ES2399003T3 - Derivados de HIDROXIALQUILALMIDÓN y procedimientos para su preparación - Google Patents

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Abstract

Método para la preparación de un derivado de hidroxialquilalmidón, que comprende a. hacer reaccionar hidroxialquilalmidón (HAS) de4 fórmula (I) mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor del HAS con el grupo amino M de un compuesto dereticulación según la fórmula (II) en la que A es un grupo acetal o un grupo cetal; y L es un espaciador que forma un puente entre M y A, enla que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M, obteniéndose un derivado de HAS según la fórmula (III) en la que X es el grupo funcional que resulta de la reacción del grupo amino M con el HAS mediante elátomo de carbono C* del extremo reductor opcionalmente oxidado del HAS, yen la que HAS' es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón, y R1, R2 y R3 sonindependientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.

Description

Derivados de hidroxialquilalmidón y procedimientos para su preparación
La invención se refiere a un método para la preparación de un derivado de hidroxialquilalmidón que comprende hacer reaccionar hidroxialquilalmidón (HAS) mediante el extremo reductor opcionalmente oxidado del HAS con el grupo amino M de un compuesto de reticulación que, aparte del grupo amino, comprende un grupo carbonilo específicamente protegido, concretamente un grupo acetal o un grupo cetal. El método puede comprender además una reacción del derivado de HAS así obtenido con el grupo amino de un compuesto biológicamente activo mediante alquilación, preferiblemente mediante aminación reductora. Además, la invención se refiere a los derivados de HAS que pueden obtenerse mediante el procedimiento de la invención y un derivados de HAS específicos como tales. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los derivados de HAS que contienen el compuesto biológicamente activo, a esos derivados de HAS como agente terapéutico o profiláctico y al uso de derivados de HAS específicos para la preparación de medicamentos.
El hidroxialquilalmidón (HAS), en particular hidroxietilalmidón (HES), es un derivado sustituido de polímero de hidrato de carbono que se produce de manera natural, amilopectina, que está presente en almidón de maíz a una concentración de hasta el 95% en peso, y se degrada por alfa-amilasa en el organismo. HES, en particular, muestra propiedades biológicas ventajosas y se usa como agente de reemplazo de volumen sanguíneo y en terapia de hemodilución en las clínicas (Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; Weidler et al., 1991, Arzneimittelforschung/Drug Res., 41, 494-498).
En la técnica se describen algunas maneras de producción de un derivado de hidroxietilalmidón.
El documento DE 26 16 086 da a conocer la conjugación de hemoglobina a hidroxietilalmidón en la que, en una primera etapa, se une un agente de reticulación, por ejemplo bromociano, a hidroxietilalmidón y posteriormente se une hemoglobina al producto intermedio.
Un campo importante en el que se usa HES es la estabilización de polipéptidos que se aplican, por ejemplo, al sistema circulatorio con el fin de obtener un efecto fisiológico particular. Un ejemplo específico de estos polipéptidos es eritropoyetina, una glicoproteína ácida de aproximadamente 34.000 kDa que es esencial en la regulación del nivel de glóbulos rojos en la circulación.
Un problema bien conocido con la aplicación de polipéptidos y enzimas es que con frecuencia estas proteínas muestran una estabilidad insatisfactoria. Especialmente la eritropoyetina tiene una semivida en plasma relativamente corta (Spivak y Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718). Esto significa que se pierden rápidamente los niveles en plasma terapéuticos y deben llevarse a cabo administraciones intravenosas repetidas. Además, en determinadas circunstancias se observa una respuesta inmunitaria frente a los péptidos.
Generalmente se acepta que puede mejorarse la estabilidad de polipéptidos y se reduce la respuesta inmunitaria frente a estos polipéptidos cuando se acoplan los polipéptidos a moléculas poliméricas.
El documento WO 94/28024 da a conocer que polipéptidos fisiológicamente activos modificados con polietilenglicol (PEG) muestran una reducción de la inmunogenicidad y antigenicidad y circulan en el torrente sanguíneo durante considerablemente más tiempo que las proteínas no conjugadas, es decir, tienen una velocidad de aclaramiento más larga. Sin embargo, los conjugados de PEG-fármaco muestran diversas desventajas, por ejemplo, no muestran una estructura natural que pueda reconocerse por elementos de rutas de degradación in vivo. Por tanto, aparte de conjugados de PEG, se han producido otros conjugados y polimerizados de proteínas.
El documento WO 02/080979 da a conocer compuestos que comprenden un conjugado de un agente activo y un hidroxialquilalmidón en los que el agente activo y el hidroxialquilalmidón están unidos o bien directamente o bien mediante un compuesto de unión. En lo que se refiere a la unión directa, la reacción de agente activo e hidroxialquilalmidón se lleva a cabo en un medio acuoso que comprende al menos el 10% en peso de agua. No se proporcionan ejemplos que se refieran a un hidroxialquilalmidón unido a un compuesto de reticulación mediante un grupo amino de dicho compuesto de reticulación en los que el compuesto de reticulación contenga además un grupo carbonilo protegido. Adicionalmente, no se proporcionan ejemplos que muestren un derivado de HAS que se obtenga haciendo reaccionar dicho derivado de HAS mediante dicho grupo carbonilo con un grupo amino de un agente biológicamente activo.
El documento WO 03/074087 da a conocer conjugados de hidroxialquilalmidón-proteína en los que el enlace entre una molécula de hidroxialquilalmidón y una proteína es covalente y es el resultado de un acoplamiento de un grupo aldehído terminal del hidroxialquilalmidón o un grupo funcional que resultó de la reacción de dicho grupo aldehído con un grupo funcional de una proteína.
El documento WO 03/074088 da a conocer conjugados de hidroxialquilalmidón con un compuesto de bajo peso molecular en los que el enlace entre el hidroxialquilalmidón y el compuesto de bajo peso molecular es covalente y es el resultado de un acoplamiento de un grupo aldehído terminal del hidroxialquilalmidón o un grupo funcional que resultó de la reacción de dicho grupo aldehído con un grupo funcional de una proteína.
El documento WO 2005/014024 da a conocer polímeros funcionalizados mediante un grupo aminooxilo o un derivado de los mismos, conjugados, estando los polímeros funcionalizados covalentemente acoplados con una proteína mediante un grupo de unión oxima, un procedimiento para preparar los polímeros funcionalizados, un procedimiento para preparar los conjugados, polímeros funcionalizados tal como se obtienen mediante el procedimiento de la presente invención, conjugados tal como se obtienen mediante el procedimiento, y composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un conjugado y el uso de dichos conjugados y composiciones para la profilaxis o terapia del organismo humano o animal.
El documento WO 2005/092390 da a conocer conjugados de hidroxialquilalmidón y una proteína estando estos conjugados formados por una unión covalente entre el hidroxialquilalmidón o un derivado del hidroxialquilalmidón y la proteína y un método de producción de estos conjugados y el uso de estos conjugados.
El documento WO 2004/024777 da a conocer derivados de hidroxialquilalmidón, particularmente derivados de hidroxialquilalmidón que pueden obtenerse mediante un procedimiento en el que se hace reaccionar hidroxialquilalmidón con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de unión. Según una realización especialmente preferida, el documento WO 2004/024777 da a conocer derivados de hidroxialquilalmidón que pueden obtenerse mediante un procedimiento según el cual se hace reaccionar hidroxialquilalmidón con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de unión y se hace reaccionar el producto de reacción resultante con un polipéptido, preferiblemente con una glicoproteína y de manera especialmente preferible con eritropoyetina, mediante al menos otro grupo reactivo del compuesto de unión. Un hidroxialquilalmidón que se prefiere especialmente es hidroxietilalmidón. Según el documento WO 2004/024777, se hace reaccionar el hidroxialquilalmidón, y preferiblemente el hidroxietilalmidón, con el compuesto de unión en su extremo reductor que no se oxida antes de la reacción.
El documento WO 2004/024776 da a conocer derivados de hidroxialquilalmidón, particularmente derivados de hidroxialquilalmidón que pueden obtenerse mediante un procedimiento en el que se hace reaccionar hidroxialquilalmidón con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de reticulación o con dos compuestos de reticulación en los que el derivado de hidroxialquilalmidón resultante tiene al menos un grupo funcional X que puede hacerse reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional, y en los que este grupo Y del compuesto adicional es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, un grupo acetal o un grupo tio. Según una realización especialmente preferida, el documento WO 2004/024776 se refiere un derivados de hidroxialquilalmidón que pueden obtenerse mediante un procedimiento según el cual se hace reaccionar hidroxialquilalmidón con un grupo amino primario o secundario de un compuesto de reticulación, haciéndose reaccionar adicionalmente de manera opcional el producto de reacción resultante con un segundo compuesto de reticulación, en el que el derivado de hidroxialquilalmidón resultante tiene al menos un grupo funcional X que puede hacerse reaccionar con un grupo funcional Y de un compuesto adicional y en el que este grupo Y es un grupo aldehído, un grupo ceto, un grupo hemiacetal, un grupo acetal o un grupo tio, y se hace reaccionar el producto de reacción resultante con un polipéptido, preferiblemente con un polipéptido tal como AT III, IFN-beta o eritropoyetina, y de manera especialmente preferible con eritropoyetina, que comprende al menos uno de estos grupos funcionales
Y. Un hidroxialquilalmidón que se prefiere especialmente es hidroxietilalmidón. Según el documento WO 2004/024776, se hace reaccionar el hidroxialquilalmidón, y preferiblemente el hidroxietilalmidón, con el compuesto de unión en su extremo reductor que se oxida opcionalmente antes de la reacción.
El documento WO 2005/092928 da a conocer conjugados de hidroxialquilalmidón, preferiblemente hidroxietilalmidón, y una proteína, formándose estos conjugados por una reacción de aminación reductora entre al menos un grupo aldehído del hidroxialquilalmidón o de un derivado del hidroxialquilalmidón, y al menos un grupo amino de la proteína, de modo que el hidroxialquilalmidón o el derivado del mismo se une covalentemente a la proteína mediante una unión de azometina o una unión de aminometileno. El documento WO 2005/092928 también se refiere a un método de producción de estos conjugados y a usos específicos de los conjugados.
El documento US 2006/0194940 A1 da a conocer alcanales poliméricos solubles en agua. Entre otros, se dan a conocer reactivos de aldehído protegido que se hacen reaccionar con un polímero. Aunque se mencionan de manera genérica polisacáridos, polímeros especialmente preferidos son polietilenglicoles. No se dan a conocer almidones o, en particular, almidones modificados tales como hidroxialquilalmidones, en el documento US 2006/0194940 A1. Por consiguiente, el documento US 2006/0194940 A1 no contiene ninguna divulgación referente a maneras específicas de acoplar un compuesto de unión dado a hidroxialquilalmidón. Lo mismo se aplica a los documentos US 7.157.546 B2, EP 1 591 467 A1 y WO 2004/022630 A2.
El documento US 6.916.962 B2 da a conocer un compuesto de reticulación de aminoacetal en forma protegida y no protegida. Este documento no contiene ninguna divulgación referente a un posible acoplamiento de este compuesto de reticulación con polímeros distintos de polietilenglicoles. En particular, no se dan a conocer almidones, mucho menos almidones modificados tales como hidroxialquilalmidones, en el documento US 6.916.962 B2. Por consiguiente, el documento US 6.916.962 B2 no contiene divulgación referente a maneras específicas de acoplamiento de un compuesto de unión dado a hidroxialquilalmidón. Lo mismo se aplica a los documentos US
6.956.135 B2 y WO 03/049699 A2.
El documento US 5.990.237 da a conocer estructuras que contienen un grupo aldehído protegido. Se acoplan
5 compuestos que comprenden estas estructuras preferiblemente a polietilenglicol, y el acoplamiento se lleva a cabo mediante un haluro como grupo funcional comprendido en los compuestos que contienen grupo aldehído protegido, grupo haluro que reacciona con un grupo hidroxilo del polietilenglicol.
Un objeto de la presente invención es proporcionar un método novedoso para obtener derivados de 10 hidroxialquilalmidón.
Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar derivados de HAS novedosos tales como derivados de HAS obtenidos o que pueden obtenerse haciendo reaccionar HAS con compuestos de reticulación específicamente funcionalizados.
15 Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar derivados de HAS novedosos adicionales tales como derivados de HAS obtenidos o que pueden obtenerse haciendo reaccionar los derivados de HAS (obtenidos o que pueden obtenerse haciendo reaccionar HAS con compuestos de reticulación específicamente funcionalizados) con un grupo funcional adecuado de compuesto biológicamente activo.
20 Sorprendentemente, se encontró que es posible usar, para la preparación de derivados de HAS específicos, un compuesto de reticulación que, por un lado, puede acoplarse selectivamente al extremo reductor opcionalmente oxidado de un hidroxialquilalmidón mediante un grupo amino y, por otro lado, tiene (como segundo grupo funcional) un grupo carbonilo completamente protegido, concretamente un grupo acetal o un grupo cetal. En comparación con
25 realizaciones en las que se emplea un compuesto de reticulación que tiene un grupo aldehído o ceto libre o, por ejemplo, un grupo hemiacetal como grupo funcional, emplear un grupo completamente protegido de este tipo minimiza drásticamente el riesgo de que, durante la reacción de HAS con el compuesto de reticulación, tenga lugar oligomerización o polimerización indeseadas entre las moléculas de compuesto de reticulación. De manera inesperada, se encontró que la desprotección del grupo acetal o cetal comprendido en el derivado de HAS resultante
30 es posible sin destruir al menos parcialmente la estructura química específica del hidroxialquilalmidón, en particular el hidroxietilalmidón, que se caracteriza por numerosos grupos funcionales tales como grupos acetales y grupos éteres. Por tanto, la presente invención permite un método extremadamente eficaz de preparación de un primer derivado de HAS minimizando el riesgo de oligomerización o polimerización entre las moléculas de compuesto de reticulación individuales, combinado con la posibilidad de desproteger los grupos funcionales de los derivados de
35 HAS resultantes sin la destrucción al menos parcial de la estructura de HAS, con el fin de proporcionar un derivado de HAS que permite un acoplamiento eficaz con un compuesto biológicamente activo.
Por tanto, la presente invención se refiere a un método para la preparación de un derivado de hidroxialquilalmidón, que comprende
(i) hacer reaccionar hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
45 mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor del HAS con el grupo amino M de un compuesto de reticulación según la fórmula (II) M—L—A 50 en la que A es un grupo acetal o un grupo cetal; y L es un espaciador que forma un puente entre M y A, en la que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M, obteniendo un derivado de HAS según la fórmula (III) 55
en la que X es el grupo funcional que resulta de la reacción del grupo amino M con el HAS mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor opcionalmente oxidado del HAS, y
5 en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón, y R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
Además, la presente invención se refiere un derivado de hidroxialquilalmidón (HAS) que puede obtenerse u obtenido 10 mediante este método.
Además, la presente invención se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (III)
15 en la que A es un grupo acetal o cetal; L es un espaciador que forma un puente entre X y A;
en la que X es el grupo funcional que resulta de la reacción de un grupo amino M de un compuesto de reticulación de fórmula (II) 20 M—L—A
con hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
mediante el átomo de carbono C* del HAS, en la que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M,
en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son independientemente 30 hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
Hidroxialquilalmidón
En el contexto de la presente invención, el término “hidroxialquilalmidón” (HAS) se refiere a un derivado de almidón 35 que se ha sustituido con al menos un grupo hidroxialquilo. Un hidroxialquilalmidón preferido de la presente invención tiene una constitución según la fórmula (I’)
en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno, un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado o el grupo
-
[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-OH
en la que R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y grupo alquilo, preferiblemente hidrógeno y grupo metilo,
m es de 2 a 4, en el que los residuos R1 y R2 pueden ser iguales o diferentes en los m grupos CR1R2;
n es de 0 a 20, preferiblemente de 0 a 4;
o es de 2 a 20, preferiblemente de 2 a 4, en el que los residuos R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes en los o grupos CR3R4.
Preferiblemente, R1, R2 y R3 son independientemente un grupo -(CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6, y en particular, R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o 2-hidroxietilo.
En la fórmula (I) y (I’) el extremo reductor de la molécula de almidón se muestra en la forma no oxidada y la unidad de sacárido terminal de HAS se muestra en la forma de hemiacetal que, dependiendo por ejemplo del disolvente, puede estar en equilibrio con la forma de aldehído (libre). La abreviatura HAS’ tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a la molécula de HAS sin la unidad de sacárido terminal en el extremo reductor de la molécula de HAS. Esto es lo que significa el término “parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón” tal como se usa en el contexto de la presente invención.
El término “hidroxialquilalmidón” tal como se usa en la presente invención no se limita a compuestos en los que el resto hidrato de carbono terminal comprende grupos hidroxialquilo R1, R2 y/o R3 tal como se representan, por motivos de brevedad, en las fórmulas (I) y (I’), sino que también se refiere a compuestos en los que al menos un grupo hidroxilo que está presente en cualquier sitio, o bien en el resto hidrato de carbono terminal y/o bien en la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón, HAS’, está sustituido con un grupo hidroxialquilo R1, R2 y/o R3.
También es posible un hidroxialquilalmidón que comprende dos o más grupos hidroxialquilo diferentes.
El al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS puede contener uno o más, en particular dos o más, grupos hidroxilo. Según una realización preferida, el al menos un grupo hidroxialquilo comprendido en HAS contiene un grupo hidroxilo.
El término “hidroxialquilalmidón” también incluye derivados en los que el grupo alquilo está mono o polisustituido. En este contexto, se prefiere que el grupo alquilo esté sustituido con un halógeno, especialmente flúor, o con un grupo arilo. Además, el grupo hidroxilo de un grupo hidroxialquilo puede estar esterificado o eterificado.
Además, en vez de alquilo, también pueden usarse grupos alquenilo lineales o ramificados, sustituidos o no sustituidos.
El hidroxialquilalmidón es un derivado de éter de almidón. Además de dichos derivados de éter, también pueden usarse otros derivados de almidón en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, son útiles derivados que comprenden grupos hidroxilo esterificados. Estos derivados pueden ser por ejemplo derivados de ácidos mono o dicarboxílicos no sustituidos con 2-12 átomos de carbono o de derivados sustituidos de los mismos. Son especialmente útiles derivados de ácidos monocarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono, especialmente derivados de ácido acético. En este contexto, se prefieren acetilalmidón, butirilalmidón y propionilalmidón.
Además, se prefieren derivados de ácidos dicarboxílicos no sustituidos con 2-6 átomos de carbono.
En el caso de derivados de ácidos dicarboxílicos, es útil que el segundo grupo carboxilo del ácido dicarboxílico también esté esterificado. Además, derivados de ésteres monoalquílicos de ácidos dicarboxílicos también son adecuados en el contexto de la presente invención.
Para los ácidos mono o dicarboxílicos sustituidos, los grupos sustituyentes pueden ser preferiblemente los mismos que se mencionaron anteriormente para residuos alquilo sustituidos.
En la técnica se conocen técnicas para la esterificación de almidón (véase por ejemplo Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, Nueva York, especialmente el capítulo 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9).
Según una realización preferida de la presente invención, se emplea hidroxialquilalmidón según la fórmula (I) mencionada anteriormente. Las otras estructuras de anillo de sacárido comprendidas en HAS’ pueden ser las mismas que el, o diferentes al, anillo de sacárido descrito explícitamente, con la diferencia de que carecen de un extremo reductor.
En lo que se refiere a los residuos R1, R2 y R3 según la fórmula (I), no hay limitaciones específicas. Según una realización preferida, R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo, un grupo hidroxiaralquilo o un grupo hidroxialcarilo que tiene desde 2 hasta 10 átomos de carbono en el residuo alquilo respectivo. Se prefieren hidrógeno y grupos hidroxialquilo que tienen desde 2 hasta 10 átomos de carbono. Más preferiblemente, el grupo hidroxialquilo tiene desde 2 hasta 6 átomos de carbono, más preferiblemente desde 2 hasta 4 átomos de carbono, e incluso más preferiblemente desde 2 hasta 3 átomos de carbono. En una realización preferida, hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón en el que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo (CH2CHO)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
Por tanto, “hidroxialquilalmidón” comprende preferiblemente hidroxietilalmidón, hidroxipropilalmidón e hidroxibutilalmidón, en los que se prefieren particularmente hidroxietilalmidón e hidroxipropilalmidón y lo más preferido es hidroxietilalmidón.
El grupo alquilo, aralquilo y/o alcarilo puede ser lineal o ramificado y estar adecuadamente sustituido.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un derivado de HAS tal como se describió anteriormente en el que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado con desde 2 hasta 6 átomos de carbono.
Por tanto, R1, R2 y R3 pueden ser preferiblemente H, hidroxihexilo, hidroxipentilo, hidroxibutilo, hidroxipropilo tal como 2-hidroxipropilo, 3-hidroxipropilo, 1-hidroxiisopropilo, hidroxietilo tal como 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente hidrógeno y el grupo 2-hidroxietilo.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método y un derivado de HAS tal como se describió anteriormente en el que R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo 2-hidroxietilo, prefiriéndose especialmente una realización en la que al menos un residuo R1, R2 y R3 es 2-hidroxietilo.
Hidroxietilalmidón (HES) es lo más preferido para todas las realizaciones de la presente invención.
Por tanto, la presente invención se refiere al método y a un derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que el polímero es hidroxietilalmidón y el derivado es un derivado de hidroxietilalmidón (HES).
HAS, en particular HES, se caracteriza principalmente por la distribución de peso molecular, el grado de sustitución y la razón de sustitución C2:C6. Hay dos posibilidades para describir el grado de sustitución:
El grado de sustitución (GS) de HAS se describe en relación a la parte de monómeros de glucosa sustituidos con respecto a todos los restos glucosa.
El patrón de sustitución de HAS también puede describirse como la sustitución molar (MS), en la que se cuenta el número de grupos hidroxietilo por resto glucosa.
En el contexto de la presente invención, el patrón de sustitución de HAS, preferiblemente HES, se denomina MS, tal como se describió anteriormente (véase también Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278, en particular pág. 273).
MS se determina mediante cromatografía de gases tras la hidrólisis total de la molécula de HES. Se facilitan los valores de MS del material de partida de HAS respectivo, en particular HES. Se supone que el valor de MS no se ve afectado durante el procedimiento de derivatización en las etapas a) y b) del procedimiento de la invención.
Las disoluciones de HAS y en particular de HES están presentes como composiciones polidispersas, en las que cada molécula se diferencia de la otra con respecto al grado de polimerización, el número y el patrón de sitios de ramificación, y el patrón de sustitución. Por tanto, HAS y en particular HES es una mezcla de compuestos con
5 diferente peso molecular. Por consiguiente, una disolución particular de HAS, y en particular de HES, se determina por el peso molecular promedio con la ayuda de medios estadísticos. En este contexto, Mn se calcula como la media aritmética dependiendo del número de moléculas. Alternativamente, Mw (o MW), el peso molecular promedio en peso, representa una unidad que depende de la masa del HAS, en particular HES.
10 En este contexto el peso molecular promedio en número se define por la ecuación 1:
en la que ni es el número de moléculas de la especie i de masa molar Mi. M indica que el valor es un promedio, pero la línea normalmente se omite por convenio.
n
M es el peso molecular promedio en peso, definido por la ecuación 2:
w
en la que ni es el número de moléculas de la especie i de masa molar Mi.
M indica que el valor es un promedio, pero la línea normalmente se omite por convenio.
w
25 Preferiblemente, el hidroxialquilalmidón, en particular el hidroxietilalmidón, usado en la invención tiene un peso molecular medio (media en peso) de desde 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa. El hidroxietilalmidón puede mostrar además una sustitución molar preferida de desde
30 0,1 hasta 3, preferiblemente de 0,1 a 2, más preferido de 0,1 a 0,9 o de 0,4 a 2, preferiblemente de 0,4 a 1,3, y una razón preferida entre sustitución C2:C6 en el intervalo de desde 2 hasta 20 con respecto a los grupos hidroxietilo.
El término “peso molecular medio” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al peso tal como se determina según el método de LALLS-(dispersión de la luz de láser de ángulo pequeño)-GPC tal como se
35 describe en Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; y Weidler et al., 1991, Arzneim.Forschung/Drug Res., 41, 494-498. Para pesos moleculares medios de 10 kDa y menores, adicionalmente, se llevó a cabo la calibración con un patrón que se había cualificado previamente mediante LALLS-GPC.
Según una realización preferida de la presente invención, el peso molecular medio de hidroxietilalmidón empleado
40 es de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa.
45 Además, la sustitución molar de HAS y en particular HES es preferiblemente de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 3, preferiblemente aproximadamente 0,4 hasta aproximadamente 1,3, tal como de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3.
50 Un ejemplo de HES que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5 a 300 kDa, preferiblemente de 50 a 150 kDa es un HES con una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como de 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3.
En lo que se refiere a la razón de sustitución C2:C6, dicha sustitución está preferiblemente en el intervalo de desde 2 55 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
Otros almidones distintos de hidroxialquilalmidones
En general, los métodos de la presente invención también pueden llevarse a cabo, y los derivados de la presente invención también puede prepararse, usando otros almidones distintos de hidroxialquilalmidones, en particular hidroxietilalmidón tal como se describió anteriormente, con la condición de que esos almidones también contengan un extremo reductor que esté presente en la forma de hemiacetal, opcionalmente en equilibrio con la forma de aldehído (libre), extremo reductor que puede oxidarse adecuadamente para dar la forma oxidada respectiva. En particular, puede emplearse un producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido, es decir un almidón que tiene un grado de ramificación significativamente superior a la amilopectina y tiene el grado de ramificación alfa-1,6 de glicógeno, o incluso lo supera, y, si está sustituido, tiene una sustitución molar MS de tan sólo hasta 0,3, preferiblemente de desde 0,05 hasta 0,3. El término MS (sustitución molar) tal como se usa en el contexto de este producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido, significa el número promedio de grupos hidroxietilo o hidroxipropilo por unidad de anhidroglucosa. La MS se mide normalmente mediante determinación del contenido de grupos hidroxietilo o hidroxipropilo en una muestra y asignación computacional a las unidades de anhidroglucosa presentes en la misma. La MS también puede determinarse mediante cromatografía de gases. El grado de ramificación puede determinarse mediante un análisis de metilación por cromatografía de gases como % en moles de anhidroglucosas unidas de manera alfa-1,4,6-glicosídica en el polímero. El grado de ramificación es en cada caso un promedio porque el producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido de la invención es un compuesto polidisperso. Las unidades de glucosa en dicho producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido están unidas mediante uniones alfa-1,4 y alfa-1,6. El grado de ramificación significa la proporción de unidades de glucosa con uniones alfa-1,4,6 en % en moles de la totalidad de todas las anhidroglucosas. La razón de C2/C6 expresa la razón o sustitución en C-2 con respecto a aquella en C-6. El producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido tiene un grado de ramificación preferido de desde el 6% hasta el 50%, que puede lograrse mediante una etapa de transglucosidación con la ayuda de enzimas de ramificación. Incluso más preferiblemente, el grado de ramificación está en el intervalo de desde 10 hasta 45, más preferiblemente desde 20 hasta 40 tal como de 20, 25, 30, 35 ó 40. También se prefieren intervalos de desde más de 20 hasta 40, preferiblemente desde más de 20 hasta 30, tal como desde 21 hasta 40, preferiblemente desde 21 hasta 30. El material de partida que puede usarse para este fin es en principio cualquier almidón, pero preferiblemente almidones cerosos con una alta proporción de amilopectina o la propia fracción de amilopectina. El grado de ramificación que se necesita para el uso según la presente invención de los productos de almidón (en lo que se refiere a estos “otros almidones”) está en el intervalo de desde el 8% hasta el 20%, expresado como % en moles de anhidroglucosas. Esto significa que los productos de almidón que pueden usarse para los fines de la invención tienen en promedio una unión alfa-1,6, y por tanto un punto de ramificación, de cada 12,5 a cada 5 unidades de glucosa. Productos de almidón altamente ramificados, no sustituidos o poco sustituidos preferidos tienen un grado de ramificación de más del 10% y de hasta el 20% y en particular de desde el 11 hasta el 18%. Un grado de ramificación superior significa una mayor solubilidad de los productos de almidón de la invención y una mayor biodisponibilidad de estos productos de almidón disueltos en el organismo. Se proporciona preferencia particular a productos de almidón no modificados con un grado de ramificación de más del 10%, en particular de desde el 11% hasta el 18%. El producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido puede prepararse mediante ensamblaje enzimático dirigido usando las denominadas enzimas de ramificación o transferencia, cuando sea apropiado seguido por derivatización parcial de grupos hidroxilo libres con grupos hidroxietilo o hidroxipropilo. En vez de esto, es posible convertir un almidón hidroxietilado o hidroxipropilado mediante ensamblaje enzimático usando las denominadas enzimas de ramificación o transferencia en un producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido. La obtención de productos de almidón ramificados enzimáticamente a partir de almidón de trigo con un grado de ramificación de hasta el 10% se conoce en sí misma y se describe por ejemplo en el documento WO 00/66633 A. Se dan a conocer enzimas de ramificación o transferencia adecuadas y la obtención de las mismas en los documentos WO 00/18893 A, US 4.454.161, EP 0 418 945 A, JP 2001294601 A o US 2002/065410 A. Esta última publicación describe productos de almidón no modificados con grados de ramificación de más del 4% y de hasta el 10% o superiores. La transglicosilación enzimática puede llevarse a cabo de una manera conocida en sí misma, por ejemplo incubando almidón de maíz ceroso, almidón de patata obtenido de patatas que tienen un alto contenido en amilopectina, o almidón obtenido a partir de arroz, a partir de yuca, a partir de trigo, a partir de trigo que tiene un alto contenido en amilopectina, a partir de maíz, a partir de maíz que tiene un alto contenido en amilopectina, o a partir de maíz que tiene un alto contenido en amilosa, con las enzimas apropiadas en condiciones suaves a valores de pH de entre 6 y 8 y temperaturas de entre 25 y 40ºC en disolución acuosa. El peso molecular Mw significa, tal como se usa en el contexto de los productos de almidón altamente ramificados, no sustituidos o poco sustituidos, el peso molecular promedio en peso. Esto puede determinarse de una manera conocida en sí misma mediante diversos métodos, es decir, mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) o cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) junto con detección por dispersión de la luz y RI. La razón de C2/C6 preferida para almidones sustituidos está en el intervalo de desde 5 hasta 9. El alto grado de ramificación de los productos de almidón altamente ramificados, no sustituidos o poco sustituidos aumenta la solubilidad en agua de los mismos hasta un grado tal que puede obviarse total o sustancialmente la sustitución de hidroxietilo o hidroxipropilo con el fin de mantener el producto de almidón en disolución. El peso molecular promedio del producto de almidón altamente ramificado, no sustituido o poco sustituido puede aumentarse de una manera adecuada mediante el límite de permeabilidad del peritoneo. La variable característica que puede usarse en este caso también es el valor de GPC de la denominada fracción inferior BF90% (peso molecular al 90% del área de pico como una medida de la proporción de fracciones de moléculas menores). Puede lograrse una mayor eficacia de ultrafiltración (UF) mediante aumento apropiado del peso molecular con, al mismo tiempo, una absorción drásticamente reducida a través de la membrana peritoneal. Al mismo tiempo, ya no
5 se producen o ahora sólo se producen en un ligero grado fragmentos residuales de alto peso molecular que se producen mediante degradación por amilasa endógena, que ya no pueden degradarse adicionalmente por amilasa, y que se almacenan en órganos o tejidos.
Según la presente invención, se hace reaccionar hidroxialquilalmidón con un compuesto de reticulación M-L-A en el
10 que M es un grupo amino y A es un grupo acetal o un grupo cetal, estando separados el grupo M y el grupo L por un espaciador adecuado.
El grupo acetal o cetal A
15 En lo que se refiere al grupo acetal o al grupo cetal A, no existen limitaciones específicas. En el contexto de la presente invención, el término “grupo acetal” también comprende acetales de azufre y acetales de nitrógeno, y el término “grupo cetal” también comprende cetales de azufre y cetales de nitrógeno. Adicionalmente, en lo que se refiere al término “grupo acetal”, se excluyen explícitamente los hemiacetales, y en lo que se refiere al término “grupo cetal”, se excluyen explícitamente los hemicetales.
20 Según una realización preferida de la presente invención, el grupo A del compuesto de reticulación M-L-A es un residuo según la fórmula (IIa)
25 en la que Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en los que Rx es H o alquilo inferior tal como metilo, etilo o propilo tal como n-propilo o i-propilo, o C(O)-Ry en el que Ry se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y arilo C6-C14, incluso más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y terc-butilo opcionalmente sustituidos,
30 preferiblemente no sustituidos; siendo Rx preferiblemente H; A1 y A2 son cada uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb)
35 en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o (CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y en la que A3 es H o metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un anillo con el átomo de N del grupo amino M
o con un átomo adecuado comprendido en L. 40 Preferiblemente, al menos uno de Z1 y Z2 es O, más preferiblemente tanto Z1 como Z2 son O. En lo que se refiere al residuo A3, se prefieren grupos acetales según la presente invención, es decir A3 es preferiblemente H.
45 Si A es un grupo cetal, se prefiere que A3 sea metilo. Por tanto, grupos cetales A concebibles según la presente invención son, entre otros,o
Si A3 está formando, por ejemplo, un anillo o bien con el átomo de N del grupo amino M o bien con un átomo adecuado comprendido en L, compuestos de reticulación concebibles según la presente invención son, por ejemplo,
Un compuesto de reticulación especialmente preferido según la presente invención es
15 es decir, el grupo amino M es una amina secundaria, tanto Z1 como Z2 son O, y A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2-.
Según una realización preferida, A1 y A2 son cada uno metilo o etilo, incluso más preferiblemente etilo. Por tanto, un grupo acetal A particularmente preferido según la presente invención es -CH(OCH3)2 o -CH(OC2H5)2, en particular 20 -CH(OC2H5)2.
Según una realización adicional en la que A1 y A2 están formando un anillo según la fórmula (IIb), A1 y A2, tomados juntos, son preferiblemente -(CH2)2-. En lo que se refiere a esta realización, grupos acetales A particularmente preferidos según la presente invención son
El grupo amino M
30 En lo que se refiere al grupo amino M, no existen restricciones particulares con la condición de que el grupo amino pueda hacerse reaccionar con el extremo reductor o bien oxidado o bien no oxidado, es decir mediante el átomo de carbono C* de la unidad de sacárido terminal reductora de HAS, preferiblemente HES, o bien en el estado no oxidado, es decir como hemiacetal o como grupo aldehído libre, o bien en el estado oxidado, es decir como lactona
o como grupo carboxilo libre. El término “grupo amino” tal como se usa en este contexto de la presente solicitud
35 también comprende sales adecuadas del grupo amino, tales como, por ejemplo, grupos amino protonados, con un anión farmacéuticamente aceptable, tal como, por ejemplo, cloruro, hidrogenosulfato, sulfato, carbonato, hidrogenocarbonato, citrato, fosfato o hidrogenofosfato.
Preferiblemente, el grupo amino del compuesto de reticulación M-L-A según la presente invención es un grupo 40 según la fórmula (IIc)
en la que Y o bien está ausente o bien es un resto químico seleccionado del grupo que consiste en
en los que G es O o S o NH, y, si está presente dos veces, cada G es independientemente O o S o NH, siendo G
5 preferiblemente O, y en los que R’ es H o un grupo hidroxilo o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo y alquilarilo sustituido. En este contexto, el término “alquilo” se refiere a residuos alquilo no ramificados, residuos alquilo ramificados y residuos cicloalquilo. Preferiblemente, cada uno de estos residuos orgánicos tiene desde 1 hasta 10 átomos de carbono. Como sustituyentes concebibles,
10 pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br. Preferiblemente, los residuos orgánicos son hidrocarburos no sustituidos.
Si R’ es un grupo hidroxilo, el grupo amino preferido de la presente invención es HO-NH-, es decir Y está ausente.
15 Preferiblemente, en caso de que R’ sea un residuo orgánico, R’ se selecciona del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido, prefiriéndose especialmente el residuo alquilo. Incluso más preferiblemente, el residuo alquilo opcionalmente sustituido tiene desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4 tal como 1, 2, 3 ó 4 átomos de carbono. Por tanto, residuos orgánicos preferidos según la presente invención son metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo o t-butilo. Según una realización especialmente
20 preferida, el residuo orgánico R’ es metilo o etilo, en particular metilo.
Por tanto, en caso de que R’ sea un residuo orgánico, grupos amino preferidos según la presente invención son, por ejemplo, H3C-CH2-NH-, H3C-NH-, H5C6-NH-, H3C-CH2-NH-O-, H3C-NH-O-, H5C6-NH-O-, prefiriéndose particularmente H3C-NH-, H5C6-NH- y H3C-NH-O-.
25 Según la presente invención, también es posible que R’ no sea un residuo separado sino que forme una estructura de anillo con un átomo adecuado comprendido en L o con un residuo A3 del grupo A del compuesto de reticulación. Estas estructuras también están comprendidas en la definición mencionada anteriormente del término “alquilo” con respecto a R’. A modo de ejemplo, R’ puede formar una estructura de anillo con un residuo A3 del grupo A del
30 compuesto de reticulación, siendo A un grupo cetal. Compuestos de reticulación concebibles son, por ejemplo,
En este caso, un compuesto de reticulación especialmente preferido según la presente invención es
es decir, el grupo amino M es una amina secundaria, tanto Z1 como Z2 son O, y A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2-.
En una realización preferida de la presente invención, R’ es H. Por tanto, grupos amino M preferidos del presente son H2N
en los que G es O o S, y, si está presente dos veces, independientemente O o S, prefiriéndose O.
5 Grupos amino especialmente preferidos M de la presente invención, si R’ es H, son H2N-, H2N-O- y H2N-NH-(C=O)-.
Por tanto, la presente invención también se refiere al método y al derivado mencionados anteriormente, en los que el grupo amino M es H2N-, H2N-O-, H2N-NH-(C=O)-, H3C-NH- o H3C-NH-O-, preferiblemente H2N-, H2N-O-, o H2N-NH(C=O)-.
El espaciador L
Según la presente invención, los grupos funcionales M y A del compuesto de reticulación están separados por un espaciador adecuado. El término “espaciador” tal como se usa en este contexto de la presente solicitud se refiere a
15 cualquier resto químico adecuado que forma un puente entre M y A.
En general, no hay restricciones particulares en cuanto a la naturaleza química del espaciador L con la condición de que L tenga en particular propiedades químicas que permitan llevar a cabo el método de la invención para la preparación de los derivados novedosos y proporcionar propiedades químicas adecuadas a los derivados novedosos en lo que se refiere a su uso previsto.
Según una realización preferida de la presente invención, L que forma un puente entre M y A es un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId)
en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido y residuos -O-R” en los que R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido.
En este contexto, el término “alquilo” se refiere a residuos alquilo no ramificados, residuos alquilo ramificados y residuos cicloalquilo. Como sustituyentes preferidos, pueden mencionarse halógenos tales como F, Cl o Br.
35 Preferiblemente, L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido; más preferiblemente, L1 y L2 son independientemente uno de otro H o alquilo; incluso más preferiblemente, tanto L1 como L2 son H.
Preferiblemente, si L1 y L2 son residuos orgánicos, cada uno de L1 y L2 puede contener independientemente de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10, más preferiblemente de 1 a 8, más preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. Se prefieren especialmente residuos L1 y L2 tales como residuos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo opcionalmente sustituidos, preferiblemente no sustituidos. Según la presente invención, L1 puede ser H y L2 puede ser un residuo orgánico tal como se definió anteriormente.
45 En lo que se refiere al número entero n, n es preferiblemente desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
Si el número entero n es mayor que 1, los grupos (CL1L2) pueden ser iguales o diferentes uno de otro. Según una realización preferida de la presente invención, los grupos (CL1L2) directamente unidos uno a otro tienen la misma constitución.
Según una realización preferida de la presente invención, el espaciador L consiste en una unidad estructural según la fórmula (IId) en la que L1 y L2 son tal como se definió anteriormente. Más preferiblemente, el número entero n es desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 1 hasta 10 tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Incluso más preferiblemente, cada uno de los grupos (CL1L2) es (CH2) de tal manera que el espaciador L que forma un puente entre M y A tiene la estructura
10 en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, más preferiblemente desde 1 hasta 10 tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10. Incluso más preferiblemente, n está en el intervalo de desde 1 hasta 6, más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 4, tal como 1, 2, 3 ó 4, y en particular 2.
Por tanto, según una realización particularmente preferida de la presente invención, el espaciador L es -CH2-CH2-.
15 Según realizaciones adicionales de la presente invención, el espaciador L del compuesto de reticulación comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId)
en la que n, L1 y L2 son tal como se definió anteriormente, preferiblemente
25 y en la que L comprende además al menos un resto químico diferente de -(CL1L2)-.
En este contexto, pueden mencionarse realizaciones en las que el espaciador L consiste en una unidad estructural -(CL1L2)n y un resto químico adicional T que separa -(CL1L2)n- del grupo M o A. También pueden concebirse realizaciones en las que el espaciador L consiste en una unidad estructural -(CL1L2)n- y dos restos químicos
30 adicionales T1 y T2 en los que T1 separa -(CL1L2)n- del grupo M y T2 separa -(CL1L2)n- del grupo A. Por tanto, la presente invención también abarca realizaciones según las cuales el compuesto de reticulación tiene una de las siguientes estructuras:
M-T-(CL1L2)n-A
35 M-(CL1L2)n-T-A
M-T1-(CL1L2)n-T2-A
40 En cuanto a los restos químicos T, T1 o T2, no hay restricciones particulares en cuanto a su naturaleza química con la condición de que L tenga en particular propiedades químicas que permitan llevar a cabo el método de la invención para la preparación de los derivados novedosos y proporcionar propiedades químicas adecuadas a los derivados novedosos en lo que se refiere a su uso previsto.
45 Por tanto, T, T1 y/o T2 pueden comprender residuos arilo opcionalmente sustituidos, heteroátomos adecuados, grupos funcionales adecuados, o similares. En lo que se refiere a los grupos funcionales, pueden mencionarse realizaciones según las cuales estos grupos funcionales resultan de la preparación del compuesto de reticulación en el que se hacen reaccionar al menos un primer compuesto y al menos un segundo compuesto entre sí para dar un compuesto M-L-A. A modo de ejemplo, pueden hacerse reaccionar un primer compuesto M-L’-W1 y un segundo compuesto W2-L”-A para dar un compuesto de reticulación M-L-A en el que -L- es -L’-F-L”- y F representa el grupo funcional que resulta de la reacción del grupo funcional W1 con el grupo funcional W2, y en el que al menos uno de L’ y L” comprende la unidad estructural -(CL1L2)n-. Tales grupos funcionales W1 y W2 pueden elegirse de manera adecuada. A modo de ejemplo, uno de los grupos W1 y W2, es decir W1 o W2, puede elegirse del grupo que consiste en los grupos funcionales según la siguiente lista mientras que el otro grupo, W2 o W1, se selecciona de manera adecuada y puede formar una unión química con W1 o W2, en los que W2 o W1 también se selecciona preferiblemente del grupo mencionado anteriormente:
-
dobles enlaces C-C o triples enlaces C-C o enlaces C-C aromáticos;
-
el grupo tio o el grupo hidroxilo;
-
hidrazidas de ácido alquilsulfónico, hidrazidas de ácido arilsulfónico;
-
1,2-dioles;
-
1,2-amino-tioalcoholes;
-
azidas;
-
1,2-aminoalcoholes;
-
el grupo amino -NH2 o derivados de los grupos amino que comprenden la unidad estructural -NH- tales como grupos aminoalquilo, grupo aminoarilo, grupos aminoaralquilo o grupos alcarilamino;
-
el grupo hidroxilamino -O-NH2, o derivados del grupo hidroxilamino que comprenden la unidad estructural -O-NH-, tales como grupos hidroxilalquilamino, grupos hidroxilarilamino, grupos hidroxilaralquilamino o grupos hidroxilalcarilamino;
-
grupos alcoxiamino, grupos ariloxiamino, grupos aralquiloxiamino o grupos alcariloxiamino, comprendiendo cada uno la unidad estructural -NH-O-;
-
residuos que tienen un grupo carbonilo, -Q-C(=G)-M’, en los que G es O o S, y M’ es, por ejemplo, -- -OH o -SH; -- un grupo alcoxilo, un grupo ariloxilo, un grupo aralquiloxilo o un grupo alcariloxilo; -- un grupo alquiltio, un grupo ariltio, un grupo aralquiltio o un grupo alcariltio; -- un grupo alquilcarboniloxilo, un grupo arilcarboniloxilo, un grupo aralquilcarboniloxilo, un grupo
alcarilcarboniloxilo; -- ésteres activados tales como ésteres de hidroxilaminas que tienen estructura de imida tales como N
hidroxisuccinimida; - -NH-NH2 o -NH-NH-; - -NO2;
-
el grupo nitrilo;
-
grupos carbonilo tales como el grupo aldehído o el grupo ceto;
-
el grupo carboxilo;
-
el grupo -N=C=O o el grupo -N=C=S;
-
grupos haluro de vinilo tales como el grupo yoduro de vinilo o el bromuro de vinilo o triflato; - -C=C-H; - -(C=NH2Cl)-O-alquilo
-
grupos -(C=O)-CH2-Hal en los que Hal es Cl, Br o I;
- -CH=CH-SO2-;
-
un grupo disulfuro que comprende la estructura -S-S-;
-
el grupo
-
el grupo
A modo de ejemplo, W1 o W2 pueden ser un grupo carboxilo o un éster activado, y W2 o W1 pueden ser un grupo amino o un grupo hidroxilo de tal manera que F que representa el grupo funcional que resulta de la reacción del
15 grupo funcional W1 con el grupo funcional W2, es una amida o un éster. Por tanto, a modo de ejemplo, compuestos de reticulación que tienen un espaciador L que comprende, aparte de la unidad estructural -(CL1L2)n-, un grupo funcional, pueden tener una constitución tal como
20 M-L’-(C=O)-NH-(CL1L2)n-A o M-L’-(C=O)-O-(CL1L2)n-A
25 o M-L’-NH-(C=O)-(CL1L2)n-A 30 o M-L’-O-(C=O)-(CL1L2)n-A o 35 M-(CL1L2)n-(C=O)-NH-L”-A o 40 M-(CL1L2)n-(C=O)-O-L”-A o M-(CL1L2)n-NH-(C=O)-L”-A 45 o M-(CL1L2)n-O-(C=O)-L”-A 50 en los que L’ y L” pueden comprender o no una unidad estructural -(CL1L2)n-. Entre estas estructuras, se prefieren compuestos de reticulación que tienen las constituciones M-L’-(C=O)-NH-(CL1L2)n-A 55
o M-(CL1L2)n-(C=O)-NH-L”-A Además, entre estas estructuras, se prefieren espaciadores en los que L’ y L”, si están presentes, contienen la
unidad estructural -(CL1L2)n-. En estos casos, se prefiere incluso más que n esté en el intervalo de desde 1 hasta 4,
más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 3, tal como 1, 2 ó 3. Si un espaciador dado contiene, por
ejemplo, dos unidades estructurales -(CL1L2)n-, el índice n de cada unidad estructural puede ser igual o diferente.
Por tanto, se prefieren los siguientes compuestos de reticulación que tienen las siguientes constituciones:
M-(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-A
en la que cada n está preferiblemente, independientemente uno de otro, en el intervalo de desde 1 hasta 4, más
preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 3, tal como 1, 2 ó 3. Por consiguiente, espaciadores L preferidos
tienen la constitución
-
(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-
Por tanto, compuestos de reticulación particularmente preferidos que contienen -(C=O)-NH- son
M-(CL1L2)3-(C=O)-NH-(CL1L2)3-A
o
M-(CL1L2)3-(C=O)-NH-(CL1L2)2-A
o
M-(CL1L2)2-(C=O)-NH-(CL1L2)3-A
o
M-(CL1L2)2-(C=O)-NH-(CL1L2)2-A
Compuestos de reticulación más preferidos que contienen -(C=O)-NH- son
M-(CL1L2)3-(C=O)-NH-(CL1L2)2-A
o
M-(CL1L2)2-(C=O)-NH-(CL1L2)2-A Incluso más preferiblemente, L1 y L2 son ambos H. Por tanto, se prefieren especialmente compuestos de reticulación que tienen las siguientes constituciones
M-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-A
o
M-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-A
o
M-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-A
o
M-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-A
Los más preferidos son compuestos de reticulación que tienen las siguientes constituciones
M-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-A
o M-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-A A modo de ejemplo, compuestos de reticulación preferidos de la presente invención son
o
o
o
o
De nuevo a modo de ejemplo y con el fin de ilustrar las estructuras comentadas anteriormente, un compuesto de reticulación concebible en el contexto de la presente invención puede ser
Según una realización adicional de la presente invención, el espaciador L puede comprender más de una unidad estructural -(CL1L2)n- en el que estas unidades estructurales pueden ser iguales o diferentes, es decir la estructura puede diferenciarse en n y/o L1 y/o L2, en el que al menos dos de tales unidades estructurales pueden estar separadas por un heteroátomo tal como O o S. Preferiblemente, según esta realización, el espaciador L comprende al menos una unidad estructural -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, preferiblemente -(CH2)n1-O-(CH2)n2, en la que n1 es igual a,
o diferente de, n2, y en la que el espaciador L está unido mediante -(CL1L2)n1- al grupo amino M del compuesto de reticulación, es decir el compuesto de reticulación que comprende la siguiente subestructura
5 M-(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-
Según una realización concebible preferida, pueden mencionarse estructuras de espaciador tales como
-
((CL1L2)n1-O)m-(CL1L2)n2-
10 siendo m un número entero de desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6 tal como 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. De manera particularmente preferible, m es 1, 2 ó 3, más preferiblemente 2 ó 3. Preferiblemente, n1 es desde 2 hasta 4, y más preferiblemente 2. Preferiblemente, n2 es desde 1 hasta 4, más preferiblemente 1 ó 2. Por tanto, son estructuras preferidas, a modo de ejemplo,
15 -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-
y más preferiblemente
20 -((CH2)2-O)m-CH2-
De nuevo a modo de ejemplo y con el fin de ilustrar las estructuras comentadas anteriormente, un compuesto de reticulación preferiblemente usado en el contexto de la presente invención es
o
o
35 Según una realización adicional de la presente invención, el grupo M y el grupo A pueden estar separados por 2 restos químicos adecuados, comprendiendo al menos uno de los mismos -(CL1L2)n-, de tal manera que el átomo de N del grupo M y el átomo de C del grupo cetal A están formando un anillo. Ya se presentó anteriormente una realización preferida y tiene la estructura
Compuestos de reticulación especialmente preferidos de la presente invención son compuestos que tienen, como grupo M, el grupo H2N- o el grupo H2N-O- o el grupo H2N-NH-(C=O)-, de manera especialmente preferible el grupo H2N-, y, como grupo A, un grupo acetal, preferiblemente un grupo acetal que tiene la estructura
45 en la que, más preferiblemente, Z1 y Z2 son O e, incluso más preferiblemente, A1 y A2 son ambos etilo. Incluso más preferiblemente, el espaciador L consiste en unidad estructural -(CL1L2)n-, siendo L1 y L2 preferiblemente H, y siendo incluso más preferiblemente el número entero n desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
Por tanto, compuestos de reticulación preferidos según la presente invención son, a modo de ejemplo,
o
o
o
o
o
o
o
o
15 o
o
o o
5 o
o
o
o
o
o
o
o
15 Incluso más preferiblemente, los compuestos de reticulación se seleccionan del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). Más preferiblemente, los compuestos de reticulación se seleccionan del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). En particular, los compuestos de reticulación se seleccionan del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12) y (a16).
20 Como compuesto de reticulación M-L-A se prefiere particularmente 1-amino-3,3-dietoxipropano,
A modo de ejemplo, compuestos de reticulación de amino-acetal concebibles según la presente invención son:
1-(1,3-dioxan-2-il)-2-metilpropan-2-amina
4,4-dietoxi-2-metilbutan-2-amina
1-(1,3-dioxolan-2-il)-2-metilpropan-2-amina
4,4-dietoxi-N,2-dimetilbutan-2-amina
3,3-dimetoxipropinimidhidrazida A modo de ejemplo, compuestos de reticulación de amino-cetal concebibles según la presente invención son:
1,4-ditia-8-azaespiro[4.5]decano
1-oxa-4-tia-8-azaespiro[4.5]decano
N-metil-1-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)metanamina
4-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)butan-1-amina
1-(3,4-dimetoxifenil)-2-(2-metil-1,3-dioxolan-2
2-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)-1-feniletanamina
1-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)propan-2-amina 3-metil-1-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)butan-2-amina
2-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)etanamina
3-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)pentan-2-amina
2-metil-1-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)propan-2-amina
2-(4-metoxifenil)-2-(2-metil-1,3-dioxolan-2
amina
3-(2,4-dimetil-1,3-dioxolan-2-il)-2,2-dimetilpropan-1amina
N-metil-3-(2-metil-1,3-dioxolan-2-il)butan-1-amina
1-(2,5,5-trimetil-1,3-dioxolan-2-il)heptan-4-amina
3-(2-metil-1,3-ditian-2-il)propan-1-amina
3,3-dimetil-1-(2-metil-1,3-ditian-2-il)butan-2-amina
1-(2-metil-1,3-dioxan-2-il)pentan-2-amina 3-(2-metil-1,3-dioxan-2-il)butan-2-amina
3-metil-1-(2-metil-1,3-dioxan-2-il)butan-2-amina 1,1,1-trifluoro-3-(2-metil-1,3-dioxan-2-il)propan-2amina
Derivado de hidroxialquilalmidón
Por consiguiente, la presente invención se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón (HAS) que puede obtenerse u obtenido mediante el método tal como se describió anteriormente.
Además, la presente invención se refiere a un derivado de HAS de fórmula (III)
en la que A es un grupo acetal o cetal; L es un espaciador que forma un puente entre X y A;
5 en la que X es el grupo funcional que resulta de la reacción de un grupo amino M de un compuesto de reticulación de fórmula (II) M—L—A
10 con hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
mediante el átomo de carbono C* del HAS, en la que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M,
15 en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
En lo que se refiere a realizaciones preferidas con respecto a HAS, preferiblemente HES, L, A, R1, R2, y R3, se hace 20 referencia específica a las realizaciones tal como se describieron anteriormente en el presente documento.
Además, la presente invención se refiere al derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que R1, R2 y R3 son independientemente un grupo -(CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
25 Además, la presente invención se refiere al derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón (HES).
Además, la presente invención se refiere al derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que A es un 30 residuo según la fórmula (IIa)
en la que Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en los que Rx es H o alquilo 35 inferior tal como metilo, etilo o propilo, preferiblemente H;
A1 y A2 son cada uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb)
en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y en la que A3 es H o metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un anillo con el átomo de N del grupo amino M 5 o con un átomo adecuado comprendido en L, siendo A3 preferiblemente H.
La naturaleza química precisa del grupo X del derivado de HAS según la invención depende de la naturaleza química respectiva del grupo M, del estado de oxidación del átomo de carbono C* del extremo reductor de HAS, y de las condiciones de reacción tales como disolvente, temperatura, etcétera, empleadas para la reacción. Según realizaciones de la presente invención en las que el átomo de carbono C* se emplea en estado oxidado y no oxidado, a continuación en el presente documento se comentan con detalle ejemplos específicos y preferidos.
Preferiblemente, en lo que se refiere a X, la presente invención se refiere al derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que X se selecciona del grupo que consiste en -CH=N-, -CH2-NH-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-,
15 -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-NH-, -CH=N-NH-(C=O)-, -CH2-NH-NH-(C=O)-, que consiste preferiblemente en -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-, -CH=N-NH-(C=O)- y -CH2-NH-NH-(C=O)-, que consiste más preferiblemente en -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O- y -CH2-NH-O-.
Para determinadas realizaciones del grupo X, es concebible que la unidad de sacárido terminal del HAS presente en el derivado de HAS esté presente en una estructura de anillo que puede estar en equilibrio con la estructura abierta según la fórmula (III) anterior, teniendo la estructura de anillo y la estructura abierta una determinada distribución de equilibrio. En estos casos, y para el fin de la presente invención, la fórmula (III) tal como se facilitó anteriormente comprende la estructura abierta así como la estructura de anillo, y la fórmula (III) no limita el derivado de HAS a la estructura abierta. Para ejemplos específicos y preferidos comentados con detalle a continuación en el presente
25 documento, en algunos casos se muestra la estructura de anillo.
Además, la presente invención se refiere al derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que L que forma un puente entre M y A es un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId), que consiste preferiblemente en una unidad estructural según la fórmula (IId)
en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido,
35 arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, y residuos -O-R” en los que R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido; más preferiblemente H o alquilo; más preferiblemente H, en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
El extremo reductor opcionalmente oxidado de HAS, preferiblemente HES
Según la presente invención, puede hacerse reaccionar HAS, preferiblemente HES, mediante el átomo de carbono
45 C* del extremo reductor terminal del almidón con el grupo amino M del compuesto de reticulación, en el que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M.
La expresión “el HAS se hace reaccionar mediante el extremo reductor” o “el HAS se hace reaccionar mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor terminal” tal como se usa en el contexto de la presente invención puede referirse a un procedimiento según el cual se hace reaccionar el HAS predominantemente mediante su extremo reductor (opcionalmente oxidado de manera selectiva).
Este término “predominantemente mediante su extremo reductor (opcionalmente oxidado de manera selectiva)” se refiere a procedimientos según los cuales estadísticamente más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% y todavía más preferiblemente al menos el 95%, tal como el 95%, 96%, 97%, 98%,
o 99% de las moléculas de HAS empleadas para una reacción dada se hacen reaccionar mediante al menos un
5 extremo reductor (opcionalmente oxidado de manera selectiva) por molécula de HAS, en el que una molécula de HAS dada que se hace reaccionar mediante al menos un extremo reductor (opcionalmente oxidado de manera selectiva) puede hacerse reaccionar en la misma reacción dada mediante al menos un grupo funcional adecuado adicional que está comprendido en dicha molécula polimérica y que no es un extremo reductor. Si se hacen reaccionar una o más moléculas de HAS mediante al menos un extremo reductor (opcionalmente oxidado de
10 manera selectiva) y simultáneamente mediante al menos un grupo funcional adecuado adicional que está comprendido en esta(s) molécula(s) de HAS y que no es un extremo reductor (opcionalmente oxidado de manera selectiva), de manera estadísticamente preferible más del 50%, preferiblemente al menos el 55%, más preferiblemente al menos el 60%, más preferiblemente al menos el 65%, más preferiblemente al menos el 70%, más preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más
15 preferiblemente al menos el 90% y todavía más preferiblemente al menos el 95%, tal como el 95%, 96%, 97%, 98%,
o 99% de todos los grupos funcionales que reaccionan de estas moléculas de HAS, incluyendo dichos grupos funcionales los extremos reductores (opcionalmente oxidados de manera selectiva), son extremos reductores (oxidados de manera selectiva).
20 El término “extremo reductor” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere al grupo aldehído terminal de una molécula de HAS que puede estar presente como grupo aldehído y/o como forma de hemiacetal correspondiente y/o como grupo acetal, teniendo el grupo acetal la siguiente estructura
25 que puede estar presente si el residuo -OR3 según la fórmula (I) anterior es -O-CH2-CH2-OH.
En caso de que el extremo reductor esté oxidado, el extremo reductor oxidado está en forma de un grupo carboxilo y/o de la lactona correspondiente. 30 Extremo reductor oxidado
Por tanto, según una primera realización de la presente invención, se hace reaccionar el compuesto de reticulación mediante el grupo amino con el átomo de C* oxidado del extremo reductor terminal de HAS, preferiblemente HES.
35 Aunque la oxidación puede llevarse a cabo según cualquier método o métodos adecuados que dan como resultado el extremo reductor oxidado del hidroxialquilalmidón, se lleva a cabo preferiblemente usando una disolución de yodo alcalina tal como se describe, por ejemplo, en Sommermeyer et al., documento US 6.083.909, columna 5, líneas 6367, y columna 7, líneas 25-39; columna 8, línea 53 a columna 9, línea 20, incorporándose el contenido respectivo en
40 la presente invención como referencia.
Oxidar de manera selectiva el HAS, preferiblemente el HES, conduce a que HAS, preferiblemente HES, sea una lactona y/o un ácido carboxílico
o una sal adecuada del ácido carboxílico tal como sal de metal alcalino, preferiblemente como sal de sodio y/o potasio, y siendo HAS’ preferiblemente HES’.
10 Según una primera alternativa de la presente invención, se hace reaccionar esta forma del HAS, preferiblemente HES, como tal con el grupo amino M del compuesto de reticulación.
Según una segunda alternativa de la presente invención, en primer lugar se hace reaccionar el HAS, preferiblemente HES, oxidado de manera selectiva en su extremo reductor, con un compuesto adecuado para dar el HAS, 15 preferiblemente HES, que comprende un grupo carboxilo reactivo.
La introducción del grupo carboxilo reactivo en el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor puede llevarse a cabo mediante todos los métodos concebibles y todos los compuestos adecuados.
20 Según un método específico de la presente invención, el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un alcohol, preferiblemente con al menos un alcohol ácido tal como alcoholes ácidos que tienen un índice de pKA en el intervalo de desde 6 hasta 12 o de desde 7 hasta 11 a 25ºC. El peso molecular del alcohol ácido puede estar en el intervalo de desde 80 hasta 500 g/mol, tal como de desde 90 hasta 300 g/mol o de desde 100 hasta 200 g/mol.
25 Alcoholes ácidos adecuados son todos los alcoholes H-O-RA que tienen un protón ácido que puede hacerse reaccionar con el HAS oxidado para dar el éster de HAS reactivo respectivo, preferiblemente según la fórmula
todavía más preferiblemente según la fórmula
Alcoholes preferidos son N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles sustituidos de manera adecuada tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o,o’-dinitrofenol, triclorofenol tal 5 como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Se prefieren especialmente Nhidroxisuccinimidas, prefiriéndose especialmente N-hidroxisuccinimida y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Todos los alcoholes pueden emplearse solos o como combinación adecuada de dos o más de los mismos. En el contexto de la presente invención, también es posible emplear un compuesto que libera el alcohol respectivo, por ejemplo
10 añadiendo diésteres de ácido carbónico.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente, en el que el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el HAS oxidado con un alcohol ácido, preferiblemente con N-hidroxisuccinimida y/o sulfo-N-hidroxisuccinimida.
15 Según una realización preferida de la presente invención, el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con al menos un diéster carbónico RB-O-(C=O)-O-RC, en el que RB y RC pueden ser iguales o diferentes. Preferiblemente, este método da HAS reactivo según la fórmula
en la que HAS’ es preferiblemente HES’.
Como compuestos de diéster carbónico adecuados, pueden emplearse compuestos cuyos componentes de alcohol
25 son independientemente N-hidroxisuccinimidas tales como N-hidroxisuccinimida o sulfo-N-hidroxisuccinimida, fenoles sustituidos de manera adecuada tales como p-nitrofenol, o,p-dinitrofenol, o,o’-dinitrofenol, triclorofenol tal como 2,4,6-triclorofenol o 2,4,5-triclorofenol, trifluorofenol tal como 2,4,6-trifluorofenol o 2,4,5-trifluorofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, o hidroxiazoles tales como hidroxibenzotriazol. Se prefieren especialmente carbonato de N,N’-disuccinimidilo y carbonato de sulfo-N,N’-disuccinimidilo, prefiriéndose especialmente carbonato
30 de N,N’-disuccinimidilo.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente, en el que el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor se activa haciendo reaccionar el HAS oxidado con carbonato de N,N’-disuccinimidilo.
35 Se hace reaccionar el alcohol ácido con el HAS oxidado o la sal del HAS oxidado a una razón molar de alcohol ácido:HAS preferiblemente de desde 5:1 hasta 50:1, más preferiblemente de desde 8:1 hasta 20:1, a una temperatura de reacción preferida de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC y de manera especialmente preferible de desde 1 hasta 25ºC. El tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo
40 de desde 1 hasta 10 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 5 h, más preferiblemente de desde 2 hasta 4 h y particularmente de desde 2 hasta 3 h.
Se hace reaccionar el compuesto de diéster carbónico con el HAS oxidado o la sal del HAS oxidado a una razón molar de compuesto de diéster:HAS generalmente de desde 1:1 hasta 3:1, tal como de desde 1:1 hasta 1,5:1. El 45 tiempo de reacción está generalmente en el intervalo de desde 0,1 hasta 12 h, tal como de desde 0,2 hasta 6 h, o de desde 0,5 hasta 2 h o de desde 0,75 hasta 1,25 h.
Según una realización preferida de la presente invención, la reacción del HAS oxidado con alcohol ácido y/o diéster carbónico se lleva a cabo en al menos un disolvente aprótico, tal como en un disolvente aprótico anhidro que tiene un contenido de agua de no más del 0,5 por ciento en peso, preferiblemente de no más del 0,1 por ciento en peso. Disolventes adecuados son, entre otros, dimetilsulfóxido (DMSO), N-metilpirrolidona, dimetilacetamida (DMA),
5 dimetilformamida (DMF) y mezclas de dos o más de los mismos. Las temperaturas de reacción están preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 40ºC, más preferiblemente de desde 10 hasta 30ºC.
Para hacer reaccionar el HAS oxidado con el al menos un alcohol ácido, se emplea al menos un agente activante adicional.
10 Agentes activantes adecuados son, entre otros, carbonildiimidazol, carbodiimidas tales como diisopropilcarbodiimida (DIC), diciclohexilcarbodiimidas (DCC), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), prefiriéndose especialmente diciclohexilcarbodiimidas (DCC) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC).
15 Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, en el que el HAS que se oxida en su extremo reductor, se hace reaccionar con un alcohol ácido en presencia de un agente activante adicional para dar el éster de HAS reactivo.
Según una realización de la presente invención, la reacción del HAS oxidado con diéster carbónico y/o alcohol ácido
20 se lleva a cabo a una actividad de base baja que puede determinarse añadiendo la mezcla de reacción a agua con una razón en volumen de agua con respecto a mezcla de reacción de 10:1. Antes de la adición, el agua que no comprende esencialmente tampón tiene un valor de pH de 7 a 25ºC. Tras la adición de la mezcla de reacción y midiendo el valor de pH, se obtiene la actividad de base de la mezcla de reacción, que tiene un valor de preferiblemente no más de 9,0, más preferiblemente de no más de 8,0 y de manera especialmente preferible de no
25 más de 7,5.
Según otra realización de la presente invención, se hace reaccionar el HAS oxidado con N-hidroxisuccinimida en DMA seca en ausencia de agua con EDC para dar selectivamente el éster de N-hidroxisuccinimida polimérico según la fórmula
siendo HAS’ más preferiblemente HES’.
35 Esta reacción no da subproductos resultantes de reacciones de EDC con grupos OH de HES, y la reacción de transposición de la O-acilisourea formada por EDC y el HAS oxidado para dar la N-acilurea respectiva se suprime sorprendentemente.
Según otra realización preferida de la presente invención, se hace reaccionar el HAS oxidado con carbonato de
40 N,N’-disuccinimidilo en DMF seca en ausencia de agua y en ausencia de un agente activante para dar selectivamente el éster de HAS-N-hidroxisuccinimida según la fórmula
siendo HAS’ más preferiblemente HES’.
Según otra realización de la presente invención, el HAS que se oxida de manera selectiva en su extremo reductor se hace reaccionar en el extremo reductor oxidado con un azolido tal como carbonildiimidazol o carbonildibencimidazol para dar un polímero que tiene un grupo carboxilo reactivo. En el caso de carbonildiimidazol, se obtiene como resultado un derivado de HAS de imidazolido reactivo según la fórmula
10 en la que HAS’ es preferiblemente HES’.
Entonces se hace reaccionar adicionalmente el derivado de HAS reactivo que comprende al menos un grupo carboxilo reactivo, que resulta preferiblemente de la reacción del HAS con el alcohol ácido, el carbonato y/o el azolido, tal como se describió anteriormente, con el grupo amino M del compuesto de reticulación M.
15 La reacción del HAS mediante el extremo reductor oxidado, opcionalmente activado de manera adicional tal como se describió anteriormente, con el grupo amino M puede llevarse a cabo según todos los métodos adecuados. Preferiblemente, el grupo amino M es un grupo amino primario H2N- o un grupo amino secundario.
20 Generalmente, se usan disolventes apróticos preferiblemente polares que también pueden contener una determinada cantidad de agua, tal como hasta el 10% en peso. Disolventes apróticos preferidos son, entre otros, DMSO o DMF.
Un ejemplo de un intervalo de temperatura de reacción preferido es de desde 0 hasta 80ºC, más preferiblemente 25 desde 0 hasta 70ºC, más preferiblemente desde 0 hasta 60ºC, más preferiblemente desde 0 hasta 50ºC e incluso más preferiblemente desde 0 hasta 40ºC.
Si se usan compuestos de reticulación para la reacción con HAS que tiene el extremo reductor en forma oxidada que, según una realización preferida, tienen H2N- como grupo amino M, se obtiene un derivado de HAS mediante la 30 etapa (i) de la presente invención en la que el HAS y el compuesto de reticulación empleados como materiales de partida se unen mediante un enlace amida, en la que el derivado de HAS obtenido contiene además el grupo acetal
o ceto A.
Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, en el que en (i),
35 se hace reaccionar HAS mediante su extremo reductor oxidado con el grupo amino M del compuesto de reticulación, siendo M H2N-, y en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 0 hasta 80ºC, y en el que X es -(C=O)-NH-.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere al derivado de HAS, que puede obtenerse u obtenido 40 mediante el método tal como se describió anteriormente.
Además, la presente invención también se refiere al derivado de HAS como tal, que tiene la siguiente estructura
en la que R’ es H si el grupo amino M del compuesto de reticulación es un grupo amino primario, y en la que R’ es
un resto químico distinto de H si el grupo amino M del compuesto de reticulación es un grupo amino secundario. La naturaleza química precisa de R’ depende del compuesto de reticulación, y por tanto, se hace referencia a la valoración de los compuestos de reticulación generalmente posibles y preferiblemente empleados anteriormente en el presente documento.
Según compuestos de reticulación preferidos descritos anteriormente empleados para la presente invención, pueden mencionarse los siguientes derivados de HAS como realizaciones preferidas a modo de ejemplo, en los que en cada caso, HAS es (según realizaciones preferidas de la presente invención) HES:
o
o
20 o
o
o
o
15 o o
o
o
15 o o
o
o
15 o
o
10 Se prefieren más los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). Se prefieren incluso más los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). Se prefieren particularmente los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12) y (a16).
15 Según una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a un derivado de HES que tiene la siguiente estructura:
20 en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta
25 aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
30 Extremo reductor no oxidado
Según una realización segunda y preferida de la presente invención, se hace reaccionar el compuesto de reticulación mediante grupo amino con el átomo de C* no oxidado del extremo reductor terminal de HAS,
35 preferiblemente HES, es decir el grupo aldehído terminal de una molécula de HAS puede estar presente como grupo aldehído y/o como forma de hemiacetal correspondiente.
La reacción del HAS mediante el extremo reductor no oxidado, con un grupo amino M puede llevarse a cabo según todos los métodos adecuados. Preferiblemente, el grupo amino M es H2N-, un grupo amino secundario adecuado HNR’- tal como, por ejemplo, H3C-NH-, H2N-O-, o un grupo hidroxilamino secundario adecuado HNR’-O- tal como, por ejemplo, H3C-NH-O-, o H2N-NH-(C=O)-.
Preferiblemente, el grupo amino M es H2N-, H2N-O- o H2N-NH-(C=O)-, incluso más preferiblemente H2N- o H2N-O-, y en particular H2N-.
Según una realización preferida de la presente invención, esta reacción se lleva a cabo en un sistema acuoso. El término “sistema acuoso” tal como se usa en este contexto de la presente invención se refiere a un disolvente o a una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de desde al menos el 10% en peso, preferiblemente al menos el 50% en peso, más preferiblemente al menos el 80% en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90% en peso o hasta el 100% en peso, basándose en el peso de los disolventes implicados. Como disolventes adicionales, pueden mencionarse disolventes tales como DMSO, DMF, etanol o metanol.
Según una realización preferida, si se hace reaccionar HAS con el compuesto de reticulación en un medio acuoso y el grupo amino M del compuesto de reticulación es una hidroxilamina o a hidrazida, la temperatura de la reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 5 hasta 45ºC, más preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 30ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 15 hasta 25ºC.
Según otra realización preferida, si se hace reaccionar HAS con el compuesto de reticulación en un medio acuoso y el grupo amino M del compuesto de reticulación es un grupo H2N- o R’HN-, siendo la reacción una aminación reductora, la temperatura está preferiblemente en el intervalo de hasta 100ºC, más preferiblemente en el intervalo de desde 10 hasta 90ºC, más preferiblemente en el intervalo de desde 20 hasta 80ºC, más preferiblemente en el intervalo de desde 30 hasta 70ºC y de manera especialmente preferible en el intervalo de desde 40 hasta 60ºC.
Durante el transcurso de la reacción puede variarse la temperatura, preferiblemente en los intervalos facilitados anteriormente, o mantenerse esencialmente constante.
El tiempo de reacción para la reacción de HAS con el compuesto de reticulación M puede adaptarse a las necesidades específicas y está generalmente en el intervalo de desde 1 h hasta 7 d. En caso de que, por ejemplo, el grupo amino M sea una hidroxilamina o a hidrazida, el tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 1 h hasta 3 d, más preferiblemente de desde 2 h hasta 48 h, y de manera especialmente preferible de desde 3 hasta 24 h.
En caso de que, por ejemplo, la reacción de HAS con el compuesto de reticulación sea una aminación reductora, el tiempo de reacción está preferiblemente en el intervalo de desde 1 h hasta 7 d, más preferiblemente en el intervalo de desde 4 h hasta 6 d, más preferiblemente en el intervalo de desde 8 h hasta 5 d e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 16 h hasta 3 d.
El valor de pH para la reacción de HAS con el compuesto de reticulación puede adaptarse a las necesidades específicas tales como la naturaleza química de los reactantes. En caso de que, por ejemplo, el grupo M del compuesto de reticulación sea una hidroxilamina o una hidrazida, el valor de pH está preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 9, más preferiblemente de desde 4 hasta 8 e incluso más preferiblemente de desde 4,5 hasta 6,5.
En caso de que, por ejemplo, la reacción de HAS con el compuesto de reticulación sea una aminación reductora, el valor de pH está preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 9, más preferiblemente en el intervalo de desde 3,5 hasta 8, e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 4 hasta 6.
El valor de pH adecuado de la mezcla de reacción puede ajustarse, para cada etapa de reacción, añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones adecuados, pueden mencionarse tampones acetato, preferiblemente tampón acetato de sodio, tampones fosfato o borato.
Si se usan compuestos de reticulación para la reacción con HAS que tiene el extremo reductor en forma no oxidada que, según una realización preferida, tienen H2N- como grupo amino M, se obtiene un derivado de HAS mediante la etapa (i) de la presente invención en la que el HAS y el compuesto de reticulación empleados como materiales de partida se unen mediante un enlace imina, en la que el derivado de HAS obtenido contiene además el grupo acetal o ceto A. Si la reacción se lleva a cabo en condiciones de aminación reductora en presencia de un agente reductor adecuado, se obtiene un derivado de HAS mediante la etapa (i) de la presente invención en la que el HAS y el compuesto de reticulación empleados como materiales de partida se unen mediante un enlace amina, en la que el derivado de HAS obtenido contiene además el grupo acetal o ceto A.
Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, en el que en (i), se hace reaccionar HAS, preferiblemente en un sistema acuoso, mediante su extremo reductor no oxidado con el grupo amino M del compuesto de reticulación, siendo M H2N-, y en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 20 hasta 80ºC a un pH en el intervalo de desde 4 hasta 7, siendo X -CH=N-.
Además, la presente invención también se refiere al método descrito anteriormente, en el que en (i), la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente reductor, tal como borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos de complejo de borano orgánico tales como un complejo de 4-(dimetilamina)piridina-borano, complejo de N-etildiisopropilamina-borano, complejo de N-etilmorfolina-borano, complejo de N-metilmorfolina-borano, complejo de N-fenilmorfolina-borano, complejo de lutidina-borano, complejo de trietilamina-borano, o complejo de trimetilamina-borano, preferiblemente NaCNBH3, para obtener un derivado de HAS, siendo X -CH2-NH-.
La concentración de estos agentes reductores usados para la aminación reductora de la presente invención está preferiblemente en el intervalo de desde 0,01 hasta 2,0 mol/l, más preferiblemente en el intervalo de desde 0,05 hasta 1,5 mol/l, y más preferiblemente en el intervalo de desde 0,1 hasta 1,0 mol/l, con respecto, en cada caso, al volumen de la disolución de reacción.
Según la realización preferida descrita anteriormente en la que M es H2N- y la reacción del compuesto de reticulación con HAS se lleva a cabo en condiciones de aminación reductora, la razón molar de compuesto de reticulación:HAS está preferiblemente en el intervalo de desde 1:1 hasta 100:1, más preferiblemente desde 2:1 hasta 80:1, más preferiblemente desde 3:1 hasta 70:1, más preferiblemente desde 4:1 hasta 60:1, y más preferiblemente desde 5:1 hasta 50:1.
Según la realización preferida descrita anteriormente en la que M es H2N- y la reacción del compuesto de reticulación con HAS se lleva a cabo en condiciones de aminación reductora, la concentración de HAS, preferiblemente HES, en el sistema acuoso está preferiblemente en el intervalo de desde el 1 hasta el 50% en peso, más preferiblemente desde el 3 hasta el 45% en peso, y más preferiblemente desde el 5 hasta el 40% en peso, con respecto, en cada caso, al peso de la disolución de reacción.
Si se usan compuestos de reticulación para la reacción con HAS que tiene el extremo reductor en forma no oxidada que, según una realización preferida, tienen H2N-O- o H2N-NH-(C=O)- como grupo amino M, se obtiene un derivado de HAS mediante la etapa (i) de la presente invención en la que el HAS y el compuesto de reticulación empleados como materiales de partida se unen mediante un enlace -CH=N-O- o un enlace -CH=N-NH-(C=O)-, en el que el derivado de HAS obtenido contiene además el grupo acetal o ceto A. Si la reacción se lleva a cabo en condiciones reductoras en presencia de un agente reductor adecuado, se obtiene un derivado de HAS mediante la etapa (i) de la presente invención en la que el HAS y el compuesto de reticulación empleados como materiales de partida se unen mediante un enlace -CH2-NH-O- o un enlace -CH2-NH-NH-(C=O)-, en el que el derivado de HAS obtenido contiene además el grupo acetal o ceto A.
Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, en el que en (i), se hace reaccionar HAS, preferiblemente en un sistema acuoso, mediante su extremo reductor no oxidado con el grupo amino M del compuesto de reticulación, siendo M H2N-O- o H2N-NH-(C=O)-, y en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 5 hasta 80ºC a un pH en el intervalo de desde 4,5 hasta 6,5, siendo X -CH=N-O- o -CH=N-NH-(C=O)-.
Además, la presente invención también se refiere al método descrito anteriormente, en el que en (i), la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente reductor, tal como borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos de complejo de borano orgánico tales como un complejo de 4-(dimetilamina)piridina-borano, complejo de N-etildiisopropilamina-borano, complejo de N-etilmorfolina-borano, complejo de N-metilmorfolina-borano, complejo de N-fenilmorfolina-borano, complejo de lutidina-borano, complejo de trietilamina-borano, o complejo de trimetilamina-borano, preferiblemente NaCNBH3, para obtener un derivado de HAS, siendo X -CH2-NH-O- o -CH2NH-NH-(C=O)-.
La concentración de estos agentes reductores usados para esta reacción de la presente invención está preferiblemente en el intervalo de desde 0,001 hasta 2,0 mol/l, más preferiblemente en el intervalo de desde 0,01 hasta 1,0 mol/l, y más preferiblemente en el intervalo de desde 0,1 hasta 0,8 mol/l, con respecto, en cada caso, al volumen de la disolución de reacción.
Según la realización preferida descrita anteriormente en la que M es H2N-O- o H2N-NH-(C=O)-, y la reacción del compuesto de reticulación con HAS se lleva a cabo en condiciones reductoras, la razón molar de compuesto de reticulación:HAS está preferiblemente en el intervalo de desde 1:1 hasta 100:1, más preferiblemente desde 2:1 hasta 80:1, más preferiblemente desde 3:1 hasta 70:1, más preferiblemente desde 4:1 hasta 60:1, y más preferiblemente desde 5:1 hasta 50:1.
Según la realización preferida descrita anteriormente en la que M es H2N- y la reacción del compuesto de reticulación con HAS se lleva a cabo en condiciones de aminación reductora, la concentración de HAS, preferiblemente HES, en el sistema acuoso está preferiblemente en el intervalo de desde el 1 hasta el 50% en peso, más preferiblemente desde el 3 hasta el 45% en peso, y más preferiblemente desde el 5 hasta el 40% en peso, con respecto, en cada caso, al peso de la disolución de reacción.
Por consiguiente, la presente invención también se refiere al derivado de HAS, que puede obtenerse u obtenido mediante el/los método(s) tal como se describió anteriormente. Además, la presente invención también se refiere al derivado de HAS como tal, que tiene la siguiente estructura
10 en la que, dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química específica del compuesto de reticulación, el doble enlace CN puede estar presente en la conformación E o Z, en la que también puede estar presente una mezcla de ambas formas que tiene una determinada distribución de equilibrio;
o, en lo que se refiere a la estructura de anillo correspondiente que para los fines de la presente invención se 15 considerará como idéntica a la estructura abierta anterior,
en la que dependiendo de las condiciones de reacción y/o la naturaleza química específica del compuesto de
20 reticulación, estos derivados de HAS pueden estar presentes con el átomo de N en posición ecuatorial o axial en la que también puede estar presente una mezcla de ambas formas que tiene una determinada distribución de equilibrio;
o 25
o
o la estructura de anillo correspondiente
o
o
15 o la estructura de anillo correspondiente
o
Según compuestos de reticulación preferidos descritos anteriormente, pueden mencionarse los siguientes derivados de HAS como realizaciones preferidas a modo de ejemplo, en los que en cada caso, HAS es (según realizaciones preferidas de la presente invención) HES:
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, 10 o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, 20 o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
o en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, 5 o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
15 o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
15 en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
10 o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
15 o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
en la que se incluye la estructura de anillo correspondiente, o
15 Se prefieren más los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). Se prefieren incluso más los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12), (a14), (a16) y (a18). Se prefieren particularmente los derivados de HAS basados en los compuestos de reticulación seleccionados del grupo que consiste en las estructuras (a2), (a11), (a12) y (a16).
20 Según una realización especialmente preferida, la presente invención se refiere a un derivado de HES que tiene la siguiente estructura: la estructura de anillo correspondiente
y/o
en las que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde 15 aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e
20 incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
Otras realizaciones concebibles con respecto a HAS
Por motivos de completitud, se mencionará que, aunque no se prefiere según la presente invención, puede ser 25 concebible que se oxide HAS antes de la reacción con el compuesto de reticulación de tal manera que se introducirán al menos dos grupos aldehído en HAS según la siguiente fórmula
Generalmente, puede emplearse cada agente de oxidación o combinación de agentes de oxidación que puede oxidar al menos un anillo de sacárido del polímero para dar el anillo de sacárido abierto que tiene al menos uno, preferiblemente al menos dos grupos aldehído. Esta reacción puede ilustrarse mediante el siguiente esquema de reacción que muestra un anillo de sacárido de HAS que se oxida para dar un anillo abierto que tiene dos grupos aldehído:
10 Agentes oxidantes adecuados son, entre otros, peryodatos tales como peryodatos de metal alcalino o mezclas de dos o más de los mismos, prefiriéndose peryodato de sodio y peryodato de potasio. Puede ser concebible que estos grupos aldehído pueden hacerse reaccionar con el compuesto de reticulación M-L-A mediante el grupo amino M.
15 Aislamiento y/o purificación
Generalmente, es concebible que el derivado de HAS de la etapa (i) de la presente invención se hace reaccionar posteriormente tal como se describe a continuación en el presente documento. Según una realización preferida, el derivado de HAS de la etapa (i) se purifica adecuadamente tras la etapa de reacción (i).
20 Para la purificación del derivado de HAS de la etapa (i), pueden mencionarse las siguientes posibilidades A) a C) a modo de ejemplo, en las que se prefiere la posibilidad A):
A) Ultrafiltración usando agua o una disolución acuosa de tampón que tiene una concentración preferiblemente de
25 desde 0,1 hasta 100 mmol/l, más preferiblemente desde 1 hasta 50 mmol/l y más preferiblemente desde 5 hasta 20 mmol/l tal como aproximadamente 10 mmol/ml, un pH en el intervalo de preferiblemente desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 4 hasta 10, más preferiblemente desde 6 hasta 10 y más preferiblemente desde 8 hasta 10 tal como aproximadamente 9; el número de ciclos de intercambio es preferiblemente de desde 10 hasta 50, más preferiblemente desde 10 hasta 40 e incluso más preferiblemente desde 10 hasta 30 tal como aproximadamente 20.
30 B) Diálisis usando agua o una disolución acuosa de tampón que tiene una concentración preferiblemente de desde 0,1 hasta 100 mmol/l, más preferiblemente desde 1 hasta 50 mmol/l y más preferiblemente desde 5 hasta 20 mmol/l tal como aproximadamente 10 mmol/ml, un pH en el intervalo preferido de desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 4 hasta 10, más preferiblemente desde 6 hasta 10 y más preferiblemente desde 7 hasta 9; en la que se
35 emplea una disolución que contiene el derivado de HAS en una concentración preferida de desde el 5 hasta el 20% en peso; y en la que se usa tampón o agua en particular en un exceso de aproximadamente 100:1 con respecto a la disolución de derivado de HES.
C) Precipitación con etanol o isopropanol, centrifugación y nueva disolución en agua para obtener una disolución
40 que tiene una concentración preferida de aproximadamente el 10% en peso y posterior ultrafiltración usando agua o una disolución acuosa de tampón que tiene una concentración de preferiblemente desde 0,1 hasta 100 mmol/l, más preferiblemente desde 1 hasta 50 mmol/l e incluso más preferiblemente desde 5 hasta 20 mmol/l tal como aproximadamente 10 mmol/ml, un pH en el intervalo preferido de desde 2 hasta 10, más preferiblemente desde 4 hasta 10, más preferiblemente desde 6 hasta 10 y más preferiblemente desde 7 hasta 9; el número de ciclos de intercambio es preferiblemente de desde 10 hasta 40, más preferiblemente desde 10 hasta 30 e incluso más preferiblemente desde 10 hasta 20 tal como 10.
Tras la etapa de purificación preferida, el derivado de HAS se obtiene preferiblemente como un sólido. Según
5 realizaciones concebibles adicionales de la presente invención, pueden mencionarse disoluciones de derivado de HAS o disoluciones de derivado de HAS congeladas que tienen contenidos de derivado de HAS preferidos de desde el 2 hasta el 40% en peso, estando el pH de estas disoluciones preferiblemente en un intervalo de desde 3 hasta 10 y la concentración del tampón usado está preferiblemente en el intervalo de desde 0,1 hasta 1 mol/l.
10 Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente, en el que, tras (i), el derivado de HAS obtenido en (i) se purifica usando ultrafiltración usando agua o una disolución acuosa de tampón que tiene una concentración de desde 0,1 hasta 100 mmol/l, un pH en el intervalo de desde 2 hasta 10, siendo el número de ciclos de intercambio de desde 10 hasta 50.
15 Reacción con agente biológicamente activo BA
Según una realización adicional preferida, la presente invención se refiere a un método en el que el derivado de HES descrito anteriormente
se hace reaccionar además de manera adecuada con un compuesto biológicamente activo BA mediante un grupo acetal o cetal A, grupo A que se transforma preferiblemente en el grupo aldehído o ceto correspondiente antes de la reacción con BA.
25 Lo más preferiblemente, el grupo A, preferiblemente el grupo aldehído o ceto correspondiente, se hace reaccionar con un grupo amino, todavía más preferiblemente con un grupo amino primario comprendido en BA. Para tales casos y para los fines de la presente invención, BA también se representa como H2N-BA’ en el que BA’ es la parte restante de BA.
30 Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, que comprende además
(ii) hacer reaccionar el derivado de HAS según la fórmula (III) mediante el grupo A con un grupo amino de un agente 35 biológicamente activo H2N-BA’, mediante aminación reductora, obteniendo un derivado de HAS según la fórmula (IV)
Según una primera realización de la presente invención, el derivado de HAS obtenido de (i) que se ha purificado
40 preferiblemente se somete adecuadamente a una transformación del grupo A en el grupo aldehído o ceto correspondiente en el que se somete el derivado de HAS resultante a una etapa de purificación y/o aislamiento adecuada antes de la reacción con BA. La transformación en el grupo aldehído o ceto se realiza preferiblemente mediante una reacción de hidrólisis catalizada por ácido. La reacción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 100ºC, más preferiblemente desde 10 hasta 80ºC y más preferiblemente desde 20
45 hasta 60ºC, a un pH que está preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 5, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente desde 1 hasta 3 e incluso más preferiblemente desde 1 hasta menos de 3. La purificación y el intercambio de tampón del producto de la reacción de hidrólisis pueden lograrse mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo mediante diálisis o ultrafiltración. El material transformado puede recuperarse de la disolución como un sólido por ejemplo mediante liofilización.
5 Según una segunda realización de la presente invención, el derivado de HAS obtenido de (i) que se ha purificado preferiblemente se somete adecuadamente a una transformación del grupo A en el grupo aldehído o ceto correspondiente en el que se hace reaccionar el derivado de HAS resultante directamente con BA, es decir sin una etapa de purificación y/o aislamiento adecuada separada del derivado de HAS que comprende el grupo aldehído o
10 ceto. La transformación en el grupo aldehído o ceto se realiza preferiblemente mediante una reacción de hidrólisis catalizada por ácido. La reacción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 100ºC, más preferiblemente desde 10 hasta 80ºC y más preferiblemente desde 20 hasta 60ºC, a un pH que está preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 5, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente desde 1 hasta 3 e incluso más preferiblemente desde 1 hasta menos de 3. El producto de la
15 reacción de hidrólisis puede combinarse con el BA en una disolución tamponada o bien directamente o bien tras haberse ajustado el pH a un valor compatible con la reacción con el BA.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente en el que antes de (ii), el grupo A del derivado de HAS según la fórmula (III) se transforma en el grupo aldehído o ceto
20 correspondiente.
Según una tercera realización concebible de la presente invención, el derivado de HAS obtenido de (i) que se ha purificado preferiblemente se hace reaccionar directamente con BA, es decir se hace reaccionar con BA en condiciones de reacción que permiten la transformación in situ del grupo A en el grupo aldehído o ceto 25 correspondiente sin una etapa de purificación y/o aislamiento adecuada separada y sin una etapa separada para la transformación del grupo A en el grupo aldehído o ceto correspondiente. La transformación en el grupo aldehído o ceto se realiza preferiblemente mediante una reacción de hidrólisis catalizada por ácido. La reacción se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde 0 hasta 100ºC, más preferiblemente desde 10 hasta 80ºC y más preferiblemente desde 20 hasta 60ºC, a un pH que está preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 6, más
30 preferiblemente desde 1 hasta 5, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente desde 1 hasta 3 e incluso más preferiblemente desde 1 hasta menos de 3. El producto de la reacción de hidrólisis puede combinarse con el BA en una disolución tamponada o bien directamente o bien tras haberse ajustado el pH a un valor compatible con la reacción con el BA.
35 Qué método según las tres realizaciones mencionadas anteriormente se lleva a cabo depende, por ejemplo, de la naturaleza específica de la sustancia biológicamente activa BA empleada. Si, por ejemplo, se emplea una proteína tal como EPO, G-CSF o IFN alfa como BA, generalmente la primera o segunda realización identificada anteriormente es adecuada.
40 La reacción en la etapa (ii) se lleva a cabo preferiblemente en un sistema acuoso. El término “sistema acuoso” tal como se usa en este contexto de la presente invención se refiere a un disolvente o a una mezcla de disolventes que comprende agua en el intervalo de desde al menos el 10% en peso, preferiblemente al menos el 50% en peso, más preferiblemente al menos el 80% en peso, incluso más preferiblemente al menos el 90% en peso o hasta el 100% en peso, basándose en el peso de los disolventes implicados. Como disolventes adicionales, pueden mencionarse
45 disolventes tales como DMSO, DMF, etanol o metanol.
Aunque puede concebirse llevar a cabo la reacción en la etapa (ii) en condiciones para obtener la forma no reducida del derivado de HAS según la fórmula (IV), es decir
se prefiere particularmente llevar a cabo la reacción según la etapa (ii) en condiciones de aminación reductora en presencia de al menos un agente reductor adecuado. En particular, en estas condiciones el grupo -CH=N- obtenido mediante la reacción del grupo aldehído o ceto que resulta del grupo A del derivado de HAS y el grupo H2N- de BA
55 se reduce para dar -CH2-NH-.
A modo de ejemplo, pueden emplearse los siguientes agentes reductores: NaBH(OAc)3, borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, compuestos de complejo de borano orgánico tales como un complejo de 4(dimetilamina)piridina-borano, complejo de N-etildiisopropilamina-borano, complejo de N-etilmorfolina-borano, complejo de N-metilmorfolina-borano, complejo de N-fenilmorfolina-borano, complejo de lutidina-borano, complejo de trietilamina-borano, o complejo de trimetilamina-borano. Se prefieren NaBH4 y NaCNBH3, y se prefiere particularmente NaCNBH3.
En una realización, el derivado de HAS se añade a una disolución acuosa que contiene el agente biológicamente activo. De manera preferible, posteriormente se añade el al menos un agente reductor, en particular NaCNBH3.
En una realización alternativa, el derivado de HAS puede llevarse opcionalmente a una disolución acuosa, y después se añade el BA. De manera preferible, posteriormente se añade el al menos un agente reductor, en particular NaCNBH3.
La reacción del derivado de HAS con el grupo amino del compuesto biológicamente activo BA en la etapa (ii) se lleva a cabo preferiblemente a un valor de pH de desde 3 hasta 9, preferiblemente de desde 3 hasta 8, más preferiblemente de desde 3 hasta 7, más preferiblemente desde 3 hasta inferior a 7, tal como a un pH de 3 ó 4 o de 5 ó 6. El valor de pH adecuado de la mezcla de reacción puede ajustarse añadiendo al menos un tampón adecuado. Entre los tampones preferidos, pueden mencionarse tampones acetato, preferiblemente tampón acetato de sodio, tampones fosfato o borato.
La reacción del derivado de HAS obtenido en la etapa b) con el grupo amino del compuesto biológicamente activo BA en la etapa (ii) se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de desde -10 hasta 100ºC, preferiblemente de desde 0 hasta 50ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 37ºC, más preferiblemente de desde 0 hasta 25ºC, tal como de 0, 5, 10, 15, 20 ó 25ºC.
El tiempo de reacción en la etapa (ii) depende de la temperatura, la razón de derivado de HAS, en particular HES, y compuesto BA y la concentración absoluta del derivado de HAS y el compuesto BA. Generalmente, pueden concebirse tiempos de reacción de desde 5 min. hasta 7 d, preferiblemente desde 1 h hasta 7 d.
La razón molar de derivado de HAS obtenido con respecto a compuesto BA en la etapa (ii) es preferiblemente de desde 0:1 hasta 200:1 equivalentes, incluso más preferiblemente desde 1:1 hasta 100: 1, basándose en el peso molecular promedio en número (Mn) del derivado de HAS. Preferiblemente, la razón molar es de desde 1:1 hasta
50:1. Pueden concebirse razones molarse bajas tales como razones molares de 50:1 o inferiores, preferiblemente desde 1:1 hasta 20:1, más preferiblemente desde 1:1 hasta 10:1, e incluso más preferiblemente desde 2:1 hasta 9:1, más preferiblemente desde 3:1 hasta 8: 1 e incluso más preferiblemente desde 4:1 hasta 7:1, por ejemplo, si BA es una proteína, en particular IFN alfa.
En una realización preferida particular la concentración del derivado de HAS usado en la etapa (ii) es superior a aproximadamente el 10% en peso, en particular superior a aproximadamente el 15% en peso, en cada caso con respecto al peso de la disolución de reacción de (ii).
Por tanto, la presente invención también se refiere al método tal como se describió anteriormente, en el que en (ii), la reacción se lleva a cabo, preferiblemente en un sistema acuoso, en presencia de un agente reductor, preferiblemente NaCNBH3, a una temperatura en el intervalo de desde 0 hasta 37ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC y un pH en el intervalo de desde 3 hasta 9, preferiblemente de 3 a inferior a 7, y en el que en (ii), la razón molar del derivado de HAS con respecto a agente biológicamente activo BA es de desde 0,1:1 hasta 200:1 equivalentes, preferiblemente desde 1:1 hasta 50:1 equivalentes, basándose en el peso molecular promedio en número (Mn) del derivado de HAS.
Concentraciones preferidas de BA, tales como, por ejemplo, concentraciones de proteína preferidas de la disolución, preferiblemente la disolución acuosa, sometida a (ii) están en el intervalo de desde 0,1 hasta 10 g/l, más preferiblemente desde 1 hasta 9 g/l. La concentración del derivado de HAS en dicha disolución, antes de (ii) y dada en (p/v), está preferiblemente en el intervalo de desde el 0,1 hasta el 50%, más preferiblemente desde el 0,5 hasta el 45% y más preferiblemente desde el 1 hasta el 40%.
Según una realización concebible, el agente biológicamente activo BA puede disolverse en un medio acuoso, preferiblemente en una disolución acuosa de tampón, en particular en una disolución de tampón acetato de sodio. La disolución acuosa puede contener adicionalmente aditivos, tales como detergentes y/o dispersantes, en particular seleccionados del grupo que consiste en SDS, Chaps, Tween 20, Tween 80, Nonidet P-40 y Triton X 100. Si se usa un detergente y/o dispersante, está preferiblemente presente en una cantidad del 0,005 al 3% en peso, preferiblemente del 0,05 al 3% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,5% en peso, basándose en el peso total de la disolución acuosa.
Si se emplea el al menos un agente reductor según la presente invención, y X, presente en el derivado de HAS empleado para la reacción con BA, es, por ejemplo, -CH=N-, -CH=N-O- o -CH=N-NH-(C=O)-, se reduce preferiblemente para dar como resultado un grupo funcional X que es -CH2-NH-, -CH2-NH-O- o -CH2-NH-NH-(C=O)en las condiciones de aminación reductora usadas para la reacción en (ii).
5 La presente invención también se refiere por tanto al derivado de HAS obtenido o que puede obtenerse mediante el método tal como se describió anteriormente, en particular mediante un método tal como se describió anteriormente en el que en (ii), la reacción se lleva a cabo, preferiblemente en un sistema acuoso, en presencia de un agente reductor, preferiblemente NaCNBH3, a una temperatura en el intervalo de desde 0 hasta 37ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC y un pH en el intervalo de desde 3 hasta 9, más preferiblemente desde 3 hasta 7, más preferiblemente desde
10 3 hasta inferior a 7, y en el que en (ii), la razón molar del derivado de HAS con respecto a agente biológicamente activo BA es de desde 0,1:1 hasta 200:1 equivalentes, preferiblemente desde 1:1 hasta 10:1 equivalentes, basándose en el peso molecular promedio en número (Mn) del derivado de HAS empleado en la etapa (ii), en cada caso con la condición de que X no sea un grupo amida. Se prefieren particularmente razones molares del derivado de HAS con respecto a agente biológicamente activo BA inferiores a 10, tales como desde 1:1 hasta 9:1, más
15 preferiblemente desde 1:1 hasta 8:1, más preferiblemente desde 1:1 hasta 7:1, más preferiblemente desde 1:1 hasta
6:1 e incluso más preferiblemente desde 1:1 hasta 5:1, tal como aproximadamente 1: 1, aproximadamente 2:1, aproximadamente 3:1, aproximadamente 4:1, o aproximadamente 5:1. Aunque pueden concebirse tales razones molares bajas como razones molares de 50:1 o inferiores, más preferiblemente de 10:1 o inferiores, para diversos agentes biológicamente activos, se prefieren por ejemplo para proteínas en las que se prefiere especialmente IFN
20 alfa. En lo que se refiere, por ejemplo, a G-CSF y EPO, se prefieren razones molares de 50:1 o inferiores tales como, por ejemplo, desde 1:1 hasta 50:1. En general, a modo de ejemplo, pueden mencionarse razones molares en el intervalo de desde 1:1 hasta 50: 1 o desde 2:1 hasta 40:1 o desde 3:1 hasta 30:1 o desde 4:1 hasta 20:1 o desde
5:1 hasta 15:1.
25 En caso de emplear una proteína como agente biológicamente activo BA según la presente invención, y especialmente a los intervalos de pH preferidos facilitados anteriormente, particularmente a un pH inferior a 7 y superior o igual a 3, para hacer reaccionar el derivado de HAS predominantemente con el grupo amino situado en el extremo N-terminal de la proteína. El término “predominantemente” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una realización en la que al menos el 50%, preferiblemente al menos el 60%, preferiblemente
30 al menos el 70%, preferiblemente al menos el 80%, preferiblemente al menos el 85% de los grupos amino Nterminales disponibles se hacen reaccionar mediante aminación reductora. También es posible hacer reaccionar al menos el 90% o al menos el 95% o al menos el 96% o al menos el 97% o al menos el 98% o al menos el 99% de los grupos amino N-terminales disponibles. Aunque no puede descartarse completamente el acoplamiento a grupos amino distintos del grupo amino N-terminal, se cree que el acoplamiento mediante aminación reductora según la
35 presente invención a un pH inferior a 7, tiene lugar de manera esencialmente selectiva en el grupo amino N-terminal. En particular, se prefieren estas condiciones de reacción para proteínas que son estables en estas condiciones. Si una proteína es por ejemplo lábil en medio ácido, tal como alfa1-antitripsina (A1AT), entonces se prefiere elegir condiciones de reacción apropiadas, en particular un pH desde inferior a 7,5 hasta superior a 5.
40 Por tanto, la presente invención también se refiere a un método para la preparación de un derivado de HAS que comprende BA’, a un derivado de HAS que puede obtenerse u obtenido mediante tal método y a un derivado de HAS según la fórmula (IV) como tal, tal como se describió anteriormente, en los que la proteína comprende el grupo amino N-terminal y al menos un grupo amino adicional, acoplándose predominantemente dicho derivado de HAS que comprende el HAS al grupo amino N-terminal.
45 Por tanto, la presente invención también se refiere a un derivado de HAS según la fórmula (IV)
50 Además, la presente invención también se refiere a un derivado de hidroxialquilalmidón de fórmula (IV)
en la que X es un grupo funcional que resulta de la reacción de un grupo amino M de un compuesto de reticulación de fórmula (II) 5 M-L-A (II)
en la que X no es un grupo amida -C(=O)-NH-,
10 con hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
mediante el átomo de carbono C* del HAS, en el que C* se oxida opcionalmente, lo más preferiblemente no se oxida 15 antes de la reacción de HAS con M,
en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado,
20 en la que A es un residuo según la fórmula (IIa)
en la que
25 Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en el que Rx es H o alquilo inferior tal como metilo, etilo, o propilo tal como n-propilo o i-propilo, o C(O)-Ry en el que Ry se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y arilo C6-C14, incluso más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y terc-butilo opcionalmente sustituidos, preferiblemente no
30 sustituidos; siendo Rx preferiblemente H;
A1 y A2 son cada uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb) en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y en la que A3 es H o metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un anillo con el átomo de N del grupo amino M
o con un átomo adecuado comprendido en L, siendo A3 preferiblemente H;
5 y en la que L es un espaciador que forma un puente entre M y A,
en la que BA’ es la parte restante de un agente biológicamente activo BA’-NH2 que queda tras la reacción del grupo amino de BA mediante aminación reductora con A o con el grupo aldehído o el grupo ceto correspondiente a A.
En cuanto a realizaciones preferidas con respecto a HAS, preferiblemente HES, y el compuesto de reticulación, se hace referencia a la descripción respectiva anterior.
En lo que se refiere al derivado de HAS de fórmula (IV), X se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en
15 -CH2-NH-, -CH=N-, -CH2-NH-O- y -CH=N-O-, más preferiblemente -CH2-NH- y -CH2-NH-O-, lo más preferiblemente -CH2-NH-.
Además, en lo que se refiere al derivado de HAS de fórmula (IV), L que forma un puente entre M y A es preferiblemente un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId), que consiste preferiblemente en una unidad estructural según la fórmula (IId)
en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste
25 en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido y residuos -O-R” en los que R” se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido; más preferiblemente H o alquilo; más preferiblemente H,
en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
35 El término “sustancia biológicamente activa” (BA) tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una sustancia que puede afectar a cualquier propiedad física o bioquímica de un organismo biológico incluyendo, pero sin limitarse a, virus, bacterias, hongos, plantas, animales y seres humanos. En particular, el término “sustancia biológicamente activa” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una sustancia prevista para el diagnóstico, cura, alivio, tratamiento o prevención de una enfermedad en seres humanos o animales, o para potenciar de otra moda el bienestar físico o mental de seres humanos o animales. Los ejemplos de sustancias activas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, polipéptidos, proteínas, enzimas, fármacos de moléculas pequeñas, colorantes, lípidos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos tales como, por ejemplo, oligonucleótidos que tienen un espaciador adecuado tal como un espaciador de 5’-aminohexilo, polinucleótidos, ácidos nucleicos, células, virus, liposomas, micropartículas y micelas. Preferiblemente, una sustancia biológicamente activa según la presente
45 invención contiene un grupo amino nativo.
Los ejemplos de proteínas incluyen, pero no se limitan a, eritropoyetina (EPO), tal como EPO humana recombinante (rhEPO) o un mimético de EPO, factores estimulantes de colonias (CSF), tales como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhGCSF), alfa-interferón (IFN alfa), beta-interferón (IFN beta) o gamma-interferón (IFN gamma), tal como IFN alfa y IFN beta como IFN alfa o IFN beta humanos recombinantes (rhIFN alfa o rhIFN beta), interleucinas, por ejemplo de IL-1 a IL-34 tales como IL-2 o IL-3 o IL-11 como IL-2 o IL-3 humanas recombinantes (rhIL-2 o rhIL-3), proteínas séricas tales como factores de coagulación II-XIII como factor VIII, factor VII, factor IX, factor II, factor III, factor IV, factor V, factor VI, factor X, factor XI, factor XII, factor XIII, inhibidores de serina proteasa tales como alfa1antitripsina (A1AT), proteína C activada (APC), activadores de plasminógeno tales como activador de plasminógeno 55 de tipo tisular (tPA), tal como activador de plasminógeno tisular humano (hTPA), AT III tal como AT III humana recombinante (rhAT III), mioglobina, albúmina tal como albúmina sérica bovina (BSA), factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de trombocitos (PDGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de cerebro (BDGF), factor de crecimiento nervioso (NGF), factor de crecimiento de células B (BCGF), factor de crecimiento neurotrófico derivado de cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), factores de crecimiento transformantes tales como TGF alfa o TGF beta, BMP (proteínas
morfogénicas óseas), hormonas del crecimiento tales como hormona del crecimiento humana (hGH) como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), factores de necrosis tumoral tales como TNF alfa o TNF beta, somatostatina, somatotropina, somatomedinas, hemoglobina, hormonas o prohormonas tales como insulina, gonadotropina, hormona estimulante de melanocitos (alfa-MSH), triptorelina, hormonas hipotalámicas tales como hormonas antidiuréticas (ADH y oxitocina así como hormonas liberadoras y hormonas inhibidoras de la liberación, hormona paratiroidea, hormonas tiroideas tales como tiroxina, tirotropina, tiroliberina, calcitonina, glucagón, péptidos similares a glucagón (GLP-1, GLP-2 etc.), exendinas tales como exendina-4, leptina, tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), Kemptide (Trp4-Kemptide), vasopresina, gastrina, secretina, integrinas, hormonas de glicoproteínas (por ejemplo LH, FSH etc.), hormonas estimulantes de melanósido, lipoproteínas y apo-lipoproteínas tales como apo-B, apo-E, apo-La, inmunoglobulinas tales como IgG, IgE, IgM, IgA, IgD y fragmentos de las mismas, tales como fragmento Fab derivado de molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G murina (mIgG), hirudina, inhibidor de la ruta tisular, proteínas de plantas tales como lectina o ricina, veneno de abeja, veneno de serpiente, inmunotoxinas, antígeno E, inhibidor de alfa-proteinasa, alérgeno de artemisa, melanina, proteínas de oligolisina, proteínas RGD u opcionalmente receptores correspondientes para una de esas proteínas; prolactina o un mutante de la misma, tal como G129R, en el que el aminoácido de tipo natural en la posición 129, glicina, está sustituido por arginina (un nombre comercial para este mutante es “LactoVert”) y un derivado funcional o fragmento de cualquiera de estas proteínas o receptores.
El polipéptido se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en eritropoyetina (EPO) tal como EPO recombinante humana (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhG-CSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales como fragmento Fab derivado de molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G tal como inmunoglobulina G murina (mIgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), interleucina-2, interleucina-11, alfa-1-antitripsina, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo y un andamiaje proteico alternativo.
Más preferiblemente, el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en eritropoyetina (EPO) tal como EPO recombinante humana (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhGCSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales como fragmento Fab derivado de molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G tal como inmunoglobulina G murina (mIgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), interleucina-2, interleucina-11 y alfa-1-antitripsina.
La sustancia activa se selecciona preferiblemente del grupo compuesto por antibióticos, antidepresivos, antidiabéticos, antidiuréticos, anticolinérgicos, antiarrítmicos, antieméticos, antitusivos, antiepilépticos, antihistamínicos, antimicóticos, antisimpatotónicos, antitrombóticos, andrógenos, anti andrógenos, estrógenos, anti estrógenos, antiosteoporóticos, agentes antitumorales, vasodilatadores, otros agentes antihipertensores, agentes antipiréticos, analgésicos, agentes antiinflamatorios, betabloqueantes, inmunosupresores y vitaminas.
Algunos ejemplos adicionales no limitativos de sustancias activas son alendronato, amikacina, atenolol, azatioprina, cimetidina, clonidina, cosintropina, cicloserina, desmopresina, dihidroergotamina, dobutamina, dopamina, ácido épsilon-aminocapróico, ergometrina, esmolol, famotidina, flecainida, ácido fólico, flucitosina, furosemida, ganciclovir, glucagón, hidralazina, isoproterenol, ketamina, liotironina, LHRH, merpatricina, metildopa, metoprolol, neomicina, nimodipino, nistatina, oxitocina, fentolamina, fenilefrina, procainamida, procaína, propranolol, ritodrina, sotalol, terbutalina, tiamina, tiludronato, tolazolina, trimetoprima, trometamina, vasopresina; amifostina, amiodarona, ácido aminocapróico, aminohipurato de sodio, aminoglutetimida, ácido aminolevulínico, ácido aminosalicílico, amsacrina, anagrelida, anastrozol, asparaginasa (tal como asparaginasa recombinante, por ejemplo a partir de E. coli (rAsparaginasa)), antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfano, cabergolina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cilastatina de sodio, cisplatino, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas, ácido 13-cis-retinóico, ácido retinóico todo trans; dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenac, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorubicina, epirubicina, estramustina, etopósido, exemestano, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutamida, gemcitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecán, itraconazol, goserelina, letrozol, leucovorin, levamisol, lisinopril, levotiroxina de sodio, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalán, mercaptopurina, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, naloxona, nicotina, nilutamida, octreotida, oxaliplatino, pamidronato, pentostatina, pilcamicina, porfímero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrón, raltitrexed, sirolimus, estreptozocina, tacrolimus, tamoxifén, temozolomida, tenipósido, testosterona, tetrahidrocannabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, topotecán, tretinoína, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, dolasetrón, granisetrón; formoterol, fluticasona, leuprolide, midazolam, alprazolam, anfotericina B, podofilotoxinas, antivirales de nucleósidos, aroilhidrazonas, sumatriptán; macrólidos tales como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, leucomicina, miocamicina, rokitamicina, andazitromicina y swinolide A; fluoroquinolonas tales como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, grepafloxacina, gatifloxacina, lomefloxacina, sparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina y sitafloxacina; aminoglicósidos tales como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amikacina, kanamicina, neomicina y estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tales como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas incluyendo agentes sensibles a penicilinasa como penicilina G, penicilina V; agentes resistentes a penicilinasa como meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes activos de microorganismos gram negativos como ampicilina, amoxicilina y hetacilina, cilina y galampicilina; penicilinas antipseudomónicas como carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozilo, ceftbuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cephalexin, cefradrina, cefoxitina, cefamandol, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxilo, cefaloglicina, cefuroxima, ceforamida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicid, cefoperazona, cefotetán, cefinetazol, ceftazidima, loracarbef y moxalactam, monobactams como aztreonam; y carbapenems tales como imipenem, meropenem, isetiouato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, acetamida de triamcinolona, acetonida de budesonida, fluticasona, bromuro de ipratropio, flunisolida, cromolina de sodio y tartrato de ergotamina; taxanos tales como paclitaxel; SN-38 y tirfostinas.
Por tanto, compuestos químicos conocidos por el experto en la técnica como “moléculas pequeñas” también son sustancias biológicamente activas concebibles según la presente invención. El término “molécula pequeña” tal como se usa en este contexto de la presente invención se refiere a un compuesto químico biológicamente activo distinto de una proteína y un oligonucleótido, incluyendo, sin embargo, péptidos de hasta 50 aminoácidos. En el párrafo anterior se indican ejemplos típicos de tales moléculas pequeñas.
Ejemplos para un oligonucleótido son aptámeros y ARNip. También deben mencionarse ácidos nucleicos peptídicos (ANP) como sustancias biológicamente activas concebibles.
Por tanto, la presente invención también se refiere a un método tal como se describió anteriormente y a un derivado de HAS tal como se describió anteriormente, en el que la proteína es eritropoyetina (EPO) tal como EPO recombinante humana (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhG-CSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales como fragmento Fab derivado de molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G tal como inmunoglobulina G murina (mIgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), interleucina-2, interleucina-11, alfa-1-antitripsina, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o un andamiaje proteico alternativo.
El término “andamiaje proteico alternativo” tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a una molécula que tiene capacidades de unión similares a un anticuerpo dado basándose la molécula en un entramado proteico distinto de anticuerpo alternativo. En este contexto, pueden mencionarse los artículos de A. Skerra, T. Hey et al. y H.K. Binz (véase la lista de referencias a continuación).
En lo que se refiere a las sustancias biológicamente activas (BA) de la presente invención, estos compuestos pueden comprender uno o más grupos amino para acoplarse según la fase (ii) de la presente invención. Para casos en los que BA como tal no comprende un grupo amino adecuado para este acoplamiento, es concebible que se introduzca al menos un grupo amino de este tipo en BA mediante funcionalización adecuada mediante métodos conocidos por el experto en la técnica, antes de someter BA a (ii).
Según agentes biológicamente activos descritos anteriormente, en particular con agentes biológicamente activos preferidos descritos anteriormente, y según compuestos de reticulación preferidos descritos anteriormente y los derivados de HAS obtenidos a partir de los mismos, pueden mencionarse los siguientes derivados de HAS como realizaciones preferidas a modo de ejemplo, en los que en cada caso HAS es (según realizaciones preferidas de la presente invención) HES:
o
o
o
15 o o
5 o
o
o
o
o
o
o
15 o
o
en las que BA’ es una proteína, más preferiblemente, en las que la proteína es eritropoyetina (EPO) tal como EPO
10 recombinante humana (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhG-CSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales como fragmento Fab derivado
15 de molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G tal como inmunoglobulina G murina (mIgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), interleucina-2, interleucina-11, alfa-1-antitripsina, un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, o un andamiaje proteico alternativo, en particular en las que la proteína es EPO, IFN alfa o G-CSF. Incluso más preferiblemente, HAS’ es HES’, en las que, incluso más preferiblemente, HES tiene un
20 peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una
25 sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, preferiblemente de 0,7 a 1,3, tal como 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, lo más preferiblemente aproximadamente 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta
12.
30 Según realizaciones especialmente preferidas, la presente invención se refiere a un derivado de HAS según la fórmula
en la que HAS es preferiblemente HES y en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente de 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7,
5 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
Según realizaciones especialmente preferidas adicionales, la presente invención se refiere a un derivado de HAS 10 según la fórmula
en la que HAS es preferiblemente HES y en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular
15 medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta
20 aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
25 Según realizaciones especialmente preferidas adicionales, la presente invención se refiere a un derivado de HAS según la fórmula
30 en la que HAS es preferiblemente HES y en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde
35 aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
40 Según realizaciones especialmente preferidas adicionales, la presente invención se refiere a un derivado de HAS según la fórmula en la que HAS es preferiblemente HES y en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular
5 medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta
10 aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
15 Según realizaciones especialmente preferidas adicionales, la presente invención se refiere a un derivado de HAS según la fórmula
20 en la que HAS es preferiblemente HES y en la que, incluso más preferiblemente, HES tiene un peso molecular medio de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1000 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 800 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 400 kDa, más preferiblemente desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 300 kDa, más preferiblemente desde
25 aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 kDa, en particular desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 kDa, una sustitución molar de 0,1 a 3, preferiblemente 0,4 a 1,3, tal como 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2 ó 1,3, y una razón de sustitución C2:C6 de preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 20, más preferiblemente en el intervalo de desde 2 hasta 15 e incluso más preferiblemente en el intervalo de desde 3 hasta 12.
30 Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, o un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, obtenido o que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano o animal.
35 Además, la presente invención se refiere a un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, o un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, obtenido o que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente, como agente terapéutico o profiláctico.
40 Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende en una cantidad terapéuticamente efectiva un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, o un derivado de HAS que comprende BA’ tal como se describió anteriormente, obtenido o que puede obtenerse mediante un método tal como se describió anteriormente.
45 Los derivados de HAS de la presente invención, que comprenden BA’, pueden administrarse mediante métodos adecuados tales como por ejemplo métodos enterales, parenterales o pulmonares administrados preferiblemente por vías i.v., s.c. o i.m. La vía específica elegida dependerá del estado que está tratándose. Preferiblemente, los derivados pueden administrarse junto con un portador adecuado, tal como se conoce en la técnica (por ejemplo como se usa en el compuesto biofarmacéutico de primera generación/no modificado, libre de albúmina o con albúmina como excipiente), un diluyente adecuado, tal como disoluciones estériles para aplicación i.v., i.m. o s.c. La dosificación requerida dependerá de la gravedad del estado que está tratándose, la respuesta individual del paciente, el método de administración usado y similares. El experto en la técnica puede establecer una dosificación correcta basándose en su conocimiento general.
En lo que se refiere a las composiciones farmacéuticas según la presente invención que comprenden el derivado de HAS que comprende BA’, tal como se describió anteriormente, los derivados de HAS pueden usarse en combinación con un excipiente farmacéutico. Generalmente, el derivado de HAS estará en una forma sólida que puede combinarse con un excipiente farmacéutico adecuado que puede estar en forma o bien sólida o bien líquida. Como excipientes, pueden mencionarse hidratos de carbono, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensioactivos, tampones, ácidos, bases y combinaciones de los mismos. Un hidrato de carbono tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificado y/o un polímero de azúcar puede estar presente como excipiente. Los excipientes de hidratos de carbono específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa, y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones, y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosilsorbitol, mioinositol, y similares. El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o tampón tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato de sodio monobásico, fosfato de sodio dibásico y combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica según la presente invención también puede comprender un agente antimicrobiano para prevenir o evitar el crecimiento microbiano, tal como, por ejemplo, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol y combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica según la presente invención también puede comprender un antioxidante, tal como, por ejemplo, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol bitilado, hidroxitolueno bitilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, galato de propilo, bisulfito de sodio, formaldehidosulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio y combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica según la presente invención también puede comprender un tensioactivo, tal como, por ejemplo, polisorbatos, o ésteres de sorbitano plurónicos; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas ácidos y ésteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA o zinc. La composición farmacéutica según la presente invención también puede comprender ácidos o bases tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de los mismos, y/o hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio y combinaciones de los mismos. Generalmente, el excipiente estará presente en la composición farmacéutica según la presente invención en una cantidad del 0,001 al 99,999% en peso, preferiblemente desde el 0,01 hasta el 99,99% en peso, más preferiblemente desde el 0,1 hasta el 99,9% en peso, en cada caso basándose en el peso total de la composición farmacéutica.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es EPO, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de trastornos anémicos o trastornos de disfunción hematopoyética o enfermedades relacionadas con los mismos.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es G-CSF, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de hemofilia A para el tratamiento de un trastorno caracterizado por una función inmunitaria o hematopoyética reducida. Según una realización preferida, el trastorno caracterizado por una función inmunitaria o hematopoyética reducida es un resultado de quimioterapia, radioterapia, enfermedad infecciosa, neutropenia crónica grave o leucemia.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es IFN alfa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de leucemia por ejemplo leucemia de células pilosas, leucemia mielogenosa crónica, mieloma múltiple, linfoma folicular, cáncer, por ejemplo tumor carcinoide, melanoma maligno y hepatitis, por ejemplo hepatitis B crónica y hepatitis C crónica.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es IFN gamma, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de osteoporosis y/o enfermedad maligna crónica.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es IL-2, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de osteoporosis y/o enfermedad maligna crónica.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es IL-11, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de transfusiones de plaquetas tras quimioterapia mielosupresora.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es A1AT, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfisema, fibrosis quística, dermatitis atópica y/o bronquitis.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es IFN beta, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de esclerosis múltiple, preferiblemente formas recidivantes de esclerosis múltiple.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es factor VII para la preparación de un medicamento para el tratamiento de episodios en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores de factor VIII o factor
IX.
Según otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de un derivado de HAS, preferiblemente un derivado de HES tal como se describió anteriormente, en el que BA es factor IX para la preparación de un medicamento para el control y la prevención de episodios hemorrágicos en pacientes con hemofilia B, por ejemplo deficiencia de factor IX congénita o enfermedad de Christmas, incluyendo el control y la prevención de hemorragias en entornos quirúrgicos.
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Descripción de las figuras
Figura 1: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-IFNa
La figura 1 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES-IFNa según el ejemplo 2. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carriles 1-4: mezclas de reacción según el ejemplo 2. La HESilación satisfactoria de la proteína diana (19 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una
amplia distribución de masa que oscila entre 30 y >200 kDa. Figura 2: Cromatografía de intercambio aniónico de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-IFNa La figura 2 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en una
columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-IFNa según el ejemplo 2. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare). Columna: HiTrap Q HP 1 ml (GE Healthcare) Eluyente A: Tris-Cl 10 mM, pH 8,0. Eluyente B: Tris-Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min, 21ºC.
Parámetros de ejecución:
carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 2 CV 0% de B elución 16 CV 0-50% de B regeneración 10 CV 100% de B nuevo equilibrado 8 CV 0% de B
Carga: 2 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 2, diluida 20 veces en eluyente A y 5 ajustada a pH 8,0.
Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 3: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-EPO
La figura 3 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-EPO según el ejemplo 3. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12%
15 de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante. Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen).
Carril 1: mezcla de reacción según el ejemplo 3.
Carril 2: material de partida de EPO antes de la conjugación.
La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~35-40 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una 25 amplia distribución de masa que oscila entre 55 y >200 kDa.
Figura 4: Cromatografía de intercambio catiónico de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-EPO
La figura 4 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en una columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de oxHES55/0,7-EPO según el ejemplo 3. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare).
35 Columna: HiTrap SP HP (GE Healthcare).
Eluyente A: acetato de sodio 20 mM, pH 4,0.
Eluyente B: acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0.
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 5 ml/min, 21ºC.
Parámetros de ejecución:
carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 1 2 CV 0% de B lavado 2 2 CV 10% de B elución 21 CV 10-52% de B regeneración 8 CV 100% de B nuevo equilibrado 5 CV 0% de B
45 Carga: 2 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 3, diluida 10 veces en eluyente A.
Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 5: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-IFNa
La figura 5 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES-IFNa según el ejemplo 5. 55 La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
5 M: marcador, Mark 12 (Invitrogen).
Carril 1: mezcla de reacción según el ejemplo 5.
La HESilación satisfactoria de la proteína diana (19 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa.
Figura 6: Cromatografía de intercambio aniónico de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-IFNa
La figura 6 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en una
15 columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-IFNa según el ejemplo 5. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare).
Columna: HiTrap Q HP 5 ml (GE Healthcare).
Eluyente A: Tris-Cl 10 mM, pH 8,0.
Eluyente B: Tris-Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0.
25 Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min, 21ºC.
Parámetros de ejecución:
carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 2 CV 0% de B elución 12,5 CV 0-50% de B regeneración 5 CV 100% de B nuevo equilibrado 5 CV 0% de B
Carga: 2 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 5, diluida 20 veces en eluyente A y ajustada a pH 8,0.
Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína
35 con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 7: Mapeo de péptidos de un conjugado de oxHES100/1,0-IFNa
La figura 7 muestra la separación cromatográfica de un conjugado de oxHES-IFNa purificado por IEX según el ejemplo 5 tratado con Endo-LysC. Se realizó la proteolisis usando el 7,5% de Endo-LysC en Tris-Cl 50 mM, pH 8,6, el 0,01% de SDS a 37ºC durante la noche. Se desnaturalizaron las muestras con DTT y cloruro de guanidinio y se analizaron mediante RP-HPLC en una columna Jupiter C4 de 4,6 x 250 mm (Phenomenex) usada con un gradiente de agua/acetonitrilo con TFA. Los cromatogramas mostrados se monitorizaron a 214 nm. La flecha indica la región
45 del cromatograma en la que son visibles fuertes diferencias entre los cromatogramas para la proteína (A) y el conjugado (B). Los picos para L1 y L1/L2 (el péptido N-terminal que resulta del tratamiento con Endo-LysC) está fuertemente reducido para la muestra de conjugado mientras que los demás fragmentos no se ven prácticamente afectados. Estos datos sugieren un acoplamiento preferencial del HES al extremo N-terminal de IFNa.
Figura 8: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-EPO
La figura 8 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-EPO según el ejemplo 6. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
55 Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark12 (Invitrogen).
Carril 1: 10 !g de material de partida de EPO antes de la conjugación.
Carril 2: 5 !g de material de partida de EPO antes de la conjugación.
Carril 3: mezcla de reacción según el ejemplo 6.
5 La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~35-40 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 70 y >200 kDa.
Figura 9: Cromatografía de intercambio catiónico de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-EPO
La figura 14 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en una columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-EPO según el ejemplo 6. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare). 15 Columna: 2x 5 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare).
Eluyente A: acetato de sodio 20 mM, pH 4,0.
Eluyente B: acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0.
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 5 ml/min, 21ºC.
Parámetros de ejecución:
25 carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 1 2 CV 0% de B lavado 2 2 CV 10% de B elución 21 CV 10-52% de B regeneración 2,5 CV 100% de B nuevo equilibrado 5 CV 0% de B
Carga: 2 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 6, diluida 10 veces en eluyente A.
Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 10: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-G-CSF
35 La figura 10 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-G-CSF según el ejemplo 7. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carril 1: mezcla de reacción según el ejemplo 7. 45 Carril 2: material de partida de G-CSF antes de la conjugación.
La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~18 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa. Figura 11: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-G-CSF La figura 11 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento de oxHES100/1,0-G-
CSF según el ejemplo 7 monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: 55 Sistema de cromatografía: Summit, P580 (HPG) (Dionex). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex). Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua.
Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo.
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min, 20ºC.
5 Gradiente: 0-5 min., el 5-55% de B; 5-12 min., el 55-68% de B; 12-17 min., el 100% de B; 17-22 min., el 5% de B; retraso de gradiente de 2,5 min.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de 0,1 mg/ml.
El pico principal a 11,5 min. es el conjugado de HES-proteína separado de G-CSF libre que eluye a ~13 min.
Figura 12: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-IFNa
15 La figura 12 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES-IFNa según el ejemplo 10. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, marcador proteico no teñido de 5-200 kDa (Serva).
Carril 1: mezcla de reacción según el ejemplo 9.
25 La HESilación satisfactoria de la proteína diana (19 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa.
Figura 13: Cromatografía de intercambio aniónico de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-IFNa
La figura 13 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en una columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de HES 100/1,0-IFNa según el ejemplo 10. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
35 Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare).
Columna: 5 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare).
Eluyente A: acetato de sodio 20 mM, pH 4,0.
Eluyente B: acetato de sodio 20 mM, 1 M NaCl, pH 4,0.
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 5 ml/min., 21ºC.
45 Parámetros de ejecución:
carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 1 2 CV 0% de B elución 20 CV 0-50% de B regeneración 10 CV 100% de B nuevo equilibrado 5 CV 0% de B
Carga: 3 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 9, diluida 10 veces en eluyente A.
Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 14: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-EPO
55 La figura 14 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-EPO según el ejemplo 11. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 412% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carril 1: conjugado de HES-EPO purificado por IEX.
5 Carril 2: mezcla de reacción según el ejemplo 11. Carril 3: 5 !g de material de partida de EPO antes de la conjugación. La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~35-40 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una
amplia distribución de masa que oscila entre 70 y >200 kDa. Figura 15: Cromatografía de intercambio catiónico de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-EPO La figura 15 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en
15 una columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de HES 100/1,0-EPO según el ejemplo 11. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare). Columna: 4 x 5 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare). Eluyente A: acetato de sodio 20 mM, pH 4,0. Eluyente B: acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. 25 Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 5 ml/min., 21ºC.
Parámetros de ejecución: carga de muestra de equilibrado 5 CV 0% de B lavado 1 2 CV 0% de B elución 13 CV 0-52% de B regeneración 2,5 CV 100% de B nuevo equilibrado 2,5 CV 0% de B
Carga: 3 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 11, diluida 2 veces en eluyente A. Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la
35 proteína no modificada. Figura 16: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF La figura 16 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF según el
ejemplo 12. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 412% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante. Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción. 45 M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carril 1: conjugado de HES-G-CSF purificado por IEX. Carril 2: mezcla de reacción según el ejemplo 12.
Carril 3: 5 !g de material de partida de G-CSF antes de la conjugación. La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~18 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa.
Figura 17: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF La figura 17 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF según el ejemplo 12 monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Summit, P580 (LPG) (Dionex). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex).
5 Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua. Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC. Gradiente: 0-5 min., el 5-55% de B; 5-12 min., el 55-68% de B; 12-17 min., el 100% de B; 17-22 min., el 5% de B;
retraso de gradiente de 2,5 min. Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de
15 0,1 mg/ml. El pico principal a 10-10,5 min. es el conjugado de HES-proteína separado del G-CSF libre que eluye a ~12 min. Figura 18: Cromatografía de intercambio catiónico de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF La figura 18 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm en
una columna de intercambio iónico de una reacción de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF según el ejemplo 12. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: 25 Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare). Columna: 2 x 5 ml HiTrap SP HP (GE Healthcare). Eluyente A: acetato de sodio 20 mM, pH 4,0. Eluyente B: acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 5 ml/min., 21ºC.
35 Parámetros de ejecución: carga de muestra de equilibrado 5 CV 0% de B lavado 2 CV 0% de B elución 15 CV 0-40% de B regeneración 5 CV 100% de B nuevo equilibrado 5 CV 0% de B
Carga: 3 mg de proteína/ml de resina como mezcla de reacción según el ejemplo 12, diluida 2 veces en eluyente A. Se encuentra HES en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HESilación debilita la interacción de la proteína
con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada. Se hace referencia a las figuras 19-23 en el contexto de los ejemplos respectivos.
Figura 24 La figura 24 muestra una sección del análisis de HPGPC de una reacción de acoplamiento de oxHBS-BSA según “datos adicionales (A.2)” monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 280 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Shimadsu LC10 AD/ Detector de UV: TSP UV 2000 Columna: Superose 6 10/300 GL (Pharmacia).
55 Eluyente: tampón fosfato: (se disolvieron 3,887 g de Na2HPO4 x 2 H2O, 1,967 g de NaH2PO4 x 2 H2O, 11,688 g de NaCl, 0,05 g de NaN3 en agua para la cromatografía (Reagent Pharmakopoea Europaea) hasta un volumen total de 1,0 l. Se filtró la disolución usando un filtro de 0,45 !m)
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 0,4 ml/min., 20ºC. Carga: 0,9 mg de proteína como mezcla de reacción, disuelta en 100 !l hasta una concentración de proteína de
9 mg/ml.
La parte superior muestra el material de partida de BSA antes de la reacción de acoplamiento. De izquierda a derecha, los picos están a 38,038, 39,277 y 42,272.
5 La parte inferior muestra el conjugado de HBS-BSA. De izquierda a derecha, los picos están a 36,795, 39,345 y 41,521.
Figura 25: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHBS-IFNa
La figura 25 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHBS-IFNa según “datos adicionales (A.3)”. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
15 Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen).
Carriles 1-4: mezclas de reacción según “datos adicionales (A.3)”.
La HBSilación satisfactoria de la proteína diana (19 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 30 y >200 kDa.
Figura 26: Cromatografía de intercambio aniónico de una reacción de acoplamiento de oxHBS-IFNa
25 La figura 26 muestra la separación cromatográfica monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm de una reacción de acoplamiento de oxHBS-IFNa según datos adicionales (A.3) usando una columna de intercambio aniónico. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Äkta Explorer 100 (GE Healthcare).
Columna: HiTrap Q HP 1 ml (GE Healthcare).
Eluyente A: Tris·Cl 10 mM, pH 8,0.
35 Eluyente B: Tris·Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0.
Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC.
Parámetros de ejecución:
carga de muestra de equilibrado 10 CV 0% de B lavado 2 CV 0% de B elución 16 CV 0-50% de B regeneración 10 CV 100% de B nuevo equilibrado 8 CV 0% de B
Carga: mezcla de reacción según el ejemplo 3, diluida 20 veces en eluyente A y ajustada a pH 8,0.
45 Se encuentra HBS en exceso no reaccionado en el flujo a través. La HBSilación debilita la interacción de la proteína con la columna dando como resultado tiempos de elución disminuidos para el conjugado en comparación con la proteína no modificada.
Figura 27: Análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHBS-EPO
La figura 27 muestra el análisis de SDS-PAGE de una reacción de acoplamiento de oxHBS-EPO según “datos adicionales (A.4)”. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
55 Carga: 10 !g de proteína como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carril 1: mezcla de reacción según “datos adicionales (A.4)”. Carril 2: material de partida de EPO antes de la conjugación.
La HBSilación satisfactoria de la proteína diana (~35-40 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una
amplia distribución de masa que oscila entre 45 y >200 kDa. Figura 28: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0, grupo de unión (a2) y (Trp4)-Kemptide
La figura 28 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0, grupo de unión (a2) y (Trp4)-Kemptide según el ejemplo 18, tabla 3, monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes:
Sistema de cromatografía: Shimadzu LC 20 Prominence, LC 20AT (LPG) (Shimadzu). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex). Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua. Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC. Gradiente: 0-15 min., el 2-30% de B; 15-20 min., el 30-98% de B; 20-27 min., el 2% de B. Carga: 5 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de
0,05 mg/ml.
El pico principal a 11,5-15 min. es el conjugado de HES-péptido separado de (Trp4)-Kemptide libre que eluye a ~17 min. Figura 29: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0, grupo de unión (a16) y
(Trp4)-Kemptide La figura 29 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0,
grupo de unión (a16) y (Trp4)-Kemptide según el ejemplo 18, tabla 5, línea 13, monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: Sistema de cromatografía: Shimadzu LC 20 Prominence, LC 20AT (LPG) (Shimadzu). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex). Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua. Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC. Gradiente: 0-15 min., el 2-30% de B; 15-20 min., el 30-98% de B; 20-27 min., el 2% de B. Carga: 5 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de
0,05 mg/ml.
El pico principal a 11,5-15 min. es el conjugado de HES-péptido separado de (Trp4)-Kemptide libre que eluye a ~17 min. Figura 30: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0, grupo de unión (a11) y
(Trp4)-Kemptide La figura 30 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0,
grupo de unión (a11) y (Trp4)-Kemptide según el ejemplo 18, tabla 5, línea 24, monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: Sistema de cromatografía: Shimadzu LC 20 Prominence, LC 20AT (LPG) (Shimadzu). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex).
Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua. Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC. Gradiente: 0-15 min., el 2-30% de B; 15-20 min., el 30-98% de B; 20-27 min., el 2% de B. Carga: 5 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de
0,05 mg/ml.
El pico principal a 11,5-15 min. es el conjugado de HES-péptido separado de (Trp4)-Kemptide libre que eluye a ~17 min. Figura 31: Análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0, grupo de unión (a12) y
(Trp4)-Kemptide La figura 31 muestra una sección del análisis de RP-HPLC de una reacción de acoplamiento usando HES100/1,0,
grupo de unión (a12) y (Trp4)-Kemptide según el ejemplo 18, tabla 5, línea 30, monitorizada mediante espectroscopía de UV-Vis a 221 nm. Las condiciones de cromatografía fueron las siguientes: Sistema de cromatografía: Shimadzu LC 20 Prominence, LC 20AT, (LPG) (Shimadzu). Columna: Jupiter C18, 300 A, 5 !m, 4,6 x 150 mm (Phenomenex). Eluyente A: el 0,1% de ácido trifluoroacético en agua. Eluyente B: el 0,1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Condiciones de funcionamiento: velocidad de flujo de 1 ml/min., 20ºC. Gradiente: 0-15 min., el 2-30% de B; 15-20 min., el 30-98% de B; 20-27 min., el 2% de B. Carga: 5 !g de proteína como mezcla de reacción, diluida en agua hasta una concentración de proteína de
0,05 mg/ml.
El pico principal a 11,5-15 min. es el conjugado de HES-péptido separado de (Trp4)-Kemptide libre que eluye a ~17 min. Figura 32: Análisis de SDS-PAGE de reacciones de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF La figura 32 muestra el análisis de SDS-PAGE de reacciones de acoplamiento de HES100/1,0-G-CSF según el
ejemplo 18. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4
12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y un tampón de corrida de MES según las instrucciones del fabricante.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen). Carril 1: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 7 (10 !g de proteína cargada). Carril 2: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 16 (10 !g de proteína cargada). Carril 3: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 27 (10 !g de proteína cargada). Carril 4: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 33 (10 !g de proteína cargada). Carril 5: 0,5 !g de material de partida de rhG-CSF antes de la conjugación. La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~18 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una
amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa. Figura 33: Análisis de SDS-PAGE de reacciones de acoplamiento de HES100/1,0-IFNa y HES100/1,0-EPO La figura 33 muestra el análisis de SDS-PAGE de reacciones de acoplamiento entre HES100/1,0 y rhIFNa o rhEPO
según el ejemplo 18. La separación se realizó en condiciones reductoras usando el sistema NuPAGE (Invitrogen) con el 4-12% de geles de Bis-Tris (1,0 mm) y tampón de corrida de MOPS según las instrucciones del fabricante.
Para la separación electroforética mostrada a la derecha se usó tampón de MES en vez de MOPS.
Carga típica: 10 !g de proteína o bien como material de partida o bien como mezcla de reacción.
M: marcador, Mark 12 (Invitrogen).
Carril 1: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 4.
Carril 2: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 14.
Carril 3: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 25.
Carril 4: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 31.
Carril 5: material de partida de rhIFNa antes de la conjugación.
La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~19 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 50 y >200 kDa.
Carril 6: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 15.
Carril 7: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 5.
Carril 8: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 32.
Carril 9: material de partida de rhEPO antes de la conjugación.
Carril 10: mezcla de reacción según la tabla 5, línea 26.
La HESilación satisfactoria de la proteína diana (~35-40 kDa) se vuelve visible como una banda manchada con una amplia distribución de masa que oscila entre 60 y >200 kDa.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de oxHES55/0,7-N-(3-propioaldehidodietilacetal)
Se sintetizó ácido aldónico de HES (oxHES) tal como se describe en el ejemplo 9 del documento WO 2005/083103 A (en dicho documento, la preparación se describe para un almidón hiperramificado, HBS) partiendo de HES con un peso molecular de 55 kDa y una sustitución molar de 0,7 (HES55/0,7). Se disolvieron 30 g de oxHES 55/0,7, secados durante 2 d a 80ºC, en 60 ml de dimetilformamida (DMF) seca y se calentó la disolución hasta 70ºC. Se añadieron 25 g de 1-amino-3,3-dietoxipropano en 50 ml de DMF seca y se calentó la mezcla de reacción a 70ºC durante 48 h. Se eliminaron la DMF y el 1-amino-3,3-dietoxipropano en exceso a 60-80ºC a vacío utilizando un evaporador rotatorio. Se lavó sólido en bruto restante con acetona hasta que no pudo detectarse color en la disolución de lavado. Se disolvió el producto en 500 ml de agua y se purificó mediante ultrafiltración utilizando una membrana con un punto de corte de 10.000 Dalton. Cuando el pH del material retenido había alcanzado un valor de 6-7, éste volvió a ajustarse a 9 utilizando disolución de hidróxido de sodio 0,1 M. Se repitió este procedimiento cuatro veces. Finalmente se liofilizó el producto.
Ejemplo 2: Preparación de conjugado de oxHES55/0,7-interferón alfa 2b (IFNa)
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo I se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante 24 h para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se concentró el interferón-alfa (interferón alfa-2b humano recombinante preparado mediante tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli), estando compuesto el interferón alfa-2b por 165 aminoácidos y presentando una secuencia de aminoácidos que es idéntica al interferón alfa-2b humano natural (hIFN-alfa-2b)) hasta 16 mg/ml y se transfirió a un tampón de conjugación adecuado (tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0) usando dispositivos de ultrafiltración. Se uso un exceso molar de 10 veces de aldehído de oxHES (basándose en Mw) con una concentración de proteína en la mezcla de reacción de 6 mg/ml; la concentración de aldehído de oxHES era del 20% (p/v). Se combinó el aldehído de oxHES desprotegido con la disolución de proteína y se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 recién preparada (0,5 M en tampón de conjugación) produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 10ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 1) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó el interferón-alfa HESilado de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambioaniónico usando una columna Q HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, el eluyente B era Tris-Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0. El gradiente para la separación del proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 50% de B en 16 CV (figura 2).
Ejemplo 3: Preparación de conjugados de oxHES55/0,7-eritropoyetina (EPO)
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo 1 se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante 24 h para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se combinó el aldehído de oxHES desprotegido con una disolución de EPO (EPO humana recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de EPO humana y esencialmente las mismas características que Erypo® (Ortho Biotech, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche) disponibles comercialmente) (10 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5). Se añadió aldehído de oxHES en un exceso molar de 10 veces (basándose en Mw) en comparación con la concentración de EPO. La concentración de EPO resultante en la mezcla de reacción era de 5 mg/ml, la concentración de aldehído de oxHES era del 10% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 0ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 3) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución de la RP-HPLC usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó la EPO HESilada de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio catiónico usando una columna SP HP con un sistemaÄkta (GE Healthcare). El eluyente A era acetato de sodio 20 mM, pH 4,0, el eluyente B era acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 10% de B, 2 CV; del 10% de B => al 52% de B en 21 CV (figura 4). Se identificaron sitios de acoplamiento de HES en la proteína diana mediante mapeo de péptidos del conjugado de HES-proteína purificado mediante IEX. Se digirieron los conjugados usando una proteasa adecuada (endoproteinasa Lys-C al 2%, pH 8,6, 37ºC, durante la noche) y se separaron los fragmentos resultantes mediante cromatografía en fase inversa en una columna C4 (Phenomenex, Jupiter) usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con TFA. Pudieron identificarse indirectamente los sitios de HESilación en la proteína mediante reducción o desaparición de los péptidos respectivos en el cromatograma en comparación con las digestiones control de la proteína diana sola.
Ejemplo 4: Preparación de oxHES100/1,0-N-(3-propioaldehidodietilacetal)
Se sintetizó ácido aldónico de HES (oxHES) tal como se describe en el ejemplo 9 del documento WO 2005/083103 A (en dicho documento, la preparación se describe para un almidón hiperramificado, HBS) partiendo de HES con un peso molecular de 100 kDa y una sustitución molar de 1,0 (HES 100/1,0). Se disolvieron 30 g de oxHES 100/1,0, secados durante 2 d a 80ºC, en 150 ml de dimetilformamida seca (DMF) y se calentó la disolución hasta 70ºC. Se añadieron 25 g de 1-amino-3,3-dietoxipropano en 60 ml de DMF seca y se calentó la mezcla de reacción a 70ºC durante 48 h. Se eliminaron la DMF y el 1-amino-3,3-dietoxipropano en exceso a 60-80ºC a vacío utilizando un evaporador rotatorio. Se lavó el sólido en bruto restante con acetona hasta que no pudo detectarse color en la disolución de lavado. Se disolvió el producto en 500 ml de agua y se purificó mediante ultrafiltración utilizando una membrana con un punto de corte de 10.000 Dalton. Cuando el pH del material retenido había alcanzado un valor de 6-7, éste volvió a ajustarse a 9 utilizando disolución de hidróxido de sodio 0,1 M. Se repitió este procedimiento cuatro veces. Finalmente se liofilizó el producto.
Ejemplo 5: Preparación de conjugado de HES100/1,0-interferón alfa (IFNa) a partir de HES oxidado
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo 4 se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante la noche para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se concentró interferón-alfa (interferón alfa-2b humano recombinante preparado mediante tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli), estando compuesto el interferón alfa-2b por 165 aminoácidos y presentando una secuencia de aminoácidos que es idéntica a interferón alfa-2b humano natural (hIFN-alfa-2b)) hasta 16 mg/ml y se transfirió a un tampón de conjugación adecuado (tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0) usando dispositivos de ultrafiltración. Se usó un exceso molar de 6 veces de aldehído de oxHES (basándose en Mn) con una concentración de proteína final en la mezcla de reacción de 8 mg/ml; la concentración de aldehído de oxHES era del 20% (p/v). Se combinó el aldehído de oxHES desprotegido con la disolución de proteína y se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 recién preparada (0,5 M en tampón de conjugación) produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 5ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 5) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó el interferón-alfa HESilado de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Q HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, el eluyente B era Tris-Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 50% de B en 12,5 CV (figura 6). Se identificaron sitios de acoplamiento de HES en la proteína diana mediante mapeo de péptidos del conjugado de HES-proteína purificado mediante IEX. Se digirieron los conjugados usando una proteasa adecuada (endoproteinasa Lys-C al 2%, pH 8,6, 37ºC, durante la noche) y se separaron los fragmentos resultantes mediante cromatografía en fase inversa en una columna C4 (Phenomenex, Jupiter) usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con TFA. Pudieron identificarse sitios de HESilación en la proteína indirectamente mediante reducción o desaparición de los péptidos respectivos en el cromatograma en comparación con las digestiones control de la proteína diana sola (figura 7).
Ejemplo 6: Preparación de un conjugado de HES100/1,0-eritropoyetina (EPO) a partir de HES oxidado
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo 4 se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución a 21ºC durante 24 h para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se combinó el aldehído de oxHES desprotegido con una disolución de EPO (EPO humana recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de EPO humana y esencialmente las mismas características que Erypo® (Ortho Biotech, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche) disponibles comercialmente) (10 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5). Se añadió aldehído de oxHES en un exceso molar de 15 veces (basándose en Mn) en comparación con la concentración de EPO. La concentración de EPO resultante en la mezcla de reacción era de 3,7 mg/ml, la concentración de aldehído de oxHES era del 15% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 10ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 8) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó la EPO HESilada de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio catiónico usando una columna SP HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era acetato de sodio 20 mM, pH 4,0, el eluyente B era acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 10% de B, 2 CV; del 10% de B => al 52% de B en 21 CV (figura 9). Se identificaron sitios de acoplamiento de HES en la proteína diana mediante mapeo de péptidos del conjugado de HES-proteína purificado mediante IEX. Se digirieron los conjugados usando una proteasa adecuada (endoproteinasa Lys-C al 2%, pH 8,6, 37ºC, durante la noche) y se separaron los fragmentos resultantes mediante cromatografía en fase inversa en una columna C4 (Phenomenex, Jupiter) usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con TFA. Pudieron identificarse sitios de HESilación en la proteína indirectamente mediante reducción o desaparición de los péptidos respectivos en el cromatograma en comparación con las digestiones control de la proteína diana sola.
Ejemplo 7: Preparación de un conjugado de HES100/1,0-factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de HES oxidado
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo 4 se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución a 21ºC durante la noche para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se combinó el aldehído de oxHES desprotegido con una disolución de rh-Met-G-CSF (5 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5; G-CSF expresado por E.coli, que tiene la misma secuencia de aminoácidos y esencialmente las mismas características que el Neupogen® de Amgen, Múnich, A, comercialmente disponible). Se añadió aldehído de oxHES en un exceso molar de 30 veces (basándose en Mn) en comparación con la concentración de G-CSF. La concentración de G-CSF resultante en la mezcla de reacción era de 1,9 mg/ml, la concentración de aldehído de oxHES era del 20% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 0ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 10) y cromatografía en fase inversa (figura 11) en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA.
Ejemplo 8: Preparación de HES100/1,0-N-(3-propioaldehidodietilacetal)
Se disolvieron 15 g de HES100/1,0 en 35 g de tampón de acetato de sodio (pH = 5 y c = 1 mol/l) y se añadieron 2,07 ml de 1-amino-3,3-dietoxipropano así como 1,885 g de cianoborohidruro de sodio. Se agitó la mezcla de reacción a 60ºC durante 16-24 h, se diluyó con 100 ml de agua, se neutralizó con disolución de hidróxido de sodio diluida y se sometió a tratamiento final mediante ultrafiltración usando una membrana con un punto de corte de
10.000 Da frente a tampón de hidrogenocarbonato de amonio (pH = 9, c = 10 mmol/l, 45 ciclos) así como a agua durante los último 5 ciclos de intercambio. Se sometió a diálisis la disolución de derivado de HES purificado y concentrado (aproximadamente el 20% en peso) frente a disolución de hidróxido de sodio (pH = 12) a 60ºC usando una membrana con un punto de corte de 10.000 Da. Después de eso, se aisló el producto mediante liofilización.
Ejemplo 9: Preparación de HES100/1,0-N-(3-propioaldehído)
Se disolvieron 10 g de HES-N-(3-propioaldehidodietilacetal) del ejemplo 8 en 100 ml de HCl acuoso, pH = 2 (c = 10 mmol/l) y se agitaron a 40ºC durante 16-24 h. Se purificó la mezcla de reacción mediante ultrafiltración usando una membrana con un punto de corte de 10.000 Da frente a HCl acuoso, pH = 2 (10 ciclos) así como a agua durante los últimos 5 ciclos de intercambio. Se llevó a cabo el aislamiento del producto mediante liofilización.
Ejemplo 10: Preparación de un conjugado de HES 100/1,0-interferón alfa (IFNa) a partir de HES
A 400 mg de acetal preparado en el ejemplo 8 se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante la noche para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se concentró interferón-alfa (interferón alfa-2b humano recombinante preparado mediante tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli), estando compuesto el interferón alfa-2b por 165 aminoácidos y presentando una secuencia de aminoácidos que es idéntica al interferón alfa-2b humano natural (hIFN-alfa-2b)) hasta 16 mg/ml y se transfirió a un tampón de conjugación adecuado (tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0) usando dispositivos de ultrafiltración. Se usó un exceso molar de 5 veces de aldehído de HES (basándose en Mw) con una concentración de proteína final en la mezcla de reacción de 7 mg/ml; la concentración de aldehído de HES era del 18% (p/v). Se combinó el aldehído de HES desprotegido con la disolución de proteína y se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 recién preparada (0,5 M en tampón de conjugación) produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 5ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 12) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó el IFNalfa HESilado de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio catiónico usando una columna SP HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era acetato de sodio 20 mM, pH 4,0, el eluyente B era acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 50% de B en 20 CV (figura 13). Se identificaron sitios de acoplamiento de HES en la proteína diana mediante mapeo de péptidos del conjugado de HES-proteína purificado mediante IEX. Se digirieron los conjugados usando una proteasa adecuada (endoproteinasa Lys-C al 2%, pH 8,6, 37ºC, durante la noche) y se separaron los fragmentos resultantes mediante cromatografía en fase inversa en una columna C4 (Phenomenex, Jupiter) usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con TFA. Pudieron identificarse sitios de HESilación en la proteína indirectamente mediante reducción o desaparición de los péptidos respectivos en el cromatograma en comparación con las digestiones control de la proteína diana sola.
Ejemplo 11: Preparación de un conjugado de HES 100/1,0-eritropoyetina (EPO) a partir de HES
Se combinó el aldehído de HES desprotegido del ejemplo 9 con una disolución de EPO (EPO humana recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de EPO humana y esencialmente las mismas características que Erypo® (Ortho Biotech, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche) comercialmente disponibles) (10 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5). Se añadió aldehído de HES en un exceso molar de 40 veces (basándose en Mn) en comparación con la concentración de EPO. La concentración resultante de EPO en la mezcla de reacción era de 3,2 mg/ml, la concentración de aldehído de HES era del 30% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 5ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 14) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó la EPO HESilada de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio catiónico usando una columna SP HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era acetato de sodio 20 mM, pH 4,0, el eluyente B era acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 52% de B en 13 CV (figura 15).
Ejemplo 12: Preparación de un conjugado de HES 100/1,0-factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) a partir de HES
Se combinó el aldehído de HES desprotegido del ejemplo 9 con una disolución de rh-Met-G-CSF (5 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5; G-CSF expresado por E.coli que tiene la misma secuencia de aminoácidos y esencialmente las mismas características que el Neupogen® de Amgen, Múnich, A, comercialmente disponible). Se añadió aldehído de HES en un exceso molar de 40 veces (basándose en Mn) en comparación con la concentración de G-CSF. La concentración de G-CSF resultante en la mezcla de reacción era de 1,3 mg/ml, la concentración de aldehído de HES era del 20% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 10ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para determinar el rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución de la RP-HPLC usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 16) y cromatografía en fase inversa (figura 17) en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución de la RP-HPLC usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó el G-CSF HESilado de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía deintercambio catiónico usando una columna SP HP con un sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era acetato de sodio 20 mM, pH 4,0, el eluyente B era acetato de sodio 20 mM, NaCl 1 M, pH 4,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 40% de B en 15 CV (figura 18).
Ejemplo 13: Bioensayo in vivo de farmacodinamia en ratones (conjugado de HES-EPO según el ejemplo 11)
Se alojaron en grupo ratones Balb C obtenidos de Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemania) que pesaban aproximadamente 18-20 gramos (máx. 10 por jaula) en jaulas según la norma europea tipo III (largo x ancho x alto, 425x266x185 mm) a una temperatura ambiente de 21ºC y una humedad relativa del 55%. Se usó “Tapvei Einstreu” de 4x4x1 mm (madera de Aspen) como material de lecho para las jaulas. Adicionalmente se facilitó viruta de madera. Se cambiaron y se limpiaron las jaulas una vez a la semana. Se facilitó agua potable (pH 3,8-4; ácido sulfúrico) a voluntad. Se numeraron las jaulas de los animales. En cada jaula se marcó a los animales en la oreja y se codificaron adicionalmente con colores. En el día de la asignación aproximadamente y una semana antes del comienzo del tratamiento, se realizó una comprobación de salud inicial. Sólo se usaron animales sanos. Se sometieron a prueba el conjugado de HES-EPO tal como se obtuvo en el ejemplo 11, el material de partida sin modificar (rHuEPO) y Aranesp® de Amgen como una dosis subcutánea en bolo único en 4 ratones por grupo a una dosificación de 100 !g/kg de peso corporal, basándose en el contenido de proteína de las muestras. Se incluyó el mismo volumen de PBS como control de vehículo. En varios momentos en el tiempo (día 0, 3, 6, 9, 13, 16, 20 y 23) se extrajeron muestras de aproximadamente 30-60 !l de sangre completa de la vena de la cola o del plexo venoso retrobulbar usando “capilares para hematocrito” que contenían Na-heparina (Hirschmann Laborgeräte, Alemania) y se centrifugó la sangre completa durante 6 minutos a 10.000 rpm en una centrifugadora Hettich Hämatocrit 210 (Tuttlingen, Alemania) para determinar el hematocrito de cada muestra de sangre completa. Se controlaron la respuesta y la duración eritropoyética como función de cambio de hematocrito [%] como función del tiempo (véase la figura 19). Estos datos muestran que todas las muestras que contenían EPO, Aranesp® o EPO conjugado podían elevar el hematocrito. Aranesp® podía aumentar la potencia en comparación con el material de partida 3-4 veces y también el conjugado de HES-EPO podía aumentar la potencia de 1,5-2 veces en comparación con Aranesp®.
Ejemplo 14: Bioensayo in vivo de farmacodinamia en ratones (conjugado de HES-IFN alfa según el ejemplo 5)
Se sometió a prueba un conjugado de oxHES100/1,0-interferón alfa, preparado según el ejemplo 5 en el ensayo in vivo según el ejemplo 13. La dilución a CE50 de las muestras de suero se representó en una escala semilogarítmica frente al tiempo tras la inyección i.v. Se calculó la semivida a partir de la pendiente de la curva de ajuste exponencial. La semivida de la muestra era de 8,9 horas (véase la figura 20).
La actividad in vitro relativa de un conjugado de oxHES100/1,0-interferón alfa, preparado según el ejemplo 5 en comparación con Intron A se muestra en la figura 21 (en cuanto a la determinación de la actividad in vitro, véase el ejemplo 16 a continuación).
Ejemplo 15: Bioensayo in vivo de farmacodinamia en ratones (conjugado de HES-IFN alfa según el ejemplo 10)
Se sometieron a prueba tres conjugados de HES 100/1,0-interferón alfa, preparados según el ejemplo 10 en el ensayo in vivo según el ejemplo 13. El medio de la dilución a CE50 de las muestras de suero se representó en una escala semilogarítmica frente al tiempo tras la inyección i.v. Se calculó la semivida a partir de la pendiente de la curva de ajuste exponencial. La semivida promedio de las muestras era de 9,7 horas (figura 22). Para el IFN-alfa no modificado, al actividad antiviral del suero era demasiado baja para calcular una semivida sérica. En K.R. Reddy et al. Advaced Drug Delivery Reviews 54 (2002) págs. 571-586 e determinó una semivida sérica de IFN-alfa en ratas (i.v.) de 2 h.
La actividad in vitro relativa de tres conjugados de HES100/1,0-interferón alfa, preparados según el ejemplo 10 en comparación con Intron A se muestra en la figura 23 (en cuanto a la determinación de la actividad in vitro, véase el ejemplo 16 a continuación).
Ejemplo 16: Descripción del procedimiento de prueba: actividad antiviral de interferón-alfa (ejemplos 14 y 15)
Tras diluir previamente los elementos de prueba en medio de cultivo celular, se prepararon diluciones de dos veces en serie. En placas de microtitulación de 96 pocillos, se añadió interferón diluido (en repeticiones de cuatro veces por dilución) a células MDBK recién tripsinizadas (40.000 células por pocillo). Se incubaron los ensayos durante 24 horas a 37ºC (volumen total por pocillo: 175 !l. Posteriormente, se añadieron 50 !l de disolución madre de VSV diluida a cada pocillo (excepto a los pocillos de control positivo) dando como resultado una multiplicidad de infección de 0,1. Se inocularon los siguientes controles en cada ensayo: 12 pocillos que recibieron virus más medio de cultivo celular en lugar de interferón (control negativo) y 12 pocillos que recibieron medio de cultivo celular en lugar de interferón y virus (control positivo). Se incubaron los ensayos durante 42 horas a 37ºC. Al final del periodo de incubación se sustituyó el sobrenadante del cultivo celular de cada pocillo por 50 !l de una disolución de MTT (al menos 2 mg/ml en medio de cultivo celular). Se incubaron las células durante tres horas. Se solubilizó el colorante formazán de color púrpura formado por las células en proliferación añadiendo 100 !l de disolución de isopropanol/HCl (isopropanol con HCl 40 mM) a cada pocillo. Posteriormente, se midieron los valores de absorbancia de las disoluciones a 570/630 nm en un lector de placas de microtitulación. Se calculó la actividad proliferativa de células MDBK que se hicieron crecer en presencia de interferón y VSV para cada dilución de interferón tal como se indica a continuación:
(absorbancia mediadecuatropocillos tratadoscon interferón)-(absorbancia mediadecontrolnegativo))*100 (absorbancia media de control positivo) -(absorbancia media de control negativo)
Se determinó la actividad antiviral de interferón-alfa en cuatro ensayos separados para cada uno de los elementos de prueba. En el sistema de ensayo descrito anteriormente, se sometieron a prueba los conjugados respectivos, conjugado de HES100/1,0-interferón alfa (ejemplo 15 y 10, respectivamente) y conjugado de oxHES100/1,0interferón alfa (ejemplo 14 y 5, respectivamente), en comparación con el material de partida de IFN-alfa no modificado, concretamente Intron A. Se calculó la concentración CPE50 de los materiales.
Ejemplo 17: Preparación de derivados de HES-grupo de unión según la invención
En el ejemplo 17, se produjeron derivados de HES-grupo de unión de la invención. Por un lado, para una estructura de grupo de unión dada, se varió HES con respecto al peso molecular medio, y con respecto a su sustitución molar. Por otro lado, se varió la naturaleza química del grupo de unión, para un material de partida de HES dado.
Se disolvieron las cantidades de HES indicadas en las siguientes tabas 1 y 2 en el volumen apropiado (“V de tampón”) de tampón de acetato de sodio (1 mol/l, pH = 5) mediante agitación vigorosa y calentamiento moderado (hasta 40ºC). A la disolución transparente, se le añadió la cantidad indicada de grupo de unión (40 equivalentes con respecto a Mn de la especie de HES). En algunos casos, se añadió la cantidad de grupo de unión como una disolución de “DMF-grupo de unión”. Por tanto se disolvió la cantidad requerida de grupo de unión en una pequeña cantidad de DMF y se añadió la disolución de DMF-grupo de unión transparente resultante, indicada en la tabla 2 como “V de disolución de DMF-grupo de unión” a la mezcla de reacción. Finalmente, se disolvió NaCNBH3 sólido, indicado como cantidad de NaCNBH3, en la disolución con agitación dando una concentración final de normalmente 0,6 M, y se calentó la mezcla de reacción y se agitó a 60ºC durante 18 – 24 h.
Para realizar el tratamiento final de la reacción, se diluyó la mezcla mediante agua ultrapura dando una concentración final de aproximadamente 100 mg/ml (10% m/v) de derivado de HES y se purificó o bien mediante ultrafiltración (UF) o bien mediante diálisis (D) usando una membrana con un punto de corte de 10 kDa y agua ultrapura como disolvente. En caso de grupo de unión (a2) y (a3), se usó tampón de NH4HCO3 10 mM, pH = 9 seguido por agua ultrapura para la ultrafiltración.
Para la desprotección posterior, se acidificó la disolución de derivado de HES purificada (10%, 100 mg/ml) mediante disolución de HCl concentrada dando la “c (HCl)” con el “nivel de pH” apropiado. Se agitó la mezcla y se calentó a 40ºC durante el tiempo de reacción “t” y posteriormente se neutralizó (NaOH dil.), se sometió a tratamiento final mediante ultrafiltración (punto de corte de membrana de 10 kDa) usando el “disolvente de tratamiento final” adecuado y finalmente se liofilizó dando un polvo de color blanco a amarillento.
Se verificó la derivatización mediante acoplamiento satisfactorio a una molécula diana (Kemptide, véase el siguiente ejemplo 18, tablas 3, 4 y 5). Para los derivados de HES, preparados usando grupo de unión (a15) y (a10), se comprobó la derivatización satisfactoria mediante propiedades de espectro. Todos los derivados de HES, preparados tal como se describió anteriormente, se usaron para la conjugación a las dianas, indicadas en el ejemplo
18 en las tablas 3, 4 y 5.
Abreviaturas usadas en las tabas 1 y 2:
D
diálisis
DMF
dimetilformamida
HES
hidroxietilalmidón
HCl
ácido clorhídrico
NaCNBH3 cianoborohidruro de sodio
NaOH hidróxido de sodio 5 UF ultrafiltración
V volumen
10 Agua agua ultrapura (milliQ)
Se prepararon el derivado de HES de HES 100/1,0 y la estructura del grupo de unión (a2) se prepararon según los ejemplos 8 y 9 de esta invención. La estructura del grupo de unión (a2) se refiere a la estructura (a2) tal como se definió anteriormente en el presente documento, es decir a 1-amino-3,3-dietoxipropano,
Tabla 1: Variación del resto HES (ejemplo 17)
Material de partida
Derivatización
grupo de unión
especie de HES cantidad de HES [g] cantidad de grupo de unión [ml] cantidad de NaCNBH3 [g] V de tampón [ml] tipo de tratamiento final*
(a2)
100/1,0 15 2,07 1,885 35 UF
(a2)
30/0,4 5 1,7 0,628 11,7 UF
(a2)
30/1,0 10 2,94 1,256 23,3 UF
(a2)
60/0,7 C2/C6 = 6 5 0,69 0,628 11,67 UF
(a2)
60/0,7 C2/C6 = 8,5 5 0,82 0,628 11,67 UF
(a2)
60/1,0 C2/C6 = 6 15 2,25 1,884 35 UF
(a2)
60/1,0 C2/C6 = 8,5 5 0,8 0,628 11,67 UF
(a2)
100/0,4 5 0,42 0,628 11,67 UF
(a2)
100/0,7 5 0,52 0,628 11,67 UF
(a2)
100/1,3 5 0,43 0,628 11,67 UF
(a2)
150/0,4 5 0,32 0,628 11,67 UF
(a2)
150/1,0 15 0,95 1,885 11,67 UF
(a2)
300/1,0 5 0,16 0,628 11,67 UF
* Se usó tampón NH4HCO3 (10 Mm, pH=9) seguido por agua ultrapura para la ultrafiltración. Tabla 1: Variación del resto HES (ejemplo 17; continuación)
Material de partida
Desprotección
grupo de unión
especie de HES c (HCl) [mM] nivel de pH t [h] disolvente de tratamiento final
(a2)
100/1,0 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
30/0,4 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
30/1,0 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
60/0,7 C2/C6 = 6 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
60/0,7 C2/C6 = 8,5 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
60/1,0 C2/C6 = 6 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
60/1,0 C2/C6 = 8,5 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
100/0,4 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
100/0,7 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
100/1,3 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
150/0,4 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
150/1,0 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a2)
300/1,0 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
Tabla 2: Variación de la estructura del grupo de unión (ejemplo 17)
Material de partida
Derivatización
grupo de unión
especie de HES cantidad de HES [g] cantidad de grupo de unión [mg] cantidad de NaCNBH3 [g] V de tampón [ml] V de disolución de DMFgrupo de unión [ml] V de reacción tipo de tratamiento final
(a1)#
100/1,0 5 366 628,3 11,67 - - D
(a3)#
100/1,0 15 1058 1883 35 - - UF
(a4)#
100/1,0 1 135,5 125,6 2 0,33 2,33 D
(a16)#
100/1,0 1 138 125,6 2 0,33 2,33 D
(a17)#
100/1,0 10 1654 125,6 23,3 - - UF
(a11)#
100/1,0 1 136 125,6 2 0,33 2,33 D
(a12)#
100/1,0 1 144,6 125,6 2 0,33 2,33 D
(a13)#
100/1,0 0,5 72,4 62,83 1 0,16 1,67 D
(a18)#
100/1,0 10 1479 1256 23,3 - - UF
(a5)#
100/1,0 0,5 72,72 94,25 *1,95 + 0,05 (HOAc) - - UF**
(a14)#
100/1,0 0,5 85,81 62,8 1,17 - - D
(a15)#
100/1,0 0,5 83 62,83 *1,0 + 0,08 (HOAc) - - UF**
(a10)#
60/1,0 0,2 20& 6,5 + 43 !l de DMSO *1,6 + 0,1 (HOAc) - - D
(a21)#
100/1,0 1 55,3 - 3,34 - - D
5 # tal como se define en el contexto de la presente invención
* DMSO en lugar de tampón de acetato de sodio ** centrifugación de la mezcla de reacción diluida y neutralizada antes de la ultrafiltración
& se usaron 20 equivalentes en lugar de 40 (con respecto a Mn de HES) Tabla 2: Variación de la estructura del grupo de unión (ejemplo 17; continuación)
Material de partida
Desprotección
grupo de unión
especie de HES c (HCl) [mM] nivel de pH t [h] disolvente de tratamiento final
(a1)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a3)#
100/1,0 10 2 18-24 HCl 10 mM/ agua
(a4)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a16)#
100/1,0 100 1 2 agua
(a17)#
100/1,0 100 1 2 agua
(a11)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a12)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a13)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a18)#
100/1,0 100 1 2 agua
(a5)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a14)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a15)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
(a10)#
60/1,0 - - - -
(a21)#
100/1,0 10 2 18-24 agua
# tal como se define en el contexto de la presente invención
Ejemplo 18: Preparación de derivados de HES-grupo de unión-agente biológicamente activo según la invención
5 Se transfirió la cantidad de la molécula diana tal como se indica en las siguientes tablas 3, 4 y 5 al tampón de reacción apropiado. Se disolvió la cantidad indicada del derivado de HES-grupo de unión (definido por el grupo de unión y la especie de HES) en tampón de reacción y se mezcló con la disolución de sustancia diana. Se añadió NaCNBH3 (normalmente como una disolución madre 0,5 M en tampón de reacción recién preparada) hasta una
10 concentración final de normalmente 20 mM. Se incubó la mezcla de reacción con control de temperatura a la temperatura “T de reacción” durante el tiempo de reacción “t de reacción”.
El volumen de reacción final (“V de reacción”) y las concentraciones resultantes y las razones de los reactantes se facilitan en las tablas 3, 4 y 5.
15 Se mostró el éxito de la reacción de conjugación mediante análisis cromatográfico (RP-HPLC, SE-HPLC) o SDS-PAGE (véanse las figuras 28 a 33 para derivados seleccionados). En todas las reacciones de acoplamiento descritas en el presente documento pudo detectarse un conjugado de diana-HES. No se optimizaron las condiciones de reacción para las diversas moléculas diana.
20 Abreviaturas usadas:
rhIFNa: interferón-alfa 2b humano recombinante
25 rhEPO: eritropoyetina humana recombinante
rhG-CSF: factor de estimulación de colonias de granulocitos humano recombinante con una metionina Nterminal adicional
30 rhFIX factor IX de coagulación humano recombinante
rhFVIIa: factor VIIa de coagulación humano recombinante
rhGH hormona del crecimiento humana recombinante 35 hFab fragmento Fab derivado de una molécula de inmunoglobulina G humana
mIgG inmunoglobulina G murina
40 GLP-1 péptido-1 similar a glucagón; aminoácidos 1-37
rAsparaginasa asparaginasa recombinante de E. coli
NH2-ADN Oligonucleótido con espaciador 5’-aminohexilo que tiene la secuencia GGC TAC GTC CAG GAG 45 CCA CCT
rhLeptina leptina humana recombinante
AmphoB Anfotericina B, n.º CAS 1397-89-3 50 Kemptide Trp4-Kemptide (Leu-Arg-Arg-Trp-Ser-Leu-Gly), n.º CAS 80224-16-4
NaOAc tampón que contiene acetato de sodio
55 HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico, n.º CAS 7365-45-9
Tabla 3: Variación de las sustancias diana (ejemplo 18)
grupo de unión
especie de HES molécula diana sistema de tampón cantidad de diana cantidad de HES [mg] HES: diana % de HES (p/v)
(a2)
100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 3 mg 76 5:1 (Mw) 18
(a2)
100/1,0 rhFIX HEPES 0,1 M, pH 7 3,5 mg 133 29:1 25
(a2)
100/1,0 rhFVIIa NaOAc 0,1 M, pH 5 40 !g 2,6 50:1 16
(a2)
100/1,0 rhGH Citrato 0,1 M, pH 6 0,1 mg 16 60:1 40
(a2)
100/1,0 mIgG NaOAc 0,1 M, pH 5 0,1 mg 3 80:1 3
(a2)
100/1,0 hFab NaOAc 0,1 M, pH 5 50 !g 3,8 60:1 20
(a2)
100/1,0 GLP-1 NaOAc 0,1 M, pH 5 30 !g 26 60:1 20
(a2)
100/1,0 rAsparaginasa NaOAc 0,1 M, pH 5 30 !g 4 80:1 26
(a2)
100/1,0 NH2-ADN HEPES 0,05 M, pH 7 Mg2+ 10 mM 10 !g 5,5 60:1 20
(a2)
100/1,0 rhLeptina NaOAc 0,1 M, pH 5 0,1 mg 22,5 60:1 25
(a2)
100/1,0 Ampho B NaOAc 0,1 M, pH 5; 80% de DMSO 20 !g 78 60:1 40
(a2)
100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M, pH 5 30 !g 12,1 5,6:1 20
Tabla 3: Variación de las sustancias diana (ejemplo 18, continuación)
estructura del grupo de unión
especie de HES molécula diana conc. de diana [g/l] NaCNBH3 [mg] V de reacción [!l] T de reacción [ºC] t de reacción [h]
(a2)
100/1,0 rhIFNa 7 20 425 5 18
(a2)
100/1,0 rhFIX 6,7 20 531 10 18
(a2)
100/1,0 rhFVIIa 2,5 20 16 10 18
(a2)
100/1,0 rhGH 2,5 20 41 5 18
(a2)
100/1,0 mIgG 0,9 20 107 5 48
(a2)
100/1,0 hFab 2,7 20 19 5 18
(a2)
100/1,0 GLP-1 0,2 20 83 21 18
(a2)
100/1,0 rAsparaginasa 2 20 15 5 18
(a2)
100/1,0 NH2-ADN 0,4 20 16 30 18
(a2)
100/1,0 rhLeptina 1,1 20 90 10 18
(a2)
100/1,0 Ampho B 0,1 20 195 21 18
(a2)
100/1,0 Kemptide 0,5 20 61 5 18
Tabla 4: Variación del resto HES (ejemplo 18)
grupo de unión
especie de HES diana sistema de tampón diana [mg] HES [mg] HES: diana % de HES
(a2)
30/0,4 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 40 8:1 6,5
(a2)
30/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 52 8:1 8,3
(a2)
60/0,7 C2/C6=6 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 97 8:1 16
(a2)
60/0,7 C2/C6=8,5 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 82 8:1 13
(a2)
60/1,0 C2/C6=6 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 94 8:1 15
(a2)
60/1,0 C2/C6=8,5 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 85 8:1 14
(a2)
100/0,4 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 10 314 8:1 25
(a2)
100/0,7 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 130 8:1 21
(a2)
100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 125 8:1 20
(a2)
100/1,3 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 154 8:1 15
(a2)
150/0,4 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 10 415 8:1 33
(a2)
150/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 5 187 8:1 30
(a2)
300/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M, pH 4 10 2437 24:1 40
(a2)
30/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M, pH 5 4,5 173 50:1 23
(a2)
60/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M, pH 5 4,5 313 40:1 30
(a2)
100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M, pH 5 60 5683 40:1 30
(a2)
150/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M, pH 5 4,5 885 50:1 35
Tabla 4: Variación del resto HES (ejemplo 18; continuación) Tabla 5: Variación de la estructura del grupo de unión (ejemplo 18) Tabla 5: Variación de la estructura del grupo de unión (ejemplo 18; continuación)
grupo de unión
especie de HES diana conc. de diana [g/l] NaCNBH3 [mg] V de reacción [!l] T de reacción [ºC] t de reacción [h]
(a2)
30/0,4 rhIFNa 8 20 626 !l 5 18
(a2)
30/1,0 rhIFNa 8 20 626 !l 5 18
(a2)
60/0,7 C2/C6=6 rhIFNa 8 20 625 !l 5 18
(a2)
60/0,7 C2/C6=8,5 rhIFNa 8 20 625 !l 5 18
(a2)
60/1,0 C2/C6=6 rhIFNa 8 20 628 !l 5 18
(a2)
60/1,0 C2/C6=8,5 rhIFNa 8 20 625 !l 5 18
(a2)
100/0,4 rhIFNa 8 20 1257 !l 5 18
(a2)
100/0,7 rhIFNa 8 20 624 !l 5 18
(a2)
100/1,0 rhIFNa 8 20 625 !l 5 18
(a2)
100/1,3 rhIFNa 8 20 627 !l 5 18
(a2)
150/0,4 rhIFNa 8 20 1257 !l 5 18
(a2)
150/1,0 rhIFNa 8 20 623 !l 5 18
(a2)
300/1,0 rhIFNa 1,6 20 6093 !l 5 18
(a2)
30/1,0 rhEPO 6 20 750 !l 10 18
(a2)
60/1,0 rhEPO 4,3 20 1043 !l 10 18
(a2)
100/1,0 rhEPO 3,2 20 18,9 ml 10 18
(a2)
150/1,0 rhEPO 1,8 20 2528 !l 10 18
grupo de unión
especie de HES diana sistema de tampón diana HES [mg] HES: diana
1
(a1) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,3 5,6:1
2
(a3) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 0,1 mg 10,4 40:1
3
(a4) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
4
(a4) 100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M pH 4 0,1 mg 2,7 8:1
5
(a4) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 100 !g 4,3 20:1
6
(a4) 100/1,0 rhG-CSF NaOAc 0,1 M pH 5 53 !g 5,2 30:1
7
(a4) 100/1,0 rhLeptina NaOAc 0,1 M pH 5 0,1 mg 22,5 60:1
8
(a4) 100/1,0 NH2-ADN HEPES 0,05 M pH 7 10 !g 5,5 60:1
9
(a4) 100/1,0 rhFVIIa NaOAc 0,1 M pH 5 40 !g 2,6 50:1
10
(a4) 100/1,0 hFab NaOAc 0,1 M pH 5 50 !g 3,8 60:1
11
(a4) 100/1,0 rhGH Citrato 0,1 M pH 6 0,1 mg 17 60:1
12
(a4) 100/1,0 AmphoB NaOAc 0,1 M pH 5; 80% de DMSO 20 !g 83 60:1
13
(a16) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
14
(a16) 100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M pH 4 0,1 mg 2,7 8:1
15
(a16) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 100 !g 8,6 40:1
16
(a16) 100/1,0 rhG-CSF NaOAc 0,1 M pH 5 44 !g 4,3 30:1
17
(a16) 100/1,0 rhLeptina NaOAc 0,1 M pH 5 0,1 mg 22,5 60:1
18
(a16) 100/1,0 hFab NaOAc 0,1 M pH 5 50 !g 3,8 60:1
19
(a16) 100/1,0 rhGH Citrato 0,1 M pH 6 0,1 mg 18 60:1
20
(a17) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
21
(a17) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 4 mg 513 60:1
22
(a17) 100/1,0 rhFVIIa NaOAc 0,1 M pH 5 40 !g 2,6 50:1
23
(a17) 100/1,0 rhLeptina NaOAc 0,1 M pH 5 0,1 mg 22,5 60:1
24
(a11) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
25
(a11) 100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M pH 4 0,1 mg 2,7 8:1
26
(a11) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 2 mg 173 40:1
27
(a11) 100/1,0 rhG-CSF NaOAc 0,1 M pH 5 55 !g 5,4 30:1
28
(a11) 100/1,0 rhGH Citrato 0,1 M pH 6 0,1 mg 18 60:1
29
(a11) 100/1,0 hFab NaOAc 0,1 M pH 5 50 !g 3,8 60:1
30
(a12) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
31
(a12) 100/1,0 rhIFNa NaOAc 0,1 M pH 4 0,1 mg 2,7 8:1
32
(a12) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 11 mg 478 20:1
33
(a12) 100/1,0 rhG-CSF NaOAc 0,1 M pH 5 47 !g 4,6 30:1
34
(a13) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
35
(a18) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
36
(a18) 100/1,0 rhEPO NaOAc 0,1 M pH 5 4 mg 342 40:1
37
(a5) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 12,1 5,6:1
38
(a14) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 54,3 25:1
39
(a21) 100/1,0 Kemptide NaOAc 0,1 M pH 5 30 !g 54,3 25:1
grupo de unión
especie de HES diana % de HES conc. de diana [g/l] NaCNBH3 [mM] V de reacción [!l] T de reacción [ºC] t de reacción [h]
1
(a1) 100/1,0 Kemptide 20 0,49 20 61 5 18
2
(a3) 100/1,0 rhEPO 30 2,9 20 35 10 18
3
(a4) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
4
(a4) 100/1,0 rhIFNa 20 7,5 20 13 5 18
5
(a4) 100/1,0 rhEPO 20 4,7 20 21 5 18
6
(a4) 100/1,0 rhG-CSF 15 1,5 20 35 10 18
7
(a4) 100/1,0 rhLeptina 25 1,1 20 90 5 18
8
(a4) 100/1,0 NH2-ADN 20 0,4 20 16 30 18
9
(a4) 100/1,0 rhFVIIa 7 1,1 20 39 10 18
10
(a4) 100/1,0 hFab 20 2,7 20 19 5 18
11
(a4) 100/1,0 rhGH 40 2,3 20 44 5 18
12
(a4) 100/1,0 AmphoB 40 0,1 20 208 21 18
13
(a16) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
14
(a16) 100/1,0 rhIFNa 20 7,5 20 13 5 18
15
(a16) 100/1,0 rhEPO 30 3,5 20 29 5 18
16
(a16) 100/1,0 rhG-CSF 15 1,5 20 29 10 18
17
(a16) 100/1,0 rhLeptina 25 1,1 20 90 5 18
18
(a16) 100/1,0 hFab 20 2,7 20 19 5
18
19
(a16) 100/1,0 rhGH 40 2,3 20 44 5 18
20
(a17) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
21
(a17) 100/1,0 rhEPO 40 3,1 20 1284 5 18
22
(a17) 100/1,0 rhFVIIa 6 0,9 20 43 10 18
23
(a17) 100/1,0 rhLeptina 25 1,1 20 90 10 18
24
(a11) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
25
(a11) 100/1,0 rhIFNa 20 7,5 20 13 5 18
26
(a11) 100/1,0 rhEPO 30 3,5 20 579 5 18
27
(a11) 100/1,0 rhG-CSF 15 1,5 20 36 10 18
28
(a11) 100/1,0 rhGH 40 2,3 20 44 5 18
29
(a11) 100/1,0 hFab 20 2,7 20 19 5 18
30
(a12) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
31
(a12) 100/1,0 rhIFNa 20 7,5 20 13 5 18
32
(a12) 100/1,0 rhEPO 20 4,6 20 2389 5 18
33
(a12) 100/1,0 rhG-CSF 15 1,5 20 31 10 18
34
(a13) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
35
(a18) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
36
(a18) 100/1,0 rhEPO 30 3,5 20 1141 5 18
37
(a5) 100/1,0 Kemptide 20 0,5 20 61 5 18
38
(a14) 100/1,0 Kemptide 20 0,1 20 271 5 18
39
(a21) 100/1,0 Kemptide 20 0,1 20 271 25 18
5 Datos adicionales
(A.1) Preparación de oxHBS-N-(3-propioaldehidodietilacetal) a partir de HBS de 7 kDa
Se sintetizó ácido aldónico de almidón hiperramificado (HBS) según el ejemplo 9 del documento WO2005 / 083103 10 A1 partiendo de un almidón hiperramificado (Mw=7000 (7 kDa), grado promedio de ramificación: 15% en moles). Se transfirió el ácido aldónico obtenido a la lactona correspondiente secando durante 24 h a 80ºC (la abreviatura
“oxHBS” se refiere al ácido aldónico de HBS así como a la lactona correspondiente). Se disolvieron 5 g de la lactona en 15 ml de 1-amino-3,3-dietoxipropano y 10 ml de DMF seca y se agitaron a 70ºC durante 48 h. Se evaporaron el 1-amino-3,3-dietoxipropano en exceso y la DMF (dimetilformamida) a vacío y el sólido de color amarillo pálido resultante se lavó con acetona hasta que desapareció el color amarillo. Se disolvió el producto en agua y se purificó mediante ultrafiltración utilizando una membrana con un punto de corte de 1.000 Dalton hasta que el pH del filtrado alcanzó un valor de > 6. Se trató el material retenido con 2 g de una resina de intercambio catiónico ácida (Amberlite® 120) durante 2 h, se eliminó por filtración la resina y se liofilizó la disolución restante. El espectro 1H-RMN del compuesto mostró un triplete a 1,7 y un multiplete a 1,2 ppm que representan los grupos metilo y metileno en posición alfa con respecto al átomo de nitrógeno del residuo del compuesto de unión (1-amino-3,3dietoxipropano).
(A.2) Preparación de conjugado de oxHBS de 7 kDa-albúmina sérica bovina (BSA)
Se disolvieron 750 !g de acetal preparado en (A.1) en 5 ml de HCl 0,01 N. Se ajustó el pH a 2,0 con HCl 1 N, y se agitó la mezcla de reacción a 21ºC durante 18 h. Se añadieron 2 ml de una disolución de BSA al 1% tampón de acetato (pH = 7,0) a 200 !l de la mezcla preparada anteriormente. Se disolvieron 140 mg de cianoborohidruro de sodio en 5 ml de tampón de acetato 0,1 N (pH = 7,0), y se añadió una alícuota de 50 ml a la mezcla de reacción inmediatamente. Se almacenó la mezcla de reacción a 4ºC durante 15 h. El análisis de la mezcla de reacción mediante de cromatografía de exclusión por tamaños reveló un rendimiento de reacción del 90% de conjugado de HBS-BSA. (Figura 24).
(A.3) Preparación de conjugado de oxHBS 65 kDa - interferón-alfa
A 400 mg de un HBS 65 kDa-N-(3-propioaldehidodietilacetal) preparado de manera análoga a (A.1) se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v) y un valor de pH de 2. Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante la noche para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M antes del acoplamiento. Se concentró interferón-alfa (interferón alfa-2b humano recombinante preparado mediante tecnología de ADN recombinante usando Escherichia coli (E. coli), estando compuesto el interferón alfa-2b por 165 aminoácidos y presentando una secuencia de aminoácidos que es idéntica al interferón alfa-2b humano natural (hIFN-alfa-2b)) hasta 16 mg/ml y se transfirió a un tampón de conjugación adecuado (tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 4,0) usando dispositivos de ultrafiltración. Se usó un exceso molar de 10 veces de aldehído de oxHBS (basándose en Mw) con una concentración de proteína final en la mezcla de reacción de 6 mg/ml; la concentración de aldehído de oxHBS era del 20% (p/v). Se combinó el aldehído de oxHBS desprotegido con la disolución de proteína y se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 recién preparada (0,5 M en tampón de conjugación) produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 10ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 25) y cromatografía en fase inversa en una columna C18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA. Se separó el HBS-interferón-alfa de los compuestos que no reaccionaron mediante cromatografía de intercambio aniónico usando una columna Q HP conun sistema Äkta (GE Healthcare). El eluyente A era Tris·Cl 10 mM, pH 8,0, el eluyente B era Tris·Cl 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,0. El gradiente para la separación de proteína conjugada y no modificada era del 0% de B => al 50% de B en 16 CV (figura 26).
(A.4) Preparación de conjugado de oxHBS 65-eritropoyetina (EPO)
A 400 mg de un HBS 65 kDa-N-(3-propioaldehidodietilacetal) preparado de manera análoga a (A.1) se les añadió una cantidad apropiada de HCl 10 mM produciendo una disolución con una concentración del 40% (p/v). Se incubó la disolución con agitación a 21ºC durante la noche para desproteger la función aldehído. Se ajustó el valor de pH al valor usado en el tampón de conjugación mediante la adición de NaOH 0,1 M. Se combinó el aldehído de oxHBS desprotegido con una disolución de EPO (EPO humana recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de EPO humana y esencialmente las mismas características que Erypo® (Ortho Biotech, Jansen-Cilag) o NeoRecormon® (Roche) comercialmente disponibles) (10 mg/ml en el tampón de reacción, tampón de acetato de sodio 0,1 M, pH 5). Se añadió aldehído de oxHBS a un exceso molar de 20 veces (basándose en Mw) en comparación con la concentración de EPO. La concentración de EPO resultante en la mezcla de reacción era de 4,6 mg/ml, la concentración de aldehído de oxHBS era del 20% (p/v). Se inició la reacción de aminación reductora mediante la adición de una disolución de NaCNBH3 0,5 M preparada en tampón de reacción produciendo una concentración final del agente reductor de 20 mM. Tras mezclado exhaustivo, se incubó la reacción durante la noche a 10ºC. Se analizaron las mezclas de reacción mediante SDS-PAGE (figura 27) y cromatografía en fase inversa (figura A.4-1) en una columna C 18 (Phenomenex, Jupiter) para demostrar el acoplamiento satisfactorio y para la determinación del rendimiento de conjugación. Se llevó a cabo la elución usando un gradiente de agua/acetonitrilo ácido con el 0,1% de TFA.

Claims (39)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método para la preparación de un derivado de hidroxialquilalmidón, que comprende
    a. hacer reaccionar hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
    mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor del HAS con el grupo amino M de un compuesto de 10 reticulación según la fórmula (II) M-L-A (II) en la que A es un grupo acetal o un grupo cetal; y L es un espaciador que forma un puente entre M y A, en 15 la que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de HAS con M, obteniéndose un derivado de HAS según la fórmula (III)
    20 en la que X es el grupo funcional que resulta de la reacción del grupo amino M con el HAS mediante el átomo de carbono C* del extremo reductor opcionalmente oxidado del HAS, y
    en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón, y R1, R2 y R3 son 25 independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
  2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que R1, R2 y R3 son independientemente un grupo -(CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
    30 3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón (HES).
  3. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que A es un residuo según la fórmula (IIa)
    en la que
    Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en el que Rx es H o alquilo inferior tal como metilo, etilo o propilo tal como n-propilo o i-propilo, o C(O)-Ry en el que Ry se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y arilo C6-C14, incluso más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y terc-butilo opcionalmente sustituidos, preferiblemente no sustituidos; siendo Rx preferiblemente H; A1 y A2 son cada uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1-tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb)
    en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y
    10 en la que A3 es H o metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un anillo con el átomo de N del grupo amino M o con un átomo adecuado comprendido en L, siendo A3 preferiblemente H.
    15 5. Método según la reivindicación 4, en el que Z1 y Z2 son cada uno O; A3 es H; y en el que A1 y A2 son cada uno etilo o en el que A1 y A2 están formando un anillo según la fórmula (IIb) en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2-.
  4. 6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el grupo amino M es un grupo según la 20 fórmula (IIc)
    en la que Y o bien está ausente o bien es un resto químico seleccionado del grupo que consiste en
    en el que G es O o S o NH, y, si está presente dos veces, cada G es independientemente O o S o NH, prefiriéndose O, y en el que R’ es H o un grupo hidroxilo o un residuo orgánico seleccionado del grupo que
    30 consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo y alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido; más preferiblemente H o alquilo.
    35 7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el grupo amino M es H2N-, H2N-O-, H2NNH-(C=O)-, H3C-NH- o H3C-NH-O-, preferiblemente H2N-, H2N-O- o H2N-NH-(C=O)-.
  5. 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), se hace reaccionar HAS mediante su extremo reductor oxidado con el grupo amino M del compuesto de reticulación, siendo M H2N-, y en el
    40 que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 0 hasta 80ºC, y en el que X es -(C=O)-NH-.
  6. 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), se hace reaccionar HAS, preferiblemente en un sistema acuoso, mediante su extremo reductor no oxidado, con el grupo amino M del
    45 compuesto de reticulación, siendo M H2N-, y en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 20 hasta 80ºC a un pH en el intervalo de desde 4 hasta 7, siendo X -CH=N-.
  7. 10. Método según la reivindicación 9, en el que en (i), la reacción se lleva a cabo en presencia de un agente
    reductor, preferiblemente NaCNBH3, para obtener un derivado de HAS, siendo X -CH2-NH-. 50
  8. 11.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en (i), se hace reaccionar HAS, preferiblemente en un sistema acuoso, mediante su extremo reductor no oxidado con el grupo amino M del compuesto de reticulación, siendo M H2N-O o H2N-NH-(C=O)-, y en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de desde 5 hasta 80ºC a un pH en el intervalo de desde 4,5 hasta 6,5, siendo X
    -CH=N-O- o -CH=N-NH-(C=O)-.
  9. 12.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que L que forma un puente entre a M y A es un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId), que consiste preferiblemente en una unidad estructural según la fórmula (IId)
    en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que
    10 consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, y residuos -O-R’’ en los que R’’ se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido;
    15 más preferiblemente H o alquilo; más preferiblemente H,
    en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
    20 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que L es -(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-, en el que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, y en el que, más preferiblemente, L es -CH2-CH2-.
  10. 14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que L comprende al menos una unidad
    25 estructural -(CL1L2)n-O-(CL1L2)n2-, preferiblemente -(CH2)n1-O-(CH2)n2 en la que n1 es igual a, o diferente de, n2, y en el que el espaciador L está unido preferiblemente mediante -(CL1L2)n1- al grupo amino M del compuesto de reticulación.
  11. 15. Método según la reivindicación 14, en el que L es -((CL1L2)2-O)m-CL1L2-, preferiblemente -((CH2)2-O)m-CH2-, 30 en la que m es 1, 2 ó 3, más preferiblemente 2 ó 3.
  12. 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que L es -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n-, en la que cada n está, independientemente uno de otro, preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 4, más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 3.
  13. 17. Método según la reivindicación 16, en el que L se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-;
    40 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3- y -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-; lo más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2- y -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-.
  14. 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el compuesto de reticulación M-L-A según la fórmula (II) se selecciona del grupo que consiste en H2N-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; 50 H2N-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(OCH2CH3)2, H2N-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; 55 H2N-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2;
    H2N-(CH2)7-CH(OCH2CH3)2; H2N-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(OCH2CH3)2; y
    H2N-NH-(C=O)-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; preferiblemente del grupo que consiste en
    5 H2N-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; H2N-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(OCH2CH3)2,
    10 H2N-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; H2N-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; H2N-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(OCH2CH3)2; y
    15 H2N-NH-(C=O)-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; y más preferiblemente del grupo que consiste en
    20 H2N-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; H2N-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CH(OCH2CH3)2, H2N-(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2; y
    25 H2N-(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-CH(OCH2CH3)2.
  15. 19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el compuesto de reticulación M-L-A
    según la fórmula (II) es 1-amino-3,3-dietoxipropano. 30
  16. 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además
    (ii) hacer reaccionar el derivado de HAS según la fórmula (III) mediante el grupo A con un grupo amino de
    un agente biológicamente activo H2N-BA’, mediante aminación reductora, obteniendo un derivado de HAS 35 según la fórmula (IV)
  17. 21. Método según la reivindicación 20, en el que antes de (ii), se transforma el grupo A del derivado de HAS 40 según la fórmula (III) en el grupo aldehído o ceto correspondiente.
  18. 22. Método según la reivindicación 20 ó 21, en el que en (ii), la reacción se lleva a cabo, preferiblemente en un sistema acuoso, en presencia de un agente reductor, preferiblemente NaCNBH3, a una temperatura en el intervalo de desde 0 hasta 37ºC, preferiblemente de 0 a 25ºC y un pH en el intervalo de desde 3 hasta 9,
    45 preferiblemente desde 3 a 7, más preferiblemente desde 3 hasta inferior a 7, y en el que en (ii), la razón molar del derivado de HAS con respecto al agente biológicamente activo BA es de desde 0,1:1 hasta 200:1 equivalentes, preferiblemente desde 1:1 hasta 50:1 equivalentes, basándose en el peso molecular promedio en número (Mn) del derivado de HAS.
    50 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, en el que el compuesto biológicamente activo BA es un péptido, un oligopéptido, un polipéptido, una proteína, un derivado funcional, fragmento o mimético del polipéptido o proteína, un compuesto de molécula pequeña o un oligonucleótido.
  19. 24. Método según la reivindicación 23, en el que la proteína es eritropoyetina (EPO) tal como EPO humana 55 recombinante (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano
    recombinante (rhG-CSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano
    recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa
    humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del
    crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales
    5
    como fragmento Fab derivado de una molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G
    tal como inmunoglobulina G murina (mlgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como
    asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina),
    interleucina-2, interleucina-11, alfa-1-antitripsina, un anticuerpo o
    un fragmento de anticuerpo o un
    andamiaje proteico alternativo.
    10
  20. 25.
    Derivado de hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (III)
    15 en la que A es un grupo acetal o cetal; L es un espaciador que forma un puente entre X y A; en la que X es un el grupo funcional que resulta de la reacción de un grupo amino M de un compuesto de reticulación de fórmula (II) 20 M-L-A (II) con hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (I)
    mediante el átomo de carbono C* del HAS, en la que C* se oxida opcionalmente antes de la reacción de
    HAS con M,
    en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son 30 independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado.
  21. 26. Derivado de HAS según la reivindicación 25, en el que R1, R2 y R3 son independientemente un grupo -(CH2CH2O)n-H, en el que n es un número entero, preferiblemente 0, 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.
    35 27. Derivado de HAS según la reivindicación 25 ó 26, en el que el hidroxialquilalmidón es hidroxietilalmidón (HES).
  22. 28. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en el que A es un residuo según la
    fórmula (IIa) 40
    en la que
    5 Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en el que Rx es H o alquilo inferior tal como metilo, etilo o propilo tal como n-propilo o i-propilo, o C(O)-Ry en el que Ry se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y arilo C6-C14, incluso más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y terc-butilo opcionalmente sustituidos, preferiblemente no sustituidos; siendo Rx preferiblemente H; A1 y A2 son cada
    10 uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1-tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb)
    15 en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y
    en la que A3 es H o metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un
    anillo con el átomo de N del grupo amino M o con un átomo adecuado comprendido en L, siendo A3
    preferiblemente H.
  23. 29. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en el que X se selecciona del grupo que consiste en -CH=N-, -CH2-NH-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-, -C(=O)-NH-, -C(=O)-NH-NH-, preferiblemente que consiste en -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O- y -CH=N-NH-(C=O)-.
    25 30. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, en el que L que forma un puente entre M y A es un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId), que consiste preferiblemente en una unidad estructural según la fórmula (IId)
    30 en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, y residuos -O-R’’ en los que R’’ se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo,
    35 alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido; más preferiblemente H o alquilo; más preferiblemente H,
    en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente 40 desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
  24. 31. Derivado de HAS según la reivindicación 30, en el que L es -(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-, en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, y en el que, más preferiblemente, L es -CH2-CH2-.
  25. 32. Derivado de HAS según la reivindicación 30, en el que L comprende al menos una unidad estructural -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, preferiblemente -(CH2)n1-O-(CH2)n2 en la que n1 es igual a, o diferente de, n2, y en el que el espaciador L está unido preferiblemente mediante -(CL1L2)n1- al grupo amino M del compuesto de reticulación.
  26. 33. Derivado de HAS según la reivindicación 31, L es -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-, preferiblemente -((CH2)2-O)m5 CH2-, en la que m es 1, 2 ó 3, más preferiblemente 2 ó 3.
  27. 34. Derivado de HAS según la reivindicación 30, en el que L es -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n-, en la que cada n está, independientemente uno de otro, preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 4, más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 3.
  28. 35. Derivado de HAS según la reivindicación 34, en el que L se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; 15 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3- y -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-; lo más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2- y -(CH2)2-(C=O)
    NH-(CH2)2-. 20 36. Derivado de hidroxialquilalmidón según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, que tiene la estructura
  29. 37.
    Derivado de hidroxialquilalmidón según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, que tiene la estructura
  30. 38.
    Derivado de hidroxialquilalmidón de fórmula (IV)
    30 en la que X es un grupo funcional que resulta de la reacción de un grupo amino M de un compuesto de reticulación de fórmula (II) 35 M-L-A (II) en la que X no es un grupo amida -C(=O)-NH-, con hidroxialquilalmidón (HAS) de fórmula (1) 40
    mediante el átomo de carbono C* del HAS, en la que C* se oxida opcionalmente, lo más preferiblemente no se oxida antes de la reacción de HAS con M,
    5 en la que HAS’ es la parte restante de la molécula de hidroxialquilalmidón y R1, R2 y R3 son independientemente hidrógeno o un grupo hidroxialquilo lineal o ramificado,
    en la que A es un residuo según la fórmula (IIa) 10
    en la que
    15 Z1 y Z2 son cada uno independientemente O o S o NRx, preferiblemente O, en el que Rx es H o alquilo inferior tal como metilo, etilo o propilo tal como n-propilo o i-propilo, o C(O)-Ry en el que Ry se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en alquilo C1-C6 y arilo C6-C14, incluso más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo y terc-butilo opcionalmente sustituidos, preferiblemente no sustituidos; siendo Rx preferiblemente H; A1 y A2 son cada
    20 uno independientemente metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo, bencilo, 1,1,1-tricloroetilo, nitrobencilo, metoxibencilo, etoxibencilo, o están formando un anillo según la fórmula (IIb)
    25 en la que A1 y A2, tomados juntos, son -(CH2)2- o -(CH2)3- o -(CH2CH(CH3))-, y
    en la que A3 es H o metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, pentilo, bencilo, o está formando un anillo con el átomo de N del grupo amino M o con un átomo adecuado comprendido en L, siendo A3 preferiblemente H;
    30 y en la que L es un espaciador que forma un puente entre M y A,
    en la que BA’ es la parte restante de un agente biológicamente activo BA’-NH2 que queda tras la reacción del grupo amino de BA mediante aminación reductora con A o con el grupo aldehído o grupo ceto
    35 correspondiente a A.
  31. 39. Derivado de HAS según la reivindicación 38, en el que X se selecciona del grupo que consiste en -CH2-NH-, -CH=N-, -CH2-NH-O y -CH=N-O-, lo más preferiblemente -CH2-NH- y -CH2-NH-O-, lo más preferiblemente -CH2-NH-.
  32. 40. Derivado de HAS según la reivindicación 38 ó 39, en el que L que forma un puente entre M y A es un espaciador que comprende al menos una unidad estructural según la fórmula (IId), que consiste preferiblemente en una unidad estructural según la fórmula (IId)
    en la que L1 y L2 son independientemente uno de otro H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que
    5 consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido, y residuos -O-R’’ en los que R’’ se selecciona del grupo que consiste en alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, alquilarilo, alquilarilo sustituido; preferiblemente H o un residuo orgánico seleccionado del grupo que consiste en alquilo y alquilo sustituido;
    10 más preferiblemente H o alquilo; más preferiblemente H,
    en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, más preferiblemente desde 1 hasta 6, más preferiblemente desde 1 hasta 4, más preferiblemente 2.
    15 41. Derivado de HAS según la reivindicación 40, en el que L es -(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-, en la que n es un número entero desde 1 hasta 20, preferiblemente desde 1 hasta 10, y en el que, más preferiblemente, L es -CH2-CH2-.
  33. 42. Derivado de HAS según la reivindicación 40, en el que L comprende al menos una unidad estructural
    20 -(CL1L2)n)-O-(CL)L2)n2-, preferiblemente -(CH2)n1-O-(CH2)n2 en la que n1 es igual a, o diferente de, n2, y en el que el espaciador L está unido preferiblemente mediante -(CL)L2)n1- al grupo amino M del compuesto de reticulación.
  34. 43. Derivado de HAS según la reivindicación 42, L es -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-, preferiblemente -((CH2)2-O)m25 CH2-, en la que m es 1, 2 ó 3, más preferiblemente 2 ó 3.
  35. 44. Derivado de HAS según la reivindicación 40, en el que L es -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, preferiblemente -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n-, en la que cada n está, independientemente uno de otro, preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 4, más preferiblemente en el intervalo de desde 1 hasta 3.
  36. 45. Derivado de HAS según la reivindicación 44, en el que L se selecciona del grupo que consiste en
    -
    (CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-;
    35 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3- y -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-;
    lo más preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en
    -
    (CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2- y -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-. 40
  37. 46. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, que tiene la estructura
    45 47. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 46, en el que el compuesto biológicamente activo BA es un péptido, un oligopéptido, un polipéptido, una proteína, un derivado funcional, fragmento o mimético del polipéptido o proteína, un compuesto de molécula pequeña o un oligonucleótido.
  38. 48. Derivado de HAS según la reivindicación 47, en el que la proteína es eritropoyetina (EPO) tal como EPO
    50 humana recombinante (rhEPO), un factor estimulante de colonias (CSF) tal como G-CSF como G-CSF humano recombinante (rhG-CSF), interferón (IFN) tal como IFN alfa, IFN beta, IFN gamma como IFN alfa humano recombinante (rhIFN alfa) o IFN beta humano recombinante (rhIFN beta), factor VII tal como factor VIIa humano recombinante (rhFVIIa), factor IX tal como factor IX humano recombinante (rhFIX), hormona del crecimiento (GH) tal como hormona del crecimiento humana recombinante (rhGH), fragmentos Fab tales como fragmento Fab derivado de una molécula de inmunoglobulina G humana (hFab), inmunoglobulina G
    5 tal como inmunoglobulina G murina (mIgG), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1), asparaginasa tal como asparaginasa recombinante (rAsparaginasa), leptina tal como leptina humana recombinante (rhLeptina), interleucina-2, interleucina-11, alfa-1-antitripsina, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un andamiaje proteico alternativo.
    10 49. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48, como agente terapéutico o profiláctico.
  39. 50. Derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48, para su uso en un método para el tratamiento del organismo humano o animal.
    15 51. Composición farmacéutica que comprende, en una cantidad terapéuticamente eficaz, un derivado de HAS según cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48.
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