TWI357337B - Conjugates of hydroxyalkyl starch and g-csf - Google Patents

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九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關經基烧基澱粉與粒細胞群落刺激因子蛋白質 (G-CSF)之接合物’其巾此等接合物係⑽総級粉或經基烧基 殿粉之衍生物與蛋白質之間共舰結所形成。本發明亦有關一種製 造此等接合物之方法，及此等接合物之用途。 【先前技術】 通常已知當此等蛋白質與聚合分子偶合時，可改善蛋白質之安 定性及對抗此等蛋白質之免疫反應^侧㈣28·揭示經聚乙二醇 (PEG)修飾之生理活性蛋自質具有降低之免疫原性與抗原性，且在 血液循環中之哥命顯著高於未接合之蛋白質，亦即排空速度減慢。 G-CSF為一種21 kDa醣蛋白，其利用兩條鏈之間二硫鍵安定 化’且包含單一 〇_鏈結之碳水化合物部份基團。成熟之g_csf具 有174個胺基酸。動物體中之G_CSF係由骨髓基質細胞、巨噬細 胞與纖維母細胞合成。其主要功能為嗜中性白血球與其前體細胞之 生長與分化因子。然而，相關技藝亦已知GCSF可活化成熟嗜中 ) 生白血球。此外，其刺激多種其他造金性子細胞之生長/分化(與其 他造血生長因子產生增效作用），及促進内皮細胞增生與移動。臨 床上’ G-CSF係用於投藥治療嗜中性白血球缺乏症（由例如：成形 不全性貧血、脊髓發育不良、AIDS或化療所引起）。 W0 02/09766特別揭示生物相容性蛋白質_聚合物化合物，其 係由生物活性蛋白質與生物相容性聚合物衍生物接合製成。所使用 之生物相容性聚合物為高度反應性分支聚合物，所得之接合物在聚 合物衍生物與蛋白質之間包含一長鏈結物。作為生物相容性聚合物 者可述及如式(P-〇CH2CO-NH-CHR-CO-)n-L-Qk-A之聚合物，其中 P與Q為聚合殘基，k可為1或〇。卩與q則可述及聚乙二醇、聚 1357337 丙二醇、聚氧乙稀、聚三亞甲基二醇、聚乳酸與其衍生物、聚丙稀· 酸與其衍生物、聚胺基酸、聚乙稀醇、聚胺基甲酸醋、聚彻、聚 (L-離胺酸）、聚伸絲氧化物、聚丙稀酿胺與水溶性聚合物如： 葡聚糖或多藤。蛋白質中可特別述及與γ·干擾素、血液因子、 5細胞素’如：間白素、G-CSF、GM-CSF。W0 02/09766之實例中 僅揭示僅與干擾素及表皮生長因子偶合之單·、二與三聚乙二醇衍 生物，及人類生長激素。 WO 94/G1483揭示之生物相容性聚合物接合物係由無生物活 性聚合物或聚合物衍生物與醫藥上純的合成性親水性聚合物，經由 10特定型態之化學鍵共價結合形成。其中揭示天然聚合物與其衍生籲 物、多醣類如：玻尿酸、蛋白多醣如：硫酸軟骨素A、B與c、幾 丁質 '肝素、肝素硫酸鹽、葡聚糖如：環糊精、經乙基纖維素、纖 維素醚與澱粉、脂質如：三酸甘油酯與磷脂。合成性聚合物可述及 平均分子量約100至約100,000之聚乙烯與其衍生物。與聚合物或 15 聚合物衍生物鏈結之蛋白質可述及細胞素與生長因子，包括干擾 素、腫瘤壞死因子、間白素、群落刺激因子、生長因子如：成骨因 子萃物、表皮生長因子、轉形生長因子、丘小板衍化生長因子、酸 性纖維母細胞生長因子，等等。W0 94/01483之所有操作實例中，傷 使用聚乙二醇衍生物作為聚合物。 20 W〇 96/11953揭示N·末端經化學修飾之蛋白質化合物及其製 法。明確言之，其中說明由水溶性聚合物與G-CSF 末端偶合 形成之G-CSF組合物。WO 96/11953中亦揭示N-末端與水溶性聚 合物偶合之複合干擾素(consensus IFN)。雖然WO 96/11953中列出 許多種水聚合物(例如：乙二醇與丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、 25 葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基°比咯啶酮、聚-1,3-二噚茂烷、聚_1，3,6_ 三哼烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物）、 聚(N-乙烯基吡咯啶酮）聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/ • 6 - 環氧乙烷共聚物或聚氧乙基化多元醇），但wo 96/11953之操作實 例中僅述及PEG基化之G-CSF或複合IFN組合物》 US 6,555,660 B2揭示之多肽接合物包含具有G-CSF活性之多 肽，其胺基酸序列不同於人類G-CSF胺基酸序列之處在於至少一 個專一性引進及/或脫除之胺基酸殘基，其中該接合物包含連接非 多肽部份基團之基團，且另包含至少一個附接在多肽連接基團上之 非多肽部份基團《該非多肽部份基團可為聚合物，如：聚乙二醇或 寡醣。US 6,555,660 B2中明白指示peg為目前最佳之聚合物分 子，因為相較於多醣類如：葡聚糖，其僅具有幾個可以進行交聯之 反應性基團。 WO 97/30148係有關降低應變性之多肽接合物，其包含與兩個 或多個多肽分子偶合之聚合性載體分子。此等接合物最好為個人保 養用品市場上所使用組合物之一部份。該接合物製法係活化聚合性 載體分子，由兩個或多個多肽分子與活化之聚合性載體分子反應， 並封阻接合物上殘留之活性基團。w〇97/3〇148中列出多種聚合性 載體分子，包括如天然或合成均聚物之不同化合物群，如：多元醇、 多元胺、聚羧酸與包含至少兩個不同附接基團之雜聚物。其實例包 括星形PEGS、分支PEGs、聚乙騎、聚紐、聚乙·^比錢 _與聚-D，L·胺基酸。其中亦揭示葡聚糖，如：解基葡聚糖、纖 維素’如：羥乙基纖維素或羥丙基纖維素、脫乙醯殼多醣之水解物、 澱粉，如：經乙基澱粉或經丙基澱粉、肝畴、瘦脂糖、關華豆膠、 菊糖、支鏈澱粉、黃原膠、鹿角菜膠、果膠、藻酸，等等。其中亦 僅明確揭示幾種酵素作為多肽。 '

Baldwin, J.E.# A, Tetrahedron, vol. 27 (1981), pp. Π23 - 1726 中說明葡聚糖與私錢粉之化學修料，所形成祕取代之聚合 物可與血紅素反應’產生可溶性之與聚合物結合之血紅素。其已顯 不可與氧結合’細臟灌讀驗清楚證實，該絲合減合之血紅 1357337 素不適用為血液替代品。 > W0 99/49897說明之血紅素接合物係由多醣類如：葡聚糖或羥 乙基澱粉與血紅素之胺基反應形成。可使用經氧化反應打開醣環所 產生之醛基作為多醣之官能基。所揭示之較適用還原劑為曱硼烷二 5 甲基胺。此外’ W0 99/49897特別限於血紅素。 W0 03/074087係有關一種由蛋白質與澱粉所衍生經修飾之 多醣進行偶合之方法。蛋白質與多醣(羥基烷基澱粉)之間之結合作 用為共價鏈結，其係由羥基烷基澱粉分子之該末端醛基經化學修飾 後所得之末端醛基或官能基與蛋白質之官能基之間形成。其中所揭 10 示之蛋白質反應性基團為胺基、硫基與羧基基，且未述及蛋白質之鲁 越基。此外，雖然其中列出不同鏈結之多種可能性，包括不同官能 基，但操作實例中在理論上合適之不同連接分子及不同化學製程 上，僅提出兩種選擇：第一，使用氧化之經基乙基澱粉，採用乙基 二甲基胺基丙基碳化二亞胺(EDC)活化作用，直接與蛋白質偶合， 15 或採用未氧化之羥基丙基澱粉，直接與蛋白質偶合形成希夫氏鹼 (Schiffsbase)’其接著還原成各種胺。因此，W003/074087之操作 實例既未揭示利用蛋白質之硫基或羧基偶合之單一接合物，亦未說 明包含羥基丙基澱粉、蛋白質及一種或多種連接分子之接合物。此 外，其操作實例中亦未使用G-CSF分子。 琴 20 因此’本發明一項目的在於提供先前技藝中未曾說明之經基烧 基澱粉，較佳為羥基乙基澱粉，與G-CSF之接合物。 本發明另一項目的為提供一種製造此等接合物之方法。 【發明内容】 25 因此，本發明係有關一種製備包含蛋白質與聚合物或其衍生物 之接合物之方法，其中該聚合物為羥基烷基澱粉(HAS)，且該蛋白 質為粒細胞群落刺激因子(G-CSF) ’該方法包括由聚合物或其衍生 1357337 % 物中至少一個官能基A與蛋白質之至少一個官能基z反應，藉以 形成共價鏈結，其中Z為選自下列各物組成之群中之基團：胺基、 硫醇基、醛基與酮基，且 -其中，若Z為醛基或酮基時，A包含與Z形成該鏈結之胺基，或 5 _其中’若z為胺基時’A為選自下列各物組成之群中：反應性羧 基與醛基、酮基或半縮醛基， -其中’若A為醛基、酮基或半縮醛基時，該方法尚包括引進A 至聚合物中，形成聚合物衍生物 -由聚合物與一種至少雙官能基化合物反應，其中一個官能基 10 可與聚合物反應，其中至少另一個官能基為醛基、酮基或半 縮醛基，或為另經化學修飾可產生醛基、酮基或半縮醛基之 官能基，或 -氧化聚合物’形成至少一個’特定言之至少兩個酸:基，或 -其中，若A為反應性羧基時’該方法另包括引進a至聚合物 15 中，形成聚合物衍生物 -選擇性氧化聚合物之還原端，並活化所得之羧基，或 -由聚合物之未氧化還原端與碳酸二酯反應，或 -其中，若Z為硫醇基時，A包括 -馬來酿亞胺基或 20 -齒乙醯基 與Z形成該鏈結。 因此’本發明亦有關如上述方法製得之接合物。 G-CSF之製法可依化學合成法或可來自任何人類(參見例如： Burgess，A.W.等人1977,人類胎盤調理培養基對人類骨髓細胞 25 形成造丘群洛之刺激作用（Stimulation by human placental conditioned medium of hemopoietic colony formation by human marrow cells).Bl〇〇d 49 (1977)，573-583; Shah，R.G.等人 1977,人類單 -9- 1357337 核細胞與植物血凝集素刺激之淋巴球所產生群落刺激活性之判別 法（Characterization of colony-stimulating activity produced by human monocytes and phytohemagglutinin-stimulated lymphocytes).Blood 50 (1977)，811)或另一種哺乳動物來源，且可由人類胎盤、人類血 5 液或人類尿液等天然來源純化製得。此外，有許多上皮癌瘤、急性 脊髓白血病細胞與多種不同腫瘤細胞株(膀胱癌瘤、神經管胚細胞 瘤）均可表現此因子。 此外，G-CSF表現亦包括G-CSF變異體，其中一個或多個胺 基酸(例如：1至25個’較佳為1至10個，更佳為1至5個，最佳 10 為1或2個）已換成另一種胺基酸，且具有G-CSF活性(參見例如： Riedhaar-01son，J.F.等人1996,決定人類粒細胞群落刺激因子活. 性之殘基之判別法(Identification of residues critical to the activity of human granulocyte colony-stimulating factor). Biochemistry 35:9034-9041 1996;美國專利案 Nos. 5,581476; 5,214，132; 5,362,853; 15 4,904,584)。G-CSF活性之測定法說明於相關技藝中（G-CSF活性之 活體外測定法參見例如：Shirafuji，N.等人1989,採用鼠科骨體胚 細胞NFS-60細胞作為目標並於取自正常健康人與罹患傳染性與 血液疾病之患者之血清中估測其含量，作為人類粒細胞群落刺激因 子（hG-CSF)之新穎生物分析法（a new bioassay for human 20 granulocyte colony-stimulating factor (hG-CSF) using murine myeloblastic NFS-60 cells as targets and estimation of its levels in sera from normal healthy persons and patients with infectious and hematological disorders), Exp.Hematol. 1989, 17, 116-119; G-CSF 活 性之活體内測定法可參見例如：Tanaka，H.等人1991，與聚乙二醇 25 接合之重組體人類粒細胞群落刺激因子於大鼠中之藥物動力學 (Pharmacokinetics ofrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor conjugated to polyethylene glycol in rats), -10-

CancerResearch51，3710-3714，1991)。其他有關測定 G-CSF 活性之 方法之文獻為美國專利案No. 6,555,660; Nohynek，G.J·等人，1997， 糖基化與未糖基化重組體人類粒細胞群落刺激因子於嗜中性白血 球減少症及非嗜中性白血球減少症CD大鼠中之效力之比較 (Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and nonneutropenic CD rats). Cancer Chemother Pharmacol (1997) 39;259-266。 G-CSF為重組產生較佳。其包括採用基因組或cDNA選殖或 10 DNA合成法，由原核生物或真核生物宿主表現得到外因性DNA序 列。合適之原核生物宿主包括多種不同細菌，如：大腸桿菌(E c〇li)。 合適真核生物宿主包括酵母’如：釀酒酵母(S. cerevisiae)與哺乳動 物細胞如：中國倉鼠卵巢細胞與猴子細胞。 相關技藝已知蛋白質之重組生產法。通常，其包括以適當表現 15 載體轉感染宿主細胞，於可以產生蛋白質之條件下培養宿主細胞， 及自宿主細胞中純化蛋白質。有關詳細資料可參見例如：Souza， L.M.等人1986,人類粒細胞群落刺激因子:對正常及白血病骨髓巨 核細胞之影響（Recombinant human granulocyte colony-stimulating factors: effects on normal and leukemic myeloid cells). Science 1986 20 232:61-65，1986; Nagata，S.等人1986,人類粒細胞群落刺激因子之 cDNA 之分子選殖法與表現(Molecular cloningand and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factors). Nature 319:415-418, 1986; Komatsu, Y.等人1987，自人類巨噬細胞中選殖 粒細胞群落刺激因子cDNA及其於大腸桿菌中之表現(Cloning of 25 human granulocyte colony-stimulating factors cDNA from human macrophages and its expression in Escherichia coli), Jpn J Cancer Res. 1987 78(ll):1179-im。 -11 - 1357337 較佳具體實施例中，G-CSF具有人類成熟G-CSF之胺基酸序 列（參見例如：Nagata，S.等人1986，人類粒細胞群落刺激因子之 cDNA 之分子選殖法與表現(Molecular cloning and expression of cDNA for human granulocyte colony-stimulating factors). Nature 5 319:415-418, 1986) ’且可進一步在其胺基末端包含一曱硫胺酸，形 成175個胺基酸之蛋白質。此外，G-CSF可改含絲胺酸或蘇胺酸殘 基來替代甲硫胺酸》 用於本發明方法與根據本發明接合物中之G-CSF可包含一個 碳水化合物側鏈’利用Thr 133位置上0-鏈結之糖基化作用附接 10 G-CSF’ 亦即 G-CSF 經糖基化(V· Gervais 等人，Eur. J. Biochem. 1997， 247， 386-395) »碳水化合物側鍵之結構可為

NeuNAc(a2-3)Gal(pi-3)[NeuNAc(a2-6)]GalNAc 與(a2-3)Gal(pl-$^ (NeuNAc=N-乙醯基神經胺酸，GalNAc = N-乙醯基半乳糖胺）》 曾有人建議修飾G-CSF與其他多肽，相較於天然多肽，再引 15 進至少另一個碳水化合物鏈(美國專利案N〇.5,218,092)。依所使用 宿主而定’G-CSF表現產物可經哺乳動物或其他真核生物碳水化合 物糖基化。通常，當G-CSF於真核生物細胞中產生時，該蛋白質 係於轉譯後糖基化。結果，可由哺乳動物(尤指人類）、昆蟲或酵素 φ 細胞在生合成期間，使碳水化合物侧鏈附接在G-CSF上》 20 重組之人類G-CSF(rhG-CSF)通常用於治療多種型式之白血球 減少症。因此，可由名稱為弗格斯汀（filgrastim)(Gran®與 Neupogen®)、理格斯 ^(lenograstim) (Neutrogin®與 Granocyte®)及納 格斯汀(nartograstim)(Neu-up®)之商品取得rhG-CSF商業製劑。

Gran®與Neupogen®為非糖基化，且於重組之大腸桿菌細胞中產 25 生。Neutrogin®與Granocyte®為糖基化，且於重組之CH0細胞中產 生，Neu-up®為未糖基化，其具有5個胺基酸取代在完整rhG-CSF 之N-末端區，且於重組之大腸桿菌細胞中產生。 •12- 1357337 減太義* 难作為糖基化蛋白質。 根據本發财法與接合物中，可使用任何未糖基化g csf，如：

NeuP〇gen作為未糖基化G-CSF。 卜’ G_CSF可包含—f硫胺酸胺基酸殘基、 絲胺酸殘基或穌胺酸殘基。 本發明内容中，術語”經基燒基澱粉"(HAS)意指殿粉衍生物經 至少-個錄絲取代。本發明之㈣絲絲殿粉具有根據 之組成 10

OH Η (I) 15 其中殿粉分子之還原端以未氧化型表示，末端聽單位以縮搭型表 示，其係依例如：溶劑而定，可能與路型平衡。 20 術語”羥基烷基澱粉”用於本發明中並不限於式令所示末端碳 水化合物部份基團包含羥基烷基Ri、R：!、與/或心之化合物為了 簡便，式(I)化合物亦指其中在末端碳水化合物部份基圈與/或澱粉 分子HAS’令其餘部份之任何位置之至少一個羥基經羥基烷基、 R2或R3取代之化合物。 羥基烷基澱粉亦可能包含兩個或多個不同羥基烷基。 含在HAS中之至少一個羥基烷基可包含兩個或多個羥基。根 據較佳具體實施例，該含在HAS中之至少一個羥基烷基包含一個 經基。 "羥基烷基澱粉"一詞亦包括其中烷基經單_或多取代之衍生 物。本文中，較佳為烷基經齒素，尤指氟取代，或經芳基取代。此 -13· 25 外，羥基烷基之羥基可經酯化或醚化。 此外，亦可改用直鏈或分支之經取代或未經取代烯基替代烷 基。 經基烧基殿粉為澱粉之驗衍生物。除了該謎衍生物外本發明 中亦可使用其_粉衍生物。例如：適狀衍生物包含聽經基。 此等衍生物可為例如H12個碳原子之未經取代—元或二元叛 酸之何生物或其經取代之衍生物。尤其適用為含2·6個碳原子之未 經取代一元羧酸之衍生物，尤指乙酸之衍生物。本文中，以乙醯基 澱粉、丁基澱粉與丙基澱粉較佳。 此外’以含2·6個碳原子之未經取代二元羧酸之衍生物或較佳。 若為二元羧酸衍生物時，適用之衍生物為該二元羧酸之第二個 羧基亦酯化之衍生物。此外，二元羧酸之單烷基酯衍生物亦適用於 本發明。 經取代之一元或二元羧酸中，取代基最好與上述取代烷基之取 代基相同。 派粉之酯化技術係相關技藝已知(參見例如：Klemm D.等人述 於向級纖維素化學（Comprehensive Cellulose Chemistry) Vol. 2, 1998’ Whiley-VCH，Weinheim, New York,尤指第 4.4 章”纖維素之醋 化法(Esterification of Cellulose)，，(ISBN 3-527-29489-9)。 根據本發明較佳具體實施例，係使用根據式⑴之羥基烷基澱 粉。式(I)中，明確說明醣環，以HAS，代表之殘基共同代表較佳羥 基燒基殿粉分子。HAS'中包含之其他醣單位與明確說明之醣單位 相同或相異。 根據式(I)中說明之殘基Ri、R2與R3沒有明確限制。根據較佳 具體實施例’ Κ·1、Κ·2、與R3分別獨立為氫或各烧基中具有2至10 個碳原子之羥基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基β以氫 與具有2至10個碳原子之羥基烷基較佳。更佳為具有2至6個碳 原子之羥基烷基，更佳為具有2至4個碳原子之羥基烷基，甚至更 佳為具有2至4個碳原子。因此"經基烷基澱粉"較佳為包含羥基乙 基激粉、經基丙基澱粉與經基丁基澱粉’其中以經基乙基澱粉與經 基丙基澱粉特別佳，以羥基乙基澱粉最佳 烧基、芳基、芳烧基與/或炫芳基可為直鍵或分支鏈且經適當 取代。 因此，本發明亦有關一種上述方法，其中&、尺2與r3分別獨 立為氫或含1至6個碳原子之直鏈或分支羥基烷基。 因此’ R!、R2與R3較佳為經基己基、經基戊基、經基丁基、 羥基丙基，如：2-羥基丙基、3-羥基丙基、2-羥基異丙基、羥基乙 基，如：2-羥基乙基，以氫與2-羥基乙基尤其佳。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中Ri、r2 與R3分別獨立為氫或2-羥基乙基’一項具體實施例中，其中Rl、 R_2與.R3中至少一個為2-經基乙基尤其佳。 本發明所有具體實施例中，以羥基乙基澱粉(HES)最佳。 因此’本發明係有關一種如上述方法與接合物，其中該聚合物 為羥基乙基澱粉，且該聚合物衍生物為羥基乙基澱粉衍生物。 羥基乙基澱粉(HES)為天然支鏈澱粉之衍生物，可被體内α—殿 粉酶分解。HES為碳水化合物聚合物支鍵殿粉之經取代衍生物，其 在玉米澱粉中之含量濃度高達95重量％。HES具有有利之生物性 質’用為血液體積之置換劑，臨床上用於血液稀釋療法 (Sommermeyer 等人，1987, Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278;與 Weidler 等人，1991，Arzneim.- Forschung/Drug Res” 41,494-498) 〇 支鏈澱粉係由葡萄糖單位組成，其中主鏈中含有α-1，4-糖普 鍵’且分支位置出現ct-l，6-糖苷鍵。此分子之物化性質主要由糖苷 鍵決定。由於有α-1，4-糖苷鍵之存在，因此產生每一圈約6個葡萄 糖單體之螺旋結構。聚合物之物化性質及生化性質可經由取代法修 倚。利用驗性經基乙基化反應可引㈣基乙基。藉由反應條件可能 使未V·!取代之葡萄糖單體中各經基對經基乙基化反應具有不同反 應性。基於此事實，習此相關技藝之人士可以限制取代型態。 HES之主要特徵在於分子量分佈與取代度。取代度之說明有兩 種可能性： 1. 取代度可由經取代之葡萄糖單體相對於所有葡萄糖部份基團之 比例表示。 2. 取代度可由莫耳取代度表示，其中說明每個葡萄糖部份基團之羥 基乙基數。 本發明内容中，以DS表示之取代度係有關如上述之莫耳取代 HES溶液係呈聚勻散組合物，其中各分子之聚合度、分支位置 之數目與型態、及取代型態相異。因此，HES為不同分子量之化合 物之混合物。因此，特定之HES溶液係藉由統計方式得到之平均 分子量來決定》本文中，Mn係依分子數目之算術平均法計算。或 者’平均重量Mw(或MW)代表依HES質量而定之單位。 本發明内容中，羥基乙基澱粉之較佳平均分子量(平均重量）為 1至300 羥基乙基澱粉之較佳莫耳取代度可進一步為〇丨至 0.8 ’羥基乙基在C2:C6取代作用上之較佳比例範圍為2至20。 術語"平均分子量”用於本發明中係有關依據Sommermeyer等 人，1987, Krankenhauspharmazie，8(8)，271-278;與 Weidler 等人，1991

Arzneim.-Forschung/Drug Res.，41，494-498 決定之重量。 依據本發明較佳具體實施例，所使用羥基乙基澱粉之平均分子 量為1至300kD，更佳為2至200kD，更佳為4至130kD，更佳 為4至70 kD。 平均分子量約130 kD之HES實例為來自Fresenius公司之 Voluven®«Voluven®為人造膠體，其用於例如：醫療上置換體積用， 1357337 供治療與預防血容積減少症。Voluven®之特性為平均分子量為 130,000 +/- 20,00()D，莫耳取代度為 0.4，C2 : C6 比例約 9 : 1。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中羥基烷基 澱粉為平均分子量4至70 Kd之羥基乙基澱粉。 5 平均分子量之較佳範圍為例如：4至70 kD或10至70 kD或 12至70 kD或18至70 kD或50至70 kD或4至50 kD或10至50 kD或12至50 kD或18至50 kD或4至18 kD或10至18 kD或12 至18 kD或4至12 kD或10至12 kD或4至10 kD。 根據本發明特別佳具體實施例，所使用羥基乙基澱粉之平均分 10 子量範圍在4 kD以上及70 kD以下，如：約10 kD，或在9至10 kD 或10至11 kD或9至11 kD之範圍内，或約12kD，或在11至12 kD或12至13 kD或11至13 kD之範圍内，或約18 kD，或在約 17至18 kD或18至19kD或17至19kD之範圍内，或約50kD， 或在49至50 kD或50至51 kD或49至51 kD之範圍内。 15 若提及取代度(DS)時，DS較佳為至少0.1，更佳為至少0.2， 更佳為至少0.4。DS之較佳範圍為0.1至0.8，更佳為0.2至0.8， 更佳為0.3至0.8，甚至更佳為0.4至0.8，亦更佳為0.1至0.7，更 佳為0.2至0.7，更佳為0.3至0.7，更佳為0.4至0.7。特別佳之 DS 值為例如：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 或 0.8，以 0.2、 20 0_3、0.4、0.5、0.6、0.7 或 0.8 更佳，甚至以 0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7或0.8更佳，以0.4、0.5、0.6、0.7或0.8亦更佳，及以例如： 0.4與0.7特別佳。 羥基烷基澱粉(較佳為羥基乙基澱粉)之分子量與其取代度DS 之特別佳組合為例如：10 kD與0.4或10 kD與0.7或12 kD與0.4 25 或 12 kD 與 0.7 或 18 kD 與 0.4 或 18 kD 與 0.7 或 50kD 與 0.4 或 50 kD 與 0.7 0 本發明另一項較佳具體實施例中，羥基乙基澱粉(所使用及包 -17- 1357337 含在本文所說明接合物中者)之分子量為約20 kD至約130 kD(亦即 約 40 kD、約 50 kD、約 60 kD、約 70 kD、約 80 kD、約 90 kD、 約100kD、約110kD、約120kD、約130kD)，較佳平均分子量為 約30 kD至約100 kD，更佳為約40至約70 kD，取代度為0.4至 10 15 20 0.8，更佳為0.5至0.8。 本文中術語"約30kD"咸了解係有關平均分子量在25 kD至34 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量26、27、28、29、31、32、 33或34 kD之澱粉。 本文中術語"約40kD”咸了解係有關平均分子量在35 kD至44 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量36、37、38、39、41、42、 43或44 kD之澱粉。 本文中術語"約50kD"咸了解係有關平均分子量在45 kD至54 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量46、47、48、49、51、52、 53或54 kD之澱粉。 本文中術語”約60kD"咸了解係有關平均分子量在55 kD至64 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量56、57、58、59、61、62、 63或64 kD之澱粉。 本文中術語"約70kD"咸了解係有關平均分子量在65 kD至74 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量66、67、68、69、71、72、 73或74 kD之澱粉。 本文中術語”約80kD”咸了解係有關平均分子量在75. kD至84 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量76、77、78、79、81、82、 83或84 kD之澱粉。 本文中術語”約90kD"咸了解係有關平均分子量在85 kD至94 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量86、87、88、89、91、92、 93或94 kD之澱粉。 本文中術語”約100kD”咸了解係有關平均分子量在95 kD至

-18- 25 1357337 104 kD之範圍内’亦即亦包括平均分子量96、97、98、99、101、 102、103 或 104 kD 之澱粉。 本文中術語"約110kD"咸了解係有關平均分子量在1〇5奶至 U4 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量1〇6 ' 1〇7、1〇8、1〇9、 111、112、113 或 114 kD 之澱粉。 本文中術語"約120kD"咸了解係有關平均分子量在ιΐ5忉至 124 kD之範_，亦即亦包括平均分子量116、ιΐ7、ιι8、ιι9、 121、122、123 或 124 kD 之澱粉。 ίο 本文中術語"約HOkD"咸了解係有關平均分子量在125印至 134 kD之範圍内，亦即亦包括平均分子量i26、i27、i28、129、 131、132、133 或 134 kD 之澱粉。 因此上述具體實施例包括平均分子量約3〇奶，取代度為〇4 或0 5或G.6或G.7或G.8，較佳為〇 6、Q 7或Q 8之經基乙基殿粉 (與本文所朗包含«乙基澱粉之接合物及本文所㈣使用經基 乙基澱粉之方法）。 因此上述具體實施例中亦包含平均分子量約4〇尬，取代度為 "0,6 °·7 °·8 ? 4 °·6' °·7 ^ 所朗包含減乙基澱粉之接合物及本文所說明使用 輕基乙基;殿粉之方法）。 20 因此’上述實關亦包含平均分子制5咖，取代度為 搬粉^太或G 6或G 7或G.8 ’較佳為G.6、G.7或G.8之幾基乙基 經基乙其所說明包含錄乙級粉之接合物及本文所說明使用 羥基乙基歲粉之方法）。 0 4或因〇此5 ^述具體實補純含平均分子量約齡D，取代度為 .或〇.6或0.7或0.8’較佳為.0.6、〇·7哎〇 某兵 基乙基接合物== -19- 25 因此’上述具體實施例亦包含平均分子量約70 kD，取代度為 0 4或0.5或〇·6或〇.7或0.8，較佳為0.6、0.7或0.8之羥基乙基 搬粉(與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明使用 經基乙基澱粉之方法）。 因此’上述具體實施例亦亦包含平均分子量約8〇kD，取代度 為〇.4或0.5或0.6或〇.7或0.8，較佳為0.6、0.7或0.8之羥基乙 基澱粉(與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明使 用羥基乙基澱粉之方法）。 因此，上述具體實施例亦亦包含平均分子量約9〇kD，取代度 為〇.4或0.5或〇.6或〇.7或〇.8，較佳為〇.6、〇·7或〇.8之羥基乙 基澱粉(與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明使 用經基乙基澱粉之方法）。 因此，上述具體實施例亦亦包含平均分子量約100 kD，取代 度為0.4或〇·5或〇.6或〇.7或〇.8，較佳為〇 6、〇 7或〇 8之羥基 乙基澱粉(與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明 使用羥基乙基澱粉之方法）。 因此，上述具體實施例亦亦包含平均分子量約110 kD，取代 度為〇·4或0 5或0.6或〇.7或0.8，較佳為0.6、0·7或0.8之羥基 乙基澱粉(與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明 使用羥基乙基澱粉之方法）。 因此，上述具體實施例亦包含平均分子量約120 kD，取代度 為〇·4或〇·5或G.6或G.7或G.8，較佳為g.6、G.7或G.8之經基乙 基澱粕（與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明使 用羥基乙基澱粉之方法）。 因此’上述具體實施例亦包含平均分子量約130 kD，取代度 為0.4或G.5或G.6或G.7或G.8，較佳為g.6、G.7或G.8之經基乙 基殿氣（與本文所說明包含羥基乙基澱粉之接合物及本文所說明使 1357337 5 10 15 20 用羥基乙基澱粉之方法）。 平均分子量約130kD之HES實例為取代度為〇2至〇8，如： 〇_2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 或 0.8 之 HES，較佳為 0.4 至 〇 7，如： 0.4、0_5、0.6 或 0.7 之 HES。 若提及ere：6取代比例時，該取代比例較佳為2至2〇之範圍 内，更佳為2至15之範圍内，甚至更佳為3至12之範圍内。 根據本發明另一項具體實施例，亦可使用平均分子量不同與/ 或取代度不同與/或C2 : Q取代比例不同之羥基乙基澱粉之混合 物。因此，所使用之羥基乙基澱粉之混合物可具有不同平均分子量 與不同取代度與不同C2 : C：6取代比例，或具有不同平均分子量與 不同取代度與相同或約相同之C2: C6取代比例，或具有不同平均 分子量與相同或約相同之取代度與不同C：2: Q取代比例，或具有 相同或約相同之平均分子量與不同取代度與不同c2: Q取代比 例，或具有不同平均分子量與相同或約相同之取代度與相同或約相 同之C2 . c0取代比例，或具有相同或約相同之平均分子量與不同 取代度與相同或.約相同之C2 ·· C6取代比例，或具有相同或約相同 之平均分子量與相同或約相同之取代度與不同C：2 : c6取代比例， 或具有約相同之平均分子量與約相同之取代度與約相同之^ : 取代比例。 根據本發明不同接合物與/或不同方法，可使用不同經基貌基 澱粉，較佳為不同羥基乙基澱粉與/或不同羥基烷基澱粉混合物， 較佳為不同羥基乙基澱粉混合物。 根據本發明一項具體實施例，蛋白質之官能基Z為醛基或酮 基。因此，本發明係有關一種如上述方法與接合物，其令蛋白質之 g此基Z為酸基或酮基。 雖然蛋白質令之搭或基之位置一般沒有限制，但根據本發明 較佳具體實施例，搭或綱基係位於蛋白質之碳水化合物側鍵。因

•21· 25 此’本具體實施例採用糖基化蛋白質β 了使用任何糖基化G-CSF，如：Granocyte®作為糖基化蛋白質。 本發明内容中’術語"碳水化合物側鏈•，係指羥基醛或羥基酮及 八化學t 飾型（參見 R〇mpp Chemielexikon，Thierne Verlag Stuttgart,

Germany,第9版1990, Vol. 9, p. 2281_2285與其中摘錄之文獻）。此 外，其亦指天然碳水化合物部份基團（如；半乳糖、N乙醯基神經 胺酸與N-乙醯基半乳糖胺），等等之衍生物。若所使用G_CSF之突 變體已N-糖基化時，其碳水化合物部份基團可為甘露糖。 甚至更佳具體實施例中，醛基或酮基為碳水化合物側鏈之半乳 糖殘基之一部份。此半乳糖殘基可經由脫除末端唾液酸而可與包含 在聚合物或聚合物衍生物中之官能基A反應，然後依下文所述進 行氧化。 另一項較佳具體實施例中，由包含官能基A之聚合物或聚合 物衍生物連結碳水化合物侧鏈之唾液酸殘基，較佳為碳水化合物側 鏈之末端唾液酸殘基。 末端碳水化合物部份基團之氧化反應可依化學或酵素方式進 行。 ’ 多肽之碳水化合物部份基圏之化學氧化反應係相關技藝已 知，且包括使用過碘酸鹽之處理法(Cham〇w等人1992,）刖吡

Chem” 267,15916-15922)。 ’ 化學氧化法巾，制上可以氧化錄末端或非末私任何碳水 化合物部份基團。然而，藉由選擇溫和反應條件，最好可氧化碳水 化合物側鏈之末端唾液酸，產生醛基或酮基。 根據本發明一項具體實施例，該溫和反應條件係有關蛋白質與 合適過碘酸鹽水溶液之反應，較佳過碘酸鹽濃度範圍在1至刈 mM，更佳為i至25mM，尤其佳為i至1〇福，如：約i碰， 較佳反應溫度為0至40°C，尤其佳為❶至2iec，如：約〇。〇，較佳 1357337 反應時間為5分鐘至5小時，更佳為1〇分鐘至2小時，尤其佳為 10分鐘至1小時，如：約1小時。過碘酸鹽：蛋質 比例為以⑽至⑴，更佳為1:50至1:5，如：質約^佳i莫耳 因此，本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其中在蛋白質 5與聚合物或聚合物衍生物反應之前，先由糖基化蛋白質與過蛾酸鹽 :谷液反應’產生在氧化之碳水化合物側鍵上具有路基或酮基之蛋白 質。 或者，碳水化合物側鏈可經酵素氧化。各碳水化合物側鏈之氧 化酵素係相關技藝已知，例如：若為半乳糖時，其酵素為半乳糖氧 10 化酶。若多肽已於可使唾液酸附接在碳水化合物鍵上之細胞中，例 如：哺乳動物細胞，或經基因改造可使唾液酸附接在碳水化合物鍵 上之細胞中產生時’若需氧化末端半乳糖部份基團，則最終必需(部 份或完全)脫除末端唾液酸。脫除唾液酸之化學或酵素方法係相關 技藝已知(Chaplin與Kennedy(編輯)，觸，碳水化合物分析·操作 15 法(Carbohydrate Analysis: a practical approach)，尤指第 5 章， Montreuill, Glycoproteins, p. 175-177; IRL Press Practical approach series (ISBN 0-947946-44-3))。 根據本發明另一項較佳具體實施例，醛基或酮基可位於蛋白質 之N末端’且可進行適當氧化反應。尤其當包含經基之胺基酸位 2〇於蛋白質之N·末端時，如：蘇胺酸或絲胺酸，該N_末端胺基酸之 氧化反應即可形成該酮基或醛基。蘇胺酸為人類衍生之g_csf之 N-末端胺基酸《另一個N_末端絲胺酸或蘇胺酸可依分子生物法引 進任何展現似G-CSF活性之蛋白質中。此蛋白質或表現人類胺基 酸序列之蛋白質可由原核生物或真核生物細胞，如：細菌、哺乳動 25 物、昆蟲或酵母細胞之表現產生，且可經或不經糖基化。可採用任 何合宜之方法作為合適N•末端胺基酸之化學氧化法，以使用過碘 酸鹽之氧化法較佳。 、 1357337 根據本發明另一項具體實施例，該溫和反應條件係有關蛋白質· 與合適之過碘酸鹽水溶液反應，其較佳過碘酸鹽濃度範圍為丨至 5〇mM ’更佳為1至25 mM，尤其佳為1至10mM，如：約1 ， 較佳反應溫度為〇至40°C，尤其佳為〇至2l°C，如：約〇。〇，較佳 5 反應時間為5分鐘至5小時，更佳為10分鐘至2小時，尤其佳為 10分鐘至1小時，如：約1小時。過碘酸鹽：蛋白質之較佳莫耳 比例為1 : 200至1 : 1 ’更佳為丨：5〇至丨：5，如·約15 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中醛基或酮 基位於蛋白質之碳水化合物側鏈與/或蛋白質之N_末端。 1〇 因此’真核生物細胞所產生蛋白質之寡糖型態已於轉譯後糖基 ® 化，此點與衍生自人類之蛋白質不同。此外，許多糖基化蛋白質^ 沒有所需數量之末端唾液酸殘基來遮蔽其他碳水化合物部份基 團，如：半乳糖殘基。然而，彼等其他碳水化合物部份基團，如： 半乳糖殘基若未受遮蔽時，則可能會出現一些缺點，如：以該蛋白 15 醫藥之用途中’該蛋白質於血針之半衰期可能會縮短。現 已驚人地發現，藉由提供一種由羥基烷基澱粉聚合物，較佳為羥基 乙基澱粉聚合物，利用例如：下文中說明之肟鏈結共價連接蛋白質 之碳水化合物侧鏈中碳水化合物部份基團，其可直接連接或利用至 少一鏈結化合物連接(如：一個或兩個鏈結化合物），所形成之蛋白 2〇 f接合物，可以克服至少一項上述缺點。因此，咸信藉由經基院基 澱粉聚合物或其衍生物，較佳為羥基乙基澱粉聚合物或其衍生物， 與糖基化蛋白質之至少一條碳水化合物側鏈偶合時，可彌補碳水化 合物側鏈所缺乏之合適末端碳水化合物殘基。根據本發明另一方 面，提供一種由羥基烷基澱粉聚合物或其衍生物，較佳為羥基乙基 25 職聚合物或其衍生物，與如上述氧化之碳水化合物部份基團偶合 之接合物時’不僅可翻上賴點，而且所提供之蛋白質接合物在 所需應用領域上，具有比天然蛋白質更佳之特性。因此，根據本發 •24- 5 ㈣具有彌補’甚至增效之效果。該蛋白質甚至可 需合糾水化合㈣錄團上不具有所 質。此== 絲(如：唾液酸殘基)數量之人類蛋白 時’叫供_魏細粉聚合物或其触物，較 其衍生物與如上述氧化之碳水化合物料“ 。成各接°物不僅可克服及彌補人造蛋白質之缺點，而且可 改善天然蛋白質之特性。經基 ° 衍生物胁《基5^料基乙基祕)或其 偶人之官_ 之碳水化合物部份基團中搭基或· 10

用^= 及下文中所揭示之官能基Α。此—般觀念不僅適 物=I=_CSF，制上料驗财缺乏躲乏末端碳水化合 聋基之糖基化蛋白質。其中特別述及促紅血球生成素卿）、干 擾素_FN陶、ATIII、因子νπ、因子聰、因子ιχ、^抗姨 蛋白 S#(AIAT)、htPA，或 GM-CSF。 15

因此’本發明亦有關崎基錄澱粉，較佳祕基乙基;殿粉， 或其衍生物於_蛋白質中天然或轉譯後_之碳水化合物部份 基團所缺乏之末财水化合物，較佳為唾紐殘基上之用途， 其係共價偶合澱粉或其衍生物與具有至少一個酮基或醛基之蛋白 質中至少一個氧化之碳水化合物部份基圏。 20 因此’本發明亦有關一種在蛋白質中天然或轉譯後附接之碳水 化合物部份基團上彌補所缺乏之末端碳水化合物殘基，較佳為唾液 酸殘基之方法，其係共價偶合羥基烷基澱粉，較佳為羥基乙基澱粉 或其衍生物與具有至少一個酮基或醛基之蛋白質之至少一個氧化 之碳水化合物部份基團，以利用肟鏈結較佳。 此外，本發明亦有關一種由羥基烷基澱粉，較佳為羥基乙基澱 粉，或其衍生物，與蛋白質之至少一個氧化之碳水化合物部份基團 共價鏈結所形成之接合物，該蛋白質係自天然來源中單離或於真核 生物細胞’如：哺乳動物、昆蟲或酵母細胞中表現產生，該碳水化 • 25- 25 合物部份基圏具有至少一個酮基或醛基，其中該接合物在所需領域 之用途中’較佳為作為醫藥之用途中，具有與各未修飾之蛋白質相 同或更佳之特性。 若蛋白質之官能基Z為醛基或酮基時，聚合物或其衍生物之官 能基A包含如s_NH_之胺基。 因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中可與聚合 物中可視需要氧化之還原端反應之官能基A包含結構式-NH-之胺 基。 根據本發明較佳具體實施例，此官能基A為具有結構式R，-NH-之基圏，其中R，為氫或烷基、環烷基、芳基、芳烷基、芳基環烷基、 烷芳基或環烷基芳基殘基，其中環烷基、芳基、芳烷基、芳基環烷 基、烷芳基或環烷基芳基殘基可直接連接NH基團，或根據另一 項具體實施例，可利用氧橋連基連接NH基團。烷基、環烷基、 芳基、芳烷基、芳基環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基可經適當取 代。較佳取代基可述及鹵素，如：F、C1或尤其佳殘基R,為氫、 烷基與烷氧基，甚至更佳為氫與未經取代之烷基與烷氧基。 烧基與烧氧基中，以具有1、2、3、4、5或6個碳原子者較佳。 更佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基與異 丙氧基。尤其佳為甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別佳為甲基或 曱氧基。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中R，為氫 或甲基或曱氧基。 根據本發明另一項較佳具體實施例，官能基A具有結構式 R'-NH-R"-，其中R”較佳為包含結構單位_NH與/或結構單位 -(C=G)-，其中G為〇或s，與/或結構單位_s〇2_。 根據更佳具體實施例，官能基R"係選自下列各物組成之群中： 1357337

與 G 其中若G出現兩次時，其分別獨立為Ο或S。 因此，包含胺基-NH2之較佳官能基A為例如：

其中G為Ο或S，且若出現兩次時，其分別獨立為Ο或S，且R' 為甲基。 包含胺基之尤其佳官能基A為胺基氧基 20 ,0、 Η2Ν' γ〇、/ R〆 Ν Η 以η2ν-ο-特別佳，及醯肼基 Η /Ν\/ η2ν γ

G -27- 1357337 ，其中G較佳為〇» 因此，本發明亦有關一種如上述方法，其中蛋白質之官能基ζ 為醛基或酮基，官能基Α為胺基氧基或醯肼基。根據本發明之尤 其佳具體實施例，A為胺基氧基。 5 因此’本發明亦有關一種如上述接合物’其中蛋白質之官能基 Z為藤基或酮基，官能基A為胺基氧基或酿肼基。根據本發明之尤 其佳具體實施例，A為胺基氧基。 當聚合物或聚合物衍生物之胺基氧基與蛋白質之醛基或酮基 反應時，形成肟鏈結。 10 因此，本發明亦有關一種如上述接合物，其中蛋白質與聚合物 或聚合物衍生物之間之共價鏈結為蛋白質之官能基z(該官能基Z 為醛基或酮基)與聚合物或聚合物衍生物之官能基A(該官能基A為 胺基氧基)反應所形成之將鏈結。 當聚合物或聚合物衍生物之醯肼基與蛋白質之醛基或酮基反 15 應時，形成腙鏈結。 因此，本發明亦有關一種如上述接合物，其中蛋白質與聚合物 或其聚合物衍生物之間共價鏈結為蛋白質之官能基Z(該官能基Z 為醛基或酮基)與聚合物或聚合物衍生物之官能基A(該官能基A為 醯肼基)反應所形成之腙鏈結。 20 為了引進官能基A至聚合物中，形成包含官能基A之聚合物 衍生物之過程沒有明確限制》 根據本發明較佳具體實施例，將官能基A引進聚合物中之方 法為由聚合物與至少雙官能基化合物反應，其中一個官能基可與聚 合物中至少一個官能基反應，雙官能基化合物中至少另一個官能基 25 為官能基A或可經化學修飾形成官能基A之基團。 根據另一項較佳具體實施例，由聚合物與至少雙官能基化合物 之可視需要氧化之還原端反應。 • 28- 若聚合物與其未氧化還原端反應時，該聚合物之組成較佳為 (I) 式(ι)中包括未氧化還原端之路型。 10 has

OH Η 若聚合物與其氧化之還原端反應時，該聚合物較佳為具有如 Ula) 、 15

Η (Ha) 20 與/或如式(lib)之組成

COOH Η (Ub) 進行 聚合物（較佳為羥基乙基澱粉)之還原端之氧化反應可依據可 產生具有上述結構式(Ila)與/或(Hb)之化合物之各方法或組合方法 原端 雖然氧化法可根據所有可產生羥基烷基澱粉之氧化之還 •29· 25 1357337 之〇適方法或方法群進行，但較佳為利用驗性破溶液.進行，其說明 於例如.DE 196 28 705 Α卜其揭示内容(實例Α，第9欄，第6至 24行）已以引用之方式併入本文中。 可使用可與Μ基絲殿粉之可視需要氧化之還原端形成化學 5鏈結之各g能基作為可與聚合物之可視需要氧化之還原端反應之 至少雙官能基化合物之官能基。 根據本發明較佳具體實施例，此官能基包含化學結構式_NH_。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中至少雙官 能基化合物之官能基(該官能基可肖聚合物之可視需要氧化之還原 10 端反應）包含結構式-NH-。 根據本發明較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物之此官能 基為具有結構式R’-ΝΗ-之基團，其中R，為氫或烧基、環烧基、芳 基、芳院基'芳基環炫基'院芳基或環烷基芳基殘基，其中環烷基、 芳基、芳絲、絲環絲、貌絲或觀基芳基絲可直接連接 I5 NH基團，或根據另一項具體實施例，可利用氧橋連基連接NR基 團。該烧基、環烧基、芳基、芳烧基、芳基環烧基、貌芳基或環烷 基芳基殘基可經適當取代。較佳取代取基可述及為齒素，如：F、

Cl或Br。尤其佳殘基r，為氫、烷基與烷氧基，甚至更佳為氫與未 經取代之烷基與烷氧基。 20 烧基與炫氧基中’以含丨、2、3、4、5或6個碳原子者較佳。 更佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基與異 丙氧基。尤其佳為甲基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別佳為甲基或 甲氧基。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中R，為氮 25 或曱基或曱氧基。 根據本發明另一項較佳具體實施例，至少雙官能基化合物之官 能基如結構式R，-NH-R"-，其中R"較佳為包含結構單位…小與/或 1357337 結構單位-(C=G)·，其中G為〇或8，與/或結構單位_s〇2_e根據更 佳具體實施例，官能基R"係選自下列各物組成之群中：

Η 與 其中若G出現兩次時，其分別獨立為〇或s。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中至少雙官 月&基化合物之官能基(該官能基可與聚合物之可視需要氧化之還原 端反應)係選自下列各物組成之群中： 15 20

其中G為Ο或S，且若出現兩次，其分別獨立為〇或S，R，為曱基。 根據本發明甚至更佳具體實施例，其中至少雙官能基化合物之 官能基(該官能基可與聚合物之可視需要氧化之還原端反應，且包 含胺基)為胺基氧基 h2n〆

R〆。 • 31 - 25 以H2N-〇-特別佳，或為酿肼基 Η，Νγ"

G 其中G為〇較佳。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中蛋白質之 官能基Ζ為醛基或酮基，且該至少雙官能基化合物之官能基(該官 能基可與聚合物之可視需要氧化之還原端反應）為胺基氧基或醯肼 基’較佳為胺基氧基。 因此’本發明亦有關一種如上述接合物，其中蛋白質之官能基. Ζ為搭基或酮基，且該至少雙官能基化合物之官能基(該官能基可 與聚合物之可視需要氧化之還原端反應）為胺基氧基或醯肼基，較 佳為胺基氧基。 根據本發明另一項較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物係 與聚合物之未氧化之還原端反應。 根據本發明另一項較佳具體實施例，該可與聚合物之可視需要 氧化之還原端反應之至少雙官能基化合物包含官能基Α。 該至少雙官能基化合物可先與聚合物反應，產生之聚合物衍生 物繼續利用官能基A與與蛋白質反應。亦可能由該至少雙官能基 化合物經由官能基A，先與蛋白質反應，產生之蛋白質衍生物繼續 與聚合物經由含在蛋白質衍生物中至少雙官能基化合物殘基之至 少一個官能基反應。 根據本發明較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物係先與聚 合物反應。 因此，本發明係有關一種如上述方法與接合物，該方法尚包括 由聚合物之未氧化之還原端先與包含可與聚合物之未氧化還原端 反應之官能基與基團A之至少雙官能基鏈接化合物反應，然後由 1357337 包含A之聚合物衍生物與包含2之蛋白質反應。 了旬用任何合適之間隔基分隔與聚合物反應之至少雙官能基 鏈結化合物之官能基與可與蛋白質之官能基Z反應之至少雙官能 基鏈結化合物之官能基A。其中間隔基可為可視需要經取代之直 鏈、分支與/或環狀烴殘基。通常，烴殘基具有至多60個碳原子， 較佳為至多4〇個，更佳為至多20個，更佳為至多1〇個，更佳為 至多6個，尤其佳為至多4個。若出現雜原子時，該分隔基通常包 含1至20個雜原子，較佳為i至8個，更佳為i至6個，更佳為 1至4個，尤其佳為1至2個》以Ο作為雜原子較佳。烴殘基可包 10 15 20 含具有例如：5至7個碳原子之可視需要分支之絲鏈或芳基或環 烧基，或為芳絲、絲基，其中絲部份可為直雜/或環狀燒 基。根據本發明甚至更佳具體實施例，官能基係利用具有4個碳原 子之直鏈烴分隔。本發明另-項較佳具體實施射，官能基係利用 具有4個碳原子與至少—個，較佳為—個雜原子，特職為一個氧 原子之直鏈煙分隔。 2其他齡具體實關，該至少雙以基鏈聽合 =基=化合物。因此’本發明亦有關一種製備如上述接合物之 ^少雙官能基鍵結化合物為均雙官能基化合物。 I = ’該均雙讀基鍵結化 為包含兩個絲氧基H齡以個胺基氧基r :=肼基H2_-(C=G).，以胺基氣基顧_〇-與： H2N-NH-(〇〇)·較佳，以胺基氧基關心尤其佳 物中含==ΓΝΙΗ<>0)，有可能均雙官能基化合 煙殘基分=為之 ，一 6個.尤其佳為更二至多 殘基具有i至4個碳原子，如：卜2、3 原子。更佳為該烴 J或4個。最佳為該烴殘基 33- 25 1357337 具有4個碳原子 。因此， 以如下式均雙官能基化合物較佳。

根據本發明甚至更佳具體實關，雙官能基鏈結化合物為甲酿

—处述本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中該至少 雙S能基魏化合物為均雙官能基化合物且包含兩_基氧基。因 此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中該至少雙官能基 鍵結化合物為均雙官能基化合物且包含兩個胺基氧基_-〇二土 15 如上述，聚合物較佳為在其還原端未氧化之前先與雙官能基鏈 結化合物反應。因此，由包含兩個胺基氧基Η2Ν_〇_之較佳均雙官 能基化合物與聚合物反應，產生包含肟鏈結之聚合物衍生物。又 因此，由於蛋白質之官能基Ζ為最好可與聚合物衍生物之胺基 氧基反應之醛或酮基，因此本發明亦有關如上述接合物，該接合物 20 包含聚合物與蛋白質，分別利用肟或環狀胺基醛鏈結共價連接鍵結 化合物。 包含兩個胺基氧基Η2Ν-0-之所有可能均雙宫能基化合物中， 較佳雙官能基化合物中之兩個胺基氧基利用具有1至60個碳原子 之烴殘基分隔’較佳為1至40個，更佳為1至20個，更佳為i至 25 1〇個，更佳為1至6個，尤其佳為1至4個碳原子，更佳為該煙 殘基具有1至4個碳原子’如：1、2、3或4個碳原子。最佳為 該烴殘基具有4個碳原子。甚至更佳為該烴殘基具有至少—個雜原 -34- 丄357337 子，更佳為一個雜原子，最佳為一個 〇-[2-(2-胺基氡-乙氧基)_乙基]經基胺尤其佳。。以如下式化合物 °-NH2 該接合物具有如下式 10 因此，本發明係有關一種如上述接合物 之組成

蛋白質

^較佳為㈣。特純讀紅級粉⑽如 之經基乙基_，或平均^ 灵.7之祕乙基練，或平均分子量約12比且ds約〇 4之經 ^平均分子量㈣kD且Ds約q 7之減“殿粉， ^H 8⑴且抓約〇.4之雜乙基搬粉，或平均分子 ΓΓ二且DS約〇,7之經基乙基殿粉’或平均分子量約⑽ 且DS約0.4之錄乙基澱粉，或平均分子量約細且⑽約〇.7 -35- 25 1357337 之羥基乙基澱粉。 聚物之未氧化還原端與鏈結化合物（尤指該键結化合物為包 含兩個胺基氣基之均雙官能基鏈結化合物)反應時，最好在 水性系統中進行。 5 術水性系統"用於本發明中意指該溶劑或溶劑混合物中之 含水量範圍為占所涉及溶劑重量之至少10%重量比，較佳為至少 50%重量比，更佳為至少8〇%重量比，甚至更佳為至少9〇%重量 比，或至鬲100%重量比。較佳反應介質為水。 根據另一項具體實施例’至少使用另一種可溶解HAS，較佳 10 為HES之溶劑。此等溶劑實例為例如：DMF、二甲基乙醯胺或 DMSO。 反應期間所採用之溫度沒有明確限制，只要反應產生所需聚合 物衍生物即可。 方聚合物與包含兩個胺基氧基h2n-o-之均雙官能基鏈結化合 15 物’較佳為0·[2·(2·胺基氧-乙氧基)-乙基]羥基胺反應時，該溫度之 較佳範圍為0至45〇C，更佳範圍為4至30.〇c，尤其佳之範圍為15 至 25°C。 聚合物與包含兩個胺基氧基Η2Ν-0-之均雙官能基鏈結化合 物’較佳為0'[2_(2·胺基氧-乙氧基)-乙基]羥基胺之反應時間可依需 20 要調整，通常在1小時至7天之範圍内，較佳為1小時至3天之範 圍内，更佳為2小時至48小時。 聚合物與包含兩個胺基氧基η2ν·ο之均雙官能基鏈結化合 物，較佳為0-[2-(2-胺基氧-乙氧基)_乙基]羥基胺之反應ρΙί值可依 需要調整’如：反應物之化學性質。較佳pH值範圍為4 5至9 5， 25 更佳範圍為4.5至6.5。 上述反應條件之明確實例為例如：反應溫度約25°C，及pH約 5.5 ° • 36 - 1357337 反應混合物之合適pH值可藉由添加至少—種合適緩衝劑來調 整。較佳缓衝劑可述及乙酸倾衝劑、贿鹽__缓衝劍。 -旦形成包含聚合物及與之連接之雙官能基鍵結化合物之聚 合物衍生物時，即可採用至少-種合適方法，自反應混合物中單離 5出。若必要時，該聚合物衍生物可先沉凝後，再採用至少-種合適 方法單離。 若先使聚合物衍生物沉搬時，其可能作法為例如：由反應混合 物與至少-種不肢反射溶劑聽航合物之溶舰溶劑混合 物，於合適溫度下接觸。根據本發明特別佳具體實施例，其中最好 10使用水性介質’較佳為以水作為溶劑’由反應混合物與2_丙醇，於 較佳溫度範圍為_20至+5(TC下接觸，尤其佳範圍為·2〇至坑。 聚合物衍生物之單離法可採用包括__個或多個步驟之合適製 程進行。根據本發明較佳具體實施例，先自反應混合物或反應混合 物與例如：2-丙醇水性混合物之混合物卜依合適方法如：離心 15法分離聚合物触物。第二步驟t，分離之聚合物衍生物可 進一步處理，如：透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析法、 逆向層析法、HPLC、MPLC、凝膠過滤法與/或冷;東乾燥法之後處 理法。根據本發明甚至更佳具體實施例，先透析所分離之聚合物衍 生物，較佳為相對於水進行，然後冷凍乾燥，直到反應產物之溶劑 2〇 含量夠低足以符合產物所需要求為止。冷凍乾燥法可在20至35°C 之溫度下進行，較佳為2〇至3〇0C。 所單離之聚合物衍生物再進一步經由官能基A，與蛋白質之官 能基Z反應’其中Z為醛基或酮基。當A為胺基氧基η2Ν-0-，可 在聚合物衍生物與蛋白質之間產生肟鏈結之尤其佳之例子中，反應 25 最好在水性介質中，較佳為水中 ，較佳溫度範圍為0至40°C下， 更佳為4至25°C，尤其佳為15至25°C。反應介質之較佳PH範圍 為4至10，更佳範圍為5至9，尤其佳範圍為5至7。較佳反應時 -37- 1357337 至48小時’尤其佳範圍為4 間範圍為1至72小時，更佳範圍為 至24小時。 5 接合物可進一步處理，如： 離子交換層析法、逆向層析法 冷凍乾燥法等後處理法。 透析法、離心過濾法或加壓過濾法、 ' HPLC、MPLC、凝膠過濾法與/或 根據本發明另-項具體實施例，蛋白質之官能基z為胺基。 因此，本發明係有關一種如上述方法與接合物，其中蛋白質之官能 基Z為胺基》 10 根據本發明另一項較佳具體實施例，與作為官能基2之胺基反 應之官能基A為反應性羧基。因此，本發明亦有關一種如上述方 法與接合物，其中官能基Z為胺基，聚合物或聚合物衍生物之官能 基A為反應性羧基。 根據本發明第一項較佳具體實施例，反應性叛基係藉由選擇性 氧化聚合物之還原端而引進聚合物中。 因此，要引進反應性羧基之聚合物如下結構式(Ila) 15

(Ha)

與/或如式(lib)較佳：

(Hb) 25 1357337 5 如式(i)聚合物(較佳為窥基乙基激粉)之還原端之氧化反應

(I) 可根據可，生上述結構式(IIa)與/或⑽)之各方法或組合方法進行。 10 雖然氧化时依據所有可產趣基絲之氧化之還原端 之合適方法或方法群進行，但其最好採用例如：Μ ΐ96 Μ 7〇5 Μ 中說明之驗性雜液法進行，其揭示内容(實例A，第9攔，第6 至24行）已以引用之方式併入本文中。 將反應性縣引進其還原此選擇性氧化 可採用所材财法騎。 *。T之万去 15 氧化之聚合物可呈其本身或呈鹽型，如用 與/或鉀鹽較佳。 蜀-便用，以鈉 根據本發明較佳方法，其還原端經選擇性 化之還原端與至少一種醇反應，較佳為與至少 二物係於氧 20 較佳為25。(：之ΡΚΑ值範圍在6至12酸性醇，更*醇反應。亦 性醇之較佳分子量範圍為80至5〇〇克/莫耳 為7至11。酸 莫耳，尤其佳為100至200克/莫耳。、 佳為9〇至300克/ 合適之酸性醇為所有具有酸性質子且可與氧 形成各反應性聚合物自旨之H.0.R4，其較佳為如下^聚合物反應 HAS’

OR Ά -39. 25 1357337 亦更佳為如下式 10 15 20

較佳醇類為N-經基_酿亞胺，如：N•經基破魏亞胺或續 基-N-包緑賴亞胺，經適當取代之_，如：刺基苯紛、鄰， 對-二碗基苯紛、鄰，鄰，二硝基料、三氯_，如：2,4,6三氣苯 驗或2,4,5·三氯絲、三氟苯盼，如：2,4,6•三氟料或2,4,5_三氣 苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如：羥基苯并三唑。尤 其佳為N-羥基琥珀醯亞胺’以N-羥基琥珀醯亞胺與磺基—N•羥基琥 珀醯亞胺尤其佳。所有醇類均可單獨使用或呈其兩種或多種之組合 使用。本發明内容中，亦可能使用可藉由例如：添加碳酸之二酯而 釋出醇之化合物。

因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其還原端經選 择性氧化之聚合物係經由氧化之聚合物與酸性醇，較佳為與队經 基琥珀醯亞胺與/或磺基·Ν_羥基琥珀醯亞胺反應而活化。 根據本發明另一項較佳具體實施例，其還原端經選擇性氧化之 聚合物係經由氧化之還原端與至少一種碳酸二酯碳酸二自旨 Rb-〇-(C=〇)-〇-rc(其中化與Rc可相同或相異)反應。較佳者，此 方法產生如下式反應性聚合物

-40- 25 1357337 其中HAS'為HES'較佳。 合適之碳酸酯化合物可使用其醇成分別為下列者：N_經基玻始 醒亞胺’如：N-經基琥珀酿亞胺或磺基-N-經基破珀酸亞胺，經適 當取代之苯酚，如：對硝基苯酚、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰,·二確 5 基苯酚、三氣苯酚，如：2,4,6-三氯苯酚或2,4,5-三氣笨紛、三氟苯 紛，如：2,4,6-三氟苯紛或2,4,5-三氟苯酌·、五氯苯紛、五敗苯盼， 或羥基唑類’如：羥基苯并三唑。尤其佳為Ν，Ν·_二琥珀酿亞胺基 兔酸0s與崎基·Ν，Ν -一號ίά酿亞胺基碳酸@旨，以ν，Ν’-二號拍酿亞胺 基碳酸酯尤其佳。 10 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原端經 鲁 選擇性氧化之聚合物係經由氧化之聚合物與ν，ν'-二號轴酿亞胺基 碳酸酯反應而活化。 酸性醇係與氧化之聚合物或氧化之聚合物之鹽，依酸性醇：聚 合物之較佳莫耳比例5:1至50:1，更佳為8:1至20:1，於較佳反應 15 溫度2至40<>(：下，更佳為10至30Ό下，尤其佳為15至25°c下反 應。較佳反應時間範圍為1至10小時，更佳為2至5小時，更佳 為2至4小時，特定言之2至3小時。 碳酸二酯化合物係與氧化之聚合物或氧化之聚合物之鹽，依二 酯化合物：聚合物之較佳莫耳比例1:1至3:1，更佳為1:1至丨5:1反 · 20 應。較佳反應時間範圍為〇·1至12小時，更佳為0.2至ό小時，更 佳為0.5至2小時，特定言之〇 75至丨25小時。 根據本發明較佳具體實施例，氧化之聚合物與酸性醇與/或碳 酸-醋之反應係於至少-種非質子性溶劑中進行，特別佳為於水含 量不超過0.5%重量比，較佳為不超過〇 1%重量比之無水非質子性 25 '谷劑中進行。合適溶劑特別指二甲亞砜(DMSO)、Ν-甲基吡咯啶酮、 二甲基乙酿胺_Α)、二甲基甲酿_明與其中兩種或多種之混 口物。較佳反應溫度範圍為2至4〇〇c，更佳為1〇至3〇它。 氧化之聚合物與至少一種酸性醇之反應中至少另使用一種活 •41· 1357337 化劑。 合適活化劑特別指羰基二咪唑、碳化二亞胺如：二異丙基碳化 二亞胺(DIC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)、丨_乙基_3 (3二甲基胺基 丙基)碳化二亞胺(EDC)，以二環己基碳化二亞胺^^❽與丨乙基 -3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)尤其佳。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由還原端 已氧化之聚合物與酸性醇，於另一種活化劑之存在下反應，產生反 應性聚合物醋。 根據本發明尤其佳具體實施例，氧化之聚合物與碳酸二酯與/ ίο 或酸性醇之反應係在低鹼活性下進行，其可藉由添加反應混合物至鲁 水中來決定，其中水對反應混合物之體積比為1〇:1。添加之前，基 本上不包含緩衝劑之水於25°C下之pH值為7。添加反應混合物後 測定pH值時，反應混合物所得之鹼活性數值較佳為不超過9 〇， 更佳為不超過8.0，尤其佳為不超過7.5 » 15 根據本發明較佳具體實施例，氧化之聚合物與N_羥基琥珀醯 亞胺之反應係於無水DMA中，在沒有水之存在下，使用EDC選 擇性反應’產生如下式聚合物N-羥基琥珀醯亞胺酯 20

其中HAS%HES’更佳》 令人驚訝的是，此反應並未因EDC與HES之OH基團反應而 產生副產物，且意外地壓制了 EDC與氧化聚合物所形成〇-醯基異 脲發生重組反應所形成之各N-醯基脲。 根據本發明另一項較佳具體實施例，氧化之聚合物與Ν,Ν'-二 -42- 丄妁7337 琥珀酿亞胺基碳酸酯係無水DMF中，在沒有活化劑之存在下反 應’選擇性產生如下式N-羥基琥珀醯亞胺酯

其中HAS’為HES·較佳》 ίο 上述反應性聚合物最好進一步與蛋白質之至少一個胺基反 鲁 應，產生醯胺鏈結。根據本發明較佳具體實施例，由反應性聚合物 與蛋白質中一個胺基反應。 因此’本發明係有關最好具有如下組成之接合物 15

20 其中醯胺鏈結之N原子衍生自蛋白質之胺基，其中HAS，為HES， 時更佳，羥基乙基澱粉較佳為平均分子量約1〇kD，DS約〇 4之羥 基乙基澱粉’或平均分子量約10 kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉， 或平均分子量約12 kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量 約12kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約18kD，DS 約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約18 kD，DS約〇 7之羥基 乙基澱粉，或平均分子量約50 kD，DS約〇·4之羥基乙基澱粉，或 平均分子量約50kD，DS約0·7之羥基乙基殿粉。 反應性聚合物與蛋白質之反應可組合反應性聚合物製法之反 1357337 應混合物’亦即不單離反應性聚合物下，其中包含至少10%重量 比’更佳為至少30%，亦更佳為至少50%重量比反應性聚合物，與 蛋白質之水溶液進行。蛋白質之較佳水溶液包含〇 〇5至1〇，更佳 為0.5至5，尤其佳為〇.5至2%重量比蛋白質，較佳PH為5.0至 5 9.0，更佳為6.0至9.0，尤其佳為7.5至8.5。 根據本發明，亦可能純化反應性聚合物，其係在至少一個，較 佳為多重沉澱法中，使用至少一種合適沉澱劑進行，如：無水乙醇、 異丙醇與/或丙酮，產生包含至少1〇，更佳為至少3〇，亦更佳為至 少50%重量比反應性聚合物之固體。 10 純化之反應性聚合物可加至蛋白質之水溶液中。亦可能添加純 參 化之反應性聚合物溶液至蛋白質之水溶液中。 根據本發明較佳具體實施例，反應性聚合物與蛋白質產生醯胺 鏈結之反應過程係於2至40°C之溫度下，更佳為5至35〇c，尤其 佳為10至30°C下，較佳為pH 7.0至9.0，較佳為7 5至9 〇，尤^ 15 佳為7.5至8.5下’較佳反應時間0.1至12小時下，更佳為〇5至 5小時，更佳為0.5至3小時，亦更佳為0.5至72小時，尤其佳為 0.5至1小時下，反應性聚合物酯：蛋白質之莫耳比例較佳為 至70:1，更佳為5:1至50:1，尤其佳為10:1至5〇:1下進行^ ’ 根據本發明另一項具體實施例’還原端經選擇性氧化之聚合物 書 20 係於其氧化之還原端與唑化物反應，如：羰基二味唾或幾基二^并 咪唑’產生具有反應性羧基之聚合物。若為羰基二咪唾時，可產生 如下式反應性聚合物衍生物

• 44- 25 1357337 其中HAS為HES較佳。由聚合物與峻化物反應產生之味啥化物可 優先與蛋白質之胺基反應，產生酿胺鏈結。若蛋白質出現羥基時， 亦可反應產生酯鏈結，或與蛋白質之硫基反應產生硫酯鏈結，或若 蛋白質出現羧基時’亦可能產生·(〇=〇)-〇-(〇=0)-鏈結。 5 根據本發明另一項具體實施例，*有由聚合物之選擇性氧化之 還原端與上述一種化合物，最好與至少一種酸性醇類與/或至少一 種碳酸二酯化合物反應產生之反應性羧基A之聚合物可利用至少 一種鏈結化合物連接蛋白質之官能基若使用鏈結化合物時，該 化合物為至少雙官能基化合物，其中具有至少一個可與聚合物衍生 10 物之官能基A反應之官能基匕，及至少一個可與蛋白質之官能基z 反應之官能基F2或經化學修飾可與蛋白質之官能基z反應之官能 基Fa。該化學修飾法可為例如：由官能基&與另一種鏈結化合物 之官能基F3反應’或氧化或還原合適官能基F2。若使用至少一種 鏈結化合物時，該反應不限於蛋白質之胺基，但依鏈結化合物或鏈 15 結化合物群中官能基之化學性質而定，其可用於與蛋白質之各合適 官能基形成鏈結，如：羧基、反應性羧基、醛基、酮基、硫基、胺 基或羥基。若使用兩種鍵結化合物時，所使用之第一種鏈結化合物 具有至少一個可與聚合物之反應性羧基A反應之官能基Fl，如： 胺基、硫基、經基或叛基《此外，該第一種鍵結化合物具有至少另 20 一個可與第二鏈結化合物之至少一個官能基F3反應之官能基ρ2。 官能基F2可述及下列官能基： -C-C-雙鍵或C-C-參鍵或芳香系C-C·鍵； _硫基或羥基； -烷基磺酸醯肼、芳基磺酸醯肼； 25 -丨，2-二元醇； -1,2-胺基醇類； • 1，2-胺基-硫醇類； -疊氮化物； -45- 1357337 -胺基-NH2或包含結構單位_NH-之胺基衍生物，如：胺基烷基、 胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺基； -羥基胺基-0-ΝΗ2,或包含結構單位-0-NH-之羥基胺基之衍生 物，如：羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基 5 炫芳基胺基； -烧氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 包含結構單位-NH-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其tG為0或S，M為例如： --OH 或-SH ; 10 _燒氧基、芳基氧基、芳烧基氧基或院芳基氧基； 鲁 -烧基硫基、芳基硫基、芳炫基硫基或燒芳基硫基； -烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 氧基； •活化之酯，如：具有如：N-羥基琥珀醯亞胺之亞胺結構或具有 15 結構單位0-N ’其中N為雜芳基化合物中一部份之經基胺之 酯’或其中G=0且Q不存在，如：具有經取代芳基殘基，如： 五氟苯基、對确基苯基或三氣苯基之芳基氧化合物之酉旨； 其中Q不存在或為NH或雜原子，如：S或Ο ; -NH-NH2 或-NH-NH- ; · 20 N〇2， -腈基； _幾基，如：路基或酬基； -羧基； --N=C=0基團或-N=C=S基團； 25 -乙烯基鹵化物基團’如：乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三 氟曱磺酸根； --OC-H ; --(c=nh2ci)-o 烷基 -46- 1357337 1357337 --(C=0)-CH2-Hal 基團，其中 Hal 為 α、ΒΓ 或 j ; -ch=ch-so2-； •包含結構式-s-s-之二硫化物基團； -如下式基團 —N -如下式基團

o2n 其中f3為可與上述-個基團形成化學鏈結之基團， 上述基圑中。此外，第二鍵結化合物具有至少—個可與蛋白 能基z反應之官能基，其為例如：胺基、硫基、緩基、反應性叛基s、 酸基、酮基、或經基。若使用一麵結化合物共價連接聚合物與 白質時，該聚合物可與鍵結化合物反應，所得聚合物衍生物再與蛋 白質反應’或蛋白質可與鍵結化合物反應，所得蛋白質衍生物再* · 聚合物反應》若使用兩種鏈結化合物L1與l2時，可由聚合物^ L1反應，所得聚合物衍生物再與L2反應，並由所得聚合物ς生物 與蛋白質反應，錢蛋"與L2反應，所得蛋* t衍生物再與L1 反應，所得蛋白f衍生㈣絲合献應。，村㈣合減u反 應，由蛋白質與L2反應’再㈣合物衍生物與蛋白f衍生物反應。 此外’亦可由U肖L2反應，所得化合物再絲合物反應，所得 聚合物衍生物再與蛋白質反應。 此外，亦可由U與L2反應，所得化合物再與蛋白質反應， -47- 1357337 所得蛋白質衍生物再與聚合物反應。 根據本發明第二項較佳具體實施例係有關反應性羧基引進聚 合物之反應’反應性羧基係引進聚合物中未氧化之還原端，其係由 聚合物之至少一個羥基與碳酸二酯反應。 5 因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中A為反 應性羧基且其中A係引進聚合物之未氧化還原端，其係由聚合物 中至少一個羥基與至少一種碳酸二酯Rb_〇_(c=〇)_〇_Rc反應，其中 Rb與Rc可相同或相異。 根據本發明另一項具體實施例，由還原端未氧化之聚合物中至 10 少一個羥基與唑化物反應如：羰基二咪唑、羰基二_(1，2,4-三唑）或 籲 羰基二苯并咪唑，產生具有反應性羧基之聚合物。 適用之碳酸二酯化合物可使用其醇成分分別獨立為下列基團 者：N-羥基琥珀醯亞胺，如：N—羥基琥珀醯亞胺或磺基_N_羥基琥 珀醯亞胺，經適當取代之苯酚，如：對硝基苯酚、鄰，對_二硝基苯 15 酌、鄰，鄰二硝基苯酚、三氯苯酚，如：2,4,6-三氯苯酚或2,4,5- 三氣苯酚、三氟苯酚，如：2,4,6-三氟苯酚或2,4,5-三氟苯酚、五氯 苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如：羥基苯并三唑。 尤其佳為對稱性碳酸二酯化合物，因此5^與Rc相同。碳酸二 酉曰之醇成分較佳為選自下列各物組成之群中：N_經基玻珀醯亞胺、參 20 磺酸化N-羥基琥珀醯亞胺、N-羥基苯并三唑與硝基_與鹵素_取代之 苯酚。其中以硝基苯酚、二硝基苯酚、三氯苯酚、三氟苯酚、五氣 笨酚與五氟苯酚較佳，尤其佳為N，N，_二琥珀醯亞胺基碳酸酯與磺 基-N，N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯，以N，N，·二琥珀醯亞胺基碳酸酯尤 其佳。 25 因此，本發明亦有關一種羥基烷基澱粉衍生物與其製造方法， 較佳為羥基乙基澱粉衍生物，其中該澱粉中至少一個羥基，較佳為 至少兩個經基已與碳酸二酯化合物反應，產生各反應性酯。 根據本發明較佳具體實施例，還原端未氧化之聚合物與至少一 •48· 1357337 種碳酸二酯化合物之反應係於2至40°C之溫度下，更佳為至 30°C ’尤指15至25°c下，較佳反應時間0.5至5小時，更佳為i 至3小時’尤其佳為2至3小時下進行。 5 碳酸二酯與/或唑化物，較佳為碳酸二酯化合物：聚合物之莫 耳比例依聚合物之取代度而定，其係指為與碳酸二酯化合物反應之 羥基數與未反應之聚合物中羥基數之相對比例。 10 根據本發明一項較佳具體實施例，碳酸二酯化合物：無水葡萄 糖單位之莫耳比例範圍為1:2至ι:ι〇〇〇，更佳為1:3至ι:ι〇〇，尤 其佳為1:10至1:50，所產生之取代度範圍為〇 5至〇 〇(n，較佳為 0.33至0.01，尤其佳為（U至〇.〇2。取代度係由uv光譜決定。 根據本發明較佳具體實施例，還原端未氧化之聚合物與碳酸二 酯之反應係於至少一種非質子性溶劑中進行，特別佳為於水含量不 超過0.5%重量比，較佳為不超過〇1%重量比之無水非質子性溶劑 中進行。合適溶劑特別指二甲亞砜(DMS〇)、N_甲基吡咯啶酮、二 15 甲基乙酿胺(DMA)、二甲基甲酿胺(DMF)與其中兩種或多種之混合 物。 20 一因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原端未 氧化之聚合物中至少一個羥基與碳酸二酯反應產生反應性酯基團 A之過程係於無水非質子性極性溶劑中進行，該溶劑較佳為二 乙醯胺、二曱基甲醯胺或其混合物。 ’、一 土 L 3至少一個反應性酯基，較佳為至少兩個反應性酯基之反』 性聚合物與蛋白質反應產生至少—麵胺鏈結，較佳為至少兩個g 組合反應性聚合物製法之反應混合物’亦即不單离 反應性聚。物下，其中包含至少5%重量比，更佳為至少⑴，㈣ 佳為至少15%重量比反應性聚合物，與蛋白質之水溶液進行 質之較佳水溶液包含⑽5至1G，更佳為Q 5至5

2%重量比蛋白質，較佳PH為7.0至9，更佳為7.5至9，H 7.5至8.5。 &丹住石 •49· 25 1357337 根據本發明’亦可能純化反應性聚合物，其係在至少一個較 佳為多重沉澱法中，使用至少一種合適沉澱劑進行，如：無水乙醇、 異丙醇與/或丙酮，產生包含至少2〇，更佳為至少5〇，亦更佳為至 少80%重量比反應性聚合物之固體。 純化之反應性聚合物可加至蛋白質之水溶液中。亦可能添加純 化之反應性聚合物溶液至蛋白質之水溶液中。 此j«” 10 根據本發明較佳具體實施例，反應性聚合物與蛋白質產生至+ 一個，較佳為至少二個醯胺鏈結之過程係於2至4〇。〇之溫产下( 更佳為5至机’尤其佳為1〇至贼下，較佳pH 7 〇至皿^下較 佳為7.5至9.0，尤其佳為7.5至8_5下，較佳反應時間〇 $至$小 時下，更佳為0.5至3小時，尤其佳為0.5至i小時下，反應㈣ 合物酿：蛋白質之莫耳比例較佳為1:1至7〇:1，更佳為Η至制， 尤其佳為10:1至50:1下進行。 15 根據本發明較佳具體實施例，所得到寡-或聚蛋白質_取代之聚 合物中之蛋白質分子係利用醯胺鏈結連接聚合物。 本發明内容中所採用蛋白質分子之取代度(PDS)係指連接蛋白 質之葡萄糖部份基SJ相對於HAS，較佳為HES巾所含所 部份基團之比例。 20 0.2。 PDS範圍為0.001至卜較佳為〇 〇〇5至〇 5，更佳為_5至 根據本發明另一項具體實施例，具有由聚合物之至少-個經基 ^上述-種化合物’最好與至少—種碳酸二醋反應產生之反應性ς 土 ^之聚合物可利用至少一種鏈結化合物連接蛋白質之官能基 z。錢用鏈結化合物時，該化合物為至少雙官能基化合物，其$ 具f至少一個可與聚合物衍生物之官能基A反應之官能基^，及 至少—個可與蛋白質之官能基Z反應之官能基F2或經化學修都可 與^ f質之官錄Z反應之官能基F2。該化學修騎可為例如： 由官能基F2與ϋ鏈結化合物之官能基f3反應，或氧化或還原 •50· 25 1357337 合適官能基f2。若使用至少-種鏈結化合物時該反應不限於蛋· 白質之胺基’但依鏈結化合物或鏈結化合物群中官能基之化學性質 而定’其可用於與蛋白質之各合適官能基形成鍵結，如：減、反 應性叛基、藤基、酮基'硫基、胺基或經基。若使用兩種键結化合 5 物時’所使用之第一種鍵結化合物具有至少一個可斑聚合物之反應 性羧基A反應之官能基Fl，如：胺基、硫基、羥基或羧基。此外‘， 該第一種鏈結化合物具有至少另一個可與第二鏈結化合物之至少 一個g此基F3反應之官能基Fz。官能基p2可述及下列官能基： -C-C-雙鍵或C-C-參鍵或芳香系C-C·鍵； 10 -疏基或羥基； Φ -烧基績酸酿胼、芳基績酸醯胼·； -1，2-二元醇； -1，2-胺基醇類； -1,2-胺基-疏醇類； 15 -疊氮化物； -胺基-NH2或包含結構單位-NH-之胺基之衍生物，如：胺基烷基、 胺基芳基、胺基芳烧基或烷芳基胺基； -羥基胺基-0-ΝΗ2，或包含結構單位·〇·ΝΗ_之羥基胺基之衍生 物’如：羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基 修 20 烷芳基胺基； -烷氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 包含結構單位-ΝΗ-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其中G為Ο或S，M為例如： --OH 或-SH ; 25 -烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； -烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； -烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 氧基； -51- 1357337 -活化之酯，如：具有如：羥基琥珀醯亞胺之亞胺結構或其有 結構單位0·Ν，其巾Ν為雜絲化合物巾-部份之經基胺之 醋’或其中G=0且Q不存在，如：具有經取代芳基殘基，如： 玉氟苯基、對硝基苯基或三氣苯基之芳基氧化合物之醋； 其中Q不存在或為NH或雜原子，如：s或〇 ; -NH-NH2 或-NH-NH- ; * -N〇2 ; •腈基； -幾基，如：酸基或嗣基； ίο -羧基； -_N=C=0基團或-N=C=S基團； -乙稀基鹵化物基H乙烯基蛾化物或乙烯基溴化物基團或三 氟甲磺酸根； -OC-H ; 15 --(c=nh2ci)-o 烷基 --(C=〇)-CH2-Hal 基團’其中 Hal 為 a、Br 或工； --CH=CH-S02-; -包含結構式-S-S-之二硫化物基團； -如下式基團

^下式基團 20 1357337 10 15 其中F3為可與上述—個基團形成化學鏈結之基團 上述基團中。此外，第二鍵結化合物具有至少—個可與蛋 能基Z反應之官能基’其為例如：胺基、硫基、縣、反應性幾基、 搭基、嗣基、或|«。若使用—種鏈結化合物共價連接聚合物與蛋 白質時’該聚合物可與鏈結化合物反應，所得聚合物衍生物再盘蛋 白質反應’或蛋白質可與鏈結化合物反應，所得蛋白⑽生物再與 聚合物反應。若使用兩種鍵結化合物L1肖L2時可由聚合物^ L1反應，所得聚合物衍生物再與L2反應，並由所得聚合物衍生物 與蛋白質反應，或由蛋白質與L2反應，所得蛋白物生物再與以 反應，所得蛋白質衍生物再與聚合物反應。亦可由聚合物與u反 應’由蛋白質與L2反應，再由聚合物衍生物與蛋白f衍生物反應。 此外，亦可由L1肖L2反應，所得化合物再妓合物反應，所得 聚合物衍生物再與蛋白質反應。此外，亦可由L1與L2反應，所 得化合物再與蛋白質反應，所得蛋白質衍生物再與聚合物反應。

根據本發明尤其佳具體實施例，蛋白質之官能基z為胺基，聚 合物或其衍生物之官能基A為醛基、酮基或半縮醛基。根據特別佳 具體實施例，官能基Z與官能基A係經由還原性胺化反應進行反 應。 20 根據本發明還原性胺化反應中之聚合物或聚合物衍生物係利 用至少一個醛基或酮基或半縮醛基，與蛋白質之至少一個胺基共價 連接’該反應較佳為在0至40°C之深度下，更佳為〇至25°C，尤 其佳為4至21°C下進行。較佳反應時間範圍為〇,5至72小時，更 佳為2至48小時，尤其佳為4至7小時。較適用之反應溶劑為水 性介質。

因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 化法係於4至21°C之溫度下進行。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 -53- 25 1357337 化法係於水性介質中進行。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 化法係於4至21。(：之溫度下，於水性介質中進行。 術語"水性介質"用於本發明中係有關一種溶劑或溶劑混合 物，其中水含量範圍占所涉及溶劑重量之至少10%重量比，更佳為 至少20%重量比，更佳為至少30%重量比，更佳為至少4〇%重量 比，更佳為至少50%重量比，更佳為至少6〇%重量比，更佳為至少 70%重量比，更佳為至少80%重量比，甚至更佳為至少9〇°/〇重量比 或至高100%重量比。較佳反應介質為水。 ίο 反應介質之一般pH值範圍為4至9或4至8或4至7.3。 根據本發明較佳具體實施例，該還原性胺化法之反應pH為低 於7.3，更佳為小於或等於7，最佳為低於7，亦即在酸性範圍内進 15 行。因此，較佳範圍為3至低於7,更佳為3.5至65，亦更佳為4 至6，亦更佳為4J至5.5 ’尤其佳為約5.〇，亦即4 6或4 7或4.8 或4.9或5.0或5.1或5.2或5.3或5·4。較佳範圍特別指3至6.9 20 或3至6.5或3至6或3至5.5或3至5或3至4 5或3至4或3 至3.5或3.5至6.9或3.5至6.5或3.5至6或3.5至5 5戍3 5至5 或3.5至4.5或3.5至4或4至6.9或4至6.5或4至6^4至至5.5 或4至5或4至4.5或4.5至6.9或4.5至6.5或4 5至:或4 5至 5.5或4.5至5或5至6·9或5至6 5或5至6或5至5 5或5 5至 6.9或5.5至6.5或5.5至6或6至6.9或6至6.5或6 5至6 9。 因此’本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其中還原性胺 化法係於pH 7或以下進行，更佳為ρΗ6或以下。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物 化法係於4至21 C之溫度下，於pH 7或以下進行 下。 ’其中還原性胺 ’較佳為6或以 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物 其中還原性胺 -54- 25 1357337 化法係於pH 7或以下，較佳為6或以下之水性介質中進行。 因此’本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其原 化法係於4至2PC之溫度下，於pH 7或以下，較佳為6 = 水性介質中進行。 ^ 10 15 反應所使用聚合物衍生物:蛋白質之莫耳比例較佳範圍為撤^ 至5:1 ’更佳為ΐ〇〇:ι至10:卜尤其佳為75:1至2〇:ι。 已驚人地發現，尤其在上述較佳pH範圍内，特定言之在pH 低於7且大於或等於4下，可由聚合物減物主要與位於°蛋白質n 末端之胺基反應。術語"主要"一詞用於本發明中係有關一項具體實 施例，其中至少80〇/〇，較佳為至少85 %之沭末端胺基可用ς進行 還原性胺化反應。亦可能由至少9〇%或至少95%或至少96%或至少 97%或至少98%或至少99%之Ν-末端胺基反應。雖然無法排除除了 Ν-末端胺基以外之胺基進行偶合之可能性，但咸信該經由根據本發 明於pH低於7，較佳為低於6下之還原性胺化反應所進行之偶合 法基本上選擇在N-末端胺基上進行。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其令蛋白質包 含N-末端胺基與至少另一個胺基，該接合物包含之聚合物主要偶 合在N-末端胺基上。

20 根據本發明尤其佳具體實施例，係有關一種主要在蛋白質之 N-末端胺基上鍵結經搭或_基或半縮醒官能化之經基院基澱粉或 經齡或酮基或半縮醛官能化之羥基烷基澱粉衍生物之方法，該方法 包括由該羥基烷基澱粉或其衍生物，於pH 7或以下，較佳為pH6 或以下進行還原性胺化反應，該還原性胺化反應較佳為在水性介質 中進行。

根據本發明，以經醛官能化之羥基烷基澱粉或經醛官能化之羥 基烧基;殿粉衍生物較佳。 根據另一項亦較佳具體實施例，本發明係有關一種選擇在蛋白 -55- 25 1357337 質之N-末端胺基上鏈結經醛或酮基或半縮醛官能化之羥基烷基澱 . 粉或經醛或酮基或半縮醛官能化之羥基烷基澱粉衍生物之方法，該 方法包括由該經基烷基澱粉或其衍生物，於pH 7或以下，較佳為 PH6或以下進行還原性胺化反應，該還原性胺化反應較佳為在水性 5 介質中進行，所使用之羥基乙基澱粉較佳為平均分子量約i〇kD， DS約〇·4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約1〇 kD，DS約〇 7之 經基乙基殿粉，或平均分子量約12 kD，DS約0.4之經基乙基殿粉， 或平均分子量約12kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量 約18kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約18kD，DS 10 約〇·7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約50 kD，DS約0.4之羥基 ® 乙基澱粉，或平均分子量約50kD，DS約0_7之羥基乙基澱粉。 聚合物衍生物與蛋白質之反應中，醛基或酮基或半縮醛基與胺 基之間為產生希夫氏鹼(Schiff’s base)之還原性胺化法。繼此反應 後，此鹼可經至少一種還原劑還原，在聚合物衍生物與蛋白質之間 15 .產生女定之鍵結。該反應亦可能於至少一種還原劑之存在下進行。 根據較佳具體實施例，該還原性胺化反應係於至少一種還原劑之存 在下進行。 較佳還原劑為氫硼化鈉、氰基氫硼化鈉、有機甲蝴燒複合物， 如：4-(二甲基胺)吡啶甲硼烷複合物、N_乙基二異丙基胺甲硼烷複 20 合物、N-乙基嗎啉甲硼烷複合物、N·甲基嗎啉甲硼烷複合物、N-苯基嗎啉甲硼烷複合物、二甲基吡啶曱硼烷複合物、三乙基胺甲硼 烷複合物或三甲基胺甲硼烷複合物。特別佳為為氰基氫硼化鈉。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 化法係於NaCNBH3之存在下進行。 25 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 化法係於pH 7或以下，較佳為6或以下之水性介質中，於還原劑 之存在下，較佳為NaCNBH3之存在下進行。 •56· 1357337 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中還原性胺 .， 化法係於4至21。(：之溫度下，於PH7或以下，較佳為6或以下之 水性介質中’於還原劑之存在下，較佳為NaCNBH3之存在下進行。 反應所使用聚合物衍生物:蛋白質之較佳莫耳比例範圍為2〇〇:1 5 至10:1，更佳為1⑻:1至1〇:卜尤其佳為75:1至20:卜 人因此，本發明亦有關一種製造接合物之方法，該方法包括由包 3醛基之聚合物或聚合物衍生物，於水性介質中，與蛋白質之胺 基於還原性之存在下反應，該還原劑較佳為NaCNBH^。 1〇 根據本發明第一項較佳具體實施例，包含至少兩個經由開環氧 化反應引進聚合物中之絲之聚合物較佳為包含至少 1 之結構·· 裡如下式

，根據本發明此具體實施例，可使用可氧化聚合物中至少—個 ，形成具有至少一個，較佳為至少兩個醛基之開放醣環之^化劑 戸化劑之紐合。此反應說明於下列反應时，其中出示聚合物之 衣經氧化產生具有兩個醛基之開放環： 15

25 合適氧化劑特別指過填酸鹽，如：.驗金過峨酸鹽或其 多種之混合物，以過碘酸鈉與過碘酸鉀較佳。 ** 、 ^ 因此，本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其中由 物使用過碘酸鹽進行開環氧化反應，產生且 y ° 少兩個喊之聚合物衍生物。 目’較佳為至 此氧化反射，所使㈣合物之還原端可 態，以未氧化態較佳。 ％ 未氧化 因此，本發明亦有關-種如上述方法與接 合物之還«係呈未氧化態。 所便用t 10 該反應溫度之較料為G至4Gt，更 其佳為〇至心反應時間之較佳範圍為！分鐘至5小時 至目1何°依所需氧化程度而定，亦即氧化反應所 產生經基數目“，可料選擇過猶鹽：聚合物 15 因此，本伽«關—種如上財法與接絲、H 反應係於0至5t之溫度下進行β Μ開環氧化 為在=過侧之氧化反應較佳為在水性介質中進行，最佳 20 反應::水=:種如上述方法與接合物，其中開環氡化 反應混合物之合適ρΗ值可藉由 整。較佳緩衝劑可述及乙酸鈉緩補·^種°私衝劑來調 進行今㈣詩Β 鹽或微鹽緩衝劑。 進灯該開魏化反應之_乙基㈣純㈣ 麵，DS約Μ之錄乙基澱粉，或平均分子量 子= 〇.7之減乙基殿粉，或平均分子量約12尬，抓約〇 基澱粉，或平均分子量約12 kD，DS約。7之減 輕= 均分子量約18 kD，DS約〇.4 土澱私，或千 18kD，DS約G.7之m基’或平均分子量約 基絲’或平均分子量約50 kD，DS約 •58- 25 0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約5〇kD，Ds約0 7之羥基乙· 基殺粉。 所得聚合物衍生物可自反應混合物中，採用至少一種合適方法 純化。若需要時，聚合物衍生物可先沉澱後，再採用至少一種合適 方法單離。 σ 若先使聚合物衍生物沉澱時，其可例如：由反應混合物與至少 一種不同於反應混合物中溶劑或溶劑混合物之溶劑或溶劑混合 物，於合適溫度下接觸。根據本發明特別佳具體實施例，其中使= 水性介質，較佳為水，作為溶劑，由反應混合物與2_丙醇或丙酮與 乙醇之混合物，較佳為1:1混合物(ν/ν)(此表示等體積之該等化合參 物）’於較佳溫度範圍為-20至+50t下，尤其佳範圍為_2()至25。^ 下接觸。 聚合物衍生物可採用合適方法單離，其可包括一個或多個步 驟。根據本發明較佳具體實施例，先採用合適方法如：離心法或過 濾法，自反應混合物或反應混合物與例如：2_丙醇水性混合物之混 合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，所分離聚合物衍:物進二 步處理，如：透析法、離心過濾法或加壓過濾法、離子交換層析法、 逆向層析法、HPLC、MPLC、凝膠過據法與/或冷凌乾燥法等後處 理法。根據甚至更佳具體實施例，所分離之聚合物衍生物先經透響 析，較佳為相對於水進行，然後冷凍乾燥，直到反應產物之溶劑含 量夠低足以符合產物所需要求為止。冷凍乾燥法可在2〇至35°C之 溫度下進行，較佳為20至30。(：。 根據較佳具體實施例，氧化反應所得之氧化聚合物係採用至少 一種合適方:¾:純化’如：超過遽法與/或透析法，以便例如：排除 不需要之低分子量鹽類與聚合物成分，藉以控制氧化聚合物之分子 量範圍。 氧化之聚合物可直接用於與蛋自質反應或於第—步驟中適當 1357337 回收’例如：利用冷凍乾燥法回收，然後再溶於水中，供於第二步 驟中與蛋白質接合。蛋白質中至少一個胺基與聚合物中至少一個醛 基利用還原性胺化法進行之偶合法可參見上述有關還原性胺化反 應之明確反應參數，如：pH或溫度。 5 根據第二項較佳具體實施例，由聚合物與至少雙官能基化合物 反應’其包含至少一個可與聚合物反應之官能基Μ及至少一個可 與蛋白質之胺基進行還原性胺化反應且為醛基或酮基或半縮醛基 反應之官能基Q。 氧化之聚合物可直接用於與蛋白質反應或於第一步驟中適當 10 回收，例如：利用冷凍乾燥法回收，然後再溶於水中，供於第二步 驟中與蛋白質接合。蛋白質中至少一個胺基與聚合物中至少一個醛 基利用還原性胺化法進行之偶合法可參見上述有關還原性胺化反 應之明確反應參數，如：pH或溫度。根據本發明尤其佳具體實施 例，還原性胺化法較佳為在〇至5°C之溫度下，如：約4°C下，於 15 約PH 4.5至5.5 ’如：約5.0下’反應時間約20至30小時，如： 約24小時下進行。 根據第二項較佳具體實施例，由聚合物與至少雙官能基化合物 反應’其包含至少一個可與聚合物反應之官能基Μ及至少一個可 與蛋白質之胺基進行還原性胺化反應且為盤基或酮基或半縮路基 20 反應之官能基Q。 較適用之化合物中除了醛基或酮基或半縮醛基外，尚包含至少 一個羧基或至少一個反應性羧基，較佳為一個羧基或一個反應性羧 基。該醛基或酮基或半縮醛基與該羧基或反應性羧基可利用任何合 適間隔基分隔。其中間隔基可為可視需要經取代之直鍵、分支與/ 25 或環狀烴殘基。通常，烴殘基具有1至60個，較佳為1至4〇個， 更佳為1至20個’更佳為2至1〇個，更佳為2至6個，尤其佳為 2至4個碳原子。若出現雜原子時，該分隔基通常包含i至2〇個， •60· 1357337 較佳為1至8個，尤其佳為i至4個雜原子。該烴殘基可包含具有 例如^至7個碳原子之可視需要分支之院基鍵或芳基或環炫基， 或為芳烧基、院芳基，其中烧基部份可為直鏈與/或環狀院基。根 據甚至更佳具體實施例，雜殘基為具有5至7個，較佳為6個碳 5 原子之芳基殘基。該經基殘基為苯殘基最佳。根據此較佳具體實施 例，羧基與醛基可位於苯環1，4-位置、U_位置或12_位置，以14· 位置較佳。 作為反應性羧基者，可述及反應性酯、異硫代氰酸酯或異氰酸 酯。較佳為反應性酯為衍生自N-羥基琥珀醯亞胺者，如：N_羥基 10 破珀醯亞胺或確基-N-羥基琥珀酿亞胺，經適當取代之苯紛，如： 對硝基苯盼、鄰，對-二硝基苯酚、鄰，鄰，_二硝基苯酚、三氣苯紛， 如· 2,4,6-二氣本酌·或2,4,5-三氯苯紛、三說苯盼，如：2,4,6_三氟ι 苯酚或2,4,5-三氟苯酚、五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如： 經基本并二峻。尤其佳為N-經基號ίό酿亞胺，以N-經基玻珀醯亞 15 胺與磺基A—羥基琥珀醯亞胺尤其佳。所有醇類均可單獨使用或呈 其兩種或多種之組合使用β尤其佳之反應性酯為五氟苯基酯與N_ 羥基琥珀醯亞胺酯。 因此，根據較佳具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與 接合物’其中由聚合物與甲醯基苯甲酸反應》 20 根據另一項較佳具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與 接合物，其中由聚合物與甲醯基苯甲酸五氟苯基酯反應。 根據另一項較佳具體實施例’本發明係有關一種如上述方法與 接合物’其中由聚合物與甲醯基苯甲酸N_羥基琥珀醯亞胺酯反應。 根據另一項具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與接合 25 物，其中由聚合物與4-(4-甲醯基-3,5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應。 與包含Μ(其中Μ較佳為羧基或反應性羧基)與Q(其中q為醛 基或酮基或半縮醛基)之化合物反應之羥基乙基澱粉最佳為平均分 -61 - 1357337 子量約10kD ’ DS約〇·7之羥基乙基澱粉。亦可能為乂八θ . 〜10kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均公二旦b 幺为子量約 卞里約12 kD，DS約 0.4之經基乙基麟，或平均分子量約12 kD，Ds約〇 7之經基乙 基殿粉，或平均分子量約18 kD，DS約〇·4之經基乙基殿粉，二平 5 均分子量約18 kD，DS約〇·7之羥基乙基澱粉，或=均分子量約 50 kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子吾 刀里’·’ 0.7之羥基乙基澱粉。特別佳為所使用羥基烷基澱粉，甚至更佳為 羥基乙基澱粉之還原端係呈氧化態。 ~ 所得具有醛基或酮基或半縮醛基之聚合物衍生物續與蛋白質 1〇 之胺基進行還原性胺化反應。蛋白質中至少一個胺基與聚合物中至 · 少一個醛基或酮基或半縮醛基利用還原性胺化法進行之:合法可 參見上述有關還原性胺化反應之明確反應參數，如：pH或溫度。 根據本發明尤其佳具體實施例’與蛋白質之胺基之反應較佳為在〇 至40°c之溫度下’更佳為0至25°c，尤其佳為4至2rc下進行。 15 較佳反應時間範圍為30分鐘至72小時，更佳為2至48小時，尤 其佳為4小時至17小時。反應之溶劑以水性介質較佳。反應介質 之pH值較佳範圍為4至9,更佳為4至8,尤其佳為4.5至5.5。 根據第三項較佳具體實施例，由聚合物中可視需要氧化之還原 φ 端與包含胺基Μ與官能基Q之至少雙官能基化合物反應，其中該 20 胺基Μ係與聚合物中可視需要氧化之還原端反應，而官能基Q則 經化學修飾，產生經醛官能化之聚合物衍生物，其再與蛋白質之胺 基進行還原性胺化法。 作為官能基Q之官能基可特別述及下列： -C-C-雙鍵或C-C-參鍵或芳香系C-C-鍵； 25 -硫基或羥基； -烷基磺酸醯肼、芳基磺酸醯肼； -1，2-二元醇； • 62· 1357337 -1，2-胺基-硫醇類； · -疊氮化物； -1,2-胺基醇類； -胺基-NH2或包含結構單位-NH-之胺基之衍生物，如：胺基烷基、 5 胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺基； -經基胺基-0-ΝΗ2,或包含結構單位-0-NH-之經基胺基之衍生物， 如：羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基烷芳 基胺基； -炫氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 10 包含結構單位-NH-0- ; # •具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其中G為Ο或S，M為例如： --OH 或-SH ; -烧氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； -烧基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； 15 •烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 氧基； 活化之酿’如：具有如：N•羥基琥珀醯亞胺之亞胺結構或具有 結構單位0-N，其中N為雜芳基化合物中一部份之羥基胺之 · 酯，或其中G=0且Q不存在，如：具有經取代芳基殘基，如： 20 五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基之芳基氧化合物之酯； 其中Q不存在或為NH或雜原子，如：8或〇; --NH-NH2 或-NH-NH-; --N〇2 ; -猜基， 25 -羰基，如：醛基或酮基； -羧基； --N=C=0基團或-N=C=S基團； -63- 1357337 -乙烯基鹵化物基團’如：乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三 氟甲磺酸根； --OC-H ; -(c=nh2ci)-o 烷基 5 - -(C=0)-CH2-Hal 基團，其中 Hal 為 C卜 Br 或 I ; -CH=CH-S02-； -包含結構式-S-S-之二硫化物基團； -如下式基團

根據本發明較佳具體實施例，術語"官能基Q"係有關一種包含 化學結構式_NH-之官能基Q。 根據本發明一項較佳具體實施例，官能基M為如結構式 R/-NH-之基團，其中R’為氫或烷基、環烷基、芳基、芳烷基、芳基 環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基，其中環烷基、芳基、芳烷基、 芳基環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基可直接連接NH基團，或根 據另一項具體實施例，可利用氧橋連基連接\11基團。烷基、環烷 基、芳基、芳烷基、芳基環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基可經適 §取代。較佳取代基可述及鹵素，如：F、ci或Br。尤其佳殘基 R’為氫、烷基與烷氧基，甚至更佳為氫與未經取代烷基與烷氧基。 -64 - 1357337 烷基與烷氧基中，以含1、2、3、4、5或6個碳原子者較佳。 更佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基與異 丙氧基。尤其佳為曱基、乙基、甲氧基、乙氧基，特別佳為曱基或 曱氧基。 5 根據本發明另一項具體實施例，官能基Μ如結構式 R’-NH-R"-，其中R"較佳為包含結構單位-ΝΗ-與/或結構單位 -(C=G)-，其中G為Ο或S，與/或結構單位-S02-。官能基R"之明 確實例為

G 15 其中若G出現兩次時，其分別獨立為Ο或S。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中官能基Μ 係選自下列各物組成之群中：

η2ν- η Η2Ν \ Η2Ν”\ R,/〇、H Η η2ν γ G Η2Νν ?\ N-S—— Η II 0 Η Η Η2Ν 丫、 Η H2r 丫、 G G 20 其中G為Ο或S，且若出現兩次時，其分別獨立為Ο或S，且R1 為曱基。 -65- 25 根據本發明特別佳具體實施例，官能基Μ為胺基-NH2。 術語"胺基Q”係有關一種包含化學結構式-NH-之官能基Q。 根據本發明較佳具體實施例，官能為如結構式R,_NH_之 基^，其中R，為氩或烷基、環烷基、芳基、芳烷基、芳基環烷基、 5院芳基或魏基芳基殘基，其巾魏基、絲、芳絲、芳基環烧 基、烷芳基或環烷基芳基殘基可直接連接NH基團，或根據另一 ，具體實施例’可利用氧橋連基連接NH基團。絲、環院基、 芳基、芳烷基、芳基環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基可經適當取 1〇代。較佳取代基可述及卣素，如：F、C1或Br。尤其佳殘基R，為氫、 〇 烷基與烷氧基，甚至更佳為氫與未經取代烷基與烷氧基。 烧基與烧氧基巾’时卜2、3 ' 4、5或6個韻、子者較佳。 更佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、曱氧基、乙氧基丙氧基與異 丙氧基。尤其佳為甲基、乙基、甲氧基'乙氧基，特別佳為甲基或 甲氧基。 根據本發明另一項具體實施例，官能基Q如結構式 ，其中R"較佳為包含結構單位= _(c=G)- ’其中G為〇或s，與/或結構單位_s〇2_。根據更佳具體實 施例，官能基R"係選自下列各物組成之群中：

其中若G出現兩次時，其分別獨立為Ο或S。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其 係選自下列各物組成之群中： 、匕基9 •66· 1357337

ίο 15 其中G為Ο或S，若出現兩次時，其分別獨立為Ο或S，且R'為 甲基。 根據本發明特別佳具體實施例，官能基Q為胺基-NH2。 根據本發明另一項較佳具體實施例，Μ與Q二者均包含胺基 -ΝΗ-。根據特別佳具體實施例，Μ與Q二者均為胺基-ΝΗ2。 根據本發明較佳具體實施例，包含Μ與Q之化合物為均雙官 能基化合物，更佳為包含胺基-ΝΗ2最佳，或根據其他具體實施例， 包含羥基胺基-〇-ΝΗ2或如下式基團作為官能基Μ與Q之均雙官能 基化合物 Η Η2Ν

G 20 G為Ο較佳。此等包含Μ與Q之化合物之明確實例為

0 -67- 25 1357337 或 H2r0〜^0 八/0、Nh2 5 與包含M(M較佳為胺基-NH-，更佳為胺基_Nh2,亦更佳為μ與Q 均包含胺基-NH-’特別佳& M與q均包含胺基_NH2)之化合物反應 之羥基乙基澱粉較佳為平均分子量約1〇 kD，DS約〇 4之羥基乙基 澱粉，或平均分子量約1〇1^1)，1)8約〇 7之羥基乙基澱粉。亦可能 為平均分子量分子量約12 kD，DS約〇.4之羥基乙基澱粉，或平均 10 分子量約12kD，08約0.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約18 kD，DS約0·4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約18kD，DS約〇 7 之羥基乙基澱粉，或平均分子量約5〇1^1),1：^約〇4之羥基乙基澱 粉，或平均分子量約50 kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉。 若Μ與Q —者均為胺基-NH2時，Μ與Q可利用任何合適間隔 15 基分隔。其中間隔基特別指可視需要經取代之直鏈' 分支與/或環 狀烴殘基’通常’烴殘基具有1至60個，較佳為1至4〇個’更佳 為1至20個，更佳為2至1〇個，更佳為2至6個，尤其佳為2至 4個碳原子。若出現雜原子時，該分隔基團通常包含1至2〇個， 較佳為1至8個’尤其佳為1至4個雜原子。煙殘基可包含具有例 20 如：5至7個碳原子之可視需要分支之烷基鏈或芳基或環烷基，或 為芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可為直鏈與/或環狀烷基。根據 甚至更佳具體實施例’煙殘基為1至20個碳原子之烧基鏈.，較佳 為2至10個’更佳為2至6個’尤其佳為2至4個碳原子。 因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中該聚合物 25 係與1，4-二胺基丁烧、1，3-二胺基丙烷或ι，2·二胺基乙烧反應，產 生聚合物衍生物。 包含Μ與Q之至少雙官能基化合物與聚合物之反應較佳為在 -68- 1357337 0至100°C之溫度下，更佳為4至80°C，尤其佳為20至80°C下進 · 行；較佳反應時間範圍為4小時至7天，更佳為10小時至5天， 尤其佳為17至4小時。至少雙官能基化合物：聚合物之較佳莫耳 比例範圍為10至200，尤指50至100。 5 至少雙官能基化合物與聚合物之反應溶劑為至少一種非質子 性溶劑，特別佳為水含量不超過0.5%重量比，較佳為不超過〇1% 重量比之無水非質子性溶劑。合適溶劑特別指二甲亞砜(DMS〇)、 N-曱基吡咯啶酮、二甲基乙醯胺(DMA)、二甲基甲醯胺(DMF)與其 中兩種或多種之混合物。 10 亦可使用水性介質作為至少雙官能基化合物與聚合物之反應鲁 溶劑。 根據較佳具體實施例，包含聚合物與至少雙官能基化合物之聚 合物衍生物中之游離官能基Q經化學修飾，產生包含搭基或鲷基 或半縮醛基之聚合物衍生物。根據本具體實施例，較佳為由聚合物 15 衍生物與包含可與官能基Q反應之官能基與醛基或酮基或半縮醛 基之至少一種至少雙官能基化合物反應。 適用為至少雙官能基化合物者為各種具有醛基或酮基或半縮 醛基與至少一個可與聚合物衍生物之官能基Q形成鏈結之官能基 之化合物。該至少一個官能基係選自與Q相同之官能基集合中， 20且應可與Q反應。較佳例子中，當Q為胺基_職時，較適用之化 合物t除了醛基或酮基或半縮醛基外，尚包含至少一個羧基或至少 一個反應性羧基，較佳為一個羧基或一個反應性羧基。該醛基或酮 基或半縮酸基與該幾基或反應性缓基可利用任何合適間隔基分 隔。其中間隔基可為可視需要經取代之直鍵、分支與/或環狀烴殘 25 基。通申’烴殘基具有1至60個，較佳為1至40個，更佳為1至 20個’，佳為2至1〇個，更佳為2至6個，尤其佳為2至4個碳 原子右出現雜原子時，該分隔基通常包含1至20個，較佳為1 •69· 1357337 至8個，尤其佳為1至4個雜原子《該烴殘基可包含具有例如：5 . 至7個碳原子之可視需要分支之烷基鏈或芳基或環烷基，或為芳烷 基、烷芳基，其中烷基部份可為直鏈與/或環狀烷基。根據甚至更 佳具體實施例，該烴殘基為具有5至7個，較佳為6個碳原子之芳 5 基殘基。該烴基殘基為苯殘基最佳。根據此較佳具體實施例，羧基 與搭基可位於苯環1,4-位置、1，3-位置或i，2-位置，以丨，4·位置較 佳。 作為反應性羧基者可述及反應性酯、異硫代氰酸酯或異氰酸 醋。較佳反應性酯為衍生自下列者·· N_羥基琥珀醯亞胺，如：N_ 10 經基玻珀酿亞胺或續基-N-經基破珀酿亞胺，經適當取代之苯驗，Φ 如.對硝基苯酌·、鄰，對-二硝基苯紛、鄰，鄰，_二硝基苯盼、三氯苯 酚’如：2,4,6-三氣苯酚或2,4,5-三氣苯酚、三說苯酚，如：2,4,6_ 一氣本盼或2,4,5-二敦本盼、五氯苯盼、五氣苯齡，或經基^坐類， 如：經基苯并三唾。尤其佳為N-羥基號珀醯亞胺，以N-經基玻珀 15 醯亞胺與績基-N-經基破拍醯亞胺尤其佳。所有醇類均可單獨使用 或呈其兩種或多種之組合使用。以五氟苯基酯與Ν-羥基琥珀醯亞 胺酯作為反應性酯尤其佳。 因此，根據較佳具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與 接合物，其中包含Q之聚合物衍生物(Q為胺基-ΝΗ2)進一步與甲 20 醯基苯甲酸反應。 根據另一項具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與接合 物’其中包含Q之聚合物衍生物(Q為胺基)進一步與甲醯基笨甲酸 五氟苯基酯反應。 根據另一項具體實施例中，本發明係有關一種如上述方法與接 25 合物，其中包含Q之聚合物衍生物(Q為胺基)進一步與甲醯基苯甲 酸Ν·羥基琥珀醯亞胺酯反應。 根據另一項具體實施例，本發明係有關一種如上述方法與接合 -70- 1357337 物’其中包含q之聚合物衍生物⑹為胺基)進一步與4 (4甲酿 -3,5-二甲氧基苯氧基)丁酸反應。 土 包含胺基之聚合物衍生物與例如：甲酿基苯甲酸之反應溶 至J-種非質子性溶劑，特別佳為水含量不超過Q5%重量比，輕 佳為不超過G.l/e重量比之無水非質子性溶齊卜合適溶劑特別#二 甲亞卿ms〇)、n_甲基鱗咬酮、二f基乙_(DMA)= 甲酿胺(DMF)與其中兩種或多種之混合物。 該反應較佳為在0至4(TC之溫度下，更佳為〇至25〇c ,尤其 ίο 佳為15至坑下，反應時間較佳為〇 5至％小時尤其佳為u 17小時下進行。 根據較佳具體實施例，該反應係在活化劑之存在下進行。合適 活化劑特別指碳化二亞胺類如：二異丙基碳化二亞胺(dic)、二環 己基碳化二亞胺(DCC)、^乙基·3_(3·二甲基胺基丙基)碳化二=胺 (EDC)，以二異丙基碳化二亞胺(DIC)尤其佳。 15 所得聚合物衍生物可採用至少-種合適方法，自反應混合物中 純化。若必要時，該聚合物衍生物可先沉澱後，再採用至少一種合 適方法單離。 若先使聚合物衍生物沉澱時，其可能作法為例如：由反應混合 20 物與至少一種不同於反應中溶劑或溶劑混合物之溶劑或溶劑混合 物，於合適溫度下接觸。根據本發明特別佳具體實施例，其中最好 使用水性介質，較佳為以水作為溶劑，由反應混合物與2丙醇威含 丙酮與乙醇之混合物，較佳為1:1混合物(v/v)(此表示等體積之該 等化合物)於較佳溫度範圍為·20至+5CTC下接觸，尤其佳範圍為jo 至 25°G。 聚合物衍生物之單離法可採用包括一個或多個步驟之合適製 程進行。根據本發明較佳具體實施例’先自反應混合物或反應滿合 物與例如：2-丙醇水性混合物之混合物中，依合適方法如：離心或 -71 - 25 1357337 過濾法分離聚合物衍生物。第二步驟中，分離之聚合物衍生物可進 _ 一步處理，如：透析、離心過濾或加壓過濾、離子交換層析法、逆 向層析法、HPLC、MPLC '凝膠過濾法與/或冷凍乾燥法之後處理 法。根據本發明甚至更佳具體實施例，先透析所分離之聚合物衍生 物’較佳為相對於水進行，然後冷凍乾燥’直到反應產物之溶劑含 量夠低足以符合產物所需要求為止。冷康乾燥法可在20至35°C之 溫度下進行，較佳為2〇至30。〇。 所得含醛基或酮基或半縮醛基之聚合物衍生物繼續與蛋白質 之胺基進行還原性胺化反應。蛋白質中至少一個胺基與聚合物中至 少一個路基或酮基或半縮醛基利用還原性胺化法進行之偶合法可 φ 參見上述有關還原性胺化反應之明確反應參數，如：pH或溫度。 根據本發明尤其佳具體實施例，還原性胺化法係在0至HTC之溫 度下’如：約1至8°C或2至6°C下，如：於約4。(：下，於pIi45 至5·5，如：約5.0下進行。反應時間約10至20小時，如：12至 19小時或14至π小時，如：約π小時或約20至30小時，如. 約24小時。 因此’根據上述較佳具體實施例，當聚合物經由其氧化之還原 端反應時，本發明亦有關如下式接合物：

根據尤其佳具體實施例，該聚合物為羥基乙基澱粉，亦即HAs, 為HES'，n=2、3或4，最佳為4，如上已述。因此，當聚合物緩由 • 72- 其氧化之還原端反應時，本發明亦有關如下式接合物 OR. HES，\

Γ蛋白質 根據另一項較佳具體實施例，當聚合物經由其氧化之還原端反 應時，本發明亦有關如下式接合物

蛋白質 其中η=2、3或4’R4分別獨立為氫或曱氧基，當艮為氫時，m=〇， 當R·4為曱氧基時，n^i，HAS較隹為hES,。 上述各式中’附接在蛋白質之氮衍生自蛋白質之胺基，聚合物 20 衍生物則利用醛基連接。 根據上述具體實施例，官能基河與卩包含胺基_NH2,其中Μ 亦可能為胺基福2，且Q包含β_麟胺基·™(ΟΗ)_Οί2·ΝΗ2，較 佳為β-羥基胺基。 因此’本發明亦有關—種如上述方法與接合物 ，其中包含兩個 25胺基Μ與Q之化合物中之胺基Q為β•經基胺基·€Η(ΟΗΚ：Η2-ΝΗ2。 此時Μ與Q可利用任何合適間隔基分隔。其中間隔基可為 可視需要經取代之直鏈、分支與/或環狀烴殘基1常，烴殘基具 -73· 丄妁/337 =至60個，較佳為i至4G個，更佳為i至如個 =固，更佳為i至6個，尤其佳為丨至2個碳原子J = ，’該分絲通常包含m〇個，較佳為丨至8個 ^ 1=4個雜原子。該烴殘基可包含具有例如：5至7個碳軒; 支之絲鏈絲基或環絲，或為找基、料基，/中 鏈與/峨院基。根據甚至更佳具體實施例:'該 殘基為具有1至20個之烷基鏈，較佳為1至10個，更佳為i 6個’更佳為1至4個碳原子’尤其佳為丨至2個碳原子。亦 為Μ與Q利用亞曱基分隔。 ίο

^因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中該聚合物 係與1，3-二胺基-2-羥基丙烷反應。 若聚合物經由其氧化之還原端反應時，則產生如下式聚合物扩 生物 /Τ 15

其中HAS’=HES’尤其佳。 包含Μ與Q之至少雙官能基化合物，特別佳為1,3-二胺基 羥基丙烷，與聚合物之反應較佳為在40至120°C溫度下，更佳為 40至90°C，尤其佳為60至80°C下進行。較佳反應時間範圍為17 至168小時，更佳為17至96小時，尤其佳為48至96小時。至 少雙官能基化合物：聚合物之較佳莫耳比例範圍為200:1至10:1。 尤指 50:1 至 100:1。 該至少雙官能基化合物與聚合物之反應溶劑為至少一種非質 -74- 25 1357337 子性洛劑，較料水含量不超過〇.5%重量比，為不超過〇 ι% 重里比之無水非質子性溶齊卜合適溶劑特別指二甲㈣(dms〇)、 N-甲基料個、二甲基乙酿胺_Α)、二甲基甲 其中兩種或多種之混合物。 ^ 聚合物衍生物之β-羥基胺基Q诵縈可由 G Y通Φ可與至少雙官能基化合物 反應’後者包含至少-個可與Q反應之官能基，且另包含至少一 ^路基或或半_基之官能以可雌飾產纽基或嗣基 或半祕基之官能基。根據本發”—項㈣實施例，好經 基係經化學氧化法直接進行化學修飾，產生酸基。 10 此氧化反應可使用所有可使β·羥基胺基轉^化裔 化劑進行。較佳氧化劑為過破酸鹽，如：驗金屬過碘二二$ 15 =破義，其最好呈水減使^此輕讀佳魏根濃度為i ^知癒’更-佳…至^處义其佳為^心心該氧化反 應係於0至贼之溫度下，較佳為〇至饥，尤其料4至 下進行。 所得聚合物衍生物可自反應混合物中，採用至少一種合適方法 純化。若需要時，聚合物衍生物可先沉澱後，再採用至 ^ 方法單離。 裡〇適 20 若先使聚合物衍生物沉澱時，其可例如：由反應混合物與至少 種不同於反應混合物中溶劑或溶劑混合物之溶劑或溶劑混入 物，於合適溫度下接觸。根據本發明特別佳具體實施例，其中使用 水性介質，較佳為水，作為溶劑，由反應混合物與2·丙醇或丙_與 乙醇之混合物，較佳為1:1混合物(v/v)(此表示等體積之該等化二

物）’於較佳溫度範圍為·2〇至+501下，尤其佳範圍為_2〇至； 下接觸。 L 聚合物衍生物可採用合適方法單離，其可包括一個或多個步 驟。根據本發明較佳具體實施例，先採用合適方法如：離心法或過 -75- 25 1357337 濾法，自反應混合物或反應混合物與例如：2丙醇水性混合物之混 合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，所分離聚合物衍生物可進 步處理如.透析法、離心過濾法或加壓過遽法、離子交換層析 & ' 'hplc'mplc、轉财法與/或冷練燥法等 5 後處理法。根據甚至更佳具體實施例，所分離之聚合物衍生物先經 透^較佳為姆於水騎，職冷錄燥，直到反應產物之溶劑 3里夠低足以4合產物所需要求為止^冷綠燥法可在2G至饥 之溫度下進行’較佳為20至30。〇 10

因此’本㈣亦有關—種如上財法與接合物，其巾卜經基胺 丞Q之氧化法係採用一種過碘酸鹽進行。 本發明亦有關_種製造接合物之方法，當所使用之聚合 聚還原端時，最好使用触酸鹽氧化具有β··胺基之 聚》物竹生物，尤其佳為 15

20 且特定言之HAS，= HES,， 形成具有料之聚合物衍生物，尤其佳

• 76- 25 1357337 且特定言之HAS’ = HES'。 所得具《基A之聚合物衍生物輯與蛋㈣反應。因此， 本發明亦有關-種製造接合物之方法，該方法包括由具有p_經基胺 基之聚合物衍生物，當所使用之聚合物具有氧化之還肩端時，尤其 5 佳為如下式

且特定言之HAS’ = HES，，與蛋白質之胺基反應。 所得具有喊之聚合物衍生物繼續與蛋白質之胺基進行還原 性胺化法。有關蛋白質之至少〜個胺基與聚合物之至少一個路基利 15肖還原性胺化法進行之偶合法可參見上文所揭示之象細内容。 因Jt，根據上述較佳具體實施例，本發明亦有關一種如下式接

合物 20

特定言之HAS· = HES’ ’當所使用之聚合物具有氧化之還原端時。 25上式中，附接在蛋白質之氮街生自蛋白質之胺基 ，聚合物衍生物則 利用醛基連接。 根據本發明另-項具體實施例，由聚合物先與合適化合物反 •77- 1357337 應’產生包含至少一個反應性羧基之第一聚合物衍生物。此第一聚 合物衍生物再與另一種至少雙官能基化合物反應，其中此另一種化 合物中至少一個官能基係與聚合物衍生物之至少一個反應性羧基 反應，且該另一種化合物申至少另一個官能基為醛基或酮基或半縮 路基’或為可經化學修飾產生醛基或酮基或半縮醛基之官能基，其 中所得包含該醛基或酮基或半縮醛基之聚合物衍生物如上述，經由 還原性胺化法，與蛋白質之至少一個胺基反應。亦可能改變各化合 物之相互反應順序。 根據該另一項具體實施例之第一種替代法，包含至少一個反應 10

性羧基之聚合物之製法係利用聚合物之還原端進行選擇性氧化反 應’然後由已成為内酉旨 15

(Ila) 與/或羧酸

20

或幾酸之合適鹽’如：驗金屬鹽，較佳為納鹽與/或卸鹽，^ HAS’為HES1較佳之氧化聚合物，與合適化合物反應，產生包含至 少一個反應性羧基之聚合物。 -78- 25 ，較佳為歸乙基澱粉之氧化法可依據可產生上述結構 式_與/或⑽)之化合物之各方法或組合方法進行。 5 之合==:===: :應性羧基引進還原端已選擇性氧化之聚合物中之方法可採 用所有可能之方法及所有錢化合物進行。物中之方去葛 根據本發明明確方法， 10 少-種醇反應，較料與至少祕氧化之聚合物與至 圍為6至12或7至u之 ”如.25C下之PKA值範 ㈣咖克/莫耳，如：90至===之分= 圍可在 合適酸性醇類為所有 飞⑻至克/莫耳。 15 聚合物 20

ora

亦更佳為如下式

Η Ο

-79- 25 1357337 較佳醇類為N-經基_醯亞胺，如：N_經基號賴亞胺或續 基-N-經基破謹亞胺’經適當取代之料，如：對祕笨齡、鄰， 對-二硝基苯酚、鄰，鄰，-二硝基苯酚、三氣笨酚，如：2,4,6•三氯苯 盼或2,4,5-三氯苯齡、二氟笨驗’如：2,4,6_三說苯盼或2,4,5·三氟 本盼、五氣本盼、五氟本紛，或經基唾類，如：經基苯并三唾。尤 其佳為N-羥基琥珀醯亞胺，以N-羥基琥珀醯亞胺與續基_N_羥基琥 珀醯亞胺尤其佳。所有醇類均可單獨使用或呈其兩種或多種:組合° 使用》本發明内容中，亦可能使用可藉由例如：添加碳酸之二酯而 釋出醇之化合物。 10 因此，本發明亦有關一種如上述方法，其中還原端經選擇性氧 化之聚合物之活化法為由該氧化之聚合物與酸性醇，較佳為與N_ 經基琥珀醯亞胺與/或磺基-N-羥基琥珀醯亞胺反應。 15 根據本發明較佳具體實施例，還原端經選擇性氧化之聚合物係 於其氧化之還原端與至少一種碳酸二酯RB-〇-(C=〇)-〇_Rc反應，其 中與Rc可相同或相異。較佳者，此方法產生如下式反應性聚合 物

其中HAS·為HES，較佳。 合適之碳酸二酯化合物可使用其醇成分分別獨立為下列基團 之化合物：N-羥基琥珀醯亞胺，如：N-羥基琥站醯亞胺或磺基-N· 羥基琥珀醯亞胺，經適當取代之笨鹼’如：對硝基笨酚、鄰，對-二 硝基苯酚、鄰，鄰，-二硝基苯酚、三氯苯酚，如：2,4,6-三氣苯酚或 -80- 1357337 2,4二氯笨盼、三氟苯盼，如：2,4,6•三氣笨紛或2,4,5_三氣苯盼、 五氯㈣、五氟苯紛’ _基，如：經基苯并三七尤其佳為 N^N 一琥#醯亞胺基碳酸g旨與續基二細社胺基碳酸 酯’以Ν，Ν，-二琥珀醯亞胺基碳酸酯尤其佳。 因此’本發明亦有關一種如上述方法其中還原端經選擇性氧 化之聚合物之活化法為由氧化之聚合物與νν，醯 酸酯反應。 10 性醇與氧化之聚合物或氧化之聚合物之鹽之反應莫耳比例 為酸性辟：聚合物為5:1至5G:1較佳，更佳為8:1至應，較佳反 應溫度為2至4(TC，更佳為H)至耽，尤其佳為15至坑。較 佳反應時間範圍為1至1G小時，更佳為2至5小時，更佳為2至 4小時’特定言之2至3小時。 15 碳酸二醋化合物與氧化之聚合物或氧化之聚合物之鹽之反應 莫耳比例—般為二酯化合物：聚合物為1:1至3:1，如：1:1至15.1。 反應時間-般範圍為〇]至12小時，如:〇 2至6小時，或〇 5至2 小時或0.75至1.25小時。 20 根據本發明較佳具體實施例，氧化之聚合物與酸性醇與/或碳 酸二醋之反應係於至少-種非f子性溶劑中，如：水含量不超過 0.5%重量比，較佳為不超過〇1%重量比之無水非質子性溶劑中進 行。合適溶劑特別指二甲亞砜(DMS0)、N_曱基吡咯啶酮、二甲基 乙酿胺(DMA)、二甲基甲醯胺(DMF)與其中兩種或多種之混合物。 較佳反應溫度範圍為2至40。(：，更佳為1〇至3〇。(：。 氧化之聚合物與至少一種酸性醇之反應中使用至少另一種活 化劑。 合適活化劑特別指羰基二咪唑、碳化二亞胺如：二異丙基碳化 二亞胺(DIC)、二環己基碳化二亞胺(dccw-乙基·3_(3二甲基胺基 丙基)碳化二亞胺(EDC)，以二環己基碳化二亞胺(DCC^丨·乙基 •81- 25 1357337 -3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)尤其佳。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由還原端 已氧化之聚合物與酸性醇，於另一種活化劑之存在下反應，產生反 應性聚合物酯β 根據本發明一項具體實施例，氧化之聚合物與碳酸二酯與/或 酸性醇之反應係在低驗活性下進行’其可藉由添加反應混合物至水 中來決定，其中水對反應混合物之體積比為10:1 »添加之前，基本 上不包含緩衝劑之水於25°c下之pH值為7。添加反應混合物後測 定pH值時，反應混合物所得之鹼活性數值較佳為不超過9.〇，更 佳為不超過8.0，尤其佳為不超過7.5。 根據本發明另一項具體實施例，氧化之聚合物與N·經基破ίό 醯亞胺之反應係於無水DMA中，在沒有水之存在下，使用EDC 選擇性反應，產生如下式聚合物N-羥基琥珀醯亞胺酯

2〇 HAS，為 HES，更佳。 令人驚訝的是，此反應並未因EDC與HES之OH基團反應而 產生副產物，且意外地壓制了 EDC與氧化聚合物所形成Ο-醯基異 脲發生重組反應形成之各N-醯基脲。 因此’根據本發明另一項較佳具體實施例，氧化之聚合物與 25 Ν,Ν·-二琥珀醯亞胺基碳酸酯係於無水DMF中，在沒有水及活化劑 之存在下反應’選擇性產生如下式Ν-羥基琥珀醯亞胺酯 •82- 1357337

其中HAS·為HES’更佳。 ίο 根據本發明另一項具體實施例，還原端經選擇性氧化之聚合物 係於氧化之還原端與唑化物’如：羰基二咪唑或羰基二苯并味嗤反 應’產生具有反應性羧基之聚合物。若使用羰基二咪唾時，得到如 下式反應性咪唑化物聚合物衍生物

15

20 根據本發明該另一項具體實施例之第二替代項，當引進至少一 個反應性羧基至聚合物中時’該反應性羧基係引進還原端未氧化之 聚合物中，其係由聚合物之至少一個羥基與碳酸二酯反應。 因此，本發明亦有關一種方法與接合物，其中反應性羧基引進 還原端未氧化之聚合物之方法係由聚合物之至少一個羥基與至少 一種奴酸一6旨RB-〇-(C=0)-0-Rc(其中Rb與Rc可相同或相異)反應。 根據本發明另一項具體實施例，還原端未氧化之聚合物係於至 少一個羥基上與唑化物如：羰基二咪唑、羰基_二_(1，2,4-三唑）或羰 基二苯并咪唑反應，產生具有反應性羧基之聚合物。 -83· 25 1357337 合適之碳酸二酯化合物可述及其醇成分分別獨立為下列基® 之化合物：N-羥基琥珀醯亞胺，如：N-羥基琥珀醯亞胺、磺基-N-羥基琥珀醯亞胺、經適當取代之苯酚，如：對硝基苯酚、鄰，對·二 硝基苯酚、鄰，鄰二硝基苯酚、三氯苯酚，如：2,4,6-三氯苯酚或 5 2,4,5-三氯苯酚、三氟苯酚，如：2,4,6-三氟笨酚或2,4,5-三氟苯酚、 五氯苯酚、五氟苯酚，或羥基唑類，如：羥基苯并三唑。 尤其佳為對稱性碳酸二酯化合物，因此RB與Rc相同。碳酸二 酯之醇成分較佳為選自下列各物組成之群中：N_羥基琥珀醯亞胺、 磺酸化N-羥基琥珀醯亞胺、N-羥基苯并三唑與硝基-與鹵素-取代之 10 苯酚。其中以硝基苯酚、二硝基苯酚、三氣苯酚、三氟皋酚、五氣 苯酚與五氟笨酚較佳，尤其佳為N，N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯與磺 基-N，N'-二琥ίά醢亞胺基碳酸醋，以n，N'-二號轴酿亞胺基碳酸酯尤 其佳。 因此，本發明亦有關一種經基烧基澱粉衍生物，較佳為經基乙 15 基澱粉衍生物，其中該澱粉中至少一個羥基，較佳為至少兩個羥基 已與碳酸二酯化合物反應，產生各反應性酯。 根據本發明較佳具體實施例，還原端未氧化之聚合物與至少一 種碳酸二酯化合物之反應係於2至40°C之溫度下，更佳為1〇至 30°C ’尤指15至25°C下，較佳反應時間0.5至5小時，更佳為i 20 至3小時，尤其佳為2至3小時下進行。 碳酸二酯化合物：聚合物之莫耳比例依聚合物之取代度而定， 其係指與碳酸二酯化合物反應之羥基數與未反應之聚合物中羥基 數之相對比例。 根據本發明一項較佳具體實施例，碳酸二酯化合物:無水葡萄 25 糖單位之莫耳比例範圍為1:2至ι:ιοοο，更佳為1:3至1:1〇〇，尤 其佳為1:10至1:50，所產生之取代度範圍為〇 5至〇 〇〇1，較佳為 〇·33至0·(Η，尤其佳為〇.丨至〇 〇2。 -84· 1357337 發明較佳具體實施例，還原端未氧化之聚合物與碳酸二 知之反應係於至少-種非質子性溶劑中進行，特別佳為於水含量不 超過〇.5%重量比，較佳為不超過0.1%重量比之無水非質子性溶劑 中進打。合適溶劑特別指二甲亞硬(DMS〇)、N f基料伽、二 5甲基乙酿胺_Α)、二甲基甲醯胺(獅)與其中兩種或多種之混合 物。 〇 因此，本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其中還原端未 氧化之聚合物中至少-她基與碳酸二酷反應產生反應性缓基之 過程係於無㈣質子性極性溶針進行，雜織料二甲基乙酿 10 胺、二甲基甲醯胺或其混合物。 包含至少一個反應性羧基之反應性聚合物衍生物(較佳為如上 述，由聚合物與酸性醇、碳酸醋與/或嗤化物反應產生者)進一步與 另種至少雙S月b基化合物反應，其中此另一種化合物中至少一個 官能基F!係與聚合物衍生物之至少一個反應性羧基反應。該另一 15 種化合物之至少一個官能基沒有明確限制，只要可與聚合物之 至少一個反應性羧基反應即可。較佳官能基Fl為例如：胺基或羥 基或硫基或叛基。 該另一個至少雙官能基化合物包含至少另一個為齡基之官能 基Fz或可經化學修飾產生醛基之官能基h。該化學修飾法可為例 20 如：由官能基p2與另一種鏈結化合物之官能基F3反應，或氧化或 還原合適官能基F2。 若由F2與另一種化合物之官能基I?3反應時，官能基F2可特別 選自： -C-C-雙鍵或C-C·參鍵或芳香系C-C-鍵； 25 -硫基或羥基； -烷基磺酸醯肼、芳基磺酸醯肼； -1，2-二元醇； -85 - 1357337 -1，2-胺基醇類； -1，2-胺基-硫醇類； -疊氮化物； -胺基-NH2或包含結構單位-NH-之胺基之衍生物，如：胺基烷基、 5 胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺基； -羥基胺基-〇-NH2,或包含結構單位-0-NH-之羥基胺基之衍生 物，如：羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基 烷芳基胺基； -烧氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 10 包含結構單位-NH-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基’其中G為Ο或S，M為例如： --OH 或-SH ; -烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； -烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； 15 _烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 氧基； -活化之酯，如：具有如：N-羥基琥珀醯亞胺之亞胺結構或具有 結構單位0-N，其中N為雜芳基化合物中一部份之羥基胺之 酯，或其中G=0且Q不存在，如：具有經取代芳基殘基，如： 20 五氟苯基、對硝基笨基或三氣苯基之芳基氧化合物之酯； 其中Q不存在或為NH或雜廣子，如：s或 --NH-NH2 或-NH-NH-; --N〇2， -腈基； 25 -羰基，如：醛基或酮基； -羧基； --N=C=0基團或-N^C^S基團； -86- 1357337 -6歸基鹵化物基團’如：乙稀基峨化物或乙烯基溴化物基團或三 氟甲磺酸根； ~ -Csc-H ； --(c=nh2ci)-o 烷基 • -(C=〇)-CH2-Hal 基團，其中 Hal 為 a、Br 或 I ; -ch=ch-so2-; -包含結構式-S-S-之二硫化物基團； -如下式基團

其中h為可與上述一個基團形成化學鏈結之基團，其較佳為選自 上述基團中。此外，第二鏈結化合物具有至少一個可與蛋白質之胺 · 20 基進行還原性胺化反應之醛基或酮基或半縮醛基。 S此基F丨與該至少雙官能基鏈結化合物巾與聚合物反應之搭 基或酮基或半祕基，及/或該至少雙官能基鏈結化合物中與聚合 物反應之官能基F,與F2，及/或該另一種至少雙官能基鍵結化合物 中與聚合物反應之官能基&與搭基或_基或半祕基可分別利用 25任何合適之間隔基分隔^其中間隔基可為可視需要經取代之直鍵、 分支與/或環狀烴殘基。通常，烴殘基具有至多6〇個碳原子，較佳 為至多40個，更佳為至多20個，更佳為至多川個碳原子。若出 -87- 1357337 ίο :雜=該分隔基通常包含!至20個雜原子，較佳為ι至8 作為雜原子較佳。烴殘基可包含具有例如：5至需要分支之絲鏈或芳基或雜基，或為技基辟基H = 基部份可為直鏈與/或環狀烷基。 、兀 具有官能基faf2之化合物實例為例如：具有2至2〇個碳原 子之可視需魏取代之二胺滅，尤其佳為12·二絲乙院、i 3_ -胺基丙烧與Μ·二胺基丁^具有官能基㈣縣或酮基或半 縮搭基之較佳化合物實例為例如：甲醯基苯甲酸、4甲基苯甲酸 五氟苯基輯、4-甲酿基苯甲酸Ν-經基琥贿亞胺酷與4·^_甲酿基 -3,5-一甲氧基苯氧基)丁酸。

15 20 因此，本發明亦有關一種製造接合物之方法，該方法包括由聚 合物，較佳為羥基乙基澱粉，於其可視需要氧化之還原端與選自下 列各物組成之群中之化合物反應：酸性醇類、碳酸二酯與唑化物> 產生包含至少一個反應性羧基之聚合物衍生物，該聚合物衍生物再 與至少一種至少雙官能基化合物反應，產生包含醛基或酮基或半縮 醛基或可經化學修飾產生醛基或酮基或半縮醛基之官能基之聚合 物衍生物，可視需要化學修飾該官能基，產生包含醛基或酮基或半 縮醛基之聚合物衍生物，再由該包含醛基或酮基或半縮醛基之聚合 物衍生物與蛋白質之胺基進行還原性胺化反應。 因此，本發明亦有關一種接合物，其包含聚合物，較佳為羥基 乙基澱粉，與蛋白質互相共價鏈結，該接合物之製法包括由聚合物 之可視需要氧化之還原端與選自下列各物組成之群中之化合物反 應：酸性醇類、碳酸二酯與唑化物，產生包含至少一個反應性羧基 之聚合物衍生物’該聚合物衍生物再與至少一種至少雙官能基化合 物反應’產生包含醛基或酮基或半縮醛基或可經化學修飾產生醛基 或酮基或半縮醛基之官能基之聚合物衍生物，可視需要化學修飾該

-88- 25 丄357337 官能基’產生包含祕或鳴或半祕基L衍生物，再由該 包含搭基或酮基或半祕基之聚合物衍生物與蛋白f之胺基進行 還原性胺化反應。 具有官能基F,與已氧化成搭基之官能基F2之化合物明確實例 為例如：具有胺基作為F,及具有β_經基胺基作為^之化合物。尤 其佳實例為1，3_二胺基_2·祕丙炫。此氧化反射使用所有可使卜 經基胺基轉化顏基之合軌化舰行。較佳氧化縣過蛾酸鹽， 如：鹼金屬過碘酸鹽。尤其佳為過碘酸鈉’其最好呈水溶液使用。 ίο 此溶液之較佳碘酸根濃度為i至50 mM，更佳為i至25 mM，尤 其佳為1至10 mM。該氧化反應係於〇至仞它之溫度下，較佳為〇 鲁 至25°C，尤其佳為4至2(TC下進行》 所得聚合物衍生物可自反應混合物中，採用至少一種合適方法 純化。若需要時’聚合物衍生物可先沉澱後，再採用至少一種合適 方法單離。 15 20 若先使聚合物衍生物沉澱時，其可例如：由反應混合物與至少 一種不同於反應混合物中溶劑或溶劑混合物之溶劑或溶劑混合 物’於合適溫度下接觸。根據本發明特別佳具體實施例，其中使用 水性介質’較佳為水’作為溶劑’由反應混合物與2-丙醇或丙酮與 $ 乙醇之混合物’較佳為1:1混合物(v/v)(此表示等體積之該等化合 物）’於較佳溫度範圍為-20至+50°C下，尤其佳範圍為-20至25°C 下接觸。 聚合物衍生物可採用合適方法單離，其可包括一個或多個步 驟。根據本發明較佳具體實施例，先採用合適方法如：離心法或過 濾法，自反應混合物或反應混合物與例如：2-丙醇水性混合物之混 合物中分離聚合物衍生物。第二步驟中，所分離聚合物衍生物進一 步處理，如：透析法、離心過濾法或加壓過濾法、離子交換層析法、 逆向層析法、HPLC、MPLC、凝膠過濾法與/或冷凍乾燥法等後處 -89- 理法。根據甚至更佳具體實施例，所分離之聚合物衍生物先經透 · 析，較佳為相對於水進行，然後冷凍乾燥，直到反應產物之溶劑含 置夠低足以符合產物所需要求為止。冷凍乾燥法可在20至35°C之 溫度下進行，較佳為20至30。(：。 根據本發明另一項較佳具體實絶例’與聚合物或聚合物衍生物 之官能基A反應之蛋白質之官能基Z為硫醇基。 該硫醇基可呈其本身出現在蛋白質中。此外，其亦可能依據合 適方法引進硫醇基至蛋白質中。其中可特別述及化學方法。若蛋白 質中出現二硫化物橋連基時，可還原-S-S-結構式，得到硫醇基。亦 可轉形多肽中之胺基，形成SH&，其作法為由多肽經由胺基與具 φ 有至少兩個不同官能基之化合物反應，其中一個官能基可與胺基反 應另一個則為SH基或SH基之前體，例如：N-琥珀酿亞胺基-s_ 乙醯基硫代乙酸酯、N_琥珀醯亞胺基_s_乙醯基硫代丙酸酯或N-琥 珀醯亞胺基-3-(吡啶二硫）丙酸酯。亦可能利用蛋白質突變法引進 SH基，如：引進另一個半胱胺酸至蛋白質中，交換一個胺基酸形 成半胱胺酸，或如：排除蛋白質中一個半胱胺酸，以使蛋白質中另 —個半胱胺酸無法形成二硫化物橋連基。最佳者，由聚合物連接蛋 白質之游離半胱脖酸，尤其佳為Cys 17或Cys 18，其中Cys 17出· _ 現在例如：Granocyte®，Cys 18 出現在例如：Neupogen®。 據第一項具體實施例，蛋白質之官能基Z為硫醇基，聚合物 之g此基A為齒素乙酿基，且其中a係經由聚合物之可視需要氧 化之還原端與具有至少兩個官能基且各包含胺基之至少雙官能基 化口物反應，產生具有至少一個官能基且包含胺基之聚合物衍生 物由該聚合物衍生物與經單函素取代之乙酸與/或反應性經單鹵 素取代之乙酸衍生物反應。 作為具有至少兩個官能基且各包含胺基之至少雙官能基化合 物者可為所有可與聚合物之可視需要氡化之還原端反應產生包含

胺基(其可與經單自素取代之乙酸與/或反應性經單齒素取代之乙酸 衍生物反應)之聚合物衍生物之化合物。 根據較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物中一個官能基 (該m基可與聚合物之可視需要氧化之還原端反應)係選自下列 各物組成之群中： h2n— h2^H2N"N-Nf^ GΗ2Ν^γΜχ G

FT ,0、 Η2Νν ί/ N-S— Η II Ο Η〆

Υ G G、 其中G為0或S’若出現兩次時，其分別獨立為〇或S，R•為甲基。 根據本發明尤其佳具體實施例，該至少雙官能基化合物中一個 官能基(該官能基可與可視需要氧化之還原端反應）為胺基-Μ]%。根 據另一項較佳具體實施例，此官能基，最佳為胺基，係與聚合物之 氧化之還原端反應。 根據本發明較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物之官能基 (該官能基可與經單自素取代之乙酸與/或反應性經單齒素取代之乙 酸衍生物反應)為胺基-NH2。 該至少雙官能基化合物之官能基(較佳為均為胺基-NH2，該官 能基可與聚合物之可視需要氧化之還原端，較佳為氧化之還原端， 及經單齒素取代之乙酸與/或反應性經單自素取代之乙酸衍生物反 應）可利用任何合適間隔基分隔。其中間隔基可為可視需要經取代 之直鏈、分支與/或環狀烴殘基《合適取代基為烷基、芳基、芳烷 基、烧芳基、鹵素、幾基、酿基、缓基、狻基醋、經基、硫基、院 rI357337 氧基與/或烷硫基。通常，烴殘基具有1至60個，較佳為1至40 個，更佳為1至20個，更佳為2至10個，更佳為2至6個，尤其 佳為2至4個碳原子。若出現雜原子時，該分隔基通常包含1至 20個，較佳為1至8個，尤其佳為1至4個雜原子。該烴殘基可 5 包含具有例如：5至7個碳原子之可視需要分支之烷基鏈或芳基或 環烷基，或為芳烷基、烷芳基，其中烷基部份可為直鏈與/或環狀 烷基。根據甚至更佳具體實施例，該烴殘基為具有1至20個之烷 基鏈，較佳為2至10個，尤其佳為2至8個碳原子。因此，較佳 之至少雙官能基化合物為雙官能基胺基化合物，尤其佳為1，8-二胺 10 基辛烷、1，7-二胺基庚烷、1，6-二胺基己烷、1，5-二胺基戊烷、1，4-二胺基丁烷、1，3-二胺基丙烷、與1，2-二胺基乙烷。 根據另一項較佳具體實施例，該至少雙官能基化合物為二胺基 聚乙二醇，較佳為如下式二胺基聚乙二醇 15 H2N-(CH2-CH2-0)m-CH2-CH2-NH2 其中m為整數，m較佳為1、2、3或4。 20 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由聚合物 與1,8-二胺基辛烷、1，7-二胺基庚烷、1，6-二胺基己烷、1，5-二胺基 戊烷、1，4-二胺基丁烷、1，3-二胺基丙烷與1,2-二胺基乙烷，於其氧 化之還原端反應，產生如下式聚合物衍生物

-92- 25 1357337 其中n=2、3、4、5、6、7或8,該聚合物為HES尤其佳。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由聚合物 與H2N-(CHrCH2-0)m-CH2-CH2-NH2之氧化之還原端反應，其中m 為1、2、3或4，產生如下式聚合物衍生物 ίο

其中m=l、2、3或4，且聚合物為HES尤其佳。 聚合物（較佳為羥基乙基澱粉）之還原端之氧化反應可依據可 產生具有上述結構式(Ila)與/或（lib)之化合物之各方法或組合方法 進行。 15 HAS'

(Ila)

20

雖然氧化法可根據所有可產生羥基烷基澱粉之氧化之還原端 -93- 25 1357337 之合適方法或方法群進行，但較佳為利用驗性破溶液進行，其說明 於例如：DE 196 28 705 A卜其揭示内容(實例a，第9攔，第6至 24行）已以引用之方式併入本文中。 由聚合物與至少雙官能基化合物反應所得之聚合物衍生物再 與經單齒素取代之乙酸與/或反應性經單齒素取代之乙酸衍生物反 應0 較佳之經單齒素取代之乙酸或反應性酸為經C1_取代、經Br· 取代及經I-取代之乙酸較佳，以乙醯氯特別佳。 10 若使用經鹵素取代之酸本身時，其較佳為由酸與聚合物衍生 物’於活化劑之存在下反應。合適活化劑特別指碳化二亞胺類如：· 二異丙基碳化二亞胺（DIC)、二環己基碳化二亞胺(DCC)、丨_乙基 -3-(3·二曱基胺基丙基)碳化二亞胺（EDC)，以二環己基碳化二亞胺 (DCC)與1-乙基_3_(3_二甲基胺基丙基)破化二亞胺(EDC)尤其佳。 15 因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由聚合 物，較佳為HES，與二胺基化合物，較佳為含2至8個碳原子之 二胺基烷或 H2N-(CH2-CH2-0)m-CH2-CH2-NH2 反應，其中 m 為 1、 2、3或4 ’所得聚合物衍生物再與經Br取代與經I取代之乙酸， 於活化劑之存在下，較佳為於EDC之存在下反應。 0 因此’本發明亦有關一種如下式聚合物衍生物 20

其中X=a、Br或I，n=2、3、4、5、6、7或8，該聚合物為HES 尤其佳’或如下式聚合物衍生物 -94- 25 丄357337

其中X=C卜Br或I ’ m=l、2、3或4，該聚合物為HES尤其佳。 10 聚合物衍生物與經齒素取代之乙酸之反應較佳為在水性系 統，較佳為水中’於較佳ΡΗ3.5至5.5 ’更佳為4.0至5.0,尤其佳 為4.5至5.0下’較佳反應溫度4至3(TC，更佳為15至25°C，尤 獨| 其佳為20至25°C下’較佳為反應時間為1至8小時，更佳為2至 6小時，尤其佳為3至5小時下進行。 15 包含聚合物衍生物之反應混合物中包含聚合物、至少雙官能義 化合物與經齒素取代之乙酸，可用於與蛋白質本身反應。根據本發 明較佳具體實施例，聚合物衍生物自反應混合物中之分離法較佳為 採用超過濾法’然後沉澱’可視需要洗滌與真空乾燥。 聚合物衍生物與蛋白質之反應較佳為於水性系統中進行。 20 聚合物衍生物與蛋白質之反應較佳為於pH6.5至8.5下，更佳 為7.0至8.5與尤其佳為7.5至8.5 ;較佳反應溫度4至3(TC，更佳 ® 為15至25°C，尤其佳為20至25°C下；與較佳反應時間0.5至8 小時，更佳為1至6小時與尤其佳為2至5小時下進行。 聚合物衍生物與蛋白質之硫醇基之反應在聚合物衍生物與蛋 白質之間產生硫醚鏈結。 因此，本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中由聚合物 (較佳為HES)與二胺基化合物’較佳為含2至8個碳原子之二胺基 燒或 H2N-(CH2-CH2-0)m-CH2-CH2-NH2 反應，其中 m 為 1、2、3 或4 ’所得聚合物衍生物再與經Br取代與經I取代之乙酸，於活化 -95- 25 1357337 劑之存在下’較佳為於EDC之存在下反應，所得聚合物衍生物再 與蛋白質之硫醇基反應，產生在蛋白質與聚合物衍生物之間包含硫 醚鏈結之接合物。 因此’本發明亦有關一種如如下式接合物 5 10

其中n=2、3、4、5、6、7或8,該聚合物為HES尤其佳，或如下 式聚合物衍生物

其中m=l、2、3或4，該聚合物為HES尤其佳。該經基乙基搬粉 2〇較佳為平均分子量約1〇kD ’ DS約0.4之經基乙基澱粉，或平均二 子量約10kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約 DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約12 kD，Ds約〇 7之 經基乙基澱粉，或平均分子量、約18kD，DS、約〇 4之經基乙基殿粉， 或平均分子量約18 kD，DS約〇·7之祕乙麵粉，或平均分子刀旦 25 、約5咖，DS .約0.4之祕乙基殿粉，或平均分子量約50kD，^ 約〇·7之羥基乙基澱粉。 根據第二項具體實關，蛋自f之官能基2為辆基且聚合物 -96- 1357337 之官能基A包含馬來醯亞胺基。 * 根據本具體實施例，有數種可能性可產生接合物。通常，由聚 合物之可視需要氧化之還原端與至少一種至少雙官能基化合物反 應，其中此至少雙官能基化合物包含一個可與該聚合物中可視需要 5 氧化之還原端反應之官能基’與至少一個包含馬來醯亞胺基或經化 學修飾之官能基，以產生包含馬來醯亞胺基之聚合物衍生物。根據 較佳具體實施例，該官能基經化學修飾，以產生包含馬來酿亞胺基 之聚合物衍生物。 因此，本發明係有關一種如上述方法與接合物，其係由包含馬 10 來醢亞胺基之聚合物衍生物與蛋白質之硫醇基反應，該方法包括由 · 聚合物之可視需要氧化之還原端與包含可與該可視需要氧化之還 原端反應之官能基U之至少雙官能基化合物反應，該至少雙官能 基化合物另包含可經化學修飾以產生馬來醯亞胺基之官能基w, 該方法另包括化學修飾官能基w，產生馬來醯亞胺基。 15 官能基U可為任何可與聚合物之可視需要氧化之還原端反應 之各官能基。 根據本發明較佳具體實施例，官能基U包含化學結構式 -NH-。 φ 因此’本發明亦有關一種如上述方法與接合物，其中官能基U 20 包含結構式-NH-。 根據本發明一項較佳具體實施例，官能基U為具有結構式 R’-NH-之基團’其中R，為氫或烷基、環烷基、芳基、芳烷基、芳基 環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基，其中環烷基、芳基、芳烷基、 芳基環烧基、燒芳基或環烷基芳基殘基可直接連接NH基團，或根 25 據另一項具體實施例，可利用氧橋連基連接NH基團。該烷基、環 炫基、芳基、芳烷基、芳基環烷基、烷芳基或環烷基芳基殘基可經 適當取代。較佳取代基可述及鹵素，如：F、C1或Br。尤其佳殘基 -97- 1357337 R’為氫、院基與烷氧基’甚至更佳為氫與未經取代之烷基與蜣氧基。 5 烧基與院氧基中’以含1、2、3、4、5或6個碳原子者較佳。 更佳為甲基、乙基、丙基、#丙基、曱氧基、乙氧基、丙氧基與異 丙氧基》尤其佳為甲基、乙基、甲氡基、乙氧基，特別佳為曱基或 甲氧基。 因此，本發明亦有關-種如上述方法與接合物，其中R，為氣或 曱基或曱氧基。 根據本發明另-項較佳具體實施例，官能基u如 10

RW· ’其巾R”較料包含結構單位魯與/或結構單位 -(C=G)- ’其令G為Ο或S，與/或結構單位_s〇2_。 根據更佳具體實施例t，官能基R,丨技哪，办… • 丞K係選自下列各物組成之群 中. 15

20 其中若G出現兩次時，其分別獨立為〇或s 因此，本發明亦有關一種如上述方法 係選自下列各物組成之群十：

與接合物，其中官能基U

-98- 25 1357337 其中G為〇或s，若出現兩次時，其分別獨立為〇或s，Ri為甲基。 根據本發明更佳具體實施例，U包含胺基-NH2。 根據本發明一項具體實施例，該至少雙官能基化合物中之官能 基W之化學修飾法為由包含w之聚合物衍生物與另一種包含可與 W反應之官能基且另包含馬來醯亞胺基之至少雙官能基化合物反 應0 作為官能基W及該另一種至少雙官能基化合物令可與W反應 之官能基者可特別述及下列： -C-C-雙鍵或C-C-參鍵或芳香系C-C-鍵； 10 -硫基或羥基； 翁 -烷基磺酸醯肼、芳基磺酸醯肼； -1，2-二元醇； -1,2-胺基醇類； -1，2-胺基-硫醇類； 15 -疊氮化物； -胺基-NH2或包含結構單位_nh-之胺基之衍生物，如：胺基烷基、 胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺基； -經基胺基·0-ΝΗ2，或包含結構單位-0-NH-之羥基胺基之衍生 物’如：經基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基 20 烷芳基胺基； -烧氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 包含結構單位-ΝΗ-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其申G為Ο或S，M為例如： --OH 或-SH ; 25 -烧氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； -院基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； -烧基幾基氧基'芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 -99- 1357337 氧基；

其中Q不存在或為NH或雜原子，如：s或〇; -ΝΗ-ΝΗ2 或，ΝΗ-ΝΗ-; -Ν〇2 ； 猜基； 10 叛基，如：醒基或酮基； 羧基； -Ν=Ο0基團或-N=C=S基團； 乙烯基函化物基團，如：乙烯基碘化物或乙烯基溴化物基團或三 氟甲磺酸根； 15 -OC-H ; _(C=NH2Cl)-〇 烷基 -(C=0)-CH2-Hal 基團，其中 Hal 為 Cl、Br 或 I ; CH=CH-S02-; 包含結構式-s-s-之二硫化物基團； 如下式基團

25 如下式基團 1357337

其中w與該另一種至少雙官能基化合物之官能基分別為可與上述 一種基團形成化學鏈結之基團。 根據本發明亦更佳之具體實施例，W包含胺基-NH2 » 根據本發明較佳具體實施例，W與另一個官能基均來自上列 基團。 π 根據本發明一項具體實施例，其中一個此等官能基為硫基。此 特别例子巾，該另_個官能基較佳為選自下列各物組成之群中：

其中Hal為Cl、Br或I，較佳為Br或I。 根據本發明尤其佳具體實施例，其中一個此等官能基選自下列 各物組成之群中：反應性酯，如：具有亞胺結構式之羥基胺（如： 20 N-經基琥J6醯亞胺)之酿，或具有結構單位〇_N其中N為雜芳基化 合物之一部份之酯，或如：具有經取代芳基殘基，如：五氟笨基、 對硝基苯基或三氣苯基之芳基氧化合物之醋，或可視需要轉形成反 應性酯之羧基之酯》此特別例子中，該另一個官能基包含化學結構 式-NH- 〇 25 根據本發明尤其佳具體實施例，W包含結構式-NH-，該另一 種至少雙官能基化合物包含反應性酯與馬來醯亞胺基。 包含結構式-NH-之官能基w中，可及上述官能基，其中w可 -101· 1357337 10 與u相同或相異。根據本發錄佳具體實關>1；與〜相同。更 佳為U與W均包含胺基。特別佳者，M w均為胺基—NH2。 根據本發明一項具體實施例，聚合物可與包含1;與臂之至少 雙官能基化合物巾未氧化之還原端，於水性介f巾反應。根據較佳 具體實施例’其中1；與w均為胺基，該反應係採用具有氧化離還 原端之聚合物，於至少-種非質子性溶劑，特別佳為於水含量 過0.5%重量比，較佳為不超過〇.1%重量比之無水非質子性溶劑中 進行。合適溶劑特別指二曱亞硬(DMS〇)、N_甲基鱗销二甲 基乙酿胺(DMA)、二甲基曱酿胺(DMF)與其中兩種或多種之混合 物。 σ

15 20 尤其當u與w均為胺基—ΝΗ2時，u與w可利用任何合適 隔基分隔。其中間隔基可為可視需要經取代之直鏈、分支與 狀烴殘基。合適取代基桃基、芳基、芳絲、絲基、齒素S、· 基、醢基、基、羧基自旨、祕、硫基、絲基與 : 常，烴殘基具有1至60個，較佳為i至40個，更佳為i二個 更佳為2至10個’更佳為2至6個’尤其㈣2至4個碳原子 若出現雜原子時’該分隔基通常包含i至2〇個，較佳為】至q 尤其佳為1至4個雜原子^該烴殘基可包含具有例如：$至7個固 原子之可《要分支之絲鏈或絲或環絲，或為狄基 基，其中烧基部份可為直鏈與/或環狀炫基。根據 施例，該烴殘基為具有i至2〇個之院基鏈，較佳為2至⑴固， 佳為2至6個碳原子，尤其佳為2至4個碳原子。

因此，本發明亦有關—種如上述方法與接合物， 之氧化之還原端與α二胺基丁烧、u-二胺基丙燒或 乙烷反應，產生如下式聚合物衍生物 ， 土 -102- 25 1357337

S

其中n=2、3或4 ’該聚合物為HES較佳。 10

15 根據上述較佳具體實施例，包含胺基之聚合物衍生物再與包含 反應性酯基與馬來醯亞胺基之至少雙官能基化合物反應。該反應性 酯基與馬來醯亞胺基可利用合適間隔基分隔。此間隔基可參見官能 基U與W之間之間隔基。根據本發明較佳具體實施例，反應性酯 基與馬來醯亞胺基之間利用具有1至1〇個碳原子之烴鏈分隔，較 佳為1至8個，更佳為1至6個，更佳為1至4個，更佳為1至2 個’及特別佳為1個碳原子。根據另一項亦較佳具體實施例中，該 反應性酯為琥珀醯亞胺酯，根據特別佳具體實施例，該包含馬來酿 亞胺基與反應性酯基之至少雙官能基化合物為Ν-(α-馬來醯亞胺基 乙醯氧基)琥珀醯亞胺酯。

因此，本發明亦有關一種如下式聚合物衍生物 20

其中η=2、3或4，聚合物為HES較佳。 包含馬來醯亞胺基之聚合物衍生物進一步與蛋白質之硫醇基 反應，產生包含利用硫醚基連接蛋白質之聚合物衍生物之接合物。 -103· 1357337

S 因此，本發明亦有關一種包含蛋白質與聚合物之如下式接合物 **

10 15 其中n=2、3或4，較佳為4 ’該聚合物為HES較佳，其中上式中 S原子衍生自蛋白質之Cysl7或Cysl8。該羥基乙基澱粉為較佳為 平均分子量約10 kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量約 10kD，DS約0.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約12]^)，1^約 0.4之羥基乙基澱粉’或平均分子量約12 kD，DS約〇7之經基乙 基澱粉，或平均分子量約18kD，DS約0·4之羥基乙基澱粉，或平 均分子量約18 kD，DS約〇.7之羥基乙基澱粉，或平均分子量約 50kD，DS約0.4之羥基乙基澱粉，或平均分子量分子量約5〇kD， DS約0·7之經基乙基殿粉。

20 包含馬來醯亞絲之聚合物财物與蛋之硫醇基之反 較佳為在經緩衝之水性系統中，較佳為在阳55至8 5下，更佳 6至8 ’尤其佳為6·5至7·5下，較佳反應溫度為Q至 ?Γ=’及尤其佳為4至批下，較佳反應時間為㈣: 小:，更佳為120小時，尤其佳為2至17小時下進行。該反 可藉由添加至少-種合適緩衝劑來調整。較 素含量濃度較了或刪緩衝劑’其中之 且/或包含SDS，其較佳更佳為2至請，尤其佳為4至8〜 、較佳濃度為〇至1〇/ ( ㈣，尤其佳為0.8至1%一。 更佳為Μ至1 接合物可進一步處理，如：進行透析法、離心過渡法或祕

-104- 25 41357337 濾法、離子交換層析法、逆向層析法、HPLC、MPLC、凝膠過濾 " 法與/或冷凍乾燥法等後處理法。 因此’本發明亦有關一種依上述方法製得之接合物。 因此，本發明亦有關一種依上述方法製得之接合物，其中A 為反應性缓基，其中將A引進聚合物中未氧化之還原端令之方法 為由聚合物之至少一個羥基與碳酸二酯反應，其中該接合物包含一 個聚合物分子與利用醯胺鏈結連接聚合物之至少一個，特定言之1 至10個蛋白質分子。 10 本發明亦有關一種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物’其中該聚合物為經基烧基澱粉出⑽，該蛋白質為粒細胞群落· 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下 15

20 與/或

其中R,、R2與R3分別獨立為氫或具有i至1〇個碳原 基、經基絲、減钱基或祕料基，較佳 二 更佳為氫総基6基， 其中G係選自Ο與S组成之群中，較佳為〇， -105- 3 1357337 其中L為可視需要經適當取代之直鏈、分支與/或環狀烴殘基，其 “ 可視需要包含至少一個雜原子’較佳為2至60個碳原子之烷基、 芳基、芳烧基、雜芳基、雜芳烧基殘基。 縮寫"蛋白質”用於上式中指用於反應中不含碳水化合物部份 5 基團中碳原子之G_CSF分子，其係N=C雙鍵中肟鏈結之一部份。 本發明亦有關一種如上述接合物，其中為_(αι ) …、4小6、7、8、9、10,較佳為2、3、4、(5、26)，更佳； 2、3、4，尤其佳為4 〇 本發明亦有關一種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 Κ)物，其中該聚合物為輕基燒基澱粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落鲁 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下：

至10個碳原子之羥基烷 較佳為氫或經基烧基， 其中R!、&與R3分別獨立為氫或具有j 25 基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基， 更佳為氫或羥基乙基，且 較佳為〇。 其中G係選自〇與s組成之群中，較佳為 • 106· 1357337 、缩寫"蛋白質"用於上式中指用於反應中不含碳水化合物部份— 基團中碳原子之G-CSF分子，其係N=C雙鍵中聘鍵結之—部广 本發明亦有關-種接合物，其包含蛋白質與聚合生 物，其中《合物絲減基澱粉(觸），料㈣輪細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下：

其中與R3分別獨立為氫或具有i至1〇個碳原子之經基烧 基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基’較佳為氫或羥基烷 20 更佳為氫或羥基乙基，及 ^ 其中L為可視需要經適當取代之直鏈、分支與/或環狀烴殘基，其 可視需要包含至少一個雜原子，較佳為2至60個碳原子之烷基、 芳基、芳烷基、雜芳基、雜芳烷基殘基。 土 縮寫"蛋白質”用於上式中指用於反應十不含碳水化合物部份 25 基團中碳原子之G-CSF分子，其係N=C雙鍵中肟鏈結之—部份。 上述兩個結構式說明一種結構式，其中交聯化合物係利用肟鏈 結連接HAS之還原端，其中HES之末端醣單位呈開放型，及說明 -107- ^^/337 一種具有各環狀胺基醛型之結構式，其中交聯化合物利用氧胺基連 接.HES之還原端，且其中HES之末端醣單位呈環狀型 。這兩種結 構式均可能同時呈互相平衡之狀態存在。 本發明亦有關一種如上述接合物，其中_L•為 ~[(CRaRj))mG]n[CRcRd]0-其中Ra、Rb、Re、Rd分別獨立為氫、烷基、芳基，較佳為氫，其 中G選自〇與S組成之群中，較佳為〇，且其中 10 m為卜2、3或4,其中m個CRaRb基團中之殘基Ra與Rb 可相同或相異； η為〇至20，較佳為〇至10，更佳為1、2、3、4、5 ’最 佳為1或2 ; 0為0至20，較佳為0至10，更佳為1、2、3、4、5，最 15 佳為1或2，其中〇個CRcRd基團中之殘基心與仏可相 同或相異； 本發明亦有關一種如上述接合物，其中^、^、^、^為氫， m=2，n=l，0=2。 20 本發明亦有關一種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物，其中該聚合物為羥基烷基溉粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下

-108- 25 1^57337 * 其中Rl、R2與K分別獨立為氫或具有1 基 '羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基 更佳為氫或經基乙基。 5 至10個碳原子之經基炫 ’較佳為氫或羥基烷基， 縮寫蛋白質”用於上式中指用於反應巾不含胺基中氮原子之 G-CSF分子，其係醯胺鏈結之一部份。 本發明亦有關-種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物’其中騎合物為織錄祕(HAS),終白f為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下： 10

蛋白質

15 其中R丨、R2與R3分別獨立為氫或具有1至10個碳原子之羥基烷 基'羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，較佳為氫或羥基烷基， 更佳為氫或羥基乙基，及 其中鏈結-0-(C=0)-係由羧基或反應性羧基與HAS分子之羥基反應 所形成。

縮寫”蛋白質"用於上式中指用於反應中不含胺基中氮原子之 G-CSF分子，其係醯胺鏈結之一部份。 20 本發明亦有關一種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物，其中該聚合物為羥基烷基澱粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下：

25 5.1357337 其中^^^卿立為氫或具有^⑺個碳原子之經基烧 基、經基芳基、減芳絲祕基絲基，較料氫紐基院基， 更佳為氫或羥基乙基，及 其中L為具有U60個，較佳為U40個，更佳為m〇個， 更佳為i至H)個，更佳為i至6個，更佳為1至2個碳原子尤 其佳為丨個碳原子之可視需要娜代之直鏈、分支與/或環狀煙殘 基，特定言之L為CH2。 縮寫"蛋白質"用於上式中指用於反應中不含胺基中氣原子之 G-CSF分子，其係胺基曱基鍵結之一部份。 ίο

本發明村I卜種接合物，其包含蛋白f與聚合物或立衍生 物’其巾騎合㈣減絲麟(HAS)，叫自f _細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下：

其中IR2與R3分別獨立為氫或具有i至1〇個碳原子之經基烧 2〇基、減芳基、經基芳焼基或經基院芳基，較佳為氫或經基烧基， 更佳為氫或羥基乙基，及 其中L〗與La分別為可視需要經取代之直鏈、分支與/或環狀烴殘 基，其可視需要包含至少一個雜原子，其包含烷基、芳基、芳烷基 雜烷基與/或雜芳烷基部份基團，該殘基具有1至6〇個，較佳為^ 25 至40個’更佳為1至20個’更佳為1至10個碳原子，且 其中D為一鏈結，較佳為由連接Li之適當官能基F2與連接^之 合適官能基F3所形成之共價鏈結。 •110- -1 1357337 縮寫蛋白質用於上式中指用於反應中不含胺基中氣原子之 G-CSF分子，其係胺基甲基鏈結之一部份。 一本發明亦有關一種如上述接合物其中L為仰2)n_，其中 η 3 4 5 6、7、8、9、1〇’較佳為2、3、4、5、6，更佳為 2、3、4，尤其佳為4。 發^亦有關-種如上述接合物，其中^包含可視需要經適 田取、之芳基』伤基團’較佳為包含6個碳原子之芳基部份基團， l2尤其佳為c6h4或，其中L2為仰#，其中n=2、3、4、5、6、 7、8、9、10 ’ 較佳為 2、3、4、5、6，更佳為 2、3、4。 10 本發明亦有關-種如上述接合物，其中係選自下列各物組成之 群中： -C-O雙鍵或OC-參鍵或芳香系c_c_鍵； -硫基或經基； -烷基磺酸醯肼、芳基磺酸醯肼； 15 -1，2-二元醇； -1，2-胺基-硫醇類； -疊11化物； -1,2-胺基醇類； 20 -脍基-NH2或包含結構單位-NH-之胺基之衍生物，如：胺基烷基、 胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺基； -羥基胺基-0-ΝΗ2’或包含結構單位-0-NH-之羥基胺基之衍生 物，如：羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基芳烷基胺基或羥基 烷芳基胺基； -烷氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基，其各 包含結構單位-NH-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其中G為0或S，M為例如： --OH 或-SH ; -111 - 25 1357337 ， _烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； . -烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； -烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷芳基羰基 氧基； 5 -活化之酯，如：具有如：N·羥基琥珀醯亞胺之亞胺結構或具有 結構單位0-N，其中N為雜芳基化合物中一部份之羥基胺之 酯’或其中G=0且Q不存在，如：具有經取代芳基殘基，如： 五氟苯基、對硝基苯基或三氯苯基之芳基氧化合物之醋； 其中Q不存在或為NH或雜原子，如：8或〇; 10 - -NH-NH2 或-NH-NH- ; · --N〇2， -赌基， -幾基，如：路基或酮基； -幾基； 15 - -N=C=0 基團或-N^C^S 基團； -乙稀基鹵化物基團’如：乙缔基蛾化物或乙稀基漠化物基團或三 氟曱磺酸根； --OC-H ; --(c=nh2ci)-o 烷基 ® 20 _ -(C=0)-CH2-Hal 基團，其中 Hal 為 α、Br 或 j ; --ch=ch-so2-; ••包含結構式-S-S-之二碑化物基團； -如下式基團

-112- 0 1357337 -如下式基團

且其中F3為了與F2形成化學鍵結之官能基，較佳為選自上述基團 中’ F2較佳為包含部份基團.ΝΗ·，更佳為包含胺基，^較佳為^含 部份基團-(c=G)-，更佳為_(c脅，更佳為部份基團(c=g) g，亦 更佳為-(C=0)-G- ’尤其佳為(叫〇，〇特別佳為醯胺鏈結。 10 本發明亦有關-種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生_ 物’其中該聚合物為經基院基澱粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下： HAS"-C—N—蛋白質 Η2 Η 15 其中部份基81 ·ΟΙ2·Ν2_之碳原子衍生自經由開環氧化反應引進聚 σ物中之酸基’其中HAS"係有關由開環氧化反應及與蛋白質之胺 基反應產生之不含醛基之羥基烷基澱粉分子，其中氮原子衍生自蛋 白質之胺基。 ^ 20 縮寫"蛋自質"用於上式巾指用於反應中不含胺基巾氮原子之 G-CSF分子，其係醯胺鏈結之一部份。 本發明亦有關-種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物’其中該聚合物為經基燒基殺粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下·· -113· 25 1357337

其中R丨、&與R3分別獨立為氫或具有丄 基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基 更佳為氮或輕基乙基》及 至10個碳原子之羥基烷 ’較佳為氫或羥基烷基， 10 15 其中L為可《要縣代之直鏈、分支與/或環狀烴絲，其 $包含至少-㈣原子’其包纽基、芳基、芳絲雜烧基系 ^芳絲雜基團，誠基具有2至6(M目，錄為2至4〇個， 更佳為2至20個’更佳為2至10個碳原子，且 其中硫原子触自蛋自質之半胱職祕或二硫化物基團。 本發明亦有關一種如上述接合物，其中_L_為

-[(CRaRb)mG]n[CRcRd]0- 2〇 其中Ra、Rb、Rc、K分別獨立為氫、烷基、芳基，較佳為氫， 其中G選自〇與8組成之群中，較佳為〇,且其中 m為1、2、3或4,以2最佳，其中m個基團CRaRb中之殘 基Ra與Rb可相同或相異； 為1至20，較佳為1至10，最佳為卜2、3或4 ; 為1至20 ’較佳為1至10 ’更佳為卜2、3、4 ' 5，更佳 為1或2,最佳為1，其中〇個基團CRel*之殘基心與 可相同或相異； 或 η 0 -114- 25 1357337 其中 η 為〇 ;及 0為2至20 ’較佳為2至10 ’更佳為2、3、4、5、6、7或 8，其中〇個基團CRcRd中之殘基扎與^可相同或相異。 本發明亦有關一種接合物，其包含蛋白質與聚合物或其衍生 物，其令該聚合物為羥基烷基澱粉(HAS)，該蛋白質為粒細胞群落 刺激因子(G-CSF)，其結構式如下： 10

15 .其中Ri、R2與R3分別獨立為氫或具有丨至1〇個碳原子之羥基烷 基、經基芳基、經基紐基或絲辟基，較佳為氫紐基烧基， 更佳為氫或羥基乙基，及 其中L為可視需要經取代之直鏈、分支與/或

^要包含至少-個雜原子，其包含錄、芳基、雜隸H 20 或雜芳烧基部份基團，該殘基具有2至60個’較佳為2至4〇個， 更佳為2至20個，更佳為2至10個碳原子，且 其中硫原子衍生自蛋白質之半胱胺酸殘基或二硫化物基團。 本發明亦有關一種如上述接合物，其中_乙_為 -[(CRaRb)mG]n[CRcRd]0- 其中Ra、Rb、Re、心分別獨立為氫、烷基、芳基，較佳為氫， 其中G選自0與S組成之群中，較佳為〇，且其中 -115- 1357337 m為1、2、3或4，以2最佳，其中m個基團CRaRb中之殘 基Ra與Rb可相同或相異； η為1至20，較佳為1至1〇 ’最佳為卜2、3或4 ’ 〇為1至20，較佳為1至1〇 ’更佳為1、2、3、4、5 ’更佳 5 為1或2,最佳為1，其中〇個基團CRcRd中之殘基心與

Rd可相同或相異； 或 其中 η為0 ;及 10 〇為2至20 ’較佳為2至10，更佳為2、3、4、5、6、7或8, 其中〇個基團CRcRd中之殘基1與1^可相同或相異。 本發明亦有關如上述任何接合物，其中羥基烷基澱粉為羥基乙 基澱粉。 本發明亦有關如上述任何接合物，其中經基乙基澱粉之分子量 15 為2至200 k〇，較佳為4至13〇kD，更佳為4至70 kD。 根據另一方面’本發明係有關一種如上述接合物，或依上述方 法製得之接合物，其係用於治療人體或動物體之方法。 此外’本發明亦有關一種醫藥組合物，其包含醫療有效量之如 上述接合物或依上述方法製得之接合物。 術浯醫療有效量”用於本文中意指其用量可針對特定病症與

伤投，。所需劑量將所治療病症之嚴重性 用投藥方法，等等而定。 因此，

〒姐名、物尚包含至少一種醫藥上 尤其佳為用於G-CSF療法。 •116-

Claims (1)

1. 申請專利範圍 芝利甲請案第93123553號 va ^ ^PPlicati〇n. No. 93123553 修f·後51凭寻利範圍会換本-附件(三） Amended Claims in Chinese - F.nrl fun (5琴iq〇年09月27曰送呈） (^ubmmed on September 27,2011) 物為羥基貌基澱粉(HAS)且蛋白質為粒細胞群落刺激因 dCSF) ’該方法包括 種製備包含蛋白質與聚合物之接合物最中該聚合 子 至少一個選自由醛基、酮基或半縮醛基所組成之群組的 S迠基A至該聚合物中形成聚合物衍生物，其係藉由該聚合 物與至少一種雙官能基化合物反應，其中一個官能基m可與 該聚合物反應，和其中至少另一個官能基為醛基、酮基或半 縮醛基A，或為另經化學修飾可產生醛基、嗣基或半縮醛基 A之官能基，以及 由聚合物衍生物中至少一個官能基A與蛋白質之至少一個官 能基Z反應，藉以形成共價鏈結，其中z為胺基，且其中該 聚合物衍生物與蛋白質之反應為還原性胺化法。 κ 根據申轉利賴第〗項之方法’其巾贿基餘殿粉為經 基乙基殿粉。 根據中請專利範圍第2項之方法，其中該絲乙基澱粉之分 子量為2至200 kD。 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中該聚合物係與該 至少雙宫祕化合物之官祕M反應，產生該聚合物衍生 物，該£少雙官能基化合物尚包含至少另_個為祕、嗣基 或半縮塔基A之官能基Q。 根據申請專概圍第4項之紐，其巾M包括胺基。 根據申請專利範圍第丨或2項之方法，其中該聚合二係與該至 少雙官能基化合物之官能基M反應，該至少”能基化合物 尚包含至少另-個U祕基，基或半祕基A之官能基 Q，該方法尚包㈣官能基Q與至少—種合適化合物反應 生包含《、_基或半祕基A之聚合物衍生物。 1357337

   20 7. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中Μ與Q包括胺基。 8. 根據申請專利範圍第6項之方法，其中該至少一種合適化合 物包含羧基與該醛基、酮基或半縮醛基A。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該至少一種合適化合 物為甲醯基苯甲酸或4-(4-曱醯基-3,5-二曱氧基苯氧基)丁酸。 10. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中還原性胺化法係 於NaCNBH3之存在下進行。 11. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中還原性胺化法係 於pH7或以下進行。 12. 根據申請專利範圍第11項之方法，其中該pH為6或以下。 φ 13. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中還原性胺化法係 於0至25°C之溫度下進行。 14. 根據申請專利範圍第1或2項之方法，其中還原性胺化法係 於水性介質中進行。 15. —種根據申請專利範圍第1或2項之方法製得之接合物。 16. 根據申請專利範圍第15項之接合物，其係用於治療人體或動 物體之方法。 17. —種包含蛋白質與聚合物之接合物，其中該聚合物為羥基烷 基澱粉(HAS)，蛋白質為粒細胞群落刺激因子(G-CSF)，該接 籲 合物具有結構式如下：

   與/或 -162· 1357337

   其中R!、R2與R3分別獨立為氫或具有2至10個碳原子之羥 基烷基、羥基芳基、羥基芳烷基或羥基烷芳基，及 其中L為可視需要經取代之直鏈、分支與/或環狀烴殘基，可 視需要包含至少一個雜原子，具有1至60個碳原子。 18. 根據申請專利範圍第17項之接合物，其中L具有1至40個、 1至20個、1至10個、1至6個、1至2個碳原子或1個碳 原子。 ίο 19. 根據申請專利範圍第17或18項之接合物，其中L為CH2。 20. 根據申請專利範圍第17或18項之接合物，其中R〗、R2與R3 分別獨立為氫或羥基乙基。 21. 根據申請專利範圍第17項之接合物，其係用於治療人體或動 物體之方法。 •5 22. —種包含蛋白質與聚合物之接合物，其中該聚合物為羥基烷 基澱粉(HAS)，蛋白質為粒細胞群落刺激因子(G-CSF)，該接 合物具有結構式如下：

   其中R,、尺2與R3分別獨立為氫或具有2至10個碳原子之羥 -163 - 二二、經基方基、經基芳絲或經基统芳基及 八中Ll與L2分別獨立為可視需要經取代之直鏈、八支Μ 狀煙殘基，可視需要包含至少 之支與/或環 芳烧基、靴細或料、含縣、芳基、 個碳原子，及 方坑基晶基團’該殘基具有460 其中D為一藉由連接L 八 & 1 c 〇適B此基F2與連接L2之合適官 月b基F3所形成之共價鏈結。 、s 23. 根據申請專利範圍第22項之接合物， 獨立為氫或經基乙基。 、H R〆刀別 24. 根據申請專利範圍第η或η項之接合物，其 ==視需要經取代之直鏈、分支與/或環狀煙殘基，㈣ 需要包含至少-個雜原子’包含絲1基、芳烧基、雜烧 基與/或雜芳烧基部份基團，該殘基具有i至*個、i至2〇 個或1至10個碳原子。 15 A根據申請專利範圍第22或23項之接合物，其中 -(CH2)n- ’ 其中 n=2、3、4、5、6、7、8、9、1()。 26. 根據申請專利範圍第25項之接合物，其中n為4。 27. 根據申請專利範圍第22或23項之接合物，"其中^包含可視 需要經適當取代之芳基部份基團。 20 28. 根據申睛專利範圍第27項之接合物，苴中τ & ρ υ 〆、T 馬 L6hl4。 29. 根據申請專利範圍第22或23項之接合物，其中&係選自下 列各物組成之群中： -C-C-雙鍵或C-C-參鍵或芳香系c_c_鍵； - 硫醇基或經基； ' 烧基續酸酿肼、芳基讀酸酿肼； ~ 1，2-二元醇； • 1，2-胺基-硫醇類； -164- 25 1357337 - 疊氮化物； -1，2-胺基醇類； " - 胺基-NH2或胺基烷基、胺基芳基、胺基芳烷基或烷芳基胺 ' 基； 5 - 羥基胺基-o-nh2，或羥基烷基胺基、羥基芳基胺基、羥基 芳烷基胺基或羥基烷芳基胺基； -烷氧基胺基、芳基氧胺基、芳烷基氧胺基或烷芳基氧胺基， 其各包含結構單位-NH-0-; -具有羰基-Q-C(=G)-M之殘基，其中G為Ο或S，M為： ^0 -OH 或-SH ί --烷氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或烷芳基氧基； "烷基硫基、芳基硫基、芳烷基硫基或烷芳基硫基； "烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、芳烷基羰基氧基、烷 芳基羰基氧基；或 土兀 15 - 活化之酯； -ΝΗ-ΝΗ2 或-ΝΗ·ΝΗ-; • Ν〇2 ； - 腊基； ® 幾基； 20 - 羧基； --N=C=0基團或-N=C=S基團； - 乙烯基鹵化物基團； --OC-H ; -(c=nh2ci)-o 烷基 25 - (CKK-Hal 基團，其中 Hal 為 Q、Br 或 j ; • -CH=:CH-S〇2- > -包含結構式-S-S-之二硫化物基團； -165- 1357337 - 如下式基團

   - 如下式基團

   F N〇2 以及其中在F3與F2之反應期間形成共價鏈結D，以及其中F3 為選自上述基團。 10

   30. 根據申請專利範圍第29項之接合物，其中F2包含胺基，以 及其中F3包含部份基團-(C=0)-或部份基團-(C=0)-0,以及其 中D為醯胺鍵。 31. 根據申請專利範圍第17或22項之接合物，其中該羥基烷基 澱粉為羥基乙基澱粉。 32. 根據申請專利範圍第31項之接合物，其中該羥基乙基澱粉之 分子量為2至200 kD。 33. 根據申請專利範圍第22項之接合物，其係用於治療人體或動 物體之方法。 34. —種醫藥組合物，其包含醫療有效量之根據申請專利範圍第 20 15項之接合物。 35. —種醫藥組合物，其包含醫療有效量之根據申請專利範圍第 17項之接合物。 36. —種醫藥組合物，其包含醫療有效量之根據申請專利範圍第 -166- 1357337 22項之接合物。 37.根據申請專利範圍第34項之醫藥組合物，其尚包括至少一種 醫藥上可接受之稀釋劑、輔劑或載劑。 ' 38. —種根據申請專利範圍第15項之接合物於製備供治療出現造 5 血或免疫功能降低之特徵之病變的藥物之用途。 39. —種根據申請專利範圍第17項之接合物於製備供治療出現造 血或免疫功能降低之特徵之病變的藥物之用途。 40. —種根據申請專利範圍第22項之接合物於製備供治療出現造 血或免疫功能降低之特徵之病變的藥物之用途。 ·〇 41.根據申請專利範圍第38項之用途，其中該病變係因化療、放 φ 射療法、感染性疾病、嚴重慢性嗜中性白血球減少症或白血 病所造成。 -167-