente inactivo con un
polímero hidrófilo sintético farmacéuticamente puro mediante tipos
específicos de enlaces químicos. Como polímeros que se producen
naturalmente y sus derivados, se dan a conocer polisacáridos tales
como ácido hialurónico, proteoglicanos tales como sulfatos A, B y C
de condroitina, heparina, sulfato de heparina, dextranos tales como
ciclodextrano, hidroxietil celulosa, éter de celulosa y almidón,
lípidos tales como triglicéridos y fosfolípidos. Como polímeros
sintéticos, entre otros, se describen polietilenos y sus derivados
que tienen un peso molecular promedio de entre aproximadamente 100
a aproximadamente 100.000. Como proteínas unidas al polímero o
derivado de polímero, se describen citocinas y factores de
crecimiento, entre los que se incluyen interferones, y se dan a
conocer factores de necrosis tumoral, interleucinas, factores
estimuladores de colonias, factores de crecimiento tales como
extracto de factor osteogénico, factor de crecimiento epidérmico,
factor de crecimiento transformante, factor de crecimiento derivado
de plaquetas, factor ácido de crecimiento de fibroblastos y otros.
En todos los ejemplos de trabajo del documento WO 94/01483, se usan
como polímeros derivados de polietilenglicol.
El documento WO 96/11953 da a conocer compuestos
de proteínas modificadas químicamente en el extremo N y los
procedimientos para su producción. Específicamente, se describen
composiciones de G-CSF que son el resultado de
acoplar un polímero soluble en agua en el extremo N de
G-CSF. En el contexto del documento WO 96/11953, se
dan a conocer interferones consenso acoplados en el extremo N a
polímeros solubles en agua. Aunque se relaciona una amplia variedad
de polímeros hídricos en el documento WO 96/11953 (por ejemplo,
copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa,
dextrano, alcohol polivinílico, polivinil pirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como
copolímeros aleatorios), poli(n-vinil
pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de
polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de
etileno o polioles polioxietilados), se describen solo composiciones
de G-CSF PEGilado o composiciones de IFN consenso
en los ejemplos del documento WO 96/11953.
El documento US 6.555.660 B2 da a conocer
conjugados de polipéptidos que comprenden un polipéptido que
presenta actividad G-CSF y que tiene una secuencia
de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de
G-CSF humana en al menos un resto de aminoácido
especificado y/o eliminado, en el que el conjugado comprende un
grupo de unión de un resto no polipeptídico, y comprende además al
menos un resto no polipeptídico unido al grupo de unión del
polipéptido. El resto no polipeptídico puede ser un polímero tal
como polietilenglicol o un oligosacárido. En el documento US
6.555.660 B2 se define explícitamente y sin ambigüedad que PEG es de
lejos la molécula de polímero más preferida debido a que tiene unos
pocos grupos reactivos capaces de reticularse en comparación con
polisacáridos tales como dextrano.
El documento WO 97/30148 se refiere a conjugados
de polipéptidos con alergenicidad reducida que comprenden una
molécula portadora polimérica que tiene dos o más moléculas de
polipéptidos acopladas a la anterior. Estos conjugados son
preferiblemente parte de las composiciones usadas en el mercado del
cuidado personal. Dichos conjugados se producen activando una
molécula portadora polimérica, haciendo reaccionar dos o más
moléculas de polipéptidos con la molécula portadora polimérica
activada y bloqueando los grupos residuales activos del conjugado.
Como molécula portadora polimérica, se relaciona una gran variedad
en el documento WO 97/30148, que incluye los mencionados grupos
diferentes de compuestos homopoliméricos de tipo natural o sintético
tales como polioles, poliaminas, ácidos policarboxílicos, y
heteropolímeros que comprenden al menos dos grupos de unión
diferentes. Se proporcionan ejemplos, que comprenden PEG de tipo
estrella, PEG ramificados, alcoholes polivinílicos,
policarboxilatos, polivinilpirrolidonas y
poli-D,L-aminoácidos Entre otros, se
dan a conocer también dextranos tales como carboximetil dextrano,
celulosas tales como hidroxietilcelulosa o hidroxipropilcelulosa,
hidrolizados de quitosán, almidones tales como hidroxietil almidones
o hidroxipropil almidones, glucógeno, agarosa, goma guar, inulina,
pululano, goma xantana, carragenatos, pectina, ácido algínico. Como
polipéptidos, se dan a conocer únicamente de manera explícita
algunas enzimas.
Baldwin, J.E. y col., Tetrahedron, vol. 27
(1981), pp. 1723-1726 describen la modificación
química del dextrano y del hidroxietil almidón para dar polímeros
sustituidos con aldehído que se dejan reaccionar con hemoglobina
para dar hemoglobinas unidas a polímeros. Se muestra que estas son
capaces de unirse a oxígeno, pero los experimentos de perfusión
cardiaca indicaron claramente que las hemoglobinas unidas a
polímeros no fueron adecuadas para el uso como sustitutos de la
sangre.
El documento WO 99/49897 describe conjugados de
hemoglobina formados haciendo reaccionar polisacáridos tales como
dextrano o hidroxietil almidón con grupos amino de la hemoglobina.
Como grupos funcionales de los polisacáridos, se usan grupos
aldehído producidos mediante apertura oxidativa de anillo de
sacáridos. Como agente reductor preferido usado, se da a conocer
borano dimetilamina. Además, el documento WO 99/49897 se limita
exclusivamente a la hemoglobina.
El documento WO 03/074087 se refiere a un
procedimiento para acoplar proteínas a un polisacárido modificado
derivado de almidón. La acción de unión entre la proteína y el
polisacárido, el hidroxialquil almidón, es un enlace covalente que
se forma entre el grupo aldehído terminal o un grupo funcional
resultante de una modificación química de dicho grupo aldehído
terminal de la molécula de hidroxialquil almidón, y un grupo
funcional de la proteína. Como grupo reactivo de la proteína, se
dan a conocer grupos amino, grupos tio y grupos carboxilo, y no se
mencionan los grupos aldehído de la proteína. Además, aunque se
proporciona una gran variedad de posibilidades de enlaces
diferentes en la forma de muchas listas, que incluyen diferentes
grupos funcionales, moléculas enlazantes diferentes teóricamente
adecuadas, y diferentes procedimientos químicos, los ejemplos de
trabajo describen solo dos alternativas; en primer lugar se usa un
hidroxietil almidón oxidado y se acopla directamente a las
proteínas usando las activación con etildimetilaminopropil
carbodiimida (EDC), o se usa un hidroxietil almidón no oxidado y se
acopla directamente a una proteína formando una base de Schiff que
se reduce posteriormente a la amina respectiva. De esta manera, los
ejemplos de trabajo del documento WO 03/074087 ni dan a conocer un
conjugado individual acoplado mediante un grupo tio o un grupo
carboxilo de la proteína, ni describen un conjugado que comprende
hidroxietil almidón, la proteína, y una o más moléculas enlazantes.
Adicionalmente, se usa una molécula sin G-CSF en
los ejemplos de trabajo.
Por tanto, ha sido un objeto de la presente
invención proporcionar conjugados de hidroxialquil almidón,
preferiblemente hidroxietil almidón, y G-CSF, que
no se habían descrito todavía en la técnica anterior.
Es un objeto adicional de la presente invención
proporcionar procedimientos para producir estos conjugados.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar un conjugado que comprende una proteína
y un derivado polimérico en el que el polímero es un hidroxialquil
almidón (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF), comprendiendo el procedimiento
hacer reaccionar al menos un grupo A funcional del derivado
polimérico con al menos un grupo Z funcional de la proteína y formar
por tanto un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en
el que A se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal.
- -
- en el que el procedimiento comprende además introducir A en el polímero para dar un derivado polimérico
- -
- haciendo reaccionar el polímero con al menos un compuesto bifuncional, un grupo funcional, el cual reacciona con el polímero y al menos otro grupo funcional adicional el cual es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo funcional que está modificado químicamente de manera adicional para dar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el que la reacción del derivado polimérico con la proteína es una aminación reductora.
\newpage
De acuerdo con esto, la presente invención se
refiere también a un conjugado que es obtenible mediante un
procedimiento que se describe anteriormente.
Se puede producir el G-CSF
mediante procedimientos de síntesis química o puede proceder de
cualquier fuente humana (véanse, por ejemplo. Burgess, A.W. y col.
1977, Stimulation by human placental conditioned medium of
hemopoietic colony formation by human marrow cells, Blood 49 (1977),
573-583; Shah, RG. Y col. 1977, Characterization of
colony-stimulating activity produced by
humanmonocytes and phytohemagglutinin-stimulated
lymphocytes, Blood 50 (1977), 811) u otra animal y se puede obtener
mediante purificación de fuentes que se producen naturalmente
similares a la placenta humana, sangre humana u orina humana.
Adicionalmente, una elevada cantidad de carcinomas epiteliales,
células de leucemia mieloide aguda, y varias líneas de células
tumorales (carcinomas de vejiga, meduloblastomas), son capaces de
expresar este factor.
Además, la expresión de G-CSF
abarca también una variante de G-CSF en la que uno o
más aminoácidos (por ejemplo, 1 a 25, preferiblemente 1 a 10, más
preferiblemente 1 a 5, lo más preferido 1 ó 2) se han intercambiado
por otro aminoácido y que presenta actividad G-CSF
(véanse por ejemplo, Riedhaar-Olson, J.F. y col.
1996, Identification of residues critical to the activity of human
granulocyte colony stimulating factor, Biochemistry 35:
9034-9041 1996; Patentes de los Estados Unidos
N^{os}. 5.581.476; 5.214.132; 5.362.853; 4.904.584). Se ha
descrito en la técnica la medida de la actividad de
G-SCF (para la medida de la actividad de
G-SCF in vitro véase por ejemplo Shirafuji,
N. y col.1989, A new bioassay for human granulocyte
colony-stimulating factor (hG-CSF)
using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets
and estimation of its levels in sera from normal healthy persons
and patients with infectious and hematological disorders, Exp.
Hematol. 1989, 17, 116-119; para la medida de la
actividad de G-CSF in vivo véase por ejemplo
Tanaka, H. y col. 1991, Pharmacokinetics of recombinant human
granulocyte colonystimulating factor conjugated to polyethylene
glycol in rats, Cancer Research 51,
3710-3714,1991). Publicaciones adicionales donde se
muestran ensayos para la medida de la actividad de
G-CSF son la Patente de los Estados Unidos Nº
6.555.660; Nohynek, G.J. y col. 1997, Comparison of the potency of
glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte
colony-stimulating factors in neutropenic and non
neutropenic CD rats, Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39;
259-266.
Preferiblemente, el G-SCF se
produce de forma recombinante. Esta incluye la expresión en
huéspedes procariotas o eucariotas de secuencias de ADN exógeno
obtenidas mediante genómica o clonación de ADNc o mediante síntesis
de ADN. Los huéspedes procariotas adecuados incluyen diversas
bacterias tales como E. coli. Los huéspedes eucariotas
adecuados incluyen levaduras tales como S. cerevisiae y
células de mamíferos tales como células de ovario de hámster chino
y células de monos.
Se conoce en la técnica la producción
recombinante de una proteína. En general, esta incluye la
transfección de células huésped con un vector de expresión
apropiado, el cultivo de células huésped en condiciones que
permitan la producción de la proteína y la purificación de la
proteína de las células huésped. Para información detallada véanse
por ejemplo Souza, L.M. y col. 1986, Recombinant human granulocyte
colony-stimulating factor: effects on normal and
leukemic myeloid cells, Science 1986 232: 61-65,
1986; Nagata, S. y col. 1986, Molecular cloning and expression of
cDNA for human granulocyte colonystimulating factor, Nature 319:
415-418, 1986; Komatsu, Y. y col. 1987, Cloning of
granulocyte colony-stimulating factor cDNA from
human macrophages and its expression in Escherichia coli,
Jpn J Cancer Res. 1987 78(11): 1179-1181.
En una forma de realización preferida, el
G-CSF tiene la secuencia de aminoácidos del
G-SCF maduro humano (véase por ejemplo; Nagata, S.
y col. 1986, Molecular cloning and expression of cDNA for human
granulocyte colony-stimulating factor, Nature 319:
415-418, 1986 ), y puede contener además una
metionina en su extremo amino, que da como resultado a continuación
una proteína de 175 aminoácidos. Además, en vez de la metionina,
G-CSF puede contener un resto de serina o una
treonina.
El G-CSF usado en los
procedimientos de la presente invención y los conjugados de acuerdo
con la presente invención pueden comprender una cadena secundaria
de carbohidrato unida al G-CSF mediante
glicosilación unida a O en la posición Thr 133, es decir, el
G-CSF está glicosilado (V. Gervais y col., Eur. J.
Biochem. 1997, 247, 386-395). La estructura de la
cadena secundaria de carbohidrato puede ser
NeuNAc(alfa2-3)Gal(beta1-3)[NeuNAc(alfa2-6)]GalNAc
y
(alfa2-3)Gal(beta1-3)GalNAc
(NeuNAc = ácido N-acetilneurámico, GalNAc =
N-acetilgalactosamina).
Se ha sugerido la modificación de
G-CSF y de otros tipos de polipéptidos con el fin de
introducir al menos una cadena adicional de carbohidrato en
comparación con el polipéptido natural (patente de los Estados
Unidos Nº 5.218.092). Dependiendo del hospedador empleado, se puede
glicosilar el producto de expresión de G-CSF con
carbohidratos de mamíferos u otros eucariotas. Normalmente, cuando
se produce G-CSF en células eucariotas, la proteína
se glicosila después de la traducción. Consiguientemente, la cadena
secundaria de carbohidrato se puede haber unido al
G-CSF durante la biosíntesis en mamíferos,
especialmente en células de seres humanos, insectos o
levaduras.
Se usa generalmente G-CSF
recombinante humano (rhG-CSF) para tratar diversas
formas de leucopenia. De esta manera, están disponibles
preparaciones comerciales de rhG-CSF con los nombres
filgrastim (Gran® and Neupogen®), lenograstim (Neutrogin ® y
Granocyte®) and nartograstim (Neu-up®). Gran® y
Neupogen® no están glicosiladas y se producen en células de E.
coli recombinantes. Neutrogin® y Granocyte® están glicosiladas y
se producen en células CHO recombinantes y Neu-up®
no está glicosilada y tiene 5 aminoácidos sustituidos en la región
N terminal del rhG-CSF intacto producido en las
células de E. coli recombinantes.
Como proteína glicosilada, se puede emplear
cualquier G-CSF glicosilado tal como Granocyte®,
como G-CSF no glicosilado, se puede emplear
cualquier G-CSF no glicosilado tal como Neupogen® en
los procedimientos y en los conjugados de acuerdo con la presente
invención.
Además, en la posición -1, G-CSF
puede contener un resto de aminoácido metionina, un resto serina, o
un resto treonina.
En el contexto de la presente invención, el
término "almidón hidroxialquílico" (HAS) se refiere a un
derivado de almidón que se ha sustituido por al menos un grupo
hidroxialquilo. Un almidón hidroxialquílico de la presente
invención tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (I)
en la que se muestra el extremo
reductor de la molécula de almidón en la forma no oxidada y se
muestra la unidad de sacárido terminal en la forma acetal que,
dependiendo por ejemplo, del disolvente, puede estar en equilibrio
con la forma
aldehído.
\vskip1.000000\baselineskip
El término hidroxialquil almidón tal como se usa
en la presente invención no está limitado a los compuestos en los
que el resto carbohidrato terminal comprende restos hidroxialquilo
R_{1}, R_{2}, y/o R_{3} tal como se representan, por
brevedad, en la fórmula (I), pero se refiere también a compuestos en
los que al menos un grupo hidroxilo presente de cualquier forma,
tanto en el resto carbohidrato terminal como y/o en la parte
restante de la molécula de almidón, HAS', está sustituido por un
grupo hidroxialquilo R_{1}, R_{2}, o R_{3}.
Son también posibles almidones hidroxialquílicos
que comprenden dos o más grupos hidroxialquilo diferentes.
El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido
en HAS puede contener dos o más grupos hidroxilo. De acuerdo con
una forma de realización preferida, el al menos un grupo
hidroxialquílico comprendido en HAS contiene un grupo
hidroxilo.
La expresión "almidón hidroxialquílico"
incluye también derivados en los el grupo alquilo está mono o
polisustituido. En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo
esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un
grupo arilo. Por tanto, el grupo hidroxilo de un grupo
hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado.
Además, en vez de alquilo, se pueden usar
también grupos alqueno lineales o ramificados sustituidos o no
sustituidos.
Almidón hidroxialquílico es un derivado de éter
de almidón. Además de dichos derivados de éter, se pueden usar
también otros derivados de éter en el contexto de la presente
invención. Por ejemplo, son útiles los derivados que comprenden
grupos hidroxilo esterificados. Estos derivados pueden ser, por
ejemplo, derivados de ácidos mono o dicarboxílicos no sustituidos
con 2-12 átomos de carbono o de sus derivados
sustituidos. Especialmente útiles son los derivados de ácidos
monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de
carbono, especialmente derivados del ácido acético. En este
contexto, se prefieren acetil almidón, butil almidón y propil
almidón.
Por tanto, se prefieren derivados de ácidos
dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de
carbono.
En el caso de derivados de ácidos
dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxilo del ácido
dicarboxílico esté también esterificado. Por tanto, en el contexto
de la presente invención son también adecuados los derivados de
monoalquil ésteres de ácidos dicarboxílicos.
Para los ácidos mono o dicarboxílicos
sustituidos, los grupos sustitutos pueden ser preferiblemente los
mismos que los mencionados anteriormente para los restos alquilo
sustituidos.
Se conocen en la materia las técnicas para la
esterificación del almidón (véase por ejemplo, Klemm D. y col.,
Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998,
Whiley-VCH, Weinheim, Nueva York, especialmente el
capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN
3-527-29489-9).
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, se emplea almidón
hidroxialquílico de acuerdo con la fórmula (I). En la fórmula (I),
el anillo de sacárido descrito explícitamente y el resto denotado
como HAS' representan juntos la molécula de almidón hidroxialquílico
preferida. Las otras estructuras de anillo de sacárido comprendidas
en HAS' pueden ser iguales que o diferentes del anillo de sacárido
descrito explícitamente.
Siempre que estén implicados los restos R_{1},
R_{2} y R_{3} de acuerdo con la fórmula (I), no existen
limitaciones específicas. De acuerdo con una forma de realización
preferida, R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente
hidrógeno o un grupo hidroxialquílico, un grupo hidroxiarilo, un
grupo hidroxiaralquilo, un grupo hidroxialcarilo que tiene de entre
2 a 10 átomos de carbono en el resto alquilo respectivo. Se
prefieren los grupos hidrógeno e hidroxialquilo que tienen de entre
2 a 10. Más preferiblemente, el grupo hidroxialquilo tiene entre 2
y 6 átomos de carbono, más preferiblemente entre 2 y 4 átomos de
carbono, e incluso más preferiblemente entre 2 y 4 átomos de
carbono. "Almidón hidroxialquílico" comprende por tanto
preferiblemente almidón hidroxietílico, almidón hidroxipropílico y
almidón hidroxibutílico, en el que se prefieren particularmente
almidón hidroxietílico y almidón hidroxipropílico y se prefiere más
almidón hidroxietílico.
El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo
puede ser lineal o ramificado y sustituido de forma adecuada.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente en
el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son independientemente hidrógeno o
un grupo hidroxialquílico lineal o ramificado con entre 1 a 6
átomos de carbono.
De esta manera, R_{1}, R_{2} y R_{3}
pueden ser preferiblemente hidroxihexilo, hidroxipentilo,
hidroxibutilo, hidroxipropilo tal como
2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo,
2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como
2-hidroxietilo, hidrógeno y se prefiere
especialmente el grupo 2-hidroxietilo.
Así, la presente invención se refiere también a
un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente en el que R_{1}, R_{2} y R_{3} son
independientemente hidrógeno o un grupo
2-hidroxietilo, una forma de realización en la que
se prefiere que al menos uno de los restos R_{1}, R_{2} y
R_{3} sea 2-hidroxietilo.
Almidón hidroxietílico (HES) es el más preferido
para todas las realizaciones de la presente invención.
Por tanto, la presente invención se refiere al
procedimiento y al conjugado tal como se ha descrito anteriormente,
en el que el polímeros es almidón hidroxietílico y el derivado
polimérico es un derivado de almidón hidroxietílico.
El almidón hidroxietílico (HES) es un derivado
de amilopectina que se produce naturalmente y se degrada mediante
la alfa amilasa en el cuerpo. HES es un derivado sustituido del
polímero de carbohidrato amilopectina, que está presente en el
almidón de maíz a una concentración de hasta un 95% en peso. HES
presenta propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de
sustitución del volumen de la sangre y en una terapia de
hemodilución en el ámbito clínico (Sommermeyer y col., 1987,
Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y
Weidler y col., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,
494-498).
La amilopectina está constituida por restos de
glucosa, en los que están presentes enlaces
alfa-1,4-glucosídicos en la cadena
principal y se encuentran enlaces
alfa-1,6-glucosídicos en los sitios
de ramificación. Las propiedades fisicoquímicas de esta molécula se
determinan principalmente por el tipo de enlaces glucosídicos.
Debido al enlace
alfa-1,4-glucosídico desnudo, se
producen estructuras helicoidales con aproximadamente 6 monómeros
de glucosa por vuelta. Las propiedades fisicoquímicas así como las
propiedades bioquímicas del polímero se pueden modificar mediante
sustitución. Se puede conseguir la introducción de un grupo
hidroxietilo mediante hidroxietilación alcalina. Adaptando las
condiciones de reacción es posible aprovechar la diferente
reactividad del grupo hidroxilo respectivo en el monómero de
glucosa no sustituido con respecto a la hidroxietilación. Debido a
este hecho, la persona experta es capaz de influenciar el modelo de
sustitución en una extensión limitada.
HES se caracteriza principalmente por la
distribución de pesos moleculares y el grado de sustitución. Existen
dos posibilidades para describir el grado de sustitución:
- 1.
- Se puede describir el grado en relación a la porción de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos de glucosa.
- 2.
- Se puede describir el grado de sustitución como la sustitución molar, en la que se describen el número de grupos hidroxietilo por resto de glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención, el
grado de sustitución, denotado como DS, se refiere a la sustitución
molar, tal como se ha descrito anteriormente.
Las soluciones de HES se presentan en forma de
composiciones polidispersas, en las que cada molécula difiere de
otra con respecto al grado de polimerización, el número y el modelo
de sitios de ramificación, y el modelo de sustitución. HES es por
tanto una mezcla de compuestos con diferente peso molecular. Por
consiguiente, se determina una solución HES particular mediante el
peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En
este contexto, se calcula M_{n} como la media aritmética
dependiendo del número de moléculas. Alternativamente, M_{w} (o
MW), el peso promedio, representa una unidad que depende de la masa
del HES.
En el contexto de la presente invención, el
almidón hidroxietílico puede tener preferiblemente un peso molecular
promedio (peso promedio) de entre 1 a 300 kD. El almidón
hidroxietílico puede presentar adicionalmente un grado de
sustitución molar preferido de entre 0,1 a 0,8 y una relación de
sustitución preferida entre C_{2}:C_{6} en el intervalo de entre
2 y 20 con respecto a los grupos hidroxietilo.
El término "peso molecular promedio" tal
como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al
peso tal como se determinó de acuerdo con Sommermeyer y col., 1987,
Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y
Weidler y col., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41,
494-498.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el peso molecular promedio del
almidón hidroxietílico empleado es de 1 a 300 kD, más
preferiblemente de 2 a 200 kD, más preferiblemente de 4 a 130 kD,
más preferiblemente de 4 a 70 kD.
Un ejemplo de HES con un peso molecular promedio
de aproximadamente 130 kD es Voluven® de Fresenius. Voluven® es un
coloide artificial, empleado por ejemplo, para sustitución del
volumen usado en la indicación terapéutica para la terapia y la
profilaxis de la hipovolemia. Las características de Voluven® son un
peso molecular promedio de 130.000 +/- 20.000 D, una sustitución
molar de 0,4 y una relación C2:C6 de aproximadamente 9:1.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a los conjugados tal como se han
descrito anteriormente en el que almidón hidroxietílico es almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de entre 4 a 70
kD.
Los intervalos preferidos del peso molecular
promedio son, por ejemplo, 4 a 70 kD o 10 a 70 kD o 12 a 70 kD o 18
a 70 kD o 50 a 70 kD o 4 a 50 kD o 10 a 50 kD o 12 a 50 kD o 18 a 50
kD o 4 a 18 kD o 10 a 18 kD o 12 a 18 kD o 4 a 12 kD o 10 a 12 kD o
4 a 10 kD.
De acuerdo con las formas de realización
particularmente preferidas de la presente invención, el peso
molecular promedio del almidón hidroxietílico empleado está en el
intervalo de entre más de 4 kD y por debajo de 70 kD, tal como
aproximadamente 10 kD, o en el intervalo de entre 9 a 10 kD o entre
10 a 11 kD o entre 9 a 11 kD, o aproximadamente 12 kD, o en el
intervalo de entre 11 a 12 kD o entre 12 a 13 kD o entre 11 a 13 kD,
o aproximadamente 18 kD, o en el intervalo de entre 17 a 18 kD o
entre 18 a 19 kD o entre 17 a 19 kD, o aproximadamente 50 kD, o en
el intervalo de entre 49 a 50 kD o entre 50 a 51 kD o entre 49 a 51
kD.
Siempre que esté implicado el grado de
sustitución (DS), DS es preferiblemente al menos 0,1, más
preferiblemente al menos 0,2, y más preferiblemente al menos 0,4.
Los intervalos preferidos de DS son de 0,1 a 0,8, más
preferiblemente de 0,2 a 0,8, más preferiblemente de 0,3 a 0,8 e
incluso más preferiblemente de 0,4 a 0,8, aún más preferiblemente
de 0,1 a 0,7, más preferiblemente de 0,2 a 0,7, más preferiblemente
de 0,3 a 0,7 y más preferiblemente de 0,4 a 0,7. Los valores de DS
particularmente preferidos son, por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4,
0,5, 0,6, 0,7 o 0,8, siendo más preferidos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6,
0,7 o 0,8, siendo incluso más preferidos 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o
0,8, siendo incluso aún más preferidos 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 o 0,8 y,
por ejemplo, siendo particularmente preferidos 0,4 y
0,7.
0,7.
Las combinaciones particularmente preferidas de
pesos moleculares del almidón hidroxialquílico, preferiblemente
almidón hidroxietílico, y su grado de sustitución DS son, por
ejemplo, 10 kD y 0,4 o 10 kD y 0,7 o 12 kD y 0,4 o 12 kD y 0,7 o 18
kD y 0,4 o 18 kD y 0,7 o 50 kD y 0,4 o 50 kD y 0,7.
En otra forma de realización preferida de la
presente invención, el almidón hidroxietílico (como el empleado así
como el contenido en los conjugados descritos en el presente
documento) tiene un peso molecular de entre 20 kD a 130 kD (es
decir, 40 kD, 50 kD, 60 kD, 70 kD, 80 kD, 90 kD, 100 kD, 110 kD, 120
kD, 130 kD) preferiblemente un peso molecular promedio de 30 kD a
100 kD, más preferiblemente de 40 a 70 kD, y un grado de sustitución
de 0,4 a 0,8, más preferido de 0,5 a 0,8.
En este contexto, se entiende que el término
"30 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 25 kD a 34 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 26, 27, 28, 29, 31, 32, 33
o 34 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"40 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 35 kD a 44 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43
o 44 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"50 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 45 kD a 54 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 46, 47, 48, 49, 51, 52, 53
o 54 kD.
\newpage
En este contexto, se entiende que el término
"60 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 55 kD a 64 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 56, 57, 58, 59, 61, 62, 63
o 64 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"70 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 65 kD a 74 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 66, 67, 68, 69, 71, 72, 73
o 74 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"80 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 75 kD a 84 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 76, 77, 78, 79, 81, 82, 83
o 84 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"90 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el intervalo
de entre 85 kD a 94 kD, es decir incluyendo también los almidones
que tienen un peso molecular promedio de 86, 87, 88, 89, 91, 92, 93
o 94 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"100 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el
intervalo de entre 95 kD a 104 kD, es decir incluyendo también los
almidones que tienen un peso molecular promedio de 96, 97, 98, 99,
101, 102, 103 o 104 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"110 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el
intervalo de entre 105 kD a 114 kD, es decir incluyendo también los
almidones que tienen un peso molecular promedio de 106, 107, 108,
109, 111, 112, 113 o 114 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"120 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el
intervalo de entre 115 kD a 124 kD, es decir incluyendo también los
almidones que tienen un peso molecular promedio de 116, 117; 418;
119; 121; 122; 123 o 124 kD.
En este contexto, se entiende que el término
"130 kD" se refiere a un peso molecular promedio en el
intervalo de entre 125 kD a 134 kD, es decir incluyendo también los
almidones que tienen un peso molecular promedio de 126, 127, 128,
129, 131, 132, 133 o 134 kD.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende un almidón hidroxietílico (y los
conjugados descritos en el presente documento que comprenden el
almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en el
presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene un
peso molecular promedio de 30 kD y un grado de sustitución de 0,4 o
0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 40 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 50 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 60 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 70 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 80 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 90 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o 0,8.
\newpage
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 100 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o
0,8.
0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 110 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o
0,8.
0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 120 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o
0,8.
0,8.
De acuerdo con esto, la forma de realización
descrita anteriormente comprende también un almidón hidroxietílico
(y los conjugados descritos en el presente documento que comprenden
el almidón hidroxietílico así como los procedimientos descritos en
el presente documento que emplean almidón hidroxietílico) que tiene
un peso molecular promedio de 130 kD y un grado de sustitución de
0,4 o 0,5 o 0,6 o 0,7 o 0,8, preferiblemente 0,6, 0,7 o
0,8.
0,8.
Un ejemplo de HES que tiene un peso molecular
promedio de aproximadamente 130 kD es un HES con un grado de
sustitución de 0,2 a 0,8 tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, o
0,8, preferiblemente de 0,4 a 0,7 tal como 0,4, 0,5, 0,6, o
0,7.
Siempre que esté implicada la relación de
sustitución C_{2}:C_{6}, dicha sustitución está preferiblemente
en el intervalo de entre 2 a 20, más preferiblemente en el intervalo
de entre 2 a 15, e incluso más preferiblemente en el intervalo de
entre 3 a 12.
De acuerdo con una forma de realización
adicional de la presente invención, se pueden emplear también
mezclas de almidones hidroxietílicos que tengan diferentes pesos
moleculares promedio y/o diferentes grados de sustitución y/o
diferentes relaciones de sustitución C_{2}:C_{6}. Por tanto, se
pueden emplear mezclas de almidones hidroxietílicos que tengan
diferentes pesos moleculares promedio y diferentes grados de
sustitución y diferentes relaciones de sustitución C_{2}:C_{6},
o que tengan diferentes pesos moleculares promedio y diferentes
grados de sustitución y la misma relación de sustitución
C_{2}:C_{6}, o que tengan diferentes pesos moleculares promedio
y los mismos grados de sustitución y diferentes relaciones de
sustitución C_{2}:C_{6}, o que tengan los mismos pesos
moleculares promedio y diferentes grados de sustitución y diferentes
relaciones de sustitución C_{2}:C_{6}, o que tengan diferentes
pesos moleculares promedio y el mismo grado de sustitución y la
misma relación de sustitución C_{2}:C_{6}, o que tengan los
mismos pesos moleculares promedio y diferentes grados de
sustitución y la misma relación de sustitución C_{2}:C_{6}, o
que tengan los mismos pesos moleculares promedio y los mismos
grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución
C_{2}:C_{6}, o que tengan los mismos pesos moleculares promedio
y los mismos grados de sustitución y las mismas relaciones de
sustitución
C_{2}:C_{6}.
C_{2}:C_{6}.
En diferentes conjugados y/o en diferentes
procedimientos de acuerdo con la presente invención, se pueden
emplear diferentes almidones hidroxialquílicos, preferiblemente
diferentes mezclas de almidones hidroxietílicos y/o diferentes
mezclas de almidones hidroxialquílicos, preferiblemente diferentes
mezclas de almidones hidroxietílicos.
La reacción de aminación reductora de acuerdo
con la invención, en la que el polímero o derivado polimérico se
une covalentemente mediante al menos un grupo aldehído o un grupo
ceto o un grupo hemiacetal a al menos un grupo amino de la
proteína, se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de entre
0 a 40ºC, más preferiblemente de entre 0 a 25ºC y de manera
especialmente preferible de entre 4 a 21ºC. El tiempo de reacción
varía preferiblemente de entre 0,5 a 72 h, más preferiblemente de
entre 2 a 48 h y de manera especialmente preferible de entre 4 a 7
h. Como disolvente de la reacción, se prefiere un medio acuoso.
De esta manera, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo a
una temperatura de entre 4 a 21ºC.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo en
un medio acuoso.
De esta manera, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo a
una temperatura de entre 4 a 21ºC en un medio acuoso.
\newpage
El término "medio acuoso", tal como se usa
en el contexto de la presente invención, se refiere a un disolvente
o a una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de
entre al menos 10% en peso, más preferiblemente al menos 20% en
peso, más preferiblemente al menos 30% en peso, más preferiblemente
al menos 40% en peso, más preferiblemente al menos 50% en peso, más
preferiblemente al menos 60% en peso, más preferiblemente al menos
70% en peso, más preferiblemente al menos 80% en peso, incluso más
preferiblemente al menos 90% en peso o hasta 100% en peso,
basándose en el peso de los disolventes implicados. El medio de
reacción preferido es agua.
El valor del pH del medio de reacción está
generalmente en el intervalo de entre 4 a 9 o entre 4 a 8 o entre 4
a 7,3.
De acuerdo con la forma de realización preferida
de la presente invención, el pH al cual se lleva a cabo la reacción
de aminación reductora está por debajo de 7,3, más preferiblemente
más pequeño o igual a 7 y lo más preferible por debajo de 7, es
decir, en el intervalo ácido. Los intervalos preferidos son por
tanto de entre 3 a por debajo de 7, más preferiblemente de entre
3,5 a 6,5, aún más preferiblemente de entre 4 a 6, aún más
preferiblemente de entre 4,5 a 5,5 y de manera especialmente
preferible aproximadamente 5,0, es decir, 4,6 o 4,7 o 4,8 o 4,9 o
5,0 o 5,1 o 5,2 o 5,3 o 5,4. Intervalos preferidos son, entre otros,
3 a 6,9 o 3 a 6,5 o 3 a 6 o 3 a 5,5 o 3 a 5 o 3 a 4,5 o 3 a 4 o 3 a
3,5 o 3,5 a 6,9 o 3,5 a 6,5 o 3,5 a 6 o 3,5 a 5,5 o 3,5 a 5 o 3,5 a
4,5 o 3, 5 a 4 o 4 a 6,9 o 4 a 6,5 o 4 a 6, o 4 a 5,5 o 4 a 5 o 4 a
4,5 o 4,5 a 6,9 o 4,5 a 6,5 o 4,5 a 6 o 4,5 a 5,5 o 4,5 a 5 o 5 a
6,9 o 5 a 6,5 o 5 a 6 o 5 a 5,5 o 5,5 a 6,9 o 5,5 a 6,5 o 5,5 a 6 o
6 a 6,9 o 6 a 6,5 o 6,5 a 6,9.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo a pH
7 o inferior, más preferiblemente a un pH de 6 o inferior.
De esta manera, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo a
una temperatura de entre 4 a 21ºC a un pH de 7 o inferior,
preferiblemente de 6 o inferior.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo en
un medio acuoso a un pH de 7 o inferior, preferiblemente de 6 o
inferior.
De acuerdo con esto, la presente invención se
refiere también a un procedimiento y a un conjugado y al como se ha
descrito anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a
cabo a una temperatura de entre 4 a 21ºC en un medio acuoso a un pH
de 7 o inferior, preferiblemente de 6 o inferior.
La relación molar de derivado
polimérico:proteína usada para la reacción está preferiblemente en
el intervalo de 200.1 a 5:1, más preferiblemente de entre 100:1 a
10:1 y de manera especialmente preferible de entre 75:1 a 20:1.
Se encontró sorprendentemente que era posible,
especialmente a los intervalos de pH preferidos proporcionados
anteriormente, particularmente a un pH por debajo de 7 y mayor o
igual a 4, hacer reaccionar el derivado polimérico
predominantemente con el grupo amino localizado en el extremo N de
la proteína. El término "predominantemente" tal como se usa en
el contexto de la presente invención, se refiere a una forma de
realización en la que al menos un 80%, preferiblemente al menos un
85% de los grupos amino N terminales disponibles se hacen reaccionar
mediante aminación reductora. Es también posible hacer reaccionar
al menos un 90% o al menos un 95% o al menos un 96% o al menos un
97% o al menos un 98% o al menos un 99% de los grupos amino N
terminales disponibles. Aunque no se puede descartar completamente
el acoplamiento con grupos amino diferentes del grupo amino N
terminal, se piensa que el acoplamiento mediante aminación
reductora de acuerdo con la presente invención a un pH por debajo
de 7, preferiblemente por debajo de 6, tiene lugar esencialmente de
manera selectiva en el grupo amino del extremo
N.
N.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la proteína comprende el grupo amino del
extremo N y al menos un grupo amino adicional, dicho conjugado
comprende el polímero que se está acoplando predominantemente con el
grupo amino del extremo N.
De acuerdo con una forma de realización
especialmente preferida, la presente invención se refiere a un
procedimiento de unión del almidón hidroxialquílico funcionalizado
con aldehído o ceto o hemiacetal o un derivado de almidón
hidroxialquílico funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal con
el grupo amino del extremo N de una proteína, comprendiendo dicho
procedimiento someter dicho almidón hidroxialquílico o derivado del
mismo a una reacción de aminación reductora, a un pH de 7 o
inferior, preferiblemente a un pH de 6 o inferior, llevándose a cabo
dicha reacción de aminación reductora preferiblemente en un medio
acuoso.
De acuerdo con la presente invención, se
prefiere el almidón hidroxialquílico funcionalizado con aldehído o
un derivado de almidón hidroxialquílico funcionalizado con
aldehído.
De acuerdo con una forma de realización más
adicional preferida, la presente invención se refiere a un
procedimiento de unión de un almidón hidroxietílico funcionalizado
con aldehído o ceto o hemiacetal o un derivado de almidón
hidroxietílico funcionalizado con aldehído o ceto o hemiacetal de
manera selectiva al grupo amino del extremo N de una proteína,
comprendiendo dicho procedimiento someter dicho almidón
hidroxialquílico o un derivado del mismo a una reacción de
aminación reductora, a un pH de 7 o inferior, preferiblemente a un
pH de 6 o inferior, llevándose a cabo dicha reacción de aminación
reductora preferiblemente en un medio acuoso, siendo el almidón
hidroxietílico empleado almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de aproximada mente 10 kD y un DS de
aproximadamente 0,4 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de 10 kD y un DS de 0,7 o un almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 12 kD y un DS
de 0,4 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular
promedio de 12 kD y un DS de 0,7 o un almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 18 kD y un DS de 0,4 o un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 18
kD y un DS de 0,7 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de 50 kD y un DS de 0,4 o un almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 50 kD y un DS
de 0,7.
La reacción del derivado polimérico y la
proteína entre el grupo aldehído o el grupo ceto o el grupo
hemiacetal y el grupo amino es una aminación reductora en la que se
produce una base de Schiff. Posteriormente después de la reacción,
se puede reducir esta base por al menos un agente reductor para dar
un enlace estable entre el derivado polimérico y la proteína. Es
también posible llevar a cabo la reacción en presencia de al menos
un agente reductor. De acuerdo con una forma de realización
preferida, la reacción de aminación reductora se lleva a cabo en
presencia de al menos un agente reductor.
Los agentes reductores preferidos son
borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos
complejos de borano orgánico tales como complejo de
4-(dimetilamina)piridina borano, complejo de
N-etildiisopropilamina borano, complejo de
N-etilmorfolina borano, complejo de
N-metilmorfolina borano, complejo de
N-fenilmorfolina borano, complejo de lutidina
borano, complejo de trietilamina borano, o complejo de trimetilamina
borano. Particularmente preferido es el cianoborohidruro de
sodio.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo en
presencia de NaCNBH_{3}.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a cabo en
un medio acuoso a un pH de 7 o inferior, preferiblemente de 6 o
inferior, en presencia de un agente reductor, preferiblemente
NaCNBH_{3}.
De acuerdo con esto, la presente invención se
refiere también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha
descrito anteriormente, en el que la aminación reductora se lleva a
cabo a una temperatura de entre 4 a 21ºC en un medio acuoso a un pH
de 7 o inferior, preferiblemente de 6 o inferior, en presencia de un
agente reductor, preferiblemente NaCNBH_{3}.
La relación molar del derivado
polimérico:proteína usada para la reacción está preferiblemente en
el intervalo de entre 200:1 a 10:1, más preferiblemente de entre
100:1 a 10:1 y de manera especialmente preferible de entre 75:1 a
20:1.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento para producir un conjugado, comprendiendo
dicho procedimiento hacer reaccionar un polímero o un derivado
polimérico que comprende un grupo aldehído en un medio acuoso con
un grupo amino de la proteína en presencia de un agente reductor,
siendo preferiblemente dicho agente reductor NaCNBH_{3}.
De acuerdo con la primera forma de realización
preferida de la presente invención, de acuerdo con la cual el
polímero comprende al menos dos grupos aldehído que se introducen en
el polímero mediante una reacción de oxidación de apertura de
anillo, el polímero comprende preferiblemente al menos una
estructura de acuerdo con la fórmula
De acuerdo con esta forma de realización de la
presente invención, se puede emplear cada agente de oxidación o
combinación de agentes de oxidación que sea capaz de oxidar al menos
un anillo de sacárido del polímero para dar un anillo de sacárido
abierto que tiene al menos uno, preferiblemente al menos dos grupos
aldehído. Esta reacción se ilustra por el siguiente esquema de
reacción que muestra un anillo de sacárido del polímero que se
oxida para dar un anillo abierto que tiene dos grupos aldehído:
Los agentes oxidantes adecuados son, entre
otros, periodatos tales como periodatos de metales alcalinos o
mezclas de dos o más de los mismos, prefiriéndose el periodato de
sodio y el periodato de potasio.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que el polímero se somete a una reacción de
oxidación de apertura de anillo usando un periodato para dar un
derivado polimérico que tiene al menos uno, preferiblemente al menos
dos grupos aldehído.
Para esta reacción de oxidación, se puede
emplear el polímero con su extremo reductor tanto en la forma
oxidada como en la no oxidada, prefiriéndose la forma no
oxidada.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que emplea el polímero con su extremo reductor
en la forma no oxidada.
La temperatura de reacción está en un intervalo
preferido de entre 0 a 40ºC, más preferiblemente de entre 0 a 25ºC
y de manera especialmente preferible de entre 0 a 5ºC. El tiempo de
reacción está en un intervalo preferido de entre 1 min a 5 h y de
manera especialmente preferible de entre 10 min a 4 h. Dependiendo
del grado deseado de oxidación, es decir, del número de grupos
aldehído resultantes de la reacción de oxidación, se puede escoger
apropiadamente la relación molar de periodato:polímero.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la reacción de oxidación de apertura de
anillo se lleva a cabo a una temperatura de entre 0 a 5ºC.
La reacción de oxidación del polímero con el
periodato se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso, lo
más preferible en agua.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la reacción de oxidación de apertura de
anillo se lleva a cabo en un medio acuoso. El valor de pH adecuado
de la mezcla de reacción puede ajustarse añadiendo al menos un
tampón adecuado. Entre los tampones preferidos, se pueden mencionar
tampón de acetato de sodio, tampones de fosfato o borato.
El almidón hidroxietílico sometido a dicha
reacción de apertura de anillo es preferiblemente almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 10 kD y un
DS de 0,4 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular
promedio de 10 kD y un DS de 0,7 o un almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 12 kD y un DS de 0,4 o un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 12 kD
y un DS de 0,7 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de 18 kD y un DS de 0,4 o un almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 18 kD y un DS
de 0,7 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular
promedio de 50 kD y un DS de 0,4 o un almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 50 kD y un DS de 0,7.
Se puede purificar el derivado polimérico
resultante de la mezcla de reacción mediante al menos un
procedimiento adecuado. Si es necesario, se puede precipitar el
derivado polimérico antes del aislamiento mediante al menos un
procedimiento adecuado.
Si el derivado polimérico se precipita en primer
lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de
reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes
diferente que el disolvente o la mezcla de disolventes presente en
la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con una
forma de reacción particularmente preferida de la presente
invención en la que un medio acuoso, preferiblemente agua, se usa
como disolvente, se pone en contacto la mezcla de reacción con
2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol,
preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales
de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el
intervalo de entre -20 a +50ºC y de manera especialmente preferible
en el intervalo de entre -20 a 25ºC.
Se puede llevar a cabo el aislamiento del
derivado polimérico mediante un procedimiento adecuado que puede
comprender una o más etapas. De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el derivado polimérico se
separa en primer lugar de la mezcla de reacción o la mezcla de la
mezcla de reacción con, por ejemplo, una mezcla acuosa de
2-propanol, mediante un procedimiento adecuado tal
como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado
polimérico separado se puede someter a un tratamiento adicional tal
como una diálisis de tipo postratamiento, filtración centrífuga o
filtración a presión, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía en fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o
liofilización. De acuerdo con una forma de realización incluso más
preferida, el derivado polimérico separado se dializa en primer
lugar, preferiblemente frente a agua, y a continuación se liofiliza
hasta que el contenido de disolvente del producto de reacción es
suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas
del producto. Se puede llevar a cabo la liofilización a una
temperatura de entre 20 a 35ºC, preferiblemente de entre 20 a
30ºC.
De acuerdo con una forma de realización
preferida, el polímero oxidado resultantes de la reacción de
oxidación se purifica usando al menos un procedimiento adecuado tal
como ultrafiltración y/o diálisis con el fin de, por ejemplo,
eliminar sales indeseables de bajo peso molecular y componentes
poliméricos, ofreciendo por tanto también un medio de controlar el
intervalo de pesos moleculares del polímero oxidado.
Se puede usar directamente el polímero oxidado
para la reacción con la proteína o se recupera adecuadamente en una
primera etapa, por ejemplo, mediante liofilización, y se vuelve a
disolver en agua para la conjugación con la proteína en una segunda
etapa. Como para el acoplamiento de al menos un grupo amino de la
proteína con al menos un grupo aldehído del polímero mediante
aminación reductora, se hace referencia a la anterior divulgación
detallada que se refiere a los parámetros de reacción específicos de
la reacción de aminación reductora tales como el pH o la
temperatura.
De acuerdo con la segunda forma de realización
preferida, se hace reaccionar el polímero con al menos un compuesto
bifuncional que comprende al menos un grupo funcional M capaz de
hacerse reaccionar con el polímero y al menos un grupo funcional Q
que es un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que
se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína mediante
aminación reductora.
Se puede usar directamente el polímero oxidado
para la reacción con la proteína o se recupera adecuadamente en una
primera etapa, por ejemplo, mediante liofilización, y se vuelve a
disolver en agua para la conjugación con la proteína en una segunda
etapa. Como para el acoplamiento de al menos un grupo amino de la
proteína con al menos un grupo aldehído del polímeros mediante
aminación reductora, se hace referencia a la anterior divulgación
detallada que se refiere a los parámetros de reacción específicos de
la reacción de aminación reductora tales como el pH o la
temperatura. De acuerdo con las formas de realización especialmente
preferidas de la presente invención, la aminación reductora se
lleva preferiblemente a cabo a una temperatura de entre 0 a 5ºC tal
como aproximadamente 4ºC a un pH de aproximadamente 4,5 a 5,5 tal
como aproximadamente 5,0 y para un tiempo de reacción de
aproximadamente 20 a 30 h tal como aproximadamente 24 h.
De acuerdo con la segunda forma de realización
preferida, se hace reaccionar el polímero con al menos un compuesto
bifuncional que comprende al menos un grupo funcional M capaz de
hacerse reaccionar con el polímero y al menos un grupo funcional Q
que es un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que
se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína mediante
aminación reductora.
Se prefiere emplear un compuesto que tenga,
aparte del grupo aldehído o grupo ceto o grupo hemiacetal, al menos
un grupo carboxilo o al menos un grupo carboxilo reactivo,
preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo.
Se puede separar el grupo aldehído o el grupo ceto o el grupo
hemiacetal y el grupo carboxilo o el grupo carboxilo reactivo
mediante cualquier separador adecuado. Entre otros, el separador
puede ser un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o cíclico
opcionalmente sustituido. Generalmente, el resto hidrocarburo tiene
entre 1 y 60, preferiblemente entre 1 y 40, más preferiblemente
entre 1 y 20, más preferiblemente entre 2 y 10, más preferiblemente
entre 2 y 6 y de manera especialmente preferible entre 2 y 4 átomos
de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador
comprende generalmente entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8 y
de manera especialmente preferible entre 1 y 4 heteroátomos. El
resto hidrocarburo puede comprender una cadena de alquilo
opcionalmente ramificado o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo
que tiene, por ejemplo, entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un
grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede
ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una forma de
realización incluso más preferida, el resto hidrocarburo es un
resto arilo que tiene 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono.
Lo más preferible, el resto hidrocarburo es el resto benceno. De
acuerdo con esta forma de realización preferida, el grupo carboxilo
y el grupo aldehído se pueden localizar en el anillo de benceno en
la posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la
posición 1,4.
Como grupos carboxilo reactivos se pueden
mencionar, un éster reactivo, isotiocianatos o isocianatos. Los
ésteres reactivos preferidos se derivan de
N-hidroxisuccinimidas tales como
N-hidroxisuccinimida o
sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles
sustituidos adecuados tales como p-nitrofenol,
o,p-dinitrofenol, o,o'-dinitrofenol,
triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o
2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como
2,4,6-trifluorofenol o
2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol,
pentafluorofenol, o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol.
Especialmente preferidas son las
N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente
la N-hidroxisuccinimida y la
sulfo-N-hidroxisuccinimida. Se
pueden emplear todos los alcoholes individualmente o como una
combinación adecuada de dos o más de los mismos. Como éster
reactivo, se prefieren especialmente pentafluorofenil éster y éster
de N-hidroxisuccinimida.
De esta manera, de acuerdo con una forma de
realización preferida, la presente invención se refiere a un
procedimiento y a un conjugado como se ha descrito anteriormente,
en el que el polímero se hace reaccionar con ácido
formilbenzoico.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento y a
un conjugado como se ha descrito anteriormente, en el que el
polímero se hace reaccionar con pentafluorofenil éster del ácido
formilbenzoico.
De acuerdo con otra forma más de realización
preferida, la presente invención se refiere a un procedimiento y a
un conjugado como se ha descrito anteriormente, en el que se hace
reaccionar el polímero con éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido formilbenzoico.
De acuerdo con otra forma más de realización, la
presente invención se refiere a un procedimiento y a un conjugado
como se ha descrito anteriormente, en el que se hace reaccionar el
polímero con ácido
4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.
El almidón hidroxietílico sometido a la reacción
con el compuesto que comprende M, siendo M preferiblemente un grupo
carboxilo o un grupo carboxilo reactivo y siendo Q un grupo aldehído
o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, es más preferiblemente un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 10 kD
y un DS de 0,7. Son también posibles almidones hidroxietílicos que
tienen un peso molecular promedio de 10 kD y un DS de 0,4 o un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 12 kD
y un DS de 0,4 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de 12 kD y un DS de 0,7 o un almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 18 kD y un
DS de 0,4 7 o un almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular
promedio de 18 kD y un DS de 0,7 o un almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 50 kD y un DS de 0,4 o un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 50 kD
y un DS de 0,7. Particularmente preferible, el almidón
hidroxietílico e incluso más preferiblemente el almidón
hidroxietílico se emplea con un extremo reductor en la forma
oxidada.
El derivado polimérico resultante con el grupo
aldehído o el grupo ceto o el grupo hemiacetal se hace reaccionar
posteriormente con un grupo amino de la proteína mediante aminación
reductora. Como para el acoplamiento de al menos un grupo amino de
la proteína con al menos un grupo aldehído o un grupo ceto o un
grupo hemiacetal del polímero mediante aminación reductora, se hace
referencia a la anterior divulgación detallada que se refiere a los
parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación
reductora tales como el pH o la temperatura. De acuerdo con una
forma de realización especialmente preferida de la presente
invención, la reacción con el grupo amino de la proteína se lleva
preferiblemente a cabo a una temperatura de entre 0 a 40ºC, más
preferiblemente de entre 0 a 25ºC y de manera especialmente
preferible de entre 4 a 21ºC El tiempo de reacción varía
preferiblemente de entre 30 min a 72 h, más preferiblemente de
entre 2 a 48 h y de manera especialmente preferible de entre 4 a 17
h. Como disolvente para la reacción, se prefiere un medio acuoso. El
valor del pH del medio de reacción está preferiblemente en
el
intervalo de entre 4 a 9, más preferiblemente de entre 4 a 8 y de manera especialmente preferible de entre 4,5 a 5,5.
intervalo de entre 4 a 9, más preferiblemente de entre 4 a 8 y de manera especialmente preferible de entre 4,5 a 5,5.
De acuerdo con la tercera forma de realización
preferida, se hace reaccionar el polímero en su extremo reductor
opcionalmente oxidado con al menos un compuesto bifuncional que
comprende un grupo amino M y un grupo funcional Q, en el que dicho
grupo amino M se hace reaccionar con el extremo reductor
opcionalmente oxidado y en el que el grupo funcional Q está
modificado químicamente para dar un derivado polimérico
funcionalizado con aldehído que se hace reaccionar con un grupo
amino de la proteína mediante aminación reductora.
Como para el grupo funcional Q, se van se van a
mencionar, entre otros, los siguientes grupos funcionales:
- -
- dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;
- -
- el grupo tio o los grupos hidroxilo;
- -
- hidrazida del ácido alquil sulfónico, hidrazida del ácido aril sulfónico;
- -
- 1,2-dioles;
- -
- 1,2 amino-tioalcoholes;
- -
- azidas;
- -
- 1,2 -aminoalcoholes;
- -
- el grupo amino -NH_{2} o los derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
- -
- el grupo hidroxilamino -O-NH_{2}, o los derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como grupos hidroxialquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxialcarilamino;
- -
- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura -NH-O-;
- -
- restos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, en el que G es O u S, y M es, por ejemplo,
- - -
- -OH o -SH;
- - -
- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo, o un grupo alcariloxilo;
- - -
- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;
- - -
- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;
- - -
- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tal como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad de estructura O-N en la que N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tal como compuestos ariloxilo con un resto de arilo sustituido tal como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;
en el que Q está ausente o es NH o un
heteroátomo tal como S u O;
- -
- -NH-NH_{2}, o -NH-NH-;
- -
- -NO_{2};
- -
- el grupo nitrilo;
- -
- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- -
- el grupo carboxilo;
- -
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- -
- grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato;
- -
- -C=C-H;
- -
- -(C=NH_{2}Cl)-OAlquilo
- -
- grupos -(C=O)-CH_{2}-Hal en los que Hal es C, Br, o I;
- -
- -CH=CH-SO_{2}-;
- -
- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
- -
- el grupo
- -
- el grupo
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el término "grupo funcional
Q" se refiere a un grupo funcional Q que comprende la estructura
química -NH-.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el grupo funcional M es un grupo
que tiene la estructura R'-NH- en la que R es un
hidrógeno o un resto alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo,
arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el resto
cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o
cicloalquilarilo puede unirse directamente al grupo NH o, de acuerdo
con otra forma de realización, puede unirse mediante un puente de
oxígeno al grupo NH. Los restos alquilo, cicloalquilo, arilo,
aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo, o cicloalquilarilo se pueden
sustituir adecuadamente. Como sustituyentes preferidos, se pueden
mencionar halógenos tales como F, Cl o Br. Los restos R'
especialmente preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo,
e incluso más preferidos son los grupos hidrógeno y alquilo y
alcoxilo no sustituidos.
Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se
prefieren los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de carbono. Son
más preferidos los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo,
metoxilo, etoxilo, propoxilo, e isopropoxilo. Se prefieren
especialmente metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se proporciona
preferencia particular a metilo o metoxi.
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, el grupo funcional M tiene la estructura
R'-NH-R''- en el que R'' comprende
preferiblemente la unidad de estructura -NH- y/o la unidad de
estructura -(C=G) en la que G es O u S, y/o la unidad de estructura
-SO_{2}-. Los ejemplos específicos del grupo funcional R''
son
en el que, si G está presente dos
veces, es independientemente O u
S.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha
mencionado anteriormente en el que el grupo funcional M se
selecciona entre el grupo que consiste en
en las que G es O u S y, si está
presente dos veces, independientemente O u S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una forma de realización
particularmente preferida de la presente invención, el grupo
funcional M es un grupo amino -NH_{2}.
El término "grupo amino Q" se refiere a un
grupo funcional Q que comprende la estructura química -NH-.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el grupo funcional Q es un grupo
que tiene la estructura R'-NH- en la que R' es
hidrógeno o un resto alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo,
arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo en el que el resto
cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o
cicloalquilarilo se puede unir directamente al grupo NH o, de
acuerdo con otra forma de realización, se puede unir mediante un
puente de oxígeno al grupo NH. Los restos alquilo, cicloalquilo,
arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo se
pueden sustituir adecuadamente. Como sustituyentes preferidos, se
pueden mencionar halógenos tales como F, Cl o Br. Los restos R'
especialmente preferidos son grupos hidrógeno, alquilo y alcoxilo,
e incluso más preferidos son hidrógeno y los grupos alquilo y
alcoxilo no sustituidos.
Entre los grupos alquilo y alcoxilo, se
prefieren grupos con 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de C. Más preferidos
son los grupos metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxilo,
etoxilo, propoxilo, e isopropoxilo. Especialmente preferidos son
metilo, etilo, metoxilo, etoxilo, y se proporciona particular
preferencia a metilo o metoxilo.
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, el grupo funcional Q tiene la estructura
R'-NH-R''- en la que R'' comprende
preferiblemente la unidad de estructura -NH- y/o la unidad de
estructura -(C=G)- en la que G es O u S, y/o la unidad de
estructura -SO_{2}-. De acuerdo con las formas más preferidas, el
grupo funcional R'' se selecciona entre el grupo que consiste en
en las que, si G está presente dos
veces, es independientemente O u
S.
\vskip1.000000\baselineskip
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha
mencionado anteriormente en el que el grupo funcional Q se
selecciona entre el grupo que consiste en
en las que G es O u S y, si está
presente dos veces, es independientemente O u S, y R' es
metilo.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una forma de realización
particularmente preferida de la presente invención, el grupo
funcional Q es un grupo amino -NH_{2}.
De acuerdo con una forma más adicional preferida
de la presente invención, M y Q comprenden un grupo amino -NH-. De
acuerdo con una forma de realización particularmente preferida, M y
Q son un grupo amino NH_{2}.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el compuesto que comprende M y
Q es un compuesto homobifuncional, mas preferiblemente un compuesto
homobifuncional que comprende, como grupos funcionales M y Q, lo
más preferible el grupo amino -NH_{2}, o, de acuerdo con otras
formas de realización, el grupo hidroxilamino
-O-NH_{2} o el grupo
siendo G preferiblemente O. Los
ejemplos específicos de estos compuestos que comprenden M y Q
son
El almidón hidroxietílico sometido a la reacción
con el compuesto que comprende M, siendo M preferiblemente un grupo
amino -NH- y siendo más preferiblemente un grupo amino -NH_{2},
comprendiendo aún más preferiblemente M y Q un grupo amino -NH- y
de manera particularmente preferible, comprendiendo M y Q un grupo
amino -NH_{2}, es preferiblemente almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 10 kD y un DS de 0,4 o un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 10 kD
y un DS de 0,7. Son también posibles almidones hidroxietílicos que
tienen tanto un peso molecular de 12 kD y un DS de 0,4 como un
almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 12
KD y un DS de 0,7 como un almidón hidroxietílico que tiene un peso
molecular promedio de 18 kD y un DS de 0,4 como un almidón
hidroxietílico que tiene un peso molecular promedio de 18 kD y un
DS de 0,7 como un almidón hidroxietílico que tiene un peso molecular
promedio de 50 kD y un DS de 0,4 como un almidón hidroxietílico que
tiene un peso molecular promedio de 50 kD y un DS de 0,7.
En ambos casos M y Q son un grupo amino
-NH_{2}, M y Q se pueden separar mediante cualquier separador
adecuado. Entre otros, el separador puede ser un resto hidrocarburo
lineal, ramificado y/o cíclico sustituido. Generalmente, el resto
hidrocarburo tiene entre 1 y 60, preferiblemente entre 1 y 40, más
preferiblemente entre 1 y 20, más preferiblemente entre 2 y 10, más
preferiblemente entre 2 y 6 y de manera especialmente preferible
entre 2 y 40 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el
grupo separador comprende generalmente entre 1 y 20,
preferiblemente entre 1 y 8 y de manera especialmente preferible
entre 1 y 4 heteroátomos. El resto hidrocarburo puede comprender
una cadena de alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un
grupo cicloalquilo que tiene, por ejemplo, entre 5 y 7 átomos de
carbono, o ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo en el que la
parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De
acuerdo con una forma de realización incluso más preferida, el
resto hidrocarburo es una cadena de alquilo de entre 1 y 20,
preferiblemente entre 2 y 10, más preferiblemente entre 2 y 6, y de
manera especialmente preferible entre 2 y 4 átomos de carbono.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que se hace reaccionar el polímero con 1,4
diaminobutano, 1,3-diaminopropano o
1,2-diaminoetano para dar un derivado
polimérico.
La reacción de al menos el compuesto bifuncional
que comprende M y Q con el polímero se lleva a cabo preferiblemente
a una temperatura de entre 0 y 100ºC, más preferiblemente de entre 4
y 80ºC y de manera especialmente preferible de entre 20 y 80ºC; el
tiempo de reacción varía preferiblemente de entre 4 h a 7 d, más
preferiblemente de entre 10 h a 5 d, y de manera especialmente
preferible de entre 17 a 4 h. La relación molar del al menos
compuesto bifuncional: polímero está preferiblemente en el
intervalo de entre 10 a 200, especialmente entre 50 y 100.
Como disolvente de la reacción del al menos
compuesto bifuncional con el polímero, se prefiere al menos un
disolvente aprótico, de manera particularmente preferible un
disolvente aprótico anhidro que tenga un contenido de agua de no
más de un 0,5 por ciento en preso, preferiblemente de no más de un
0,1 por ciento en peso. Los disolventes adecuados son, entre otros,
dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil pirrolidona,
dimetil acetamida (DMA), dimetil formamida (DMF) y las mezclas de
dos o más de los mismos.
Como disolvente de la reacción del al menos
compuesto bifuncional con el polímero, se puede usar también un
medio acuoso.
De acuerdo con una forma de realización
preferida, el derivado polimérico que comprende el polímero y el al
menos compuesto bifuncional está modificado químicamente en el grupo
funcional libre Q para dar un derivado polimérico que comprende un
grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal. De acuerdo con
esta forma de realización, se prefiere hacer reaccionar el derivado
polimérico con al menos uno de al menos un compuesto bifuncional
que comprende un grupo funcional capaz de hacerse reaccionar con el
grupo funcional Q y un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo
hemiacetal.
Como el al menos compuesto bifuncional, es
adecuado que cada compuesto tenga un grupo aldehído o u grupo ceto
o un grupo hemiacetal y al menos un grupo funcional que sea capaz de
formar un enlace con el grupo funcional Q del derivado polimérico.
El al menos un grupo funcional se selecciona entre la misma
combinación de grupos funcionales que Q y se escoge para ser capaz
de hacerse reaccionar con Q. En el caso preferido en que Q es un
grupo amino -NH_{2}, se prefiere emplear un compuesto que tenga,
aparte del grupo aldehído o del grupo ceto o del grupo hemiacetal,
al menos un grupo carboxilo o al menos un grupo carboxilo reactivo,
preferiblemente un grupo carboxilo o un grupo carboxilo reactivo.
El grupo aldehído o el grupo ceto o el grupo hemiacetal y el grupo
carboxilo o el grupo carboxilo reactivo se pueden separar mediante
cualquier separador adecuado. Entre otros, el separador puede ser
un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente
sustituido. Generalmente, el resto hidrocarburo tiene entre 1 y 60,
preferiblemente entre 1 y 40, más preferiblemente entre 1 y 20, más
preferiblemente entre 2 y 10, más preferiblemente entre 2 y 6, y de
manera especialmente preferible entre 2 y 4 átomos de carbono. Si
están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende
generalmente entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8, y de manera
especialmente preferible entre 1 y 4 heteroátomos. El resto
hidrocarburo puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente
ramificada o un grupo alquilo o un grupo cicloalquilo que tiene,
por ejemplo, entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo
aralquilo, un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser
un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una forma de
realización incluso más preferida, el resto hidrocarburo es un resto
arilo que tiene 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono. Lo más
preferible, el resto hidrocarburo es el resto benceno. De acuerdo
con esta forma de realización preferida, el grupo carboxilo y el
grupo aldehído se pueden localizar en el anillo del benceno en la
posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la posición
1,4.
Como grupo carboxilo reactivo, se puede
mencionar un éster reactivo, isotiocianatos o isocianato. Los
ésteres reactivos preferidos se derivan de
N-hidroxisuccinimidas tales como
N-hidroxisuccinimida o
sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles
sustituidos adecuados, tales como p-nitrofenol,
o,p-dinitrofenol, o,o'-dinitrofenol,
triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o
2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como
2,4,6-trifluorofenol o
2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol,
pentafluorofenol, o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol.
Especialmente preferidas son las
N-hidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente
la N-hidroxisuccinimida y la
sulfo-N-hidroxisuccinimida. Se
pueden emplear todos los alcoholes solos o como una combinación
adecuada de dos o más de los mismos. Como ésteres reactivo, se
prefieren especialmente el pentafluorofenil éster y el éster de
N-hidroxisuccinimida.
De esta manera, de acuerdo con una forma de
realización preferida, la presente invención se refiere a un
procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que el derivado polimérico que contiene Q,
siendo Q un grupo amino -NH_{2}, se hace reaccionar
adicionalmente con ácido formilbenzoico.
De acuerdo con otra forma de realización, la
presente invención se refiere a un procedimiento y a un conjugado
tal como se ha descrito anteriormente, en el que el derivado
polimérico que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se hace
reaccionar adicionalmente con pentafluorofenil éster del ácido
formilbenzoico.
De acuerdo con otra forma de realización
adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento y a
un conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el que el
derivado polimérico que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se
hace reaccionar adicionalmente con el éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido fomilbenzoico.
De acuerdo con otra forma de realización
adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento y a
un conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el que el
derivado polimérico que comprende Q, siendo Q un grupo amino, se
hace reaccionar adicionalmente con el ácido
4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Como disolvente de la reacción del derivado
polimérico que comprende un grupo amino y, por ejemplo, ácido
formilbenzoico, se prefiere al menos un disolvente aprótico, de
manera particularmente preferible un disolvente aprótico anhidro
que tenga un contenido de agua de no más de un 0,5 por ciento en
peso, preferiblemente de no más de un 0,1 por ciento en peso. Los
disolventes adecuados son, entre otros, dimetil sulfóxido (DMSO),
N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA),
dimetil formamida (DMF) y las mezclas de dos o más de los
mismos.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a
una temperatura de entre 0 a 40ºC, más preferiblemente de entre 0 a
25ºC y de manera especialmente preferible de entre 15 a 25ºC para un
tiempo de reacción preferible de entre 0,5 a 24 h y de manera
especialmente preferible de entre 1 a 17 h.
De acuerdo con una forma de realización
preferida, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente
activador. Los agentes activadores adecuados son, entre otros,
carbodiimidas tales como diisopropil carbodiimida (DIC),
diciclohexil carbodiimidas (DCC),
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diisopropil
carbodiimida (DIC).
El derivado polimérico resultante se puede
purificar de la mezcla de reacción mediante al menos un
procedimiento adecuado. Si es necesario, se puede precipitar el
derivado polimérico antes del aislamiento mediante al menos un
procedimiento adecuado.
Si se precipita en primer lugar el derivado
polimérico, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de
reacción con al menos un disolventes o mezcla de disolventes
diferente que la del disolvente o la mezcla de disolventes presente
en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con
una forma de realización particularmente preferida de la presente
invención, en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua,
como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con
2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol,
preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales
de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el
intervalo de entre -20 a +50ºC y, de manera especialmente preferible
en el intervalo de entre -20 a 25ºC.
El aislamiento del derivado polimérico se puede
llevar a cabo mediante procedimientos adecuados que pueden
comprender una o más etapas. De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el derivado polimérico se
separa en primer lugar de la mezcla de reacción o de la mezcla de la
mezcla de reacción con, por ejemplo, una mezcla acuosa de
2-propanol, mediante un procedimiento adecuado tal
como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado
polimérico separado se puede someter a tratamiento adicional tal
como diálisis de tipo postratamiento, filtración centrífuga o
filtración a presión, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía en fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o
liofilización. De acuerdo con una forma de realización incluso más
preferida, el derivado polimérico separado se dializa en primer
lugar, preferiblemente frente a agua, y a continuación se liofiliza
hasta que el contenido de disolvente del producto de reacción es
suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas
del producto. Se puede llevar a cabo la liofilización a una
temperatura de entre 20 y 35ºC, preferiblemente de entre 20 y
30ºC.
El derivado polimérico resultante con el grupo
aldehído o el grupo ceto o el grupo hemiacetal se hace reaccionar
posteriormente con un grupo amino de la proteína mediante aminación
reductora. Como para el acoplamiento de al menos un grupo amino de
la proteína con al menos un grupo aldehído o un grupo ceto o un
grupo hemiacetal del polímero mediante aminación reductora, se hace
referencia a la anterior divulgación detallada que se refiere a los
parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación
reductora tales como el pH o la temperatura. De acuerdo con una
forma de realización especialmente preferida de la presente
invención, la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura
de entre 0 a 10ºC tal como entre 1 a 8ºC o entre 2 a 6ºC tal como
aproximadamente 4ºC a un pH de aproximadamente 4,5 a 5,5 tal como
aproximadamente 5,0. El tiempo de reacción es de 10 a 20, tal como
de 12 a 19 o de 14 a 18, tal como 17 h o 20 a 30 h tal como 24
h.
\global\parskip1.000000\baselineskip
De esta manera, de acuerdo con las formas de
realización anteriormente mencionadas preferidas, la presente
invención se refiere también, en el caso de que se hiciera
reaccionar el polímero mediante su extremo reductor oxidado, a un
conjugado de acuerdo con la fórmula
De acuerdo con una forma de realización
especialmente preferida, el polímero es almidón hidroxietílico, es
decir, HAS' es HES', y n = 2, 3, ó 4, lo más preferible 4, tal como
se ha descrito anteriormente. Por tanto, en el caso de que se
hiciera reaccionar el polímero mediante su extremo reductor oxidado,
la presente invención se refiere también a un conjugado de acuerdo
con la fórmula
De acuerdo con otra forma de realización
preferida, la presente invención se refiere también, en el caso de
que se hiciera reaccionar el polímero con su extremo reductor
oxidado, a un conjugado de acuerdo con la fórmula
en la que n = 2, 3, ó 4, siendo
R_{4} independientemente hidrógeno o un grupo metoxilo, y m = 0 en
el caso de que R_{4} sea hidrógeno y m = 1 en el caso de que
R_{4} sea metoxilo, siendo HAS preferiblemente
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
En cada una de las fórmulas anteriores, el
nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína
que se une al derivado polimérico mediante el grupo aldehído.
Con respecto a las formas de realización
anteriormente mencionadas de acuerdo con las cuales los grupos
funcionales M y Q comprenden un grupo amino -NH_{2}, es también
posible que M sea un grupo amino -NH_{2} y Q comprende un grupo
beta hidroxi amino
-CH(OH)-CH_{2}-NH_{2} y
preferiblemente es un grupo beta hidroxi amino.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que el grupo amino Q del compuesto que
comprende dos grupos amino M y Q es un grupo beta hidroxi amino
-CH(OH)-CH_{2}-NH_{2}.
En este caso, M y Q se pueden separar mediante
cualquier separador adecuado. Entre otros, el separador puede ser
un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente
sustituido. Generalmente, el resto hidrocarburo tiene entre 1 y 60,
preferiblemente entre 1 y 40, más preferiblemente entre 1 y 20, más
preferiblemente entre 2 y 10, más preferiblemente entre 1 y 6 y de
manera especialmente preferible entre 1 y 12 átomos de carbono. Si
están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende
generalmente entre 1 y 20, preferiblemente entre 1 y 8 y de manera
especialmente preferible entre 1 y 4 heteroátomos. El resto
hidrocarburo puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente
ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tenga, por
ejemplo, entre 5 y 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo,
un grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo
alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una forma de realización
incluso más preferida, el resto hidrocarburo es una cadena de
alquilo de entre 1 a 20, preferiblemente entre 1 a 10, más
preferiblemente entre 1 a 6, más preferiblemente entre 1 a 4 átomos
de carbono y de manera especialmente preferible entre 1 a 2 átomos
de carbono. Aún más preferiblemente, M y Q están separados por un
grupo metileno.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que el polímero se hace reaccionar con
1,3-diamino-2-hidroxipropano.
En el caso de que se haga reaccionar el polímero
mediante su extremo reductor oxidado, resulta especialmente
preferible un derivado polimérico de acuerdo con la fórmula
con HAS' =
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
La reacción del al menos compuesto bifuncional
que comprende M y Q, de manera particularmente preferible
1,3-diamino-2-hidroxipropano,
con el polímero, se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura
de entre 40 a 120ºC, más preferiblemente de entre 40 a 90ºC y de
manera especialmente preferible de entre 60 a 80ºC. El tiempo de
reacción varía preferiblemente de 17 a 168 h, más preferiblemente
de 17 a 96 h y de manera especialmente preferible de 48 a 96 h. La
relación molar del al menos compuesto bifuncional:polímero está
preferiblemente en el intervalo de entre 200:1 a 10:1,
especialmente de 50:1 a 100:1.
Como disolvente de la reacción del al menos un
compuesto bifuncional con el polímero, se prefiere al menos un
disolvente aprótico, preferiblemente un disolvente aprótico anhidro
que tiene un contenido de agua de no más de un 0,5 por ciento en
peso, preferiblemente de no más de un 0,1 por ciento en peso. Los
disolventes adecuados son, entre otros, dimetil sulfóxido (DMSO),
N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA),
dimetil formamida (DMF) y las mezclas de dos o más de los
mismos.
Se puede hacer reaccionar generalmente el grupo
beta hidroxi amino de Q del derivado polimérico con el al menos
compuesto bifuncional capaz de hacerse reaccionar con Q y que
comprende adicionalmente al menos un grupo funcional capaz de
modificarse para dar un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo
hemiacetal. De acuerdo con otra forma de realización de la presente
invención, el grupo beta hidroxi amino está modificado químicamente
de manera directa para dar un grupo aldehído mediante oxidación
química.
Se puede llevar a cabo esta oxidación con todos
los agentes de oxidación adecuados que son capaces de convertir el
grupo beta hidroxi amino en un grupo aldehído. Los reactivos de
oxidación preferidos son periodatos tales como periodatos de
metales alcalinos. Se prefiere especialmente el periodato de sodio,
que se emplea preferiblemente como solución acuosa. Esta solución
tiene una concentración de yodato preferida de entre 1 a 50 mM más
preferiblemente de entre 1 a 25 mM y de manera especialmente
preferible de entre 1 a 10 mM. Se lleva a cabo la oxidación a una
tempe-
ratura de entre 0 a 40ºC, preferiblemente de entre 0 a 25ºC y de manera especialmente preferible de entre 4 a 20ºC.
ratura de entre 0 a 40ºC, preferiblemente de entre 0 a 25ºC y de manera especialmente preferible de entre 4 a 20ºC.
Se puede purificar el derivado polimérico
resultante de la mezcla de reacción mediante al menos un
procedimiento adecuado. Si es necesario, se puede precipitar el
derivado polimérico antes del aislamiento mediante al menos un
procedimiento adecuado.
Si el derivado polimérico se precipita en primer
lugar, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de
reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes
diferentes del disolvente o la mezcla de disolventes presentes en
la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con una
forma de realización particularmente preferida de la presente
invención en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua,
como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con
2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol,
preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales
de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el
intervalo de entre -20 a +50ºC y de manera especialmente preferible
en el intervalo de entre -20 a 25ºC.
Se puede llevar a cabo el aislamiento del
derivado polimérico mediante cualquier procedimiento adecuado que
puede comprender una o más etapas. De acuerdo con una forma de
realización preferida de la presente invención, el derivado
polimérico se separa en primer lugar de la mezcla de reacción o de
la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo, una mezcla
acuosa de 2-propanol, mediante un procedimiento
adecuado tal como centrifugación o filtración. En una segunda
etapa, se puede someter el derivado polimérico separado a un
tratamiento adicional tal como una diálisis de tipo postratamiento,
filtración centrífuga o filtración a presión, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía en fase inversa, HPLC, MPLC,
filtración en gel y/o liofilización. De acuerdo con una forma de
realización incluso más preferida, se dializa en primer lugar el
derivado polimérico separado, preferiblemente frente a agua, y a
continuación se liofiliza hasta que el contenido de disolvente del
producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las
especificaciones deseadas del producto. Se puede llevar a cabo la
liofilización a una temperatura de entre 20 a 35ºC, preferiblemente
de entre 20 a 30ºC.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento y a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, en el que la oxidación del grupo beta hidroxi amino
de Q se lleva a cabo usando un periodato.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento de producción de un conjugado, en el
que, en el caso de que se empleara el polímero con el extremo
reductor oxidado, se oxida un derivado polimérico que tiene un
grupo beta hidroxi amino, de manera especialmente preferible
y particularmente con HAS' = HES',
preferiblemente con periodato, a un derivado polimérico que tiene un
grupo aldehído, de manera especialmente
preferible
y particularmente con HAS' =
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado polimérico resultante con el grupo
aldehído A se hace reaccionar posteriormente con la proteína. Por
tanto, la presente invención se refiere también a un procedimiento
de producción de un conjugado, comprendiendo dicho procedimiento
hacer reaccionar un derivado polimérico que tiene un grupo beta
hidroxi amino, en el caso de que se empleara el polímero con el
extremo reductor oxidado, de manera especialmente preferible de
acuerdo con la fórmula
y particularmente con HAS' = HES',
con un grupo amino de la
proteína.
\vskip1.000000\baselineskip
El derivado polimérico resultante con el grupo
aldehído se hace reaccionar posteriormente con un grupo amino de la
proteína mediante aminación reductora. Como para el acoplamiento de
al menos un grupo amino de la proteína con al menos un grupo
aldehído del polímero mediante aminación reductora, se hace
referencia a la anterior divulgación detallada.
De esta manera, de acuerdo con la forma de
realización anteriormente mencionada preferida, la presente
invención se refiere también a un conjugado de acuerdo con la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
particularmente con HAS' = HES', en
el caso de que se empleara el polímero con el extremo reductor
oxidado. En la fórmula anterior, el nitrógeno unido a la proteína
deriva del grupo amino de la proteína que se une al derivado
polimérico mediante el grupo
aldehído.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, se hace reaccionar el polímero
en primer lugar con un compuesto adecuado para dar un primer
derivado polimérico que comprende al menos un grupo carboxilo
reactivo. Este primer derivado polimérico se hace reaccionar a
continuación con al menos un compuesto bifuncional adicional en el
que al menos un grupo funcional de este compuesto adicional se hace
reaccionar con al menos un grupo carboxilo reactivo del derivado
polimérico y al menos otro grupo funcional del compuesto adicional
es un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o es un
grupo funcional que está modificado químicamente para dar un grupo
aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el que el
derivado polimérico resultante que comprende dicho grupo aldehído o
grupo ceto o grupo hemiacetal se hace reaccionar mediante aminación
reductora, tal como se ha descrito anteriormente, con al menos un
grupo amino de la proteína. Es también posible alterar la secuencia
para hacer reaccionar los respectivos compuestos entre sí.
De acuerdo con una primera alternativa de dicha
forma de realización adicional, el polímero que comprende al menos
un grupo carboxilo reactivo se prepara oxidando selectivamente el
polímero en su extremo reductor y haciendo reaccionar
posteriormente el polímero oxidado con una lactona
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y/o un ácido
carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
o una sal adecuada del ácido
carboxílico tal como una sal de metal alcalino, preferiblemente tal
como una sal de sodio y/o potasio, y siendo HAS' preferiblemente
HES', con un compuesto adecuado para dar el polímero que comprende
al menos un grupo carboxilo
reactivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede llevar a cabo la oxidación del
polímero, preferiblemente almidón hidroxietílico, de acuerdo con
cada procedimiento o combinación de procedimientos que de cómo
resultado compuestos que tengan las estructuras (IIa) y/o (IIb)
anteriormente mencionadas.
Aunque se puede llevar a cabo la oxidación de
acuerdo con el procedimiento o todos los procedimientos adecuados
que den como resultado el extremo reductor oxidado del almidón
hidroxialquílico, se lleva a cabo preferiblemente usando una
solución de yodo alcalino tal como se describe, por ejemplo, en el
documento DE 196 28 705 A1 (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a
24).
Se puede llevar a cabo la introducción del grupo
carboxilo reactivo en el polímero que se oxida selectivamente en su
extremo reductor mediante todos los procedimientos concebibles y
todos los compuestos adecuados.
De acuerdo con un procedimiento específico de la
presente invención, el polímero que se oxida selectivamente en su
extremo reductor se hace reaccionar en su extremo reductor con al
menos un alcohol, preferiblemente con al menos un alcohol ácido tal
como alcoholes ácidos que tienen un valor de pK_{A} en el
intervalo de entre 6 a 12 o de entre 7 a 11 a 25ºC. El peso
molecular del alcohol ácido puede estar en el intervalo de entre 80
a 500 g/mol, tal como de entre 90 a 300 g/mol o de entre 100 a 200
g/mol.
Los alcoholes ácidos adecuados son todos los
alcoholes H-O-R_{A} que tienen un
protón ácido y son capaces de hacerse reaccionar con el polímero
oxidado para dar el éster polimérico reactivo respectivo,
preferiblemente de acuerdo con la fórmula
de manera aún más preferible de
acuerdo con la
fórmula
\newpage
Los alcoholes preferidos son
N-hidroxisuccinimidas tales como
N-hidroxisuccinimida o
sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles
sustituidos adecuados tales como o,p-dinitrofenol,
o,o'-dinitrofenol, triclorofenol tal como
2,4,6-triclorofenol o
2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como
2,4,6-trifluorofenol o
2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol,
pentafluorofenol, o hidroxiazoles tal como hidroxi benzotriazol. Se
prefieren especialmente las N-hidroxisuccinimidas,
prefiriéndose especialmente N-hidroxisuccinimida y
sulfo-N-hidroxisuccinimida. Se
pueden emplear todos los alcoholes solos o como una combinación
adecuada de dos o más de los mismos. En el contexto de la presente
invención, es también posible emplear un compuesto que libere el
alcohol respectivo, por ejemplo, añadiendo diésteres de ácido
carbónico.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente,
en el que el polímero que se oxida selectivamente en su extremo
reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con un
alcohol ácido, preferiblemente con
N-hidroxisuccinimida y/o
sulfo-N-hidroxisuccinimida.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el polímero que se oxida
selectivamente en su extremo reductor se hace reaccionar en el
extremo reductor con al menos un diéster carbónico
R_{B}-O-(C=O)-O-R_{C},
en el que R_{B} y R_{C} pueden ser iguales o diferentes.
Preferiblemente, este procedimiento proporciona polímeros reactivos
de acuerdo con la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que HAS' es preferiblemente
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
Como compuestos diésteres carbónicos adecuados,
se pueden emplear compuestos cuyos componentes alcohólicos son
independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como
N-hidroxisuccinimida o
sulfo-N-hidroxi-succinimida,
fenoles sustituidos adecuados tales como
o,p-dinitrofenol, o,o'-dinitrofenol,
triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o
2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como
2,4,6-trifluorofenol o
2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol,
pentafluorofenol, o hidroxiazoles tal como hidroxi benzotriazol. Se
prefieren especialmente carbonato de
N,N'-disuccinimidilo y carbonato de
Sulfo-N,N'-disuccinimidilo,
prefiriéndose especialmente carbonato de
N,N'-disuccinimidilo.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente,
en el que el polímero que se oxida selectivamente en su extremo
reductor se activa haciendo reaccionar el polímero oxidado con
carbonato de N,N'-disuccinimidilo.
El alcohol se hace reaccionar con el polímero
oxidado o la sal del polímero oxidado con una relación molar de
alcohol ácido:polímero preferiblemente de entre 5:1 a 50:1, más
preferiblemente de entre 8:1 a 20:1, a una temperatura de reacción
preferida de entre 2 a 40ºC, más preferiblemente de entre 10 a 30ºC
y de manera especialmente preferible de entre 15 a 25ºC El tiempo
de reacción está preferiblemente en el intervalo de entre 1 a 10 h,
más preferiblemente de entre 2 a 5 h, más preferiblemente de entre 2
a 4 h y particularmente de entre 2 a 3 h.
El compuesto de diéster carbónico se hace
reaccionar con el polímero oxidado o la sal del polímero oxidado a
una relación molar de compuesto de diéster:polímero generalmente de
entre 1:1 a 3:1, tal como de entre 1:1 a 1,5:1. El tiempo de
reacción está generalmente en el intervalo de entre 0,1 a 12 h,
igualmente de entre 0,2 a 6 h, o de entre 0,5 a 2 h o de entre 0,75
a 1,25 h.
De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, la reacción del polímero oxidado
con el alcohol ácido y/o el diéster carbónico se lleva a cabo en al
menos un disolvente aprótico, tal como en un disolvente aprótico
anhidro que tiene un contenido de agua de no más de un 0,5 por
ciento en peso, preferiblemente de no más de un 0,1 por ciento en
peso. Los disolventes adecuados son, entre otros, dimetil sulfóxido
(DMSO), N-metil pirrolidona, dimetil acetamida
(DMA) dimetil formamida (DMF) y las mezclas de dos o más de los
mismos. Las temperaturas de reacción están preferiblemente en el
intervalo de entre 2 a 40ºC, más preferiblemente de entre 10
a
30ºC.
30ºC.
\newpage
Para hacer reaccionar el polímero oxidado con el
al menos un alcohol ácido, se emplea al menos un agente activador
adicional.
Por tanto, la presente invención también se
refiere al procedimiento que se ha descrito anteriormente, en el
que el polímero que se oxida en su extremo reductor se hace
reaccionar con un alcohol acídico en presencia de un agente
activante adicional para par el polímero de éster reactivo.
De acuerdo con una forma de realización de la
presente invención la reacción del polímero oxidado con el diéster
carbónico y/o el alcohol ácido se lleva a cabo a una actividad
básica baja que se puede determinar añadiendo la mezcla de reacción
a agua con una relación volumétrica del agua a la mezcla de reacción
de 10:1. Antes de la adición, el agua que no comprende
esencialmente tampón, tiene un valor de pH de 7 a 25ºC. Después de
la adición de la mezcla de reacción y midiendo el valor del pH, se
obtiene la actividad básica de la mezcla de reacción, que tiene un
valor de preferiblemente no más de 9,0, más preferiblemente de no
más de 8,0, y de manera especialmente preferible de no más de
7,5.
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, el polímero oxidado se hace reaccionar con
N-hidroxisuccinimida en DMA seco en ausencia de agua
con EDC para proporcionar selectivamente el éster de
N-hidroxisuccinimida polimérico de acuerdo con la
fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo HAS' de manera más
preferible
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, esta reacción no da
subproductos resultantes de las reacciones del EDC con los grupos OH
de HES, y se suprime de manera sorprendente la reacción de
redisposición de la O-acil isourea formada por el
EDC y el polímero oxidado con la N-acil urea
respectiva.
De acuerdo con otra forma de realización
preferida de la presente invención, se hace reaccionar el polímero
oxidado con carbonato de N,N'-disuccinimidilo en DMF
seco en ausencia de agua en ausencia de un agente activador para
dar selectivamente el éster de N-hidroxisuccinimida
polimérico de acuerdo con la fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
siendo HAS' de manera más
preferible
HES'.
\newpage
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, el polímero que se oxida selectivamente en su
extremo reductor se hace reaccionar en su extremo reductor con una
azolida tal como carbonildiimidazol o carbonil dibencimidazol para
dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo. En el caso
del carbonildiimidazol, da como resultado un derivado polimérico
reactivo de imidazolida de acuerdo con la fórmula
siendo HAS' de manera más
preferible
HES'.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con una segunda alternativa de dicha
forma de realización adicional de la presente invención con
respecto a la introducción de al menos un grupo carboxilo reactivo
en el polímero, el grupo carboxilo reactivo se introduce en el
polímero cuyo extremo reductor no se oxida, haciendo reaccionar al
menos un grupo hidroxilo del polímero don un diéster carbónico.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento o a unos conjugados en los que el grupo
carboxilo reactivo se introduce en el polímero cuyo extremo reductor
no se oxida, haciendo reaccionar al menos un grupo hidroxilo del
polímero con al menos un diéster carbónico
R_{B}-O-(C=O)-O-R_{C},
en el que R_{B} y R_{C} pueden ser iguales o diferentes.
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no se oxida,
se hace reaccionar en al menos un grupo hidroxilo con una azolida
tal como carbonildiimidazol,
carbonil-di-(1,2,4-triazol) o
carbonil dibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo
carboxilo reactivo.
Como compuestos diésteres carbónicos adecuados,
se pueden emplear compuestos cuyos componentes alcohólicos son
independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como
N-hidroxisuccinimida o
sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles
sustituidos adecuados tales como p-nitrofenol,
p-dinitrofenol, o,o'-dinitrofenol,
triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o
2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como
2,4,6-trifluorofenol o
2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol,
pentafluorofenol, o hidroxiazoles tal como hidroxi benzotriazol.
Se prefieren especialmente compuestos diésteres
carbónicos simétricos, siendo R_{B} y R_{C} iguales. El
componente alcohólico del diéster carbónico se selecciona
preferiblemente entre el grupo que consiste en
N-hidroxisuccinimida,
N-hidroxisuccinimida sulfonada,
N-hidroxi benzotriazol, y fenoles nitro y halógeno
sustituidos. Entre otros, se prefieren nitrofenol, dinitrofenol,
triclorofenol, trifluorofenol, pentaclorofenol, y pentafluorofenol.
Se prefieren especialmente carbonato de
N,N'-disuccinimidilo y carbonato de
sulfo-N,N'-disuccinimidilo,
prefiriéndose especialmente carbonato de
N,N'-disuccinimidilo.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un derivado de almidón hidroxialquílico, preferiblemente
un derivado de almidón hidroxietílico, en el que al menos un grupo
hidroxilo, preferiblemente al menos dos grupos hidroxilo de dicho
almidón se han hecho reaccionar con un compuesto de diéster
carbónico para dar el éster reactivo respectivo.
De acuerdo con una forma de realización de la
presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor
no está oxidado, con el al menos un compuesto de diéster carbónico
se lleva a cabo a una temperatura de entre 2 a 40ºC, más
preferiblemente de entre 10 a 30ºC y especialmente de entre 15 a
25ºC. Un tiempo de reacción preferido varía de 0,5 a 5 h, más
preferiblemente de 1 a 3 h, y de manera especialmente preferible de
2 a 3 h.
La relación molar de compuesto de diéster
carbónico: polímero depende del grado de sustitución del polímero
con respecto al número de grupos hidroxilo que se hacen reaccionar
con el compuesto de diéster carbónico con respecto al número de
grupos hidroxilo presentes en el polímero sin reaccionar.
De acuerdo con una forma de realización de la
presente invención, la relación molar de compuesto de diéster
carbónico:unidades de anhidroglucosa está en el intervalo de 1:2 a
1:100, más preferiblemente de 1:3 a 1:100 y especialmente
preferiblemente de 1:10 a 1:50, para dar un grado de sustitución en
el intervalo de 0,5 a 0,001, preferiblemente de 0,33 a 0,01 y
especialmente preferiblemente de 0,1 a 0,02.
De acuerdo con una forma de realización de la
presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor
no se oxida, con diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un
disolvente aprótico, de manera particularmente preferible en un
disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua de no más
de un 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más de un 0,1
por ciento en peso. Los disolventes adecuados son, entre otros,
dimetil sulfóxido (DMSO), N-metil pirrolidona,
dimetil acetamida (DMA), dimetil formamida (DMF) y las mezclas de
dos o más de los mismos.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento tal como se ha descrito anteriormente en
el que la reacción de el al menos un grupo hidroxilo del polímero
cuyo extremo reductor no se oxida, con el diéster carbónico para
dar un grupo carboxilo reactivo se lleva a cabo en un disolvente
polar aprótico anhidro, siendo preferiblemente el disolvente
dimetil acetamida, dimetil formamida o una mezcla de los mismos.
El derivado polimérico reactivo que comprende al
menos un grupo carboxilo reactivo, resultante preferiblemente de la
reacción del polímero con el alcohol ácido, el carbonato y/o la
azolida, tal como se ha descrito anteriormente, se hace reaccionar
adicionalmente con un al menos compuesto bifuncional adicional en el
que al menos un grupo F_{1} funcional de este compuesto adicional
se hace reaccionar con al menos un grupo carboxilo reactivo del
derivado polimérico. Como para al menos un grupo F_{1} funcional
del compuesto adicional, no existen limitaciones específicas que
faciliten que sea posible una reacción con el al menos un grupo
carboxilo reactivo del polímero. Los grupos F_{1} funcionales
preferidos son, por ejemplo, un grupo amino o un grupo hidroxilo o
un grupo tio o un grupo carboxilo.
El al menos compuesto bifuncional adicional
comprende al menos otro grupo F_{2} funcional que es un grupo
aldehído o un grupo F_{2} funcional que es capaz de modificarse
químicamente para dar un grupo aldehído. La modificación química
puede ser, por ejemplo, una reacción del grupo F_{2} funcional con
un grupo F_{3} funcional, un compuesto enlazante adicional o una
oxidación o una reducción de un grupo F_{2} funcional
adecuado.
En el caso en el que se hace reaccionar F_{2}
con un grupo F_{3} funcional de un compuesto adicional, el grupo
F_{2} funcional se puede seleccionar de, entre otros,
- -
- dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;
- -
- el grupo tio o el grupo hidroxilo;
- -
- hidrazida del ácido alquil sulfónico, hidrazida del ácido aril sulfónico;
- -
- 1,2-dioles;
- -
- 1,2-aminoalcoholes;
- -
- 1,2 amino-tioalcoholes;
- -
- azidas;
- -
- el grupo amino -NH_{2} o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tales como grupos aminoalquílicos, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
- -
- el grupo hidroxilamino -O-NH_{2}-, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxilalcarilamino;
- -
- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura NH-O-;
- -
- restos que tienen un grupo carbonilo, Q-C(=G)-M en el que G es O u S, y M es, por ejemplo,
- - -
- -OH o -SH;
- - -
- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo, o un grupo alcariloxilo;
- - -
- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;
- - -
- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;
- - -
- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad de estructura O-N en la que N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuestos de ariloxilo con un resto arilo sustituido tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;
en el que Q está ausente o es NH o un
heteroátomo tal como S u O;
- -
- -NH-NH_{2}, o -NH-NH-;
- -
- -NO_{2};
- -
- el grupo nitrilo
- -
- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- -
- el grupo carboxilo;
- -
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- -
- grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato;
- -
- -C=C-H;
- -
- -(C=NH_{2}Cl)-OAlquilo
- -
- Grupos -(C=O)-CH_{2}-Hal en el que Hal es Cl, Br, o I;
- -
- -CH=CH-SO_{2}-;
- -
- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
- -
- el grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- el grupo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que F_{3} es un grupo capaz
de formar un enlace químico con uno de los grupos anteriormente
mencionados y se selecciona preferiblemente entre los grupos
anteriormente mencionados. Además, el segundo compuesto enlazante
tiene preferiblemente al menos un grupo aldehído o un grupo ceto o
un grupo hemiacetal que es capaz de hacerse reaccionar con un grupo
amino de la proteína mediante aminación
reductora.
\vskip1.000000\baselineskip
El grupo F_{1} funcional y el grupo aldehído o
el grupo ceto o el grupo hemiacetal del al menos compuesto de unión
bifuncional que se hace reaccionar con el polímero, y/o los grupos
F_{1} y F_{2} funcionales del al menos compuesto de unión
bifuncional que se hace reaccionar con el polímero, y/o el grupo
F_{3} funcional y el grupo aldehído o el grupo ceto o el grupo
hemiacetal del al menos compuesto de unión bifuncional adicional,
se pueden separar independiente mediante un separador adecuado.
Entre otros, el separador puede ser un resto hidrocarburo lineal,
ramificado y/o cíclico alifático y/o aromático opcionalmente
sustituido. Generalmente, el resto hidrocarburo tiene hasta 60,
preferiblemente hasta 40, más preferiblemente hasta 20, más
preferiblemente hasta 10 átomos de carbono. Si están presentes
heteroátomos, el grupo separador comprende generalmente de 1 a 20,
preferiblemente de 1 a 8, más preferiblemente de 1 y 6, más
preferiblemente de 1 a 4 y de manera especialmente preferible de 1
a 2 heteroátomos. Como heteroátomo, se prefiere O. El resto
hidrocarburo puede comprender una cadena de alquilo opcionalmente
ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene, por
ejemplo, de 5 a 7 átomos de carbono, o ser un grupo aralquilo, un
grupo alcarilo en el que la parte alquilo puede ser un grupo
alquilo lineal y/o
cíclico.
cíclico.
Ejemplos de un compuesto con grupos F_{1} y
F_{2} funcionales son, por ejemplo, diaminoalcano opcionalmente
sustituido que tiene de 2 a 20 átomos de carbono, de manera
especialmente preferible 1,2-diaminoetano,
1,3-diaminopropano, y
1,4-diaminobutano. Ejemplos preferidos de un
compuesto con grupos F_{3} funcionales y un grupo aldehído o un
grupo ceto o un grupo hemiacetal son, por ejemplo, ácido
formilbenzoico, pentafluorofenil éster del ácido
4-formilbenzoico, éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido
4-formilbenzoico y ácido
4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.
Por tanto, la presente invención se refiere
también a un procedimiento de producción a un conjugado,
comprendiendo dicho procedimiento hacer reaccionar el polímero,
preferiblemente almidón hidroxietílico, en su extremo reductor
opcionalmente oxidado con un compuesto, seleccionado entre el grupo
que consiste en alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y azolidas,
para dar un derivado polimérico que comprende al menos un grupo
carboxilo reactivo, haciendo reaccionar dicho derivado polimérico
con al menos un compuesto al menos bifuncional para dar un derivado
polimérico que comprende un grupo aldehído o un grupo ceto o un
grupo hemiacetal o un grupo funcional capaz de modificarse
químicamente para dar un derivado polimérico que comprende un grupo
aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino
de una proteína mediante aminación reductora.
De acuerdo con esto, la presente invención se
refiere también a un conjugado que comprende un polímero,
preferiblemente almidón hidroxietílico, y una proteína unidos
covalentemente entre sí, obtenible mediante un procedimiento de
producción de un conjugado, comprendiendo dicho procedimiento hacer
reaccionar el polímero, en su extremo reductor opcionalmente
oxidado con un compuesto, seleccionado entre el grupo que consiste
en alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y azolidas, para dar un
derivado polimérico que comprende al menos un grupo carboxilo
reactivo, hacer reaccionar dicho derivado polimérico con al menos un
compuesto bifuncional para dar un derivado polimérico que comprende
un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo
funcional capaz de modificarse químicamente para dar un grupo
aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y hacer reaccionar
el derivado polimérico que comprende un grupo aldehído o un grupo
ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína
mediante aminación reductora.
Como un ejemplo específico de un compuesto que
tiene un grupo F_{1} funcional y un grupo F_{2} funcional que
se oxida para dar un grupo aldehído está, por ejemplo, un compuesto
que tiene un grupo amino tal como F_{1} y un grupo beta hidroxi
amino tal como F_{2}. Un ejemplo especialmente preferido es
1,3-diamino-2-hidroxipropano.
Esta oxidación se puede llevar a cabo con todos los agentes de
oxidación adecuados que sean capaces de convertir el grupo beta
hidroxi amino en un grupo aldehído. Los reactivos de oxidación
preferidos son los periodatos tales como los periodatos de metales
alcalinos Se prefiere especialmente el periodato de sodio que se
emplea preferiblemente en solución acuosa. Esta solución tiene una
concentración de yodato preferida de entre 1 a 50 mM, más
preferiblemente de entre 1 a 25 mM, y de manera especialmente
preferible de entre 1 a 10 mM. La oxidación se lleva a cabo a una
temperatura de entre 0 a 40ºC, preferiblemente de entre 0 a 25ºC, y
de manera especialmente preferible de entre 4 a
20ºC.
20ºC.
Se puede purificar el derivado polimérico
resultante de la mezcla de reacción mediante al menos un
procedimiento adecuado. Si es necesario, se puede precipitar el
derivado polimérico antes del aislamiento mediante al menos un
procedimiento adecuado.
Si se precipita en primer lugar el derivado
polimérico, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de
reacción con al menos un disolvente o mezcla de disolventes
diferentes del disolvente o de la mezcla de disolventes presentes
en la mezcla de reacción a temperaturas adecuadas. De acuerdo con
una forma de reacción particularmente preferida de la presente
invención en la que se usa un medio acuoso, preferiblemente agua,
como disolvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con
2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol
preferiblemente una mezcla 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales
de dichos compuestos, a una temperatura, preferiblemente en el
intervalo de entre -20 a +50ºC y de manera especialmente preferible
en el intervalo de entre -20 a 25ºC.
El aislamiento del derivado polimérico se lleva
a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado que puede
comprender una o más etapas De acuerdo con una forma de realización
preferida de la presente invención, el derivado polimérico se
separa en primer lugar de la mezcla de reacción o de la mezcla de la
mezcla de reacción con, por ejemplo, una mezcla acuosa de
2-propanol, mediante un procedimiento adecuado tal
como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, se puede
someter el derivado polimérico separado a un tratamiento adicional
tal como diálisis de tipo postratamiento, filtración centrífuga o
filtración a presión, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía en fase inversa, HPLC, MPLC, filtración en gel y/o
liofilización. De acuerdo con una forma de realización incluso más
preferida, el derivado polimérico separado se dializa en primer
lugar, preferiblemente frente a agua, y a continuación se liofiliza
hasta que el contenido de disolvente del producto de reacción es
suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas
del producto. Se puede llevar a cabo la liofilización a una
temperatura de entre 20 a 35ºC, preferiblemente de entre 20 a
30ºC.
\newpage
La presente invención se refiere también a u
conjugado, que comprende una proteína y un polímero o derivado del
mismo, en el que el polímero es almidón hidroxialquílico (HAS) y la
proteína es un factor estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF), que tiene una estructura de acuerdo con la
fórmula
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo,
un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo, o un grupo
hidroxialcarilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono,
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo,
y
en la que L es un resto hidrocarburo lineal,
ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende
opcionalmente al menos un heteroátomo, que tiene de 1 a 60,
preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más
preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 6, más
preferiblemente de 1 a 2 átomos de carbono, y de manera
especialmente preferible 1 átomo de carbono, siendo L en particular
CH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La abreviatura "Proteína'" tal como se usa
en la fórmula anterior se refiere a la molécula de
G-CSF usada para la reacción sin el átomo de
nitrógeno del grupo amino que es parte del enlace aminometilo.
La presente invención se refiere también a un
conjugado, que comprende una proteína y un polímero o un derivado
del mismos, en el que el polímero es un almidón hidroxialquílico
(HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonias de
granulocitos (G-CSF), que tiene una estructura de
acuerdo con la fórmula
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo,
un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo
hidroxialcarilo que tiene de entre 1 a 10 átomos de carbono,
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo,
y
en la que L_{1} y L_{2} son
independientemente un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o
cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente un
heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo, aralquil
heteroalquilo, y/o heteroaralquilo, teniendo dicho resto de 1 a 60,
preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20 más
preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono, y
en la que D es un enlace, preferiblemente un
enlace covalente que se formó mediante un grupo F_{2} funcional
adecuado unido a L_{1} y un grupo F_{3} funcional adecuado unido
a L_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
La abreviatura "Proteína'" tal como se usa
en las fórmulas anteriores se refiere a la molécula de
G-CSF usada para la reacción sin el átomo de
nitrógeno del grupo amino que es parte del enlace aminometilo.
La presente invención se refiere también a un
conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el que L_{1}
es -(CH_{2})n con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4, y de
manera especialmente preferible 4.
La presente invención se refiere también a un
conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el que L_{2}
comprende un resto arilo opcionalmente sustituido, preferiblemente
un resto arilo que contiene 6 átomos de carbono, siendo L_{2} de
manera especialmente preferible C_{6}H_{4}, o en el que L_{2}
es -(CH_{2})n con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4.
La presente invención se refiere también a un
conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el que se
selecciona del grupo que consiste en
- -
- dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;
- -
- el grupo tio o el grupo hidroxilo;
- -
- hidrazida del ácido alquil sulfónico, hidrazida del ácido aril sulfónico;
- -
- 1,2-dioles;
- -
- 1,2-aminoalcoholes;
- -
- 1,2 amino-tioalcoholes;
- -
- azidas;
- -
- el grupo amino -NH_{2} o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tales como grupos aminoalquílicos, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
- -
- el grupo hidroxilamino -O-NH_{2}-, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxilalcarilamino;
- -
- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura NH-O-;
- -
- restos que tienen un grupo carbonilo, Q-C(=G)-M en el que G es O u S, y M es, por ejemplo,
- - -
- -OH o -SH;
- - -
- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo, o un grupo alcariloxilo;
- - -
- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;
- - -
- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;
- - -
- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad de estructura O-N en la que N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuestos de ariloxilo con un resto arilo sustituido tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;
en el que Q está ausente o es NH o un
heteroátomo tal como S u O;
- -
- -NH-NH_{2}, o -NH-NH-;
- -
- -NO_{2};
- -
- el grupo nitrilo
- -
- grupos carboxilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- -
- el grupo carboxilo;
- -
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- -
- grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato;
- -
- -C=C-H;
- -
- -(C=NH_{2}Cl)-OAlquilo
- -
- Grupos -(C=O)-CH_{2}-Hal en el que Hal es Cl, Br, o I;
- -
- -CH=CH-SO_{2}-;
- -
- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
- -
- el grupo
- -
- el grupo
y en la que F_{3} es un grupo
funcional capaz de formar un enlace químico con F_{2} y se
selecciona preferiblemente entre el grupo anteriormente mencionado,
comprendiendo F_{2} preferiblemente el resto -NH-, que comprende
más preferiblemente un grupo amino, comprendiendo F_{3}
preferiblemente el resto -(C=G)-, más preferiblemente -(C=O)-, más
preferiblemente el resto -(C=G)-G-, aún más
preferiblemente -(C=O)-G-, y de manera especialmente
preferible -(C=O)-O, siendo D de manera
particularmente preferible un enlace
amida.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere también a
cualquier conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el
que el almidón hidroxialquílico es almidón hidroxietílico.
La presente invención se refiere también a
cualquier conjugado tal como se ha descrito anteriormente, en el
que el almidón hidroxietílico tiene un peso molecular de entre 2 a
200 kD, preferiblemente de entre 4 a 130 kD, más preferiblemente de
entre 4 a 70 kD.
De acuerdo con un aspecto adicional, la presente
invención se refiere a un conjugado tal como se ha descrito
anteriormente, o a un conjugado, obtenible mediante un procedimiento
tal como se ha descrito anteriormente, para uso en un procedimiento
para el tratamiento del cuerpo humano o animal.
Además, la presente invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente
eficaz de un conjugado tal como se ha descrito anteriormente,
obtenible mediante un procedimiento tal como se ha descrito
anteriormente.
La expresión "en una cantidad terapéuticamente
eficaz" tal como se usa en el contexto de la presente invención
se refiere a la cantidad que proporciona efecto terapéutico para una
dolencia y régimen de administración dados. La administración es
preferiblemente mediante rutas. La ruta específica escogida de la
dolencia que se está tratando. La administración se lleva a cabo
preferiblemente como parte de una formulación que contiene un
vehículo adecuado, tal como polisorbato, un diluyente adecuado, tal
como agua y un potenciador adecuado tal como sorbitol. La
dosificación requerida dependerá de la gravedad de la dolencia que
se está tratando, la respuesta individual de los pacientes, el
procedimiento de administración usado, y similares.
De esta manera, en una forma de realización
preferida, la composición farmacéutica comprende además al menos un
diluyente, potenciador y/o vehículo farmacéuticamente aceptables, de
manera especialmente preferible, útil en la terapia de
G-CSF.
La composición farmacéutica se usa
preferiblemente para el tratamiento de un trastorno caracterizado
por una función hematopoyética o inmune reducida o enfermedades
relacionadas con las anteriores.
Por tanto, la presente invención se refiere
también al uso de una composición farmacéutica tal como se ha
descrito anteriormente, que comprende un conjugado tal como se ha
descrito anteriormente o un conjugado, obtenible mediante un
procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno
caracterizado por una función hematopoyética o inmune reducidas.
De acuerdo con una forma de realización
preferida, el trastorno caracterizado por una función hematopoyética
o inmune reducidas, es un resultado de quimioterapia, terapia de
radiación, enfermedad infecciosa, neutropenia crónica grave, o
leucemia.
Por tanto, la presente invención se refiere
también al uso de una composición farmacéutica tal como se ha
descrito anteriormente, que comprende un conjugado tal como se ha
descrito anteriormente o un conjugado, obtenible mediante un
procedimiento tal como se ha descrito anteriormente, para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno
caracterizado por una función hematopoyética o inmune reducidas, en
el que el trastorno es un resultado de quimioterapia, terapia de
radiación, enfermedad infecciosa, neutropenia crónica grave, o
leucemia.
El objeto del tratamiento con la composición
farmacéutica de acuerdo con la invención se administra
preferiblemente mediante rutas i.v. o s.c. Para esto, se puede
administrar la composición farmacéutica como una solución
estéril.
La invención se ilustra adicionalmente mediante
las siguientes figuras, tablas y ejemplos.
La Figura 1a muestra un análisis SDS page del
conjugado HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.1 (a), Neupogen®. Para la electroforesis
en gel, se emplearon un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, D) y un suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv,
Turnhout, B). Se usaron un gel Bis-Tris al 12%
junto con un tampón de avance MOPS SDS en condiciones de reducción
(ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF (Neupogen®) con HES tal como se describe en el Ejemplo 2.1 (a).
- Banda C:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1b muestra un análisis SDS page del
conjugado HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.1 (a), Granocyte®. Para la electroforesis
en gel, se emplearon un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, D) y un suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv,
Turnhout, B). Se usaron un gel Bis-Tris al 12%
junto con un tampón de avance MOPS SDS en condiciones de reducción
(ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las
instrucciones de los fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF (Granocyte®) con HES tal como se describe en el Ejemplo 2.1 (a).
- Banda C:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1b muestra un análisis SDS page del
conjugado HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.1 (b), G-CSF de Strathmann
Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se emplearon
un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un
suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se
usaron un gel Bis-Tris al 12% junto con un tampón de
avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES10/0,4 en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda C:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES10/0,7 en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda D:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES50/0,4 en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda E:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES50/0,7 en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda F:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 3 muestra un análisis SDS page de los
conjugados HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.2, G-CSF de Strathmann
Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se emplearon
un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un
suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se
usaron un gel Bis-Tris al 12% junto con un tampón de
avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES10/0,7 oxidado en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda C:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES50/0,4 oxidado en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda D:
- Producto bruto tras la conjugación de G-CSF con HES50/0,7 oxidado en tampón de NaOAc 0,1 M pH 5.0.
- Banda E:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4 muestra un análisis SDS page de los
conjugados HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.3, G-CSF es Neupogen® o
Granocyte®. Para la electroforesis en gel se emplearon un XCell Sure
Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro
eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel
Bis-Tris al 12% junto con un tampón de avance MOPS
SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto (i-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda C:
- Producto bruto (ii-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda D:
- Producto bruto (iii-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda E:
- Producto bruto (iv-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda F:
- Producto bruto (i-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda G:
- Producto bruto (ii-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda H:
- Producto bruto (iii-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda I:
- Producto bruto (iv-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.
- Banda J:
- Neupogen®.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 muestra un análisis SDS page de los
conjugados HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.4, G-CSF de Strathmann
Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se emplearon
un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un
suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se
usaron un gel Bis-Tris al 12% junto con un tampón de
avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto (vi) de acuerdo con el Ejemplo 2.4.
- Banda C:
- Producto bruto (v) de acuerdo con el Ejemplo 2.4.
- Banda D:
- Material de partida de G-CSF.
- Banda E:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda F:
- Producto bruto (ix) de acuerdo con el Ejemplo 2.4.
- Banda G:
- Producto bruto (viii) de acuerdo con el Ejemplo 2.4.
- Banda H:
- Producto bruto (vii) de acuerdo con el Ejemplo 2.4.
- Banda I:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 6 muestra un análisis SDS page de los
conjugados HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 2.5, G-CSF de Strathmann
Biotec AG, Hamburgo, D. Para la electroforesis en gel se emplearon
un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un
suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se
usaron un gel Bis-Tris al 12% junto con un tampón de
avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto de acuerdo con el Ejemplo 2.5.
- Banda C:
- Material de partida de G-CSF.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 7 muestra un análisis SDS page de los
conjugados HES-G-CSF, producido de
acuerdo con el Ejemplo 3, G-CSF es Neupogen® o
Granocyte®. Para la electroforesis en gel se emplearon un XCell Sure
Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro
eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se usaron un gel
Bis-Tris al 12% junto con un tampón de avance MOPS
SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes.
- Banda A:
- Marcador de proteínas SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD.
- Banda B:
- Producto bruto (x) de acuerdo con el Ejemplo 3.
- Banda C:
- Producto bruto (xi) de acuerdo con el Ejemplo 3.
- Banda D:
- Producto bruto (xii) de acuerdo con el Ejemplo 3.
- Banda E:
- Producto bruto (xiii) de acuerdo con el Ejemplo 3.
- Banda F:
- Producto bruto (xiv) de acuerdo con el Ejemplo 3.
- Banda G:
- Producto bruto (xv) de acuerdo con el Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 8 muestra los resultados in
vitro del Ejemplo 6.
En el diagrama, el eje x muestra la
concentración en pg/ml, el eje y se refiere al número de
células/100.000. En el diagrama, las siguientes abreviaturas se
refieren a
- G-CSF/A32
- conjugado de G-CSF tal como se preparó de acuerdo con el Ejemplo 2.5.
- G-CSF/A33
- material de partida de G-CSF, usado para el conjugado del Ejemplo 2.5.
- G-CSF/A57
- Neulasta® no-modificado.
- G-CSF/A58
- Neupogen® no-modificado.
- G-CSF/A60
- conjugado de G-CSF tal como se preparó de acuerdo con el Ejemplo 4.2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 9 muestra el cromatograma de HPGPC con
respecto al producto bruto de la reacción de conjugación de acuerdo
con el Ejemplo 4.1. Se usaron los siguientes parámetros en el
análisis HPGPC:
- Columna:
- Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm de D.I. (Pharmacia).
- Eluyente:
- Na_{2}HPO_{4} 27,38 mM; NaH_{2}PO_{4} 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN_{3} al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada.
- Flujo:
- 0,24 ml/h.
- Detector 1:
- detector MALLS.
- Detector 2:
- UV (280 nm).
- Detector 3:
- IR (Detector de Índice de Refracción).
A representa el resultado del detector 1, B
representa el resultado del detector 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 10 muestra el cromatograma de HPGPC
con respecto al producto de la reacción de conjugación de acuerdo
con el Ejemplo 4.1, en el que el contenido de la mezcla con respecto
a los subproductos de reacción tales como los
oxo-HES sin reaccionar y la
N-hidroxisuccinimida así como el disolvente se
degradaron usando una membrana de ultrafiltración de 10 kD en una
centrífuga con enfriamiento.
Se usaron los siguientes parámetros en el
análisis de HPGC
- Columna:
- Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm de D.I. (Pharmacia).
- Eluyente:
- Na_{2}HPO_{4} 27,38 mM; NaH_{2}PO_{4} 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN_{3} al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada.
- Flujo:
- 0,24 ml/h.
- Detector 1:
- detector MALLS.
- Detector 2:
- UV (280 nm).
- Detector 3:
- IR (Detector de Índice de Refracción).
A representa el resultado del detector 1, B
representa el resultado del detector 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usaron los siguientes parámetros en el
análisis HPGC
- Columna:
- Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm de D.I. (Pharmacia).
- Eluyente:
- Na_{2}HPO_{4} 27,38 mM; NaH_{2}PO_{4} 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN_{3} al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada.
- Flujo:
- 0,24 ml/h.
- Detector 1:
- detector MALLS.
- Detector 2:
- UV (280 nm).
- Detector 3:
- IR (Detector de Índice de Refracción).
A representa el resultado del detector 1, B
representa el resultado del detector 2.
\vskip1.000000\baselineskip
- Columna:
- Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm de D.I. (Pharmacia).
- Eluyente:
- Na_{2}HPO_{4} 27,38 mM; NaH_{2}PO_{4} 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN_{3} al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada.
- Flujo:
- 0,24 ml/h.
- Detector 1:
- detector MALLS.
- Detector 2:
- UV (280 nm).
- Detector 3:
- IR (Detector de índice de refracción).
A representa el resultado del detector 1, B
representa el resultado del detector 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 13 muestra el análisis
SDS-PAGE del flujo pistón y del eluato de
G-CSF modificado con HES (A32) tras la
cromatografía en DEAE-Sefarosa
CL-6B. 1,5% de las fracciones indicadas se desalaron
mediante ultrafiltración, se secaron en SpeedVac y se aplicaron
sobre un gel de poliacrilamida al 12,5%.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 14 muestra un espectro MALDI/TOF del
material de partida de G-CSF (muestra A33).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 15 muestra un espectro MALDI/TOF de
G-CSF modificado con HES (muestra A32).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 16 muestra un espectro MALDI/TOF de
G-CSF modificado con HES (muestra A60).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 17 muestra la electroforesis en gel de
las mezclas de reacción del ejemplo 7.2 (b).
Para la electroforesis en gel se emplearon un
XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un
suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B). Se
usaron un gel Bis-Tris al 12% junto con un tampón
de avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos de Invitrogen
GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. Se tiñó el gel con Roti-Blue (Carl Roth
GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
- Banda A:
- Marcador de proteínas Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
- Banda B:
- Producto bruto tras la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el ejemplo 7.1 (d).
- Banda C:
- Producto bruto tras la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el ejemplo 7.1 (b).
- Banda D:
- Producto bruto tras la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado en el ejemplo 7.1 (j).
- Banda E:
- Reacción de control. HES 50/07.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 18 muestra la electroforesis en gel de
las mezclas de reacción del ejemplo 7.2 (d). Para la electroforesis
en gel se emplearon un XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH,
Karlsruhe, D) y un suministro eléctrico Consort E143 (CONSORTnv,
Turnhout, B). Se usaron un gel Bis-Tris al 12% junto
con un tampón de avance MOPS SDS en condiciones de reducción (ambos
de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones
de los fabricantes. Se tiñó el gel con Roti-Blue
(Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
- Banda A:
- Marcador de proteínas Roti-Mark STANDARD (Carl Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D). Marcador de pesos moleculares desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD.
- Banda B:
- hG-CSF tras intercambio de tampón tal como se describe en el ejemplo 7.2 (c).
- Banda C:
- Producto bruto tras la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 7.1 (f).
- Banda D:
- Producto bruto tras la conjugación de hG-CSF con el derivado de HES preparado tal como se describe en el ejemplo 7.1 (h).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 19 muestra el cromatograma de HPGPC
con respecto al producto de la reacción de conjugación de acuerdo
con el Ejemplo 7.3 (detector MALLS; diagrama superior; detector UV:
diagrama inferior). Se usaron los siguientes parámetros en el
análisis HPGPC:
- Columna:
- Superose 12 HR 10/30 300 x 10 mm de D.I. (Pharmacia).
- Eluyente:
- Na_{2}HPO_{4} 27,38 mM; NaH_{2}PO_{4} 12,62 mM; NaCl 0,2 M; NaN_{3} al 0,005% en 1 l de agua desmineralizada.
- Flujo:
- 0,24 ml/h.
- Detector 1:
- detector MALLS.
- Detector 2:
- UV (280 nm).
- Detector 3:
- IR (Detector de índice de refracción).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 20 muestra los resultados del ensayo
de mitogenicidad del ejemplo 7.4. El eje Y indica el número de
células NFS-60/ml y el eje X la concentración en
pg/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 21 muestra los resultados del ensayo
in vivo del ejemplo 7.5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 1.1
(a)
Se disolvieron 100 mg de Oxo-HES
10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4, preparado por Supramol Parenteral
Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con
el documento DE 196 28 705. A1, en 5 ml de tampón de fosfato de
sodio 20 mM, pH 7,2 y se enfriaron a 0ºC. Se disolvieron 21,4 mg de
periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml del mismo tampón y se enfriaron a 0ºC.
Se mezclaron ambas soluciones y tras incubación durante 10 min a
0ºC, se añadieron 0,73 ml de glicerol y se incubó la mezcla de
reacción a 21ºC durante 10 min. Se dializó la mezcla de reacción
durante 24 h frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de
3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó.
Ejemplo 1.1
(b)
Se disolvieron 100 mg de Oxo-HES
10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4, preparado por Supramol Parenteral
Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con
el documento DE 196 28 705. A1, en 5 ml de tampón de fosfato de
sodio 20 mM, pH 7,2. Se disolvieron 214 mg de periodato de sodio
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)
en 5 ml del mismo tampón. Se mezclaron ambas soluciones y tras
incubación durante 10 min a 21ºC, se añadieron 0,73 ml de glicerol
y se incubó la mezcla de reacción a 21ºC durante 10 min. Se dializó
la mezcla de reacción durante 24 h frente a agua (tubería de
diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland
GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo 1.2
(a)
Se disolvieron 100 mg de Oxo-HES
10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4, preparado por Supramol Parenteral
Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) en 5 ml de
tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2 y se enfriaron a 0ºC. Se
disolvieron 214 mg de periodato de sodio (Fluka,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml
del mismo tampón y se enfriaron a 0ºC. Se mezclaron ambas
soluciones y tras incubación durante 10 min a 0ºC, se añadieron 0,73
ml de glicerol y se incubó la mezcla de reacción a 21ºC durante 10
min. Se dializó la mezcla de reacción durante 24 h fren-
te a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
te a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo 1.2
(b)
Se disolvieron 100 mg de Oxo-HES
10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4, preparado por Supramol Parenteral
Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) en 5 ml de
tampón de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2. Se disolvieron 21,4 mg de
periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml del mismo tampón. Se mezclaron ambas
soluciones y tras incubación durante 10 min a 21ºC, se añadieron
0,73 ml de glicerol y se incubó la mezcla de reacción a 21ºC
durante 10 min. Se dializó la mezcla de reacción durante 24 h frente
a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo
1.3
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D; preparó Oxo-HES
10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4; de acuerdo con el documento DE 196 28
705. A1.
Se disolvieron 5,1 g (0,51 mmol) de
oxo-HES10/0,4 en 15 ml de dimetil sulfóxido anhidro
(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) y se añadieron gota a gota en atmósfera de nitrógeno
a una solución de 5,1 ml (51 mmol) de
1,4-diaminobutano en 10 ml de dimetil sulfóxido
anhidro y se agitaron a 40ºC durante 19 h. Se añadió la mezcla de
reacción a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. El
precipitado resultante se separó mediante centrifugación, se lavó
con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se volvió a
disolver en 80 ml de agua. Se dializó la solución durante 4 días
frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD,
Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó
posteriormente. El rendimiento fue del 67% (3,4 g) de
amino-HES 10/0,4.
Se disolvieron 150 mg de ácido
4-formilbenzoico y 230 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 10 ml de N,N-dimetilformamida y
se añadieron 204 \mul de
N,N'-diisopropilcarbodiimida. Tras incubación a
21ºC durante 30 min, se añadió 1 g del amino-HES
10/0,4. Tras agitación durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de
reacción a 84 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v)
enfriada en hielo. Se recogió el producto precipitado mediante
centrifugación a 4ºC, se volvió a disolver en 50 ml de agua, se
dializó durante 2 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin,
corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó.
Ejemplo
1.4
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D preparó Oxo-HES
10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7; de acuerdo con el documento DE 196 28
705. A1.
Se disolvieron 83 mg de ácido
4-formilbenzoico y 180 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 5 ml de N,N-dimetilformamida y se
añadieron 78 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida.
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 0,5 g de
oxo-HES 10/0,7. Tras agitación durante 19 h a 22ºC,
se añadió la mezcla de reacción a 37,5 ml de una mezcla 1:1 de
acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió el producto
precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se volvió a disolver en
una mezcla de 2,5 ml de agua y 2,5 ml de DMF y se precipitó de
nuevo tal como se ha descrito anteriormente. Se recogió el producto
de reacción mediante centrifugación tal como se ha descrito, se
volvió a disolver en 10 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a
agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo
1.5
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim D. preparó HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS
= 0,7).
Se disolvieron 50 mg de ácido
4-formilbenzoico y 108 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 3 ml de N,N-dimetilformamida
(Calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 47 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida.
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 0,3 g de
HES10/0,7. Tras agitación durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla
de reacción a 23 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v)
enfriada en hielo. Se recogió el producto precipitado mediante
centrifugación a 4ºC, se volvió a disolver en una mezcla de 1,5 ml
de agua y 1,5 ml de DMF y se precipitó de nuevo tal como se ha
descrito anteriormente. Se recogió el producto de reacción mediante
centrifugación, tal como se ha descrito, se volvió a disolver en 10
ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubería de
diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland
GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo
1.6
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim D. preparó HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS
= 0,7); de acuerdo con el documento DE 196 28 705. A1.
Se disolvieron 6,0 g (0,6 mmol) de
oxo-HES 10/0,7 en 20 ml de dimetil sulfóxido anhidro
(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) y se añadieron gota a gota en atmósfera de nitrógeno
a una solución de 6 ml (60 mmol) de
1,4-diaminobutano en 11 ml de dimetil sulfóxido
anhidro y se agitaron a 40ºC durante 19 h. Se añadió la mezcla de
reacción a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. Se
separó el precipitado resultante mediante centrifugación, se lavó
con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se volvió a
disolver en 80 ml de agua. Se dializó la solución durante 4 días
frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD,
Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó
posteriormente. El rendimiento fue del 52% (3,15 g) de
amino-HES 10/0,7.
Se sintetizó pentafluorofenil éster de ácido
4-formilbenzoico tal como se describe en J. S.
Lindsey y col., Tetrahedron 50 (1994) pp. 8941-68,
especialmente p. 8956. Se disolvieron 50 mg de
amino-HES10/0,7 en 0,5 ml de
N,N-dimetilformamida (Calidad de síntesis de
péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadieron 15,3 mg de
pentafluorofenil éster del ácido 4-formilbenzoico.
Tras agitación durante 22 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción
a 3,5 ml de 2-propanol enfriado en hielo. Se recogió
el producto precipitado mediante centrifugación a 4ªC, se lavó con
4 ml de 2-propanol enfriado en hielo, se volvió a
disolver en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua
(tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences
Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo
1.7
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim D. preparó HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS
= 0,7); de acuerdo con el documento DE 196 28 705. A1.
Se sintetizó pentafluorofenil del ácido
4-formilbenzoico tal como se describe en J. S.
Lindsey y col., Tetrahedron 50 (1994) pp. 8941-68,
especialmente p. 8956. Se disolvieron 200 mg de
oxo-HES10/0,7 en 2 ml de
N,N-dimetilformamida (calidad de síntesis de
péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadieron 61,2 mg de
pentafluorofenil éster del ácido 4-formilbenzoico.
Tras agitación durante 22 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción
a 15 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en
hielo. Se recogió el producto precipitado mediante centrifugación a
4ºC, se volvió a disolver en una mezcla de 1,4 ml de agua y 0,7 ml
de DMF y se precipitó de nuevo tal como se ha descrito
anteriormente. Se recogió el producto de reacción mediante
centrifugación tal como se ha descrito, se volvió a disolver en 10
ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua (tubería de
diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland
GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
Ejemplo
1.8
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim D. preparó HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS
= 0,7); de acuerdo con el documento DE 196 28 705. A1.
Se disolvieron 5,1 g (0,51 mmol) de
oxo-HES10/0,4 en 15 ml de dimetil sulfóxido anhidro
(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) y se añadieron gota a gota en atmósfera de nitrógeno
a una solución de 5,1 ml (51 mmol) de
1,4-diaminobutano en 10 ml de dimetil sulfóxido
anhidro y se agitó a 40ºC durante 19 h. Se añadió la mezcla de
reacción a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. Se
separó el precipitado resultante mediante centrifugación, se lavó
con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se volvió a
disolver en 80 ml de agua. Se dializó la solución durante 4 días
frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD,
Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó
posteriormente. El rendimiento fue del 67% (3,4 g) de
amino-HES10/0,4.
Se disolvieron 80,5 mg de ácido
4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico
(Calbiochem-Novabiochem, Läufelfingen, CM y 61 mg
de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D)
en 3 ml de N,N-dimetilformamida (calidad de
síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se añadieron
45,4 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida. Tras
incubación a 21ºC durante 30 minutos, se añadieron 0,3 g de
amino-HES 10/0,4. Tras agitación durante 22 h a
22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 23 ml de una mezcla 1:1 de
acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió el producto
precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se volvió a disolver en
una mezcla de 2 ml de agua y 1 ml de DMF y se precipitó de nuevo
tal como se ha descrito anteriormente. Se recogió el producto de
reacción mediante centrifugación, tal como se ha descrito, se volvió
a disolver en 10 ml de agua, se dializó durante 1 d frente a agua
(tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences
Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2.1
(a)
En el ejemplo 2.1, se probó usar el
procedimiento de síntesis del documento WO 03/074087 (ejemplo 12,
página 22-23) para la producción de un conjugado
HES-G-CSF.
A 3,33 \mul de una solución acuosa de
G-CSF (Neupogen® de Amgen, Múnich, D, o Granocyte®
de Aventis Pharma AG, Zurich, CH, respectivamente, 3 mg/ml) en
tampón de fosfato de sodio 0,1 M con pH 7,4, se añadieron 3,33
\mul de una solución de HES10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, Supramol
Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, 79
mg/ml) en el mismo tampón. A esta mezcla, se añadieron 3,33 \mul
de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo
tampón, y se incubó la mezcla resultante durante 4 h a 22ºC.
Posteriormente, se añadieron otros 3,33 \mul de la solución de
cianoborohidruro de sodio 60 mM preparada recientemente. Durante el
tiempo de incubación, se añadieron un total de 5 porciones de 3,33
\mul de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM preparada
recientemente. Se analizó la mezcla de reacción mediante
electroforesis en gel. No se observó reacción.
Ejemplo 2.1
(b)
A 3,33 \mul de una solución acuosa de
G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec
AG, Hamburgo, D, 3 mg/mL) en un tampón dado, se añadieron 3,33
\mul de una solución de HES (300 mg/ml) en el mismo tampón. Se
enfrió la mezcla a 4ºC, y se añadieron 3,33 \mul de una solución
de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón a 4ºC, y se
incubó la mezcla resultante durante 20 h a 4ºC.
Se emplearon las siguientes preparaciones de HES
y del tampón:
- a)
- Tampón: tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0
- -
- HES 10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- -
- HES50/0,4 (MW = 50 kD, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- -
- HES50/0,7 (MW = 50 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- b)
- Tampón: tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2
- -
- HES 10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- c)
- Tampón: tampón de borato de sodio 0,1 M, pH 8,3
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- d)
- Tampón: tampón de borato de potasio 0,2 M, pH 9,2
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Se analizó cada mezcla de reacción mediante
electroforesis en gel. No se observó conjugación o fue despreciable
(no se muestran los barridos en gel de las reacciones b) a d)).
Ejemplo
2.2
A 3,33 \mul de una solución acuosa de
G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec
AG, Hamburgo, D, 3 mg/ml) en un tampón dado, se añadieron 3,33
\mul de una solución de oxo-HES (300 mg/ml) en el
mismo tampón. Se enfrió la mezcla a 4ºC, y se añadieron 3,33 \mul
de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo
tampón, y se incubó la mezcla durante 17 h a 4ºC.
Se emplearon las siguientes preparaciones de HES
y del tampón:
- a)
- Tampón: tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0
- -
- oxo-HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- -
- oxo-HES50/0,4 (MW = 50 kD, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- -
- oxo-HES50/0.7 (MW = 50 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- b)
- Tampón: tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,2
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- c)
- Tampón: tampón de borato de sodio 0,1 M, pH 8,3
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
- d)
- Tampón: tampón de borato de potasio, pH 9,2
- -
- HES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)
Se analizó cada mezcla de reacción mediante
electroforesis en gel. No se observó conjugación o fue despreciable
(no se muestran los barridos en gel de las reacciones b) a d)).
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D, llevó a cabo la oxidación de
HES10/0,4 (MW = 10 kD, DS = 0,4); de acuerdo con el documento DE
196 28 705 A1.
Ejemplo
2.3
A 3,33 \mul de una solución acuosa de
G-CSF (Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zurich, CH,
y Neupogen® de Amgen, Múnich, D, respectivamente, 3 mg/mL) en
tampón de acetato de sodio 0,1 M pH 5,0, se añadieron 3,33 \mul
de una disolución de un aldehído-HES (79 mg/ml) en
el mismo tampón. A esta mezcla se añadieron 3,33 \mul de una
disolución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón y
se incubó la mezcla durante 25 h a 21ºC. Se analizó la mezcla de
reacción mediante electroforesis en gel.
Se emplearon los siguientes conjugados de HES
funcionalizados con aldehído:
- (i-N)
- preparado con Neupogen® de acuerdo con El Ejemplo 1.1 (a) anteriormente en el presente documento;
- (ii-N)
- preparado con Neupogen® de acuerdo con El Ejemplo 1.1 (b) anteriormente en el presente documento;
- (iii-N)
- preparado con Neupogen® de acuerdo con El Ejemplo 1.2 (a) anteriormente en el presente documento;
- (iv-N)
- preparado con Neupogen® de acuerdo con El Ejemplo 1.2 (b) anteriormente en el presente documento;
- (i-G)
- preparado con Granocyte® de acuerdo con El Ejemplo 1.1 (a) anteriormente en el presente documento;
- (ii-G)
- preparado con Granocyte® de acuerdo con El Ejemplo 1.1 (b) anteriormente en el presente documento;
- (iii-G)
- preparado con Granocyte® de acuerdo con El Ejemplo 1.2 (a) anteriormente en el presente documento;
- (iv-G)
- preparado con Granocyte® de acuerdo con El Ejemplo 1.2 (b) anteriormente en el presente documento.
Ejemplo
2.4
A 3,33 \mul de una solución acuosa de
G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec
AG, Hamburgo, D, 3 mg/ml) en tampón de acetato de sodio 0,1 M pH
5,0, se añadieron 3,33 \mul de una solución de un
aldehído-HES (118,5 mg/ml) en el mismo tampón y se
enfriaron a 4ºC. Se añadieron a la mezcla 3,33 \mul de una
solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM en el mismo tampón a
4ºC y se incubó la mezcla durante 17 h a 4ºC. Se analizó la mezcla
de reacción mediante electroforesis en gel.
Se emplearon los siguientes conjugados de HES
funcionalizados con aldehído:
- (v)
- preparado de acuerdo con El Ejemplo 1.4 anteriormente en el presente documento;
- (vi)
- preparado de acuerdo con El Ejemplo 1.5 anteriormente en el presente documento;
- (vii)
- preparado de acuerdo con El Ejemplo 1.6 anteriormente en el presente documento;
- (viii)
- preparado de acuerdo con El Ejemplo 1.7 anteriormente en el presente documento;
- (ix)
- preparado de acuerdo con El Ejemplo 1.8 anteriormente en el presente documento.
Ejemplo
2.5
A 2,5 ml de una solución acuosa de
G-CSF (G-CSF de Strathmann Biotec
AG, Hamburgo, D, 227 mg/ml) en tampón de acetato de sodio 0,1 M pH
5,0, se añadieron 136 mg de aldehído-HES 10/0,4,
preparado tal como se ha descrito en el Ejemplo 1.3 anteriormente
en el presente documento, y se enfrió la solución a 0ºC. Se
añadieron a la mezcla 2,5 ml de una solución de cianoborohidruro de
sodio 40 mM enfriada en hielo en el mismo tampón, y se incubó la
mezcla durante 17 h a 4ºC. Se analizó la mezcla de reacción mediante
electroforesis en gel.
\vskip1.000000\baselineskip
(No de acuerdo con la
invención)
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D preparó
Oxo-FIES10/0,7 (MW = 10 kD, DS = 0,7); de acuerdo
con el documento DE 196 28 705 A1.
Se disolvieron 6,0 g (0,6 mmol) de
oxo-HES 10/0,7 en 20 ml de dimetil sulfóxido anhidro
(DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Tautkirchen, D) y se añadieron gota a gota en atmósfera de nitrógeno
a una solución de 6 ml (60 mmol) de
1,4-diaminobutano en 11 ml de dimetil sulfóxido
anhidro y se agitó a 40ºC durante 19 h. Se añadió la mezcla de
reacción a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. Se
separó el precipitado resultante mediante centrifugación, se lavó
con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se volvió a
disolver en 80 ml de agua. Se dializó la solución durante 4 días
frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD,
Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó
posteriormente. El rendimiento fue del 52% (3,15 g) de
amino-HES
10/0,7.
10/0,7.
A 132 \mug de amino 10/0,7, disueltos en 100
\mul de tampón de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50
mM, pH 7.2), se añadieron 10 \mul de una solución de 17,5 mg/ml de
éster de N-alfa(maleimidoacetoxi)
succinimida (AMAS) en DMSO seco (ambos de Fluka,
Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, D), y se
incubó la solución transparente durante 80 min a 25ºC y
posteriormente durante 20 min a 40ºC. Se retiró el exceso de AMAS
mediante filtración centrífuga con un concentrador VIVASPIN de 0,5
ml, 5KD MWCO (VIVASCIENCE, Hannover, D) a 13.000 rpm, se lavó 2
veces durante 30 min con 450 \mul del tampón fosfato y una vez con
450 \mul de un tampón B. A la solución residual, se añadieron 10
\mug de G-CSF (Neupogen® de Amgen, Múnich, D, y
Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zürich, CH, respectivamente, 3
\mug/\mul en tampón fosfato), y se incubó la mezcla durante 16
h a 25ºC. Se analizó la mezcla de reacción mediante electroforesis
en gel tras concentración a vacío.
Se escogieron los siguientes procedimientos:
- (x)
- G-CSF (Granocyte®) que emplea tampón de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) como tampón B.
- (xi)
- G-CSF (Neupogen®) que emplea tampón de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) como tampón B.
- (xii)
- G-CSF (Granocyte®) que emplea una mezcla 1:1 (v/v) de tampón de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) y urea 8 M, SDS al 1%, pH 7,4 como tampón B.
- (xiii)
- G-CSF (Neupogen®) que emplea una mezcla 1:1 (v/v) de tampón de fosfato de sodio (0,1 M, NaCl 0,15 M, EDTA 50 mM, pH 7,2) y urea 8 M, SDS al 1%, pH 7,4 como tampón B.
- (xiv)
- G-CSF (Granocyte®) que emplea urea 8 M, SDS al 1%, pH 7,4 como tampón B.
- (xv)
- G-CSF (Neupogen®) que emplea urea 8 M, SDS al 1%, pH 7,4 como tampón B.
\newpage
No de acuerdo con la
invención
Ejemplo
4.1
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D preparó
Oxo-HES10/0,4 (MW = 10.559 D, DS = 0,4), de acuerdo
con el documento DE 196 28 705 A1. El grado de oxidación de
oxo-HES fue del 95%.
Se disolvieron 66 mg de
oxo-HES10/0,4 en 0,5 ml de DMF anhidro. A esta
solución, se añadieron 3,4 mg de carbonato de
N,N'-disuccinimidilo, y se agitó la mezcla durante 2
h a temperatura ambiente. La solución resultante tuvo una
concentración de HES reactivo de un 13 por ciento en peso.
Una solución de G-CSF
(Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D), que tenía una concentración de
aproximadamente 0,5 mg de G-CSF/ml, se concentró a
una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugación a un
corte de 10 kD usando una centrífuga con enfriamiento.
A 0,5 ml de esta solución concentrada de
G-CSF, se añadieron 180 \mul de una solución de
bicarbonato de sodio. Posteriormente, se añadieron gota a gota 3
porciones (de 100 \mul cada una) de la solución de HES reactivo a
la solución de proteínas, hasta que, tras aproximadamente 30 min, la
reacción llegó a la finalización. De esta manera, la relación molar
total de HES reactivo: G-CSF fue de 20:1. A
continuación se ajustó el pH de la mezcla a 4,0 usando HCl 0,1
N.
Un análisis de HPGPC (Cromatografía de
Permeación en Gel de Alto rendimiento) proporcionó un resultado de
aproximadamente el 70%. En la Fig. 9 se muestra este resultado.
La mezcla se podía almacenar a 4ºC a un pH de
4,0 durante 4 d y, de acuerdo con los análisis de HPGPC, permaneció
estable, es decir, sin cambiar.
Fue posible la degradación del contenido de la
mezcla con respecto a los subproductos de reacción tales como
oxo-HES sin reaccionar y
N-hidroxisuccinimida libre así como del disolvente,
usando una membrana de ultrafiltración de 10 kD en una centrífuga
con enfriamiento sin dificultades. En la fig. 10 se muestran los
resultados de este experimento de degradación.
Ejemplo
4.2
Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D preparó
Oxo-HES10/0,4 (MW = 10.559 D, DS = 0,4), de acuerdo
con el documento DE 196 28 705 A1. El grado de oxidación de
oxo-HES fue del 95%.
Se disolvieron 400 mg de
oxo-HES10/0,4 en 1 ml de DMF anhidro. A esta
solución, se añadieron 21 mg de carbonato de
N,N'-disuccinimidilo, y se agitó la mezcla durante 2
h a temperatura ambiente. La solución resultante tuvo una
concentración de HES reactivo de un 40 por ciento en peso.
Una solución de G-CSF
(Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D), que tenía una concentración de
aproximadamente 0,5 mg de G-CSF/ml, se concentró a
una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugación a un
corte de 10 kD usando una centrífuga con enfriamiento.
A 0,5 ml de esta solución concentrada de
G-CSF, se añadieron 180 \mul de una solución de
bicarbonato de sodio. Posteriormente, se añadieron gota a gota 3
porciones (de 100 \mul cada una) de la solución de HES reactivo a
la solución de proteínas, hasta que, tras aproximadamente 30 min, la
reacción llegó a la finalización. De esta manera, la relación molar
total de HES reactivo: G-CSF fue de 50:1. A
continuación se ajustó el pH de la mezcla a 4,0 usando HCl 0,1
N.
Un análisis de HPGPC (Cromatografía de
Permeación en Gel de Alto Rendimiento) proporcionó un rendimiento de
más del 95%. No se podía detectar G-CSF sin
reaccionar. En la Fig. 11 se muestra este resultado.
Se purificó la mezcla usando tecnología de
ultrafiltración sin dificultades. En la Fig. 12 se muestran los
resultados de esta degradación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvo G-CSF purificado que
tenía esencialmente las mismas características que el producto
comercial Neupogen ® (Amgen) y se mantuvo 1 alícuota sin modificar
como control.
Se sintetizaron los conjugados esencialmente tal
como se ha descrito en el Ejemplo 4.2, pero con
Oxo-HES50/0,7 (código de la muestra A60), o tal
como se ha descrito en el Ejemplo 2.5 (código de la muestra A32) y
se usaron para el intercambio de tampón y la purificación
adicionales.
Se sometieron muestras de G-CSF
modificado con HES o G-CSF sin modificar (como
control) (0,5-5 mg de proteína) a intercambio de
tampón usando unidades de Concentrador Vivaspin 6 (10.000 MWCO PES,
Vivascience, Nº de Cat. VS0602). Se concentraron las muestras a
0,5-0,7 ml y se diluyeron a 5 ml con tampón de
fosfato de sodio 10 mM pH 7,2. Se sometió cada muestra 3 veces a
este ciclo de concentración/intercambio de tampón.
Muestras de G-CSF tras la
modificación con HES y, para comparación, muestras de
G-CSF sin modificar, se purificaron y analizaron
usando una cromatografía de intercambio aniónico a temperatura
ambiente usando un sistema ÄKTA explorer 10 tal como se ha
descrito. Se dializaron alícuotas de G-CSF tanto
antes como después de la HESilación mediante ultrafiltración frente
a dicho tampón A (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2) o se diluyeron con
aproximadamente 13 volúmenes de tampón A. La columna que contenía 2
ml de DEAE-Sefarosa (DEAE-Sepharose
CL-6B, Pharmacia Nº de Cat.
17-0710-01) se regeneró 5,0
volúmenes de columna (VC) de guanidina/HCl 6,5 M, 5,0 VC de tampón
A, 5,0 VC de tampón C (NaCl 1,5 M en fosfato de sodio 10 mM, pH
7,2) y a continuación 10 VC de tampón A. a continuación se
inyectaron las muestras (0,8-4,5 ml en tampón de
fosfato de sodio 10 mM pH 7,2) usando un caudal de 0,6 ml/min. Tras
el lavado del bucle de muestra con 10 ml (bucle de muestra de 2 ml)
o 20 ml (bucle de muestra de 5 ml) de tampón A, dependiendo de la
muestra aplicada, se lavó la columna adicionalmente con
0-22 VC de tampón A (caudal = 0,8 ml/min). Se llevó
a cabo la elución aplicando un gradiente lineal de
0-100% de tampón B en 5 VC y un arrastre isocrático
con 2,5 VC de 100% de tampón B usando un caudal de 0,6 ml/min. Se
volvió a equilibrar la columna con 5 VC de tampón A y se regeneró
tal como se ha detallado anteriormente usando un caudal de 1
ml/min.
Si se requirió, se concentraron las muestras
usando un concentrador Vivaspin y se llevó a cabo el intercambio de
tampón tal como se ha descrito anteriormente. Se almacenaron las
muestras a 0-8ºC en tampón de acetato de sodio 10
mM pH 4,0 antes o después de la filtración esteril usando unidades
de filtración de 0,2 \mum, Corning, Nº de Cat. 431215). Se
prepararon las siguientes muestras para los bioensayos in
vitro y para el análisis analítico adicional. Se determinó la
concentración de proteínas tal como se describe en la sección 6.1 a
continuación:
- I.
- 0401-15/A33, 0,44 mg/ml, volumen = 500 \mul de G-CSF (E. coli)
- II.
- 0402-03/A60, 0,35 mg/ml, volumen = 600 \mul de H-G-CSF (G-CSF modificado con HES, 10/0,4)
- III.
- 0401-13/A32, 0,28 mg/ml, volumen = 900 \mul G-CSF (E. coli) modificado con HES, 10/0,4
- IV.
- 0401-28/A58, 0,60 mg/ml, volumen = 350 \mul de Neupogen
- V.
- 0401-28/A57, 0,50 mg/ml, volumen = 400 \mul de Neulasta
Se analizaron alícuotas de las muestras para su
contenido de proteína y para las modificaciones.
Se cuantificó el contenido de proteínas de
G-CSF usando la preparación de proteínas sin
modificar (concentración: 0,453 mg/ml) como patrón.
Se usó un sistema HPLC Dionex que consiste en
una bomba P 680 A HPG, una unidad de desgasificación Degasys DG
1210, un automuestreador y un inyector ASI-100, un
bucle de muestra de 250 \mul, se usó un apartado de columna
termostatizado TCC 100 junto con un UV/Vis-Detektor
UVD170U equipado con un Software Chromeleon Chromatography
Management System. Se usaron una precolumna CC 8/4 Nucleosil
120-5 C4, Macherey-Nagel, Nº de Cat.
721889, y una columna de separación 40 C-4
Nucleosil MPN, columna RP de 5 \mum, 125 x 4 mm
(Macherey-Nagel, Nº de orden 7200 45.40). El
disolvente A fue H_{2}O más 0,06% (v/v) de ácido trifluoroacético
y el disolvente B fue acetonitrilo al 90% en H_{2}O, que contenía
0,06% (v/v) de ácido trifluoroacético; el caudal fue de: 1 ml/min.
La detección UV fue a una longitud de onda de 214, 221, 260 y a 280
nm.
\newpage
Se inyectaron muestras de aproximadamente 10 -20
\mug en una columna RP-HPLC. Se usó el siguiente
gradiente:
- -
- 0-5 min: 0-10% de B
- -
- 17 min: 10-45% de B
- -
- 35 min: 45-80% de B
- -
- 36 min: 80-100% de B
- -
- 38 min: 100% de B
- -
- 39 min: 10% de B
- -
- 45 min: 10% de B
Se usó el área del pico resultante en la
posición de elución de la preparación de G-CSF
patrón y se comparó con el patrón de referencia comparando el pico
que aparecía a alrededor de 29 min a una longitud de onda de 280
nm.
Alícuotas procedentes de las muestras de
proteínas de G-CSF se redujeron y
carboxamidometilaron tal como se describe en otra parte
(Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo
Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz
(2004) N- and O-linked carbohydrates and
glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-
macrophage colony-stimulating factor secreted by a
Chinese hamster ovary cell line; European J. Biochem, 273 (5),
907-919). La carboxamidometilación condujo a restos
de cisteína modificados. Se llevó a cabo la digestión con
endoproteinasa Glu-C de la proteína
carboxamidometilada en NH_{4}HCO_{3} 25 mM que contenía urea 1
M a pH 7,8 y usando una relación enzima/sustrato de 0,2:10 durante
18-24 horas.
Los péptidos generados por la digestión con
Endo-Glu-C se separaron en un
sistema HPLC Dionex que consiste en una bomba P 680 A HPG, una
unidad de desgasificación Degasys DG 1210, un automuestreador y un
inyector ASI-100, un bucle de muestra de 250
\mul, se usó un apartado de columna termostatizado TCC 100 junto
con un UV/Vis-Detektor UVD170U equipado con un
Software Chromeleon Chromatography Management System. Se usaron una
precolumna CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4,
Macherey-Nagel, Nº de Cat. 721889, y una columna de
separación 40 C-4 Nucleosil MPN, columna RP de 5
\mum, 125 x 4 mm (Macherey-Nagel, Nº de orden 7200
45.40). El disolvente A fue H_{2}O más 0,06% (v/v) de ácido
trifluoroacético y el disolvente B fue acetonitrilo al 90% en
H_{2}O, que contenía 0,06% (v/v) de ácido trifluoroacético; el
caudal fue de: 1 ml/min. Se aplicó el siguiente gradiente:
- -
- 0-5 min: 10% de B
- -
- 17 min: 45% de B
- -
- 65 min: 100% de B
- -
- 67 min: 100% de B
- -
- 69 min: 10% de B
- -
- 75 min: 10% de B
La detección UV fue a una longitud de onda de
214, 221, 260 y a 280 nm. Se separaron los péptidos generados por
la digestión con Endo-Glu-C (no se
muestran los datos).
Se usó la espectrometría de masas para detectar
el extremo N intacto de G-SCF en las diferentes
muestras preparadas. Las muestras (3-5 \mug)
resultantes de las digestiones con Endoproteinasa
Glu-C y las muestras de proteínas
carboxamidometiladas se usaron directamente para el análisis de EM
(sin el RP-HPLC de la etapa 6.3) y se purificaron
usando puntas de pipeta ZipTip que contenían material en fase
inversa C18 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras
el lavado con 0,1% (v/v) de ácido fórmico, se llevó a cabo la
elución de los péptidos con 10 \mul de ácido fórmico al 0,1%
(v/v) en acetonitrilo al 60% (v/v).
Se analizaron los fragmentos de péptidos
proteolíticos (Endo-Glu-C) con un
equipo Bruker ULTRAFLEX por tiempo de vuelo (TOF/TOF) en el modo
lineal de ión positivo usando una matriz de 22,4 mg de ácido
3,5-dimetoxi-4-hidroxi
cinnámico en 400 \mul de acetonitrilo y 600 \mul de ácido
trifluoroacético al 0,1% (v/v) en H_{2}O; se midieron los
(gluco)-péptidos usando una matriz de 19 mg de ácido
\alpha-ciano-4-hidroxicinnámico
en la misma mezcla de disolventes usando el reflectrón para la
resolución potenciada. Se mezclaron soluciones de muestras de 1
\mul y una concentración aproximada de 1-10
pmol\cdot\mul^{-1} con cantidades iguales de la respectiva
matriz. Se manchó esta mezcla sobre una diana de acero inoxidable y
se secó a temperatura ambiente antes del análisis. Se registraron
los espectros en el intervalo de masas de 900-5000
dalton. La siguiente Tabla correlaciona las masas esperadas con los
péptidos G-CSF
respectivos.
respectivos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se carboxamidometilaron los restos de cisteína;
se detectaron los péptidos marcados como fat en el espectro
MALDI/TOF del G-CSF sin modificar.
Se detectó el péptido
Endo-Glu-C del extremo N
(MTPLGPASSLPQSFLLKCLE; m/z 2189,1) que comprendía la posición
1-20 de la proteína en los espectros
MALDI/TOF-EM de las muestras tras el tratamiento
proteolítico de G-CSF con endoproteinasa
Glu-C tal como se ha descrito anteriormente.
Se sometieron A32, A60 y G-CSF
sin modificar a purificación usando una columna
DEAE-Sefarosa CL-6B tal como se ha
descrito con A4.
En el caso de la muestra
0401-15/A33 sin modificar, no se detectó absorción
significativa a 280 nm en el flujo pistón y se eluyó la proteína a
una concentración de 40-50% de tampón B (NaCl
0,16-0,20 M) en un volumen de 6 ml, con un área de
pico específica de 660 mAU x ml x mg^{-1} a 280 nm.
Se eluyó la muestra 0401-14/A32
(derivada d3e 0401-15/A33; HESilación con
AldehídoHES 10/0,4) en un gran intervalo del gradiente a una
concentración de tampón B de 20-80% (NaCl
0,08-0,32 M) en un volumen de 12 ml. Aproximadamente
un 90% del área total del pico detectada a 280 nm se encontró en el
flujo pistón, que contenía aproximadamente un 50% de la proteína
total con un peso molecular en apariencia ligeramente mayor cuando
se comparó con el de la proteína eluída, tal como se detectó
mediante el análisis SDS-PAGE tal como se muestra en
la Figura 13 anterior.
Se eluyó la muestra 0402-03/A60
(HESilada con HES 10/0,4, tras el procedimiento global del Ejemplo
4.2) en un volumen de 10,5 ml a una concentración similar de
20-80% de tampón B. En este caso, se encontró
aproximadamente un 35% del área total del pico detectado a 280 nm
en el flujo pistón, sin embargo, mediante el análisis
SDS-PAGE, no se detectó proteína sin unir en esta
fracción. Cuando se comparó con el área del pico específico de la
muestra 0401-15/A33, el contenido de proteína en el
eluato de la muestra 0402-03/A60 fue un 45% mayor
que la cantidad de proteína definida que se aplicó a la
columna.
Se calculó la recuperación de proteínas
basándose en el área del pico (A280 nm) de las fracciones de elución
en comparación con la proteína G-CSF sin
modificar.
\vskip1.000000\baselineskip
El péptido del extremo N resultante de la
digestión con endoproteinasa Glu-C del
G-CSF carboxamidometilado sin modificar (Figura 14)
y el producto comercial Neupogen (no se muestran los datos), se
detectó claramente mediante MALDI/TOF-EM
(MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189,1; cisteína
carboxamidometilada). Esta señal estuvo ausente en las muestras
sometidas a modificación con HES mediante aminación reductora
(Figura 15) y en Neulasta (no se muestran los datos), indicando
modificaciones de este péptido. En el caso de G-CSF
modificado con HES, en el que se llevó a caso la modificación
mediante química de éster activado, se detectó el péptido del
extremo N a una intensidad de señal relativa comparable a la del
material de partida A32 sin modificar (Figura 16) indicando que se
había conseguido la modificación con HES de estos derivados en
diferentes cadenas secundarias de aminoácidos.
La secuenciación del extremo N del
G-CSF modificado con HES (muestra A33 del producto
comercial Neulasta) desveló un extremo N bloqueado sugiriendo de
hecho que el resto metionina del extremo N de este derivado de
proteína está modificado por el derivado de HES. Debido a que no se
detectó la señal correspondiente al péptido que comprende los
restos de aminoácidos en las posiciones 35-47
(KLCATYKLCHPEE; se carboxamidometilaron ambos restos de cisteína
m/z 1648,78) en la muestra A60, se concluyó que uno o ambos restos
de lisina (en la posición 35 y en la posición 41) pueden estar
modificados por HES.
Guillermina Forno, Mariela Bollati
Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina
Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred
Nimtz (2004) N- and O-linked
carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human
granulocyte-macrophage
colony-stimulating factor secreted by a Chinese
hamster ovary cell line Eur. J. Biochem, 271 (5),
907-919.
Nimtz, M., Grabenhorst, E.,
Conradt, H. S., Sanz, L. y Calvete, J. J.
(1999) Structural characterization of the oligosaccharide
chains of native and crystallized boar seminal plasma spermadhesin
PSP-I and PSP-II glycoforms. Eur.
J. Biochem. 265, 703-718.
Nimtz, M., Martin, W.,
Wray, V., Klöppel, K.-D., Agustin, J. y
Conradt, H. S. (1993) Structures of sialylated
oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant
BHK-21 cells. Eur J. Biochem. 213,
39-56.
Nimtz, M., Noll G.,
P\hat{a}ques, E. y Conradt, H. S. (1990)
Carbohydrate structures of human tissue plasminogen activator
variant expressed in recombinant Chinese hamster ovary cells.
FEBS Lett. 271, 14-18.
Schröter, S., Derr, P.,
Conradt, H. S., Nimtz, M., Hale, G. y
Kirchhoff, C. (1999) Male-specific
modification of human CD52. J. Biol. Chem. 274,
29862-29873.
E. Grabenhorst y H. S. Conradt
(1999) The Cytoplasmic, Transmembrane and the Stem Regions of
Glycosyltransferases specify their in vivo functional
sublocalization and stability in the Golgi J. Biol. Chem.,
274, 36107-36116.
E. Grabenhorst, A. Hoffmann, M.
Nimtz, G. Zettlmeiß1 y H. S. Conradt
(1995) Construction of stable BHK-21 cells
coexpressing human secretory glycoproteins and human
Gal\beta1-4GlcNAc-R
2,6-sialyltransferase: 2,6-linked
NeuAc is preferably attached to the
Gal\beta1-4GlcNAc\beta1-2Man\beta1-3-branch
of biantennary oligosaccharides from secreted recombinant -trace
protein. Eur. J. Biochem., 232, 718-725.
\vskip1.000000\baselineskip
Se conoce G-CSF por sus efectos
específicos sobre la proliferación, diferenciación, y activación de
las células hematopoyéticas del linaje de granulocitos neutrófilos.
Se ensayó la capacidad mitogénica de las variantes de
G-CSF usando células NFS-60 de ratón
(N. Shirafuji y col., Exp. Hematol. 1989, 17,
116-119). Las células crecieron en medio RPMI con
suero de ternera fetal al 10% (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D)
que contenía medio acondicionado WEHI-3B al
5-10% (DSMZ, Braunschweig, D; cultivado tal como se
describe por el DSMZ) como fuente de IL-3 exógena,
se cosecharon mediante centrifugación, se lavaron y se distribuyeron
en alícuotas a 100.000 células por pocillo en placas de 24
pocillos. Se dejaron adaptar las células durante 1 hora a 37ºC en
medio RPMI sin medios acondicionados WEHI-3B antes
de que se añadieran las muestras de factores de crecimiento de
G-CSF en los mismos medios. Se expusieron las
células NFS-60 a las variantes de
G-CSF purificadas durante 3 días a 37ºC y a
continuación se contaron las células electrónicamente (Contador
Celular Casy TT, Schärfe System, Reutlingen, D). En la Figura 12 se
resumieron los resultados. Como se observa en la Figura 12, las
variantes de G-CSF diferentes
(0,5-50 pg/ml) fueron capaces de estimular un
aumento en el número de células después de 3 días en comparación
que el medio que no contenía factores de crecimiento añadidos.
Las proteínas G-CSF/A33 y
G-CSF/A58 no modificadas del control estimularon las
células en una extensión muy similar (DE50 = 5-10
pg/ml) mientras que los conjugados G-CSF/A60
G-CSF/A32 y G-CSF/A57 de
G-CSF mostraron únicamente una menor disminución en
la actividad si se comparaban con la versión sin modificar (DE50 =
10 25 pg/ml).
(véase la Figura 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7.1
Ejemplo 7.1
(a)
Se calentaron 5,12 g de oxo HES10/0,4 (MW =
10000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D de acuerdo con el documento DE
196 28 705 A1) durante la noche a 80ºC a vacío y se disolvieron en
atmósfera de nitrógeno en 25 ml de dimetil sulfóxido seco (Fluka,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se
añadieron 5,13 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar
a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de
una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se
recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se
lavó con 40 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada
en hielo y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el
producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a
agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento
del producto aislado fue del 67%.
Ejemplo 7.1
(b)
Se disolvieron 105 mg de ácido
4-formilbenzoico y 135 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 7 ml de N,N-dimetilformamida
(calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 135 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D).
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 0,7 g de
aminoHES 10/0,4 (sintetizado tal como se ha descrito en 1.1). Tras
agitar durante 18 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 42 ml
de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se
recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se
volvió a disolver en 5 ml de DMF y se precipitó con 42 ml de
etanol/acetona tal como se ha descrito anteriormente. Tras la
centrifugación, se disolvió el precipitado recogido con agua, se
dializó durante 1 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin,
corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 95%.
Ejemplo 7.1
(c)
Se disolvieron 6,02 de oxo-HES
10/0,7 (MW = 10000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D, de acuerdo con el documento DE
196 28 705) en atmósfera de nitrógeno en 32 ml de dimetil sulfóxido
seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) y se añadieron 6,03 ml de
1,4-diaminobutano. Tras agitar a 40ºC durante 17 h,
se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una mezcla 1:1 de
acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió el producto
precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se lavó con 40 ml de una
mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo y se recogió
mediante centrifugación. Se disolvió el producto bruto en 80 ml de
agua durante 4 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte
de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 52%.
Ejemplo 7.1
(d)
Se disolvieron 150 mg de ácido
4-formilbenzoico y 230 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 10 ml de N,N-dimetilformamida
(calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 204 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D).
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadió 1 g de
aminoHES10/0,7 (sintetizado tal como se ha descrito en 1.3). Tras
agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 84 ml
de 2-propanol enfriado en hielo. Se recogió el
producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se volvió a
disolver en 50 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a agua
(tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences
Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del
producto aislado fue del 83%.
Ejemplo 7.1
(e)
Se calentaron 5 g de oxo-HES
30/0,4 (MW = 30000 D, DS = 0,4, Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D, Usando relaciones molares de
los ingredientes de acuerdo con el documento DE 196 28 705 A1)
durante la noche a 80ºC a vacío y a continuación se disolvieron en
atmósfera de nitrógeno en 28 ml de dimetil sulfóxido seco (Fluka,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se
añadieron 1,67 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar
a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una
mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió
el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC. Se disolvió
el producto bruto en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a
agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó
el rendimiento del producto aislado.
Ejemplo 7.1
(f)
Se disolvieron 130 mg de ácido
4-formilbenzoico y 153 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 36 ml de N,N-dimetilformamida
(Calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 110 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D).
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 2,61 g de
aminoHES30/0,4 (sintetizado tal como se ha descrito en 1.5). Tras
agitar durante 22,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160
ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se
recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se
lavó con una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo.
Tras centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua,
se dializó durante 1 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin,
corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 81%.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Ejemplo 7.1
(g)
Se calentaron 5 g de oxo-HES
30/0,7 (MW = 30000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares del
ingrediente de acuerdo con el documento DE 196 28 705 A1) durante la
noche a 80ºC a vacío y a continuación se disolvieron en atmósfera
de nitrógeno en 28 ml de dimetil sulfóxido seco (Fluka,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se
añadieron 1,67 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar
a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a 175 ml de una
mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió
el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC. Se disolvió
el producto bruto en 40 ml de agua, se dializó durante 2 d frente a
agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó
el rendimiento del producto aislado.
Ejemplo 7.1
(h)
Se disolvieron 122 mg de ácido
4-formilbenzoico y 144 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 34 ml de N,N-dimetilformamida
(Calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 103 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D).
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 2,46 g de
aminoHES30/0,7 (sintetizado tal como se ha descrito en 1.7). Tras
agitar durante 22,5 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160
ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se
recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC y se
lavó con una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo.
Tras centrifugación, se disolvió el precipitado en 30 ml de agua,
se dializó durante 1 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin,
corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 87%.
Ejemplo 7.1
(i)
Se calentaron 6,09 g de oxo-HES
50/0,7 (MW = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH,
Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de
los ingredientes de acuerdo con el documento DE 196 28 705 A1)
durante la noche a 80ºC a vacío y a continuación se disolvieron en
atmósfera de nitrógeno en 32 ml de dimetil sulfóxido seco (Fluka,
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se
añadieron 1,22 ml de 1,4-diaminobutano. Tras agitar
a 40ºC durante 17 h, se añadió la mezcla de reacción a 150 ml de una
mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se recogió
el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC. Se lavó con
40 ml de agua de una mezcla 1:1 de acetona y etanol enfriada en
hielo, y se recogió mediante centrifugación. Se disolvió el
producto bruto en 80 ml de agua, se dializó durante 4 d frente a
agua (tubería de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio
Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento
del producto aislado fue del 82%.
Ejemplo 7.1
(j)
Se disolvieron 125 mg de ácido
4-formilbenzoico y 174 mg de
1-hidroxi-1H-benzotriazol
(ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
Taufkirchen, D) en 38 ml de N,N-dimetilformamida
(Calidad de síntesis de péptidos, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se
añadieron 155 \mul de N,N'-diisopropilcarbodiimida
(Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D).
Tras incubación a 21ºC durante 30 min, se añadieron 3,8 g de
aminoHES50/0,7 (sintetizado tal como se ha descrito en 1.9). Tras
agitar durante 19 h a 22ºC, se añadió la mezcla de reacción a 160 ml
de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada en hielo. Se
recogió el producto precipitado mediante centrifugación a 4ºC, se
volvió a disolver en 20 ml de N,N-dimetilformamida y
se precipitó con 80 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol (v/v)
enfriada en hielo, tal como se ha descrito anteriormente. Tras
centrifugación, se disolvió el precipitado en 50 ml de agua, se
dializó durante 2 d frente a agua (tubería de diálisis SnakeSkin,
corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se
liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 77%.
Ejemplo
7.2
Ejemplo 7.2
(a)
Se concentraron 33 ml de una solución de 0,454
mg/ml de hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D)
en acetato de sodio 10 mM, 50 mg/ml de sorbitol y Tween 80 al
0,004% a pH 4,0 mediante diafiltración a 0ºC hasta 4 ml con un
concentrador Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG,
Hannover, D) y se volvieron a diluir hasta 15 ml con un tampón de
acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0. Se repitió esta diafiltración dos
veces. La concentración final en la última etapa de diafiltración
fue de 3 mg/ml.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7.2
(b)
A 1,67 ml de una solución de
hG-GCSF tras intercambio del tampón en tampón de
acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (tal como se ha descrito en 7.2 (a)
anterior), se añadieron 1,67 ml de una solución del derivado de HES
y 1,67 ml de una solución 60 mM de cianoborohidruro de sodio, ambos
en el mismo tampón, y se incubó la solución durante 15,5 h a 4ºC.
Todas las soluciones se enfriaron a 0ºC antes de la mezcla.
Se emplearon las siguientes concentraciones
finales de HES.
- 39,4 mg/ml para los derivados de HES preparados de acuerdo con el ejemplo 7.1 (b) y 7.1 (d).
- 197 mg/ml para el derivado de HES preparado de acuerdo con el ejemplo 7.1 (j).
- 197 mg/ml de HES50/0,7 (MW = 50000 D, DS = 0,7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) como control de la reacción.
Se analizaron las mezclas de reacción mediante
electroforesis en gel (véase la figura 17).
Ejemplo 7.2
(c)
Se concentraron 20 ml de una solución de 0,454
mg/ml de hG-CSF (XM02, BioGeneriX AG, Mannheim, D)
en acetato de sodio 10 mM, 50 mg/ml de sorbitol y Tween 80 al
0,004% a pH 4,0 mediante diafiltración a 15ºC hasta 4 ml con un
concentrador Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG,
Hannover, D) y se volvieron a diluir hasta 15 ml con un tampón de
acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0. Se repitió esta diafiltración dos
veces. La concentración final en la última etapa de diafiltración
fue de 1,5 mg/ml.
Ejemplo 7.2
(d)
A 3,3 ml de una solución de
hG-CSF tras intercambio del tampón en tampón de
acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0 (tal como se ha descrito en el
ejemplo 7.2 (c) anterior), se añadieron 3,3 ml de una solución de
789 mg de derivado de HES y 3,3 ml de una solución 60 mM de
cianoborohidruro de sodio, ambos en el mismo tampón, y se incubó la
solución durante 30 h a 4ºC. Todas las soluciones se enfriaron a 0ºC
antes de la mezcla.
Después de 17 h, se retiraron las muestras para
el control de la reacción. Se analizaron las mezclas de reacción
mediante electroforesis en gel (véase la figura 18).
Ejemplo
7.3
(No de acuerdo con la
invención)
Ejemplo 7.3
(a)
Se disolvieron 400 mg de
oxo-HES10/0,7 (preparado por Supramol Parenteral
Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con
el documento DE 196 28 705 A1, el grado de oxidación de
oxo-HES fue del 95%) en 1 ml de DMF anhidro. A esta
solución, se añadieron 21 mg de carbonato de
N,N'-disuccinimidilo, y se agitó la mezcla durante
2 h a temperatura ambiente. La solución resultante tuvo una
concentración de HES reactivo de 40 por ciento en peso.
Una solución de G-CSF
(Strathmann Biotec AG, Hamburgo, D), que tenía una concentración de
aproximadamente 0,5 mg de G-CSF/ml, se concentró a
una concentración de 10 mg/ml mediante ultracentrifugación a un
corte de 100 kD usando una centrífuga con enfriamiento.
A 0,5 ml de esta solución concentrada de
G-CSF, se añadieron 180 \mul de una solución de
bicarbonato de sodio posteriormente, se añadieron gota a gota 3
porciones (de 100 \mul cada una) de la solución de HES reactivo a
la solución de proteína, hasta que después de aproximadamente 30
min., la reacción llegó a la finalización. De esta manera, la
relación molar total de HES reactivo:G-CSF fue de
aproximadamente 50:1. A continuación, se ajustó el pH de la mezcla
a 4,0 usando HCl 0,1 N.
Un análisis HPGPV (Cromatografía de Permeación
en Gel de Alto Rendimiento) proporcionó un rendimiento de más del
95%. No se podía detectar G-CSF sin reaccionar En la
Fig. 19 se muestra este resultado.
Ejemplo
7.4
Se conoce G-CSF por sus efectos
específicos sobre la proliferación, diferenciación, y activación de
las células hematopoyéticas del linaje de granulocitos neutrófilos.
Se ensayó la capacidad mitogénica de las variantes de
G-CSF usando células NFS-60 de ratón
(N. Shirafuji y col., Exp. Hematol. 1989, 17,
116-119). Las células crecieron en medio RPMI con
suero de ternera fetal al 10% (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D)
que contenía medio acondicionado WEHI-3B al
5-10% (DSMZ, Braunschweig, D; cultivado tal como se
describe por el DSMZ) como fuente de IL-3 exógena,
se cosecharon mediante centrifugación, se lavaron y se distribuyeron
en alícuotas a 100.000 células por pocillo en placas de 24
pocillos. Se dejaron adaptar las células durante 1 hora a 37ºC en
medio RPMI sin medios acondicionados WEHI-3B antes
de que se añadieran las muestras de factores de crecimiento de
G-CSF diluidas en los mismos medios. Se expusieron
las células NFS-60 a las variantes de
G-CSF purificadas (purificación de acuerdo con los
ejemplos 5.3, 5.4, cuantificación de la proteína de acuerdo con el
ejemplo 5.5 (a)):
- Neupogen®, Neulasta® ambos de Amgen,
- "Conjugado de HES-GCFS 10/0,4" preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "Conjugado de HES-GCFS 10/0,7" preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "Conjugado de HES-GCFS 30/0,4" preparado en el ejemplo 7.2 (d),
- "Conjugado de HES-GCFS 30/0,7" preparado en el ejemplo 7.2 (d),
- "Conjugado de HES-GCFS 50/0.7" preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "Conjugado de HES-GCFS 10/0,7 (Supramol)" preparado de acuerdo con el ejemplo 7.3 (a),
- "Incubación simulada"(= control de la reacción, 197 mg/ml de HES50/0,7, MW 50000D, DS 7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania),
durante 3 días a 37ºC y se contaron las células
electrónicamente (Contador Celular Casy TT, Schärfe System,
Reutlingen, D). Los resultados se resumieron en la Tabla 2 y en la
Figura 20. En todos los casos, las cantidades de proteína
proporcionadas en la Tabla 2 y en la Figura 20 representan el
contenido de G-CSF únicamente de los conjugados y
se basan en las concentraciones determinadas por GlucoThera. Como se
puede observar en la Figura 20, todas las diferentes variantes de
G-CSF (2,5-250 pg/ml) fueron capaces
de estimular un aumento en el número de células después de 3 días
en comparación con un medio que no contenía factores de crecimiento
añadidos. Todas las variantes alcanzaron el máximo nivel de
estimulación a una concentración de 250 pg/ml.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Ejemplo
7.5
Tras su llegada, las ratas [ratas macho CRL:CD®
(7 semanas de edad), Charles River Deutschland GmbH, Sanghofer Weg
7, D-97633 Sulzfeld)] se clasificaron aleatoriamente
en grupos de 5. Después de 7 días de aclimatación, se excluyeron
las ratas en mal estado y se sustituyeron por animales de reserva.
El peso de las ratas tras la llegada fue de 181-203
g.
Se administraron a cada grupo de cinco ratas
seleccionadas aleatoriamente 100 \mug de proteínas por kg de peso
corporal (velocidad de inyección 15 s/dosis, vehículo: 5 ml de
PBS/kg de peso corporal de las siguientes muestras de
G-CSF no conjugado o conjugado (purificadas de
acuerdo con los ejemplos 5.3, 5.4, cuantificación de proteínas de
acuerdo con el ejemplo 5.5 (a)):
- Neupogen®, Neulasta® ambos de Amgen,
- "Conjugado de HES-GCFS10/0,4" (10/0,4) preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "Conjugado de HES-GCFS10/0,7" (10/0,7) preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "Conjugado de HES-GCFS20/0,4" (30/0,4) preparado en el ejemplo 7.2 (d),
- "Conjugado de HES-GCFS30/0,7" (30/0,7) preparado en el ejemplo 7.2 (d),
- "Conjugado de HES-GCFS50/0,7" (50/0.7) preparado en el ejemplo 7.2 (b),
- "HES-GCFS 10/0,7 Supramol" (S 10/0,7) preparado de acuerdo con el ejemplo 7.3 (a),
- "Incubación simulada"(= control de la reacción, 197 mg/ml de HES50/0,7, MW 50000D, DS 7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania) y
- un vehículo control.
Se extrajeron muestras de sangre de todos los
animales de aproximadamente 200 \mul de EDTA de sangre completa
procedentes del plexo venoso retrobulbar bajo ligera sedación con
éter. En el día de ensayo -5 se extrajo sangre una vez por la
mañana de todos los animales tras ayuno durante la noche. En los
días de ensayo 1 a 8 se extrajo sangre dos veces diariamente a un
intervalo de 12 horas. La primera muestra de sangre en el día 1 se
extrajo antes de la administración del conjugado de
G-CSF/GCSF.
Se llevaron a cabo los recuentos de glóbulos
blancos (WBC) usando un Bayer ADVIA^{TM} 120 (Fernwald, Alemania).
En la figura 21 se muestran los resultados.
Claims (31)
1. Un procedimiento para preparar un conjugado
que comprende una proteína y un derivado polimérico, en el que el
polímero es un almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un
factor estimulador de colonias de granulocitos
(G-CSF), comprendiendo el procedimiento hacer
reaccionar al menos un grupo A funcional del derivado polimérico
con al menos un grupo Z funcional de la proteína y formar de dicha
forma un enlace covalente, en el que Z es un grupo amino, y en el
que A se selecciona entre el grupo que consiste en un grupo
aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, en el que el
procedimiento comprende además introducir A en el polímero para dar
un derivado polimérico haciendo reaccionar el polímero con un al
menos compuesto bifuncional, un grupo funcional que se hace
reaccionar con el polímero y al menos otro grupo funcional que es un
grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, o es un grupo
funcional que está químicamente modificado de manera adicional para
dar un grupo aldehído, un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y en el
que la reacción del derivado polimérico con la proteína es una
aminación reductora.
2. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 1 en el que el almidón hidroxialquílico es almidón
hidroxietílico.
3. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 2 en el que el almidón hidroxietílico tiene un peso
molecular de entre 2 a 200 kD, preferiblemente de entre 4 a 130 kD,
más preferiblemente de entre 4 a 70 kD.
4. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el
procedimiento hacer reaccionar adicionalmente el polímero con un
grupo M funcional de un al menos compuesto bifuncional para dar un
derivado polimérico, el al menos compuesto bifuncional que comprende
además al menos otro grupo Q funcional que es el grupo aldehído, el
grupo ceto o el grupo A hemiacetal.
5. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 4, en el que M comprende un grupo amino.
6. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo el
procedimiento hacer reaccionar adicionalmente el polímero con un
grupo M funcional de un al menos compuesto bifuncional para dar un
derivado polimérico, el al menos compuesto bifuncional comprende
además al menos otro grupo Q funcional que no es un grupo aldehído,
un grupo ceto o un grupo hemiacetal, comprendiendo el procedimiento
hacer reaccionar adicionalmente el grupo Q funcional con al menos un
compuesto adecuado para dar el derivado polimérico que comprende el
grupo aldehído, el grupo ceto o el grupo A hemiacetal.
7. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 5, en que M y Q comprenden un grupo amino.
8. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 6 o 7, en el que al menos un compuesto adecuado
comprende un grupo carboxilo y un grupo aldehído, un grupo ceto o un
grupo hemiacetal.
9. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 8, en el que al menos un compuesto adecuado es ácido
formilbenzoico o ácido
4-(4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico.
10. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 6 o 7, en el que M comprende un grupo amino y Q
comprende un grupo beta hidroxi amino.
11. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 10, en el que se hace reaccionar el polímero en su
extremo reductor oxidado con un grupo M funcional de un al menos
compuesto bifuncional.
12. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 10, que comprende oxidar adicionalmente el grupo
beta hidroxiamino para dar el grupo aldehído.
13. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 12, en el que se lleva a cabo la reacción de
oxidación usando un periodato.
14. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que se lleva a
cabo la aminación reductora en presencia de NaCNBH_{3}.
15. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que se lleva a
cabo la aminación reductora a un pH de 7 o inferior.
16. El procedimiento que se reivindica en la
reivindicación 15, en el que el pH es 6 o inferior.
17. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que se lleva a
cabo la aminación reductora a una temperatura de entre 0 a 25ºC.
18. El procedimiento que se reivindica en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que se lleva a
cabo la aminación reductora en un medio acuoso.
19. Un conjugado que es obtenible mediante un
procedimiento que se reivindica en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18.
20. Un conjugado que comprende una proteína y un
polímero o derivado del mismo, en el que el polímero es un almidón
hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador de
colonias de granulocitos (G-CSF), que tiene una
estructura de acuerdo con la fórmula
en las que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo,
un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo
hidroxialcarilo que tiene de entre 2 a 10 átomos de carbono,
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo,
y
en las que L es un resto hidrocarburo lineal,
ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende
opcionalmente al menos un heteroátomo, que tiene entre 1 a 60,
preferiblemente entre 1 a 40, más preferiblemente entre 1 a 20, más
preferiblemente entre 1 a 10, más preferiblemente entre 1 a 6, más
preferiblemente entre 1 a 2 átomos de carbono, y de manera
especialmente preferible 1 átomo de carbono, siendo L en particular
CH_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Un conjugado que comprende una proteína y un
polímero o un derivado del mismo, en el que el polímero es un
almidón hidroxietílico (HAS) y la proteína es un factor estimulador
de colonias de granulocitos (G-CSF), que tiene una
estructura de acuerdo con la fórmula
en la que R_{1}, R_{2} y
R_{3} son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo,
un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo
hidroxialcarilo que tiene de entre 2 a 10 átomos de carbono,
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más
preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo,
y
en la que L_{1} y L_{2} son
independientemente un resto hidrocarburo lineal, ramificado y/o
cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente al
menos un heteroátomo, que comprende un resto alquilo, arilo,
aralquil heteroalquilo, y/o heteroaralquilo, teniendo dicho resto
entre 1 a 60, preferiblemente entre 1 a 40, más preferiblemente
entre 1 a 20, más preferiblemente entre 1 a 10 átomos de carbono,
y
en la que D es un enlace, preferiblemente un
enlace covalente que se formó mediante un grupo F_{2} funcional
adecuado unido a L_{1} y un grupo F_{3} funcional adecuado unido
a L_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El conjugado que se reivindica en la
reivindicación 21, en el que L_{1} es -(CH_{2})n- con n =
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más
preferiblemente 2, 3, 4, y de manera especialmente preferible
4.
23. El conjugado que se reivindica en la
reivindicación 21 o 22 en el que L_{2} comprende un resto arilo
sustituido opcionalmente de manera adecuada, preferiblemente un
resto arilo que contiene 6 átomos de carbono, siendo L_{2} de
manera especialmente preferible C_{6}H_{4}.
24. El conjugado que se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 21 a 23, en el que F_{2} se selecciona
entre el grupo que consiste en
- -
- dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;
- -
- el grupo tio o los grupos hidroxilo;
- -
- hidrazida del ácido alquil sulfónico, hidrazida del ácido aril sulfónico;
- -
- 1,2-dioles;
- -
- 1,2-aminoalcoholes;
- -
- 1,2 amino-tioalcoholes;
- -
- azidas;
- -
- el grupo amino -NH_{2} o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad de estructura -NH- tales como grupos aminoalquílicos, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino;
- -
- el grupo hidroxilamino -O-NH_{2}-, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad de estructura -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino, o grupos hidroxilalcarilamino;
- -
- grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad de estructura NH-O-;
- -
- restos que tienen un grupo carbonilo, Q-C(=G)-M en el que G es O u S, y M es, por ejemplo,
- - -
- -OH o -SH;
- - -
- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo, o un grupo alcariloxilo;
- - -
- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio;
- - -
- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo alcarilcarboniloxilo;
- - -
- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad de estructura O-N en la que N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tales como compuestos de ariloxilo con un resto arilo sustituido tales como pentafluorofenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo;
en el que Q está ausente o es NH o un
heteroátomo tal como S u O;
- -
- -NH-NH_{2}, o -NH-NH-;
- -
- -NO_{2};
- -
- el grupo nitrilo
- -
- grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
- -
- el grupo carboxilo;
- -
- el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
- -
- grupos de haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato;
- -
- -C=C-H;
- -
- -(C=NH_{2}Cl)-OAlquilo
- -
- Grupos -(C=O)-CH_{2}-Hal en el que Hal es Cl, Br, o I;
- -
- -CH=CH-SO_{2}-;
- -
- un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
- -
- el grupo
- -
- el grupo
y en la que F_{3} es un grupo
funcional capaz de formar un enlace químico con F_{2} y se
selecciona preferiblemente entre el grupo anteriormente mencionado,
comprendiendo F_{2} preferiblemente el resto -NH-, que comprende
más preferiblemente un grupo amino, comprendiendo F_{3}
preferiblemente el resto -(C=G)-, más preferiblemente -(C=O)-, más
preferiblemente el resto -(C=G)-G-, aún más
preferiblemente -(C=O)-G-, y de manera especialmente
preferible -(C=O)-O, siendo D de manera
particularmente preferible un enlace
amida.
\vskip1.000000\baselineskip
25. El conjugado que se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 20 a 24, en el que el almidón
hidroxialquílico es almidón hidroxietílico.
26. El conjugado que se reivindica en la
reivindicación 25 en el que el almidón hidroxietílico tiene un peso
molecular de entre 2 a 200 kD, preferiblemente de entre 4 a 130 kD,
más preferiblemente de entre 4 a 70 kD.
27. Un conjugado que se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 19 a 26, para uso en un procedimiento para
el tratamiento del cuerpo humano o animal.
28. Una composición farmacéutica que comprende
en una cantidad terapéuticamente eficaz un conjugado que se
reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26.
29. Una composición farmacéutica que se
reivindica en la reivindicación 28, que comprende además al menos
un diluyente, potenciador o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
30. Un conjugado que se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones 19 a 26 para uso en un procedimiento de
tratamiento de un trastorno caracterizado por una función
hematopoyética o inmune reducida.
31. El conjugado que se reivindica en la
reivindicación 30, en el que el trastorno es un resultado de
quimioterapia, terapia de radiación, enfermedad infecciosa,
neutropenia crónica grave, o leucemia.
Applications Claiming Priority (6)
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