MXPA06010189A - Conjugados de almidon de hidroxialquilo y una proteina preparados por aminacion reductora - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, y a una proteína, donde estos conjugados se forman por reacción de aminación reductora entre por lo menos un grupo aldehído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal del almidón de hidroxialquilo o de un derivado del almidón de hidroxialquilo, y por lo menos un grupo amino de la proteína, de modo que el almidón de hidroxialquilo o el derivado del mismo están ligados covalentemente con la proteína a través de un enlace azometina o un enlace amino. La presente invención se refiere también a un método para producir estos conjugados y a los específicos de los conjugados.

Description

CONJUGADOS DE ALMIDÓN DE HIDROXIALQUILO Y UNA PROTEINA, PREPARADOS POR AMINACION REDUCTORA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a conjugados a almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, y a una proteína, donde estos conjugados están formados por medio de una reacción de aminación reductora entre por lo menos un grupo aldehido del almidón de hidroxialquilo o de un derivado del almidón de hidroxialquilo, y por lo menos un grupo amino de la proteína, de manera que el almidón de hidroxialquilo o un derivado del mismo está ligado covalentemente a la proteína a través de un enlace azo etina o .un enlace aminometileno. La presente invención se refiere también al método de producción e estos conjugados y a los usos específicos de los conjugados. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Generalmente se acepta que la estabilidad en las proteínas puede mejorarse y que se reduce la respuesta inmunitaria contra estas proteínas cuando estas proteínas están acopladas a moléculas poliméricas. La WO 94/28024 describe que las proteínas fisiológicamente activas modificadas con polietilen glicol (PEG) exhiben inmunogenicidad y antigenicidad reducida y que circulan en la corriente sanguínea por un tiempo considerablemente más REP:175350 prolongado que las proteínas no conjugadas, es decir que tiene una vida media en el plasma más prolongada. La WO 03/074087 se refiere a un método de acoplamiento de proteínas con un polisacárido modificado derivado de almidón. La acción de adhesión entre la proteína y el polisacárido, almidón de hidroxialquilo, es un enlace covalente que se forma entre el grupo aldehido terminal o un grupo funcional resultante de la modificación guímica de dicho grupo aldehido terminal de la molécula de almidón de hidroxialquilo, y un grupo funcional de la proteína. Como grupo reactivo de la proteína, se describen grupos amino, grupos tio y grupos carboxilo. Además, si bien se ofrece una vasta variedad de posibilidades de enlaces diferentes, en forma de muchas listas, que incluyen grupos funcionales diferentes, moléculas ligadoras diferentes teóricamente apropiadas, y procedimientos químicos diferentes, los ejemplos operativos describen únicamente dos alternativas: primero, se usa un almidón de hidroxietilo oxidado y se acopla directamente a proteínas usando activación de etildimetilaminopropil carbodiimida (EDC) , o un almidón de hidroxietilo no oxidado y acoplado directamente, es decir, sin un compuesto ligador a una proteína formadora de una base de Schiff, la cual es subsiguientemente reducida a la amina respectiva. Por lo tanto, los ejemplos operativos de WO 03/074087 no describen un solo conjugado que comprenda almidón de hidroxietilo, la proteína y una o más moléculas ligadoras. Adicionalmente, en cuanto a lo que se refiere a los conjugados formados por aminación reductora, la WO 03/074087 no contiene ninguna información en lo que se refiere a un grupo amino preferido de la proteína con la cual se lleva a cabo la aminación reductora. DESCRIPCIÓ DETALLADA DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, fue un objeto de la presente invención proveer nuevos conjugados de almidón de hidroxialquilo, preferiblemente de almidón de hidroxietilo, y una proteína, donde dichos conjugados tienen efectos terapéuticos beneficios cuando se administran a un sujeto que lo necesita. Es un objeto adicional de la presente invención proveer nuevos conjugados de almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, y una proteína, que se forman por aminación reductora mediante la reacción de un grupo amino del oligopéptido o del polipéptido con un aldehido o con un grupo ceto o con un grupo hemiacetal de almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, o con un derivado del mismo aldehido funcionarizado. Fue otro objeto de la presente invención proveer un método para producir dichos conjugados novedosos en los que dicho método se aplica usando condiciones de reacción específicas y seleccionadas . Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado polimérico, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo, dicho método comprende ligar covalentemente por lo menos un grupo aldehido o un grupo cetó o un grupo hemiacetal del polímero o el derivado polimérico a por lo menos un grupo amino de la proteína por aminación reductora, donde dicho método comprende adicionalmente o bien introducir por lo menos dos grupos aldehido en el polímero mediante una reacción de oxidación por apertura de anillo y hacer reaccionar por lo menos uno de dichos grupos aldehido del polímero con un .grupo amino de la proteína, la reacción del polímero con por lo menos un compuesto bifuncional, donde dicho compuesto comprende dos grupos funcionales M y Q, donde un grupo funcional M se hace reaccionar con el polímero y un grupo funcional Q químicamente modificado para proporcionar un derivado polimérico aldehido o ceto o hemiacetal funcionarizado, el cual se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína por aminación reductora. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado polimérico, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo, obtenible por un método para preparar un conjugado, donde dicho método comprende ligar covalentemente por lo menos un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal del polímero o del derivado polimérico, a por lo menos un grupo amino de la proteína mediante aminación reductora, y dicho método comprende además o bien introducir por lo menos dos grupos aldehido en el polímero mediante una reacción de oxidación por apertura de anillo y hacer reaccionar por lo menos uno de dichos grupos aldehido del polímero con un grupo amino de la proteína, o hacer reaccionar el polímero con por lo menos un compuesto bifuncional, donde dicho compuesto comprende dos grupos funcionales M y Q, donde un grupo funcional M se hace reaccionar con el polímero y un grupo funcional Q se modifica químicamente para proporcionar un derivado polimérico aldehido o ceto o hemiacetal funcionarizado, el cual se hace reaccionar con un grupo amino de la proteina por aminación reductora. El término "proteína" tal como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere a cualquier secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 2, preferiblemente por lo menos 5, más preferiblemente por lo menos 10, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, más preferiblemente por lo menos 25, más preferiblemente por lo menos 30, más preferiblemente por lo menos 35, más preferiblemente por lo menos 40, más preferiblemente por lo menos 45 , más preferiblemente por lo menos 50 y aún más preferiblemente por lo menos 100 aminoácidos . La proteína puede producirse por procedimientos químicos de síntesis o puede ser cualquier fuente humana o de otro mamífero, y puede obtenerse por purificación a partir de fuentes naturales . De acuerdo con la presente invención, la proteína puede ser un factor de crecimiento, una citoquina, un activador, un inhibidor, una enzima, un anticuerpo, un antígeno, una proteína de transporte, una proteína de bioadhesión, una hormona, un receptor, un supresor, o un derivado funcional o fragmento del mismo. El -término "derivado funcional o fragmento" tal como se usa en el contexto de-Jla presente invención se refiere a un derivado o fragmento que mantiene la propiedad o actividad biológica deseada de la molécula original total o parcialmente, por ejemplo, por lo menos 10%, más preferiblemente por lo menos 20%, más preferiblemente por lo menos 30%, más preferiblemente por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 80% y especialmente preferiblemente por lo menos 90% de la propiedad o actividad biológica deseada de la molécula original. Ejemplos particularmente preferidos de dichos fragmentos son, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos. Son ejemplos de proteínas la eritropoyetina (EPO) tal como EPO humana recombinante (rhEPO) , factores estimuladores y colonia (CSF) , tales como G-CSF de tipo G-CSF recombinante humano (rhG-CSF) , alfa-Interferón (IFN alfa) , beta-Interferón (IFN beta) o gamma-Interferón (IFN gamma) , tales como IFN alfa e IFN beta del tipo de IFN alfa o IFN beta humano recombinante (rhIFN alfa o rhIFN beta) , interleucinas, por ejemplo, IL-1 a IL-18 tales como IL-2 o IL-3 de tipo de IL-2 o IL-3 humano recombinante (rhIL-2 o rhIL-3), proteínas del suero tales como los factores de coagulación II-XIII del tipo de los factores VII, VIII, IX, alfal-antitripsina (AlAT) , proteína C activada (APC) , activadores de plasminógeno tales como activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) , tales como activador de plasminógeno de tejido humano tisular (hTPA) , AT III tales como AT III (rhAT III) humano recombinante, mioglobina, albúmina tal como albúmina de suero bovino (BSA) , factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor de crecimiento trombocítico (PDGF) , factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , factor de crecimiento de derivación cerebral (BDGF) , factor de crecimiento nervioso (NGF) , factor de crecimiento de célula B (BCGF) , factor de crecimiento neurotrófico de derivación cerebral (BDNF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factores transformadores de crecimiento tales como TGF alfa o TGF beta, BMP (proteínas óseas morfogénicas) , hormonas del crecimiento tales como hormonas del crecimiento humano, factores de necrosis tumoral tales TNF alfa o TNF beta, somatostatina, somatotropina, somatomedinas , hemoglobina, hormonas o prohormonas tales como insulina, gonadotropina, hormona estimuladora de melanocitos (alfa-MSH) , triptorrelina, hormonas hipotalámicas tales como hormonas antidiuréticas (ADH y oxitocina así como también hormonas liberadoras y hormonas inhibidoras de liberación, hormonas paratiroides, hormonas de la tiroides tales como tiroxina, tirotropina, tiroliberina, prolactina, calcitonina, glucagon, péptidos de tipo glucagon (GLP-1, GLP-2, etc.), exendinas tales cómo exendina-4, leptina, vasopresina, gastrina, secretina, integrinas, hormonas de glicoproteína (por ejemplo, LH, FSH, etc.), hormonas estimuladoras de melanosida, lipoproteínas y apo-lipoproteínas tales como apo-B, apo-E, apo-La, inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas, hirudina, inhibidor de la vía tisular, proteínas de plantas tales como lectina o ricina, veneno de abejas, veneno de víboras, inmunotoxinas, antígeno E, inhibidor de alfa-proteinasa, alérgeno de ambrosía, melanina, proteínas de oligolisina, proteínas de RGD o receptores opcionalmente correspondientes para una de estas proteínas; o un derivado funcional o fragmento de cualquiera de estas proteínas o receptores . Las enzimas preferidas son, por ejemplo, enzimas específicas de carbohidrato, enzimas proteolíticas, oxidadas, óxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liases, isomerasas, quinasas y ligasas . Ejemplos no limitativos de específicos son asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, adenosina desaminasa, glutaminasa, glutaminasa-asparaginasa, fenilalanina, triptofanasa, ti.rosinasa, superóxido dismutasa (SOD) , endotoxinasa, catalasa, peroxidasa, calicreína, tripsina, quimotripsina, elastasa, termolisina, lipasa, uricasa, adenosina difosfatasa, fosforilasa de nucleósido de purina, bilirrubina oxidasa, glucosa oxidasa, glucodasa, gluconato oxidasa, galactosidasa, glucocerebrosidasa, glucuronidasa, hialuroñldasa, factor tisular, estreptoquinasa," uroquinasa, MAP-quinasas, ADNasas, ARNasas, lactoferrina y derivados o fragmentos funcionales de las mismas . De acuerdo con realizaciones preferidas de la presente invención, la proteína se selecciona del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3 , mioglobina, SOD, 8 y BSA. De acuerdo con realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, la proteína se selecciona del grupo que consiste en rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, mioglobina, SOD, AIAT y BSA. La eritropoyetina (EPO) es una hormona de glicoproteína necesaria para la maduración de las células progenitoras eritroides, en eritrocitos. En adultos humanos, se produce en el riñon. La EPO es esencial para regular el nivel de los glóbulos rojos de la sangre en la circulación. Los trastornos marcados por bajos niveles de oxígeno tisular provocan un aumento de la biosíntesis de EPO, lo cual estimula a su vez la eritropoyesis . Una pérdida de la función renal tal como la que se observa en las insuficiencias renales crónicas, pro ejemplo, da típicamente como resultado una disminución de la biosíntesis de EPO y una reducción concomitante de los glóbulos rojos de la sangre. La eritropoyetina es "una hormona acida de glicoproteína de aproximadamente 34.000 Da. La eritropoyetina humana es un polipéptido de 166 aminoácidos que existen en forma natural como monómero (Lin et al., 1985, PNAS 82, 7580-7584, EP 148 605- B2 , EP 411 678 B2) . La identificación, clonación y expresión de genes que codifican eritropoyetina han sido descriptas por ejemplo, en la patente norteamericana 4.703.008. La purificación de eritropoyetina recombinante a partir de un medio de cultivo de células, que sustenta el crecimiento de células de mamífero que contienen plásmidos de eritropoyetina recombinante, se ha descripto por ejemplo en la patente norteamericana 4.667.016. Generalmente se cree en este campo de la técnica, que la actividad biológica de EPO in vivo depende principalmente del grado de ácidos siálicos unidos a EPO (ver por ejemplo, EP 428 267 Bl) . Teóricamente, 14 moléculas de ácido siálico pueden unirse a una molécula EPO en los extremos terminales de las cadenas secundarias de carbohidrato ligadas a los sitios de N- y 0-glicosilación. Son necesarias etapas de purificación sumamente sofisticadas para obtener preparaciones EPO altamente sialiladas . Para una información adicional detallada sobre la eritropoyetina ver Krantz, Erythropoietin, 1991, Blood, 77(3): 419-34 (Review) and Cerami, Beyond erythropoiesis : novel applications for recombinant human erythropoietin, 2001, Semin Hematol., (3 Suppl 7): 33-9 (Review). G-CSF es una glicoproteína de 21 kDa, estabilizada por dos enlaces disulfuro del intracadena y que contiene una única porción carbohidrato ligada a O. El G-CSF maduro tiene 174 aminoácidos. En el cuerpo animal, el G-CSF se sintetiza mediante células estromales de médula ósea, macrófagos y fibroblastos. Su función principal es la de ser un factor de crecimiento y diferenciación para los neutrófilos y sus células precursoras. Sin embargo, se sabe también en el arte que el G-CSF activa los neutrófilos maduros. Además, estimula el crecimiento/diferenciación de varias otras células progenitoras hematopoyéticas (en sinergia con los factores de crecimiento hematopoyético adicionales) y provee la proliferación y migración de células endoteliales . Clínicamente, el G-CSF se administra para el tratamiento de deficiencias en niveles neutrofílicos (causadas, por ejemplo, por anemia aplásica, mielodisplasia, SIDA, o quimioterapia) . El G-CSF puede producirse por procedimientos de síntesis química o puede ser de origen humano (ver por ejemplo, Burgess, A.W. et al. 1977, Estimulación mediante un medio acondicionado placental humano de la formación de colonias hematopoyéticas mediante células de médula humana, Blood 49 (1977), 573-583;. Shah, R.G. et al. 1977, Caracterización de la actividad estimuladora de colonia producida por monolitos humanos y linfocitos estimulados por fitohemaglutinina, Blood 50 (1977), 811) o por otra fuente de mamíferos y pueden obtenerse por purificación a partir de fuentes naturales tales como placenta humana, sangre humana u orina humana. Además, un lote de carcinomas epiteliales, células de leucemia mieloide aguda y varias líneas de células tumorales (carcinomas de vejiga, méduloblastomas) , son capaces de expresar este factor. Además, la expresión G-CSF abarca también la variante de G-CSF en la cual uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1 a 25, preferiblemente 1 a 10, más preferiblemente 1 a 5, más preferiblemente 1 o 2) han sido intercambiados con otro aminoácido y que exhiben actividad G-CSF (ver por ejemplo, Riedhaar-Olson, J.F. et al. 1996, Identificación de residuos crítica para la actividad del factor estimulador de colonia granulocítica humana, Biochemistry 35:9034-9041 1996; Pat. norteamericanas Nos. 5.581.476; 5.214.132; 5.362.853; 4.904.584). La medición de la actividad de G-CSF ha sido descripta en el arte (para una medición de la actividad de G-CSF in vitro ver por ejemplo, Shirafuji, N. et al.1989. Un nuevo bioensayo para el factor estimulador de colonia granulocítica humana (hG-CSF) usando células NFS-60 mieloblásticas murinas como objetivo y estimación de sus niveles en el suero de personas sanas normales y pacientes con desórdenes infecciosos y hematológicos, Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119; para una medición de la actividad de G-CSF in vivo ver por ejemplo, Tanaka, H. et al. 1991,_Farmacocinética de factor estimulador de colonia granulocítica humana recombinante conjugado con polietilen glicol en ratas, Cáncer Research 51, 3710-3714, 1991) . Otras publicaciones en las cuales los ensayos para la medición de la actividad de G-CSF ha sido descrita, son la patente norteamericana No. 6.555.660; Nohynek, G.J. et al.1997, Comparación de la potencia de los factores estimuladores de . colonia granulocítica, humana glicósilados y no glicosilados recombinantes, en ratas CD neu'tropénicas y no neutropénicas, Cáncer Chemother Pharmacol (1997). 39; 259-266. Preferiblemente, el G-CSF se produce recombinantemente . Esto incluye la expresión de huéspedes procarióticos o eucarióticos de secuencias de ADN exógenas obtenidas por clonación genómica o de ADNc o síntesis de ADN. Los huéspedes procarióticos apropiados incluyen varias bacterias tales como E. coli. Los huéspedes eucarióticos apropiados incluyen levaduras tales como S. cerevisiae y células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino y células de mono. La producción recombinante de una proteína es conocida en el arte. En general, esta incluye la transfección de células huésped con un vector de expresión apropiado, el cultivo de células huésped bajo condiciones que permitan la producción de la proteína y la purificación de la proteína a partir de células huésped. Para información detallada, ver por ejemplo, Souza, L.M.et al. 1986, Factor estimulador de colonia de granulocitos humanos recombinante: efectos sobre células mieloides normales y leucémicas, Science 1986 232:61-65,1986; Nagata, S. et.al. 1986, Clonación y expresión molecular de ADNc para el factor estimulador de colonia de granulocitos humanos, Nature 319:415-418, 1986; Komatsu, Y. et al. 1987, Clonación del ADNc del factor estimulador" de colonia de granulocitos a partir de_ macrófagos humanos y su expresión en Escherichia coli, Jpn J Cáncer Res. 1987 78 (11) : 1179-1181. En una- realización preferida, el G-CSF tiene la secuencia de aminoácido de G-CSF maduro humano (ver por ejemplo, Nagata, S. et. al.1986, Clonación y expresión molecular de ADNc para el factor estimulador de colonia de granulocitos humanos, Nature 319:415-418, 1986), y puede contener adicionalmente una metionina en su término amino, lo cual da luego como resultado una proteína de 175 aminoácidos. Además, en lugar de la metionina, el G-CSF puede contener un residuo serina o treonina. El G-CSF usado en los métodos de la presente invención y los conjugados de acuerdo con la presente invención pueden comprender una cadena secundaria de carbohidrato unida al G-CSF a través de glicosilación ligada a O en la posición Thr 133, es decir el G-CSF está glicosilado (V. Gervais et al., Eur. J. Biochem. 1997, 247, 386-395). La estructura de la cadena secundaria de carbohidrato puede ser NeuNAc (alfa2- 3 ) Gal (betal-3 ) [NeuNAc (alfa2-6) ] GalNAc y (alfa2-3 ) Gal (betal- 3) GalNAc (NeuNAc = N-ácido acetilneurámico, GalNAc = N- acetilgalactosamina) . Se ha sugerido la modificación de G-CSF y otros polipéptidos, para introducir por lo menos una cadena de carbohidrato adicional en comparación con el polipéptido natural (patente norteamericana No. 5.218.092). Dependiendo del huésped empleado, el producto de expresión de G-CSF puede ser glicosilado con carbohidrato de mamífero u otros eucarióticos. Usualmente, cuando se produce G-CSF en células eucarióticas, la proteína es post-translacionalmente glicosilada. Consecuentemente, la cadena secundaria de carbohidrato puede haber sido unida al G-CSF durante la biosíntesis en mamíferos, especialmente en células humanas de insecto o levadura. EL G-CSF (rhG-CSF) humano recombinante se usa generalmente para el tratamiento de varias formas de leucopenia. Por lo tanto, las preparaciones comerciales de rhG-CSF se encuentran disponibles bajo los nombres filgrastim (Gran® y Neupogen®) , lenograstim (Neutrogin® y Granocyte®) y nartograstim (Neu-up®) . Gran® y Neupogen® son no glicosiladas y producidas en células de ?. coli recombinantes. Las Neutrogin® y Granocyte® están glicosiladas y son producidas en células de CHO recombinantes y Neu-up® es no glicosilada, con cinco aminoácidos sustituidos en la región N-terminal del rhG- CSF intacto producido en células E. coli recombinantes. Los interferones son citoquinas que intermedian las actividades antivirales, anti-proliferativas é inmunomoduladoras, en respuesta a la infección viral y otros inductores biológicos. En contraste con IFN alfa, IFN beta es sumamente especifico de especie. Existen dos subtipos de IFN beta, IFN beta la y IFN beta lb. Cuando se llega a la producción industrial, entonces la diferencia principal entre IFN beta la e IFN beta lb es el respectivo sistema celular utilizado para su producción. IFN beta la se produce con células de mamífero y recibe la designación la debido a " su secuencia de aminoácido que es idéntica a la del interferón beta natural . IFN beta lb es producido por bacterias . Los interferones tal como la mayoría de otras proteínas de mamífero, están modificados post-translacionalmente por glicosilación. Las bacterias, sin embargo, carecen de la capacidad de glicosilar proteínas y por lo tanto IFN beta lb no incluye las cadenas secundarias de carbohidrato que se encuentran en el material natural. IFN beta la tiene 166 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 22.500 D, IFN beta lb tiene 165 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 18.500 Da, debido a que falta la metionina N-terminal en IFN beta lb así como también la glicosilación debida al método de producción de bacterias . La secuencia de aminoácido del interferón beta humano se da por ejemplo, en la EP 0 218 825 Al. La estructura cristalina del interferón beta, fue informada en: Proc . Nati . Acad. Sci . USA 94 (1997) pp 11813-11818, Biochemistry, Karpusas M, Nolte M, Benton CB, Meier W, Lipscomb WN, - Goelz S. Las preparaciones comerciales de interferón beta son Betaseron® (IFN beta Ib) , Avonex® y Rebif® (IFN beta la) . El interferón beta Ib es manufacturado mediante fermentación bacteriana de una cepa de E. coli que es portadora de un plásmido genéticamente manipulado que contiene el gen para interferón betaseri7 humano . El gen natural se obtuvo de fibroblastos humanos y se alteró de una manera que sustituye el residuo serina por cisteína que se encuentra en la posición 17. El interferón beta la se produce por tecnología de ADN recombinante usando células de Ovario de Hámster Chino (CHO) genéticamente manipuladas en las cuales se ha introducido el gen beta interferón humano . La secuencia de. aminoácido de IFN beta la es idéntica al interferón beta humano derivado de fibroblasto natural. El interferón beta natural y el interferón beta la están glicosilados conteniendo cada uno una porción carbohidrato compleja única ligada a N en Asn80. Los fármacos con interferón beta están indicados para el tratamiento de esclerosis múltiple remitente relapsante. Sin embargo,' existen muchos efectos secundarios graves relacionados con la administración de los productos de fármacos con interferón beta. Además, son administrados por inyección (intramuscular o subcutánea) , lo cual implica riesgos adicionales. La reducción de los efectos secundarios y una administración más fácil (por ejemplo, menos frecuente) , son las razones por las cuales se ha llevado a cabo un extenso trabajo de desarrollo para mejorar las propiedades de IFN beta. La modificación polimérica de proteínas es una técnica que se aplica para mejorar las propiedades de las proteínas. La -técnica principalmente usada es la modificación de interferón con polietilen glicol, conocida como PEGilación. Las formas de IFN alfa se producen en forma natural mediante monocitos/macrófagos, células linfoblastoides, fibroblastos y una cantidad de diferentes tipos de células siguiendo la inducción por virus, ácidos nucleicos, hormonas glucocorticoides y otros inductores . Se conocen por lo menos 23 variantes diferentes de IFN alfa. Las proteínas individuales tienen masas moleculares comprendidas entre 19-26 kD y consisten en proteínas con longitudes de 156-166 y 172 aminoácidos. Todos los subtipos de IFN alfa poseen una región de secuencia conservada común entre las posiciones de aminoácidos 115-151 mientras que los extremos amino-terminales son variables . Muchos subtipos de IFN alfa difieren en sus secuencias en únicamente una o dos posiciones . Los enlaces disulfuros se forman entre cisteínas en las posiciones 1/98 y 29/138. El enlace disulfuro 29/138 es esencial para la actividad biológica mientras que el enlace 1/98 puede reducirse sin afectar la actividad biológica. Todas las formas IFN alfa contienen un potencial sitio de glicosilación pero la mayoría de los subtipos no están glicosilados . En contraste con IFN gamma, las proteínas IFN alfa son estables a un pH de 2. La producción industrial de IFN alfa se lleva a cabo usando E. coli genéticamente modificado. Debido a que las bacterias carecen de capacidad para glicosilar las proteínas, las dos variantes de IFN alfa (IFN alfa 2a, y IFN alfa 2b), que se usan en productos farmacológicos aprobados, están glicosiladas . Un inconveniente principal del IFN alfa convencional son los efectos secundarios. Se ha dedicado muchísimo trabajo para mejorar los fármacos de interferón alfa, los cuales están indicados para el tratamiento de la Hepatitis C. La modificación polimérica de proteínas es una técnica que se aplica para mejorar las propiedades de las proteínas . La técnica principalmente usada es la modificación de interferón con polietilen glicol, que se conoce como PEGilación. Dos variantes PEGiladas comercialmente obtenibles de IFN-alfa son PEGIntron® (SP) y Pegasys® (Roche) . La antitrombina III (AT III) es un inhibidor de serina proteasa que inhibe la trombina y el factor Xa (Travis, Annu. Rev. Biochem. 52: 655, 1983)'. En menor grado, los factores IXa, Xla, Xlla, tPA, uroquinasa, tripsina, plasmina y calicreína son también inhibidos (Menache, Semin. Hematol. 28:1, 1991; Menache, Transfusión 32:580, 1992; Lahiri, Arch. Biochem. Biophys. 175:737, 1976). La AT III humana se sintetiza en el hígado como una glicoproteína de cadena única de 432 aminoácidos con un peso molecular (MW) de aproximadamente 58.000 D. Su concentración de plasma está dentro del rango de 14-20 mg/dL (Rosenberg, Rev. Hematol. 2:351,1986; Murano, Thromb. Res. 18:259, 1980). La proteína es portadora de tres puentes disulfuro (Cys 8-128, Cys 21-95, Cys 247-430) y cuatro cadenas carbohidrato ligadas a N (Asn 96,- 135,-155,-192) que constituyen el 15% de la masa total (Franzen, J. Biol. Chem.. 255:5090, 1980; Peterson, The Physiological Inhibitions of Blood Coagulation and Fibrinolysis, Elsevier/ North- Holland Biomedical Press 1979, p 43) . La antitrombina es un inhibidor de serina proteinasa del tipo serpina que es de gran importancia para el control de la coagulación de la .sangre. La AT III ' es el anticoagulante endógeno más abundante que circula en el plasma humano . Este inhibidor de serina proteasa participa en la regulación de la coagulación tanto en estados fisiológicos como patológicos (Opal, Crit. Care Med. 2002, 30:325). Circula en dos formas con baja capacidad inhibidora de trombina (Pike, J. Biol.

Chem. 272:19562, 1997; Ersdal-Badju, Fed. Proc. 44:404, 1985) (85-95% de isoforma alfa con 4 cadenas de oligosacáridos biantenarias, mono- y di-sialiladas, 5-15% es la isoforma beta de alta afinidad con heparina que carece de glicosilación en el enlace de ácido siálico 2-6 terminal Asn 135) . Una pequeña fracción del AT III circulante está normalmente unida a proteoglicanos en la superficie de células endoteliales vasculares . Estos proteoglicanos son predominantemente heparan sulfato, una molécula, que es estructuralmente similar a la heparina, que es capaz de catalizar la inhibición de trombina de la misma manera que la heparina. La unión de AT III a unidades de pentasacáridos bien definidas de heparina produce un -cambio conformacional de la proteína (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. "Res. Commun. 116:492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266: 6353 ;_'-.1991; Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991;" Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997) . Esta unión cataliza un aumento de 1000 veces la actividad inhibidora AT III con respecto a la trombina y al Factor Xa (Rosenberg, Fed. Proc. 44:404,1985; Bjork, Antitrombina e inhibidores relacionados de proteinasas de coagulación en Barett, Salvesen (eds.): Proteinase Inhibitors, vol 17, Amsterdam, The Netherlands Elsevier Science Publishers (Biomedical Devision) 1986 p 489; Olson, J. Biol. Chem. 267:12528,1992). Esta localización de una fracción de la AT III en la superficie endotelial, donde son comúnmente generadas enzimas de la cascada de coagulación intrínseca, permite que la AT III neutralice rápidamente estas enzimas hemostáticas y proteja las superficies naturales contra la formación de trombo. Por lo tanto, las propiedades primordiales de AT III para la prevención eventos trombóticos son su capacidad para unir el catalizador heparina, sufrir el cambio conformacional que altera sus propiedades inhibidoras, y unir irreversiblemente trombina o Factor Xa inhibiendo de esta manera sus actividades. La AT III tiene también notables propiedades anti-inflamatorias, varias de las cuales son el resultado de sus acciones en la cascada de coagulación (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis . 2002, 13:657). Las proteasas de coagulación activadas tales como el factor X activado y la trombina contribuyen a inflamación; por ejemplo, mediante la liberación de mediadores pro-inflamatorios . La inhibición de estas proteasas mediante AT III previene su interacción específica con células y reacciones subsiguientes (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis 2002, 13:657). Las propiedades anti-inflamatorias de AT III independientes de la coagulación involucran interacciones directas con células lo cual conduce a la liberación de por ejemplo, prostaciclina. La unión de AT III a un receptor celular recientemente identificado, sindican-4, conduce a la interferencia con la señal intracelular inducida por mediadores tales como lipopolisacáridos y, por lo tanto, a una modulación por disminución de la respuesta inflamatoria (Roemisch, Blood Coagul Fibrinolysis 2002, 13:657). Además del análisis de la estructura de AT III libre, se han llevado a cabo muchos estudios que evalúan los sitios de formación de complejos para unidades de oligosacáridos de heparina debido a la importancia del complejo de heparina AT III para la función fisiológica de AT III (Choay, Ann. NY Acad. Sci. 370:644, 1981; Choay, Biochem. Biophys. Res. Commun. 116:492, 1983; Olson, J. Biol. Chem. 266:6353, 1991; Bauer, Semin. Hematol. 28:10, 1991; Carell, Thromb. Haemost. 78:516, 1997). La AT III puede producirse siguiendo técnicas de fraccionamiento de plasma humano clásicas. La cromatografía de "afinidad (heparina- sefarosa) usando la alta afinidad de la heparina como ligando para AT III seguida de tratamiento con calor para la inactivación viral, se usa para la separación del plasma. Además, del fraccionamiento del plasma, se encuentran disponibles alternativas más recientes para la producción AT III, siguiendo técnicas de producción recombinantes que proveen una acceso más seguro a esta importante Proteína terapéutica (Levi, Semin Thromb Hemost 27: 405, 2001). ATryn™ es una AT III humana recombinante (rh AT III) producida por GTC Biotherapeutics en cabras transgénicas. Se han llevado a cabo investigaciones detalladas que comparan las propiedades estructurales y funcionales de ambos plasmas derivados de AT III (ph AT III) y rh AT III (Edmunds, Blood, 91:4561, 1998). En base a estos experimentos, se ha observado que rh AT III es estructuralmente idéntico a ph AT III con excepción de la glicosilación. Se encontraron estructuras de oligomannosa en Asn 155 del material transgénicamente producido, mientras que se encontraron estructuras complejas en el caso de la proteína derivada de plasma. Algunas de las unidades galactosa del pd AT III están sustituidas con unidades GalNac en el rh AT III. Un grado superior de fucosilación en rh AT III es otra diferencia. Finalmente, el patrón de sialilación de ambas proteínas difiere de dos maneras : el rh AT III está menos sialilado y contiene ácidos N-acetil- así como también N- glicolilneuramínicos . Esta diferencia estructural entre las dos partes de carbohidrato de ambas moléculas, da también como resultado diferentes propiedades bioquímicas . Las siguientes drogas AT III se encuentran disponibles en el mercado hospitalario Europeo (Source: IMS-ATC group 2001) : Kybernin® (Aventis Behring) , AT III (Baxter, Grifols) , Atenativ® (Pharmacia) , Aclotine® (LFB) , Anbin® (Grifols) . El factor VIII participa en esta cascada intrínseca de coagulación de . la sangre de las proteinasas y sirve como cofactor en la reacción del factor X convertidor del factor IXa a la forma activa, factor Xa, que finalmente conduce a la formación de un coágulo de fibrina. Una falta de inestabilidad del factor VIII conduce a la hemofilia A, un desorden de coagulación ligado a x recesivo común. La frecuencia de la hemofilia A es de 1-2 en 10.000 nacimientos masculinos en todos los grupos étnicos . Pacientes o bien expresan niveles del factor VIII muy por debajo de los normales o bien pertenecen al grupo de pacientes positivos denominado grupo crm (material de reacción cruzada) (aproximadamente 5% de los pacientes) que tienen una cantidad considerable de factor VIII en su plasma (por lo menos 30% del normal) , pero la proteína es no funcional. Aproximadamente 50% de todos los pacientes tienen hemofilia grave con una actividad de factor VIII de menos de 1% de lo normal; tienen frecuentes hemorragias espontáneas en las articulaciones, músculos y órganos internos.- La hemofilia liviana A, que ocurre en 30-40% de los pacientes está asociada con una actividad del 5-30% normal. La hemorragia ocurre únicamente después de trauma o cirugía significativa. La hemofilia moderadamente grave a ocurre en aproximadamente 10% de los pacientes. Aquí, la actividad del factor VIII es 2-5% de la normal, y las hemorragias ocurren ya después de un trauma menor. La vida media in vivo humana del factor VIII es usualmente de 10-15 horas, pero cabe observar que la liberación, estabilidad y cinética de degradación están también influenciadas por otro factor, el factor Willebrand. El factor VIII es producido por extracción convencional a partir de plasma humano donado o bien, más recientemente, mediante el uso de sistemas recombinantes. Por ejemplo, se usaron células de riñon de hámster bebé (BHK) para la producción de Kogenate® (Bayer) , mientras que se usaron células de Ovario de Hámster Chino (CHO) para otro producto, Rekombinate® (Baxter) . Tal como la proteína de cadena única completa de 2351 aminoácidos con un peso molecular nominal de 267. kD (Toóle et al., 1984, Nature 312: 342) o en versiones diferentes, en las cuales el dominio B completo o partes del mismo están delecionados para obtener un producto más estable y que provea un rendimiento de producción más elevado 5 (Bhattacharyya et al. 2003, CRIPS 4/3: 2-8). El producto precursor de procesa en dos cadenas polipeptídicas de 200 y 80 -.-. kD en el Golgi y las dos cadenas que son mantenidas conjuntamente por iones metálicos se expresan en la sangre (Kaufman et al., 1988, J. Biol. Chem.,~ 263: 6352). _La~ actividad procoagulante requiere disociación de trombina adicional para proporcionar fragmentos de 54 kD y 44 kD de la cadena pesada además de un fragmento "de cadena liviana de 72 kD (Aly et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA: 4933). En los concentrados de factor VIII derivados de plasma humano, se han descripto varias formas de factor VIII totalmente activas fragmentadas (Anderson et al., 1986, Proc. Nati. Acad, Sci. 83: 2979). Un efecto secundario común de la administración de factor VIII recombinante o plasmático son las reacciones inmunológicas en una cantidad bastante elevada de pacientes (hasta 30%) que alteran el valor terapéutico. En el pasado, se llevaron a cabo varios intentos para la tolerancia de los pacientes mediante inducción oral de tolerancia pero los resultados no fueron demasiado alentadores . Se han propuesto nuevos medios genéticos para inducir tolerancia, pero hasta el presente no se les encontró aplicación amplia. Los presentes inventores han contemplado una proteína hesilada que tiene menor grado de inmunogenicidad y que por lo tanto podría reducir esta complicación. El factor VIII es muy rico en residuos lisina (casi 220 de los 2350 aminoácidos totales) , que podrían usarse para la realización de la Aminación Reductora. -- La alfal- Antitripsina (AlAT, denominada también inhibidor de alfa 1-proteinasa) es un inhibidor de proteinasa que ha demostrado que inhibir virtualmente toda la serina proteinasa (Travis Ann . Rev. Biochem. 52 (1983) p. 655) incluyendo elastasa neutrofílica, trombina, factores Xa y Xla. A1AT es una glicoproteína de una sola cadena sintetizada en el hígado, con 394 aminoácidos, y un peso molecular de 53 kD. La concentración de plasma está dentro del rango de 1-1,3 g/l. La presencia de únicamente de una cisteína en la proteína entera no permite la formación de puentes disulfuro intramoleculares . La molécula es portadora de tres cadenas secundarias de carbohidrato (Asn 46, 83, 247) (Mega J. Biol . Chem. 255 (1980) p. 4057; Mega J. Biol . Chem. 255 (1980) p. 4053; Carell FEBS Letters 135 (1981) p. 301; Hodges Biochemistry 21 (1982) p. 2805) que representa el 12% del peso molecular. Se descubrieron dos tipos de cadenas de carbohidrato que tienen una estructura bi- o triantenaria, respectivamente (Hodges J. Biol . Chem. 254 (1979) p. 8208) . La AlAT humana ocurre en por lo menos veinte formas diferentes en la población general. La icro-heterogenicidad es un resultado de cantidades variables de los dos tipos de cadenas de carbohidrato. La función primordial es el control de la actividad de la elastasa neutrofílica (Travis Ann . Rev. Biochem. 52 (1983) p. 655) . Una actividad descontroiada de la elastasa conduce a un ataque sobre los tejidos epiteliales con el resultado de un daño irreparable. Durante el proceso de inactivación el AlAT actúa como substrato para la adhesión de elastasa al centro activo de la proteasa que subsiguientemente es inactivada por esta formación de complejo. Una deficiencia de AlAT causa por ejemplo enfisema pulmonar lo" cuál está conectado a una lesión del epitelio pulmonar. La distribución de los dos tipos de cadenas secundarias de carbohidrato de AlAT en los tres sitios de N-glicosilación de AlAT es diferente para cada isotipo de AlAT. La producción clásica de AlAT se lleva a cabo siguiendo técnicas de fraccionamiento de plasma usando diferentes etapas de cromatografía por afinidad de plasma humano. Sin embargo, una forma más reciente para producir AlAT es el uso de técnicas recombinantes . PPL Therapeutics ha desarrollado un procedimiento que permite recuperar AlAT (rHAlAT) humano recombinante a partir de leche de ovinos transgénicos (Olman Biochem. Soc. Symp . 63 (1998) p. 141; Tebbutt Curr. Opin . Mol . Ther. 2 (2000) p. 199; Carver Cytotechnology 9 (1992) p. 77; Wright Biotechnology (NY) 9 (1991) p. 830) . Con respecto a la parte proteínica de la molécula, rhAlAT muestra una estructura idéntica en comparación con pdAlAT. Pero - tal como sucede en el caso de otras proteínas humanas producidas recombinantemente - ocurren diferencias en las cadenas secundarias de carbohidrato, especialmente con respecto a la cantidad de residuos de ácido siálico. El activador de plasminógeno de tipo tisular (tPA) es una importante serina proteasa del tipo de la tripsina en la lisis de los coágulos. En presencia de un coágulo de fibrina, tPA convierte plasminógeno a plasmina, lo cual degrada la fibrina. La TPA exhibe actividad incrementada en presencia de fibrina y como resultado, produce una activación . de plasminógeno específico de fibrina (M. W. Spellman, L.J. Basa, C.K. Leonard, J.A. Chakel, J.V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100) . La plasmita solubiliza la fibrina, lo cual provee productos de degradación de fibrina. A través de un mecanismo de retro-alimentación positiva, la fibrina incrementa su propia degradación mediante la estimulación de la activación de plasminógeno intermediada por tPA (R.J. Stewart et.al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp. 10112-10120) . La htPA es un activador fisiológico de fibrinólisis, que está presente en diferentes tipos de tejidos. Es una glicoproteína con un peso molecular de aproximadamente 68 kD. En forma natural, la tPA existe en forma de cadena única (activador de plasminógeno de tipo tisular de cadena única, sctPA) , que puede convertirse por disociación de la plasmita en el enlace peptídico Arg 275-Ile 276 en una estructura de cadena doble (activador plasminógeno de tipo tisular de cadena doble, tctPA) . Para terapia de fibrinólisis, se produce en forma recombinante como rtPA (activador de plasminógeno de tipo tisular recombinante) .

Existen diferentes tipos de tPA que muestran diferencias estructurales en la estructura carbohidrato. El tPA de tipo I tiene oligosacáridos N-ligados en los aminoácidos Asnll7, Asnl84 y Asn448. El tPA de tipo II está glicosilado en Asnll7 y Asn448. Ambos tipos contienen un residuo fucosa ligado a O en Thr61 (K. Mor.i et.al. The Journal of Biological Chemistry 270 (1995) pp. 3261-3267) . La estructura carbohidrato de tPA expresada en células CHO fue investigada, y mostró una gran variedad de estructuras di-, tri- y tetraantenarias de las cadenas de azúcar (M. W. Spellman, L.J. Basa, C.K. Leonard, J.A. Chakel, J.V. O'Connor, The Journal of Biological Chemistry 264 (1989) p. 14100) . La estructura primaria de tPA contiene varias cisteínas, que se cree que están entrecruzadas y además de un residuo cisteína libre en el sitio 83, que puede interactuar con otro tPA, formador de un dímero . Varios resultados indican que la depuración in vivo de tPA está influenciada por la estructura carbohidrato, particularmente por el oligosacárido de alto contenido de mannosa adherida en el sitio Asnll7. Otro mecanismo de depuración propuesto involucra el reconocimiento del residuo fucosa ligado a O, en Thr61 mediante un receptor de alta afinidad en los hepatocitos . Este residuo está próximo a Cys83. Se ha desarrollado un tPA (TNK-tPA) biomanipulado para prolongar la vida media. El sitio de glicosilación en la posición 117, fue cambiado a la posición 103. La asparagina en el sitio 117 fue sustituida con Glutamina y Treonina en él sitio 103 sustituido con Asparagina. El TNK-tPA es resistente a la inactivación causada por el inhibidor 1 activador de plasminógeno, "debido a la sustitución tetra-alanina en el dominio proteasa (R.J. Stewart et.al. The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) pp. 10112-10120) . El TNK-tpA está en el mercado como Tenecteplase® (Boehringer Ingélheim) . El TNK-tPA puede administrarse como bolo intravenoso único mientras que el tPA debe ser administrado en forma de un bolo seguido de una infusión. La proteína activada C (APC) es un modulador de la coagulación e inflamación asociado con varias sepsis . La Proteína Activada C se convierte a partir de su precursor inactivo (proteína C) con trombina acoplada a trombomodulina. Este complejo disocia una corta cadena pesada de la forma péptido de activación N-terminal, lo cual da como resultado la proteína activada C. La Drotrecogina alfa (activada) es una proteína C activada humana recombinante (rhAPC) . Su secuencia de aminoácido es idéntica a la proteína C activada derivada de plasma y tiene propiedades similares. La proteína C activada es comercializada por Eli Lilly como Xigris®. Se produce en una línea de célula humana (HEK293), dentro de la cual se introduce los vectores de expresión de la proteína C. La línea celular se usó debido a su capacidad para llevar a cabo una serie correcta de modificaciones post-translacionales complejas que son necesarias para la actividad funcional. La proteína C activada humana recombinante es una glicoproteína de 2 cadenas que cotienen 4 sitios de N-glicosilación" y 12 enlaces disulfuro. La cadena pesada contiene 250 aminoácidos. En esta cadena,- siete residuos son cisteína y tres son sitios de glicosilación ligados a N (Asn-248, Asn-313 y Asn-329) . Los siete residuos cisteína forman tres enlaces disulfuro dentro de la cadena pesada y un enlace disulfuro entre las cadenas. La cadena liviana contiene un sitio de glicosilación ligado a N (Asn-97) y 17 residuos cisteína, que forman ocho enlaces disulfuro dentro de la cadena liviana y un enlace disufluro entre las cadenas . Los primeros nueve ácidos glutámicos en la cadena liviana están gamma carboxilados (Gla) y el ácido aspártico 71 está beta hidroxilado. El rhAPC tiene una secuencia de aminoácido idéntica a la de la proteína C activada derivada de plasma humano, pero difiere de esta última en su patrón de glicosilación. La proteína C activada es una proteasa que pertenece a la familia de serina proteasa. Juega un rol principal en la regulación de la coagulación. La base para la función antitrombótica de la proteína C activada es su capacidad para inhibir la función trombina. Además, la proteína C activada es un importante modulador de la inflamación asociado con sepsis grave. Los inhibidores de serina proteasa endógenos son inhibidores naturales para la proteína C activada, lo cual da como resultado una proteína C activada que tiene una vida media de actividad circulatoria muy corta (menos de 30 minutos) in vivo. La depuración de la proteína C activada a partir de la circulación es intermediada por la combinación de por lo menos tres procedimientos que incluyen la inhibición de la actividad enzimática de la proteína C activada mediante inhibidores endógenos de proteasa, . la depuración de los complejos inhibidores de proteína C activada y/o proteína C activada-serina proteasa, mediante órganos tales como el hígado y el riñon, y la degradación de los complejos inhibidores de proteína activada C y/o proteína activada C-serina proteasa, mediante proteasas circulantes o tisulares. Los estudios clínicos de fase I con infusión de 24 horas a 24 µg/kg/h dieron como resultado una concentración de plasma en estado fijo de 70 ng/ml. La vida media de rhAPC medida al final de una infusión fue de 0,5-1,9 h. Las concentraciones de rhAPC en el plasma cayeron por debajo del límite de detección de 10 ng/ml dentro de las 2 horas de terminación de la infusión. Debido a su corta vida media fisiológica y farmacocinética, en uso clínico para terapia séptica, la proteína C activada es infundida continuamente a cierto régimen para mantener la concentración deseada en el plasma. Se efectuaron ciertos esfuerzos para mejorar el perfil farmacocinética de la proteína C activada. Por ejemplo, D.T. Berg et. al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100 (2003) pp. 4423-4428, describen una variante manipulada de proteína C activada con vida media en el plasma prolongada. El factor VII participa en la cascada de coagulación sanguínea intrínseca, de proteinasas y -^promueve la hemostasis por activación de la vía extrínseca de la cascada de coagulación. F VII se convirtió al factor Vlla mediante el factor Xa, factor Xlla, factor IXa, o trombina por proteólisis menor. En presencia del factor tisular e iones calcio, "el factor Vlla convierte entonces el factor X al factor Xa por proteólisis limitada. El factor Vlla convierte también el factor IX al factor IXa en presencia de factor tisular y calcio . El factor VII es una glicoproteína que depende de la vitamina K que consiste en 406 residuos aminoácidos (MW 50 K Dalton) . El factor VII es producido o bien por extracción convencional a partir de plasma humano donado, más recientemente, mediante el uso de sistemas recombinantes. Novo Nordisk usa células de riñon de hámster bebé (BHK) para la producción de NovoSeven®. Expresado como proteína de cadena única de 406 aminoácidos con un peso molecular nominal de 55 kDa (Thim, L. et al., Biochemistry 27:7785-7793(1988). La molécula es portadora de cuatro cadenas secundarias de carbohidrato. Dos cadenas secundarias de carbohidrato ligadas a 0 en Ser 52, 60 y dos cadenas secundarias de carbohidrato ligadas a N en Asn 145,' 322 (Thim, L. et al., Biochemistry 27:7785-7793(1988) . El factor VII se indica para el tratamiento de episodios de hemorragias en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores del Factor VIII o Factor IX. Por lo tanto, la presente invención se refiere también al uso de un conjugado de HAS-Factor VII para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores del Factor VIII o el Factor IX. El_ factor IX es una proteína de plasma que depende de la vitamina K, que participa en la vía intrínseca de coagulación de la sangre mediante la conversión del factor X a su forma activa en presencia de iones Ca(2+), fosfolípidos y factor Villa. El factor IX es una glicoproteína con una masa molecular aproximada de 55.000 Da que consiste en 415 aminoácidos en una cadena única (Yoshitake S . et al . , Biochemistry 24:3736-3750(1985)). El factor IX es producido por una extracción convencional a partir de plasma humano donado o bien, más recientemente, por el uso de un sistema recombinante . Wyeth usa células de ovario de hámster chino (CHO) para la producción BeneFIX®. Tiene una secuencia de aminoácido primaria que es idéntica a la forma alélica Ala 148 del factor IX derivado de plasma, y tiene características estructurales y funcionales similares a las del factor IX endógeno. La proteína es portadora de ocho cadenas secundarias de carbohidrato. Seis cadenas secundarias de carbohidrato, ligadas a 0 en Ser 53, 61 y en Treonina 159, 169, 172, 179 y dos cadenas secundarias de carbohidrato ligadas a N en Asn 157, 167 (Yoshitake S. et al., Biochemistry 24:3736- 3750(1985); Balland A. et al., Eur J Biochem. 1988;172(3) :565-72) . El factor IX está indicado para el control y prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (deficiencia del factor congénito IX o enfermedad de - Christmas) , que incluyen el control y prevención del sangrado en' casos quirúrgicos. Por lo tanto, la presente invención se refiere también al uso de conjugado de HAS-Factor IX para la preparación de un medicamento para el control y prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (por ejemplo, deficiencia del factor congénito IX o enfermedad de Christmas) incluyendo el control y prevención del sangrado en casos quirúrgicos . En el contexto de la presente invención, el término "almidón de hidroxialquilo" se refiere a un derivado de almidón que ha sido sustituido con por lo menos un grupo hidroxialquilo . Un almidón de hidroxialquilo preferido de la presente invención tiene una constitución de acuerdo con la fórmula (I) en la cual el extremo reductor de la molécula de almidón se muestra en forma no oxidada y la unidad de sacárido terminal se muestra en la forma de hemiacetal que dependiendo por ejemplo del solvente, puede estar en equilibrio con la forma aldehido . " El término almidón de hidroxialquilo tal como se usa en la presente invención no está limitado a compuestos en los cuales la porción carbohidrato terminal comprende los grupos Ri, R-2 , y/o R3 tal como se han descripto, por razones de brevedad, en la fórmula (I) , sino que se refiere también a compuestos en los cuales está presente por lo menos un grupo hidroxialquilo en cualquier parte, ya sea en la porción carbohidrato terminal y/o en la parte remanente de la molécula de almidón, HAS', está sustituida con un grupo hidroxialquilo Ri, R2, o R3. El almidón de hidroxialquilo que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes, es también posible. El por lo menos un grupo hidroxial uilo comprendido en HAS puede contener dos o más grupos hidroxi . De acuerdo con una realización preferida, el por lo menos un grupo hidroxialquilo que comprende HAS contiene un grupo hidroxi. La expresión "almidón de hidroxialquilo" incluye también derivados en los cuales el grupo alquilo está mono- o polisustituido. En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor o con un grupo arilo. Además, el grupo hidroxi de un grupo hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado. Además, en vez de alquilo, pueden usarse también grupos alqueno lineales o ramificados sustituidos o no sustituidos. El almidón de hidroxialquilo es un derivado éter de almidón. Además de dichos derivados éter, pueden usarse también otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, son útiles los derivados" que comprenden grupos hidroxi esterificados . Estos derivados pueden ser por ejemplo derivados de ácidos mono- o dicarboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos . Son especialmente útiles los derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este contexto, se prefieren almidón de acetilo, almidón de butirilo y almidón de propionilo . Además, también son preferidos derivados de ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono. En el caso de derivados de ácidos dicarboxílicos, esterificado útil que el segundo grupo carboxi del ácido dicarboxílico esté también esterirficado. Además, los derivados de esteres monoalquílieos de ácidos dicarboxílicos son también apropiados en el contexto de la presente invención. Para los ácidos mono- o dicarboxílicos sustituidos, los grupos -sustitutos pueden ser preferiblemente los mismos que se han mencionado anteriormente para residuos "alquilo sustituidos . -'Las técnicas para la esterificación de almidón son conocidos en el arte (ver por ejemplo Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especialmente capítulos 4.4, Esterificación de Celulosa (ISBN 3-527-29489-9) . De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, se emplea el almidón de hidroxialquilo de acuerdo con la fórmula (I) antes mencionada. En la fórmula (I) , el anillo sacárido descripto explícitamente y el residuo denotado como HAS' conjuntamente representan la molécula de almidón de hidroxialquilo preferida. Las otras estructuras de anillo sacárido comprendida en HAS' pueden ser iguales o diferentes del anillo sacárido explícitamente descripto. En lo que se refiere a los residuos Ri, R2 y R3 de acuerdo con la fórmula (I), no existen limitaciones específicas. De acuerdo con una realización preferida, . Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de 2 a 10 átomos de carbono en el residuo alquilo respectivo o un grupo (CH2CH20)n-H en el cual n es un número entero, preferiblemente 1, 2, 3, 4, 5 o 6. Los grupos de hidrógeno e hidroxialquilo que tienen de 2 a 10 átomos de carbono son los preferidos. Más preferiblemente, el grupo hidroxialquilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono, más preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono, e incluso más preferiblemente de 2 a 3 átomos de carbono. "Almidón de hidroxialquilo" comprende por lo tanto preferiblemente, almidón de hidroxietilo, almidón de hidroxipropilo y almidón de hidroxibutilo, donde el almidón de hidroxietilo y el almidón de hidroxipropilo son particularmente preferidos y se prefiere aún más el almidón de hidroxietilo. El grupo alquilo, arilo, aralquilo y/o alcarilo puede ser lineal o ramificado y puede estar convenientemente sustituido.

Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como el descripto anteriormente en el cual Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con desde 2 a 6 átomos de carbono . Por lo tanto, R r R2 y R3 puede ser preferiblemente hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tal como 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como 2-hidroxietilo, hidrógeno y se prefiere especialmente el grupo 2-hidroxietilo.

Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se han descripto anteriormente donde Rl7 R y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente una realización en la cual por lo menos un residuo Ri, R2 y R3 es 2-hidroxietilo. El almidón de hidroxietilo (HES) es el preferido de entre todas las realizaciones de la presente invención. Por lo tanto, la presente invención se refiere al método y al conjugado descriptos anteriormente, en los cuales el polímero es almidón de hidroxietilo y el derivado polimérico es un derivado de almidón de hidroxietilo.- El almidón de hidroxietilo (HES) es un derivado de amilopectina natural y es degradado por la alfa-amilasa en el cuerpo. El. HES es un derivado sustituido de la amilopectina de polímero de carbohidrato que está presente en el almidón de maíz en una concentración de hasta 95% en peso. El HES exhibe propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo volumétrico de la sangre y en terapia de hemodilución en las clínicas (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res. , 41, 494-498). La amilopectina consiste en porciones glucosa, en las cuales en la cadena princip'al están presentes enlaces alfa- 1, 4-glicosídicos y en los sitios de ramificación se encuentran enlaces alfa-1, 6-glicosídicos . Las propiedades físico-químicas de esta molécula se determinan principalmente por el tipo de enlaces glicosídicos . Durante el enlace alfa-1, 4-glicosídico de ajuste preciso, se producen estructuras helicoidales con aproximadamente seis monómeros de glucosa por vez. Las propiedades físico-químicas así como también las bioquímicas del polímero pueden modificarse a través de sustitución. La introducción de un grupo hidroxietilo puede lograrse por hidroxietilación alcalina. Mediante la adaptación de las condiciones de reacción es posible explotar la reactividad diferente del respectivo grupo hidroxi en el monómero de glucosa no sustituido con respecto a la hidroxietilación. Debido a este hecho, los expertos en la materia son capaces de influenciar el patrón de sustitución hasta un grado limitado El HES se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular y por el grado de sustitución. Existen dos posibilidades para describir el grado de sustitución: 1. El grado de sustitución puede describirse en relación a la porción de monómeros de glucosa sustituida con respecto a todas las porciones de glucosa. 2. El grado de sustitución puede describirse como la sustitución molar donde se describe la cantidad de grupos hidroxietilo por porción glucosa. En el contexto de la presente invención el grado de sustitución denotado como DS, se refiere a la sustitución molar tal como se describió anteriormente. (ver también Sommermeyer et at., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278, tal como se citó anteriormente, en particular p. 273. Las soluciones de HES están presentes como composiciones polidispersas,-' donde cada molécula difiere de la otra con respecto al grado de polimerización, a la cantidad y al patrón de sitios de ramificación, y al patrón de sustitución. El HES es por lo tanto una mezcla de compuestos con diferentes pesos moleculares. Por consiguiente, una solución HES particular se determina por el peso molecular promedio con ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como el promedio aritmético dependiendo de la cantidad de moléculas . Alternativamente, Mw (o MW) , el promedio en peso, representa una unidad que depende de la masa del HES . En el contexto de la presente invención, el almidón de hidroxietilo puede tener preferiblemente un peso molecular promedio (promedio en peso) de desde 1 a 300 kD. El almidón de hidroxietilo puede exhibir adicionalmente un grado de sustitución molar preferido de desde 0,1 a 3, preferiblemente 0,1 a 2, más preferiblemente 0,1 a 0,9, preferiblemente 0,1 a 0,8, y una relación preferida comprendida entre substitución C2 : Ce en el rango de 2 a 20 con respecto a los grupos hidroxietilo. El término "peso molecular promedio" tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al peso determinado de acuerdo con LALLS- (dispersión de luz láser de ángulo bajo)- método GPC descrito por Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498. Para pesos moleculares promedio de 10 kD y menores, adicionalmente, la calibración se llevó a cabo con un modelo que había sido previamente cualificado por LALLS-GPC. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el peso molecular promedia de - almidón de hidroxietilo empleado es de 1 a 300 kD,_más preferiblemente de 2 a 200 kD, y_ más preferiblemente- de ~A a 130 kD, y más preferiblemente de desde 4 a 70 kD. Un ejemplo de HES que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 130 kD es un HES con un grado de sustitución de 0,1 a 0,9, preferiblemente 0,2 a 0,8 tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, o 0,8, preferiblemente desde 0,4 a 0,7 tal como 0,4, 0,5, 0,6, o 0,7. Un ejemplo de HES con un peso molecular promedio de aproximadamente 130 kD es Voluven® from Fresenius. Voluven® es un coloide artificial empleado por ejemplo para el reemplazo de volumen usado en las indicaciones terapéuticas para terapia y profilaxis de hipovolemia. Las características de Voluven® son de un peso molecular promedio de 130,000 +/- 20,000 D, una sustitución molar de 0,4 y una relación de C2 : C6 de aproximadamente 9:1. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a los conjugados que se han descrito anteriormente donde el almidón de hidroxialquilo es almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de desde 4 a 100 kD, preferiblemente de 4 a 70 kD. Los rangos preferidos de peso molecular promedio son por ejemplo, 4 a 70 kD o 10 a 70 kD o 12 a 70 kD o 18 a 70 kD o 50 a 70 kD o 4 a 50 kD o 10 a 50 kD o 12 a 50 kD o 18 a 50 kD o 4 a 18 kD o 10 a 18 kD o 12 a 18 kD o 4 a 12 kD o 10 a 12 kD o 4 a 10 kD. De acuerdo con realizaciones particularmente preferidas de la presente invención, el peso molecular promedio del almidón de hidroxietilo que se emplea está en el rango de desde más de 4 kD y por debajo de 70 kD, tal como aproximadamente 10 kD, o en el rango de 9 a 10 kD o de 10 a 11 kD o de 9 a 11 kD, o aproximadamente 12 kD, o en el rango desde 11 a 12 kD o desde 12 a 13 kD o desde 11 a 13 kD, o aproximadamente 18 kD, o en el rango de desde 17 a 18 kD o desde 18 a 19 kD o desdel7 al9 kD, o aproximadamente 50 kD, o en el rango de desde 49 a 50 kD o desde 50 a 51 kD o desde 49 a 51 kD. En cuánto al límite superior del grado molar de substitución (DS) , son también posibles valores de hasta 3,0 tales como 0,9, 1,0, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 o 2,0, prefiriéndose los valores por debajo de 2,0, y siendo aún más preferidos, los valores por debajo de 1,0, tales como 0,7, 0,8 o 0,9. Por lo tanto, los rangos preferidos de grado de substitución molar son de desde 0,1 a 2 o de 0,1 a 1,5 o de 0,1 a 1,0 o de 0,1 a 0,9 o de 0,1 a 0,8. Son rangos de substitución molar mas preferidos los de 0,2 a 2 o de 0,2 a 1,5 o de 0,2 a 1,0 o de 0,2 a 0,9 o de 0,2 a 0,8. Son rangos aún más preferidos .del grado molar de substitución los de 0,3 a 2 o de 0,3 a 1,5 o de 0,3 a 1,0 o de 0,3 a 0,9 o de 0,3 a 0,8. Son rangos aún más preferidos del grado molar de sustitución los de 0,4 a 2 o de 0,4 a l, 5 o de 0,4 a 1,0 o de 0,4 a 0,9 o de 0,4 a 0,8. En cuanto a lo que se refiere al grado de sustitución (DS) , el DS es preferiblemente por lo menos 0,1, más preferiblemente por lo menos 0,2, más preferiblemente por lo menos 0,4 y más preferiblemente por lo menos 0,4. Los rangos de DS preferidos son de desde 0,1 a 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferiblemente 0,1 a 0 , 9 , más preferiblemente desde 0,1 a 0,8, más preferiblemente desde 0,2 a 0,8, más preferiblemente desde 0,3 a 0,8 y aún más preferiblemente de 0,4 a 0,8, aún más preferiblemente de 0,1 a 0,7, más preferiblemente de 0,2 a 0,7, más preferiblemente de 0,3 a 0,7, y más preferiblemente de 0,4 a 0,7. Valores particularmente preferidos de DS son, por ejemplo, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, ó 0,9, siendo más preferidos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, y aún más preferidos , 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, y todavía más preferidos 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 ó 0,8, por ejemplo particularmente preferidos 0,4 y 0,7. En el contexto de la presente invención, un valor determinado del grado de sustitución molar, tal como 0,9 puede - ser el valor exacto o puede entenderse como dentro de un rango - de desde 0,85 a 0,94 o 0,8 puede ser el valor exacto o puede interpretarse dentro de un rango de desde 0,75 a 0,84. Por lo tanto, por ejemplo, uri valor determinado de 0,1 puede ser el valor exacto de 0,1 o puede estar en el rango de desde 0,05 a 0,14, un valor determinado de 0,4 puede ser el .valor exacto de 0,4 o estar en el rango de desde 0,35 a 0,44, o un valor determinado de 0,7 puede ser el valor exacto de 0,7 o estar en el rango de desde 0,65 a 0,74. Combinaciones particularmente preferidas de peso molecular del almidón de hidroxialquilo, preferiblemente almidón de hidroxietilo, y su grado de sustitución de DS son, por ejemplo, 10 kD y 0,4 o 10 kD y 0.7 o 12 kD y 0,4 o 12 kD y 0,7 o 18 kD y 0,4 o 18 kD y 0,7 o 50 kD y 0,4 o 50 kD y 0,7, o 100 kD y 0,7. En lo que se refiere a la relación de la sustitución de C2 : Ce, dicha sustitución está preferiblemente en el rango de desde 2 a 20, más preferiblemente en el rango de 2 a 15 y aún más preferiblemente en el rango de 3 a 12. De acuerdo con otra realización de la presente invención, pueden emplearse también mezclas de almidones de hidroxietilo que tienen diferentes pesos moleculares y/o diferentes grados de sustitución y/o diferentes relaciones de sustitución C2 : Ce - Por lo tanto, pueden emplearse mezclas de almidones de hidroxietilo que tienen diferentes promedios de pesos moleculares y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2 : Ce , o que tienen diferentes promedios de peso molecular y diferentes grados de sustitución y la misma o aproximadamente la misma relación de sustitución C2 : Ce , o que tienen diferentes pesos moleculares promedio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución de C2 : Ce , o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo promedio de peso molecular y diferentes grados de sustitución y diferentes relaciones de sustitución C2 : Ce o que tienen diferentes pesos moleculares promedio y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y la misma o aproximadamente la misma relación de sustitución C2 : Ce , o que tienen los mismos o aproximadamente los mismos promedios de pesos moleculares y diferentes grados de sustitución y la misma o aproximadamente la misma relación de sustitución C : Ce , o que tienen el mismo o aproximadamente el mismo promedio de peso molecular y el mismo o aproximadamente el mismo grado de sustitución y diferentes relaciones de sustitución de C2 : C6, o que tienen aproximadamente el mismo peso molecular y aproximadamente el mismo grado de sustitución y aproximadamente la misma relación de sustitución C2 : . En diferentes conjugados y/o diferentes métodos de acuerdo- con la presente invención, pueden emplearse diferentes almidones de hidroxialquilo, preferiblemente diferentes almidones de hidroxietilo y/o diferentes mezclas de almidón de hidroxialquilo, preferiblemente diferentes mezclas de almidón de hidroxietilo. La reacción de aminación" réductora de acuerdo con la invención, donde el polímero o derivado polimérico está ligado covalentemente a través de por lo menos un grupo aldehido a por lo menos un grupo amino de la proteína por aminación reductora, se llevó a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 a 40SC, más preferiblemente 0 a 37aC, más preferiblemente de desde 0 a 25aC en particular desde 4 a 21 2C, pero especialmente preferiblemente de 40 a 21°C. El tiempo de reacción está preferiblemente comprendido entre desde 0,5 a 72 horas, más preferiblemente de desde 2 a 48 horas y especialmente preferiblemente desde 4 a 7 horas . Como solvente para la reacción se prefiere un medio acuoso. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se han descripto anteriormente, donde la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 a 21°C, pero especialmente preferiblemente 0 a 21aC. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde la aminación reductora se lleva a cabo en un medio acuoso. Por lo tanto, la presente invención ser refiere también a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente donde la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 a 21°C pero especialmente preferiblemente 0 a 212; en un medio acuoso. El término "medio acuoso " tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a un solvente o a una mezcla de solventes que comprenden agua en el rango de desde por lo menos 10% en peso, más preferiblemente por lo menos 20% en peso, más preferiblemente por lo menos 30% en peso, más preferiblemente por lo menos 40% en peso, más preferiblemente por lo menos 50 % en peso, más preferiblemente por lo menos 60% en peso, más preferiblemente por lo menos 70% en peso, más preferiblemente por lo menos 80% en peso y aún más preferiblemente por lo menos 90% en peso o hasta 100% en peso en base al peso de los solventes involucrados. El medio de reacción preferido es agua. El valor de pH del medio de reacción generalmente está en el rango de desde 4 a 9 o de 4 a 8 o de 4 a 7,5 o de 4 a 7,3.

De acuerdo con una realización preferida de la presente invención el pH al cual se llevó a cabo la aminación reductora está por debajo de 10, preferiblemente por debajo de 7,5, preferiblemente 7,3, más preferiblemente es menor o igual a 7 y aún más preferiblemente está por debajo de 7, es decir en el rango ácido. Los rangos preferidos son por lo tanto desde 3 hasta por debajo de 7, más preferiblemente desde 3,5 a 6,5, y aún más "preferiblemente desde 4 a 6, y aún más preferiblemente desde 4,5 a 5,5 y en forma especialmente preferida de aproximadamente 5,0, es decir. 4,6 o 4,7 o 4,8 o 4,9 o 5,0. o 5,1 o 5,2 o 5,3 o 5,4. Los rangos preferidos están entre otros, comprendidos entre 3 a 6,9 o 3 a 6,5 o 3- a 6 o 3 a-'5, 5 o 3 a 5 o 3 a 4,5 o 3 a 4 o 3 a 3,5 o 3,5 a 6,9 o 3,5 a 6,5 o 3,5 a 6 o 3,5 a 5,5 o 3,5 a 5 o 3,5 a 4,5 o 3,5 a 4 o 4 a 6,9 o 4 a 6,5 o 4 a 6 o 4 a 5,5 o 4 a 5 o 4 a 4,5 o 4,5 a 6,9 o 4,5 a 6,5 o 4,5 a 6 o 4,5 a 5,5 o 4,5 a 5 o 5 a 6,9 o 5 a 6,5 o 5 a 6 o 5 a 5,5 o 5,5 a 6,9 o 5,5 a 6,5 o 5.5 a 6 o 6 a 6,9 o 6 a 6,5 o 6,5 a 6,9. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente donde la aminación reductora se llevó a cabo a un pH de 7 o menos, más preferiblemente a un pH de 6 o menos. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se han descrito anteriormente donde la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde O a 21aC, preferiblemente 4 a 21 aC y a un pH de 7,5 o menos, preferiblemente de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente donde la _aminación reductora se lleva a cabo en un medio acuoso a pH~"de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos. - - Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los descritos " anteriormente, donde la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 a 21°C en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos. La relación molar de derivado polimérico : proteína que se usa para la reacción está preferiblemente en el rango de 200:1 a5:l, más preferiblemente de desde 100:1 a 10:1 y en forma especialmente preferida desde 75:1 a 20:1 . Se descubrió sorprendentemente que era posible, especialmente a los rangos de pH preferidos que se dieron anteriormente, particularmente a un pH por debajo de 7 y superior o igual a 4, hacer reaccionar el derivado polimérico predominantemente con - el grupo amino situado en el término N de la proteína. El término "predominantemente" tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una realización en la cual por lo menos el 80%, preferiblemente por lo menos el 85% de los grupos amino N-terminales disponibles se hacen reaccionar a través de aminación reductora. También es posible hacer reaccionar por lo menos 90% o por lo menos 95% o por lo menos 96% o por lo menos 97% o por lo menos 98 % o por lo menos 99% de los grupos amino N- terminales disponibles . Aunque el acoplamiento a grupos amino distintos del grupo amino N-terminal no podrían ser excluidos completamente, se cree que el acoplamiento a través de aminación reductora de acuerdo con la presente invención a un pH por debajo de 7, preferiblemente por debajo de 6, ocurrió esencialmente en forma selectiva en el grupo amino N-terminal .

En particular, estas condiciones de reacción se prefieren para las proteínas que son estables bajo estas condiciones. Si una proteína fuera, por ejemplo, lábil al ácido, tal como la alfa 1-antitripsina, entonces se preferiría elegir condiciones de reacción apropiadas, en particular un pH de desde menos de 7,5 hasta más de 5. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente donde la proteína comprende el grupo amino N-terminal y por lo menos un grupo amino adicional, donde dicho conjugado comprende el polímero que está predominantemente acoplado al grupo amino N-terminal. apropiadas, en particular un pH de desde menos de 7,5 hasta más de 5. De acuerdo con una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a un método para unir almidón de hidroxialquilo aldehido ceto o hemiacetal funcionalizado o un derivado de almidón de hidroxialquilo aldehido o ceto o hemiacetal funcionalizado predominantemente en el grupo amino N-terminal de una proteína_, donde dicho método comprende someter dicho almidón de hidroxialquilo o derivado del mismo a una reacción de aminación reductora a un pH de 7 o menos, preferiblemente a un pH de 6 o menos, donde dicha aminación reductora se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere un almidón de hidroxialquilo aldehido funcionalizado o un derivado de almidón de hidroxialquilo aldehido funcionalizado.

-"De- acuerdo con una realización aún más preferida, la presente invención se refiere a un método para unir un almidón de hidroxietilo aldehido o ceto o hemiacetal funcionalizado o un derivado de almidón de hidroxietilo aldehido o ceto o heliacetal funcionalizado, selectivamente al grupo amino N-ter inal de una proteína donde dicho método comprende someter dicho almidón de hidroxialquilo o derivado del mismo a una reacción de aminación reductora a un pH de 7 o menos, preferiblemente a un pH de 6 o menos, donde reacción de aminación reductora se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso, y el almidón de hidroxietilo es preferiblemente almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio e^ aproximadamente kD y una DS de aproximadamente 0,4 o - '""" almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o un almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y una DS de aproximadamente 0,7, o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7. La reacción del derivado polimérico y la proteína entre el grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal y el grupo amino es una aminación reductora en la cual se produce la base de Schiff. Subsiguientemente después de la reacción, esta base puede reducirse mediante por lo menos un agente reductor para proporcionar un enlace estable entre el derivado polimérico y la proteína. También es posible llevar a cabo la reacción en presencia de por lo menos un agente reductor. De acuerdo con una realización preferida, la reacción de aminación reductora se lleva a cabo en presencia de por lo menos un agente reductor. Los agentes reductores preferidos son borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos de complejos orgánicos de borano, tales como complejo de 4- (dimetilamin) piridina borano, complejo de N- etildiisopropilamina borano, complejo de N-etilmorfolina borano, complejo de N-metilmorfolina borano, complejo de N- fenilmorfolina borano, complejo de lutidina borano, complejo de trietilamina borano, o complejo de trimetilamina borano. Se prefiere particularmente el cianoborohidruro de sodio . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente donde la aminación reductora se llevó a cabo en presencia de NaCNBH3. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y conjugado tal como el descrito anteriormente donde la aminación reductora se lleva a cabo en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente 6 o menos en presencia de un agente reductor, preferiblemente NaCNBH3. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un método y conjugado tal como el descrito anteriormente, donde la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 4 a 21°C en un medio acuoso a un pH de 7 o menos, preferiblemente de 6 o menos en presencia de un agente reductor, preferiblemente NaCNBH3.

La relación molar de derivado polimérico : proteína que se usa para la reacción está preferiblemente en el rango de desde 200:1 a 10:1 más preferiblemente de desde 100:1 a 10:1 y especialmente de desde 75:1 a 20:1 . Por lo tanto, la presente invención se refiere también al método para producir un conjugado, donde dicho método comprende hacer reaccionar un polímero o un derivado polimérico que comprende un grupo aldehido en un medio acuoso con un grupo amino de la proteína en presencia de un agente reductor, donde dicho agente reductor es preferiblemente NaCNBH3. De acuerdo con la primera realización preferida de la presente, invención, según la cual el polímero comprende por lo menos dos grupos aldehido que se introducen en el polímero mediante una reacción de oxidación por apertura de anillo, el polímero comprende preferiblemente por lo menos una estructura de acuerdo con la fórmula: De acuerdo con esta realización de la presente invención, puede emplearse cada agente de oxidación o combinación de agentes de oxidación capaces de oxidar por lo menos un anillo sacárido del polímero para proporcionar un anillo sacárido abierto que tiene por lo menos uno, preferiblemente por lo menos dos grupos aldehido. Esta reacción se ilustra mediante el siguiente esquema de reacción que muestra un anillo sacárido del polímero que es oxidado para proporcionar un anillo abierto que tiene dos grupos aldehido : Los agentes oxidantes apropiados son, entre otros, periodatos tales como periodatos de metales alcalinos o mezclas de dos o más de los mismos, prefiriéndose el periodato de sodio y periodato de potasio. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde el polímero se somete a una reacción de oxidación por apertura de anillo usando un periodato para proveer un derivado polimérico que tiene por lo menos uno, preferiblemente por lo menos dos grupos aldehido. Para esta reacción de oxidación, el polímero puede emplearse con su extremo reductor en la forma oxidada o bien en la forma no oxidada, prefiriéndose la forma no oxidada. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los que se describieron anteriormente, donde se emplea el polímero con su extremo reductor en forma no oxidada. La temperatura de reacción está en un rango preferido de desde 0 a 40°C, más preferiblemente de desde 0 a 25°C y especialmente preferiblemente de desde 0 a 5°C. El tiempo de reacción está en un rango preferido de desde 1 minuto a 5 horas y especialmente preferiblemente de desde 10 minutos a 4 horas . Dependiendo del grado de oxidación deseado es decir de la cantidad de grupos aldehido resultantes de la reacción de oxidación, la relación molar dependerá de periodato:polímero puede elegirse apropiadamente. Por lo tanto, la presente invención, se refiere también a un método y a un conjugado tal como los que se han descrito anteriormente donde la reacción de oxidación con apertura de anillo se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 5aC. La reacción de oxidación del polímero con periodato se lleva a cabo preferiblemente en un medio acuoso más preferiblemente en agua. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde la reacción de oxidación con apertura de anillo se lleva a cabo en un medio acuoso . El valor de pH apropiado de la mezcla de reacción puede ajustarse mediante agregado de por lo menos un buffer apropiado. Entre los buffers preferidos, pueden mencionarse el buffer de acetato de sodio, buffer de fosfato o borato. El almidón de hidroxietilo sometido a dicha reacción de oxidación de apertura de anillo es preferiblemente almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS .de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7, o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7. El derivado polimérico resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante por lo menos un método apropiado. Si es necesario el derivado polimérico puede precipitarse antes de la aislación mediante por lo menos un método apropiado. Si el derivado polimérico precipita primero, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con por lo menos un solvente o una mezcla solvente distinta del solvente o la mezcla solvente que está presente en la mezcla de reacción a temperaturas apropiadas . De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, donde se usa un medio acuoso preferiblemente agua como solvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla de 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura preferiblemente en el rango de desde -20 a +50°C y especialmente preferiblemente en el rango de desde -20 a 25°C.

La aislación del derivado polimérico puede llevarse a cabo mediante un procedimiento apropiado que comprender una o más etapas. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el derivado polimérico se separa primero de la mezcla de reacción o la mezcla o la mezcla de mezcla de reacción con por ejemplo una mezcla acuosa de 2-propanol, mediante un método apropiado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado polimérico separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como una diálisis de tipo post-tratamiento, filtración centrífuga o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración de gel y/o liofilización. De acuerdo con una realización aún más preferida, el derivado polimérico separado es dializado primero, preferiblemente contra agua, y luego es liofilizado hasta que el contenido de solvente del producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas para el producto. La liofilización puede llevarse a cabo a una temperatura de desde 20 a 35°C, preferiblemente de 20; a 30°C. De acuerdo con una realización preferida, el polímero oxidado resultante de la reacción de oxidación se purifica usando por lo menos un método apropiado tal como ultrafiltración y/o diálisis para, por ejemplo, remover las sales indeseables de bajo peso molecular y los componentes poliméricos, ofreciendo de este modo un medio para controlar el rango de peso molecular del polímero oxidado . El polímero oxidado puede usarse directamente para la reacción con la proteína o puede recuperarse convenientemente en una primera etapa, por ejemplo, por liofilización, y puede redisolverse en agua para la conjugación con la proteína en una segunda etapa. En lo que se refiere al acoplamiento de por lo menos un grupo amino de la proteína con por lo menos un grupo aldehido del polímero por aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior referente a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como el pH o la temperatura. De acuerdo con realizaciones especialmente preferidas de la presente invención de acuerdo con las cuales rhIL 2, rhIL 3, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhEPO, rhAT III, rhG-CSF, BSA, Mioglobina y SOD se usan como proteínas, la aminación reductora se llevó a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 a 5°C tal como de aproximadamente 4°C a un pH de aproximadamente 4,5 a 5,5 tal como aproximadamente 5,0 y por un tiempo de reacción de aproximadamente 20 a 30 horas tal como aproximadamente 24 horas . De acuerdo con la segunda realización preferida el polímero se hace reaccionar con por lo menos un compuesto bifuncional que comprende por lo menos un grupo funcional M capaz de reaccionar con el polímero y por lo menos un grupo funcional Q que es un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal y que se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína por aminación reductora. Se prefiere emplear un compuesto que tenga, aparte del grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal, por lo menos un grupo carboxi o por lo menos un grupo carboxi reactivo preferiblemente un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo. El grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal y el grupo carboxi o el grupo carboxi reactivo pueden separarse mediante un espaciador apropiado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. En general el residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 60, preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 6 y especialmente preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende en general de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 8 y especialmente preferiblemente de 1 a 4 heteroátomos . El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalguilo que tienen por ejemplo de 5 a 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tiene de 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono . Más preferiblemente el residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. De acuerdo con esta realización preferida, el grupo carboxi y el grupo aldehido pueden estar situados en el anillo benceno en posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la posición 1,4. Como grupo carboxi reactivo, puede mencionarse un éster reactivo, isotiocianatos o isocianato. Los esteres reactivos preferidos derivan de N-hidroxi succinimidas tales como N- hidroxi succinimida o sulfo-N-hidroxi succinimida, convenientemente fenoles sustituidos tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o, o ' -dinitrofenol, triclorofenol tales como 2, 4, 6-triclorofenol o 2, 4, 5-triclorofenol, trifluorfenol tales como 2, 4, 6-trifluorfenol "o 2, 4, 5-trifluorfenol, pentaclorofenol, pentafluorfenol, o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol son especialmente preferidas las N-hidroxi succinimidas, siendo especialmente preferidas la N-hidroxi succinimida y la sulfo-N-hidroxi succinimida. Pueden emplearse todos los alcoholes solos o en una combinación apropiada de dos o más de los mismos. Como este reactivo, son especialmente preferidos el éster de pentafluorfenilo y el éster de N-hidroxi succinimida Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente donde el polímero se hace reaccionar con ácido formilbenzoico . De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los que se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con éster pentafluorfenílico de ácido formilbenzoico . De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido formilbenzoico. De acuerdo con una realización más, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente donde el polímero se hace reaccionar con ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi) butírico. De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente, en el cual el polímero se hace reaccionar con un compuesto bifuncional que es un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos siálicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal . Con respecto a los ácidos alfa-ceto- carboxílicos, éstos son preferiblemente ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados de amino ácidos y en la mayoria de los casos pueden hallarse también en el cuerpo humano. Los ácidos alfa-ceto carboxílicos preferidos derivados de amino ácidos están seleccionados del grupo ue consiste en ceto-valina, ceto-leucina, ceto-isoleucina y ceto-alanina. El grupo carboxi de los ácidos alfa-ceto carboxílicos se hace reaccionar con el grupo Q del polímero que es un grupo amino. Con éste, se forma un grupo amido. El grupo ceto libre remanente del ácido alfa-ceto carboxílico, puede reaccionar luego con un grupo funcional de la proteína, en particualr un grupo amino. Con éste, se forma un grupo imino ue puede hidrogenarse. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un ácido alfa-ceto carboxílico. Con respecto a los ácidos siálicos o derivados de éstos , son preferiblemente biocompatibles, in particular son azúcares que se encuentran en el cuerpo humano, que están N- y/o 0- acetilados. En una" realización preferida, los ácidos siálicos son ácidos N-acetil neurámicos . Estos compuestos muestran una rigidez deseada debido a la estructura piranosa, para desempeñar la función de un espaciador. Por otra parte, puede ser posible introducir un grupo aldehido en estos compuestos a través de oxidación selectiva. Los ácidos siálicos se encuentran en el cuerpo humano, por ejemplo como monosacáridos terminales en las cadenas glicano de las proteínas glicosiladas . En una realización preferida, el ácido siálico puede estar selectivamente oxidado a un grupo aldehido. Los métodos para oxidar selectivamente los ácidos siálicos son conocidos en el arte, por ejemplo en L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21 - 32 y T. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673. Preferiblemente la oxidación del ácido siálico puede llevarse a cabo antes de la reacción con el grupo amino del polímero . Los compuestos resultantes contienen un grupo aldehido que puede reaccionar luego por aminación reductora con un grupo amino de una proteína. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el - polímero se hace reaccionar con ácido siálico opcionalmente oxidado. Con respecto al fosfato de piridoxal (PyP) , éste es un compuesto bifuncional altamente biocompatible y se denomina también vitamina B6. PyP es una co-enzima que participa en las transaminaciones, descarboxilaciones, racemizaciones y en numerosas modificaciones de las cadenas secundarias de amino ácido. Todos los PyP que requieren enzimas, actúan a través de la formación de una base de Schiff entre el amino ácido y la co-enzima. El grupo fosfato del PyP puede reaccionar con el grupo amino del polímero, preferiblemente almidón de hidroxialquilo, en particular almidón de hidroxietilo, que forma una fosforamida. El grupo aldehido de PyP puede reaccionar luego con el grupo amino de una proteína, formando una base de Schiff, que luego puede reducirse. En una realización preferida, la estructura del conjugado es HES-NH-P(O) 2-0-(piridoxal) -CH-NH-proteína.

En el caso de PyP, el grupo funcional del polímero se introduce preferiblemente dentro del polímero mediante el uso de un compuesto di-amino tal como se describió anteriormente.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con fosfato de piridoxal .

El almidón de hidroxietilo sometido a la reacción con el compuesto que comprende M, donde M es preferiblemente un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo y Q es un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, es más preferiblemente almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,7.

Asimismo son posibles los almidones de hidroxieti-lo que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y un DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7. Particularmente es preferible, un almidón de hidroxialquilo e incluso más preferiblemente se emplea un almidón de hidroxietilo con- su extremo reductor en forma oxidada. El derivado polimérico resultante con el grupo aldehido o con el grupo ceto o el grupo hemiacetal se hace reaccionar subsiguientemente con un grupo amino de la proteína a través de aminación reductora. En lo que se refiere al acoplamiento de por lo menos un grupo amino de la proteína con por lo menos un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal del polímero por aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior referente a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como el pH o la temperatura. De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, según la cual se usa G-CSF como proteína, la reacción con el grupo amino de la proteína se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 a 40°C, más preferiblemente de 0 a 25°C y especialmente preferiblemente de desde 4 a 21°C. El tiempo de reacción está preferiblemente dentro de un rango de desde 30 minutos a 72 horas, más preferiblemente de 2 a 48 horas, y especialmente en forma preferida desde 4 horas a 17 horas .

Como solvente para la reacción, se prefiere un medio acuoso. El valor de pH del medio de reacción está preferiblemente en el rango de desde 4 a 9, más preferiblemente de desde 4 a 8 y especialmente preferiblemente de desde 4,5 a 5,5. De acuerdo con la tercera realización preferida, el polímero se hace reaccionar en su extremo opcionalmente oxidado con por lo menos un compuesto bifuncional que comprende un grupo amino M y un grupo funcional Q, donde el grupo amino M se hace reaccionar con el extremo reductor opcionalmente oxidado del polímero y donde el grupo funcional Q se modifica químicamente para .proporcionar un derivado polimérico aldehido funcionalizado que se hace reaccionar con un grupo amino de la proteína por aminación reductora. El término "el polímero se hace reaccionar a través del extremo reductor" o "el polímero se hace reaccionar a través del extremo reductor oxidado" tal como se usan en el contexto de la presente invención, pueden relacionarse con un procedimiento de acuerdo con el cual se hace reaccionar el almidón de hidroxialquilo predominantemente a través de su extremo reductor (selectivamente oxidado) . El polímero es almidón de hidroxialquilo, en particular almidón de hidroxietilo . Este término "predominantemente a través de su extremo reductor (selectivamente oxidado) " se refiere a procedimientos de acuerdo con los cuales estadísticamente más del 50%, preferiblemente por lo menos 55%, más preferiblemente por lo menos 55%, más preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 65%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%. más preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, y aún más preferiblemente por lo menos 95% tal como 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de las moléculas poliméricas empleadas para una reacción determinada, " se hacen reaccionar con por lo menos un extremo reductor (oxidado selectivamente) por molécula polimérica, donde una molécula polimérica determinada, que se - hace reaccionar a través de por lo menos un extremo reductor, puede reaccionar en la misma reacción determinada a través de por lo menos un grupo funcional adicional apropiado que está comprendido en dicha molécula polimérica y que no es un extremo reductor. Si se hacen reaccionar una o más moléculas poliméricas a través de por lo menos un grupo reductor y simultáneamente a través de por lo menos un grupo funcional adicional apropiado que está comprendido en estas moléculas poliméricas y que no es un extremo reductor, estadísticamente, preferiblemente más del 50%, preferiblemente por lo menos 55%, más preferiblemente por lo menos 60%, preferiblemente por lo menos 65%, preferiblemente por lo menos 70%, preferiblemente por lo menos 75,%, preferiblemente por lo menos 80, preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90%, y aún más preferiblemente por lo menos 95%, tal como 95%, 96%, 997%, 98%, 99% de todos los grupos funcionales reaccionados de estas moléculas poliméricas, dichos grupos funcionales, incluyendo los extremos reductores, son extremos reductores . El término "extremo reductor" tal como se usa en el contexto de la presente invención, se refiere al grupo aldehido terminal y/o a la forma acetal correspondiente. En casos en los que se oxida el extremo reductor, el grupo aldehido o acetal está en forma de un grupo carboxi y/o la lactona correspondiente. En cuanto al grupo funcional Q, se mencionarán los grupos funcionales siguientes entre otros: dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos; el grupo tio o los grupos hidroxi; hidrazida de ácido alquil sulfónico, hidrazida de ácido aril sulfónico; 1,2-dioles; - 1,2 amino-tioalcoholes; azidas; 1, 2-aminoalcoholes; el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la -unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxialquilamino, grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxalalcarilamino; grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, donde cada uno comprende la unidad estructural -NH-0-; - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, donde G es O o S, y M es, por ejemplo -OH o -SH; un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi o un grupo alcariloxi; — un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; un grupo alquilcarboniloxi, un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, o un grupo alcarilcarboniloxi; — esteres desactivados tales como esteres de hidroxilaminas que tienen estructura imida tal como N- hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N forma parte de un compuesto heteroarilo o, con G = O y Q ausente, tal como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorfenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; donde Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u 0; -NH-NH2, o -NH-NH-; -N02; - el grupo nitrilo; grupos carbonilo tales como el grupo aldehido o el grupo ceto; el grupo carboxi el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S ; - grupos de haluro de vinilo tales como el grupo de ioduro de vinilo o bromuro de vinilo o triflato; -C=C-H; - (C=NH2C1) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal donde Hal es Cl, Br, o I; - -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-; -el grupo -el grupo De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el término "grupo funcional Q" se relaciona con el grupo funcional Q que comprende la estructura química -NH- por ejemplo NH2 o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural -NH-, tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino . De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el grupo funcional M es un grupo que tiene la estructura R'-NH- donde R' es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloálquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralqullo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede estar ligado directamente al grupo NH o, de acuerdo con otra realización puede estar ligado por un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, -- arilo, aralquilo, arilcicloalquilo alcarilo, o cicloalquilarilo pueden estar apropiadamente sustituidos . Como sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos R' especialmente preferidos son hidrógeno, grupos alquilo y alcoxi, e incluso son más preferidos hidrógeno y grupos alquilo y alcoxi no sustituidos . Entre los grupos alquilo y alcoxi, se prefieren los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de C . Grupos más preferidos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, e isopropoxi . Son especialmente preferidos metilo, etilo, metoxi, etoxi, y se da preferencia particular a metilo o metoxi .

De acuerdo con otra realización de la presente invención, el grupo funcional M tiene la estructura R'-NH-R"- en la cual R" comprende preferiblemente la unidad estructural -NH- y/o la unidad estructural -(C=G)- donde G es O o S, y/o la unidad estructural -S0- . . "Ejemplos específicos para el grupo funcional R" son en las cuales, si G está presente dos veces, es independientemente O o S . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los que se han mencionado anteriormente donde el grupo funcional M está seleccionado del grupo que consiste en H fl H2N ^" ^ H2NS y" N-S — H II G 0 en las cuales G es O o S y, cuando están presentes dos veces, independientemente 0 o S, y R' es metilo. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, el grupo funcional M es un grupo amino -NH2. De acuerdo con una primera alternativa, el grupo funcional M que es un grupo NH2 amino se hace reaccionar con el extremo reductor oxidado del polímero resultante en un grupo amido que une el polímero y el compuesto que comprende M y Q. De acuerdo con una segunda alternativa, el grupo funcional M que es un grupo amino NH2, se hace reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero a través de aminación reductora, lo cual da como resultado un grupo imino que subsiguientemente es preferiblemente hidrogenado, para proporcionar un grupo amino, el grupo imino y el grupo amino, respectivamente, que unen el polímero con el compuesto que comprende M y Q. De acuerdo con una segunda alternativa, el grupo funcional M que es un grupo NH2 se hace reaccionar con el extremo reductor no oxidado del polímero a través de aminación reductora lo cual da como resultado un grupo imino que subsiguientemente es preferiblemente hidrogenado para proporcionar un gurpo amino, el grupo imino y el grupo amino, respectivamente, que unen el polímero y el compuesto que comprende M y Q. En este caso, es posible que el grupo funcional Q sea un grupo amino. En caso de que el derivado polimérico resultante se someta a una reacción subsiguiente, con por lo menos un compuesto bifuncional a través de un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo, tal como se describe a continuación, u otro grupo de por lo menos un compuesto bifuncional que se hace reaccionar con un grupo amino, . se prefiere que el compuesto que comprende M y Q sea una amina primaria que contenga - como grupo funcional - solamente un grupo amino. En este caso específico, aunque el compuesto contiene solamente un grupo funcional, se considera como compuesto bifuncional que comprende M y Q, donde M es el grupo amino contenido en el compuesto sujeto a aminación reductora con el extremo reductor del polímero,, y donde Q es el grupo amino secundario resultante de la aminación reductora con el extremo reductor del polímero y donde Q es el grupo amino secundario resultante de la aminación reductora y la subsiguiente hidrogenación. De acuerdo con una tercera alternativa, el extremo reductor no oxidado del polímero se hace reaccionar con amoníaco a través de aminación reductora, lo cual da como resultado un grupo imino terminal del polímero, el cual es subsiguientemente preferiblemente hidrogenado para proporcionar un grupo amino terminal del polímero y por lo tanto un grupo amino primario terminal . En este caso específico, el amoníaco se considera un compuesto bifuncional que comprende M y Q donde M es NH2 comprendido en el amoníaco empleado y donde Q es el grupo amino primario resultante de la aminación reductora y de la subsiguiente hidrogenación. El término "grupo amino Q" se refiere a un grupo funcional Q que comprende la estructura química -NH-, por ejemplo -NH¿ o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural -HN- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino . De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el grupo funcional Q es un grupo que tiene la estructura R'-NH- donde R' es hidrógeno o un residuo alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo, donde el residuo cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo puede estar ligado directamente al grupo NH o, de acuerdo con otra realización, puede estar ligado por un puente de oxígeno al grupo NH. Los residuos alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, arilcicloalquilo, alcarilo o cicloalquilarilo pueden estar apropiadamente sustituidos . Como sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Residuos de R' especialmente preferidos son hidrógeno, grupos alquilo y alcoxi, e incluso los más preferidos son hidrógeno y grupos alquilo y alcoxi no sustituidos. Entre los grupos alquilo y alcoxi, se prefieren los grupos con 1, 2, 3, 4, 5, o 6 átomos de C. Grupos más preferidos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, metoxi, etoxi, propoxi, e isopropoxi. Especialmente preferidos son metilo, etilo, metoxi, etoxi, y se da preferencia particular a metilo o metoxi . De acuerdo con otra realización de la presente invención, el grupo funcional Q tiene la estructura R'-NH-R"- donde R" comprende preferiblemente la unidad estructural- -NH- y/o la unidad estructural ~(C=G)- donde G es 0 o S," y/o la unidad estructural -S02-. De acuerdo con- realizaciones más preferidas, el grupo funcional R" está seleccionado del grupo que consiste en donde, si G está presente dos veces, es independientemente O o S. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los mencionados anteriormente, en los cuales el grupo funcional Q está seleccionado del grupo que consiste en donde G es O o S y, si está presente dos veces, independientemente o 0 o S, y R' es metilo. " 10 De acuerdo con una realización -particularmente preferida de la presente invención, el grupo- funcional Q es un grupo amino -NH2. De acuerdo con una realización adicional preferida de la presente invención, tanto M y Q comprenden un grupo amino -NH- 15 . De acuerdo con una realización particularmente preferida, tanto M y Q son un grupo amino -NH2. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el compuesto que comprende M y Q es un compuesto homobifuncional, más preferiblemente un compuesto homobifuncional que comprende como grupos funcionales M y Q, más preferiblemente el grupo amino -NH2, o de acuerdo con otras realizaciones del grupo hidroxilamino -0-NH2 o el grupo donde G es preferiblemente 0. Ejemplos específicos de estos compuestos que comprenden M y Q son o El almidón de hidroxietilo sometido a la reacción con el compuesto que comprende M, donde M es preferiblemente un grupo amino -NH-, y más preferiblemente es un grupo amino -NH2, más preferiblemente tanto M y Q comprenden un grupo amino -NH- y son particularmente preferidos tanto M y Q que comprenden un grupo amino -NH2, es preferiblemente almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o un almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10 kD y una DS de aproximadamente 0,7. También son posibles almidones de hidroxietilo que tienen un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 18 kD y una DS de aproximadamente 0,7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y una DS de aproximadamente 0,4 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 50 kD y una DS de aproximadamente 0-, 7 o almidón de hidroxietilo que tiene un peso molecular proomedio de aproximadamente 100 kD y un DS de aproximadamente 0,7. En caso de que tanto M y Q sean un grupo amino -NH2, M y Q pueden estar separados por cualquier espaciador apropiado.

Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. En general, el residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 60, preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 6 y especialmente preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende en general de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 8 y especialmente preferiblemente de 1 a 4 heteroátomos . El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene por ejemplo de 5 a 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena alquilo de 1 a 20, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 6, y especialmente preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar - con 1,4-diaminobutano, 1, 3-diaminopropano o 1, 2-diaminoetano para proveer un derivado polimérico . La reacción del por lo menos un compuesto bifuncional que comprende M y Q con el polímero es preferiblemente llevado a una temperatura de desde 0 a 100 aC, más preferiblemente de desde 4 a 80°C y especialmente en forma preferida de desde 20 a 80°C; el tiempo de reacción preferiblemente está en un rango de desde 4 horas a 7 días, más preferiblemente de desde 10 horas a 5 días y especialmente preferiblemente de desde 17 a 4 horas. La relación molar de por lo menos compuesto bifuncional : polímero está preferiblemente en el rango de desde 10 a 200, especialmente 50 a 100. Como solvente para la reacción del por lo menos un compuesto bifuncional con el polímero, se prefiere por lo menos un solvente aprótico, y es particularmente preferible un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua de no más de 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más de 0,1 por ciento en peso. Los solventes apropiados son entre otros sulfóxido de dimetilo (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA) , dimetil formamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos . Como solvente para la reacción de por lo menos compuesto bifuncional con el polímero, puede-, usarse también un medio acuoso . De acuerdo con una realización preferida, el derivado polimérico que comprende el polímero y por lo menos el - compuesto bifuncional se . modifican químicamente en el grupo funcional libre Q para proporcionar un derivado polimérico que comprende un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal. De acuerdo con esta realización se prefiere hacer reaccionar el derivado polimérico con por lo menos un compuesto bifuncional que comprende un grupo bifuncional que es capaz de reaccionar con el grupo funcional Q y un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal . Como por lo menos compuesto bifuncional, es apropiado cada compuesto que tiene un grupo aldehido o un grupo ceto o un gruop hemiacetal, y por lo menos un grupo funcional capaz de formar un enlace con el grupo funcional Q del derivado polimérico. El por lo menos un grupo funcional se selecciona del mismo conjunto de grupos funcionales que Q y se elige de modo que sea capaz de reaccionar con Q. En el caso preferido en el que Q es un grupo amino -NH2, o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino, se prefiere emplear un compuesto que tenga, aparte del grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal, por lo menos un grupo carboxi o por lo menos un grupo carboxi reactivo, preferiblemente un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo. El grupo aldehido o el grupo ceto y el grupo hemiacetal, y el grupo carboxi o el grupo carboxi reactivo pueden separarse mediante cualquier espaciador apropiado. Entre otros, el espaciador puede ser un . residuo hidrocarbonado opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico. En general, el residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 60, preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 6 y especialmente preferiblemente de 2 a 4 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende en general de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 8 y especialmente preferiblemente de 1 a 4 heteroátomos. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene por ejemplo de 5 a 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte alquilo puede ser un grupo alquilo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una realización preferida, el residuo hidrocarbonado es un grupo alquilo que tiene 2 a 6 y preferiblemente 2 a 4 átomos de carbono . También es posible que no haya ningún átomo de carbono presente entre el grupo aldehido o ceto y el grupo carboxi. Alternativamente, el residuo hidrocarbonado puede ser un grupo hidrocarbonado cíclico sustituido o no sustituido que tiene de 3 a 11 átomos de carbono, preferiblemente 3 a 6 o 3 a 5 átomos de carbono. Cuando el grupo hidrocarbonado cíclico está sustituido, el sustituyente puede seleccionarse del grupo que consiste en grupos amino o alcoxi. sustituidos o no sustituidos. Si está presente, la cantidad de".sustituyentes es preferiblemente de 1 a 3. Además el grupo hidrocarbonado alquilo y/o cíclico puede contener uno o más heteroátomos, tales como O o S, en particular O. En este caso, preferiblemente están presentes 1 a 3 , en particular 1 o 2 heteroátomos . Los compuestos preferidos en este contexto están seleccionados del siguiente grupo de compuestos. '3 11 De acuerdo con una realización más preferida, el residuo hidrocarbonado es un residuo arilo que tiene 5 a 7 y preferiblemente 6 átomos de carbono. Más preferiblemente, el residuo hidrocarbonado es el residuo benceno. De acuerdo con esta realización preferida, el grupo carboxi y el grupo aldehido pueden estar situados en el anillo de benceno en posición 1,4, posición 1,3 o posición 1,2, prefiriéndose la posición 1,4. Como grupo carboxi reactivo, puede mencionarse un éster reactivo, isotiocianatos o isocianato Los esteres reactivos preferidos derivan de N-hidroxi succinimidas tales como N- hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, adecuadamente fenoles sustituidos tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o, o ' -dinitrofenol, triclorofenol tales como 2, 4, 6-triclorofenol o 2 , 4, 5-triclorofenol, trifluorfenol tales como 2, 4, 6-trifluorfenol o 2, 4, 5-trifluorfenol, pentaclorofenol, pentafluorfenol, o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol". Son especialmente preferidas las N-hidroxi succinimidas, siendo especialmente preferidas N-hidroxi succinimida y Sulfo-N-hidroxi succinimida. Todos los alcoholes pueden empelarse solos o en una combinación apropiada de dos o más de los mismos . Como éster reactivo son especialmente preferidos el éster pentafluorfenílico y el i éster de N-hidroxi succinimida De acuerdo con una realización específica, el grupo funcional que es capaz de formar una unión química con el grupo funcional Q, donde Q es preferiblemente NH2 o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaral uilo, o grupos alcarilamino, siendo en particular NH2, es un grupo carboxi reactivo. En este caso, el grupo funcional que es capaz de formar una unión química, con el grupo funcional Q y que es un grupo carboxi, se hace reaccionar convenientemente para obtener un grupo carboxi reactivo tal como se describió anteriormente.

Por lo tanto, se prefiere someter el por lo menos un compuesto bifuncional que comprende un grupo carboxi y un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, a una reacción en la cual el grupo carboxi es transformado en un grupo carboxi reactivo, y el por lo menos un compuesto bifuncional resultante, se purifica- y se hace reaccionar con el grupo funcional Q del derivado polimérico. Ejemplos específicos del por lo menos compuesto bifuncional que comprende un grupo carboxi que puede hacerse reaccionar para obtener un grupo carboxi reactivo, son los compuestos 1 a 11 de la lista anterior. En este contexto, el término "grupo carboxi" se refiere también a una lactona y a un anhídrido interno de un completo de ácido dicarboxílico. Por lo tanto, de acuerdo con una realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el derivado polimérico que comprende Q, donde Q es un grupo amino-NH2, o un derivado del grupo amino que comprende la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo, o grupos alcarilamino, se hace reaccionar adicionalmente con ácido formil benzoico . De acuerdo con otra realización, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente, donde el derivado polimérico comprende Q, donde Q es un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con éster pentafluorfenílico de ácido formilbenzoico. De acuerdo con una realización más, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como los descritos anteriormente donde el derivado polimérico que comprende Q, donde Q es un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con éster de N-hidroxisuccinimida de ácido formilbenzoico. De acuerdo con una realización más, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde el derivado polimérico que comprende Q, donde Q es un grupo amino, se hace reaccionar adicionalmente con ácido 4- (4-formil-3 , 5-dImetoxifenoxi) butírico. De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un compuesto bifuncional que es un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos siálicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal. Con respecto a los ácidos alfa-ceto carboxílicos, éstos son preferiblemente ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados de amino ácidos y pueden, en la mayoría de los casos, encontrarse también en el cuerpo humano . Los ácidos alfa-ceto carboxílicos preferidos derivados de amino ácidos están seleccionados del grupo que consiste en ceto-valina, ceto-leucina, ceto-isoleucina y ceto-alanina. El grupo carboxi de ácidos alfa- ceto carboxílicos se hace reaccionar con el grupo Q del polímero que es un grupo amino. Con él, se forma un grupo amido. El grupo ceto libre remanente del ácido alfa-ceto carboxílico, se hace reaccionar luego con un grupo funcional de la proteína, en particular un grupo amino. Con él, se forma un grupo imino, el cual puede ser hidrogenado. Por consiguiente," la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describió anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un ácido alfa-ceto carboxílico. Con respecto a los ácidos siálicos o a sus derivados, éstos son. preferiblemente biocompatibles, en particular son azúcares que se encuentran en el cuerpo humano, los cuales están N- y/o O-acetilados . En una realización preferida, los ácidos siálicos son ácidos N-acetil neurámicos . Estos compuestos muestran una rigidez deseada, debido a la estructura piranósica, para cumplir la función de espaciadores. Por otra parte, puede ser posible introducir un grupo aldehido dentro de estos compuestos a través de oxidación selectiva. Los ácidos siálicos se encuentran en el cuerpo humano, por ejemplo como monosacáridos terminales en cadenas glicano de proteínas glicosiladas . En una realización preferida, el ácido siálico puede estar selectivamente oxidado a un grupo aldehido. Los métodos para oxidar selectivamente ácidos siálicos, son conocidos en el arte, por ejemplo en L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980), 21 - 32 y T. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673. Preferiblemente la oxidación del ácido siálico puede llevarse a cabo antes de la reacción con el grupo amino del p.olímero. El ácido siálico opcionalmente oxidado, puede reaccionar luego a través de su grupo ácido carboxílico en el grupo amino del polímero . Los compuestos resultantes -contienen un grupo aldehido que puede reaccionar luego por aminación reductora con un grupo amino de una proteína. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un ácido siálico opcionalmente oxidado . Con respecto al fosfato de piridoxal (PyP) , éste es un compuesto bifuncional altamente biocompatible y se denomina también vitamina B6. El PyP es una co-enzima que participa en las transaminaciones, descarboxilaciones, racemizaciones y numerosas modificaciones de cadenas secundarias de amino ácido. Todos los PyP que requieren enzimas , actúan a través de la formación de una base de Schiff entre el amino ácido y la co-enzima.

El grupo fosfato del PyP puede reaccionar con un grupo amino del polímero, preferiblemente almidón de hidroxialquilo, en particular almidón de hidroxietilo, formando una fosforamida. El grupo aldehido de PyP puede reaccionar luego con el grupo amino de una proteína, formando una base de Schiff, la cual puede ser luego reducida. En una realización preferida, la estructura del conjugado es HES-NH-P(O) 2-0- (piridoxal) -CH-NH-proteína. En 1 caso del- PyP, el grupo funcional del "polímero es introducido preferiblemente dentro del polímero mediante el uso de un compuesto " diamino tal como se describió anteriormente . Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con fosfato de piridoxal . Como solvente para la reacción, del derivado polimérico que comprende un grupo amino, y por ejemplo ácido formil benzoico, se prefiere por lo menos un solvente aprótico o por lo menos un solvente polar. Son solventes apropiados, entre otros, agua, sulfóxido de dimetilo (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA) , dimetil formamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos . Como solvente para la reacción del derivado polimérico que comprende un grupo ,amino y por lo menos .. un compuesto bifuncional que comprende un grupo carboxi, es también posible usar un medio acuoso. El término "medio acuoso", tal como se usa en este contexto de la presente invención, se refiere a un solvente o a una mezcla de solventes que comprenden agua en el rango de desde por lo menos 10% en peso o por lo menos 20% en peso o por lo menos 30% en peso o por lo menos 40% en peso o por lo menos 50% en peso o por lo menos 60% en peso o por lo menos 70% en peso o por lo menos 80% en peso o por lo menos 90% en peso o hasta 100% en peso, en base al peso de los solventes involucrados . -La reacción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 a 40°C, más preferiblemente de desde 0 a 25°C y es especialmente preferible de 15 a 25°C para un tiempo de reacción preferiblemente 0,5 a 24 horas y es especialmente preferible de 1 a 17 horas. De acuerdo con una realización preferida, la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente activador. Los agentes activadores apropiados son entre otros carbodiimidas tales como diisopropil carbodiimida (DIC) , diciclohexil carbodiimidas (DCC), l-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) , prefiriéndose especialmente diisopropil carbodiimida (DIC) El derivado polimérico resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante por lo menos un método apropiado. Si es necesario, el derivado polimérico puede precipitar antes de la aislación mediante por lo menos un método apropiado. Si precipita primero el derivado polimérico, es posible, por ejemplo, poner en contacto la mezcla de reacción con por lo menos un solvente o una mezcla de solventes distintos del solvente o mezcla de solventes que están presentes en- la mezcla de reacción, a temperaturas apropiadas. De acuerdo con una realización particularmente prejfe'rida de la presente invención donde se usa como solvente un medio acuoso, preferiblemente agua, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla de 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura preferiblemente en el rango de -20 a +50°C y especialmente preferiblemente en el rango de desde -20 a 25°C. La aislación del derivado polimérico puede llevarse a cabo mediante un procedimiento apropiado que puede comprender una o más etapas . De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el derivado polimérico ' se separa primero de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con, por ejemplo una mezcla de 2-propanol acuoso, mediante metanol apropiado tal como por centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado polimérico separado puede someterse a tratamiento adicional tal como un post-tratamiento de tipo diálisis, una filtración centrífuga o una filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración de gel y/o liofilización. De acuerdo con una realización aún más preferida el derivado polimérico separado se dializa primero preferiblemente contra agua, y luego se liofiliza hasta el contenido de solvente del producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a una temperatura de desde 20 a 35°C, preferiblemente de desde 20 a 30°C. El derivado polimérico resultante con el grupo aldehido o el grupo ceto o el grupo hemiacetal se hace reaccionar subsiguientemente con un grupo amino de la proteína a través de aminación reductora. En cuanto al acoplamiento de por lo menos un grupo amino de la proteína con por lo menos un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal del polímero por aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior referente a los parámetros de reacción específicos de la reacción de aminación reductora tal como el pH o la temperatura. De acuerdo con una realización especialmente preferida de la presente invención, de acuerdo con la cual se usa G-CSF como proteína, la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 10°C tal como de 1 a 8°C o desde 2 a 6°C tal como de aproximadamente 4°C a un pH de aproximadamente 4,5 a 5,5 tal como de aproximadamente 5,0. El tiempo de reacción es de aproximadamente 10 a 20 horas tal como de desde 12 a 19 horas o de 14 a 18 horas tal como de aproximadamente 17 horas o aproximadamente 20 a 30 horas tal como de aproximadamente 24 horas. De acuerdo con realizaciones especialmente preferidas de la presente invención, de acuerdo con las cuales rhIL 2, rhIL 3, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhEPO, rhAT III, BSA, Mioglobina y SOD se usan como proteínas, la aminación reductora se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 a 5°C tal como de aproximadamente 4°C a a pH de aproximadamente 4,5 a 5,5 tal como de aproximadamente 5,0 y por un tiempo de reacción de aproximadamente 20 a 30 horas tal como de aproximadamente 24 horas. Por lo tanto, de acuerdo con las realizaciones preferidas antes mencionadas, la presente invención se refiere también, en el caso en el cual se hace reaccionar el polímero a través del extremo reductor oxidado, a un conjugado de acuerdo con la fórmula De acuerdo con una realización especialmente preferida, el polímero es almidón de hidroxietilo, es decir HAS' es HES ' , y n = 2, 3, o 4, más preferiblemente 4, tal como se describió anteriormente. Por lo tanto, en el caso en el cual se hace reaccionar el polímero a través de su extremo reductor oxidado, la presente invención ser refiere también a un conjugado de acuerdo con la fórmula De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere también, en el caso en el cual el polímero se hace reaccionar a través de su extremo reductor oxidado, con un conjugado de acuerdo con la fórmula en la cual n = 2 , 3 , o 4, R4 es independientemente hidrógeno o un grupo metoxi, y m = 0 en el caso en el que R4 es hidrógeno y = 1 en el caso en el que R es metoxi, HAS es preferiblemente HES' . En cada una de las fórmulas anteriores, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína a la cual está ligado el derivado polimérico a través del grupo aldheído. Con respecto a las realizaciones antes mencionadas de acuerdo con las cuales los grupos funcionales M y Q comprenden - un grupo amino -NH2, es también posible que M sea un grupo amino -NH2 y que Q comprenda un grupo beta hidroxi amino -CH(OH)-CH2- NH2 y que preferiblemente sea un grupo beta hidroxi amino. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método y aun conjugado tal como se describió anteriormente donde el grupo amino Q del compuesto comprende dos grupos amino M y Q, es un grupo beta hidroxi amino -CH(OH)-CH2-NH2. En este caso, M y Q pueden estar separados por cualquier espaciados apropiado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido. En general el residuo hidrocarbonado tiene de 1 a 60, preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 2 a 10, y más preferiblemente de 1 a 6 y especialmente preferiblemente de 1 a 2 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende en general de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 8 y especialmente preferiblemente de 1 a 4 heteroátomos . El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que tiene por ejemplo de 5 a 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo, un grupo alcarilo donde la parte alquilo puede ser un grupo lineal y/o cíclico. De acuerdo con una realización aún más preferida, el residuo hidrocarbonado es una cadena alquilo de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono y especialmente preferiblemente de 1 a 2 átomos de carbono . Aún más preferiblemente, M y Q están separados por un grupo metileno. Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un método y a uñ conjugado tal . como los que se han descrito anteriormente donde el polímero se hace reaccionar con 1,3-diamino-2-hidroxipropano . En el caso en el cual el polímero se hace reaccionar a través de su extremo reductor oxidado, el resultado es un derivado polimérico que tiene la fórmula especialmente en forma preferida con HAS ' = HES ' La reacción del por lo menos un compuesto bifuncional que comprende M y Q, particularmente preferiblemente 1,3-diamino- 2-hidroxipropano, donde el polímero se eleva preferiblemente a una temperatura de desde 40 a 120°C, más preferiblemente de desde 40 a 90°C y especialmente preferiblemente de desde 60 a 80°C. El ti'empo de reacción está preferiblemente dentro de un rango de 17 a 168 hs, más preferiblemente de 17 a 96 hs y especialmente preferiblemente en un rango de 48 a 96 hs . La relación molar del por lo menos compuesto bifuncional : polímero, está preferiblemente en el rango de 200:1 a 10:1, especialmente de 50:1 a 100:1. Como solvente para la reacción del por lo menos compuesto bifuncional con el polímero, se prefiere por lo menos un solvente aprótico, preferiblemente un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua de no más de 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más de 0,1 por ciento en peso. Los solventes apropiados son entre otros, sulfóxido de dimetilo (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA) , dimetil formamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos. El grupo Q beta hidroxi amino del derivado polimérico puede reaccionar generalmente con por lo menos un compuesto bifuncional que comprende por lo menos un grupo funcional capaz de reaccionar con Q y que comprende adicionalmente por lo menos un grupo funcional que es un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional capaz de ser modificado para proporcionar un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal. De acuerdo con otra realización de la presente invención el grupo beta hidroxi amino está directamente químicamente modificado para proporcionar un grupo aldheído por oxidación química. Esta oxidación puede llevarse a cabo con todos los agentes de oxidación apropiados que son capaces de convertir el grupo hidroxi amino a un grupo aldheído . Los reactivos de oxidación preferidos son periodatos tales como periodatos de metales alcalinos . Es especialmente preferido periodato de sodio que se emplea preferiblemente como solución acuosa. Esta solución tiene una concentración de yodato preferido de desde 1 a 50 mM, más preferiblemente de 1 a 25 mM y especialmente preferiblemente de 1 a 10 mM. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 40°C, preferiblemente de 0 a 25°C y especialmente preferiblemente de 4 a 20°C. El derivado polimérico resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción con por lo menos un método apropiado. Si es necesario, el derivado polimérico puede precipitar antes de la aislación con por lo menos un método apropiado . Si precipita primero el derivado polimérico, es posible poner en contacto por ejemplo la mezcla de reacción con por lo menos un solvente o una mezcla de solventes distinto del solvente o mezcla de solventes que están presentes en la mezcla de reacción a temperaturas apropiadas . De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, cuando se usa como solvente un medio acuoso preferiblemente agua, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla de 1:1 (v/v) , que indica volúmenes iguales de dichos compuestos a una temperatura preferiblemente en el rango de -20 a +50°C y especialmente preferiblemente en el rango de desde -20 a 25°C. La aislación del derivado polimérico puede llevarse a cabo mediante un procedimiento apropiado que puede comprender - una o más etapas . De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el derivado polimérico se separa primero de la mezcla de reacción con por ejemplo una mezcla de 2-propanol acuoso mediante un método apropiado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado polimérico separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un post-tratamiento de tipo diálisis, filtración centrífuga o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración de gel y/o liofilización. De acuerdo con una realización más preferida, el derivado polimérico separado se dializa primero preferiblemente contra agua, y luego se liofiliza hasta que el contenido de solvente del producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas para el producto. La liofilización puede llevarse a cabo a una temperatura de desde 20 a 35°C, preferiblemente de 20 a 30°C. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a un conjugado tal como el que se describió anteriormente donde la oxidación del grupo Q beta hidroxi amino se lleva a cabo usando un periodato. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método para producir un conjugado, donde en el caso en el cual se emplea el polímero con el extremo reductor oxidado, un derivado polimérico que tiene un grupo beta hidroxi amino, especialmente preferiblemente y particularmente con HAS' = HES', es oxidado, preferiblemente con un periodato, a un derivado polimérico que tiene un grupo aldheído, especialmente preferiblemente y particularmente HAS ' = HES ' . De acuerdo con la presente invención, también es posible hacer reaccionar el compuesto que comprende una estructura 1- amino 2-hidroxi descrita anteriormente con un por lo menos grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo y un grupo aldehido, ceto o acetal descrito anteriormente para obtener un derivado polimérico que puede somterse a aminación reductiva con un grupo amino de -la proteína. El derivado polimérico resultante con el grupo aldheído A, se hace reaccionar subsiguientemente con la proteína. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método para producir un conjugado, donde dicho método comprende hacer reaccionar un derivado polimérico que tiene un grupo beta hidroxi amino, en el caso en el cual se emplea el polímero, con un extremo reductor oxidado especialmente preferiblemente de acuerdo con la fórmula y particularmente con HAS ' = HES ' , con un grupo amino de la proteína. El derivado polimérico resultante con el grupo aldheído se hace reaccionar subsiguientemente con un grupo amino de la proteína a través de aminación reductora. En lo que se refiere al acoplamiento del por lo menos un grupo amino de la proteína con por lo menos un grupo aldheído del polímero por aminación reductora, se hace referencia a la descripción detallada anterior. Por lo tanto, de acuerdo con la realización preferida antes mencionada, la presente invención se refiere también a un conjugado de acuerdo con la fórmula particularmente con HAS ' = HES ' , en el caso en el - que se emplea el polímero con el extremo reductor oxidado . En la fórmula anterior, el nitrógeno unido a la proteína deriva del grupo amino de la proteína a la cual está ligado el derivado polimérico a través del grupo aldheído. De acuerdo con una realización adicional de la presente invención, el polímero se hace reaccionar primero con un compuesto apropiado para proporcionar un primer derivado polimérico que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo. Este primer derivado polimérico se hace reaccionar luego con por lo menos un compuesto bifuncional adicional donde por lo menos un grupo funcional de este compuesto adicional se hace reaccionar con por lo menos un grupo carboxi reactivo del derivado polimérico y por lo menos otro grupo funcional del compuesto adicional es un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o es un grupo funcional que está químicamente modificado para proporcionar un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y done el derivado polimérico resultante que comprende dicho grupo aldheído o dicho grupo ceto o grupo hemiacetal se hace reaccionar otra vez de aminación reductora tal _ como se describió anteriormente, con por lo menos un grupo amino de la proteína. También es posible alterar la secuencia de reacción de los respectivos compuestos entré sí . De acuerdo con una primera alternativa de dicha realización adicional, el polímero que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo se prepara oxidando selectivamente el polímero en su extremo reductor y haciendo reaccionar subsiguientemente' el polímero oxidado que es una lactona y/o un ácido carboxílico o una sal apropiada del ácido carboxílico tal como una sal de metal alcalino, preferiblemente una sal de sodio y/o potasio, y HAS' es preferiblemente HES', con un compuesto apropiado para proporcionar el polímero que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo . La oxidación del polímero, preferiblemente almidón de hidroxietilo, puede llevarse a cabo de acuerdo con cada método o combinación de métodos que dan como resultado compuestos que tienen las estructuras antes mencionadas (lia) y/o (Ilb) . Aunque la oxidación puede llevarse a cabo de acuerdo a todos los métodos apropiados o métodos que dan como resultado un extremo reductor oxidado de almidón hidroxialquilo, preferiblemente se lleva a cabo usando una solución alcalina de yodo tal como ha sido descrita por ejemplo en DE 196 28 705 Al cuyos contenidos respectivos (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24) se incorporan aquí como referencia. La introducción del grupo carboxi reactivo dentro del polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor puede llevarse a cabo mediante cualquier método conferible y todos los compuestos apropiados. De acuerdo con el método específico de la presente invención, el polímero que se oxida selectivamente en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con por lo menos un alcohol preferiblemente con por lo menos un alcohol ácido tal como alcoholes ácidos que tienen un valor de pKA en el rango de 6 a 12 de desde 7 a 11 hasta 25°C.

El peso molecular del alcohol ácido puede estar en el rango de desde 80 a 500 g/moles, tal como desde 90 a 300 g/moles o desde 100 a 200 g/moles. Los alcoholes ácidos apropiados son todos alcoholes H-0- RA que tienen un protón ácido y que son capaces de reaccionar con el polímero oxidado para proporcionar el respectivo éster polimérico reactivo preferiblemente de acuerdo con la fórmula y aún más preferiblemente de acuerdo con la fórmula Los alcoholes preferidos son N-hidroxi succinimidas tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles apropiadamente sustituidos tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o, o1 -dinitrofenol, triclorofenol tales como 2, 4, 6-triclorofenol o 2, 4, 5-triclorofenol, trifluorofenol tales como 2, 4, 6-trifluorofenol o 2, 4, 5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, o hidroxiazoles tal como hldroxl benzotriazol . Se prefieren especialmente las N-hidroxi succinimidas, siendo especialmente preferidas la N- hidroxisuccinimida y la Sulfo-N-hidroxisuccinimida. Pueden emplearse todos los alcoholes solos o en una combinación apropiada de dos o más de los mismos . En el contexto de la presente invención es también posible emplear un compuesto que libere al alcohol respectivo por ejemplo por agregado de diésteres de ácido carbónico. Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método tal como el descrito anteriormente, donde el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor es activado por reacción del polímero oxidado con un alcohol ácido, preferiblemente con N-hidroxi succinimida y/o Sulfo-N-hidroxi succinimida. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el polímero que es selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con por lo menos un diéster carbónico RB-0- (C=0) -O-Rc, donde RB y Rc pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente este método provee polímeros reactivos de acuerdo con la fórmula en la cual HAS ' es preferiblemente HES ' . Como compuestos diéster carbónicos apropiados pueden emplearse compuestos cuyos componentes alcohol son independientemente N-hidroxi succinimidas tales como N-hidroxi succinimida o Sulfo-N-hidroxi succinimida, convenientemente fenoles sustituidos tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o,o'-dinitrofenol, triclorofenol tales como 2,4,6- triclorofenol o 2, 4, 5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2, 4, 6-trifluorofenol o 2, 4, 5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol , o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol . Son especialmente preferidos el carbonato de N,N' -disuccinimidilo y el carbonato de Sulfo-N,N'-disuccinimidilo, siendo especialmente preferido el carbonato de N,N' -disuccinimidilo. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método tal como el descrito anteriormente donde el polímero que es oxidado selectivamente en su extremo reductor es activado por reacción del polímero oxidado con carbonato de N,N' -disuccinimidilo . El alcohol ácido se hace reaccionar con el polímero oxidado o con la sal del polímero oxidado en una relación molar de alcohol ácido : polímero preferiblemente de desde 5:1 a 50:1, más preferiblemente de 8:1 a 20:1, a una temperatura de reacción preferida de desde 2 a 40°C, y más preferiblemente de 10 a 30°C y en forma especialmente preferida de 15 a 25°C. El tiempo de reacción está preferiblemente en el rango de 1 a 10 hs, más preferiblemente de 2 a 5 hs, más preferiblemente de 2 a 4 hs y particularmente de 2 a 3 hs . El compuesto de diéster carbónico se hace reaccionar con el polímero oxidado o con la sal de polímero oxidado en una relación molar de compuesto diéster : polímero generalmente de desde 1:1 a 3:1, tal como de desde 1:1 a 1.5:1. El tiempo de reacción generalmente está en el rango de desde 0,1 a 12 hs, tal como de 0,2 a 6 hs, o de 0,5 a 2 hs o de 0,75 a 1,25 hs. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, la reacción del polímero oxidado con alcohol ácido y/o diéster carbónico se lleva a cabo en por lo menos un solvente aprótico tal como en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua de no más 0,5 por ciento en peso. Preferiblemente de no más de 0,1 por ciento en peso. Los solventes apropiados son, entre otros, sulfóxido de dimetilo (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA) , dimetil formamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos. Las temperaturas de reacción están preferiblemente en el rango de desde 2 a 40°C, más preferiblemente de desde 10 a 30°C.

Para la reacción del polímero oxidado con el por lo menos un alcohol ácido se emplean por lo menos una agente activador adicional . Los agentes activadores apropiados son entre otros, carbonildiimidazol, carbodiimidas tales como diisopropil carbodiimida (DIC) , diciclohexil carbodiimidas (DCC) , 1-etil- 3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), siendo especialmente preferidas diciclohexil carbodiimidas (DCC) y 1- etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Por lo tanto, la presente invención se refiere también al método descrito anteriormente donde el polímero que es oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar con un alcohol ácido en presencia de un agente activador adicional para proveer el éster polimérico reactivo. De acuerdo con una realización de la presente invención, la reacción del polímero oxidado con diéster carbónico y/o alcohol ácido se lleva a cabo a una actividad de base baja que puede determinarse mediante agregado de la mezcla de reacción a agua, con una relación de volumen de agua a mezcla de reacción de 10:1. Antes de la adición, el agua que no comprende esencialmente buffer, tiene un valor de pH de 7 a 25°C. Después de la adición de la mezcla de reacción y después de medir el valor de pH, se obtiene la actividad básica de la mezcla de reacción, que tiene un valor de preferiblemente de no más de 9,0, más preferiblemente de no más de 8,0 y especialmente preferiblemente de no más de 7,5. De acuerdo con otra realización de la presente invención el polímero oxidado se hace reaccionar con N-hidroxi succinimida en DMA seco en ausencia de agua con EDC para proveer selectivamente el éster de N-hidroxi succinimida de acuerdo con la fórmula _ '-- más preferiblemente donde HAS' es HES'. Sorprendentemente, esta reacción no produce sub-productos resultantes de reacciones de EDC con grupos OH de HES, y la reacción de reordenamiento de la O-acil isourea formada por EDC y el polímero oxidado con la respectiva N-acil urea es sorprendentemente suprimida. De acuerdo con otra realización preferida de la presente invención, el polímero oxidado se hace reaccionar con carbonato de N,N' -disuccinimidilo en DMF seco en ausencia de agua y ausencia de un agente activador para proveer selectivamente el polímero éster de N-hidroxi succinimida de acuerdo con la fórmula más preferiblemente donde HAS ' es HES ' . - "De acuerdo con otra realización de la presente invención, el polímero que está selectivamente oxidado en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con una- azolida tal como carbonildiimidazol^ o carbonil dibenzimidazol para proveer un polímero que tiene un grupo carboxi reactivo. En el caso de carbonildiimidazol, resulta un derivado polimérico de imidazolida reactiva de acuerdo con la fórmula donde HAS ' es preferiblemente HES ' . De acuerdo con una segunda alternativa de dicha realización adicional de la presente invención con respecto a la introducción de un grupo carboxil reactivo dentro del polímero, el grupo carboxi reactivo es introducido dentro del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, mediante reacción de por lo menos un grupo hidroxi del polímero con un diéster carbónico . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método y a conjugados donde el grupo carboxi reactivo es introducido en el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, por reacción de por lo menos un grupo hidroxi del polímero con por lo menos un diéster carbónico diéster carbónico RB-0- (C=0)-0-Rc, donde RB y Rc pueden ser iguales o diferentes . De acuerdo con otras realización de la presente invención, el polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, se hace reaccionar con por lo menos un grupo hidroxi con una" azolida tal como carbonildiimidazol, carbonil-di- (1, 2, 4- triazol) o carbonil dibenzimidazol para proporcionar un polímero que tiene un grupo carboxi reactivo . Como compuestos diéster carbónicos apropiados, pueden emplearse compuestos cuyos componentes alcohólicos son independientemente N-hidroxi succinimidas tales como N-hidroxi succinimda o Sulfo-N-hidroxi succinimida, fenoles apropiadamente sustituidos tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o, o ' -dinitrofenol, triclorofenol tales como 2, 4, 6-triclorofenol o 2 , 4, 5-triclorofenol, trifluorofenol tales como 2, 4, 6-trifluorofenol o 2 , 4, 5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorfenol, o hidroxiazoles tales como hidroxi benzotriazol .

Se prefieren especialmente los compuestos diéster carbónicos simétricos, RB y Rc que por lo tanto son iguales. El componente alcohólico del diéster carbónico está preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en N- hidroxi succinimida, N-hidroxi succinimida sulfonada, N- hidroxi benzotriazol, y fenoles, nitro- y halógeno- sustituidos. Entre otros, se prefieren, nitrofenol, dinitrofenol, triclorofenol, trifLuorfenol, pentaclorofenol, y pentafluorfenol . Son especialmente preferidos el carbonato de N,N' -disuccinimidilo y el carbonato de N,N' -disuccinimidilo, siempre especialmente preferidos el carbonato de . N,N'- disuccinimidilo . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un derivado de almidón de hidroxialquilo, preferiblemente un derivados de almidón de hidroxi etilo, donde por lo menos un grupo hidroxi, preferiblemente dos grupos hidroxi, de dicho almidón han reaccionado con un compuesto diéster carbónico para proporcionar el respectivo éster reactivo . De acuerdo con una realización de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con por lo menos un compuesto de diéster carbónico, se eleva hasta una temperatura de 2 a 40°C, más preferiblemente de desde 10 a 30°C y especialmente desde 15 a 25°C. Un tiempo de reacción preferido está comprendido entre desde 0,5 a 5 hs, más preferiblemente desde 1 a 3 hs, y especialmente en forma preferida de 2 a 3 hs . La relación molar compuesto de diéster carbónico : polímero depende del grado de sustitución del polímero con respecto a la cantidad de grupos hidroxi reaccionados con el compuesto diéster carbónico relativo a la cantidad de grupos hidroxi presentes en el polímero no reaccionado. De acuerdo con una realización de la presente invención, la relación molar de compuesto de diéster carbónico : unidades de anhidroglucosa del polímero está en el rango de desde 1:2 a 1:1000, más preferiblemnete de 1:3 a 1:100 y especialmente preferiblemente desde 1:10 a 1:50, para proporcionar un grado de sustitución en el rango de desde 0,5 a 0,001, preferiblemente de desde 0,33 a 0,01 y especialmente preferiblemente desde 0,1 a 0,02. De acuerdo con una realización de la presente invención, la reacción del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con diéster carbónico se lleva a cabo en por lo menos un solvente aprótico, particularmente preferiblemente en un solvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más de 0,1 por ciento en pesos. Los solventes apropiados son entre otros, sulfóxido de dimetilo (DMSO) , N-metil pirrolidona, dimetil acetamida (DMA) , dimetil formamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método tal como el que se describió anteriormente donde la reacción del por lo menos un grupo hidroxi del polímero cuyo extremo reductor no está oxidado, con el diéster carbónico para proporcionar un grupo carboxi reactivo se lleva a cabo en un solvente polar aprótico anhidro, donde el solvente es preferiblemente dimetil acetamida, dimetil formamida o una mezcla de éstas. El derivado polimérico reactivo que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo, resultante preferiblemente de -la reacción del polímero con el alcohol ácido, el carbonato y/o la azolida, tal como se describió anteriormente, se hace reaccionar adicionalmente con por lo menos un compuesto adicional donde por lo menos funcional Fi de este compuesto adicional se hace reaccionar con por lo menos un grupo carboxi reactivo del derivado polimérico . Como por lo menos un grupo funcional Fi del compuesto adicional, no existe ninguna limitación específica dado que es posible una reacción con el por lo menos un grupo carboxi reactivo del polímero . Los grupos funcionales preferidos Fi son por ejemplo un grupo amino o un grupo hidroxi o un grupo tio o un grupo carboxi .

El compuesto adicional, por lo menos bifuncional comprende por lo menos otro grupo funcional F2 que consiste en un grupo aldheído o un grupo funcional F2 que es capaz de ser modificado químicamente para proporcionar un grupo aldheído. La modificación química puede ser por ejemplo una reacción del grupo funcional F2 con un grupo funcional F3 un compuesto ligado al adicional o una oxidación o reducción del grupo funcional F2 apropiado. En caso de hacer reaccionar F2 con un grupo funcional F3 de un compuesto adicional, el grupo funcional F2 puede seleccionarse, entre otros, de dobles enlaces C-C- o triples enlaces C-C- o enlaces aromáticos C-C- ; - el grupo tio o el grupo hidroxi; hidrazida de ácido alquil sulfónico, hidrazida de ácido aril sulfónico; 1,2-dioles; 1, 2-aminoalcoholes; - 1,2 amino-tioalcoholes; azidas; el grupo amino -NH2 o derivados de grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, un grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad estructural -O-NH-, tal como grupos hidroxilalguilamino grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxiaralquilamino o grupos hidroxalalcarilamino; - grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos ar lquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, que comprenden cada uno la unidad estructural -NH-0-; residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, donde G es 0 o S, y M es, por ejemplo, — -OH o -SH; un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi ; un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, "alcariltio; — un grupo alquilcarboniloxi, un grupo -arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcarilcarboniloxi; esteres activados tales como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida tales como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural -O-N donde N es parte de un compuesto heteroarilo o, con G = 0 y Q ausentes, tal como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorfenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; donde Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u 0; - -NH-NH2, o -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo; grupos carbonilo tales como el grupo aldheído o el grupo ceto; el grupo carboxi; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos haluro vinílico tales como yoduro de vinilo o el grupo de bromuro vinílico o triflato; -C=C-H; - (C=NH2C1) -O alquilo; grupos - (C=0) -CH2-Hal donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-; el grupo el grupo donde F3 es un grupo capaz de formar un enlace químico con uno de los grupos antes mencionados y preferiblemente está seleccionado entre los grupos antes mencionados. Además, el segundo compuesto ligador tiene preferiblemente por lo menos un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal que es capaz de reaccionar con un grupo amino de la proteína a través de aminación reductora. El grupo funcional Fi y el grupo aldheído o grupo ceto o grupo hemiacetal del por lo menos compuesto de enlace bifuncional que se hace reaccionar con el polímero y/o los grupos funcionales Fi y F2 del por lo menos compuesto de enlace bifuncional que se hace reaccionar con el polímero y/o el grupo F3 y el grupo aldheído o el grupo ceto o el grupo hemiacetal del compuesto adicional de enlace por lo menos bifuncional, pueden separarse independientemente mediante cualquier espaciador apropiado. Entre otros, el espaciador puede ser un residuo hidrocarbonado opcionalmente sustituido, lineal, ramificado y/o cíclico, alifático y/o aromático. En general, el residuo hidrocarbonado tiene hasta 60, preferiblemente hasta 40, más preferiblemente hasta 20, más preferiblemente hasta 10 átomos de carbono. Si están presentes heteroátomos, el grupo separador comprende en general desde 1 a 20, preferiblemente desde 1 a 8, más preferiblemente 1 a 6, - más preferiblemente 1 a 4 y especialmente preferiblemente de 1 a 2 heteroátomos. Como heteroátomo se prefiere O. El residuo hidrocarbonado puede comprender una cadena alquilo opcionalmente ramificada o un grupo arilo o un grupo cicloalquilo que por ejemplo de 5 a 7 átomos de carbono, o puede ser un grupo aralquilo un grupo alcarilo donde la parte alguilo puede ser un grupo alguilo lineal y/o cíclico. Ejemplos de un compuesto con grupos funcionales Fi y F2, son por ejemplo diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene de 2 a 20 átomos de carbono, especialmente preferiblemente 1, 2-diaminoetano, 1,3-diaminopropano, y 1,4- diaminobutano . Ejemplos preferidos de un compuesto con grupos funcionales F3 y un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal son por ejemplo ácido formilbenzoico, éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico, éster de N- hidroxisuccinimida de ácido 4-formilbenzoico y 4-(4-formil- 3 , 5-dimetoxifenoxi) butírico, o un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos neuramínicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal . De acuerdo con otra realización preferida, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un compuesto bifuncional que es un compuesto biocompatible seleccionado del grupo que consiste en ácidos alfa-ceto carboxílicos, ácidos neuramínicos o siálicos o derivados de los mismos y fosfato de piridoxal. Con respecto a los ácidos alfa-ceto carboxílicos, éstos son preferiblemente ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados de amino ácidos y pueden, en la mayoría de los casos, encontraarse también en el cuerpo humano . Los ácidos alfa-ceto carboxílicos derivados de amino ácidos están seleccinados del grupo que consiste en ceto-valina, ceto-leucina, ceto-isoleucina y ceto-alanina. El grupo carboxi de los ácidos alfa-ceto caboxílicos se hace reaccionar con el grupo Q del polímero que es un grupo amino . Con él se forma un grupo amido. El grupo ceto libre remanente del ácido alfa-ceto carboxílico, se hace reaccionar luego con un grupo funcional de la proteína, en particular un grupo amino. con éste, se forma un grupo imino que puede serr hidrogenado. Por consiguiente, la presetne invención se refiere a un método y a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con un ácido alfa-ceto carboxílico. Con respecto a los ácidos siálicos o los derivados de los mismos, éstos son preferiblemente biocompatibles, en particular son azúcars que se encuetnran en el cuerpo humano, que están N- y/o O-acetilados . En una realización preferida, los ácidos siálicos son ácidos N-acetil neurámicos. Estos compuestos muestran una rigidez deseada, debido a la estructura piranósica, para cumplir la función de espaciadores. Por otra parte, puede ser posible introducir un grupo aldehido dentro de estos compuestos a través de oxidación selectiva. Los ácidos siálicos se encuentran en el cuerpo humano, por ejemplo como monosacáridos terminales en cadenas glicano de proteínas glicosiladas. En una realización preferida, el ácido siálico puede estar selectivamente oxidado a un grupo aldehido. Los métodos para oxidar selectivamente ácidos siálicos, son conocidos en el arte, por ejemplo en L.W. Jaques, B.F. Riesco, W. Weltner, Carbohydrate Research, 83 (1980) , 21 - 32 y T. Masuda, S. Shibuya, M. Arai, S. Yoshida, Tomozawa, A. Ohno, M. Yamashita, T. Honda, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 13 (2003), 669 - 673. Preferiblemente la oxidación del ácido siálico puede llevarse a cabo antes de la reacción con el grupo amino del polímero. El ácido siálico opcionalmente oxidado, puede reaccionar luego a través de su grupo ácido carboxílico en el grupo amino del polímero . Los compuestos resultantes contienen un grupo aldehido que puede reaccionar luego por aminación reductora con un grupo amino de una proteína. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con. un ácido siálico opcionalmente oxidado . Con respecto al fosfato de piridoxal (PyP) , éste es un compuesto bifuncional altamente biocompatible y se denomina también vitamina B6. El PyP es una co-enzima que participa en las transaminaciones, descarboxilaciones, racemizaciones y numerosas modificaciones de cadenas secundarias de amino ácido. Todos los PyP que requieren enzimas, actúan a través de la formación de una base de Schiff entre el amino ácido y la co-enzima. El grupo fosfato del PyP puede reaccionar con un grupo amino del polímero, preferiblemente almidón de hidroxialquilo, en particular almidón de hidroxietilo, formando una fosforamida. El grupo aldehido de PyP puede reaccionar luego con el grupo amino de una proteína, formando una base de Schiff, la cual puede ser luego reducida. En una realización preferida, la estructura del conjugado es HES-NH-P(O) 2-0- (piridoxal) -CH-NH-proteína. En el caso del PyP, el grupo funcional del polímero es introducido preferiblemente dentro del polímero mediante el uso de un compuesto diamino tal como se describió anteriormente . Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método y a un conjugado tal como se describieron anteriormente, donde el polímero se hace reaccionar con fosfato de piridoxal . Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un método para producir un conjugado, donde dicho método comprende hacer reaccionar el polímero, preferiblemente almidón de hidroxietilo, su extremo reductor opcionalmente oxidado, seleccionado del grupo que consiste en alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y ázolidas, para proporcionar un derivado polimérico que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo, hacer reaccionar dicho derivado polimérico con por lo menos un compuesto bifuncional para proporcionar un derivado polimérico que comprende un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional capaz de ser químicamente modificado para proporcionar un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, opcionalmente modificando químicamente dicho grupo funcional para proporcionar un derivado polimérico que comprende un grupo aldheído o un grupo aceto o un grupo hemiacetal, y hacer reaccionar el derivado polimérico que comprende un grupo aldheído o un grupo aceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína a través de aminación reductora. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a un conjugado que comprende un polímero, preferiblemente almidón de hidroxietilo, y una proteína ligada covalentemente una a la otra, obtenible mediante un método de producción de un conjugado, donde dicho método comprende hacer reaccionar el polímero en su extremo reductor opcionalmente oxidado, con un compuesto, seleccionado del grupo que consiste alcoholes ácidos, diésteres carbónicos y azolidas, para proporcionar un derivado polimérico que comprende por lo menos un grupo carboxi reactivo, hacer reaccionar dicho derivado polimérico con por lo menos un compuesto bifuncional para proporcionar un derivado polimérico que comprende un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal o un grupo funcional capaz de ser químicamente modificado para proporcionar un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y modificar opcionalmente químicamente dicho grupo funcional para proporcionar un derivado polimérico que comprende un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal, y hace reaccionar el derivado polimérico que comprende un grupo aldheído o un grupo ceto o un grupo hemiacetal con un grupo amino de una proteína a través de aminación reductora. Un ejemplo específico de un compuesto que tiene un Fi funcional y un grupo F2 funcional que está oxidado para proporcionar un grupo aldheído es por ejemplo un compuesto que tiene un grupo amino como Fi y un grupo beta hidroxi amino como F2. Un ejemplo especialmente preferido es 1, 3-diamino-2-hidroxipropano . Esta oxidación puede llevarse a cabo con todos los agentes de oxidación apropiados que son capaces de convertir el grupo beta hidroxi amino a un grupo aldheído. Los reactivos de oxidación preferidos son periodatos tales como periodatos de metales alcalinos . Son especialmente preferidos el periodato de sodio que se emplea preferiblemente en forma de una solución acuosa. Esta solución tiene una concentración de yodato preferida de desde 1 a 50 mM, más preferiblemente de 1 a 25 mM y especialmente preferiblemente de desde 1 a 10 mM. La oxidación se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 40°C, preferiblemente desde 0 a 25°C y especialmente preferiblemente de 4 a 20°C. El derivado polimérico resultante puede purificarse a partir de la mezcla de reacción mediante por lo menos un método apropiado. Si es necesario, el derivado polimérico puede precipitar antes de la aislación mediante por lo menos el método apropiado.

Si el derivado polimérico precipita primero, es posible, por e emplo, poner la' mezcla de reacción en contacto con por lo menos un solvente o una mezcla de solventes distintos del solvente o la mezcla de solventes que están presentes en la mezcla de reacción, a temperaturas apropiadas. De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, cuando se usa un medio acuoso como solvente, la mezcla de reacción se pone en contacto con 2-propanol o con una mezcla de acetona y etanol, preferiblemente una mezcla de 1:1 (v/v), que indica volúmenes iguales de dichos compuestos, a una temperatura preferiblemente en el rango de desde -20 a +50°C y especialmente preferiblemente en el rango de desde -20 a 25°C. La aislación del derivado polimérico puede llevarse a cabo mediante un procedimiento apropiado que puede comprender una o más etapas. De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, el derivado polimérico es separado primero de la mezcla de reacción o la mezcla de la mezcla de reacción con por ejemplo una mezcla acuosa de 2-propanol, mediante un método apropiado tal como centrifugación o filtración. En una segunda etapa, el derivado polimérico separado puede someterse a un tratamiento adicional tal como un post-tratamiento de tipo diálisis, filtración centrífuga o filtración por presión, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa, HPLC, MPLC, filtración de gel y/o liofilización. De acuerdo con una realización aún más preferida, el derivado polimérico separado es dializado primero preferiblemente contra agua, y luego es liofilizado hasta que el contenido de solvente del producto de reacción es suficientemente bajo de acuerdo con las especificaciones deseadas del producto. La liofilización puede llevarse a cabo a una temperatura de desde 20 a 35°C, preferiblemente desde 20 a 30°C. La presente invención se refiere también a un conjugado que comprende almidón de hidroxialquilo y una proteína, donde el almidón de hidroxialquilo está acoplado con su extremo reductor oxidado a través de un enlace amida a un primer compuesto de entrecruzamiento, donde dicho compuesto de entrecruzamiento está ligado adicionalmente a través de un enlace amida a un segundo compuesto de entrecruzamiento donde dicho segundo compuesto de entrecruzamiento está ligado a través de una azometina y/o un enlace amino a una proteína, donde el primer compuesto de entrecruzamiento se empleó preferiblemente en forma de un compuesto de amino funcionalizado y el segundo compuesto entrecruzamiento se empleó preferiblemente como un carboxi y aldehido y ceto o hemiacetal, más preferiblemente un compuesto carboxi y aldehido funcionalizado. La presente invención se refiere también a un conjugado que comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un almidón de hidroxilquilo (HAS) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula donde Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente por lo menos un heteroátomo, que tiene de 1 a 60 preferiblemente de 1 a 40, y más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 6 más preferiblemente de 1 a 2 átomos de carbono y especialmente preferiblemente 1 átomo de carbono, donde L es en particular H2 • La presente invención se refiere también a un conjugado, que comprende una proteína o un polímero o un derivado del mismo donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo (HAS) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula en la cual Ri, R2 y R3 son independiente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de 1 a 10 átomos de carbono, preferentemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde Li y L2 son independientemente un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente por lo menos un heteroátomo que comprende una porción alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo y/o heteroaralquilo, donde dicho residuo tiene de 1 a 60 preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, y más preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono, y donde D es un enlace, preferiblemente un enlace covalente Jue se formó mediante un grupo funcional F2 apropiado ligado a Li y un grupo funcional F3 apropiado ligado a L2. La presente invención se refiere también a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde Li es -(CH2)n- con n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4, y especialmente preferiblemente 4.

La presente invención se refiere también a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde L2 comprende una porción arilo opcionalmente apropiadamente sustituida, preferiblemente una porción arilo que contiene 6 átomos de carbono, y L2 es especialmente preferiblemente CSH4. La presente invención se refiere a un conjugado tal como el descrito anteriormente, que está seleccionado del grupo que consiste en dobles enlaces C-C- o triples enlaces C-C- o enlaces aromáticos C-C-; el grupo tio o los grupos hidroxi; hidrazida de ácido alquil sulfónico, hidrazida de ácido aril sulfónico; - 1, 2-dioles; 1,2 amino-tioalcoholes; azidas; 1, 2-aminoalcoholes; el grupo amino -NH o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprende la unidad estructural -O-NH-, tal como grupos hidroxialquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxilalcarilamino; grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino, o grupos alcariloxiamino, donde cada uno comprende la unidad estructural -NH-0-; residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q- C(=G)-M, donde G es 0 o S, y M es, por ejemplo, -SH; un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi, o un grupo alcariloxi; un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; un grupo alquilcarboniloxi, un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcarilcarboniloxi; esteres activados tales como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida tal como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N es parte de una compuesto heteroarilo o con G = 0 y Q ausente, tal como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorfenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; donde Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S o O; -NH-NH2, O -NH-NH-; -N02; el grupo nitrilo; - - grupos carbonilo tales como el grupo aldehido o el grupo ceto; el grupo carboxi; el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos de haluro de vinilo tales como yoduro de vinilo o el grupo bromuro de de vinilo o triflato; - -C=C-H; - (C=NH2C1 ) -OAlquilo grupos - (C=0) -CH2-Hal donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-; grupo grupo y donde F3 es un grupo funcional capaz de formar un enlace químico con F2 y preferiblemente está seleccionado del grupo F2 anteriormente mencionado que comprende preferiblemente la porción -NH-, más preferiblemente comprende un grupo amino F3 que comrpende preferiblemente la proción -(C=G)-, más preferiblemente -(C=0)-, y más preferiblemente la porción - (C=G)-G-, y aún más preferiblemente -(C=0)-G-, y especialmente preferiblemente -(C=0)-0, D siendo particularmente preferible un enlace amida. La presente invención se refiere también al conjugado tal como el descrito anteriormente que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula n = 2, 3, o 4, R es independientemente hidrógeno o un grupo metoxi, y m = 0 en el caso en el cual R es hidrógeno y m = 1 en el caso en el cual R4 es metoxi . La presente invención se refiere también a un conjugado que comprende una proteína y una polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo (HAS) y la proteína es un factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula HAS" C N- Prate na' H2 H donde el átomo de carbono de la porción -CH2-N2- deriva de un grupo aldehido que fue introducido en el polímero mediante reacción de oxidación por apertura de anillo, y donde el átomo de nitrógeno deriva de un grupo amino de la proteína.

La presente invención se refiere también a un conjugado tal como el descrito anteriormente, donde el almidón de hidroxialquilo es almidón de hidroxietilo. La presente invención se refiere también a cualquiera de los conjugados descritos en los cuales el almidón de hidroxietilo tiene un peso molecular de 2 a 200 kD, preferiblemente de 4 a 130 kD, más preferiblemente de 4 a 70 kD. La presente invención se refiere también a un conjugado tal como el descrito anteriormente donde la proteína está seleccionada del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3 , mioglobina, SOD, y BSA, preferiblemente del grupo que consiste en rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, mioglobina, SOD, y BSA, y/o del grupo que consiste en AlAT, factor VII, factor VIII, factor IX, tPA, y APC. En los métodos para preparar un conjugado de la invención, el régimen de conversión en los métodos descritos anteriormente puede ser de por lo menos -50%, más preferiblemente por lo menos 70%, aún más preferiblemente por lo menos 80% y en particular 95% o incluso más, tal como por lo menos 98% o 99%. Los conjugados de acuerdo con la invención pueden ser por lo menos 50% puros, aún más preferiblemente por lo menos 70% puros, aún más preferiblemente por lo menos 90%, en particular por lo menos 95% o por lo menos 99% puros. En una realización más preferida, los conjugados pueden ser 100% puros, es decir no hay ningún otro sub-producto presente. Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también a una composición que puede comprender el (los) conjugado (s) de la invención, donde la cantidad del (los) conjugado (s) puede ser de por lo menos 50 % en peso, aún más preferiblemente por lo menos 70% en peso, aún más preferiblemente por lo menos 90% en peso, en particular por lo menos 95% en peso o por lo menos 99% en peso. En una realización más preferida, la composición puede consistir en el (los) conjugado (s) , es decir la cantidad de conjugado(s) es de 100% en peso. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también a un conjugado tal como el descrito anteriormente o a un conjugado obtenible por un método tal como el descrito, para ser usado en un método para el tratamiento de un cuerpo humano o de un animal . Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente eficaz de un conjugado tal como el descrito anteriormente o un conjugado obtenible por un método tal como el descrito anteriormente. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a la cantidad que provee un efecto terapéutico para una afección determinada y un régimen de administración. Por lo tanto, en una realización preferida, la composición farmacéutica comprende además por lo menos un diluyente, aditivo y/o portador farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente este diluyente, aditivo y/o portador farmacéuticamente aceptable es especialmente útil en terapia con IFN alfa, IFN beta, EPO, AT III, G-CSF, APC, AlAT, tPA, Factor VII, Factor VIII o Factor IX. Todos los conjugados de proteína-HAS de la presente invención se administran preferiblemente por vía i.v., s.c. o i.m. La vía específica elegida dependerá de la afección que se esté tratando. Preferiblemente, los conjugados se administran, conjuntamente con un portador apropiado tal como los conocidos en el arte (por ejemplo los que se usan en la primera generación/biofarmacéutica no modificada, libre de albúmina o como excipiente) , un diluyente apropiado tal como soluciones estériles para aplicación por i.v., i.m., o s.c. La dosis requerida dependería de la gravedad de la enfermedad que se está tratando, de la respuesta individual de los pacientes del método de administración usado, y similares. El experto en la materia podrá establecer una dosis correcta en base a sus conocimientos generales . De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, obtenible por un método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es EPO, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes anémicos o desórdenes de disfunciones hematopoyéticas o enfermedades relacionadas con las mismas . La administración de isoformas de eritropoyetina es -preferiblemente por vía parenteral. La vía específica elegida dependerá de la enfermedad que se está tratando. La administración de isoformas de eritropoyetina se efectúa preferiblemente como parte de una formulación que contiene un - portador apropiado tal como albúmina de suero humano, un diluyente apropiado, tal como solución salina de pH regulado y/o un aditivo apropiado. La dosis requerida será en cantidades suficientes para elevar el hematocrito de los pacientes y variará dependiendo de gravedad de la enfermedad que se está tratando, del método de administración usado y similares. El objeto del tratamiento con la composición farmacéutica de la invención, es preferiblemente un aumento del valor de la hemoglobina de más de 6,8 mmoles/l en la sangre. Para esto, la composición farmacéutica puede administrarse en una forma en la cual el valor de hemoglobina aumente entre 0,6 mmoles/1 y 1,6 mmoles/1 por semana. Si el valor de la hemoglobina excede 8,7 mmoles/l, la terapia debería ser preferiblemente interrumpida hasta que el valor de hemoglobina está por debajo de 8,1 mmoles 11. La composición de la invención se usa preferiblemente en una formulación apropiada para inyección subcutánea o intravenosa o parenteral. Para esto, excipientes y portadores apropiados por -ejemplo el dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato disódico, clorato de sodio, polisorbato 80, HSA y agua para inyección. La composición puede administrarse tres veces por semana, preferiblemente dos veces por semana, más preferiblemente una vez por semana, y aún más preferiblemente cada dos semanas. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra en una cantidad de 0,01-10 µg/kg de peso corporal del paciente, más preferiblemente 0,1 a 5 µg/kg, 0,1 a 1 µg/kg, o 0,2-0,9 µg/kg, más preferiblemente 0,3-0,7 µg/kg, y aún más preferiblemente 0,4-0,6 µg/kg de peso corporal . En general, preferiblemente entre 10 µg y 200 µg, preferiblemente entre 15 µg y 100 µg administrados por dosis. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, tal como se describió anteriormente o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, obtenible por un método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es G-CSF, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un desorden caracterizado por una función reducida hematopoyética o inmunitaria donde dicho desorden es preferiblemente el resultado de quimioterapia, terapia de radiación, enfermedades infecciosas, neutropenia crónica, neutropenia crónica grave o leucemia. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un HES-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, obtenible por un método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es el Factor VIII, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A. De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un conjugado de HAS-AT III tal como el descrito anteriormente o un conjugado de HAS-proteína, obtenible por un método tal como el descrito, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un deficiencia hereditaria de AT III, una enfermedad veno-oclusiva, quemaduras y resistencia en cirugía de injerto de bypass arterial coronario, Graft (CABG) , perforación intestinal resultante de trauma o cirugía gastrointestinal; coagulación intravascular (DIC) y/o sepsis así como también para la prevención de la formación de micro-coágulos asociados con terapia de ventilación. La composición farmacéutica que comprende el conjugado de HAS-AT III de la invención puede usarse por lo tanto para estos propósitos . De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un HAS-, preferiblemente a un conjugado de HES-proteína tal como se describió anteriormente o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína, obtenible por método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es AlAT, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de .enfisema, fibrosis quística, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar obstructiva cróica (COPD) y/o bronquitis . La composición farmacéutica de la invención que comprende el conjugado HAS-A1AT- de la invención puede usarse también para estos propósitos. ' De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere al uso de un HAS-, preferiblemente a un conjugado de HES-proteína tal como el descrito anteriormente, o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína obtenible por un método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es tPA, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infartos de miocardio (ataques cardíacos), trombosis, tromboembolismo o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas . De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un HAS- , preferiblemente un conjugado de HES-proteína tal como el descrito anteriormente o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína obtenible por un método tal como el descrito anteriormente, donde la proteína es APC, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis severa, trombosis, gromboembolismo o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas . De acuerdo con otro aspecto, la presente invención se refiere también al uso de un HAS-, preferiblemente a un conjugado de HES-proteína tal como el descrito anteriormente o un HAS-, preferiblemente un conjugado de HES-proteína obtenible por método tal como el descrito anteriormente donde la proteína es IFN alfa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia, por ejemplo tricoleucemia, leucemia mielógena crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica. De acuerdo con otro aspecto la presente invención, se refiere también al uso de un HAS-, preferiblemente a un conjugado de HES-proteína tal como el descrito anteriormente o un HAS-, preferiblemente a un conjugado de HES-proteína obtenible por método tal como el descrito anteriormente donde la proteína es IFN beta, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente formas recurrentes de esclerosis múltiple. La presente invención se refiere también al uso de un conjugado de HAS-Factor VII para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para el Factor VIII o Factor IX. La presente invención se refiere también al uso de un conjugado de HAS-Factor IX para la preparación de un medicamento para el control y prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (por ejemplo deficiencia IX del factor congénito o la enfermedad de Christmas) , que incluye control y prevención del sangrado en casos quirúrgicos . La invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras, tabla y ejemplos, que de ninguna manera pretenden restringir el alcance de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura la La figura la muestra un análisis SDS del conjugado HES—G-CSF producido de acuerdo con el Ejemplo 2.1 (a), Neupogen®. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF (Neupogen®) con HES tal como se describió en el Ejemplo 2.1 (a). Franja C: Material de partida de G-CSF. Figura lb La Figura lb muestra un análisis SDS del conjugado de HES—G- CSF, producido de acuerdo con el Ejemplo 2.1 (a), Granocyte®. Para lá electrofóresis de gel, se emplearon a XCell Sure Lock Mini Cell _r(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF (Granocyte®) con HES tal como se describió en el Ejemplo 2.1 (a). Franja C: Material de partida de G-CSF.

Figura 2 La Figura 2 muestra un análisis de SDS page del conjugado HES—G-CSF, producido de acuerdo con el Ejemplo 2.1(b), G-CSF que es hGCSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen® . Para la electrofóresis de gel, se emplearon XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B).Se usaron un gel Bis-Tris al -12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular desde la parte superior a la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD Franja B: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HESlO/0,4 en 0,lM en buffer NaOAc a pH 5,0. Franja C: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HES10/0,7 en 0,1M en buffer NaOAc a pH 5,0. Franja D: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HES10/0,4 en 0,1M en buffer NaOAc a pH 5,0.

Franja E: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HESlO/0,7 en 0,1M en buffer NaOAc a pH 5,0. Franja F: Material de partida G-CSF. Figura 3 La Figura 3 muestra un análisis de SDS page de los conjugados HES—G-CSF producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.2, G-CSF conjugado HES—G-CSF, producido de acuerdo con el Ejemplo 2.1(b), que es G-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen®. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv,- urnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular desde la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HESlO/0,7 oxidado en buffer NaOAc 0,1M a pH 5.0. Franja C: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HES50/0,4 oxidado en buffer NaOAc 0,1M a pH 5.0. Franja D: Producto crudo después de la conjugación de G-CSF con HES50/0,7 oxidado en buffer NaOAc 0,1M a pH 5.0. Franja E: Material de partida G-CSF. Figura 4 La figura 4 muestra un análisis SDS de los conjugados de HES—G-CSF, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.3, G-CSF es Neupogen® o Granocyte®. Para la electroforesis de gel, emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort EÍ43 (CONSORTnv, Turnho t, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al -12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular desde parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo (i-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja C: Producto crudo (ii-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja D: Producto crudo (iii-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3.

Franja E: Producto crudo (iv-N) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja F: Producto crudo (i-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja G: Producto crudo (ii-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja H: Producto crudo (iii-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja I: Producto crudo (iv-G) de acuerdo con el Ejemplo 2.3. Franja J: Neupogen®. Figura 5 La Figura 5 muestra el análisis de SDS page de los conjugados HES—G-CSF, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.4, G-CSF que es hG-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen®. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular de la parte superior hasta la parte inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo (vi) de acuerdo con el Ej emplo 2.4. Franja C: Producto crudo (v) de acuerdo con el Ej emplo 2.4. Franja D: Material de partida G-CSF. Franja E: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular desde la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 -' kD, 3 kD. Franja F: Producto crudo (ix) de acuerdo con el Ejemplo 2.4. Franja G: Producto crudo (viii) de acuerdo con el Ejemplo 2.4. Franja H: Producto crudo (vii) de acuerdo con el Ejemplo 2.4. Franja I: Material de partida G-CSF. Figura 6 La Figura 6 muestra un análisis de SDS page en el conjugado HES—G-CSF, producido de acuerdo con el Ejemplo 2.5, G-CSF que es hG-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen®. Para la electrofóresis de gel se emplearon XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 10% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular de la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Producto crudo de acuerdo con el Ejemplo 2.5. Franja C: Material de Partida G-CSF. Figura 7 La Figura 7 muestra un análisis SDS page de los conjugados de HES—Proteína, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.6. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras con un volumen superior a 15 µl se concentraron al vacío a este volumen. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular de la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 klD. Franja B: Conjugación de IL-2 con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja C: Conjugación de IL-2 con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja D: Control: IL-2, tratado con borohidruro de sodio sin aldehido -HES . Franja E: Conjugación de IFN-alfa con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja F: Conjugación de IFN-alpha con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja G: Control: IFN-alfa, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES . Figura 8 La Figura 8 muestra un análisis de SDS page de los conjugados de HES—Proteína, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.6. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y el suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un MOPS SDS funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras con un volumen superior a 15 µL se concentraron al vacío a este volumen. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular de la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Conjugación de IL-3 con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja C: Conjugación de IL-3 con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja D: Control: IL-3, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Franja E: Conjugación de Mioglobina con aldehído-HES sintetizado tal como se- describió en el Ejemplo 1.9. Franja F: Conjugación de Myoglobin with aldehydo-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja G: Control: Mioglobina, tratada con borohidruro de sodio sin aldehído-HES . Figura 9 La Figura 9 muestra un análisis SDS page de los conjugados de HES—Proteína, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.6. Para la electrofóresis gel se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y el suministro de energía Consort El43 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel de Tris-Acetato a 3-8% conjuntamente con un Tris-Acetato SDS con un buffer funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) . Marcador de peso molecular desde la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Conjugación de BSA con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja C: Conjugación de BSA con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja D: Control: BSA, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Figura 10 La Figura 10 muestra un análisis SDS page de los conjugados de HES—Proteína, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.6. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un buffer funcionando MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras con un volumen superior a 15 µL se concentraron al vacío a este volumen. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular de la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Conjugación de SOD con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja C: Conjugación de SOD con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja D: Control: SOD, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. " Franja E: Control: EPO, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Franja F: Conjugación de EPO con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja G: Conjugación de EPO con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja H: Conjugación de IFN-beta con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja I: Conjugación de IFN-beta con aldeh?do-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja J: Control: IFN-beta, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Figura 11 La Figura 11 muestra un análisis SDS page de los conjugados de HES—Proteína, producidos de acuerdo con el Ejemplo 2.6. Para la electrofóresis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usó un gel de Tris-acetato al 3-8% conjuntamente con un Tris-Acetato SDS de buffer funcionando bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de proteína SeeBlue®Plus2 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular de la parte superior a la inferior: 188 kD, 98 kD, 62 kD, 49 kD, 38 kD, 28 kD, 17 kD, 14 kD, 6 kD, 3 kD. Franja B: Conjugación de AT III con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.9. Franja C: Conjugación de AT III con aldehído-HES sintetizado tal como se describió en el Ejemplo 1.10. Franja D: Control: AT III, tratado con borohidruro de sodio sin aldehído-HES. Figura 12 La Figura 12 muestra los resultados in vitro del Ejemplo 4. En el diagrama, el eje x muestra la concentración en pg/ml, el eje y se refiere a la cantidad de células / 100,000. En el diagrama, las abreviaturas siguientes se refieren a G-CSF/A32 El conjugado G-CSF se preparó de acuerdo con el Ejemplo 2.5 G-CSF/A33 El material de partido G-CSF, se usó para el conjugado del Ejemplo 2.5 G-CSF/A57 Neulasta® no modificado G-CSF/A58 Neupogen® no modificado Figura 13 SDS-PAGE : Flujo y eluato de G-CSF modificado con HES- de acuerdo con el Ejemplo 2.5 después de cromatografía (ver Ejemplo 3 ) sobre DEAE-Sepharose CL-6B ; 1.5% de las fracciones indicadas fueron desalificadas- por ultrafiltración, secada en un SpeedVac y se aplicaron sobre ~ un gel de poliacrilamida al 12.5%. Figura 14: Espectro de MALDI/TOF de G-CSF (ver Ejemplo 3) Figura 15: Espectro MALDI/TOF de G-CSF modificado con HES (ver Ejemplo 3) Figura 16: La Figura 16 muestra los resultados del ejemplo 5 (análisis de los conjugados crudos alAT-HES preparados tal como se ha descrito en el ejemplo 5.5 por electroforesis de gel) . Para la electroforesis de gel, se emplearon XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Power Pac 200 (Bio-Rad, Munich, D) . Se usó gel de Tris-acetato 3-8 %, conjuntamente con un buffer de corrida SDS de Tris-Acetato, bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de Proteína SDS Page no teñido 6,5- 200Kda (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) Marcador de peso molecular de la parte superior' a la inferior: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21 KD, 14,3 KD, 6,5 KD; Franja B: Conjugación a aldehído-HES"~ tal como se describió en el ejemplo 5.5; Franja C: Conjugación a HES tal como se describió en el ejemplo 5.6; Figura 17: La Figura 17 muestra los resultados del ejemplo 5 (análisis de las fracciones B1-C6 recogidas después de Cromatografía de Intercamio Iónico (ver ejemplo 5.7) Para las condiciones para la electrofóresis de gel ver la figura 16. Franja A: Marcador de Proteína SDS Page no teñido 6,5-200KDa (SERVA Elektrophoresis GmbH, Heidelberg, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la inferior: 200 KD, 116 KD, 67 KD, 45 KD, 29 KD, 21KD, 14,3 KD, 6,5 KD; Franja B: Fracción Bl Franja C: Fracción C 1 Franja D: Fracción C2 Franja E: Fracción C3 Franja F: Fracción C4 Franja G: Fracción C5 Franja H: Fracción C6 Franja I: AIAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lote No. - 080604A) Figura 18: La figura 18 muestra el gráfico de actividad enzimática residual vs .- concentración de Prolastin® HS (Bayer vital GmbH, Leverkusen, Germany, Lot No. PR4HA43 ) , AlAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lote No. 080604A) y un conjugado HES-A1AT sintetizado tal como se describió en el ejemplo 5.5. Figura 19 La figura 19 muestra la electroforesis de gel de las mezclas de reacción del ejemplo 6.2(b). Para la electroforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel 12% Bis-Tris conjuntametne con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambas de Invítrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con Roti-Blue (Cari Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante Franja A: Marcador de Proteína Roti-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior a la inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD Franja B: Producto crudo después de conjugación de hG-CSF con el derivado HES preparado en el ejemplo 6.1(d) Franja C: Producto crudo después de conjugación de hG-CSF con el derivado HES preparado en el ejemplo 6.1 (b) Franja D: Producto crudo después de conjugación de hG-CSF con el derivado HES preparado en el ejemplo 6.1(j) Franja E: Control de reacción: HES 50/0,7 (Mw 47.000, DS = 0,76 Figura 20 La figura 20 muestra la electroforesis de las mezclas de reacción del ejemplo 6.2 (d). Para la electroforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usó un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con Roti-Blue (Cari Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Marcador de Proteína Roti-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co.KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, '43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD. Franja B: hG-CSF después de intercambio de buffer tal como se describió en el Ejemplo 6.2(c). Franja C: Producto crudo después de conjugación de hG-CSF con el derivado HES preparado tal como se describió en el Ejemplo 6.1(f). Franja D: Producto crudo después de conjugación de hG-CSF con el derivado HES preparado tal como se describió en el Ejemplo 6.1(h). Figura 21 La Figura 21 muestra los resultados del ensayo de mitogenicidad del ejemplo 6.3. El eje Y indica la cantidad de Células NFS-60/ml y el eje X la concentración en pg/ml. Figura 22 La Figura 22 muestra los resultados del ensayo in vivo del ej emplo 6.4. Figura 23 La Figura 23 muestra el análisis de los conjugados EPO-HES crudo del ejemplo 7 por electroforesis de gel.

Para la electroforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B. Se usaron un un gel Bis-Tris 10 % conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja A: Roti®-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14.3 KD; Franja B: Conjugación de EPO a aldehído-HES tal como se describió en el ejemplo 7.3; Franja C: Reacción de EPO y aldehído-HES sin cianoborohidruro de sodio (Control de Reacción A) tal como se describió en el ejemplo 7.4; Franja D: Reacción de EPO y cianoborohidruro de sodio sin aldehído-HES (Control de Reacción B) tal como se describió en el ejemplo 7.5. Como resultará evidente en la Figura 23, no se observó ninguna reacción para los controles de reacción A y B, ya sea sin aldehído-HSD o sin cianoborohidruro de sodio. Figura 24 La Figura 24 muestra el análisis de los conjugados IFN-alfa-HES del ejemplo 8.3.1 mediante electroforesis de gel.

Para la electroforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 10% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja X: Roti®-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Franja A: Conjugación a aldehídoHES 10/0,4 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada A; Franja B: Conjugación a aldehídoHES 10/0,7 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada B; Franja C: Conjugación a aldehídoHES 30/0,4 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada C; Franja D: Conjugación a aldehídoHES 30/0,7 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada D Franja E: Conjugación a aldehídoHES 50/0,4 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada E Franja F: Conjugación a aldehídoHES 50/0,7 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada F; Franja G: Reacción de control, sin aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada G; Franja I: Reacción de control, sin aldehido HES y sin NaCNBH3 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada I; Franja J: Control de reacción, con HES10/04 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada J; Franja K: Control de reacción, con HES10/04 pero sin NaCNBH3 tal como se describió en el ej . 8.3.1, entrada K; Figura 25 La figura 25 muestra el análisis de los conjugados de IFN-alfa-HES del ejemplo 8.3.2 mediante electroforesis. de gel . Para la electoforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un Gel Bis-Tris al 10% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambas de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Franja X: Roti®-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Franja A: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada A; Franja B: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada B; Franja C: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada C; Franja D: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada D Franja E: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada E; Franja F: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada F Franja G: Control de reacción, con HES tal como se describió en el ej . 8.3.2, entrada G De acuerdo a lo evidenciado en la Figura 25, no se observó ninguna reacción para el control de reacción G Figura 26 La figura 26 muestra el análisis de los conjugados de iFN-alfa-HES del ejemplo 8.3.3 mediante electroforesis. de gel. Para la electoforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un Gel Bis-Tris al 10% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Análisis de los conjugados IFNa-HES mediante electroforesis de gel Franja A:Roti®-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 66 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Franja B: Conjugación de IFNa a AldehídoHES tal como se describió en 8.3.3.1; Franja C: Conjugación de IFNa a AldehídoHES tal como -se. describió en 8.3.3.2; Franja D: Conjugación de IFNa a HESlO/0,4 sodio (Control*-de Reacción) tal como" * se describió en 8.3.3.3; Figura 27 La Figura 27 muestra el análisis de los conjugados IFN- -alfa-HES del ejemplo 8.3.4 por electroforesis de gel Para la electoforesis de gel, se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un Gel Bis-Tris al 10% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambos de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Franja X: Roti®-Mark STANDARD (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) Marcador de peso molecular desde la parte superior hasta la parte inferior: 200 KD, 119 KD, 88 KD, 43 KD, 29 KD, 20 KD, 14,3 KD; Franja A: Conjugación a aldehídoHES tal como se describió en el ej . 8.3.4; Franja B: Control de reacción; conjugación a HES (MW = 7,6 kD, DS = 0,41) tal como se describió en el ejemplo 8.3.4. - De acuerdo a lo evidenciado en la Figura 27, no se observó ninguna reacción para el control de reacción B. Figura 28 La figura 28 muestra la actividad proliferativa del Intron A, en comparación con NIH standard rhIFN-alfa 2a de acuerdo con el ejemplo 9.1. Figura 29 La figura 29 muestra la actividad relativa in vi tro de IFN-alfa-HES de incubación simulada, en comparación con el material de partida IFN-alfa no modificado de acuerdo con el ejemplo 9.2. Figura 30 La figura 30 muestra la actividad relativa in vitro de los conjugados IFN-alfa-HES en comparación con el material de partida IFN-alfa no modificado, Intron A y Pegasys, respectivamente, de acuerdo con el ejemplo 9.3. Figura 31 La figura 31 muestra la actividad relativa in vi tro del conjugado IFN-alfa-HES en comparación con el Intron A de acuerdo con el ej emplo 9.4.

Figura 32 La figura 32 muestra la dilución de las muestras de suero requeridas para lograr una protección del 50% de células MDBK contra infección viral vs . tiempo post inyección i.v. de 30 µg/kg en ratones . El suero de ratones tratados con material de partida no modificado tiene un efecto antiviral muy bajo. La modificación de IFN-alfa con HES prolonga el efecto antiviral del suero, en forma substancial. La vida media aumenta con el peso molecular de HES usado para la modificación de IFN-alfa (ver ejemplo 10) . Figura 33 La figura 33 muestra los datos del PK-Study en conejos, de acuerdo con el ejemplo 11. IFN-alfa-HES muestra una clara prolongación de la vida media, en comparación con el material de partida IFN-alf . Para > 24 h (aprox. < 1000 pCi/ l) la curva de material no modificado, se nivela y casi no puede observarse disminución de la actividad. Figura 34 La figura 34 muestra el PK-Study en conejos de acuerdo con el ejemplo 11. Los datos se evaluaron en el periodo comprendido entre 4 y 24 horas. ElIFN-alfa-HES muestra un clara prolongación de la vida media, en comparación con el material de partida IFN-alfa no modificado. Figuras 35a-35b Las figuras 35a-35b muestran la evaluación estadística del PK-Study (se muestra: un período de hasta 12 h) de acuerdo con el ejemlo 11. En el caso de material de partida no modificado (ver Figura 35a) , la concentración bajó hasta casi cero durante las primeras dos horas, mientras que IFN-alfa-HES muestra una vida media claramente prolongada (Figura 35 b) . Figura 36 La Figura 36 muestra los resultados del ejemplo 6.5 (comparación de la determinación de vida media de un conjugado HES-G-CSF de acuerdo con la invención Neulasta® y Neupogen®) . Figura 37 La figura 37 muestra los resultados del ejemplo 10.3 en un gráfico (actividad antiviral de los conjugados IFN-alfa-HES) Figura 38 La figura 38 muestra los resultados del ejemplo 9.5 en un gráfico (actividad antiviral de los conjugados IFN-alfa-HES) . Ejemplos Ejemplo 1: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado Ejemplo 1.1(a): Síntesis con oxidación de periodato de almidón de hidroxietilo selectivamente oxidado en su extremo reductor y con incubación a 0°C 100 mg de Oxo-HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, preparado por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con DE 196 28 705 Al) se disolvieron en 5 ml de buffer de fosfato de sodio 20 mM, a pH 7,2 y se enfriaron a 0°C. Se disolvieron 21,4 mg de periodato de sodio (Fluka, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 5 ml del mismo buffer y se enfriaron a 0°C. Ambas soluciones se mezclaron y después de incubación durante 10 minutos a 0°C, se agregaron 0,73 ml de gliceron y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 minutos. La mezcla de reacción se dializó durante 24 horas contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El peso molecular del HESl0/0,4, medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,41. ?jemplo 1.1(b) Síntesis con oxidación de periodato de almidón de hidroxietilo oxidado selectivamente en su extremo reductor e incubación a 21 °C 100 mg de Oxo-HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, preparado por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con DE 196 28 705 Al) se disolvieron en 5 ml de buffer de fosfato de sodio 20 mM, a pH 7,2. Se disolvieron 21,4 mg de periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml del mismo buffer. Ambas soluciones se mezclaron y después de incubación durante 10 minutos a 21°C, se agregaron 0,73 ml de gliceron y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 minutos. La mezcla de reacción de dializó durante 24 horas 24 h contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El peso molecular del HESlO/0,4, medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kp. y el DS fué de 0,41. Ejemplo 1.2 (a): Síntesis de almidón de hidroxietilo aldehido funcionalizado por oxidación de periodato de almidón de hidroxietilo con extremo reductor no oxidado e incubación a 0 °C - Se disolvieron 100 mg de HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D)' en 5 ml de buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.2 y se enfriaron a 0 °C. Se disolvieron 21,4.. mg de periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml del mismo buffer y se enfriaron a 0°C. Ambas soluciones se mezclaron y después de incubación durante 10 minutos a 0aC, se agregaron 0,73 ml de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 minutos. La mezcla de reacción se dializó durante 24 horas contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3 , 5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0,4, medido con LALLS-GPC fué de 8,5 kD y el DS fué de 0,41.

Ejemplo 1.2(b): Síntesis de almidón de hidroxietilo aldehido funcionalizado con oxidación de periodato de almidón de hidroxietilo con extremo reductor no oxidado e incubación a 21°C 100 mg de HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, preparado por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se disolvieron en 5 ml de buffer de fosfato de sodio 20 mM, a pH - 7,2. Se disolvieron 21,4 mg de periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 ml del mismo buffer. Ambas soluciones se mezclaron y después de incubación durante 10 minutos a 21°C, se agregaron 0,73 ml de gliceron y la mezcla de. reacción se incubó a 21°C durante 10 minutos. La mezcla de reacción se dializó durante 24 horas contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El peso molecular del HES10/0,4, medido con LALLS-GPC fué de 8,5 kD y el DS fué de 0,41. Ejemplo 1.3: Síntesis de almidón de hidroxietilo aldehido funcionalizado a partir de almidón hidroxietilo amino funcionalizado y ácido formilbenzoico Oxo-HESlO/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4) se preparó mediante Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES10/0,4, medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,41.

Se disolvieron 5,lg (0,51 mmol) de oxo-HES10/0.4 e nl5 ml de sulfóxido de dimetil anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron por goteo bajo nitrógeno a una solución de 5,1 ml (51 mmoles) 1,4- diaminobutano en 10 ml sulfóxido de dimetil anhidro y se agitó a 40°C durante 19 horas. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 ml de etanol_y 20 ml de acetona y si re-disolvió en 80 ml de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y subsiguientemente se liofilizó. El rendimiento fue de 67% (3,4 g) de a ino-HES10/0.4. Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 10 ml de N,N-dimetilformamida (Calidad de síntesis de Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 204 µl de N,N'-diisopropilcarbodiimida. Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregó 1 g del amino-HES10/0.4. Después de agitar durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 84 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo, de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en 50 m de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) ys e liofilizó. Ejemplo 1.4: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado a partir de almidón de hidroxietilo y ácido formilbenzoicQ Se preparó Oxo-HESl0/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7) a partir de Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES /0,7 medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,76. Se disolvieron 83 mg de ácido 4-formilbenzoico y 180 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 5 mL de N,N-dimetilformamida (DMF, calidad de síntesis de Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 78 µl de N,N' -diisopropilcarbodiimida.

Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 0,5 g de oxo-HES10/0.7. Después de agitar durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 37,5 ml de una mezcla de 1 : Ide acetona y etanol enfriada con hielo (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se re-disolvió una mezcla de 2,5 ml de agua y 2,5 ml de DMF y precipitó nuevamente tal como se describió anteriormente. El producto de reacción se recogió por centrifugación tal como se describió, se re-disolvió 10 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3;5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.5: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado a partir de almidón de hidroxietilo y ácido formilbenzoico Se preparó HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0,7) mediante Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D. El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el-DS fué de 0,76 Se disolvieron 50 mg de ácido 4-formilbenzoico y 108 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 3 ml de N,N-dimetilformamida (calidad de síntesis de Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 47 µl de N,N' -diisopropilcarbodiimida. Después de incubación a 21aC durante 30 minutos, se agregaron 0,3 de HES10/0.7. Después de agitar durante 19 horas a 22?C, la mezcla de reacción se agregó a 23 ml de una mezcla de acetona y etanol de 1:1 enfriada con hielo (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4SC, se re-disolvió en una mezcla de 1,5 ml de agua y 1,5 ml de DMF y precipitó nuevamente tal como se describió anteriormente. El producto de reacción se recogió por centrifugación tal como se describió en 10 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó.

Ejemplo 1.6: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado a partir de almidón de hidroxietilo amino funcionalizado y éster pentafluorfenílico de ácido formilbenzoico Se preparó Oxo-HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7) a partir - de Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES 10/0,7 medido .con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,76 Se disolvieron 6..0 g (0.6 mmol) de oxo-HESlO/0.7 en 20 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron por goteo bajo nitrógeno a una solución de 6 ml (60 mmoles) de 1,4- diaminobutano en 11 ml de -sulfóxido de dimetil anhidro y se agitaron a 40°C durante 19 horas. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se re- disolvió en 80 ml de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y subsiguientemente se liofilizó. El rendimiento fue de 52 % (3,15 g) amino-HESlO/0.7. Se sintetizó éster pentafluorfenílico de ácido 4- formilbenzoico tal como se describió en J. S. Lindsey at al., Tetrahedron 50 (1994) pp. 8941-68, especialmente p. 8956. Se disolvieron 50 mg de amino-HESlO/0.7 en 0,5 ml de N,N- dimetilformamida (calidad de síntesis del Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron y 15,3 mg de éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico. Después de agitar durante 22 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 3,5 ml de 2-propanol enfriado con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se lavó con 4 ml de 2-propanol enfriado con hielo, se re-disolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis ""SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.7: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado, a partir de almidón de hidroxietilo y éster pentafluorfenílico de ácido formilbenzoico Se preparó Oxo-HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7) a partir de Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,76 Se sintetizó éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico tal como se describió en J. S. Lindsey at al., Tetrahedron 50' (1994) pp. 8941-68, especialmente página 8956. Se disolvieron 200 mg de oxo-HESl0/0.7 en 2 ml de N,N-dimetilformamida (calidad de síntesis del Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 61,2 mg de éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico. Después de agitar durante 22 horas a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 15 L de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol enfriada con hielo (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en una mezcla de 1.4 ml de agua y 0,7 ml de DMF y precipitó nuevamente tal como se describió anteriormente. El producto de reacción se recogió por centrifugación tal como se describió, se re-disolvió en 10 ml de agua, se dializó durante 2 horas- contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.8: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado, a partir de almidón de hidroxietilo amino funcionalizado y ácido 4- (4-formil-3,5-dimetoxifenoxi)butírico Se preparó Oxo-HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4) mediante Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES 10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,41 Se disolvieron 5,1 g (0,51 mmoles) de oxo-HESl0/0.4 en 15 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron por goteo bajo nitrógeno a una solución de 5,1 ml (51 mmoles) de 1,4-diaminobutano en 10 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro y se agitaron a 40fiC durante 19 horas. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se re- disolvió en 80 ml de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y subsiguientemente se liofilizó. El rendimiento fue de 67 % (3,4 g) de amino-HES10/0.4. 80,5 mg de ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi) butírico (Calbiochem-Novabiochem, Láufelfingen, CH) y 61 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 3 ml de N,N-dimetilformamida (calidad de síntesis de Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 45.4 µl de N,N'-diisopropilcarbo iimida. Después de incubación a 21aC durante 30 minutos, se agregaron 0,3 g de amino-HESlO/0.4. Después de agitar durante 22 horas a 22aC, la mezcla de reacción se agregó a 23 ml de una mezcla 1:1 de acetona y etanol enfriada con hielo (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en una mezcla de 2 ml de agua y 1 ml de DMF, y precipitó nuevamente tal como se describió anteriormente. El producto de reacción se recogió por centrifugación tal como se ha descrito, se disolvió nuevamente en 10 ml de agua, se dializó durante 1 día contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.9: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado, a partir de almidón de hidroxietilo amino funcionalizado y ácido 4-formilbenzoico Oxo-HESlO/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4) se preparó por Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de. acuerdo con DE 196 28 705 Al.' " - - " El peso molecular del HES 10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,41. Se disolvieron 5,1 g (0.51 mmoles) de oxo-HESl0/0.4 en 15 ml de sulfóxido de dimetilo anhidro (DMSO, Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) ) y se agregaron por goteo bajo nitrógeno a una solución de 5,1 ml (51 mmoles) de 1,4-diaminobutano en 10 ml de sulfóxido de dimetil anhidro y se agitaron a 40°C durante 19 horas. La mezcla de reacción se agregó a una mezcla de 80 ml de etanol y 80 ml de acetona. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se lavó con una mezcla de 20 ml de etanol y 20 ml de acetona y se re-disolvieron en 80 ml de agua. La solución se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn, D) y subsiguientemente se liofilizó. El rendimiento fue de 67% (3,4 g) de amino-HESlO/0.4. Se disolvieron 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) , en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad de síntesis de péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 204 µl de N,N'-diisopropilcarbodiimida. Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregó 1 g del amino-HESlO/0.4. Después de agitar durante 19 horas a 22aC, la mezcla de reacción se agregó a 84 ml de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a aC, se re- disolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 días contra a agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 1.10: Síntesis de almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado mediante oxidación de periodato de almidón de hidroxietilo selectivamente oxidado en su extremo reductor Se preparó Oxo-HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4) mediante Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con la DE 196 28 705 Al. El peso molecular del HES10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,41. Se disolvieron 300 mg de oxo-HESl0/0.4 en 15 ml de buffer de fosfato de sodio 20 mM, a pH 7 , 2. Se disolvieron 64,2 mg de periodato de sodio (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) en 15 ml del mismo buffer. Ambas soluciones se mezclaron y después de incubación durante 30 minutos a 21°C, se agregaron 2 ml de glicerol y la mezcla de reacción se incubó a 21°C durante 10 minutos. La mezcla de reacción se dializó durante 24 horas contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, de corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. Ejemplo 2: Síntesis de conjugados de G-CSF por afinación reductora El G-CSF es un G-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto comercialmente obtenible Neupogen® (Amgen, München, D) . Ejemplo 2.1(a): Síntesis de conjugados de G-CSF por aminación reductora con almidón de hidroxietilo con extremo reductor no oxidado a pH = 7,4 (Ejemplo Comparativo) En el Ejemplo 2.1, se trató de usar el método de síntesis de WO 03/074087 (ejemplo 12, páginas 22 - 23) para la producción del conjugado HES-G-CSF. A 3,33 µl de una solución acuosa de G-CSF (Neupogen® de Amgen, München, D, o Granocyte® de Aventis Pharma AG, Zürich, CH, respectivamente, se agregaron 3 mg/ml) en buffer de fosfato de sodio 0,1 M con un pH 7,4, se agregaron 3.33 µl de una solución del HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, 79 mg/ml) en el mismo buffer. A esta mezcla se le agregaron 3,33 µl de una solución 60 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer y la mezcla resultante se incubó durante 4 horas a 22aC. Subsiguientemente, se agregaron 3,33 µl de la solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio recientemente preparada. Durante el tiempo de incubación de 30 horas, Ya se habían agregado 5 porciones de 3,33 µl de la solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM recientemente preparada. La mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel. No se observó ninguna reacción. Ejemplo 2.1(b): Síntesis de conjugados de G-CSF por aminación reductora con almidón de hidroxietilo con extremo reductor no oxidado a pH = 5,0 a 9,2 (Ejemplo Comparativo) A 3,33 µL de una solución acuosa de G-CSF (3 mg/mL) en un buffer determinado, se agregaron 3,33 µl de solución de HES (300 mg/ml) en un mismo buffer. La mezcla se enfrió a 4°C, y se agregaron 3.33 µl de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer a 4aC, y la mezcla resultante se incubó durante 20 horas a 4°C. Se emplearon las siguientes preparaciones de HES y buffer : . a) Buffer: buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0 HES10/0.4 (MW = 10 kD, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) El peso molecular del HES 10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 8,5 kD y el DS fué de 0,41. - HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) El peso molecular del HESlO/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,76 HES50/0.4 (MW = 50 kD, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) El peso molecular del HES10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 57 kD y el DS fué de 0,41 HES50/0.7 (MW = 50 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . El peso molecular del HES50/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 47 kD y el DS fué de 0,76 b) Buffer: buffer de fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,2 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,76. c) Buffer: buffer de borato de sodio 0,1 M a pH 8,3 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . . El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,76. d) Buffer: buffer de borato de potasio de 0,2 M a pH 9,2 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) Cada mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel. No se observó ninguna conjugación a una conjugación insignificante (no se muestran los escaneados de gel para las reacciones b) a d) ) . Ejemplo 2.2: Síntesis de conjugados G-CSF por aminación reductora con almidón de hidroxietilo con extremo reductor oxidado a pH = 5,0 a 9,2 (Ejemplo Comparativo) A 3,3-3 µL de una solución acuosa de G-CSF (3 mg/ml) en un buffer determinado, se agregaron 3,33 µl de una solución de oxo-HES (300 mg/ml) en el mismo buffer. La mezcla se enfrió a 4aC, y se agregaron 3,33 µl de una solución 60 mM de cianoborohidruro de sodio en e mismo buffer a 4aC, y la mezcla se incubó durante 17 horas a 4°C. Se emplearon las siguientes preparaciones de HES y buffer: a) Buffer: buffer de acetato de sodio de 0,1 M a pH 5,0 oxo-HESlO/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . . El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 14,5 kD y el DS fué de 0,76. - oxo-HES50/0.4 (MW = 50 kD, DS = 0.4, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . . El peso molecular del HES 10/0,4 medido con LALLS-GPC fué de 42 kD y el DS fué de 0,41. oxo-HES50/0.7 (MW = 50 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . . El peso molecular del HES50/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 57 kD y el DS fué de 0,76. b) Buffer: buffer de fosfato de sodio de 0,1 M a pH 7,2 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . . El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10, 5 kD y el DS fué de 0,76. c) Buffer: buffer de borato de sodio de 0,1 M a pH 8,3 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids -GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . El peso molecular del HES 10/0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,76. d) Buffer: buffer de borato de potasio de 0,2 M a pH 9,2 HES10/0.7 (MW = 10 kD, DS = 0.7, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) . El peso molecular del HES /0,7 medido con LALLS-GPC fué de 10,5 kD y el DS fué de 0,76. Cada mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel. No se observó ninguna conjugación o bien una conjugación insignificante (no se muestran los escaneados de gel para las reacciones b) a d) ) . La oxidación de HES10/0.4 (MW = 8,4 kD, DS = 0.4-1 se llevó a cabo con Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D; de acuerdo con DE 196 28 705 Al.

Ejemplo 2.3: Síntesis de conjugados de G-CSF por aminación reductora con almidón de hidroxietilo aldehido funcionalizado sintetizado por oxidación de periodato A 3,33 µl de una solución acuosa de G-CSF (Granocyte® from Aventis Pharma AG, Zürich, - CH, and Neupogen® from Amgen, München, D, se agregaron respectivamente, 3 mg/mL) en buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0, 3,33 µl de una solución de un aldehído-HES (79 mg/mL) .en el mismo buffer. A la mezcla se agregaron 3,33 µL de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer y la mezcla se incubó durante 25 horas a 21aC. La mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel . Se emplearon los siguientes conjugados HES aldehido funcionalizados : (i-N) preparado con Neupogen® de acuerdo con el Ejemplo 1.1 (a) anterior; (ii-N) preparado con Neupogen® de acuerdo con el Ejemplo 1.1 (b) anterior; (iii-N) preparado con Neupogen® de acuerdo con el Ejemplo 1.2 (a) anterior; (iv-N) preparado con Neupogen® de acuerdo con el Ejemplo 1.2 (b) anterior; (i-G) preparado con Granocyte® de acuerdo con el E emplo 1.1 (a) anterior; (ii-G) preparado con Granocyte® de acuerdo con el Ejemplo 1.1 (b) anterior; (iii-G) preparado con Granocyte® de acuerdo con el Ejemplo 1.2 (a) anterior; (iv-G) preparado con Granocyte® de acuerdo con el Ejemplo 1.2 (b) anterior. Ejemplo 2.4: Síntesis de conjugados de G-CSF por aminación reductora con almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado sintetizado por conjugación de almidón de hidroxietilo con un ácido formil carboxílico A 3,33 µl de una solución acuosa de G-CSF ( 3 mg/ml) en buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0, se agregaron 3,33 µl de una solución de un aldehído-HES (118,5 mg/mL) en el mismo buffer y se enfrió a 4aC. A la mezcla se le agregaron 3,33 µl de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio en le mismo buffer a 4°C, y la mezcla se incubó durante 17 horas a 4aC. La mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel . Se emplearon los siguientes conjugados HES aldehidos funcionarizados : (v) preparado de acuerdo con el Ejemplo 1.4 anterior; (vi) preparado de acuerdo con el Ejemplo 1.5 anterior; (vii) preparado de acuerdo con el Ejemplo 1.6 anterior; (viii) preparado de acuerdo con el Ejemplo 1.7 anterior; (ix) preparado de acuerdo con el Ejemplo 1.8 anterior.

Ejepplo 2.5: Síntesis de conjugados de G-CSF- por aminación reductora con almidón de hidroxietilo, aldehido funcionalizado sintetizado por conjugación de hidroxietilo a ácido formil—carbaxílico A 2,5 ml de una solución acuosa de G-CSF (2.27 mg/ml) en buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0, se agregaron 136 mg de aldehído-HESlO/0.4, preparado tal como se describió en el Ejemplo 1.3 anterior, y la solución se enfrió a 0°C. Se agregaron -.a la mezcla 2,5 ml de una solución de 40 mM de cianoborohidruro de sodio enfriado con hielo, en el mismo buffer, y la mezcla se incubó durante 17 horas -a 4aC. La mezcla de reacción se analizó por electrofóresis de gel. Ejemplo 2.6: Síntesis de varios conjugados de proteína para aminación reductora con almidón de hidroxietilo aldehido funcionalizado, sintetizado de acuerdo con los Ejemplos 1.9 y 1.10, respectivamente A w µl (ver Tabla I siguientes) de una solución de la Proteína P (ver Tabla I a continuación) en buffer de acetato de sodio 0.1 M a pH 5,0 (x mg/ml; ver Tabla I a continuación) y µl (ver Tabla I a continuación) de una solución del derivativo de HES (sintetizado tal como se describió en el los Ejemplos 1.9 o 1.10) en el mismo buffer (200 mg/mL) . La mezcla se enfrió a 4°C y se agregaron z µl de una solución de 120 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismos buffer a 4°C y la mezcla se incubó durante 24 horas a 4aC. La mezcla de reacción cruda se analizó por electrofóresis de gel. Se observó una conjugación exitosa para todas las proteínas, de acuerdo a lo indicado por la migración de las bandas de proteína a peso moleculares más elevados (ver Figuras 7 a 11) . El aumento del ancho de la banda se debe a la distribución de peso molecular de los derivados HES y a la cantidad de derivados HES ligados a la proteína. Tabla I: Experimentos llevados a cabo de acuerdo con el Ejemplo 2.6 El IFN beta usado fue un rhIFN beta la producido en células CHO que contenían cadenas secundarias de carbohidrato di- y triantenario y repeticiones de N-acetillactosamina. La EPO usada fue EPO producida recombinantemente que tenía la secuencia de aminoácido de la EPO humana y esencialmente las mismas características que la Erypo® (ORTHO BIOTECH, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche) comercialmente obtenibles, cf. EP 0 148 605, EP 0 205 564, EP 0 411 678. Ejemplo 3: Análisis del conjugado G-CSF obtenido en el Ejemplo 2.5 A. Purificación Se obtuvo G-CSF que era hG-GSF purificado, que tenía esencialmente las mismas características que el producto comercial Neupogen ® y se guardó una alícuota sin modificar como control . 1. Intercambio de buffer de muestra de G-CSF y de conjugado de G-CSF antes de la purificación por cromatografía de intercambio aniónico La muestra de G-CSF HES-modificada o de G-CSF no modificado (como control) (0,5 - 5 mg de proteína) se sometió a intercambio de buffer usando unidades de concentrador de Vivaspin 6 (10.000 MWCO PES, Vivascience, Cat. Nr. VS0602) . Las muestras se concentraron a 0,5-0,7 ml y se diluyeron a 5 ml con buffer de fosfato de Na 10 mM a pH 7,2. Cada muestra se sometió 3 veces a este ciclo de intercambio de concentración/buffer. 2. Cromatografía de intercambio aniónico de las formas G-CSF y HES- odificadas del mismo en una columna de DEAE- Sepharose Las muestras de G-CSF después de modificación HES y, para comparación, muestras de G-CSF no modificado, se purificaron y analizaron por cromatografía de intercambio aniónico a temperatura ambiente mediante el uso de un sistema explorador 10 ÁKTA tal como se describió. Se dializaron alícuotas de G- CSF antes o después de la HESilación mediante ultrafiltración contra dicho buffer A (10 mM Na-fosfato, pH 7,2) o se diluyeron con aproximadamente 13 volúmenes de buffer A. La columna que contenía 2 ml DEAE-Sepharose (DEAE-Sepharose CL- 6B, Pharmacia Kat. Nr. 17-0710-01) se regeneró mediante aplicación de volúmenes de columna 5,0 (CV) de 6,5 M guanidina/HCl , 5,0 CV buffer A, 5,0 CV de buffer C (1,5 M NaCl en 10 mM de fosfato de Na, pH 7,2) y luego 10 CV de buffer A. Las muestras (0,8 - 4,5 ml en 10 mM de buffer de fosfato de Na a pH 7,2) fueron luego inyectadas mediante el uso de un régimen de flujo de 0,6 ml/min. Después de lavado del circuito de reacción de la muestra con 10 ml (2 ml de circuito de la muestra) o 20 ml (5 ml de circuito de la muestra) , de buffer A, dependiendo de la muestra aplicada, la columna se lavó adicionalmente con 0-22 CV de buffer A (régimen de flujo = 0,8 ml/min) . La elución se llevó a cabo aplicando un gradiente lineal de 0-100% de buffer B sobre 5 CV y un ensayo isocrático con 2,5 CV de 100% de buffer B usando un régimen de flujo de 0,6 ml/min. La columna fue re-equilibr da con 5 CV de buffer A y se regeneró en la forma que se detalló anteriormente mediante el régimen de flujo de 1 ml/min. Si es necesario, se concentran muestras usando un concentrador Vivaspin y se efectuó un intercambio de buffer tal como se ha descrito anteriormente. Las muestras se almacenaron a 0-8°C en 10 mM de buffer de acetato de Na a pH 4,0 antes o después de filtración estéril usando una .unidad de filtración de 0,2 µm, Corning, Cat. No. 431215). Se prepararon las muestras siguientes para los bioensayos in vitro y para los .análisis analíticos adicionales. La concentración de proteína se determinó tal como se describió en la sección Bl siguiente: I. 0401-15/A33, 0,44 mg/ml, volumen = 500 µl G-CSF (E. coli) II. 0401-13/A32, 0,28 mg/ml, volumen = 900 µl G-CSF (E. coli) HES-modificado III. 0401-28/A58, 0,60 mg/ml, volumen, = 350 µl Neupogen IV. 0401-28/A57, 0,50 mg/ml, volumen, = 400 µl Neulasta B. Análisis Se analizaron alícuotas de la muestra para determinar su contenido de proteína y para modificaciones . 1. Cuantificación de proteína G-CSF por RP-HPLC El contenido de proteína G-CSF de la muestra usando la preparación de proteína no modificada (concentración: 0,453 mg/ml) como un estándar. Se usó un sistema Dionex HPLC que consistía en una bomba P 680 A HPG, una unidad desgasificadora Degasys DG 1210, un dispositivo de automuestreo e inyector ASI-100, un circuito de la muestra de 250 µl, un departamento TCC 100 de columna con termostato junto con un UV/Vis-Detektor UVD170U equipado con Software Chromeleon Chromatography Management System. Se usaron una precolumna de CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel , Cat. No. 721889, y una columna 40 de separación C-4 Nucleosil MPN, 5 µm, 125 x 4 mm RP-columna (Macherey-Nagel, No. de orden 7200 45.40). El solvente A fue H20 además de 0,06% (v/v) de ácido trifluoracético y el solvente B fue 90% de acetonitrilo en H20, que contenía 0,06% (v/v) de ácido trifluoracético: el régimen de flujo fue: 1 ml/min. La detección de UV fue en una longitud de onda de 214, 221, 260 y a 280 nm. Se indicaron muestras de aproximadamente 10 - 20 µg en una columna de RP-HPLC. Se usó el gradiente siguiente: 0-5 min: 0-10% B - 17 min: 10-45% B 35 min: 45-80% B 36 min: 80-100% B 38 min: 100% B 39 min: 10% B - 45 min: 10% B El área pico resultante en la posición de elución de la preparación de G-CSF convencional se usó y se comparó con el patrón de referencia, por comparación del pico que aparece a alrededor de 29 minutos a una longitud de onda de 280 nm. 2. Reducción + carboxamidometilación de la proteína G- CSF Se redujeron alícuotas de muestras de proteína de G-CSF y se carboxamidometilaron tal como se describió en otra parte (Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) carbohidratos N- y O-ligados y ocupancia del sitio de glicosilación en factor estimulador de colonia de granulocitos-macrófagos humanos recombinantes, secretado por la línea de células de ovario de hámster chino; European J. Biochem, 273(5), 907-919). La carboxamidometilación conduce a residuos cisteína modificados . La digestión endoproteinasa Glu-C de la proteína carboxamidometilada se llevó a cabo en 25 mM de NH4HC03 que contenía 1 M de urea a pH 7,8 y se usó una relación de enzima/substrato de 0,2:10 durante 18 - 24 horas. 3. Separación de péptidos Endo-Glu-C por RP-HPLC Los péptidos generados por digestión de Endo-Glu-C se separaron en un sistema Dionex HPLC que consistía en una bomba P 680 A HPG, una unidad de desgasificación Degasys DG 1210, un dispositivo de automuestreo e inyector ASI-100, y se usó un circuito de la muestra de 250 µl, una columna con termostato department TCC 100 junto con UV/Vis-Detektor UVD170U equipado con un Software Chromeleon Chr-omatography Management System. Se usaron una precolumna CC 8/4 Nucleosil 120-5 C4, Macherey-Nagel, Cat. No. 721889, y una columna de separación 40 C-4 Nucleosil MPN, 5 µm, 125 " 4 mm RP-columna (Macherey-Nagel, orden No. 7200 45,40). El solvente A fue H20 además de 0,06% (v/v) de ácido trifluoracético y el solvente B fue 90% de acetonitrilo en H20, que contenía 0,06% (v/v) de ácido trifluoracético; el régimen de flujo fue: 1 ml/min. Se aplicó el siguiente gradiente: 0 - 5 min: 10% B - 17 min: 45% B - 65 min: 100% B - 67 min: 100% B - 69 min: 10% B - 75 min: 10% B Ladetección UV fue de una longitud de onda de 214, 221, 260 y a 280 nm. Péptidos generados por la digestión Endo-Glu-C fueron separables (no se muestran datos) . 4. Espectrometría de masa de tiempo de vuelo de deserción/ionización láser asistida por matriz (MALDI/TOF/TOF-MS) Se usó espectrometría de masa para detectar el N-término intacto de G^-CSF's en las diferentes muestras preparadas. Las muestras (3 - : 5 µg) resultantes de las digestiones de Endoproteinasa Glu-C de muestras de proteína reducidas de carboxamidometiladas, se usaron directamente para el análisis del espectro de masa (sin la RP-HPLC de la etapa 3) y se purificaron usando puntas de pipeta ZipTip que contenían material de fase inversa C18 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de lavar con 0,1% (v/v) de ácido fórmico, se llevó a cabo la elución de péptidos con 10 µl de 0,1% (v/v) de ácido fórmico en 60% (v/v) de acetonitrilo. Se analizaron fragmentos peptídicos proteolíticos (Endo-Glu-C) con un instrumento de tiempo de vuelo Bruker ULTRAFLEX (TOF/TOF) en el modo de ion lineal positivo usando una matriz de 22,4 mg de ácido 3 , 5-dimetoxi-4-hidroxi-cinnámico en 400 µl de acetonitrilo y 600 µl de ácido trifluoracético al 0,1% (v/v) en H20; se midieron (glico) -péptidos usando una matriz de 19 mg de ácido -ciano-4-hidroxicinnámico en la misma mezcla solvente usando el reflectrón para una resolución mejorada. Se mezclaron soluciones de muestra de 1 µl y concentraciones aproximadas de 1-10 pmol-µl-1 con cantidades iguales de la matriz respectiva. Esta mezcla se salpicó sobre un objetivo de acero inoxidable y se secó a temperatura ambiente antes del análisis . Se registraron los espectros en el rango de masa de 900 - 5000 dalton. La tabla siguiente está correlacionada con las masas esperadas con los respectivos péptidos G-CSF. Tabla II:_ Masas teóricas (monoisotópicas) de péptidos Endo-Glu-C resultantes de G-CSF Los residuos cisteína fueron carboxamidometilados; los péptidos marcados como grasos fueron detectados en el espectro MALDI/TOF del G-CSF no modificado. El péptido Endo-Glu-C N-terminal (MTPLGPASSLPQSFLLKCLE; m/z 2189,1) que comprende la posición 1-20 de la proteína fue detectado en el espectro de muestras de MALDI/TOF-MS después del tratamiento proteolítico del G-CSF con endoproteinasa Glu- C tal como se describió anteriormente. ^ Resultados: I. Purificación de G-CSF y variante modificada con HES El HES-modificado con G-CSF y el G-CSF no modificado se sometieron a purificación usando una columna de DEAE-Sepharose CL-6B tal como se describió bajo A4. En el caso de la muestra 0401-15/A33 no modificada, no se detectó ninguna absorción significativa a 280 nm en el diagrama de flujo y la proteína se eluyó en una concentración de 40-50% de buffer B (0,16-0,20 M NaCl) en un volumen de 6 ml, con un área pico específica de 660 mAU x ml x mg"1 a 280 nm. La muestra (G-CSF modificada con HES) fue eluida en un rango amplio del gradiente en una concentración de buffer B de -80% (0,08-0,32 M NaCl) en un volumen de 12 ml.

Aproximadamente el 90% del área de pico total detectada a 280 nm, se encontró en el diagrama de flujo que contenía aproximadamente 50% de la proteína total con una masa molecular aparentemente ligeramente más elevada cuando se comparó con la proteína eluida, detectada por análisis de SDS- PAGE tal como se muestra en la Figura 13. La recuperación de proteínas se calculó en base al área pico (A280 nm) de las fracciones de elución en comparación con la proteína G-CSF no modificada. Tabla 1: Comparación de las áreas pico a una detección de 280 nm ** la cuantificación de RP-HPLC de la proteína confirmó estos resultados II. Análisis de proteínas por mapeo de péptidos y MALDI/TOF MS después de tratamiento con endoproteinasa Glu-C El péptido N-terminal resultante de la digestión de endoproteinasa Glu-C de ambos, el G-CSF no modificado carboxamidometilado (Figura 14) y el producto del mercado Neupogen (no se muestran datos) , fue claramente detectado por MALDI/TOF-MS (MTPLGPASSLPQSFLLKC*LE, m/z 2189.1; cisteína carboxamidometilada) . _ Esta señal estuvo ausente en las muestras sometidas a modificación con HES (Figura 15) y en Neulasta (no se muestran datos) , lo cual indica la modificación de este péptido. El secuenciamiento N-terminal de G-CSF modificado con HES reveló un N-término bloqueado que sugiere que en realidad el residuo metionina N-terminal de este derivado de proteína se modificó mediante el derivado HAS.

Referencias : Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz (2004) carbohidratos ligados con N- y O- y ocupancia del sitio de glicosilación en factor estimulador de colonias de granulocito-macrófago humano recombinante secretadas por una línea de célula de ovario de hámster chino. Eur. J. Biochem, 271 (5), 907-919. Nimtz, M. , Grabenhorst, E., Conradt, H.S., Sanz, L. & Calvete, J.J. (1999)- Caracterización estructural de las cadenas de oligosacáridos de glicoformas PSP-I y PSP-II de espermadhesina de plasma seminal de verraco cristalizado y natural. Eur. J.

Biochem. 265, 703-718. Nimtz, M. , Martin, W. , Wray, V., Kloppel, K.-D., Agustín, J. & Conradt, H.S. (1993) Estructuras de oligosacáridos sialilados de eritropoyetina humana expresados en células recombinantes de BHK-21. Eur «7. Biochem. 213, 39-56. Nimtz, M., Noli G. , Paques, E. & Conradt, H.S. (1990) Estructuras de carbohidrato de la variante de activador de plasminógeno de tejido humano expresadas en células de ovario de hámster chino recombinante. FEBS Lett . 271, 14-18. Schroter, S., Derr, P. , Conradt, H.S., Nimtz, M. , Hale, G. & Kirchhoff, C. (1999) Modificación específica de macho de CD52 humano. J. Biol . Chem. 274, 29862-29873.

E. Grabenhorst y H.S. Conradt (1999) Las Regiones Citoplásmicas, de Transmembrana y de origen de Glicosiltransferasas especifican su sublocalización funcional in vivo y su estabilidad en el aparato de Golgi . J. Biol. Chem., 274, 36107-36116. E. Grabenhorst, A.Hoffmann, M.Nimtz, G. Zettlmeißl y H. S. Conradt (1995) Construcción de células de BHK-21 estables que coexpresan glicoproteínas secretoras humanas y Galßl-4GlcNAc-R D2,6- sialiltransferasa humana: D2,6-ligada NeuAc está preferiblemente unida a "" la ramificación Galßl-4GlcNAcßl-2Manßl-3- de oligosacáridos biantenarios de la proteína vestigial recombinante secretada. Eur.J.Biochem. , 232, 718-725. Ejemplo 4: Resultados In vitro del conjugado G-CSF obtenido en el Ejemplo 2.5 y purificado de acuerdo con el Ejemplo 3: Mitogenicidad de las variantes de G-CSF para células NFS-60 de ratón El G-CSF es conocido por sus efectos específicos sobre la proliferación, diferenciación y activación de células hematopoyéticas del linaje de granulocitos neutrofílicos. La capacidad mitogénica de las variantes G-CSF se ensayó usando células NFS-60 de ratón (N. Shirafuji et al., Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119) . Las células se cultivaron en un medio RPMI con 10% de suero de ternero fetal (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D) que contenía 5-10% de WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, D; se cultivaron tal como se describió para el medio condicionado DSMZ) como fuente de IL-3 exógena y se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se formaron alícuotas a 100.000 células por receptáculo en una placa de 24 receptáculos . Se permitió que las células sé adaptaran durante 1 hora a 37°C en un medio de RPMI sin medio acondicionado WEHI-3B desde agregar muestra de factores de crecimiento de G-CSF diluidas en el mismo medio. Las__ células NFS-60 se expusieron a variantes de G-CSF codificadas durante 3 días a 37°C, y luego las células se contaron electrónicamente (Casy TT Cell Counter, Schárfe System, Reutlingen, D) . Los resultados se resumen en la Figura 12. Tal como se observa en la Figura 12, la diferencia de las variantes G-CSF (0,5 - 50 pg/ml) permitió estimular un aumento de la cantidad de células después de 3 días en comparación con el medio que no contenía factores de crecimiento agregados . Proteínas de control no modificadas, G-CSF/A33 y G-CSF/A58 estimularon las células hasta un grado muy similar (ED50=5 - 10 pg/ml) mientras que los conjugados de G-CSF, G-CSF/A32 y G-CSF/A57 mostraron únicamente una leve disminución de la actividad, al compararlas con la versión no modificada (ED50= 10 - 25 pg/ml) .

Ejemplo 5 Conjugados AlAT (alAT, alfalaT) sintetizados a través de aminación reductora Ejemplo 5.1 Síntesis de amino-HES (A) a partir de HES oxidado 6,09 g de oxo-HES (MW = 57,000 D, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, preparados de acuerdo con la DE 196 28 705 Al)- se calentaron durante la noche a 80°-C~al vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 32 ml de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D, ) y se agregaron 1,22 ml de 1,4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de agitar a 40°C durante 17 hs la mezcla de reacción se agregó a 150 ml de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 40 ml de una mezcla de acetona y etanol (v/v) de 1:1, enfriada con hielo, y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 ml de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 82 %. Ejemplo 5.2 Síntesis del aldheído-HES (A) a partir del amino-HES (A) del ejemplo 5.1 125 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi- lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 38 ml de N,N- dimetilformamida (calidad de síntesis de péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) , y se agregaron 155 µL N,N'- diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 min., se agregaron 3,8 g de amino-HES (A) (preparado tal como se describió en el ejemplo 5.1). Después de agitar durante 19 hs a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 ml de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se redisolvió en 20 ml de N,N-dimetilformamida y precipitó con 80 de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente en el ejemplo 5.1. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 77 %. Ejemplo 5.3 Síntesis de amino-HES (B) a partir de HES oxidado 10 g de oxo-HES (MW = 57,000 D, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, preparado de acuerdo con la DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 52 ml de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 2 ml de 1, 4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de agitar a 40°C durante 17 hs, la mezcla de reacción se agregó a 350 ml de 2-propanol enfriado con hielo (Cari Roth GmbH + Co.

KG, Karlsruhe, D) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 80 ml de 2-propanol enfriado con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, entubación 3,5 kD, - "" Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilió. El rendimiento del producto aislado fue del 85 %. Ejemplo 5.4 Síntesis de aldheído-HES (B) a partir de amino- HES (B) del ejemplo 5.3 15 153 mg de ácido 4-formilbenzoico y 241 mg de 1-hidroxi- iH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 51 ml de N,N- dimetilformamida (calidad de síntesis del péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 170 µL de N,N'- 20 diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 5,1 g de amino-HES (B) (preparado tal como se describió en el ejemplo 5.3) . Después de agitar durante 16 hs a 22°C, se agregó la mezcla de reacción a 360 ml de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se redisolvió en 50 ml de agua y precipitó con 360 ml de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente en el ejemplo 5.1. Después de centrifugación el pricipitado se disolvió en 50 ml de agua, - se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento de un producto aislado fue de 87%. Ejemplo 5.5 Conjugación del aldheído-HES (A) y (B) a A1AT mediante aminación reductora Una mezcla de 189 mg de aldehído-HES (B) (preparado tal como se describió en el ejemplo 5.4) y 172 mg de aldehído-HES (A) (preparado tal como se describió en el ejemplo 5.2), se disolvieron en 2,88 ml de buffer de reacción (buffer de fosfato de sodio 0,1 M , 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2). A 20°C, se agregó 1,67 ml de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer seguido de 0,455 ml de una solución de AlAT (c (AlAT) = 11.0 mg/ml en 20 mM de buffer de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2, A1AT= rh AlAT proporcionado por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) . La mezcla se incubó a 20°C. Después de 17 horas, se agregaron 6,7 mg de cianoborohidruro de sodio adicional disuelto en 200 µl del buffer de reacción, y la mezcla se incubó durante 24 horas adicionales a la misma temperatura. Se analizaron 10 µL de esta solución después de un tiempo de incubación total de 25 horas mediante electrofóresis de gel (ver Figura 16) . Ejemplo 5.6 Conjugación de HES a AlAT mediante aminación reductora (control de reacción) 362 mg HES (MW = 56,000 D, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se disolvieron en 2,88 ml de buffer de reacción (buffer de fosfato de sodio 0,1 M, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2). A 20°C, se agregaron 1,67 ml de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio en el mismo buffer, seguido de 0,455 ml de una solución AlAT (c (AlAT) = 11,0 mg/ml en 20 mM de buffer de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2, lAT= rh alAT proporcionado por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) . La mezcla se incubó a 20°C. Después de 17 horas se agregaron 6,7 mg adicionales de cianoborohidruro de sodio disueltos en 200 µl del buffer de reacción y la mezcla se incubó durante 24 horas adicionales a la misma temperatura. Se analizaron 10 µL de esta solución después de un tiempo de incubación total de 25 hora por electroforesis de gel (ver Figura 17) . Ejemplo 5.7 Purificación del conjugado HES-AlAT mediante cromatografía de intercambio iónico (IEC) Los conjugados de AlAT se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico en una columna HiTrap Q HP usando un sistema de cromatografía ÁKTA-Explorer (ambos de Amersham Biosciences) . La purificación se efectuó de acuerdo con la aislación de AlAT a partir de plasma humano tal como se describió en "Chen, Hammond, Lang and Lebing, Purification of aiProteinase Inhibitor from Human Plasma Fraction IV-1 by Ion Exchange Chromatography, VoxSanguinis 1998, 74, 232-241". Preparación de la muestra: intercambio de buffer en una columna HiPrep 26/10 Desal ting (Amersham Biosciences) en combinación con el sistema de cromatografía ÁKTA-Explorer usando 20 mM de fosfato de sodio, 20 mM de cloruro de sodio, a pH 8 como eluyente. Se llevó a cambio un intercambio de buffer después de dilución de la mezcla de reacción cruda (preparación tal como se describió en el ejemplo 5.5, aproximadamente 5 ml) con agua desalificada hasta un volumen final de 10 ml usando los parámetros siguientes : Columna: HiPrep 26/10 Desalting Régimen de flujo: 10 ml / min Eluyente: 20 mM de fosfato de sodio 20 mM de cloruro de sodio pH 8 Volumen de la muestra: 10 ml Fraccionamiento del eluato: 2,5 ml Equilibración: volúmenes de 5 columnas Longitud de elución: volúmenes de 2 columnas Se reunieron los primero 14 ml de eluyente, y se agregó buffer de adhesión para proporcionar un volumen final de 20 ml . Esta solución, que contenía aproximadamente 5 mg de proteína, se purificó por IEC usando los parámetros siguientes : Columna : HiTrap Q HP 1 ml Régimen de flujo: 1 ml / min Buffer de adhesión (BB) 20 mM de fosfato de sodio, 20 mM de cloruro de sodio, pH 8 Buffer de elusión (EB) 20 mM de fosfato de sodio, cloruro de sodio 1 M, pH 8 Volumen de la muestra: 20 ml Fraccionamiento a través de flujo: 2 ml Fraccionamiento de eluato : 1 ml Concentración inicial de EB: 0 % Equilibración : volúmenes de 5 columnas Restos de muestra no adherida: 15 ml Concentración buscada de EB: 15 % Longitud del gradiente: 20 ml Las fracciones recogidas después de cromatografía fueron analizadas mediante SDS-Page. Las fracciones que contenía el conjugado HES-A1AT se reunieron (volumen de elusión de 40 a 47 ml que corresponde a las fracciones Bl - C6, ver figura 17) . En algunas de las fracciones reunidas, fue detectable una pequeña cantidad de AlAT no reaccionado. La concentración inicial de la fracción reunida después de cromatografía determinada por BCA (Pierce Cat. No. 23225), usando AlAT (proporcionado por GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) como modelo de referencia) fue de 170 µg/ml. Después de dilución e intercambio de buffer en 20 mM de fosfato de sodio, 150 mM de cloruro de sodio, pH 7,2, -Ia concentración de la proteína resultante fue de 54,5 µg/ml (BCA (penetrado con AlAT de GTC Biothearpeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A (como modelo de referencia)). Esta solución final se usó para determinar la eficiencia inhibidora del conjugado . Ejemplo 5.8 Determinación de la capacidad de inhibición in vitro del conjugado HES-A1AT para la elastasa de ganulocita humano. Los ensayos de la actividad inhibidora de elastasa de los conjugados se llevaron a cabo de acuerdo con Castillo et al . , Anal . Biochem. 1979, 99, 53-64 usando un Tecan UV-VIS-Platereader Model Sunrise. Este ensayo se basó en la liberación de p-nitroanilina a partir de N-Met-0-succinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-N02-anilina catalizada por elastasa. Esta hidrólisis puede estar seguida de un aumento de la absorbancia a 405 nm. El régimen d e hidrólisis inicial está en estrecha correlación con la actividad de la enzima. El ensayo se llevó a cabo en ausencia y en presencia de diferentes concentraciones del inhibidor a ser ensayado. La disminución de la actividad enzimática de acuerdo con la actividad inhibidora de las sustancias sometidas a ensayo se representa en una disminución de la pendiente en el gráfico de A405 versus tiempo. La actividad residual de la elastasa en presencia de cierta concentración inhibidora se da por la pendiente de la curva inhibida dividida por la pendiente de la curva no inhibida. Existe una correlación lineal entre la actividad enzimática residual y la concentración de inhibidor. Mediante el uso de regresión lineal, puede lograrse una línea lineal lisa, y puede calcularse la actividad enzimática residual para una concentración de inhibidor determinada. De este modo, puede calcularse la actividad inhibidora (= 1-actividad enzimática residual) de la misma concentración de inhibidores diferentes (ver figura 18) . Se usaron los parámetros siguientes : Concentración de sustrato: 1,5 mM Actividad de elastasa: 7,5 mU Longitud de onda: 405 nm Temperatura: 20°C Intervalo de tiempo: 15 s Ciclos cinéticos: 25 Modo de medición: Central La solución de ensayo consistía en 300 µl de buffer (0,1 M Hepes, 0,5 M NaCl, 0,05 % (m/v) Tritón X-100, pH 7,5) que contenía 10 % de DMSO, 1,5 mM de N-Met-O-succinil-Ala-Ala-Pro- Val-p-N0-anilina, 7,5 mU Elastasa y varias cantidades de inhibidores . La elastasa fue adquirida en Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg. Todas las otras sustancias fueron adquiridas en Sigma Aldrich, Taufkirchen. La actividad inhibidora del conjugado sintetizado tal como se describió en el ejemplo 5.5 se ensayó en comparación con Prolastin® HS (Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania Lot No. PR4HA43) co o referencia, y con AlAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) como material de partida para la conjugación. En la figura 18 se da el gráfico de actividad enzimática versus concentración. La linealidad para todas las curvas fue de R2 > 0,98. En la parte inferior, se dan los valores de CI50 y de la inhibición de elastasa para c (inhibitor) = 1 µg/ml, así como también la actividad inhibidora del material de partida y del conjugado en relación con la referencia. Los datos señalados en la tabla siguiente demuestran claramente que la parte principal de la actividad de AlAT permaneció después de la conjugación con HES.

Tabla del ?jemplo 5.8 ?jemplo 5.9 Determinación de la vida media in-vivo del conjugado HES-rh alfalAT en comparación con rh alfalAT y h alfalAT. Se utilizaron ratones hembra de una edad de 8-10 semanas (BALB/cOlaHsd, Harían GmbH, Borchen, Alemania) , organismo de ensayo (42 ratones, 14 por muestra) . El "es peso corporal" de cada animal se detectó justo antes de la administración de las diferentes soluciones de muestra. 100 µl de una solución de 50 µg/ml de las muestras que se señalan más abajo en un buffer de pH = 7,2 (20 mmoles de fosfato de sodio, 150 mmoles de cloruro de sodio) se inyectaron intravenosamente en la vena de la cola de los ratones . Muestra 1: rh alfalAT (GTC Biotherapeutics Inc., Framingham, MA, lot No. 080604A) Muestra 2 : preparado rh alfalAT-HES preparado en el ejemplo 5.5. Muestra 3: h alfalAT derivado de plasma (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania) A las 1, 2, 4, 10, 24, 31,5 y 48 horas después de la inyección, se sacrificaron dos ratones de cada grupo, y se extrajeron muestras de sangre completa (~500µl) del corazón de los animales. Se preparó suero usando Microvette® 500 Z-Gel (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) . Las muestras de suero se almacenaron a -80°C hasta que comenzaron las mediciones de la -concentración de alfalAT. __ Las concentraciones de alfalAT se detectaron usando un alfalAT- ELISA comercialmente obtenible, (Immundiagnostik, Bensheim, Alemania) siguiendo las instrucciones 'del fabricante '. Los resultados obtenidos- demuestran un aumento de la vida media en el plasma significativa para el conjugado de rh alfalAT-HES en comparación con el material de partida rh alfalAT no modificado. La vida media del conjugado medida, está en el mismo rango que la del h alfalAT derivado de plasma de acuerdo con la tabla siguiente. Tabla del ejemplo 5.9: Vida media del plasma de las muestras 1-3.

Ejemplo 6 Síntesis de conjugados de G-CSF- Ejemplo 6.1 Síntesis de derivados de aldheído-HES Ejemplo 6.1 (a) Síntesis de AminoH?SlO/O, 5,12 g de oxo HES10/0.4 (MW = 14,500 D, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, preparado de acuerdo con la DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y se disolvieron bajo nitrógeno en 25 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 5,13 mL de 1, 4-diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 h, la mezcla de reacción se agregó a 150 mL de una mezcla de 1 : 1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 67%. Ejemplo 6.1(b) Síntesis de Aldehido HES10/0.4 105 mg de ácido 4-formilbenzoico y 135 mg de 1-hidroxi-iH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 7 L de N,N-dimetilformamida (calidad de Síntesis del Péptido, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 135 µL de N,N' -diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 0,7 g de amino HES10/0,4 (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 6.1 (a)). Después de agitar durante 18 horas a 22°C, la mezcla_ de reacción se agregó a 42 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re- disolvió, en 5 mL de DMF y precipitó con 42 mL de etanol/ acetona tal como se describió anteriormente. Después de .centrifugación, el precipitado recogido se disolvió con agua, se dializó durante 1 día contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 95%. Ejemplo 6.1(c) Síntesis de AminoHESlO/0.7 Se disolvieron 6,02 g de oxo-HES 10/0.7 (MW = 15,000 D, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, de acuerdo con la DE 196 28 705) bajo nitrógeno en 32 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 6,03 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 150 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 42C, se lavó con 40 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 52%. Ejemplo 6.1(d) Síntesis de AldehídoH?SlO/0.7 150 mg de ácido 4-formilbenzoícp y 230 mg de 1-hidroxi- lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron -en 10 mL de N,N- dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 204 µL de N,JN'--diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 min. , se agregaron 1 g de aminoHESlO/0.7 (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 6.1 (c) ) . Después de agitar durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 84 mL de 2-propanol enfriado con hielo . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en 50 L de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue 83%. Ejemplo 6.1(e) Síntesis de AminoHES30/0.4 5 g de oxo-HES 30/0.4 (MW = 28,000 D, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de los ingredientes de acuerdo con la DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 28 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mL de 1, 4-diaminobutano . Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 175 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y- etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C. El producto crudo se disolvió en 40 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado . Ejemplo 6.1(f) Síntesis de AldehídoHES30/0.4 130 mg de ácido 4-formilbezoico y 153 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 36 mL de N,N-dimetilformamidas (calidad de Péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 110 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 2,61 g de aminoHES30/0, 4 (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 6.1(e)). Después de agitar durante 22,5 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 enfriada con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC y se lavó con una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 mL de agua, se dializó durante 1 día contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 81%. Ejemplo 6.1(g) Síntesis de AminoHES30/0.7 5 g de oxo-HES 30/0.7 (MW = 31,000 D, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de lo ingredientes de acuerdo con DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 28 mL en sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 175 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C. El producto crudo se disolvió en 40 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado .

Ejemplo 6.1(h) Síntesis de AldehídoHES30/0.7 122 mg de ácido 4-formilbenzoico y 144 mg de 1-hidroxi- iH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 34 L de N,N- dimetilformamida (calidad del Péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 103 µL de N,N'- diisopropilcarbodiimida (F-luka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, 2,46 g de aminoHES30/0.7 (sintetizado tal como se describió el ejemplo 6.1(g)). Después de agitar durante 22,5 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 mL de agua, se dializó durante 1 día contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 87%. Ejemplo 6.1(i) Síntesis de AminoHES50/0.7 6,09 g de oxo-HES 50/0.7 (MW = 57,000 D, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, usando relaciones molares de los ingredientes de acuerdo con la DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 32 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y 1,22 mL y se agregaron 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 150 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El -producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se lavó con 40 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializtS durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 82%. Ejemplo 6.1(j) Síntesis de AldehídoHES50/0.7 125 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi- lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 38 L de N,N-dimetilformamida (calidad del Péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 155 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 min., se agregaron 3,8 g de aminoHES50/0.7 (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 6.1 (i)). Después de agita durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4SC, se re-disolvió en 20 mL de N,N-dimetilformamida y precipitó con 80 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente. Después de centrifugación el precipitado se disolvió en 50 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua, (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 77%. Ejemplo 6.2 Síntesis de conjugados de HES-G-CSF por afinación reductora ?jemplo 6.2 (a) Intercambio de Buffer A: 33 mL de una solución de 0,454 mg/mL de hG-CSF (hG-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto commercial Neupogen en 10 mM de acetato de sodio, 50 mg/mL de sorbitol y 0,004% de Tween 80 a pH 4,0 se concentraron por diafiltración a 0°C hasta 4 mL con un concentrador Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D) y se re-diluyeron nuevamente hasta 15 mL con 1 buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0. Esta diafiltración se repitió dos veces. La concentración final en la última etapa de dialfiltración fue de 3 mg/mL. Ejemplo 6.2 (b) Reacción de hG-CSF con derivados aldehídoHES de los ejemplos 6.1(b), 6.1(d) y 6.1(j) A 1,67 mL de una solución de hG-CSF después de intercambio de buffer en buffer de acetato de sodio 0,1 M, a pH 5,0 (tal como se describió en el ejemplo 6.2 (a) anterior), se agregaron 1,67 mL de una solución del derivado HES-y 1,67 mL de una solución 60 mM de cianoborohidruro de sodio, ambos en el mismo buffer, y la solución se incubó durante 15,5 horas a 4°C. Todas las soluciones se enfriaron a 0°C antes de la mezcla.

Se emplearon las siguientes concentraciones finales de HES : 39,4 mg/mL para los derivados HES preparados de acuerdo con el ejemplo 6.1(b) y 6.1(d). _- 197 mg/mL para el derivado HES preparado de acuerdo con el ejemplo 6.1 (j ) . 197 mg/mL de HES50/0"7 (MW = 47,000 D, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) como control de reacció . Las mezclas de reacción se analizaron por electrofóresis de gel (ver figura 19) . Ejemplo 6.2 (c) Buffer de intercambio B: 20 mL de una solución de 0,454 mg/mL de hG-CSF (hG-CSF purificado que tiene esencialmente las mismas características que el producto commercial Neupogen®) en 10 M de acetato de sodio, 50 mg/mL de sorbitol y 0,004% Tween 80 a pH 4,0 se concentraron por diafiltración a 15°C hasta 4 mL con un concentrador Vivaspin 15R (VS15RH11, 5KD MWCO, Vivascience AG, Hannover, D) y se diluyeron nuevamente hasta 15 mL con buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0. Esta diafiltración se repitió dos veces . La concentración final en la última etapa de diafiltración fue de 1,5 mg/mL. Ejemplo 6.2 (d) Reacción de hG-CSF con derivados de aldehídoHES de los ejemplos 6.1(f) y 6.1(h) A 3,3 mL de una solución de hG-CSF después de intercambio de buffer en buffer de- acetato de sodio 0,1 M, a H 5,0 (tal como se describió en el ejemplo 6.2 (c) anterior), se agregaron 3,3 L de una solución de 789 mg del derivado HES- y 3,3 mL de una solución de 60 mM de cianoborohidruro de sodio, ambos en el mismo buffer, y- la solución se incubó durante 30 horas a 4°C. Todas las soluciones se enfriaron a 0°C antes de mezclarlas . Después de 17 horas se extrajeron las muestras para el control de reacción. Las muestras de reacción se analizaron por electrofóresis de gel (ver figura 20) . Ejemplo 6.3 Ensayo In vitro Mitogenicidad de las variantes de G-CSF par alas células NFS-60 de ratón El G-CSF es conocido por sus efectos específicos sobre la proliferación, diferenciación y activación de células hematopoyéticas del linaje de granulocitos neutrofílicos . La capacidad mitogénica de las variantes de G-CSF se ensayó usando células de NFS-60 de ratón (N. Shirafuji et al., Exp. Hematol. 1989, 17, 116-119). Las células cultivadas en un medio de RPMI con 10% de suero de ternero fetal (Gibco INVITROGEN GmbH, Karlsruhe, D) que contenían 5-10% WEHI-3B (DSMZ, Braunschweig, D; cultivadas tal como se describió en DSMZ) medio acondicionado como fuente de IL-3 exógena se cosecharon por centrifugación, se lavaron y se formaron alícuotas a 100.000 células por receptáculo en una placa de 24 receptáculos . Se permitió que las células se adaptaron durante 1 hora a 37°C en un medio de RPMI sin medio acondicionado con WEHI-3B antes-" de agregar las muestras del factor de crecimiento G-CSF diluidas en el mismo medio. Las células NFS- 60 se expusieron a variante G-CSF purificado (purificación de acuerdo con los ejemplos 3 A 1 y 2, cuantificación de proteína de acuerdo con el ejemplo 3 B 1) : Neupogen®, Neulasta® ambos de Amgen, "Conjugado HES-GCFS10/0.4" preparado en el ejemplo 6.2(b), "conjugado HES-GCFS10/0.7" preparado en el ejemplo 6.2 (b), "Conjugado HES-GCFS30/0.4" preparado en el ejemplo 6.2 (d), "Conjugado HES-GCFS30/0.7 preparado en el ejemplo 6.2 (d), "Conjugado HES-GCFS50/0.7" preparado en el ejemplo 6.2 (b), "Incubación de imitación" ( = control de reacción, 197mg/ml HES50/0.7, MW 47,000 D, DS 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania) , durante 3 días a 37°C, y luego la células se contaron electrónicamente (Casy TT Cell Counter, Schárfe System, Reutlingen, D) . Los resultados se resumen en la tabla siguiente y en la Figura 21. Todos los casos, las cantidades de proteínas que se dan en la tabla siguiente y en la Figura 21 representan el contenido de G-CSF de los conjugados solamente tal como puede observarse en la Figura 21, todas las variantes diferentes de G-CSF (2,5 - 250 pg/ml), fueron capaces de estimular un aumento en la cantidad de células después de 3 días en comparación con un medio que no contenían factores de crecimiento agregados . Todas las variantes alcanzaron el mimo nivel de estimulación máxima a una concentración de 250 pg/ml. Tabla del ejemplo 6.3 : Proliferación de las células de ratón NFS-~60, inducidos por las variantes G-CSF Ejemplo 6.4 Efectos biológicos in vivo de los conjugados de hG-CSF en ratas En el momento de llegar, las ratas [ratas macho CRL:CD® (de 7 semanas de edad) , de Charles River Deutschland GmbH, Sanghofer Weg 7, D-97633 Sulzfeld) ] fueron distribuidas al azar en grupos de 5. Después de 7 días de aclimatización, las ratas que no estaban en buen estado queden excluidas y reemplazadas por animales de reserva. El peso de las ratas al llegar era de 181-203 g. A cada grupo de cinco ratas seleccionadas al azar, se les administró intravenosamente 100 µg de proteína por kg de peso corporal (velocidad de la inyección 15 segundos/dosis, vehículo: 5ml de PBS/kg de peso corporal) del las siguientes muestras de G-CSF no conjugadas ó conjugadas (purificación de acuerdo con los ejemplos 3 A 1 y 2, cuantificación de la proteína de acuerdo con el ejemplo 3 B 1) :_ ". Neupogen® y Neulasta®, ambas de Amgen, "Conjugado HES-GCSF10/0.4" (10/0.4) preparado en el ejemplo 6.2(b), "Conjugado HES-GCSF10/0.7" (10/0.7) preparado en el ejemplo 6.2 (b), "Conjugado HES-GCSF30/0.4" (30/0.4) preparado en el ejemplo 6.2(d), "Conjugado HES-GCSF30/0.7" (30/0.7) preparado en el ejemplo 6.2(d) , "Conjugado HES-GCSF50/0.7" (50/0.7) preparado en el ejemplo 6.2 (b) , "Incubación de Imitación" ( = control de reacción, 197 mg/ml de HES50/0.7, MW 47,000 D, DS 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach Rodheim, Alemania) y un vehículo de control (PBS, volumen de aplicación 5 ml/kg en peso) . Muestras de sangre de todos los animales, de aproximadamente 200 µl de EDTA, de sangre completa se tomaron del plexo venoso retrobulbar bajo anestesia de éter liviana. En el día del ensayo -5, se tomó sangre una vez por la mañana de todos los animales después de mantenerlos en ayunas durante la noche. En los días 1 a 8 la sangre se tomó dos veces por día a un intervalo de 12 horas. La primera muestra de sangre en el día 1 se tomó antes de la administración del G-CSF / conjugado de G-CSF-HES- . El recuento de leucocitos (WBC) se llevó a cabo usando un Bayer ADVIA™ 120 (Fernwald, Alemania) . Los resultados -"sé muestran en la figura 22. Ejemplo 6.5 Medición de la vida media in vivo del conjugado preparado a partir de H?S50/0.7 y G-CSF a través de afinación reductora (ejemplo 6.2(b)) en comparación con Neupogen® y Neulasta® (Amgen) Se usaron ratones hembra BALB/cOlaHsd (Harían GmbH/Borchen) . En el día de la administración, se pesaron los animales (19-22 g) . Se inyectaron en la vena de la cola de nueve ratones, 100 µg por kg de peso corporal de la muestra de rh-G-CSF químicamente modificada, preparada en el Ejemplo 6.2 (b) así como también muestras de Neupogen® y Neulasta® (Amgen) . A las 1, 3, 6, 11, 22, 30, 49, 72 horas después de la inyección (ver tabla siguiente) , se tomaron muestras de sangre completa de aproximadamente 150 µl, de la vena de la cola o del plexo venoso retrobulbar de 3 ratones del grupo respectivo usando capilares que contenían heparina de sodio (Hirschmann, Eberstadt) y se almacenaron en hielo hasta la preparación del plasma. Tabla del ejemplo 6.5: Conducta en el procedimiento de muestreo Se centrifugó sangre entera durante 10 minutos a 2000g. El plasma fue transferido a otro tubo y se recentrifugó durante 5 minutos a 3500g. Se almacenaron alícuotas a -80°C hasta el día del análisis. La cantidad de G-CSF en las muestras de plasma se cuantificó utilizando un método ELISA (R&D GmbH, Wiesbaden) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en la Figura 36 a partir de los cuales resulta evidente ue en comparación con Neupogen, el conjugado de HES-G-CSF de acuerdo con la invención, tienen una vida media altamente incrementada (5.1 en comparación con 1.2 horas), y en comparación con Neulasta, tiene una vida media que es casi la misma (5.1 en comparación con 5,2 horas) . Ejemplo 7 Conjugación de un H?S a h?PO recombinante por afinación reductora Se usó EPO humana recombinante, que tiene la secuencia de amino ácido de la EPO humana y esencialmente las mismas características que la Erypo® (Orhto Biotech, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche), comercialmente obtenible cf. EP 0 148 605, EP 0 205 564, EP 0 411 678. Ejemplo 7.1 Síntesis de amino-HES 10 g de HES oxidado (MW = 57,000 D, DS = 0.76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D, preparado de acuerdo con DE 196 28 705 Al) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 53 ml de sulfóxido de dimetilo (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 2 ml de 1, 4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de agitar a 0°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 350 ml de 2-propanol enfriado con hielo (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se lavó con 8-0 ml de 2- propanol enfriado con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio "Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 85%. _ ?jemplo 7.2 Síntesis de aldehído-HES 153 mg de ácido 4-formilbenzoico y 241 mg de 1-hidroxi- IH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 51 ml de N,N-dimetilformamida (calidad del Péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 170 µL N,N'~ diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 min. , se agregaron 5,1 g de amino-HES, preparado de acuerdo con el ejemplo 7.1. Después de agitar durante 16 horas a 22aC, la mezcla de reacción se agregó a 360 ml de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re- disolvió en 50 ml de agua y precipitó con 360 ml de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 50 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fué de 87 %.

Ejemplo 7.3 Conjugación de aldehído-HES a EPO por afinación reductora 625 mg aldehído-HES, preparado de acuerdo con el ejemplo 7.2, se disolvieron en 1,67 ml en buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5.0) y se enfriaron a 0°C. Se agregaron 1,67 ml de la solución de EPO (3mg/ml) y 1,67 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio de 60 mM, ambos en el mismo buffer y se enfriaron a 0°C, y la mezcla se encubó a 02C. Después de 17 horas, la mezcla de reacción se purificó después de análisis por electrofóresis de gel (ver Fig. 23, Franja B) . Ejemplo 7.4 Control de Reacción A: Reacción de aldehido -HES con EPO sin cianoborohidruro de sodio 313 mg de aldehído-HES, preparado de acuerdo con el ejemplo 7.2, se disolvieron a 0,83 ml en buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,l M a pH 5,0) y se enfriaron a 0°C. Se agregaron 0,83 ml de la solución EPO (3 mg/ml) en el mismo buffer, y se agregaron 0,83 ml del buffer de reacción, ambos enfriados a 0aC, y la mezcla se incubó a 0aC. Después de 17 horas, la mezcla de reacción se purificó después de análisis por electrofóresis de gel (ver Fig. 23, Franja C) . Ejemplo 7.5 Control de Reacción B: Reacción de EPO con cianoborohidruro 0,83 ml de la solución de EPO (3 mg/ml) en buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0) y se enfriaron a 0°C, 0,83 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio de 60 mM en el mismo buffer y 0,83 ml de buffer de reacción, ambos enfriados a 0fiC, se agregaron y la mezcla se incubó a 0aC. Después de 17 horas, la mezcla de reacción se purificó después de análisis por electrofóresis de gel (ver la Fig. 23, Franja D) . Ejemplo 7.6 Cromatografí de Intercambio Iónico para la purificación de EPO y derivados de EPO La purificación de muestras de EPO se llevó a cabo a temperatura ambiente usando un sistema ÁKTA explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech) que consistía en una bomba P-903, una mezcladora M-925, con una cámara de 0,6 ml, un Monitor UV-900, con una célula de flujo de 10 mm, un Monitor pH/C-900, un Collector de fracciones Frac-900, un circuito de la muestra de 2 ml junto con software Único Versión 3.2.1.. La columna que contenía 5 ml de Q-Sepharose Fast Flow se equilibró con 10 CV de buffer A (20mM de ácido N-morfolino-propan sulfónico / NaOH, pH 8.0) . Las muestras de EPO se diluyeron en 1:10 con buffer A (y finalmente se ajustaron a pH 7,8-8,2 y se aplicaron usando la bomba con la muestra a un régimen de flujo de 1 ml/min. Después de lavar la bomba de la muestra con 10 ml de buffer A, la columna se lavó adicionalmente con 6 CV buffer A a un régimen de flujo de 1,0 ml/minuto.

Subsiguientemente, 4 volúmenes de 20mM de Fosfato de Na, a pH 6,5; buffer B a un régimen de flujo de 0,8 ml/min. y EPO, " fueron eluidos usando un gradiente de empinado de 0-40% de buffer C (NaCl 0,5M en 20mM de Fosfato de Na, a pH 6,5), en el término de 37 min. Se registraron los perfiles de elución a 206, 260 y 280 nm de absorbancia. Después de completar la elución, la columna se regeneró con 25 ml de buffer C a un régimen de flujo .de 1 ml/minuto. Finalmente la columna se trató con NaOH 1M durante 60 minutos y se re-acondicionó con buffer C y se almacenó hasta su uso posterior. Ejemplo 7.7 Determinación de la Proteína EPO La determinación cuantitativa de la proteína EPO se llevó a cabo midiendo la absorción de UV a 280 nm de acuerdo con la Eur. Phar. (European Pharmacopeia 4, Monography 01/2002: 1316: solución concentrada de eritropoyetinas) en una cubeta con una longitud de Icm. Además, se cuantificó la EPO aplicando un método de RP-HPLC empleando una columna RP-C4 (Vydac Protein C4, Cat.# 214TP5410, Grace Vydac, Ca, US); el método de HPLC se calibró usando el patrón de referencia BRP 1 de eritropoyetina (European Pharmacopeia, Conseil de l'Europe B.P. 907-F67029, Strasbourg Cedex 1) . Ejemplo 7.8 ?nsayo in vivo de la actividad biológica de la ?PO modificada con H?S El bioensayo de EPO en el sistema de ratón normocitémico 5 se efectuó de acuerdo con los procedimientos descritos en la Farmacopeia Europea 4, Monografía 01/2002:1316: solución concentrada de Erytropoyetina y Ph. Eur. Capítulo 5.3 : "Análisis Estadístico de los Resultados de Ensayos y Pruebas Biológicas"; para la EPO modificado con HES de acuerdo con el 1.0 ejemplo 7.3, se midió un valor de la actividad específica de 418 500 unidades por mg de EPO de proteína lo cual indicó una actividad específica aproximadamente 4-5 veces superior en comparación con el material de partida EPO . Los resultados del estudio se resumen en la Tabla 15 siguiente.

Tabla del ejemplo 7.8: 0 Ejemplo 8 Síntesis de Conjugados HES-IFN-alfa a través de aminación reductora El IFN- usado era un Inferieron alfa-2b humano recombinante manufacturado por tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli) . Está compuesta por 165 amino ácidos y presenta una secuencia de amino ácidos que es idéntica a la del interferón alfa "2b humano natural (hlFN-alfa 2b) . : ?jemplo 8.1 Síntesis de oxo-HES El HES oxidado en su extremo reductor tal como se describirá más adelante (oxo-HES) se prepare a partir de HES usando una solución de yodo alcalino tal como se describió en DE 196 28 705 Al, los contenidos respectivos del (ejemplo A, columna 9, líneas 6 a 24) se incorporan aquí como referencia. ?jemplo 8.2 Síntesis de derivados HES En un procedimiento en dos etapas, el oxo-HES del ejemplo 8.1 se modificó en su extremo reductor con una amina, y se introdujo un grupo aldehido en una segunda reacción. El aldehído-HES resultante se usó para producir los conjugados iFN-alfa-HES a través de afinación reductora tal como se describió en el ejemplo 8.3. ?jemplo 8.2.1 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 8.1 5,12 g de oxo-HES del ejemplo 8.1 (MW = 14,5 kD, DS = 0.41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80aC al vacío y se disolvieron bajo nitrógeno en 25 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 5,13 L de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40aC durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 150 L de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mL una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80' mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento^ del producto aislado fue del 67%. Ejemplo 8.2.2 Síntesis del aldehído-HES de amino-HES del ejemplo 8.2.1 105 mg de ácido 4-formilbenzoico y 135 mg de 1-hidroxi-IH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 7 mL de N,N-dimetilformamida (calidad del Péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 135 µL de N,N' -diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21aC durante 30 minutos, se agregaron 0,7 g de amino-HES (sintetizado tal como describió en el ejemplo 8.2.1). Después de agitar durante 18 horas a 22 °C, la mezcla de reacción se agregó a 42 L de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se re-disolvió en mL de DMF y precipitó con 42 mL de etanol/acetona tal como se describió. Después de centrifugación, el precipitado recogido se disolvió con agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschland GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue del 95 %. Ejemplo 8.2.3 Síntesis de amino-HES de oxo-HES del ejemplo 8.1 Se calentaron 6,02 g de oxo-HES del ejemplo 8,1 (MW = 14,7 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) durante la noche a 80°C al vacío y se disolvieron bajo nitrógeno en 32 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 6,03 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40aC durante 17 horas la mezcla de reacción se agregó a 150 mL de una mezcla de 1:1 enfriado con hielo de acetona y etanol (v/v) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4aC, se lavó con 40 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriado con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 52 %. ?jemplo 8.2.4 Síntesis de aldehído-H?S de amino-HES del ejemplo 8.2.3 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi- ÍH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 10 mL de N,N- dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 204 µL de N,N'- diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos se agregó 1 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.3). Después de agitar durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 84 mL de 2-propanol enfriado con hielo . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se redisolvió en 50 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis (SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 83%. Ejemplo 8.2.5 Síntesis de amino-HES de oxo-HES del ejemplo 8.1 5 g de oxo-HES del ejemplo 8.1 (MW = 28 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 28 mL de sulfóxido de dimetilo (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas la mezcla de reacción se agregó a 175 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C. El producto crudo se disolvió en 40 L de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado. ?jemplo 8.2.6 Síntesis de aldehído-H?S de amino-H?S del ejemplo 8.2.5 130 mg de ácido 4-formilbenzoico y 153 mg de- 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 36 mL de N,N-dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 110 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 2,61 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.5). Después de agitar durante 22,5 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla de acetona y etanol de 1:1 (v/v) enfriada con hielo. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 L de agua, se dializó durante 1 día contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, - Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 81%. ?jemplo 8.2.7 Síntesis de amino-H?S de oxo-H?S del ejemplo 8.1 5 g de oxo-HES del ejemplo 8.1 (MW = 30,8 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y se luego se disolvieron bajo nitrógeno én 28 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas la mezcla de reacción se agregó a 175 mL de una mezcla de 1:1 mixture de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C. El producto crudo se disolvió en 40 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. No se determinó el rendimiento del producto aislado. ?jemplo 8.2.8 Síntesis de aldehído-HES de amino-HES del ejemplo 8.2.7 122 mg de ácido 4-formilbenzoico y 144 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 34 mL de N,W- dimetilformamida (calidad de péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 103 µL de N,N'- diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 2,46 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.7). "Después de agitar durante 22,5 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió in 30 mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 87%. Ejemplo 8.2.9 Síntesis de amino-HES de oxo-H?S del ejemplo 8.1 g de oxo-HES (MW = 42,1 kD, DS = 0,41, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante dos días a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 53 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 2,01 mL de 1, -diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas la mezcla de reacción se agregó a 350 L de 2-propanol enfriado con hielo (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 80 mL de 2-propanol enfriado con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3 , 5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 7-6%. ?jemplo 8.2.10 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 8.2.9 900 mg de ácido 4-formilbenzoico y 1053 mg de 1-hidroxi- iH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, - Taufkirchen, D) se disolvieron en 30 mL de N,N-dimetilformá ida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 930 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 3 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 88.2.9 y disueltos en 20 mL de N,N-dimetilformamida) . Después de agitar durante 22,5 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 210 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C y se lavó con una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 97%. ?jemplo 8.2.11 Síntesis de amino-HES a partir de oxo-HES del ejemplo 8.1 (A) 6,09 g de oxo-HES (MW = 56,8 kD, DS = 0,76, Süpramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 32 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,22 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 150 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado -se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 40 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió en 80 mL de agua, se dializó durante 4 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 82%. ?jemplo 8.2.12 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 8.2.11 125 mg de ácido 4-formilbenzoico y 174 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 38 mL de N,N- dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 155 µL de N,N'- diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 3,8 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.11). Después de agitar durante 19 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 160 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en 20 mL de N,N-dimetilformamida y precipitó con 80 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente.

Después de centrifugación, el precipitado se disolvió in 50 L de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 77%. ?jemplo 8.2.13 Síntesis de amino-HES de oxo-H?S del ejemplo 8.1 (B) 10 g de oxo-HES (MW = 56,8 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío y luego se disolvieron bajo nitrógeno en 53 mL de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 2 mL de 1, 4-diaminobutano. Después de agitar a 40°C durante 17 horas, la mezcla de reacción se agregó a 350 L de 2-propanol enfriado con hielo (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) . El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se lavó con 80 mL de 2-propanol enfriado con hielo y se recogió por centrifugación. El producto crudo se disolvió jen 80 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3 , 5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 85%. .-- Ejemplo 8.2.14 Síntesis de aldehído-HES de amino-HES del ejemplo 8.2.13 153 mg de ácido 4-formilbenzoico y 241 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 51 mL de N,N-dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 170 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregaron 5,1 g de amino-HES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.13). Después de agitar durante 16 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 360 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se disolvió nuevamente en 50 mL de agua y precipitó con 360 mL de una mezcla de 1:1 de acetona y etanol (v/v) enfriada con hielo tal como se describió anteriormente. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 50 mL de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 3,5 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 87%. Ejemplo 8.2.15 Síntesis de amino-HES de oxo-H?S del ejemplo 8.1 5,0 g de ._ oxo-HES (MW = 29,3 kD, DS = 0,86, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 20 ml de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 1,67 ml de 1, 4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de agitar a 40°C durante 30,5 horas, la mezcla de reacción se agregó a 175 ml de una mezcla de 1:1 (v/v) de acetona (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D) enfriada con hielo.

El producto precipitado se recogió por centrifugación durante 120 minutos a 4°C, se disolvió en 40 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 87%. ?jemplo 8.2.16 Síntesis de aldehído-H?S de amino-HES del ejemplo 8.2.15 150 mg de ácido 4-formilbenzoico y 230 mg de 1-hidroxi- lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 10 ml de N,N- dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 166 µL " de N,N'~ diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregó una solución de 3,02 g de AminoHES (sintetizado tal como se describió en el ejemplo 8.2.15)" en 20 ml de DMF. Después de agitar durante 16 horas a 22°C, la mezcla de reacción se agregó a 215 ml de una mezcla de 1:1 (v/v) de acetona (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en 20 ml de agua y precipitó con acetona/ etanol tal como se describió anteriormente. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 ml de agua, se dializó durante 2.5 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 87%.

Ejemplo 8.2.17 Síntesis de amino-H?S a partir de oxo-HES del ejemplo 8.1 5,0 g de oxo-HES (MW = 97,9 kD, DS = 0,76, Supramol Parenteral Colloids GmbH, Rosbach-Rodheim, D) se calentaron durante la noche a 80°C al vacío, se disolvieron bajo nitrógeno en 20 ml de sulfóxido de dimetilo seco (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) y se agregaron 0,50 ml de 1, 4-diaminobutano (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de agitar a 40°C durante 30,5 horas la mezcla de reacción se agregó a 175 ml de una mezcla de 1:1 (v/v) de acetona (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D) enfriada con hielo.

El producto precipitado se recogió por centrifugación durante 120 minutos a 4°C, se disolvió en 40 ml de agua, se dializó durante 2 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 90%. ?jemplo 8.2.18 Síntesis de aldehído-HES a partir de amino-HES del ejemplo 8.2.17 73 mg de ácido 4-formilbenzoico y 112 mg de 1-hidroxi-lH-benzotriazol (ambos de Aldrich, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) se disolvieron en 10 ml de N,N-dimetilformamida (calidad del péptido de síntesis, Biosolve, Valkenswaard, NL) y se agregaron 81,3 µL de N,N'-diisopropilcarbodiimida (Fluka, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, D) . Después de incubación a 21°C durante 30 minutos, se agregó una solución de 3,09 g de AminoHES (preparado tal como se describió en el ejemplo 8.2.17) en 20 ml de DMF. Después de agitar durante 16 horas a 22°C la mezcla de reacción se agregó a 215 ml de una mezcla de 1:1 (v/v) de acetona (Cari Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, D) y etanol (Sonnenberg, DAB, Braunschweig, D) enfriada con hielo. El producto precipitado se recogió por centrifugación a 4°C, se re-disolvió en 20 ml de agua y precipitó con acetona/etanol tal como se describió anteriormente. Después de centrifugación, el precipitado se disolvió en 30 ml de agua, se dializó durante 2,5 días contra agua (entubación de diálisis SnakeSkin, corte de 10 kD, Perbio Sciences Deutschly GmbH, Bonn, D) y se liofilizó. El rendimiento del producto aislado fue de 96%. Ejemplo 8.3 Síntesis de conjugados de IFN-alfa a través de aminación reductora Ejemplo 8.3.1 Conjugación de IFN-alfa a una escala de 20 µg A 0,675 mg de IFN-alfa, disueltos en 0,375 ml de buffer de fosfato de sodio 25 mM a pH 7,5, que contenía 150 mM de NaCl y 0,3 mM de EDTA, se le agregaron 4 ml del buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,1M a pH 5,0) y la solución se centrifugó durante 30 minutos a 3939 x g en un concentrador Vivaspin 6 (Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Alemania) . El procedimiento de lavado se repitió dos veces por dilución de la solución residual con el buffer de reacción a 6 ml y la centrifugación tal como se ha descrito. El volumen de la solución de IFN-alfa final fue de 0,236 ml, que corresponde a una concentración final calculada de 2,86 mg/ml de IFN-alfa. La concentración de proteína no fue verificada experimentalmente . A 7 µl de la solución de IFN-alfa preparada tal como se describió anteriormente y enfriada a 0°C, se le agregaron 10 µl (50 equiv. ) de la respectiva solución de aldehído-HES (ver tabla siguiente) y 11,3 µl de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambos en el mismo buffer (acetato de sodio, pH 5,0) y enfriada a 0°C y la mezcla se incubó durante 17 h a 0°C. La mezcla de reacción se analizó por electroforesis de gel . Se emplearon las siguientes concentraciones de las soluciones de aldehído-HES : Tabla del ejemplo 8.3.1 El análisis SDS-Page de los conjugados se muestra en la Figura 24. ?jemplo 8.3.2 Conjugación a IFN-alfa en una escala de 3 mg A 20 mg de IFN-alfa, disueltos en 25 mM de buffer de fosfato de sodio a pH 7,5, que contenía 150 mM de NaCl y 0,3 mM de EDTA, se le agregaron 8 ml del buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0) y la solución se centrifugó durante 99 minutos a 3939 x g en un concentrador .

Vivaspin 15R (Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, _ Alemania) . El procedimiento de lavado se repite dos veces por dilución de la solución residual con el buffer de reacción a 18 ml y la centrifugación tal como se ha descrito. La solución final de IFN-alfa se diluyó con buffer de reacción a 6,66 ml lo cual proporcionó una concentración calculada final de 3 mg/ml de IFN-alfa. La concentración de proteína no se verificó experimentalmente . A 1 ml de una solución de IFN-alfa preparada tal como se describió anteriormente, y enfriada a 0°C, se le agregó 1 ml de una solución de aldehídoHES (75 equiv.) y 1 ml de un solución de cianoborohidruro de sodio 60 M, ambos en el mismo buffer (acetato de sodio, pH 5,0) y enfriada a 0°C, y la mezcla se incubó durante 22 horas a 0°C. La mezcla de reacción se purificó después de análisis por electroforesis de gel. Para la reacción descripta en la entrada G, únicamente se usaron 0,666 µl de las soluciones correspondientes. Se emplearon las siguientes concentraciones de las soluciones de aldehídoHES : Tabla del ejemplo 8.3.2 El análisis SDS-Page de los conjugados se muestra en la Figura 25. ?jemplo 8.3.3 Conjugación a IFN-alfa en una escala de 3 mg 8.3.3.1 Conjugación de AldehídoHES preparado en el ejemplo 8.2.16 a IFNa mediante aminación reductora A 10 mg de IFNa, disueltos en 25 mM de buffer de fosfato de sodio a pH 7,5, que contenía 150 M de NaCl y 0,3 mM de EDTA, se le agregaron 8 ml del buffer de reacción (buffer de acetato de sodio 0,1 M a pH 5,0) y la solución se centrifugó durante 30 minutos a 3939 x g en un concentrador Vivaspin 15R (Viva Science, 5 kD MWCO, Hannover, Alemania) . El procedimiento de lavado se repitió dos veces por dilución de la solución residual con el buffer de reacción a 18 ml y centrifugación tal como se ha descrito . La solución IFNa final se diluyó con el buffer de reacción hasta 3,33 ml lo cual proporcionó una concentración final calculada de 3 mg/ml de IFNa. La concentración de proteína- no se verificó experimentalmente. A 1 ml de la solución de IFNa preparada tal como se-describió anteriormente y enfriada a 0°C, se le agregó 1 ml de la solución de aldehídoHES preparada en el ejemplo 8.2.16- (75 equiv., 352 mg/ml) y 1 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambos en el mismo buffer y se enfriaron a 0°C, y la mezcla se incubó durante 22 horas a 0°C. La mezcla de reacción se purificó después de análisis por electroforesis de gel. Para la electroforesis de gel se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usó un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un buffer de corrida MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambas de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 8.3.3.2 Conjugación de AldehídoHES preparado en el ejemplo 8.2.18 a IFNa por aminación reductora A 1 ml de la solución de IFNa preparada tal como se describió en 8.3.3.1 y enfriada a 0°C, se agregaron 2 ml de la solución de aldehídoHES preparada en el ejemplo 8.2.18 (75 equiv. , 369 mg/ml) y 1,5 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo buffer y se enfriaron a 0°C, y la mezcla se incubó durante 22 horas a 0°C. La mezcla de reacción se purificó después de análisis por electroforesis de gel . Para la electroforesis de gel se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y. un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turnhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente .con un buffer de corrida de MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambas de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones de fabricante. 8.3.3.3 Control de reacción: Conjugación de HESlO/0,4 (Mw 7,6 kD DS = 0,41) a IFNa por aminación reductora A 1 ml de la solución de IFNa preparada tal como se describió en 8.3.3.1 y enfriada a 0°C, se agregaron 1 ml de la solución de HESlO/0,4 (75 equiv. , 117 mg/ml) y 1 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo buffer y se enfriaron a 0°C, y la mezcla se incubó durante 22 horas a 0°C. La mezcla de acción se purificó después de análisis por electroforesis de gel. Para la electroforesis del se emplearon una XCell Sure Lock Mini Cell (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) y un suministro de energía Consort E143 (CONSORTnv, Turhhout, B) . Se usaron un gel Bis-Tris al 12% conjuntamente con un buffer de corrida de MOPS SDS bajo condiciones reductoras (ambas de Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de SDS-Page de los conjugados se muestra en la Figura 26. Ejemplo 8.3.4 Conjugación a IFN-alfa en una escala de 16 mg El buffer de una solución de IFN-alfa de 20 mg se intercambió tal como se describió en el ejemplo 8.3.2. La solución IFN-alfa final se diluyó con el buffer de reacción a 6,37 ml lo cual proporcionó una concentración final calculada de 3,14 mg/ml de IFN-alfa. Se diluyeron 100 µl de esta solución con 900 µl de buffer de reacción y la concentración de proteína se determinó espectrofotometricamente a 279 nm hasta 3,01 mg/ml, en base al coeficiente de extinción molar de 18000. Después de combinación con el material usado para la determinación de la concentración de proteína, el volumen final fue de 7,0 ml con una concentración de proteína de 2,74 mg/ ml . A 5,91 ml de esta solución de IFN-alfa (16,2 mg) preparada tal como se describió anteriormente y enfriada a 0°C, se agregó una solución de 3,152 g de aldehído-HES del ejemplo 8.2.14 (75 equiv.) en 5 ml de buffer de reacción y 6 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo buffer (acetato de sodio, pH 5,0) y se enfrió a 0°C y la mezcla se incubó durante 22 horas a 0°C (ver Figura 27, Línea A) . Como control de reacción, se mezclaron 1,09 ml de la solución IFN-alfa preenfriada (3 mg) con 1 ml de una solución de 122 mg de HES10/0,4 no oxidado (Mw 7,6 kD DS = 0,41) en el buffer de reacción y 1 ml de una solución de cianoborohidruro de sodio 60 mM, ambas en el mismo buffer y se enfriaron a 0°C (ver Figura 27, línea"B) . El análisis SDS-Page del conjugado se muestra en la Figura 27. Ejemplo 8.4 Purificación de los conjugados de IFN-alfa-HES 8.4.1 Purificación de HES-IFN-o a partir de incubaciones de la proteína reducti amente aminada con derivados HES activados (separación de la proteína modificada y la no modificada a partir de los derivados HES) La purificación de todas las muestras se llevó a cabo a temperatura ambiente usando un equipo ÁKTA explorer 10. La columna que contenía 3 ml de Q-Sepharose Fast Flow se equilibró con 10 CV de buffer A (20 mM de Tris/HCl, a pH 8,0) . Las muestras se diluyeron a 1:10 con buffer A y se aplicaron mediante el uso de una bomba para muestras a un régimen de flujo de 1 ml/min. Después del lavado de la bomba de muestras con 10 ml de buffer A, la columna se lavó adicionalmente con 6 CV de buffer A a un régimen de flujo de 1,0 ml/min. La elusión se llevó a cabo usando un gradiente lineal de 0-100% de buffer B (0,3 M de NaCl en 20 mM de Tris/HCl, pH 8,0) sobre 2 CV y una corrida isocrática con 0,5 CV de buffer B a un régimen de flujo de 0,8 ml/min. La columna se regeneró mediante el uso de 2 CV de buffer C (1,5 M de NaCl en 20 mM de Tris /HCl, pH 8,0) seguido de 0,5 CV de buffer B a un régimen de flujo de 0,8 ml/min. La re-equilibración para la prueba siguiente se llevó a cabo mediante el uso de 6 CV de buffer A y un régimen de flujo de 1,0 ml/min. 8.4.2 Materiales y Métodos 8.4.3 Equipo: ÁKTA explorer 10 (Amersham Pharmacia Biotech), con: Bomba P-903 Mezcladora M-925, con una cámara de 0,6 ml Monitor UV-900, con una célula de flujo de 10 mm Monitor pH/C-900 Bomba P-950 (bomba para muestras) Software Unicom Versión 3.21 Columna: Amersham Biosciences C 10/10 Material de la columna: Q-Sepharose Fast Flow, Código no. 17-0510-01, Lote no. OD 06453 Volumen de la columna: 3 ml Buffer A: 20 mM Tris/HCI, pH 8,0, Lote-Nr. PL0746 Buffer B: 0,3 M NaCI en 20 mM Tris/HCI, pH 8,0, Lote-Nr. PL0747 Buffer C: 1 ,5 M NaCI en 20 mM Tris/HCI, pH 8,0, Lote-Nr. PL0748 Volumen Etapa Buffer Régimen de flujo 1 CV Equilibración 100% de buffer A 1,0 ml/min -28 ml Muestra de carga muestra 1 :10 en buffer A 1 ,0 ml/min ml Bomba de muestra 100% buffer A 1,0 ml/min de lavado 5 CV Muestra no adherida 100% buffer A 1,0 ml/min Comienzo del Fracciona100% buffer A 1 ,0 ml/min miento 6 CV Elución, gradiente lineal 0-100% buffer B 0,8 ml/min 2 CV Elución, isocrática 100 % buffer B 0,8 ml/min 2 CV Regeneración 100% buffer C 0,8 ml/min 0,5 CV Regeneración 100% buffer B 0,8 ml/min Interrupción del Fracciona100% buffer B 0,8 ml/min miento 5 CV Reequilibración 100% buffer A 1,0 ml/min Detección: 280 nm, 260 nm, 220 nm PH Conductividad Fraccionamiento: Fracciones de 1 ml 8.4 .3 Resultados 8.4.3.1 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8 Composición de la muestra: 1 mg de EP2001 (rhlFN-a2b) en 25 mM de fosfato de Na, NaCI 0,13 M y 0,3 mM de EDTA, pH 7,5 ± 0,2 Volumen de partida: 0,5 ml, diluido a 1 :10 en buffer A = 5 ml Flujo/lavado 9,3 ml Fecha de la corrida : 29-09-2004 Corrida no.: QS24 D39 (ver Tabla para el ejemplo 8.4.4.1) 8.4.3.2 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada A) Composición de la muestra: 2,5 mg EP2001 + 97,5 mg de AldehídoHES 10/0,4 (NZA256) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de sodio, pH 5,0 Volumen inicial: 2,5 ml, diluido a 1 :10 en buffer A = 25 ml Flujo/lavado: 44 ml Fecha de la corrida: 29-09-2004 Corrida no.: QS25 D56 (ver Tabla para el ejemplo 8.4.4.1 ) 8.4.3.3 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada B) Composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 97,5 mg de AldehídoHES 10/0,7 (NZA235A) en acetato de Na 0,1 , 20 mM de cianoborohidruro de Na, a pH 5,0 Volumen inicial: 2,5 ml, diluido a 1 :10 en buffer A = 25 ml Flujo/lavado: 41 ml - Fecha de la corrida: 30-09-2004 Corrida no.: QS26 D57 (ver Tabla para el ejemplo 8.4.4.1 8.4.3.4 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada C) Composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 292 mg de AldehídoHES 30/0,4 (NZA328) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de Na, a pH 5,0 Volumen inicial: 2,5 ml, diluido a 1 :10 in buffer A = 25 ml Flujo/lavado: 42 ml Fecha de la corrida: 30-09-2004 Corrida no.: QS27 D58 (ver Tabla para el ejemplo 8.4.4.1 ) 0 8.4.3.5 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada D) Composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 292 mg de AldehídoHES 30/0,7 (NZA329) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de Na, a pH 5,0 Volumen inicial: 2,5 ml, diluido a 1:10 en buffer A = 25 ml Flujo/lavado: 40 ml Fecha de la corrida: 30-09-2004 Corrida no.: QS28 D59 (ver Tabla para el ejemplo 8.4.4.1) 8.4.3.6 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada E) <- Composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 487 mg de AldehídoHES 50/0,4 (NZA303) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de Na, a pH 5,0 Volumen inicial: 2,7 ml, diluido a 1 :10 en buffer A = 27 ml Flujo/lavado: 50 ml Fecha de la corrida: 30-09-2004 Corrida no.: QS29 D60 (ver Tabla 8.4.4.1) 8.4.3.7 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada F) Composición de la muestra: 2,5 mg de EP2001 + 487 mg de AldehídoHES 50/0,7 (NZA309) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de Na, a pH 5,0 volumen de partida: 2,6 ml, diluido 1 :10 en buffer A = 26 ml flujo/lavado: 50 ml fecha de la corrida: 2004-09-30 corrida no.: QS30 D61 (ver Tabla 8.4.4.1 ) 8.4.3.8 Muestra de acuerdo con el ejemplo 8.3.2 (Entrada G) composición de la muestra: 1.7 mg EP2001 + 98 mg HES10/0.4 (Supramol Lot. 407B) en acetato de Na 0,1 M, 20 mM de cianoborohidruro de Na, pH 5,0 volumen inicial: 2,5 ml, diluido 1 :10 en buffer A = 25 ml flujo/lavado: 42 ml fecha de la corrida: 2004-10-01 corrida no.: QS31 D62 (ver Tabla por ejemplo 8.4.4.1 ) 8.4.4 Comparación de los resultados 8.4.4.1 Análisis SDS-PAGE de picos de elusión de IFN-alfa Tabla 1: Comparación de las áreas pico detectados a 280 nm durante cromatografía con Q-Sepharose de IFN-a HESilado (Tabla por ejemplo 8.4.4.1) * datas del análisis cuantitativo derivado de RP-HPLC-3 ?jemplo 9 Descripción del bioensayo de actividad antivirial de IFN alfa Descripción del Procedimiento de ?nsayo: Actividad antiviral de Interferon-alfa Después de pre-diluir los items de ensayo en el medio -decultivo de células, se prepararon diluciones seriadas por duplicado. En placas microtituladoras de 96 receptáculos, se agregó Interferon diluido en replicas cuadruplicadas por dilución- a células MDBK recientemente tripsinizadas (40.000 células por receptáculo) . Los ensayos se incubaron durante 24 horas a 37°C (volumen total por receptáculo: 150 µL (ejemplo 9.1) o 175 µl (ejemplo 9.2, 9.3, 9.4, 10)). Subsiguientemente, se agregaron 50 µL de solución de carga VSV diluida a cada receptáculo (excepto para los receptáculos de control positivo) lo cual dio como resultado una multiplicidad de infección de 0,1. Se incluyeron los controles siguientes en cada ensayo: 12 receptáculos que recibieron virus más medio de cultivo de células en lugar de Interferon (control negativo) y 12 receptáculos que recibieron medio de cultivo de células en lugar de ínterferon y virus (control positivo) . Los ensayos se incubaron durante 42 horas a 37°C. Al finalizar el período de incubación, se reemplazo el sobrenadante del cultivo de células de cada receptáculo con 50 µL de una solución de MTT (a menos de 2 mg/mL en medio de cultivo de células) . Las células se incubaron durante tres horas . El colorante de formazan color purpura formado por las células proliferantes se solubilizó mediante adición de una solución de 100 µL de isopropanol/HCl (isopropanol con 40 mM de HCl) a cada receptáculo. Subsiguientemente, se midieron los valores de absorbancia de las soluciones a 570/630 nm en un lector de placa microtituladora. La actividad proliferativa de células MDBK cultivadas en - presencia de Inferieron y VSV se calculó para cada dilución de ""Inferieron de la manera siguiente: ( (Absorbancia -media de cuatro receptáculos- tratados con Inferieron) - (Absorbancia media de control negativo) ) * 100 (Absorbancia media de control positivo) - (Absorbancia media de control negativo) Se determine la actividad antiviral de Interferon-alfa en cuatro ensayos separados para cada uno de los ítems de Ensayo. ?jemplo 9.1 Actividad antiviral de Intron A en relación al modelo NIH En todos los experimentos, se usó Intron A (IFN-alfa 2b, Schering-Plough) , calibrado contra NIH- estándar de rhIFN-alfa 2a (NIAID, NIH, Bethesda, USA, GxaOl-901-535) , como referencia lab interna. El NIH-estándar tenía una actividad específica de 9,000 Ul/ml. La referencia lab interna Intron A tenían actividad específica de 8,487,000 Ul/ml en el ensayo descrito en el ejemplo 9. La actividad proliferativa de Intron A en comparación con NIH estándar rhlFN-alfa 2a se muestra en la Figura 28. Ejemplo 9.2 Actividad antiviral de IFN-OC-H?S de incubación simulada en relación al material de partida no modificado Tal como se describió en el ejemplo 8.3.4, el IFN-alfa- HES incubado (descrito en ejemplo 8.3.2, entrada G) se usó como control de reacción. La actividad antiviral del material se comparó con la del material de partida no modificado para investigar la influencia del acoplamiento y el proceso de purificación sobre la bioactividad. La incubación simulada no afectó la bioactividad in vitro de IFN-alfa. En relación a la actividad in vitro de IFN-alfa-HES de incubación simulada en comparación con el material de partida IFN-alfa no modificado, se muestra en la Figura 29. ?jemplo 9.3 Actividad antiviral de conjugados IFN-alfa-H?S en relación a Intron A En el sistema de ensayo descrito en el Ejemplo 9, los conjugados (entradas A, B, C, D, E del ejemplo 8.3.2 purificado de acuerdo con el ejemplo 8.4), se ensayaron en comparación con el material de partida no modificado IFN-alfa, Intron A y Pegasys (Roche) . Se calculó la concentración CPE50 de los materiales. Todos los conjugados All IFN-alfa-HES detuvieron una actividad antiviral que fue sustancialmente superior a la de Pegasys . La actividad relativa in vitro de los conjugados IFN-alfa- HES en comparación con el material de partida IFN-alfa no modificado, Intron A y Pegasys se muestra en la Figura 30. ?jemplo 9.4 Actividad antiviral del conjugado IFN-alfa-H?S en comparación con Intron A En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 9, el conjugado IFN-alfa-HES del ejemplo - 8.3.4, purificado de acuerdo con el ejemplo 8.4, se ensayo en comparación con Intron A. Se calculó la concentración CPE50 de los materiales.

El- conjugado IFN-alfa-HES retuvo una elevada actividad antiviral de más del 25% en comparación con Intron A. La actividad relativa in vi tro de los conjugados IFN-alfa-HES en comparación con Intron A se muestra en la Figura 31. ?jemplo 9.5 Actividad antiviral del conjugado IFN-alfa-H?S en comparción con Intron A En el sistema de ensayo descrito en el ejemplo 9, los conjugados IFN-alfa-HES del ejemplo 8.3.3, purificado de acuerdo con el ejemplo 8.4, se ensayaron en comparación con Intron A y Peglntron. Se calculó la concentración CPE50 de los materiales. Los conjugados de IFN-alfa-HES retuvieron una Actividad antiviral de aproximadamente 25% en comparción con Intron A, que está al mismo nivel que la actividad in vitro de Peglntron. La actividad relativa in vi tro de los conjugados de IFN- alfa-HES en comparación con Intron A se muestra en la Figura 38. Ejemplo 10 Bioactividad in vivo de los conjugados IFN-alfa-H?S (estudio PK en ratones) ?jemplo lO.lInfluencia del suero de ratón sobre el sistema de ensayo tal como se describió en el ejemplo 9 Se prepararon diluciones de Interferon-alfa en medio de cultivo de células (control) , y el suero de ratón (dilución 1:40 y dilución 1:80). El ensayo se llevó a cabo tal como se describió en el ejemplo 9. Se determinó la actividad antiviral del Interferon-alfa en dos ensayos separados para el control, para suero de ratón diluido a 1:40 así como también para suero de ratón diluido a 1:80. Los resultados indicaron que el suero de ratón a una dilución de 1:40 y a 1:80 no acepta el bioensayo para la actividad antiviral del Interferon-alfa. Ejemplo 10.2 ?studio in vivo en ratones (I) Se ensayó la actividad antiviral de suero reunido en un ensayo antiviral. Se recogió el suero de dos ratones (ratones BALB/c hembra, de una edad de 8 semanas) , cada vez, que fueron sacrificados a las 2h, 4h, 12h, y 24h post-inyección i.v. de 30µg/kg (en base al contenido de proteína) de IFN-alfa o de conjugado de IFN-alfa-HES. Las muestras de suero fueron descongeladas y se homogeneizaron cuidadosamente mediante agitación de remolino (y se diluyeron) . Se prepararon diluciones cerradas por duplicado en un medio de cultivo de células . Un frasco de Intron A (diluido) , se descongeló y se homogeneizó cuidadosamente --por, agitación de remolino . Se prepararon diluciones seriadas. por duplicado en un medio de cultivo de células . Las diluciones de CE-50^ en el ensayo CPE se determinaron a ^partir de las curvas de respuesta a la dosis de series de dilución 1:2 tan como se describió en el ejemplo 9. La vida media de los materiales se determinó en comparación con el material de partida no modificado en Pegasys . La vida media se calculó a partir de un gráfico semi-logarítmico de la dilución de CE-50 vs . tiempo de postinyección. La actividad antiviral se detectó para (i) IFN-alfa-HES (ejemplo 8.3.2, entrada B de la Tabla), (ii) IFN-alfa-HES (ejemplo 8.3.2, entrada D de la tabla), (iii) IFN-alfa-HES (ejemplo 8.3.4) hasta 24 horas. Tal como puede observarse en la Figura 32, la vida media que se incrementó desde (i) (aproximadamente 3 horas) con respecto a (ii) (aproximadamente 5 horas) hasta (iii) (aproximadamente 7 horas) . Para IFN-alfa no modificado, la Actividad antiviral del suero fue demasiado baja para calcular una vida media en el suero. En K. R. Reddy et al . Advaced Drug Delivery Reviews 54 (2002) 571-586 se determinó una vida media en el suero de IFN- alfa en ratas (i.v.) de 2 horas. Ejemplo 10.3 ?studio In vivo en ratones (II) Se ensayó en el ensayo antiviral la Actividad antiviral del suero reunido. Se recogió suero de dos ratones (ratones BALB/c hembra, de una edad de 8 semanas) cada vez, los cuales fueron sacrificados a las 2h, 4h, 12h, y 24h post inyección i.v. de 30µg/kg (en base al contenido de proteínas) de IFN-alfa o del conjugado de IFN-alfa-HES. Las muestras de suero se descongelaron y se homogeneizaron cuidadosamente por agitación con remolino (y se diluyeron) . Se separaron diluciones seriadas por duplicado en el medio de cultivo de células. Un frasco de Intron A (diluido) se descongeló y se homogeneizó cuidadosamente por agitación con remolino. Se prepararon diluciones seriadas por duplicado en un medio de cultivo de células . Las diluciones de CE-50 en en ensayo CPE se determinaron a partir de las curvas de respuesta a la dosis de una serie de dilución de 1:2 tal como se describió en el ejemplo 9. La vida media de los materiales se determinó en comparación con el material de partida no modificado y Pegasys. La vida media se calculó a partir de un gráfico semi- logarítmico de la dilución CE-50 vs . tiempo de post inyección. La actividad antiviral se detectó para (i) Peglntron, (ii) IFN- lfa-HES 30/0.8 (ejemplo 8.3.3.1) y (iii) IFN-alfa- HES 100/0.7 (ejemplo 8.3.3.2) hasta 24 horas. Tal como puede observarse en la Figura 37, la vida media se incrementó desde (i) (aproximadamente 3,6 h) hasta (ii) y (iii) (aproximadamente 6,5 y 6,8 horas) . ?jemplo 11 Bioactividad In vivo de los conjugados de iFN-alfa-H?S (?studio de PK en conejos) ?jemplo 11.1 Rotulación radioactiva de IFN-alfa y de los conjugados de IFN-alfa-HES Las muestras usadas para el estudio de PK se rotularon con 125I con el método de Cloramina T. La Cloramina T se hizo reaccionar con ioduro y se formó una especie de interhalógeno (I-Cl) . El interhalógeno reacciona en el anillo aromático de Tirosina y la sustituye en la posición o- . ?jemplo 11.2 Experimento de referencia: Rotulación de oxo-HES 50/0.4 con a25I En una primera serie experimental bajo condiciones de reacción determinadas, se investigó si podían detectarse cantidades vestigiales de yodo, por ejemplo con yodo, poliyodo o poliyoduro formadores de complejos con HES. En comparación, los oxo-HES (MW 42.1 kD DS = 0.41) y IFN-alfa-HES (ejemplo 8.3.2, entrada E de la tabla) se rotularon bajo las mismas condiciones y después de un proceso de purificación, se midió la radioactividad en las muestras . De acuerdo con la literatura, la amilopectina puede formar complejos con yodo, poliyodo o poliyoduro, cuando las estructuras helicoidales tienen por lo menos 11 unidades anhidroglucosa. Únicamente en la muestra de- IFN-alfa-HES, se detectó radioactividad. Este resultado demuestra que la radioactividad fue exclusivamente causada por la modificación covalente de los residuos tirosina en IFN-alfa pero no por yodo potencialmente adherido físicamente, que no fue removido en el proceso de purificación. oxo-HES 50/0.4 (MW = 42,1 kD, DS = 0,41) puede considerarse como control negativo. Debido al alto peso molecular y al bajo grado de sustitución en esta especie oxo-HES, se esperarían estructuras helicoidales más largas si hubiera alguna presente, y por lo tanto, en este caso, se correría el riesgo más alto de complejación del yodo.. ?jemplo 11.3 Rotulación de Interferon-alfa con yodo no radioactivo ("yodación en frió") Se rotuló el Interferon alfa con yodo no radioactivo en el mismo proceso de rotulación y purificación que los conjugados de IFN-alfa-HES- 50/0.4. En el ensayo antiviral, se retuvo la actividad antiviral. Sin embargo, no se llevó a cabo ninguna cuantificación, debido a que en el proceso de rotulación y purificación, se cambió la concentración, y no pudo determinarse debido a la pequeña cantidad de materiales disponibles . ?jemplo 11.4 Rotulación radioactiva de conjugados de IFN-alfa- H?S Se rotularon muestras de acuerdo con el ejemplo 11.1 con 12I radioactivo. Las muestras con el material de partida IFN- alfa, IFN-alfa-HES (ejemplo 8.3.2, entrada D de la tabla). Las muestras tenían una actividad específica de 38 µCi/µg (material de partida IFN-alfa) , 41 µCi/µg (IFN-alfa-HES 30/0.7). ?jemplo 11.5 ?studio de PK In vivo en conejos Ejemplo 11.5.1 Procedimiento experimental Se usaron ítems de ensayo como dilución. Se preparó una solución de 4 µCi/ml. El buffer de dilución fue PBS. Cuatro Conejos Blancos de Nueva Zelanza HsdIf:NZW. Fuente Harían Winkelmann GmbH, D-33178 Borchen, . Sexto: hembra; peso corporal al comienzo del studio: > 2.5 kg. Se habían aplicado a todos los animáis sustancias de ensayo radiorotuladas, recibiendo un volumen de 1 ml/kg de peso corporal, que es equivalente a una dosis de 4 µci/kg de peso corporal. Se extrajeron muestras de sangre en puntos de tiempo definidos. En cada punto de muestreo, se extrajeron para investigaciones posteriores aproximadamente 600 µl de sangre de la vena auricular de los animales .

Para la muestra de sangre, se introdujo un catéter intravenoso bajo anestesia general (Cetamina/Rompun) dentro de la vena auricular. La anestesia permaneció en el punto de muestra de la sangre antes de la aplicación, para la aplicación misma, y para las primeras tres muestras de sangre después de la aplicación (0,5 horas, 1 hora y 2 horas). Los catéteres se introdujeron en los animales para los puntos - de muestra posteriores hasta que fueron expulsados por los- mismos animales. Se determinaron otros muéstreos de sangre con una cánula a través de diferentes áreas de las venas auriculares.

Se llevaron a cabo procesos adicionales en las muestras de sangre después del muestreo de" .sangre. Para determinar el item de ensayo radiorotulado en la sangre, las muestras de sangre recogidas se procesaron de acuerdo con un protocolo de solubilización específica. Para esto, se transfirieron 250 µl de muestras de sangre a un nuevo frasco, y se agregó un volumen igual de Solvable™. Las muestras se incubaron durante una hora a 50°C en un baño de agua bajo agitación. Después del tiempo de incubación las muestras se enfriaron a temperatura ambiente, y se agregaron 100 µl de solución de EDTA [100 mM] . Se agregaron subsiguientemente 300 µl de H202 [30%] y después de agitar nuevamente las muestras se incubaron durante una hora a 50°C en un baño de agua bajo agitación. Antes de continuar con el proceso, se recogieron muestras.

Al finalizar la recolección y solubilización de sangre, las muestras fueron transferidas a un frasco de centelleo de 20 ml, y se agregaron 10 ml de un cocktail de centelleo Ultima Gold™. Hasta la medición del isótopo 125I en un contra- centelleo (aproximadamente 72 horas después de la adición del cocktel) las muestras se almacenaron en la oscuridad a 2-8°C.

Antes del procesamiento y análisis estadístico de los datos, se determinó el apagado de la detección de actividad bajo condiciones experimentales específicas. El coeficiente de regresión (r2 = 0.9970) es una medida del ajuste a la línea. El factor de apagado [pCi/cpm] se halló fuera de 3.315938. Resultados (ver Figura 33): La IFN-alfa-HES mostró una clara prolongación de la vida media en comparación con el material de partida. Después de 24 horas (aproximadamente < 1000 pCi/ml) la curva del material no modificado nivelo y no se observó casi ninguna disminución de la actividad. La pequeña desviación standard de la radioactividad medida para todas las muestras se muestra la calidad del experimento . Se calculó la vida media de la concentración de IFN-alfa en muestras de sangre. Para la evaluación que se muestra en la Figura 34, únicamente se consideraron los datos de las muestras de sangre tomados entre las 4 y 24 horas. Para el material no modificado se calculó una vida media de 7 horas. Con IFN-alfa-HES, se observó un sustancial aumento de la vida media (aproximadamente 33 horas) . Se evaluaron estadísticamente los datos de acuerdo con diferentes modelos de compartimiento tal como se muestran en los diagramas en la Figura 35 a y b (corte 0-12 horas) . En el modelo de un compartimiento, es obvio que las concentraciones de IFN-alfa bajaron rápidamente durante las primeras 2 horas después de la inyección. Para IFN-alfa-HES, la vida media se prolongó claramente. La vida media estadísticamente calculada fue de 0,26 hora para IFN-alfa, 7,7 horas para IFN-alfa-HES . Es seguido de acuerdo con el modelo no compartimental, la evaluación estadística da como resultado una vida media de 147 horas para IFN-alfa no modificado (en base a los datos de 24-120 horas), 42,7 horas para IFN-alfa-HES (en base a los datos de 36-120 horas) . Tal como se describió anteriormente, la vida media de IFN-alfa no modificado se prolongó sustancialmente debido a que la curva se mide lo más allá de las 24 horas.

La vida media de las dos muestras se resume en la tabla siguiente en base a los modelos descritos para el cálculo.

Tabla del ejemplo 11.5.1: Vida media de IFN-alfa y IFN-alfa-H?S calculada de acuerdo con modelos diferentes Material de partida IFN-alfa-HES de IFN-alfa modelo no compartimental (147.0*) 42.7* un modelo compartimental 0.26 " 7.7 gráfico semi logarítmico 7 " 33 (ver fig.33, 4-24 horas) * datos evaluados a las 24-120 horas, ** datos evaluados a las 36-120 horas Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (58)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para preparar un conjugado que comprende una proteína y un polímero, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo, caracterizado porque comprende administrar (a) (1) introducir por lo menos un grupo aldehido en el polímero mediante una reacción de oxidación de cierre de anillo, o (a) (2) hacer reaccionar "el polímero con por lo menos un compuesto bifuncional, donde dicho compuesto comprende dos grupos funcionales M y Q, donde un grupo funcional M se hace reaccionar con el polímero y el grupo funcional Q es (i) un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal ; o (ii) es un grupo funcional químicamente modificado para proporcionar el derivado polimérico aldehido o ceto o hemiacetal funcionales; y (b) ligar covalentemente el por lo menos un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal del polímero o del derivado del mismo, con por lo menos un grupo amino de la proteína por afinación reductora. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el almidón de hidroxialquilo es almidón de hidroxietilo.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el almidón de hidroxietilo tiene un peso molecular de desde 2 a 200 kD, preferiblemente de ^ desde 4 a 130 kD, más preferiblemente de desde 4 a 70 kD.
4. 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la aminación reductora se lleva a cabo, eñ un medio acuoso .
5. 5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la aminación reductora se lleva a cabo en presencia de NaCNBH3.
6. 6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la afinación reductora se lleva a cabo a un pH de 7,5, preferiblemente 7 o menos .
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el pH es 6 o menos.
8. 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la aminación reductora se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 25°C.
9. 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en (a) (1) , el polímero se somete a una reacción de oxidación con apertura de anillo usando un periodato para proporcionar un derivado polimérico que tiene por lo menos un grupo aldehido.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la reacción de oxidación con apertura de anillo se lleva a cabo en un medio acuoso.
11. 11. El conjugado de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizado porque la reacción se oxidación con apertura de anillo se lleva a cabo a una temperatura de desde 0 a 5°C.
12. 12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque el polímero se emplea con su extremo reductor en forma no oxidada.
13. 13. El método - de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en (a) (2) (i) , el grupo M funcional es un grupo carboxi o. un grupo carboxi reactivo, y el grupo Q funcional es un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal .
14. 14. El método de conformi ad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el compuesto bifuncional que comprende M y Q está seleccionado del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico, éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-formilbenzoico, y ácido 4- (4-formil-3 , 5-dimetoxifenoxi)butírico.
15. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en (a) (2) (ii) , el grupo M funcional es un grupo amino y el grupo Q funcional es un grupo amino .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el compuesto que comprende dos " grupos amino M y Q es un diaminoalcano opcionalmente sustituido que tiene de 2 a 20 átomos de carbono.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el diaminoalcano está seleccionado del grupo que consiste en 1, 2-diaminoetano, 1, 3-diaminopropano, y l.,.4-diaminobutano.
18. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizado porque comprende, adicionalmente, hacer reaccionar el derivado polimérico, resultante de la reacción del polímero con el por lo menos un compuesto bifuncional que comprende dos grupos amino M y Q, en el grupo amino Q con un compuesto bifuncional adicional que comprende un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo y un grupo aldehido o un grupo ceto o un hemiacetal para proporcionar un derivado polimérico que tiene un grupo aldehido o un grupo ceto o un hemiacetal .
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el compuesto bifuncional adicional está seleccionado del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico, éster de N-hidroxisuccimida de ácido 4-formilbenzoico, y ácido 4- (4- formil-3 , 5-dimetoxifenoxi) utírico .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el grupo amino Q del compuesto que comprende dos grupos amino M y Q, es un grupo beta hidroxi amino .
21. 21. El 'método de conformidad con la reivindicación "20, caracterizado porque el grupo beta hidroxiamino está oxidado para proporcionar un grupo aldehido.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20 o 21, caracterizado porque el compuesto que comprende dos grupos amino M y Q, donde Q es un grupo beta hidroxi amino, es.1,3- diamino-2-hidroxipropano .
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque la reacción de oxidación se lleva a cabo usando un periodato.
24. 24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, caracterizado porque la proteína está seleccionada del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3 , mioglobina, SOD, y BSA, preferiblemente del grupo que consiste en rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhlFN beta, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3 , mioglobina, SOD, y BSA, o del grupo que consiste en AlAT, factor VII, factor VIII, factor IX, tPA, y APC.
25. 25. Un conjugado caracterizado porque comprende una proteíná y un polímero, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
26. 26. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polímero o el derivado del mismo está predominantemente acoplado al grupo amino N-terminal de la proteína a través de un enlace azometina y/o amino, y la proteína usada para la reacción comprende el grupo amino N- terminal y por lo menos un grupo amino adicional, preferiblemente un grupo lisina adicional.
27. 27. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, caracterizado porque el polímero empleado comprende por lo menos un grupo aldehido introducido en el polímero mediante una reacción de oxidación por apertura de anillo, que comprende al menos una estructura de acuerdo con la fórmula donde Ri es hidrógeno o un grupo hidroxialguilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de 2 a 10 átomos de carbono.
28. 28. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado porque la proteína está ligada covalentemente al derivado polimérico a través de un enlace azometina y/o amino, siendo dicho derivado resultante de la reacción del polímero con el compuesto que comprende dos grupos amino M y Q a través del grupo funcional M, y donde el compuesto resultante a reaccionado adicionalmente a través de Q con un compuesto bifuncional adicional que comprende un grupo carboxi o un- grupo carboxi reactivo, y un grupo aldehido o un grupo cetcr ó un grupo hemiacetal, donde dicho grupo carboxi o grupo carboxi reactivo formador de un enlace de amida con el grupo amino Q, y dicho grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal ha reaccionado con el- grupo amino de la proteína por aminación reductora.
29. 29. El conjugado de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el compuesto bifuncional adicional que comprende un grupo carboxi o un grupo carboxi reactivo y un grupo aldehido o un grupo ceto o un grupo hemiacetal está seleccionado del grupo que consiste en ácido formilbenzoico, éster pentafluorfenílico de ácido 4-formilbenzoico, éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-formilbenzoico, y ácido 4- (4-formil-3, 5-dimetoxifenoxi) butírico .
30. 30. El conjugado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porgue tiene la estructura en el caso en el que el polímero reacciona con su extremo reductor oxidado, Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, y n = 2, 3, o 4, donde R4 es independientemente hidrógeno o un grupo metoxi, y m = 0 en el caso en el que R es hidrógeno y m = 1 en el caso en el que R4 es metoxi .
31. 31. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado porque la proteína está ligada covalentemente al derivado polimérico a través de un enlace azometina y/o amino, donde dicho derivado resultante de la reacción del polímero con el compuesto comprende dos grupos amino M y Q, donde Q es un grupo beta hidroxi amino, y oxidación del grupo Q beta hidroxiamino para proporcionar un grupo aldehido .
32. 32. El conjugado de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porgue el compuesto que comprende dos grupos amino M y Q, donde Q es un grupo beta hidroxi amino, es 1,3-diamino-2-hidroxipropano .
33. 33. El conjugado de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque tiene la estructura en el caso en el que el polímero se hace reaccionar con su extremo reductor oxidado, Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo.
34. 34. El conjugado de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 25 a 33, caracterizado porque la .~proteína está seleccionada del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3 , mioglobina, SOD,- y -BSA.
35. 35. El conjugado de conformidad con cualquiera " de las reivindicaciones 25 a 33, caracterizado porque la proteína está seleccionad del grupo que consiste en rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, mioglobina, SOD, y BSA.
36. 36. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 33, caracterizado porque la proteína está seleccionada del grupo que consiste en AlAT, factor VII, factor VIII, factor IX, tPA, y APC.
37. 37. Un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado porque se usa en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal .
38. 38. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende en una cantidad terapéuticamente eficaz un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
39. 39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende además por lo menos un diluyente aditivo o portador farmacéuticamente aceptable. " ~- -..
40. 40. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es EPO y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes anémicas o desórdenes de disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas con los mismos .
41. 41. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es G-CSF y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un desorden caracterizado por una función hematopoyética o inmunitaria reducida, donde dicho desorden es preferiblemente el resultado de quimioterapia, terapia de radiación, enfermedades infecciosas, neutropenia crónica severa, o leucemia..
42. 42. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es AT III y el polímero es HAS,' preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de deficiencias hereditarias, enfermedades veno-oclusivas, quemaduras y resistencia a la heparina en cirugía de inserto de bypass arterial coronario (CABG) , prevención de formaciones de micro-coágulos asociados con terapia de ventilación, tratamiento de perforación intestinal resultante de trauma o cirugía gastrointestinal; coagulación intravascular diseminada (DIC) y/o sepsis.
43. 43. Uso de un conjugado de conformidad con cualguiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es el Factor VIII y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A.
44. 44. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es AlAT y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfisema, fibrosis cística, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar crónica obstructiva (COPD) y/o bronquitis.
45. 45. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde -la proteína es tPA y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infartos de miocardio (ataques cardíacos) , trombosis, tromboembolismo o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas.
46. 46. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es APC y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de sepsis severa, trombosis, tromboembolismo o enfermedades oclusivas, especialmente enfermedades arteriales oclusivas .
47. 47. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es IFN alfa y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia, por ejemplo tricoleucemia, leucemia mielogena crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis, por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica.
48. 48. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 54, o un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es IFN beta y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente forma recurrente de esclerosis múltiple.
49. 49. Un conjugado caracterizado porque comprende almidón de hidroxialquilo y una proteína, donde el almidón de hidroxialquilo está acoplado con su extremo reductor oxidado a través de un enlace amida a un primer compuesto de entrecruzamiento, donde dicho compuesto de entrecruzamiento está adicionalmente ligado a través de un enlace amida a un segundo compuesto de entrecruzamiento, dicho segundo compuesto de entrecruzamiento está ligado a través de un enlace azometina y/o amino a una proteína, donde el primer compuesto de entrecruzamiento se emplea preferiblemente como un compuesto diamino funcionarizado y el segundo compuesto de entrecruzamiento se emplea preferiblemente como un carboxi y aldehido o ceto o hemiacetal, más preferiblemente como un compuesto carboxi y aldehido funcionalizado.
50. 50. Un conjugado, caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo (HAS) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula Protcipa donde Rl7 R2 y R son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene de 1, preferiblemente de 2 a 10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde L es un residuo hidrocarbonado lineal, ramificado y/o cíclico opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente por lo menos un heteroátomo, que tiene de 1 a 60 preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 6 más preferiblemente de 1 a 2 átomos de carbono y especialmente preferiblemente 1 átomo de carbono, donde L es en particular CH2.
51. 51. Un conjugado, caracterizado porque comprende una proteína y un polímero o un derivado del mismo, donde el polímero es un almidón de hidroxialquilo (HAS) , que tiene la estructura de acuerdo con la fórmula Protoina en la cual Ri, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiarilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene desde 1, preferiblemente desde 2 a .10 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno o un "grupo hidroxialquilo, más preferiblemente hidrógeno o un grupo hidroxietilo, y donde Li y L2 son independientemente un residuo hidrocarbonado, lineal, ramificado y/o cíclico, opcionalmente sustituido, que comprende opcionalmente por lo menos un heteroátomo, que comprende, una porción alquilo, arilo, aralquilo, heteroalquilo y/o heteroaralquilo, donde dicho residuo tiene de 1 a 60 preferiblemente de 1 a 40, más preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10 átomos de carbono, y donde D es un enlace, preferiblemente un enlace covalente que se formó mediante un grupo F2 funcional apropiado ligado a La y un grupo funcional apropiado F3 ligado a L2.
52. 52. El conjugado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque La es -(CH2)n- donde n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, preferiblemente 2, 3, 4, 5, 6, más preferiblemente 2, 3, 4 y especialmente preferiblemente 4.
53. 53. El conjugado de conformidad con la reivindicación 51 o 52, -.caracterizado porgue ~L2 comprende una porción arilo opcionalmente apropiadamente sustituida, preferiblemente una porción arilo que contiene 6 átomos de carbono, donde L2 es especialmente preferiblemente C6H .
54. 54. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53, caracterizado porque F2 está seleccionado del grupo que consiste en - dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces aromáticos C-C; el grupo tio o los grupos hidroxi; hidrazida de ácido alquil sulfónico, hidrazida de ácido aril sulfónico; - 1,2-dioles; 1,2 amino-tioalcoholes; azidas; 1, 2-aminoalcoholes; el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tal como grupos aminoalquilo, grupos aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilaminos; el grupo hidroxilamino -0-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tal como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hi roxilaralgu.ilamino o grupos hidroxilalcarilamino; grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxia ino o'" grupos alcariloxiamino, -donde cada uno comprende la unidad estructural -NH-0-; ~-"' ..-- - residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M, donde G es O o S, y M es, por ejemplo, — -OH o -SH; — un grupo alcoxi, un grupo ariloxi, un grupo aralquiloxi o un grupo alcariloxi; — un grupo alguiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio, o un grupo alcariltio; — un grupo alquilcarboniloxi, un grupo arilcarboniloxi, un grupo aralquilcarboniloxi, un grupo alcari1carboniloxi ; — esteres activados tales como esteres de hidroxilaminas que tienen una estructura imida tal como N-hidroxisuccinimida o que tienen una unidad estructural O-N donde N forma parte de un compuesto heteroarilo o, con G = 0 y Q ausente, tal como compuestos ariloxi con un residuo arilo sustituido tal como pentafluorfenilo, paranitrofenilo o triclorofenilo; donde Q está ausente o NH o un heteroátomo tal como S u 0; -NH-NH2, o -NH-NH-; - -N02 ; el grupo nitrilo; grupos carbonilo tales como el grupo aldheído o el grupo ceto; el grupo carboxi; - el grupo -N=C=0 o el grupo -N=C=S; grupos de haluro de vinilo tales como yoduro de vinilo o el grupo bromuro de vinilo o triflato; -C=C-H; -(C=NH2Cl)-0 alquilo; - grupos - (C=0) -CH2-Hal donde Hal es Cl, Br, o I; -CH=CH-S02-; un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S- el grupo >Í y ^ el grupo 02N A y? NO2 y donde F3 es un grupo funcional capaz de formar un enlace químico con F2 y preferiblemente está seleccionado del grupo antes mencionado, F2 comprende preferiblemente la porción -NH-, más preferiblemente comprende un grupo amino, F3 comprende preferiblemente la porción -(C=G)-, más preferiblemente -(C=0)-, más preferiblemente la porción - 5 (C=G)-G-, y aún más preferiblemente -(C=0)-G-, y especialmente preferiblemente -(C=0)-0, donde D es particularmente preferiblemente un enlace amida.
55. 55. El conjugado de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque tiene una estructura de acuerdo con 0 la fórmula n = 2, 3, o 4, donde R4 es independientemente hidrógeno o un grupo metoxi, y m = 0 en el caso en el que R4 es hidrógeno y m = 1 en el caso en el que R4 es metoxi .
56. 56. Un conjugado, que comprende una proteína y un 0 polímero o un derivado del mismo, caracterizado porque el polímero es un almidón de hidroxialquilo (HAS) , que tiene una estructura de acuerdo con la fórmula HAS" -N H Proteífia ¿r en la cual el átomo de carbono de la porción -CH2-NH- derivada de un grupo aldehido que fue introducido en el polímero mediante una reacción de oxidación por apertura de anillo, y donde el átomo de nitrógeno deriva del grupo amino de la proteína.
57. 57. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 71, caracterizado porque el almidón de hidroxialquilo es almidón de hidroxietilo.
58. 58. El conjugado de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el almidón de hidroxietilo tiene un peso molecular de desde 2 a 200 kD, preferiblemente de desde 4 a 130' kD, y más preferiblemente desde 4 a 70 kD. 5 . El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 • a 58, caracterizado porque la proteína está seleccionada del grupo que consiste en EPO, G-CSF, IFN alfa, IFN beta, AT III, IL-2, IL-3 , mioglobina, SOD, y BSA, preferiblemente del grupo que consiste en rhEPO, rhG-CSF, rhIFN alfa, rhIFN beta, rhAT III, rhIL-2, rhIL-3, mioglobina, SOD, y BSA, y/o del grupo que consiste en AlAT, factor VII, factor VIII, factor IX, tPA, y APC. 60. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es el Factor VII y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores del Factor VIII o Factor IX. 61. Uso de un conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 36 o 49 a 58, o de un conjugado, obtenible por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la proteína es Factor IX y el polímero es HAS, preferiblemente HES, para la preparación de un medicamento para el control y prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B, preferiblemente deficiencia congénita del factor IX o enfermedad de Christmas, incluyendo control de prevención del sangrado en casos quirúrgicos .