KR20100099282A - 히드록시알킬 전분 유도체 및 이의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 히드록시알킬 전분 (HAS)을 이러한 HAS의 임의로 산화된 환원성 말단을 통하여, 아미노 기와는 별개로 특이적으로 보호된 카보닐 기, 즉 아세탈 기 또는 케탈 기를 포함하는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시키는 단계를 포함하는, 히드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 히드록시알킬 전분 (HAS)을 이러한 HAS의 임의로 산화된 환원성 말단을 통하여, 아미노 기와는 별개로 특이적으로 보호된 카보닐 기, 즉 아세탈 기 또는 케탈 기를 포함하는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시키는 단계를 포함하는, 히드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 이로써 수득된 HAS 유도체를 알킬화, 바람직하게는 환원적 아민화를 통하여 생물학적 활성 화합물의 아미노 기와 반응시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 더우기, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 HAS 유도체, 및 특이적 HAS 유도체 그 자체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 생물학적 활성 화합물을 함유하는 HAS 유도체를 포함하는 제약 조성물, 치료제 또는 예방제로서의 이들 HAS 유도체 및 약물을 제조하기 위한, 특이적 HAS 유도체의 용도에 관한 것이다.
히드록시알킬 전분 (HAS), 특히 히드록시에틸 전분 (HES)은 95 중량% 이하의 농도로 옥수수 전분에 존재하고 체내에서 알파-아밀라제에 의해 분해되는, 천연 발생적 탄수화물 중합체 아밀로펙틴의 치환된 유도체이다. HES는 특히, 유리한 생물학적 특성을 나타내고, 혈액 용적 대체제로서 사용되고 전문 병원에서는 혈액희석 요법에 사용되고 있다 [참고: Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; Weidler et al., 1991, Arzneimittel-forschung/Drug Res., 41, 494-498].
히드록시에틸 전분 유도체를 제조하는 몇 가지 방식이 당해 분야에 기재되어 있다.
DE 26 16 086에는 헤모글로빈을 히드록시에틸 전분과 접합시키는 방법이 기재되어 있는데, 제1 단계에서는, 가교 결합제 (예: 브로모시안)를 히드록시에틸 전분과 결합시키고, 연속해서 헤모글로빈을 중간체 생성물과 연결시킨다.
HES가 이용되는 한 가지 중요한 분야는 특별한 생리적 효과를 획득하기 위해, 예를 들어 순환계에 적용되는 폴리펩티드를 안정화시키는 것이다. 이들 폴리펩티드의 한 가지 구체적인 예는 순환시 적혈구의 수준을 조절하는 데에 있어서 필수적인 대략 34,000 kDa의 산 당단백질인 에리트로포이에틴 (erythropoietin)이다.
폴리펩티드 및 효소를 적용하는 경우에 발생하는 것으로 널리 공지된 문제점은 이들 단백질이 종종 불만족스러운 안정성을 나타낸다는 것이다. 특히 에리트로포이에틴은 혈장 반감기가 비교적 짧다 [참고: Spivak and Hogans, 1989, Blood 73, 90; McMahon et al., 1990, Blood 76, 1718]. 이는 치료적 혈장 수준이 신속하게 상실되고 정맥내 투여를 반복해서 수행해야만 한다는 것을 의미한다. 더우기, 특정 상황 하에서는 해당 펩티드에 대항한 면역 반응이 관찰된다.
일반적으로는, 폴리펩티드를 중합체성 분자와 커플링시킨 경우에 이러한 폴리펩티드의 안정성이 개선될 수 있고, 이들 폴리펩티드에 대항한 면역 반응이 저하되는 것으로 여겨진다.
WO 94/28024에는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 변형시킨 생리적 활성 폴리펩티드가 저하된 면역원성 및 항원성을 나타내고, 접합되지 않은 단백질 보다 상당히 더 장시간 혈류 내로 순환된다고, 즉 제거되기 까지의 시간이 더 길다고 기재되어 있다. 그러나, PEG-약물 접합체는 몇 가지 단점을 나타내는데, 예를 들어 이는 생체내 분해 경로 요소들에 의해 인식될 수 있는 천연 구조를 나타내지 않고 있다. 따라서, PEG-접합체와는 별개의 기타 접합체 및 단백질 중합화이 생성되어 왔다.
WO 02/080979에는 활성제와 히드록시알킬 전분의 접합체를 포함하는 화합물이 기재되어 있는데, 이러한 활성제와 히드록시알킬 전분은 직접적으로 또는 링커 화합물을 통하여 연결된다. 직접적인 연결이 관련되는 한은, 활성제와 히드록시알킬 전분의 반응을, 10 중량% 이상의 물을 포함하는 수성 매질에서 수행한다. 보호된 카보닐 기를 추가로 함유하는 가교 결합성 화합물의 아미노 기를 통하여 이러한 가교 결합성 화합물과 연결된 히드록시알킬 전분에 관한 예는 전혀 제공되지 않았다. 부가적으로, HAS 유도체를 상기 카보닐 기를 통하여, 생물학적 활성제의 아미노 기와 반응시킴으로써 수득되는 HAS 유도체를 나타내는 어떠한 예도 제공되지 않았다.
WO 03/074087에는 히드록시알킬 전분 분자와 단백질 간의 결합이 공유적이고, 히드록시알킬 전분의 말단 알데히드 기, 또는 이러한 알데히드 기와 단백질의 관능기와의 반응으로부터 생성된 관능기의 커플링 결과인 히드록시알킬 전분 단백질 접합체가 기재되어 있다.
WO 03/074088에는 히드록시알킬 전분과 저분자량 화합물 간의 결합이 공유적이고, 히드록시알킬 전분의 말단 알데히드 기, 또는 이러한 알데히드 기와 단백질의 관능기와의 반응으로부터 생성된 관능기의 커플링 결과인, 저분자량 화합물과의 히드록시알킬 전분 접합체가 기재되어 있다.
WO 2005/014024에는 아미노옥시 기 또는 그의 유도체에 의해 관능화된 중합체, 이와 같이 관능화된 중합체를 옥심 연결성 기에 의해 단백질과 공유적으로 커플링시킨 접합체, 상기 관능성화 중합체의 제조 방법, 상기 접합체의 제조 방법, 상기 발명의 방법에 의해 수득 가능한 바와 같은 관능성화 중합체, 이러한 방법에 의해 수득 가능한 바와 같은 접합체 및 하나 이상의 접합체를 포함하는 제약 조성물, 및 인체 또는 동물체를 예방 또는 치료하기 위한 상기 접합체 및 조성물의 용도가 기재되어 있다.
WO 2005/092390에는 히드록시알킬 전분 또는 히드록시알킬 전분의 유도체와 단백질 간의 공유적 연결에 의해 형성되는, 히드록시알킬 전분과 단백질의 접합체, 및 이들 접합체의 제조 방법 및 이들 접합체의 용도가 기재되어 있다.
WO 2004/024777에는 히드록시알킬 전분 유도체, 특히 히드록시알킬 전분을 링커 화합물의 1급 또는 2급 아미노 기와 반응시키는 방법에 의해 수득 가능한 히드록시알킬 전분 유도체가 기재되어 있다. 특히 바람직한 양태에 따르면, WO 2004/024777에는 히드록시알킬 전분을 링커 화합물의 1급 또는 2급 아미노 기와 반응시키고, 이로써 생성되는 반응 생성물을 링커 화합물의 하나 이상의 기타 반응성 기를 통하여 폴리펩티드, 바람직하게 당단백질, 특히 바람직하게 에리트로포이에틴과 반응시키는 방법에 의해 수득 가능한 히드록시알킬 전분 유도체가 기재되어 있다. 특히 바람직한 히드록시알킬 전분은 히드록시에틸 전분이다. WO 2004/024777에 따르면, 히드록시알킬 전분, 바람직하게 히드록시에틸 전분을 반응 이전에는 산화되지 않는 그의 환원성 말단에서 링커 화합물과 반응시킨다.
WO 2004/024776에는 히드록시알킬 전분 유도체, 특히 히드록시알킬 전분을 가교 결합성 화합물의 1급 또는 2급 아미노 기와 반응시키거나 또는 2개의 가교 결합성 화합물과 반응시키는 방법 (이로써 생성되는 히드록시알킬 전분 유도체는 추가의 화합물의 관능기 Y와 반응할 수 있는 하나 이상의 관능기 X를 갖고 있고, 추가의 화합물의 기 Y는 알데히드 기, 케토 기, 헤미아세탈 기, 아세탈 기 또는 티오 기다)에 의해 수득 가능한 히드록시알킬 전분 유도체가 기재되어 있다. 특히 바람직한 양태에 따르면, WO 2004/024776은 히드록시알킬 전분을 가교 결합성 화합물의 1급 또는 2급 아미노 기와 반응시키고, 이로써 생성되는 반응 생성물을 임의로, 제2 가교 결합성 화합물과 추가로 반응시키며 (이로써 생성되는 히드록시알킬 전분 유도체는 추가의 화합물의 관능기 Y와 반응할 수 있는 하나 이상의 관능기 X를 갖고 있고, 이러한 기 Y는 알데히드 기, 케토 기, 헤미아세탈 기, 아세탈 기 또는 티오 기다), 이로써 생성되는 반응 생성물을 상기 관능기 Y 중의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드, 바람직하게 AT III, IFN-베타 또는 에리트로포이에틴과 같은 폴리펩티드, 특히 바람직하게 에리트로포이에틴과 반응시키는 방법에 의해 수득 가능한 히드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다. 특히 바람직한 히드록시알킬 전분은 히드록시에틸 전분이다. WO 2004/024776에 따르면, 히드록시알킬 전분, 바람직하게 히드록시에틸 전분을, 반응에 앞서 임의로 산화되는 그의 환원성 말단에서 링커 화합물과 반응시킨다.
WO 2005/092928에는 히드록시알킬 전분, 바람직하게 히드록시에틸 전분과 단백질의 접합체가 기재되어 있는데, 이들 접합체는 히드록시알킬 전분 또는 히드록시알킬 전분 유도체의 하나 이상의 알데히드 기와 상기 단백질의 하나 이상의 아미노 기 간의 환원적 아민화 반응에 의해 형성되므로, 히드록시알킬 전분 또는 그의 유도체는 아조메틴 연쇄 또는 아미노메틸렌 연쇄를 통하여 단백질과 공유적으로 연결된다. WO 2005/092928은 또한, 이들 접합체의 제조 방법 및 이들 접합체의 구체적 용도에 관한 것이다.
US 2006/0194940 A1에는 수용성 중합체 알카날이 기재되어 있다. 특히, 중합체와 반응하는 보호된 알데히드 시약이 기재되어 있다. 다(당류)가 총칭적으로 언급되긴 하지만, 특히 바람직한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 전분, 또는 특히 변형된 전분, 예를 들어 히드록시알킬 전분은 US 2006/0194940 A1에 기재되어 있지 않다. 결과적으로, US 2006/0194940 A1에는 소정의 링커 화합물을 히드록시알킬 전분과 커플링시키는 구체적인 방식에 관한 설명이 없다. US 7,157,546 B2, EP 1 591 467 A1 및 WO 2004/022630 A2도 마찬가지이다.
US 6,916,962 B2에는 보호되지 않은 형태 및 보호된 형태의 아미노아세탈 가교 결합성 화합물이 기재되어 있다. 이러한 가교 결합성 화합물과 폴리에틸렌 글리콜 이외의 중합체의 가능한 커플링에 관한 어떠한 설명도 상기 문헌에 포함되어 있지 않다. 특히, 히드록시알킬 전분과 같은 변형된 전분은 커녕 전분도 US 6,916,962 B2에 기재되어 있지 않다. 결과적으로, US 6,916,962 B2에는 소정의 링커 화합물을 히드록시알킬 전분과 커플링시키는 구체적 방식에 관한 설명이 전혀 포함되어 있지 않다. US 6,956,135 B2 및 WO 03/049699 A2도 마찬가지이다.
US 5,990,237에는 보호된 알데히드 기를 함유하는 구조가 기재되어 있다. 이들 구조를 포함하는 화합물은 바람직하게, 폴리에틸렌 글리콜과 커플링시키고, 이러한 커플링은 상기 보호된 알데히드 기 함유 화합물 내에 포함된 관능기로서 할라이드를 통하여 수행하는데, 이때 할라이드 기는 폴리에틸렌 글리콜의 히드록시 기와 반응한다.
본 발명의 목적은 히드록시알킬 전분 유도체를 수득하기 위한 신규 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 신규한 HAS 유도체, 예를 들어 HAS를 특이적으로 관능화된 가교 결합성 화합물과 반응시킴으로써 수득되거나 수득 가능한 HAS 유도체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 추가의 신규한 HAS 유도체, 예를 들어 HAS 유도체 (이는 HAS를 특이적으로 관능화된 가교 결합성 화합물과 반응시킴으로써 수득되거나 수득 가능하다)를 생물학적 활성 화합물의 적합한 관능기와 반응시킴으로써 수득되거나 수득 가능한 HAS 유도체를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 특이적 HAS 유도체를 제조하기 위해서, 한편으론 아미노 기를 통하여 히드록시알킬 전분의 임의로 산화된 환원성 말단과 선택적으로 커플링될 수 있고, 또 다른 한편으론 제2의 관능기로서 완전히 보호된 카보닐 기, 즉 아세탈 기 또는 케탈 기를 갖는 가교 결합성 화합물을 사용하는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 관능기로서 자유 알데히드 또는 케토 기, 또는 예를 들어, 헤미아세탈 기를 갖는 가교 결합성 화합물을 이용하는 양태와 비교해서, 상기와 같이 완전히 보호된 기를 이용하는 것이, HAS와 가교 결합성 화합물과의 반응 동안에 가교 결합성 화합물 분자들 간에 바람직하지 못한 올리고머화 또는 중합 반응이 일어나는 위험을 철저하게 최소화시켜 준다. 예상치 못하게도, 아세탈 기 및 에테르 기와 같은 수 많은 관능기의 특징인, 히드록시알킬 전분, 특히 히드록시에틸 전분의 특이적 화학 구조를 적어도 부분적으로 붕괴시키지 않으면서도, 상기 생성된 HAS 유도체에 포함된 아세탈 또는 케탈 기를 탈보호시키는 것이 가능한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 생물학적 활성 화합물과의 효과적인 커플링을 고려한 HAS 유도체를 제공하기 위해, HAS 구조를 적어도 부분적으로 파괴시키지 않고서도 생성된 HAS 유도체의 관능기를 탈보호시킬 수 있는 가능성과 아울러, 개별적 가교 결합성 화합물 분자들 간의 올리고머화 또는 중합 위험을 최소화함으로써 제1 HAS 유도체를 제조하는 극도의 효과적인 방법을 참작한다.
따라서, 본 발명은
(i) 다음 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)을, 이러한 HAS의 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여 다음 화학식 II에 따르는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시켜 다음 화학식 III에 따르는 HAS 유도체를 수득하는 단계를 포함하는, 히드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법에 관한 것이다:
[화학식 I]
[화학식 II]
M-L-A
[화학식 III]
상기식에서,
A는 아세탈 기 또는 케탈 기이고; L은 M과 A를 브릿징하는 스페이서이며; C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화되며;
X는 아미노 기 M을, HAS의 임의로 산화된 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기이고;
HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이다.
추가로, 본 발명은 상기 방법에 의해 수득 가능하거나 수득되는 히드록시알킬 전분 (HAS) 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 다음 화학식 III의 히드록시알킬 전분 (HAS) 유도체에 관한 것이다:
화학식 III
상기식에서,
A는 아세탈 또는 케탈 기이고; L은 X와 A를 브릿징하는 스페이서이며;
X는 다음 화학식 II의 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M을, 다음 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)의 탄소 원자 C* (여기서, C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화된다)를 통하여 상기 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기이고;
HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이다:
화학식 I
화학식 II
M-L-A
히드록시알킬
전분
본 발명의 맥락에서 용어 "히드록시알킬 전분" (HAS)은 하나 이상의 히드록시알킬 기에 의해 치환시킨 전분 유도체를 지칭한다. 본 발명의 바람직한 히드록시알킬 전분은 화학식 I'에 따르는 구성을 갖는다:
[화학식 I']
상기식에서, HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소, 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기, 또는 기 -[(CR1R2)mO]n[CR3R4]o-OH (여기서, R1, R2, R3 및 R4는 수소 및 알킬 기, 바람직하게는 수소 및 메틸 기로 이루어진 군 중에서 독립적으로 선택되고; m은 2 내지 4인데, 잔기 R1 및 R2는 m 기 CR1R2에서 동일하거나 상이할 수 있으며; n은 0 내지 20, 바람직하게 0 내지 4이고; o는 2 내지 20, 바람직하게 2 내지 4인데, 잔기 R3 및 R4는 o 기 CR3R4에서 동일하거나 상이할 수 있다)이다.
바람직하게, R1, R2 및 R3은 독립적으로, 기 -(CH2CH2O)n-H (여기서, n은 정수, 바람직하게 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)이고, 특히 R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 2-히드록시에틸이다.
화학식 I 및 I'에서, 전분 분자의 환원성 말단은 비-산화된 형태로 제시되고, HAS의 말단 당류 단위는, 예를 들어 용매에 따라서 (자유) 알데히드 형태와 평형 상태로 존재할 수 있는 헤미아세탈 형태로 제시된다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 약어 HAS'는 HAS 분자의 환원성 말단에 말단 당류 단위를 수반하지 않은 HAS 분자를 지칭한다. 이는 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분"을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은 용어 "히드록시알킬 전분"은 말단 탄수화물 부분이 화학식 I 및 I'에서 간결하게 하기 위해 도시된 바와 같은 히드록시알킬 기 R1, R2 및/또는 R3을 포함하는 화합물로 제한되지 않을 뿐만 아니라 말단 탄수화물 부분 및/또는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분 HAS' 내의 어느 곳에도 존재하는 하나 이상의 히드록시 기가 히드록시알킬 기 R1, R2 및/또는 R3에 의해 치환되는 화합물을 지칭한다.
2개 이상의 상이한 히드록시알킬 기를 포함하는 히드록시알킬 전분이 또한 가능하다.
HAS 내에 포함된 하나 이상의 히드록시알킬 기는 하나 이상, 특히 2개 이상의 히드록시 기를 함유할 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, HAS 내에 포함된 하나 이상의 히드록시알킬 기는 하나의 히드록시 기를 함유한다.
"히드록시알킬 전분"이란 표현에는 또한, 알킬 기가 일치환 또는 다치환되는 유도체가 포함된다. 이러한 맥락에서, 알킬 기가 할로겐, 특히 불소, 또는 아릴 기로 치환되는 것이 바람직하다. 더우기, 히드록시알킬 기의 히드록시 기는 에스테르화 또는 에테르화될 수 있다.
더우기, 알킬 대신, 선형 또는 분지된 치환되거나 치환되지 않은 알케닐 기를 사용할 수도 있다.
히드록시알킬 전분은 전분의 에테르 유도체이다. 이러한 에테르 유도체 이외에도, 기타 전분 유도체를 본 발명의 맥락에서 사용할 수도 있다. 예를 들어, 에스테르화 히드록시 기를 포함하는 유도체가 유용하다. 이들 유도체는, 예를 들어 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 모노- 또는 디카복실산의 유도체 또는 그의 치환된 유도체일 수 있다. 특히 유용한 것은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 모노카복실산의 유도체, 특히 아세트산의 유도체이다. 이러한 맥락에서, 아세틸 전분, 부티릴 전분 및 프로피오닐 전분이 바람직하다.
더구나, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 치환되지 않은 디카복실산의 유도체가 바람직하다.
디카복실산의 유도체의 경우에는, 이러한 디카복실산의 제2 카복시 기가 또한 에스테르화되는 것이 유용하다. 더구나, 디카복실산의 모노알킬 에스테르의 유도체가 또한 본 발명의 맥락에서 적합하다.
치환된 모노- 또는 디카복실산의 경우, 치환 기는 바람직하게, 치환된 알킬 잔기에 대해 상기 언급된 바와 동일할 수 있다.
전분을 에스테르화하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다 [참고: 예를 들어, Klemm D. et al, Comprehensive Cellulose Chemistry Vol. 2, 1998, Whiley-VCH, Weinheim, New York, especially chapter 4.4, Esterification of Cellulose (ISBN 3-527-29489-9)].
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 언급된 화학식 I에 따르는 히드록시알킬 전분을 이용한다. HAS' 내에 포함된 기타 당류 환 구조는 상기 명시된 당류 환과 동일하거나 상이할 수 있는데, 상이하다면 환원성 말단이 결여된다는 것이다.
화학식 I에 따르는 잔기 R1, R2 및 R3이 관련되는 한, 그에 대한 구체적인 제한은 없다. 바람직한 양태에 따르면, R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소, 또는 각각의 알킬 잔기에 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 히드록시알킬 기, 히드록시아르알킬 기 또는 히드록시알카릴 기이다. 수소, 및 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 히드록시알킬 기가 바람직하다. 보다 바람직하게는, 히드록시알킬 기가 2 내지 6개 탄소 원자, 보다 바람직하게 2 내지 4개 탄소 원자, 보다 더 바람직하게 2 내지 3개의 탄소 원자를 갖는다. 바람직한 양태에서, 히드록시알킬 전분은 R1, R2 및 R3이 독립적으로, 수소 또는 기 (CH2CH2O)n-H (여기서, n은 정수, 바람직하게 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)인 히드록시에틸 전분이다.
따라서, "히드록시알킬 전분"에는 바람직하게 히드록시에틸 전분, 히드록시프로필 전분 및 히드록시부틸 전분이 포함되고, 히드록시에틸 전분 및 히드록시프로필 전분이 특히 바람직하고, 히드록시에틸 전분이 가장 바람직하다.
알킬, 아르알킬 및/또는 알카릴 기는 선형 또는 분지될 수 있고 적합하게 치환될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, R1, R2 및 R3이 독립적으로, 수소, 또는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기인 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체 및 방법에 관한 것이다.
따라서, R1, R2 및 R3은 바람직하게, H, 히드록시헥실, 히드록시펜틸, 히드록시부틸, 히드록시프로필, 예를 들어 2-히드록시프로필, 3-히드록시프로필, 1-히드록시이소프로필, 히드록시에틸, 예를 들어 2-히드록시에틸일 수 있고, 수소 및 2-히드록시에틸 기가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, R1, R2 및 R3이 독립적으로, 수소 또는 2-히드록시에틸 기인 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체 및 방법에 관한 것이고, R1, R2 및 R3 중의 하나 이상의 잔기가 2-히드록시에틸인 양태가 특히 바람직하다.
히드록시에틸 전분 (HES)이 본 발명의 모든 양태에 가장 바람직하다.
따라서, 본 발명은 중합체가 히드록시에틸 전분이고, 유도체가 히드록시에틸 전분 (HES) 유도체인 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체 및 방법에 관한 것이다.
HAS, 특히 HES는 주로, 분자량 분포, 치환도 및 C2 : C6 치환비를 특징으로 한다. 치환도를 서술하는 2가지 가능성이 있다:
HAS의 치환도 (DS)는 모든 글루코스 부분을 기준으로 하여 치환된 글루코스 단량체 부분을 상대적으로 서술한 것이다.
HAS의 치환 패턴은 또한, 몰 치환 (MS)으로서 서술될 수도 있는데, 이는 글루코스 부분 1개당 히드록시에틸 기의 수를 계수한 것이다.
본 발명의 맥락에서, HAS, 바람직하게 HES의 치환 패턴은 상기 언급된 바와 같은 MS로서 지칭된다 [참고: Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278, in particular p. 273].
MS는 HES 분자를 완전히 가수분해한 후 기체 크로마토그래피에 의해 결정한다. 각각의 HAS, 특히 HES 출발 물질의 MS 값이 제공된다. 이러한 MS 값은 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에서의 유도체화 과정 동안에 전혀 영향을 받지 않는다.
HAS, 특히 HES 용액이 다분산성 조성물로서 존재하는데, 각 분자는 중합도, 분지화 부위 수 및 패턴, 및 치환 패턴과 관련하여 서로 상이하다. 따라서, HAS, 특히 HES는 분자량이 상이한 화합물들의 혼합물이다. 결과적으로, 특별한 HAS, 특히 HES 용액은 통계적 수단의 도움을 받아 평균 분자량으로써 결정된다. 이러한 맥락에서, Mn은 분자 수에 따라서 산술적 평균으로서 계산한다. 또 다른 한편, 중량 평균 분자량인 Mw (또는 MW)는 HAS, 특히 HES의 질량에 좌우되는 특정 단위를 나타낸다.
이러한 맥락에서, 수 평균 분자량은 다음 수학식 1로써 정의된다:
상기식에서, ni는 몰 질량 Mi의 종 i의 분자 수이고;
Mw는 다음 수학식 2로써 정의된 중량 평균 분자량이다:
상기식에서, ni는 몰 질량 Mi의 종 i의 분자 수이고;
바람직하게, 본 발명에 사용된 히드록시알킬 전분, 특히 히드록시에틸 전분은 평균 분자량 (중량 평균)이 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa이다. 히드록시에틸 전분은 추가로, 바람직한 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.1 내지 2, 보다 바람직하게 0.1 내지 0.9 또는 0.4 내지 2, 바람직하게 0.4 내지 1.3일 수 있고, 히드록시에틸 기를 기준으로 하여 바람직한 C2 : C6 치환비가 2 내지 20의 범위일 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "평균 분자량"은 문헌 [참고: Sommermeyer et al., 1987, Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278; and Weidler et al., 1991, Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498]에 기재된 바와 같은 LALLS-(저각 레이저 광 산란)-GPC 방법에 따라서 결정된 바와 같은 중량에 관한 것이다. 평균 분자량이 10 kDa 이하인 경우에는 부가적으로, 기존에 LALLS-GPC에 의해 적합한 것으로 밝혀진 표준을 이용하여 교정을 수행하였다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 이용된 히드록시에틸 전분의 평균 분자량은 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이다.
추가로, HAS, 특히 HES의 몰 치환은 바람직하게 약 0.1 내지 약 3, 바람직하게 약 0.4 내지 약 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이다.
평균 분자량이 약 5 내지 300 kDa, 바람직하게 50 내지 150 kDa인 HES의 한 예는 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3인 HES이다.
C2 : C6 치환비가 관련되는 한은, 이러한 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
히드록시알킬 전분 이외의 전분
일반적으로, 본 발명의 방법을 또한 수행할 수 있고, 본 발명의 유도체는 또한, 상기 언급된 바와 같은 히드록시알킬 전분, 특히 히드록시에틸 전분 이외의 전분을 이용하여 제조할 수 있는데, 단 이들 전분은 헤미아세탈 형태로, 임의로 (자유) 알데히드 형태와 평형 상태로 존재하는 환원성 말단을 또한 함유해야 하는데, 이러한 환원성 말단은 산화되어 각각의 산화된 형태를 제공하는 것이 적합할 수 있다. 특히, 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물, 즉 분지화도가 아밀로펙틴 보다 상당히 더 높고, 글리코겐의 알파-1,6-분지화도를 갖고 있거나 심지어 이를 초과하며, 치환된 경우에는 몰 치환 MS가 단지 0.3 이하, 바람직하게 0.05 내지 0.3인 전분을 이용할 수 있다. 이와 같이 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 MS (몰 치환)은 무수 글루코스 단위당 히드록시에틸 또는 히드록시프로필 기의 평균 수를 의미한다. MS는 통상적으로, 샘플 중의 히드록시에틸 또는 히드록시프로필 기의 함량, 및 내부에 존재하는 무수 글루코스 단위에 대한 컴퓨터 이용한 할당량을 결정함으로써 측정한다. MS는 기체 크로마토그래피에 의해 결정할 수도 있다. 분지화도는 중합체 내의 알파-1,4,6-글리코시드성으로 연결된 무수 글루코스의 몰 %로서 기체 크로마토그래피적 메틸화 분석에 의해 결정할 수 있다. 분지화도는 모든 경우에 있어서 평균인데, 이는 본 발명의 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물이 다분산성 화합물이기 때문이다. 상기 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물 내의 글루코스 단위는 알파-1,4- 및 알파-1,6-연쇄를 통하여 연결된다. 분지화도는 모든 무수 글루코스 전체를 기준으로 한 몰 %로서의 알파-1,4,6-연결된 글루코스 단위 비율을 의미한다. C2/C6 비는 C-2에서의 치환 대 C-6에서의 치환 비를 표현한 것이다. 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물는 분지화 효소의 도움으로 글루코스전이 단계에 의해 달성될 수 있는 바람직한 분지화도가 6% 내지 50%이다. 보다 더 바람직하게, 분지화도는 10 내지 45의 범위, 보다 바람직하게 20 내지 40의 범위, 예를 들어 20, 25, 30, 35, 또는 40이다. 또한, 20 초과 내지 40의 범위가 바람직하고, 바람직하게는 20 초과 내지 30, 예를 들어 21 내지 40, 바람직하게 21 내지 30이다. 이를 위해 사용될 수 있는 출발 물질은 원칙적으로 모든 전분이지만, 아밀로펙틴 비율이 높거나 아밀로펙틴 분획 자체인 왁스상 전분이 바람직하다. 본 발명에 따라서 사용하는 데에 필요한, 전분 생성물 (이들 "기타 전분"이 관련되는 한)의 분지화도는 8% 내지 20%의 범위인데, 이는 무수 글루코스의 몰 %로서 표현된다. 이는 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있는 전분 생성물이 평균 1개의 알파-1,6-연쇄를 갖고 있으므로, 12.5 내지 5개 글루코스 단위당 분지점을 갖고 있다는 것을 의미한다. 바람직한 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물은 분지화도가 10% 초과 20% 이하, 특히 11 내지 18%이다. 보다 높은 분지화도는 본 발명의 전분 생성물의 용해도가 보다 크고, 체내에서의 이들 용해된 전분 생성물의 생체내 이용 효율이 보다 크다는 것을 의미한다. 특히 바람직한 것은 분지화도가 10% 초과, 특히 11% 내지 18%인 변형되지 않은 전분 생성물이다. 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물은 경우에 따라 소위 분지화 또는 전이 효소를 이용하는 표적화 효소적 어셈블리에 이어 자유 히드록실 기를 히드록시에틸 또는 히드록시프로필 기로 부분적으로 유도체화시킴으로써 제조할 수 있다. 대신, 소위 분지화 또는 전이 효소를 이용하는 효소적 어셈블리에 의해 히드록시에틸화 또는 히드록시프로필화 전분을 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물로 전환시키는 것이 가능하다. 분지화도가 10% 이하인 밀 전분으로부터 효소적으로 분지된 전분 생성물을 수득하는 것은 그 자체가 공지되어 있고, 예를 들어 WO 00/66633 A에 기재되어 있다. 적합한 분지화 또는 전이 효소 및 그의 수득 방법은 WO 00/18893 A, US 4,454,161, EP 0 418 945 A, JP 2001294601 A 또는 US 2002/065410 A에 기재되어 있다. 이러한 후자 공보에는 분지화도가 4% 초과 10% 이하, 또는 그 이상인 변형되지 않은 전분 생성물이 기재되어 있다. 효소적 글리코실전이 반응은 그 자체가 공지된 방식, 예를 들어 왁스상 옥수수 전분; 아밀로펙틴 함량이 높은 감자로부터 수득된 감자 전분; 또는 벼, 카사바 (=manioc), 밀, 아밀로펙틴 함량이 높은 밀, 옥수수, 아밀로펙틴 함량이 높은 옥수수, 또는 아밀로스 함량이 높은 옥수수로부터 수득된 전분을, 수성 용액 중에서 pH 6 내지 8 및 25 내지 40℃의 순한 조건 하에서 적당한 효소와 함께 항온 배양함으로써 수행할 수 있다. 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물의 맥락에서 사용된 바와 같은 분자량 Mw는 중량 평균 분자량을 의미한다. 이는 각종 방법, 즉 광 산란 및 RI 탐지와 연계한 겔 투과 크로마토그래피 (GPC) 또는 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 자체 공지된 방식으로 결정할 수 있다. 치환된 전분에 바람직한 C2/C6 비는 5 내지 9의 범위이다. 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물의 높은 분지화도는, 이러한 전분 생성물을 용액 중에 유지시키기 위해 히드록시에틸 또는 히드록시프로필 치환을 완전히 또는 실질적으로 없앨 수 있는 정도로 상기 전분 생성물의 수중 용해도를 증가시켜 준다. 고도로 분지된, 치환되지 않거나 저 치환된 전분 생성물의 평균 분자량은 복막의 투과성 제한을 통하여 적합한 방식으로 증가시킬 수 있다. 이러한 경우에 사용될 수 있는 특징적인 변수는 또한, 소위 바닥 분획 BF90% (보다 적은 분자 분획 비율의 측정치로서 피크 면적 90%에서의 분자량)의 GPC 값이다. 보다 큰 한외 여과 (UF) 효율은 복막을 가로지르는 흡수 속도를 동시에 철저하게 감소시키면서 분자량을 적당히 상승시킴으로써 달성할 수 있다. 이와 동시에, 내인성 아밀라제에 의해 분해됨으로써 생성되고, 아밀라제에 의해 더 이상 추가로 분해될 수 없으며 기관 또는 조직에 저장되는 고 분자량 잔류성 단편은 더 이상 존재하지 않거나 단지 약간 정도로만 존재한다.
본 발명에 따르면, 히드록시알킬 전분을 가교 결합성 화합물 M-L-A (여기서, M은 아미노 기이고, A는 아세탈 기 또는 케탈 기이며, 기 M과 기 L은 적합한 스페이서에 의해 분리된다)와 반응시킨다.
아세탈 또는 케탈 기 A
아세탈 기 또는 케탈 기 A가 관련되는 한, 이에 대한 구체적인 제한은 존재하지 않는다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "아세탈 기"는 또한, 황 아세탈 및 질소 아세탈을 포함하고, 용어 "케탈 기"는 또한, 황 케탈 및 질소 케탈을 포함한다. 부가적으로, 용어 "아세탈 기"가 관련되는 한은, 헤미아세탈이 명백히 배제되고, 용어 "케탈 기"가 관련되는 한은, 헤미케탈이 명백히 배제된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물 M-L-A의 기 A는 다음 화학식 IIa에 따르는 잔기이다:
[화학식 IIa]
상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고, Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 예를 들면 n-프로필 또는 i-프로필, 또는 C(O)-Ry (여기서, Ry는 바람직하게, C1-C6 알킬 및 C6-C14 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 더 바람직하게 임의로 치환된, 바람직하게 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 3급-부틸로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; Rx는 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환을 형성한다:
[화학식 IIb]
상기식에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고, A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성한다.
바람직하게는, Z1 및 Z2 중의 하나 이상이 O이고, 보다 바람직하게는 Z1 및 Z2 둘 다가 O이다.
잔기 A3이 관련되는 한은, 아세탈 기가 본 발명에 따라서 바람직한데, 즉 A3이 바람직하게 H이다.
A가 케탈 기인 경우, A3이 메틸인 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따라서 생각할 수 있는 메탈 기 A는 특히 
또는 
또는
또는
또는 
또는 
이다.
A3이, 예를 들어 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하는 경우, 본 발명에 따라서 생각할 수 있는 가교 결합성 화합물은, 예를 들어 다음과 같다:
본 발명에 따르는 특히 바람직한 가교 결합성 화합물은
바람직한 양태에 따르면, A1 및 A2는 각각 메틸 또는 에틸, 보다 더 바람직하게 에틸이다. 따라서, 본 발명에 따르는 특히 바람직한 아세탈 기 A는 -CH(OCH3)2 또는-CH(OC2H5)2, 특히 -CH(OC2H5)2이다.
A1 및 A2가 화학식 IIb에 따르는 환을 형성하는 추가의 양태에 따르면, A1 및 A2가 함께, 바람직하게 -(CH2)2-이다. 이러한 양태가 관련되는 한은, 본 발명에 따르는 특히 바람직한 아세탈 기 A는 
및 
이다.
아미노 기 M
아미노 기 M이 관련되는 한은, 특별한 제한이 존재하지 않는데, 단 아미노 기는 산화되거나 비-산화된 환원성 말단과 반응할 수 있는데, 즉 비-산화된 상태로 (즉, 헤미아세탈 또는 자유 알데히드 기로서) 또는 산화된 상태로 (즉, 락톤 또는 자유 카복시 기로서), HAS, 바람직하게 HES의 환원성 말단 당류 단위의 탄소 원자 C*를 통하여 반응할 수 있다. 이러한 본 출원의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노 기"는 또한, 아미노 기, 예를 들어 양성자화 아미노 기와 제약상 허용 가능한 음이온, 예를 들어 염화물, 황산수소, 황산염, 탄산염, 탄산수소, 시트레이트, 인산염 또는 인산 수소의 적합한 염을 포함한다.
바람직하게, 본 발명에 따르는 가교 결합성 화합물 M-L-A의 아미노 기는 다음 화학식 IIc에 따르는 기이다:
[화학식 IIc]
상기식에서, Y는 부재하거나 또는 
으로 이루어진 군 중에서 선택된 화학적 부분이며;
G는 O 또는 S 또는 NH이고, 2번 존재하는 경우, 각 G는 독립적으로, O 또는 S 또는 NH이며, G는 바람직하게 O이고,
R'는 H 또는 히드록시 기이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아르알킬, 치환된 아르알킬, 알킬아릴, 및 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이다. 이러한 맥락에서, 용어 "알킬"은 분지되지 않은 알킬 잔기, 분지된 알킬 잔기 및 시클로알킬 잔기에 관한 것이다. 바람직하게, 이들 유기 잔기 각각은 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는다. 생각할 수 있는 치환체로서, 할로겐, 예를 들어 F, Cl 또는 Br을 언급할 수 있다. 바람직하게, 유기 잔기는 치환되지 않은 탄화수소이다.
R'가 히드록시 기인 경우, 본 발명의 바람직한 아미노 기는 HO-NH-인데, 즉 Y가 존재하지 않는다.
바람직하게, R'가 유기 잔기인 경우, R'는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택되고, 알킬 잔기가 특히 바람직하다. 보다 더 바람직하게는, 임의로 치환된 알킬 잔기가 1 내지 10개, 보다 바람직하게 1 내지 6개, 보다 바람직하게 1 내지 4개, 예를 들어 1, 2, 3, 또는 4개의 탄소 원자를 갖는다. 따라서, 본 발명에 따르는 바람직한 유기 잔기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 또는 t-부틸이다. 특히 바람직한 양태에 따르면, 유기 잔기 R'는 메틸 또는 에틸, 특히 메틸이다.
따라서, R'가 유기 잔기인 경우, 본 발명에 따르는 바람직한 아미노 기는, 예를 들어 H3C-CH2-NH-, H3C-NH-, H5C6-NH-, H3C-CH2-NH-O-, H3C-NH-O-, H5C6-NH-O-이고, H3C-NH-, H5C6-NH-, 및 H3C-NH-O-가 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, R'가 별개의 잔기는 아니지만, L에 포함된 적합한 원자와 함께 또는 가교 결합성 화합물의 기 A의 잔기 A3과 함께 환 구조를 형성하는 것이 또한 가능하다. 이들 구조는 또한, R'와 관련하여 상기 언급된 용어 "알킬"의 정의에 포함된다. 예를 들어, R'는 가교 결합성 화합물의 기 A의 잔기 A3과 함께 환 구조를 형성할 수 있는데, A는 케탈 기이다. 생각할 수 있는 가교 결합성 화합물은, 예를 들어 
또는
또는
이다.
이러한 경우, 본 발명에 따르는 특히 바람직한 가교 결합성 화합물은 
인데, 즉 아미노 기 M이 2급 아민이고, Z1 및 Z2 둘 다가 O이며, A1 및 A2가 함께, -(CH2)2-이다.
본 발명의 바람직한 양태에서는, R'가 H이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 아미노 기 M은
[여기에서, G는 O 또는 S이고, 2번 존재하는 경우에는 독립적으로, O 또는 S이며, O가 바람직하다]이다.
R'가 H인 경우에, 본 발명의 특히 바람직한 아미노 기 M은 H2N-, H2N-O-, 및 H2N-NH-(C=O)-이다.
따라서, 본 발명은 또한, 아미노 기 M이 H2N-, H2N-O-, H2N-NH-(C=O)-, H3C-NH- 또는 H3C-NH-O-, 바람직하게 H2N-, H2N-O-, 또는 H2N-NH-(C=O)-인 상기 언급된 유도체 및 방법에 관한 것이다.
스페이서 L
본 발명에 따르면, 가교 결합성 화합물의 관능기 M 및 A는 적합한 스페이서에 의해 분리된다. 이러한 본원 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "스페이서"는 M과 A를 브릿징하는 적합한 모든 화학적 부분에 관한 것이다.
일반적으로, 스페이서 L의 화학적 성질에 관해서는 특별한 제한이 없는데, 단 L은 신규 유도체를 제조하는 본 발명의 방법을 수행할 수 있게 해주고, 이의 의도된 용도가 관련되는 한은 신규 유도체에 대한 적합한 화학적 특성을 제공해 주는 특별한 화학적 특성을 지니고 있다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, M과 A를 브릿징하는 L은 다음 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하는 스페이서이다:
[화학식 IId]
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 [여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다]이다.
이러한 맥락에서, 용어 "알킬"은 분지되지 않은 알킬 잔기, 분지된 알킬 잔기 및 시클로알킬 잔기에 관한 것이다. 바람직한 치환체로서, 할로겐, 예를 들어 F, Cl 또는 Br을 언급할 수 있다.
바람직하게, L1 및 L2는 서로 독립적으로 H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, L1 및 L2는 서로 독립적으로, H 또는 알킬이며; 보다 더 바람직하게, L1 및 L2 둘 다는 H이다.
바람직하게, L1 및 L2가 유기 잔기인 경우, L1 및 L2 각각은 독립적으로, 1 내지 20개, 바람직하게 1 내지 10개, 보다 바람직하게 1 내지 8개, 보다 바람직하게 1 내지 6개, 보다 바람직하게 1 내지 4개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 특히 바람직한 것은 임의로 치환된, 바람직하게는 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 3급-부틸 잔기와 같은 잔기 L1 및 L2이다. 본 발명에 따르면, L1은 H일 수 있고, L2는 상기 정의된 바와 같은 유기 잔기일 수 있다.
정수 n이 관련되는 한은, n이 바람직하게 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2이다.
정수 n이 1을 초과하는 경우, 기 (CL1L2)는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 서로 직접 연결된 기 (CL1L2)는 동일한 구성을 갖는다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 스페이서 L은 화학식 IId에 따르는 구조 단위 (여기서, L1 및 L2는 상기 정의된 바와 같다)로 이루어진다. 보다 바람직하게, 정수 n은 1 내지 20, 보다 바람직하게 1 내지 10, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 보다 더 바람직하게, 기 (CL1L2) 각각은 (CH2)이므로, M과 A를 브릿징하는 스페이서 L은 다음 구조를 갖는다:
상기에서, n은 1 내지 20, 보다 바람직하게 1 내지 10, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 정수이다. 보다 더 바람직하게, n은 1 내지 6의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 4의 범위, 예를 들어 1, 2, 3, 또는 4, 특히 2이다.
따라서, 본 발명의 특별히 바람직한 양태에 따르면, 스페이서 L은 -CH2-CH2-이다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물의 스페이서 L은 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함한다.
화학식 IId
상기식에서, n, L1 및 L2는 상기 정의된 바와 같고, 바람직하게
L은 -(CL1L2)-과는 상이한 하나 이상의 화학적 부분을 추가로 포함한다.
이러한 맥락에서, 스페이서 L이 구조 단위 -(CL1L2)n-과, -(CL1L2)n-을 기 M 또는 A와 분리시켜 주는 추가의 화학적 부분 T로 이루어지는 양태가 언급될 수 있다. 또한, 스페이서 L이 구조 단위 -(CL1L2)n-와 2개의 추가의 화학적 부분 T1 및 T2로 이루어지는 양태 [여기서, T1은 -(CL1L2)n-을 기 M과 분리시켜 주고, T2는 -(CL1L2)n-을 기 A와 분리시켜 준다]를 생각할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 가교 결합성 화합물이 다음 구조식 중의 하나를 갖는 양태를 포괄한다:
화학적 부분 T, T1 또는 T2에 관해서는, 그들의 화학적 성질에 관한 특별한 제한이 없는데, 단 L은 신규 유도체를 제조하는 본 발명의 방법을 수행할 수 있게 해주고, 이의 의도된 용도가 관련되는 한은 신규 유도체에 대한 적합한 화학적 특성을 제공해 주는 특별한 화학적 특성을 지니고 있다.
따라서, T, T1 및/또는 T2는 임의로 치환된 아릴 잔기, 적합한 헤테로 원자, 적합한 관능기 등을 포함할 수 있다. 관능기가 관련되는 한은, 이들 관능기가 적어도 제1 화합물과 적어도 제2 화합물을 서로 반응시켜 화합물 M-L-A를 수득하는 가교 결합성 화합물의 제조로부터 생성되는 양태를 언급할 수 있다. 예를 들어, 제1 화합물 M-L'-W1과 제2 화합물 W2-L"-A를 반응시켜 가교 결합성 화합물 M-L-A를 수득할 수 있는데, 여기서 -L-은 -L'-F-L"-이고, F는 관능기 W1과 관능기 W2의 반응으로부터 생성되는 관능기를 나타내며, L' 및 L" 중의 적어도 하나는 구조 단위 -(CL1L2)n-를 포함한다. 이러한 관능기 W1 및 W2는 적합하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 기 W1 및 W2 중의 하나, 즉 W1 또는 W2는 다음 목록에 따르는 관능기로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있지만, 기타 기, W2 또는 W1은 적합하게 선택되고 W1 또는 W2와 화학적 연쇄를 형성할 수 있는데, 여기서 W2 또는 W1은 또한 바람직하게, 상기 언급된 기 중에서 선택된다:
- C-C-이중 결합 또는 C-C-삼중 결합 또는 방향족 C-C-결합;
- 티오 기 또는 히드록시 기;
- 알킬 설폰산 히드라지드, 아릴 설폰산 히드라지드;
- 1,2-디올;
- 1,2-아미노-티오알코올;
- 아지드;
- 1,2-아미노알코올;
- 아미노 기 -NH2, 또는 구조 단위 -NH-를 포함하는 아미노 기의 유도체, 예를 들어 아미노알킬 기, 아미노아릴 기, 아미노아르알킬 기 또는 알카릴아미노 기;
- 히드록실아미노 기 -0-NH2, 또는 구조 단위 -O-NH-를 포함하는 히드록실아미노 기의 유도체, 예를 들어 히드록실알킬아미노 기, 히드록실아릴아미노 기, 히드록실아르알킬아미노 기 또는 히드록실알카릴아미노 기;
- 알콕시아미노 기, 아릴옥시아미노 기, 아르알킬옥시아미노 기, 또는 알카릴옥시아미노 기 (각각은 구조 단위 -NH-O-를 포함한다);
- 카보닐 기를 갖는 잔기 -Q-C(=G)-M' [여기서, G는 O 또는 S이고, M'는, 예를 들어
-- -OH 또는 -SH;
-- 알콕시 기, 아릴옥시 기, 아르알킬옥시 기 또는 알카릴옥시 기;
-- 알킬티오 기, 아릴티오 기, 아르알킬티오 기 또는 알카릴티오 기;
-- 알킬카보닐옥시 기, 아릴카보닐옥시 기, 아르알킬카보닐옥시 기, 알카릴카보닐옥시 기;
-- 활성화 에스테르, 예를 들어 이미드 구조를 갖는 히드록실아민의 에스테르 (예: N-히드록시석신이미드)이다];
- -NH-NH2, 또는 -NH-NH-;
- -NO2;
- 니트릴 기;
- 카보닐 기, 예를 들어 알데히드 기 또는 케토 기;
- 카복시 기;
- -N=C=O 기 또는 -N=C=S 기;
- 비닐 할라이드 기, 예를 들어 비닐 요오다이드 또는 비닐 브로마이드 기 또는 트리플레이트;
- -C≡C-H;
- -(C=NH2Cl)-O알킬;
- 기 -(C=O)-CH2-Hal (여기서, Hal은 Cl, Br, 또는 I이다);
- -CH=CH-SO2-;
- 구조 -S-S-를 포함하는 디설파이드 기;
- 기 
;
- 기 
.
예를 들어, W1 또는 W2는 카복시 기 또는 활성화 에스테르일 수 있고, W2 또는 W1은 아미노 기 또는 히드록시 기일 수 있으므로, 관능기 W1과 관능기 W2의 반응으로부터 생성되는 관능기를 나타내는 F는 아미드 또는 에스테르이다.
따라서, 예를 들어, 구조 단위 -(CL1L2)n- 이외의 관능기를 포함하는 스페이서 L을 갖는 가교 결합성 화합물은 다음과 같은 구성을 지닐 수 있다:
상기에서, L' 및 L"는 구조 단위 -(CL1L2)n-를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
이들 구조 중에서, 가교 결합성 화합물은 다음 구성을 갖는 것이 바람직하다:
또한, 이들 구조 중에서, L' 및 L"가 존재하는 경우, 이들이 구조 단위 -(CL1L2)n-를 함유하는 스페이서가 바람직하다. 이러한 경우에는, n이 1 내지 4의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 3의 범위, 예를 들어 1, 2 또는 3인 것이 보다 더 바람직하다. 소정의 스페이서가, 예를 들어 2개의 구조 단위 -(CL1L2)n-를 함유하는 경우, 각 구조 단위의 지수 n은 동일하거나 상이할 수 있다.
따라서, 다음 가교 결합성 화합물이 다음 구성을 갖는 것이 바람직하다:
상기에서, 각 n은 서로 독립적으로, 바람직하게 1 내지 4의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 3의 범위, 예를 들어 1, 2 또는 3이다. 따라서, 바람직한 스페이서 L은 구성 
을 갖는다.
따라서, -(C=O)-NH-를 함유하는 특히 바람직한 가교 결합성 화합물은 다음과 같다:
-(C=O)-NH-을 함유하는 보다 바람직한 가교 결합성 화합물은 다음과 같다:
보다 더 바람직하게, L1 및 L2는 둘 다 H이다. 따라서, 다음 구성을 갖는 가교 결합성 화합물이 특히 바람직하다:
다음 구성을 갖는 가교 결합성 화합물이 가장 바람직하다:
예를 들어, 본 발명의 바람직한 가교 결합성 화합물은 다음과 같다:
다시 예를 들고, 상기 논의된 구조를 예시하기 위해, 본 발명의 맥락에서 생각할 수 있는 가교 결합성 화합물은
일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에 따르면, 스페이서 L은 1개 초과의 구조 단위 -(CL1L2)n-를 포함할 수 있고, 이들 구조 단위는 동일하거나 상이할 수 있는데, 즉 이러한 구조는 n 및/또는 L1 및 L2 측면에서 상이할 수 있으며, 이러한 구조 단위 2개 이상은 O 또는 S와 같은 헤테로 원자에 의해 분리될 수 있다. 바람직하게, 이러한 양태에 따르면, 스페이서 L은 1개 이상의 구조 단위 -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, 바람직하게 -(CH2)n1-O-(CH2)n2- (여기서, n1은 n2와 동일하거나 상이하다)을 포함하고, 스페이서 L은 -(CL1L2)n1-을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 연결되는데, 즉 가교 결합성 화합물은 다음 서브-구조를 포함한다:
M-(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-.
생각할 수 있는 바람직한 양태에 따르면, 스페이서 구조, 예를 들어 -((CL1L2)n1-O)m-(CL1L2)n2-이 언급될 수 있는데, m은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 정수이다. 특히 바람직하게, m은 1, 2, 또는 3, 보다 바람직하게 2 또는 3이다. 바람직하게, n1은 2 내지 4이고, 보다 바람직하게 2이다. 바람직하게, n2는 1 내지 4, 보다 바람직하게 1 또는 2이다. 따라서, 바람직한 구조는, 예를 들어 -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-이고, 보다 바람직하게는 -((CH2)2-O)m-(CH2)-이다.
다시 예를 들고, 상기 논의된 구조를 예시하기 위해, 본 발명의 맥락에서 바람직하게 사용된 가교 결합성 화합물은
본 발명의 추가의 양태에 따르면,기 M과 기 A는 2개의 적합한 화학적 부분에 의해 분리될 수 있고, 이들 중의 적어도 하나는 -(CL1L2)n-을 포함하므로, 기 M의 N 원자와 케탈 기 A의 C 원자는 환을 형성한다. 바람직한 양태는 이미 상기에 제시되었고, 다음 구조를 갖는다:
본 발명의 특히 바람직한 가교 결합성 화합물은 기 M으로서 기 H2N- 또는 기 H2N-O- 또는 기 H2N-NH-(C=O)-, 특히 바람직하게 기 H2N-을 갖고, 기 A로서 아세탈 기, 바람직하게 다음 구조를 갖는 아세탈 기를 갖는 화합물이다:
상기에서, 보다 바람직하게 Z1 및 Z2는 O이고, 보다 더 바람직하게 A1 및 A2는 둘 다 에틸이다. 보다 더 바람직하게, 스페이서 L은 구조 단위 -(CL1L2)n-로 이루어지고, L1 및 L2는 바람직하게 H이고, 정수 n은 보다 더 바람직하게 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2이다.
따라서, 본 발명에 따르는 바람직한 가교 결합성 화합물은, 예를 들어 다음과 같다:
보다 더 바람직하게, 가교 결합성 화합물은 구조 (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 보다 바람직하게, 가교 결합성 화합물은 구조 (a2), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된다. 특히, 가교 결합성 화합물은 구조 (a2), (a11), (a12), 및 (a16)으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
가교 결합성 화합물 M-L-A로서 특히 바람직한 것은 1-아미노-3,3-디에톡시프로판 
이다.
예를 들어, 본 발명에 따라서 생각할 수 있는 아미노-아세탈 가교 결합성 화합물은 다음과 같다:
예를 들어, 본 발명에 따라서 생각할 수 있는 아미노-케탈 가교 결합성 화합물은 다음과 같다:
히드록시알킬
전분 유도체
따라서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 히드록시알킬 전분 (HAS) 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 다음 화학식 III의 HAS 유도체에 관한 것이다:
화학식 III
상기식에서,
A는 아세탈 또는 케탈 기이고; L은 X와 A를 브릿징하는 스페이서이며;
X는 화학식 II의 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M을, 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)의 탄소 원자 C* (여기서, C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화된다)를 통하여 상기 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기이고;
HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이다:
화학식 I
화학식 II
M-L-A.
HAS, 바람직하게 HES, L, A, R1, R2 및 R3에 관한 바람직한 양태가 관련되는 한, 상기 언급된 바와 같은 양태들을 구체적으로 참고한다.
추가로, 본 발명은 R1, R2 및 R3이 독립적으로 기 -(CH2CH2O)n-H (여기서, n은 정수, 바람직하게 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다)인, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 히드록시알킬 전분이 히드록시에틸 전분 (HES)인, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 A가 화학식 IIa에 따르는 잔기인, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다:
화학식 IIa
상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고; Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환을 형성한다:
화학식 IIb
상기식에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고, A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하며, A3은 바람직하게 H이다.
본 발명에 따르는 HAS 유도체의 기 X의 정확한 화학적 성질은 기 M의 각각의 화학적 성질, HAS의 환원성 말단의 탄소 원자 C*의 산화 상태, 및 반응을 위해 이용된 반응 조건, 예를 들어 용매, 온도 등에 좌우된다. 탄소 원자 C*가 산화된 상태 및 비-산화된 상태로 이용되는 본 발명의 양태에 따르면, 구체적이고도 바람직한 예가 다음에 상세히 논의된다.
바람직하게, X가 관련되는 한, 본 발명은 X가 -CH=N-, -CH2-NH-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NH-NH-, -CH=N-NH-(C=O)-, -CH2-NH-NH-(C=O)-로 이루어진 군, 바람직하게 -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-, -CH=N-NH-(C=O)-, 및 -CH2-NH-NH-(C=O)-로 이루어진 군, 보다 바람직하게 -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O-, 및 -CH2-NH-O-로 이루어진 군 중에서 선택되는, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다.
기 X의 특정 양태의 경우, HAS 유도체에 존재하는 바와 같은 HAS의 말단 당류 단위는 상기 화학식 III에 따르는 개방 구조와 평형 상태일 수 있는 환 구조로 존재하는데, 이러한 환 구조와 개방 구조는 특정의 평형 분포를 지니고 있는 것으로 생각될 수 있다. 이들 경우 및 본 발명의 목적상, 상기 제공된 바와 같은 화학식 III은 개방 구조 뿐만 아니라 환 구조를 포함하고, 화학식 III은 HAS 유도체를 개방 구조로만 제한하지 않는다. 구체적이고도 바람직한 예가 다음에 상세히 논의되는 경우에는, 환 구조가 몇몇 경우에 제시된다.
추가로, 본 발명은 M과 A를 브릿징하는 L이 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하는, 바람직하게는 화학식 IId에 따르는 구조 단위로 이루어진 스페이서인, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다:
화학식 IId
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 (여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; 바람직하게, H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, H 또는 알킬이며; 보다 바람직하게, H이고;
n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2의 정수이다.
HAS
, 바람직하게
HES
의 임의로 산화된 환원성 말단
본 발명에 따르면, HAS, 바람직하게 HES는 이러한 전분의 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여, 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시킬 수 있다 (여기서, C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화된다).
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은, "HAS를 환원성 말단을 통하여 반응시킨다" 또는 "HAS를 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여 반응시킨다"라는 것은 HAS를 주로, 그의 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 반응시키는 공정에 관한 것이다.
이와 같이 "주로, 그의 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 반응시킨다"는 것은 통계상, 소정의 반응을 위해 이용된 HAS 분자의 50% 초과, 바람직하게 55% 이상, 보다 바람직하게 60% 이상, 보다 바람직하게 65% 이상, 보다 바람직하게 70% 이상, 보다 바람직하게 75% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 보다 바람직하게 95% 이상, 예를 들어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를, HAS 분자당 1개 이상의 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 반응시키는 공정에 관한 것인데, 1개 이상의 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 반응되는 소정의 HAS 분자는, 상기 중합체 분자에 포함되고 환원성 말단이 아닌 하나 이상의 추가의 적합한 관능기를 통하여 동일한 소정의 반응에서 반응시킬 수 있다. 하나 이상의 HAS 분자(들)를 1개 이상의 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단을 통하여 반응시키고, 이와 동시에 이러한 HAS 분자에 포함되고 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단이 아닌 하나 이상의 추가의 적합한 관능기를 통하여 반응시키는 경우에는, 통계상 이들 HAS 분자의 반응된 모든 관능기 [이러한 관능기에는 (임의로 선택적으로 산화된) 환원성 말단이 포함된다]의 50% 초과, 바람직하게 55% 이상, 보다 바람직하게 60% 이상, 보다 바람직하게 65% 이상, 보다 바람직하게 70% 이상, 보다 바람직하게 75% 이상, 보다 바람직하게 80% 이상, 보다 바람직하게 85% 이상, 보다 바람직하게 90% 이상, 보다 바람직하게 95% 이상, 예를 들어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 (선택적으로 산화된) 환원성 말단이다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "환원성 말단"은 알데히드 기로서 존재하고/하거나 상응하는 헤미아세탈 형태 및/또는 아세탈 기로서 존재할 수 있는 HAS 분자의 말단 알데히드 기에 관한 것인데, 아세탈 기는 상기 화학식 I에 따르는 잔기 -OR3이 -0-CH2-CH2-OH인 경우에 존재할 수 있는 다음 구조를 갖는다:
환원성 말단이 산화되는 경우, 이와 같이 산화된 환원성 말단은 카복시 기 및/또는 상응하는 락톤 형태이다.
산화된 환원성 말단
따라서, 본 발명의 제1 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물을 아미노 기를 통하여 HAS, 바람직하게 HES의 환원성 말단의 산화된 C* 원자와 반응시킨다.
산화가 히드록시알킬 전분의 산화된 환원성 말단을 생성시켜 주는 적합한 모든 방법(들)에 따라서 수행될 수 있긴 하지만, 예를 들어 문헌 [참고: Sommermeyer et al., US 6,083,909, column 5, lines 63-67, and column 7, lines 25-39; column 8, line 53 to column 9, line 20; 각각의 전문이 본원에 참고로 도입된다]에 기재된 바와 같은 알칼리성 요오드 용액을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.
HAS, 바람직하게 HES를 선택적으로 산화시키면, 락톤
및/또는 카복실산
또는 카복실산의 적합한 염, 예를 들어 알칼리 금속 염, 바람직하게 나트륨 및/또는 칼륨 염으로서의 HAS, 바람직하게 HES가 산출되고, HAS'는 바람직하게 HES'이다.
본 발명의 제1 대안에 따르면, 이러한 형태의 HAS, 바람직하게 HES를 그 자체로서 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시킨다.
본 발명의 제2 대안에 따르면, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화된 HAS, 바람직하게 HES를 먼저, 적합한 화합물과 반응시켜 반응성 카복시 기를 포함하는 HAS, 바람직하게 HES를 수득한다.
반응성 카복시 기를, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS 내로 도입하는 것은 생각할 수 있는 모든 방법과 적합한 모든 화합물에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적 방법에 따르면, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS를, 이와 같이 산화된 환원성 말단에서 하나 이상의 알코올, 바람직하게 하나 이상의 산성 알코올, 예를 들어 25℃에서 pKA 값이 6 내지 12의 범위 또는 7 내지 11의 범위인 산성 알코올과 반응시킨다. 이러한 산성 알코올의 분자량은 80 내지 500 g/mol의 범위, 예를 들어 90 내지 300 g/mol 또는 100 내지 200 g/mol의 범위일 수 있다.
적합한 산성 알코올은 산성 양성자를 갖고 있고 산화된 HAS와 반응하여 각각의 반응성 HAS 에스테르, 바람직하게 다음 식에 따르는 반응성 HAS 에스테르
보다 바람직하게, 다음 식에 따르는 반응성 HAS 에스테르
를 수득할 수 있는 모든 알코올 H-O-RA이다.
바람직한 알코올은 N-히드록시 석신이미드, 예를 들어 N-히드록시 석신이미드 또는 설포-N-히드록시 석신이미드, 적합하게 치환된 페놀, 예를 들어 p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 트리클로로페놀, 예를 들어 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 예를 들어 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀, 또는 히드록시아졸, 예를 들어 히드록시 벤조트리아졸이다. 특히 바람직한 것은 N-히드록시 석신이미드이고, N-히드록시 석신이미드 및 설포-N-히드록시 석신이미드가 특히 바람직하다. 모든 알코올을 단독으로 이용할 수 있거나 또는 그의 둘 이상의 적합한 조합물로서 이용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 카본산의 디에스테르를 부가함으로써 각각의 알코올을 방출시키는 화합물을 이용하는 것이 또한 가능하다.
따라서, 본 발명은 또한, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS를, 이와 같이 산화된 HAS를 산성 알코올, 바람직하게 N-히드록시 석신이미드 및/또는 설포-N-히드록시 석신이미드와 반응시킴으로써 활성화시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS를, 이와 같이 산화된 환원성 말단에서 하나 이상의 카본산 디에스테르 RB-O-(C=O)-O-RC (여기서, RB 및 RC는 동일하거나 상이할 수 있다)와 반응시킨다. 바람직하게는, 이러한 방법으로 다음 식에 따르는 반응성 HAS를 수득한다:
상기에서, HAS'는 바람직하게 HES'이다.
적합한 카본산 디에스테르 화합물로서, 그의 알코올 성분이 독립적으로, N-히드록시 석신이미드, 예를 들어 N-히드록시 석신이미드 또는 설포-N-히드록시 석신이미드, 적합하게 치환된 페놀, 예를 들어 p-니트로페놀, o,p-디니트로페놀, o,o'-디니트로페놀, 트리클로로페놀, 예를 들어 2,4,6-트리클로로페놀 또는 2,4,5-트리클로로페놀, 트리플루오로페놀, 예를 들어 2,4,6-트리플루오로페놀 또는 2,4,5-트리플루오로페놀, 펜타클로로페놀, 펜타플루오로페놀, 또는 히드록시아졸, 예를 들어 히드록시 벤조트리아졸인 화합물을 이용할 수 있다. N,N'-디석신이미딜 카보네이트 및 설포-N,N'-디석신이미딜 카보네이트가 특히 바람직하고, N,N'-디석신이미딜 카보네이트가 특히 더 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS를, 이와 같이 산화된 HAS를 N,N'-디석신이미딜 카보네이트와 반응시킴으로써 활성화시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
산성 알코올은 산화된 HAS 또는 산화된 HAS의 염과, 바람직하게 5:1 내지 50:1, 보다 바람직하게 8:1 내지 20:1의 산성 알코올:HAS의 몰 비에서, 2 내지 40℃, 보다 바람직하게 10 내지 30℃, 특히 바람직하게 15 내지 25℃의 바람직한 반응 온도 하에 반응시킨다. 반응 시간은 바람직하게 1 내지 10 h, 보다 바람직하게 2 내지 5 h, 보다 바람직하게 2 내지 4 h, 특히 2 내지 3 h이다.
카본산 디에스테르 화합물은 산화된 HAS 또는 산화된 HAS의 염과, 일반적으로 1:1 내지 3:1, 예를 들어 1:1 내지 1.5:1의 디에스테르 화합물:HAS의 몰 비로 반응시킨다. 반응 시간은 일반적으로 0.1 내지 12 h, 예를 들어 0.2 내지 6 h, 또는 0.5 내지 2 h 또는 0.75 내지 1.25 h이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 산화된 HAS를 산성 알코올 및/또는 카본산 디에스테르와 반응시키는 것은 한 가지 이상의 비양성자성 용매, 예를 들어 수분 함량이 0.5 중량% 이하, 바람직하게 0.1 중량% 이하인 무수 비양성자성 용매 중에서 수행한다. 적합한 용매는 특히, 디메틸 설폭시드 (DMSO), N-메틸 피롤리돈, 디메틸 아세트아미드 (DMA), 디메틸 포름아미드 (DMF) 및 그의 둘 이상의 혼합물이다. 반응 온도는 바람직하게, 2 내지 40℃의 범위, 보다 바람직하게 10 내지 30℃의 범위이다.
산화된 HAS를 하나 이상의 산성 알코올과 반응시키기 위해, 한 가지 이상의 부가 활성화제를 이용한다.
적합한 활성화제는, 특히 카보닐디이미다졸, 카보디이미드, 예를 들어 디이소프로필 카보디이미드 (DIC), 디시클로헥실 카보디이미드 (DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC)이고, 디시클로헥실 카보디이미드 (DCC) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 (EDC)가 특히 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, 그의 환원성 말단에서 산화되는 HAS를 부가의 활성화제의 존재 하에 산성 알코올과 반응시켜 반응성 HAS 에스테르를 수득하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 산화된 HAS를 카본산 디에스테르 및/또는 산성 알코올과 반응시키는 것은, 물 대 반응 혼합물의 용적 비를 10:1으로 하여 반응 혼합물을 물에 부가함으로써 결정될 수 있는 저 염기 활성 하에서 수행한다. 상기 부가에 앞서, 완충제를 거의 포함하지 않는 물은 25℃에서 pH 값이 7이다. 반응 혼합물을 부가한 후, 그리고 pH 값을 측정함으로써, 반응 혼합물의 염기 활성을 수득하는데, 이는 바람직하게 9.0 이하, 보다 바람직하게 8.0 이하, 특히 바람직하게 7.5 이하 값이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 산화된 HAS를 EDC와 함께 물의 부재 하에 무수 DMA 중의 N-히드록시 석신이미드와 반응시켜 다음 식에 따르는 중합체 N-히드록시 석신이미드 에스테르를 선택적으로 수득한다:
보다 바람직하게는, HAS'가 HES'이다.
이러한 반응으로는, EDC가 HES의 OH 기와 반응함으로써 비롯되는 부산물이 전혀 수득되지 않고, EDC에 의해 형성된 O-아실 이소우레아와 산화된 HAS를 각각의 N-아실 우레아로 재배열 반응시키는 것이 놀랍게도 억제된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, 산화된 HAS를 물의 부재 및 활성화제의 부재 하에 무수 DMF 중의 N,N'-디석신이미딜 카보네이트와 반응시켜 다음 식에 따르는 HAS-N-히드록시 석신이미드 에스테르를 선택적으로 수득한다:
보다 바람직하게는, HAS'가 HES'이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 그의 환원성 말단에서 선택적으로 산화되는 HAS를 산화된 환원성 말단에서 아졸리드, 예를 들어 카보닐디이미다졸 또는 카보닐 디벤즈이미다졸과 반응시켜 반응성 카복시 기를 갖는 중합체를 수득한다. 카보닐디이미다졸의 경우에는, 다음 식에 따르는 반응성 이미다졸리드 HAS 유도체가 생성된다:
상기에서, HAS'는 바람직하게 HES'이다.
이어서, 바람직하게는 HAS를 상기 언급된 바와 같은 산성 알코올, 카보네이트 및/또는 아졸리드와 반응시킴으로써 생성되는, 하나 이상의 반응성 카복시 기를 포함하는 반응성 HAS 유도체를 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 추가로 반응시킨다.
상기 언급된 바와 같이 임의로 추가로 활성화시킨 산화된 환원성 말단을 통하여 HAS를 아미노 기 M과 반응시키는 것은 적합한 모든 방법에 따라서 수행할 수 있다. 바람직하게, 아미노 기 M은 1급 아미노 기 H2N- 또는 2급 아미노 기이다.
일반적으로, 특정 량의 물, 예를 들어 10 중량% 이하의 물을 함유할 수도 있는 극성 비양성자성 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 바람직한 비양성자성 용매는 특히, DMSO 또는 DMF이다.
바람직한 반응 온도 범위의 특정 예는 0 내지 80℃, 보다 바람직하게 0 내지 70℃, 보다 바람직하게 0 내지 60℃, 보다 바람직하게 0 내지 50℃, 보다 더 바람직하게 0 내지 40℃이다.
가교 결합성 화합물을, 바람직한 양태에 따라서 아미노 기 M으로서 H2N-을 갖는 산화된 형태의 환원성 말단을 갖는 HAS와 반응시키는 데 사용하는 경우, HAS 유도체는 출발 물질로서 이용된 HAS와 가교 결합성 화합물을 아미드 결합을 통하여 연결시키는 본 발명의 단계 (i)에 의해 수득되는데, 이로써 수득된 HAS 유도체는 아세탈 또는 케토 기 A를 추가로 함유한다.
따라서, 본 발명은 또한, (i)에서 HAS를 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 0 내지 80℃ 범위의 온도에서 수행하고, X가 -(C=O)-NH-인, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 HAS 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 다음 구조를 갖는 HAS 유도체 그 자체에 관한 것이다:
상기에서, R'는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M이 1급 아미노 기인 경우에 H이고, R'는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M이 2급 아미노 기인 경우에 H 이외의 화학적 부분이다. R'의 정확한 화학적 성질은 가교 결합성 화합물에 좌우되므로, 일반적으로 가능하고 바람직하게 이용된 상기 가교 결합성 화합물에 관한 논의를 참고할 수 있다.
본 발명에 이용된 상기 언급된 바람직한 가교 결합성 화합물에 따라서, 예를 들어 바람직한 양태로서 다음 HAS 유도체가 언급될 수 있는데, 각 경우에 있어 HAS는 본 발명의 바람직한 양태에 따라서 HES이다:
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
또는
구조 (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 보다 바람직하다. 구조 (a2), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 보다 더 바람직하다. 구조 (a2), (a11), (a12), 및 (a16)으로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 구조를 갖는 HES 유도체에 관한 것이다:
보다 더 바람직하게, HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
비-산화된 환원성 말단
본 발명의 제2 및 바람직한 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물을 아미노 기를 통하여, HAS, 바람직하게 HES의 환원성 말단의 비-산화된 C* 원자와 반응시키는데, 즉 HAS 분자의 말단 알데히드 기가 알데히드 기로서 존재하고/하거나 상응하는 헤미아세탈 형태로서 존재할 수 있다.
HAS를 비-산화된 환원성 말단을 통하여 아미노 기 M과 반응시키는 것은 적합한 모든 방법에 따라서 수행할 수 있다. 바람직하게, 아미노 기 M은 H2N-, 적합한 2급 아미노 기 HNR'-, 예를 들어 H3C-NH-, H2N-O-, 또는 적합한 2급 히드록시아미노 기 HNR'-O-, 예를 들어 H3C-NH-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-이다.
바람직하게, 아미노 기 M은 H2N-, H2N-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-, 보다 더 바람직하게 H2N- 또는 H2N-O-, 특히 H2N-이다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 상기 반응을 수성 시스템에서 수행한다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "수성 시스템"은 용매, 또는 포함된 용매의 중량을 기준으로 하여 물을 10 중량% 이상, 바람직하게 50 중량% 이상, 보다 바람직하게 80 중량% 이상, 보다 더 바람직하게 90 중량% 이상 또는 100 중량% 이하 포함하는 용매 혼합물을 지칭한다. 부가의 용매로서, DMSO, DMF, 에탄올 또는 메탄올과 같은 용매를 언급할 수 있다.
바람직한 양태에 따르면, HAS를 수성 매질 중에서 가교 결합성 화합물과 반응시키고 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M이 히드록실아민 또는 히드라지드인 경우, 반응 온도는 바람직하게 5 내지 45℃의 범위, 보다 바람직하게 10 내지 30℃의 범위, 특히 바람직하게 15 내지 25℃의 범위이다.
또 다른 바람직한 양태에 따르면, HAS를 수성 매질 중에서 가교 결합성 화합물과 반응시키고 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M이 기 H2N- 또는 R'HN-인 경우, 반응은 환원적 아민화 반응이고, 온도는 바람직하게 100℃ 이하 범위, 보다 바람직하게 10 내지 90℃의 범위, 보다 바람직하게 20 내지 80℃의 범위, 보다 바람직하게 30 내지 70℃의 범위, 특히 바람직하게 40 내지 60℃의 범위이다.
반응 과정 동안, 온도가 바람직하게는 상기 제시된 범위 내에서 다양할 수 있거나, 거의 일정하게 유지될 수 있다.
HAS를 가교 결합성 화합물의 기 M과 반응시키는 데 소요되는 반응 시간은 구체적인 필요에 맞도록 적응시킬 수 있고, 이는 일반적으로 1 h 내지 7 d의 범위이다. 예를 들어, 아미노 기 M이 히드록실아민 또는 히드라지드인 경우, 반응 시간은 바람직하게 1 h 내지 3 d의 범위, 보다 바람직하게 2 h 내지 48 h, 특히 바람직하게 3 내지 24 h의 범위이다.
예를 들어, HAS와 가교 결합성 화합물의 반응이 환원적 아민화 반응인 경우, 반응 시간은 바람직하게 1 h 내지 7 d의 범위, 보다 바람직하게 4 h 내지 6 d의 범위, 보다 바람직하게 8 h 내지 5 d의 범위, 보다 더 바람직하게 16 h 내지 3 d의 범위이다.
HAS와 가교 결합성 화합물의 반응을 위한 pH 값은 반응물의 화학적 성질과 같은 구체적인 필요에 맞도록 적응시킬 수 있다. 예를 들어, 가교 결합성 화합물의 기 M이 히드록실아민 또는 히드라지드인 경우, pH 값은 바람직하게, 3 내지 9, 보다 바람직하게 4 내지 8, 보다 더 바람직하게 4.5 내지 6.5의 범위이다.
예를 들어, HAS와 가교 결합성 화합물의 반응이 환원적 아민화 반응인 경우, pH 값은 바람직하게, 3 내지 9, 보다 바람직하게 3.5 내지 8, 보다 더 바람직하게 4 내지 6의 범위이다.
반응 혼합물의 적합한 pH 값은, 하나 이상의 적합한 완충제를 가함으로써 각 반응 단계에 대해 조정할 수 있다. 바람직한 완충제로서, 아세테이트 완충제, 바람직하게 나트륨 아세테이트 완충제, 인산염 또는 붕산염 완충제를 언급할 수 있다.
가교 결합성 화합물을, 바람직한 양태에 따라서 아미노 기 M으로서 H2N-을 갖는 비-산화된 형태의 환원성 말단을 갖는 HAS와의 반응에 사용하는 경우, HAS 유도체는 출발 물질로서 이용된 HAS와 가교 결합성 화합물을 이민 결합을 통하여 연결시키는 본 발명의 단계 (i)에 의해 수득되는데, 이로써 수득된 HAS 유도체는 아세탈 또는 케토 기 A를 추가로 함유한다. 이러한 반응을 적합한 환원제의 존재 하에 환원적 아민화 조건 하에 수행하는 경우, HAS 유도체는 출발 물질로서 이용된 HAS와 가교 결합성 화합물을 아민 결합을 통하여 연결시키는 본 발명의 단계 (i)에 의해 수득되는데, 이로써 수득된 HAS 유도체는 아세탈 또는 케토 기 A를 추가로 함유한다.
따라서, 본 발명은 또한, (i)에서, HAS를 바람직하게 수성 시스템 중에서 그의 비-산화된 환원성 말단을 통하여, 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 4 내지 7의 범위의 pH에서 20 내지 80℃ 범위의 온도에서 수행하는 (여기서, X는 -CH=N-이다), 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 또한, (i)에서, 반응을 환원제, 예를 들어 나트륨 보로히드라이드, 나트륨 시아노보로히드라이드, 유기 보란 착물 화합물, 예를 들면 4-(디메틸아민)피리딘 보란 착물, N-에틸디이소프로필아민 보란 착물, N-에틸모르폴린 보란 착물, N-메틸모르폴린 보란 착물, N-페닐모르폴린 보란 착물, 루티딘 보란 착물, 트리에틸아민 보란 착물, 또는 트리메틸아민 보란 착물, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 수행하여 HAS 유도체 (여기서, X는 -CH2-NH-이다)를 수득하는, 상기 언급된 방법에 관한 것이다.
본 발명의 환원적 아민화 반응에 사용된 이들 환원제의 농도는, 각각의 경우에 반응 용액의 용적을 기준으로 하여, 바람직하게 0.01 내지 2.0 mol/l의 범위, 보다 바람직하게 0.05 내지 1.5 mol/l의 범위, 보다 바람직하게 0.1 내지 1.0 mol/l의 범위이다.
M이 H2N-이고 가교 결합성 화합물과 HAS의 반응을 환원적 아민화 조건 하에 수행하는 상기 언급된 바람직한 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물:HAS의 몰 비가 바람직하게 1:1 내지 100:1, 보다 바람직하게 2:1 내지 80:1, 보다 바람직하게 3:1 내지 70:1, 보다 바람직하게 4:1 내지 60:1, 보다 바람직하게 5:1 내지 50:1의 범위이다.
M이 H2N-이고 가교 결합성 화합물과 HAS의 반응을 환원적 아민화 조건 하에 수행하는 상기 언급된 바람직한 양태에 따르면, 수성 시스템 중의 HAS, 바람직하게 HES의 농도가 각 경우에 있어서 반응 용액의 중량을 기준으로 하여, 바람직하게 1 내지 50 wt.-%, 보다 바람직하게 3 내지 45 wt.-%, 보다 바람직하게 5 내지 40 wt.-%의 범위이다.
가교 결합성 화합물을, 바람직한 양태에 따라서 아미노 기 M으로서 H2N-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-을 갖는 비-산화된 형태의 환원성 말단을 갖는 HAS와의 반응에 사용하는 경우, HAS 유도체는 출발 물질로서 이용된 HAS와 가교 결합성 화합물을 -CH=N-O- 결합 또는 -CH=N-NH-(C=O)- 결합을 통하여 연결시키는 본 발명의 단계 (i)에 의해 수득되는데, 이로써 수득된 HAS 유도체는 아세탈 또는 케토 기 A를 추가로 함유한다. 이러한 반응을 적합한 환원제의 존재 하에 환원적 조건 하에 수행하는 경우, HAS 유도체는 출발 물질로서 이용된 HAS와 가교 결합성 화합물을 -CH2-NH-O- 결합 또는 -CH2-NH-NH-(C=O)- 결합을 통하여 연결시키는 본 발명의 단계 (i)에 의해 수득되는데, 이로써 수득된 HAS 유도체는 아세탈 또는 케토 기 A를 추가로 함유한다.
따라서, 본 발명은 또한, (i)에서, HAS를 바람직하게 수성 시스템 중에서 그의 비-산화된 환원성 말단을 통하여, 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 4.5 내지 6.5의 범위의 pH에서 5 내지 80℃ 범위의 온도에 수행하는 (여기서, X는 -CH=N-O- 또는 -CH=N-NH-(C=O)-이다), 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 또한, (i)에서, 반응을 환원제, 예를 들어 나트륨 보로히드라이드, 나트륨 시아노보로히드라이드, 유기 보란 착물 화합물, 예를 들면 4-(디메틸아민)피리딘 보란 착물, N-에틸디이소프로필아민 보란 착물, N-에틸모르폴린 보란 착물, N-메틸모르폴린 보란 착물, N-페닐모르폴린 보란 착물, 루티딘 보란 착물, 트리에틸아민 보란 착물, 또는 트리메틸아민 보란 착물, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 수행하여 HAS 유도체 (여기서, X는 -CH2-NH-O- 또는 -CH2-NH-NH-(C=O)-이다)를 수득하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명의 반응에 사용된 이들 환원제의 농도는, 각 경우에 있어서 반응 용액의 용적을 기준으로 하여, 바람직하게 0.001 내지 2.0 mol/l의 범위, 보다 바람직하게 0.01 내지 1.0 mol/l의 범위, 보다 바람직하게 0.1 내지 0.8 mol/l의 범위이다.
M이 H2N-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-이고 가교 결합성 화합물과 HAS의 반응을 환원적 조건 하에 수행하는 상기 언급된 바람직한 양태에 따르면, 가교 결합성 화합물:HAS의 몰 비가 바람직하게 1:1 내지 100:1, 보다 바람직하게 2:1 내지 80:1, 보다 바람직하게 3:1 내지 70:1, 보다 바람직하게 4:1 내지 60:1, 보다 바람직하게 5:1 내지 50:1의 범위이다.
M이 H2N-이고 가교 결합성 화합물과 HAS의 반응을 환원적 아민화 조건 하에 수행하는 상기 언급된 바람직한 양태에 따르면, 수성 시스템 중의 HAS, 바람직하게 HES의 농도는 각 경우에 있어서 반응 용액의 중량을 기준으로 하여, 바람직하게 1 내지 50 wt.-%, 보다 바람직하게 3 내지 45 wt.-%, 보다 바람직하게 5 내지 40 wt.-%의 범위이다.
따라서, 본 발명은 또한, 상기 언급된 바와 같은 방법(들)에 의해 수득 가능하거나 수득되는 HAS 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 또한, 구조
(여기서, 반응 조건 및/또는 가교 결합성 화합물의 특이적 화학적 성질에 따라서, C-N 이중 결합이 E 또는 Z 입체 형태로 존재할 수 있고, 특정의 평형 분포를 지닌 양 형태의 혼합물이 존재할 수 있다); 또는
본 발명의 목적상 상기 개방 구조와 동일한 것으로 간주될 상응하는 환 구조가 관련되는 한, 구조
(여기서, 반응 조건 및/또는 가교 결합성 화합물의 특이적 화학적 성질에 따라서, HAS 유도체는 N-원자와 함께 적도 또는 축상 위치에 존재할 수 있고, 특정의 평형 분포를 지닌 양 형태의 혼합물이 존재할 수 있다); 또는 구조
또는
또는 구조
또는
또는
또는 상응하는 환 구조
또는
를 갖는 HAS 유도체 그 자체에 관한 것이다.
상기 언급된 바람직한 가교 결합성 화합물에 따르면, 다음 HAS 유도체가 바람직한 양태로서 언급될 수 있는데, 각 경우에 있어서 HAS는 본 발명의 바람직한 양태에 따라서 HES이다:
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
또는
(여기서, 상응하는 환 구조가 포함된다); 또는
구조 (a2), (a4), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 보다 바람직하다. 구조 (a2), (a11), (a12), (a14), (a16), 및 (a18)로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 보다 더 바람직하다. 구조 (a2), (a11), (a12), 및 (a16)으로 이루어진 군 중에서 선택된 가교 결합성 화합물에 기초한 HAS 유도체가 특히 바람직하다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 구조
상응하는 환 구조
및/또는
를 갖는 HES 유도체에 관한 것이다. 여기서, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
HAS와 관련하여 생각할 수 있는 기타 양태
완벽을 기하기 위해, 본 발명에 따라서 바람직하지 않긴 하지만, HAS를 가교 결합성 화합물과 반응시키기 전에 이를 산화시켜 2개 이상의 알데히드 기가 다음 식에 따르는 HAS 내로 도입되도록 하는 것을 생각할 수 있다는 것이 언급되어야 한다:
일반적으로, 1개 이상, 바람직하게 2개 이상의 알데히드 기를 갖는 개방된 당류 환을 제공하기 위해 중합체의 하나 이상의 당류 환을 산화시킬 수 있는 각각의 산화제 또는 산화제의 조합물을 이용할 수도 있다. 이러한 반응은 2개의 알데히드 기를 갖는 개방된 환을 제공하기 위해 산화되는 HAS의 당류 환을 나타내는 다음 반응 도식에 의해 예시될 수 있다:
적합한 산화제는 특히, 과요오드화물, 예를 들어 알칼리 금속 과요오드화물 또는 그의 둘 이상의 혼합물이고, 과요오드화나트륨 및 과요오드화칼륨이 바람직하다. 이들 알데히드 기를 아미노 기 M을 통하여 가교 결합성 화합물 M-L-A와 반응시킬 수 있었던 것으로 생각할 수 있다.
단리 및/또는 정제
일반적으로, 본 발명의 단계 (i)로부터의 HAS 유도체는 후술되는 바와 같이 후속 반응시키는 것으로 생각될 수 있다. 바람직한 양태에 따르면, 단계 (i)로부터의 HAS 유도체를 반응 단계 (i) 후에 정제하는 것이 적합하다.
단계 (i)로부터의 HAS 유도체를 정제하기 위해, 예를 들어 다음 가능성 A) 내지 C)를 언급할 수 있는데, 가능성 A)가 바람직하다:
A) 농도가 바람직하게 0.1 내지 100 mmol/l, 보다 바람직하게 1 내지 50 mmol/l, 보다 바람직하게 5 내지 20 mmol/l, 예를 들어 약 10 mmol/l이고, pH가 바람직하게 2 내지 10, 보다 바람직하게 4 내지 10, 보다 바람직하게 6 내지 10, 보다 바람직하게 8 내지 10의 범위, 예를 들어 약 9인 수성 완충제 용액 또는 물을 이용한 한외 여과 방법 (교환 주기 수는 바람직하게 10 내지 50, 보다 바람직하게 10 내지 40, 보다 더 바람직하게 10 내지 30, 예를 들어 20이다).
B) 농도가 바람직하게 0.1 내지 100 mmol/l, 보다 바람직하게 1 내지 50 mmol/l, 보다 바람직하게 5 내지 20 mmol/l, 예를 들어 약 10 mmol/l이고, pH가 바람직하게 2 내지 10, 보다 바람직하게 4 내지 10, 보다 바람직하게 6 내지 10, 보다 바람직하게 7 내지 10의 범위인 수성 완충제 용액 또는 물을 이용한 투석 방법 (여기서, 2 내지 20 중량%의 바람직한 농도로 HAS 유도체를 함유하는 용액을 이용하고, 완충액 또는 물은 HES 유도체 용액에 대해 특히 과량으로 (약 100:1) 사용된다).
C) 에탄올 또는 이소프로판올을 이용하여 침전시키고, 원심분리하며 물에 재용해시켜 약 10 중량%의 바람직한 농도를 갖는 용액을 수득한 다음; 농도가 바람직하게 0.1 내지 100 mmol/l, 보다 바람직하게 1 내지 50 mmol/l, 보다 바람직하게 5 내지 20 mmol/l, 예를 들어 약 10 mmol/l이고, pH가 바람직하게 2 내지 10, 보다 바람직하게 4 내지 10, 보다 바람직하게 6 내지 10, 보다 바람직하게 7 내지 9의 범위인 수성 완충제 용액 또는 물을 이용하여 한외 여과시키는 방법 (교환 주기 수는 바람직하게 10 내지 40, 보다 바람직하게 10 내지 30, 보다 더 바람직하게 10 내지 20, 예를 들어 10이다).
바람직한 정제 단계 후, HAS 유도체를 바람직하게 고체로서 수득한다. 본 발명의 추가의 생각할 수 있는 양태에 따르면, 바람직한 HAS 유도체 함량이 2 내지 40 중량%이고, 용액의 pH가 바람직하게 3 내지 10의 범위이며 사용된 완충제의 농도가 바람직하게 0.1 내지 1 mol/l의 범위인 HAS 유도체 용액 또는 동결 HAS 유도체 용액을 언급할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, (i) 후에, (i)에서 수득된 HAS 유도체를, 농도가 0.1 내지 100 mmol/l이고, pH가 2 내지 10의 범위인 수성 완충제 용액 또는 물을 이용하는 한외 여과 방법 (교환 주기 수는 10 내지 50이다)를 이용하여 정제하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
생물학적 활성제 BA와의 반응
추가의 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 상기 언급된 HES 유도체
를 추가로 적합하게, 아세탈 또는 케탈 기 A를 통하여 생물학적 활성 화합물 BA와 반응시키는 방법에 관한 것인데, 상기 기 A는 바람직하게, BA와의 반응 이전에 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환된다.
가장 바람직하게는, 기 A, 바람직하게 상응하는 알데히드 또는 케토 기를 아미노 기, 보다 바람직하게 BA에 포함된 1급 아미노 기와 반응시킨다. 이러한 경우 및 본 발명의 목적상, BA는 또한 H2N-BA' (여기서, BA'는 BA의 나머지 부분이다)로서 나타낸다.
따라서, 본 발명은 또한,
(ii) 화학식 III에 따르는 HAS 유도체를 기 A를 통하여 생물학적 활성제 H2N-BA'의 아미노 기와 환원적 아민화 반응시켜 화학식 IV에 따르는 HAS 유도체를 수득하는 단계
를 추가로 포함하는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다:
[화학식 IV]
본 발명의 제1 양태에 따르면, 바람직하게 정제시킨 (i)로부터 수득된 HAS 유도체를 대상으로 하여 적합하게는, 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환시키고, 이로써 생성되는 HAS 유도체를 BA와 반응시키기 이전에 적합하게 정제 및/또는 단리시킨다. 알데히드 또는 케토 기로의 변환은 바람직하게, 산-촉매된 가수분해 반응에 의해 수행된다. 이러한 반응은 바람직하게 0 내지 100℃, 보다 바람직하게 10 내지 80℃, 보다 바람직하게 20 내지 60℃; 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 5, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 1 내지 3, 보다 더 바람직하게 1 내지 3 미만 범위의 pH에서 수행한다. 가수분해 반응 생성물의 정제 및 완충제-교환은 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들어 투석 또는 한외 여과에 의해 달성할 수 있다. 변환된 물질은, 예를 들어 동결 건조에 의해 용액으로부터 고체로서 회수할 수 있다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 바람직하게 정제시킨 (i)로부터 수득된 HAS 유도체를 대상으로 하여 적합하게는, 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환시키고, 이로써 생성되는 HAS 유도체를 BA와 직접적으로 반응시키는데, 즉 알데히드 또는 케토 기를 포함하는 HAS 유도체에 별도의 적합한 정제 및/또는 단리 단계를 수행하지 않는다. 알데히드 또는 케토 기로의 변환은 바람직하게, 산-촉매된 가수분해 반응에 의해 수행된다. 이러한 반응은 바람직하게 0 내지 100℃, 보다 바람직하게 10 내지 80℃, 보다 바람직하게 20 내지 60℃; 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 5, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 1 내지 3, 보다 더 바람직하게 1 내지 3 미만 범위의 pH에서 수행한다. 가수분해 반응 생성물을 직접적으로 또는 pH를 BA와의 반응에 화합성인 값으로 조정시킨 후에 완충 용액 중에서 BA와 합할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한, (ii) 이전에, 화학식 III에 따르는 HAS 유도체의 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환시키는, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태에 따르면, 바람직하게 정제시킨 (i)로부터 수득된 HAS 유도체를 BA와 직접적으로 반응시키는데, 즉 별도의 적합한 정제 및/또는 단리 단계를 수행하지 않고 그리고 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환시키기 위한 별도의 단계 없이 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 계내 변환시켜 줄 수 있는 반응 조건 하에 BA와 반응시킨다. 알데히드 또는 케토 기로의 변환은 바람직하게, 산-촉매된 가수분해 반응에 의해 수행된다. 이러한 반응은 바람직하게 0 내지 100℃, 보다 바람직하게 10 내지 80℃, 보다 바람직하게 20 내지 60℃; 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 5, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 1 내지 3, 보다 더 바람직하게 1 내지 3 미만 범위의 pH에서 수행한다. 가수분해 반응 생성물을 직접적으로 또는 pH를 BA와의 반응에 화합성인 값으로 조정시킨 후에 완충 용액 중에서 BA와 합할 수 있다.
상기 언급된 제3 양태에 따르는 방법이 수행되는 것은, 예를 들어 이용된 생물학적 활성 물질 BA의 특이적 성질에 좌우된다. 예를 들어, EPO, G-CSF 또는 IFN알파와 같은 단백질을 BA로서 이용하는 경우에는, 상기 확인된 제1 또는 제2 양태가 일반적으로 적합한다.
단계 (ii)에서의 반응은 바람직하게, 수성 시스템에서 수행한다. 이러한 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "수성 시스템"은 용매, 또는 포함된 용매의 중량을 기준으로 하여 물을 10 중량% 이상, 바람직하게 50 중량% 이상, 보다 바람직하게 80 중량% 이상, 보다 더 바람직하게 90 중량% 이상 또는 100 중량% 이하 포함하는 용매 혼합물을 지칭한다. 부가의 용매로서, DMSO, DMF, 에탄올 또는 메탄올과 같은 용매를 언급할 수 있다.
화학식 IV에 따르는 HAS 유도체의 비-환원된 형태를 수득하기 위한 조건 하에 단계 (ii)에서의 반응을 수행하는 것이 생각될 수 있긴 하지만, 단계 (ii)에 따르는 반응을 하나 이상의 적합한 환원제의 존재 하에 환원적 아민화 조건 하에 수행하는 것이 특히 바람직하다:
화학식 IV
특히, 이들 조건 하에서, HAS 유도체의 기 A로부터 생성되는 알데히드 또는 케토 기를 BA의 H2N-기와 반응시킴으로써 수득된 기 -CH=N-를 환원시켜 -CH2-NH-를 수득한다.
예를 들어, 다음 환원제를 이용할 수 있다: NaBH(OAc)3, 나트륨 보로히드라이드, 나트륨 시아노보로히드라이드, 유기 보란 착물 화합물, 예를 들면 4-(디메틸아민)피리딘 보란 착물, N-에틸디이소프로필아민 보란 착물, N-에틸모르폴린 보란 착물, N-메틸모르폴린 보란 착물, N-페닐모르폴린 보란 착물, 루티딘 보란 착물, 트리에틸아민 보란 착물, 또는 트리메틸아민 보란 착물. NaBH4 및 NaCNBH3이 바람직하고, NaCNBH3이 특히 바람직하다.
한 양태에서는, HAS 유도체를, 생물학적 활성제를 함유하는 수성 용액에 가한다. 바람직하게는, 연속해서 하나 이상의 환원제, 특히 NaCNBH3를 가한다.
대체 양태에서는, HAS 유도체를 임의로 수성 용액 내로 유입시킨 다음, BA를 가할 수 있다. 바람직하게는, 연속해서 하나 이상의 환원제, 특히 NaCNBH3를 가한다.
HAS 유도체를 단계 (ii)에서 생물학적 활성 화합물 BA의 아미노 기와 반응시키는 것은 바람직하게, 3 내지 9, 바람직하게 3 내지 8, 보다 바람직하게 3 내지 7, 보다 바람직하게 3 내지 7 미만의 pH, 예를 들어 3 또는 4 또는 5 또는 6의 pH에서 수행한다. 반응 혼합물의 적합한 pH 값은 하나 이상의 적합한 완충제를 가함으로써 조정할 수 있다. 바람직한 완충제로서, 아세테이트 완충제, 바람직하게 나트륨 아세테이트 완충제, 인산염 또는 붕산염 완충제를 언급할 수 있다.
단계 b)에서 수득된 HAS 유도체를 단계 (ii)에서 생물학적 활성 화합물 BA의 아미노 기와 반응시키는 것은 바람직하게, -10 내지 100℃, 바람직하게 0 내지 50℃, 보다 바람직하게 0 내지 37℃, 보다 바람직하게 0 내지 25℃, 예를 들어 0, 5, 10, 15, 20, 또는 25℃에서 수행한다.
단계 (ii)에서의 반응 시간은 온도, HAS, 특히 HES 유도체와 화합물 BA의 비, 및 HAS 유도체와 화합물 BA의 절대 농도에 좌우된다. 일반적으로, 5분 내지 7일, 바람직하게 1시간 내지 7일의 반응 시간이 생각될 수 있다.
단계 (ii)에서 수득된 HAS 유도체 대 화합물 BA의 몰 비는 HAS 유도체의 수 평균 분자량 (Mn)을 기준으로 하여, 바람직하게 0:1 내지 200:1 당량, 보다 바람직하게 1:1 내지 100:1이다. 바람직하게, 몰 비는 1:1 내지 50:1이다. 예를 들어, BA가 단백질, 특히 IFN 알파인 경우에는, 낮은 몰 비, 예를 들어 50:1 이하, 바람직하게 1:1 내지 20:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 10:1, 보다 더 바람직하게 2:1 내지 9:1, 보다 바람직하게 3:1 내지 8:1, 보다 더 바람직하게 4:1 내지 7:1의 몰 비를 생각할 수 있다.
특히 바람직한 양태에서, 단계 (ii)에서 사용된 HAS 유도체의 농도는 각 경우에 있어서 (ii)의 반응 용액의 중량을 기준으로 하여, 약 10 중량% 초과, 특히 약 15 중량% 초과이다.
따라서, 본 발명은 또한, (ii)에서, 반응을 환원제, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 바람직하게 수성 시스템 중에서, 0 내지 37℃, 바람직하게 0 내지 25℃범위의 온도 하에 및 3 내지 9, 바람직하게 3 내지 7 미만 범위의 pH에서 수행하고, (ii)에서, HAS 유도체 대 생물학적 활성제 BA의 몰 비가 HAS 유도체의 수 평균 분자량 (Mn)을 기준으로 하여 0.1:1 내지 200:1 당량, 바람직하게 1:1 내지 50:1 당량인, 상기 언급된 바와 같은 방법에 관한 것이다.
(ii)를 수행한 BA의 바람직한 농도, 예를 들어 용액, 바람직하게 수성 용액의 바람직한 단백질 농도는 0.1 내지 10 g/1, 보다 바람직하게 1 to 9 g/1의 범위이다. (ii)에 앞서 상기 용액 중의 HAS 유도체의 농도 [(w/v)]는 바람직하게 0.1 내지 50%, 보다 바람직하게 0.5 내지 45%, 보다 바람직하게 1 내지 40%의 범위이다.
생각할 수 있는 양태에 따르면, 생물학적 활성제 BA를 수성 매질, 바람직하게 수성 완충제 용액, 특히 나트륨 아세테이트 완충제 용액에 용해시킬 수 있다. 이러한 수성 용액은 부가적으로, 첨가제, 예를 들어 특히, SDS, 챕스 (Chaps), 트윈 (Tween) 20, 트윈 80, 노니뎃 (Nonidet) P-40, 및 트리톤 (Triton) X 100으로 이루어진 군 중에서 선택된 붕해제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 붕해제 및/또는 분산제가 사용되는 경우에는, 수성 용액의 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 3 중량%, 바람직하게 0.05 내지 3 중량%, 바람직하게 약 0.5 중량%의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.
하나 이상의 환원제를 본 발명에 따라서 이용하고, BA와의 반응에 이용된 HAS 유도체에 존재하는 X가, 예를 들어 -CH=N-, -CH=N-O-, 또는 -CH=N-NH-(C=O)-인 경우에는, 이를 (ii)에서의 반응에 사용된 환원적 아민화 조건 하에 바람직하게 환원시켜, -CH2-NH-, -CH2-NH-O-, 또는 -CH2-NH-NH-(C=O)-인 관능기 X를 생성시킨다.
따라서, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 방법, 특히 (ii)에서, 반응을 환원제, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 바람직하게 수성 시스템 중에서, 0 내지 37℃, 바람직하게 0 내지 25℃ 범위의 온도 하에 및 3 내지 9, 보다 바람직하게 3 내지 7, 보다 바람직하게 3 내지 7 미만 범위의 pH에서 수행하고, (ii)에서, HAS 유도체 대 생물학적 활성제 BA의 몰 비가 단계 (ii)에서 이용된 HAS 유도체의 수 평균 분자량 (Mn)을 기준으로 하여 0.1:1 내지 200:1 당량, 바람직하게 1:1 내지 10:1 당량인 (각 경우에 있어서, 단 X는 아미드 기가 아니다), 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한 HAS 유도체에 관한 것이다. 특히 바람직한 HAS 유도체 대 생물학적 활성제 BA의 몰 비는 10 미만, 예를 들어 1:1 내지 9:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 8:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 7:1, 보다 바람직하게 1:1 내지 6:1, 보다 더 바람직하게 1:1 내지 5:1, 예를 들어 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1 또는 약 5:1이다. 이러한 낮은 몰 비, 예를 들어 50:1 이하의 몰 비, 보다 바람직하게 10:1 이하의 몰 비가 몇 가지 생물학적 활성제에 대해 생각할 수 있는 것이긴 하지만, 이는, 예를 들어 IFN 알파가 특히 바람직한 단백질에 대해 바람직하다. 예를 들어, G-CSF 및 EPO가 관련되는 한은, 50:1 이하, 예를 들어 1:1 내지 50:1의 몰 비가 바람직하다. 일반적으로, 예를 들어 1:1 내지 50:1 또는 2:1 내지 40:1 또는 3:1 내지 30:1 또는 4:1 내지 20:1 또는 5:1 내지 15:1의 몰 비를 언급할 수 있다.
단백질이 본 발명에 따르는 생물학적 활성제 BA로서 이용되고, 특히 상기 제시된 바람직한 pH 범위, 특히 7 미만 3 이상의 pH에서 이용되는 경우에는, HAS 유도체가 주로, 상기 단백질의 N 말단에 위치한 아미노 기와 반응한다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "주로"는 이용 가능한 N-말단 아미노 기의 50% 이상, 바람직하게 60% 이상, 바람직하게 70% 이상, 바람직하게 80% 이상, 바람직하게 85% 이상이 환원적 아민화를 통하여 반응되는 양태에 관한 것이다. 이용 가능한 N-말단 아미노 기의 90% 이상 또는 95% 이상 또는 96% 이상 또는 97% 이상 또는 98% 이상 또는 99% 이상이 반응되는 것이 가능하다. N-말단 아미노 기 이외의 아미노 기와의 커플링을 완전히 배재할 수는 없었지만, 7 미만의 pH에서 본 발명에 따르는 환원적 아민화를 통한 커플링은 거의 선택적으로 N-말단 아미노 기에서 일어나는 것으로 여겨진다. 특히 이들 반응 조건은 이들 조건에서 안정적인 단백질에 대해 바람직하다. 단백질이, 예를 들어 산 불안정하다면, 예를 들어 알파-1-항트립신 (A1AT)인 경우에는, 적당한 반응 조건, 특히 7.5 미만 내지 5 초과의 pH를 선택하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명은 또한, BA'를 포함하는 HAS 유도체, 상기 방법에 의해 수득 가능하거나 수득된 HAS 유도체, 및 상기 언급된 바와 같은 화학식 IV에 따르는 HAS 유도체 그 자체의 제조 방법에 관한 것인데, 단백질은 N-말단 아미노 기 및 하나 이상의 추가의 아미노 기를 포함하고, HAS를 포함하는 HAS 유도체는 주로, N-말단 아미노 기와 커플링된다.
따라서, 본 발명은 또한, 화학식 IV에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
화학식 IV
더우기, 본 발명은 또한, 화학식 IV의 히드록시알킬 전분 유도체에 관한 것이다:
화학식 IV
상기식에서, X는 화학식 II의 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M을, 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)의 탄소 원자 C* (여기서, C*는 임의로 산화되고, 가장 바람직하게는 HAS와 M과의 반응 이전에 산화되지 않는다)를 통하여 화학식 I의 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기 (여기서, X는 아미드 기 -C(=O)-NH-가 아니다):
화학식 I
화학식 II
M-L-A
{상기식에서, HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이며;
A는 화학식 IIa에 따르는 잔기:
화학식 IIa
[상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고, Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 예를 들면 n-프로필 또는 i-프로필, 또는 C(O)-Ry (여기서, Ry는 바람직하게, C1-C6 알킬 및 C6-C14 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 더 바람직하게, 임의로 치환된, 바람직하게는 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 3급-부틸로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; Rx는 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환:
화학식 IIb
(여기에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고,
A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하고, A3은 바람직하게 H이다)을 형성한다]이며;
L은 M과 A를 브릿징하는 스페이서이다}이고;
BA'는 BA의 아미노 기를 환원적 아민화를 통하여 A와 반응시키거나 또는 A에 상응하는 알데히드 기 또는 케토 기와 반응시킨 후에 잔존하는, 생물학적 활성제 BA'-NH2의 나머지 부분이다.
HAS, 바람직하게 HES, 및 가교 결합성 화합물과 관련된 바람직한 양태에 대해서는, 상기 각각의 설명을 참고한다.
화학식 IV의 HAS 유도체가 관련되는 한은, X가 바람직하게, -CH2-NH-, -CH=N-, -CH2-NH-O- 및 -CH=N=O-, 보다 바람직하게 -CH2-NH- 및 -CH2-NH-O-로 이루어진 군 중에서 선택되고, 가장 바람직하게는 -CH2-NH-이다.
더우기, 화학식 IV의 HAS 유도체가 관련되는 한은, M과 A를 브릿징하는 L이 바람직하게, 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하고, 바람직하게 화학식 IId에 따르는 구조 단위로 이루어진 스페이서이다:
화학식 IId
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 (여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; 바람직하게, H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, H 또는 알킬이며; 보다 바람직하게, H이며;
n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2의 정수이다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성 물질" (BA)은 바이러스, 세균, 진균, 식물, 동물 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 생물학적 유기체의 모든 물리적 또는 생화학적 특성에 영향을 미칠 수 있는 물질에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성 물질"은 인간 또는 동물에게서 질병을 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방하거나, 또는 인간 또는 동물의 신체적 또는 정신적 행복을 증강시키도록 의도된 물질에 관한 것이다. 활성 물질의 예에는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 효소, 소분자 약물, 염료, 지질, 뉴클레오시드, 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 5'-아미노헥실 스페이서와 같은 적합한 스페이서를 갖는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 핵산, 세포, 바이러스, 리포솜, 미소입자 및 미셀 (micelle)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명에 따르는 생물학적 활성 물질은 천연 아미노 기를 함유한다.
단백질의 예에는 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO) 또는 EPO 유사작용제, 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 알파-인터페론 (IFN 알파), 베타-인터페론 (IFN 베타) 또는 감마-인터페론 (IFN 감마), 예를 들어 IFN 알파 및 IFN 베타, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 또는 IFN 베타 (rhIFN 알파 또는 rhIFN 베타), 인터루킨, 예를 들어 IL-1 내지 IL-34, 예를 들면 IL-2 또는 IL-3 또는 IL-11, 예를 들어 재조합 인간 IL-2 또는 IL-3 (rhIL-2 또는 rhIL-3), 혈청 단백질, 예를 들어 응고 인자 II 내지 XIII, 예를 들면 인자 VIII, 인자 VII, 인자 IX, 인자 II, 인자 III, 인자 IV, 인자 V, 인자 VI, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 세린 프로테아제 억제제, 예를 들어 알파-1-항트립신 (A1AT), 활성화 단백질 C (APC), 플라스미노겐 활성화제, 예를 들어 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (tPA), 예를 들면 인간 조직 플라스미노겐 활성화제 (hTPA), AT III, 예를 들어 재조합 인간 AT III (rhAT III), 미오글로빈, 알부민, 예를 들어 소의 혈청 알부민, (BSA), 성장 인자, 예를 들어 표피 성장 인자 (EGF), 혈전세포 성장 인자 (PDGF), 섬유아세포 성장 인자 (FGF), 뇌 유래 성장 인자 (BDGF), 신경 성장 인자 (NGF), B-세포 성장 인자 (BCGF), 뇌 유래 향신경성 성장 인자 (BDNF), 섬모체 향신경성 인자 (CNTF), 전환 성장 인자, 예를 들어 TGF 알파 또는 TGF 베타, BMP (뼈 형태발생 단백질), 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 (hGH), 예를 들면 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF 알파 또는 TNF 베타, 소마토스타틴 (somatostatine), 소마토트로핀 (somatotropine), 소마토메딘 (somatomedine), 헤모글로빈, 호르몬 또는 프로호르몬, 예를 들어 인슐린, 고나도트로핀, 멜라닌 세포 자극 호르몬 (알파-MSH), 트립토렐린 (triptorelin), 시상하부 호르몬, 예를 들어 항이뇨 호르몬 (ADH 및 옥시토신 뿐만 아니라 방출 호르몬 및 방출-억제성 호르몬), 부갑상선 호르몬, 갑상선 호르몬, 예를 들어 티록신, 티로트로핀, 티로리베린, 칼시토닌, 글루카곤, 글루카곤-유사 펩티드 (GLP-1, GLP-2 등), 엑센딘 (exendine), 예를 들어 엑센딘-4, 렙틴 (leptin), 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 켐프티드 (Kemptide) (Trp4-켐프티드), 바소프레신 (vasopressin), 가스트린 (gastrin), 세크레틴 (secretin), 인테그린 (integrin), 당단백질 호르몬 (예: LH, FSH 등), 멜라노시드 자극 호르몬, 지단백질 및 아포-지단백질, 예를 들어 아포-B, 아포-E, 아포-La, 면역글로불린, 예를 들어 IgG, IgE, IgM, IgA, IgD 및 그의 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 뮤린 (murine) 면역글로불린 G (mIgG), 히루딘 (hirudin), 조직 경로 억제제, 식물 단백질, 예를 들어 렉틴 (lectin) 또는 리신 (ricin), 벌독, 사독, 면역독소, 항원 E, 알파-프로테이나제 억제제, 두드러기쑥 (ragweed) 알레르기 유발 항원, 멜라닌, 올리고리신 단백질, RGD 단백질, 또는 이들 단백질 중의 하나에 대한 임의의 상응하는 수용체; 프롤락틴 (prolactin) 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어 G129R (여기서는, 위치 129에 있는 야생형 아미노산 글리신을 아르기닌으로 대체시킨다) (이러한 돌연변이체의 상표명은 "LactoVert"이다) 및 이들 단백질 또는 수용체의 작용성 유도체 또는 단편이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
폴리펩티드는 바람직하게, 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 알파-1-항트립신, 항체 또는 항체 단편, 및 대체 단백질 스캐폴드 (scaffold)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
보다 바람직하게, 폴리펩티드는 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 및 알파-1-항트립신으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
활성 물질은 바람직하게, 항생제, 항우울제, 항당뇨병제, 항이뇨제, 항콜린작동제, 항부정맥제, 항구토제, 진해제, 항간질제, 항히스타민제, 항진균제, 항교감신경강장제, 항혈전제, 안드로겐, 항안드로겐, 에스테르겐, 항에스트로겐, 항골다공증제, 항종양제, 혈관확장제, 기타 고혈압 치료제, 해열제, 진통제, 소염제, 베타 차단제, 면역억제제 및 비타민으로 구성된 군 중에서 선택된다.
활성 물질의 몇몇 부가의 비-제한적 예는 알렌드로네이트 (alendronate), 아미카진 (amikazin), 아테놀롤 (atenolol), 아자티오프린 (azathioprine), 시메티딘 (cimetidine), 클로니딘 (clonidine), 코신트로핀 (cosyntropin), 시클로세린 (cycloserine), 데스모프레신 (desmopressin), 디히드로에르고타민 (dihydroergotamine), 도부타민 (dobutamine), 도파민 (dopamine), 엡실론-아미노카프로산, 에르고메트린 (ergometrine), 에스몰롤 (esmolol), 파모티딘 (famotidine), 플레카이니드 (flecainide), 엽산, 플루시토신 (flucytosine), 프로세미드 (furosemide), 강시클로비르 (ganciclovir), 글루카곤, 히드라잘린 (hydrazaline), 이소프로테레놀 (isoproterenol), 케타민 (ketamine), 리오티로닌 (liothyronine), LHRH, 메르파트리신 (merpatricin), 메틸도파 (methyldopa), 메토프롤롤 (metoprolol), 네오미신 (neomicin), 니모디핀 (nimodipine), 니스타틴 (nystatin), 옥시토신 (oxytocin), 펜톨라민 (phentolamine), 페닐에프린 (phenylephrine), 프로카인아미드 (procainamide), 프로카인 (procaine), 프로프라놀롤 (propranolol), 리토드린 (ritodrine), 소탈롤 (sotalol), 테르부탈린 (terbutaline), 티아민, 틸루드로네이트 (tiludronate), 톨라졸린 (tolazoline), 트리메토프림 (trimethoprim), 트로메타민 (tromethamine), 바소프레신 (vasopressin); 아미포스틴 (amifostine), 아미오다론 (amiodarone), 아미노카프로산, 아미노히푸레이트 나트륨, 아미노글루테티미드, 아미로레불린산, 아미노살리실산, 암사크린 (amsacrine), 아나그렐리드 (anagrelide), 아나스트로졸 (anastrozole), 아스파라기나제 [예: 재조합 아스파라기나제, 예를 들어 이. 콜라이 (E.coli)로부터의 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제)], 안트라사이클린 (anthracycline), 벡사로텐 (bexarotene), 비칼루타미드 (bicalutamide), 블레오마이신 (bleomycin), 부세렐린 (buserelin), 부설판 (busulfan), 카베르골린 (cabergoline), 카페시타빈 (capecitabine), 카보플라틴 (carboplatin), 카르무스틴 (carmustine), 클로람부신 (chlorambucin), 실라스타틴 (cilastatin) 나트륨, 시스플라틴 (cisplatin), 클라드리빈 (cladribine), 클로드로네이트 (clodronate), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 시프로테론 (cyproterone), 시타라빈 (cytarabine), 캄프토테신 (camptothecin), 13-시스 레티노산, 모든 트랜스 레티노산; 다카르바진 (dacarbazine), 닥티노마이신 (dactinomycin), 다우노루비신 (daunorubicin), 데페록사민 (deferoxamine), 덱사메타손 (dexamethasone), 디클로페낙 (diclofenac), 디에틸스틸베스트롤 (diethylstilbestrol), 도세탁셀 (docetaxel), 독소루비신 (doxorubicin), 에피루비신 (epirubicin), 에스트라무스틴 (estramustine), 에토포시드 (etoposide), 엑세메스탄 (exemestane), 펙소페나딘 (fexofenadine), 플루다라빈 (fludarabine), 플루드로코르티손 (fludrocortisone), 플루오로우라실 (fluorouracil), 플루옥시메스테론 (fluoxymesterone), 플루타미드 (flutamide), 젬시타빈 (gemcitabine), 에피네프린 (epinephrine), L-도파, 히드록시우레아, 이다루비신 (idarubicin), 이포스파미드 (ifosfamide), 이마티니브 (imatinib), 이리노테칸 (irinotecan), 이트라코나졸 (itraconazole), 고세렐린 (goserelin), 레트로졸 (letrozole), 류코보린 (leucovorin), 레바미솔 (levamisole), 리시노프릴 (lisinopril), 로보티록신 (lovothyroxine) 나트륨, 로무스틴 (lomustine), 메클로르에타민 (mechlorethamine), 메드록시프로게스테론 (medroxyprogesterone), 메게스트롤 (megestrol), 멜팔란 (melphalan), 머캅토퓨린 (mercaptopurine), 메타라미놀 (metaraminol) 비타르트레이트, 메토트렉세이트 (methotrexate), 메토클로프라미드 (metoclopramide), 멕시레틴 (mexiletine), 미토마이신 (mitomycin), 미토탄 (mitotane), 미톡산트론 (mitoxantrone), 날록손 (naloxone), 니코틴 (nicotine), 닐루타미드 (nilutamide), 옥트레오티드 (octreotide), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 파미드로네이트 (pamidronate), 펜토스타틴 (pentostatin), 필카마이신 (pilcamycin), 포르피머 (porfimer), 프레드니손 (prednisone), 프로카바진 (procarbazine), 프로클로르페라진 (prochlorperazine), 온단세트론 (ondansetron), 랄티트렉세드 (raltitrexed), 시롤리무스 (sirolimus), 스트렙토조신 (streptozocin), 타크롤리무스 (tacrolimus), 타목시펜 (tamoxifen), 테모졸로미드 (temozolomide), 테니포시드 (teniposide), 테스토스테론 (testosterone), 테트라히드로칸나비놀 (tetrahydrocannabinol), 탈리도미드 (thalidomide), 티오구아닌, 티오테파 (thiotepa), 토포테칸 (topotecan), 트레티노인 (tretinoin), 발루비신 (valrubicin), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 빈데신 (vindesine), 비노렐빈 (vinorelbine), 돌라세트론 (dolasetron), 그라니세트론 (granisetron); 포르모테롤 (formoterol), 플루티카손 (fluticasone), 류프롤리드 (leuprolide), 미다졸람 (midazolam), 알프라졸람 (alprazolam), 암포테리신 (amphotericin) B, 포도필로톡신 (podophylotoxin), 뉴클레오시드 항바이러스제, 아로일 히드라존, 수마트립탄 (sumatriptan); 매크롤리드 (macrolide), 예를 들어 에리트로마이신 (erythromycin), 올레안도마이신 (oleandomycin), 트롤레안도마이신 (troleandomycin), 록시트로마이신 (roxithromycin), 클라리트로마이신 (clarithromycin), 다베르신 (davercin), 아지트로마이신 (azithromycin), 플루리트로마이신 (flurithromycin), 디리트로마이신 (dirithromycin), 조사마이신 (josamycin), 스피로마이신 (spiromycin), 미데카마이신 (midecamycin), 류코마이신 (leucomycin), 미오카마이신 (miocamycin), 로키타마이신 (rokitamycin), 안다지트로마이신 (andazithromycin) 및 스위놀리드 (swinolide) A; 플루오로퀴놀론, 예를 들어 시프로플록사신 (ciprofloxacin), 오플록사신 (ofloxacin), 레보플록사신 (levofloxacin), 트로바플록사신 (trovafloxacin), 알라트로플록사신 (alatrofloxacin), 목시플록시신 (moxifloxicin), 노르풀록사신 (norfloxacin), 에녹사신 (enoxacin), 그레파플록사신 (grepafloxacin), 가티플록사신 (gatifloxacin), 로메플록사신 (lomefloxacin), 스파르플록사신 (sparfloxacin), 테마플록사신 (temafloxacin), 페플록사신 (pefloxacin), 아미플록사신 (amifloxacin), 플레록사신 (fleroxacin), 토수플록사신 (tosufloxacin), 프룰리플록사신 (prulifloxacin), 이를록사신 (irloxacin), 파주플록사신 (pazufloxacin), 클리나플록사신 (clinafloxacin), 및 시타플록사신 (sitafloxacin); 아미노글리코시드, 예를 들어 젠타미신 (gentamicin), 네틸미신 (netilmicin), 파라메신 (paramecin), 토브라마이신 (tobramycin), 아미카신 (amikacin), 카나마이신 (kanamycin), 네오마이신 (neomycin), 및 스트렙토마이신 (streptomycin), 반코마이신 (vancomycin), 테이코플라닌 (teicoplanin), 람폴라닌 (rampolanin), 미데플라닌 (mideplanin), 콜리스틴 (colistin), 답토마이신 (daptomycin), 그라미시딘 (gramicidin), 콜리스티메테이트 (colistimethate); 폴리믹신 (polymixin), 예를 들어 폴리믹신 B, 카프레오마이신 (capreomycin), 바시트라신 (bacitracin), 페넴 (penem); 페니실린 (penicillin), 예를 들어 페니실리나제-민감성 작용제, 예를 들어 페니실린 G, 페니실린 V; 페니실리나제-내성 작용제, 예를 들어 메티실린 (methicillin), 옥사실린 (oxacillin), 클록사실린 (cloxacillin), 디클록사실린 (dicloxacillin), 플록사실린 (floxacillin), 나프실린 (nafcillin); 그램 음성 미생물 작용제, 예를 들어 앰피실린 (ampicillin), 아목시실린 (amoxicillin), 및 헤타실린 (hetacillin), 실린 (cillin), 및 갈람피실린 (galampicillin); 항슈도모나스성 (antipseudomonal) 페니실린, 예를 들어 카르베니실린 (carbenicillin), 티카르실린 (ticarcillin), 아즐로실린 (azlocillin), 메즐로실린 (mezlocillin), 및 피페라실린 (piperacillin); 세팔로스포린 (cephalosporin), 예를 들어 세프포독심 (cefpodoxime), 세프프로질 (cefprozil), 세프트부텐 (ceftbuten), 세프티족심 (ceftizoxime), 세프트리악손 (ceftriaxone), 세팔로틴 (cephalothin), 세파피린 (cephapirin), 세팔렉신 (cephalexin), 세프라드린 (cephradrine), 세폭시틴 (cefoxitin), 세파만돌 (cefamandole), 세파졸린 (cefazolin), 세팔로리딘 (cephaloridine), 세파클로르 (cefaclor), 세파드록실 (cefadroxil), 세팔로글리신 (cephaloglycin), 세푸록심 (cefuroxime), 세포라미드 (ceforamide), 세포탁심 (cefotaxime), 세파트리진 (cefatrizine), 세파세트릴 (cephacetrile), 세페핌 (cefepime), 세픽심 (cefixime), 세포니시드 (cefonicid), 세포페라존 (cefoperazone), 세포테탄 (cefotetan), 세핀타졸 (cefinetazole), 세프타지딤 (ceftazidime), 로라카르베프 (loracarbef), 및 목살락탐 (moxalactam), 모노박탐 (monobactam), 예를 들어 아즈트레오남 (aztreonam); 및 카르바페넴 (carbapenem), 예를 들어 이미페넴 (imipenem), 메로페넴 (meropenem), 펜타미딘 이세티오우에이트 (pentamidine isethiouate), 알부테롤 (albuterol) 설페이트, 리도카인 (lidocaine), 메타프로테레놀 (metaproterenol) 설페이트, 베클로메타손 (beclomethasone) 디프레피오네이트, 트리암시놀론 (triamcinolone) 아세트아미드, 부데소니드 아세토니드 (budesonide acetonide), 플루티카손 (fluticasone), 이프라트로퓸 (ipratropium) 브로마이드, 플루니솔리드 (flunisolide), 크로몰린 (cromolyn) 나트륨, 및 에르고타민 (ergotamine) 타르트레이트; 탁산 (taxane), 예를 들어 파클리탁셀 (paclitaxel); SN-38, 및 티르포스틴 (tyrphostine)이다.
따라서, 당업자에게 "소분자"로서 공지된 화학적 화합물이 또한, 본 발명에 따라서 생각할 수 있는 생물학적 활성 물질이다. 본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "소분자"는 단백질 및 올리고뉴클레오티드 이외의 것이긴 하지만, 50개 이하 아미노산의 펩티드를 포함한, 생물학적 활성 화학적 화합물에 관한 것이다. 이러한 소분자의 전형적인 예가 앞서 문단에 열거되어 있다.
올리고뉴클레오티드에 대한 예는 앱타머 (aptamer) 및 siRNA이다. 또한, 생각할 수 있는 생물학적 활성 물질로서 펩티드 핵산 (PNA)이 언급된다.
따라서, 본 발명은 또한, 단백질이 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 알파-1-항트립신, 항체 또는 항체 단편, 및 대체 단백질 스캐폴드인, 상기 언급된 바와 같은 방법 및 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 맥락에서 사용된 바와 같은 용어 "대체 단백질 스캐폴드"는 소정의 항체와 유사한 결합 능력을 지닌 분자에 관한 것인데, 이러한 분자는 대체 비-항체 단백질 골격에 기초한다. 이러한 맥락에서, 문헌 [참고: A. Skerra, T. Hey et al., and H. K. Binz (다음 참고 문헌 목록 참고)]을 언급할 수 있다.
본 발명의 생물학적 활성 물질 (BA)이 관련되는 한은, 이들 화합물이 본 발명의 단계 (ii)에 따라서 커플링하기 위한 하나 이상의 아미노 기를 포함할 수 있다. BA 자체가 이러한 커플링에 적합한 아미노 기를 포함하지 않는 경우에는, 이러한 아미노 기 중의 하나 이상을, BA를 대상으로 하여 (ii)를 수행하기 이전에, 당업자에게 공지된 방법을 통하여 적합하게 관능기화함으로써 BA 내로 도입하는 것을 생각할 수 있다.
상기 언급된 생물학적 활성제, 특히 상기 언급된 바람직한 생물학적 활성제에 따르면, 그리고 상기 언급된 바람직한 가교 결합성 화합물 및 그로부터 수득된 HAS 유도체에 따르면, 다음 HAS 유도체가, 예를 들어 바람직한 양태로서 언급될 수 있는데, 각 경우에 있어서 HAS는 본 발명의 바람직한 양태에 따라서 HES이다:
또는
또는 
또는
또는
상기에서, BA'는 단백질이고, 보다 바람직하게 이러한 단백질은 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 알파-1-항트립신, 항체 또는 항체 단편, 및 대체 단백질 스캐폴드이며, 특히 단백질은 EPO, IFN 알파 또는 G-CSF이다. 보다 더 바람직하게, HAS'는 HES'이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3, 바람직하게 0.7 내지 1.3, 예를 들어 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3, 가장 바람직하게 약 1.0, 1.1, 1.2 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 식에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
상기식에서, HAS는 바람직하게, HES이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
추가의 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 식에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
상기식에서, HAS는 바람직하게, HES이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
추가의 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 식에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
상기식에서, HAS는 바람직하게, HES이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
추가의 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 식에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
상기식에서, HAS는 바람직하게, HES이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
추가의 특히 바람직한 양태에 따르면, 본 발명은 다음 식에 따르는 HAS 유도체에 관한 것이다:
상기식에서, HAS는 바람직하게, HES이고, 보다 더 바람직하게 HES는 평균 분자량이 약 1 내지 약 1000 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 800 kDa, 보다 바람직하게 약 1 내지 약 500 kDa, 보다 바람직하게 약 2 내지 약 400 kDa, 보다 바람직하게 약 5 내지 약 300 kDa, 보다 바람직하게 약 10 내지 약 200 kDa, 특히 약 50 내지 약 150 kDa이고, 몰 치환이 0.1 내지 3, 바람직하게 0.4 내지 1.3, 예를 들어 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 또는 1.3이며, C2 : C6 치환비가 바람직하게 2 내지 20의 범위, 보다 바람직하게 2 내지 15의 범위, 보다 더 바람직하게 3 내지 12의 범위이다.
추가의 국면에 따르면, 본 발명은 인체 또는 동물체를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체, 또는 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한, 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 치료제 또는 예방제로서의, 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체, 또는 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한, 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체에 관한 것이다.
더우기, 본 발명은 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체, 또는 상기 언급된 바와 같은 방법에 의해 수득되거나 수득 가능한, 상기 언급된 바와 같은 BA'를 포함하는 HAS 유도체의 치료상 유효량을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
BA'를 포함하는 본 발명의 HAS 유도체는 적합한 방법, 예를 들어 바람직하게 정맥내, 피하 또는 근육내 경로에 의해 투여되는 경장, 비경구 또는 폐 방법에 의해 투여할 수 있다. 선택된 구체적인 경로는 치료하고자 하는 질환에 좌우될 것이다. 바람직하게, 상기 유도체는 당해 분야에 공지된 바와 같은 적합한 담체 (예를 들어, 부형제로서 알부민을 수반하거나 알부민-무함유의 제1 세대/변형되지 않은 생물의약품에 사용된 바와 같음), 적합한 희석제, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는피하 적용용 멸균성 용액과 함께 투여할 수 있다. 요구되는 투여량은 치료하고자 하는 질환의 중증도, 환자의 개별적 반응, 사용된 투여 방법 등에 좌우될 것이다. 당업자는 그의 일반적인 지식에 기초하여 정확한 투여량을 확립할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, BA'를 포함하는 HAS 유도체를 포함하는 본 발명에 따르는 제약 조성물이 관련되는 한은, HAS 유도체를 제약 부형제와 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로, HAS 유도체는 고체 또는 액체 형태일 수 있는 적합한 제약 부형제와 조합할 수 있는 고체 형태일 것이다. 부형제로서, 탄수화물, 무기 염, 항미생물제, 항산화제, 계면활성제, 완충제, 산, 염기 및 그의 조합물을 언급할 수 있다. 탄수화물, 예를 들어 당, 유도체화 당, 예를 들면 알디톨, 알돈산, 에스테르화 당 및/또는 당 중합체가 부형제로서 존재할 수 있다. 구체적인 탄수화물 부형제에는, 예를 들어 단당류, 예를 들면 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 소르보스 등; 이당류, 예를 들면 락토스, 슈크로스, 트레할로스, 셀로비오스 등; 다당류, 예를 들면 라피노스, 멜레지토스, 말토덱스트린, 덱스트란, 전분 등; 및 알디톨, 예를 들면 만니톨, 크실리톨, 말티톨, 락티톨, 크실리톨, 솔비톨 (글루시톨), 피라노실 솔비톨, 미오이노시톨 등이 포함된다. 부형제에는 또한, 무기 염 또는 완충제, 예를 들어 시트르산, 염화나트륨, 염화칼륨, 황산나트륨, 질산칼륨, 1가 인산나트륨, 2가 인산나트륨 및 그의 조합물이 포함될 수 있다. 본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 미생물 성장을 방지시키거나 막기 위한 항미생물제, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 벤질 알코올, 세틸피리디늄 클로라이드, 클로로부탄올, 페놀, 페닐에틸 알코올, 페닐머쿠르산 니트레이트, 티메르솔 및 그의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 차아인산, 모노티오글리세롤, 프로필 갈레이트, 아황산나트륨, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 나트륨 메타비설파이트 및 그의 조합물을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 계면활성제, 예를 들어 폴리솔베이트 또는 플루로닉스 (pluronics) 솔비탈 에스테르; 지질, 예를 들어 인지질, 예를 들면 레시틴 및 기타 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 산 및 지방 에스테르; 스테로이드, 예를 들면 콜레스테롤; 및 킬레이트제, 예를 들면 EDTA 또는 아연을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 제약 조성물은 또한, 산 또는 염기, 예를 들어 염산, 아세트산, 인산, 시트르산, 말산, 락트산, 포름산, 트리클로로아세트산, 질산, 과염소산, 인산, 황산, 푸마르산, 및 그의 조합물, 및/또는 수산화나트륨, 나트륨 아세테이트, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모늄 아세테이트, 칼륨 아세테이트, 인산나트륨, 인산칼륨, 나트륨 시트레이트, 나트륨 포르메이트, 황산나트륨, 황산칼륨, 칼륨 푸메레이트 및 그의 조합물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 부형제는 본 발명에 따르는 제약 조성물 내에, 각 경우에 있어서 제약 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.001 내지 99.999 wt-%, 바람직하게 0.01 내지 99.99 wt.-%, 보다 바람직하게 0.1 내지 99.9 wt.-%의 양으로 존재할 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 빈혈성 장애 또는 조혈 기능장애 또는 이와 관계된 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 EPO이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 장애를 치료하기 위해 혈우병 A를 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 G-CSF이다)의 용도에 관한 것이다. 바람직한 양태에 따르면, 조혈 또는 면역 기능 저하를 특징으로 하는 장애는 화학요법, 방사선 요법, 감염성 질환, 중증 만성 호중구 감소증, 또는 백혈병에 따른 결과이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 백혈병, 예를 들어 모발상 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 난포성 림프종, 암, 예를 들어 카르시노이드 (carcinoid) 종양, 악성 흑색종 및 간염, 예를 들어 만성 B형 간염 및 만성 C형 간염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 IFN 알파이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 골다공증 및/또는 만성 악성 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 IFN 감마이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 골다공증 및/또는 만성 악성 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 IL-2이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 골수억제성 화학요법 후 혈소판 수혈을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 IL-11이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 폐기종, 낭포성 섬유증, 아토피성 피부염 및/또는 기관지염을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 A1AT이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 다발성 경화증, 바람직하게 재발 형태의 다발성 경화증을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 IFN 베타이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 인자 VIII 또는 인자 IX에 대한 억제제가 있는 혈우병 A 또는 B 환자에게서의 증상 발현을 치료하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 인자 VII이다)의 용도에 관한 것이다.
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 또한, 수술 상황 하에서의 출혈을 제어하고 예방하는 것을 포함한, 혈우병 B 환자에게서의 출혈성 증상 발현, 예를 들어 선천성 인자 IX 결핍증 또는 크리스마스병 (Christmas disease)을 제어하고 예방하기 위한 약물을 제조하기 위한, 상기 언급된 바와 같은 HAS 유도체, 바람직하게 HES 유도체 (여기서, BA는 인자 IX이다)의 용도에 관한 것이다.
참고문헌 목록
<도면의 설명>
도 1: oxHES55/0.7-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 1은 실시예 2에 따르는 oxHES-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (Mark12) (공급처: Invitrogen).
레인 1-4: 실시예 2에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (19 kDa)의 성공적인 HES화는 30 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 (smeary) 밴드로서 가시적이었다.
도 2: oxHES55/0.7-IFNa 커플링 반응의 음이온 교환 크로마토그래피
도 2는 실시예 2에 따르는 oxHES55/0.7-IFNa 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 (Akta Explorer) 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 하이 트랩 (Hi Trap) Q HP 1 ml (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0.
용출제 B: 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척 2 CV 0%B
용출 16 CV 0-50%B
재생 10 CV 100%B
재평형 8 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 20배 희석되고 pH 8.0으로 조정된, 실시예 2에 따르는 반응 혼합물로서 2 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 3: oxHES55/0.7-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 3은 실시예 3에 따르는 oxHES55/0.7-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 실시예 3에 따르는 반응 혼합물.
레인 2: 접합 이전의 EPO 출발 물질.
표적 단백질 (약 35 내지 40 kDa)의 성공적인 HES화는 55 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 4: oxHES55/0.7-EPO 커플링 반응의 양이온 교환 크로마토그래피
도 4는 실시예 3에 따르는 oxHES55/0.7-EPO 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 하이 트랩 SP HP (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0.
용출제 B: 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0.
작동 조건: 유속 5 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척1 2 CV 0%B
세척2 2 CV 10%B
용출 21 CV 10-52%B
재생 8 CV 100%B
재평형 5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 10배 희석된, 실시예 3에 따르는 반응 혼합물로서 2 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 5: oxHES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 5는 실시예 5에 따르는 oxHES-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 실시예 5에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (19 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 6: oxHES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 음이온 교환 크로마토그래피
도 6은 실시예 5에 따르는 oxHES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 하이 트랩 Q HP 5 ml (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0.
용출제 B: 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척 2 CV 0%B
용출 12.5 CV 0-50%B
재생 5 CV 100%B
재평형 5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 20배 희석되고 pH 8.0으로 조정된, 실시예 5에 따르는 반응 혼합물로서 2 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 7: oxHES100/1.0-IFNa 접합체의 펩티드 지도화
도 7은 엔도-LysC로 처리시킨 실시예 5에 따르는 IEX-정제된 oxHES-IFNa 접합체의 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다.
37℃ 하에 밤새 50 mM 트리스-Cl, pH 8.6, 0.01% SDS 중의 7.5% 엔도-LysC를 이용하여 단백질 분해를 수행하였다. DTT 및 염화구아니디늄을 이용하여 샘플을 변성시키고, TFA를 수반한 물/아세토니트릴 구배를 이용하여 수행한 4.6 x 250 mm 주피터 (Jupiter) C4 칼럼 (공급처: Phenomenex) 상에서 RP-HPLC함으로써 분석하였다. 도시된 크로마토그램은 214 nm에서 모니터링하였다.
화살표는 단백질 (A)에 대한 크로마토그램과 접합체 (B)에 대한 크로마토그램 간의 강력한 차이가 가시적인 크로마토그램 영역을 표시한다. L1 및 L1/L2 (엔도-Lys C 처리로부터 생성되는 N-말단 펩티드)에 대한 피크는 접합체 샘플에 대해 상당히 감소되는 반면, 기타 단편은 거의 영향을 받지 않고 있다. 이들 데이터는 HES가 IFNa의 N-말단과 우선적으로 커플링된다는 것을 제안하고 있다.
도 8: oxHES100/1.0-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 8은 실시예 6에 따르는 oxHES100/1.0-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 접합 이전의 10 ㎍ EPO 출발 물질.
레인 2: 접합 이전의 5 ㎍ EPO 출발 물질.
레인 3: 실시예 6에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (약 35 내지 40 kDa)의 성공적인 HES화는 70 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 9: oxHES100/1.0-EPO 커플링 반응의 양이온 교환 크로마토그래피
도 9는 실시예 6에 따르는 oxHES100/1.0-EPO 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 2 x 5 ml 하이 트랩 SP HP (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0.
용출제 B: 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0.
작동 조건: 유속 5 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척1 2 CV 0%B
세척2 2 CV 10%B
용출 21 CV 10-52%B
재생 2.5 CV 100%B
재평형 5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 10배 희석된, 실시예 6에 따르는 반응 혼합물로서 2 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 10: oxHES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 10은 실시예 7에 따르는 oxHES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 실시예 7에 따르는 반응 혼합물.
레인 2: 접합 이전의 G-CSF 출발 물질.
표적 단백질 (약 18 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 11: oxHES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 11은 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 7에 따르는 oxHES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 수미트 (Summit), P580 (HPG) (공급처: Dionex).
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-5분, 5-55%B; 5-12분, 55-68%B; 12-17분, 100%B; 17-22분, 5%B; 구배 지연 2.5분.
부하: 0.1 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
11.5분에서의 주요 피크는 약 13분에 용출되는 자유 G-CSF로부터 분리된 HES 단백질 접합체이다.
도 12: HES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 12는 실시예 10에 따르는 HES-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 염색되지 않은 단백질 마커 5 내지 200 kDa (공급처: Serva).
레인 1: 실시예 9에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (19 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 13: HES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 음이온 교환 크로마토그래피
도 13은 실시예 10에 따르는 HES100/1.0-IFNa 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 5 ml 하이 트랩 SP HP (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0.
용출제 B: 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0.
작동 조건: 유속 5 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척1 2 CV 0%B
용출 20 CV 0-50%B
재생 10 CV 100%B
재평형 5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 10배 희석된, 실시예 9에 따르는 반응 혼합물로서 3 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 14: HES100/1.0-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 14는 실시예 11에 따르는 HES100/1.0-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: IEX 정제된 HES EPO 접합체.
레인 2: 실시예 11에 따르는 반응 혼합물.
레인 3: 접합 이전의 5 ㎍ EPO 출발 물질.
표적 단백질 (약 35 내지 40 kDa)의 성공적인 HES화는 70 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 15: HES100/1.0-EPO 커플링 반응의 양이온 교환 크로마토그래피
도 15는 실시예 11에 따르는 HES100/1.0-EPO 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 4 x 5 ml 하이 트랩 SP HP (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0.
용출제 B: 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0.
작동 조건: 유속 5 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 5 CV 0%B
샘플 부하
세척1 2 CV 0%B
용출 13 CV 0-52%B
재생 2.5 CV 100%B
재평형 2.5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 2배 희석된, 실시예 11에 따르는 반응 혼합물로서 3 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 16: HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 16은 실시예 12에 따르는 HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: IEX 정제된 HES G-CSF 접합체.
레인 2: 실시예 12에 따르는 반응 혼합물.
레인 3: 접합 이전의 5 ㎍ G-CSF 출발 물질.
표적 단백질 (약 18 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 17: HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 17은 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 12에 따르는 HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 수미트, P580 (LPG) (공급처: Dionex).
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-5분, 5-55%B; 5-12분, 55-68%B; 12-17분, 100%B; 17-22분, 5%B; 구배 지연 2.5분.
부하: 0.1 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
10 내지 10.5분에서의 주요 피크는 약 12분에 용출되는 자유 G-CSF로부터 분리된 HES 단백질 접합체이다.
도 18: HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 양이온 교환 크로마토그래피
도 18은 실시예 12에 따르는 HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 이온 교환 칼럼 상에서 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 2 x 5 ml 하이 트랩 SP HP (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0.
용출제 B: 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0.
작동 조건: 유속 5 ml/min, 21℃.
수행 파라미터:
평형 5 CV 0%B
샘플 부하
세척 2 CV 0%B
용출 15 CV 0-40%B
재생 5 CV 100%B
재평형 5 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 2배 희석된, 실시예 12에 따르는 반응 혼합물로서 3 mg 단백질/ml 수지.
반응되지 않은 과량의 HES가 관류에서 발견된다. HES화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 19 내지 23은 각각의 실시예 맥락에서 지칭된다.
도 24
도 24는 280 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 "부가의 데이터 (A.2)"에 따르는 oxHBS-BSA 커플링 반응의 HPGPC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 쉬마드수 (Shimadsu) LC1O AD/UV-데텍토르 (Detektor): TSP UV 2000.
칼럼: 슈퍼로스 (Superose) 6 10/300 GL (공급처: Pharmacia).
용출제: 인산염 완충액: [3.887g Na2HPO4 x 2 H2O, 1.967g NaH2PO4 x 2 H2O, 11.688g NaCl, 0.05g NaN3을 총 용적 1.0 ℓ 이하가 되도록 크로마토그래피 (Reagent Pharmakopoea Europaea)를 위해 물에 용해시켰다. 0.45 ㎛ 필터를 활용하여 용액을 여과시켰다].
작동 조건: 유속 0.4 ml/min, 20℃.
부하: 9 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 100 ㎕에 용해시킨, 반응 혼합물로서 0.9 mg 단백질.
상단부는 커플링 반응 이전의 BSA 출발 물질을 도시한 것이다. 좌측에서 우측으로 피크는 38.038, 39.277, 및 42.272 하에서이다.
하단부는 HBS-BSA 접합체를 도시한 것이다. 좌측에서 우측으로 피크는 36.795, 39.345, 및 41.521 하에서이다.
도 25: oxHBS-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 25는 "부가의 데이터 (A.3)"에 따르는 oxHBS-IFNa 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1 내지 4: "부가의 데이터 (A.3)"에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (약 19 kDa)의 성공적인 HBS화는 30 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 26: oxHBS-IFNa 커플링 반응의 음이온 교환 크로마토그래피
도 26은 이온 교환 칼럼을 이용하여 부가의 데이터 (A.3)에 따르는 oxHBS-IFNa 커플링 반응의 221 nm 하의 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 크로마토그래피적 분리를 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 악타 익스플로러 100 (공급처: GE Healthcare).
칼럼: 하이 트랩 Q HP 1 ml (공급처: GE Healthcare).
용출제 A: 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0.
용출제 B: 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
수행 파라미터:
평형 10 CV 0%B
샘플 부하
세척 2 CV 0%B
용출 16 CV 0-50%B
재생 10 CV 100%B
재평형 8 CV 0%B
부하: 용출제 A에서 20배 희석되고 pH 8.0으로 조정된, 실시예 3에 따르는 반응 혼합물.
반응되지 않은 과량의 HBS가 관류에서 발견된다. HBS화는 단백질과 칼럼의 상호 작용을 약화시켜, 변형되지 않은 단백질과 비교해서 접합체에 대한 용출 시간을 단축시킨다.
도 27: oxHBS-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 27은 "부가의 데이터 (A.4)"에 따르는 oxHBS-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
부하: 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: "부가의 데이터 (A.4)"에 따르는 반응 혼합물.
레인 2: 접합 이전의 EPO 출발 물질.
표적 단백질 (약 35 내지 40 kDa)의 성공적인 HBS화는 45 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 28: HESlOO/1.0, 링커 (a2) 및 (Trp
4
)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 28은 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 18, 표 3에 따르는 HESlOO/1.0, 링커 (a2) 및 (Trp4)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 쉬마드주 LC 20 프로미넨스 (Prominence), LC 20AT (LPG) (공급처: Shimadzu)
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-15분, 2-30%B; 15-20분, 30-98%B; 20-27분, 2%B.
부하: 0.05 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 5 ㎍ 단백질.
11.5 내지 15분에서의 주요 피크는 약 17분에 용출되는 자유 (Trp4)-켐프티드로부터 분리된 HES 펩티드 접합체이다.
도 29: HESlOO/1.0, 링커 (a16) 및 (Trp
4
)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 29는 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 18, 표 5, 라인 13에 따르는 HESlOO/1.0, 링커 (a16) 및 (Trp4)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 쉬마드주 LC 20 프로미넨스, LC 20AT (LPG) (공급처: Shimadzu)
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-15분, 2-30%B; 15-20분, 30-98%B; 20-27분, 2%B.
부하: 0.05 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 5 ㎍ 단백질.
11.5 내지 15분에서의 주요 피크는 약 17분에 용출되는 자유 (Trp4)-켐프티드로부터 분리된 HES 펩티드 접합체이다.
도 30: HESlOO/1.0, 링커 (a11) 및 (Trp
4
)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 30은 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 18, 표 5, 라인 24에 따르는 HESlOO/1.0, 링커 (a11) 및 (Trp4)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 쉬마드주 LC 20 프로미넨스, LC 20AT (LPG) (공급처: Shimadzu)
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-15분, 2-30%B; 15-20분, 30-98%B; 20-27분, 2%B.
부하: 0.05 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 5 ㎍ 단백질.
11.5 내지 15분에서의 주요 피크는 약 17분에 용출되는 자유 (Trp4)-켐프티드로부터 분리된 HES 펩티드 접합체이다.
도 31: HESlOO/1.0, 링커 (a12) 및 (Trp
4
)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석
도 31은 221 nm 하에서 UV-Vis 분광법에 의해 모니터링된 실시예 18, 표 5, 라인 30에 따르는 HESlOO/1.0, 링커 (a12) 및 (Trp4)-켐프티드를 이용한 커플링 반응의 RP-HPLC 분석 박편을 도시한 것이다. 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:
크로마토그래피 시스템: 쉬마드주 LC 20 프로미넨스, LC 20AT (LPG) (공급처: Shimadzu)
칼럼: 주피터 C18, 300A, 5 ㎛, 4.6 x 150 mm (공급처: Phenomenex).
용출제 A: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산.
용출제 B: 아세토니트릴 중의 0.1% 트리플루오로아세트산.
작동 조건: 유속 1 ml/min, 20℃.
구배: 0-15분, 2-30%B; 15-20분, 30-98%B; 20-27분, 2%B.
부하: 0.05 mg/ml의 단백질 농도가 되도록 수중 희석시킨, 반응 혼합물로서 5 ㎍ 단백질.
11.5 내지 15분에서의 주요 피크는 약 17분에 용출되는 자유 (Trp4)-켐프티드로부터 분리된 HES 펩티드 접합체이다.
도 32: HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 32는 실시예 18에 따르는 HES100/1.0-G-CSF 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MES 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 표 5, 라인 7에 따르는 반응 혼합물 (10 ㎍ 단백질 부하됨).
레인 2: 표 5, 라인 16에 따르는 반응 혼합물 (10 ㎍ 단백질 부하됨).
레인 3: 표 5, 라인 27에 따르는 반응 혼합물 (10 ㎍ 단백질 부하됨).
레인 4: 표 5, 라인 33에 따르는 반응 혼합물 (10 ㎍ 단백질 부하됨).
레인 5: 접합 이전의 0.5 ㎍ rhG-CSF 출발 물질.
표적 단백질 (약 18 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
도 33: HES100/1.0-IFNa 및 HES100/1.0-EPO 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석
도 33은 실시예 18에 따르는 HES100/1.0과 rhIFNα 또는 rhEPO 간의 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 도시한 것이다. 분리는 제조업자의 지시에 따라서 4 내지 12% 비스-트리스 겔 (1.0 mm) 및 MOPS 수행 완충액을 수반한 NuPAGE 시스템 (공급처: Invitrogen)을 이용하여 환원성 조건 하에 수행하였다. 우측에 도시된 전기영동적 분리의 경우에는, MOPS 대신 MES 완충액을 사용하였다.
전형적인 부하: 출발 물질 또는 반응 혼합물로서 10 ㎍ 단백질.
M: 마커, 마르크12 (공급처: Invitrogen).
레인 1: 표 5, 라인 4에 따르는 반응 혼합물.
레인 2: 표 5, 라인 14에 따르는 반응 혼합물.
레인 3: 표 5, 라인 25에 따르는 반응 혼합물.
레인 4: 표 5, 라인 31에 따르는 반응 혼합물.
레인 5: 접합 이전의 rhIFNα 출발 물질.
표적 단백질 (약 19 kDa)의 성공적인 HES화는 50 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
레인 6: 표 5, 라인 15에 따르는 반응 혼합물.
레인 7: 표 5, 라인 5에 따르는 반응 혼합물.
레인 8: 표 5, 라인 32에 따르는 반응 혼합물.
레인 9: 접합 이전의 rhEPO 출발 물질.
레인 10: 표 5, 라인 26에 따르는 반응 혼합물.
표적 단백질 (약 35 내지 40 kDa)의 성공적인 HES화는 60 내지 >200 kDa 범위의 광범위한 질량 분포도를 나타내는 얼룩진 밴드로서 가시적이었다.
<실시예>
실시예 1: oxHES55/0.7-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)의 제조
분자량이 55 kDa이고 몰 치환이 0.7인 HES (HES55/0.7)로부터 출발하여 WO 2005/083103 A의 실시예 9에 기재된 바와 같이 HES 알돈산 (oxHES)을 합성하였다 (상기 문헌에는 고분지된 전분 HBS에 대한 제조가 기재되어 있다).
80℃ 하에 2일 동안 건조시킨 3O g oxHES 55/0.7을 60 ml 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해시키고, 이 용액을 70℃로 가열하였다. 50 ml 무수 DMF 중의 25 g 1-아미노-3,3-디에톡시프로판을 가하고, 반응 혼합물을 48시간 동안 70℃에서 가열하였다.
회전 증발기를 활용하여 진공하 60 내지 80℃에서 DMF 및 과량의 1-아미노-3,3-디에톡시프로판을 제거하였다. 세척 용액에서 색상이 전혀 탐지되지 않을 때까지 나머지 조 고체를 아세톤으로 세척하였다. 생성물을 500 ml 물에 용해시키고, 컷-오프 (cut-off)가 10,000 달톤인 막을 활용하여 한외 여과시킴으로써 정제하였다. 보존물의 pH가 6 내지 7에 도달하게 되면, 0.1 M 수산화나트륨 용액을 활용하여 이를 9로 재조정하였다. 이러한 과정을 4회 반복하였다. 최종적으로, 생성물을 동결건조시켰다.
실시예 2: oxHES55/0.7 인터페론 알파 2b (IFNa) 접합체의 제조
실시예 1에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 24시간 동안 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
인터페론-알파 [에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli) (이. 콜라이)를 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b; 이러한 인터페론 알파-2b는 165개 아미노산으로 구성되고, 천연 인간 인터페론 알파-2b (hIFN-알파-2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시한다]를 16 mg/ml 이하로 농축시키고, 이를 한외 여과 장치를 이용하여 적합한 접합 완충액 (0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 4.0)에 옮겼다.
10배 몰 과량의 oxHES 알데히드 (Mw를 기준으로 함)를 반응 혼합물 중의 단백질 농도 6 mg/ml와 함께 사용하였는데; oxHES 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 탈보호된 oxHES 알데히드를 단백질 용액과 합하고, 신선하게 제조된 NaCNBH3 용액 (접합 완충액 중의 0.5 M)을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 10℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 1)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 Q HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 인터페론-알파를 분리하였다. 용출제 A는 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0이고, 용출제 B는 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 16 CV 중에서 0%B => 50%B였다 (도 2).
실시예 3: oxHES55/0.7 에리트로포이에틴 (EPO) 접합체의 제조
실시예 1에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 24시간 동안 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
탈보호된 oxHES 알데히드를 EPO [인간 EPO의 아미노산 서열을 갖고 있고 시판용 Erypo® (공급처: Ortho Biotech, Jansen-Cilag) 또는 NeoRecormon® (공급처: Roche)와 거의 동일한 특징을 지니고 있는 재조합 인간 EPO] 용액 (반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 10 mg/ml)과 합하였다. OxHES 알데히드를 EPO 농도와 비교해서 10배 몰 과량 (Mw를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 EPO 농도는 5 mg/ml였고, oxHES 알데히드 농도는 10% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 0℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 3)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 RP-HPLC의 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 SP HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 EPO를 분리하였다. 용출제 A는 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0이고, 용출제 B는 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 10%B, 2 CV; 21 CV 중에서 10%B => 52%B였다 (도 4).
표적 단백질 내의 HES 커플링 부위는 IEX-정제된 HES-단백질 접합체를 펩티드 지도화함으로써 확인하였다. 적합한 프로테아제를 이용하여 상기 접합체를 분해시키고 (2% 엔도프로테이나제 Lys-C, pH 8.6, 37℃, 밤새), 이로써 생성된 단편을, TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 C4 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분리하였다. 단백질 내의 HES화 부위는 표적 단백질 단독의 대조군 분해물과 비교해서 크로마토그램에서 각각의 펩티드가 감소되거나 소멸되는 것에 의해 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 4: oxHES100/1.0-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)의 제조
분자량이 100 kDa이고 몰 치환이 1.0인 HES (HES100/1.0)로부터 출발하여 WO 2005/083103 A의 실시예 9에 기재된 바와 같이 HES 알돈산 (oxHES)을 합성하였다 (상기 문헌에는 고분지된 전분 HBS에 대한 제조가 기재되어 있다).
80℃ 하에 2일 동안 건조시킨 3O g oxHES 100/1.0을 150 ml 무수 디메틸포름아미드 (DMF)에 용해시키고, 이 용액을 70℃로 가열하였다. 60 ml 무수 DMF 중의 25 g 1-아미노-3,3-디에톡시프로판을 가하고, 반응 혼합물을 48시간 동안 70℃에서 가열하였다.
회전 증발기를 활용하여 진공하 60 내지 80℃에서 DMF 및 과량의 1-아미노-3,3-디에톡시프로판을 제거하였다. 세척 용액에서 색상이 전혀 탐지되지 않을 때까지 나머지 조 고체를 아세톤으로 세척하였다. 생성물을 500 ml 물에 용해시키고, 컷-오프가 10,000 달톤인 막을 활용하여 한외 여과시킴으로써 정제하였다. 보존물의 pH가 6 내지 7에 도달하게 되면, 0.1 M 수산화나트륨 용액을 활용하여 이를 9로 재조정하였다. 이러한 과정을 4회 반복하였다. 최종적으로, 생성물을 동결건조시켰다.
실시예 5: 산화된 HES로부터 HES100/1.0 인터페론 알파 (IFNa) 접합체의 제조
실시예 4에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 밤새 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
인터페론-알파 [에스케리챠 콜라이 (이. 콜라이)를 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b; 이러한 인터페론 알파-2b는 165개 아미노산으로 구성되고, 천연 인간 인터페론 알파-2b (hIFN-알파-2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시한다]를 16 mg/ml 이하로 농축시키고, 이를 한외 여과 장치를 이용하여 적합한 접합 완충액 (0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 4.0)에 옮겼다.
6배 몰 과량의 oxHES 알데히드 (Mn를 기준으로 함)를 반응 혼합물 중의 최종 단백질 농도 8 mg/ml와 함께 사용하였는데; oxHES 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 탈보호된 oxHES 알데히드를 단백질 용액과 합하고, 신선하게 제조된 NaCNBH3 용액 (접합 완충액 중의 0.5 M)을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 5℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 5)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 Q HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 인터페론-알파를 분리하였다. 용출제 A는 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0이고, 용출제 B는 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 12.5 CV 중에서 0%B => 50%B였다 (도 6).
표적 단백질 내의 HES 커플링 부위는 IEX-정제된 HES-단백질 접합체를 펩티드 지도화함으로써 확인하였다. 적합한 프로테아제를 이용하여 상기 접합체를 분해시키고 (2% 엔도프로테이나제 Lys-C, pH 8.6, 37℃, 밤새), 이로써 생성된 단편을, TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 C4 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분리하였다. 단백질 내의 HES화 부위는 표적 단백질 단독의 대조군 분해물과 비교해서 크로마토그램에서 각각의 펩티드가 감소되거나 소멸되는 것에 의해 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 6: 산화된 HES로부터 HES100/1.0 에리트로포이에틴 (EPO) 접합체의 제조
실시예 4에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 21℃에서 24시간 동안 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
탈보호된 oxHES 알데히드를 EPO [인간 EPO의 아미노산 서열을 갖고 있고 시판용 Erypo® (공급처: Ortho Biotech, Jansen-Cilag) 또는 NeoRecormon® (공급처: Roche)와 거의 동일한 특징을 지니고 있는 재조합 인간 EPO] 용액 (반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 10 mg/ml)과 합하였다. OxHES 알데히드를 EPO 농도와 비교해서 15배 몰 과량 (Mn를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 EPO 농도는 3.7 mg/ml였고, oxHES 알데히드 농도는 15% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 10℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 8)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 SP HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 EPO를 분리하였다. 용출제 A는 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0이고, 용출제 B는 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 10%B, 2 CV; 21 CV 중에서 10%B => 52%B였다 (도 9).
표적 단백질 내의 HES 커플링 부위는 IEX-정제된 HES-단백질 접합체를 펩티드 지도화함으로써 확인하였다. 적합한 프로테아제를 이용하여 상기 접합체를 분해시키고 (2% 엔도프로테이나제 Lys-C, pH 8.6, 37℃, 밤새), 이로써 생성된 단편을, TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 C4 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분리하였다. 단백질 내의 HES화 부위는 표적 단백질 단독의 대조군 분해물과 비교해서 크로마토그램에서 각각의 펩티드가 감소되거나 소멸되는 것에 의해 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 7: 산화된 HES로부터 HES100/1.0 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF) 접합체의 제조
실시예 4에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 21℃에서 밤새 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
탈보호된 oxHES 알데히드를 rh-Met-G-CSF 용액 [반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 5 mg/ml; 시판용 Neupogen® (공급처: Amgen, Munchen, D)와 동일한 아미노산 서열과 거의 동일한 특징으로 지니고 있는, 이. 콜라이에 의해 발현된 G-CSF]과 합하였다. OxHES 알데히드를 G-CSF 농도와 비교해서 30배 몰 과량 (Mn를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 G-CSF 농도는 1.9 mg/ml였고, oxHES 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 0℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 10)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피 (도 11)함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
실시예 8: HES100/1.0-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)의 제조
15 g HES 100/1.0을 35 g 나트륨 아세테이트 완충제 (pH = 5 및 c = 1 mol/1)에 용해시키고, 2.07 ml의 1-아미노-3,3-디에톡시프로판 뿐만 아니라 1.885 g의 나트륨 시아노보로히드라이드를 가하였다. 반응 혼합물을 60℃ 하에 16 내지 24시간 동안 교반시키고, 100 ml 물로 희석시키며, 묽은 수산화나트륨 용액을 이용하여 중화시키고, 탄산수소 암모늄 완충제 (pH = 9, c = 10 mmol/1, 45주기) 뿐만 아니라 물 (마지막 5회 교환 주기를 위함)에 대항하여 컷-오프가 10,000 Da인 막을 이용하여 한외 여과함으로써 후처리하였다. 정제되고 농축시킨 HES 유도체 용액 (대략 20 wt-%)를, 컷-오프가 10,000 Da인 막을 이용하여 60℃에서 수산화나트륨 용액 (pH = 12)에 대항하여 투석하였다. 그 후, 생성물을 동결건조시킴으로써 단리하였다.
실시예 9: HES100/1.0-N-(3-프로피오알데히드)의 제조
실시예 8로부터의 1O g의 HES-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)을 100 ml의 수성 HCl, pH = 2 (c = 10 mmol/1)에 용해시키고 40℃ 하에 16 내지 24시간 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 수성 HCl, pH = 2 (10 주기) 뿐만 아니라 물 (마지막 5회 교환 주기를 위함)에 대항하여 컷 오프가 10,000 Da인 막을 이용하여 한외 여과시킴으로써 정제하였다. 생성물의 단리는 동결건조시킴으로써 수행하였다.
실시예 10: HES로부터 HES100/1.0 인터페론 알파 (IFNa) 접합체의 제조
실시예 8에서 제조된 400 mg의 아세탈에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 밤새 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
인터페론-알파 [에스케리챠 콜라이 (이. 콜라이)를 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b; 이러한 인터페론 알파-2b는 165개 아미노산으로 구성되고, 천연 인간 인터페론 알파-2b (hIFN-알파-2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시한다]를 16 mg/ml 이하로 농축시키고, 이를 한외 여과 장치를 이용하여 적합한 접합 완충액 (0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 4.0)에 옮겼다.
5배 몰 과량의 HES 알데히드 (Mw를 기준으로 함)를 반응 혼합물 중의 최종 단백질 농도 7 mg/ml와 함께 사용하였는데; HES 알데히드 농도는 18% (w/v)였다. 탈보호된 HES 알데히드를 단백질 용액과 합하고, 신선하게 제조된 NaCNBH3 용액 (접합 완충액 중의 0.5 M)을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 5℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 12)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 SP HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 IFN알파를 분리하였다. 용출제 A는 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0이고, 용출제 B는 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 20 CV 중에서 0%B => 50%B였다 (도 13).
표적 단백질 내의 HES 커플링 부위는 IEX-정제된 HES-단백질 접합체를 펩티드 지도화함으로써 확인하였다. 적합한 프로테아제를 이용하여 상기 접합체를 분해시키고 (2% 엔도프로테이나제 Lys-C, pH 8.6, 37℃, 밤새), 이로써 생성된 단편을, TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 C4 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분리하였다. 단백질 내의 HES화 부위는 표적 단백질 단독의 대조군 분해물과 비교해서 크로마토그램에서 각각의 펩티드가 감소되거나 소멸되는 것에 의해 간접적으로 확인할 수 있었다.
실시예 11: HES로부터 HES100/1.0 에리트로포이에틴 (EPO) 접합체의 제조
실시예 9로부터의 탈보호된 HES 알데히드를 EPO [인간 EPO의 아미노산 서열을 갖고 있고 시판용 Erypo® (공급처: Ortho Biotech, Jansen-Cilag) 또는 NeoRecormon® (공급처: Roche)와 거의 동일한 특징을 지니고 있는 재조합 인간 EPO] 용액 (반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 10 mg/ml)과 합하였다. HES 알데히드를 EPO 농도와 비교해서 40배 몰 과량 (Mn를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 EPO 농도는 3.2 mg/ml였고, HES 알데히드 농도는 30% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 5℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 14)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 SP HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 EPO를 분리하였다. 용출제 A는 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0이고, 용출제 B는 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 13 CV 중에서 0%B => 52%B였다 (도 15).
실시예 12: HES로부터 HES100/1.0 과립구 집락 자극 인자 (G-CSF) 접합체의 제조
실시예 9로부터의 탈보호된 HES 알데히드를 rh-Met-G-CSF 용액 [반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 5 mg/ml; 시판용 Neupogen® (공급처: Amgen, Munchen, D)와 동일한 아미노산 서열과 거의 동일한 특징으로 지니고 있는, 이. 콜라이에 의해 발현된 G-CSF]과 합하였다. HES 알데히드를 G-CSF 농도와 비교해서 40배 몰 과량 (Mn를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 G-CSF 농도는 1.3 mg/ml였고, HES 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 10℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 RP-HPLC의 용출을 수행하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 16)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피 (도 17)함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 RP-HPLC의 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 SP HP 칼럼을 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HES화 G-CSF를 분리하였다. 용출제 A는 20 mM 나트륨 아세테이트, pH 4.0이고, 용출제 B는 20 mM 나트륨 아세테이트, 1 M NaCl, pH 4.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 15 CV 중에서 0%B => 40%B였다 (도 18).
실시예 13: 마우스에서 약력학적 생체내 생물 검정 (실시예 11에 따르는 HES-EPO 접합체)
체중이 대략 18 내지 20 그램인 Balb C 마우스 [구입처: Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Germany)]를 21℃의 실온 및 상대 습도 55% 하의 유로 표준 팁 (Euro Standard Typ) III (LxBxH 425x266x185 mm) 우리에서 무리지어 사육하였다 (한 우리당 최대 10마리씩 사육함). "탑바이 아인슈트로이 (Tapvei Einstreu)" 4x4x1 mm (사시나무)를 우리용 깔집 재료로서 사용하였다. 부가적으로, 나무를 깍아낸 부스러기를 공급하였다. 우리를 1주에 한번씩 바꾸고 깨끗하게 하였다. 음료수 (pH 3.8-4; 황산)는 무제한으로 공급하였다. 동물 우리에 번호를 매겼다. 우리 내에 있는 동물은 귀에 표시를 하고 부가적으로 색별 표식하였다.
대략 할당 당일 및 처치를 시작하기 1주 전에, 초기 건강 검진을 수행하였다. 건강한 동물 만을 사용하였다.
실시예 11에서 수득된 바와 같은 HES EPO 접합체, 변형되지 않은 출발 물질 (rHuEPO) 및 Aranesp® (공급처: Amgen)를, 샘플의 단백질 함량을 기준으로 하여 100 ㎍/체중 kg의 투여량으로 한 무리당 4마리 마우스에게 단일 거환 피하 용량으로서 시험하였다. 비히클 대조군으로서 동일한 용적의 PBS가 포함되었다.
여러 시점 (0, 3, 6, 9, 13, 16, 20, 및 23일째)에서 대략 30 내지 60 ㎕의 전혈 샘플을, Na-헤파린을 함유하는 "헤마토크릿-카피랄렌 (Hamatokrit-Kapillaren)" (공급처: Hirschmann Laborgerate, Germany)를 이용하여 꼬리 정맥 또는 눈뒤 정맥 얼기로부터 취하고, 전혈을 헤티치 헤마토크릿 (Hettich Hamatocrit) 210 원심분리기 (공급처: Tuttlingen, Germany)에서 10,000 rpm으로 6분 동안 원심분리시켜 각 전혈 샘플의 적혈구 용적율을 결정하였다. 적혈구조혈 반응 및 기간을 시간의 함수로서 적혈구 용적율 변화 (%) 함수로서 모니터링하였다 (도 19 참고).
이들 데이터는 EPO, Aranesp® 또는 EPO 접합체를 함유하는 모든 샘플에게서 적혈구 용적율이 상승될 수 있었다는 것을 보여준다. Aranesp®는 출발 물질과 비교해서 그 효력을 3 내지 4배 증가시킬 수 있었고, 또한 HES EPO 접합체는 Aranesp®과 비교해서 그 효력을 1.5 내지 2배 증가시킬 수 있었다.
실시예 14: 마우스에서 약력학적 생체내 생물 검정 (실시예 5에 따르는 HES-IFN 알파 접합체)
실시예 5에 따라서 제조된 하나의 oxHES100/1.0 인터페론 알파 접합체를 실시예 13에 따르는 생체내 검정에서 시험하였다. 혈청 샘플의 EC50 희석도를 정맥내 주사 후 시간에 대항해 반-대수적으로 플롯팅하였다. 지수적 피트-곡선의 기울기로부터 반감기를 계산하였다. 상기 샘플의 반감기는 8.9시간이었다 (도 20 참고).
인트론 A와 비교한, 실시예 5에 따라서 제조된 oxHES100/1.0 인터페론 알파 접합체의 상대적 시험관내 활성이 도 21에 도시되었다 (시험관내 활성의 결정에 관해서는 다음 실시예 16을 참고한다).
실시예 15: 마우스에서 약력학적 생체내 생물 검정 (실시예 10에 따르는 HES-IFN 알파 접합체)
실시예 10에 따라서 제조된 3개의 HES100/1.0 인터페론 알파 접합체를 실시예 13에 따르는 생체내 검정에서 시험하였다. 혈청 샘플의 EC50 희석도의 중간값을 정맥내 주사 후 시간에 대항해 반-대수적으로 플롯팅하였다. 지수적 피트-곡선의 기울기로부터 반감기를 계산하였다. 상기 샘플의 평균 반감기는 9.7시간이었다 (도 22 참고).
변형되지 않은 IFN-알파의 경우에는, 혈청의 항바이러스 활성이 너무 낮아서 혈청 반감기를 계산할 수 없었다. 문헌 [참고: K.R. Reddy et al. Advaced Drug Delivery Reviews 54 (2002) pp. 571-586]에서는, 랫트 (정맥내)에서의 IFN-알파의 혈청 반감기 (2시간)를 결정하였다.
인트론 A와 비교한, 실시예 10에 따라서 제조된 3개의 HES100/1.0 인터페론 알파 접합체의 상대적 시험관내 활성이 도 23에 도시되었다 (시험관내 활성의 결정에 관해서는 다음 실시예 16을 참고한다).
실시예
16: 시험 과정에 관한 설명: 인터페론-알파 (
실시예
14 및 15)의 항바이러스 활성
세포 배양 배지에서 시험 항목을 예비-희석시킨 후, 일련의 2배 희석물을 제조하였다. 96 웰 미세역가 판에서, 희석된 인터페론 (1회 희석당 4배 복제물)을 신선하게 트립신 처리시킨 MDBK 세포 (웰당 40,000개 세포)에 가하였다. 검정물을 37℃ 하에 24시간 동안 항온 배양하였다 (웰당 총 용적: 175 ㎕).
연속해서, 50 ㎕ 희석된 VSV 스톡 용액을 각 웰 (양성 대조군 웰은 제외된다)에 가하면, 감염 다중도가 0.1이 되었다.
다음 대조군을 각 검정에 포함시켰다: 인터페론 대신 세포 배양 배지에 바이러스를 부가시킨 12 웰 (음성 대조군) 및 인터페론 및 바이러스 대신 세포 배양 배지를 부가시킨 12 웰 (양성 대조군). 이 검정물을 37℃ 하에 42시간 동안 항온 배양하였다.
항온 배양 기간이 끝날 무렵, 각 웰의 세포 배양 상등액을 50 ㎕의 MTT 용액 (세포 배양 배지 중의 적어도 2 mg/mL)으로 대체하였다. 세포를 3시간 동안 항온 배양하였다. 증식성 세포에 의해 형성된 자색 포르마잔 염료를, 이소프로판올/HCl의 100 ㎕ 용액 (40 mM HCl을 수반한 이소프로판올)을 각 웰에 부가함으로써 가용화시켰다. 연속해서, 이러한 용액의 흡광도 값을 미세역가 판 판독기에서 570/630 nm 하에 측정하였다.
인터페론 및 VSV의 존재 하에 성장시킨 MDBK 세포의 증식 활성을 다음과 같이 인터페론의 각 희석에 대해 계산하였다:
(인터페론 처리된 4개 웰의 평균 흡광도)-(음성 대조군의 평균 흡광도)) * 100
---------------------------------------------------------------------
(양성 대조군의 평균 흡광도) - (음성 대조군의 평균 흡광도)
인터페론-알파의 항바이러스 활성은 시험 항목 각각에 대한 4가지 별개의 검정에서 결정하였다.
상기 언급된 검정 시스템에서는, 각각의 접합체 HES100/1.0 인터페론 알파 접합체 (각각 실시예 15 및 10) 및 oxHES100/1.0-인터페론 알파 접합체 (각각 실시예 14 및 5)를 변형되지 않은 IFN-알파 출발 물질, 즉 인트론 A와 비교해서 시험하였다. 상기 물질의 CPE50 농도를 계산하였다.
실시예 17: 본 발명에 따르는 HES-링커 유도체의 제조
실시예 17에서는, 본 발명의 HES-링커 유도체를 제조하였다. 한편, 소정의 링커 구조에 대해서는, HES를 평균 분자량 및 그의 몰 치환 측면에서 다양하게 하였다. 또 다른 한편으론, 소정의 HES 출발 물질에 대해, 링커의 화학적 성질을 다양하게 하였다.
다음 표 1 및 2에 표시된 양의 HES를 격렬하게 교반시키고 적당한 수준으로 가열 (40℃ 이하)함으로써 적당한 용적 ("완충제 V")의 나트륨 아세테이트 완충제 (1 mol/l, pH = 5)에 용해시켰다. 청정한 용액에 표시된 양의 링커 (HES 종의 Mn과 관련된 40 당량)를 가하였다. 몇몇 경우에는, 이러한 양의 링커를 "DMF-링커" 용액으로서 가하였다. 따라서, 요구되는 양의 링커를 소량의 DMF에 용해시키고, 이로써 생성되는 청정한 DMF-링커 용액 (표 2에서 "DMF-링커 용액 V"로서 표시됨)을 반응 혼합물에 가하였다. 최종적으로, NaCNBH3 양으로서 표시된 고형 NaCNBH3를 교반 용액에 용해시켜 전형적으로 0.6 M의 최종 농도를 수득하고, 반응 혼합물을 60℃에서 18 내지 24시간 동안 가열 및 교반하였다.
반응물을 후처리하기 위해, 혼합물을 초고순도 물에 의해 희석시켜 최종 농도 약 100 mg/ml (10% m/V)의 HES 유도체를 수득하고, 용매로서 초고순도 물을 이용하고 컷-오프가 10 kDa인 막을 이용하여 투석 (D)시키거나 한외 여과 (UF)함으로써 정제하였다. 링커 (a2) 및 (a3)의 경우에는, 초고순도 물을 이용하기 전에 10 mM NH4HCO3-완충제, pH = 9를 한외 여과에 사용하였다.
후속 탈보호를 위해, 정제된 HES-유도체 용액 (10%, 100 mg/ml)을 진한 HCl 용액에 의해 산성화시켜 적당한 "pH 수준"을 갖는 "c (HCl)"을 수득하였다. 혼합물을 반응 시간 "t" 동안 40℃ 하에 교반 및 가열한 후, 중화시키고 (묽은 NaOH), 적당한 "후처리 용매"를 이용하여 한외 여과 (막 컷-오프 10 kDa)함으로써 후처리한 다음, 최종적으로 동결건조시켜 백색 내지 황색 분말을 수득하였다.
유도체화는 표적 분자와의 성공적인 커플링에 의해 확증되었다 (켐프티드; 다음 실시예 18, 표 3, 4 및 5 참고). 링커 (a15) 및 (a1O)을 이용하여 제조된 HES-유도체의 경우에는, 분광 특성에 의해 성공적인 유도체화를 검사하였다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 모든 HES-유도체를, 실시예 18, 표 3, 4 및 5에 열거된 표적과의 접합에 사용하였다.
표 1 및 2에서 사용된 약어:
D: 투석
DMF: 디메틸포름아미드
HES: 히드록시에틸 전분
HCl: 염산
NaCNBH3: 나트륨 시아노보로히드라이드
NaOH: 수산화나트롬
UF: 한외 여과
V: 용적
물: 초고순도 물 (milliQ).
HES 100/1.0과 링커 구조 (a2)의 HES 유도체를 본 발명의 실시예 8 및 9에 따라서 제조하였다. 링커 구조 (a2)는 상기 정의된 바와 같은 구조 (a2), 즉 다음 1-아미노-3,3-디에톡시프로판에 관한 것이다:
[표 1]
HES 부분의 변화 (실시예 17)
HES 부분의 변화 (실시예 17 계속)
* 초고순도 물을 사용하기 전에 NH4HCO3-완충제 (10 mM, pH = 9)를 한외 여과에 사용하였다.
[표 2]
링커 구조의 변화 (실시예 17)
링커 구조의 변화 (실시예 17 계속)
# 본 발명의 맥락에서 정의된 바와 같음.
* 나트륨 아세테이트 완충제 대신 DMSO.
** 한외 여과시키기 전에 희석되고 중화된 반응 혼합물을 원심분리시킨다.
& 40 대신 20 당량 (HES의 Mn과 관련됨)을 사용하였다.
실시예 18: 본 발명에 따르는 HES-링커-생물학적 활성제 유도체의 제조
다음 표 3, 4 및 5에 표시된 바와 같은 양의 표적 분자를 적당한 반응 완충액 내로 옮겼다. 표시된 양의 HES-링커 유도체 (링커와 HES 종에 의해 규정됨)를 반응 완충액에 용해시키고, 이를 표적 물질 용액과 혼합하였다. NaCNBH3 - 전형적으로, 반응 완충액 중에서 신선하게 제조된 0.5 M 스톡 용액으로서 존재함 - 를 전형적으로 20 mM의 최종 농도에 가하였다. 반응 혼합물을 반응 시간 "rxn t" 동안 온도 "rxn T"에서 온도 제어 하에 항온 배양하였다.
최종 반응 용적 ("rxn V") 및 이로써 생성되는 반응물의 농도 및 비가 표 3, 4 및 5에 제시되어 있다.
접합 반응의 성공이 크로마토그래피적 분석 (RP-HPLC, SE-HPLC) 또는 SDS-PAGE에 의해 밝혀졌다 (선택된 유도체에 대해서는 도 28 내지 33을 참고한다). 본원에 기재된 모든 커플링 반응에서, 표적-HES 접합체가 탐지 가능하였다. 각종 표적 분자에 대한 반응 조건은 최적화되지 못하였다.
사용된 약어:
rhIFNα: 재조합 인간 인터페론-알파 2b
rhEPO: 재조합 인간 에리트로포이에틴
rhG-CSF: 부가의 N-말단 메티오닌을 수반한 재조합 인간 과립구 집락 자극 인자
rhFIX: 재조합 인간 응고 인자 IX
rhFVIIa: 재조합 인간 응고 인자 VIIa
rhGH: 재조합 인간 성장 호르몬
hFab; 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편
mIgG: 뮤린 면역글로불린 G
GLP-1: 글루카곤-유사 펩티드-1; 아미노산 1-37
r아스파라기나제: 이. 콜라이로부터의 재조합 아스파라기나제
NH2-DNA: 서열 GGC TAC GTC CAG GAG CCA CCT을 갖는 5'-아미노헥실스페이서를 수반한 올리고뉴클레오티드
rh렙틴: 재조합 인간 렙틴
앰포B: 앰포테리신 B, CAS No. 1397-89-3
켐프티드: Trp4-켐프티드 (Leu-Arg-Arg-Trp-Ser-Leu-Gly), CAS No. 80224-16-4
NaOAc: 나트륨 아세테이트 함유 완충제
HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, CAS No. 7365-45-9
[표 3]
표적 물질의 변화 (실시예 18)
표적 물질의 변화 (실시예 18 계속)
[표 4]
HES 부분의 변화 (실시예 18)
HES 부분의 변화 (실시예 18 계속)
[표 5]
링커 구조의 변화 (실시예 18)
링커 구조의 변화 (실시예 18 계속)
부가의 데이터
(A.1)
HBS
7
kDa
로부터
oxHBS
-N-(3-
프로피오알데히드디에틸아세탈
)의 제조
고분지된 전분 [Mw=7000 달톤 (7 kDa), 평균 분지화도: 15 mol%]으로부터 출발하여 WO2005/083103 A1의 실시예 9에 따라서 고분지된 전분 (HBS) 알돈산을 합성하였다. 이와 같이 수득된 알돈산을, 80℃ 하에 24시간 동안 건조시킴으로써 상응하는 락톤으로 전이시켰다 (약어 "oxHBS"는 HBS 알돈산 뿐만 아니라 상응하는 락톤을 지칭한다).
5 g의 락톤을 15 ml의 l-아미노-3,3-디에톡시프로판 및 10 ml의 무수 DMF에 용해시키고, 70℃ 하에 48시간 동안 교반시켰다. 과량의 l-아미노-3,3-디에톡시프로판 및 DMF (디메틸포름아디드)를 진공 하에 증발시키고, 이로써 생성되는 담황색 고체를 황색이 사라질 때까지 아세톤으로 세척하였다. 생성물을 물에 용해시키고, 여액의 pH가 >6의 값에 도달할 때까지 컷-오프가 1,000 달톤인 막을 활용하여 한외 여과시킴으로써 정제하였다.
보존물을 2 g의 산성 양이온 교환 수지 (Amberlite® 120)로 2시간 동안 처리하고, 수지를 여과 제거한 다음, 잔여 용액을 동결건조시켰다.
화합물의 1H-NMR 스펙트럼은 1.7 ppm에서 삼중선을 나타내고 1.2 ppm에서 다중선을 보여주었는데, 이는 링커 화합물 (1-아미노-3,3-디에톡시프로판)의 잔기의 질소 원자에 대한 알파 위치에 있는 메틸 기 및 메틸렌 기를 나타낸다.
(A.2) oxHBS 7 kDa - 소 혈청 알부민 (BSA) 접합체의 제조
(A.1)에서 제조된 750 ㎍의 아세탈을 5 ml 0.01 N HCl에 용해시켰다. 1 N HCl을 이용하여 pH를 2.0이 되도록 조정하고, 반응 혼합물을 21℃ 하에 18시간 동안 교반시켰다. 아세톤 완충제 (pH = 7.0) 중의 2 ml의 1% BSA 용액을, 상기 제조된 혼합물 200 ㎕에 가하였다. 140 mg 나트륨 시아노보로히드라이드를 5 ml 0.1 N 아세테이트 완충제 (pH = 7.0)에 용해시키고, 50 ml 분취액을 반응 혼합물에 즉시 가하였다. 반응 혼합물을 4℃ 하에 15시간 동안 저장하였다. 반응 혼합물을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석한 결과, HBS-BSA 접합체의 반응 수율이 90%인 것으로 밝혀졌다 (도 24).
(A.3) oxHBS 65 kDa - 인터페론-알파 접합체의 제조
(A.1)과 유사하게 제조된 400 mg의 65 kDa HBS-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)이고 pH 값이 2인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 밤새 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 커플링에 앞서 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
인터페론-알파 [에스케리챠 콜라이 (이. 콜라이)를 이용한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 재조합 인간 인터페론 알파-2b; 이러한 인터페론 알파-2b는 165개 아미노산으로 구성되고, 천연 인간 인터페론 알파-2b (hIFN-알파-2b)와 동일한 아미노산 서열을 제시한다]를 16 mg/ml 이하로 농축시키고, 이를 한외 여과 장치를 이용하여 적합한 접합 완충액 (0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 4.0)에 옮겼다.
10배 몰 과량의 oxHBS 알데히드 (Mw를 기준으로 함)를 반응 혼합물 중의 최종 단백질 농도 6 mg/ml와 함께 사용하였는데; oxHBS 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 탈보호된 oxHBS 알데히드를 단백질 용액과 합하고, 신선하게 제조된 NaCNBH3 용액 (접합 완충액 중의 0.5 M)을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 10℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 25)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
악타 시스템 (공급처: GE Healthcare) 상에서 Q HP 칼럼을 이용하여 음이온 교환 크로마토그래피함으로써 반응되지 않은 화합물로부터 HBS-인터페론-알파를 분리하였다. 용출제 A는 10 mM 트리스-Cl, pH 8.0이고, 용출제 B는 10 mM 트리스-Cl, 0.5 M NaCl, pH 8.0였다. 접합체와 변형되지 않은 단백질을 분리시키기 위한 구배는 16 CV 중에서 0%B => 50%B였다 (도 26).
(A.4) oxHBS 65 에리트로포이에틴 (EPO) 접합체의 제조
(A.1)과 유사하게 제조된 400 mg의 65 kDa HBS-N-(3-프로피오알데히드디에틸아세탈)에 적당한 양의 10 mM HCl를 가하여 농도가 40% (w/v)인 용액을 산출하였다. 이 용액을 교반 하에 21℃에서 밤새 항온 배양하여 알데히드 관능기를 탈보호시켰다. 0.1 M NaOH를 부가함으로써 pH 값을 접합 완충액에서 사용된 값으로 조정하였다.
탈보호된 oxHBS 알데히드를 EPO [인간 EPO의 아미노산 서열을 갖고 있고 시판용 Erypo® (공급처: Ortho Biotech, Jansen-Cilag) 또는 NeoRecormon® (공급처: Roche)와 거의 동일한 특징을 지니고 있는 재조합 인간 EPO] 용액 (반응 완충액 0.1 M 나트륨 아세테이트 완충제, pH 5 중의 10 mg/ml)과 합하였다. OxHBS 알데히드를 EPO 농도와 비교해서 20배 몰 과량 (Mw를 기준으로 함)으로 가하였다. 이로써 생성된 반응 혼합물 중의 EPO 농도는 4.6 mg/ml였고, oxHBS 알데히드 농도는 20% (w/v)였다. 반응 완충액에서 구성된 0.5 M NaCNBH3 용액을 가함으로써 환원적 아민화 반응을 시작하여 최종 농도가 20 mM인 환원제를 수득하였다. 철저히 혼합한 후, 상기 반응물을 10℃ 하에 밤새 항온 배양하였다.
반응 혼합물을 SDS-PAGE (도 27)에 의해 그리고 C18 칼럼 (공급처: Phenomenex, Jupiter) 상에서 역상 크로마토그래피 (도 A.4-1)함으로써 분석하여 성공적인 커플링을 입증하고 접합 수율을 결정하였다. 0.1% TFA를 수반한 산성 수/아세토니트릴 구배를 이용하여 용출을 수행하였다.
Claims (51)
- (i) 다음 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)을, 이러한 HAS의 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여 다음 화학식 II에 따르는 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 반응시켜 다음 화학식 III에 따르는 HAS 유도체를 수득하는 단계
를 포함하는, 히드록시알킬 전분 유도체의 제조 방법:
화학식 I
화학식 II
M-L-A
화학식 III
상기식에서,
A는 아세탈 기 또는 케탈 기이고; L은 M과 A를 브릿징하는 스페이서이며; C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화되며;
X는 아미노 기 M을, HAS의 임의로 산화된 환원성 말단의 탄소 원자 C*를 통하여 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기이고;
HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이다. - 제1항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로, 기 -(CH2CH2O)n-H이고, n이 정수, 바람직하게 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 히드록시알킬 전분이 히드록시에틸 전분 (HES)인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, A가 다음 화학식 (IIa)에 따르는 잔기인 방법:
화학식 IIa
상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고, Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 예를 들면 n-프로필 또는 i-프로필, 또는 C(O)-Ry (여기서, Ry는 바람직하게, C1-C6 알킬 및 C6-C14 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 더 바람직하게, 임의로 치환된, 바람직하게는 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 3급-부틸로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; Rx는 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환을 형성한다:
화학식 IIb
상기식에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고,
A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하고, A3은 바람직하게, H이다. - 제4항에 있어서, Z1 및 Z2가 각각 O이고; A3이 H이며; A1 및 A2가 각각 에틸이거나 또는 A1 및 A2가 화학식 IIb에 따르는 환 (여기서, A1 및 A2는 함께 -(CH2)2-이다)을 형성하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노 기 M이 다음 화학식 IIc에 따르는 기인 방법:
화학식 IIc
상기식에서, Y는 부재하거나 또는으로 이루어진 군 중에서 선택된 화학적 부분이며;
G는 O 또는 S 또는 NH이고, 2번 존재하는 경우, 각 G는 독립적으로, O 또는 S 또는 NH이며, 바람직하게 O이고,
R'는 H 또는 히드록시 기이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 및 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 바람직하게는 H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이며; 보다 바람직하게는 H 또는 알킬이다. - 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노 기 M이 H2N-, H2N-O-, H2N-NH-(C=O)-, H3C-NH- 또는 H3C-NH-O-, 바람직하게 H2N-, H2N-O-, 또는 H2N-NH-(C=O)-인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, (i)에서 HAS를 그의 산화된 환원성 말단을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 0 내지 80℃ 범위의 온도에서 수행하는 (여기서, X는 -(C=O)-NH-이다) 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, (i)에서, HAS를 바람직하게 수성 시스템 중에서 그의 비-산화된 환원성 말단을 통하여, 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 4 내지 7 범위의 pH에서 20 내지 80℃ 범위의 온도 하에 수행하는 (여기서, X는 -CH=N-이다) 방법.
- 제9항에 있어서, (i)에서, 반응을 환원제, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 수행하여 HAS 유도체 (여기서, X는 -CH2-NH-이다)를 수득하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, (i)에서, HAS를 바람직하게 수성 시스템 중에서 그의 비-산화된 환원성 말단을 통하여, 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M (여기서, M은 H2N-O- 또는 H2N-NH-(C=O)-이다)과 반응시키고, 이러한 반응을 4.5 내지 6.5 범위의 pH에서 5 내지 80℃ 범위의 온도 하에 수행하는 (여기서, X는 -CH=N-O- 또는 -CH=N-NH-(C=O)-이다) 방법.
- 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, M과 A를 브릿징하는 L이 다음 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하고, 바람직하게 화학식 IId에 따르는 구조 단위로 이루어진 스페이서인 방법:
화학식 IId
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 (여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; 바람직하게, H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, H 또는 알킬이며; 보다 바람직하게, H이며;
n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2의 정수이다. - 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n- (여기서, n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10의 정수이다)이고, 보다 바람직하게 L이 -CH2-CH2-인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, L이 1개 이상의 구조 단위 -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, 바람직하게 -(CH2)n1-O-(CH2)n2- (여기서, n1은 n2와 동일하거나 상이하다)을 포함하고, 스페이서 L이 바람직하게, -(CL1L2)n1-을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 연결되는 방법.
- 제14항에 있어서, L이 -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-, 바람직하게 -((CH2)2-O)m-CH2-(여기서, m은 1, 2 또는 3, 보다 바람직하게 2 또는 3이다)인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n-(여기서, 각 n은 서로 독립적으로, 바람직하게 1 내지 4의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 3의 범위이다)인 방법.
- 제16항에 있어서, L이 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 II에 따르는 가교 결합성 화합물 M-L-A가
로 이루어진 군 중에서 선택되고; 바람직하게는
로 이루어진 군 중에서 선택되며; 보다 바람직하게는
로 이루어진 군 중에서 선택되는 방법.
- 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 II에 따르는 가교 결합성 화합물 M-L-A가 1-아미노-3,3-디에톡시프로판인 방법.
- 제1항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 있어서,
(ii) 화학식 III에 따르는 HAS 유도체를 기 A를 통하여 생물학적 활성제 H2N-BA'의 아미노 기와 환원적 아민화 반응시켜 화학식 IV에 따르는 HAS 유도체를 수득하는 단계
를 추가로 포함하는 방법:
화학식 IV
- 제20항에 있어서, (ii)에 앞서, 화학식 III에 따르는 HAS 유도체의 기 A를 상응하는 알데히드 또는 케토 기로 변환시키는 방법.
- 제20항 또는 제21항에 있어서, (ii)에서, 반응을 환원제, 바람직하게 NaCNBH3의 존재 하에 바람직하게 수성 시스템 중에서, 0 내지 37℃, 바람직하게 0 내지 25℃ 범위의 온도 하에 및 3 내지 9, 바람직하게 3 내지 7, 보다 바람직하게 3 내지 7 미만 범위의 pH에서 수행하고, (ii)에서, HAS 유도체 대 생물학적 활성제 BA의 몰 비가 HAS 유도체의 수 평균 분자량 (Mn)을 기준으로 하여 0.1:1 내지 200:1 당량, 바람직하게 1:1 내지 50:1 당량인 방법.
- 제20항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 화합물 BA가 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질; 이러한 폴리펩티드 또는 단백질의 기능성 유도체, 단편 또는 유사작용제; 소분자 화합물 또는 올리고뉴클레오티드인 방법.
- 제23항에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 알파-1-항트립신, 항체 또는 항체 단편, 또는 대체 단백질 스캐폴드 (scaffold)인 방법.
- 화학식 III의 히드록시알킬 전분 (HAS) 유도체:
화학식 III
상기식에서,
A는 아세탈 또는 케탈 기이고; L은 X와 A를 브릿징하는 스페이서이며;
X는 화학식 II의 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M을, 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)의 탄소 원자 C* (여기서, C*는 HAS와 M과의 반응 이전에 임의로 산화된다)를 통하여 상기 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기이고;
HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이며; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이다:
화학식 I
화학식 II
M-L-A. - 제25항에 있어서, R1, R2 및 R3이 독립적으로, 기 -(CH2CH2O)n-H이고, n이 정수, 바람직하게 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6인 HAS 유도체.
- 제25항 또는 제26항에 있어서, 히드록시알킬 전분이 히드록시에틸 전분 (HES)인 HAS 유도체.
- 제25항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, A가 다음 화학식 (IIa)에 따르는 잔기인 HAS 유도체:
화학식 IIa
상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고, Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 예를 들면 n-프로필 또는 i-프로필, 또는 C(O)-Ry (여기서, Ry는 바람직하게, C1-C6 알킬 및 C6-C14 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 더 바람직하게, 임의로 치환된, 바람직하게는 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 3급-부틸로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; Rx는 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환을 형성한다:
화학식 IIb
상기식에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고,
A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하고, A3은 바람직하게, H이다. - 제25항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, X가 -CH=N-, -CH2-NH-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NH-NH-로 이루어진 군, 바람직하게 -CH2-NH-, -CH=N-, -CH=N-O-, -CH2-NH-O- 및 -CH=N-NH-(C=O)-로 이루어진 군 중에서 선택되는 HAS 유도체.
- 제25항 내지 제29항 중의 어느 한 항에 있어서, M과 A를 브릿징하는 L이 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하고, 바람직하게 화학식 IId에 따르는 구조 단위로 이루어진 스페이서인 HAS 유도체:
화학식 IId
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 (여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; 바람직하게, H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, H 또는 알킬이며; 보다 바람직하게, H이며;
n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2의 정수이다. - 제30항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n- (여기서, n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10의 정수이다)이고, 보다 바람직하게 L이 -CH2-CH2-인 HAS 유도체.
- 제30항에 있어서, L이 1개 이상의 구조 단위 -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, 바람직하게 -(CH2)n1-O-(CH2)n2- (여기서, n1은 n2와 동일하거나 상이하다)을 포함하고, 스페이서 L이 바람직하게, -(CL1L2)n1-을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 연결되는 HAS 유도체.
- 제31항에 있어서, L이 -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-, 바람직하게 -((CH2)2-O)m-CH2- (여기서, m은 1, 2 또는 3, 보다 바람직하게 2 또는 3이다)인 HAS 유도체.
- 제30항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n- (여기서, 각 n은 서로 독립적으로, 바람직하게 1 내지 4의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 3의 범위이다)인 HAS 유도체.
- 제34항에 있어서, L이 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되는 HAS 유도체.
- 제25항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 구조를 갖는 히드록시알킬 전분 유도체:
- 제25항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 구조를 갖는 히드록시알킬 전분 유도체:
- 화학식 IV의 히드록시알킬 전분 유도체:
화학식 IV
상기식에서, X는 화학식 II의 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M을, 화학식 I의 히드록시알킬 전분 (HAS)의 탄소 원자 C* (여기서, C*는 임의로 산화되고, 가장 바람직하게는 HAS와 M과의 반응 이전에 산화되지 않는다)를 통하여 화학식 I의 HAS와 반응시킴으로써 생성되는 관능기 (여기서, X는 아미드 기 -C(=O)-NH-가 아니다):
화학식 I
화학식 II
M-L-A
{상기식에서, HAS'는 히드록시알킬 전분 분자의 나머지 부분이고; R1, R2 및 R3은 독립적으로, 수소 또는 선형 또는 분지된 히드록시알킬 기이며;
A는 화학식 IIa에 따르는 잔기:
화학식 IIa
[상기식에서,
Z1 및 Z2는 각각 독립적으로, O 또는 S 또는 NRx, 바람직하게 O이고, Rx는 H 또는 저급 알킬, 예를 들어 메틸, 에틸 또는 프로필, 예를 들면 n-프로필 또는 i-프로필, 또는 C(O)-Ry (여기서, Ry는 바람직하게, C1-C6 알킬 및 C6-C14 아릴로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 더 바람직하게, 임의로 치환된, 바람직하게는 치환되지 않은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸 및 3급-부틸로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; Rx는 바람직하게 H이며;
A1 및 A2는 각각 독립적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 3급-부틸, 벤질, 1,1,1-트리클로로에틸, 니트로벤질, 메톡시벤질, 에톡시벤질이거나, 또는 다음 화학식 IIb에 따르는 환:
화학식 IIb
(여기에서,
A1 및 A2는 함께, -(CH2)2- 또는 -(CH2)3- 또는 -(CH2CH(CH3))-이고,
A3은 H 또는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 펜틸, 벤질이거나, 또는 아미노 기 M의 N 원자와 함께 또는 L에 포함된 적합한 원자와 함께 환을 형성하고, A3은 바람직하게 H이다)을 형성한다]이며;
L은 M과 A를 브릿징하는 스페이서이다}이고;
BA'는 BA의 아미노 기를 환원적 아민화를 통하여 A와 반응시키거나 또는 A에 상응하는 알데히드 기 또는 케토 기와 반응시킨 후에 잔존하는, 생물학적 활성제 BA'-NH2의 나머지 부분이다. - 제38항에 있어서, X가 -CH2-NH-, -CH=N-, -CH2-NH-O- 및 -CH=N-O-로 이루어진 군, 보다 바람직하게 -CH2-NH- 및 -CH2-NH-O-로 이루어진 군 중에서 선택되는, 가장 바람직하게는 -CH2-NH-인 HAS 유도체.
- 제38항 또는 제39항에 있어서, M과 A를 브릿징하는 L이 화학식 IId에 따르는 하나 이상의 구조 단위를 포함하고, 바람직하게 화학식 IId에 따르는 구조 단위로 이루어진 스페이서인 HAS 유도체:
화학식 IId
상기식에서,
L1 및 L2는 서로 독립적으로, H이거나 또는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴 및 잔기 -O-R"로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기 (여기서, R"는 알킬, 치환된 알킬, 알케닐, 치환된 알케닐, 알키닐, 치환된 알키닐, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 알킬아릴, 치환된 알킬아릴로 이루어진 군 중에서 선택된다)이고; 바람직하게, H이거나 또는 알킬 및 치환된 알킬로 이루어진 군 중에서 선택된 유기 잔기이고; 보다 바람직하게, H 또는 알킬이며; 보다 바람직하게, H이며;
n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10, 보다 바람직하게 1 내지 6, 보다 바람직하게 1 내지 4, 보다 바람직하게 2의 정수이다. - 제40항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n- (여기서, n은 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 10의 정수이다)이고, 보다 바람직하게 L이 -CH2-CH2-인 HAS 유도체.
- 제40항에 있어서, L이 1개 이상의 구조 단위 -(CL1L2)n1-O-(CL1L2)n2-, 바람직하게 -(CH2)n1-O-(CH2)n2- (여기서, n1은 n2와 동일하거나 상이하다)을 포함하고, 스페이서 L이 바람직하게, -(CL1L2)n1-을 통하여 가교 결합성 화합물의 아미노 기 M과 연결되는 HAS 유도체.
- 제42항에 있어서, L이 -((CL1L2)2-O)m-(CL1L2)-, 바람직하게 -((CH2)2-O)m-CH2- (여기서, m은 1, 2 또는 3, 보다 바람직하게 2 또는 3이다)인 HAS 유도체.
- 제40항에 있어서, L이 -(CL1L2)n-(C=O)-NH-(CL1L2)n-, 바람직하게 -(CH2)n-(C=O)-NH-(CH2)n- (여기서, 각 n은 서로 독립적으로, 바람직하게 1 내지 4의 범위, 보다 바람직하게 1 내지 3의 범위이다)인 HAS 유도체.
- 제44항에 있어서, L이 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)3-; -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)3-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되고, 보다 바람직하게는 -(CH2)3-(C=O)-NH-(CH2)2-; 및 -(CH2)2-(C=O)-NH-(CH2)2-로 이루어진 군 중에서 선택되는 HAS 유도체.
- 제38항 내지 제40항 중의 어느 한 항에 있어서, 다음 구조를 갖는 HAS 유도체:
- 제38항 내지 제46항 중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 화합물 BA가 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드, 단백질; 이러한 폴리펩티드 또는 단백질의 기능성 유도체, 단편 또는 유사작용제; 소분자 화합물 또는 올리고뉴클레오티드인 HAS 유도체.
- 제47항에 있어서, 단백질이 에리트로포이에틴 (EPO), 예를 들어 재조합 인간 EPO (rhEPO), 집락 자극 인자 (CSF), 예를 들어 G-CSF, 예를 들면 재조합 인간 G-CSF (rhG-CSF), 인터페론 (IFN), 예를 들어 IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, 예를 들면 재조합 인간 IFN 알파 (rhIFN 알파) 또는 재조합 인간 IFN 베타 (rhIFN 베타), 인자 VII, 예를 들어 재조합 인간 인자 VIIa (rhFVIIa), 인자 IX, 예를 들어 재조합 인간 인자 IX (rhFIX), 성장 호르몬 (GH), 예를 들어 재조합 인간 성장 호르몬 (rhGH), Fab 단편, 예를 들어 인간 면역글로불린 G 분자로부터 유래된 Fab 단편 (hFab), 면역글로불린 G, 예를 들어 뮤린 면역글로불린 G (mIgG), 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 아스파라기나제, 예를 들어 재조합 아스파라기나제 (r아스파라기나제), 렙틴, 예를 들어 재조합 인간 렙틴 (rh렙틴), 인터루킨-2, 인터루킨-11, 알파-1-항트립신, 항체 또는 항체 단편, 또는 대체 단백질 스캐폴드인 HAS 유도체.
- 제38항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 치료제 또는 예방제로서의 HAS 유도체.
- 제38항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 인체 또는 동물체의 치료 방법에 사용하기 위한 HAS 유도체.
- 제38항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 따르는 HAS 유도체의 치료상 유효량을 포함하는 제약 조성물.
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